7. Captación de la imagen en microscopía confocal

Transcripción

7. Captación de la imagen
en microscopía confocal
La mayor aplicación de la microscopía confocal es la
captación mejorada de imágenes de muestras
gruesas en una gran variedad de tipos de muestras.
La ventaja del sistema confocal resulta de la
capacidad de obtener imágenes de secciones
ópticas
individuales
a
elevada
resolución
en
secuencia a través de la muestra.
Hay varios modos de captación de imagen y todos
se basan en la sección óptica como unidad básica
Secciones ópticas sencillas
La sección óptica es la unidad de imagen básica en
los métodos de microscopía confocal.
Los datos se recogen de muestras fijadas y teñidas
en uno o varios modos de iluminación (con
diferentes longitudes de onda).
Las muestras con múltiple marcaje se recogen en
múltiples imágenes cada una de un marcador.
●
La mayoría de los microscopios láser confocal
tardan aproximadamente 1 segundo en adquirir una
sección óptica sencilla aunque, a veces, se recogen
varias y se promedian mediante software para
mejorar la relación señal/ruido.
Lapsos de tiempo y células vivas
●
Se pueden recoger secciones ópticas sencillas a
diferentes intervalos de tiempo seleccionados.
●
La obtención de buenas imágenes de células vivas
requiere extremo cuidado durante todo el proceso de
toma
de
imágenes
en
mantener
condiciones
tolerables en la platina del microscopio.
●
Se deben cuidar los requisitos específicos de cada
tipo de célula tales como temperatura ambiente,
atmósfera, etc.
●
Hay antioxidantes como el ácido ascórbico que se
añaden al medio de cultivo para reducir el oxígeno
que se puede liberar en la excitación de moléculas
fluorescentes y que causaría la aparición de
radicales libres que matan a las células.
●
El daño por la luz del láser es acumulativo después
de múltiples barridos por eso la exposición al haz
debe mantenerse en el mínimo necesario para
adquirir la imagen.
●
Se debe utilizar la menor potencia de láser que
permita obtener una imagen y recoger las imágenes
tan rápido como sea posible.
Series-z e imágenes tridimensionales
●
Una serie-z es una secuencia de secciones ópticas
recogidas a diferentes niveles perpendiculares al eje
óptico (el eje z) dentro de la muestra. Se recogen
coordinando paso a paso cambios en el foco fino del
microscopio con adquisición secuencial de imágenes
a cada paso.
●
A partir de una serie-z se pueden extraer varias
imágenes de una región de interés y mezclarlas con
un procesador de imágenes.
●
Una vez recogida la serie-z es ideal para procesarla
en una representación tridimensional de la muestra
usando técnicas de visualización de volumen.
Imágenes en 4 dimensiones
Las preparaciones vivas u otras muestras que
exhiben
fenómenos
dinámicos
presentan
la
posibilidad de utilizar el microscopio confocal para
recoger secuencias en lapsos de tiempo de datos
tridimensionales presentados con el tiempo como
una cuarta dimensión.
Imágenes x-z
Si se necesita una vista perfil de una muestra se
puede obtener una sección x-z de dos formas:
●
Barriendo una línea sencilla a través de la muestra
(en el eje x) a diferentes profundidades de z
cambiando el foco y mostrando la serie superpuesta
en una imagen
●
Cortando
un
plano
en
una
reconstrucción
tridimensional para extraer el perfil de una serie-z ya
existente.
Imágenes x-z
Imágenes x-z
Imágenes luz reflejada, transmitida...
Cualquiera de los modos de imagen comúnmente
empleados en microscopía se puede utilizar en el
microscopio confocal, incluyendo contraste de fases,
contraste diferencial interferencial, campo oscuro o
luz polarizada.
Un detector de luz transmitida se utiliza para recoger
la luz que pasa a través de la muestra y una fibra
óptica
transmite
fotomultiplicadores.
la
señal
a
uno
de
los
●
Una estrategia en algunos estudios es combinar la
imagen de luz transmitida no confocal de la muestra
con una o más imágenes fluorescentes de la misma
muestra.
Series: Proyecciones
Cada corte óptico, es decir, cada imagen individual,
muestra la información de un solo plano de la
muestra.
Las estructuras que se extienden por toda la
muestra se recogen de forma parcial en las
diferentes imágenes.
Para hacer visibles estas estructuras de forma global
se precisan las proyecciones.
