Berichrom*Antithrombin III

Berichrom* Antithrombin III
Reagents for the determination of antithrombin III
Intended Use
For the quantitative determination of functionally active antithrombin III (AT III) as an aid in the
diagnosis and monitoring of thrombosis and related conditions.
Summary and Explanation
Antithrombin III is the plasmatic inhibitor of thrombin and activated factor X and forms an irreversible
inactive complex with these enzymes. Inactivation of the activated coagulation factors is greatly accelerated by heparin. Berichrom* Antithrombin III aids in the quick determination of physiologically active antithrombin III and allows the diagnosis of inherited and acquired antithrombin III deficiency, which represents an increased risk of thrombosis. Acquired antithrombin III deficiencies often occur as a result of
consumption after major operations or disseminated intravascular coagulation (DIC) associated with sepsis, nephrosis, parenchymal liver damage (hepatitis, drug intoxication, alcoholism) and contraceptives
containing estrogen1. The test enables the early detection of patients at increased risk of thrombosis 2.
Principle of the Method
The antithrombin III in the sample is converted by heparin into an immediate inhibitor and inactivates the thrombin present. The residual thrombin content is determined in a kinetic test measuring
the increase in absorbance at 405 nm according to the following reaction scheme:
Heparin
AT IIIsample + Thrombinexcess –––––––––––> [AT III-Thrombin] + Thrombinresidue
thrombin residue
Tos-Gly-Pro-Arg-ANBA-IPA –––––––––––> Tos-Gly-Pro-Arg-OH + ANBA-IPA
Reagents
Materials provided
Berichrom* Antithrombin III,
Test Kit, Code No. OUBP with
6 x for 15 mL Thrombin Reagent
6 x for 2 mL Substrate Reagent
1 x 100 mL Buffer Solution
Composition
Thrombin Reagent bovine, lyophilized; containing heparin, mannitol (2 g/L), sodium chloride (2 g/L)
and aprotinin as additives
Substrate Reagent, lyophilized; concentration in the working solution:
Tosylglycyl-prolyl-arginyl-5-amino-2-nitrobenzoic acid isopropylamide (Tos-Gly-Pro-Arg-ANBA-IPA,
2 mmol/L)
Buffer solution: Tris (12 g/L), NaCl (9 g/L), pH 8.2
Preservative: sodium azide (< 1 g/L)
Warnings and Precautions
1. For in vitro diagnostic use only.
2. Reagents containing sodium azide must be handled with due caution: Do not ingest or allow to
contact skin or mucous membranes. Sodium azide can form explosive azides if it comes into
contact with heavy metals such as copper or lead.
3. Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all materials obtained from
human blood should always be handled with due care, observing the precautions recommended for biohazardous material3.
Preparation of the Reagents
Thrombin Reagent: Reconstitute with the amount of buffer solution indicated on the label and incubate for 30 minutes at +15 to +25 °C before use.
Substrate Reagent: Dissolve the contents of the vial with the amount of distilled water indicated on
the label.
Mix reagents carefully once more before using.
Storage and Stability
The test kit may be used up to the date indicated on the label if stored unopened at +2 to + 8 °C.
Stability after reconstitution:
Temperature
Thrombin
Substrate Reagent
+37 °C
8 hours
1 week
+30 °C
2 days
2 weeks
+15 to +25 °C
1 week
2 weeks
+2 to +8 °C
2 weeks
6 weeks
-20 °C
3 months
6 months
Thrombin may be frozen in the original vial up to 5 times, the substrate up to 10 times.
The buffer solution is stable for 6 months after it is first opened if stored at +2 to +8 °C.
Different coagulation analyzers have individual stability data.
Additional materials required, but not provided
Standard Human Plasma, Code No. ORKL, AT III calibrated by the WHO Standard
Control Plasma N, Code No. ORKE
Control Plasma P, Code No. OUPZ
Acetic acid 20% (for the two-point method only)
Isotonic saline solution
Coagulation analyzer (see section titled "Limitations of the Procedure")
Specimens
To obtain the plasma, carefully mix 1 part sodium citrate solution (0.11 mol/L) with 9 parts venous
blood, avoiding the formation of foam. Centrifuge immediately at no less than 1,500 x g for at least
10 minutes.
Stability of the sample:
-20 °C
1 month
+2 to +8 °C
2 days
+15 to +25 °C
6 hours
Plasma stored at -20 °C is to be thawed within 10 minutes at +37 °C, after which the assay is to be
performed within 2 hours.
Procedure
Berichrom* Antithrombin III can be used in a great number of coagulation analyzers.
Observe the operating instructions issued by the analyzer’s manufacturer!
Manual:
Dilute 1 part patient plasma with 40 parts isotonic saline (e.g. 25 µL plasma + 1 mL isotonic saline
solution) and use in the test within 45 minutes (+15 to +25 °C).
Half-micro test:
Cuvette:
1 cm thickness
Wavelength:
405 nm
Testing temperature:
optionally +25 °C, +30 °C or +37 °C
Prewarm the Thrombin Reagent Solution, Substrate Reagent as well as the plastic cuvettes or
tubes to the chosen testing temperature.
OUBP G21 E0540 (68) CS
1
Edition December 2003
Pipetting diagram for the kinetic method
Thrombin enzyme value (TEV)
Sample
Isotonic saline solution
50 µL
Plasma dilution
50 µL
Thrombin Reagent
1000 µL
1000 µL
Mix and incubate for 3 minutes at selected test temperature.
Substrate Reagent
100 µL
100 µL
Mix and determine ∆A405 nm/minute.
Photometer/Stopwatch: Read the distinction within 30 seconds and start the stopwatch at the
same time. Repeat the reading after exactly 60 and 120 seconds, calculate the respective ∆A/
minute by subtraction and then the mean value from both measured values.
Evaluation, Kinetic Method
The thrombin enzyme value (∆A/minuteTEV) and the reference measurement value, which is determined using a reference plasma with an assigned value for AT III (e.g. Standard Human Plasma) as
the sample, are used to calculate the laboratory internal factor FL:
Assigned value (% of the norm)reference plasma
FL = –––––––––––––––––––––––––––––––––––––
∆A/minuteTEV - ∆A/minutereference plasma
The AT III content of the sample in % of the norm can then be calculated from the following formula:
AT IIIsample (% of the norm) = FL x (∆A/minuteTEV - ∆A/minutesample)
Pipetting diagram for the two-point method
Thrombin enzyme value (TEV)
Sample
Isotonic saline solution
50 µL
Plasma dilution
50 µL
Thrombin Reagent
1000 µL
1000 µL
Mix and incubate for 3 minutes at the selected testing temperature.
Substrate Reagent
100 µL
100 µL
Mix immediately and start the stop watch simultaneously. After exactly 2 minutes, add:
Acetic acid 20%
500 µL
500 µL
Mix immediately and read the absorbance against air within 60 minutes.
Evaluation, two-point method
The thrombin enzyme value (A/minute TEV) and the reference measurement value, which is determined using a reference plasma with an assigned value for AT III (e.g. Standard Human Plasma) as
the sample, are used to calculate the laboratory internal factor FL:
Assigned value (% of the norm)reference plasma
FL = –––––––––––––––––––––––––––––––––––
ATEV - Areference plasma
The AT III content of the sample in % of the norm can then be calculated from the following formula:
AT IIIsample (% of the norm) = FL x (ATEV - Asample)
Comments
1. Doubling or halving the volumes has no effect on the calculation and the laboratory-internal factor.
2. For each series of measurements, but at the latest after 2 hours, the thrombin enzyme value
(∆A/minuteTEV) must be re-measured.
3. If the sample has an AT III content below 20% of the norm, it is recommended that the predilution
of the sample be prepared using half the volume of isotonic saline, e.g. 25 µL sample + 500 µL
isotonic NaCl, and then repeat the test. The result is then divided by 2.
4. The laboratory internal factor FL must be redetermined for each change in instruments and for
each new lot of Berichrom* Antithrombin III.
Automatic:
Special instructions for coagulation analyzers may be obtained from Dade Behring by request.
Internal Quality Control
Normal range:
Control Plasma N
Pathological range: Control Plasma P
Two controls should be measured at least every 8 hours during each day of testing (one in the normal
range and one in the pathological range). The controls should be treated like the samples. Each laboratory should determine its own quality control range, either by means of the target values and ranges
provided by the manufacturer of the controls or by means of control values determined in the laboratory.
If the measured control value lies outside of the pre-determined confidence range, then the reagents and
the coagulation analyzer should be checked and the laboratory-internal factor F L should be redetermined.
Limitations of the Procedure
There are appropriate coagulation analyzers for which Dade Behring provides operating instructions.
The use of Berichrom* Antithrombin III in other coagulation analyzers must be validated by the
testing laboratory. In doing so, performance data other than that provided may be obtained.
Hirudin interferes with the test since it inhibits thrombin like AT III.
Lipemic plasmas and plasmas with elevated concentrations of bilirubin and hemoglobin (hemolytic
plasmas) interfere with the two-point method. In these cases, a plasma blank must be included using
the following pipetting sequence: 1. 500 µL acetic acid; 2. 1100 µL isotonic saline; 3. 50 µL plasma
dilution. Afterwards mix, read the absorbance and subtract from the sample measurement value.
Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient’s medical history,
clinical presentation and other findings.
Reference Range
75 - 125% of the norm4
Systematic deviations from this range may be determined by the particular device. It may be necessary to calculate your own reference range in the laboratory.
Specific Performance Characteristics
Measuring range
The measuring range is from 0 to 140% of the norm.
