Salus online Vol. 12 Sup. 1

Salus online
Vol. 12 Sup. 1 - Biología Molecular Genotipificación DENV-1 p. 73
ARTICULO
Genotipificación de virus dengue tipo 1 circulantes en el estado Aragua durante el
período 1997 – 2007
Daría Elena Camacho1, Elizabeth Ferrer1, Francisco Rodríguez-Henríquez1, Gloria Sierra1,
Irene Bosch2, Diane Schmidt2, Leticia Franco3, María José Malo4, Tadeusz J. Kochel 3,
Antonio Tenorio4 y Guillermo Comach1
1
Laboratorio Regional de Diagnóstico
e Investigación del Dengue y otras
Enfermedades Virales. Instituto de
Investigaciones Biomédicas de la
Universidad de Carabobo
(LARDIDEV/BIOMED-UC).Facultad de
Ciencias de la Salud. Universidad de
Carabobo (Sede Aragua). Maracay.
Estado Aragua. Venezuela.
2
Center for Infectious Disease and
Vaccine Research, University of
Massachusetts Medical School,
Worcester, Massachusetts, E.U.A
3
U.S. Naval Medical Research Center
Detachment (NMRCD) Lima, Peru
4
Laboratorio de Arbovirus, Centro
Nacional de Microbiología. Instituto de
Salud Carlos III (ISCIII). MajadahondaMadrid, España
Correspondencia: G, Comach.
E-mail: [email protected],
[email protected],
[email protected]
RESUMEN
Desde la emergencia de la fiebre hemorrágica del dengue (FHD) en 1989, Virus Dengue-1 (DENV-1)
ha sido el serotipo prevalente en la mayoría de los brotes epidémicos ocurridos en el estado Aragua,
Venezuela. De igual manera, durante estos brotes epidémicos, el DENV-1 ha sido detectado tanto en
pacientes con fiebre de dengue (FD) como con FHD. En este estudio se genotipificaron 43 cepas de
DENV-1 circulantes en el estado Aragua durante el período 1997 – 2007. El análisis filogenético
determinó que los aislados virales de Aragua se agruparon dentro del genotipo V, junto con otros
virus detectados en Argentina, Brasil, Nicaragua, Guyana Francesa y Puerto Rico. Así mismo, el
análisis sugiere que los DENV-1 de Aragua segregaron en dos clados: uno constituido por virus que
circularon en los años 1997 y 1998 – y quizás antes –, y otro conformado por virus que han circulado
mayoritariamente entre 1998 - 2007 y que reemplazó al otro clado. Ambos clados pueden ser
distinguidos inequívocamente por cuatro substituciones de aminoácidos (aa) en las posiciones E-297,
NS1-146, NS2B-70 y NS4B-17. La secuenciación y el análisis filogenético del segmento unión
Salus online
Vol. 12 Sup. 1 - Biología Molecular Genotipificación DENV-1 p. 74
E/NS1, confirmó la utilidad de este enfoque para la genotipificación del DENV-1. Las manifestaciones
clínicas de los pacientes infectados con los DENV-1, genotipo V, de Aragua, indican que dicho virus
posee el potencial para causar todas las formas clínicas de la enfermedad, e incluso la muerte. El
análisis filogenético de los DENV-1 aislados en el estado Aragua durante 1997 – 2007 fue
determinante para conocer la variabilidad genética y el impacto epidemiológico de los virus
circulantes en los brotes epidémicos ocurridos en dicho período.
Palabras clave: Dengue, DENV-1, genotipos, secuenciación
ABSTRACT
Genotyping of dengue virus type 1 circulating in Aragua during the 1997 – 2007 period
Since the emergence of dengue hemorrhagic fever (DHF) in 1989, DENV-1 has been the prevalent
serotype in the majority of the outbreaks occurred in Aragua state, Venezuela. Likewise, during these
outbreaks, DENV-1 has been isolated from patients with dengue fever (DF) as well as DHF. In this
study, we have genotyped 43 DENV-1 strains which circulated during the 1997 – 2007 period. The
phylogenetic analysis determined that the Aragua viral isolates grouped within genotype V, along with
viruses detected in Argentina, Brazil, Nicaragua, French Guyana and Puerto Rico. Likewise, the
analysis suggests that the Aragua´s DENV-1 segregated in two clades: one composed by virus that
circulated in 1997 and 1998 - and perhaps before - and another which contained virus that have
circulated mainly between 1998 and 2007, and that has replaced the other clade. Both clades can be
distinguished unmistakably by aminoacid (aa) substitutions at positions E-297, NS1-146, NS2B-70
and NS4B-17. The sequencing and phylogenetic analysis of the short E/NS1 junction segment
confirmed the value of this approach for DENV-1 genotyping. The clinical manifestations of the
patients infected with the Aragua´s DENV-1, genotype V, indicated that this genotype has the
potential of producing all clinical forms of dengue, including death. The phylogenetic analysis of
DENV-1 isolated in Aragua state during 1997 - 2007 was determinant to know the genetic variability
and the epidemiological impact of the circulating viruses in the outbreaks which occurred during that
period.
Key words: dengue virus, genotype, sequences
INT RODUCCI ÓN
Las i nf ecci one s caus adas por c ual q ui era de l os serotipos d el v i rus Dengue
(DENV-1, DENV -2, DENV -3 y DENV -4) repres entan
l a e nferme dad
trans mi tid a por mos qui tos a humanos más i mportante en térmi nos de morbi mortal idad (1). Clíni c ame nte,
el dengue puede cursa r de f o rma
as i ntomáti ca , o de forma si n tomáti ca c omo l a Fiebre de Dengue (F D), qu e en
una minoría de cas os progres a a l a forma sev era de Fi eb re Hemorrági c a de
Dengu e/Síndrome de Choq ue por Dengu e (FHD/SCD). El DENV es end émi co
en má s de 100 paíse s, con un re gi s tro d e 50 mi ll on es de i nfec tados cada
año , inc luyendo 500 .000 cas os de FHD/SCD qu e req uieren hos pi tali zac i ón
(2).
En mu chos p aíses de Asi a y Améri ca Lati na, l as epi demi as de FD han s ido
gradu al mente desplazadas p or l a s de FHD/SCD. As í, p or e j empl o, se
obs erva que l uego de la pri me ra epi demi a de F HD/SCD del conti nente
Ame ri cano ocurrida en 1981 en Cuba (3), l a mi s ma se exti ende a Ve nezu el a
a f inal es de 1989 prod uci e ndo más de 6000 ca sos co n 73 fal le ci do s (4).
