Biotecnología Aplicada a la Salud Humana

Transcripción

PROGRAMA PRELIMINAR
3 al 5 de Noviembre de 2010
CIEMAT - AVDA. COMPLUTENSE, 22 – MADRID
DIRECCIÓN DEL CURSO
Dr. José Luis Motellón y Dr. Juan Bueren
Entidades colaboradoras
Con el auspicio de:
Este Curso es posible gracias a una aportación educacional de
Acreditación de la Comisión de Formación Continuada
del Ministerio de Sanidad y Consumo (en tramitación).
PROGRAMA PRELIMINAR
3 al 5 de Noviembre de 2010
CIEMAT - AVDA. COMPLUTENSE, 22 – MADRID
DIRECCIÓN DEL CURSO
Dr. José Luis Motellón y Dr. Juan Bueren
© 2011 Faltan!!!!!
Edita: Edikamed, S.L.
Josep Tarradellas, 52 - 08029 Barcelona
www.edikamed.com
ISBN: 978-84-7877-658-0
Impreso por:
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Índice
Gene therapy for inmunodeficiency . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Adrian J Trasher
Centre for Immunodeficiency, Molecular Immunology Unit, Londres COMPROBAR!!!!
1. Inmunoterapia humoral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Manuel Hidalgo
The Johns Hopkins University. Baltimore (MD). Estados Unidos
Centro Integral Oncológico Clara Campal. Hospital de Madrid Norte Sanchinarro. Madrid
2. Genómica, proteómica y medicina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Fernando Vivanco
Fundación Jiménez Díaz
Universidad Complutense. Madrid
3. Impact of pharmacogenetics on drug use in individually optimised
pharmacotherapy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Arnold G. Vulto PharmD PhD and Monique J. Bijl PharmD PhD
Department of Hospital Pharmacy
Erasmus University Medical Centre, P.O. Box 2030, 3000 CA Rotterdam, The Netherlands
4. Biología de las células madre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
Antonio Bernard
Departamento de Cardiología Regenerativa
Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC)
5. Clinical applications of cell therapy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
José López-Barneo
Instituto de Biomedicina de Sevilla-Ibis
Hospital Universitario Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla. Sevilla
6. Avances de la terapia génica en el tratamiento de enfermedades monogénicas . . 84
Juan A. Bueren
División de Hematopoyesis y Terapia Génica
CIEMAT y CIBER de Enfermedades Raras
Índice
III
7. Nanomedicina: apliación de la nanotecnología en la salud . . . . . . . . . . . 98
Laura M. Lechuga
Grupo de Nanobiosensores y Aplicaciones Bioanalíticas
Centro de Investigación en Nanociencia y Nanotecnología (CIN2)
Consejo Superior de Investigaciones Científicas
8. Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por biotecnología . . . . . . 113
Alfonso Domínguez-Gil Hurlé
Servicio de Farmacia
Hospital Universitario de Salamanca
9. Aplicaciones de la biotecnología recombinante vegetal a la terapéutica humana 122
Fernando Ponz
Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (UPM-INIA)
Campus de Montegancedo. Pozuelo de Alarcón. Madrid
10. Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la Agencia Europea
de Medicamentos (EMA), BWP (Grupo de Biológicos) y CHMP
(Comité de Medicamentos de Uso Humano) . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
Sol Ruiz
Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios (AEMPS)
11. Las empresas biotecnológicas y su importancia en la terapia humana . . . . . 136
José Luis Motellón
AMGEN
IV
9a edición del curso de Biotecnología Aplicada a la Salud Humana
Gene therapy
for inmunodeficiency
Adrian J Trasher
Centre for Immunodeficiency, Molecular Immunology Unit, Londres
COMPROBAR!!!
At the start of the 1990s, the first clinical trials
of gene therapy were attempted for an inherited severe combined immunodeficiency (SCID)
caused by deficiency of the intracellular enzyme
adenosine deaminase. In the absence of definitive treatment, SCID of any molecular type is
usually fatal within the first year of life, although
patients with ADA deficiency can be supported
by administration of exogenous bovine enzyme.
Even so, this is often only partially effective, and
is extremely expensive. The rationale for the
development of gene therapy for SCID therefore derives from the severity of the illness,
the inadequacy of conventional therapy, and the
considerable morbidity and mortality associated
with stem-cell transplantation, particularly from
a mismatched donor. Efficacy in these early studies was limited, but a decade further on, gene
transfer technology and cell handling protocols had been refined sufficiently to produce
real clinical benefit. Four recent studies have
demonstrated highly effective gene therapy
for the X-linked form of SCID (SCID-X1) and
ADA deficiency, using retroviruses to deliver the
therapeutic genes into haemopoietic stem cells
ex vivo,. Bearing in mind the outcome and adverse effects of conventional therapy, these are
remarkable results and the first clear indication
that gene therapy can offer a cure for some human diseases. In a few patients the treatment
has failed, indicating that there is more to learn
about the effective dose of corrected cells and
the potential for host factors to influence immune cell development.
