Perfil Forense STRs

Protocolos y métodos
Laboratorio de Genómica Viral y Humana
Facultad de Medicina UASLP
Autentificación/Filiación por STRs
Creado: 28 de Mayo del 2010
Ultima modificación: 02 de Junio del 2009
Autentificación y filiación por microsatelites Short Tandem Repeats (STRs)
Este protocolo describe el procedimiento de autentificación de líneas celulares y/o filiación molecular por microsatelites de
muestras humanas. El protocolo amplifica 16 loci diferentes (HUMTH01, D18S51, D13S317, TPOX, D3S1358, D21S11,
CSF1PO, vWA, FES, D10S1248, FGA, D16S539, D7S820, F13A1, D14S1434, F13B) en siete reacciones de PCR multiplex.
Esta técnica puede ser empleada para validar la autenticidad de líneas celulares humanas al igual que para establecer
parentezcos biológicos entre seres humanos (genealogia, identificación de cadáveres y pruebas de paternidad).
Sets de oligonucleótidos:
Nombre
TH01-F
TH01-R
TPOX -F
TPOX-R
CSF1P0-F
CSF1P0-R
VWA-F
VWA-R
FES/FPS-F
FES/FPS-R
D3S1358-F
D3S1358-R
D13S317-F
D13S317-R
D10S1248-F
D10S1248-R
D16S539-F
D16S539-R
D7S820-F
D7S820-R
D18S51-F
D18S51-R
D14S1434-F
D14S1434-R
F13A1 -F
F13A1 -R
D21S11-F
D21S11-R
FGA-F
FGA-R
F13B-F
F13B-R
Secuencia
ATTCAAAGGGTATCTGGGCTCTGG
ACTGGCACAGAACAGGCACTTAGG
GGAGGAACTGGGAACCACACAGGT
AACCTGAGTCTGCCAAGGACTAGC
Set 1
2p25.3; intron 10 of human thyroid
peroxidase gene
Set 1
TTCCACACACCACTGGCCATCTTC
CCCTAGTGGATGATAAGAATAATCAGTATG
GGACAGATGATAAATACATAGGATGGATGG
GGGATTTCCCTATGGATTGG
ACTGCAGTCCAATCTGGGT
ATGAAATCAACAGAGGCTTG
ACAGAAGTATGGGATGTGGA
GCCCAAAAAGACAGACAGAA
TTAATGAATTGAACAAATGAGTGAG
GCAACTCTGGTTGTATTGTCTTCAT
GATCCCAAGCTCTTCCTCTT
ACGTTTGTGTGTGCATCTGT
TGTCATAGTTTAGAACGAACTAACG
CTGAGGTATCAAAAACTCAGAGG
CAAACCCGACTACCAGCAAC
AGCCATGTTCATGCCACTG
TGTAATAACTCTACGACTGTCTGTCTG
GAATAGGAGGTGGATGGATGG
GAGGTTGCACTCGAGCCTTTGCAA
TTCCTGAATCATCCCAGAGCCACA
ATATGTGAGTCAATTCCCCAAG
TGTATTAGTCAATGTTCTCCAG
GCCCCATAGGTTTTGAACTCA
TGATTTGTCTGTAATTGCCAGC
TGAGGTGGTGTACTACCATA
GATCATGCCATTGCACTCTA
–
Set 1’
Set 1
GCGAAAGAATGAGACTACAT
Laboratorio de Genómica Viral y Humana
Set 1
Location
11p15.5; intron 1 of human tyrosine
hydroxylase gene
STRBase
GTGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT
5q33.1; human c-fms proto-oncogene
for CSF-1 receptor gene, 6th intron
12p13.31; von Willebrand Factor, 40th
intron
15q25-qter; human c-fes/fps protooncogene
Set 1
3p21.31
Set 2
13q31.1
Set 2
10q26.3
Set 2
16q24.1
Set 3
7q21.11
Set 1
18q21.33
Set 2
14q32.13
Set 2
6p24-p25
Set 2
21q21.1
Set 1
Set 1
Facultad de Medicina
4q28; located in the third intron of the
human alpha fibrinogen gene
1q31-q32.1; human blood
coagulation factor XIII b subunit gene
–
Universidad Autónoma de San Luis Potosí
Origin
FBI Core
Loci
FBI Core
Loci
FBI Core
Loci
FBI Core
Loci
FBI Core
Loci
FBI Core
Loci
European
loci
FBI Core
Loci
FBI Core
Loci
FBI Core
Loci
FBI Core
Loci
FBI Core
Loci
Protocolos y métodos
Laboratorio de Genómica Viral y Humana
Facultad de Medicina UASLP
Autentificación/Filiación por STRs
Creado: 28 de Mayo del 2010
Ultima modificación: 02 de Junio del 2009
Procedimiento de preparación de PCR’s individuales:
1.- Prepare el WBT (Water-Buffer-Taq) Mix de acuerdo al número de muestras por procesar según la
siguiente tabla:
dH20
10x Buffer
Taq
1x
66.3
8.5
1.7
2x
139.23
17.85
3.57
3x
205.53
26.35
5.27
4x
271.83
34.85
6.97
2.- Dispense una alícuota de 76.5 µL de WBT Mix a un microtubo de 0.2 mL previamente etiquetado con
el identificador único de cada una de las muestras por procesar.