Specificity
Interference from heparin cofactor II can be disregarded since bovine thrombin is used in the test5.
Precision and Reproducibility
For AT III values within the reference range, the coefficient of variation within the series lies between
2.8 and 4.4%, from day to day between 4.8 and 6.2%. For pathological values, the coefficient of
variation in the series is between 2.5 und 7.5%, and from day to day between 5.8 and 8.1%.
Method comparison
In a comparison of Berichrom* AT III (with manual dilution) with Berichrom* AT III (A) using the
Hitachi 717, 111 samples were determined in the range from 25 to150% % of the norm. The coefficient of correlation was 0.99 (y-axis intersect: - 3.7%; slope: 0.98).
Bibliography
1. Hathaway W E: Clinical Aspects or Antithrombin III Deficiency. Semin Hematol 1991; 28: 19 – 23.
2. Fareed J et al., Messmore HL, Walenga J, et al. Synthetic peptide substrates in hemostatic
testing. Crit Rev Clin Lab Sci 1983; 19: 71-134.
3. U.S. Department of Health and Human Services CDC, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, HHS Publication (CDC) 93-8395; 1999; Section II; 8-16
4. Frantzen Handeland G, Abildgaard U, Aasen A O: Simplified Assay for Antithrombin III Activity
Using Chromogenic Peptide Substrate. Scand. J. Haematol. 31 (1983) 427–436
5. Friberger P, Egberg N, Holmer E, Hellgren M, Blombäck M: Antithrombin Assay – The Use of
Human or Bovine Thrombin and the Observation of a ”Second” Heparin Cofactor. Thrombosis
Research 25 (1982) 433–436
* Berichrom is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in Germany and other
countries.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
USA Distributor:
Dade Behring Inc.
Newark, DE 19714 U.S.A.
Berichrom* Antithrombin III
Pipettierschema für die kinetische Methode
Thrombin-Enzymwert (TEW)
Probe
isotonische Kochsalzlösung
50 µl
Plasma-Verdünnung
50 µl
Thrombin-Reagenz
1000 µl
1000 µl
mischen und 3 Minuten bei der gewählten Testtemperatur inkubieren.
Substrat-Reagenz
100 µl
100 µl
mischen und ∆E 405 nm/Minute bestimmen.
Photometer/Stoppuhr: innerhalb von 30 sec die Extinktion ablesen und gleichzeitig die Stoppuhr
starten. Nach genau 60 und 120 sec Ablesung wiederholen, die jeweiligen ∆E/Minute durch Differenzbildung berechnen und aus beiden Meßwerten den Mittelwert bilden.
Reagenzien zur Bestimmung von Antithrombin III
Anwendungsbereich
Zur quantitativen Bestimmung von funktionell aktivem Antithrombin III (AT III) zur Unterstützung der
Diagnose und Überwachung von Thrombosen und verwandten Zuständen.
Diagnostische Bedeutung
Antithrombin III ist der plasmatische Inhibitor von Thrombin und aktiviertem Faktor X und bildet mit
diesen Enzymen irreversibel einen inaktiven Komplex. Die Inaktivierung der aktivierten Gerinnungsfaktoren wird durch Heparin massiv beschleunigt. Berichrom* Antithrombin III dient zur schnellen
Bestimmung des physiologisch aktiven Antithrombin III und erlaubt die Diagnose von erblichem und
erworbenem Antithrombin III-Mangel, der ein erhöhtes Thrombose-Risiko darstellt. Erworbene Antithrombin III-Mängel treten häufig infolge eines Verbrauchs nach großen Operationen oder infolge
disseminierter intravaskulärer Gerinnung (DIC) bei Sepsis, Nephrosen, Leberparenchymschäden
(Hepatitis, Drogenintoxikation, Alkoholismus) und östrogenhaltigen Kontrazeptiva1 auf. Der Test ermöglicht ein frühzeitiges Erkennen von Patienten mit erhöhtem Thrombose-Risiko2.
Prinzip der Methode
Das Antithrombin III der Probe wird durch Heparin in einen Sofort-Inhibitor überführt und inaktiviert
vorgelegtes Thrombin. Der Rest-Thrombin-Gehalt wird in einem kinetischen Test mit Extinktionszunahme bei 405 nm nach folgendem Reaktionsschema bestimmt:
Auswertung, kinetische Methode
Mit dem Thrombin-Enzymwert (∆E/Minute TEW) und dem Referenzmeßwert, der mit einem Bezugsplasma mit Sollwertangabe für AT III (z. B. Standard-Human-Plasma) als Probe bestimmt wird, wird
der laborinterne Faktor FL berechnet:
FL =
Der AT III-Gehalt der Probe in % der Norm ergibt sich dann nach folgender Formel:
AT III Probe (% d. N.) = FL x (∆E/Minute TEW - ∆E/Minute Probe)
Pipettierschema für die Zweipunkt-Methode
Thrombin-Enzymwert (TEW)
Probe
isotonische Kochsalzlösung
50 µl
Plasma-Verdünnung
50 µl
Thrombin-Reagenz
1000 µl
1000 µl
mischen und 3 Minuten bei der gewählten Testtemperatur inkubieren.
Substrat-Reagenz
100 µl
100 µl
sofort mischen und gleichzeitig die Stoppuhr starten. Nach genau 2 Minuten Zugabe von:
Essigsäure 20%
500 µl
500 µl
sofort mischen und die Extinktion innerhalb von 60 Minuten gegen Luft bestimmen.
Heparin
AT III Probe + Thrombin Überschuß ––––––> [AT III-Thrombin] + Thrombin Rest
Thrombinrest
Tos-Gly-Pro-Arg-ANBA-IPA ––––––––> Tos-Gly-Pro-Arg-OH + ANBA-IPA
Reagenzien
Inhalt der Handelspackung
Berichrom* Antithrombin III
Testkit, Bestell-Nr. OUBP mit
Auswertung, Zweipunkt-Methode
Mit dem Thrombin-Enzymwert (E/Minute TEW) und dem Referenzmeßwert, der mit einem Bezugsplasma mit Sollwertangabe für AT III (z. B. Standard-Human-Plasma) als Probe bestimmt wird, wird
der laborinterne Faktor FL berechnet:
6 x für 15 ml Thrombin-Reagenz
6 x für 2 ml Substrat-Reagenz
1 x 100 ml Pufferlösung
Zusammensetzung
Thrombin-Reagenz vom Rind, lyophilisiert; mit Zusatz von Heparin, Mannit (2 g/l), Natriumchlorid
(2 g/l) und Aprotinin
Substrat-Reagenz, lyophilisiert; Konzentration in der Gebrauchslösung:
Tosylglycyl-prolyl-arginyl-5-amino-2-nitrobenzoesäure-isopropylamid (Tos-Gly-Pro-Arg-ANBA-IPA,
2 mmol/l)
Pufferlösung: Tris (12 g/l), NaCl (9 g/l), pH 8,2
Konservierungsmittel: Natriumazid (< 1 g/l)
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung.
2. Beim Umgang mit natriumazidhaltigen In-vitro-Diagnostika ist zu beachten: Verschlucken und
Kontakt mit Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Natriumazid kann mit Schwermetallen, wie
Kupfer oder Blei, explosive Azide bilden.
3. Alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien sollten wegen nie auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden3.
Vorbereitung der Reagenzien
Thrombin-Reagenz: Mit der auf dem Etikett angegebenen Menge Pufferlösung lösen und vor Gebrauch 30 Minuten bei +15 bis +25 °C inkubieren.
Substrat-Reagenz: Inhalt der Flasche mit der auf dem Etikett angegebenen Menge dest. Wasser
lösen.
Reagenzien vor Gebrauch noch einmal vorsichtig mischen.
Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Der Testkit ist ungeöffnet bei +2 bis +8 °C zu lagern und bis zu dem auf dem Etikett angegebenen
Datum verwendbar.
Stabilität nach Rekonstitution:
Temperatur
+37 °C
+30 °C
+15 bis +25 °C
+2 bis +8 °C
-20 °C
Thrombin
8 Stunden
2 Tage
1 Woche
2 Wochen
3 Monate
Sollwert (% der Norm) Bezugsplasma
––––––––––––––––––––––––––––––
∆E/Minute TEW - ∆E/Minute Bezugsplasma
Substrat-Reagenz
1 Woche
2 Wochen
2 Wochen
6 Wochen
6 Monate
Thrombin kann in der Originalflasche bis zu 5 mal, das Substrat bis zu 10 mal eingefroren werden.
Die Pufferlösung ist nach erstmaligem Öffnen 6 Monate bei +2 bis +8 °C stabil.
Die verschiedenen Gerinnungsmeßgeräte haben individuelle Stabilitätsdaten.
Zusätzlich benötigte Materialien
Standard-Human-Plasma, Bestell-Nr. ORKL, AT III kalibriert am WHO Standard
Kontroll-Plasma N, Bestell-Nr. ORKE
Kontroll-Plasma P, Bestell-Nr. OUPZ
Essigsäure 20%ig (nur für die Zweipunkt-Methode)
Isotonische Kochsalzlösung
Gerinnungsmeßgerät (siehe Kapitel "Einschränkungen der Testdurchführung")
Untersuchungsmaterial
Zur Plasmagewinnung 1 Teil Natriumcitrat-Lösung (0,11 mol/l) mit 9 Teilen Venenblut sorgfältig unter
Vermeidung von Schaumbildung mischen. Sofort mindestens 10 Minuten bei mindestens 1.500 x g
zentrifugieren.
