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ISSN: 1515-1883
CIENCIA
VETERINARIA
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS
UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PAMPA
Vol. 7
Nº 1
Año 2005
Ciencia Veterinaria
Volumen 7 - Número 1 - 2005
General Pico - La Pampa, República Argentina
ISSN: 1515-1883
Revista de Publicaciones Científicas de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
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Ciencia Veterinaria Vol. 7, Nº 1, Año 2005
ISSN: 1515-1883
2
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ISSN: 1515-1883
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Ciencia Veterinaria
Volumen 7 - Número
Número 1 - 2005
General Pico - La Pampa, República Argentina
ISSN: 1515-1883
-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-. ÍNDICE.ÍNDICE.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.
-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-Trabajos de InvestigaciónInvestigación-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-
Tumores de mama en la perra
Hermo, G., Garcia, M., Torres, P., Gobello, C
5
Diagnóstico inmunológico de la equinococcosis ovina
Gatti, A., Alvarez, A. R., Araya, D., Herrero, E., Costa, M. T., Mancini, S.,
Santillan, G., Larrieu, E.
30
Participación del glutamato en la adaptación osmótica de Pseudomonas
aeruginosas
Tortone, C. A., Lucchesi, G. I
49
Impacto de la fertilización nitrogenada sobre la producción y la
composición química de trigo doble propósito y otros forrajes invernales.
Revisión bibliográfica
Denda, S.
69
Tuberculosis Bovina: Valoración de la inmunohistoquímica como método
de diagnóstico complementario
Dubarry, J.
86
Constantes biofisicoquímicas del líquido sinovial de bovinos. Tensión
superficial a distintas temperaturas
Noia, M. A., Carroza, J. S. W., Frigoli, A. E., Simpson, M. I
91
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Tumores de Mama en la Perra
1
Hermo, G.; 2García, M.; 3Torres, P.; 4Gobello, C.
1
Laboratorio de Oncologia Molecular, Departamento de Ciencia y Tecnología.
Universidad Nacional de Quilmes, Buenos Aires, Argentina. 2Profesional
independiente. 3Cátedra de Técnica y Patología Quirúrgica y Cátedra de Química
Biológica, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLPam. 4Facultad de Ciencias
Veterinarias, UNLP.
RESUMEN
Los tumores mamarios caninos (TMC) representan casi la mitad de las neoplasias en la
perra. La etiopatogenia de los TMC es multifactorial. En perras el efecto protector de la
ovarioectomía temprana y la presencia de receptores para hormonas esteroideas en los
tejidos tumorales indican que el factor hormonal esta involucrado en el desarrollo de los
tumores mamarios. La presentación clínica de los TMC es muy variable, pudiendo ser
únicos o múltiples. En los casos múltiples pueden ser del mismo o diferente tipo
histológico. En esta revisión se presenta la clasificación histopatológica de los tumores,
junto a una breve descripción de las características particulares de cada una. Si bien la
cirugía es el método de elección para las neoplasias mamarias caninas, actualmente se
cuenta con diferentes modalidades de terapias adyuvantes que podrían mejorar el
pronóstico de la enfermedad. El objetivo del presente trabajo fue realizar una revisión y
actualización de los tumores de mama en la perra, poniendo especial énfasis en la
etiopatogenia, tratamiento y nuevas perspectivas creadas a partir de los avances
adquiridos en oncología molecular.
Palabras claves: Tumores mamarios, caninos, etiopatogenia, terapia, oncología
molecular
SUMMARY
Canine mammary tumors (CMT) represent nearly half of bitch's neoplasias. The
etiopathogeny of CMT is multifactorial. Both the protective effect of early
ovarioectomy and steroid hormone receptors present in the tumor tissues show that the
hormonal factor is involved in the development of mammary tumors. Clinical
presentation of CMT may be unique or multiple, being the latter of the same or different
histological type. The histopathological classification of tumors together with a brief
description of their particular features is presented in this review. Although surgery is
the best treatment for CMT, there are different adyuvant therapies that could improve
the prognosis of the disease. The goal of the present work was to make an updated
review of CMT, with special emphasis on its etiopathogy, treatment and new options
resulting from the advances in molecular oncology.
Key words: Canine, mammary tumors, etiopathogy, treatment, molecular oncology.
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INTRODUCCIÓN
La perra posee 4-6 pares de mamas divididos en dos cadenas (derecha e izquierda) y se
designan, según su localización, como torácicas (craneal y caudal), abdominales
(craneal y caudal) e inguinales. Las glándulas mamarias son glándulas cutáneas
modificadas, tubuloalveolares compuestas. Su desarrollo comienza en el embrión pero
su crecimiento total no se produce hasta la pubertad y concluye luego de la primera
parición (Claver et al., 1985).
Los tumores mamarios caninos (TMC) representan casi la mitad de los tumores en la
perra. La edad promedio de aparición es de 10 años, son raros en los machos y animales
jóvenes de ambos sexos (Van Garderbiblio, 1997). La etiopatogenia de los TMC es
multifactorial. El desarrollo de cáncer mamario canino en gran medida es
hormonodependiente. El objetivo del presente trabajo fue realizar una revisión y
actualización y de los tumores de mama en la perra, poniendo especial énfasis en la
etiopatogenia, tratamiento y nuevas perspectivas creadas a partir de los avances
adquiridos en oncología molecular.
PREVALENCIA
Los TMC son excepcionales en animales menores de 2 años. La incidencia aumenta en
forma marcada a partir de los 6 años y continúa haciéndolo hasta los 10 años, pasada
esta edad el riesgo disminuye. La ovarioectomía temprana es una firme protección
contra el desarrollo de tumores mamarios, el riesgo es de 0,5 % para las perras
esterilizadas antes del primer estro, 8 % para las esterilizadas después del primer ciclo y
26 % para aquellas esterilizadas después de 2 o más ciclos (Loar, 1989; Misdorp, 1988).
La administración de progestágenos se asocia con incremento en la aparición de
tumores mamarios benignos en la perra (Misdorp, 1988; Donnay et al., 1994; Rutteman,
1990; Selman, 1994). Los tratamientos con estrógenos utilizados para la interrupción de
la preñez también aumentan el riesgo de aparición de tumores mamarios (Donnay et al.,
1994; Rutteman, 1990). Se ha sugerido que los frecuentes episodios de pseudopreñez
podrían incrementar la aparición de lesiones preneoplasicas (Donnay et al., 1994;
Murrel, 1991; Rutteman, 1990; Selman, 1994). La obesidad y la dieta rica en grasas en
los primeros años de vida también fueron asociadas con un peor pronóstico e
incremento del riesgo de padecer tumores mamarios, respectivamente (Kitchell, 1995;
Sonnenschein, 1991). Los tumores mamarios benignos aparecen en la vida mas
tempranamente que los malignos (Misdorp, 1988) y en animales jóvenes a menudo
pueden presentarse displasias o hiperplasias (Perez Alenza et al., 2000).
ETIOPATOGENIA
La etiopatogenia de los TMC es multifactorial, en perras el efecto protector de la
ovarioectomia temprana y la presencia de receptores para hormonas esteroideas en los
tejidos tumorales indicarían que el factor hormonal podría estar involucrado en el
desarrollo de tumores mamarios (Battistacci, 1974; Hellmén, 1993). Se han encontrado
receptores para estrógenos y progesterona (ERs y PRs), en el 50% de los tumores de
glándula mamaria malignos y en el 70% de los tumores de glándula mamaria benignos,
como así también en el tejido glandular mamario normal (Corrada y Gobello, 2001).
Este hallazgo concuerda con la idea de que una desviación del mecanismo normal de
expresión de dichos receptores produciría un progresivo desarrollo de tumores
malignos. Los tumores que no presentan receptores son los más agresivos, así como
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también son más indiferenciados que aquellos que si expresan. Además la presencia de
receptores es muy poco frecuente en las metástasis, lo que podría indicar un patrón de
crecimiento autónomo. En humanos, los tumores ricos en Ers o Ers y PRs (Mc Guire,
1980; Nerurkar, 1987; Rooney y Henry, 1993) responden a la terapia de ablación
endocrina, pero los tumores que carecen de tales receptores no lo hacen y se consideran
de peor pronostico (Donnay et al., 1996).
Otros factores de crecimiento que podrían participar en el desarrollo de tejidos
mamarios normales y neoplásicos son el factor de crecimiento epidérmico (EGF), los
factores de crecimiento transformante (TGFs) (Blood y Zetter, 1990; Donnay, et
al.,1994; Ettinger y Felman, 1997), factor tipo insulínico I (IGF-I) y la proteína
relacionada a la hormona paratiroidea (PTHrP) (Gilbertson et al., 1983; Okada et
al.,1997; Weir, et al., 1998). Dichos factores están asociados con la presencia de Ers y
PRs en tumores de glándula mamaria (Gobello y Corrada, 2001; Rutteman et al., 1989).
Además, existen otros mecanismos muy importantes para el avance del proceso
neoplásico que se manifiestan especialmente en los tumores Ers negativos (Ers-), en los
que la progresión de la enfermedad es mas independiente de las hormonas esteroideas.
Los productos de oncogenes, entre los que se encuentran los factores de crecimiento y
sus receptores, cumplen un papel fundamental en los procesos de malignidad celular.
El IGF-I se sintetiza en el hígado y se encuentra en la circulación unido a proteínas
transportadoras. En los tejidos se hallan los receptores para este factor (IGF-Ir) que, al
unirse al ligando inician una serie de reacciones bioquímicas en cadena que finalmente
se expresan sobre la proliferación celular sin intervención del circuito Ers o bien,
simultáneamente, con el mismo.
El rol desempeñado por las hormonas hipofisarias mamotróficas en la tumorogenesis
mamaria todavía es controversial. La prolactina (Gobello, et al., 2001; Rutteman et al.,
1989; Rutteman, 1995) y hormona del crecimiento (GH) fisiológicamente estimulan el
desarrollo y diferenciación de la glándula y también la lactogénesis. La secreción de GH
inducida por la progesterona podría influenciar el desarrollo de tumores, que ocurriría
por la proliferación de células epiteliales mamarias susceptibles (Ettinger y Felman,
1997; Hahn, 2001; Hampe y Misdorp, 1974; Rutteman et al., 1989). Las mamas
neoplásicas producen, a su vez, GH que autoperpetuaría su desarrollo (Corrada, et al.,
2002). El riesgo de desarrollar un tumor mamario es más elevado para las perras que
presentaron muchas pseudogestaciones. Este aumento del riesgo ligado a muchas
pseudopreñeces podría ser secundario a la asociación del efecto de la edad y a la
acumulación de productos de secreción dentro de la mama. Estos productos no se
eliminan como en la lactancia fisiológica. Habría una combinación de hipoxia ligada a
la distensión de los acinos, liberación de radicales libres carcinogénicos y acumulo de
productos carcinogénicos de origen alimenticio o derivados de la degradación de la
misma leche. Estos productos estarían en un contacto prolongado con el epitelio
mamario y podrían inducir lesiones preneoplasicas o influenciar la evolución de
lesiones preexistentes. Dentro de todo esto la prolactina jugaría un rol indirecto por
inducción a la pseudogestación (Corrada y Gobello, 2001).
En ciertos tumores de glándula mamaria también se encontraron receptores para
glucocorticoides (Parodi et al., 1984) y dihidrotestosterona (DÁrville y Pierrepoint,
1979). Existen diversas enzimas involucradas en la etiopatogenia tumoral, este es el
caso de las metaloproteinasas de matriz (MMPs), las cuales juegan un rol fundamental
en los mecanismos de degradación durante los procesos de invasión y metástasis. Estas
enzimas forman parte de una familia de más de 10 endopeptidasas que son expresadas
en niveles bajos en los tejidos adultos normales, pero cuya expresión se eleva
rápidamente en procesos de remodelación tisular normales y patológicos tales como el
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desarrollo embrionario, la reparación tisular, la inflamación y durante la diseminación
tumoral. Varios trabajos reportan la elevada expresión de dichas enzimas en tumores
mamarios caninos y la directa correlación con el grado de malignidad (Hirayama et al.,
2002; Papparella et al., 2002; Yokota et al., 2001). Todas estas enzimas son secretadas
como proenzimas y requieren calcio y zinc para desempeñar su función. Los factores de
crecimiento que promueven el crecimiento tumoral también inducen la producción de
diversas MMPs. Dada la importancia de las MMPs, es lógico que se haya observado
con atención los avances en el conocimiento sobre los inhibidores tisulares naturales de
MMPs, los inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMPs), el TIMPs-1 es el
inhibidor mas conocido y ha sido aislado de una amplia variedad de tejidos y fluidos
corporales. Dentro de un modelo estocástico, la disminución de los niveles de TIMP-1
no solo iniciaría la oncogenesis, sino también predispondría a la célula a cambios
posteriores conducentes a la progresión tumoral (Gomez y Alonso, 1998).
La catepsina D es una de las proteasas que regula la cohesión del medio extracelular.
Resulta de importancia porque la génesis y desarrollo de las metástasis depende, entre
otros factores, de la integridad o ruptura de las proteínas que la célula metastásica
encuentra en su movilidad (Rocheford et al., 1992). Conjuntamente con otras proteasas
(colagenasa, metaloproteinasas, etc.) la catepsina D ha pasado a ser un marcador de
recurrencia y metástasis en las neoplasias. Su aumento se correlaciona con mayor
fluidez extracelular por proteolisis de cadherina, actina, vinculina y otras moléculas de
adhesión celular. Esta enzima también actúa sobre las proteínas de la membrana basal
de las células endoteliales, la cual favorece el desplazamiento de células neoplásicas que
irán a anidar a otros tejidos. Su síntesis es estimulada por estrógenos, que aumenta el
contenido circulante. No obstante esta presente en el tejido mamario neoplásico, tanto
de tumores Ers (+) como Ers (-).
La vinculación entre el colesterol y la biología tumoral se estableció hace tiempo,
cuando se observó que ciertas células neoplásicas sintetizaban grandes cantidades de
colesterol. Más tarde, se comprobó que la principal enzima reguladora de la síntesis de
colesterol, la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (HMG-CoA reductasa), se
encontraba significativamente aumentada en los tejidos tumorales (Gomez y Alonso,
1998; Alonso y Gomez, 1999). Las células tumorales tendrían una demanda mucho
mayor de colesterol y sus moléculas precursoras, que las células normales. La enzima
HMG-CoA reductasa intervendría en la duplicación celular proporcionando cantidades
suficientes de colesterol para la conservación de la integridad de las membranas
celulares, y activando la DNA polimerasa, enzima de la cual depende la síntesis del
ácido desoxirribonucleico (DNA). La observación de que en animales de
experimentación el descenso del colesterol en sangre -inducido sea por la dieta o por
tratamiento con fármacos- disminuye el crecimiento de la masa tumoral, corrobora que
la inhibición de la biosíntesis del colesterol representa una estrategia atractiva para
bloquear procesos relacionados con la transformación neoplásica (Gomez y Alonso,
1998). La lovastatina es un antibiótico fúngico que inhibe en forma competitiva la
actividad de la HMG-CoA reductasa, porque su estructura es semejante al sustrato, el
HMG-CoA. Las propiedades de la lovastatina no se limitan a sus efectos sobre la
proliferación de las células tumorales, puesto que también se comporta como un potente
inhibidor de los procesos de adhesión, migración e invasión, de los cuales depende la
capacidad de establecer metástasis de un tumor.
¿Que acontece para que la célula se libere de los frenos normales sobre el crecimiento
celular? En los últimos años comenzaron a surgir algunas respuestas. Se descubrieron
genes de cáncer en los cromosomas de las células tumorales. Estos genes, llamados
oncogenes, representan la fuerza impulsora en el crecimiento descontrolado de muchas
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células cancerosas. Presentes en la célula normal como proto-oncogenes, estos genes
reguladores del crecimiento se activan de manera inapropiada y redundan en la
conversión de la célula fundadora normal en otra cancerosa. Una vez activados, los
genes actúan en forma continua dirigiendo las células hacia la división incontrolada, un
comportamiento que se conoce como cáncer.
Resumiendo, se llama proto-oncogenes a los distintos genes que normalmente se
encargan, a través de las correspondientes proteínas que codifican, de gobernar la
replicación y la diferenciación celular. Esta denominación surge de la idea que el
desarrollo de determinadas alteraciones en un protooncogen, por más pequeñas que
estas pudieran ser, lo transforman en su contrapartida patológica, u oncogen. El oncogen
c-erbB2 se encuentra en cánceres mamarios y ováricos. Su amplificación se asocia a un
elevado índice mitótico y se correlaciona con una pobre respuesta clínica a la
quimioterapia. El oncogen c-erbB2 codifica una forma alterada y truncada de un
receptor de membrana de factores de crecimiento, con actividad intrínseca de tirosina
kinasa que puede llevar acabo autofosforilaciones que encienden señales intracelulares
de proliferación (Gomez y Alonso, 1998). El c-erbB2 fue mapeado en caninos mediante
FISH (Fluorescence In Situ Hibridization), técnica genética utilizada en el mapeo de
genes, ubicado en el cromosoma 1q13.1. Su expresión fue correlacionada con una mas
rápida progresión y mal pronostico en cáncer de mama en perras (Murua Escobar et al.,
2001). Un estudio realizado por Matsuyama et al. (2001) ha demostrado que c-erbB
juega un importante papel en la carcinogénesis de la glándula mamaria canina, este
estudio revela que c-erbB no se expresa en glándulas mamarias normales mientras que
si es expresado en tumores mamarios benignos y malignos, no habiendo correlación
entre el tipo de receptor expresado (c-erbB1, c-erbB2, c-erbB3, c-erbB4) y tipo
histopatológico de tumor (Matsuyama et al., 2001). También reportan que el
protooncogen c-kit es frecuentemente expresado en tumores mamarios de perras y en
otros tipos de tumores caninos (Kubo et al., 1998). Es sabido que el producto de c-kit,
como de c-erbB pertenecen a la superfamilia de receptores tirosina quinasa (Chui et al.,
1996) se relacionan con la proliferación y diferenciación celular (Natali et al., 1992). De
esta manera, es muy interesante notar que una variedad de receptores tirosina quinasa es
expresado en tumores mamarios caninos. Otro grupo de genes normales que codifican
proteínas que modulan el ciclo celular a través de un efecto inhibitorio sobre la
progresión del mismo, son los denominados genes supresores de tumor. Las evidencias
sobre la existencia de los genes supresores de tumor – también llamados antioncogenes
– provinieron de distintas líneas de trabajo. Este es el caso del gen p53, que codifica una
fosfoproteina que regula la replicación del ADN, la proliferación celular y la muerte
celular. Este gen actuaría como un “policía molecular” que impide la propagación de
células dañadas genéticamente. También se encontraron mutaciones de dichos genes,
p53 en un número de cánceres mamarios caninos espontáneos los que podrían contribuir
a incrementar alteraciones citogenéticas y formación de tumor (Veldhoen et al., 1999).
Los pacientes caninos con alteraciones de p53 son considerados como los de peor
pronostico (Wakui et al., 2001). Se detectaron mutaciones puntuales en el gen de la p53
en diversos tipos de tumores, entre ellos carcinoma de glándula tiroides, papilomas
orales, adenoma de glándulas anales, osteosarcoma y linfoma mamario en caninos (Lee
et al., 2002; Koening et al., 2002). La proteína p53 se comporta como un freno para la
división de las células, aunque de manera indirecta. Se secuenció un gen llamado
WAF1, que se expresa por efecto de la p53. El producto proteico del WAF1 (la proteína
p21) se une a las kinasas dependientes de ciclinas y detiene la progresión del ciclo
celular.
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Cuando el agente mutágeno actúa sobre la célula normal, aumenta la expresión del p53.
Puede suceder que el ADN sea reparado por la célula o que detecte la falla en la célula,
no se repare y entonces el producto de p53 (fosfoproteina) estimule a otro gen, WAF-1
y el producto de este (proteína p21) induzca la entrada en apoptosis (muerte celular
programada) de la célula dañada y no reparada. En ambas situaciones no hay formación
tumoral. Sin embargo en células con pérdida de la función p53 el ADN no puede ser
reparado ni iniciar la apoptosis, apareciendo células mutantes o transformadas.
Otro gen involucrado en la etiopatogenia tumoral es el BRCA1, productor de una
fosfoproteina que participa en la regulación del ciclo celular. El rol del gen BRCA1 no
ha sido todavía bien estudiado en tejido mamario normal ni en tumores mamarios en
caninos. La perdida de la expresión de BRCA1 fue asociada con una alta proliferación
del marcador ki-67 y ERs alfa. La reducción y distribución de BRCA1 en tumores
mamarios caninos fue significativamente asociado con características malignas. Los
resultados podrían indicar que BRCA1 tendría un comportamiento maligno en esos
tumores (Nieto et al., 2003; Tsuchida et al., 2001).
La proteinquinasa C (PKC) pertenece a una familia de proteínas quinasas que fosforilan
aminoácidos serina y treonina en una gran variedad de proteínas. La importancia de la
PKC radica en que está involucrada en los mecanismos de transducción de señales de
algunos receptores hormonales y factores de crecimiento.
La función inmune alterada puede jugar un rol importante en la patogénesis de las
neoplasias mamarias en la perra. Se han identificado antígenos tumorales no específicos
que causan una inefectiva respuesta inmune humoral y celular. Los complejos inmunes
identificados en perras con tumores mamarios generalmente impiden ejercer la
respuesta inmune antitumoral (Misdorp, 1988).
También otro factor involucrado en la progresión tumoral en los tumores mamarios
caninos es la pérdida de una molécula denominada E-cadherina, perteneciente a la
familia de moléculas de adhesión celular (CAM). Estas moléculas facilitan la adhesión
entre sí de muchas células animales, con firmeza y especificidad (Lodish et al., 2002).
Hay 5 clases diferentes de CAM: cadherinas, la superfamilia de inmunoglobulinas (Ig),
selectinas, mucinas e integrinas. La adhesión intercelular en la que intervienen
cadherinas y selectinas dependen de calcio. Las integrinas intervienen en las
interacciones entre las células y la matriz, mientras que los demás tipos de CAM
participan de la adhesión intercelular (Lodish et al., 2002).
Las cadherinas de expresión más amplia son la E, P, y N. Se conocen más de 40
cadherinas diferentes. En algunas enfermedades, como ser algunos tumores de mama
canino se modifica la cantidad o naturaleza de la E-Cadherina de su superficie celular
(Restucci et al., 1997; Brunetti et al., 2003; Gama et al., 2004; Sarli et al., 2004), lo cual
afecta muchos aspectos de la adhesión intercelular y la migración celular. Por ejemplo,
las metástasis de células tumorales se correlacionan con la perdida de cadherina de
superficie celular.
Los tumores se malignizan debido a que las células tumorales invaden tejidos vecinos y
sobreviven en un sitio ectópico. El término invasión indica la penetración en un
territorio adyacente y su ocupación. Esta invasión permite a las células tumorales entrar
a la circulación sanguínea, a partir de donde pueden colonizar órganos distantes y
eventualmente formar un tumor secundario, llamado metástasis.
El gen que codifica a la E-cadherina fue uno de los primeros en ser considerado como
un gen supresor de invasión, ya que la pérdida de este gen predispone el fenotipo
invasivo. Interesantemente, un experimento in vitro ha demostrado como la perdida de
E-cadherina induce un fenotipo invasivo en un cultivo celular de células no cancerosas
inmortales (Mareel y Leroy, 2003).
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La correlación positiva entre agresividad tumoral como evidencia de una pobre
supervivencia y disturbios de la expresión de E-cadherina provee un soporte clínico para
E-cadherina como un supresor de invasión (Oka et al, 1993).
Hoy, el estudio de la invasión tumoral se beneficia enormemente a partir de los avances
en genomica y proteomica, que caracterizan estructuralmente y funcionalmente a genes
y proteínas.
CICLO CELULAR Y CÁNCER
El ciclo de replicación celular normal se divide en 5 fases discretas. Comenzando con la
finalización de la mitosis (M), las células pueden ingresar en una fase pre-sintética G1
de duración variable. Luego de esto, las células ingresan en una fase de síntesis de ADN
(S). Una vez que las células dejan de sintetizar ADN ingresan en la fase G2 previa a la
reiniciación de la mitosis. G1 y G2 son brechas entre 2 eventos de mitosis y síntesis
identificables a nivel morfológico. El termino G0 fue introducido para las células que
no ciclan pero que pueden ser reclutadas e ingresar en periodos G1.
El rol crítico de la familia de las ciclinas en la regulación del ciclo celular esta bien
establecido. Las ciclinas son proteínas especializadas que activan las distintas fases del
ciclo celular. La mayoría de las células son capaces de proliferar en base a estímulos
externos tales como factores de crecimiento y hormonas que actúan a través de
receptores de superficie celular. Estos receptores transducen la señal, con la división
celular como resultado final. Las tirosinquinasas son una parte esencial de la cascada de
señales proliferativas. Las ciclinas se combinan, activan y dirigen la acción de unas
proteínas especializadas llamadas “tirosin kinasas dependientes de ciclinas” (CDK)
(Bird et al., 2002). Las ciclinas son categorizadas dentro de 3 grupos: Tipo A, Tipo B y
Ciclinas G1 (ciclinas C, D, E).
En el ciclo celular hay varios puntos de control. Estos puntos de control son moléculas
llamadas ciclinas y kinasas dependientes de ciclinas (CDK), los cuales forman
complejos (tabla 1). Los CDK como su nombre lo indica, son kinasas que fosforilan
diversos sustratos involucrados en la progresión del ciclo celular. Son las unidades
catalíticas del complejo. Las ciclinas son las unidades regulatorias, y su nombre se debe
a que varían a lo largo del ciclo celular. Los CDK solos no tienen acción, dependen si o
si de las ciclinas.
Tabla 1: Ciclinas y CDK en el ciclo celular.
Fases del Ciclo Celular
CDK
Ciclinas
G1
CDK4 y CDK6
D (D1, D2, D3)
CDK2
E (E1, E2)
S
CDK2
E (E1, E2)
CDK2
A (A1, A2)
M
CDK1 (cdc2,cdc28)
A (A1, A2)
CDK1 (cdc2,cdc28)
B (B1, B2)
Un estudio demostró un porcentaje de expresión muy alto de ciclina A con respecto a
ciclina D1 en tumores mamarios caninos (Murakami et al., 2000). Este dato contrasta
con el presumible rol de la ciclina D1 en la tumorogénesis mamaria humana, que suele
estar mas aumentada que la ciclina A. Sin embargo otros estudios demuestran una
correlación positiva entre expresión de ciclina D y cáncer mamario canino (Spacteria et
al., 2003), mas que al aumento de ciclina A.
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ANGIOGENESIS TUMORAL
En los tumores, la proliferación de vasos de neoformación es un proceso necesario para
el crecimiento tumoral. Los nuevos grupos de células neoformadas necesitan el aporte
vascular para continuar su crecimiento. La angiogénesis tumoral involucra múltiples
pasos y vías dependientes del balance local entre factores regulatorios positivos y
negativos. Existen interacciones entre el tumor, su vasculatura, y la matriz extracelular
circundante. Mientras está ausente el fenotipo angiogénico, un tumor permanece en
estado latente, con el ritmo de proliferación celular balanceado por el ritmo apoptótico,
incapaz de crecer en tamaño mas allá de unos pocos milímetros. Al establecer un aporte
sanguíneo, se reduce la tasa de muerte celular y el tumor crece con rapidez (Casciato et
al., 2001).
Varias sustancias son necesarias para promover la formación de nuevos vasos
sanguíneos (angiogénesis), en tejidos normales. De todas formas, casi todos los tumores
medibles se limitan a producir solo uno de estos factores, llamado factor de crecimiento
del endotelio vascular (VEGF), que induce la formación de vasos sanguíneos. El VEGF
tiene algunas propiedades interesantes que pueden ser útiles en el tratamiento del
cáncer, incluyendo las siguientes:
Induce receptores para sí mismo en células endoteliales de vasos sanguíneos maduros,
no proliferantes. Estas células endoteliales normales, que están en reposo, no tienen el
receptor hasta que no son expuestas al VEGF.