3.- Agregue a cada uno de estos tubos 8.5 µL de la solución de DNA a 100 ng/µL correspondiente a cada
una de las muestras por procesar.
4.- Etiquete dos tiras de 8 tubos de PCR (16 tubos en total) con los números 1 al 16 para cada una de las
muestras que se procesarán. Utilice diferentes colores para cada par de tiras o anote el identificador único
de cada muestra en el primer tubo de cada tira.
5.- Agregue a cada uno de los 16 tubos de PCR 7.5 µL del mix de oligonucleótidos correspondiente
(donde el tubo #1 contiene el mix de F13B, el tubo #8 el de F13A1 y el #16 el de HUMTHO1).
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–
Facultad de Medicina
–
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Ultima modificación: 02 de Junio del 2009
Componentes de PCR:
Reactivos
Concentración
final
1x
Para dos
personas
dH2O
Buffer
MgCl2
dNTPs
Oligos
Taq
DNA 100 ng/µL
Volumen final
1x
0.5 mM
0.08 mM
0.5 µM
0.04 IU/µL
25-50 ng
9.425
1.25 µL
0.125 µL
0.1 µL
1 µL
0.1 µL
0.5 µL
12.5 µL
Para tres
personas
Para cuatro
personas
Condiciones:
STRs
Temperatura (°C)
Tiempo
Ciclos
95º
5’
1
95º
30”
62º
50”
33
72º
30”
72º
35’
1
5º
5’
1
RT
∞
1
Condiciones de electroforesis en gel de agarosa.
•
Preparar gel de agarosa al 3%.
•
Mezclar 5 µl de producto de PCR y mezclarlos con 3 ml de buffer de carga naranja G.
•
Cargar en cada pozo 8 µl de la mezcla con marcador de peso molecular a cada lado de la tira.
•
Correr a 120 mV por 90 minutos.
Preparación del casette portageles del ALFexpress.
•
Limpiar los termoplatos perfectamente empleando una esponja con extrán diluido, enjuagando con abundante agua de
la llave seguida de enjuagues con agua destilada. Finalmente seque a la perfección los termoplatos etanol al 70%.
•
Coloque los espaciadores en su posición con mucho cuidado.
•
Empleando una gasa pequeña empapada en bind silane, aplique una capa que cubra los primeros cuatro centímetros
superiores de la cara interna de ambos termoplatos (aquella que entrará en contacto con el peine).
•
Coloque los clips de los termoplatos cuidadosamente y de manera balanceada (tres a cada lado, uno superior, uno
medio y otro inferior).
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Preparación de geles de poliacrilamida (PAGE).
•
Coloque 30 g de urea en un vaso de precipitados de 100 ml y añada 25.2 mL de agua grado 1. Agite a 40ºC hasta que
se disuelva por completo (entre 15 y 30 minutos).
•
Calibre una micropipeta P100 para dispensar 28 µL y envaine una punta.
•
Recolecte TEMED, 7 mL de TBE 10X, la acrilamida y descongele un microtubo con Persulfato de Amonio al 10%
del congelador -20ºC.