Desd e 1990 ha sta 1995, se han documenta do más de 26 .000 cas os de
FDH/SCD en l as Amé ri cas y c erca de 5.40 0 e n Ve nezu el a (5)
Du ra nte la
epi demi a de deng ue de Vene zuel a en 1989 - 199 0 se ai s laron l os seroti pos
DENV-1 y DENV-2, si n embargo f ue este ú l ti mo el que s e ai sló con más
f recuenci a en los c aso s de FHD/SCD. Las i nv es ti gac i ones de la v a ri abili d ad
gen éti ca de los DENV ci rc ulan tes en Venezuel a entre 1987 y 199 5 sugi ri eron
que l a emergenci a de l as ep idemias d e FHD/SCD es tu vi eron asoci ada s a l a
Vol. 12 Sup. 1 - Biología Molecular Genotipificación DENV-1 p. 75
Salus online
i ntroducc ión de DENV -2 origi nario del Sud este A si á ti co (gen oti po Asiá ti co),
el cua l de spl a zo gradua l men te al DENV-2 autó ctono (geno ti po Ameri c ano)
que hab ía si do reportado como ca usan te de brotes de FD (6, 7, 8). Si n
embargo, un repo rte pos teri or que incl uye el análi si s de l as s ecu enci as
gen ómi c as de DENV-2 ai slad os entre 199 7 y 2000, prop one la ev ol uci ón i n
si tu a posi bl es v i rus reco mbi nantes (g enoti po mi x to Ameri cano/As iáti co ) (9).
Durante l a epidemia de de ngue oc urrida en Aragu a (Ve nezuel a) en 1998, el
ri es go de padecer FHD/SCD es tuvo si g nifi c ativ ame nte as oci ado a l as
i nf e cci ones c on es te DENV-2 g enoti p o mi xto Ame ri cano /Asi áti c o (10) .
El DENV-1 es i ntroduci do en l as Amé ri cas e n el año 1 977 y de sde e ntonc es
ha s i do s eñal ado c omo re spon sabl e de l a apari ci ón de di sti n tos bro tes
epi démi cos aso ci ados con dif erente s p re senta ci ones cl íni c as (F D y/o
FHD/SCD). Espe cífi ca mente , en el Es tado Aragua, el DENV-1 f ue el sero ti po
dete ctado c on ma yor f recue nci a p or el s iste ma de v i gil an ci a epi demi ol ógi ca
ac tiv a du rante l a epi demi a del año 1998 (Fi g ura 1) (L ARDIDEV, 1 998, da tos
no publ i cad os). Pos teri orme nte, e ntre 19 99 y 20 00 l a ci rc ulac ión de e ste
se ro ti po di s mi nu ye has ta hace rse i nde tectab le durante e l 20 02 y cas i todo
el 200 3, tie mpo durante el c ual ocurre en nu estro país un a gra n epidemia
ca usada p or DENV-3 . Sin embargo, el DENV-1 comi enza a ser d etectado
nuev amente e n e l es tado Aragua en no vi embre del año 2003, pa ra lu ego
i nc remen tar s u ci rcul ació n h asta co nv erti rs e e n e l s eroti po predomi nante a
parti r del año 2005 y, parti c ul arme nte, du ra nte el b ro te epi démi c o más
grand e y la rg o de la hi storia del dengue en Ara gua qu e ocu rri ó entre j ul i o de
200 6 y Mar zo d e 2 008 (Figuras 1 y 2) (LARDIDEV, 2009, dato s no
publ i ca dos)
100%
75%
50%
25%
0%
O D F A J A O D F A J A O D F A J A O D F A J A O D F A J A O D F A J A O D F A J A O D F A J A O D F A J A O D F A J A O D
1997 1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
AÑO
DENV-1
DENV-2
DENV-3
DENV-4
Fi gu ra 1. Sero t i po s de l DENV d et e ct a do s m e di a nt e a i sl a mi ent o vi ra l y/ o R T-PC R)
en el est ad o Arag ua (Ve ne zu e l a): Oct u br e 19 97 – Di ci e m bre 20 07 . F uen t e:
Reg i st ro s d e vi g i l a nci a ep i dem i o l óg i ca proa c t i va de l de ngu e en e l est a d o Aragu a.
La bo ra t ori o Re g i on al d e Di agn ó st i co d e l D en gu e y ot ra s Enf erm ed ad e s Vi ral e s
(LARDI DEV).
Vol. 12 Sup. 1 - Biología Molecular Genotipificación DENV-1 p. 76
Salus online
1400
1200
No. DE CASOS
1000
800
600
400
200
0
E A J O E A J O E A J O E A J O E A J O E A J O E A J O E A J O E A J O E A J O E A J O E A J O
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
AÑO
Fi gu ra 2. Caso s d e de n gu e d et e ct a d o s vi ro l óg i ca me nt e (a i sl a mi ent o vi ra l y/ o R TPCR) y/ o ser ol ó gi c am en t e (MAC -EL I SA) e n el est ad o Aragu a (Vene zu el a ): En er o
19 97 – Di c i em bre 2 00 8 . Fuen t e: R eg i st r o s de vi gi l anc i a ep i de mi ol óg i c a pro a ct i va
de l de ng u e en el e st ad o Ara g ua. L abo r at ori o Reg i on a l de Di ag n ó st i co del De ng u e
y ot ra s Enf e rme da d e s Vi ral e s (L AR DI DEV).
Desd e el punto de v i sta fi l ogené ti co, se ha des cri to que la i dentifi c aci ón de
v a ri antes ge néti c as del DENV es tá a sociada a l a sev eri dad de l a i nfecc i ón
en l os humano s (8 ). En e l c aso del DENV-1, l as pri meras i nv e sti ga cion es
reali zada s p ro pus ieron l a e xi s tenci a de tres a ci nc o v ari ante s genéti cas o
gen oti pos , entre l os c uales están l os que han ci rcul ado en la s Améri cas (6,
11). Se ha reportado l a presencia de c epas de DENV -1 asoc i ada s a cas os
de FD y de FHD (12). Por o tra pa rte , duran te l a epi demi a de de ngue de
Aragua (Ve nezu el a) oc urri da en 1 998 , el ri e sgo de pade cer FD estu v o
si gnifi c ativ a mente a soc iado a las i nfec ci ones cau sada s por el se ro ti po
DENV-1 (10). Si n emb argo, i ndepe ndi enteme nte de su posi bl e asoci aci ón
co n el ri esgo de s uf ri r FD o FHD/SCD, muy poc o se c onoc e so bre l a
div ersid ad gené ti ca de l o s DENV -1 ai sl ado s en Venezuel a . En es te sen ti do,
se re portó la cl asifi c aci ón de los DENV -1 ai s lados entre 199 4 -1995 en cin co
l inaj es genéti c os (13). Desde e ntonces, no s e han real i zado re portes de l os
gen oti pos c i rcul antes del DENV -1 en nues tro p aís a pesar d e la ocurrenc ia
de v arios brotes e pi démi co s en l os cu al es ha si do el serotipo predominante .
En el presen te es tudi o s e pres enta l a geno ti pifi c ació n de l as c epas de
DENV-1 ci rc ul ante s en el estado Arag ua durante el período 1997 - 2007,
bas ados en el anál i si s de l a secuenci a nucl eotídi c a del genoma compl eto y
l a se cuencia pa rc i al de la reg i ón E/NS1 , a f i n de d etermi nar sus rel a ci on es
fi log enéti c as c on otros ai sl ados vi ral es de di c ho s eroti po de Venezuela y del
resto de l mundo. Así mi s mo, se di s cuten l a s posib les aso ci ac ione s d e l os
gen oti pos v i ral es en contrad os con la sev eridad de l o s c uadros c líni c os de
l os paci entes d e los c ual es f ueron aisl ados y/o l a mag ni tud de l brote
epi démi co del año e n estu di o.
