Diagnóstico de las enfermedades mendelianas.

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Diagnóstico de las enfermedades mendelianas.
Co
ng
re
so
Na
cio
n
al
DIAGNÓSTICO
de PRENATAL:
lL
ab
“Genética molecular:oraDiagnóstico de
tor
las enfermedades mendelianas.”
io
Cl
íni
co
20
14
Begoña Ezquieta. Laboratorio Diagnóstico Molecular.
Servicio Bioquímica Clínica. Hospital General
Universitario Gregorio Marañón. Madrid.
Co
DIAGNÓSTICO
PRENATAL
n
gr
Genética
molecular
es
oN
diagnóstico, ca. (Del
gr. διαγνωστικός).
a
2. m. Med. Arte o acto dec
conocer la naturaleza de una enfermedad
mediante la observación deisus
onsíntomas y signos.
al
d
prenatal.
1. adj. Que existe o se produce antes dele
nacimiento.
lL
Real Academia Española ©
ab
DNA
or
ato
rio citogenético
Diagnóstico
“Conjunto de técnicas aplicadas a
Cl
una muestra prenatal que permiten
í
nic
obtener información sobre el
o2
padecimiento/riesgo de una
0
enfermedad congénita”
1. m. Med. Fenómeno revelador de una enfermedad.
2. m. Señal, indicio de algo que está sucediendo o va a suceder.
CRIBADO PRENATAL BIOQUÍMICO
DTN - S. Down - cromosomopatías
14
Cromosomopatías aneuploidías
Co
¿Por
ng qué “solo” mendelianas?



1822 – 1884
re
so a la alteración de UN solo gen
Debidas
Na un fenotipo (clínica).
que causa
cio
na
l d de Segregación
Se ajusta a la Ley
(separación de losecromosomas
paterno y
lL
ab
materno al formar gametos).
or
DNA
ato
riodarse aún
La aparición de fenotipo puede
Cl
en presencia de una alelo normal
(dominantes), sólo si faltan ambosínic
o2
(recesivas) o ligadas al X.
01
4
es el CASO INDICE el que define cuáles son los cromosomas mutados
Co
Además…
ng