Puede ser inducido por el oncogen c-ras, por otros oncogenes y factores de crecimiento,
que a su vez inducen mayor producción de VEGF. Por lo tanto, drogas que modulen la
acción de c-ras pueden inhibir la angiogenesis.
Induce la producción y activación de muchos otros factores de crecimiento que
contribuyen a la formación de vasos sanguíneos. Entonces, al bloquear la actividad de
VEGF también se bloquea la acción de otros factores de crecimiento involucrados en la
progresión tumoral.
A diferencia de los vasos sanguíneos normales que requieren otros factores para su
desarrollo normal, los vasos sanguíneos inducidos por VEGF “tienen goteras”, o sea,
aumento de la permeabilidad vascular. Las proteínas plasmáticas inducidas por el
VEGF, como el fibrinógeno, pueden salirse de los nuevos vasos, formando un gel
esponjoso alrededor del tumor. Este gel contiene VEGF, que induce mayor
angiogénesis.
El VEGF parece evitar la apoptosis en las células endoteliales inducidas. Por lo tanto al
inhibir la acción de VEGF se esta inhibiendo una de las vías de escape tumoral.
Los tumores también elaboran inhibidores de la angiogénesis, que pueden disminuir el
crecimiento del tumor en lugares distantes (Casciato et al., 2001). En muchas
circunstancias, la remoción quirúrgica del tumor primario es seguida por un rápido
desarrollo de metástasis. Se ha demostrado que ciertos tumores experimentales elaboran
un inhibidor endógeno de la angiogénesis, denominado angiostatina. Este factor es
liberado al torrente sanguíneo e inhibe a distancia la vascularización de focos
metastásicos y por ende su crecimiento. La extirpación del tumor primario produce una
caída brusca en los niveles circulantes de angiostatina, que facilita el crecimiento rápido
de las metástasis (Gomez y Alonso, 1998).
Receptores para VEGF han sido identificados en tumores mamarios caninos benignos y
malignos mediante inmunohistoquimica (Restucci et al., 2002; Restucci et al., 2004).
Los macrófagos intratumorales también pueden sintetizar VEGF. Se ha demostrado que
la angiogenesis y la malignidad tumoral incrementan juntas. VEGF aparece como un
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poderoso factor angiogénico en tumores mamarios caninos (Restucci et al., 2002;
Restucci et al., 2004; Graham et al., 1999).
ASPECTOS CLÍNICOS
La presentación clínica de los TMC es muy variable; pueden ser únicos (42%) o
múltiples (58%). Cuando existen varios, éstos pueden ser del mismo (33%) o diferente
(66%) tipo histológico (Castillo Magan, 2001). Aproximadamente dos tercios de los
tumores mamarios ocurren en el cuarto y quinto par, probablemente debido al mayor
volumen de tejido mamario presente en las mismas (Kurzman y Gilbertson, 1986). En
más del 50 % de los casos se afectan múltiples glándulas. Pueden estar fijados a la piel
pero por lo general no se adhieren a la pared corporal subyacente. Los malignos (mas
que los benignos) tienen mayor probabilidad de fijarse a la pared corporal y estar
cubiertos por piel ulcerada (Nelson y Couto, 1995). El tamaño de los tumores mamarios
es muy variable, desde unos pocos milímetros hasta varios centímetros. Se presentan
como nódulos aislados o múltiples dentro de la glándula mamaria y pueden o no
asociarse con el pezón. Es frecuente exprimir secreciones anormales desde los pezones
de las mamas afectadas.
Las perras con tumores mamarios benignos generalmente son asintomáticas. Pueden
presentarse signos clínicos de neoplasia mamaria debido a la molestia ocasionada por el
crecimiento de la masa, que incluye excesivo lamido de la masa, dificultad para
acostarse, y resistencia a la manipulación del área abdominal (Jordan, 1998). Los signos
clínicos pueden referirse a los sitios de metástasis de los tumores mamarios malignos.
Los órganos mas afectados en los perros son los ganglios linfáticos regionales y los
pulmones. El 70 % o más del parénquima pulmonar puede estar afectado antes que los
signos clínicos se hagan evidentes (Brodey, 1983). Las hembras pueden exhibir
intolerancia al ejercicio, disnea, fatiga, rales pulmonares y cianosis. (Brodey, 1966;
Owen, 1966). Los tumores de las glándulas posteriores parecen diseminarse a los
pulmones con mayor frecuencia que los presentes en las mamas anteriores. Los ganglios
linfáticos regionales (axilares o inguinales) se muestran agrandados en casos de
metástasis. Ocasionalmente pueden presentarse signos de osteoartropatía hipertrófica
pulmonar, tales como cojera, nueva formación de hueso en las extremidades distales de
los miembros, manifestándose como protuberancias palpables (Brodey, 1983).
La metástasis de los tumores mamarios malignos es mediante las rutas hematógena y
linfática (Theilen y Mandewell, 1987; Weiss, 1990). Las metástasis en otros órganos
ocasionan signos clínicos específicos al sitio de metástasis, por ejemplo en el ojo
ocasiona hipema e iridociclitis, y provoca ataxia, convulsiones, caminar en círculos
cuando asienta en el cerebro (Brodey, 1983). Con menor frecuencia se interesan las
glándulas adrenales, riñones, corazón, hígado y piel. El resto del examen físico no
muestra particularidades de interés. En la neoplasia avanzada puede evidenciarse
caquexia tumoral. El carcinoma mamario inflamatorio constituye una entidad clínica
distintiva. Estos tumores tienden a mostrar edema difuso, interesan a glándulas
múltiples a menudo bilaterales, y pueden ser dolorosos y calientes. Puede haber edema
del miembro por oclusión linfática y crecimiento tumoral retrógrado (Ettinger y
Feldman, 1997).
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DIAGNOSTICO
La diagnosis de neoplasia mamaria debe ser la primera consideración para cualquier
nódulo de hembra añosa. La biopsia escisional y su posterior estudio histopatológico es
el método de elección para confirmar el diagnostico. El examen citológico de
especímenes obtenidos mediante aspiración por aguja fina suele rendir resultados
ambiguos. Diez criterios citológicos de malignidad se correlacionan significativamente
con conclusiones histopatológicas de malignidad (Allen et al., 1986). En un ensayo,
solo de 8 de 19 carcinomas mamarios confirmados por histología fueron identificados
como tales mediante citología por aspiración con aguja fina (Griffiths et al., 1984). Esto
demuestra que la citología debe usarse para el diagnóstico tentativo, con la
histopatología como un procedimiento definitivo. La radiología y palpación minuciosa
permiten evaluar la carga tumoral.
MANEJO CLÍNICO
Cuando un animal llega a consulta, lo primero que hay que realizar es una historia
clínica completa que incluya: sexo, raza, edad, administración de hormonas sexuales en
el pasado, si es entera o castrada, cuando se realizó la ovarioectomía, estado del ciclo
estral, pariciones, episodios de pseudopreñez, fecha del servicio y velocidad del
crecimiento del tumor (Gobello y Corrada, 2001). Un cuestionario preimpreso de
preguntas frecuentes y un esquema de las glándulas mamarias puede ser de gran ayuda
al momento de describir las lesiones.
Una vez terminada la exploración general se procede a la evaluación de las glándulas
mamarias y linfonódulos regionales (axilar e inguinal). Se debe identificar la
localización de cada nódulo mamario, fecha de aparición y ritmo de crecimiento,
diferencias de tamaño relacionadas con el celo, tamaño del nódulo en el momento de la
consulta (en tres dimensiones), estado del linfonódulo regional, adherencia a planos
profundos y/o piel y la presencia de ulceración de la piel implicada en la lesión (Tabla
2). Los propietarios suelen reconocer tumores mamarios en sus mascotas varios meses
antes de la consulta.
Tabla 2: Resumen modificado de la Organización Mundial de la salud (WHO) del
sistema de estadios clínicos para TMC (Corrada y Gobello, 2001)
Estadios de los tumores de glandula mamaria en caninos
Estadio Tumor Primario (T) Estado del linfonódulo Metastasis a distancia (M)
regional (N)
1
Diámetro – 3cm.
No afectado
No metástasis a distancia
detectada
2
Diámetro e/ 3-5 cm. No afectado
detectada
3
Diámetro + 5 cm.
No afectado
detectada
4
Cualquier T
Metástasis
diagnosticada
por detectada
histopatológica
5
Cualquier T
Cualquier N
Metástasis
a
distancia
detectada
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La evaluación diagnóstica se completa con un hemograma y perfil químico
prequirúrgico. Las radiografías torácicas se indican para buscar enfermedad pulmonar
metastásica antes de escisión quirúrgica. La radiología abdominal también es útil para
detectar adenopatía sublumbar, la cual es de particular interés cuando las neoplasias se
ubican en las glándulas caudales, lo cual implicaría una prognosis grave, incluso sin
confirmación histológica de la neoplasia mamaria. La biopsia escisional es el método de
elección para confirmar el diagnóstico.
HISTOPATOLGÍA
Aproximadamente el 50 % de las neoplasias mamarias caninas son benignas. El
adenocarcinoma es el tipo histológico maligno más común en los tumores mamarios
caninos (Nelson y Couto, 1995). Todas las masas escindidas deberían enviarse al
laboratorio de histopatológica y estas deben estar perfectamente identificadas con el
registro del sitio de extracción, si el informe histopatológico demuestra “bordes sucios”
u otra característica importante de malignidad, la cirugía puede retomarse desde el lugar
apropiado. Por esto, el clínico debe pedir el análisis de los márgenes de la muestra
enviada. Es importante considerar que en los TMC pueden presentarse múltiples tipos
histológicos concurrentemente (Allen y Mahaffey, 1989; Brodey et al., 1983).
El reporte de histopatológia debe incluir siempre el grado de infiltración y el grado
histológico de malignidad (por ejemplo el grado de diferenciación, grado nuclear, índice
mitótico, invasión linfática o vascular). Estos valores pueden ser usados para indicar
malignidad y el alto riesgo de recurrencia y metástasis pulmonar. El grado de
malignidad histológica usualmente se expresa en una escala de 1 a 3 grados, donde el
grado 3 tiene los peores pronósticos. A continuación se presenta una clasificación
actual, los tipos más frecuentes aparecen marcados con un asterisco. (Tabla 3).
Tipos de tumores
Tumores Malignos
Tabla 3: Tipos tumorales. Características.
Denominacion
Características
Carcinoma
in
situ
(no Las células neoplásicas no
infiltrante).
atraviesan la membrana basal.
Carcinoma complejo.
Proliferación
de
células
epiteliales y mioteliales.
Carcinoma simple:
Túbulopapilar*
Sólido*
Anaplásico*
Carcinomas especiales:
De
células
fusiformes,
escamosas*
Integrado por un solo tipo
celular.
Mucinoso
Rico en lípidos
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CCE: integrado por cordones y
sábanas de células epiteliales
con áreas de diferenciación
escamosa.
Mucinoso: producen mucina
Rico en lípido: citoplasma
vacuolado
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Sarcomas:
Fibrosarcoma
Osteosarcoma.
De fibroblastos con cantidad
variable de colágeno.
Con formación de hueso y/o
tejido osteoide
Carcinosarcoma.
Se pueden reconocer mezclas
de tipos carcinomatosos y
sarcomatosos.
Carcinoma o sarcoma en un Aparecen focos de células
malignas o nódulos de estas en
tumor benigno*.
adenomas complejos o tumores
mixtos benignos.
Tumores benignos
Adenoma:
Células
epiteliales
o
Simple
mioepiteliales diferenciadas.
Complejo*
Ambos tipos celulares.
Basaloide
Cordones uniformes de células
monomórficas
basaloides
epiteliales.
Fibroadenoma(baja
Crecimiento
de
células
celularidad, alta celularidad)
luminales y del estroma o
mioepiteliales.
Tumor mixto benigno*
Compuesto de células que
morfológicamente
recuerdan
componentes
epiteliales
(luminales y/o mioepteliales) y
mesenquimatosos que producen
cartílago y/o hueso y/o grasa,
ocasionalmente,
junto
con
tejido fibroso.
Hiperpasias/displasias Ductal/lobular*
Proliferaciones
epiteliales
mamarias
benignas
con
cambios
hiperplásicos
y
cambios
extra/intralobulares
Ectasia ductal*
Dilatación del sistema ductal de
la mama.
Fibroesclerosis
Fibrosis focal
Ginecomastia
Condición de las glándulas
mamarias del macho canino con
hiperplasia de los ductos y el
estroma, incluso puede haber
algún acino. Suele formar parte
de
algún
síndrome
de
feminización asociado a tumor
de las células de Sertoli del
testículo.
En general, en todos lo TMC el índice mitótico de las células neoplásicas es bajo, por lo
que la presencia de varias mitosis por campo es un indicador de gran malignidad
histológica (Dhame y Weiss, 1989; Hampe y Misdorp, 1974; Jubb y Kennedy, 1970;
Misdorp, 1988; Misdorp et al., 1999).
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TRATAMIENTO
QUIRÚRGICO
La cirugía es el método de elección para las neoplasias mamarias caninas, salvo en
presencia de enfermedad metastásica o carcinoma inflamatorio. Las técnicas incluyen
nodulectomía, mastectomía, mastectomía en bloque, mastectomía radical uni o
bilaterales (Bojrab et al., 1993; Wilkinson, 1971; Withrow, 1975). Los pro y los contras
de la escisión radical versus la local son ampliamente discutidos. La elección de la
técnica adecuada depende del tamaño del tumor, del número de mamas afectadas, la
localización, fijación a los tejidos circundantes y el estado sanitario general del paciente
(Rosenberg et al., 1989). La remoción de los linfonodos regionales esta indicada si el
examen citológico de los mismos revela la presencia de células tumorales.
Un estudio indicó que la ovarioectomía desarrollada conjuntamente con la remoción del
tumor mamario, prolongaría el tiempo de supervivencia no solamente en perras con
tumores benignos sino también en malignos (Sorenmo et al., 2000). Este estudio mostró
que en perras castradas con un periodo inferior de 2 años desde el momento de la
ablación quirúrgica la supervivencia fue de un 45% más que si no se hubiera hecho. Por
consiguiente, la castración de todas las hembras al tiempo de la remoción del tumor
mamario debe ser considerada.
QUIMIOTERAPIA
El uso de quimioterápicos es controversial y solo se implementaría en pacientes que
presenten un alto riesgo de metástasis. Con frecuencia no se indica por sus efectos
tóxicos. Los protocolos incluyen doxorrubicina en dosis de 30mg/m2 intravenosa (IV)
cada 3 semanas con un mínimo de 2 aplicaciones, combinación de ciclofosfamida en
dosis de 1 mg/kg/día oral, vincristina 0,0125 mg/kg IV una vez por semana y
metotrexato 0,3-0,5 mg/kg IV semanalmente. (Hahn, 2001; Harvey y Gilbertson, 1977).
La doxorrubicina se ha descrito que produjo remisión parcial de metástasis pulmonar en
dos perras con adenocarcinoma a los 12-18 meses luego de la terapia (Hahn, 2001).
También se puede suplantar la doxorrubicina por mitoxantrona, es similar a la primera
pero su toxicidad es menor. Las dosis utilizadas son: mitoxantrona (combinada o no) 35 mg/m2; doxorrubicina 30 mg/m2; vincristina, 0,75 mg/m2; ciclofosfamida, 150-200
mg/m2 (Brodey, 1966). Siempre hay que realizar un análisis de sangre (recuento de
leucocitos) y electrocardiograma previo al tratamiento. Si el tratamiento va a estar
compuesto solo por mitoxantrona o doxorrubicina, esta debe administrarse cada 21 días.
Si se usa en combinación con otros fármacos la frecuencia varia (Tilley y Smith, 1998).
La quimioterapia ocasiona en los animales que la reciben inmunodepresión, quedando
en consecuencia más expuestos a las enfermedades infecciosas. Debido a ello, se indica
en estos pacientes antibioticoterapia y control permanente de plaquetas y leucocitos.
HORMONALES
El tamoxifeno, es un anti-estrógeno administrado como terapia de sostén, está
actualmente atrayendo el interés de los especialistas, dado sus potenciales beneficios en
el control del cáncer. Es un anti-estrógeno sintético no esteroide análogo al clomifeno y
mixto, con efectos agonistas y antagonistas. La manifestación de estas diferentes
acciones depende de la especie y del tejido considerado (Gottardis et al., 1988; Misdorp,
1988; Mol et al., 1997; Jordan, 1998). Por ejemplo, en humanos existen efectos
antagonistas en la glándula mamaria mientras que en el útero se observan efectos
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agonistas (Morris et al., 1993). El preciso mecanismo de acción de tamoxifeno es
todavía incierto, se piensa que podría deberse a un bloqueo competitivo de ERs pero
posiblemente tenga otros mecanismos de acción desconocidos (Kitchell, 1995). Puesto
que no todas sus acciones farmacológicas pueden ser explicadas en base a su actividad
antagonista del receptor de estrógeno, se ha sugerido que parte del efecto antitumoral
podría estar relacionado con la actividad inhibitoria de la proteina quinasa C (PKC). El
tamoxifeno tiene la capacidad de unirse al dominio catalítico de la PKC. Es importante
remarcar que la actividad de la PKC puede estar alterada en ciertos tumores. Los
tumores de mama tienden a presentar mayores niveles de PKC que el tejido normal. En
muchos casos el potencial metastático de células cancerosas se correlaciona con la
actividad de la PKC. Las células más agresivas tienen la actividad de la PKC más alta
en comparación con las células menos agresivas (Kazanietz, 2000; Kitchell, 1995). El
tamoxifeno es utilizado en mujeres para el tratamiento de tumores positivos al ERs. Por
el momento la información disponible acerca de la eficacia del tamoxifeno en el
tratamiento de tumores de glándula mamaria caninos es insuficiente. En un estudio, de
respuestas a corto plazo se observaron diferencias significativas en 16 perras con
carcinomas mamarios que recibieron tamoxifeno a una dosis de 0,4 a 0,8 mg/kg/dia vía
oral durante 4 a 8 semanas (Kitchell, 1995). No obstante, son necesarios más estudios
para ajustar el régimen de administración; efectos colaterales como piometra,
hiperplasia vaginal, incontinencia urinaria, fiebre y alopecia pueden limitar el uso de
tamoxifeno en perras (Ettinger y Felman, 1997; Misdorp, 1988; Morris et al., 1993).
La disponibilidad de antiprogestagenos como agliprestone en el mercado europeo
(Misdorp, 1988) plantea su potencial beneficio en el tratamiento de tumores de glándula
mamaria caninos positivos a los receptores de progesterona.
Dado que muchas veces el tumor de glándula mamaria se presenta conjuntamente con
pseudopreñez, puede darse un desarrollo adicional del mismo. En este caso, el manejo
con drogas antiprolactínicas esta indicado para permitir la evaluación detallada del
tumor antes de la cirugía. Puede emplearse cabergolina a 5 ug/kg/dia PO 1 semana antes
de la cirugía (Murrel, 1991).
RADIOTERAPIA
La radioterapia puede emplearse como terapia adyuvante posquirúrgica o en el
tratamiento de tumores inoperables o en metástasis óseas (Mc Leod y Thrall Da, 1999).
No hay muchos datos referidos a su eficacia en el tratamiento de tumores mamarios
caninos.
La falla en el tratamiento quirúrgico se debe entre otras cosas a una ablación
incompleta, debido a restos tumorales que pueden quedar en el margen operatorio. La
radiación a menudo fracasa en el centro del tumor, donde existen grandes volúmenes de
células, muchas en condiciones hipóxicas pero rara vez falla en la periferia, donde las
células están en cantidades reducidas y bien vascularizadas. En contraste, el alcance de
la cirugía esta limitado por la necesidad de preservar tejidos normales vitales adyacentes
al tumor. Si la cirugía fracasa en estas circunstancias, en general se debe a la presencia
de células cancerosas residuales en la periferia del campo quirúrgico (Mc Leod y Thrall
Da 1999). La radioterapia puede practicarse antes o después de la resección quirúrgica
de un tumor. Si la demora entre cirugía y radioterapia es prolongada, las células
tumorales residuales pueden tener el tiempo suficiente para repoblar el campo
quirúrgico perdiéndose las ventajas de la misma. Si la radioterapia es demasiado precoz
en el periodo postoperatorio, puede afectarse el periodo cicatrizal. En líneas generales,
un retraso de 1,5 a 3 semanas antes de iniciar la radioterapia parece ser lo más
conveniente. La radioterapia preoperatoria también posee ciertas ventajas, reduciendo el
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tamaño tumoral previo a la cirugía, puede facilitar la ablación. La radiación ionizante
también puede influir sobre la viabilidad de las células tumorales y reducir la
probabilidad de implantación o diseminación neoplásica que podría acontecer como
secuela de la manipulación operatoria (Perez y Brady, 1987).
INHIBIDORES PROTEASICOS
Si bien la invasión tumoral es el atributo que, en última instancia, determina la
agresividad biológica y la progresión de la enfermedad, la mayoría de las estrategias
terapéuticas tradicionales se basan en la inhibición de la proliferación o en la
destrucción de las células neoplásicas, pero no en la reducción de sus propiedades
invasivas. Se ha desarrollado un grupo de inhibidores sintéticos de MMPs que
actualmente son evaluados en estudios preclínicos. Entre ellos debemos destacar el BB94 o batimastar, que inhibe las MMPs al ocupar el sitio del Zn en la enzima, y ciertas
tetraciclinas modificadas (doxiciclina, minociclina), cuyo mecanismo de acción exacto
se desconoce (Gomez y Alonso, 1998).
INHIBIDORES EN LA RUTA BIOSINTÉTICA DEL COLESTEROL
Las acciones antitumorales de la lovastatina en modelos experimentales animales de
carcinoma mamario, se observaron incluso luego de administrar dosis relativamente
bajas de 1 a 2 mg diarios por kilo de peso corporal. La utilidad de la lovastatina, así
como el de estrategias alternativas que reduzcan la síntesis del colesterol, en el
tratamiento del cáncer mamario, podría incluso extenderse hacia el terreno preventivo
(Gomez y Alonso, 1998).
INMUNOTERAPIA
La inmunoterapia fue también descripta para el tratamiento de las neoplasias mamarias.
Su finalidad es la de estimular el sistema inmune para posibilitar la inhibición del
crecimiento tumoral. Se ha logrado mejores resultados cuando la masa tumoral se
reduce previamente con alguno de los métodos anteriores. La estimulación del sistema
inmune puede realizarse con levamisol en dosis de 5mg/kg tres veces por semana
durante 3 meses (Harvey y Gilbertson, 1977). Otros estudios no lograron demostrar
efectos favorables (Mc Ewen et al., 1985; Mc Ewen y Withrow, 1996). La
inmunoterapia se ha intentado con corynebacterium parvum y bacilo de CalmetteGuerin, pero esta modalidad no ha sido aprobada.
El elevado número de receptores ErbB2 en tumores mamarios humanos (entre un 2530% de estos, representan una sobre-expresión del receptor) ha llevado a utilizar a esta
molécula como “target” en el tratamiento. Distintas drogas han mostrado ser efectivas
en bloquear la señalización originada en la célula por este receptor. Pero el
descubrimiento más esperanzador es que un anticuerpo monoclonal y parece ser más
efectivo en los estadios avanzados de la enfermedad. La estrategia de intentar bloquear
los receptores mediante el empleo de proteína antireceptores (anticuerpos
antireceptores) ha sido frecuentemente empleada in vitro, pero en el caso de
trastuzumab, se ha llegado ha estudios clínicos altamente satisfactorios con pacientes
humanos. Todavía no se cuenta con estudios de este tipo en veterinaria.
ALIMENTACIÓN
Una teoría publicada en 1989, (Shofer et al 1989) y citada en varios textos (Alenza et
al., 1998) sugiere que el consumo de una dieta hiperproteica e hipograsa en perras con
cáncer mamario puede prolongar su tiempo de sobrevida.
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CONTROL DEL CICLO CELULAR
Hay potenciales estrategias terapéuticas en estudio intentando controlar el ciclo celular.
Ellas son: bloqueantes de la interacción CDk-ciclinas, bloqueo de la fosforilación,
inhibición de síntesis de ciclinas, activación de la degradación de ciclinas e inhibición
de moléculas CDK (Tabla 4).
Tabla 4: Compuestos terapéuticos que controlan el ciclo celular.
Compuesto
Familia
Especificidad
Características
Olomoucina
Purina
CDK1, CDK2 y Interrupción de crecimiento
CDK5 >> CDK4 en G1/S y G2/M. Induce
apoptosis
Roscovitina
Purina
CDK1, CDK2 y Interrupción de crecimiento
CDK5 >> CDK4 en G1/S y G2/M. Induce
apoptosis y diferenciación en
algunos casos
Purvalanol
Purina
CDK1, CDK2,
Interrupción de crecimiento
CDK5
en G1/S y G2/M.
NU 2058 y NU Purina/Piri CDK1, CDK2
Inhibición en el crecimiento
6027
midina
de células tumorales.
UCN-01*
Alcaloide CDK1, CDK2,
Inhibición en el crecimiento y
CDK4
apoptosis. Induce G1/S e
interrupción de G2/M. en los
En tratamientos clínicos ha
demostrado alguna actividad
en melanoma, linfoma y
sarcoma
Indirubina-5Indirubinas CDK1> CDK5 > La indirubina es el
ácido sulfónico
CDK2 >> CDK4 componente activo de una
receta china tradicional contra
la leucemia
Flavopiridol*
Flavonoide CDK1, CDK2,
CDK4
en G1/S y G2/M. Induce
apoptosis y diferenciación. En
tratamientos clínicos ha
demostrado alguna actividad
en linfoma y cáncer de colon
y renal.
Kenpaullone
Paullone
CDK1> CDK2
Retrasa la progresión del ciclo
>> CDK4
celular e inhibe el crecimiento
de las células tumorales in
vitro.
Butirolactona I Producto
CDK1> CDK2
Aislado del aspergillus.
natural
en G1/S y G2/M. Induce
apoptosis y diferenciación en
algunos sistemas.
Himenialdisina Producto
CDK1, CDK5 > Aislado de una esponja
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20
SU 9516
CINK4
PD 0183812
Fascapicina
natural
CDK2 >> CDK4 marina
Indolinona CDK2
Disminuye la fosforilación de
RB y la activación de Caspasa
3. Provoca el bloqueo de
G0/G1 y G2/M.
Triamino- CDK4/6-ciclina Provoca desfosforilación de
pirimidina D1
RB e interrumpe en cultivos y
tumores pequeños en un
modelo de xenoinjerto
PiridoCDK4, CDK6 > Interrupción de G1 en células
pirimidina CDK2
RB positivas en correlación
con hipofosforilación RB
Producto
CDK4
Interrumpe G1 y
natural
desfosforilación RB en sitios
que son especificos para
Kinasa CDK4
* Los asteriscos refieren a compuestos probados en tratamientos clínicos. CDK ciclina
dependiente de kinasa, RB, retino blastoma. Modificado Nat. Rev. Cancer 1 (2001), 222
CRONO FARMACOLOGÍA Y CRONOTERAPIA EN CÁNCER
La posibilidad que la acción de un medicamento variara con la hora del día fue
planteada en 1814 por el medico francés Julien Virey. Las funciones celulares del
organismo están programadas en función del tiempo. No es de extrañar que la eficacia y
el metabolismo de un medicamento varíen en función del momento del día en que es
administrado. Existe actualmente información sobre variaciones diarias en la actividad
de numerosos medicamentos. Los tejidos normales presentan ritmos circadianos en las
funciones celulares. Estas funciones rítmicas se pierden o modifican en el tejido
tumoral. En el tejido sano los ritmos de las mitosis son de 24 hs y llega en algunos casos
a ser tan breves como 8 horas. Por lo tanto el objetivo de la cronoterapia sería no solo
controlar el crecimiento tumoral sino restaurar la naturaleza rítmica perdida de la
función celular. Dos estrategias son posibles. Según la primera, el ritmo de
vulnerabilidad tumoral será utilizado para administrar el agente anticanceroso en el
momento del día en que tenga mejores posibilidades para destruir a las células
malignas. Según la segunda, el ritmo circadiano de sensibilidad del paciente a la droga
anticancerosa será computado a fin de administrar la mayor cantidad de droga posible
en el momento del día en que el paciente mejor tolere el tratamiento (Golombek, 2002).
