PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

Transcripción

PRÁCTICAS DE
MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
(CURSO 2012–2013)
Prácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
Martes
PRÁCTICAS A REALIZAR
ANÁLISIS
CUANTITATIVO
DE ORINA
ANÁLISIS
CUALITATIVO
DE ORINA
M-1
Lectura
de la placa de Agar CLED
M-2
Identificación presuntiva
de las colonias crecidas en las placas de
Agar Cromogénico y Agar MacConkey
M-3
Tinción de Gram
de colonias aisladas en las placas de
Agar Cromogénico y Agar MacConkey
M-4
Prueba de la citocromo-oxidasa
a la presunta enterobacteria
M-5
Siembra de la colonia seleccionada
en Agar MacConkey
Martes
LECTURA Y CONCLUSIONES DEL ANÁLISIS CUANTITATIVO
DE LA MUESTRA DE ORINA
FUNDAMENTO
Tratamos de conocer el número de microorganismos presentes por cada mililitro de orina.
Independientemente del número, la presencia de ciertos microorganismos, por ejemplo,
levaduras o estafilococos en cultivo puro, es suficiente para considerar que existe un
proceso infeccioso.
METODOLOGÍA
Como hemos sembrado 1μL de muestra, si multiplicamos el número de UFC (unidades
formadoras de colonias) que aparezcan en la placa por 1.000, obtendremos el número de
microorganismos presentes por cada mL de orina.
La OMS recomienda utilizar el índice de Kass (105 UFC/mL de orina) como umbral para
considerar o no la existencia de una posible infección (> 105 UFC, bacteriuria significativa).
De todas formas, este valor es sólo indicativo, ya que hay personas que presentando
valores superiores al índice de Kass, están perfectamente sanas y otras, en cambio, tienen
infección en el tracto urinario (ITU) aun cuando no presentan más de 102 ó 103 UFC/mL
de orina.
Martes
ANÁLISIS CUANTITATIVO DE ORINA
Lectura de la placa de Agar CLED
Inoculada con un volumen de 1 μl de orina
¾
Contar el número de UFC en la placa
¾
Ejemplo:
¾
Nº UFC/µL
=
35
¾
Nº UFC/mL
=
35 x 103 =
¾
Nº UFC/mL
=
0,35 x 105
3,5 x 104
Nº BACTERIAS EN ORINA
Nº
>
105
105 /mL
Nº
<
/ mL
> Nº >
104
Bacteriuria significativa
Probable infección
/ mL
104
/mL
Diagnóstico dudoso
Debe repetirse el análisis
Bacteriuria no significativa
Probable contaminación
Martes
ANÁLISIS CUALITATIVO DE ORINA
Identificación presuntiva de colonias
Utilizaremos las placas:
Agar de MacConkey
Moderadamente selectivo
Agar Cromogénico
No selectivo
Observaremos la pigmentación de las
colonias y consultaremos la tabla.
Martes
AGENTES MICROBIANOS AISLADOS FRECUENTEMENTE
EN INFECCIONES URINARIAS
INDIVIDUO SIN
FACTORES
PREDISPONENTES
FRECUENTES
Escherichia coli
Proteus mirabilis
Klebsiella pneumoniae
Enterococos
POCO
Staphylococcus
FRECUENTES saprophyticus
INDIVIDUO CON
FACTORES
PREDISPONENTES
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
Otras enterobacterias
Enterococos
Staphylococcus epidermidis
Candida albicans
Corynebacterium urealyticum
Martes
Fermenta
la lactosa
Agar de
MacConkey
No fermenta
la lactosa
Agar de MacConkey
Zona oscurecida alrededor de las
colonias debida al precipitado de las
sales biliares cuando el medio se
hace fuertemente ácido
Martes
Martes
FERMENTACIÓN DE LA LACTOSA POR ENTEROBACTERIAS
Microorganismo
Tipo de
Liberación Liberación
Fermentador
fermentación de
de ácidos
de CO2
de lactosa
la glucosa
Escherichia coli
Fuerte
Ácido mixta
Muchos
Poco
Enterobacter
aerogenes
Fuerte
Butilén-glicólica
Pocos
Mucho
Klebsiella pneumoniae
Fuerte
Butilén-glicólica
Pocos
Mucho
Citrobacter
Lento
Ácido mixta
Muchos
Poco
Serratia
Lento
Ácido mixta
Butilén-glicólica
Muchos
Pocos
Poco
Mucho
Salmonella, Shigella, Proteus, Edwarsiella y Providencia: no fermentan la lactosa
Martes
PIGMENTACIÓN DE COLONIAS
BACTERIA
CLED
MACCONKEY
CROMOGÉNICO
Amarillo (grandes)
Rojo-rosa
(precipitado)
Rosa
Amarillo-azulblanquecino
Rosa
(mucosa)
Azul oscuro
Púrpura
Azul translúcido
Incolora
Halo marrón
Azul
Incolora
-
Verde
-
Verde
Marrón
Staphylococcus
aureus
Amarillo dorado
No crece
Blanco
Crema
S. epidermidis
Amarillo pálido
No crece
Rosa
Blanco pálido
Enterococcus
faecalis
Amarillo
No crece
Azul
Turquesa
-
No crece
Blanco
Escherichia coli
Klebsiella
Proteus
Salmonella
Pseudomonas
aeruginosa
Estreptococcus
Se realizarán tinciones de Gram a colonias
aisladas y se observarán al microscopio
Interesan únicamente las colonias que se
correspondan con bacilos Gram negativos
Se seleccionará una de estas colonias y se
le realizará la prueba de la oxidasa
La prueba de la oxidasa debe salir negativa
(todas las enterobacterias son
oxidasa negativas)
Martes
Martes
Tinción de Gram
1. Extensión.
2. Desecación.
3. Fijación.
4. Colorante: Cristal violeta, 2 minutos.
5. Lavar con agua.
6. Mordiente: Lugol, 2 minutos.
7. Lavar abundantemente con agua.
8. Decoloración: Alcohol etílico 96%, 20 segundos.
10. Colorante de contraste: Safranina, 3-4 minutos.
12. Dejar secar a temperatura ambiente.
13. Observar al microscopio con objetivo de inmersión (100X).
Gram positiva
Martes
Gram negativa
Extender y fijar
la preparación
Cristal violeta
Lugol
Etanol
Safranina
Martes
Gram
negativas
Tinción
de Gram
Gram positivas
Martes
Martes
Prueba de la citocromo oxidasa
Fundamento
Determinar la presencia del
enzima citocromo c oxidasa.
Procedimiento
-
+
Depositar unas gotas de
reactivo (tetrametil-p-fenilén
diamina) sobre un papel de filtro. Inmediatamente, con la ayuda de un palillo estéril
extender un inóculo de la bacteria sobre el papel de filtro impregnado de reactivo.
Prueba positiva
Aparición de color azul-violeta intenso en 10-15 segundos, debido a la formación de
azul de indofenol.
Control positivo
Pseudomonas aeruginosa.
SIEMBRA DE LA COLONIA SELECCIONADA
COMO PRESUNTA ENTEROBACTERIA
EN PLACA DE AGAR DE MACCONKEY
La colonia seleccionada debe cumplir:
Haber sido aislada en Agar Cromogénico
o en Agar de MacConkey
Se corresponde con bacilos cortos Gram
negativos
Dar negativa la prueba de la oxidasa
Martes
Siembra por estrías en sectores
de la placa de Agar de MacConkey
Martes

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