Caso de estudio 1: frijol resistente a virus

Estudio de caso 1: Frijol resistente a virus
(RV)
PARTE I: LA PLANTA NO TRANSGÉNICA
DESCRIPCIÓN GENERALDE LA PLANTA.
El frijol común (Phaseolus vulgaris L.), es una planta anual, herbácea, e intensamente cultivada
desde la zona tropical hasta las templadas. Es originario de América y se le conoce con diferentes
nombres: poroto, haricot, caraota, judía, alubia, habichuela, feijão y otros. El frijol es uno de los
alimentos básicos en la dieta del mexicano y es la principal fuente de proteína; es rico en lisina pero
deficiente en los aminoácidos azufrados metionina, cistina y triptófano; por lo cual una dieta
adecuada en aminoácidos esenciales se logra al combinar frijol con cereales (arroz, maíz, otros). El
frijol se adapta bien desde 50 hasta 2,600 msnm. El cultivo necesita entre 300 a 400 mm de lluvia.
La falta de agua durante las etapas de floración, formación y llenado de vainas afecta seriamente el
rendimiento. El exceso de humedad afecta el desarrollo de la planta y favorece el ataque de gran
número de plagas y enfermedades.
El frijol requiere desde el inicio del ciclo hasta un mínimo de sesenta días después de la siembra de
humedad adecuada en el suelo, para un buen crecimiento, desarrollo de la planta, formación y
llenado del grano; a la vez requiere de un período seco o de poca precipitación al final del ciclo,
para favorecer el proceso de maduración y cosecha. Por estas razones es importante sembrar a
tiempo, para no carecer de humedad y para que la cosecha coincida con una estación seca favorable.
Cuando se desea sembrar al final de la época de siembra recomendada, se sugiere el uso de
variedades precoces o de ciclo corto. Respecto de la morfología y fenología de la planta sólo se
menciona aquí brevemente, la existencia de varios hábitos de crecimiento que se correlacionan
directamente y en general, con la longitud del ciclo de desarrollo; el intervalo va desde el hábito
determinado, precoces desde 80 días (matas), hasta el indeterminado hasta 180 días (enredaderas),
En cada variedad, la sucesión y duración de las diferentes etapas de desarrollo, aunque están
determinadas genéticamente, se ven también afectadas en cierto grado por las condiciones del
medio, siendo los factores del clima como temperatura, humedad, duración e intensidad de la luz,
los más importantes.
Se mencionan otros aspectos importantes en su biología reproductiva. Las flores de frijol
desarrollan en una inflorescencia de racimo, la cual puede ser terminal como sucede en las
variedades de hábito determinado o lateral en las indeterminadas. La inflorescencia consta de
pedúnculo raquis, brácteas y botones florales. Los botones florales desarrollan en las axilas de las
brácteas. Pueden ser blancas, rosada o de color púrpura. La floración inicia cuando por lo menos el
10% de las plantas presentan una o más flores. Prosigue en plena floración durante un período en
que todas las plantas presentan flores y más del 50% de éstos muestra una floración abundante. El
final de la floración se considera cuando solamente el 10% de las plantas muestran flores bien
desarrolladas. El fruto es el ovario desarrollado en forma de vaina con dos suturas que unen las dos
valvas; Las semillas se unen a las valvas en forma alterna sobre la sutura placentaria. Las
divergencias laterales están constituidas por los cotiledones y las dos hojas primarias verdaderas;
Los cotiledones forman la parte voluminosa de la semilla, son hojas modificadas para el almacén de
carbohidratos y proteínas y constituyen la parte aprovechable de la semilla. El embrión se sitúa
dentro de la semilla entre los cotiledones con la radícula orientada hacia el micrópilo y la plúmula
hacia el interior del grano.
1
La madurez fisiológica ocurre cuando la planta ha completado su ciclo de vida y se puede arrancar
o cortar sin consecuencias negativas en la fisiología y peso de la semilla. En frijol se presenta
cuando la planta aún tiene algunas hojas senescentes (envejecidas y amarillentas) y la mayoría de
las vainas muestran sus valvas apergaminadas y secas.
Fig. 1. Etapas de desarrollo temprano de la planta de frijol y componentes morfológicos y fisiológicos del
rendimiento agronómico.
SIGLAS: 2C: Cotiledones; HC: Hojas de cotiledón; 3F: Hojas trifolioladas (no. variable
según hábito de crecimiento; BA: brotes axiales (para trifolios o racimos florales)
3F
HC
HC
BA
2C
C
BIOLOGÍA REPRODUCTIVA DE LA ESPECIE.
CENTROS DE ORIGEN Y CENTROS DE DIVERSIDAD GENÉTICA.
México se encuentra en uno de los centros de domesticación de esta planta: Mesoamérica. Aparte
de los tipos andinos, en esta región existen cuatro de las cinco especies domesticadas y 45 de las 50
especies del género. Las dos especies de frijol más importantes son Phaseolus vulgaris (frijol
común), cuyo centro de domesticación está ubicado en el centro-occidente de México (Jalisco,
Michoacán y Guanajuato) y Phaseolus lunatus (frijol ibes), cuya mayor diversidad de poblaciones
silvestres y cultivadas se encuentra en la Península de Yucatán. Además de ser cultivadas, en ambas
se encuentran formas silvestres y arvenses. Se ha analizado en algún grado la diversidad, la
estructura genética, el flujo genético y relaciones evolutivas dentro y entre el complejo de
poblaciones silvestre-arvense-domesticado. Aunque los frijoles son autógamos, algunas
conclusiones de estos análisis sugieren que existe cierto flujo entre las poblaciones, por lo que la
introducción de genotipos nuevos y de transgénicos debe considerada en el marco de de bioseguridad, pues el escape de genes provenientes de la poza andina y transgenes tanto a poblaciones
domesticadas como a silvestres sería probable (Piñero et al., 2009).
Especies de frijol que existen en México únicamente se han domesticado y cultivado cuatro.