En los últimos años se ha consolidado la opinión de que es prioridad aumentar la
tolerancia a la quimioterapia en los pacientes cancerosos. El aumento en la frecuencia
del tratamiento y la utilización de las dosis lo mas elevadas posibles, es la única
posibilidad para reducir la aparición de clones de células tumorales quimiorresistentes,
causa mayor de la ineficiencia de los tratamientos (Golombek, 2002).
Hay resultados de estudios hechos en base a terapias circadianas utilizando algunos de
los principales grupos de agentes citotóxicos en medicina humana. No hay datos
concluyentes en medicina veterinaria. Se demuestra la ventaja de los esquemas
circadianos en la disminución de los efectos secundarios y el incremento de intensidad
de la dosis segura de diversas clases de drogas (Golombek, 2002).
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PRONÓSTICO
Existen ciertos factores para la evaluación del pronóstico de un paciente y es importante
valorar su influencia en la evolución del mismo. Para que un factor se considere como
pronóstico tiene que aportar información fiable que permita predecir la aparición de
recidivas y/o metástasis tumorales, es decir, que nos permita establecer el tiempo libre
de enfermedad (TLE) y la supervivencia total (ST). El TLE es el período que transcurre
entre el tratamiento quirúrgico de la masa y la aparición de recidivas y/o metástasis. La
ST muestra el tiempo entre la extirpación de la masa y la muerte del animal por el tumor
u otras causas (Castillo Magan, 2001). Los factores pronóstico que nos revelan
información sobre la evolución de pacientes con TMC.
1. FACTORES CLÍNICOS
-Edad: los animales de edad avanzada tienen mayor probabilidad de desarrollar TMC y
además un peor pronóstico. Algunos autores han relacionado la edad con un mayor
ritmo de crecimiento y con un menor TLE y ST.
-Localización y número de neoplasias: parece que la localización no influye, pero sí el
número, pues a mayor número de TMC malignos menor TLE.
-Estadio clínico: basado en el tamaño tumoral, afección de ganglios linfáticos y
existencia de metástasis a distancia, está relacionado con la ST.
-La implicación de linfonódulos regionales es un tema de controversia aunque, para la
mayoría de los autores, predice un mayor riesgo de metástasis y acorta la ST.
-El ritmo y tipo de crecimiento se ha relacionado con un peor pronóstico cuando es
rápido e invasivo.
-El tamaño del tumor es un buen factor pronóstico puesto que la presencia de, al menos
un tumor maligno, de gran tamaño está relacionada con más corto TLE y ST.
-La ulceración de la piel indica que se trata de una lesión de peor pronóstico (Castillo
Magan, 2001).
2. FACTORES HISTOLÓGICOS
El tipo histológico es otro factor que influye en el pronostico (Kurzman y Gilbertson,
1986). Los tumores benignos se tratan con facilidad mediante escisión quirúrgica y por
lo general con llevan un excelente pronóstico.
Aquellas neoplasias con presencia de células mioepiteliales (complejas) tienen mejor
pronóstico que las simples. Los sarcomas son los tumores de peor pronóstico ya que
presentan una alta probabilidad de metástasis y bajos TLE y ST. Dentro de los
carcinomas simples, existe un orden creciente de malignidad: no infiltrativo,
túbulopapilar, sólido, anaplásico. Los carcinomas tubulares metastatizan con más
frecuencia y con más frecuentemente causan la muerte del animal. El pronóstico
empeora en función de la mayor anaplasia de la neoplasia (Castillo Magan, 2001).
Los sarcomas y carcinomas tienen un pronóstico malo y la mayoría de las perras mueren
por la enfermedad dentro de los 9 a 12 meses. Los carcinomas inflamatorios también
tienen un pronostico muy malo (Gilbertson et al. 1983).
La sobrevida total es de 4 a 17 meses para animales con tumores malignos. Estos suelen
dar metástasis durante los 2 años de realizada la cirugía (mas comúnmente 1 a 9 meses).
Además, las perras que desarrollaron tanto tumores benignos como malignos están en
mayor riesgo de desarrollar tumores malignos en un futuro cercano; por lo tanto debe
realizarse un seguimiento periódico en todos los casos (con una frecuencia de 3 o 6
meses para tumores benignos o malignos respectivamente) (Clark, 1994).
Los tumores que son menos invasivos y mejor diferenciados tienen bajas recurrencias,
como aquellos que existe baja reactividad linfoide. Un diagnostico histopatológico de
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tumor mamario maligno no siempre indica una neoplasia clínicamente maligna. Cerca
de la mitad de los tumores mamarios “malignos” no recurren ni se diseminan después
de la ablación quirúrgica. Aun cuando el pronóstico no puede fundamentarse en el
examen histopatológico, existen generalidades (Loar, 1986).
3. NUEVOS FACTORES PRONÓSTICO
Se han adaptado a la Medicina Veterinaria técnicas que se utilizan en el cáncer de mama
de la mujer. El análisis del ADN mediante citometría de flujo determina el contenido de
ADN de un tumor y su ploidía (numero de dotaciones cromosómicas completas que
contiene un núcleo celular; Rooney y Henry, 1993). La fracción de la fase S (síntesis de
ADN) del tumor permite establecer que los tumores aneuploides (cantidad anormal de
ADN) y con elevada fracción de la fase S tienen mal pronóstico. El marcador Ki-67
permite establecer la fracción de crecimiento tumoral o el grado de proliferación nuclear
(Gomez y Alonso, 1998). La detección de Ers se puede realizar mediante pruebas
inmunohistoquímicas más fáciles que las bioquímicas tradicionales. Un estudio
realizado en Berlín, ha demostrado por técnicas de inmunohistoquímica, que en el
84,4% de los nódulos linfáticos analizados presentaban émbolos de células tumorales o
micrometástasis. Con esta técnica podrían ser detectadas micrometástasis con más de 50
células tumorales (Busch y Rudolph, 1995).
PREVENCIÓN
La ovariohisterectomía u ovariectomía temprana en las perras que no serán destinadas a
reproducción es un elemento clave para disminuir fuertemente el riego de contraer
tumores de glándula mamaria. Los propietarios deberían ser advertidos acerca de llevar
acabo la rutina de examinar ellos mismos la mamas de sus perras, para aumentar así las
chances de realizar un diagnostico precoz y el tratamiento adecuado.
CONCLUSIONES
Los tumores de glándula mamaria son uno de los principales problema del aparato
reproductivo que nos llega actualmente a la consulta clínica. Debido a su complejo
desarrollo, que tiende a la progresión y malignización del tejido mamario a lo largo del
tiempo, no quedan dudas que cuanto más rápido se proceda a su extracción quirúrgica,
mayores son las posibilidades de sobrevida del paciente. En general los tumores
responden de manera dudosa a la irradiación aunque en ocasiones se utiliza para
intentar retrazar el crecimiento. De igual manera tienen variable respuesta a la
quimioterapia, por lo que tampoco existe un protocolo quimioterápico eficaz que pueda
ser utilizado en esta afección. Mucho se ha avanzado últimamente en los mecanismos
moleculares de transducción de señales y desarrollo tumoral y parecen promisorias las
terapias dirigidas contra estos mecanismos.
AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo es subsidiado por la Morris Foundation, Grant Nro. D05CA-059,
Directora C. Gobello. G. Hermo es Becario Nivel Inicial de la Agencia Nacional de
Promoción Científica y Tecnológica, Subsidio PICT 14255/03, Investigador
Responsable D.F. Alonso.
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ISSN: 1515-1883
29
Diagnóstico Inmunológico de la Equinococcosis Ovina
1
Gatti, A., 2Alvarez, A. R., 1Araya, D., 1Herrero, E., 1Costa, M. T., 1Mancini, S.,
3
Santillan, G., 2Larrieu, E.
1
Ministerio de Salud, Provincia de Río Negro, Argentina. 2Facultad de Ciencias
Veterinarias, UNLPampa, Argentina. Instituto Nacional de Microbiología “Carlos
Malbrán”, Buenos Aires, Argentina.
e- mail: [email protected]
RESUMEN
El inmunodiagnóstico en el ovino presenta problemas de sensibilidad y especificidad
que limitan su aplicación en sistemas de vigilancia de la enfermedad. El Objetivo del
trabajo fue desarrollar una técnica sensible, específica y económica para el diagnóstico
de la echinococcosis quística en ovinos naturalmente infectados y evaluar la validez de
la necropsia como prueba de referencia. 247 ovinos fueron estudiados en sala de faena
confirmándose los diagnósticos parasitológicos mediante histología. Los sueros
obtenidos fueron procesados mediante enzimo inmuno ensayo con tres preparaciones
antigénicas: LHT (líquido hidatídico total), S2B (fracción purificada de LHT) y B y
confirmados mediante western blot. EIE con las tres preparaciones antigénicas fue
eficaz para discriminar E. granulosus de Cisticercos tenuícolis y Taenia spp. Sueros de
ovinos negativos macroscópicamente resultaron reactivos a EIE y positivos a WB. La
sensibilidad fue de 89.2% para LHT, 80.0% para S2B y 86.4% para B. La especificidad
fue del 89.5% para LHT, 93.9% para S2B y 92.8% para B en el total de la majada. La
sensibilidad en corderos resultó de 78.6 con LHT, 75.0 con S2B y 64.3 con B. El
diagnóstico macroscópico en sala de faena demostró tener limitaciones como prueba de
referencia para el inmunodiagnóstico de la equinococcosis quística en el ovino,
resultando necesario incluir histología y WB como pruebas de referencia. EIE resultó
una técnica con sensibilidad y especificidad adecuadas para su uso en sistemas de
vigilancia y evaluación de programas de control, resultando LHT la preparación
antigénica de mayor valor.
Palabras Claves: equinococcosis quística, ovinos, inmunodiagnóstico, enzimo inmuno
ensayo.
INTRODUCCIÓN
EQUINOCOCCOSIS QUÍSTICA es una zoonosis parasitaria producida por un
endoparásito perteneciente al Phylum Platyhelminthnes, Clase Cestoda, familia
Taeniidae, género Echinococcus, especie granulosus.
Requiere de dos hospederos mamíferos para completar su ciclo de vida. Un hospedero
definitivo, (carnívoros, especialmente el perro) donde se desarrolla la faz adulta o
estrobilar y un hospedero intermediario (ungulados, especialmente el ovino) en donde
se desarrolla la faz larvaria o metacestode (Thompson and Mac Manus, 2001).
La información sobre inmunodiagnóstico en el ovino es limitada. Se ha intentado el uso
de la hemaglutinación indirecta (Yong et al., 1978, Conder et al., 1980, Bakos et al.,
1985), doble difusión cinco (Yong et al., 1979, Conder et al., 1980) y enzimo inmuno
ensayo (Craig y Richard, 1981, Yong et al., 1984, Lightowlers et al., 1984, Ming, 1986,
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30
Lloyd et al., 1991) con escaso éxito en tanto ninguna de estas experiencias logró
sistematizar ninguna prueba serológica para el ganado (Craig, 1997).
Se ha señalado que las principales limitaciones para el inmunodiagnóstico en el ovino
son las reacciones cruzadas con otras tenias (forma larval de Taenia hydatígena y forma
larval de Taenia ovis), presencia de falsos positivos y baja sensibilidad (Lightowlers et
al., 1995, Craig, 1997, Eckert et al., 2001).
La necropsia es utilizada como prueba diagnóstica de elección (Eckert et al., 2001)
siendo también empleada como prueba de referencia para estimar sensibilidad y
especificidad de las pruebas inmunodiagnósticas.
El desarrollo de pruebas de tamizaje podría ser de especial interés para identificar
animales portadores de quistes hidatídicos cuando se importan ovinos desde áreas
endémicas a áreas libres de infección (Craig, 1997, Eckert et al., 2001), para identificar
establecimientos ganaderos con focos de transmisión en los programas de control o
como sistema de vigilancia epidemiológica para evaluar la prevalencia de la infección.
Por ello, los objetivos del presente trabajo son desarrollar una técnica
inmunodiagnóstica de tamizaje sensible, específica y de ejecución sencilla y evaluar la
eficiencia de la necropsia como prueba de referencia para las pruebas
inmunodiagnósticas.
MATERIALES Y METODOS
Población y área de trabajo
Se trabajó con ovinos en el momento de ser faenados (animales naturalmente
infectados) en 5 salas de faena de la Provincia de Río Negro, en donde la prevalencia de
infección en ovinos es del 18% (Larrieu et al., 2001).
Fueron clasificados en función de la edad en corderos (0 a 6 meses), borregos (7 a 23
meses) y adultos (24 meses y más)
Se estudiaron en total 247 animales, de los cuales 85 (34.4%) correspondieron a
corderos, 60 (24.3%) a borregos y 102 (41.3%) a adultos 176 (71.3%) resultaron
machos y 71 (28.7%) hembras.
Se recolectaron muestras de sangre en tubos plásticos descartables, obteniéndose 10 cc
de sangre en forma directa de la vena yugular en el momento del sacrificio. Los tubos
fueron rotulados con el número de identificación utilizado para la identificación del
animal.
El suero se extrajo mediante centrifugación y se conservó refrigerado a 5º/8º hasta su
remisión a laboratorio antes de las 48 hs., en donde se mantuvieron a -20º hasta su
procesado.
Prueba de enzimo inmuno ensayo (EIE)
Se desarrolló como prueba tamiz la técnica de EIE utilizando tres diferentes tipos de
antígenos: líquido hidatídico total (LHT) obtenido según técnica de Coltorti (1986),
antígeno S2B obtenido según técnica de Coltorti et al. (1990) y antígeno B obtenido
según técnica de Oriol (1971). Los antígenos fueron provistos por el Instituto Nacional
de Microbiología “Carlos Malbrán”.
Para la prueba de enzimo inmuno ensayo con antígeno LHT (EIE.LHT) cada vial de
antígeno se reconstituyó con el volumen adecuado de buffer de sensibilización
(carbonato/bicarbonato, ph 9.6) a concentración de proteínas óptima, determinado por el
método de Bradford (1976).
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31
Las placas (micro strips) se sensibilizaron utilizando una concentración de antígeno de 1
microgramo/pocillo. En cada pocillo se sembraron 50 microlitros de antígeno diluido.
Se mantuvieron 18 horas en cámara húmeda y se lavó 3 veces cada vez 4 minutos con
buffer de lavado (PBS Tween 0.3%).
Se agregó a cada pocillo 100 microlitros del suero diluido 1/800 en PBS-Leche 3%Tween 0.3% y se dejó 45 minutos a 37º. Se aspiró el contenido y se lavó con buffer de
lavado 3 veces. Se sembraron 100 microlitros de conjugado antigamaglobulina ovina
marcada con peroxidasa diluida 1/2500 en solución PBS-Leche 3%-Tween 0.3%. Se
incubaron 45 minutos a 37º. Se aspiró el contenido y se lavó con buffer de lavado tres
veces.
Como substrato revelador se utilizó 100 microlitros de ABTS en solución líquida
(Sigma MR). Se incubaron 45 minutos a 37ª y se agregaron 100 microlitros de solución
de frenado (SDS 1%).
Como testigo positivo se utilizó suero ovino con hidatidosis confirmado por histología.
Como testigo negativo se utilizó suero ovino sin hidatidosis, cisticercosis y teniasis
intestinal. Se definió la dilución óptima de los sueros testigos y problema por titulación
(diluciones seriadas del antisuero y del conjugado hasta obtener la máxima dilución que
permita diferenciar muestras controles positivo alto, positivo bajo y negativo,
utilizándose el mismo protocolo que para la técnica). Se sembraron los sueros testigos y
problema. Cada suero se procesó por duplicado. En cada microplaca se incluyeron 3
sueros negativos y 1 positivo.
Las lecturas se efectuaron en un lector vertical de placas con filtro a 405 nm.
El valor de corte se determinó mediante curvas ROC (receiver operating characteristic)
mediante planilla Excel según diseño de Graeiner (1995).
Para enzimo inmuno ensayo con antígeno S2B (EIE.S2B). Cada vial de antígeno se
reconstituyó con el volumen adecuado de buffer de sensibilización (PBS 7.2), las placas
(micro strips) se sensibilizaron utilizando una concentración de antígeno de 0.15
microgramo/pocillo). El suero fue diluido 1/400. Para enzimo inmuno ensayo con
antígeno B (EIE.B), finalmente, cada vial de antígeno se reconstituyó con el volumen
adecuado de buffer de sensibilización (PBS 7.2). Las placas (micro strips) se
sensibilizaron utilizando una concentración de antígeno de 0.10 microgramo/pocillo. El
suero fue diluido 1/400. Sueros testigo, sembrado en placa, lectura y estimación del
valor de corte se aplicó en igual forma que con LHT.
Pruebas de referencia
Como prueba patrón se utilizó el diagnóstico macroscópico en sala de faena con
confirmación de positivos mediante estudios microscópicos y el diagnóstico
inmunológico mediante Western Blot (WB).
Para ello, en sala de faena los ovinos seleccionados fueron inspeccionados a los efectos
de determinar la presencia de Echinococcus granulosus, Cisticercus tenuícollis (forma
larval de Taenia hydatígena), Cisticercus ovis (forma larval de Taenia ovis) y Taenia
spp (tenias intestinales).
Se procedió a revisar visualmente y por palpación hígado, pulmón, corazón, riñón, y
epiplones; se efectuaron cortes en las mismas vísceras para detectar quistes
intraparenquimnatosos y se efectuó palpación y cortes en músculo masetero. Finalmente
se procedió a la apertura longitudinal de intestino delgado.
En sala de faena se extrajeron 26 muestras compatibles con hidatidosis y/o formas
quísticas de parásitos no características al diagnóstico macroscópico para su
confirmación histológica, siendo conservadas en formol al 5% hasta su remisión a
laboratorio.
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Fueron estudiadas con la técnica de tinción Hematoxilina-Eosina (Jubb y Kennedy,
1993). En los casos en que se presentaron quistes calcificados y/o contaminados, se
complementó con la técnica de tinción de PAS (Jubb y Kennedy, 1993).
Los ovinos que resultaron positivos a la prueba tamiz y negativos al diagnóstico
macroscópico fueron estudiados mediante la técnica de WB. Para ello se efectuó la
separación de proteínas mediante SDS-Page (Laemli, 1970) utilizándose gel de
poliacrilamida de 0.75 mm de espesor, en una cuba Mini Protean II de Bio Rad. En cada
calle se sembraron las muestras problema, un control positivo y uno negativo. La
corrida se realizó a 200V, 60 mA y 30W durante aproximadamente 1 hora.
La transferencia a nitrocelulosa se efectuó en buffer correspondiente 1 hora a 100V, 250
mA, 60 W.
La reacción inmunoenzimática se efectuó mediante bloqueo de la nitrocelulosa con PBS
Tween 0.5% leche con agitación suave durante 1 hora, agregado de suero de las ovejas
diluído 1/100, incubación de una hora con agitación suave y lavado tres veces con PBS
tween 0.5%, incubación con conjugado anti IgG anti oveja conjugado con peroxidasa,
lavado con PBS Tween 0.5% y revelado con DAB.
Se clasificaron como positivas las muestras que presentaron bandas de precipitación de
antígeno 5 (52-67 kd) o de antígeno B (8-12, 16 y 24 Kd).
Finalmente se efectuó un análisis bibliográfico comparativo de ovinos EIE positivos que
resultaron negativos al examen macroscópico en sala de faena a distintas prevalencias
esperadas en la majada ovina.
Estimación de sensibilidad y especificidad del Enzimo inmuno ensayo
Se calculó la sensibilidad y especificidad con sus correspondientes Intervalos de
Confianza del 95% para cada uno de los grupos de edad (corderos, borregos, adultos) y
para cada una de las preparaciones antigénicas (LHT, S2B y B).
El valor predictivo positivo y el valor predictivo negativo se estimó para una
prevalencia esperada del 18%.
Se utilizó el software Epidat 3.0 (Xunta de Galicia – OPS/OMS).
RESULTADOS
Diagnóstico inmunológico mediante EIE
Considerando el diagnóstico confirmado mediante histología como prueba patrón los
valores de corte, considerando las densidades ópticas de los 247 ovinos estudiados,
resultaron 0.200 (IC95% 0.18-0.23) para EIE.LTH, 0.106 (IC95% 0.10-0.12) para
EIE.S2B y 0.078 (IC95% 0.074-0.087) para EIE.B.
Incorporando a WB como prueba patrón, los valores de corte mediante análisis ROC
resultaron 0.157 (IC95% 0.137-0.166) para EIE.LTH, 0.073 (IC95% 0.068-0.082) para
EIE.S2B y 0.068 (IC95% 0.039-0.077) para EIE.B.
Con el valor de corte DO 0.157 fueron clasificados por EIE.LHT 77 ovinos positivos y
170 negativos, mientras que con el valor de corte 0.200 resultaron 61 ovinos positivos y
186 negativos.
Con DO 0.200, 1 ovino macroscópicamente negativo a E. granulosus con forma larval
de T. hydatigena resultó clasificado como positivo a EIE.LHT/WB. Con DO 0.157, 5
ovinos positivos a forma larval de T. hydatigena resultaron clasificados como positivos
a E. granulosus.
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Con DO 0.200 6 ovinos clasificados macroscópicamente como negativos a E.
granulosus y a otras parasitosis, resultaron positivos a EIE.LHT mientras que con DO
0.157 resultaron positivos 19.
Con el valor de corte DO 0.073 fueron clasificados por EIE.S2B 63 ovinos positivos y
184 negativos, mientras que con el valor de corte DO 0.106 resultaron 42 ovinos
positivos y 198 negativos.
Con DO 0.106 ningún ovino clasificado macroscópicamente como negativo a E.
granulosus con Taenia spp. o forma larval de T. hydatigena resultó clasificado como
positivo a EIE.S2B. Con DO 0.073 un ovino clasificado macroscópicamente como
negativo a E. granulosus con forma larval de T. hydatigena resultó clasificado como
positivo a EIE.S2B.
Con DO 0.106 un ovino clasificado macroscópicamente como negativos a E. granulosus
resultó positivo a EIE.S2B mientras que con DO 0.073 resultaron positivos 11.
Con el valor de corte DO 0.068 fueron clasificados por EIE.B 66 ovinos positivos y 181
negativos, mientras que con el valor de corte 0.078 resultaron 61 ovinos positivos y 186
negativos.
Con el valor de corte 0.078 ningún ovino macroscópicamente negativo a E. granulosus
con Taenia spp. o forma larval de T. hydatigena resultó clasificado como positivo a
EIE.B, mientras que con el valor de corte DO 0.068 un ovino con Taenia spp. y uno con
forma larval de T. hydatigena resultaron clasificados como positivos a EIE.B.
Con DO 0.078 5 ovinos clasificados macroscópicamente como negativos a E.
granulosus resultaron positivos a EIE.B/WB, mientras que con DO 0.068 9 resultaron
positivos.
Las relaciones entre EIE negativos y positivos y resultados negativos y positivos a la
prueba patrón se presentan en Tabla 1. En la Figura 1 se observan las densidades ópticas
en ovinos negativos y positivos a distintas parasitosis y su posición en relación al valor
de corte, mientras que la distribución de las absorbancias para ovinos clasificados como
positivos y negativos a E. granulosus se presenta en Figura 2.
La prueba de Kappa global comparando las tres preparaciones antigénicas resultó del
0.83, resultando las diferencias entre cada una de las Kappa, no significativas (Prueba
de Chi cuadrado de homogeneidad de Kappa p: 0.47).
Prueba de referencia
Se diagnosticó en forma presuntiva la presencia de Echinococcus granulosus en 44
(17.8%) ovinos, forma larval de Taenia hydatigena en 18 (7.3%) y Taenia spp en
intestino en 11 (4.5%). Resultaron con diagnóstico negativo 174 (70.4%) ovinos. No se
diagnosticó ningún caso de Taenia ovis.
En el grupo de animales con E. granulosus (44), en 3 (6.8%) también se diagnostico la
forma larval de Taenia hydatigena y en 4 (9.1%) Taenia spp.
Sobre un total de 26 muestras remitidas a laboratorio 1 (3.8%) con diagnóstico
presuntivo de echinococcosis fue descartada (diagnóstico definitivo linfoadenitis
caseosa) y 22 (84.6%) confirmadas. Tres (11.5%) con diagnóstico presuntivo de quiste
no echinococcósico fueron clasificadas como echinococcosis (2 quistes complicados, 1
quiste calcificado), encontrándose en uno de los casos oncósferas vivas de E. granulosus
en hígado. En total se observaron un 15.4% de modificaciones al diagnóstico
presuntivo.
En los animales con diagnóstico definitivo de equinococcosis se identificaron 140
quistes (promedio 3.1 quistes por animal).
La localización de los quistes de E. granulosus confirmadas resultaron hígado 17
(37.8%), pulmón 11 (24.4%), hígado y pulmón simultáneamente 17 (37.8%). Con
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34
relación al sexo, resultaron con E. granulosus 19 (28.8%) hembras y 26 (15.2%)
machos, siendo las diferencias estadísticamente significativas (p: 0.02). Se observó un
aumento significativo de la prevalencia en función de la edad (Chi cuadrado para
tendencia lineal p: 0.0007, OR para categoría adulto 4.4).
Se efectuaron en total 24 WB, resultando 20 (83.3%) positivos y 4 (26.7%) negativos.
De los ovinos que resultaron macrocópicamente negativos a echinococcosis y a otras
parasitosis en sala de faena y que presentaban títulos a EIE.LHT superiores al valor de
corte 16 (80%) fueron clasificados como positivos y 4 (20%) resultaron negativos.
Un (100%) ovino clasificado como negativo a E. granulosus en sala de faena y positivo
a Taenia spp. que presentaba título a EIE.LHT superior al valor de corte fue clasificado
como positivo por WB.
Finalmente, 3 (100%) ovinos clasificados macrocópicamente negativos a
echinococcosis en sala de faena, que presentaban títulos a EIE.LHT inferiores al valor
de corte, pero superiores al valor de corte para EIE.B fueron clasificados como positivos
por WB.
Considerando como prueba patrón el diagnóstico histológico y WB resultaron
clasificados definitivamente como positivos a E. granulosus 65 (26.3%) ovinos, siendo
182 (73.7%) clasificados como negativos.
Se efectuó un análisis de ANOVA a los efectos de comparar las medias de las
densidades ópticas en cinco grupos de animales: ovinos negativos en sala de faena y
positivos a WB (grupo 1), ovinos con E. granulosus identificado en sala de
faena/histología y EIE.LHT positivos (grupo 2), ovinos negativos en sala de faena y a
EIE.LHT (grupo 3), ovinos con forma larval de T. hydatigena (grupo 4) y ovinos con
Taenia spp intestinal (grupo 5), resultando las diferencias estadísticamente significativas
(para F: 17.1 p: 0.00). Asimismo, se efectuaron comparaciones individuales mediante la
prueba de DMS protegida de Fischer, no encontrándose diferencias estadísticas entre los
grupos 3, 4 y 5 (p>0.05), mientras que resultaron estadísticamente significativas las
diferencias entre el grupo 2 y el grupo 3 (p: 0.00), entre los grupos 1 y 2 (p: 0.046) y
entre el grupo 2 y el grupo 4 (P: 0.0001). Un resumen de los resultados de la prueba de
ANOVA/DMS se presenta en Tabla 2 y Figura 3.