re
so claramente establecida la relación
Debe estar
causa/efecto
Na de la alteración que estamos
“siguiendo” ycel fenotipo.
ion
al
de
lL
ab
or
Variantes analizadas “validadas
atoclínicamente”
rio
Cl de
La gravedad del fenotipo y/o la posibilidad
íni
actuacióndecisiones reproductivas (interrupción,
co
selección de embriones), terapia…
20
14
ASESORAMIENTO GENÉTICO
DNA
RIESGO
RECURRENCIA
Co
ng
re
so
 RECESIVAS:
a priori 25%
 RiesgoN
identificado
por la existencia de caso
ac
indice previo
ioón
al
 portadores identificados
en otras familias que
de
forman pareja
lL
ab
o
ra
 DOMINANTES: a priori 50%
tor
 Afecto que planea tener descendencia
ó
io
Cl
 Caso previo “de novo” recurrencia 
íni
co
Tras estudio gen en la muestra fetal (directo, indirecto si se
20
descarta recombinación) 100% certeza, excepto
eventos “de novo”, doble recombinación (muy improbables)
1DNA
prenatal
4
Co
Tipos
de muestras prenatales
n
gr
tradicionales
(factor tiempo y riesgo)
es
oN
 Líquido amniótico:
14-16 sem (a partir 1970´)
ac
ion
al
de
lL
ab
or
ato
rio
Cl
íni
co
20
14
 Vellosidad coriónica: 10-12 sem (a partir 1980´)
Tipos
de
muestras
prenatales
Co
tradicionales
(factor tiempo y riesgo)
ng
r
es amniótico: 14-16 sem (a partir 1970´)
 Líquido
o
 Sobrenadante
Na (determ. bioquímicas)
 Células (distintos
cio tipos celulares):
 DNA directo para
na análisis sencillos 1 o 2 PCRs
 DNA tras cultivo (necesario
si estudio requiere múltiples
l
d
PCRs)
el
La
bo sem (a partir 1980´)
 Vellosidad coriónica: 10-12
 Abundante celularidad, DNAra
no requiere cultivo
t
or
 Muestra de elección en el diagnóstico
molecular
i
o
tradicional
Cl
íni
co
 Funiculocentesis, Biopsias Hígado, Piel
20
DNA en suero materno (a partir de 1997)14
Plazos legales, terapia tiempo-dependiente, cuándo embarazada es vista en U- Genética
¿Cómo
Co son las alteraciones en enfermedades
ng
monogénicas?
¿Qué técnicas de detección?
re
so
Na Puntuales: cambio de base, inserción o
cdeleción
ion de 1 o 2 bases. SECUENCIA
al discriminación alélica (ASO, FRET,
PARCIAL,
de...)
SNaPshot,
l L Southern
 Deleciones. MLPA,
DNA
ab
prenatal
or
ato
 No Mendelianas:
 Dinámicas: Expansiónritriplete.
PCR,
o
Southern (ojo! requiere DNA)
Cl
íni isodisomía
 “Imprinting”: Estudios metilación,
co
(microsatélites).
20
Requerimientos DNA no son elevados (salvo Southern) pero sí es importante1
la4calidad
Esquema General
Co
ng
re
so
Nucleos N
ac
ion
Células
fetales
L.A.; V. C.)
DNA
genómico
Southern
MSH
PREPARATIVA
PCR
al
DNA fetal
suero materno
Puntual, Deleciones
Secuenciación parcial
Ligasa OLA
de
Uno ó varios
fragmentos
genespecifico
MLPA
lL
“Todo” el genoma
DNA embrión
Técnica de detección
de mutación conocida:
Preimplantacional
(selección embriones)
NIPT Prenatal no invasivo
(masiva dosis microsat.)
NGS Secuenciación masiva
(exoma, paneles, genoma)
(deleciones)
ASO, SNaPshot
abElectroforesis
orSonda: PCR Tiempo Real:
ato
Tamaño:
rio
Pequeñas deleciones
Cl
ARMS
í Triplete
Expansiones de n
ico
Microsatelites
20
Tinción ó Marca
R
E
S
U
L
T
A
D
O
Discriminación alélica FRET
indirecto)
(análisis
14
Co

ng
PCR
r
es
oN
ac
ion
PCR

PCR
Secuenciación
PCR
Secuenciación
Secuenciación a“tradicional”
l
PCR-Taq polimerasa
Cebador
X
de
lL
ddNTP
dNTP
ab
or
ato
rio
Secuenciación Sanger “exón a exón”
DNA amplificado
Fluorescencia (colores ACGT)

MLPA
Ligasa y Taq pol
OLA (“oligoligation assay”)
Cl
ín
ico
20
14
Fragmentos cuyas alturas de picos se comparan con sondas referencia
Co
Dinámica
general:
n
gr INDICE ya diagnosticado y alteraciones conocidas y
Caso
es clínicamente
validadas
Dato
o
Disponer deNmarcadores del cromosoma informativos (5´y 3´) previo
acde la muestra, no tejido materno (U. Citogenética). Uso de
Examen calidad
ion
material estéril. Procesamiento
rápido
Extracción de DNA manual
al o semiautomática, verificar calidad y cantidad
dcantidad
adecuar volúmenes a
el de material
La
Proteinasa K (si v.c. y baño 37ºC, 56ºC)
bo prenatal (técnicas empleadas
Repetir estudio del INDICE con la muestra
evolucionan, también soft- y hard- de análisis)
ra
tor
Análisis urgente dirigido a las regiones implicadas
io
Si estudio INDICE y prenatal son simultáneos: C
lín o gen/es
Estudio completo en ambas muestras de las alteración/es
ico
implicado/s con amplia cobertura y/o
20
Estudio de marcadores informativos asociados al locus implicado
(amplio para garantizar informatividad, incluyendo progenitores y 1
otros hermanos si es posible) ¡OJO! Diagnóstico INDICE correcto 4