Phaseolus vulgaris, conocido como frijol común es el de mayor importancia agronómica y
económica, se cultiva en todos los estados del país y ocupa el 95% de la superficie dedicada al
frijol. De los cultivados de Phaseolus vulgaris existe una amplia variación de color, tamaño, forma
de grano, así como habito de crecimiento y precocidad, en rango de adaptación y potencial de
producción, en calidad comercial y nutritiva. Considerando alguna de estas características,
2
principalmente la de color forma y tamaño de la semilla, se describen 7 ó 5 variedades botánicas:
sphaericus, ellipticus, oblongus, compressus, subcompressus, carrinatus, gonospernus. No
obstante, desde el punto de vista económico, existen otras categorías de diferenciación, ligadas a los
nombres comerciales y variedades mejorardas con adaptación regional.
Cuadro 1. Tipos varietales o cv. comerciales de frijol en México. Se indican los de mayor producción en el
país
MEDIOS
DE
DISPERSIÓN
Y
ESTABLECIMIENTO (e.g., polen, dispersión de semilla, propagación vegetativa,
etc.)
Las variedades cultivadas de frijol común, como parte de una especie parcialmente domesticada,
han perdido varios de los mecanismos silvestres de establecimiento y dispersión presentes en otros
miembros del género. En principio es una especie cleistogámica, que significa que se autopoliniza a
una alta frecuencia, ya que en esta condición, las anteras maduran y el polen fecunda a los óvulos
dentro de flores bisexuales, antes de que abra la corola. Los fitomejoradores deben recurrir a
prácticas de polinización forzada, emasculando precozmente a las flores receptoras; aún así el
promedio de éxito es cercano al 10%. La dispersión de semilla es también muy limitada en
variedades cultivadas, ya que los mecanismos de dehiscencia de la vaina han sido
contraseleccionados en el germoplasma domesticado para evitar la pérdida de grano. El consumo de
vainas tiernas (ejotes), implica el cocimiento de las semillas dentro de la legumbre; para procesar
las vainas secas y extraer las semillas, los métodos manuales recurren a la movilización de la
cosecha a espacios distintos a las parcelas de cultivo; con los métodos mecanizados que procesan el
cultivo sobre los surcos, se reducen sustancialmente la dispersión de semillas. No existen estrategias
de propagación vegetativa en el frijol, ya que las variedades cultivadas de P. vulgaris son anuales y
distinto a algunas variedades arvenses de P. coccineus o de P. polyanthus (acalete), no quedan
estructuras de propagación de un año a otro; por otro lado, para la la propagación clonal de líneas de
3
frijol, se debe recurrir al cultivo in vitro, que requiere medios especiales de cultivo conteniendo
fitohormonas.
HIBRIDACIÓN (CRUZAMIENTOS) INTRAESPECÍFICA E INTERESPECÍFICA O INTERGENÉRICA:
Existen diversos estudios sobre la taxonomía y relaciones filogenéticas de las especies de Phaseolus
spp. cultivadas dentro del género y de la subtribu Phaseoline. Estas relaciones ha sido
continuamente restablecidas a partir de nueva información fenética y genómica, que sugieren
posibles flujos con poblaciones arvenses y silvestres en regiones específicas y restricciones a la
hibridación entre las pozas genéticas presentes en los centros de origen y diversidad (AcostaGallegos et al. 2007). Como se mencionó, la condición de cleistogamia y la selección agronómica,
reducen significativamente la hibridación natural en este género, y en especial, a nivel
intraespecífico en variedades cultivadas. Desde el punto de vista agronómico, la selección del tipo
de variedad y la calidad de la semilla en cuanto a su pureza genética han cobrado especial
importancia, en virtud de la diversificación del mercado para las cosechas en México, aunque hay
preferencias regionales muy marcadas en el consumo entre el norte, el centro y el sur.
REFERENCIAS
Acosta-Gallegos J, JA Kelly & P Gepts (2007) Prebreeding in common bean and use of genetic diversity
form wild germplasm. Crop Sci. 47 (S3): 44-59
Escalante JA & Kohashi-Shibata J. (1993) El rendimiento y crecimiento de frijol. Manual para la toma de
datos. Centro de Botánica (COLPOS), Montecillo, Méx. 84 pp.
Piñero D, et al. (2009) 15. La diversidad genética como instrumento para la conservación y el
aprovechamiento de la biodiversidad: estudios en especies mexicanas, p. 457-8 (15.5.7. Frijoles) En: Capital
natural de México, Vol. I (Conocimiento actual de la biodiversidad), Tercera parte (El conocimiento de la
variabilidad genética), Conabio, México.
http://www.biodiversidad.gob.mx/pais/pdf/CapNatMex/Vol%20I/I15_Ladiversidadgen.pdf
Reyes-Rivas E., et al. (2008) Historia, naturaleza y cualidades alimentarias del fríjol, Revista Investigación
Científica (UAZ). 4(3): 1-21 - ISSN 1870-8196
http://estudiosdeldesarrollo.net/administracion/docentes/documentos_personales/15599InvestigacionCientificaVol4No3_1.pdf
4
PARTE II: EL AMBIENTE RECEPTOR
CULTIVO DE LA ESPECIE DE ESTUDIO EN MÉXICO
El cultivo del frijol ocupa un lugar importante en la economía agrícola del país, tanto por la
superficie que se le destina, como por la derrama económica que genera. En conjunto con el maíz,
constituyen la dieta básica del pueblo mexicano y en consecuencia son los productos de mayor
importancia socioeconómica tanto por la superficie de siembra como por la cantidad consumida per
capita. En el país se cosechan más de millón y medio de hectáreas que en 2008 produjeron
alrededor de un millón 120 mil toneladas (Cuadros 2B y 2C). Con la liberación del precio y la
apertura de las fronteras a la importación de este producto, la comercialización se ha convertido en
el principal problema, ya que a pesar de que el país sigue siendo deficitario, eventualmente el
mercado se satura con producto importado que desplaza a la producción nacional, especialmente a
la de Sinaloa, donde se producen principalmente variedades de tipo azufrado, cuyo mercado se ha
venido reduciendo en los últimos años. En consecuencia, la rentabilidad del cultivo dependerá en lo
sucesivo de la planeación de las siembras, la diversificación de los tipos de variedades (para mejorar
su adaptación, productividad y calidad), la pureza del material que se ofrezca al consumidor (y
potencialmente, a mercados internacionales), cada vez más exigentes.