Stabilität der Probe:
-20 °C
1 Monat
+2 bis +8 °C
2 Tage
+15 bis +25 °C 6 Stunden
Bei -20 °C gelagerte Plasmen innerhalb von 10 Minuten bei +37 °C auftauen und die Bestimmung
dann innerhalb von 2 Stunden durchführen.
Testdurchführung
Berichrom* Antithrombin III kann an einer Vielzahl von Gerinnungsmeßgeräten verwendet werden.
Bedienungsanleitung des Geräteherstellers beachten!
Manuell:
1 Teil Patientenplasma mit 40 Teilen isotonischer Kochsalzlösung verdünnen (z. B. 25 µl Plasma
+ 1 ml isotonische Kochsalzlösung) und innerhalb von 45 Minuten (+15 bis +25 °C) zur Testung
verwenden.
Halbmikroansatz:
Küvette:
1 cm Schichtdicke
Wellenlänge:
405 nm
Testtemperatur:
wahlweise +25 °C, +30 °C oder +37 °C
Thrombin-Reagenz-Lösung, Substrat-Reagenz sowie die Kunststoffküvetten bzw. -röhrchen auf
die gewählte Testtemperatur vorwärmen.
Ausgabe Dezember 2003
OUBP G21 E0540 (68) CS
2
FL =
Sollwert (% der Norm) Bezugsplasma
–––––––––––––––––––––––––––
E TEW - E Bezugsplasma
Der AT III-Gehalt der Probe in % der Norm ergibt sich dann nach folgender Formel:
AT III Probe (% d. N.) = FL x (E TEW - E Probe)
Anmerkungen
1. Eine Volumenverdopplung oder -halbierung hat keine Auswirkung auf die Berechnung und den
laborinternen Faktor.
2. Für jede Meßserie, spätestens aber nach 2 Stunden, muß der Thrombin-Enzymwert (∆E/Minute TEW)
neu gemessen werden.
3. Bei einem AT III-Gehalt der Probe unter 20% der Norm empfiehlt es sich, die Vorverdünnung der
Probe mit dem halben Volumen isotonischer Kochsalzlösung durchzuführen, z. B. 25 µl Probe +
500 µl isotonische NaCl, um die Bestimmung zu wiederholen. Das Ergebnis wird durch 2 dividiert.
4. Bei jedem Gerätewechsel und für jede Charge Berichrom* Antithrombin III muß der laborinterne
Faktor FL neu bestimmt werden.
Automatisch:
Spezielle Vorschriften für Gerinnungsmeßgeräte sind von Dade Behring auf Anfrage erhältlich.
Interne Qualitätskontrolle
Normalbereich:
Kontroll-Plasma N
Pathologischer Bereich: Kontroll-Plasma P
Mindestens alle 8 Stunden an jedem Testtag sollten zwei Kontrollen (eine im Normalbereich und
eine im pathologischen Bereich) gemessen werden. Das Kontrollmaterial sollte wie die Probe behandelt werden. Jedes Labor sollte seinen Qualitätskontrollbereich entweder anhand der vom Hersteller der Kontrollen angegebenen Sollwerte und -bereiche oder anhand im Labor bestimmter Kontrollwerte festlegen. Liegt der gemessene Kontrollwert außerhalb des vorher festgelegten Vertrauensbereiches, sollten Reagenzien und Gerinnungsmeßgerät überprüft und der laborinterne Faktor
FL neu bestimmt werden.
Einschränkungen der Testdurchführung
Es sind Gerinnungsmeßgeräte geeignet, für die Dade Behring Anwendungsvorschriften bereitstellt.
Die Verwendung von Berichrom* Antithrombin III an anderen Gerinnungsmeßgeräten muß vom
Untersuchungslabor validiert werden. Dabei können andere als die angegebenen Leistungsdaten
erhalten werden.
Hirudin stört den Test, da es wie AT III Thrombin hemmt.
Lipämische Plasmen und Plasmen mit erhöhtem Bilirubin- und Hämoglobin-Gehalt (hämolytische
Plasmen) stören die Zweipunkt-Methode. In diesen Fällen muß ein Plasma-Leerwert mitgeführt
werden mit folgender Pipettierfolge: 1. 500 µl Essigsäure; 2. 1100 µl isotonische Kochsalzlösung; 3.
50 µl Plasmaverdünnung. Anschließend mischen, die Extinktion messen und vom Probenmeßwert
abziehen.
Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem klinischen Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden.
Referenzbereich
75 - 125% der Norm4
Systematische Abweichungen von diesem Bereich können gerätebedingt sein. Gegebenenfalls
muß ein eigener Referenzbereich durch das Labor erstellt werden.
Leistungsmerkmale des Tests
Meßbereich
Der Meßbereich reicht von 0 bis 140% der Norm.
Spezifität
Störungen durch Heparin-Kofaktor II sind zu vernachlässigen, da im Test Rinder-Thrombin eingesetzt wird5.
Präzision und Reproduzierbarkeit
Für AT III-Werte im Referenzbereich liegt der Variationskoeffizient in der Serie zwischen 2,8 und
4,4%, von Tag zu Tag zwischen 4,8 und 6,2%. Bei pathologischen Werten liegt der Variationskoeffizient in der Serie zwischen 2,5 und 7,5%, von Tag zu Tag zwischen 5,8 und 8,1%.
Methodenvergleich
Bei einem Vergleich von Berichrom* AT III (mit manueller Verdünnung) mit Berichrom* AT III (A) am
Hitachi 717 wurden 111 Proben im Bereich von 25 bis 150% der Norm bestimmt. Der Korrelationskoeffizient betrug 0,99 (y-Achsenabschnitt : - 3,7%; Steigung: 0,98).
Literatur
Siehe Seite 1.
*
Berichrom ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in Deutschland und
anderen Ländern.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
Berichrom* Antithrombine III
Schéma de pipetage pour la méthode cinétique
Valeur enzymatique de thrombine (VET)
Echantillon
Sérum physiologique
50 µl
Plasma dilué
50 µl
Réactif Thrombine
1000 µl
1000 µl
Mélanger et laisser incuber 3 min à la température choisie pour le test.
Réactif Substrat
100 µl
100 µl
Mélanger et déterminer ∆D.O.405 nm/min. Photomètre/chronomètre : lire la densité optique dans les
30 sec et déclencher simultanément le chronomètre. Après exactement 60 et 120 sec, faire une
deuxième puis une troisième lecture, calculer la ∆D.O./min entre chaque lecture par différence, puis
la valeur moyenne à partir des deux ∆D.O./min obtenues.
Réactifs pour le dosage de l’antithrombine III
Domaine d’utilisation
Pour le dosage quantitatif de l’activité fonctionnelle de l’antithrombine III comme aide au diagnostic et
pour la surveillance des thromboses et des états apparentés.
Intérêt diagnostique
L’antithrombine III est l’inhibiteur plasmatique de la thrombine et du facteur X activé, qui forme avec ces
enzymes un complexe inactif irréversible. L’inactivation des facteurs de la coagulation activés est fortement accélérée par l’héparine. Berichrom* Antithrombine III permet le dosage rapide de l’antithrombine
III physiologiquement active et permet de diagnostiquer les déficits en antithrombine III congénitaux et
acquis, qui constituent un risque de thrombose augmenté. Les déficits en antithrombine III acquis
apparaissent souvent suite à une consommation due à une intervention chirurgicale importante ou à
une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) en cas de septicémie, de néphrose, de lésions du
parenchyme hépatique (hépatite, intoxication par des drogues, alcoolisme) ou de prise de contraceptifs contenant des oestrogènes1. Le test permet un dépistage précoce des patients ayant un risque de
thrombose élevé2.
Principe de la méthode
L’antithrombine III présente dans l’échantillon est transformée par l’héparine en un inhibiteur immédiat
et inactive la thrombine prédistribuée. Le taux de thrombine résiduelle est déterminé selon un test
cinétique par l’augmentation de la densité optique à 405 nm selon le schéma réactionnel suivant :
Exploitation de la méthode cinétique
Calculer un facteur interne au laboratoire FL de la façon suivante, à partir de la valeur enzymatique de
thrombine (∆D.O./minVET) et de la valeur de référence obtenue à l’aide d’un plasma de référence dont
la valeur d’AT III est déclarée (par ex. le Plasma standard humain) :
Valeur théorique (% de la normale)plasma de référence
FL = –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
∆D.O./minVET - ∆D.O./min plasma de référence
La concentration en AT III de l’échantillon en % de la normale se calcule ensuite selon la formule
suivante :
AT IIIéchantillon (% de la normale) = FL x (∆D.O./minVET - ∆D.O./min échantillon)
Schéma de pipetage pour la méthode en deux temps
Valeur enzymatique de thrombine (VET)
Echantillon
Sérum physiologique
50 µl
Plasma dilué
50 µl
Réactif Thrombine
1000 µl
1000 µl
Mélanger et laisser incuber 3 min à la température choisie pour le test.