Salus online
Vol. 12 Sup. 1 - Biología Molecular Genotipificación DENV-1 p. 77
MATERIALES Y M ÉT ODOS
Aislados virale s. Se ev al ua ro n 43 cepas de DENV-1 a i sl ad as a parti r de
muestras d e suero de pac iente s prov enientes d el estad o Ara gua (Tabl a I y
II). La s mues tra s f ueron colec tada s d urante el p eri odo 1997 -2007 y
co rre spon den a sueros recib idos a trav é s del Si stema de Vi gil a nci a del
es tado en vi ada s al Laboratorio Regi onal de Di ag nosti co e Inv esti g aci ón del
Dengu e y otra s Enf erme dade s Vi ral es (LARDIDEV) para s u confi rmac i ón
Ta bl a 1. Li st a do d e 1 8 DE NV -1 ai sl ad o s e n el est ad o Arag u a dur a nt e e l p erí od o
19 97 – 2 0 07.
Código
Año de
LARDIDEV Aislamiento
No.
Clínica
Acceso
GenBank
LAR2130
1997
FD
a
FJ639735
LAR3204
1998
FD
FJ639740
LAR3910
1998
FD
FJ639741
LAR4199
1999
LAR22849
2004
FDMHe
FJ639794
LAR24424
2004
FD**
FJ639797
LAR25025
2004
FD
FJ639802
LAR26987
2005
FD
FJ639813
b
c,d
FHD /SCD
FJ639743
a
Fiebre de Dengue;
b
LAR27521
2005
FD
FJ639814
LAR27527
2005
FDMH
FJ639815
LAR29598
2006
FD
FJ639818
Fiebre Hemorrágica de
Dengue;
c
Síndrome de Choque por
Dengue;
d
Fallecido;
e
LAR29629
2006
FD
FJ639819
Fiebre de Dengue con
manifestaciones hemorrágicas;
LAR29635
2006
FD
FJ639820
**Trombocitopenia (<100.000
3
plaquetas/mm )
LAR29665
2006
FD
FJ639821
LAR29689
2006
FD
FJ639823]
LAR29821
2006
FD
FJ639824
LAR40246
2007
FD
EU482610
LAR40325
2007
FD
EU482611
Salus online
Vol. 12 Sup. 1 - Biología Molecular Genotipificación DENV-1 p. 78
La cl as ifi cac i ón cl íni c a de l os paci ente s se hi zo s igui e ndo l o s cri te ri os
des cri tos por la Orga ni zac i ón Mundi al de l a Salud (14 ). De l os 43 ai sl ados
vi ra l es de DENV -1, 18 (Ta bl a I) fuero n env i ados al Ins ti tuto Broad
( Ma ssa chus etts, Esta dos Uni dos d e Améri c a) para l a s ecu enci a ci ón del
gen oma v i ral completo, mi entras que 25 v i rus (Tabl a 2) f ueron envi a d os al
Lab oratori o de Arbovi rus , d el Centro Naci o nal de Mi crob i ol og ía, del Ins ti tuto
de Sal ud Carl os III (Maj adah onda , España ), pa ra sec uenci ar el seg men to de
uni ón E/NS 1.
Tabla 2. Listado de 25 DENV-1 aislados en el estado Aragua durante el año 2006 empleadas en el
estudio para la secuenciación de la región E/NS1
Código
Clínica
LARDIDEV
a
29850
FD
29922
FD
30082
FD
30330
FD
30713
FD
31186
FD
31827
FD
32133
FD
32149
FD
32195
FD
32252
FD
32269
FHD
32287
FD
32321
FD
32452
FD
32908
FD
32962
FD
33008
FD
33078
FD
33337
FD
33696
FD
33700
FD
33712
FD
33715
FD
34012
FD
b
a
Fiebre de Dengue
Fiebre Hemorrágica de Dengue
b
Salus online
Vol. 12 Sup. 1 - Biología Molecular Genotipificación DENV-1 p. 79
Aislamiento e Identificac ió n de las c epas virale s: l as c epas de DENV-1 se
ai sl aron i noc uland o l os sue ros d e l os pac ientes en tubos con mo nocapa
co nf luente de l a l ínea c el ul ar C6/3 6-HT (deri v ada de Aedes albopictu s )
para s u pos terior i ncubaci ón a 33°C durante 10 días (1 5). La i dentifi c ació n
del serotipo vi ral se re al i zó medi ante ens ayo s de i nmunof luores cenc ia,
don de se enf re ntaron l as c élul as i nfec tadas c ontra un pa nel de an ti cuerp os
monocl onal e s (Ac Mc ) c ontra DENV. Estos Ac Mc f ue ron HB47 (1 5F3 -1) para
DENV-1, HB46 (3H5) para DENV -2, HB 49 (5D4-11) para DENV -3, y HB48
(1H10-6) para DENV -4 (16) y f u eron p rovi s tos genti l mente por Ce nter f or
Di sea ses Control and Prev enti on (CDC, San J uan Puerto Ri co).
Extracción del ARN viral. El ARN v i ra l s e ex traj o a pa rti r de 140 µL de
ca da uno d e los s obrenadante s de c ul tiv os cel ulares d e DENV -1 empleando
el mini ki t de ex tra cci ón v i ral de ARN QIAamp QIAGEN® ( QIAGEN Inc.;
Valen ci a, Cal iforni a, E.U.A ), sig ui end o la s i n strucci one s d el f ab ri cante. El
produ cto de l a ex tra cci ó n se res uspendi ó en 60 µ L de ag ua y s e al mace nó a
-80°C has ta su u so.
Secue nciación del genoma co mpleto. La s ecuenci aci ó n del g enoma v i ral
co mpl e to de 18 DENV -1 (Tabla I) se real i zó en el Ins ti tuto Broad si guie ndo
un proto col o e stánd ar d i señ ado en di cho i n sti tuto (17 ). Brev e men te, el ARN
vi ra l f ue amplifi ca do me diante l a técni ca de Tra nsc ri p ción Rev ersa a copl ada
a Rea cció n en Cadena de l a Pol ime rasa (RT -PCR) c on c ebado res
es pecífi cos p ara produ ci r 12 ampli cones sol a pado s de 1.5 - 2 kb.
Segui damente, di c hos a mpli cone s se mezc l aron para real i za r l a rea cci ón de
se cuen ci aci ón co n 9 6 pares de ce badores
es pecíf i cos (tabl a c on l a
i nf o rmaci ón de di cho s ceba dores di s poni bl e a p eti ci ó n d el i nteresa do) que
di e ron lugar a la amplif i cación de un número equiv al ente de re gi one s entre
500 a 700 pa res de bases. La reacci ón de sec uen ci aci ón se reali zó en un
equi po ABI 3730 medi ante el método de Sange r de acue rd o a l os p ro tocol os
de s ecuencia ci ón del Insti tuto Broa d. F inal mente, se proc edi ó a ensambl ar
l as s ecue nci a s o bteni das med iante el uso de progra mas de Bioinf ormáti ca
que permi ti eron
consegui r l a s se cuen ci as con sens o las cua les f ueron
dep osi tadas en el GenBan k.