Cuadro 2. Indicadores agroeconómicos de la producción de frijol en México y otros países.
2. A.
2. B.
5
2. C.
PRESENCIA DE CUALQUIER PARIENTE SEXUALMENTE COMPATIBLE EN EL AMBIENTE RECEPTOR.
México, como parte de una región de origen y diversificación del género Phaseolus,
específicamente del llamado complejo genético (o gene pool) mesoamericano, posee una
distribución amplia de variedades silvestres y mejoradas. La dinámica poblacional de este género,
indica que los procesos de hibridación silvestre son muy infrecuentes y que la diversificación se ha
dado principalmente por deriva y selección humana. Asimismo coexisten las otras tres especies con
variedades cultivadas (P. coccineus [ayocote], P. acutifolius [tépari] y P. lunatus ([frijol lima, ibes o
comba]), cada una con algún nicho preferencial, regional, pero sin perder su identidad ya que
incluso cruzas interespecíficas experimentales son poco viables e infértiles. Sólo con técnicas de
rescate de embriones se han logrado progenies útiles para mapeo genético y con potencial para la
introgresión de caracteres de interés agronómico (Acosta-Gallegos et al. 2007).
INTERACCIONES ECOLÓGICAS
complejos de plagas
EN EL AMBIENTE RECEPTOR
(e.g. identificación de los principales
Para el presente documento, se hará una reseña de las dos plagas más relevantes relacionadas con
este evento, haciéndose mención de otras en el contexto de la evaluación de riesgos ambientales,
dentro de las parcelas, como en sus inmediaciones.
Plagas del frijol
Las plagas son responsables en alto grado de mermas en el rendimiento y el manejo que se les dé es
determinante para lograr una buena producción. Es frecuente encontrar dos tipos de daño: el directo,
ocasionado por insectos masticadores, y el indirecto, causado por insectos chupadores, que
transmiten principalmente enfermedades de tipo viral.
Cuadro 3. Principales plagas y enfermedades de frijol en México (cf. SENASICA, COLPOS, Campos-Ávila)
ORDEN
***
Coleoptera
Lepidoptera
Lepidoptera
Coleoptera
GÉNERO ESPECIE
Phyllophaga spp.
Agrotis sp.,
Striacosta albicosta
Spodoptera sp.,
Pseudaletia
unipuncta
Epilachna varivestis
NOMBRE COMÚN
TIPO DE DAÑO
Gallina ciega
Larvas rizófagas
Gusanos trozadores
Las larvas dañan plántulas, tallos
y hojas
Gusano soldado,
barrenador
Las larvas dañan tallos y hojas
Conchuela
Larvas y adultos causan daño
severo del follaje
6
Lepidoptera
***
Xenochalepus
signaticollis
Minador de la hoja
Lepidoptera
Heliothis
(=Helicoverpa) zea
Gusano ejotero
Homoptera
Empoasca kraemeri
Cicharritas
Diptera
Bemisia tabaci
Mosca blanca
Coleoptera
Diabrotica spp.
Doradillas, loritos,
diabótica (adultos)
Thysanoptera
Trips
Larvas que hacen galerías en
hojas
Las larvas dañan la planta y
especialmente las vainas
Adultos y ninfas masticadores
causantes de clorosis,
achaparramiento y enrollamiento
Adultos, ninfas y larvas causan
marchitez y sin vectores del
BGMV en circulación continua.
Existe control biológico
Larvas rizófagas, los adultos se
alimentan de hojas, flores y
vainas
Adultos chupadores que causan
marchitez
Coleoptera
Apion godmani, A.
aurichalceum
Picudo del ejote
Daño severo a vainas y semillas
Hemiptera
Aphis spp.
Pulgones o áfidos
Adultos chupadores que causan
marchitez
Othoptera
Brachystola magna,
Brachystola
mexicana
Chapulín gordiflón,
Adultos masticadores y
trozadores de follaje
Hemíptera
Nezara virudula
Chinche verde
Coleoptera
Enfermedades
Acathoscelides
obtectus
Géneros de
agente(s) causales
Gorgojo
Nombre común
Colletotrichum lindemuthianum
Antracnosis
Uromyces appendiculatus, U. phaseoli
Roya o chahuixtle
Fusarium, Rhizoctonia, Pythium,
Thielaviopsis, Sclerotium,
Aphanomyces, Phymatotrichopsis y
Macrophomina spp.
Pudriciones de raíz
Insecto chupador de hojas y
vainas
Daños severo a semillas
almacenadas
Tipo de daño, tolerancia o
resistencia
Manchas negras alargadas en
hojas y tallos, redondas en vainas
Formación de pústulas café rojizo
en hojas y vainas; efecto
defoliante.
Lesiones hundidas acuosas de
colores terrosos, que ocasionan
amarillamiento del follaje.
Pseudomonas syringae pv.
phaseolicola
Tizón de halo
Xanthomonas phaseoli
Tizón común
Meloidogyne y Nacobbus aberrans
Nematodos formadores
de agallas
Puntos café en hojas, con
formación posterior de halo o
corona café, genera clorosis y
defoliación, cv. resistentes
Puntos de color verde húmedo,
que desarrollan clorosis y
necrosis.
Formación de nodulaciones.