•
Una vez disuelta completamente la urea agregue con una pipeta serológica los siguientes componentes en el orden
indicado:
o
6 ml de acrilamida (marca y # catálogo)
o
6 ml de TBE 10X
o
28 µl TEMED (marca y # catálogo)
o
700 µl Persulfato de Amonio al 10% (10% APS)
•
Con una jeringa de 60 ml sin aguja mezcle sin generar burbujas pero rápidamente la mezcla anterior. Posteriormente
llene la jeringa completamente con la mezcla y vierta lentamente pero de manera constante la mezcla en el borde
inferior del casette del gel PAGE (entre ambos paños del termoplato). Golpeté ligeramente con el dedo el termoplato
trasero (cuya superficie apunta hacia arriba al momento de verter el gel) para homogeneizar el vertido y evitar la
formación de burbujas de aire. EVITE LA FORMACION DE BURBUJAS DE AIRE EN EL TRAYECTO DEL
LASER! Las burbujas de aire que obstruyan por completo el trayecto del laser (indicado por dos lineas negras
horizontales marcadas en el termoplato delantero) anularán por completo la corrida.
•
Si se genera una burbuja de aire en el tercio inferior del casette puede proceder rápidamente a terminar de verter el gel
para intentar remover la burbuja formada con una herramienta de plástico delgado cortada en forma de gancho
(extractor de burbujas). Este dispositivo deberá ser creado ANTES de necesitarlo ya que la rápida polimerización del
gel evitaría improvisarlo en el momento.
•
Continue vertiendo el gel hasta que éste alcance al peine que formará los pozos. Una vez se haya alcanzado el peine,
agregue un poco más de acrilamida (entre 1 y 2 mL) y entonces vierta la acrilamida restante al vazo de precipitados
para servir como control de polimerización.
•
Coloque tres o cuatro broches de papeles con sus laminillas plásticas auxiliares para apretar a ambos termoplatos
contra el peine y formar los pozos.
•
Permita que el gel polimerice durante 40 minutos.
•
Transcurrido el tiempo de polimerización, colocar el termoplato en el equipo Alf express y retire el peine
cuidadosamente procurando no romper los pozos así formados.
•
Prepare 2000 mL de buffer TBE 1X y viertalo en las cámaras de buffer del casette portageles hasta la marca indicada.
¡PRECAUCION! - NO ADICIONE BROMURO DE ETIDIO AL BUFFER DE TBE!
•
Lave los pozos del gel para retirar gel redundante y urea sobrante con buffer TBE 1X empleando una jeringa de 60 mL
acomplada a una punta de P10.
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Condiciones de electroforesis en poliacrilamida:
•
•
PRECORRIDA:
o
Encender computadora.
o
Encender equipo
o
Entrar al programa Alf win.
o
Elegir instrumento 1.
o
File/Open casebook/STRs
o
Start. Dejar correr por 30 minutos.
CORRIDA:
o
Voltaje: 1500 V
o
Potencia: 30 W
o
Láser: ∼600
o
Temperatura: 50°C
o
Tiempo de corrida: 150 minutos
o
Volumen de muestra: 2 ml
Desnaturalización de productos de PCR:
•
El volumen restante (después de la carga en gel de agarosa) de los productos de PCR (7.5 ml) se mezclan con un
volumen igual de buffer desnaturalizante de formamidad para posteriormente ser corrido en el siguiente programa de
termociclaje: 95° / 5 min ; 5° / ∞.
•
Teniendo desnaturalizados los productos, se procede a cargarlos en el gel de poliacrilamida (mantenerlos en hielo). En
cada uno de los pozos cargar 2 ml. De ser necesario lavar nuevamente los pozos con TBE.
•
Intercalar entre cada set de STRs 2 ml de “Ladderd”, desnaturalizado también previamente.
•
Continuar la corrida (botón “cotinue”), la cual dura aproximadamente 150 minutos.
Preparación de Bind Silane:
•
Para preparar 1 ml de bind silane, mezclar 1 ml de etanol 96°.
•
Agregar 250 ml de ácido acético al 10% y 3 ml de 3-aminopropiltrietoxi silano.
•
Mezclar y guardar en recipiente cubierto de aluminio y a 4°C.
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Preparación de Persulfato de amonio 10%:
•
Pesar 1 gramo de persulfato de amonio (APS) y agregar 10 ml de dH2O, mezclar.
•
Dispensar en 25 alícuotas de 700 ml cada una en tubos eppendorf de 1500 ml.
•
Almacenar a -20 °C.