Réactif Substrat
100 µl
100 µl
Mélanger aussitôt et déclencher immédiatement le chronomètre. Après exactement 2 min, ajouter :
Acide acétique à 20%
500 µl
500 µl
Mélanger aussitôt, puis lire la densité optique dans les 60 min contre l’air.
héparine
AT IIIéchantillon + thrombineexcès –––––––––––––––––––> [AT III-thrombine] + thrombinerésiduelle
thrombinerésiduelle
Tos-Gly-Pro-Arg-ANBA-IPA –––––––––––––––––––––> Tos-Gly-Pro-Arg-OH + ANBA-IPA
Réactifs
Contenu du coffret
Berichrom* Antithrombine III
Coffret, code OUBP, contenant
Exploitation de la méthode en deux points
Calculer un facteur interne au laboratoire FL de la façon suivante, à partir de la valeur enzymatique de
thrombine (D.O./minVET) et de la valeur de référence obtenue à l’aide d’un plasma de référence dont la
valeur d’AT III est déclarée (par ex. le Plasma standard humain) :
6 x pour 15 ml de Réactif Thrombine
6 x pour 2 ml de Réactif Substrat
1 x 100 ml de Solution tampon
Composition
Réactif Thrombine, d’origine bovine, lyophilisé, additionné d’héparine, de mannite (2 g/l), de chlorure
de sodium (2 g/l) et d’aprotinine
Réactif Substrat, lyophilisé : concentration de la solution d’emploi : Tosylglycyl-prolyl-arginyl-5-amino2-acide nitrobenzoïque-isopropylamide (Tos-Gly-Pro-Arg-ANBA-IPA, 2 mmol/l)
Solution tampon : Tris (12 g/l), NaCl (9 g/l), pH 8,2
Conservateur :
azide de sodium (< 1 g/l)
Mises en garde et précautions d’emploi
1. Réservé à un usage de diagnostic in vitro.
2. Les réactifs in vitro contenant de l’azide de sodium doivent être manipulés avec précautionº: ne pas
avaler et éviter tout contact avec la peau ou les muqueuses. L’azide de sodium peut devenir explosif au contact de métaux lourds comme le cuivre ou le plomb.
3. Toute préparation obtenue à partir de tissu ou de liquide d’origine humaine doit être manipulée
avec les précautions nécessaires en cas de risque biologique, dans la mesure où l’on ne peut
exclure totalement un risque d’infection3.
Préparation des réactifs
Réactif Thrombine : le reconstituer avec le volume de Solution tampon indiqué sur l’étiquette et laisser
incuber 30 min à +15/+25 °C avant emploi.
Réactif Substrat : reconstituer le contenu du flacon avec le volume d’eau distillée indiqué sur l’étiquette.
Agiter de nouveau les réactifs avec précaution avant emploi.
Stabilité et conditions de conservation
Le coffret non ouvert et conservé à +2/+8 °C peut être utilisé jusqu’à la date de péremption indiquée sur
l’étiquette.
Stabilité après reconstitution :
Température
+37 °C
+30 °C
+15 °C/+25 °C
+2/+8 °C
-20 °C
Thrombine
8 heures
2 jours
1 semaine
2 semaines
3 mois
Réactif Substrat
1 semaine
2 semaines
2 semaines
6 semaines
6 mois
Valeur théorique (% de la normale)plasma de référence
FL = –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
D.O.VET - D.O. plasma de référence
La concentration en AT III de l’échantillon en % de la normale se calcule ensuite selon la formule
suivante :
AT IIIéchantillon (% de la normale) = FL x (D.O.VET - D.O. plasma de référence)
Remarques
1. La multiplication ou la division par deux des prises d’essai n’a pas d’influence sur l’exploitation des
résultats ni sur le facteur interne au laboratoire.
2. A chaque nouvelle série de mesures, et au plus tard toutes les 2 heures, recalculer une nouvelle
valeur enzymatique de thrombine (∆D.O./minuteVET).
3. Pour une concentration d’AT III inférieure à 20% de la normale, il est recommandé d’effectuer la
prédilution de l’échantillon avec la moitié du volume de sérum physiologique, par ex. 25 µl
d’échantillon + 500 µl de NaCl isotonique, et de recommencer le dosage. Diviser alors le résultat
par 2.
4. Déterminer un nouveau facteur interne au laboratoire FL et une nouvelle courbe d’étalonnage à
chaque changement d’appareil ou de lot de Berichrom* Antithrombine III.
Méthode automatique :
Les adaptations spécifiques aux différents appareils de coagulation sont envoyées sur demande par
Dade Behring.
Contrôle de qualité interne
Domaine normal :
Plasma de contrôle N
Domaine thérapeutique : Plasma de contrôle P
Introduire deux contrôles (un dans le domaine normal et un dans le domaine thérapeutique) au moins
toutes les 8 heures sur une journée de travail. Traiter les contrôles comme des échantillons de patients.
Chaque laboratoire doit déterminer son propre domaine de contrôle de qualité, soit à partir des valeurs
théoriques et des domaines de confiance indiqués par le fabricant des contrôles utilisés, soit à partir
d’un domaine de confiance établi dans le laboratoire. Si la valeur du contrôle obtenue sort du domaine
de confiance préalablement déterminé, vérifier les réactifs et l’appareil de coagulation utilisé, et calculer un nouveau facteur FL interne au laboratoire.
Limites du test
La Thrombine peut être congelée jusqu’à 5 fois dans son flacon original, le Substrat jusqu’à 10 fois.
Après ouverture, la Solution tampon reste stable 6 mois à +2/+8 °C.
Les différents appareils de coagulation ont leurs données de stabilité spécifiques.
Matériel et autres réactifs nécessaires
Plasma standard humain, code ORKL, étalonné en AT III d’après le standard OMS
Plasma de contrôle N, code ORKE
Plasma de contrôle P, code OUPZ
Acide acétique à 20% (uniquement pour la méthode en deux points)
Sérum physiologique
Appareil de coagulation (cf. paragraphe « Limites de réalisation du test »)
Echantillons á tester
Pour obtenir les plasmas, prélever 1 volume de solution de citrate de sodium (0,11 mol/l) avec 9 volumes de sang veineux, et mélanger avec précaution en évitant la formation de mousse. Centrifuger
aussitôt pendant 10 min à au moins 1500 x g.
Stabilité de l’échantillon :
-20 °C
1 mois
+2/+8 °C
2 jours
+15/+25 °C
6 heures
Si on utilise des plasmas congelés à -20 °C, les décongeler en 10 min maximum à +37 °C, et les tester
ensuite dans les 2 heures qui suivent.
Réalisation du test
Berichrom* Antithrombine III peut être utilisé sur un grand nombre d’appareils de coagulation. Respecter les instructions de l’appareil utilisé !
Méthode manuelle
Diluer 1 volume de plasma de patient avec 40 volumes de sérum physiologique (par ex. 25 µl de
plasma + 1 ml de sérum physiologique) et effectuer le test dans les 45 minutes (à +15/+25 °C).
Semi-micro-test :
Cuve :
1 cm de trajet optique
Longueur d’onde :
405 nm
Température du test :
au choix +25 °C, +30 °C ou +37 °C
Préchauffer le Réactif Thrombine reconstitué, le Réactif Substrat ainsi que les cuvettes ou les tubes en
plastique à la température choisie pour le test.
Dade Behring propose des protocoles d’adaptation pour les appareils de coagulation adaptés à la
réalisation du test. Si un laboratoire utilise Berichrom* Antithrombine III sur un autre appareil, il devra le
valider lui-même. Il pourra alors obtenir des valeurs différentes de celles indiquées comme caractéristiques du test.
L’anticoagulant Hirudin perturbe le test dans la mesure où, comme l’AT III, il inhibe la thrombine.
Les plasmas lipémiques et ceux contenant un taux élevé de bilirubine et d’hémoglobine (plasmas
hémolytiques) perturbent la méthode en deux points. Dans ces cas-là, introduire un blanc-plasma
selon le schéma de pipetage suivant : 1. 500 µl d’acide acétique, 2. 1100 µl de sérum physiologique, 3.
50 µl de plasma dilué. Mélanger, mesurer la densité optique, puis déduire le blanc-plasma.
Les résultats de ce test doivent toujours être interprétés en liaison avec l’histoire du patient, son tableau clinique et les résultats des autres analyses.
Domaine de référence
75 - 125% de la normale4
Des déviations systématiques par rapport à ce domaine peuvent être dues à l’appareil utilisé. Dans ce
cas-là, le laboratoire devra éventuellement déterminer son propre domaine de référence.
Caractéristiques du test
Domaine de mesure
Le domaine de mesure s’étend de 0 à 140% de la normale.
Spécificité
Les perturbations dues au cofacteur II de l’héparine sont négligeables dans la mesure où le test contient de la thrombine bovine5.
Précision et reproductibilité
Pour les valeurs d’AT III dans le domaine de référence, le coefficient de variation de répétabilité est
compris entre 2,8 et 4,4%, et le coefficient de variation de reproductibilité entre 4,8 et 6,2%. Pour les
valeurs thérapeutiques, le coefficient de variation de répétabilité est compris entre 2,5 et 7,5%, et le
coefficient de variation de reproductibilité entre 5,8 et 8,1%.
Comparaison avec une autre méthode
Une étude comparative portant sur 111 échantillons couvrant un domaine de 25 à 150% de la normale a
été effectuée sur un Hitachi 717, en les testant avec Berichrom* AT III (dilution manuelle) et Berichrom* AT
III (A). Le coefficient de corrélation a été trouvé à 0,99 (intersection de l’axe des y : -3,7% ; pente : 0,98).
Littérature
Cf. page 1.
*
OUBP G21 E0540 (68) CS
3
Edition Décembre 2003
Berichrom est une marque déposée de Dade Behring Marburg GmbH en Allemagne et dans
d’autres pays.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
Berichrom* Antitrombina III
Schema di dispensazione per il metodo cinetico
Valore enzimatico Trombina
Campione
Soluzione salina isotonica
50 µL
Plasma diluito
50 µL
Reagente Trombina
1000 µL
1000 µL
Mescolare ed incubare per 3 minuti alla temperatura prescelta.