quistes o agallas en raíces
Mosaicos (común, amarillo [sureño] del
frijol y dorado del frijol)
Enfermedades virales
Tolerancia en P. coccineus
Por la relevancia de caso, se amplía la información al respecto del Complejo mosquita blanca:
Bemisia tabaci y B. argentifolii. La importancia de la mosquita blanca en el cultivo de frijol se debe
a su capacidad para transmitir el virus del mosaico dorado. Los síntomas de esta enfermedad son: el
aspecto en mosaico de las hojas, enanismo y/o superbrotación en las plantas. Además de esto, las
plantas infectadas precozmente, tienden a alargar su ciclo vegetativo, hecho relacionado a la
brotación excesiva de flores. Las vainas, cuando se desarrollan, presentan deformaciones o un
tamaño reducido, con semillas subdesarrolladas y deformes, lo que afecta la calidad final del grano
7
y su valor comercial. Las mayores poblaciones de este insecto vector ocurren durante el verano
(julio-septiembre) y decrecen en el invierno (a partir de octubre), por los cuales las fechas de
siembra son determinantes para reducir riesgos de daño por mosquita blanca. Se considera que
siembras muy tempranas (septiembre) o muy tardías (diciembre) son las más afectadas. En general,
las siembras de la tercera decena de octubre son las más apropiadas para disminuir los riesgos
mencionados. Cuando se requieren aplicaciones de insecticidas debe considerarse la etapa
tecnológica en que se encuentra el cultivo. Los muestreos y aplicaciones deberán realizarse antes de
las 8:00 A.M. o bien durante la tarde, debido a la actividad de vuelo de la plaga. Los adultos de
mosca blanca miden 1.5 milímetros, son de color blanco-amarillento; se les encuentra en el envés
de las hojas y cuando se les disturba vuelan rápidamente. Ovipositan cientos de huevecillos en el
envés de las hojas; las ninfas son aplanadas y al nacer pegan a las hojas succionando la savia y
produciendo mucha excreta melosa en donde se desarrolla fumagina lo que da una coloración
negruzca a las plantas. Como el control químico es difícil y costoso, antes de aplicar insecticidas se
debe hacer una buena evaluación de los niveles de plaga y estimar sus posibles daños económicos.
Se ha encontrado que la aplicación de soluciones jabonosas ayudan al control de la plaga a costos
comparativamente, pero las aplicaciones deben hacerse con pulverizadores que garanticen una
buena cobertura. La solución jabonosa actúa sobre la ligera capa cerosa que protege el cuerpo de la
plaga y al exponerla al sol, provoca su deshidratación y muerte.
Combate de malezas
El frijol una planta poco competitiva. Se han observado reducciones en la cosecha hasta de 75%
cuando no se han manejado las malezas durante todo el ciclo de cultivo. Los primeros treinta días
de cultivo, debe mantenerse libre de malezas, ya que este es el período crítico en que las malezas
causan un daño irreversible y por lo tanto pérdidas en el rendimiento. Existen varios métodos de
combate de malezas: el mecánico, por medio de deshierbas manuales, mediante el uso de
cultivadores tirados por tractor en siembras mecanizadas y el combate químico por medio de
herbicidas, método que ha demostrado ser una alternativa eficaz, oportuna y económica. Existen
varios ingredientes activos que se utilizan en el combate de malezas en frijol.
8
PARTEIII: LA PLANTA TRANSGÉNICA (Embrapa 5.1)
EL PROPÓSITO DE LA TRANSFORMACIÓN (e.g., Resistencia a insectos, tolerancia a sequía, fenotipo
desplegado, etc.)
La Empresa Brasileña de Investigación Agropecuaria (Embrapa) desarrolló una línea de frijol
común (Phaseolus vulgaris L.) genéticamente modificada (GM), en adelante denominada Embrapa
5.1. El evento Embrapa 5.1 en frijol, fue generado con el uso de la estrategia de ARN interferente o
de interferencia (RNAi) y es altamente resistente al virus del mosaico dorado del frijol [cuya
nomenclatura oficial en lengua inglesa es Bean golden mosaic virus (BGMV)].
El evento Embrapa 5.1 se obtuvo a partir de la inserción de transgenes en el genoma nuclear
utilizando el método de biobalística descrito por Aragão et al. (1996). Para la obtención de
resistencia al virus se insertó un gen quimérico para la expresión de un ARN que contiene un par de
fragmentos del gen rep (AC1) del BGMV, colocados en sentido y antisentido pero intercalados por
un intrón. Ese RNA fue diseñado para formar un transcrito con secuencias de ARN bicatenario
(double stranded, o dsRNA) que son reconocidas por un complejo molecular de la célula, el cual
genera pequeños fragmentos de ARN (small, interfering o siRNA) los cuales interfieren con la
expresión del gen rep viral (cf. Cuadro 4.). Como consecuencia de la falta de expresión del gen rep,
la replicación viral se ve comprometida y las plantas se vuelven resistentes a la virosis. En adelante,
el casette (módulo) de expresión del ARN en horquilla (‘hp’ por hairpin que forma dsRNA) será
llamado ΔAC1hpRNA. Para la selección de los brotes genéticamente modificados originados de
células apicales de embriones cigóticos de frijol, se insertó el gen AtAhas de Arabidopsis thaliana
(también llamado csr1.2; AtAhas será la denominación aquí), junto a su propio promotor y la región
3’ no traducida (3´UTR) nativa. El gene AtAhas codifica la subunidad mayor de la enzima acetohidroxiácido sintasa (AHAS), también llamada acetolactato sintasa, que confiere tolerancia a los
herbicidas del grupo químico de las imidazolinonas. Aunque el evento Embrapa 5.1 presenta copias
íntegras del gen AtAhas, se verificó que las plantas no tuvieran una tolerancia significativa a este
tipo de herbicidas. La tolerancia es suficiente apenas para permitir la selección in vitro de los brotes
generados a partir de células transformadas, originados a partir del meristemo apical de embriones
de frijol.
REGIÓN
DE CULTIVO PREVISTA (COMO CULTIVO PARA AUTOCONSUMO, DE ESPECIALIDAD O A NIVEL
INDUSTRIAL)
El evento Embrapa 5.1 ha sido la base para el desarrollo de variedades comerciales de frijol de
diversos grupos para cultivo en Brasil. El aprovechamiento de las variedades de frijol común
Embrapa 5.1 GM será una importante herramienta para el control del mosaico dorado en Brasil y
posiblemente, en otros países de América Latina. Como se ha mencionado anteriormente, el
mosaico dorado es causado por el BGMV, el cual se transmite por poblaciones plaga de ‘mosquita
blanca’ (Bemisia tabaci) presentes en todas las regiones del continente donde se cultiva el frijol.
