PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

PRÁCTICAS DE
MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
(CURSO 2012–2013)
Prácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
Jueves
PRÁCTICAS A REALIZAR
J-1
ANÁLISIS CUALITATIVO
DE ORINA
J-2
PRUEBA DE
BAUER KIRBY
(ANTIBIOGRAMA)
PRUEBA DE EPSILON
(DETERMINACIÓN
DE LA CMI)
J-3
Siembra de Agar Kligler
a partir de placa de Agar de MacConkey
Siembra de la galería API 20 E
a partir de placa de Agar de MacConkey
Siembra de una placa de Agar
Müeller-Hinton
a partir de placa de Agar de MacConkey
J-4
Siembra de una placa de Agar
Müeller-Hinton
a partir de placa de Agar de MacConkey
J-5
ANÁLISIS CUALITATIVO
MUCOSA FARÍNGEA
J-6
Siembra de la galería API STAPH
a partir de la placa de Agar Sangre nº 3
Siembra de la galería API STREP
a partir de la placa de Agar Sangre nº 3
Prácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
Jueves
ANÁLISIS CUALITATIVO DE ORINA
IDENTIFICACIÓN DE UNA ENTEROBACTERIA
FUNDAMENTO
1.
Cada alumno tratará de identificar una enterobacteria (sólo género).
2.
Por cada mesa se tratará de identificar una enterobacteria mediante el
sistema API 20E (género y especie).
METODOLOGÍA
A partir de la placa de Agar de MacConkey:
•
Se siembra un tubo de Agar de Kligler.
•
Se prepara una suspensión (de cualquiera de los alumnos pertenecientes a la
mesa), y con ella se inocula una galería API 20E.
Prácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
Jueves
Medio de Kligler
Es una prueba múltiple que permite conocer si una determinada
bacteria fermenta la glucosa, la lactosa, ambas a la vez o ninguna
de ellas. Se puede observar también la producción de gas.
Además, sirve para investigar si es capaz de producir sulfhídrico.
Medio de cultivo
Peptona
Lactosa
Glucosa
Cloruro sódico
Sulfato ferroso
Tiosulfato sódico
Rojo fenol
Agar
Agua destilada
20 g/L
10 g/L
1 g/L
5 g/L
0,5 g/L
0,5 g/L
0,025 g/L
15 g/L
1L
(pH: 7,4)
Pico de
flauta
Fondo
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Jueves
Siembra: con asa o con hilo (fondo en picadura y pico de flauta por estrías).
Incubación: 24-48 horas a 37ºC.
Hacer estrías en superficie con el asa o con el hilo
Introducir el asa o el hilo sin llegar a tocar el fondo del tubo
Retirar el
asa o el hilo
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Jueves
ANTIBIOGRAMA
PRUEBA DE BAUER-KIRBY
FUNDAMENTO
El método utilizado es el de Bauer-Kirby, un sistema que estandariza las
condiciones de la prueba (medio de cultivo, discos, concentración de
antimicrobiano, concentración del microorganismo, etc).
METODOLOGÍA
El medio utilizado es el Agar de Müeller-Hinton, medio de cultivo rico, diseñado
especialmente para hacer ensayos de sensibilidad y recomendado por la OMS por
no llevar incorporados inhibidores de los antimicrobianos, como, por ejemplo, el
PABA (ácido p-amino benzoico), que anula la actividad de sulfamidas y
antibióticos.
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Jueves
ANTIBIOGRAMA
PRUEBA DE BAUER-KIRBY
METODOLOGÍA
Se prepara una suspensión muy concentrada de bacterias (108 /mL) a partir de la
propia placa de Agar de MacConkey.
El Agar de Müeller-Hinton se siembra con un hisopo estéril. El hisopo se empapa
en la suspensión y se escurre sobre la pared del tubo.
A continuación, se siembra la placa con estrías muy juntas.