Secue nciación del segme nto unión E/NS1. La secuenci aci ó n del segme nto
uni ón E/NS1 de 25 ai slado s de DENV -1 (Tabl a 2) se real i zó sig ui end o una
ada ptaci ón del protocol o des cri to previ amente (18 ). Brev emente el s egmento
se gmen to u ni ón E/NS1 fue amp lifi ca do a pa rti r del ARN vi r al medi ante l a
téc ni ca RT-PCR. El ampli có n e spec ífi co pa ra DENV -1 (4 20 pb) se vi s uali zó
medi ante gel de ag arosa a l 2%. Segu i damente, el ADNc a se cuen ciar
purifi có utili zando el QIAGEN Mi nEl ute PCR Purifi c ati on Ki t (QIAGEN Inc.;
Valen ci a, Cal ifo rn ia, E.U.A) , si g ui end o l as i ns trucc iones d el f abri c ante.
Lue go, l os ADNc de l a regi ón E/NS1 fue ron s ecuenci a dos y ampl if i cad os
medi ante PCR en un termoci cl ado r PTC-20 0 Peltie r Therma l Cycl e r (MJ
Rese arch In c.; W al tham, Ma ssa chus etts, E.U.A), uti l i zan do el estu che de
Bi gDye ® Termi nator v 3 .1 Cycl e Seq uenc ing Kit (Ap pl ied Bi o sys tems ; F oster
Ci ty, Cal if o rni a, E.U.A). El an ál i si s de lo s produ ctos s ecu enci ados se real i zó
co n el equi p o ABI PRISM® 3700 DNA Anal yzer (Ap pli ed Bio sys tems ; F oster
Ci ty, Cal i fo rni a, E.U.A ). L as secuencia s obte ni das fueron re vi sadas medi ante
el programa de co mputa ci ón (soft ware) CHR OMAS (v ers i ón 1.3, 19 96; C.
Mc Carthy, Scho ol of Bi o mol e cul a r and Bi o medi cal Sci ence, Fac ul ty of
Sci ence and Te chnol ogy, Gri ffi th Univ ers ity, Bri sbane, Queensl and,
Aus tra li a). Se gui da mente, l a s secuencias se nti do y anti -s entid o fu eron
ali n eada s medi ante el programa d e c ompu taci ó n (softwa re ) SEQ MAN
(DNASTAR Inc . Sof twa re, Mad i son, W i sconsi n .) Las s ecue nci a s consen so
Salus online
Vol. 12 Sup. 1 - Biología Molecular Genotipificación DENV-1 p. 80
f ueron comp aradas y al i neadas con l as s ecu enci as obteni das d el GenBa nk
util i zando el programa de computac ión (so f twa re ) CLUSTAL X, v ersió n 1 .83
(19).
Análisis filog enético. Se reali zó uti li zand o el p rograma de c omputaci ón
(sof tware ) MEGA4 (20). El árb ol f il ogenéti co ópti mo f ue g enerad o medi ante
el método de Neig hbor-Jo i ni ng (21 ). La s ignifi canci a esta dísti c a de la
topol ogía parti cul ar de l os árboles se eva luó a trav é s de l a prueba de
boo tstrap (22). La s di s tanci as ev olutiv as fue ro n cal cul adas medi an te el
método d e Tamu ra -Ne i (23).
RESULTADOS\
En el pres ente e stu di o se mues tran l o s res ul tad os de l a se cuen ci aci ón y
gen oti pifi c aci ón de l a s sec uenci as de l os ge nomas co mpl etos de 1 8 DENV -1
ai sl ado s de paci entes prov enie ntes de lo s diferente s muni ci pi o s del estado
Aragua , dura nte l os años 19 97 - 2007 . Asi mi smo, l os resul tados de de l a
se cuen ci aci ón y geno ti pifi c aci ón de 32 8 n ucl eó tidos de l a regi ón de uni ón
E/NS1 de 25 DENV -1 ai sl ados du rante el año 200 6. Las se cuen cias de l os
DENV-1 d e Aragua f ueron ali neada s con l as c orrespondi en tes de otros
ai sl ado s v i ral es d el mu nd o (ge noma c omp l eto y segmento E/NS1) que h an
si do deposi tadas en el Ge nBank . Una v ez al in eadas la s s ecu enci as
resp ectiv as, se proc edi ó a l a reali zaci ó n d e d os árbol e s fi logen éti co s: uno
co n l as se cuen cias de l os genomas compl eto s (Fi gura 3) y otro c on l a s
se cuen ci as de l a re gi ón E/NS1 (Fi gu ra 4)
.
Salus online
Vol. 12 Sup. 1 - Biología Molecular Genotipificación DENV-1 p. 81
100
100
Tailandia/1991(AY732477)
Djibouti/1998(AF298808)
99
Genotipo I
Camboya/2005(FJ639683)
62
Singapur/1990(M87512)
Hawaii/1944(EU848545)
83
Genotipo IV
Nauru/1974(NC 001477)
100
94
Indonesia/1998(AB189121)
Tailandia/1964(AF180817)
Genotipo II
Malasia/1972(EF457905) Genotipo III
100
94
100
100
Aragua-Venezuela/2007(LAR40325/EU482611)
Aragua-Venezuela/2007(LAR40246/EU482610)
Aragua-Venezuela/2005(LAR27527/FJ639815)
Aragua-Venezuela/2005(LAR27521/FJ639814)
Aragua-Venezuela/2006(LAR29665/FJ639821)
100
100
100
Aragua-Venezuela/2006(LAR29629/FJ639819)
Aragua-Venezuela/1999(LAR4199/FJ639743)
Aragua-Venezuela/1998(LAR3204/FJ639740)
Aragua-Venezuela/2004(LAR24424/FJ639797)
Aragua-Venezuela/2004(LAR22849/FJ639794)
100
99
61
84
71
Aragua-Venezuela/2004(LAR25025/FJ639802)
Aragua-Venezuela/2006(LAR29598/FJ639818)
Aragua-Venezuela/2006(LAR29689/FJ639823)
Aragua-Venezuela/2006(LAR29635/FJ639820)
Genotipo V
Aragua-Venezuela/2006(LAR29821/FJ639824)
100
Aragua-Venezuela/2005(LAR26987/FJ639813)
Aragua-Venezuela/1998(LAR3910/FJ639741)
Aragua-Venezuela/1997(LAR2130/FJ639735)
76
Nicaragua/2006(FJ562104)
Brasil/1990(AF226685)
10099
100
Brasil/2001(AF513110)
Argentina/2000(AF514876)
Brasil/1997(AF311958)
100
Guyana Francesa/1989(AF226687)
PtoRico/1986(FJ562106)
62
PtoRico/1998(FJ410173)
D3-Tailandia/1994(AY923865)
0.05 substituciones/sitio
Figura 3. Relaciones evolutivas de treinta y seis DENV-1 aislados en el estado Aragua y algunos
países del mundo, basadas en las secuencias nucleotídicas del genoma completo. El análisis
filogenético se realizó con el programa de computación (software) MEGA4 (20). El árbol filogenético
óptimo fue generado mediante el método de Neighbor-Joining (21). En cada una de las ramas se
indican los porcentajes ≥60 de las réplicas de los árboles mediante el test de bootstrap de 1000
replicas) (22). Las distancias evolutivas fueron calculadas mediante el método de Tamura-Nei (23).