Cuando se presenta la enfermedad, las pérdidas estimadas en la producción de granos puede variar
de 40 a 100% dependiendo de la incidencia, la época de cultivo y el cultivar. En México, se
reportan pérdidas importantes por virosis en varios estados productores, por lo que las regiones
previstas para experimentación e introducción serían aquellas a nivel de alta producción comercial,
donde no se reportan complejos cultivados-arvenses silvestres, estrechos (Zac, Dgo, Sin, Nay) La
búsqueda de cultivares resistentes al mosaico dorado fue iniciada en la década de los 70’s habiendo
sido encontrados apenas bajos niveles de tolerancia a la enfermedad. No existe, ni en Brasil ni en
México, una variedad con un nivel adecuado de resistencia al mosaico dorado; tampoco se ha
observado inmunidad a la enfermedad dentro del género Phaseolus. Hay tolerancia en cultivares de
origen mesoamericano, especialmente vs. el Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV), pero no
9
inmunidad. Como consecuencia de esta falta de un alto nivel de resistencia genética, el control del
mosaico dorado se ha hecho dependiente de prácticas culturales para el manejo de la enfermedad
por métodos de control químico del vector (mosca blanca). El principal método de control de la
mosca blanca continúa siendo el químico. Se ha registrado un número aproximado de 23 principios
activos para el control de la mosca blanca en frijol, aunque, pocos de ellos han mostrado ser
eficientes. En pruebas realizadas en condiciones controladas, los principios activos en los grupos de
los organofosforados, los piretroides, carbamatos, han sido eficientes para el control de adultos de
mosca blanca B. tabaci raza A, pero ineficientes para B. tabaci raza B.
Los insecticidas del grupo de los neonicotinoides han sido eficientes en el control de adultos de
mosca blanca B. tabaci raza B. Los principios activos thiamethoxan, acetamiprid e imidacloprid
fueron los más eficientes en el control de la mosca blanca B. tabaci raza B. Las formulaciones de
thiametoxan y de imidacloprid se utilizan en el tratamiento de semillas y en pulverizaciones.
Actualmente, en pruebas realizadas con pulverizaciones de neonicotinoides, se ha verificado una
reducción acentuada de la eficiencia y del efecto residual para el control de adultos. Este hecho
tiene como causa principal, la exposición continua de las poblaciones de mosca blanca a los
neonicotinoides, continuamente utilizados para su control. Por otro lado, se recomienda como una
medida preventiva al tratamiento de semillas y pulverizaciones secuenciales con adulticidas, el
establecimiento de un cultivo de frijol, con probabilidad de ser infestada por mosquitas blancas
provenientes de otros cultivos, como la soya. En áreas de cultivo continuo de frijol, esta misma
recomendación, no tendría el efecto esperado, porque se presenta una migración de adultos
virulíferos, portadores del virus de mosaico dorado. El insecticida actúa con eficiencia en el control
de adultos de mosca blanca, pero no es capaz de evitar la transmisión del virus. Además de ello, la
aplicación continua de insecticidas ocasiona la elevación en los costos de producción.
UN
RESUMEN DE LOS ELEMENTOS GENÉTICOS INTRODUCIDOS Y SU ORIGEN (TIPO DE SECUENCIA,
ORGANISMO DONADOR)
Cuadro 4. Resumen de elementos genéticos en el evento EMBRAPA 5.1
ELEMENTO
GENETICO*
P- ahas3’
CS - ahas-cds
T- ahas5’
P-35S
AC1 (fragmento interno)
I - pdk
ocs3’
ΔAC1
FUNCIÓN
Promotor y secuencia líder del gen ahas de Arabidopsis thaliana (AtAhas)
Secuencia codificante del producto AHAS (aceto-hidroxiácido sintasa) de A.
thaliana que confiere resistencia al herbicida imazapyr
Región de terminación del gen de Atahas
Promotor del ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV)
Fragmento del gen viral AC1 (rep) del mosaico dorado del frijol común (BGMV)
involucrado en la replicación del virus
Intrón del gen pdk de Flaveria trinervia
Región terminal del gen de octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens
Bloque génico dentro del inserto en el genoma de frijol Embrapa 5.1, que incluye 2
copias del fragmento de interferencia de 424 pb de AC1 del BGMV e incluye los
fragmentos 35S, pdk y ocs3’ (cf. Fig. 2)
P – Promotor; I – Intrón; CS – Coding Sequence (secuencia codificante); T – secuencias 3’ no traducida con señales para
terminación de transcripción y poliadenilación; *cf. Fig. 2
10
Figura 2. Mapa esquemático del inserto pBGMVRNAiAHAS que contiene los elementos genéticos descritos en el
Cuadro 4. Las flechas sólidas indican los iniciadores de PCR usados en el monitoreo de plantas. [Tomado de: Bonfim et
al. (2007). Molec. Plant-Microbe Interact. 20(6): 717-26]
Los análisis genético y moleculares mostraron que los transgenes fueron insertados en un único
locus del genoma nuclear y que se han mantenido estables por varias generaciones de
autofecundación, y después de cruzas y retrocruzas con variedades comerciales no modificadas
genéticamente (no-GM). En este evento, no se encontraron secuencias funcionales del gen bla de E.
coli que codifica para una beta-lactamasa (la cual confiere resistencia a compuestos beta-lactámicos
como la ampicilina que es usada como marcador de selección bacteriano). Esto era lo que se
esperaba, ya que el vector pBGMVRNAiAHAS, utilizado en la transformación del frijol, fue
digerido con la enzima de restricción FspI. Como el sitio de restricción que corta esa enzima se
encuentra dos veces dentro del vector y al interior de la secuencia del gen bla, la digestión del
vector resulta en la inactivación del gen marcador.
HERENCIA Y ESTABILIDAD DE CADA ATRIBUTO INTRODUCIDO (e.g. análisis de segregación, integridad del
inserto, etc.)
Fig 3. Herencia del atributo introducido. Representación esquemática de plantas de frijol GM (sombreado gris) y noGM (cuadros blancos) en la primera generación (R1) y en líneas heterócigas (R2) y homócigas (R2H) de la segunda
generación. Las plantas que mostraron síntomas de BGMV están marcados con un punto negro; las flechas indican las
progenies (generación R2) derivadas de las tres plantas transgénicas identificadas en la primera generación. T: líneas
transformadas; C controles cv. Olathe. [Tomado de: Bonfim et al. (2007). Molec. Plant-Microbe Interact. 20(6): 717-26]
11
Marcadores de peso molecular (Kpb)
Fig. 4. Estabilidad del inserto. Análisis (tipo Southern) de ADN genómico de frijol para detectar el módulo ΔAC1en
plantas de varias generaciones (carriles 1-10: marcados en gris en panel B) del evento Embrapa 5.1. El carril 11 es una
planta no-transgénica (F. Aragão, com.pers.).