En el análisis comparativo de ovinos EIE positivos que resultaron negativos al examen
macroscópico se observó que al aumentar la prevalencia de la infección en la majada
aumenta proporcionalmente la tasa de animales EIE positivos macroscópicamente
negativos, resultando esta tendencia estadísticamente significativa. (Chi Cuadrado de
tendencia lineal p: 0.00). (Tabla 4).
Pruebas diagnósticas simples y análisis ROC
Utilizando histología como prueba patrón S2B resultó la preparación antigénica que
presentó una mayor sensibilidad tanto pata el total de la majada (82.2) como para
corderos (62.5). Incorporando WB como prueba patrón LHT resultó la preparación
antigénica de mayor sensibilidad en el total de la majada (84.6-89.2) y en corderos (78.6
con los dos niveles de corte). En todos los casos las pruebas resultaron más sensibles a
mayor edad de los animales. (Tabla 4).
Con relación a la especificidad, S2B resultó la preparación antigénica que presentó una
mayor especificidad para el inmunodiagnóstico de la equinococcosis ovina utilizando
histología como prueba patrón tanto en majada (94.1) como en corderos (96.1). Con
WB como prueba patrón, también resultó S2B la preparación antigénica de mayor
especificidad tanto en majada (99.4-93.9) como en corderos (100-92.9). No se
observaron modificaciones en la especificidad a mayor edad de los animales. (Tabla 5).
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El valor predictivo positivo (para una prevalencia esperada del 18%), fue mayor para
S2B con histología como prueba patrón (75.3) y también con WB como prueba patrón
(96.4-74.2). El valor predictivo negativo, por su parte, fue mayor para S2B con
histología como prueba patrón (96.0) y mayor para LHT con WB como prueba patrón
(96.2-97.7). (Tabla 6).
LHT presentó la mayor capacidad discriminativa, estimando el área bajo la curva ROC
(0.930 IC95% 0.86-0.97). La comparación de las áreas bajo la curva ROC entre las tres
preparaciones antigénicas, resultaron no significativas (prueba de homogeneidad de Chi
cuadrado (p: 0.07).
DISCUSION
Pruebas de tamizaje para el diagnóstico de la equinococcosis quística en el ovino
En la presente experiencia, EIE con las 3 preparaciones antigénicas resultó eficaz para
discriminar ovinos con E. granulosus de ovinos portadores de otras parasitosis (forma
larval de Taenia hydatigena y tenias intestinales). Seleccionando mediante análisis ROC
un valor de corte para máxima especificidad, con LHT solo un ovino con forma larval
de Taenia hydatigena resultó clasificado como positivo a equinococcosis, mientras que
con antígeno S2B y B ninguno fue incorrectamente clasificado. Al aplicarse un valor de
corte para maximizar sensibilidad S2B clasificó sólo 1 ovino como falso positivo, 2
ovinos el antígeno B y 5 ovinos LHT.
Con las 3 preparaciones antigénicas se encontraron ovinos con serología por encima del
valor de corte que resultaron negativos al diagnóstico en sala de faena (posibles falsos
positivos). Sin embargo, la mayor parte de estos ovinos resultaron positivos a la técnica
de Western Blot utilizada como prueba patrón (80.9% utilizando LHT, 91.7% utilizando
S2B y 94.7% con B).
La mayor capacidad discriminativa entre animales positivos y negativos, estimada como
área bajo la curva ROC, fue hallada con antígeno LHT aunque las diferencias entre las
tres preparaciones antigénicas fueron estadísticamente no significativas (p>0.05). En
igual forma, la prueba global de Kappa resultó estadísticamente no significativa
(p>0.05) y las estimaciones de concordancia bruta, asimismo, resultaron altas en todas
las combinaciones posibles (0.93-0.95), corroborando las limitadas diferencias entre los
3 antígenos.
El antígeno total (LHT), obtenido de líquido hidatídico ovino resultó la preparación
antigénica de mayor sensibilidad (89.2%-77.8%, según el valor de corte) mientras que
la mayor especificidad se alcanzó con antígeno S2B (93.9%-99.4%, según el valor de
corte).
Para la prevalencia esperada en la Provincia de Río Negro, el mayor valor predictivo
positivo se logró con antígeno S2B (96.4%) y el mayor valor predictivo negativo con
LHT (97.5%).
Un análisis global de estos resultados muestra que tanto LHT como S2B podrían ser
utilizados indistintamente como antígenos para el diagnóstico de la equinococcosis
quística, aunque la mayor facilidad de producción y disponibilidad de antígeno LHT
parece recomendarlo como antígeno de elección. Antígeno B, por su parte, resulta de
uso menos recomendable.
En relación a corderos el antígeno total (LHT) también resultó el más sensible (78.6%)
y S2B el más específico (100%). Estos resultados son especialmente valiosos para la
posible aplicación del inmunodiagnóstico en programas de vigilancia epidemiológica de
la enfermedad, en tanto la identificación de transmisión en el pasado reciente (expresada
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36
como infección en animales jóvenes) es uno de los componentes fundamentales del
programa de control.
El hallazgo histológico en ovinos naturalmente infectados de oncósferas de E.
granulosus en hígado, negativos al examen macroscópico y positivos al
inmunodiagnóstico, confirman las ventajas de sensibilidad del enzimo inmuno ensayo
en relación al diagnóstico en sala de faena utilizado hasta el presente para identificar
infecciones recientes.
Analizados los presentes resultados en relación a experiencias previas, debe
considerarse que inicialmente Yong y col en 1984, utilizando antígenos nativos de
líquido hidatídico ovino habían alcanzado con EIE, en animales experimentalmente
infectados con diversos cestodes, una sensibilidad y especificidad de solo 32%-65%
respectivamente, resultando por ende una prueba no recomendable para su aplicación
específica en programas de vigilancia de la equinococcosis quistica.
Ibrahem et al. (1996) lograron una sensibilidad y especificidad con antígenos de líquido
hidatídico ovino de 36%-93% respectivamente y con antígenos de líquido hidatídico de
camello de 71%-96%, Vargas et al. (2002) con antígeno de líquido hidatídico ovino
83%-75% y Kittelberger et al. (2002) con antígeno de protoescólcies 64.6%-95%. En
todos los casos la sensibilidad y especificidad de EIE alcanzada en la presente
experiencia es superior.
Utilizando antígeno B, por su parte, Ibrahem et al. (1996) lograron una sensibilidad y
especificidad con antígeno de oveja de 57%-93% y con antígeno de camello de 90%99%; Kittelberger et al. (2002) con antígeno B de líquido hidatídico ovino 9.7%-99.5%,
mientras que en nuestro trabajo antígeno B, según el valor de corte, presentó una
sensibilidad de 84.5%/86.4% y una especificidad de 97.2%/96.8%.
Así, en el presente trabajo EIE resultó una técnica específica y sensible para identificar
transmisión de Echinococcus granulosus del perro al ovino, incluso en corderos,
resultando posible su aplicación en el diagnóstico de la equinococcosis quística en el
ovino.
LHT parece resultar el antígeno de elección por su facilidad de producción y
disponibilidad.
Pruebas de referencia para el diagnóstico serológico de la equinococcosis ovina
En el presente trabajo se demuestra que el 15.4% de los diagnósticos presuntivos
macroscópicos efectuados en sala de faena fueron modificados por los estudios
histológicos de confirmación, detectándose diagnósticos falsos positivos y falsos
negativos en todos los grupos de edad estudiados.
Estos resultados confirman estudios previos efectuados en la Provincia de Río Negro
(Larrieu et al., 2001) que identificaban en sala de faena 37.2% de diagnósticos falsos
positivos dados por granulomas inespecíficos, pseudo tuberculosis, enfisema y
degeneración grasa y 1.1% de diagnósticos falsos negativos dados por pequeños quistes
intraparenquimatosos; y coinciden con estudios efectuados en Uruguay (Cabrera et al.,
1996) que notificaron un 26.1% de ovinos clasificados como positivos en sala de faena
que resultaron no hidatídicos al estudio histológico siendo linfoadenitis caseosa,
Cisticercus tennuícolis, mancha blanca y abscesos las patologías confundentes,
señalando asimismo que quistes pequeños e intraparenquimatosos, especialmente en
pulmón, pueden pasar fácilmente desapercibidos a la inspección sanitaria resultando
clasificados como falsos negativos en sala de faena.
En el presente estudio, se identificaron mediante histología oncósferas
intraparenquimatosas y quistes de desarrollo incipiente, negativos a la inspección
macroscópica (falsos negativos a sala de faena).
ISSN: 1515-1883
37
Estos resultados confirman las limitaciones del diagnóstico macroscópico en sala de
faena y la validez de los estudios histológicos para su aplicación como pruebas de
referencia para el diagnóstico de la equinococcosis quística en el ovino.
Los estudios efectuados para determinar sensibilidad y especificidad del diagnóstico
inmunológico de la equinococcosis quística en ovinos natural o experimentalmente
infectados han considerado, sin embargo, casi exclusivamente paneles de sueros en
donde la clasificación de un animal como positivo o negativo se basó en el análisis
macroscópico en sala de faena (Conder et al., 1980, Craig et al., 1981, Yong et al.,
1984, Bakos et al., 1985, Lightowlers et al., 1984, Ibrahem et al., 1996, Moro et al.,
1997, Moro et al., 1999, Kittelberger et al., 2002, Vargas et al., 2002) mientras que solo
en un caso se recurrió a tinción de Gram para efectuar diagnósticos diferenciales con
Corynebacterium pseudotuberculosus (Dueger et al., 2003), lo cual plantea dudas sobre
la interpretación de las conclusiones expresadas.
Por el contrario, la aplicación de técnicas inmunodiagnósticas permitiría que ovinos
portadores de infecciones recientes clasificados como negativos en sala de faena fueran
correctamente clasificados como positivos por las pruebas serológicas, tal cual queda
demostrado en el presente trabajo.
De tal forma, en áreas de alta prevalencia de infección en ovinos (por ejemplo Perú)
puede considerarse que todos los animales están expuestos a la infección como
resultado de lo cual además de los animales positivos a sala de faena se encuentra que
de los animales negativos a la necropsia el 71.7% resultan seropositivos (Moro et al.,
1999, Dueger et al., 2003); en áreas de transmisión limitada (como el presente estudio
efectuado en la Provincia de Río Negro) dicha proporción es del 11.4%; mientras que en
animales criados en ambientes libres de infección la tasa resulta del 0%-2.3% (Moro et
al., 1997, 1999). De acuerdo a lo observado en la presenta experiencia, podría estimarse
que los animales negativos a la necropsia y positivos a la serología son producto de
distintos estadíos de infección (oncósferas de infección reciente, quistes incipientes en
desarrollo, quistes incipientes en fase de hialinización, etc).
Yong et al. (1984) encontraron en 3 ovinos experimentalmente infectados con baja
carga de huevos de Echinococcus granulosus (10 huevos) una respuesta de anticuerpos
positiva, aunque fallaron en encontrar quistes hidatídicos a la necropsia.
La conversión serológica expresada con posterioridad a la inoculación (Yong et al.,
1984) entre los 10 a 14 días posteriores a la inoculación, es también evidencia que
animales con infecciones recientes serán clasificados como positivos en las pruebas
serológicas y como negativos en sala de faena.
La posibilidad de utilizar en forma sistemática a los estudios histológicos como prueba
de referencia presenta sin embargo limitaciones operativas. Así, podría resultar posible
confirmar en laboratorio la totalidad de las lesiones macroscópicas con diagnóstico
dudoso, pero resultaría sumamente engorroso hacerlo en la totalidad de los diagnósticos
negativos para identificar infecciones recientes, lo cual resulta de especial interés para
un sistema de vigilancia epidemiológica, en especial en corderos.
Como alternativa, en el presente trabajo se ha utilizado Western Blot como prueba de
confirmación para ovinos que resultaban negativos en sala de faena pero resultaban
positivos al enzimo inmuno ensayo utilizado como prueba tamiz.
Western Blot, basado en la identificación de fracciones antigénicas especie específicas
de 8-12, 16 y 20-24 Kd, ha sido desarrollado para su aplicación en el
inmunodiagnóstico de la equinococcosis en el ovino con una especificidad del 98.6%100% (Moro et al., 1997, Vargas et al., 2002) y sin presentar reacciones cruzadas con
otros cestodes. La banda de 8 Kd se ha encontrado presente en todos los animales
ISSN: 1515-1883
38
seropositivos. La sensibilidad para WB, por su parte, ha sido notificada como del
91.4%-97.6% (Dueger et al., 2003, Vargas et al., 2002).
En el presente trabajo se efectuó un análisis de varianza para comparar las densidades
ópticas de sueros de animales con E. granulosus diagnosticado macroscópicamente,
ovinos clasificados como negativos en sala de faena pero positivos a EIE y WB, sueros
de ovinos con otros cestodes y sueros de ovinos libres de infección. Ello permitió
establecer con precisión las características comunes existentes entre los ovinos
clasificados como positivos por sala de faena o WB y las diferencias estadísticamente
significativas con ovinos portadores de otros cestodes y con ovinos sin infección,
corroborándose la especificidad del diagnóstico mediante WB y su utilidad como
prueba de referencia.
Así, la utilización del diagnóstico macroscópico en sala de faena como prueba patrón
para las estimaciones de sensibilidad y especificidad presenta limitaciones tal como
queda demostrado en el presente estudio.
Los mejores resultados para validar pruebas serológicas destinadas al tamizaje en
poblaciones ovinas deberían incluir la confirmación diagnóstica mediante histología o
mediante pruebas serológicas de alta especificidad tal como WB.
AGRADECIMIENTOS
A los Dr Eduardo Guarnera, Aníbal Franco e Irma Sommerfelt por su asesoramiento y
correcciones.
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ISSN: 1515-1883
41
Tabla 1. Relación entre resultados positivos y negativos a Echinococcus granulosus de
EIE con tres preparaciones antigénicas y dos valores de corte y su relación con
resultados positivos y negativos a la prueba patrón. Ovinos naturalmente parasitados.
Provincia de Río Negro, 2003/2004
Antígeno
EIE/ histología y WB LHT
S2B
B
0.157/0.200
0.073/0.106
0.068/0.078
+/+
58/55
52/41
57/56
+/19/6
11/1
9/5
-/+
7/10
13/17
13/10
-/163/176
171/181
168/176
Total
247
247
247
ISSN: 1515-1883
42
Figura 1. Capacidad de EIE de discriminar entre ovinos naturalmente parasitados con
Echinococcus granulosus, forma larval de T. hydatigena, Taenia spp. y ovinos no
parasitados. Provincia de Río Negro, 2003/2004
0.700
0.600
densidad óptica
0.500
0.400
0.300
0.200
0.100
239
225
211
197
183
169
155
141
127
113
99
85
71
57
43
29
15
1
0.000
ovinos estudiados con LHT
0.700
densidad óptica
0.600
0.500
0.400
0.300
0.200
0.100
197
211
225
239
211
225
239
183
183
197
169
169
155
141
127
113
99
85
71
57
43
29
15
1
0.000
ovinos estudiados S2B
0.500
0.450
densidad óptica
0.400
0.350
0.300
0.250
0.200
0.150
0.100
0.050
155
141
127
113
99
85
71
57
43
29
15
1
0.000
ovinos estudiados B
E. granulosus
valor corte 1
valor corte 2
forma larval T. Hydatigena
T. spp
negativos
ISSN: 1515-1883
43
1.
00
0
1.
10
0
0.
40
0
0.
44
0
0.
90
0
0.
80
0
0.
70
0
0.
60
0
0.
50
0
0.
40
0
0.
30
0
0.
20
0
0.
10
0
40.0
35.0
30.0
25.0
20.0
15.0
10.0
5.0
0.0
0.
00
frecuencia
Figura 2. Frecuencia de la distribución de absorbancias con diferentes antígenos en
ovinos con E. granulosus y sin E. granulosus. Provincia de Río Negro, 2003/2004
0.
36
0
0.
32
0
0.
28
0
0.
24
0
0.
20
0
0.
16
0
0.
12
0
0.
08
0
0.
04
0
50.0
45.0
40.0
35.0
30.0
25.0
20.0
15.0
10.0
5.0
0.0
0.
00
frecuencia
densidad óptica LHT
densidad óptica S2B
50.0
frecuencia
40.0
30.0
20.0
10.0
0.
00
0.
04
0
0.
08
0
0.
12
0
0.
16
0
0.
20
0
0.
24
0
0.
28
0
0.
32
0
0.
36
0
0.
40
0
0.
44
0
0.
48
0
0.
52
0
0.0
sin Echinococcosis
con Echinococcosis
ISSN: 1515-1883
densidad óptica B
44
Tabla 2. Resultados del análisis de ANOVA y de la prueba de DMS protegida de
Fischer en relación a las densidades ópticas a la prueba de EIE. LHT en cinco grupos de
ovinos, Provincia de Río Negro, 2003/2004.
Grupo
D.O.
D.O.
DMS
Diferencias (valor
Media
Varianza
de p)
(E.est.)
1 (Faena – / E. g. WB 0.36 (0.028)
0.05
C
1 – 2:
+)
2 (Faena/Hist. E.g. +)
p: 0.046
0.28 (0.028)
0.012
B
2 – 3:
p: 0.00
3 (Faena - / EIE.LHT - 0.09 (0.028)
0.003
A
3 – 4 – 5:
)
p > 0.05
4 (T.hyd. +)
0.11 (0.04)
0.002
A
5 (T. spp +)
0.10 (0.03)
0.002
A
F: 17.2 p: 0.00
Figura 3. Medias y error estándar obtenidos mediante análisis de ANOVA en cinco
grupos de ovinos, Provincia de Río Negro, 2003/2004
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
E.g.Wb
E.g.Hist.
Neg.
ISSN: 1515-1883
T.h.
T.spp
45
Tabla 3. Porcentaje de ovinos EIE positivos que resultaron negativos a la necropsia y su
relación con la prevalencia de echinococcosis en la majada.
Area de estudio
Prevalencia de
Porcentaje de ovinos negativos
echinococcosis ovina en la
a necropsia y positivos a EIE
majada
nº
+
%
nº
+
%
212
152
71.7
60
47
78.3
247
45
18.2(2)
202 23
11.4
Ovinos criados libres
43
0
0.0
42
1
2.3
de infección(3,4)
36
0
0.0
36
0
0.0
Perú(1)
Endémico, sin
programa de control
Río Negro
Endémico, con
programa de control
Chi cuadrado para tendencia lineal p: 0.00
1: Dueger et al., 2001, 2003
2: Larrieu et al., 2001
3: Moro et al., 1997
4: Moro et al., 1999
ISSN: 1515-1883
46
Tabla 4. Estimación de la sensibilidad del diagnóstico inmunológico mediante EIE,
utilizando histología y WB como prueba patrón, a diferentes grupos de edad, con
diferentes preparaciones antigénicas y a distintos valore de corte.
Grupo
Antígeno
de
edad
LHT
0.200
0–6 meses
7–23 meses
24–más
TOTAL
S2B
0.157
0.106
B
0.073
0.078
0.068
78.6
78.6
71.4
75.0
64.3
64.3
(76.7-80.5)
(76.7-80.5)
(69.5-73.3)
(73.1-76.9)
(60.6-68.2)
(60.6-68.1)
100
100
80.0
90.0
80.0
90.0
(90.0-100)
(90.0-100)
(74.8-85.1)
(84.9-95.1)
90.6
96.8
77.3
96.8
92.7
90.9
(89.0-92.2)
(95.3-98.3)
(76.1-78.5)
(95.3-98.5)
(91.4-93.9)
(89.7-92.1)
84.6 (83.8-
89.2 (88.4-
72.7 (71.9-
80.0 (79.2-
84.5 (84.0-
86.4 (85.6-
85.4)
90.1)
73.6)
80.8)
85.6)
87.1)
(74.8-85.1) (84.9-95.1)
nota: valor (IC95%)
Tabla 5. Estimación de la especificidad del diagnóstico inmunológico mediante EIE,
utilizando histología y WB como prueba patrón, a diferentes grupos de edad, con
diferentes preparaciones antigénicas y a distintos valores de corte.
Grupo de edad
Antígeno
LHT
0.200
0 – 6 meses
0.157
0.106
B
0.073
89.5
100
(93.8-95.2)
(88.5-90.4)
(99.1-100)
100
92.7
100
98.0
94.0
88.0
(100-100)
(91.8-93.7
(99-100)
(96.9-99.0)
(92.9-95.1)
(86.9-89.1)
97.1
87.1
96.8
87.1
98.3
92.1
(96.4-97.8)
(86.4-87.9)
(96.1-97.6)
(86.4-87.9)
97.2
89.5
99.4
93.9
97.2
92.8
(96.9-97.5)
(89.2-89.8)
(99.2-99.7)
(93.7-94.2)
(96.9-97.5)
(92.5-93.1)
24 – más
92.9
0.078 0.068
94.7
7 – 23 meses
TOTAL
S2B
98.6
(92.1-93.9) (97.8-99.3)
94.4
(93.6-95.1)
(97.5-99.2) (91.2-92.9)
nota: valor (IC95%)
ISSN: 1515-1883
47
Tabla 6. Resultados de las pruebas diagnósticas simples y del análisis ROC con distintas
preparaciones antigénicas utilizando histología/WB como prueba patrón.
Antígeno
LHT
S2B
B
Valor de corte
0.157
0.200
0.073
0.106
0.068
0.078
Sensibilidad
89.2
84.6
80.0
72.7
86.4
84.5
Especificidad
89.5
97.2
93.9
99.4
92.8
97.2
V. predictivo +
67.9
89.8
74.2
96.4
72.5
86.8
V. predictivo –
97.7
96.2
95.6
94.3
96.9
96.6
Area bajo la
curva ROC
0.930
ISSN: 1515-1883
0.860
0.890
48
Participación del Glutamato en la Adaptación Osmótica de
Pseudomonas aeruginosa
1
Tortone, C. A.; 2Lucchesi, G. I.
Microbiología Especial y Virología. Facultad de Ciencias Veterinarias. UNLPam.
2
Departamento de Biología Molecular. Facultad de Ciencias Exactas Físico-Químicas y
Naturales, UNRC.
1
RESUMEN
En este trabajo se propuso evaluar la acción del glutamato como osmoprotector exógeno
en cultivos de Pseudomonas aeruginosa crecidos en condiciones hiperosmolares. La
adición de glutamato exógeno, a partir de una concentración 0,1mM, confiere
osmoprotección cuando esta bacteria crece en presencia de NaCl, con glucosa y amonio
como fuentes de carbono y nitrógeno, respectivamente. El efecto se pone de manifiesto
por la disminución del tiempo de latencia, sin variaciones en el tiempo de generación. A
diferencia del comportamiento observado con glutamato, la adición de colina como
osmoprotector externo, disminuye ambos parámetros de crecimiento. Si glutamato y
colina se suplementan simultáneamente a cultivos hiperosmolares, P.aeruginosa
incorpora ambos compuestos y se observa un efecto sinérgico, con disminución del
tiempo de latencia y el tiempo de generación. Ello demuestra que estos osmoprotectores
no se excluyen mutuamente. En P. aeruginosa el transporte de glutamato responde a la
alta fuerza osmótica, siendo dependiente del estado energético de la célula y de la
síntesis de nuevas proteínas. El estudio de metabolitos intracelulares obtenidos luego de
incubar las células en condiciones hiperosmolares en presencia de [14C] glutamato,
mostró que, una vez incorporado, este metabolito no se acumula como tal. El análisis
del contenido intracelular por HPLC y 13C-NMR revela la presencia de Nacetilglutaminil-glutamina amida (NAGGA) y confirma que el glutamato adicionado
exógenamente actúa como precursor de este dipéptido. La identificación por 13C-NMR
de los solutos compatibles acumulados cuando P. aeruginosa crece hasta fase
logarítmica en condiciones hiperosmolares con glutamato 1 mM, mostró la presencia de
glutamato, NAGGA y trealosa. En base a estos resultados es posible atribuir al
glutamato una doble función: actuar como un mediador químico y como un osmolito
genuino.
Palabras claves: osmoadaptación, Pseudomonas aeruginosa, glutamato, osmoprotector
SUMMARY
In this work is intended to evaluate the action of the glutamate as exogenous
osmoprotectant in Pseudomonas aeruginosa grown under osmotic stress conditions. The
addition of exogenous glutamate, starting from a concentration 0,1mM, confers osmotic
tolerance when this bacterium grows in presence of NaCl, with glucose and ammonium
as carbon and nitrogen sources, respectively. The effect shows for the decrease
significatively the lag period of growth, without variations in the time of generation.
Contrary to the observed behavior with glutamate, the addition the choline like external
osmoprotectant, it diminishes both parameters of growth. If glutamate and choline are
simultaneously present in growth medium can be observed a synergist effect,
ISSN: 1515-1883
49
P.aeruginosa incorporates both compounds with decrease of the lag period growth and
the time of generation. It demonstrates that these osmoprotectants is not excluded
mutually. In P. aeruginosa the glutamate uptake responds to a hyper-osmotic upshock,
being dependent of the energetic state of the cell and of the synthesis of new proteins.
The study of intracellular metabolites obtained after incubating the cells under
conditions hyperosmotic in presence of [14C] glutamate, it showed that, once
incorporate, this metabolite doesn't accumulate as itself. The analysis of the intracellular
contained for HPLC and 13C-NMR reveals the presence of NAcetylglutaminylglutamine amide (NAGGA) and it confirms that the exogenous
glutamate acts as precursor of this dipeptide. The identification for 13C-NMR of the
accumulated compatible solutes in stressed cells of P. aeruginosa grows until
logarithmic phase under hiperosmotic conditions with the addition of 1 mM glutamate;
it showed the presence of glutamate, NAGGA and trehalose. According to these results
is possible to attribute the glutamate a double function: to act as a chemical mediator
and as a genuine osmolite.
Key words: osmoadaptation, Pseudomonas aeruginosa, osmoprotectant, glutamate.
INTRODUCCIÓN
Pseudomonas aeruginosa es un bacilo gramnegativo, patógeno oportunista que causa
infecciones importantes en huéspedes que tienen un sistema de defensa dañado como
resultado de una enfermedad subyacente o un tratamiento específico. Se considera una
de las bacterias gramnegativas no fermentadoras que más frecuentemente causa
infecciones en pacientes hospitalizados, siendo responsable de producir septicemias,
endocarditis, otitis, infecciones en la piel de quemados, a nivel del tracto urinario y
respiratorio, heridas quirúrgicas, etc (Botzenhart y Döring, 1993).
En todas las especies animales P.aeruginosa es responsable de abscesos, diarreas,
infecciones urinarias, genitales, respiratorias y de heridas. Como ejemplo, en caninos y
felinos se han descripto otitis externa, conjuntivitis, infecciones urinarias, óseas, muerte
perinatal, prostatitis, piómetra, infecciones y septicemias postquirúrgicas; en yeguas,
asociada a Klebsiella pneumoniae produce metritis e infertilidad, infecciones oculares,
abscesos pulmonares, aborto; en bovinos, mastitis, aborto, artritis, infecciones en piel;
en cerdos enteritis y procesos respiratorios (Stanchi, 2005).
La ubicuidad y versatilidad que posee esta bacteria le ofrecen la capacidad de adaptarse
a distintos medios nutricionales, de tal forma que es capaz de utilizar una gran variedad
de sustancias como nutrientes para rendir energía y permitir su crecimiento. Esta
flexibilidad implica que P. aeruginosa percibe el ambiente y responde ajustando el nivel
de expresión de sus genes en respuesta a señales producidas por cambios en la
osmolaridad, temperatura, pH, calcio, hierro u oxígeno (Botzenhart y Döring, 1993).