Se repite la operación dos veces más, tomando inóculo y cambiando la dirección
de siembra, girando la placa un ángulo de 120º, aproximadamente.
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Jueves
SIEMBRA DEL AGAR DE MÜELLER-HINTON Y
COLOCACIÓN DE LOS DISCOS
Se intenta obtener
un crecimiento
completo en la
placa, denominado
“confluente”.
Con ayuda de unas pinzas, flameadas en la llama del mechero y dejadas enfriar, se
colocan discos de papel impregnados con concentraciones conocidas de los diferentes
antibióticos o agentes quimioterapéuticos sobre la superficie del agar.
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Jueves
DIFUSIÓN DEL ANTIBIÓTICO
El antibiótico difunde radialmente
Su concentración disminuye a medida
que se va alejando del disco de papel
En esa línea circular el
antibiótico está en una
concentración igual al valor
de la CMI
Zona superior al valor de la
CMI
Zona inferior al valor de la
CMI
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Jueves
LECTURA DEL ANTIBIOGRAMA
Tras la incubación de la placa 24 horas a 37ºC, se miden los halos de inhibición
de desarrollo y se interpretan de acuerdo a tablas confeccionadas previamente.
Los resultados se expresan como: Sensible (S), Intermedio (I) o Resistente (R).
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Jueves
PRUEBA DE ÉPSILON (E-TEST)
DETERMINACIÓN DE LA CMI
La tira E-test incorpora un
gradiente exponencial de un
antimicrobiano desde uno de
sus extremos hasta el otro.
CMI
A medida que el microorganismo se multiplica,
el antimicrobiano difunde hacia el exterior de
la tira; la velocidad de difusión es proporcional
a la concentración en un punto concreto, lo que
determina la zona de inhibición.
Permite calcular la CMI (concentración mínima
inhibitoria) a partir de la escala que lleva
incorporada la banda.
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Jueves
La placa se siembra igual que en el caso
anterior con los discos, a partir de una
de las suspensiones cualquiera
preparadas
Con ayuda de unas pinzas se coloca una
tira (con los números hacia arriba) en el
centro de la placa sobre la superficie del
agar.
CMI = 2 mg/L
Se utiliza una tira E-test por cada mesa de
trabajo. De esta forma los 12 alumnos
llevarán a cabo la determinación de un
único valor de la CMI.
CMI = 0,64 mg/L
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Jueves
ANÁLISIS CUALITATIVO DE FARINGE
IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS
FUNDAMENTO
Identificar los géneros de los cocos Gram positivos sembrados en cada sector (diferenciar
Staphylococcus, Micrococcus y Streptococcus).
METODOLOGÍA
A partir de la placa 3 de agar sangre, se realiza la prueba de la catalasa a cada sector.
Staphylococcus: catalasa positiva.
Micrococcus: catalasa positiva.
Streptococcus: catalasa negativa.
Por cada mesa (grupo de 12 alumnos) se seleccionará un posible estafilococo (o
micrococo) o un posible estreptococo para identificarlos (género y especie) mediante los
sistemas API STAPH y API STREP, respectivamente.
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Jueves
Prueba de la catalasa
Fundamento
Detectar la presencia del enzima catalasa.
H2O2
Catalasa
H2O + O2
Procedimiento
Resuspender la bacteria problema en agua
oxigenada al 3% sobre un portaobjetos (o sobre
colonias en una placa de agar).
Prueba positiva
La presencia del enzima se detecta
por la aparición casi inmediata de
burbujas provocadas por el
desprendimiento de oxígeno.
Prácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
Sistemas comerciales de identificación bacteriana
Necesidad de mayor rapidez en diagnóstico.
Equipos y programas informáticos (ventajas).