Many different types of vector have been tested
in laboratory experiments to deliver therapeutic
genes, and their effectiveness is largely determined by the host and tissue type. For stable gene
transfer to dividing cells, such as haemopoietic
cells, the new genetic material has to be retained
through cell division and passed on to daughter
cells. Although retroviruses are highly effective for
this, their dependence on chromosomal integration brings with it the risk of inadvertent gene
activation or inactivation. Having initially achieved
successful immunological reconstitution, five patients with SCID-X1 (out of a total of 19 SCIDX1 and seven ADA-deficient patients treated
to date) developed T cell lymphoproliferative
disease up to after the gene therapy procedure.
In four of these patients, the enhancer sequences
in the retroviral vector, which are responsible for
effective transgene expression, had activated the
LMO-2 proto-oncogene. There are likely to be
other factors that contributed to cell transformation, but they have not yet been defined. It
is therefore unclear whether all patients are at
significant risk, or whether this is restricted to a
few with SCID-X1.
Fortunately, it is likely that much can be done
to improve efficiency and safety of current protocols, and these developments are expected
to enter clinical trial quite soon. The design of
vectors used for gene delivery is clearly imporGene therapy for inmunodeficiency
1
tant, and modifications are possible that limit
the risks of mutagenesis, such as incorporation
of DNA and RNA insulator sequences in integrating vectors; use of self-inactivating vectors
in which the powerful viral enhancer sequences
are deleted; or targeting of safe regions in the
genome. Ultimately, the development of homologous recombination or gene repair to accurately correct genetic mutations, or the construction of mitotically stable extrachromosomal
vectors, would obviate many of these problems,
but current technologies are inefficient.
T Lymphocytes
9.000
MoLV
3.000
Q
SCID/CID
Y
SD
SA
IL2RG
MoLV
R U5
*
7.000
5.000
R U5
γc, IL7Ra, JAK3, ZAP-70
RAG1/2, artemis, ligase IV,
Cernunnos
ADA, PNP
MHC I/II, CD3δ/ε/ζ, CD45,
ORAI1, STIM1, Coronin 1a
HSC-multi
*
*
*
*
1.000
10
20
30
40
50
months after gene therapy
60
70
80
Lymphocyte recovery CD3 (UK/France, 19 patients).
Forward Strand
33,65 Mb
C11orf41
CD59
33,85 Mb
LMO2
FBXO3
10
CAPRIN1 NAT10 ABTB2
Virus
integration
1
0,1
Relative to:
Leukaemia panel
DP1 T cells
DP2 T cells
LTRLTR
1
Chromosome 11p13
2
34,05 Mb
LTRLTR
Fold difference
100
2
3
4
5
6
Fold difference in expression
Relative to:
Leukaemia panel
100
DP1
DP2
10
1
0,1
IL2RG
LMO2 CDKN2A NOTCH1 HES1 MYC
Pre-treatment d0
d539
G to C
CGC to CCC
Amino acid change
R1599P in the HD-N domain
RBPJ/CSL
d717
Control
T CA G C C C CG T G C T G
TCRb to STIL-TAL-1 translocation
Leukemia
AB
AA/BB
HMM
Constitutive DNA
AB
AA/BB
HMM
0
CDKN2A
50
9 Mb
100
CDKN2A (p16INK4A/p21ARF1)
Accumulation of genetic lesions...
5’ LTR PCMV
KpnI (523)
Indication
No MSD/MUD
AP
Failure of PEG-ADA
EcoRI (1.522)
Protocol
Ncol (1.533)
D-60 BM harvest (save)
D-30 Stop PEG-ADA
Banhll (159)
D-4 BM harvest
D-2 MElphalan 140 mg/m2
ORI
SalI (2.633)
D0 Infuse cells
HincII (2.635)
KpnI (3.838)
3’ LTR SFFV
SalI (3.273)
HincII (3.275)
WPRE
Phase 1/2 Study: CD34+ cell gene therapy for ADA-deficient SCID incorporating melphalan conditioning (D-2).
Gene therapy for inmunodeficiency
3
2.500
Max on
PEG-ADA
2.000
Lymphocytes per ul
ALC
ALC
1.500
CD3
1.000
CD4
500
CD8
CD19
CD16/56
0
-20
0
20
40
60
80
100
CD3
120
Weeks
GRANs 13%, MONOs 6%, B 34%, T 48%, NK 34%
RBC ada 52 (40-100 nmol/mgHb/h)
dATP low
Lymphocyte recovery...
Centre
N.o patients
F/U
Off enzyme
Survival
DFS
Milan
10+
1,8-8,0
8/10
100%
80%
London
6
0,5-5,5
3/6
100%
50%
CHLA
5
0,75-4
3/5
100%
60%
Total
21
0,5-8,0
14/21
100%
67%
Summary of patients –Milan/London/CHLA/NIH...
Haematopoietic gene therapy represents a highly effective treatment for SCID-X1 and ADA-deficient SCID, and is
promising for other haematological, immunological and metabolic disorders (CGD,WAS, ALD)
Insertional mutagenesis is a finite risk but relatively simple modifications to design may have significant impact on
safety
Are vectors as good as we think at expressing transgene ?