Preparación de escalera de peso molecular:
•
Basada en la maplificación de algunos STRs a partir de líneas celulares de referencia. Se utilizó la línea celular Daudi
en pruebas piloto pero deben existir referencias de marcadores para DMHP, CAGS, DLDA y otros, Actualmente (2 de
junio del 2010) poseemos ALF express 50-500 sizer por lo que podremos prescindir de la síntesis de escaleras
externas..
Set1
Set2
Set3
Set4
Set5
Set6
Set7
DAUDI (todos los STRs)
HUMTH01
183, 187
D18S51
(322, 381) (262, 349)
D13S317
186, 190
TPOX
230, 242
D3S1358
135, 142
D21S11
241, 245
CSF1PO
318
vWA
144, 151
FES
217, 225
D10S1248
106
FGA
189, 209
D16S539
153, 161
D7S820
203, 211
F13A1
203, 277
D14S1434
66
F13B
169, 176, 220
Daudi (ladder)
D10S1248
106
vWA
144,151
D16S539 153,161
TH01
183,187
TPOX
230,242
CSF1PO
318
Componentes de PCR para fabricación de marcador de peso molecular:
Master Mix
Volumen
7.325 ml
1.25 ml
0.25 ml
0.125 ml
1 ml
0.05 ml
2.5 ml
12.5 ml
dH2O
Buffer
MgCl2
dNTPs
Oligos
Taq
DNAa
Vf
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–
Facultad de Medicina
Cf
1mM
0.1 mM
0.5 mM
0.02 u/ml
1 ng/ml
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Condiciones de PCR para fabricación de ladder:
•
Ver programa anterior.
Notas:
1.
Se recomienda emplear guantes sin polvo, ya que este activa a los monocitos.
2.
La separación de células de acuerdo a este procedimiento permite aislar un 60 ± 20% de los linfocitos y el 95 ± 5% de
las CMN presentes en la muestra original con una contaminación de granulocitos de 3 ± 2% y de eritrocitos de 5 ± 2%
y menos del 0.50% de las plaquetes presentes en la muestra original. La viabilidad de los linfocitos extraidos a partir
de sangre entera anticoagulada con heparina, EDTA, ACD o citrato es generalmente superior al 90%.
3.
Este procedimiento ha sido optimiado para temperaturas de procesamiento entre 18 y 20ºC.
4.
La adición de una proporción mayor de la mezcla de sangre:PBS se traduce en mayor contaminación de las CMN por
eritrocitos.
5.
Se deberá evitar emplear más G’s de las estipuladas en cualquiera de los pasos de centrifugao debido a que ello incurre
en contaminación por plaquetas de las CMN.
6.
La dilución de la sangre entera con PBS permite disminuir el número de linfocitos que son secuestrados por los
eritrocitos agregados y por ende maximizar su recuperación.
Referencias:
1.
Sigma-Aldrich, Histopaque-1077, Procedure No. 1077.
2.
Skoog, W.A. and Beck, W.S., "Studies in the fibrinogen, dextran, and phytohemagglutinin methods of isolating
leukocytes." Blood 11: 436-454, 1956.
3.
Bøyum, A., "Separation of white blood cells." Nature 204: 793-794, 1964.
4.
Bøyum, A., "Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood." Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21
Suppl. 97 (Paper IV): 77-89, 1968.
5.
Thorsby, E. and Bratlie, A., "A rapid method for preparation of pure lymphocyte suspensions." Histocompatability
Testing ed. P.I. Terasaki: 665-666, 1970.
6.
Ting, A. and Morris, P.J., "A technique for lymphocyte preparation from stored heparinized blood." Vox Sang 20:
561-563, 1971.
7.
Fotino, M., Merson, E.J. and Allen, F.H., "Micromethod for rapid separation of lymphocytes from peripheral blood."
Ann. Clin. Lab. Sci. 1: 131-133, 1971.
8.
Wottawa, A., Klein, G. and Altman, H., "A method for the isolation of human and animal lymphocytes with FicollUrografi n." Wiener Klin. Wochenschr. 86: 161-163, 1974.
9.
Fotino, M., Merson, E.J. and Allen, F.H., "Instant lymphocytes". Vox Sang 21: 469-470, 1971.
10. Peper, R.J., Tina, W.Z. and Mickelson, M.M., "Purification of lymphocytes and platelets by gradient centrifugation."
J. Lab. and Clin. Med. 72: 842-848, 1968.
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