Reagente Substrato
100 µL
100 µL
Mescolare e determinare ∆A405nm/minuto.Fotometro/Cronometro: Leggere l’estinzione entro 30
secondi e contemporaneamente avviare il cronometro. Ripetere la lettura esattamente dopo 60 e
120 secondi, calcolare il rispettivo ∆A/minuto per sottrazione e infine il valore medio per entrambi
i valori misurati.
Reagenti per la determinazione dell’Antitrombina III
Settore d'impiego
Per le determinazione quantitativa dell’antitrombina III funzionalmente attiva (AT III) come contributo alla diagnosi ed al monitoraggio della trombosi e delle condizioni correlate.
Riassunto e Spiegazione
L’Antitrombina III è l’inibitore plasmatico della trombina e del fattore X attivato e forma con tali
enzimi complessi inattivi irreversibili. L’inattivazione dei fattori attivati della coagulazione è fortemente accelerata dall’eparina. Berichrom* Antitrombina III contribuisce alla determinazione rapida
dell’antitrombina III fisiologicamente attiva e consente la diagnosi delle carenze di antitrombina III
ereditarie ed acquisite, che rappresentano un aumentato rischio di trombosi. Le carenze di antitrombina III acquisite spesso si verificano come risultato del consumo a seguito di importanti interventi
chirurgici o di coagulazione intravascolare disseminata (CID) associata con sepsi, nefrosi, danno
epatico parenchimale (epatite, intossicazione da farmaci, alcolismo) e assunzione di contraccettivi
contenenti estrogeni1. Il test consente la rilevazione precoce dei pazienti ad aumentato rischio di
trombosi2.
Valutazione, Metodo Cinetico
Il Valore Enzimatico Trombina (∆A/minutoTEV) ed il valore di riferimento, che viene determinato
utilizzando un plasma di riferimento con valore di AT III dichiarato (es.: Standard Human Plasma)
come campione, vengono utilizzati per calcolare il fattore interno di laboratorio FL:
Principio del Metodo
Schema di dispensazione per metodo a due punti
Valore assegnato (% della norma)plasma di riferimento
FL = –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
∆A/minutoTEV – A/minutoplasma di riferimento
Il contenuto di AT III del campione in % della norma può essere calcolato dalla seguente formula:
AT IIIcampione (% della norma) = FL x (∆A/minutoTEV - A/minutocampione)
L’antitrombina III del campione viene convertita dall’eparina in un inibitore immediato e inattiva la
trombina presente. La trombina residua viene quantificata in un test cinetico che misura l’aumento
di assorbanza a 405 nm secondo il seguente schema di reazione:
Valore enzimatico Trombina (TEV)
Campione
Soluzione salina isotonica
50 µL
Plasma diluito
50 µL
Reagente Trombina
1000 µL
1000 µL
Miscelare ed incubare per 3 minuti alla temperatura prescelta.
Reagente Substrato
100 µL
100 µL
Mescolare immediatamente ed avviare in contemporanea il cronometro. Dopo 2 minuti esatti,
aggiungere:
Acido acetico 20%
500 µL
500 µL
Mescolare immediatamente e leggere l’assorbanza contro aria entro 60 minuti.
Eparina
AT IIIcampione + Trombinaeccesso –––––––––––––> [AT III-Trombina] + Trombinaresidua
trombina residua
Tos-Gly-Pro-Arg-ANBA-IPA –––––––––––––––––> Tos-Gly-Pro-Arg-OH + ANBA-IPA
Reagenti
Materiali forniti
Berichrom* Antitrombina III, Kit, Codice OUBP con
Valutazione, metodo a due punti
Il Valore Enzimatico Trombina (A/minutoTEV) ed il valore di riferimento, che viene determinato utilizzando un plasma di riferimento con valore di AT III dichiarato (es.: Standard Human Plasma) come
campione, vengono utilizzati per calcolare il fattore interno di laboratorio FL:
6 x per 15 mL Reagente Trombina
6 x per 2 mL Reagente Substrato
1 x 100 mL Soluzione Tampone
Composizione
Reagente Trombina bovina, liofilizzato; contiene eparina mannitolo (2 g/L), cloruro di sodio (2 g/L)
e aprotinina come additivi
Reagente Substrato, liofilizzato; concentrazione nella soluzione d’uso: Tosylglycyl-prolyl-arginyl5-amino-2-nitrobenzoic acid isopropylamide (Tos-Gly-Pro-Arg-ANBA-IPA, 2 mmol/L)
Soluzione Tampone: Tris (12 g/L), NaCl (9 g/L), pH 8.2
Conservante: sodio azide (< 1 g/L)
Avvertenze e Precauzioni
1. Solo per uso diagnostico in vitro.
2. I reagenti contenenti sodio azide devono essere manipolati con la dovuta cautela. Non ingerire
o permetterne il contatto con la pelle o le membrane mucose. La sodio azide può formare azidi
esplosive a contatto con metalli pesanti quali rame o piombo.
3. Poiché l’assenza di agenti infettivi non può essere dimostrata, tutti i materiali ottenuti da sangue
umano devono essere maneggiati con la debita cura, osservando le precauzioni raccomandate
per i materiali a rischio biologico3.
Preparazione dei Reagenti
Reagente Trombina: Ricostituire con la quantità di soluzione tampone indicata sull’etichetta ed incubare per 30 minuti a +15 - +25 °C prima dell’uso.
Reagente Substrato: Sciogliere il contenuto del flacone con la quantità di acqua distillata indicata
sull’etichetta.
Mescolare con cura i reagenti ancora una volta prima dell’uso.
Conservazione e Stabilità
Il kit può essere utilizzato fino alla data indicata sull’etichetta se conservato ben chiuso a +2 - +8 °C.
Stabilità dopo ricostituzione:
Temperatura
+37 °C
+30 °C
+15 - +25 °C
+2 - +8 °C
-20 °C
Trombina
8 ore
2 giorni
1 settimana
2 settimane
3 mesi
Reagente Substrato
1 settimana
2 settimane
2 settimane
6 settimane
6 mesi
Valore assegnato (% della norma)plasma di riferimento
FL = –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
ATEV - Aplasma di riferimento
Il contenuto di AT III del campione in % della norma può essere calcolato dalla seguente formula:
AT IIIcampione (% della norma) = FL x (ATEV - Acampione)
Commenti
1. Raddoppiare o dimezzare i volumi non influenza il calcolo del fattore interno di laboratorio.
2. Per ogni serie di letture, ma almeno ogni 2 ore, il Valore Enzimatico Trombina (A/minutoTEV)
deve essere rimisurato.
3. Se il campione ha un contenuto di AT III inferiore al 20% della norma, si raccomanda di preparare la prediluizione del campione con metà volume di salina isotonica, es. 25 µL di campione +
500 µL di NaCl isotonica, quindi ripetere il test. Il risultato viene poi diviso per 2.
4. Il fattore interno di laboratorio FL deve essere rideterminato per ogni cambiamento di strumentazione e per ogni nuovo lotto di Berichrom* Antitrombina III.
Automatica:
Istruzioni apposite per analizzatori per coagulazione sono disponibili a richiesta da Dade Behring.
Controllo di Qualità Interno
Intervallo normale: Control Plasma N
Intervallo patologico: Control Plasma P
Due controlli (uno per l’intervallo normale ed uno per l’intervallo patologico) dovrebbero essere
analizzati ogni 8 ore per ogni giorno di utilizzo. I controlli devono essere trattati come i campioni.
Ogni laboratorio dovrebbe definire il proprio intervallo di controllo di qualità, mediante i valori medi e
gli intervalli dichiarati dal produttore dei controlli oppure tramite i valori di controllo determinati dal
laboratorio. Se il valore del controllo si posiziona al di fuori dell’intervallo di accettabilità predefinito,
occorre verificare i reagenti e l’analizzatore e rideterminare il fattore interno di laboratorio FL.
Limitazioni della esecuzione del test
La trombina nel flacone originale può essere congelata fino a 5 volte, il substrato fino a 10 volte.
La soluzione tampone è stabile per 6 mesi dopo la prima apertura se conservata a +2 - +8 °C.
Analizzatori per coagulazione diversi hanno dati di stabilità individuali.
Altri materiali richiesti, ma non forniti
Standard Human Plasma, Codice ORKL, AT III calibrata secondo lo standard OMS
Control Plasma N, Codice ORKE
Control Plasma P, Codice OUPZ
Acido acetico 20% (solo per il metodo a due punti)
soluzione salina isotonica
Analizzatore per coagulazione (vedere la sezione "Limitazioni della esecuzione del test")
Dade Behring dispone delle istruzioni operative per svariati analizzatori per coagulazione. L’utilizzo
di Berichrom* Antitrombina III su altri analizzatori per coagulazione deve essere validato dal laboratorio. In questo modo, è possibile che i dati ottenuti differiscano da quelli dichiarati.
L’Irudina interferisce con il test perché inibisce la trombina come l’AT III.
I plasmi lipemici ed i plasmi ad elevata concentrazione di bilirubina ed emoglobina (plasmi emolizzati) interferiscono con il metodo a due punti. In questi casi, bisognerebbe utilizzare anche un
bianco del plasma secondo il seguente schema di dispensazione: 1. 500 µL acido acetico; 2. 1100
µL salina isotonica; 3. 50 µL plasma diluito. Mescolare, leggere l’assorbanza e sottrarne il valore
dalla misurazione del campione.
I risultati di questo test dovrebbero sempre essere valutati insieme all’anamnesi del paziente, al
quadro clinico e ad altri reperti.