Thoughts...
4
Days 4 & 5
0,0001
0,00001
neg.
Step 1
R
U5
MOCK
Limiting dilution
assay
Step 2
EF1s
SD
$
PRE
IL2RG
SF91.eGFP.pre
Expansion
0,001
SRS.SF.eGFP.pre
DNA
RNA
Phenotype
0,01
RRL.PPT.SF.eGFP
Expansion
RRL.PPT.SF.eGFP.pre
Expansion
p = 0,03
RRL.PPT.VAV.cGREEN
2 weeks
RRL.PPT-eGFP
2 days
RRLPPT.WASP.WAS.pre
Lin. neg.
BM cells
p = 0,01
0,1
replating frequency/copy number
Day 1
R
U5
R
U5
Reduced mutagenesis with SIN configuration and non-LTR promoters...
Es1
Es2
Es1
pA
GFP
LTR
4,8 kb
D
B
D
3,1 kb
pA
GFP
LTR
Es1
R
U5
SD
EF1s
IL2RG
PRE
$
R
U5
Retroviral vector insertion site
No HLA identical donor
GTAC 146
EUDRACT Number: 2007-004308-11
MHRA approved 2009
R
U5
SD
EF1s
PRE
IL2RG
$
Phase I/II clinical trial of haematopoietic stem celll gene therapy for SCID-X1.
5
RSV
R
U5
SD
RRE
SA
EFs.
IL2RG
PRE
$
R
U5
PRE
$
R
U5
$
R
U5
$
R
U5
GC prom
IL2RG genomic
RSV
R
U5
SD
UCOE
SA
IL2RG
pA
RSV
R
Te
U5
SD
VAV
SA
PRE
IL2RG
?Te
Lentiviral IL2RG SIN vectors...
RSV
R
U5
SD
UCOE
SA
CBX3 HNRPA2B1
PRE
eGFP
NFE2L3
10 kb
CpG island
CBX3
B
HNRPA2B1
T
2.2 A2UCOE
Ubiquitous chromatin opening element (A2UCOE)...
6
1 kb
Restricted enhancer activity
RSV
R
U5
R
U5
Ins
RSV
SD
SA
SD
UCOE
IL2RG
PRE
$
R
U5
UCOE
IL2RG
PRE
$
R
U5
$
R
U5
pA
R
U5
Te
PRE
IL2RG
UCOE
SA
SD
?Te
Next generation vectors...
Glycosylation
Inactive
NAPDH
oxidase
Active
NADPH
oxidase
p21phox
Respiratory
burst
2O22O2
Vacuole
Citoplasm
gp91
phox
Flavocytochrome b
p47phox
p67phox
p40phox
SH3
domains
NADPH
Deactivated
NADPH oxidase
P
2e–
P
P
GTP
NADPH+ + H+
GDP-GTP
exchange
p21 and
GDI dissociate
p21rac and
GDI reassociate
GTP
hidrolysis
rac
GDP
GDI
GDP
GDP
7
Restricted expression or endogenous promoter/enhacer activity in myeloid cells
Ins
R
U5
R
U5
R
U5
SD
SD
SA
SD
SA
UCOE
IL2RG
PRE
$
R
U5
UCOE
IL2RG
PRE
$
R
U5
UCOE
IL2RG
PRE
$
R
U5
pA
Te
Ins
MSP
MiRNA targets
Chim
Next generation vectors...?
A
Zinc-finger domains
Nuclease domains
Mutant sequence
B
Double-stranted
break
C
Homologus recombinatio
Wild-type template
D
Corrected sequence
Urnov et al, 2005.
Lombardo et al., 2007.
Redondo et al., 2008.
Grizot et al., 2009
Enhanced homologous recombination...
8
1
Inmunoterapia humoral
Manuel Hidalgo
The Johns Hopkins University. Baltimore (MD). Estados Unidos
Centro Integral Oncológico Clara Campal.
Hospital de Madrid Norte Sanchinarro. Madrid
Resumen
El uso de anticuerpos monoclonales es actualmente una modalidad terapéutica de enorme importancia en el tratamiento de pacientes
con enfermedades neoplásicas. Los anticuerpos
se han utilizado como agentes únicos o conjugados con agentes radioactivos o como vehículos de fármacos y toxinas. Actualmente existen
anticuerpos frente a receptores de factores de
crecimiento, factores de crecimiento per se y
otras dianas celulares, como antígenos de membrana. Estos fármacos han demostrado actividad
clínica en pacientes con tumores de mama, colon, pulmón, linfomas y leucemias. Las áreas de
investigación y desarrollo incluyen la generación
de agentes con mejores propiedades farmacológicas y menos tóxicos.