Co
Escenarios
diagnóstico prenatal
n
gr
mendelianas
(enf
monogénicas)
es
o N familiar:
 Contexto
ac
ion bien diagnosticado clínica y molecularmente
 CASO INDICE
al
de novo
de
lL
ab
or
atoDOMINANTE
RECESIVA
rio
 AMBOS PROGENITORES PORTADORES para
Cl
enfermedades recesivas GRAVES y FRECUENTES
íni
co
20
F1
F2
F3
14
Escenarios
diagnóstico prenatal
Co
ng
mendelianas
(enf
monogénicas)
re
so familiar:
 Contexto
Na bien diagnosticado clínica y molecularmente
 CASO INDICE
CONOCEMOS LAS ALTERACIONES DEL CASO ÍNDICE
cio el/los alelo/s del caso índice en el feto.
Detectar/descartar
n
Análisis directo al
de
lL
ab
or
ato
rio
Cl
íni
co
20

mutación
14
Escenarios
diagnóstico prenatal
Co
ng
mendelianas
(enf
monogénicas)
re
so familiar:
 Contexto
Na bien diagnosticado clínica y molecularmente
 CASO INDICE
CONOCEMOS LAS ALTERACIONES DEL CASO ÍNDICE
cio el/los alelo/s del caso índice en el feto.
Detectar/descartar
n
Análisis directo al
Análisis indirecto: d
marcadores
polimórficos que
el
identifican cromosoma
La
bo
ra
tor
Análisis indirecto: Conjunto de marcadores identifica un cromosoma
=haplotipo
i
o
CASO INDICE bien diagnosticado, control de ausencia de recombinación
(5´y 3´)
C
Análisis directo es el que identifica las alteraciones y perrmite el diagnóstico
lín genético
ico
20

mutación
RFLP, SNP
Polimorfismoa tipo microsatélites
Tamaños (nº repeticiones)
SI o NO