Cada aislado es denominado de acuerdo al área geográfica de procedencia, el año de aislamiento, el
código del LARDIDEV en los aislados virales del estado Aragua, y el número de acceso en el
Genbank en los virus de otros países del mundo.
Vol. 12 Sup. 1 - Biología Molecular Genotipificación DENV-1 p. 82
Salus online
Granada 1977 [AF425618]
LAR32252
LAR29922
LAR30713
LAR34012
LAR32149
LAR29850
LAR33008
LAR32269
LAR30330
LAR33337
LAR33715
LAR32321
LAR32133
Genotipo V
LAR31827
LAR33078
97
LAR32195
LAR33700
LAR32452
LAR31186
LAR32962
LAR32287
100
LAR30082
LAR32908
LAR33696
LAR33712
Nauru Pacífico Occidental 1974 [U88535] Genotipo
Tailandia 1964 [AF180817] Genotipo
Tailandia 1991 [AY732477] Genotipo
Japón [AB074760] Genotipo
IV
II
III
I
DENV-3 [AY090936]
DENV-4 [AF326825]
DENV-2 [U8741]
0.005 substituciones/sitio
Figura 4. Árbol filogenético correspondiente a la secuencia parcial de la región E/NS1 de 25 DENV-1
aislados durante el año 2006. Las condiciones experimentales son las mismas descritas en la figura
3, excepto que La significancia estadística de la topología determinó mediante el test de bootstrap de
500 réplicas.
La Fig ura 3 , c orrespo nde al árbo l f i l ogen éti co de riv ado del ali ne amie nto de
l as s ecuencia s c ompl etas de ai s lado s de DENV -1 en Ara gua (Venezuela)
duran te el peri o do 2004 - 2007 y de aisl ados de o tro s países , do nde se
es tabl ec e l a rel ació n de pa re ntes co entre di ch os ai sl ados v i rales. El árbol
gen erado mues tra l a exi s tenci a de cuatro grupos co rres pondi entes a l os
gen oti pos des cri tos prev ia men te como I, II, IV y V (13 ). As í mi s mo se
obs erva que l os ai sl ados v i ral es de l a s Amé ri c as (Argenti na, Brasil , Guyana
Franc esa , Ni ca ragua, Puerto Ri co y Venezue l a) s e ubi caron en el geno ti po
V. Tamb i én se adv ierte l a di v i si ón en dos l i naje s, o cl ado s, del genotipo V:
el p ri mer cla do co nsti tui do por v i rus ai sl ado s en Puerto Ri co (198 6 y 19 98) y
en Gu yan a Franc esa (1989), y el segundo cl ado c onf ormado por a i sl ados
vi ra l es de Argenti na (2 000), Bras il (1990), Ni c aragua (2 006 ) y Ve nezu ela
(1997 – 2007). L os vi rus v enezol ano s, a s u vez, es tán di strib ui dos e n d os
l inaj es: un l inaj e conf ormad o por al gunas cep as ai sl ada s en 1 997 y 1998 ,
Salus online
Vol. 12 Sup. 1 - Biología Molecular Genotipificación DENV-1 p. 83
que c omparten un ances tro común con el vi ru s ai sl ado en Ni caragua (2 006),
y o tro l i naj e conformado por ce pas a i sl adas en el período 199 8 – 200 7.
Las 18 ce pas v enezo l anas tuv i eron 24 subs ti tuci ones no -c ons ervati v as de
ami noác idos (aa) en l o s genes que codif i can las proteínas PrM, E, NS1,
N2A, NS2B, NS3, NS4A y NS5 (Res ul tados n o mos tra dos). Los dos li naj es
de c epas v enezol an as se di sti ngu en i nequívoc amente por sub sti tuci one s de
aa e n las posi ciones de E-29 7, NS1-146, NS2B -70 y NS4 B -1 7.
La Figura 4 repres enta el árbol fi log enéti co ge nerado a pa rti r del
ali n eami ento de l as sec uenc ias nuc leotídi c a s del f ragme nto E/NS1 de l os
DENV-1 c i rcul an tes en Aragua du rante el año 2006, demostrand o el mi smo
patrón de ge notipifi caci ón ob serva do co n el an áli si s fil ogenéti c o de l as
se cuen ci as del genoma compl eto (Ve r F igura 3).
Desd e el p unto de vi s ta cl íni c o, e n l a tabl a I se ob serva qu e l as DENV -1
mostraron un ampl io es pec tro c l íni co en l os pac i ente s de los c ual es fu eron
ai sl ado s, demostrand o así su c apaci dad d e produci r d esde l as forma s l ev es
de l a enf e rmedad (FD) hasta l as más formas sev eras (FHD/SCD) d e l a
enf e rmedad, i ncl uso l a mue rte (ai sl ado LAR419 9).
DISCUSIÓN
El presen te e studi o mues tra l os resul ta dos de la genotipifi caci ón de cep as
de DENV -1 c i rcul a ntes en el e stado Aragu a entre 1997 y 2007, co n énfas i s
en l os ai slad os detec tados a parti r del año 2006. Des de el punto de vi sta
hi s tóri co, el año 2 006 se destac a c omo el momento que dio i ni c io a l a
epi demi a de deng ue de ma yor ma gni tud y du ra ci ón que se haya regi s trado
en Venezuel a, coi nci di endo a demás c on u n repun te en l a c i rcul a ci ón de
DENV-1 qu e h abía d ej ado de se r dete ctado d urante dos a ños co nsec utiv os
des de Se ptiembre del 2001 has ta su reapari c ión en Novi embre de 2003
(Fi gura s 1 y 2 ).
La introdu cci ón d el s erotipo DENV -1 en l as Améri ca s ocurri ó a trav és de
Ja mai c a, p rov en iente pos iblemente del c onti ne nte af ri cano (Ni g eri a ) o
as i áti co (Sri Lanka ), donde se i ni ci ó una pand emi a qu e s e exten di ó
prác ti camente a to das la s i sl a s del Cari be (5, 24, 25). En Améri ca del Sur y
Central , la e pi demi a comenzó en 1978 afe ctand o a Venezuela, Col ombi a,
Gu yan a, Suri nam y Gu ayan a France sa, Hondu ra s, El Salv ador, Gu atemal a y
Beli c e; l uego se p ropagó haci a el norte l legando has ta Méj i co (1 978) y e l sur
del e stado de Tex as en l o s E.U.A. (1980) (5, 24). El predomi ni o del se ro ti po
DENV-1 en l a etiolo gía de la epi demi a de dengue ocurri da en Vene zue l a en
197 8, f ue de mos trado po r W al der y Suárez (2 6).