En hojas de frijol GM cultivados en tres localidades de Brasil (Londrina, estado de Paraná [PR];
Santo Antônio de Goiás, estado de Goiás [GO] y en Sete Lagoas, estado de Minas Gerais [MG]),
fueron detectados los ARN pequeños de interferencia (siRNA) codificados por el transgén
insertado. Tales siRNA son el resultado de la expresión del inserto ΔAC1hpRNA, que produce una
horquilla de ARN bicatenaria (dsRNA) que no es traducido, pero que es procesado por
componentes macromoleculares de la célula para la formación de dos especies de siRNA. Mas aún,
los siRNA se encontraron en hojas, pero se detectaron a niveles traza en las semillas frescas; en
12
semillas cocidas no fue posible detectar siRNA. Más adelante, los análisis in silico e in planta no
mostraron ninguna señal de efecto off-target (ectópicos; es decir, el silenciamiento no intencional de
otros genes en leguminosas, humanos y animales) y se descarta la posibilidad de alteración
bioquímica de las plantas, tal y como pudo ser observado por los análisis de caracterización
agronómica y los análisis de composición nutricional.
DIFERENCIAS EN VARIABILIDAD GENÉTICA Y FENOTÍPICA CON EL CULTIVO NO TRANSGÉNICO.
Aparte de los aspectos agronómicos (ver p. 14), esta apartado se refiere a los aspectos de
equivalencia sustancial. La inocuidad para el consumo humano y animal de los transgenes
expresados en el evento Embrapa 5.1 fue evaluada por varios estudios que confirmaron que la
composición de este es sustancialmente equivalente al del su tipo parental, y similar al de otras
variedades de frijoles cultivados en Brasil. También se llevaron a cabo estudios de alimentación con
animales que no mostraron alteraciones comparados con grupos testigo que fueron alimentados con
el frijol cv. parental Olathe. El frijol es fuente de fibra, proteína y hierro. Por tanto, se realizó un
análisis extenso de composición de granos colectados en las localidades cultivadas de Paraná, Goiás
y Minas Gerais en el año de 2008, y sólo de los dos últimos en 2009. Los granos fueron colectados
y sometidos a un análisis de composición para la determinación del contenido de azúcares, de
vitaminas (B1 y B2), minerales (aluminio, calcio, cobre, hierro, fósforo, magnesio, manganeso,
potasio, zinc); de aminoácidos (triptófano, cisteína, metionina, ácido aspártico, serina, ácido
glutámico, glicina, histidina, arginina, treonina, alanina, prolina, tirosina, valina, lisina, isoleucina,
leucina, fenilalanina). Paralelamente, se determinó también el % de humedad, cenizas, proteína
total, extracto etéreo, así como de la concentración de ácido fítico y de inhibidores de tripsina. En
razón de no tener disponible información sobre el contenido de factores nutricionales y antinutricionales presentes en granos de frijol cultivados en Brasil, se generó un una base de datos para
este cultivo utilizando las variedades BRS Valente, Diamante Negro, Pérola, Timbó y Olathe
(parental del evento Embrapa 5.1), cultivados en distintos ciclos de los años 2003 a 2007 en
municipios de los estados de Goiás, Espírito Santo, Minas Gerais, Paraná y Rio Grande do Sul. Tal
estudio mostró que los niveles de estos componentes son similares entre la variedad GM, su
parental y las otras cuatro variedades convencionales cultivadas en Brasil.En relación a la
inocuidad, los animales alimentados con siRNA aislados de hojas de frijol GM no mostraron
ninguna alteración bioquímica o de desarrollo en relación a los controles. Aunque la expresión del
gen AtAhas fue muy reducida, a juzgar por la dificultad de detectar la proteína AtAHAS en tejidos
de hoja y semillas del frijol Embrapa 5.1, los análisis realizados tanto in sillico como in vitro
mostraron que esa proteína no tienen ningún potencial de alergenicidad. La predicción del potencial
alergénico de las proteínas AtAHAS y SEC61 (de cuya secuencia tampoco se detectaron
transcritos)requirió un análisis in silico que reveló que no tienen identidad con alergenos conocidos.
Adicionalmente, la comparación de las proteínas AHAS de A. thaliana y de Phaseolus vulgaris
mostró una similitud en secuencia de aminoácidos del 83% y de 98-100% en las regiones
catalíticas, característica de la superfamilia de las enzimas dependientes de tiamina difosfato
(ThDP).
Recientemente la CTNBio en Brasil, aprobó el evento BPS-CV127 de soya genéticamente
modificada la cual es tolerante a los herbicidas del grupo químico de las imidazolinonas, debido a la
expresión del gen AtAhas (con el mismo fragmento de expresión usado para la generación del
evento de frijol Embrapa 5.1). En este proceso, quedó demostrado experimentalmente que las
proteínas AtAHAS e SEC61 no poseen características de proteínas tóxicas ni alergénicas. Para
complementar esto, debe mencionarse que esas proteínas están presentes en plantas (de una forma
general), y no existen antecedentes de alergenicidad para la especie donadora del gen (A. thaliana).
Sea analizó asimismo, el perfil protéico de los granos de las variedades GM y no-GM cultivados en
localidades agrícolas de los tres estados mencionados. Las principales proteínas presentes en granos
13
maduros de frijol fueron identificadas y los resultados revelaron que el patrón es el mismo tanto
entre las variedades como entre localidades.
DIFERENCIAS
EN LAS MANERAS Y/O TASAS DE REPRODUCCIÓN COMPARADAS CON EL CULTIVO NO
TRANSGÉNICO (e.g., datos disponibles sobre entrecruzamiento)
Como se indicó anteriormente, por la condición autogámica más o menos generalizada de los
frijoles cultivados y basados en los estudios de segregación, no se llevaron a cabo otras
estimaciones de polinización cruzada, por lo que no hay datos adicionales disponibles sobre
posibles tasas diferenciales de entrecruzamiento.