14
OJO!! IMPRESCINDIBLE CASO INDICE BIEN DIAGNOSTICADO
es el CASO INDICE el que define cuáles son los cromosomas mutados
Co ANÁLISIS DIRECTO e INDIRECTO
ng ENFERMEDAD RECESIVA GRAVE
re
so
Na
cio
na
ld
CASO INDICE
el
La
bo
ra
GEN CAUSAL-exón 7
tor
“frame-shift”
io
Cl
íni
GEN CAUSAL-exón 14
co
puntual
20
PACIENTE
Heterozigoto compuesto
Heterozigosis
(normal y mutante)
Heterozigosis
(normal y mutante)
Análisis directo mutaciones GEN CAUSAL
(alteraciones graves conocidas “validadas clínicamente”)
14
Co
ng
ANÁLISIS DIRECTO e INDIRECTO
(ALELOS mutados paterno y materno)
re ENFERMEDAD RECESIVA GRAVE
so
Na
cio
n
PORTADOR
PORTADORA
Heterozigoto
Heterozigoto
al
de
CASO ÍNDICE
lL
ab
orN “trans”
ato
rio
Cl
ín
PACIENTE
Heterozigoto compuesto
Alelo paterno
IDENTIFICAR LOS CROMOSOMAS
(cromosomas normales p y m son iguales)
N
exón 14
exón 7
Gen causal- exón 7
Gen causal- exón 14
ico
20
Alelo materno
14
Análisis directo secuenciación y detección de alteraciones conocidas y
“validadas clínicamente” con segregación de las alteraciones.
Marcadores tipo MICROSATÉLITE (STR)
Co
ng
•Secuencias altamente polimórficas distribuidas en las regiones no
codificantes de todo el genoma. Gran disponibilidad e informatividad
re
•Polimorfismosreside
en longitud de fragmento, se debe generalmente
o
a variaciones en nºN
de repeticiones del dinucleótido CA (GT)
ac
3. 3
5
i
o
1.
nPCR
al
Padre
de tamaño
4
8
lL
ab
2.
Madre
or
4
ato
5
Hijo/a
rio
Cl Tiempo de retención
íni
Cromatografia capilar
co
20
14
Fluorescente
Fluorescente
CA
GT
CACACA
GTGTGT
Alelo 5
Microsatélite
D(nº)S(nº)
Alelo 4
Detección laser FLUORESCENCIA
AFECTO/A
También utilizados en “preimplantacional”, QF PCR aneuploidías 21, 13, 18, X e Y; Prenatal no invasivo (NIPT)
CoANÁLISIS DIRECTO e INDIRECTO
Análisisnindirecto polimorfismos (microsatélites) que identifican los
gr
cromosomas
es normal y mutante, paternos y maternos
locus
oN
3
2
1
10a
8
4
5 ci 3
o6n
5
3
7
2
10
al
4
5
de
3
7
lL
ab
or
ato
Alelo materno
rio
GEN CAUSAL-exón 7
Cl
Alelo paterno
íni
co
GEN CAUSAL-exón
14
2
0
es el CASO INDICE el que define cuáles son los cromosomas mutados
14
D6S265
D6S265
D6S273
PORTADOR
PORTADORA
Heterozigoto
Heterozigoto
D6S265
D6S439
D6S273
D6S439
PACIENTE
Heterozigoto compuesto
Análisis indirecto: Conjunto de marcadores identifica un cromosoma =haplotipo
CASO INDICE bien diagnosticado, control de ausencia de recombinación (5´y 3´)
Análisis directo es el que identifica las alteraciones y perrmite el diagnóstico genético
D6S273
D6S439
Co
¿Cómo
ng son las alteraciones en las
re
monogénicas?
¿Qué técnicas detección?
so
N
a Puntuales: cambio de base, inserción o
DNA
cdelecion
prenatal
ion
de 1 o 2 bases. SECUENCIA
a
PARCIAL,
l d discriminación alélica (ASO,
ANÁLISIS
DIRECTO
FRET,..)el
La
 Deleciones. MLPA,
bo Southern
ra PCR, Southern
 Expansión triplete.
t
opero sí es importante la calidad
Requerimientos DNA no son elevados (salvo Southern) r
io
C
línPCR fluores
 Microsatélites polimórficos.
ANÁLISIS
ico
INDIRECTO
SNPs (y RE), VNTRs
20
14
Si se trata de alteración no
caracterizada, múltiples
marcadores/cromosoma
(alta informativ. y baja REC)
ESTUDIO PRENATAL
Co ANÁLISIS DIRECTO e INDIRECTO
n
gr
es10 1
o
5 N3
7
a6 c
ion
3
8
5
D6S265
D6S273
D6S439
Gametos
10
5
7
D6S265
D6S273
D6S439
2
4
3
PORTADOR
PORTADORA
Heterozigoto
Heterozigoto
10
5
7
al
d13e
6
lL
3
8
5
D6S265
D6S273
D6S439
2
4
3
ab
or
2
4
3
ato 10 2
rio5¿ ?4
7C 3
lín
D6S265
D6S273
D6S265
D6S273
D6S439
PACIENTE
Heterozigoto compuesto
Contaminación materna INVALIDA!!
D6S439
ico
2,10
2,3,10
4,5 Estudio
4,5,8
MICROS
3,7
3,5,7
20
Estudio
SECUENCIACIÓN
PARCIAL
14
ESTUDIO PRENATAL
Co ANÁLISIS DIRECTO e INDIRECTO
n
gr
es10 1
o
5 N3
7
a6 c
ion
3
8
5
D6S265
D6S273
D6S439
Gametos
10
5
7
D6S265
D6S273
D6S439
2
4
3
PORTADOR
PORTADORA
Heterozigoto
Heterozigoto
10
5
7
al
d15e
6
lL
3
8
5
Heterozigoto compuesto
D6S273
D6S439
2
4
3
ab
or
2
4
3
ato
rio
PACIENTE
D6S265
D6S265
Cl
ín
1,3
D6S273
3,8
D6S439
5,6
ico
Estudio
MICROS
20
Es la
muestra
familiar !!
Estudio
SECUENCIACIÓN
PARCIAL
14
NO AFECTO/A
Co
Análisis
directo e indirecto
n