Con los algoritmos de las proyecciones es posible
seleccionar
relevantes
los
fragmentos
repartidos
en
de
varias
información
imágenes
individuales y hacerla visible en una sola imagen de
dos dimensiones.
Tipo de proyección:
●
Proyección de valor máximo
●
Proyección de valor medio
●
Proyección transparente
Se parte de la premisa de que los valores de
intensidad máximos son información relevante para
la reconstrucción de una estructura.
Por ello, en esta proyección se busca el punto de
exploración con el valor máximo de cada columna y
se representa en la proyección bidimensional como
representante de toda la columna.
Se considera que todos los valores de intensidad
influyen en la proyección en igual medida.
Por ello se calcula la media aritmética de todos los
valores de intensidad de cada columna y se
representa en la proyección bidimensional como
representante de toda la columna.
También influyen todos los valores de intensidad,
pero se valoran de forma diferente. Los valores de
las imágenes inferiores del lote tienen menor
influencia que los de las imágenes superiores.
Por ello, en esta proyección se calcula la media
ponderada de todos los valores de intensidad de
cada columna .
Máxima
Media
Transparente
Imágenes digitales
Desde un punto de vista físico una imagen puede
considerarse como un objeto plano cuya intensidad
luminosa y color puede variar de un punto a otro.
Si se trata de imágenes monocromas (blanco y
negro), se pueden representar como una función
continua f(x,y) donde (x,y) son sus coordenadas y el
valor de f es proporcional a la intensidad luminosa
(nivel de gris) en ese punto.
Imágenes digitales
Para obtener una imagen que pueda ser tratada por
el ordenador es preciso someter la función f(x,y) a
un
proceso
de
discretización
tanto
coordenadas como en la intensidad.
A este proceso se le denomina digitalización.
en
las
Imágenes digitales
La digitalización consiste en la descomposición de la
imagen en una matriz de M x M puntos donde cada
uno tiene un valor proporcional a su nivel de gris.
Dado que este valor puede ser cualquiera dentro de
un rango continuo, es preciso dividir dicho rango en
una serie de intervalos, de forma que el nivel de gris
de cada punto sea asignado a uno de los valores
que representa dicho intervalo.
Imágenes digitales
Los sistemas de proceso digital de imágenes suelen
ser capaces de discriminar 256 niveles de gris.
y
f(x,y)
x
Imágenes digitales
Cada elemento en que se divide la imagen recibe el
nombre de "pixel" (picture element).
El número de niveles de gris y las dimensiones de la
matriz (numero de filas por nº de columnas)
condicionan la capacidad de resolución de la imagen
digital.
Imágenes digitales
512 x 512
256 x 256
128 x 128
64 x 64
32 x 32
16 x 16
Imágenes digitales
Zoom:
En la microscopía confocal la ampliación de una
imagen se determina, por una parte, mediante el
objetivo y, por otra, mediante el zoom electrónico.
El objetivo genera una imagen intermedia cuya
ampliación depende del factor de ampliación del
objetivo.
El
zoom
adicional.
electrónico
permite
esa
ampliación
Imágenes digitales
Zoom:
Con el factor de zoom 1 se explora el tamaño de
barrido máximo con un determinado número de
puntos.
Si se ajusta el factor a 2, con el mismo número de
puntos en el campo de barrido se explora la mitad
de la longitud lateral del campo máximo de barrido
(1/4 del campo de barrido original).
Imágenes digitales
Zoom:
Zoom = 1
Zoom = 2
Imágenes digitales
Zoom:
También se obtiene una gran ampliación y, de esta
forma, también una mejor resolución de la imagen,
ya que se explora un campo de menor tamaño con
la misma frecuencia, lo que proporciona una mayor
densidad de información.
Imágenes digitales
Zoom:
Es posible ajustar factores de zoom entre 1 y 32. No
obstante, el zoom electrónico no permite una
ampliación ilimitada.
El límite se alcanza con la distancia óptica más
pequeña aún resoluble determinada mediante el
poder resolutivo del objetivo.
Imágenes digitales
Zoom:
Esta distancia óptica aún resoluble se visualiza, de
acuerdo con el teorema de Nyquist, sin pérdida de
información cuando se explora con 2 ó 3 puntos de
trama.
Imágenes digitales
Zoom:
Si se sobrepasa la frecuencia de exploración debido
a un factor de zoom relativamente alto y un formato
de barrido determinado, no tiene sentido una
ampliación mayor ya que no pueden apreciarse más
detalles ópticos, ampliación vacía.