Intervallo di Riferimento
75 - 125% della norma4
Deviazioni sistematiche da questo intervallo possono essere causate dalla particolare strumentazione. Può essere necessario calcolare l’intervallo di riferimento specifico del laboratorio.
Campioni in esame
Caratteristiche del test
Per ottenere il plasma, miscelare con cura 1 parte di soluzione di sodio citrato (0.11 mol/L) con 9
parti di sangue venoso, evitando la formazione di schiuma. Centrifugare immediatamente a non
meno di 1,500 x g per almeno 10 minuti.
Stabilità del campione:
-20 °C
1 mese
+2 - +8 °C
2 giorni
+15 - +25 °C
6 ore
Il plasma conservato a -20 °C deve essere riscaldato per 10 minuti a +37 °C, quindi il test deve
essere eseguito entro 2 ore.
Intervallo di Misurazione
L’intervallo di misurazione è compreso tra 0 e 140% della norma.
Esecuzione del test
Berichrom* Antitrombina III può essere utilizzato su una varietà di analizzatori per coagulazione.
Osservare le istruzioni operative del produttore dell’analizzatore!
Manuale:
Diluire1 parte di plasma del paziente con 40 parti di salina isotonica (es. 25 µL di plasma + 1 mL di
soluzione salina isotonica) e utilizzare per l’analisi entro 45 minuti (+15 - +25 °C).
Test semimicro:
Cuvetta:
1 cm percorso ottico
Lunghezza d’onda:
405 nm
Temperatura di esecuzione: a scelta +25 °C, +30 °C oppure +37 °C
Preriscaldare la soluzione di Reagente Trombina, il Reagente Substrato ed anche le cuvette di
plastica o le provette alla temperatura operativa prescelta.
OUBP G21 E0540 (68) CS
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Edizione Dicembre 2003
Specificità
L’interferenza da parte del cofattore II dell’eparina può essere trascurata perché nel test si utilizza
trombina bovina5.
Precisione e Riproducibilità
Per valori di AT III compresi nell’intervallo di riferimento, il coefficiente di variazione entro la serie
varia da 2.8 a 4.4%, per day-to-day tra 4.8 e 6.2%. Per i valori patologici, il coefficiente di variazione
nella serie varia tra 2.5 e 7.5%, e per day-to-day tra 5.8 e 8.1%.
Confronto di Metodi
Confrontando Berichrom* AT III (con diluizione manuale) con Berichrom* AT III (A) utilizzando un
Hitachi 717, sono stati analizzati 111 campioni nell’intervallo compreso tra 25 e 150% della norma.
Il coefficiente di correlazione è risultato pari a 0.99 (intercetta asse y: - 3.7%; slope: 0.98).
Bibliografia
Vedi pagina 1
*
Berichrom è un marchio registrato di Dade Behring Marburg GmbH in Germania ed altri Paesi.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
Berichrom* Antitrombina III
Esquema de pipeteo para el método cinético
Valor enzimático de trombina (VET)
Muestra
Solución salina isotónica
50 µl
Dilución de plasma
50 µl
Reactivo de trombina
1000 µl
1000 µl
Mezclar e incubar 3 minutos a la temperatura escogida para el test.
Reactivo substrato
100 µl
100 µl
Mezclar y determinar ∆E405/minFotómetro/cronómetro: Leer la extinción en el término de 30 s y
accionar simultáneamente el cronómetro. Repetir la medida exáctamente después de 60 y 120 s.
Determinar por diferencia el correspondiente ∆E/min. y calcular el valor promedio de ambas
determinaciones.
Reactivos para la determinación de Antitrombina III
Campos de aplicación
Determinación cuantitativa de la actividad funcional de la antitrombina III (AT III) como ayuda en la
diagnosis y el monitoreo de trombosis y de estados relacionados.
Significado diagnóstico
La antitrombina III es un inhibidor plasmático de trombina y del factor X activado, y forma con estas
enzimas un complejo inactivo irreversible. La inactivación de los factores activos de la coagulación
se puede acelerar masivamente por medio de heparina. Berichrom* Antitrombina III sirve para una
determinación rápida de la actividad fisiológica de la antitrombina III y permite diagnosticar deficiencias congénitas y adquiridas de antitrombina III, que implican un riesgo aumentado de trombosis.
Deficiencias adquiridas de antitrombina III se presentan frecuentemente como consecuencia de un
consumo elevado después de grandes operaciones o como consecuencia de una coagulación
intravascular diseminada (CID) en septicemias, nefrosis, detrimento del parénquima hepático (hepatitis, intoxicación por drogas, alcoholismo), y por el empleo de anticonceptivos que contienen
estrógeno1. El test facilita el reconocimiento prematuro de pacientes con riesgo elevado de trombosis2.
Principio del método
Valoración, método cinético
Con el valor enzimático de trombina (∆E/minVET) y el valor de referencia, el cual se mide usando un
plasma de referencia como muestra (p. ej. plasma humano estándar), con valor teórico ya determinado para AT III, se cálcula el factor interno del laboratorio FL:
Valor teórico (% del valor normal)plasma de referencia
FL = –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
∆E/minVET - ∆E/min.plasma de referencia
El contenido de AT III de las muestras en % del valor normal se obtiene con la siguiente fórmula:
AT III muestra (% del valor normal) = FL x (∆E/minutoVET - ∆E/minutomuestra )
Esquema de pipeteo para el método de dos puntos
La antitrombina III de la muestra, en presencia de heparina, se convierte en un inhibidor inmediato
e inactiva la trombina agregada. El contenido residual de trombina se determina por un test cinético
midiendo el aumento de la extinción a 405 nm según el siguiente esquema de reacción:
Valor enzimático de trombina (VET)
Muestra
Solución salina isotónica
50 µl
Dilución de plasma
50 µl
Reactivo de trombina
1000 µl
1000 µl
Mezclar e incubar en 3 min. a la temperatura elegida para el test.
Reactivo substrato
100 µl
100 µl
Mezclar de inmediato y accionar simultáneamente el cronómetro. Después de exactamente
2 min. agregar:
Ácido acético al 20%
500 µl
500 µl
Mezclar de inmediato y en el plazo de 60 min. determinar la extinción de las muestras contra aire.
heparina
AT IIImuestra + trombinaexceso –––––––––––––––––> (AT III-trombina) + trombinaresidual
trombina residuall
tos-gli-pro-arg-ANBA-IPA –––––––––––––––––––> tos-gli-pro-arg-OH + ANBA-IPA
Reactivos
Contenido del envase comercial
Berichrom* Antitrombina III
Testkit, N˚ de pedido OUBP con
6 x para 15 ml de Reactivo de trombina
2 x para 2 ml de Reactivo substrato
1 x 100 ml de Solución tampón
Composición
Reactivo de trombina bovina, liofilizada; contiene además heparina, manitol (2 g/l), cloruro de
sodio (2 g/l) y aprotinina
Reactivo substrato, liofilizado; concentración en la solución lista para el uso:
Tosil-glicil-prolil-arginil-5-amino-2-ácido nitrobenzoico-isopropilamida (tos-gli-pro-arg-ANBA-IPA, 2
mmol/l)
Solución tampón: Tris (12 g/l), NaCl (9 g/l), pH 8,2
Medio de conservación: azida de sodio (<1 g/l)
Advertencias y medidas de seguridad
1. Sólo para ser utilizado en diagnósticos in vitro.
2. En el manejo de diagnósticos in vitro que contengan azida sódica debe observarse la siguiente
regla: No ingerir y evitar contacto con la piel y mucosas. La azida sódica puede formar azidas
explosivas con metales pesados como cobre y plomo.
3. Todos los materiales obtenidos a partir de sangre humana deben ser manipulados con las
precauciones necesarias, siguiendo las medidas de seguridad recomendadas en el caso de
riesgo biológico, puesto que nunca se puede excluir completamente la existencia de agentes
patógenos3.
Preparación de reactivos
Reactivo de trombina: Disolver con la cantidad de solución tampón indicada en la etiqueta y, antes
de usarla, incubar durante 30 min. entre +15 y +25 °C.
Reactivo substrato: Disolver el contenido del frasco con la cantidad de agua destilada indicada en
a etiqueta. Mezclar cuidadosamente los reactivos, una vez más, antes de usarlos.
Estabilidad y almacenaje
El testkit, sin abrir, conservado entre +2 y +8 °C, se puede utilizar hasta la fecha de vencimiento
dada en la etiqueta.
Estabilidad después de la reconstitución:
Temperatura
+37 °C
+30 °C
entre +15 y +25 °C
entre +2 y +8 °C
-20 °C
Trombina
8 horas
2 días
1 semana
2 semanas
3 meses
Reactivo substrato
1 semana
2 semanas
2 semanas
6 semanas
6 meses
Conservados en sus envases originales, la trombina puede ser congelada hasta 5 veces y el reactivo substrato hasta 10 veces.
La solución tampón, una vez abierto el frasco, es estable durante 6 meses entre +2 y +8 °C.
Los diferentes aparatos de medida de la coagulación tienen datos de estabilidad individuales.
Reactivos adicionales necesarios
Plasma humano estándar, N˚ de pedido ORKL, AT III calibrado con el estándar de la OMS
Plasma de control N, N˚ de pedido ORKE
Plasma de control P, N˚ de pedido OUPZ
Ácido acetíco al 20% (sólo para el método de los dos puntos)
Solución salina isotónica
Aparatos de medida de la coagulación (ver capítulo "Limitaciones del procedimiento")
Material a investigar
Para obtener el plasma, mezclar cuidadosamente 1 parte de solución de citrato de sodio (0,11 mol/
ml) con 9 partes de sangre venosa, evitando la formación de espuma. Centrifugar a continuación
durante 10 min. por lo menos a 1500 x g.