Introducción
El desarrollo de anticuerpos con fines terapéuticos ha crecido de forma importante
en la última década. Inicialmente se utilizaron
anticuerpos de origen murino, aunque estas
moléculas tienen el inconveniente de que generan una respuesta inmunitaria a ellos. Los
anticuerpos murinos se pueden transformar
en moléculas «humanizadas», de forma que no
son reconocidos por el sistema inmunitario. Los
anticuerpos humanos (o «humanizados») se
caracterizan también por una vida media más
prolongada. Recientemente se han desarrollado estructuras con capacidad para reconocer
múltiples antígenos, con distintos tamaños y
propiedades. Junto a la creciente identificación
de dianas terapéuticas, el empleo de anticuerpos, tanto «desnudos» como conjugados con
toxinas, fármacos y compuestos radioactivos, ha
aumentado notablemente. Los anticuerpos utilizados con mayor frecuencia en el tratamiento
contra el cáncer son las inmunoglobulinas G
(IgG). Los avances en genética humana y molecular han permitido la síntesis de fragmentos
de IgG. Estos anticuerpos modificados se caracterizan por tener distinta afinidad antigénica,
un número variable de sitios de unión al antígeno y distintas propiedades farmacológicas.
Las más utilizadas son los fragmentos variables
de cadena única (scFV), que están compuestos
por cadenas variables pesadas y ligeras unidas
por un péptido. Estas moléculas tienen un peso
molecular de ≈ 25 kDa y son eficaces como
vehículos de radionucleótidos. También se han
desa-rrollado estructuras de mayor envergadura, como los llamados diabodis y minibodis;
el menor peso molecular de estas estructuras
facilita su eliminación renal y su especificidad
en la localización tumoral, a la vez que muestran menor toxicidad que la asociada a las IgG
completas.
9
Mecanismos de acción
de los anticuerpos
monoclonales
como agentes terapéuticos
Los anticuerpos monoclonales ejercen sus
actividades de forma muy diversa y variada en
función de las dianas afectadas. Los anticuerpos
dirigidos contra receptores de factores de crecimiento, como el del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), impiden la unión de ligandos
con sus receptores y, en consecuencia, impiden
sus funciones, dando como resultado inhibición
de la proliferación celular y apoptosis. Los anticuerpos también generan actividad antitumoral
por medio de mecanismos inmunológicos, induciendo anticuerpos antiidiotipo, citotoxicidad
dependiente de células (ADCC) y citotoxicidad
mediada por complemento. Como ya se ha
mencionado, los anticuerpos también se utilizan
como vehículos de otros agentes terapéuticos
como fármacos, toxinas y sustancias radioactivas. En estos casos, los mecanismos de acción
están en función de las moléculas asociadas.
Limitaciones del empleo
de anticuerpos
terapéuticos
Inicialmente, los anticuerpos terapéuticos administrados en oncología eran anticuerpos murinos. Una de las limitaciones más importantes
de estos fármacos es la generación de HAMA
(human antimouse antibodies), problema que reduce el número de tratamientos que pueden
recibir los pacientes. Técnicas más modernas
han permitido la generación de anticuerpos quiméricos, que comparten estructuras humanas
y murinas y que presentan menor inmunogenicidad. Actualmente es posible la producción
10
de anticuerpos totalmente humanizados que
no generan HAMA. Un segundo problema es
la unión del anticuerpo a antígenos circulantes,
con la consiguiente reducción en la disponibilidad del anticuerpo para llegar al tumor. Otras
limitaciones a la distribución de los anticuerpos
en el tejido tumoral son las alteraciones en la
vasculatura de los tejidos, la elevada presión
hidrostática y la distribución heterogénea de
los antígenos dentro de los tumores. Además,
la inmunoterapia humoral está limitada por las
dificultades de acceso de las células efectoras a
los tejidos tumorales. Finalmente, es bien conocido que los tumores secretan sustancias que
disminuyen la respuesta inmunitaria.
Anticuerpos terapéuticos
Neoplasia hematológica
CAMPATH-1
Es un anticuerpo monoclonal específico frente al antígeno CD52, un glucopéptido que se
expresa en linfocitos B y T. Se ha empleado en
enfermos con leucemia mieloide crónica (LMC),
leucemia promielocitica y linfomas no Hodgkin
(LNH), así como para deplecionar la médula de
células T en trasplantes alogénicos. El fármaco
tiene aproximadamente un 50% de respuesta
en pacientes con LMC resistente a fludarabina.
También ha demostrado actividad en pacientes
con enfermedad no tratada, si bien es menor
en los que presentan afectación esplénica y de
los ganglios linfáticos. En pacientes con LNH se
ha estudiado una versión humanizada del anticuerpo: el 20% respondió, aunque de forma
transitoria. Los principales efectos secundarios
observados fueron anemia, trombocitopenia e
infecciones oportunistas.
Rituximab
El rituximab es un anticuerpo monoclonal humanizado frente al antígeno CD20. En estudios
fase II, el fármaco mostró un 40-50% de respuestas positivas en pacientes con recidivas de
LNH de bajo grado, con muy buena tolerancia.