gr
es
Análisis odirecto: Mutaciones detectadas en el caso índice
Na
 Requiere CONOCER
las alteraciones del caso INDICE,
cio
(OJO! si hay interpretación
de nueva variante)
na
 VENTAJAS: no recombinación,
si las alteración/es detectada/s
ld
están “validadas clínicamente”
aporta además la confirmación del
diagnóstico clínico, puedeeaplicarse
a “sospecha ecográfica”
lL
ab
ra
Análisis indirecto: Marcadoresoindirectos
(microsatélites)
tor
en 5´y 3´
io disponible
 Requiere INDICE bien diagnosticado, muestra
C
 INFORMATIVIDAD, CONTROLAR posible recombinación
lín
ico aplicable
 VENTAJAS: detecta contaminación materna, “siempre”
(alelos no caracterizados, locus complejos, problemas eficiencia
2
01
PCR algunos locus, muestras preimplantacionales) en contextos
monogénicos y también para aneuploidías QF-PCR y NIPT) 4
Escenarios
diagnóstico prenatal
Co
ng
mendelianas
(enf
monogénicas)
re
so familiar:
 Contexto
Na bien diagnosticado clínica y molecularmente
 CASO INDICE
Detectar/descartar
cio el/los alelo/s del caso índice en el feto.
Análisis directon
al
d
el polimórficos que identifican
e indirecto: marcadores
La
cromosoma
bo
ra
tor
io
Cl
íni
c
o2
 AMBOS PROGENITORES PORTADORES para enfermedades
recesivas GRAVES y FRECUENTES Solo ánálisis directo
01
4