Las características que presentan los pulmones de pacientes que padecen fibrosis
quística (viscosidad, mucus deshidratado, células rotas, electrolitos) ayudan a vincular
la adaptación de P. aeruginosa al estrés osmótico con su patogenicidad (D´Souza Ault et
al., 1993).
Se ha descripto para distintas bacterias patógenas, tanto gramnegativas como
grampositivas, la relación entre condiciones estresantes debido a la alta osmolaridad y la
virulencia. Factores que contribuyen a una infección exitosa están involucrados en
estrategias complejas de respuesta al estrés osmótico y se suman a los factores de
virulencia “verdaderos”: toxinas, enzimas de difusión, etc (Sleator y Hill, 2002).
ISSN: 1515-1883
50
La exposición de células a la hiperosmolaridad causa una disminución tanto en el
contenido de agua interno como en la presión de turgencia, lo que lleva a una reducción
del volumen citoplasmático. Como consecuencia, las concentraciones de los metabolitos
intracelulares se incrementan pudiendo ser perjudiciales para los procesos celulares.
Generalmente para proliferar en un medio con alta fuerza osmótica, el microorganismo
responde aumentando las concentraciones de un limitado número de solutos. Estas
moléculas que se acumulan en el citoplasma no son inhibitorias de los procesos
celulares y se denominan solutos compatibles, (Csonka, 1989; Welsh, 2000). Entre ellos
los principales descriptos son: polialcoholes (azúcares, glicerol), aminoácidos
(glutamato, prolina), derivados de aminoácidos (glicina-betaína, ácido gammaaminobutírico), péptidos (N-acetilglutaminilglutamina amida), metilaminas y urea
(Csonka, 1989; Smith y Smith, 1989; Welsh, 2000). Esta acumulación intracelular
puede resultar tanto del aumento de la síntesis como del transporte desde el medio de
cultivo (Csonka, 1989). Por ejemplo, en un gran número de especies bacterianas se ha
descripto la acumulación intracelular de glicina-betaína cuando se adiciona
exógenamente al medio de crecimiento hiperosmolar que contiene fuentes de carbono y
nitrógeno preferenciales (Csonka y Hanson, 1991).
Se han discutido roles alternativos para estos solutos compatibles, como constituir
reservas intracelulares de carbono, nitrógeno y energía, o como metabolitos del estrés,
que estabilizan la estructura de las proteínas, más generalmente involucrados en
proteger a la célula bacteriana contra otras condiciones estresantes del medio:
desecación, calor o congelación (Welsh, 2000; Sleator y Hill, 2002).
Un soluto es considerado osmoprotector, cuando incrementa la velocidad de
crecimiento de células osmóticamente estresadas una vez adicionado al medio de
cultivo (Csonka, 1989; Welsh, 2000).
Como respuesta a los cambios de turgencia, se ha descripto en bacterias patógenas, que
el transporte primario de K+ está regulado positivamente por a la alta fuerza osmótica,
dando como resultado un aumento en la concentración intracelular del ión K+, la cual
alcanza concentraciones proporcionales a la osmolaridad del medio de crecimiento.
Concomitantemente al incremento de ión K+ aumentan los niveles intracelulares de
glutamato, siendo ambos compuestos los responsables de una respuesta primaria en
células sometidas a alta fuerza osmótica. La concentración de glutamato de potasio es
considerada una señal intracelular en respuesta al estrés osmótico que actúa sobre la
regulación de genes involucrados en la respuesta adaptativa (Csonka, 1989; Sleator y
Hill, 2002).
La acumulación de glutamato, ha sido observada en varias especies de bacterias
crecidas en medios hiperosmolares sin la adición exógena de este aminoácido, lo que
indica en estos casos, que el incremento de dicho aminoácido se debió a un aumento en
su velocidad de síntesis (Csonka, 1989; McLaggan et al., 1990).
A pesar de las investigaciones realizadas hasta el momento (González et al., 1990;
Helling, 1994), todavía no se ha establecido claramente cual es el camino de biosíntesis
del glutamato que lleva a su acumulación en microorganismos crecidos bajo
condiciones de estrés osmótico.
En Klebsiella aerogenes se ha demostrado que la actividad GDH (glutamato
dehidrogenasa) es sensible al pH (pH óptimo: 8), y que la exposición al estrés osmótico
resulta en una rápida salida de protones desde el citoplasma. Se propuso entonces que la
alcalinización del citosol podría aumentar la actividad GDH lo que llevaría a un
incremento de la síntesis de glutamato. En varias especies de bacterias gramnegativas y
grampositivas también se ha observado que el ión K+ a altas concentraciones estimula
la actividad GDH, y se sugirió que la acumulación de este ión bajo condiciones
ISSN: 1515-1883
51
hiperosmolares es la señal regulatoria para la síntesis de glutamato (Wels, 2000; Sleator
y Hill, 2002).
En Streptococcus lactis se mostró que hay una regulación entre la velocidad de
incorporación de glutamato y glutamina y el pH citoplasmático. El transporte de
glutamato se incrementa notablemente cuando el pH aumenta de 6 a 7,4 (Poolman et al.,
1987).
Tanto en bacterias gramnegativas como en grampositivas, aún no se ha descripto si la
incorporación de glutamato es sensible a la fuerza osmótica del medio de crecimiento.
En Escherichia coli, sólo se ha observado que condiciones de hiperosmolaridad,
producidas por la adición de altas concentraciones de sacarosa, estimulan el sistema de
alta afinidad de glutamina, mientras que el sistema de baja afinidad no se ve afectado.
Microorganismos afectados en su sistema de transporte, son incapaces de metabolizar
glutamato (Gehring et al., 1990).
Se conoce que los solutos compatibles acumulados en un microorganismo varían según
los osmoprotectores disponibles en el medio de crecimiento.
En cultivos de P. aeruginosa osmóticamente estresados crecidos en presencia de glucosa
como fuente de carbono y cloruro de amonio como fuentes de nitrógeno, se ha
detectado la acumulación del dipéptido N-acetilglutaminilglutamina amida (NAGGA),
de glutamato y trealosa. El compuesto dominante NAGGA fue previamente descripto
en Rhizobium meliloti y Pseudomonas fluorescens (Smith y Smith, 1989) pero en estas
especies el glutamato es el soluto más abundante. En E. coli, Klebsiella pneumoniae,
Azotobacter chroococcum y Azospirilum brasilense no se ha encontrado este dipéptido
y de cuatro especies de Rhizobium estudiadas sólo se ha descripto en R. meliloti
(D´Souza Ault et al., 1993).
En E. coli y R. meliloti se ha observado que la ectoína (tetrahidropirimidina), un
compuesto que exhibe propiedades osmoprotectoras semejantes a las de glicína-betaína,
no se acumula intracelularmente. Por lo tanto no reprime la síntesis de solutos
compatibles (glutamato, NAGGA, trealosa) pudiendo jugar un papel clave en provocar
la síntesis de osmolitos endógenos actuando como un mediador químico (Talibart et al.,
1994).
En varias experiencias se ha mostrado que colina, betaína o carnitina actúan como
osmoprotectores, permitiendo el crecimiento de P. aeruginosa en un medio
hiperosmolar que contiene succinato, cloruro de amonio y fósforo inorgánico como
fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato respectivamente (Lisa et al., 1994; Lucchesi et
al., 1995). Otros compuestos nitrogenados como dimetilglicina, acetilcolina y
fosforilcolina fueron menos efectivos como osmoprotectores. Además se observó
crecimiento bacteriano en medios hiperosmolares con colina o carnitina como únicas
fuentes de carbono y nitrógeno. En estas condiciones ambos compuestos también actúan
como osmoprotectores (Lisa et al., 1994; Lucchesi et al., 1995).
Bajo condiciones nutricionales iso e hiperosmolares en los cuales colina o carnitina
están presentes como fuentes de carbono y nitrógeno, se ha observado la síntesis de tres
actividades enzimáticas: acetilcolinesterasa (Che), fosfatasa ácida (Pasa) y fosfolipasa C
(PLC) (Lucchesi et al., 1989; Lisa et al., 1994 y Lucchesi et al., 1995). A través de la
acción coordinada de estas enzimas P. aeruginosa puede utilizar varios compuestos que
pueden encontrarse en el hospedador (acetilcolina, del epitelio corneal;
dipalmitoilfosfatidilcolina, de la sustancia surfactante del pulmón; fosfatidilcolina, que
integra membranas celulares), lo que permitió explicar el asentamiento y mantenimiento
de la infección producida por esta bacteria (Lisa et al., 1994).
Si colina o carnitina actúan únicamente como un osmoprotector, la síntesis de PLC,
Pasa y Che no ocurre. En este caso, la patogenicidad de P. aeuginosa no puede ser
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52
explicada por la sola acción de estas enzimas (Lisa et al., 1994; Lucchesi et al., 1995).
Probablemente involucre otros factores de virulencia, controlados por la alta
osmolaridad (Berry et al., 1989 y Deretic et al., 1990).
En medios hiperosmolares con alta concentración de fosfato y con colina o carnitina
como fuente de carbono y nitrógeno o como osmoprotector, el metabolito acumulado
es, principalmente betaína (Casale et al., 1994; Lucchesi et al., 1995).
En P. aeruginosa la adición de glicina-betaína como osmoprotector exógeno en medios
de cultivo que contienen glucosa y amonio, conduce a la acumulación del mismo, si
bien ello no implica la total desaparición de NAGGA, trealosa y glutamato. Esto
demuestra que la acumulación de glicina-betaína modula los niveles intracelulares de
los tres osmolitos endógenos (D´Souza Ault et al., 1993).
Utilizando una cepa mutante de Salmonella typhimurium deficiente en glutamato
sintetasa, se ha demostrado que la acumulación de glutamato intracelular es necesario
para el óptimo crecimiento de las células en medios hiperosmolares deficientes en
NH4+, pero no para la inducción del transporte prolina y glicina-betaína, y que el
osmoprotector glycina-betaína aparentemente no puede sustituir al glutamato (Csonka et
al., 1994).
Por otro lado se ha estudiado que cuando células de Bacillus subtilis son cultivadas en
medios con altas concentraciones de ClNa o glicerol, adquieren tolerancia a la sal si se
adiciona al medio glutamato o KCl, como osmoprotectores, y se acumula glutamato y
K+ en el citoplasma (Ikeuchi et al., 2003).
En función de los antecedentes citados, en este trabajo se pretendió conocer si la adición
de glutamato exógeno confiere o no protección a células de P. aeruginosa crecidas en
condiciones hiperosmolares, identificar los solutos mayoritarios acumulados en dicha
condición y evaluar si el glutamato exógeno es capaz de modular la respuesta de P.
aeruginosa al estrés osmótico, tal como ocurre con colina.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cepa bacteriana: Pseudomonas aeruginosa Fildes III, 1924; National Culture type
Collection, Reino Unido.
Medios de Cultivo:
a) Medio nutritivo sólido: La cepa bacteriana fue conservada mediante repiques
mensuales en un medio de la siguiente composición: Triptona 1,0%, Extracto de
levadura 0,5%, NaCl 0,5%, agar 1,5% (Sambrook et al., 1989).
b) Medio nutritivo líquido: La composición de este medio fue idéntica a la ya descripta
para el medio nutritivo sólido omitiéndose el agregado de agar. Se lo utilizó con el fin
de obtener un buen rendimiento en masa celular bacteriana para realizar inóculos
(Sambrook et al., 1989).
c) Medio mínimo con alto fosfato (HPi-BSM): Medio líquido de la siguiente
composición: KPO4H2 22mM, Na2PO4H 17 mM, NaCl 8,5 mM y MgSO4 0,8 mM.
Para evitar precipitaciones salinas, la solución de MgSO4 fue esterilizada por separado
y mezclada con el resto del medio de cultivo, previamente llevada a pH 7,4, en el
momento de su utilización, según lo descripto en Lisa (1985). A este medio basal se le
agregó, fuentes de carbono y nitrógeno, respectivamente. Para determinar el efecto
osmoprotector exógeno se utilizaron concentraciones entre 0,2 a 1mM de glutamato o
1mM de colina. Las condiciones hiperosmóticas se lograron agregando NaCl al medio
mínimo.
Condiciones de cultivo y curvas de crecimiento: Las cepas bacterianas fueron cultivadas
en frascos de erlenmeyers con el medio de cultivo apropiado en cada caso,
ISSN: 1515-1883
53
manteniéndose una relación 1/10 entre medio de cultivo y capacidad del frasco. El
cultivo se inició con el agregado al HPi-BSM de un inóculo al 1% v/v, el que se hizo
crecer previamente a 37ºC con agitación durante 15 hs. Simultáneamente se adicionó la
fuente de carbono y nitrógeno previamente esterilizadas. Los cultivos se mantuvieron en
un baño de agua termostatizada a 37ºC con agitación rotatoria (150 rpm). Para realizar
las curvas de crecimiento se tomaron muestras de cultivo en forma estéril, a distintos
tiempos y a las que se les determinó la absorbancia a 660 nm, para seguir el
crecimiento. La elección de una longitud de onda de 660 nm se debió a que en la misma
no se absorben los pigmentos piociánicos (Cheng et al., 1970).
Medición del consumo de glutamato o colina: Durante el crecimiento bacteriano en
HPi-BSM con ClNa 0,5M, glucosa 20 mM y NH4Cl 18,7 mM, suplementado con
glutamato-[14C]glutamato (AE: 145 dpm/ìmol) o colina-[metil-14C]colina (AE: 375
dpm/ìmol) en concentraciones de 0,4 mM, se determinó el consumo de estos
metabolitos como la pérdida de radiactividad en el sobrenadante del medio de cultivo,
después de remover las células por centrifugación a 12.000xg por 10 minutos. La
radioactividad fue determinada en un contador de centelleo líquido Beckman
LS60001C.
Extracción del contenido celular: Luego del crecimiento bacteriano hasta una DO660nm
de 1, las células fueron cosechadas por centrifugación en frío a 10.000xg durante 10
minutos. El precipitado celular se lavó con un medio similar al de crecimiento. El pellet
obtenido se trató con ácido perclórico al 7% y se agitó vigorosamente durante 10
minutos. Después de centrifugar nuevamente a 10.000xg durante 10 minutos, el
sobrenadante (fracción soluble) se neutralizó con OHK y se removió por centrifugación
el KClO4 resultante (D´Souza Ault et al., 1993).
Obtención de metabolitos intracelulares radioactivos: La cepa bacteriana se hizo crecer
en 25 mL de HPi-BSM con glucosa y NH4Cl, hasta una DO660nm de 0,9. Las células
fueron cosechadas por centrifugación en frío a 10.000xg durante 10 minutos. El
precipitado celular se lavó con el medio isoosmolar semejante al de crecimiento, y luego
se resuspendió hasta una DO660nm de 0,6 con HPi-BSM hiperosmolar (ClNa 0,5 M),
con las fuentes de carbono y nitrógeno y el agregado de 0,4mM de glutamato-[14C]
glutamato (AE: 2.200dpm/ìmol). Se incubaron en baño de agua con agitación rotatoria
(150 rpm) a 37ºC. A distintos tiempos se extrajeron alícuotas de 500ìL, las cuales se
centrifugaron. El consumo de glutamato se determinó midiendo la radiactividad en el
sobrenadante. Cuando se incorporó el 70% de éste, se tomaron alícuotas de 5 mL (120´
y 180´ de incubación) a las cuales se les extrajo el contenido celular como se describió
anteriormente.
Análisis del contenido intracelular:
a) TLC (Thin Layer Chromatography): La fase soluble obtenida de la extracción con
ácido perclórico, fue cromatografiada en placa de sílica gel 60 (Sigma), utilizando como
solvente de desarrollo isopropanol/ácido acético/agua (4:1:1 v/v), o fenol/agua (75:25
v/v) según Pataki (1969). La placa se reveló por acción de vapores de yodo y
posteriormente por tinción con ninhidrina al 0,3% en acetona (Marinetti y Stotz, 1986).
Cuando fue necesario, se utilizó como solvente de desarrollo butanol/etanol/agua (5:5:4
v/v), y una tinción para compuestos orgánicos. El reactivo se preparó con etanol/SO4H2
(9:1 v/v). La reacción es positiva cuando aparecen manchas de color negro luego de
calentar la placa en estufa.
b) HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Para determinar la presencia de
dipéptidos en los extractos celulares obtenidos, se utilizó una columna C18 (fase
reversa); siendo el solvente KPO4H2 50mM, pH: 3 y el flujo de 3 mL/min. la detección
ISSN: 1515-1883
54
se realizó por UV a 214 nm (según Alltech, catálogo #200, 1989, con algunas
modificaciones). Bajo esta condición el tiempo de retención atribuido al NAGGA fue de
6,7 min. Para la purificación del dipéptido se utilizaron las mismas condiciones pero se
eluyó con agua, obteniéndose en este caso un tiempo de retención de 6,5 min. para el
mismo y por debajo de 4 min para diferentes aminoácidos. Las determinaciones se
realizaron en conjunto con el Lic. César Casale, del Dpto. de Biología Molecular.
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UNRC.
c) 13C-MNR (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy): La fase soluble neutralizada,
obtenida de la extracción con ácido perclórico, se pasó a través de una columna Chelex100 (vol.: 0,5 mL) eluyendo con agua tridestilada, y se liofilizó. El extracto liofilizado
se resuspendió en D2O. Se tomó como referencia interna dioxano en agua deuterada.
Las determinaciones se realizaron en un equipo Bruker AC200. El número de barrido
fue de 1636; el ángulo de pulso PW (3.8) de 70º; el periodo de relajación (RD) de 3
segundos y la amplitud espectral (SW) de 12000 Hertz. La frecuencia del espectrómetro
fue de 50.323 MHz. Estas determinaciones fueron realizadas por la Dra. Virginia Sosa,
del Dpto. de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Químicas de la U.N.C.
Experimentos de transporte: Las células se hicieron crecer hasta la mitad de la fase
exponencial en HPi-BSM isoosmolar o con NaCl 0,5 M. Se cosecharon por
centrifugación a 10.000xg durante 10 minutos a 5ºC, y se resuspendieron en el mismo
medio con o sin ClNa, sin la adición de fuentes de carbono y nitrógeno, hasta una
DO660nm de 0,6. Para lograrla inhibición de la síntesis proteica, en los casos
requeridos, se agregó en el momento de la resuspensión 100ìg de cloranfenicol por mL.
Las suspensiones celulares se mantuvieron en hielo hasta el momento de ser utilizados.
Los experimentos de transporte fueron realizados por el método de filtración (Lisa,
1985; Salvano et al., 1989). Las células se preincubaron a 37ºC en baño de agua con
agitación rotatoria durante 10 minutos. Al cabo de ese tiempo se adicionó glutamato[14C] glutamato (AE: 3000 dpm/nmol) a una concentración final de 5ìM. Para aquellos
experimentos en los que se quiso observar si la incorporación era dependiente del estado
energético de la célula, se adicionó a la suspensión celular glucosa o succinato 5mM,
incubando 10 minutos más antes de agregar el glutamato marcado. A varios intervalos
de tiempo, alícuotas de 800 ìL de células fueron filtradas rápidamente utilizando filtros
Millipore (tamaño del poro 0,45 ìm). Los mismos se lavaron luego con 2 mL de HPiBSM con glutamato 10 mM. De la misma manera que se describe en Lisa, (1985) y
Salvano et al. (1989), las membranas de papel de filtro, una vez secas, fueron
sumergidas en 2,5 mL de líquido de centelleo de la siguiente composición: 632 mL de
tolueno, 368 mL de etanol, 4 g de PPO (2,5Diphenyloxazole) y 0,125 g de POPOP (1,4bis
[2-(5-phenyloxazolyl)]-benzene;
phenil-oxazolyl-phenyl-oxazolylphenyl).
La
radioactividad fue determinada en un contador de centelleo líquido Beckman
LS60001C.
RESULTADOS
Efecto del glutamato sobre el crecimiento de P. aeruginosa en medios con alta fuerza
osmótica:
Para determinar si el glutamato es capaz de ejercer un efecto osmoprotector sobre el
crecimiento de P. aeruginosa en condiciones de alta osmolaridad, las células se
cultivaron en HPi-BSM con glucosa y cloruro de amonio como fuente de carbono y
nitrógeno respectivamente. La fuerza osmótica se logró por la adición de NaCl. El
glutamato se suplementó a una concentración final de 1mM. En la Tabla 1 se muestran
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los valores obtenidos de los parámetros tiempo de latencia y tiempo de generación
calculados de las curvas de crecimiento a diferentes concentraciones de NaCl con o sin
el agregado de glutamato. Se puede observar que, tanto en ausencia como en presencia
de glutamato, a medida que se incrementa la concentración de NaCl en el medio de
cultivo, aumenta el tiempo de latencia y el tiempo de generación con respecto a cultivos
que no contienen NaCl. La adición de glutamato estimula el crecimiento bacteriano. En
esta condición la velocidad de crecimiento no se modifica con respecto a cultivos que
no contienen glutamato, pero sí se observa una notable disminución en el tiempo de
latencia. Para una misma concentración de NaCl, por ejemplo 0,5 M, el tiempo de
generación fue de 3,2 y 3,4 horas, mientras que el tiempo de latencia fue de 4,4 y 9,2
horas para cultivos con y sin glutamato, respectivamente.
Considerando estos resultados, se quiso determinar si este efecto se pone de manifiesto
con concentraciones menores de glutamato. En la Tabla 2 se resumen los datos que
muestran la acción de distintas concentraciones de glutamato sobre el crecimiento de P.
aeruginosa en medio hiperosmolar. Se puede observar que si bien no existen variaciones
en el tiempo de generación, el tiempo de latencia disminuye significativamente a
medida que aumenta la concentración de glutamato, por lo menos hasta las
concentraciones estudiadas.
Tabla 1: Efecto del glutamato sobre el crecimiento de P. aeruginosa en condiciones de
hiperosmolaridad.
Concentración
Sin adición
Con glutamatoa
de NaCl
----------------------------------------- ----------------------------------------(M)
------Tg
Tlag
Tg
Tlag
0,0
1,3
1,6
1,3
1,5
0,2
1,5
4,4
1,5
1,8
0,4
1,8
4,0
2,0
1,8
0,5
3,4
9,2
3,2
4.4
0,6
3,7
9,8
3,9
6,0
0,7
7,5
11,2
7,2
11,0
El crecimiento de P. aeruginosa se realizó en HPi-BSM con glucosa y cloruro de amonio, en
presencia de distintas concentraciones de NaCl como se indica en la tabla.
a
El glutamato se suplementó en una concentración de 1mM.
Tg Tiempo de generación (h).
Tlag Tiempo de latencia (h).
Tabla 2: Efecto de diferentes concentraciones de glutamato sobre el crecimiento de P.
aeruginosa en condiciones de alta osmolaridad.
Concentración
Tg
Tlag
de glutamato
---------------------------------------------------------------------(mM)
---horas
0,0
2,66
9,20
0,1
2,70
6,80
0,2
2,66
6,40
0,4
2,80
6,10
1,0
2,80
5,10
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56
Las células se hicieron crecer en HPi-BSM en presencia de NaCl 0,5 M con glucosa y
amonio como fuentes de carbono y nitrógeno, respectivamente. El glutamato se
adicionó variando su concentración como se indica en la tabla.
Efecto de colina sobre el crecimiento bacteriano en condiciones de estrés osmótico
Tal como se indicó en la introducción del presente trabajo, se conoce que colina actúa
como osmoprotector cuando es adicionado a cultivos de P. aeruginosa crecidas en
condiciones osmóticamente estresantes. Por lo tanto, resultó de interés realizar estudios
paralelos con este osmoprotector en las mismas condiciones nutricionales en las que se
estudió el glutamato. Para ello las bacterias fueron cultivadas en HPi-BSM con glucosa
y amonio como fuentes de carbono y nitrógeno respectivamente, a distintas
concentraciones de NaCl y con el agregado de 1mM de colina. En estas condiciones de
cultivo, este compuesto actuó estimulando el desarrollo microbiano, concordando con
datos obtenidos con este microorganismo en otras condiciones nutricionales (Lisa et al.,
1994).
En la Tabla 3 se puede observar que colina modifica tanto el tiempo de latencia como el
tiempo de generación. El efecto osmoprotector encontrado es diferente y más marcado
que el observado con glutamato, ya que en este último caso sólo se modificó el tiempo
de latencia (Tabla 1).
Tabla 3: Efecto osmoprotector de colina sobre crecimiento de P. aeruginosa en medios
de cultivo hiperosmolares
Concentración
Sin adición
Con colinaa
de NaCl
----------------------------------------- ----------------------------------------(M)
------Tg
Tlag
Tg
Tlag
0,0
1,3
1,6
1,2
1,6
0,2
1,5
4,4
1,4
3,2
0,4
1,8
4,0
2,1
3,4
0,5
3,4
9,2
2,3
4.0
0,6
3,7
9,8
3,2
9,0
0,7
7,5
11,2
3,6
11,0
Se determinó el crecimiento de P. aeruginosa en HPi-BSM con glucosa y amonio, como fuentes
de carbono y nitrógeno, variando las concentraciones de NaCl como se indican en la tabla.
a
Colina se suplementó en una concentración de 1mM.
Efecto del glutamato y colina sobre el crecimiento de P. aeruginosa en condiciones
hiperosmolares
Como se mostró en los resultados anteriores, tanto el glutamato como colina ejercieron
una estimulación del crecimiento de P. aeruginosa en condiciones de alta osmolaridad.
A los efectos de conocer con más detalle la influencia de estos compuestos sobre el
desarrollo bacteriano, se determinaron los parámetros de crecimiento cuando las
bacterias crecieron en HPi-BSM con distintas concentraciones de NaCl y con la adición
simultánea de glutamato y colina a concentraciones finales de 1mM. En la Tabla 4 se
muestran los valores de los parámetros de crecimiento obtenidos de las curvas de
crecimientos en estas condiciones de estrés.
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57
Con la adición simultánea de colina y glutamato, se observa una disminución del tiempo
de generación con respecto a cultivos que no contienen osmoprotectores exógenos.
Tabla 4: Efecto de colina y glutamato simultáneamente adicionados sobre el
crecimiento de P.aeruginosa en condiciones hiperosmolares.
Con colina y glutamatoa
Sin adición
Concentración
----------------------------------------- ----------------------------------------de NaCl
------(M)
Tg
Tlag
Tg
Tlag
0,0
1,3
1,6
1,2
1,4
0,2
1,5
4,4
1,5
2,2
0,4
1,8
4,0
1,7
2,2
0,5
3,4
9,2
1,9
3.0
0,6
3,7
9,8
2,2
4,0
0,7
7,5
11,2
2,7
4,8
Las células se hicieron crecer en HPi-BSM con glucosa y amonio como fuentes de carbono y
nitrógeno variando las concentraciones de NaCl.
a
Colina y glutamato se adicionaron en concentraciones de 1mM.
Si se compara este comportamiento con los resultados obtenidos cuando los
osmoprotectores fueron adicionados por separado (Tabla 1 y 3), los valores indican que
si ambos compuestos están presentes simultáneamente en el medio de cultivo muestran
un efecto sinérgico.