Estabilidad de la muestra:
-20 °C
1 mes
entre +2 y +8 °C
2 días
6 horas
entre +15 y +25 °C
Las muestras almacenadas a -20 °C se deben descongelar en máximo 10 min. a +37 °C y se deben
medir dentro de las 2 horas siguientes.
Procedimiento
El Berichrom* Antitrombina III puede ser utilizado en un gran número de aparatos de medida de la
coagulación. ¡Siga las condiciones de manejo dadas por el fabricante!.
Manual:
Diluir 1 parte de plasma de paciente con 40 partes de solución isotónica de cloruro de sodio (p. ej.
25 µl de plasma + 1 ml de solución isotónica de cloruro de sodio), y analizarlo en el transcurso de
los 45 min siguientes (entre +15 y +25 °C).
Semimicro determinación:
Cubeta:
trayectoria óptica de 1 cm
Longitud de onda: 405 nm
Temperatura:
a elección entre +25 °C, +30 °C o +37 °C
La solución del reactivo de trombina, el reactivo substrato, así como, las cubetas o tubos plásticos
se deben calentar previamente a la temperatura elegida.
OUBP G21 E0540 (68) CS
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Edición Diciembre 2003
Valoración, método de dos puntos
Con el valor enzimático de trombina (E/minutoVET) y el valor de referencia, el cual se mide usando
un plasma de referencia como muestra (p. ej. plasma humano estándar), con valor teórico ya determinado para AT III, se cálcula el factor interno del laboratorio FL:
Valor teórico (% del valor normal) plasma de referencia
FL = ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
EVET - Eplasma de referencia
El contenido de AT III de las muestras en % del valor normal se obtiene con la siguiente fórmula:
AT IIImuestra (% del valor normal) = FL x (EVET - Emuestra )
Notas
1. La duplicación o la división del volumen utilizado en la prueba no ejercen ninguna influencia en
los cálculos ni sobre el factor interno de laboratorio.
2. Para cada serie de medidas se debe medir un nuevo valor enzimático de trombina (E/minutoVET) a más tardar después de 2 horas.
3. Para un contenido de AT III en la muestra menor al 20%, se recomienda efectuar una predilución de la muestra con la mitad de la solución salina isotónica, p. ej. 25 µl de muestra + 500 µl
de solución isotónica de NaCl, y repetir la determinación. El resultado se divide por 2.
4. Para cada cambio de aparato y para cada cambio de lote de Berichrom* Antitrombina III, se
debe determinar nuevamente el factor interno del laboratorio FL o la curva de referencia.
Automático:
Instrucciones especiales para los aparatos de medida de la coagulación se pueden pedir a Dade
Behring.
Control de calidad interno
Rango normal:
Plasma de control N
Rango patológico: Plasma de control P
Por lo menos cada 8 horas, cada día de trabajo, se deben medir dos controles (uno en el rango
normal y uno en el rango patológico). Los controles deben tratarse como las muestras. Cada laboratorio debe establecer un rango de control de calidad propio ya sea basados en los valores teórico
y rangos dados por el fabricante o en el rango de confianza determinado en el laboratorio. Si el
valor medido del control se encuentra por fuera del rango de confianza establecido, se deben
comprobar los reactivos y el aparato de medida de la coagulación y se debe medir de nuevo el
factor interno del laboratorio FL.
Limitaciones del procedimiento
Existen aparatos de medida de la coagulación, para los cuales se pueden obtener en Dade Behring
las etapas de uso. El uso del Berichrom* Antitrombina III en otros aparatos debe ser validado por el
laboratorio investigador. En este caso, se pueden presentar otros datos diferentes para las características del test.
La hirudina altera el resultado del test, ya que al igual, que la AT III también inhibe la trombina.
Plasmas lipémicos y plasmas con valores altos de bilirrubina y hemoglobina (plasmas hemolíticos)
perturban el método de dos puntos. En estos casos hay que examinar también un plasma testigo
siguiendo el esquema dado a continuación:
1. 500 µl de ácido acético; 2. 1100 µl de solución isotónica de cloruro de sodio; 3. 50 µl de plasma
diluido. Finalmente mezclar, medir la extinción y restarla del valor medido en la muestra.
Los resultados de este test se deben interpretar siempre junto con la historia previa del paciente, el
cuadro clínico y los resultados de otras investigaciones.
Rangos de referencia
75 - 125% del valor normal4
Desviaciones sistemáticas de este valor pueden ser ocasionadas por el aparato. En caso dado
deberá cada laboratorio establecer su propio rango de referencia.
Características del test
Rango de medida
El rango de medida va de 0 hasta 140% del valor normal.
Especificidad
Alteraciones ocasionadas por el cofactor II de la heparina se pueden descartar, ya que para el test
se utiliza trombina bovina5.
Precisión y reproducibilidad
Para los valores de AT III en el rango de referencia el coeficiente de variación de la serie está entre
2,8 y 4,4%, y para las medidas de un día a otro entre 4,8 y 6,2%. Para los valores patológicos el
coeficiente de variación de la serie está entre 2,5 y 7,5%, y el de un día a otro entre 5,8 y 8,1%.
Comparación de métodos
En un estudio comparativo entre Berichrom* Antitrombina III (con dilución manual) con Berichrom*
AT III (A) en el Hitachi 717 se determinarón 111 muestras en el rango de 25 a 150% del valor
normal. El coeficiente de correlación encontrado fue de 0,99 (Corte del eje-y: -3,7%: Pendiente:
0,98).
Bibliografía
Ver página 1.
*
Berichrom es una marca de fábrica registrada de Dade Behring Marburg GmbH en Alemania y
en otros países.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
Berichrom* Antitrombina III
Avaliação, método cinético
O factor laboratorial FL é calculado com o valor enzimático de trombina (∆E/minutoVET) e o valor de
referência medido, que é determinado para a ATIII como uma amostra usando um plasma de referência com indicação do valor nominal (p. ex., plasma humano standard):
Reagentes para a determinação da Antitrombina III
Campo de aplicação
valor nominal (% do valor real)plasma de referência
FL = –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
∆E/minutoVET - ∆E/minutoplasma de referência
O conteúdo de AT III da amostra em % do valor normal obtém-se com a seguinte fórmula:
AT IIIamostra (% do valor normal) = FL x (∆E/minutoVET - ∆E/minutoamostra)
Esquema de pipetagem para o método de dois pontos
Para a determinação quantitativa da antitrombina III funcionalmente activa (AT III), em apoio do diagnóstico e monitorização de tromboses e estados análogos.
Significado diagnóstico
A antitrombina III é o inibidor plasmático da trombina e do factor X activado e forma um complexo
inactivo irreversível com essas enzimas. A inactivação dos factores de coagulação activados é acelerada, em grande quantidade, pela heparina. Berichrom* Antitrombina III serve para a determinação
rápida da antitrombina III fisiologicamente activa e permite o diagnóstico da deficiência hereditária e
adquirida de antitrombina III, que representa um risco elevado de trombose. As deficiências adquiridas
de antitrombina III ocorrem, frequentemente, como consequência do consumo após operações de
maior dimensão, ou como consequência de coagulação intravascular disseminada (CID) nos casos de
sepsis, nefroses, lesões hepáticas parenquimais (hepatite, intoxicação de drogas, alcoolismo) e contraceptivos contendo estrogénio1. O teste permite a detecção precoce dos pacientes com risco elevado de trombose2.
Princípio metodológico
A antitrombina III da amostra é convertida num inibidor imediato através da heparina e inactiva a
trombina presente. O conteúdo residual de trombina é determinado num teste cinético medindo o
aumento da absorvância a 405 nm, segundo o seguinte esquema de reacção:
Heparina
AT IIIamostra + Trombinaexcedente –––––––––––––––––––> [AT III- Trombina] + Trombinaresto
resto de trombina
Tos-Gly-Pro-Arg-ANBA-IPA –––––––––––––––––––––> Tos-Gly-Pro-Arg-OH + ANBA-IPA
Reagentes
Conteúdo da embalagem comercial
Berichrom* Antitrombina III
Kit de teste, ref. OUBP com
6 x para 15 ml de reagente de trombina
6 x para 2 ml de reagente de substrato
1 x 100 ml de solução tampão
Composição
Reagente de trombina bovina, liofilizado; com adição de heparina, manitol (2 g/l), cloreto de sódio (2
g/l) e aprotinina
Reagente de substrato, liofilizado; concentração na solução de uso:
Tosilglicil-L-prolil-L-arginil-5-amino-2-ácido nitrobenzóico - isopropilamido (Tos-Gly-Pro-Arg-ANBAIPA) 2 mmol/l
Solução tampão: Tris (12 g/l), NaCl (9 g/l), pH 8,2
Conservante: Azida de sódio (< 1 g/l)
Advertências e medidas de precaução
1. Só para uso diagnóstico in vitro.
2. Precauções a observar ao lidar com reagentes para diagnóstico in vitro com teor de azida de
sódio:
Evitar ingerir e todo o contacto com a pele ou mucosas! Com metais pesados, como o cobre ou o
chumbo, a azida de sódio pode formar azidas explosivas!
3. Todos os materiais obtidos a partir de sangue humano devem ser tratados com as precauções
devidas, seguindo as medidas de segurança recomendadas em caso de risco biológico, uma vez
que nunca se pode excluir inteiramente o risco de contaminação por agentes patogénicos3.