En algunas ocasiones, el tratamiento con rituximab comportó reacciones a la perfusión caracterizadas por fiebre, escalofríos, lisis tumoral, plaquetopenia, broncoespasmo e hipoxemia. Estos
síntomas se suelen resolver con tratamiento de
soporte y los pacientes pueden continuar el tratamiento sin secuelas. En raras ocasiones se han
descrito reacciones cutáneas de gran intensidad,
algunas incluso fatales. En pacientes con linfomas de grado alto e intermedio, las respuestas
positivas fueron del 30%, independientemente
de la dosis empleada. En combinación con quimioterapia CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina,
vincristina, prednisona), el índice de respuestas
fue superior al 90%, con un 55% de respuestas
completas de larga duración; es importante resaltar que pacientes con translocación del gen
blc2 negativizaron dicho marcador en sangre
medido por PCR. En ancianos, el tratamiento
combinado de quimioterapia con rituximab ha
demostrado superioridad frente al tratamiento con quimioterapia sola. En linfomas de bajo
grado, el tratamiento combinado de rituximab y
fludarabina dio como resultado un 93% de respuestas globales, con una duración de más de 14
meses. En el desarrollo clínico del rituximab, una
observación importante es que la presencia de
células CD20 positivas circulantes puede afectar
a la actividad del fármaco, actuando como un
santuario en el que se deposita el anticuerpo,
por lo que puede necesitar dosis más altas de
éste. De hecho, en otros estudios se ha observado una relación entre valores séricos del anticuerpo y actividad clínica, de forma que pacientes con enfermedad avanzada pueden precisar
dosis de anticuerpo más altas. Ocasionalmente,
los pacientes desarrollan resistencia a rituximab
debido a la proliferación de poblaciones linfocitarias sin expresión del antígeno. En estas situaciones puede considerarse la combinación de
este agente con otros fármacos dirigidos contra
las poblaciones linfocitarias emergentes.
Tumores sólidos
Trastuzumab
El Her2/Neu, también llamado ErbB2, es uno
de los miembros de la familia del EGFR. Este
receptor de membrana se encuentra sobreexpresado, debido a una amplificación genética, en
aproximadamente el 30% de pacientes con cáncer de mama. El trastuzumab (Herceptin®) es
una versión humanizada del anticuerpo murino
4D5. El anticuerpo va dirigido frente a epítopos
en el dominio extracelular del Her2. En estudios de fase II en pacientes con carcinoma de
mama avanzado, el tratamiento con este fármaco mostró un 10-15% de respuestas objetivas
y, aproximadamente, 9 y 13 meses de tiempo a
la progresión y supervivencia, respectivamente.
El fármaco es activo en los tumores que sobreexpresan el Her2, determinado mediante inmuhistoquímica o mediante amplificación genética
por FISH. En combinación con quimioterapia,
el tratamiento con trastuzumab ha mostrado
superioridad frente al tratamiento con quimioterapia exclusivamente en pacientes con cáncer de mama avanzado. En un estudio fase III,
el tratamiento combinado de trastuzumab con
paclitaxel o ciclofosfamida-adriamicina también
se demostró superior en respuestas objetivas, así como en supervivencia. El tratamiento
combinado con antraciclinas produjo casos de
disfunción miocárdica, y no se recomienda su
utilización. Recientemente se han publicado estudios con trastuzumab en combinación con
quimioterapia en pacientes con carcinoma de
mama operado, demostrando una mejor supervivencia libre de enfermedad en pacientes
tratadas con este fármaco, por lo que ha merecido su aprobación para uso clínico. La mejor
supervivencia de las pacientes tratadas indica
que posiblemente se logre un mayor número
de curaciones de la enfermedad.
Cetuximab
El EGFR, o sus ligandos, está sobreexpresado en la gran mayoría de tumores sólidos epi-
11
teliales y es una diana muy interesante para el
desarrollo de fármacos antitumorales. Farmacológicamente, se han desarrollado dos estrategias contra esta diana, basadas en el empleo
de anticuerpos monoclonales contra el dominio extracelular del receptor o de moléculas
pequeñas dirigidas frente al dominio intracelular de éste. Ambas estrategias han demostrado
ser efectivas y actualmente están aprobados
fármacos inhibidores de este receptor en las
dos categorías. Los anticuerpos monoclonales
bloquean la interacción del ligando receptor e
inhiben su función. Además, los anticuerpos monoclonales inducen la degradación del receptor,
y éste es otro mecanismo de atenuación de la
señal. En las células, estos episodios provocan
una inhibición de la proliferación celular. Estudios preclínicos han demostrado además que
estos fármacos reducen la expresión del factor
de crecimiento del endotelio vascular, con lo
que se produce una disminución del potencial
angiogénico. En estudios preclínicos se ha visto también que los anticuerpos monoclonales
ejercen efectos sinérgicos con quimioterapia y
radioterapia frente al EGFR.