EXPRESIÓN DE NUEVAS PROTEÍNAS EN DIFERENTES TEJIDOS A LO LARGO DEL DESARROLLO.
Se verificó asimismo, que el evento Embrapa 5.1, que posee copias íntegras del gen AtAhas, no
tuviera en campo, una tolerancia significativa a los herbicidas de selección. Su tolerancia debe ser
apenas suficiente para permitir la selección in vitro de brotes generados a partir de células
transformadas, derivadas a su vez, de meristemos apicales de embriones de frijol. El evento
Embrapa 5.1 no presenta tolerancia a dosis equivalentes a 1/10 de la utilizada comercialmente.
Consecuentemente el evento no podrá ser utilizado como alternativa tecnológica el para el control
de maleza.
Fig. 5. Análisis de expresión de ARN en plantas de frijol por hibridación (análisis tipo Northern) y por tinción (bromuro
de etidio; loading control). Las plantas fueron mantenidas por 6 días en presencia de mosquitas blancas virulíferas. Se
aisló el RNA total de hojas primarias de 6 y 12 días a partir de plantas transgénicas (T) y no transgénicas (NT),
inoculadas (i) o no-inoculadas (ni) con el Bean Golden Mosaic Virus (BGMV); C+ control positivo con ADN del virus. Los
patrones trasferidos (blots), se hibridaron con probadores para detectar la presencia de siRNA específicos, en A:
fragmento de AC1 (rep), -24 y -18, marcadores de PM del ARNr; en D (arriba), el ADN del virus BGMV se detectó con
un ensayo de PCR semicuantitativo para AC3; (abajo), el nivel del gen Pv18SrRNA se usó como control interno de
carga equivalente. [Modificado de: Bonfim et al. (2007). Molec. Plant-Microbe Interact. 20(6): 717-26].
14
DIFERENCIAS EN CARACTERÍSTICAS AGRONÓMICAS COMPARADAS AL CULTIVO NO TRANSGÉNICO.
La caracterización agronómica del evento Embrapa 5.1 cultivado en tres regiones de Brasil por un
período de dos años, no derivó en ninguna alteración fenotípica del frijol Embrapa 5.1, cuando fue
comparado con su cultivar parental ‘Olathe’. Tampoco se observaron diferencias en la germinación
de las semillas, sometidas o no a un proceso de almacenamiento. Cuando se cultivaron plantas de
frijol GM y no-GM en suelos de baja y alta fertilidad, no se observaron diferencias significativas en
los parámetros agronómicos, reflejando que en esas condiciones, no hubo una alteración en la
absorción de nutrientes.
Cuadro 5. Análisis de las características agronómicas entre las líneas de frijol Embrapa 5.1 (GM, BGMVR,) y el
parental convencional cv. Olathe (no-GM, BGMVS), en tres localidades de cultivo en Brasil. [Tomado de: Aragão & Faria
(2009), Nat. Biotech 27 (12): 1086-8].
LOCALIDAD
Genotipo
Característica*
Rendimiento (Kg/ Ha)
Germinación de semillas (%)
Altura inicial de plantas (cm)
Anchura de hojas (cm)
Peso de 100 semillas (g)
Tiempo a floración (dd-germ)
Semillas por vaina
Goiás
Minas Gerais
Paraná
Convencional
Frijol GM
Convencional
Frijol GM
Convencional
Frijol GM
770.8
86.9
10.4
6.8
27.3
31
5.8
628.1
91.4
10.2
6.7
29.7
31
5.7
2,460
87.9
13.6
7.4
31.0
32
5.3
2,476
85.4
13.5
7.3
32.1
32
5.4
2,268
75.2
9.9
6.4
31.4
30
5.6
2,344
86.2
9.7
6.3
32.7
30
5.7
* El análisis estadístico indicó la ausencia de diferencias significativas entre las líneas transgénicas y controles (P < 0.05; intervalo de prueba de
Tukey-Studentizado, n=48).
DIFERENCIAS EN SUSCEPTIBILIDAD A ENFERMEDADES O PLAGAS COMPARADAS AL CULTIVO NO
TRANSGÉNICO.
Fig. 6. Desarrollo de la virosis con BGMV en líneas de frijol común cultivadas en campo en distintos años en Brasil.
Comparación de líneas modificadas genéticamente para resistencia al mosaico dorado del frijol por silenciamiento
génico mediado por siRNA (Olathe T lines, trazo sobre el eje de abcisas), comparado con 3 variedades no-transgénicas.
La evaluación de la enfermedad se llevo a cabo visualmente, registrando la aparición del aclaramiento de nervaduras.
[Tomado de: Aragão & Faria (2009), Nat. Biotech 27 (12): 1086-8]
15
IMPACTO POTENCIAL EN ORGANISMO NO-BLANCO EN EL AMBIENTE RECEPTOR:
La evaluación de riesgo ambiental del evento de frijol Embrapa 5.1 implicó realizar múltiples
estudios con la intención de analizar posibles efectos sobre diversos organismos que interaccionan
con la planta en condiciones de campo. Los ensayos se realizaron en condiciones de invernadero y
de parcela experimental en tres regiones de Brasil durante un período de dos años. Se determinó en
primera instancia, la estructura así como la fluctuación poblacional de artrópodos asociados a las
parcelas cultivadas con frijoles Embrapa 5.1 y convencional, tanto en la parte aérea como en la
superficie del suelo. Las especies conocidas como plagas y enemigos naturales más comunes de los
sistemas de producción de frijol, se identificaron visualmente utilizando los manuales
correspondientes. En tales estudios fueron observadas pocas diferencias dentro de las comunidades
de artrópodos en la superficie del suelo entre ambos tratamientos, lo que permite concluir que el
evento Embrapa 5.1 no causa ningún efecto sobre la diversidad de artrópodos en esta zona.