Imágenes digitales
Zoom:
Con el formato de barrido se selecciona también la
trama utilizada para la captura de la imagen.
Junto con la apertura numérica del objetivo y la
longitud de onda de excitación, el formato de barrido
determina,
además
del
zoom
electrónico,
resolución espacial de los datos capturados.
la
Imágenes digitales
Teorema de Nyquist:
Resolución lateral = 0,61λ / A.N.
Si se utiliza una longitud de onda de 488 nm y un
objetivo con una apertura numérica de 1,4
Resolución lateral = 0,61 x 488 / 1,4 = 212 nm
La distancia entre los puntos de trama estará entre
212 / 2 = 106 nm y 212 / 3 = 71 nm
Imágenes digitales
Teorema de Nyquist:
212 / 2 = 106 nm y 212 / 3 = 71 nm
Si se selecciona un formato de barrido de 1024 x
1024 con un objetivo cuya máximo tamaño de
campo de barrido es de 150 µm, la distancia de los
puntos de trama será
150 / 1024 = 0,146 µm = 146 nm
Este formato no recogería toda la información
disponible.
Imágenes digitales
1024
150 µm
1024
La distancia de los puntos de trama será
150 / 1024 = 0,146 µm = 146 nm
Imágenes digitales
Teorema de Nyquist:
Habría que incrementar el formato, por ejemplo a
2048 x 2048 para alcanzar la distancia necesaria
entre 106 y 71 nm
150 / 2048 = 0,073 µm = 73 nm
Imágenes digitales
2048
150 µm
2048
150 / 2048 = 0,073 µm = 73 nm
Imágenes digitales
Teorema de Nyquist:
O bien reducir el tamaño del campo de barrido con
la ayuda del zoom electrónico, por ejemplo zoom=2
150 / 2 = 75 → 75 / 1024 = 0,073 µm = 73 nm
Imágenes digitales
1024
Zoom = 2
75 µm
1024
75 / 1024 = 0,073 µm = 73 nm
Imágenes digitales
Teorema de Nyquist:
Si se utiliza un zoom mayor, por ejemplo 3, sólo se
estaría aumentando en vacío porque no se estaría
barriendo entre la distancia 106 y 71 nm
150 / 3 = 50 → 50 / 1024 = 0,049 µm = 49 nm
Imágenes digitales
Factores de zoom (marcados en rojo) con los que el
preparado se explora sin pérdida de información
Imágenes digitales
Formato:
Existen una serie de formatos de imágenes que son
legibles por la mayoría de los equipos de análisis de
imagen y por los programas de manipulación de
imágenes más conocidos.
Imágenes digitales
Formato
●
●
TIFF: Tagged Image File Format.
Es probablemente el formato de imagen más universal.
Soporta imágenes de 24-bits por pixel, pudiendo ser
comprimidas o no. El formato comprimido utiliza
algoritmos de compresión sin pérdida de información
con relación al fichero original.
GIF: Graphics Interchange Format.
Es un formato comprimido muy utilizado para guardar
iconos, gráficos e imágenes con pocos colores o en
niveles de gris. Sólo soporta imágenes de 8-bits por
píxel (256 colores). Se utiliza para intercambio por
internet.
Imágenes digitales
Formato
●
●
●
PCX: Es un formato del sistema operativo DOS.
Soporta imágenes de hasta 24-bits y no está
comprimido.
PSD: Photoshop Document.
Son ficheros utilizados sólo por Adobe Photoshop
pero conservan todas las capas y canales de la
imagen para una edición posterior.
EPS: Encapsulated PostScript.
Ficheros leídos por impresoras Postscript.
Imágenes digitales
Formato
●
●
BMP: Bit Mapped.
Son los mapas de bits estándares utilizados en el
entorno de Microsoft Windows. Soporta imágenes de
24-bits sin comprimir por lo que su tamaño suele ser
grande.
PICT: Considerado el formato estándar de imágenes
para Macintosh. Soporta 24-bits por píxel.
Imágenes digitales
Formato
●
JPEG: Joint Photographic Experts Group.
Es el formato comprimido más popular, compatible
con gran número de plataformas, muy usado para
páginas web o e-mail. Los datos son comprimidos
para eliminar información no detectable por el ojo
humano. La eficiencia de la compresión es excelente
pudiendo llegar a 1/20 ó 1/30 del original. La
compresión es “lossy”, al descomprimirlos esa
información se ha perdido. Soporta imágenes en
color real de 24-bits por píxel.

7. Captación de la imagen en microscopía confocal

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