Microscopia y Tinciones

22/04/2008
Seminario N° 2
Microbiología General
Microscopia y Tinciones
Microscopía
Conceptos básicos: NA, resolución, partes del microscopio.
Microscopios: campo claro, campo oscuro, contraste de
fases fluorescencia,
fases,
fluorescencia confocal,
confocal interferencia,
interferencia electrónico de
barrido, de transmisión, fuerza atómica, efecto tunel.
-------------------------------------------------------------------------------Preparación de extendidos.
Tinciones: simples, diferenciales, especiales.
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Límite de resolución
Antony van Leeuwenhoek
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Descripción de Van Leeuwenhoek de
los
“pequeños
animáculos“
presentes en la placa dental. (First
edition, Delft in Holland, 12 September
1683, to Francois Aston, Pag.11).
Dibujó bacilos, micrococos y espirilos.
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Apertura numérica
Máxima AN (teórica)
En objetivos secos:
n = 1 y alfa = 90° entonces
AN = 1
En la práctica AN = 0.95
(ángulo 72 °)
En objetivos de inmersión:
Índice de refracción
n = 1.51 y alfa = 90° entonces
AN = 1.51
En la práctica AN = 1.45
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Apertura numérica
Apertura Numérica (AN) = n . sen (alfa)
n = índice de refracción del medio entre el objeto y el objetivo
(alfa) = mitad del ángulo descripto por el cono de luz que ingresa
al objetivo.
Uso de un condensador
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Uso de Aceite de inmersión
•Máximo teórico de AN = 1: α = 90°, sin α = 1, naire = 1
•Práctico: AN máx. = 0.95 ángulo de apertura ~ 72°
•Máximo teórico AN = 1.51: α = 90°, sin α = 1, noil = 1.51
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Poder de Resolución
Distancia mínima entre dos puntos para que estos
sean vistos como dos objetos individuales
R = λ / (NA objetivo + NA condensador)
R = λ /(2 NA)
Si luz verde λ = 550 nm , NA = 1.4 (para inmersión)
Entonces R = ?
Microscopio óptico
Ocular
Cabezal
Revolver
Objetivos
Brazo
Ajuste de
la platina
Platina
C d
Condensador
d
Macrométrico
Micrométrico
Fuente de
luz
Base
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Distancia de trabajo
Diafragma
Microscopía de campo claro
Campo claro
Contraste de fases
Campo Oscuro
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Microscopía de campo oscuro
9 La luz reflejada sobre el espécimen entra al
objetivo. Entonces observo el espécimen sobre un
f d oscuro.
fondo
9 Permite observar microorganismo vivos (sin
teñir)
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Microscopía de contraste de fases
9 Convierte diferencias pequeñas en el n y la densidad
celular en variaciones de intensidad de luz fácilmente
detectadas.
detectadas
9Permite observar microorganismo vivos (sin teñir) y
seguir eventos dinámicos en células vivas (migración,
división, etc.)
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Microscopía de Interferencia
Diferencial (Nomarski)
Aprovecha los efectos de interferencia entre las ondas que
atraviesan la célula, para crear una imagen de la
estructura celular viva, nítida y tridimensional
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Célula epitelial de mejilla humana
Campo Claro
Nomarski
Campo Oscuro
Microscopía de fluorescencia
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Microscopía de fluorescencia
9 Sensibilidad:
Mediante
fluorocromos permite detectar
la presencia de moléculas en
baja cantidad (DNA, proteínas)
Microscopía Confocal
9 Capacidad de obtener la imagen en secciones (planos)
controlando la profundidad del espécimen.
9 Elimina el background !
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Microscopía Confocal
vs
Microscopía de fluorescencia
Fluorescencia
Pierde detalle por
alta señal de emisión
Confocal
Las secciones plano
por plano permiten
evidenciar diferencias
en estructuras
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Microscopía electrónica
MICROSCOPIO
DE LUZ
MICROSCOPIO
ELECTRONICO
Iluminación
Haz de luz
Haz de electrones
Longitud de onda
2000 Å - 7500 Å
370 nm
Lentes
Vidrio
Electromagnéticas
Medio
Atmósfera
Vacío
Resolución
0,2 um = 200 nm
0,0003 um = 0,3 nm
Magnificación
10 x - 2000 x
100 x - 450000 x
Focalización
Mecánica
Eléctrica
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Microscopio
electrónico de
transmisión
Microscopio electrónico de
barrido
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Microscopio de
Fuerza Atómica
(AFM)
Microscopio de
túnel de barrido
(Tunneling)
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Preparación
de extendidos
y tinciones
Colorantes
Benzeno
Solvente orgánico sin color
Cromógeno
+
Grupo químico que imparte
Cromoforo Color al solvente
Colorante
+
Grupo químico que permite la iniciación
Auxocromo del cromóforo permitiendo la formación
de sales y la unión a fibras y tejidos
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Tinción Simple
Se utiliza para la visualización de la
morfología,
g , el tamaño y la disposición
p
Tipos de
Gram
Separa entre grupos
tinciones
Tinción Diferencial
Ácido alcohol
resistentes
Flagelos
Visualización de
estructuras
Cápsula
Esporas
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Preparación
p
de
un extendido
Tinción simple
(procedimiento)
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Tinción negativa
(procedimiento)
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Tinción de Gram
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Tinción de
Gram
Tinción de
Ziehl-Neelsen
(BAAR)
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Tinción de Esporas
(Schaeffer-Fulton)
Tinción de
Esporas (Dorner)
Tinción de
Cápsula
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Manipulación de cultivos
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