Son mu y esc asos l os estu di os s obre l a div e rs idad g enéti c a y/o
gen oti pifi c aci ón d e DENV -1 que in cluyen ai sl ados ve nezol anos (6, 12, 13,
27). Con a lguna s dife re nci a s resp ecto a la nome ncl atura de clas ifi caci ón, l os
ai sl ado s vene zola nos han s ido ti pif i cados p or a l gunos i nv es ti gad ores como
gen oti po I (6 ) y por otros co mo geno ti po V (13) y geno tipo Améri c a-Áf ri ca
(AMAF ) (2 7). En e l pres ente estu di o, el análi si s d e la s s ecuenci as
nuc leotíd i cas de l o s DENV -1 ai sl ados e n Aragua durante e l períod o de
es tudi o menci onado p ermi ti ó cl asifi carl o d entro del g enoti p o V (13 ) (Fi gu ras
3 y 4).
El hall a zgo más relev ante del presente es tudi o f ue el a grupamiento de l os
DENV-1 a i sl a dos a ra güeños en dos li n aj es (cl ad os) que i ncl u yen c epa s
Salus online
Vol. 12 Sup. 1 - Biología Molecular Genotipificación DENV-1 p. 84
ai sl ada s en períodos de tie mpo diferente s (Fi gura 3). Esto sugi ere que
proba bl emente ocurri ó un reempl azo del l inaj e de los ai slad os vi ral es
ci rc ul an te s en 1997 y 1998 po r el l i naje que a grupa todo s l os v i rus
ci rc ul an te s en tre 200 4 y 2007, además de al gunos obte ni dos en 1998 y
199 9. Las su bsti tu ci on es no -c onse rv ativ a s de ami noáci dos (aa ) en l as
pos i ci ones de E -29 7, NS1-146, NS2 B-70 y NS4 B -1 7 su gi eren que amb os
l inaj es s on lo s uf i ci e ntemente di s ti ntas como para i nf eri r q ue hu b o un
reempl azo d el cl ado (19 97 – 1998) por o tro (998 – 2007). Prev i ame nte se
reportó un ev ento si mil ar en Tail andi a do nde un cl a do de DENV -1 (1 980 –
199 4), c ons ti tuido po r tod as las c epas detectadas en 19 80 y l a mayoría de
l as enc ontrad as en 1994, fu e ree mpl azado por o tro (1990 – 2000)
co nf orma do por un a mi noría de l as cepa s obteni das en l os comienzos de
199 0 y toda s l as ci rcul antes entre 1995 y 2000 (28). El re empl azo d e li naj es
tambi én ha sid o reportad o para l o s se ro tipos DENV -3 (28) y DENV -4 (29).
Por otro l ado,
l a p osi bi li dad de que el núme ro de ai slad os vi ral es
co l ecta dos en el p eríodo 1997 – 1999 no haya s i do sufi c iente co mo para
co nclu i r i n equív oca mente q ue se p ro duj o el ree mpla zo de cl ado s, pl an tea la
nec esi dad de rea li zar l a s ecue nci a ci ón y el anál i si s fi l ogené ti co del genoma
co mpl e to de un mayor núme ro d e a i sl ados v i ral es de di c ho período 1 997 –
199 9 para co rro borar/recha zar l a hip ótesi s de reempl azo de cl ados . En e ste
se ntido ya s e env iaron a sec uenci ar el geno ma co mpl e to de DENV -1
ai sl ado s en lo s año s 199 7 (cuatro) y 1998 (tres ), y sol o esta mos a la es pera
de l as s ecue nci a s resp ectiv as para reali zar el an áli s i s fil o genéti co
co rre spon di ente .
Otro hal l azgo de i nterés fue l a ubi c aci ón fi logenéti c a del ai sl ado d e DENV -1
Si nga pur/1990 de o rigen a si áti co, el cual ha si do c lasi fi cado dentro del
gen oti po V (13), IV (30) o A MAF (27), b a sado s en el a náli si s del gen E. En
el pre sente e studi o, el análi si s fil ogenético del gen oma c ompl eto del ai sl ado
vi ra l Si ngapur/19 90 demostró su paren tesc o c on l os vi ru s agrupad os en el
gen oti po I (V er f igu ra 3).
Estud i os previ o s h an rep ortado este DENV -1
Si nga pur/1990 c omo un vi rus recombin ante (2 7, 30, 31). Tal c omo se ha
se ñal ado en o tra s inv es ti gaci ones donde se ha rep ortado rec ombi naci ón
géni ca den tro d e u n mi smo seroti po vi ral (por ej emplo, l a ce pa venezol a na
DENV-2 Mara4), l a ubi caci ón fi log enéti c a v a a de pende r de l a exi s tenc ia de
se cuen ci as nucl eotídi cas recombi nantes en l a regi ón genómi c a an al i zada
(9). En con sec uenc ia, es razonabl e i nfe ri r qu e haya ocu rr i d o algo s i mi lar en
es te aná li si s fil oge néti c o, co rrob orándose un a v e z más no sola men te el
ca rá cter recombina nte de l a cepa DENV-1 Sing apur/1990 , si no tambi én l a
i mportanci a que ti ene la s elec ción del gen, o seg mento géni c o, a se cuen ciar
para efec tos d e l a cla sifi c aci ón gen otípi c a de cual qui e r ai sl ado vi ral que
preten da es tudi ars e.
Adi ci onal mente , en al prese nte es tudio se rea li zó l a secuen ci aci ón y el
anál i si s fi lo genéti co del f rag mento del geno ma vi ral corresp ondie nte a la
regi ón de uni ón E/NS1 de 25 a i sl ado s d e DENV -1 de tectados en Ara gua
duran te al año 20 06. Es de rec al ca r qu e l os pri meros es tudi o s fil oge néti c os
de DENV -1 se reali za ro n hac iendo uso d e este f ra gmento (6, 11) pe rmi ti endo
l a cl asi f i cac i ón de DENV -1 en tre s a ci nco g enotip os, o g ru pos mon ofil éti c os,
que i ncl uían l as cepa s ci rcul antes en l a regi ó n de las Améri cas. En el
pres ente es tudi o, el a náli s i s fi lo genéti co de la s sec uenc ias nu cl eo tídi ca s de
l a regi ón unión E/NS1 pe rmi ti ó l a clas if i ca ción de las cepas a ra güeñas
den tro del genoti po V, correspo ndi en do as í c on el res ul tad o
obten ido
medi ante el análi si s de l a s se cuen ci as compl eta s del genoma. Hall azgos
Salus online
Vol. 12 Sup. 1 - Biología Molecular Genotipificación DENV-1 p. 85
si mil are s han s i do re portado s p or otros auto re s ( 18 , 27, 32) qui enes han
empl ead o esta región del genoma como una herrami enta que ha pe rm i ti do
l a rápi da cl asifi c aci ón d e lo s DENV en di s ti ntos ge notipo s o su bti pos . De
es te modo, se ref uerza l a v igen ci a y uti li da d de es ta e strateg ia s encil la,
se nsib le, e spec ífi ca y rápi da para la gen otipifi c aci ón para DENV (18, 27),
parti c ul armente en el ma rco d e l o s si stemas de v igil ancia epi demi ol ógi ca
para defi ni r fu entes de e pi demi as e i dentifi ca r de manera preci sa l a
ci rc ul aci ón temprana de gen oti pos emergentes .