Este efecto sinérgico se puede observar más claramente en el siguiente cuadro donde se
han resumido resultados tomados de las Tablas 1, 3 y 4, para una misma concentración
de ClNa (0,5 M):
Cuadro resumen: resultados tomados de tablas 1, 3 y 4
Parámetro sin adición con colina con glutamato con colina y glutamato
Tg (h)
3,4
2,3
3,2
1,9
Tlag (h)
9,2
4,0
4,4
3,0
Consumo del glutamato durante el crecimiento bacteriano:
En un intento de evaluar con mayor profundidad el papel del glutamato como
osmoprotector exógeno, se estudió su consumo a lo largo del desarrollo bacteriano. Para
ello durante el crecimiento de las células en medio HPi-BSM hiperosmolar con glucosa
y cloruro de amonio, suplementado con glutamato-[14C] glutamato, se midió la
desaparición de su radioactividad en el sobrenadante luego de remover las células por
centrifugación, tal como se describe en materiales y métodos. La Figura 1 muestra que
aproximadamente el 100% del glutamato es consumido al comenzar la fase exponencial
de crecimiento.
Por otro lado se trató de determinar si existía alguna preferencia por el consumo de
colina o glutamato cuando ambos compuestos se adicionaban conjuntamente al medio
de crecimiento. Las células se hicieron crecer en HPi-BSM con ClNa 0,5M, glucosa,
amonio y la adición de glutamato-[14C] glutamato o colina-[metil-14C] colina. Los
resultados también se muestran en la Figura 1, se puede observar que, si bien ambos
compuestos son incorporados, P. aeruginosa prefiere en primer término incorporar
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glutamato. Cuando se ha incorporado prácticamente el 90% de glutamato, sólo se ha
consumido el 26% de colina.
Figura 1: Consumo del glutamato (˜), colina (•) y crecimiento (s) de P. aeruginosa
en HPi-BSM con NaCl 0,5M. Se utilizó glucosa 20 mM y cloruro de amonio 18,7mM,
como fuentes de carbono y nitrógeno. A los tiempos indicados se sacaron muestras de
1mL, las cuales se centrifugaron a 12000xg por 10 minutos. El consumo de glutamato[14C] glutamato (AE: 145 dpm/nmol, 5µM) y colina-[metil14C] colina (AE: 375
dpm/nmol, 5µM) se determinó en el sobrenadante.
Destino del [14C] glutamato exógeno en cultivos de P. aeruginosa bajo condiciones
hiperosmolares
Con el propósito de conocer el destino del glutamato adicionado exógenamente al
medio de cultivo, se estudiaron los metabolitos intracelulares obtenidos cuando las
bacterias crecen con el osmoprotector marcado radioactivamente. Debido a que el
glutamato se incorpora antes de iniciarse la fase exponencial de crecimiento (Figura 1),
y con el propósito de obtener mayor masa celular, las bacterias se hicieron crecer en
medio isoosmolar hasta fase logarítmica (D.O.660nm: 0,8). En ese momento, se
cosecharon y se resuspendieron en medio hiperosmolar con glucosa y amonio y el
agregado de glutamato-[14C] glutamato. A diferentes tiempos se tomaron muestras a las
que se les extrajo el contenido intracelular como se describe en materiales y métodos.
Las fracciones solubles obtenidas se sometieron a cromatografía en capa fina (TLC) y
posterior autorradiografía. Se utilizó como testigo [14C] glutamato.
La Figura 2 muestra los resultados obtenidos. A medida que el glutamato es
incorporado desde el medio de crecimiento, comienza la acumulación de compuestos
marcado en el interior de las células osmóticamente estresadas. Es notable que en la
muestra obtenida a los 180 minutos de incubación, haya un compuesto
mayoritariamente marcado. Puede observarse que las manchas radioactivas
pertenecientes a las distintas muestras no se corresponden con la del testigo glutamato
(Rf: 0,61).
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Figura 2: Destino del [14C] glutamato en cultivos de P. aeruginosa crecidas en
condiciones hiperosmolares. Las células se hicieron crecer en HPI-BMS con glucosa
20mM y amonio 18,7 mM hasta DO660nm de 0,8. En ese momento se cosecharon,
lavaron y resuspendieron en HPi-BSM con ClNa 0,5 M y [14C] glutamato 0,4mM (AE:
3700dpm/mol). Se tomaron alícuotas de 5 mL a los 120ý 180´de incubación, a las
cuales se le realizó la extracción de metabolitos intracelulares con ácido perclórico. Las
fracciones solubles obtenidas se sometieron a cromatografía en capa fina y
posteriormente se realizó autorradiografía, siendo el solvente de desarrollo
isopropanol/ácido acético/agua (4:1:1).
Análisis del contenido celular por TLC
Los metabolitos extraídos de células de P. aeruginosa crecidas en condiciones de
hiperosmolaridad, en presencia de glucosa y cloruro de amonio como fuentes de
carbono y nitrógeno, y glutamato como osmoprotector, se sometieron a cromatografía
en capa fina. Se utilizaron como testigos prolina, glutamina, glutamato, ornitina,
arginina y trealosa. Ninguno de ellos se correspondió con el posible metabolito
intracelular mayoritario detectado en la muestra problema (datos no mostrados). Es
necesario destacar que en todas las muestras cromatografiadas, se notó la presencia de
manchas ninhidrina negativas no identificadas.
Identificación del NAGGA por HPLC
Como se describió en la introducción del presente trabajo, se ha demostrado que el
dipéptido NAGGA es uno de los solutos compatibles mayoritarios cuando P.aeruginosa
crece en un medio mínimo hiperosmolar con glucosa y amonio como fuentes de
carbono y nitrógeno (D´Souza Ault et al., 1993). La detección de este compuesto
utilizando métodos químicos de análisis habituales es complicada debido a que sus
grupos carboxilos y aminos terminales se encuentran bloqueados. Por ello se procedió al
análisis por HPLC.
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Se compararon los tiempos de retención de los picos obtenidos en el análisis por HPLC
de las fracciones solubles extraídas con perclórico de P. aeuginosa crecidas tanto en
condiciones iso como hiperosmolares. El cromatograma del extracto celular analizado,
perteneciente a condiciones hiperosmolares, mostró un pico con un tiempo de retención
de 6,7 min., no encontrado en condiciones isoosmolares. Para comprobar si este pico
correspondía al dipéptido, el mismo se cromatografió utilizando H2O como solvente.
En esta condición, los tiempos de retención para todos los aminoácidos se encontraron
por debajo de los 3 min (tiempo de retención en las condiciones anteriores: glutamato
3,7; glutamina 3,5; acetilglutamina 5,7; acetilglutamato, 8,2; [Casale, comunicación
personal]) y para el pico sospechoso 6,5 min. Se colectó nuevamente la fracción, se
llevó a sequedad y se resuspendió dividiéndola en dos partes. A una de ellas se le
realizó una reacción con ninhidrina que resultó negativa. La otra fracción se hidrolizó
con HCl y alta temperatura y resultó positiva la reacción con ninhidrina. Esta fracción
hidrolizada se inyectó nuevamente al cromatógrafo y no se detectó el pico con un
tiempo de retención de 6,5 min. Los nuevos picos resultantes se correspondieron con los
tiempos de retención del glutamato. El mismo procedimiento ser realizó con la fracción
soluble obtenida luego de incubar las células durante 180 min. en medio hiperosmolar
con glutamato-[14C] glutamato. En este caso el 80% de radioactividad se detectó
cuando se colectó el pico con tiempo de retención 6,5 min.
Identificación de los metabolitos intracelulares por 13C-NMR:
Para identificar los solutos intracelulares mayoritarios de células bacterianas crecidas en
medio mínimo en presencia de NaCl 0,5M con glucosa y amonio como fuentes de
carbono y nitrógeno y el agregado de glutamato 1mM, se realizó el análisis por 13CNMR utilizando las condiciones de trabajo que se detallan en materiales y métodos. El
espectro de las fracciones solubles obtenidas de la extracción con ácido perclórico,
mostró picos de resonancia idénticos a los descriptos en P. aeruginosa (D´Souza Ault et
al., 1993), para los tres compuestos compatibles mayoritarios: N-acetilglutaminilglutamina amida (NAGGA) (179.1, 177.0, 175.7, 54.1, 32.3, 27.8, y 23.1
ppm) glutamato (182.0, 176.5, 56.5, 35.2 y 28.8 ppm) y trealosa (94.9, 74.3, 73.8, 72.8,
71.5 y 62.0 ppm) (Figura 3).
Figura 3: Espectro de 13CNMR del contenido intracelular de P .aeruginosa crecida en
HPi-BSM con ClNa 0,5M, glucosa 20mM, cloruro de amonio 18,7mM y glutamato
1mM. La preparación de la muestra y los parámetros del 13CNMR se describen en
materiales y métodos. Los picos de resonancia se detallan en los resultados y
corresponden al glutamato, dipéptido NAGGA y trealosa.
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61
Captación de glutamato en P. aeruginosa.
Con el propósito de conocer en mayor profundidad la participación del glutamato en la
adaptación osmótica de P. aeruginosa, se comenzó el estudio de su sistema de
transporte. La Figura 4 muestra la incorporación de glutamato en función del tiempo, en
bacterias crecidas con glucosa y amonio como fuentes de carbono y nitrógeno,
respectivamente, en condiciones iso e hiperosmolares. La incorporación de glutamato
fue mayor en aquellas células crecidas en medios hiperosmolares y resuspendidas en las
mismas condiciones (omitiendo las fuentes de carbono y nitrógeno), que en las células
crecidas y resuspendidas en isoosmolaridad. En esta última condición, las células son
capaces de captar glutamato a pesar de que este compuesto no está presente en el medio
de cultivo. Ello indica que este sistema de transporte es constitutivo.
Por otro lado, la mayor captación obtenida en células crecidas en hiperosmolaridad,
podría ser atribuida a la existencia de más de un sistema de transporte que estarían
controlados osmóticamente y respondiendo a una señal general del medio.
Figura 4: Captación de glutamato en función del tiempo en P. aeruginosa. La medición
del mismo se llevó a cabo en HPi-BSM iso e hiperosmolar (0,5M de NaCl) con
glutamato-[14C] glutamato. Las células se hicieron crecer en medio iso (•) e
hiperosmolar (˜) en presencia de glucosa y amonio, hasta DO660 de 0,6 y luego se
cosecharon y resuspendieron en los mismos medios, sin el agregado de fuentes de
carbono y nitrógeno y con la adición de glutamato-[14C] glutamato 5µM (AE: 3708
dpm/nmol).
Para determinar si la incorporación de este compuesto en condiciones hiperosmolares es
inducida y si depende del estado energético de la célula, se realizó la siguiente
experiencia. Las células se hicieron crecer en condiciones isoosmolares con glucosa y
amonio como fuentes de carbono y nitrógeno. Seguidamente se resuspendieron en
medio hiperosmolar y se dividieron en tres partes. Una de ellas se mantuvo como
control. Al resto se le agregó: 1) succinato 5mM, 2) cloranfenicol 100 µg/mL y
succinato 5mM. La Figura 5 muestra el transporte de glutamato determinado en las tres
condiciones.
La inhibición que se observa cuando las células se expusieron a un medio con
cloranfenicol, está indicando que para que el glutamato sea transportado en
hiperosmolaridad, es necesaria la síntesis de nuevas proteínas. Si se observan los datos
obtenidos con células energizadas y no energizadas (condiciones 1 y 2), se desprende
que la incorporación del glutamato es dependiente del estado energético de la célula.
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Figura 5: Inducción y energización del transporte de glutamato en P. aeruginosa. La
incorporación se llevó a cabo en HPi-BSM con 0,5 M de NaCl y glutamato-[14C]
glutamato 5µM (AE: 3500 dpm/nmol). Antes del ensayo, las células se hicieron crecer
en isoosmolaridad y luego se transfirieron a un medio hiperosmolar con (˜) o sin (•)
succinato 5 mM, o en el mismo medio conteniendo succinato 5 mM y 100 µg/mL de
cloranfenicol (¢).
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
La adición de glutamato exógeno es capaz de conferir osmoprotección a células de
Pseudomonas aeruginosa crecidas en condiciones de estrés osmótico. En medios de
cultivos hiperosmolares obtenidos por la presencia de NaCl que contiene glucosa y
cloruro de amonio como fuentes de carbono y nitrógeno, respectivamente, el efecto se
pone de manifiesto disminuyendo significativamente el tiempo de latencia, sin
observarse variaciones en el tiempo de generación (Tabla 1).
La adición de este compuesto a partir de una concentración 0,1mM (Tabla 2), protege
notablemente el crecimiento bacteriano en condiciones hiperosmolares, por lo cual
puede ser considerado como osmoprotector.
En bacterias Gram negativas, el glutamato has sido descripto como uno de los solutos
compatibles que generalmente sintetizan y acumulan los microorganismos, ante
situaciones de estrés osmótico (Csonka, 1989). Sin embargo, adicionado exógenamente,
en miembros de la familia Enterobacteriaceae, la acumulación intracelular de glutamato,
ha sido atribuida a un aumento de la síntesis endógena y no a una incorporación del
medio (Csonka, 1991). Por otra parte, sólo en células de Bacillus subtilis cultivadas en
medios con NaCl o glicerol se ha estudiado que el glutamato adicionado exógenamente
confirió osmoprotección y se acumuló en el interior de las células juntamente con K+
(Ikeuchi et al., 2003).
Los resultados encontrados en P. aeruginosa (Tabla 1 y 2) nos permiten concluir que, a
diferencia de lo descripto para otros microorganismos por Csonka (1991), y a semejanza
de lo que ocurre con colina y carnitina en esta bacteria, (Lisa et al., 1994; Lucchesi et
al., 1995), la adición exógena de glutamato modula la adaptación de este
microorganismo al estrés osmótico.
Bajo las mismas condiciones nutricionales en las cuales se estudió el efecto del
glutamato, colina también actúa como osmoprotector modificando tanto el tiempo de
latencia como el tiempo de generación (Tabla 3). Este comportamiento fue similar al
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descripto cuando P.aeruginosa crece en medios hiperosmolares en presencia de otras
fuentes de carbono y de nitrógeno (colina, carnitina, succinato, amonio) (Lisa et al.,
1994; Lucchesi et al., 1995). Ello permite establecer, que el efecto osmoprotector de
este compuesto es independiente de la fuente de carbono y nitrógeno presente en el
medio de cultivo.
Por otro lado, si se compara el efecto encontrado con colina (Tabla 2) con el detectado
por la presencia de glutamato (Tabla 1), se puede concluir que si bien ambos
compuestos promueven el crecimiento bacteriano en condiciones hiperosmolares, el
efecto osmoprotector de cada uno de ellos se pone de manifiesto en forma diferente.
Aparentemente podría considerarse que colina, al disminuir el tiempo de latencia y el
tiempo de generación, es un osmoprotector más eficiente. Esto estaría apoyado por las
características zwiteriónicas de este compuesto, lo que se traduce en una mejor
interacción con macromoléulas celulares (Sleator y Hill, 2002).
Cuando P. aeruginosa crece en medios hiperosmolares, con la adición simultánea de
glutamato y colina como osmoprotectores exógenos, ambos compuestos son
incorporados y se observa un efecto sinérgico, con disminución del tiempo de latencia y
del tiempo de generación (Tabla 4). Este efecto, no descripto antes en este
microorganismo, demuestra que ambos compuestos no son mutuamente excluyentes.
En E. coli se demostró que los osmoprotectores ectoína y prolina compiten por los dos
sistemas de transporte descriptos para glicina-betaína (Jebbar et al., 1992). Ello se
traduce en una exclusión de osmoprotectores según cual de ellos esté presente en forma
simultánea en el medio de cultivo. En P. aeruginosa, para el caso de colina y glutamato
es posible que estos compuestos utilicen diferentes vías de entrada y, ante la necesidad
de la célula de contrarrestar el estrés, incorpore ambos osmoprotectores.
Aproximadamente el 90% del glutamato es incorporado al comenzar la fase exponencial
de crecimiento, cuando sólo se ha consumido el 26% de colina (Figura 1). Esta
preferencia por glutamato podría deberse a diferentes niveles de activación y/o
inducción de los sistemas de transporte en condiciones de hiperosmolaridad.
En P. aeruginosa el sistema de transporte de glutamato, en condiciones isoosmolares, es
constitutivo. En hiperosmolaridad se observa un aumento en la captación de este
compuesto, y no puede descartarse con los estudios realizados hasta el momento, la
existencia de diferentes sistemas de transporte que se expresen por la alta fuerza
osmótica. Por el contrario, el sistema de transporte de colina, tanto en condiciones iso
como hiperosmolares, es inducible (Salvano et al., 1989).
Como se ha descripto en otros microorganismos (Csonka, 1989; Sleator y Hill, 2002),
en una primera respuesta al estrés osmótico, las concentraciones del ión K+ y del
glutamato aumentan conjuntamente. La célula al crecer en un medio con glutamato
exógeno, prefiere incorporar este compuesto, evitando su síntesis. Ello se traduce en la
disminución del tiempo de latencia con respecto a cultivos que no tienen osmoprotector.
Si además está presente colina, la célula también incorpora este compuesto, teniendo la
ventaja de utilizar un osmoprotector altamente eficiente provisto por el medio de
crecimiento. El efecto se pone de manifiesto con la disminución del tiempo de
generación.
El estudio de metabolitos intracelulares obtenidos luego de incubar las células en
presencia de [14C] glutamato, mostró que, una vez incorporado, este metabolito no se
acumula como tal. El análisis por autorradiografía de la fase soluble extraída con ácido
perclórico (Figura 2), no mostró trazas de radioactividad en glutamato. En función de
ello, analizando el contenido celular por cromatografía en capa fina (TLC), se
descartaron que estos solutos fueran prolina, glutamina, ornitina, arginina o trealosa.
Distintas fueron las razones que llevaron a elegir estos compuestos. Prolina y trealosa
ISSN: 1515-1883
64
han sido descriptos en P. aeruginosa como solutos compatibles (D´Soulza Ault et al.,
1993; Csonka, 1989). Glutamina, la cual puede sintetizarse a partir de glutamato,
incrementa su concentración en cultivos de E. coli (Mc Laggan et al., 1990) y
Salmonella typhimurium (Csonka, 1989), crecidas en condiciones de estrés osmótico. Si
bien ornitina y arginina no han sido descriptos como solutos compatibles, estos
compuestos son intermediarios de las distintas vías metabólicas que puede seguir el
glutamato en P. aeruginosa y que pueden llevar a la síntesis de osmoprotectores
(Voellmy y Leisinger, 1978).
El análisis del contenido intracelular por HPLC de la fracción obtenida cuando las
células se incubaron con [14C] glutamato, reveló un pico con un tiempo de retención de
6,7 min. El cual presentó el mayor porcentaje de radioactividad. El hecho que este pico
resulte positivo a la reacción con ninhidrina sólo luego de una hidrólisis drástica,
conducen a pensar que se trataría del dipéptido NAGGA, ya descripto como soluto
compatible en P. aeruginosa (D`Soulza Ault et al., 1993).
En base a estos resultados, es posible suponer que, en P. aeruginosa, bajo condiciones
hiperosmolares, el glutamato exógeno actúa como precursor de este dipéptido.
En células crecidas hasta final de la fase logarítmica, en presencia de NaCl 0,5M y con
glutamato 1mM, los solutos intracelulares mayoritarios identificados por 13C-NMR
fueron el dipéptido NAGGA, trealosa y glutamato. Estos datos coinciden con los
resultados descriptos en la bibliografía, sobre los metabolitos intracelulares acumulados
por P. aeruginosa en las mismas condiciones nutricionales pero sin la presencia de
glutamato exógeno (D`Soulza Ault et al., 1993).
Al detectar la presencia del NAGGA, sumados a los resultados encontrados con
[14C]glutamato, aportan datos suficientes que permiten afirmar que el glutamato
adicionado exógenamente es el precursor del dipéptido NAGGA, ya que este compuesto
no se acumula como tal ni se deriva hacia la síntesis de trealosa.
Teniendo en cuenta que el análisis por 13C-NMR (Figura 3) mostró la presencia de
glutamato (posiblemente de origen endógeno), es posible atribuirle al glutamato una
doble función: actuar como mediador químico y como un osmolito genuino. Por lo
contrario, el efecto osmoprotector de colina se muestra diferente al obtenido con
glutamato. En trabajos realizados por algunos autores (Lisa et al., 1994; Casale et al.,
1994), muestran que si colina está presente en el medio, lleva al acúmulo intracelular de
betaína y no de otros solutos compatibles.
Existen antecedentes que sugieren que la acumulación intracelular del NAGGA,
trealosa y glutamato es una respuesta general a la alta osmolaridad, cuando P.
aeruginosa crece en medios hiperosmolares con glucosa y amonio como fuentes de
carbono y nitrógeno. El estrés osmótico producido, ya sea por la adición de NaCl, KCl,
sacarosa, K2HPO4, K2SO4, puede inducir este comportamiento (D`Soulza Ault et al.,
1993). Se ha observado en este microorganismo, que si el amonio del medio es
reemplazado por glutamato como fuente de nitrógeno, el compuesto intracelular
mayoritario es trealosa, en lugar del dipéptido NAGGA.
Los resultados discutidos en este trabajo se obtuvieron utilizando condiciones
nutricionales que incluyen altas concentraciones de amonio. En estos medios de
crecimiento, y ante la presencia de NaCl, el glutamato adicionado exógenamente actúa
como precursor del dipéptido NAGGA. Si bien no se realizaron determinaciones
cuantitativas de los solutos acumulados intracelularmente, se puede suponer, pero no
afirmar, que el NAGGA, en estas condiciones, es el metabolito mayoritario. P.
aeruginosa, ante la diferente disponibilidad de nitrógeno, posiblemente responde
acumulando solutos compatibles que sean eficientes durante la adaptación a la alta
fuerza osmótica pero que no limiten su crecimiento. Por ejemplo, ante una situación de
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65
estrés osmótico, cuando las concentraciones de amonio del medio son limitadas y debe
utilizar alguna forma de nitrógeno orgánico, acumula compuestos que osmoprotegen
pero que en su constitución molecular no requieran nitrógeno, tal como trealosa.
En E. coli se ha encontrado que la adaptación al shock hiperosmótico ocurre en dos
fases (Csonka, 1989; Sleator y Hill, 2002). Primero el ión K+ se incorpora rápidamente
con la concomitante síntesis de glutamato. En la segunda fase, la concentración de
ambos solutos decae, por la excreción de K+ y la excreción o metabolización del
glutamato, y comienza la síntesis de trealosa completando la adaptación osmótica y
siendo éste el principal soluto acumulado.
Aparentemente, es posible que en P.aeruginosa, ocurra un “juego” regulatorio entre la
acumulación de solutos compatibles, donde el glutamato podría tener un papel
importante junto a otros factores del medio (presencia de glicina-betaína, medio
limitado en nitrógeno, etc.).
En base a los resultados encontrados en este trabajo, y comparando con lo observado en
E. coli, se podría pensar que la síntesis de trealosa y del NAGGA, se lleven a cabo para
reemplazar el glutamato, sin que los niveles de este aminoácido disminuyan demasiado.
Una respuesta a este cambio podría ser la mayor eficacia de estos compuestos para
proteger a la célula osmóticamente estresada. Esta eficacia de los solutos depende, no
solo de la capacidad para reemplazar al ión K+ y al glutamato, sino también de otros
factores, tales como la interacción con macromoléculas celulares.
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68
Impacto de la Fertilización Nitrogenada Sobre la Producción y la
Composición Química de Trigo Doble Propósito y Otros Forrajes
Invernales. Revisión Bibliogáfica.
Denda, S. S.
Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLPam, General Pico, La Pampa.
Email: [email protected]
RESUMEN
En el centro-este del país, el cultivo de trigo y la ganadería forman una parte importante
de ingreso de las explotaciones agropecuarias. La producción ganadera se basa en el uso
de recursos forrajeros perennes y cultivos forrajeros anuales de uso invernal. Los
verdeos invernales son integrantes indispensables de la cadena forrajera de la invernada
o la producción lechera en esta región. La denominación “trigo doble proposito” (TDP)
hace referencia a la utilización de este cultivo con dos objetivos: la alimentación de
animales en pastoreo durante el estadio de crecimiento vegetativo y la producción de
grano. Así, el TDP es una alternativa forrajera en los sistemas mixtos agrícologanaderos. La importancia radica en que en este período invernal existe una
disminución en la oferta de forraje y simultáneamente se incrementa la competencia por
el uso del suelo con cultivos exclusivamente para grano. De esta manera, el uso de TDP
puede generar una mayor eficiencia en la utilización de los recursos disponibles.
Sumado al uso indiscriminado del suelo, el nitrógeno (N) es el mineral que produce
mayores respuestas en los vegetales, encontrandose generalmente en déficit en la
mayoría de la superficie del país. Según la bibliografía revisada la fertilización
nitrogenda aumenta la producción de materia seca (MS), como también adelanta el
periodo de utilización de forraje. Sobre la composición química aumenta el porcentaje
de proteína bruta (PB) en el vegetal y tiende a disminuir los carbohidratos no
estructurales solubles (CNES); sobre los demás componentes nutricionales parece no
tener un efecto marcado.
Palabras clave: trigo doble propósito, forrajes invernales, fertilización nitrogenada,
composición nutricional.
SUMMARY
Wheat crop and livestock raising are an important source of income in the center east of
the country. The livestock yield relies on perennial forage resources and yearly forage
crops during the winter. Winter grasses are an essential part of the forage chain in the
fattening season for cattle or milk production in this region. The so-called dual purpose
wheat (DPW) refers to using this crop with two aims: cattle grazing and crop yield.
Thus, the dual purpose wheat is a forage option in farming and livestock raising mixed
systems. During the winter season there exists a decline in forage supply and at the
same time the demand for grain crops increases. In this way DPW may produce greater
efficiency in the utilization of the available resources. Due to the irrational use of the
soil, nitrogen (N) is in great shortage in most of the country’s surface. According to
bibliography nitrogenous fertilization increases dry matter (DM) yield and hastens the
cycle of forage utilization as well. The percentage of wheat gross protein (GP) increases
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while non structural soluble carbohydrates tend to diminish. Nevertheless, nitrogenous
fertilization seems to have no pronounced effect on the other nutritional components.
Key words: dual purpose wheat, winter forages, nitrogenous fertilization, nutritional
composition.
INTRODUCCION
La producción ganadera basada en la utilización exclusiva de pasturas perennes se
encuentra limitada por la baja disponibilidad de las mismas desde fines del otoño hasta
principios de la primavera. Resulta difícil encontrar un sistema de producción viable
física y económicamente, cuya demanda coincida con esta oferta de forraje
marcadamente estacional. Ante esta situación, la inclusión de verdeos invernales en la
cadena forrajera constituye una estrategia de manejo que permite corregir el déficit
forrajero invernal (Rosso y Verde, 1992).
Sin embargo, en los sistemas mixtos la competencia que se genera entre agricultura y
ganadería hace que el productor limite al máximo la superficie destinada a los verdeos.
En el centro-este del país, región integrada por diversas provincias (Buenos Aires, Santa
Fe, Entre Ríos, Córdoba y La Pampa), el cultivo de trigo constituye la actividad agrícola
de mayor importancia en amplias zonas. En los últimos años se observa una expansión
de dicho cultivo, acompañada de una retracción o concentración de la actividad
ganadera.
El incremento de la agricultura está acompañado por un aumento de la inestabilidad
productiva y económica de las explotaciones, relacionada a las variaciones climáticas
comunes de cada región. La práctica de cultivos de doble propósito es una alternativa
viable en los sistemas mixtos agrícolo-ganaderos por proporcionar forraje durante el
periodo invernal, reduciendo la competencia por el uso del suelo con los cultivos
exclusivamente para grano, y brindando mayor estabilidad de producción. Teniendo en
cuenta la magnitud de la superficie destinada al cultivo de trigo, es importante
considerar que, además de la producción de grano para cosecha, el forraje verde
producido puede ser de utilidad simultáneamente para la producción bovina. Esta doble
producción de grano y forraje sobre la misma superficie, sobre todo con granos de alto
valor, resulta de gran interés económico. Parte de este interés radica en la
diversificación, dado que se cuenta con dos productos de cotizaciones independientes
(Arroquy, 2000).