Considerando los análisis cualitativos y cuantitativos complementarios sobre la macro y mesofauna
(especies más abundantes en suelos bajo influencia del frijol Embrapa 5.1), se determinó que los
grupos de macrofauna más abundantes fueron: hormigas, larvas e adultos de coleópteros, larvas de
dípteros, isópteros y oligoquetos. La comunidad de mesofauna del suelo tuvo al grupo de los ácaros
como el más representativo. El número medio de unidades taxonómicas por muestra o la diversidad
promedio en cada grupos presentó una variación significativa en función de la localidad, tanto para
macrofauna como para mesofauna del suelo. No obstante, no se observaron diferencias
significativas en ambos tipos de comunidades, entre los suelos cultivados con frijol convencional y
los del transgénico Embrapa 5.1, en cada localidad individual de ensayo.
Otras evaluaciones comparativas de relevancia ecológica, incluyeron las siguientes:
a). Los posibles efectos sobre Zabrotes subfasciatus, que es el principal gorgojo que ataca los
granos de frijol almacenado en las regiones más cálidas de los trópicos. Para ello se estimó el efecto
del frijol Embrapa 5.1 sobre el desarrollo biológico de 10 generaciones del gorgojo Z. subfasciatus.
Este experimento se llevó a cabo en el Laboratorio de entomología de Embrapa Arroz e Feijão, en
Santo Antônio de Goiás, GO. Los resultados demuestran que este evento biotecnológico no
interfiere con los parámetros de desarrollo biológico de Z. subfasciatus.
b). Estudios para determinar la producción de materia seca y acumulación de nitrógeno. Se
concluyó que la producción de materia seca por las plantas de frijol varió entre los tratamientos
dependiendo sólo del suelo de las diferentes localidades analizadas.
c). La comparación de los dos genotipos (evento Embrapa 5.1 y su parental Olathe) mostraron un
comportamiento similar frente a condiciones de estrés. Los resultados coinciden con el análisis de
los mecanismos de defensa antioxidante a través de las enzimas: catalasa, ascorbato peroxidasa e
superóxido dismutasa (SOD), así como las mediciones de daño celular (peroxidación lipídica) y
daños a proteínas, utilizando extractos de hojas de frijol GM (Embrapa 5.1) y su parental no-GM
(Olathe). En estos casos también, los resultados no mostraron diferencias entre los genotipos.
d). La nodulación y dependencia por fijación biológica de N2 por las raíces en plantas de frijol se
revisó también y no se encontraron alteraciones significativas entre los genotipos comparados.
e). Se estudió también la asociación de una comunidad de hongos micorrízicos arbusculares y las
raíces de las plantas de frijol, por medio de: el análisis de la densidad de esporas de HMAs (hongos
micorrízicos arbusculares) en la rizosfera de las plantas; la colonización de las raíces por HMA
nativos y el número de especies de HMAs identificadas en la rizosfera, es decir, el censo de
16
especies dentro de la comunidad de HMAs nativos. De una manera general, no se observaron
diferencias significativas entre el frijol Embrapa 5.1 y su cv. parental Olathe no-GM, lo que indica
la ausencia de alteraciones en la capacidad de micorrización debido a la modificación genética
derivada del evento en cuestión.
f). Se efectuó también un análisis cualitativo y cuantitativo de los microorganismos en suelo bajo
influencia del frijol Embrapa 5.1. Los análisis del perfil de alfaproteobacterias en la rizósfera de
plantas de frijol, se realizaron en parcelas experimentales en las localidades referidas de Paraná,
Goiás y Minas Gerais. A través de los dendrogramas generados utilizando DDGE (Denaturing
Gradient Gel Electrophoresis), fue posible observar que no hay cambios importantes en los
agrupamientos de secuencias formados entre ambas comunidades microbianas.
g). En la medición de actividades enzimáticas en el suelo cultivado con ambos genotipos en
distintas regiones de Brasil, no se detectaron diferencias estadísticas entre las muestras de rizósfera
asociadas con el frijol transgénico Embrapa 5.1 y el convencional (Olathe) con respecto a las
actividades de las enzimas: aril-sulfatasa (conjunto de enzimas del ciclo del azufre), fosfatasa ácida
y β-glucosidasa. La rizósfera es la porción del suelo que sufre influencia directa de la planta
ocasionada por los exudados que produce. Las alteraciones en el patrón de actividad enzimática del
suelo representada por un grupo de enzimas determinadas (i.e., fosfatasa ácida, beta-glucosidasa y
aril-sulfatasa), podrían ocurrir como consecuencia de la influencia de la planta sobre la actividad
biológica de la rizósfera. Las actividades de las enzimas claves del suelo, han sido utilizadas para
investigar una posible integración ente los procesos bioquímicos y la calidad del suelo, reflejada en
el estatus biológico del mismo. Las enzimas del grupo de las beta-glucosidasas son producidas por
una variedad de organismos, entre ellos, animales, plantas, hongos y bacterias. La beta-glucosidasa
es una enzima que actúa en la etapa final del proceso de descomposición de celulosa, por la
hidrólisis de los residuos de celobiosa, y las alteraciones en su actividad pueden tener, por tanto,
influencia sobre la calidad del suelo. Por los resultados encontrados, en los estudios con las
variedades de frijol, se puede concluir que la modificación genética que confiere resistencia al
mosaico dorado, no implican una alteración sensible y consistente capaces de influenciar las
actividades enzimáticas claves en la dinámica del C, S y P, en la rizósfera de frijol.
DISPONIBILIDAD GENÉRICA DE DATOS SOBRE EXPOSICIÓIN (e.g., flujo de polen, difusión de proteínas,
etc.).
Por la condición autógama del frijol no se ha considerado aún muy relevante llevar a cabo estudios
de flujo de polen. En el caso de la difusión de proteínas, este evento no implica la producción de
proteínas translocables a la superficie de la planta o difisibles al suelo; se ha demostrado que las
enzimas responsables de la resistencia contra herbicidas de selección experimental, se producen y
actúan a niveles insignificantes y que aún así, son inocuas.
REFERENCIAS SOBRE OTRAS EVALUACIONES DE RIESGO LLEVADAS A CABO EN OTROS PAÍSES.
Como se observa en el presente reporte, el estudio de evaluación de riesgo sanitario, alimentario y
ambiental más extenso y completo, se ha llevado a cabo en Brasil por parte de las unidades de
Recursos Genéticos y de Arroz y Frijol de Embrapa.
---------------------------------------------------
17