mutación
es el CASO INDICE el que define cuáles son los cromosomas mutados
Co
Escenarios
diagnóstico prenatal
n
gr
mendelianas
es
o N familiar: análisis directo e indirecto
 Contexto
ac
ion
al
de
de novo
lL
ab
or
ato
rio
Cl
íni
 Sospecha ecográfica
co
 Detectar/descartar las alteraciones graves “conocidas” y
2
01y
validadas clínicamente INTERPRETACIÓN (especificidad)
4
COBERTURA (sensibilidad). Obviamente sólo análisis directo.
F1
F2
F3
de novo
C
Enfermedad
dominante:
on
gr
Acondroplasia
es
50%
oN
 Base molecular
ac : Alteración puntual muy recurrente (>95%)
FGFR3 p.Gly380Arg
ion (c.1138C>A o C>G): PCR-RE vs
Secuenciación parcial.
desde 1994
al
de
UNA SOLA ALTERACIÓN
l L frecuente/ “de novo”
 Contexto familiar: INDICEaprogenitor, INDICE es el hijo/a
bo
 Fecuentemente son “de novo”.
ra
 Riesgo recurrencia muy bajo aunque tpuede
or haber “mosaicismo
io
germinal”
Cl
íni
co
20
14
DIAGNÓSTICO
PRENATAL ACONDROPLASIA
C
on
(amniocitos LA directo) ESTUDIO FGFR3-TM secuenciación parcial
gr DOMINANTE
ENTIDAD
es
oN
ac
ion
al
PCR y sec parcial
Estudio inicial INDICE y padres
C-
P M E
N/N
N/M
164 pb
110 pb
54 pb
de
lL
Gly380Arg
1138G>C
Caso índice: ACONDROPLASIA
Mutación FGFR3 1138GC
Tripletes 380 GGG y CGG
PCR región TM
FGFR3 y corteC+
restricción
Acondroplasia
“de novo”
Digestion Sfc I
detecta cambio
ab
or
DNA fetal
remitido
desde U.
Genética
p.Gly380Arg
1138G normal
ato
Muestra prenatal: NORMAL
rio Triplete 380 GGG
No mutación.
Cl
íni
co
20
Feto NO AFECTO (no 1
4
presenta la alteración)
de novo
C
Enfermedad
dominante:
on
gr
Acondroplasia
es
50%
oN
 Base molecular
ac : Alteración puntual muy recurrente (>95%)
FGFR3 p.Gly380Arg
ion (c.1138C>A o C>G): PCR-RE vs
Secuenciación parcial.
desde 1994
al
de
UNA SOLA ALTERACIÓN
l L frecuente/ “de novo”
 Contexto familiar: INDICEaprogenitor, INDICE es el hijo/a
bo
 Fecuentemente son “de novo”.
ra
 Riesgo recurrencia muy bajo aunque tpuede
or haber “mosaicismo
io
germinal”
11 casos/16 C
sospecha ecográfica
 Sospecha ecográfica.
lín
3 positivos
icoalelos
Valor predictivo negativo muy alto (sensibilidad 99%
caracteriz) y positivo (especificidad, validación clínica2100%)
01
VENTAJA!!
4
Co
Enfermedad
recesiva:
n
HSC-grdeficiencia 21-hidroxilasa
es
o
 Base molecular
Na : Alteraciones puntuales y grandes
reordenamientos
cioCYP21A2: Secuenciación parcial y MLPA
na SEGREGADAS (alelos
DOS ALTERACIONES
ld
paterno y materno).
el
 Contexto familiar: caso índice
La afecto, también ambos
bo
portadores de alteraciones graves.
ra (consejo genético)
 Población general: Afecto x Portador
tor
Para enfermedad no infrecuente y focalizado en lasiformas
o C graves
Existe un posible tratamiento prenatal preventivo y eficaz aunque
líntodavía experimental
ico
20
14
Análisis directo panel de alteraciones frecuentes validadas
clinicamente caracteriza >90% de los alelos. VENTAJA!!
Co
Consejo
genético HSC-21OHD
ng
re
so
Na
I
cio I.1
na
PORTADOR
ld
INDICE
e
II
5
3
Leu281/N
4
Stop318/N
lL
4
II.1
5
Leu281
sev
Dosis génica: NO DUP
III
Leu281/N 4
5
III.1
Guía clínica 2010
riesgo feto afecto CLÁSICA 1:4
“experimental”, centros referencia
655GStop318
7
ab
or
NON CLASSICAL FORM
7
4
4
I.2
655G-Stop318/NN
5
Leu281/N
II.2
ato
rio
Cl SEVERA
MUTACIÓN
í i
REQUIEREnCONSEJO
co
GENÉTICO
2
01
4
Co Pierde sal (y virilizante) HSC-21OHD
Forma
ng
Diagnóstico
prenatal feto femenino afecta
re
so
Naen 2008A
Estudio familiar
cio
na
l
Estudio PRENATAL v.c.
(marzo 2014)
Paciente c.293-13AoC>G
Cn Cn P Cn Chet
Southern
Southern pC21/3c TaqI
Cn Cn P Cn CDup
Portador
Hibrido deleción
de
Portadora
Conversión gen
Control c.293-13A
lL
1 TNF m1
7 D5S273 4
1 TNF m1
7 D5S273 4
ab
or
INDICE
6 D6S439 6
Forma CLÄSICA PS
c.293-13 A/C>G,c.332339del+Conversión gen
Southern pC21/3c BglII
Secuenciación parcial
6 D6S439 6
c.293-13 A/C>G,c.332339del+Conversión gen
ato
rio
FETO FEMENINO
AFECTA HSC21OHD
Vellosidad cor.
Cl
ín
Seguimiento post
ico
MLPA-B3
DNA Hermana
afecta (julio 14)
20
Leucocitos
Reanalizar INDICE con Prenatal
Forma CLÄSICA PS
c.293-13 A/C>G,c.332339del+Conversión gen
1
4
Tratada Dexametasona prenatalmente se previno virilización
Endocriology, Diabetes and Metabolism (2014, in press). “A of
congenital adrenal hyperplasia of prenatal treatment”
Co
Enfermedad
recesiva:
n
HSC-grdeficiencia 21-hidroxilasa
es
o
 Base molecular
Na : Alteraciones puntuales y grandes
reordenamientos
cioCYP21A2: Secuenciación parcial y MLPA
na SEGREGADAS (alelos
DOS ALTERACIONES
ld
paterno y materno).
el
 Contexto familiar: caso índice
La afecto, también ambos
bo
portadores de alteraciones graves.
ra (consejo genético)
 Población general: Afecto x Portador
tor
io
Cl
 Sospecha ecográfica: antes muy infrecuenteín
ico HSC)
8/83 prenatales sospecha ecográfica (280 formas clásicas
20
14
Análisis directo panel de alteraciones frecuentes validadas
clinicamente caracteriza >90% de los alelos. VENTAJA!!
Co
Futuro
prenatal monogénicas
ng