Por efecto de la degradación de los suelos se ven afectadas las propiedades físicas,
químicas y biológicas. El nitrógeno (N) es el nutriente que presenta deficiencias más
generalizadas en toda la región. La fertilización es una práctica usada para obtener
mayores rendimientos por unidad de superficie. En cultivos de cosecha incrementa el
rendimiento y el porcentaje de grano, con una mayor eficiencia en el uso del agua
(Fagioli y Bono, 1982; Loewy, 1995). Son numerosos los trabajos que evalúan el
impacto de la fertilización nitrogenada sobre la producción de grano, pero muy pocos
los que indagan acerca de sus efectos sobre la composición nutricional del forraje
producido y las consecuencias sobre la respuesta animal.
En consecuencia, el objetivo de este trabajo es revisar la bibliografía acerca del efecto
de niveles crecientes de fertilización nitrogenada sobre la producción de biomasa
vegetal, y el valor nutricional del forraje en general y de TDP. Además, se discutirá si la
magnitud de los cambios esperados en la composición del forraje puede afectar la
productividad animal.
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2.1. Trascendencia del trigo doble propósito.
El TDP tiene una amplia difusión en varios paises del mundo, como Australia, Nueva
Zelandia, España y Estados Unidos. En este último, ensayos realizados en los estados de
Oklahoma, Kansas, Texas, Nuevo Mexico, Colorado, Winsconsin, Indiana, Montana y
Oregon hacen referencia a la importancia de los resultados económicos de su utilización
(Davidson, 1995; Delgado, 1989; Díaz-Rosello et al., 1993; Krenzer, 1995; Redmon et
al., 1995). En Uruguay, un 30-40% de la superficie sembrada anualmente es ocupada
por TDP con variedades de ciclo largo, las cuales son pastoreadas una o dos veces
durante el ciclo vegetativo según las condiciones climáticas y la fecha de siembra
(Travella, 1995).
En nuestro país, el TDP tuvo gran difusión durante la década del 60, donde el 28% de
la superficie de trigo en la provincia de La Pampa se destinaba al pastoreo de ovinos
(Hernández, 1969; Coscia, 1967). Posteriomente, la introducción de nuevos cultivares y
la disminución de la ganadería ovina, provocaron que los productores abandonaran su
cultivo y en la actualidad esta práctica no es utilizada en forma masiva.
Según datos obtenidos de la SAGPyA, la producción del cultivo de trigo en el país ha
ido en aumento a partir de la campaña 1998/99 (Cuadro 1). Si consideramos la apertura
de los mercados a la exportación y los valores actuales a precio dólar para exportación,
la superficie destinada a siembra irá en aumento, afectando directamente la superficie
ganadera.
Cuadro 1. Producción total de trigo en la República Argentina entre 1998 y 2005
(SAGPyA, 2005).
Campaña
Área
Área
Producción Rendimiento
Sembrada Cosechada
(tn)
(kg/ha)
(has)
(has)
1998/99 5.453.250 5.399.080 12.443.000
2304,65
1999/00 6.300.000 6.153.440 15.302.560
2486,83
2000/01 6.496.600 6.408.045 15.959.352
2490,52
2001/02 7.108.900 6.840.720 15.291.660
2235,39
2002/03 6.300.210 6.050.210 12.301.000
2033,00
2003/04 6.035.857 5.718.012 14.534.000
2540,00
2004/05 6.240.000 6.040.000 16.000.000
2650,00
El aprovechamiento del cultivo como TDP puede influir positivamente, tanto en la
rentabilidad como en la preservación del recurso suelo. Sin embargo, resulta crítico
mantener un equilibrio en la utilización del TDP como verdeo invernal y la intensidad y
duración del pastoreo, dado que estos aspectos pueden afectar la producción de grano.
En este sentido, si el meristema apical de crecimiento es dañado se afectará el
rendimiento de grano (Dunphy et al., 1982, Croy et al., 1984; Redmon et al., 1995).
Además, tanto el cultivar de trigo utilizado como la fecha de siembra inciden sobre el
potencial de uso como TDP (Redmon et al., 1995).
En general, los verdeos invernales constituyen un recurso alimenticio de máxima
importancia regional. Estos producen un forraje considerado de alto valor nutritivo, que
normalmente se destina a recría y/o engorde de bovinos. Sin embargo, también pueden
constituir una opción como pastoreo suplementario para animales de requerimientos de
menor magnitud, tales como vacas de cría que consumen forrajes de baja calidad
(Arelovich y Laborde, 2002).
La información existente presenta resultados variables sobre los efectos de manejo en la
producción de cereales de invierno doble propósito, ya que la fisiología del trigo, el
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manejo del pastoreo y la compensación de los componentes del rendimiento de grano
confunden el desarrollo de interpretaciones del efecto de la defoliación sobre el
rendimiento de grano.
2.2. Aspectos relativos a la producción de grano y utilización del forraje.
El rendimiento de los TDP, tanto en lo que respecta a la producción de forraje como a la
de grano, está limitado por las condiciones ambientales, fundamentalmente
precipitación pluvial, temperatura y disponibilidad de nutrientes en el suelo.
Varios autores (Díaz-Rosello et al., 1993; Dalrymple, 1995) han informado que la
producción de forraje en cultivos anuales se incrementa a medida que disminuye la
intensidad de defoliación y se prolonga el período de descanso entre cortes. Sin
embargo, Arzadún et al. (1997), en un ensayo de avena que combinó 3 intensidades de
corte de altura (alta, baja y media) con 3 frecuencias de corte (alta, baja y media),
concluyeron que la combinación de manejo que produjo más volumen de forraje fue la
de alta intensidad de corte con períodos de descanso entre cortes de frecuencia media.
El manejo de la defoliación interactúa con factores ambientales y genotipos,
controlando la supervivencia de macollos y el desarrollo de nueva área foliar posterior
al corte. La recuperación del cultivo es dependiente en gran medida del estado hídrico
del suelo, el nivel de nitrógeno y el genotipo. En cultivos doble propósito, al remover
parte de la biomasa aérea se retira una importante cantidad de nitrógeno (Dunphy et al.
1984). Morris y Gardner (1958) trabajaron con avena, trigo y centeno e informaron que
el nivel de extracción de N contenido en el forraje removido, con diferentes niveles de
fertilización variaba entre 2,5 y 4,5%. Esta remoción de biomasa representaba entre 25 y
45 kg de nitrógeno por cada tonelada de MS extraída (Krenzer et al., 1995).
La magnitud del efecto del pastoreo de TDP de otoño a primavera sobre la producción
de grano dependerá de la disponibilidad de humedad en el suelo al momento de la
siembra y durante el crecimiento, de la fertilidad del suelo y de la intensidad de
defoliación (Redmon et al., 1995). Regionalmente, la fecha de siembra parece tener más
influencia que la intensidad de defoliación sobre la producción de grano. Arroquy
(2000) encontró que por cada día de atraso de la siembra a partir de marzo, la
producción de forraje se redujo, en promedio 19,15 kg de MS/día.
Una preocupación de los productores agropecuarios es la disminución del rendimiento
de trigo si éste se utiliza para pastoreo. Cierta información existente sobre el
rendimiento de grano asociado a la defoliación revela en general reducciones en la
producción de grano para cosecha. Redmon et al. (1995) recopilaron información de
varios ensayos realizados a fines del siglo XIX y principios del siglo XX en Estados
Unidos donde presentaban incrementos y reducciones de rendimiento de granos entre un
40 y 50% con respecto a los trigos sin pastorear.
Tanto Hernández (1969) como Horn et al (1994) evaluaron la producción de carne y el
rendimiento de grano en TDP y encontraron una relación lineal inversa entre ambas
variables (Figura 2.1).
Figura 2.1: Producción de grano versus producción de carne. Adaptado de Horn et al.
(1994).
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En otros cereales de invierno (avena, cebada y triticale) sometidos a simulaciones de
pastoreo también se encontraron reducciones del rendimiento de grano, con respecto a
los no defoliados (Delgado, 1989; García del Moral et al., 1995).
Sin embargo, bajo determinadas circunstancias de manejo, la defoliación no afectó el
rendimiento de grano de trigo. Lerner et al. (1998) concluyeron que cuando el corte se
realizó luego del estadío de espiguilla terminal el rendimiento de grano se redujo más
del 50% con respecto al testigo sin defoliar, pero cortes previos a este momento no
afectaron el rendimiento de grano. Dunphy et al. (1982) indican que la defoliación
produce una reducción severa del área foliar y en consecuencia de los fotosintatos
disponibles, en momentos en que los requerimientos de energía para crecimiento y
reproducción son elevados. Así, una reducción en la disponibilidad de fotosintatos
causó una disminución en el rendimiento de grano. Por lo tanto, los autores sugieren
que las defoliaciones tardías reducen la capacidad del cultivo para recuperar el área
fotosintéticamente activa durante la floración.
La diferenciación del ápice de crecimiento cuando pasa del estado vegetativo al
reproductivo concuerda con la elongación del primer entrenudo. Al elongarse el
extremo del ápice se eleva por encima del suelo y se ubica al alcance del animal, que
puede dañarlo durante el pastoreo. Es de fundamental importancia que el pastoreo cese
antes de la ocurrencia de este evento. La evidencia experimental indica que el
rendimiento de grano no es afectado si se remueve el ganado como mínimo una semana
antes de la elongación del primer entrenudo, o la aparición del “primer tallo hueco”
(Krenzer et al., 1997).
La disminución del rendimiento por efecto de la defoliación fue inicialmente atribuída a
la remoción de ápices meristemáticos cuando el pastoreo se extendió durante el periodo
de encañazón. El daño mecánico que provoca el pastoreo o corte por la remoción de
ápices reproductivos no sólo afecta el número de espigas, sino también el rendimiento
individual de cada espiga. Esto es atribuido a que los macollos principales son los de
mayor rendimiento individual y, al ser decapitados, la producción de grano deberá
basarse exclusivamente en los macollos secundarios, que tendrán un periodo
relativamente corto para poder alcanzar un desarrollo adecuado para la formación de
espigas (Morris y Gardner, 1958).
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Redmon et al. (1996) sostienen que el pastoreo o el corte deben finalizar cuando se
detecta el primer entrenudo hueco y que un retraso de este momento provoca
reducciones significativas en el rendimiento de grano (Figura 2.2).
Figura 2.2: Rendimiento de grano de acuerdo al momento de fin de pastoreo. Adaptado
de Redmon et al. (1996).
El trigo presenta una gran similitud con otros cereales de invierno: posee alto valor
nutritivo, fundamentalmente por su alta digestibilidad, gran palatabilidad durante el
invierno, con un alto contenido de proteína bruta (PB), y bajo contenido de fibra
(Romero et al., 1993), teniendo así características de manejo similares a otros verdeos
de invierno para producción de forraje.
Quiroga et al. (1996, 1998) y Duarte (1999) sostienen que, sin tener en cuenta el efecto
del manejo, la productividad de los verdeos depende de las características de la especie
y cultivar, de la humedad y fertilidad del suelo, y de las temperaturas del ambiente y del
suelo, como así también de la fecha de siembra.
La fecha de siembra de verdeos de invierno generalmente es llevada a cabo desde fines
de verano a fines de otoño, dependiendo de la zona. En la región pampeana una alta
proporción de la producción total de forraje de los verdeos de invierno está concentrada
en el mes de abril, indicando que un retraso en la siembra reduciría significativamente la
producción total del verdeo. Varios trabajos coinciden con dicha afirmación (Amigone
et al., 1995; Delgado, 1989; García del Moral et al., 1995; Krenzer, 1995; Josifovich et
al., 1969).
Bergh y Duhalde (1992) trabajaron en trigos para pastoreo con siembras en abril y en
mayo, obteniendo un 70% más de producción de forraje en la siembra de abril con
respecto a mayo.
Arzadún (1988) evaluó la tasa de crecimiento de un verdeo de avena sembrado en
diferentes fechas: temprana (5 de marzo) y tardía (3 de abril). Las tasas de crecimiento
en la siembra temprana fueron 67% y 58% mayores en los meses de abril y mayo,
respectivamente, comparadas con la siembra tardía. Durante junio y julio no hubo
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diferencias, mientras que en los meses de agosto y septiembre la siembra tardía superó
la tasa de crecimiento en sólo 10% y 23% al cultivo sembrado en marzo (Figura 2.3).
Figura 2.3: Tasa de crecimiento en verdeo de avena. Adaptado de Arzadún. (1988).
Los resultados variables en la reducción del rendimiento del forraje por siembras tardías
son atribuídos principalmente a la variación en las condiciones climáticas durante el
periodo de crecimiento del verdeo (Arzadún, 1988).
Existe una relación negativa entre el adelanto de la fecha de siembra y el rendimiento de
grano, inversamente a lo que ocurre con la producción de forraje (Berh y Duhakde,
1992; Delgado, 1989; Krenzer, 1995). Pero, en el caso del uso de cultivares de ciclo
largo sembrados temprano, es aconsejable uno o más pastoreos durante su ciclo
vegetativo, debido a que el crecimiento exesivo otoño-invernal puede ser perjudicial
para la producción posterior de grano (Travella, 1995). Según Mattheu et al. (1991), la
acumulación de un volumen elevado de biomasa provoca un exceso de tejidos de baja
actividad fotosintética. Cabe esperar que la defoliación provoque efectos positivos
cuando se comparan cultivos sembrados en fechas muy tempranas, ya que en
condiciones sin limitantes hídricas y nutricionales un cultivo de trigo define su potencial
de rendimiento en base a la capacidad fotosintética que logra para la formación de
órganos reproductivos (Dunphy et al., 1984).
2.3. Efectos de la fertilización nitrogenada sobre los componentes de producción
forrajera.
Los suelos de varias zonas agrícolas del país tienen bajos niveles de materia orgánica
(MO) y son fácilmente vulnerables ante los dos tipos de erosión: hídrica y eólica. Las
lluvias son la única fuente de humedad y el desfasaje entre precipitaciones y
necesidades hídricas suele ser considerable. El avance de la agricultura y el mal uso del
recurso suelo acentúan estas limitaciones, traducidas en bajos niveles de producción.
Por efecto de la degradación de los suelos se ven afectadas las propiedades físicas,
químicas y biológicas. El N es el nutriente que presenta deficiencias más generalizadas
en toda la región (Bono et al., 1997).
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75
Las deficiencias de N pueden ser corregidas de dos formas: rápida, mediante
fertilización, o lenta (progresiva), por el uso de pasturas a base de leguminosas. En el
cultivo de trigo los requerimientos más altos de agua y nutrientes se producen en
encañazón y espigazón, siendo estos los momentos más críticos, que ocurren en
septiembre y octubre (Fagioli, 1972, 1976, 1977; Fagioli y Bono, 1984a, 1984c).
La fertilización es una práctica usada para obtener mayores rendimientos por unidad de
superficie. En cultivos de cosecha incrementa el rendimiento y el porcentaje de proteína
en grano, con una mayor eficiencia en el uso del agua (Fagioli, 1987; Fagioli y Bono,
1982; Fagioli et al., 1982; Loewy, 1995).
El cultivo de trigo es el que presenta mayor información sobre fertilización nitrogenada
por ser uno de los principales cereales para cosecha debido a su importancia a nivel
mundial en la alimentación humana (Berardo, 1994; Darwich, 1989, 1995; Loewy,
1990, 1996; Loewy y Ron, 1996; Melgar et al., 1996; Ron y Lowy, 1995; Das et al.,
1994; Tonev, 1996; Abd et al., 1996).
Existe una correlación positiva entre aporte de N al suelo y la producción de grano.
Adicionalmente, se ha encontrado una interacción entre la producción de grano, el
contenido de proteína y la calidad del grano en trigos fertilizados con N. López Bellido
et al. (1998) obtuvieron, con dosis de 50-100-150 kg de N/ha un aumento proporcional
en producción de grano y en el contenido de N en los mismos. Según Abou Salama et
al. (1995), a mayor cantidad de N utilizado y a mayor frecuencia de aplicación del
fertilizante, el contenido de proteína en el grano aumenta. Justes et al. (1994)
concluyeron que a medida que disminuye la cantidad de N utilizado disminuye el
contenido de proteína en el grano.
La fertilización nitrogenada puede constituirse en una herramienta, no sólo para
incrementar la producción y calidad del grano, sino también para inducir mayor
producción de MS disponible para pastoreo en TDP. El uso de fertilizantes como el N
puede generar cambios en la cantidad y composición química de la biomasa producida.
La fertilización nitrogenada incrementa la producción total de MS en diferentes forrajes.
En este sentido, la efectividad de la fertilización parece variar con distintos factores
ambientales. Así, la temperatura ambiente y el estrés hídrico influyen directamente en la
tasa de mineralización del N en el suelo. Maddonni et al. (1995) compararon cultivos de
trigo sembrados a campo, en laboratorio y en invernáculo, y encontraron que el nivel de
mineralización del N varió al controlar el medio ambiente. Estos autores observaron que
la correlación entre el N lábil del suelo y el contenido de materia orgánica resultó a
campo menor que en invernáculo, y aquí menor que en el laboratorio.
Otro factor ambiental crítico es la disponibilidad de nitratos en el suelo durante el
invierno, la cual es generalmente baja debido a la menor mineralización de N
proveniente de la materia orgánica. Por lo tanto, el agregado de N a través del
fertilizante produce aumentos significativos en la producción, a la vez que permite
adelantar el primer aprovechamiento para consumo animal. El contenido de nitratos y la
disponibilidad de agua en el suelo en el momento de la siembra son probablemente los
dos factores que más inciden en el rendimiento de MS de verdeos como TDP.
Contrariamente, precipitaciones elevadas distribuidas en el período de crecimiento de la
planta, parecen influir negativamente sobre la absorción y eficiencia de utilización del
N.
Según Mazzanti et al. (1997), la disponibilidad de N en el suelo es uno de los factores
más limitantes para la producción de forraje en verdeos invernales, con variaciones
estacionales de la concentración de N en el suelo, que es máxima a mediados de
primavera y verano y mínima en invierno y principios de primavera. Asi también,
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76
sostienen que la eficiencia de uso de la fertilización nitrogenada en verdeos de avena
decae a medida que aumenta la dosis aplicada (Cuadro 2).
Cuadro 2. Tasa de crecimiento de verdeos de avena con distintas dosis de N
(Mazzanti et al., 1997).
Tandil, 1994.
Balcarce, 1995.
Dosis de Nitrógeno kg
kg/MS/día
kg/MS/día
/ha
0
50
100
150
55
129
154
206
29
69
73
107
Romero et al. (2001) hallaron que la producción de forraje en pasturas de cebadilla
criolla aumenta con el incremento de las dosis de fertilizante nitrogenado. En general, la
mayor eficiencia de utilización del N se logró con dosis de hasta 50 kg N/ha. Por
encima de estos niveles de N, la tasa de producción fue menor y dependió de las
características del suelo, dado que los ensayos tuvieron diferentes cultivos antecesores.
En un experimento que tuvo como antecesor una pastura de cuatro años de alfalfa
consociada con cebadilla, la producción de MS se incrementó con dosis de hasta 100 kg
N/ha. Mientras que en un segundo experimento, con una cubierta de gramíneas puras, la
producción de biomasa tuvo una respuesta positiva con dosis de hasta 200 kg N/ha.
Además de incrementar la biomasa, la aplicación de fertilizante nitrogenado al finalizar
el invierno adelanta significativamente el pico de producción primaveral de forraje,
principalmente en gramíneas templadas (Mazzanti, 1994; Marino, 1995). Estos autores
trabajaron con avena y raigrás anual, utilizando distintas dosis de fertilización
nitrogenada (en forma de urea) y analizaron la producción de forraje en dos
dimensiones. La primera de ellas se relaciona con la diferencia de forraje acumulado al
finalizar el periodo de rebrote entre pasturas sin y con el agregado de N, y la segunda se
relaciona con la anticipación con que las pasturas fertilizadas alcanzan el máximo
forraje acumulado de las pasturas no fertilizadas. La Figura 2.4 representa el forraje
acumulado de raigrás para 0 y 100 kg de fertilización con N. La flecha vertical muestra
la ventaja que se logra en la producción de forraje al finalizar el periodo de acumulación
cuando se comparan los tratamientos 0 y 100 kg de N/ha (3.865 kg MS/ha). La flecha
horizontal, trazada entre la máxima acumulación de forraje del tratamiento sin N y la
intersección con el tratamiento fertilizado, cuantifica la precocidad con que los
tratamientos fertilizados alcanzan la máxima acumulación de los no fertilizados. En este
caso se logra adelantar aproximadamente en un mes la máxima producción del raigrás
no fertilizado.
Figura 2.4: Forraje acumulado de raigrás para 0 y 100 Kg de fertilización con
Nitrógeno. Adaptado de Mazzanti et al. (1997).
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77
Diaz-Zorita et al. (1995) concuerdan con lo expuesto anteriomente: la fertilización
nitrogenada tiende a aumentar la producción temprana de forraje en otoño. Según Lobit
et al. (2001) esto se debería al incremento en el número de hojas, lo que aumenta el
aprovechamiento de N.
La aplicación de N incide sobre el desarrollo del área foliar de la planta aumentando la
cantidad de radiación interceptada. Esto promueve la utilización de los carbohidratos
para la síntesis de proteínas y tejido vegetal (Tisdale et al., 1993) y afecta la expansión
foliar mediante el incremento de la división celular (Gastal, 1994).
La fertilización nitrogenada aumenta la longitud de las hojas y vainas, la densidad y el
peso de los macollos y el ancho de las láminas (Mazzanti et al., 1997). Gonzalez et al.
(2001) estudiaron el efecto de la fertilización nitrogenada sobre el establecimiento de
gramíneas forrajeras, y observaron que el N aplicado promovió también el crecimiento
individual de los macollos y el desarrollo de vegetación adventicia.
2.4. Efectos de la fertilización nitrogenada sobre la composición quimica del forraje.
Al aumentar la producción total de MS se modifica la relación hoja/tallo del cultivo.
Esto mejora la calidad nutricional del forraje, dado que las hojas son los componentes
de mayor contenido de nutrientes y mayor digestibilidad (Gastal, 1988; Marino, 1996).
Por otra parte, la fertilización con N puede modificar la composición química de la
planta, en especial en cuanto a su contenido de proteína total y carbohidratos. Incluso,
pueden afectarse las proporciones relativas de los mismos, su solubilidad y
degradabilidad ruminal.
Frasinelli et al. (2001) estudiaron el efecto de la fertilización de una pastura con N sobre
la dinámica de la digestión ruminal medida a través de la técnica “in situ” de animales
en pastoreo. Para ello, utilizaron una pastura de Digitaria eriantha con dos tratamientos:
sin fertilización y fertilizada con 200 kg urea/ha. Estos investigadores concluyeron que
la fertilización nitrogenada aumentó significativamente la degradación ruminal de la
proteína.
Candotti et al. (2001) evaluaron el efecto de la fertilización nitrogenada y el momento
de corte sobre la producción y el valor nutritivo de Gatton panic (Panicum maximun),
un forraje destinado a la henificación. Encontraron que la producción de forraje en los
tratamientos fertilizados fue superior a la de los tratamientos no fertilizados, y que la
fertilización con N y los cortes anticipados en estados avanzados de madurez
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incrementaron la producción total y mejoraron el valor nutritivo del forraje cosechado
(Cuadro 3).
Cuadro 3. Producción de MS, PB, digestibilidad in vitro, y fibra detergente neutra para
los factores fertilización y momento de corte (adaptado de Candotti et al., 2001).
Fertilización
Momento de Corte
Item
Producción, kg MS/ha
Proteína Bruta, %
Digestibilidad in vitro, %
Fibra detergente Neutra,%
Control
1.587a
5,6a
56,9a
69,7a
50 kg N/ha
2.877b
7,8a
59,7a
69,2a
M0
1.738a
5,0a
54,3a
71,5a
M1
2.726b
8,3b
62,3b
67,4b
MO: 100% de panojamiento en la pastura; M1: máxima producción de MS digestible/ha. En
cada columna, los valores seguidos de diferentes letras difieren estadísticamente (p<0,05).
En otro estudio realizado sobre pasto clavel (Hemarthria altissima), Candotti et al.
(2001) evaluaron el efecto de la fertilización nitrogenada sobre la producción forrajera y
el contenido de PB en tres fechas durante su crecimiento (ver Cuadro 4).
Cuadro 4. Producción promedio de MS y contenido de PB en Pasto clavel (adaptado de
Candotti et al., 2001).
Tratamiento
Producción MS
PB
(kg/ha)
(kg/ha)
Sin fertilizante
4.028b
Fertilizante base
4.445ab
(P + K)
Fertilizante base + N 5.327a
(100 kg urea/ha)
156b
170b
243a
En cada columna, los valores seguidos de diferentes letras difieren estadísticamente (p<0,05)
Candotti et al. (2001) informaron que la fertilización nitrogenada aumentó la producción
de MS y de PB/ha de pasto clavel en las distintas fechas de corte estudiadas. El
incremento de PB sólo se manifestó hasta los 28 días de crecimiento. A partir de ese
momento, la PB se diluyó por el incremento de MS (Cuadro 5).
Cuadro 5. Concentración promedio de la PB en pasto clavel (adaptado de Candotti et
al., 2001).
PB (%)
Días de
Sin Fertilizante Fertilizante
Fertilizante
Crecimiento
Base
Base + N
28
5,53b
5,30b
8,70a
56
3,36a
3,45a
3,26a
84
3,86a
3,34a
3,88a
En cada columna, los valores seguidos de diferentes letras difieren estadísticamente (p<0,05)
A medida que la fertilización nitrogenada incrementa linealmente la concentración de N
en el forraje, el contenido de Carbohidratos No Estructurales Solubles (CNES)
disminuye significativamente. En estos casos, la concentración de CNES se correlaciona
negativamente con el contenido de N en la planta (Marino et al., 1995). Esta correlación
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79
se debería a la utilización de los CNES en la síntesis de proteínas destinadas al
crecimiento. En 1997, los mismos autores trabajaron con avena y raigrás anual y
también informaron un aumento en la concentración de N en el forraje y una
disminución en el contenido de CNES durante la etapa inicial del rebrote invernoprimaveral. Con el transcurso de la acumulación del forraje, la concentración de CNES
tiende a reestablecerse. La digestibilidad del forraje y el contenido de fibra no fueron
marcadamente afectados por la fertilización nitrogenada (Mazzanti et al., 1997).
Johnson et al. (2001) evaluaron la respuesta de tres especies forrajeras tropicales a
distintas dosis de fertilización nitrogenada. La fertilización con 78 kg N/ha incrementó
en un 129 % la masa de forraje producido comparado con el tratamiento no fertilizado.
Sin embargo, la adición por encima de 78 kg N/ha no produjo incrementos
significativos en la masa de forraje, mientras que la digestibilidad de la MO y la
concentración total de N tuvieron un incremento lineal. Así mismo, se observó que la
Fibra Detergente Neutro (FDN) disminuyó con el aumento de la dosis de fertilizante
nitrogenado.
En coincidencia con el trabajo precedente, Ryan et al. (1997) obtuvieron un incremento
significativo de la biomasa y de la producción de grano en trigo cuando fertilizaron con
90 kg de N/ha, pero observaron un efecto muy pequeño en la concentración de N en el
grano.
Cuomo et al. (1996) estudiaron aspectos relativos a la combinación entre fertilización
nitrogenada y posterior quema de la biomasa en pastizales naturales. Los resultados
mostraron un aumento en la concentración de PB de un 18% de magnitud, de la cual el
65% era proteína degradable en rumen.