Existen varios anticuerpos de esta clase en
desarrollo y entre los más avanzados están el
cetuximab (Erbitux®) y el panitumumab. El primero ha sido aprobado para el tratamiento de
pacientes con carcinoma de colon refractario a
irinotecán en combinación con este agente o
con radioterapia en pacientes con carcinoma
epidermoide de cabeza y cuello con enfermedad localmente avanzada; también, como agente
único, en pacientes con enfermedad avanzada.
En diferentes estudios clínicos se ha observado
que este anticuerpo tiene actividad, como agente único y también en combinación con irinotecán, en pacientes con cáncer de colon avanzado.
En un reciente estudio fase III, la combinación de
cetuximab con irinotecán resultó ser superior
a cetuximab solo en pacientes con cáncer de
colon avanzado que habían progresado al tratamiento con irinotecán. El fármaco tiene también
actividad en otros tumores, tanto como agente
único como en combinación con quimioterapia
12
y radioterapia. En particular, varios estudios recientes han demostrado que este fármaco tiene
actividad como agente único en pacientes con
tumores de cabeza y cuello. Asimismo, la adición
de cetuximab al tratamiento con quimioterapia
basada en platino, en pacientes con carcinoma
de cabeza y cuello, mostró un aumento de las
respuestas positivas. Finalmente, en un estudio
fase III, la combinación de cetuximab con radioterapia resultó superior a la radioterapia sola en
pacientes con carcinoma de cabeza y cuello localmente avanzado. La toxicidad principal observada con este fármaco es cutánea y se manifiesta
como acné. Curiosamente, en estudios clínicos se
ha observado que los pacientes que desarrollan
toxicidad cutánea tienden a evolucionar mejor.
Los datos más recientes demuestran aumento
de supervivencia en pacientes con carcinoma de
pulmón tratados con cetuximab en combinación
con quimioterapia. Así mismo, se ha demostrado
que los pacientes con carcinoma de colon que
se benefician del tratamiento con estos agentes
presentan gen Kras normal.
El otro anticuerpo monoclonal aprobado para
uso clínico es panitumumab. Este anticuerpo, a
diferencia de cetuximab, es totalmente humano,
lo cual disminuye la incidencia de reacciones de
hipersensiblidad. En un reciente estudio fase III
en pacientes con carcinoma de colon resistente a tratamiento con quimioterapia, el panitumumab mostró un aumento significativo en el
tiempo a la progresión frente a placebo. Estos
resultados han llevado a la aprobación clínica
para pacientes con carcinoma de colon refractario a quimioterapia.
Edrecolomab
El anticuerpo 17-1A (Panorex®) reconoce
el antígeno Ep-CAM. El anticuerpo desarrollado clínicamente es un anticuerpo humanizado
que tiene una larga vida media, induce ADCC
y no produce HAMA. Debido a observaciones
preclínicas que indican una mayor actividad del
anticuerpo cuando se combina con citoquinas
como interferón, interleucinas y factores de
crecimiento hemopoyéticos, este anticuerpo se
ha desarrollado en combinación con los otros
agentes. Los estudios clínicos realizados con
esta molécula han dado resultados conflictivos.
La combinación con citoquinas ha mostrado
mejores respuestas inmunitarias, pero no mejores respuestas clínicas. Los estudios iniciales
en pacientes con estadio III de cáncer de colon
demostraron aumento en la supervivencia del
grupo tratado con anticuerpo frente al control.
Estudios posteriores en pacientes en estadio II
de cáncer de colon y en combinación con quimioterapia en pacientes con estadio III no han
confirmado dicha actividad.
Bevacizumab
El VEGF es uno de los mediadores más importantes de la angiogénesis. Bevacizumab es
un anticuerpo monoclonal dirigido contra este
factor de crecimiento que ha sido recientemente aprobado para el tratamiento de pacientes afectados de carcinoma de colon en
combinación con quimioterapia. El fármaco ha
demostrado, en estudios fase III en pacientes
con carcinoma de colon avanzado, mama y pulmón, un mayor índice de respuestas objetivas
y de supervivencia. El fármaco también tiene
actividad en pacientes con carcinoma de pulmón y se está estudiando con intensidad en
estas otras enfermedades. Los principales efectos secundarios son hipertensión, hemorragias
(tumorales, epistaxis, hemoptisis) y cuadros de
perforación intestinal.
Otros anticuerpos en tumores sólidos
Actualmente se está desarrollando un gran
número de anticuerpos monoclonales frente a
otros múltiples antígenos, entre los que destacan IGF1R, VEGFR, HGF y mesotelina.