Sistemas manuales
Sistema API
Muchos tipos
API 20E
(enterobacterias)
API STAPH
(estafilococos)
API STREP
(estreptococos)
Jueves
Prácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
Jueves
Galería API
Detalle de un tubo
Cúpula
Tubo
Aceite de parafina
Prácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
Jueves
Inoculación del API 20E
El cultivo elegido será el que mayor probabilidad tenga, entre todos los del grupo, de
pertenecer a una enterobacteria (bacilos Gram negativos, oxidasa negativa, procedentes
de una colonia seleccionada a partir de Agar de MacConkey o Agar Cromogénico).
A partir de la placa de Agar de MacConkey se preparará una suspensión densa en agua
destilada estéril.
Preparación y llenado de la galería
Añadir agua de grifo a la cubeta de plástico hasta llenar todos los alvéolos. Tirar el agua
sobrante.
Sacar la galería de la bolsa y colocarla en la cubeta.
Inclinar la cubeta para inocularla.
Aspirar el inóculo con la pipeta Pasteur de plástico y llenar cada tubo apoyando la punta
de la pipeta en el borde del tubo, procurando no formar burbujas.
IND
Llenar sólo el tubo.
ADH
Llenar el tubo con el inóculo y añadir unas gotas de parafina en la cúpula.
|CIT|
Llenar el tubo y la cúpula.
Incubar la galería 24 horas a 37ºC.
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Jueves
Inoculación de la galería API STAPH
El cultivo elegido será el que mayor probabilidad tenga, entre todos los del
grupo, de pertenecer al género Staphylococcus o al género Micrococcus.
Preparación y llenado de la galería
Añadir agua de grifo a la cubeta de plástico hasta llenar todos los alvéolos.
Tirar el agua sobrante.
Sacar la galería de la bolsa y colocarla en la cubeta.
Inclinar la cubeta.
Aspirar el inóculo con la pipeta Pasteur de plástico y llenar cada tubo
apoyando la punta de la pipeta en el borde procurando no formar burbujas.
ADH
Llenar el tubo con el inóculo y añadir unas gotas de parafina en la
cúpula.
Incubar la galería 24 horas a 37ºC.
Prácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
Jueves
PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN PARA
API STAPH
•
El cultivo del sector seleccionado se suspende en
el medio contenido en la ampolla API STAPH
MEDIUM:
•
1.
Romper la ampolla y colocarla en el Densimat.
2.
Recoger inóculo del sector seleccionado con un
hisopo y suspenderlo en el medio hasta conseguir
una concentración equivalente a 0,5 en la escala
de McFarland.
Realizar la inoculación con pipetas Pasteur de
forma idéntica a la utilizada para inocular el API
20 E.
Prácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
Jueves
PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN
Preparar una suspensión equivalente a 0,5 en la
escala de MacFarland (108 bacterias/mL) con la
ayuda de DENSIMAT
Prácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
Jueves
Inoculación de la galería API STREP
El cultivo elegido será el que mayor probabilidad tenga, entre todos los del
grupo, de pertenecer al género Streptococcus.
Preparación y llenado de la galería
La galería se prepara como en los dos casos anteriores y la inoculación se lleva
a cabo con una pipeta Pasteur de plástico apoyando la punta en el borde
procurando no formar burbujas.
IND
Llenar sólo el tubo.
ADH
Llenar el tubo con el inóculo y añadir unas gotas de parafina en
la cúpula.
|CIT|
Llenar el tubo y la cúpula.
Incubar la galería 24 horas a 37ºC.
Prácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)
Jueves
PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN PARA
API STREP
‰ Abrir una ampolla conteniendo 2 ml de agua destilada y
colocarla en el Densimat.
‰ Con un hisopo recoger inóculo del sector seleccionado de la
placa de Agar Sangre Nº 3 y resuspender hasta conseguir
una suspensión muy densa (4 McFarland).
‰ Con esta suspensión inocular los 10 primeros tubos (9
pequeños y 1 grande).
‰ Abrir una ampolla de GP Medium y verter su contenido sobre
el resto de suspensión.
‰ Sembrar con esta suspensión los siguientes tubos.