Messman et al. (1991) evaluaron el efecto de la fertilización nitrogenada sobre la
digestibilidad y el contenido de FDN, Fibra Detergente Ácida (FDA) y celulosa en
cebadilla (Bromus spp.). La adición de N (98 kg/ha) no afectó significativamente a los
parámetros medidos, mientras que los mismos se modificaron a medida que las plantas
avanzaban en su estado de madurez. Brizuela et al. (1996) evaluaron el efecto de la
fertilización nitrogenada y el pasaje de estado vegetativo a reproductivo sobre el valor
nutritivo de dos cultivares de Festuca arundinacea que diferían en la flexibilidad de sus
láminas. A excepción del porcentaje de PB, que fue marcadamente incrementada por la
fertilización, las restantes variables analizadas fueron más afectadas por el cambio de
estado vegetativo a reproductivo que por el agregado de N.
2.5. Relación entre la composición química del forraje y la productividad animal.
La composición química del forraje es el principal determinante del consumo voluntario
y de la eficiencia de utilización con que el mismo se transforma en producto animal. El
trigo, como forrajera invernal anual, presenta una composición química similar a otros
verdeos de invierno (Cuadro 6).
Cuadro 6. Composición química porcentual de diferentes verdeos invernales sobre base
seca (Adaptado de INPOFOS, 1998).
VERDEO
MS
PB
FDN
FDA
Digestibilidad
(%)
(%)
(%)
(%)
in vitro (%)
Avena
21
18
62
36
78
Centeno
20
20
61
31
70
Trigo
20
19
65
38
75
En bovinos a pastoreo sobre verdeos invernales sin suplementación, se informaron
ganancias diarias de peso de hasta 900 g/día (Arzadún et al., 1998) y con
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80
suplementación hasta 1.200 gr/día (Paisley et al., 1998). Entre otros factores, la
productividad animal sobre verdeos invernales dependerá de la composición del verdeo
y de las características del suplemento.
Según Cherney (1982), la digestibilidad es una forma de estimar la calidad, y en los
forrajes depende del contenido y estructura de las paredes celulares que condicionan la
accesibilidad de los microorganismos del rumen. Con la madurez de la planta aumenta
el contenido de la pared celular y por ende disminuye su digestibilidad. Asimismo,
disminuye el contenido de calcio (Ca), fósforo (P), magnesio (Mg). Sin embargo, los
productores de la región manifiestan dificultades en lograr altas ganancias de peso sobre
verdeos invernales, principalmente avena y sobre todo en los meses de otoño. Elizalde y
Santini (1992) sugieren que las bajas ganancias otoñales son debido a una relación
inadecuada de proteína soluble (PS) y CNES, asociado a una baja concentración de MS
en los primeros estadios de crecimiento. Ferri y Stritzler (1993), sostienen que
contenidos de agua en los verdeos superiores al 85% han sido correlacionados con
transtornos metabólicos, particularmente diarrea, desbalance electrolítico,
deshidratación, depresión del consumo y bajos aumentos de peso.
Mazzanti et al. (1997) sostienen que los aumentos en la producción, precocidad y la
calidad nutritiva del forraje en invierno y principios de primavera logrados por el efecto
de la fertilización nitrogenada, permitirían incrementar la dotación animal en dicho
periodo, y con ello la productividad global de los sistemas de producción animal de la
región.
En ensayos realizados en la EEA Gral. Villegas del INTA (Gonella, 1999) se efectuaron
evaluaciones de la producción de carne sobre verdeos invernales fertilizados con
nitrógeno durante dos temporadas. Se analizó el comportamiento al pastoreo de avena
Millauquén INTA, triticale Don Norman INTA y raigrás Tama. En todos los casos, se
trabajó con un elevado nivel de nitratos en el momento de la siembra y con la aplicación
de 50 kg de urea/ha, en estadios de crecimiento temprano (3-5 hojas). Los resultados
indican que la práctica de la fertilización nitrogenada en verdeos de invierno mejora la
producción de carne para todos los cereales evaluados, anticipando la iniciación del
pastoreo, con una mayor disponibilidad de forraje. Existió una depresión del nivel de
aumento de peso individual básicamente para avena y triticale, indicando que los lotes
fertilizados con N deberían manejarse con una suplementación estratégica de los
animales durante el primer aprovechamiento para evitar deprimir el nivel de ganancia de
peso en el peor trimestre del año. La fertilización nitrogenada deprimió el contenido de
MS, pero aportó una diferencia de forraje que permite manejar mayor carga animal,
aplicando una suplementación estratégica para sostener la ganancia individual.
La fertilización con N en TDP puede exacerbar el desbalance de PS, CNES y MS.
Arelovich et al. (2003) discutieron distintos programas de suplementación que se
pueden ajustar a estas situaciones para optimizar desde el punto de vista biológico la
respuesta productiva del animal a pastoreo. Pordomingo et al. (2001) coinciden en que
sería necesaria una suplementación energética para balancear la dieta sobre verdeos de
alta producción otoñal. Sin embargo, sugieren que la suplementación invernal tendría
efectos sustitutivos pero no aditivos sobre el consumo y el aumento de peso.
COMENTARIOS FINALES
La fertilización nitrogenada provoca cambios en la composición química de los forrajes,
como así tambien un adelanto en el pico de producción de forraje y un incremento de
biomasa vegetal. A medida que aumenta la dosis de fertilizante utilizado aumenta el %
de PB aunque la eficiencia de uso de la fertilización decae a partir de ciertas
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81
concentraciones de N. Los CNES tenderían a disminuir con la fertilización nitrogenada
en un primer momento, pero luego se incrementarían con la madurez del vegetal. La
FDN, FDA y Lignina no se verían afectados por la fertilización nitrogenada pero sí por
el estado vegetativo del forraje.
El efecto de la fertilización nitrogenada estaría fuertemente asociado a factores
ambientales, principalmente lluvias y nutrientes presentes en el suelo.
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ISSN: 1515-1883
85
Tuberculosis Bovina: Valoración de la Inmunohistoquímica Como
Método de Diagnóstico Complementario
Dubarry, J.
Cátedra de Patología General, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLPam.
RESUMEN
Se analiza el valor de la inmunohistoquímica como método para ajustar los datos
estadísticos de la tuberculosis bovina en la provincia de La Pampa, estimados en base a
los decomisos en frigorífico. Se aplicó la técnica de inmunohistoquímica a las muestras
obtenidas en dos trabajos anteriores, fijadas en formol e incluidas en parafina. Se
comparó la frecuencia de los diagnósticos efectuados en dicho estudio:
anatomopatológico macroscópico, anatomopatológico microscópico y bacteriológico
positivos para dicha enfermedad, con los que lo fueron aplicando la
inmunohistoquímica. Las lesiones compatibles macroscópicamente con tuberculosis, se
confirmaron por bacteriología en un 50,33%, por histopatología en un 69,80% y por
inmunohistoquímica en un 72,49%. Esta diferencia positiva en cuanto a la
inmunohistoquímica se atribuye a la presencia de granulomas tuberculosos con
morfología atípica (abscesos inespecíficos). Este trabajo reafirma el gran valor de la
inspección macroscópica, por sus características operativas, su carácter de
irreemplazable por otras técnicas más trabajosas y que necesitan mayor tiempo para su
desarrollo, pero demuestra la importancia de la aplicación de la inmunohistoquímica
para la corrección de estadísticas y el seguimiento de los planes sanitarios, a través de
muestreos regionales.
Palabras clave: Tuberculosis, bovinos, prevalencia, inspección en la faena,
inmunohistoquímica.
SUMMARY
On analysed the immunohstochemistry value as a method for adjusted the stadistic of
bovine tuberculosis in La Pampa province of Argentine which was estimated trough the
macroscopic diagnosis in the slaughterhouse inspection. On applicated the
immunohistochemistry technique to the formol-fixed and paraffin-embedded tissu
samples obtained in two back works. The macroscopic compatible lesions as
tuberculosis were confirmed by bacteriology in an 50,33%, by histopathology in an
69,80% and by immunohistochemistry in an 72,49%. This positive difference in order
to immunohistochemistry is attributed to the atypical tuberculosis granuloma
morphology (an specific abscess). This work enhances the grate value of the gross
inspection, trough this easy and rapid operative condition, but demonstrate the
importance of the immunohistochemistry technique for the stadistic correction and for
the epidemiological vigilance, trough regional samples.
Key Words: Bovine tuberculosis, immunohystochemistry, slaughterhouse inspection,
positive predictive value.
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INTRODUCCIÓN
La tuberculosis es una enfermedad zoonótica que afecta a un gran número de especies
animales, causada por bacterias representantes del género Mycobacteriun (Acha y
Cifres, 1989). La Argentina cuenta con un plan de control y erradicación consistente en
la eliminación de los animales reactores a la prueba tuberculínica. La adopción de este
plan se justificó por la importancia de la enfermedad en la Salud Pública como así
también por su importancia económica ya que es considerada en la actualidad como una
de las enfermedades más importantes, (aumento de la infección por M. bovis en el
hombre). En la provincia de Santa Fe el 6% de los casos de tuberculosis en los seres
humanos son debidos a M. bovis (Cantor y Bernardelli, 1987; Kantor y Ritacco, 1994;
O´Reilly y Daborn, 1995). Su incidencia es negativa sobre la producción de carne y
leche, así como sobre la inserción en mercados externos, que en la actualidad, exigen la
ausencia de bacterias patógenas o fracciones de las mismas, para los productos y
subproductos de origen animal.
En la Argentina se estima que la prevalencia de la enfermedad en el ganado bovino es
del 6% (Cuando la estimación se hizo mediante la prueba de tuberculina comparativa
fue del 4,3%.) y el porcentaje de rodeos infectados se eleva al 38%.
Los datos son parciales, referidos a determinadas provincias y en la mayoría de los
casos las cifras corresponden a hallazgos en frigoríficos. Con referencia a estos últimos,
la correlación entre al diagnóstico macroscópico y microscópico varió entre el 54 y el
90%.
Para el Plan de Control y Erradicación de la Tuberculosis Bovina uno de los aspectos
más importantes es la vigilancia epidemiológica (Kantor y Ritacco, 1994; SENASA,
1999), cuyo punto de partida es la detección de animales enfermos mediante el
diagnóstico anatomopatológico macroscópico en las plantas faenadoras. Para hacer
confiables estos datos es necesario confirmarlos mediante estudios específicos.
Para nuestra ganadería y por lo tanto para la salud pública, la enfermedad constituye un
serio problema y al no haber zonas libres en las regiones más importantes de
explotación bovina, los animales enfermos circulan sin restricciones manteniendo el
ambiente contaminado y constituyendo una amenaza para el bienestar humano y animal.
La identificación del agente etiológico es considerado el diagnóstico definitivo,
mientras que los otros utilizados son presuntivos. La inspección en matadero es un
método operativo en el cual se basan las estadísticas con que contamos y su utilidad
como diagnóstico de la tuberculosis varía de acuerdo con la calidad de la inspección y la
prevalencia de la enfermedad, no obstante es un diagnóstico de carácter presuntivo
(Adams, 2001). Por eso es preciso ajustar el diagnóstico con pruebas de mayor
especificidad que permitan confirmar los verdaderos positivos y los falsos negativos, sin
discutir la validez de la inspección en matadero como método diagnóstico de
tuberculosis en todas las especies.
En un proyecto anterior: “Tuberculosis bovina: correlación entre los diagnósticos
macroscópicos y microscópicos” se realizaron los estudios histopatológicos y
bacteriológicos de las lesiones de los órganos decomisados por tuberculosis en un
frigorífico de la zona norte de la provincia de La Pampa. La gran diferencia entre los
datos obtenidos (50,33% cultivos positivos versus 69,04% positivos histopatológicos)
planteó la duda respecto a la pérdida de viabilidad de los mycobacterium por diferentes
causas.
Para confirmar o descartar esta hipótesis, se proyectó aplicar la técnica de
inmunohistoquímica, utilizando anticuerpos monoclonales para la detección de
antígenos del M. Bovis.
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87
El fundamento de la técnica de tinción por inmunohistoquímica (IHQ) es detectar los
antígenos que se encuentren en los tejidos, evidenciados por la formación de un
complejo antígeno anticuerpo que se visualiza con el uso de un microscopio estándar.
La sensibilidad de las técnicas de inmunohistoquímica fue mejorada significativamente
con el desarrollo de distintos métodos. Al comienzo se aplicaba el anticuerpo marcado
con una enzima que por una reacción colorimétrica revelaba la presencia del antígeno.
Luego se aplicaron distintos métodos indirectos que aumentaban notoriamente la
posibilidad de ver esta reacción con el antígeno, haciéndolos más sensibles. La
producción de anticuerpos monoclonales, aumentaron la especificidad de la prueba.
Los resultados de esta publicación se obtuvieron aplicando la técnica donde un
anticuerpo secundario formado por un polímero unido a varias moléculas de peroxidasa
revelan la presencia del antígeno unido al anticuerpo monoclonal anti-Mycobacterium
bovis, es decir es ampliamente sensible y específica.
Se aplicó la técnica de inmunohistoquímica para el diagnóstico de Mycobacterium bovis
a todas las muestras de órganos con lesiones macroscópicas compatibles con
tuberculosis, obtenidas para desarrollar un trabajo anterior, fijadas en formol e incluidas
en parafina.
Se utilizó el método indirecto, que consiste en unir el antígeno tisular con el anticuerpo
monoclonal anti-Mycobacterium bovis obtenido en conejo (anticuerpo primario)
(Dako). Luego se enfrenta con en anticuerpo secundario anti inmunoglobulina de conejo
unido a un polímero que contiene varias moléculas de enzima peroxidasa (Dako.
Envision). Por último se revela con un reactivo cromógeno que contiene el agua
oxigenada (Dako).
Los cortes teñidos y montados en bálsamo de Canadá se diagnosticaron con un
microscopio óptico.
RESULTADOS
Las muestras positivas a la histopatología y a la bacteriología resultaron positivas a la
inmunohistoquímica en un 100%. Las muestras positivas a la histopatología y negativas
a la bacteriología resultaron positivas a la inmunohistoquímica en un 100%. Las
muestras negativas a la histopatología fueron positivas por inmunohistoquímica en un
2,69%.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
Cuando se propone un Plan Nacional de Control y Erradicación de la Tuberculosis
Bovina, como el que comenzó a implementarse hace unos años en la República
Argentina (Kantor y Ritacco, 1994; SENASA, 1999), se debe partir del conocimiento de
la prevalencia inicial de la enfermedad, para la posterior evaluación del efecto de dicho
proyecto.
Para esto se parte de muchas indefiniciones, como son la falta de relación entre los
resultados de la prueba de tuberculina y los animales verdaderamente infectados, ya que
algunos tuberculino positivos han tenido contacto con otras micobacterias sin estar
infectados con el Mycobacterium bovis (Adams, 2001). Asimismo, no todos los
ISSN: 1515-1883
88
animales tuberculino negativos lo son realmente, como en el caso de las anergias por
tuberculosis generalizadas.
Para mejorar la estimación de la prevalencia, se consideraron los datos arrojados por los
decomisos en los frigoríficos atribuidos a esta enfermedad. Y para acercarse más a la
realidad se compararon estos datos con el diagnóstico anatomopatológico microscópico
en distintas regiones del país, dando disparidad de relaciones.
Ante esto y en trabajos anteriores esbozamos y comprobamos la hipótesis que al realizar
un mayor número de muestras de cada carcasa decomisada por tuberculosis,
aumentamos la probabilidad de encontrar una lesión morfológicamente compatible
(Jubb et al., 1990; SENASA, 1999; Dubarry et al., 2003). También relacionamos los
diagnósticos anatomopatológicos tanto macroscópicos como microscópicos con los
diagnósticos bacteriológicos positivos al cultivo en medio de Stone Brink (Kantor y
Bernardelli, 1987). Los datos obtenidos arrojaron una diferencia importante entre los
histopatológicamente positivos y los que lo fueron por bacteriología (aproximadamente
un 19% menos en este último caso). Esto podría ser debido a la pérdida de viabilidad
del Mycobacterium bovis, pero oscurecía la confiabilidad en el método histopatológico.
Así es que se decidió aplicar la técnica de inmunohistoquímica, que fue criticada en
trabajos anteriores como poco específica, en los que se utilizaban anticuerpos
policlonales que no diferenciaban entre las distintas especies de micobacterias (Coetsier
et al., 2000) e incluso reaccionaba con antígenos del Mycoplasma spp. Pero la elegimos
ya que se solucionó este inconveniente mediante la obtención de un anticuerpo
monoclonal para Mycobacterium bovis. Además y a pesar que es un antígeno de gran
tamaño, se mejoró la sensibilidad de la prueba mediante el uso de un anticuerpo
secundario unido a un polímero de gran tamaño, que permite visualizar fácilmente la
presencia del antígeno, aún cuando está en poca cantidad. Otra crítica que tenía en
cuanto a su especificidad era que también se coloreaban tejidos como el cartílago, el
conectivo y el endotelio, pero la ubicación intramacrofágica, así como en forma libre en
las distintas regiones del interior del granuloma, nos permiten diferenciar claramente al
antígeno.
Los resultados obtenidos evidencian que la inmunohistoquímica es más sensible que los
diagnósticos que utilizan técnicas tales como la tinción de los tejidos con Ziehl-Neelsen
y que los cultivos bacterianos. También es más sensible que el diagnóstico
histopatológico ya que detecta aquellas lesiones con morfología atípica para un
granuloma tuberculoso, como en los casos de los abscesos inespecíficos (Jubb et al.,
1990; SENASA, 1999; Dubarry et al., 2003).
Tiene la ventaja de ser un método rápido, de bajo costo y con mayor grado de
bioseguridad con respecto a los cultivos.
La conclusión es que es una prueba recomendada para confirmar los casos
diagnosticados macroscópicamente en la faena y así dar valor real a las estadísticas
regionales.
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ISSN: 1515-1883
90
Constantes Biofisicoquímicas del Líquido Sinovial de Bovinos. Tensión
Superficial a Distintas Temperaturas
1
Noia, M. A.; 2Carrozza, J. S. W.; 3Frígoli, A. E.; 4Simpson, M. I.
Cátedra de Introducción a la Biofísica, UNLP y Cátedra de Física Biológica, Facultad
de Ciencias Veterinarias, UNLPam. 2Cátedra de Química Inorgánica y Orgánica,
UNLPam y Cátedra de Introducción a la Biofísica y de Física y Química Aplicadas,
UNLP. 3Cátedras de Introducción a la Biofísica y de Física y Química Aplicadas,
Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP. 4Cátedra de Introducción a la Biofísica,
Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP.
1
RESUMEN
En el presente trabajo se ha estudiado la tensión superficial del líquido sinovial de
bovinos a distintas temperaturas, a fin de poder obtener por interpolación gráfica, el
dato correspondiente a la temperatura media de esta especie animal 38,5 ºC. Se
realizaron en total más de cien determinaciones, a temperaturas comprendidas entre
20,0 ºC y 40,0 ºC, a intervalos de 5,0 ºC. El valor encontrado a 38,5 ºC fue de 58,3
dinas. cm−1, notablemente inferior que el correspondiente al agua a la misma
temperatura, 69,8 dinas. cm−1 y menor aún que el correspondiente a una disolución de
cloruro de sodio al 0,6 % que corresponde a la presente en el líquido sinovial. La
concentración de los electrolitos débiles presentes en este fluido biológico, por su valor,
no pareciera ser la responsable de compensar y aún revertir los valores que una
disolución de electrolitos fuertes (semejante a la presente en el líquido sinovial de
bovinos) ejerce la tensión superficial del agua. Creemos razonable suponer que debe
existir una sustancia, presente en el líquido sinovial, que posea un marcado efecto
tensoactivo. Dicha sustancia pudiera ser el ácido hialurónico; en posteriores
investigaciones trataremos de confirmar esta suposición.
SUMMARY
The surface tension of synovial fluid of bovine has investigated in the temperature range
between 20,0 ºC and 40,0 ºC ± 0,1 ºC, at intervals of 5,0 ºC. About hundred experiments
were performed. Plotting the experimental results of the surface tension as a function of
temperature, a linear relationship is seen to be satisfactorily obeyed. The value of γ at
the mean temperature of this specie (38,5 ºC), obtained from graphical interpolation is:
γ=58,3 dynes . cm−1. This value is considerably smaller than that for pure water at the
same temperature and for sodium chloride in aqueous solutions at similar concentration
of that present in synovial liquid. There is, thus decrease in the surface tension of the
water amounting to about 20 %. The concentration of week electrolytes in the synovial
fluid cannot explain this behavior. Because of this fact, we can suggest that γ decrease
owing to the existence of some other substances - like hyaluronic acid-which can
contribute to diminished the surface tension of the solvent. In future experiments we
will try to confirm this assumption.
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91
INTRODUCCIÓN
Una propiedad muy importante que presentan los líquidos, y que los diferencian de los
gases, es la tensión superficial. Considerando a los líquidos como un sistema material
condensado, podemos decir que la tensión superficial en el resultado de las fuerzas de
atracción, no totalmente compensadas(Cramer, 1984), que afecta a las moléculas que
están en la superficie, a diferencia de lo que ocurre con aquellas que se encuentran en el
seno de la masa fluida, donde se puede considerar que el sistema es “simétrico” en lo
que se refiere a las fuerzas actuantes, lo que lleva a una resultante nula y por
consiguiente el movimiento de las distintas partículas presentes solo responde a la
agitación térmica. El presente trabajo se realiza con el objeto de medir el valor de este
parámetro fisicoquímico a distintas temperaturas y obtener por interpolación gráfica el
dato correspondiente a la temperatura media (38,5 ºC) de esta especie animal. Se
realizaron en total 100 determinaciones sobre 25 muestras, a temperaturas
comprendidas entre 20,0 ºC ± 0,1 ºC y 40,0 ºC ± 0,1 ºC a intervalos de 5 ºC.
Obtención de la muestra
El líquido sinovial se obtuvo de la articulación de la babilla (fémoro-tibio-rotuliana) la
cual fue abordada por la parte medial externa, a tres centímetros del borde de la rótula.
En promedio se extrajeron entre cinco y siete cm3 (5 y 7 cm3) por cada animal,
empleándose para tal fin agujas 50/12 y jeringas de veinte cm3 (20cm3). El líquido
obtenido era de aspecto claro y sumamente viscoso, el cual era colocado en tubos de
ensayo con tapa de baquelita a rosca, evitándose en lo posible el contacto con el aire.
Todos los animales estudiados eran clínicamente sanos y la toma de muestra se realizó
inmediatamente después de ser sacrificados. A continuación, todas las muestras fueron
refrigeradas a dieciocho grados centígrados bajo cero (-18,0 ºC), temperatura esta que
fue mantenida durante su transporte. En el laboratorio una vez alcanzada la temperatura
ambiente, se procedió a su filtración a través de papel de filtro Nº 0859 de la casa
Schleicher und Schüll y posterior centrifugación a 4.000 r.p.m. durante media hora.
Determinaciones fisicoquímicas
La tensión superficial del líquido sinovial se determinó mediante el uso de un
tensiómetro de Lecomte Du Noüy, provisto de cámara termostatizada. La constancia
térmica se obtuvo mediante un termostato marca Lauda NB-D 8/17 provisto de bomba
aspirante - impelente y con regulación de caudal. El equipo de medida se calibró con
agua bidestilada, a temperaturas comprendidas entre 15,0 ºC y 40,0 ºC, a intervalos de 5
ºC. Los valores medios obtenidos para el agua se presentan en la tabla 1. Los mismos
concuerdan satisfactoriamente, dentro de los límites del error experimental, con
encontrados en la bibliografía (Handbook of Chemistry and Physics. Ed.The Chemical
Rubber Publishing Co.). En lo que hace referencia al líquido sinovial los datos
obtenidos se encuentran en la tabla 2.
RESULTADOS
Los datos experimentales fueron procesados estadísticamente mediante el sofware
Systat (Wilkinson, 1990). Del análisis de varianza se obtiene diferencias significativas
entre los valores de tensión superficial a las distintas temperaturas de su determinación
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92
para un valor de significación de 0,05. En la tabla 2 se presentan los valores medios
hallados para las distintas temperaturas como así también su desviación standard.
La representación de la tensión superficial, γ, en función de la temperatura muestra una
muy buena correlación lineal entre ambos parámetros (R2 = 0.99), cuya pendiente
negativa vale 0,39. (Figura 1).
El valor de la tensión superficial a la temperatura media de esta especie animal (38,5 ºC)
resultó ser de 58,3 dinas . cm−1, notablemente menor que la del agua a la misma
temperatura que es de 69,8 dinas . cm−1.
DISCUSIÓN
De la curva de tensión superficial en función de la concentración para soluciones
acuosas de cloruro de sodio y cloruro de potasio, a la temperatura de 20 ºC, se
desprende que la tensión superficial correspondiente a la disolución (por más pequeña
que sea la concentración de soluto) es mayor que la del solvente puro a la misma
temperatura, cosa que sucede con la mayor parte de los electrolitos fuertes (Maron y
Prutton, 1968). En nuestro caso, el líquido sinovial se puede considerar, bajo el punto de
vista fisicoquímico, como una disolución compleja de polielectrolitos: cloruro, fosfatos
y bicarbonato de sodio, potasio, calcio y magnesio, por solo citar a las abundantes. Pero
también se debe incluir al estado iónico a las proteínas como aniones proteinatos. Entre
estos aniones de naturaleza compleja, debemos hacer una especial referencia al ácido
hialurónico, un mucopolisacárido, que al pH correspondiente a un líquido fisiológico se
encuentra como hialuronidato (Mellwraith y Trotter, 1996) de sodio, potasio, calcio,
magnesio etc. Nuestros datos experimentales muestran, por interpolación, un valor de la
tensión superficial a 20,0 ºC de 65,4 dinas . cm−1, notablemente menor que la del agua
a la misma temperatura que es de 72,2 dinas . cm−1 y menor aún que el correspondiente
a una solución acuosa de cloruro de sodio al 6‰, concentración similar a la que presenta
en el líquido sinovial.
CONCLUSIONES
Es sabido que los electrolitos débiles disminuyen la tensión superficial del agua, pero la
concentración de los mismos, presentes en el líquido sinovial, no pareciera ser la
responsable de compensar y aún revertir la influencia sobre los valores de la tensión
superficial. Creemos que debe haber presente en este fluido biológico una sustancia de
fuerte acción tensoactiva (sustancia batótona) que quizá pudiera ser el ácido hialorónico.
En posteriores trabajos trataremos de aclarar este tema.
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Cap. 20; pág. 813-814.
Tabla 1. Tensión superficial del agua a distintas temperaturas, a) Obtenido en
laboratorio, b) Datos del handbook of chemistry and physics.
TEMPERATURA
TENSIÓN SUPERFICIAL (dinas . cm−1 )
ºC
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
40,0
a
73,4 ± 0,1 Sx +/- 0,2
72,2 Sx +/- 0,4
71,5 Sx +/- 0,1
71,1 Sx +/- 0,2
70,9 Sx +/- 0,3
70,3 Sx +/- 0,2
b
73,5 ± 0,1
72,8
72,0
71,2
70,6
70,0
Tabla 2. Tensión superficial del líquido sinovial de bovinos a diferentes temperaturas.
TEMPERATURA
PROMEDIO
DESVIACIÓN
ºC
STANDARD
(dinas . cm-1)
20,0
65,3
0,4
25,0
63,4
0,3
30,0
61,5
0,2
35,0
59,6
0,4
40,0
57,6
0,2
ISSN: 1515-1883
94
Figura 1. Gráfico comparativo de la tensión superficial del agua ( ) y el líquido sinovial
de bovinos ( )
Tensión Superficial/Temp.
80
72,2
71,5
71,1
70,9
70,3
Tensión Superf.
70
60
65,3
63,4
61,5
59,6
57,6
50
40
30
20
10
0
20
25
30
35
40
Temp. ºC
ISSN: 1515-1883
95

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