Radioinmunoterapia
Radioinmunoconjugados
En esta modalidad terapéutica, los anticuerpos se utilizan como vehículos de sustancias
radioactivas. Los anticuerpos utilizados pueden
ser sin actividad terapéutica per se o con ella,
como por ejemplo rituximab. La gran disponibilidad actual de anticuerpos y radioisótopos, con
propiedades físicas y biológicas muy diversas,
permite mucha flexibilidad en su combinación,
de manera que es posible generar reactivos de
muy diversa índole. Hasta hace poco, el único
radioisótopo disponible era el 131I. Recientemente, está disponible también el 90Y, cuyo uso está
aumentando de forma progresiva. Estos agentes
de clasifican en dos grandes categorías dependiendo del tipo de energía que emiten, alfa o
beta. Estas sustancias se han utilizado mayormente en el tratamiento de neoplasias hematológicas.Tositumomab (Bexxar®) está compuesto
por 131I-anti CD20. Dosis mieloablativas de este
agente han sido eficaces en el tratamiento de
pacientes con linfoma refractario al tratamiento
convencional y también ha demostrado actividad a dosis más bajas en pacientes con linfomas
refractarios. Ibritumomab (Zevalin®) combina
un anticuerpo frente al CD20 con 90Y. El más
relevante estudio con este fármaco es de asignación aleatoria, fase III, en pacientes con linfoma de bajo grado. Se distribuyeron de modo
aleatorio 143 enfermos para recibir tratamiento con ibritumomab o rituximab, resultando en
un mayor índice de respuestas positivas (tanto
completas como parciales) en el grupo tratado
con ibritumomab. Otros fármacos RAIT incluyen Lym-1 y M195. Esta modalidad terapéutica
se ha ensayado también en tumores sólidos, con
menor éxito hasta el momento.
Conclusiones
Los anticuerpos monoclonales se han establecido como una importante modalidad terapéutica y actualmente existen varios aprobados
para el tratamiento de pacientes con diversos
tipos de tumores. Los anticuerpos ofrecen una
gran versatilidad en cuanto a su posible utilización como agentes únicos o combinados con
radioinmunoconjugados, fármacos y toxinas.
13
Referencias
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trastuzumab for primary systemic and adjuvant therapy. Semin Oncol. 2004;31:51-7.
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2
Genómica, proteómica
y medicina
Fernando Vivanco
Fundación Jiménez Díaz
Universidad Complutense. Madrid
Resumen
La secuenciación del genoma humano, junto
con el desarrollo y la implementación de las
nuevas tecnologías «ómicas» de alto rendimiento (genómica, proteómica, metabolómica), están
incrementando de manera esencial el conocimiento de la enfermedad humana y estableciendo unas bases sólidas para el desarrollo de la
medicina personalizada (MP). El paradigma de
la MP, y que plantea unos objetivos más ambiciosos, es la denominada «medicina 4P»: preventiva, predictiva, personalizada y participativa.
Aplicando la biología de sistemas (que utiliza los
datos y las técnicas genómicas, proteómicas y
metabolómicas), la emergencia de nuevas tecnologías (nanochips, microfluídica, técnicas de
visualización) y las nuevas herramientas computacionales, pretenden establecer nuevos estándares en salud humana. Uno de sus objetivos
es incorporar el genoma de cada individuo a su
historial clínico. En septiembre de 2010 se ha
anunciado el lanzamiento del Proyecto del Proteoma Humano que, de forma similar al del Genoma Humano, pretende identificar y caracterizar todas las proteínas humanas. Su consecución
es una pieza esencial en el establecimiento de
la MP para facilitar la obtención de los perfiles
proteicos (de tejidos, células y líquidos fisiológicos) que definan cada enfermedad.
De la medicina
personalizada
a la medicina 4P
La MP es una forma o modalidad de la medicina que utiliza la información de los genes,
proteínas y metabolitos de cada paciente para
prevenir, diagnosticar y tratar la enfermedad.
Emplea la información del genoma de un individuo (y los datos que se derivan, expresión de
proteínas, presencia de metabolitos) en pruebas
de diagnóstico útiles y tratamientos específicos
para cada enfermedad y para cada paciente. La
medicina genómica hace uso de la información
genómica y las tecnologías complementarias
(bioinformáticas) para determinar el riesgo y
la predisposición a la enfermedad, diagnóstico
y pronóstico y la selección y priorización de las
opciones terapéuticas. Mientras que la farmacogenética se centra en el estudio de cómo un
gen (o un pequeño número de genes) afecta al
metabolismo de un fármaco, la farmacogenómica lo hace en el estudio de cómo la variación
genética del genoma afecta al metabolismo y
respuesta frente a los fármacos. La MP utiliza los
test moleculares farmacogenéticos y farmacogenómicos para estratificar a los pacientes según
su respuesta predicha a un tratamiento particular y mejora la eficacia del tratamiento selec-
Genómica, proteómica y medicina
15
cionando los individuos que responden bien o
excluyendo a los que van a tener un efecto adverso (fig. 1). En los últimos años los genetistas
han conseguido identificar los genes responsables de enfermedades que dependen de 1 solo
gen (unos 2.000), como la enfermedad de Huntington, la fibrosis quística o la anemia falciforme. Sin embargo, otras enfermedades mucho
más comunes, como la diabetes, la enfermedad
coronaria o diversos tipos de cánceres, tienen
una base genética compleja (están implicados
muchos genes) y su estudio no puede realizarse
por las técnicas genéticas habituales. No obstante, las nuevas técnicas de secuenciación de
ADN y los microarrays de ADN han permitido
la identificación de un gran número de genes de
Patients can respond differently
to the same medicine
Anti-depressants
(SSRIS)
38%
Asthma drugs
40%
Diabetes drugs
43%
Arthritis drugs
50%
Alzheimer’s
drugs
70%
Cancer drugs
75%
Percentage of the patient population for witch particular drug
in a class is ineffective, on average
Figura 1A. Eficacia de distintos fármacos sobre
la población general.