re
so
DiagnósticoNprenatal monogénicas preimplantacional
Selección deaembriones
cio
(análisis indirectonyadirecto ¡¡ojo!! locus complejos)
l
Diagnóstico prenatal d
no
elinvasivo apoyado >8º semana
Lade alelo paterno)
(análisis directo ó indirecto
b
or las alteraciones y el
 CASO INDICE detectar/caracterizar
ato mutados
haplotipo marcador de los cromosomas
rio
Diagnóstico prenatal por sospecha ecográfica
mediante
Cl
íni e invasivos
abordajes monogénicos con  VPP y VPN
co
en la medida que exista una garantía de interpretación
20
correcta o de validación clínica (bases datos, modelos,
14
intercomunicación). Solo análisis directo
Co
Enfermedad
dominante: Síndrome de
ng (ANTIGUAMENTE “Turner de varones”)
Noonan
r
es
Base molecular:
Alteraciones puntuales genes vía RAS-
oN
desde 2001, 2006
ac caso índice afecto
 Contexto familiar:
Fecuentemente sonio“de novo”.
nabajo aunque puede haber “mosaicismo
Riesgo recurrencia muy
ld
germinal”
el
La
 Sospecha ecográfica. MUY FRECUENTE
75% (25/34)
b
“Traslucencia nucal” y cariotipo o
normal
2 positivos
r
ato
¿Cuáles y cuantos genes analizar? DESVENTAJA!!
rio
Valorar el VPN (solo 60-70% alelos caracterizados)
y el VPP
C
(“validación clínica” de los hallazgos a interpretar)
lín
ico
 Arrays genotipado (foto fija)
 Secuenciación masiva panel 11 genes 60%
20
14
INTERPRETACIÓN VARIANTES NO DESCRITAS

MAPK (50% PTPN11 y otros…)


En el contexto prenatal es extremadamente complicado
Co
Sospecha
prenatal Noonan. Hallazgo “secundario”
ngafecta Noonan (Fenotipo Turneriano)
madre
re
so
F
Na
cio
n
FAMILIA 771
NOONAN familiar
Estudio prenatal indicado por sospecha ecográfica que con posterioridad fue reconocido
como una forma familiar
al
de
E433K
(46, XX)
Higroma
quístico y
displasia
renal.
E433K
Mutación en gen SOS1
en la madre y en la niña
“Fenotipo
turneriano”
diagnosticada
post PRENATAL
lL
ab
or
ato
rio
FORMA
FAMILIAR
Noonan-SOS1
1297 G>A
Cl
ín
Sospecha ecográfica feto TRASLUCENCIA NUCAL , cromosomopatía
descartada. OTROS HALLAZGOS anomalía renal.
ico
20
Alteraciones ecográficas asociadas en sospecha Noonan (defectos cardíacos o
higroma quístico o polihidramnios o ascites o derrame pleural o hydrops fetalis o
anomalías renales o hidrotorax o saco linfático yugular)
14
Co
ng
CONTROLES
CALIDAD
re





so
Na (identificación, transporte)
PREANALÍTICA
cio
Muestra prenatal
naFETAL (examen y marcadores)
l d y cantidad, técnica a
Extracción DNA (calidad
el
aplicar). “NUEVA MUESTRA”
L
ab de enfermedad
Estudio molecular específico
or
 Externo nacional NO HAY
ato
 Externo europeo (lista “disease-specific” EMQN)
rio
Técnica/s molecular aplicada/s: EMQN
Cl
íni
 Secuenciación (EQA
co
 MLPA (controles internos calidad DNA, desnat, etc…)
20
 Fragmento microsatélite
14