Se re portó previ amente (13) que l as cep as v ene zol a nas de DENV -1
agrup adas en el genoti po V te nían la capacid ad de produ ci r FD y FH D , si n
embargo n o pudo demo strarse l a seg re gaci ón de l as mi sma s de a cuerdo a la
se veri dad de l a enfermed ad. A pesar de ell o , l os inv esti gadores con cl uyeron
que el gen oti po V de DENV -1 posee el pote nci al pa ra causa r l as formas
se veras de l a enf ermedad. En el c aso de l os ai sl ados d e DENV -1 de Arag ua
ci rc ul an te s entre 1997 y 2007, se obs erv ó que i gual mente son capaces de
ca usar todo el es pec tro cl íni c o de la enfermedad , i n cl uyendo l a muerte por
SCD (Ta bl a I, c ódigo LAR4199). No s e pued e i gnorar, si n e mbarg o, l a
ca paci dad que tiene este se roti po de estar asoci ado a las al tas tasas de
morbi li da d oc urri das en l a ma yoría de l as gran des epide mias de l estado
Aragua .
Los resul tados de esta i nv e sti ga ci ón e nf ati zan l a i mportan c ia d e l os e studi os
fi log enéti c os del DENV para determi na r l a div ersi dad genéti ca ta nto
geo gráfi ca como te mporal de l os s erotipo s ci rcul antes – en este estu di o
parti c ul ar el DENV -1 – y l a posi bl e as ocia ci ón entre la emergen ci a de cl ados
den tro de u n g enoti p o parti cul a r con l a magn i tud de los brote s epidé mi cos
en té rmi nos de morbili d ad y/o sev eri dad de l os cas os.
Agrad eci mi en to s. Lo s da t os g e nó m i co s f ue ron ge ne ra do s po r e l Ce nt ro d e
Sec ue nc i ac i ón Ge n óm i c a para Enf erm ed a de s I nf ecc i os as del I n st i t u t o Broa d,
au sp i ci a do por el Ins t i t ut o Na ci ona l de Al ergi a s y Enf e rme d ad es I nf ec ci o sa s
(Nat i o na l I ns t i t ut e of Al l erg y a nd Inf ec t i o u s Di sea se [ N IA ID] ), c om o p art e d el
pro ye ct o del ge n om a d e ng u e del C ons orc i o De n gu e de Rec urso s d e Ge n om a
(Gen om e Reso urc es i n De n g ue C on so rt i u m (GRID) den gu e g en om e Proj e ct )
(ht t p : / / www. bro ad. m i t . e du/ a n no t at i o n/ v i ral / De ng ue/ H o me . ht m l );
a gra d ece m os
al
GR ID po r l a rá p i da ces i ón d e l os d at o s g e nó mi c os . Lo s au t ore s t am bi én a gra d ec e n
al L abo rat o ri o de Arb o vi ru s, Cen t ro Nac i ona l de Mi c ro bi o l og í a, I ns t i t ut o d e Sal ud
Carl o s I I I, e n Ma j a d ah o nd a, Ma dri d , Esp a ña , p o r su i nv al u a bl e co nt ri bu ci ó n
c ons i st e nt e en l a re al i zac i ón de l a s s ec uen c i a s c om pl et as y parc i al es d e l o s vi ru s
an al i za d os e n es t e es t u di o. Igu a l m ent e , n u e st ro ag rad e ci mi e nt o a l a Co rpora ci ó n
de Sal u d de l Es t ado Ara gu a (C ORP OSAL UD ARAGUA), y e n es pe ci a l a l a s
Di rec ci one s d e Sa l ud y E p i de mi ol o gí a, p o r s u c on t ri buc i ón e n l a c ap t ac i ón y
di agn ós t i co , a t rav és de l p ro gr am a vi gi l a nc i a e pi d em i ol ó gi c a del de n gu e, d e l a
m ay orí a d e l os pa ci e nt es d e l os c ua l es de a i sl aron l os DE NV -1 repo rt a do s e n es t e
es t ud i o. Asi mi s m o, a grad ec em os al Cen t ro de Inv es t i ga ci o nes d e E nf erm ed ade s
Tro pi c al es de l a Mari n a d e Es t a do s U n i d os ( Nav al Med i ca l Res e arc h C e nt er
Det a ch me nt [ N MRCD] ), en Li m a, Pe rú, p o r su co nt ri bu ci ó n c o ns i s t ent e e n el
f i n anc i am i e nt o y di señ o d e l o s pro y e ct os de i nv es t i ga ci ó n a t ra v é s d e l o s c u al e s s e
c apt a ron y d i ag n os t i c aron a l gu nos de l o s pa ci ent e s de l os c ua l es de ai sl a ron l o s
DENV-1 r e port a dos en e st e e st u di o. F i na l me nt e , n u es t ro e t er no a gra d ec i mi ent o al
pe rso n al de Sa l u d de CO RPOSAL UD A RA GUA p o r su d esi nt ere s ad a y an ó ni m a
c ol ab ora ci ó n.
Financiamiento. El financiamiento para la realización de este estudio provino de: a) fondos
Federales del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (National Institute of Allergy
and Infectious Disease), Institutos Nacionales de Salud (National Institutes of Health), Departamento
de Salud y Servicios Humanos (Department of Health and Human Services) de los E.U.A., bajo el
contrato No. HHSN266200400001C; y b) la Unidad de Trabajo No. 800000.82000.25GB.B0016, del
Salus online
Vol. 12 Sup. 1 - Biología Molecular Genotipificación DENV-1 p. 86
Centro de Investigaciones de Enfermedades Tropicales de la Marina de Estados Unidos (NMRCD),
de Lima, Perú.
Exención de responsabilidades. Los puntos de vista expresados en este manuscrito son
únicamente de sus autores y no necesariamente representan la opinión la política oficial o la posición
del Departamento de la Marina, Departamento de Defensa, o gobierno de los E.U.A.
Declaración de derechos de autor. Copyright Statement. El autor Tadeusz J. Kochel, es un militar
en servicio activo del gobierno de los E.U.A. Este trabajo fue preparado como parte de sus deberes
oficiales. El Título 17 U.S.C. § 105 provee que no está disponible la protección del derecho de autor
para ningún trabajo del gobierno de los E.U.A. El Título 17 U.S.C. § 105 define como trabajo del
gobierno de los E.U.A como aquel realizado por militares en servicio activo o empleados del gobierno
de E.U.A como parte de sus deberes oficiales.
BIBLIOGRAFÍA
1.