Preparação dos reagentes
Reagente de trombina: Dissolver com a quantidade de solução tampão indicada no rótulo e incubar,
antes de usar, durante 30 min., entre +15 e +25 °C.
Reagente de substrato: Dissolver o conteúdo do frasco com a quantidade de água destilada indicada
no rótulo.
Antes de usar, misturar uma vez mais os reagentes com cuidado.
Estabilidade e medidas de conservação
Não aberto, o kit de teste pode ser conservado entre +2 e +8 ° C e utilizado até à data indicada no
rótulo.
Estabilidade após reconstituição:
Temperatura
Trombina
Reagente de substrato
+37 °C
8 horas
1 semana
+30 °C
2 dias
2 semanas
+15 a +25 °C
1 semana
2 semanas
+2 a +8 °C
2 semanas
6 semanas
-20 °C
3 meses
6 meses
A trombina pode ser congelada no frasco original até 5 vezes e o substrato até 10 vezes.
Uma vez aberta, a solução tampão mantém-se estável durante 6 meses entre +2 e +8 °C.
Os diferentes coagulómetros possuem características de estabilidade individuais.
Outros materiais necessários
Plasma humano standard, ref. ORKL, AT III calibrado segundo o padrão da OMS
Plasma de controlo N, ref. ORKE
Plasma de controlo P, ref. OUPZ
Ácido acético a 20% (só para o método de dois pontos)
Solução isotónica de cloreto de sódio
Coagulómetro (veja o capítulo "Limitações do procedimento")
Amostras
Para a obtenção do plasma, misturar cuidadosamente 1 parte de solução de citrato de sódio (0,11 mol/l)
com 9 partes de sangue venoso, evitando a formação de espuma. Centrifugar imediatamente a 1500 x g,
durante 10 min. no mínimo.
Estabilidade da amostra:
-20 °C
1 mês
+2 a +8 °C
2 dias
+15 a +25 °C
6 horas
Descongelar os plasmas conservados a -20 °C, durante um período de tempo de 10 min. a +37 °C e
executar depois a determinação num espaço de tempo de 2 horas.
Valor enzimático de trombina (VET)
Amostra
Solução isotónica
50 µl
de cloreto de sódio Diluição
50 µl
de plasma Reagente de trombina
1000 µl
1000 µl
Misturar e incubar durante 3 minutos à temperatura seleccionada.
Reagente de substrato
100 µl
100 µl
Misturar imediatamente e accionar o cronómetro simultaneamente. Após exactamente 2 minutos,
adicionar:
Ácido acético a 20%
500 µl
500 µl
Misturar imediatamente e determinar a absorvância num intervalo de 60 minutos contra o ar.
Avaliação, método de dois pontos
O factor laboratorial FL é calculado com o valor enzimático de trombina (E/minuto VET) e o valor de
referência medido, que é determinado para a ATIII como uma amostra usando um plasma de referência com indicação do valor nominal (p. ex., plasma humano standard):
valor nominal (% do valor real) plasma de referência
FL = –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
E VET - E plasma de referência
O conteúdo de AT III da amostra em % do valor normal obtém-se com a seguinte fórmula:
AT III amostra (% do valor normal) = FL x (E VET - E amostra)
Notas
1. A duplicação ou divisão do volume em partes iguais não tem qualquer efeito sobre o cálculo e o factor
laboratorial interno.
2. Para cada série de medições e o mais tardar após 2 horas, o valor enzimático de trombina (∆E/minuto VET)
tem de ser medido de novo.
3. Se o conteúdo de AT III da amostra for interior a 20% do valor normal, é aconselhável proceder à diluição
prévia da amostra com metade da solução isotónica de cloreto de sódio, p. ex., 25 µl de amostra + 500 µl
de NaCl, para repetir a determinação. O resultado divide-se por 2.
4. Para cada mudança de aparelho e cada lote de Berichrom* Antitrombina III é necessário determinar de
novo o factor laboratorial interno FL.
Automática:
A pedido, a Dade Behring disponibiliza instruções especiais para coagulómetros.
Controlo de qualidade interno
Intervalo normal:
Plasma de controlo N
Intervalo patológico: Plasma de controlo P
Deverão ser medidos dois controlos (um no intervalo normal e um no intervalo patológico) todas as 8
horas, no mínimo, em cada dia de trabalho. O material de controlo deverá ser tratado como a amostra.
Cada laboratório deverá determinar o seu intervalo de controlo de qualidade próprio com base nos
valores e intervalos teóricos indicados pelo fabricante dos controlos, ou com base nos valores de
controlo determinados no laboratório. Se o valor de controlo medido se situar fora do intervalo de
confiança determinado anteriormente, é necessário controlar os reagentes e o coagulómetro e o factor
laboratorial interno FL deverá ser calculado de novo.
Limitações do procedimento
São apropriados os coagulómetros para os quais a Dade Behring disponibiliza instruções de utilização. A utilização de Berichrom* Antitrombina III noutros coagulómetros tem de ser validada pelo laboratório de análise. Neste caso, podem obter-se características de performance diferentes das indicadas.
A hirudina afecta o teste, visto que inibe a trombina, tal como a ATIII
Os plasmas lipémicos e os plasmas com teor elevado de bilirubina e hemoglobina (plasmas hemolíticos) perturbam o método de dois pontos. Neste caso, é necessário examinar também um plasma
com valor em branco, com a sequência de pipetagem seguinte: 1. 500 µl de ácido acético; 2. 1100 µl
ide solução isotónica de cloreto de sódio; 3. 50 µl de diluição de plasma. Seguidamente, misturar, ler a
absorvância e subtrai-la do valor medido da amostra.
Intervalo de referência
75 - 125% do valor normal4
Os desvios sistemáticos deste intervalo podem ser induzidos pelo equipamento. Se for necessário, o
laboratório deverá determinar um intervalo de referência próprio.
Características do teste
Intervalo de medição
O intervalo de medição vai de 0 a 140% do valor normal.
Especificidade
As perturbações provocadas pelo cofactor II da heparina podem ser negligenciadas, uma vez que no
teste se utiliza trombina bovina5.
Precisão e reprodutibilidade
O coeficiente de variação na série para os valores de ATIII situa-se entre 2,8 e 4,4% e para os valores
do dia a dia situa-se entre 4,8 e 6,2%. O coeficiente de variação na série para os valores patológicos
situa-se entre 2,5 e 7,5% e para os valores do dia a dia situa-se entre 5,8 e 8,1%.
Comparação de métodos
Numa comparação de Berichrom* AT III (com diluição manual) com Berichrom* AT III (A) no Hitachi
717, foram determinadas 111 amostras no intervalo de 25 a 150% do valor normal. O coeficiente de
correlação foi de 0,99 (intercepção do eixo y: - 3,7%; inclinação: 0,98).
Bibliografia
Veja a página 1.
* Berichrom é uma marca registada da Dade Behring Marburg GmbH na Alemanha e noutros países.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
Procedimento
Berichrom* Antitrombina pode ser utilizado numa multiplicidade de coagulómetros.
Observar o manual de utilização do fabricante do aparelho!
Manual:
Diluir 1 parte do plasma do paciente com 40 partes de solução isotónica de cloreto de sódio (p. ex., 25
µl de plasma + 1 ml de solução isotónica de cloreto de sódio) e utilizar no teste num intervalo de tempo
de 45 minutos (+15 a +25 °C).
Semi-microteste:
Cuvete:
1 cm de camada de espessura
Comprimento de onda: 405 nm
Temperatura do teste: facultativa, +25 °C, +30 °C ou +37 °C
Aquecer, previamente, a solução do reagente de trombina, o reagente de substrato e as cuvetes ou
tubinhos de plástico à temperatura de teste seleccionada.
Esquema de pipetagem para o método cinético
Valor enzimático de trombina (VET)
Amostra
Solução isotónica
50 µl
de cloreto de sódioDiluição
50 µl
de plasma Reagente de trombina
1000 µl
1000 µl
Misturar e incubar durante 3 minutos à temperatura seleccionada.
Reagente de substrato
100 µl
100 µl
Misturar e determinar ∆E405 nm/minuto.
Fotómetro/Cronómetro: Ler a absorvância dentro de 30 seg. e accionar o cronómetro simultaneamente. Após 60 e 120 seg., exactamente, repetir a leitura, calcular a respectiva ∆E/minuto pela
diferença dos valores e depois o valor médio a partir dos dois valores medidos.
OUBP G21 E0540 (68) CS
6
Edição Dezembro 2003
Symbols Key / Symbolschlüssel / Explication des Symboles /
Interpretazione simboli / Clave de los Símbolos / Chave dos Símbolos
Manufactured by / Hergestellt von / Fabriqué par / Prodotto da / Fabricado por
IVD
LOT
EXP
CCYY-MM-DD
In Vitro Diagnostic Medical Device / In Vitro Diagnosticum / Dispositif Médical
Diagnostic In Vitro / Dispositivo Medico per Diagnostica In Vitro / Producto sanitario
para Diagnóstico In Vitro
Lot Number / Chargenbezeichnung / Numéro de Lot / Numero di Lotto / Número de
Lote
Expiration Date / Verfalldatum / Date de Péremtion / data di scadenza / Fecha de
vencimiento / termo da validade
Storage Temperature / Lagertemperatur / Température de Conservation / Temperatura
di conservazione / Temperatura de almacenamiento / Temperatura de armazenagem
CE Mark / CE-Zeichen / Marquage CE / Marchio CE / CE Marca / Marca CE
REF
Catalogue Number / Katalog Nummer / Référence / Codice Catalogo / Número de
Catálogo
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