ESTUDIO SIMULTÁNEO DEL CASO INDICE
Co
http://www.emqn.org/emqna/LabP
ng
urchase.do
(acceso Oct 10, 2014)
re
so
Na
cio
na
ld
el
La
bo
ra
tor
io
Cl
íni
co
20
14
Co
ng
re
so
Na
cio
n
“Elementos” y “Caracteres”
al
Biólogo austriaco.
(1822 – 1884 Brno)
dLEYES:
el
Uniformidad,
La Segregación y Combinación indeoendiente
bo
Los principales aciertosrde Mendel fueron los siguientes:
ato por individuos idénticos y
Utilizar Líneas puras, constituidas
homocigóticos.
r
io discernibles
Elegir caracteres cualitativos fácilmente
Fijarse cada vez en un sólo carácter.C
Proporciones numéricas
lín
fáciles
ico
Utilizar relaciones estadísticas en varias generaciones
sucesivas.
20
Llevar a cabo experimentos control, comprobar sus hipótesis.
14
Analizar caracteres independientes.
Co
ng
re
so
Na
cio
n
al
de
lL
Muchasabgracias
o
ra
tor
io
Cl
ín
ico
20
14
CoTratamiento y Diagnóstico prenatales HSC
ng
TRADICIONAL
(multidisciplinar, experimental)
re
so existe INDICACIÓN si riesgo FETO AFECTO forma
UNICAMENTE
Na progenitores PORTADORES MUTACIÖN SEVERA)
CLASICA 1:4 (ambos
cio Previene la virilización de niñas afectas
na Debe ser instaurado entre la 6ª y 8ª semana
l d(muestra prenatal vellosidad coriónica (10-11ª),
el
amniocitos
(14-15ª)
Lindirecto
Análisis
Dexametasona
ab dosis y pauta ≠ tto no clásica
Seguimiento
or de madre y feto
ato el tiempo de tratamiento
Minimizar/evitar
DEFINIR LA INDICACIÓN
rio
AD
AI
Retirar tto en varones, niñas sanas y portadoras
Cl conocer sexo fetal
Evitar tto de varones (exigiría
íni
CON PRECISIÓN antes de 8ª semana)
c
o2
ESTUDIO PREVIO INDICE
ESTUDIO PREVIO PAREJA
0
14
ANÁLISIS directo e indirecto V.C.
•Dexa 6ª sem
•Vellosidad
coriónica:
CYP21A2 y sexo
•Estudio INDICE
y padres
•Feto femenino
AFECTA
•Seguimiento
madre y feto
Med Clin 1997
Tto Diag
TSPY
Sexo
fetal (8ª
sem)
Seguimiento de NO AFECTOS QUE HAN SIDO TRATADOS PARCIALMENTE
Co Virilizante simple HSC-21OHD
Forma
ng
Diagnóstico
prenatal feto no afecto portador
re
so
Na
cio
n
NIÑA AFECTA
A
al
de
Clitoromegalia con fusión parcial de los
labios mayores y seno urogenital sin
gónadas palpables Prader II-III
Heterozigota compuesta
N
M p.Arg356Trp
P
M
IND
6
3
6
N
p.Ile172Asn
M
PCR-ASO, PCR gen-específica CYP21A2) y mutaciones recurrentes
10
D5S273 3
D6S439 7
TNF
11
TNF
6
D5S273
5D6S439 3
R356W/N
lL
ab
or
N/I172N 6
6
6 TNF 11
3 D5S273 5
R356W/I172N
6
D6S439
ato
rio
3
6
6
TNF
D5S273
D6S439
Forma
CLÄSICA
VIRILIZANTE
TGC AGC ATC ATC TGT TA
Prenatal I172
normal
CTG CGC CTG CGG CCC GTT
TGG
Prenatal R356W
HETEROZIGOTO
Análisis directo
Secuencia parcial ex 8
CYP21A2
6
6
3
6
R356W/N
PORTADOR NO AFECTO
Análisis
indirecto
Análisis
indirecto
Cl
ín
Microsatélites región HLA
SI crom 6 NOR materno
NO crom 6 MUT materno
(no contaminación tej mat)
ico
20
14
FETO NO AFECTO
Portador

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