Gubler DJ. Dengue and dengue hemorrhagic fever. Clin Microbiol Rev 1998; 11(3): 480-496.
2.
World Health Organization. Dengue haemorrhagic fever: diagnosis, treatment, prevention and
control. 2nd ed. Geneva (Switzerland): World Health Organization; c1997.Chapter 1, General
considerations; p. 1-4.
3.
Kourí GP, Guzmán MG, Bravo JR, Triana C. Dengue haemorrhagic fever/ dengue shock
syndrome: lessons from the Cuban epidemic. 1981. Bull World Health Organ 1989; 87: 375380.
4.
Organización Panamericana de la Salud. El Dengue en las Américas. 1980-1987. Boletin
Epidemiológico 1989; 20: 1-16.
5.
Pinheiro FP, Corber SJ. Global situation of dengue and dengue haemorrhagic fever, and its
emergence in the Americas. World Health Stat Q. 1997; 50(3-4): 161-169.
6.
Rico-Hesse R. Molecular evolution and distribution of dengue viruses type 1 and 2 in nature.
Virology 1990; 174(2): 479-493.
7.
Rico-Hesse R, Harrison LM, Salas RA, Tovar D, Nisalak A, Ramos C, Boshell J, de Mesa MT,
Nogueira RM, da Rosa AT. Origins of dengue type 2 viruses associated with increased
pathogenicity in the Americas. Virology 1997; 230(2): 244-251.
8.
Leitmeyer KC, Vaughn DW, Watts DM, Salas R, Villalobos I, Ramos C, Rico-Hesse R. Dengue
virus structural differences that correlate with pathogenesis. J Virol 1999; 73(6): 4738-4747.
9.
Uzcátegui NY, Camacho D, Comach G, Cuello de Uzcategui R, Holmes EC, Gould EA.
Molecular epidemiology of dengue type 2 virus in Venezuela: evidence for in situ virus evolution
and recombination. J Gen Virol 2001; 82: 2945-2953.
10.
Camacho DE, Alvarez M, Soler M, de Quintana M, Chiarello A, Sierra G, Rodríguez F, Comach
G. Diagnóstico de laboratorio de infecciones por el virus dengue en el Estado Aragua;
Venezuela: Octubre 1997-Diciembre 1998. Inv Clin 2003; 44 (2): 91-103.
11.
Chunge E, Cassar O, Drouet MT, Guzman MG, Laille M, Rosen L, Dubel V.
epidemiology of dengue-1 y dengue-4 viruses. J Gen Virol 1995; 76: 1877-1884.
12.
Salas RA, Tovar D, Barreto A, de Miller E, Leitmeyer K, Rico-Hesse R. Serotipos y genotipos
de virus dengue circulantes en Venezuela, 1990 – 1997. Acta Cient Venez 1998; 49(Sup. 1):
33-37.
13.
Goncalvez A, Escalante A, Pujol F, Ludert J, Tovar D, Salas R, Liprandi F. Diversity and
evolution of the envelope gene of Dengue virus type 1. Virology. 2002; 303: 110-119.
14.
Organización Panamericana de la Salud. Dengue y Dengue hemorrágico en las Américas:
guías para la prevención y el control. OPS. Washington DC; Publicación Científica. 1995; 548.
15.
Gubler D, Kuno G, Sather G, Vélez M, Oliver A. Mosquito cell cultures and specific monoclonal
antibodies in surveillance for dengue viruses. Am J Trop Med Hyg 1984; 33: 158-165.
16.
Henchal EA, Gentry MK, McCown JM, Brandt WE. Dengue virus-specific and flavivirus group
determinants identified with monoclonal antibodies by indirect immunofluorescence. Am J of
Trop Med and Hyg 1982; 31: 830-836.
Molecular
Salus online
Vol. 12 Sup. 1 - Biología Molecular Genotipificación DENV-1 p. 87
17.
Broad Institute (2009) [en línea]. Dengue Virus Database: Sequencing & Assembly. Disponible
en: http://www.broad.mit.edu/annotation/viral/Dengue/SequencingAssembly.html. [Consulta:
2009, Abril]
18.
Domingo C, Palacios G, Niedrig M, Cabrerizo M, Jabado O, Reyes N, Lipkin I, Tenorio A. A
New Tool for the Diagnosis and Molecular Surveillance of Dengue Infections in Clinical
Samples. Dengue Bull 2004; 28.
19.
Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG. The CLUSTAL_X windows interface:
flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids
Res. 1997; 25(24): 4876-4882.
20.
Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis
(MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 2007; 24: 1596-1599.
21.
Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic
trees. Molecular Biology and Evolution 1987; 4: 406-425.
22.
Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution
1987; 39: 783-791.
23.
Tamura K, Nei M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of
mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Molecular Biology and Evolution 1993; 10:
512-526.
24.
Pinheiro FP. Dengue in the Americas. 1980-1987. Epidemiol Bull 1989; 10(1):1-8.
25.
Repik PM, Dalrymple JM, Brandt WE, McCown JM, Russell PK. RNA fingerprinting as a method
for distinguishing dengue 1 virus strains. Am J Trop Med Hyg 1983; 32(3): 577-589.
26.
Walder R, Suarez OM. Epidemia de dengue, 1978. Boletín Informativo sobre dengue, la fiebre
amarilla y el Aedes aegypti en las Américas 1979; VIII (1): 13-14.
27.
Domingo C, Palacios G, Jabado O, Reyes N, Niedrig M, Gascón J, Cabrerizo M, Lipkin WI,
Tenorio A. Use of a short fragment of the C-terminal E gene for detection and characterization
of two new lineages of Dengue virus 1 in India. J Clin Microbiol 2006; 44(4): 1519-1529.
28.
Zhang C, Mammen P, Mammen Jr, Chinnawirotpisan P, Klungthong C, Rodpradit P,
Monkongde P, Nimmannitya S, Kalayanarooj S, Holmes E. Clade Replacements in dengue
virus serotypes 1 and 3 are associated with changing serotype prevalence. J Virol 2005; 79(24):
15123-15130.
29.
Bennett SN, Holmes EC, Chirivella M, Rodriguez DM, Beltran M, Vorndam V, Gubler DJ,
McMillan, WO. Selection-driven evolution of emergent dengue virus. Mol Biol Evol 2003; 20:
1650–1658.
30.
Laille M, Roche C. Comparison of dengue virus envelope glycoprotein gene sequences from
French Polynesia. Am J Trop Med Hyg 2004; 71(4): 478-484.
31.
Tolou H, Couissinier-Paris P, Durand J, Mercier V, de Pina J, de Micco P, Billoir F, Charrel R,
de Lamballerie X. Evidence for recombination in natural populations of dengue virus type 1
based on the analysis of complete genoma sequences. J. Gen Virol 2001; 82: 1283-1290.
32.
Zaki A, Perera D, Shan Jahan S, Cardosa M. Phylogeny of dengue viruses circulating in
Jeddah, Saudi Arabia: 1994 to 2006. Trop Med Int Health 2008; 13(4): 584-592.