16
susceptibilidad para estas enfermedades complejas, abriendo la posibilidad de una detección
temprana y una posible prevención en algunos
casos. Los microarrays permiten evaluar miles
de fragmentos de ADN o ARN y medir el nivel de expresión de cada gen, obteniéndose las
firmas de expresión génica o perfiles de expresión; son, por tanto, una herramienta muy poderosa para investigar el papel de uno o múltiples
genes y los polimorfismos (SNP, variaciones de
secuencias en el ADN) en los procesos patológicos de individuos o de poblaciones. Asimismo,
los estudios de asociación genómica (GenomicWide Association Study, GWAS) han permitido,
a partir de 2006, la identificación de cientos de
genes de susceptibilidad para las enfermedades
prevalentes (muy recientemente para el asma).
Con esta aproximación se comparan los genomas de un número de pacientes que tienen una
enfermedad con un grupo control que no la
tiene, para identificar las diferencias entre ambas poblaciones. Si se encuentra alguna variante
genética de algún gen que aparece con mayor
frecuencia en la población de pacientes que en
el grupo control, esas variantes se consideran
que están asociadas con la enfermedad.
En cierto sentido los médicos siempre han
practicado la MP, ajustando las dosis de los medicamentos a cada paciente, cambiando el tipo
de fármaco, etc., pero para probar en función
del resultado, lo que con frecuencia dilataba el
tiempo para aplicar el tratamiento óptimo y se
padecían los efectos adversos o la ineficacia de
los fármacos. Actualmente, la MP incorpora la
información derivada de los análisis moleculares,
con nuevos perfiles proteicos en sangre que indican un riesgo elevado de enfermedad cardiovascular o la presencia de cáncer de páncreas
o de próstata o de inflamación, que orientan
al clínico de forma decisiva en la toma de decisiones. Cada vez más, un mayor número de
enfermedades se caracteriza por su perfil molecular (genómico, proteómico), cuyo máximo
exponente es el cáncer –hasta ahora el órgano,
tejido, localización y caracterización histológica
eran los criterios decisivos–. Hoy día, además,
se caracterizan por los genes que expresa cada
tumor o por las proteínas presentes en su superficie. Los test moleculares ofrecen una gran
información sobre la situación de cada paciente,
incluyendo la susceptibilidad a una enfermedad,
su progresión y la respuesta a distintos fármacos: el fármaco adecuado, en la dosis adecuada,
para el paciente adecuado, que es la esencia de
la MP (farmacogenómica). Además, tienen en
gran medida naturaleza predictiva, lo que favorece intervenciones preventivas (tabla 1). Los
dos enfoques son complementarios, siendo los
protagonistas del primero (clásico) las células,
los tejidos y los fármacos de tipo general, supuestamente útiles para todos los pacientes de
una misma enfermedad («talla única para todos»). En el enfoque de la MP, los protagonistas
son los genes, las proteínas y los metabolitos; y
las rutas, redes e interconexiones entre ellos, de
Medicina personalizada
Beneficio y toxicidad
No beneficio y toxicidad
No beneficio y no toxicidad
Pacientes
con el mismo diagnóstico
Beneficio y no toxicidad
Tratamiento
óptimo
para cada paciente
Pacientes
con el mismo diagnóstico
Genotipado
Figura 1B. Comparación de la estrategia utilizada en la MP, utilizando test genéticos (panel inferir), frente a
la medicina clásica, que utiliza el mismo fármaco para todos los pacientes de una misma enfermedad.
17
Tabla 1. Selected Personalized Medicine Drugs, Treatments, and Diagnostics as of March 2009*
Therapy
Biomarker/test
Indication
Herceptin® (trastuzumab) HER-2/neu receptor Breast cancer: «…for the treatment of patients with metastatic
Tykerb® (lapatinib)
breast cancer whose tumors overexpress the HER2 protein and
who have received one or more chemotherapy regimens for their
metastatic disease»
Pharmaceutical and sur- BRCA 1,2
gical prevention options
and surveillance
Breast cancer: Guides surveillance and preventive treatment based
on susceptibility risk for breast and ovarian cancer
Tamoxifen
Aviara Breast Cancer Breast cancer: Calculates a combined risk analysis for recurrence
IndexSM (HOXB13, after tamoxifen treatment for ER-positive, node-negative breast
cancer
IL17BR)
Chemotherapy
Mammostrat®
Breast cancer: Prognostic immunohistochemistry (IHC) test used
for postmenopausal, node negative, estrogen receptor expressing
breast cancer patients who will receive hormonal therapy and are
considering adjuvant chemotherapy
Chemotherapy
MammaPrint®
Breast cancer: Assesses risk of distant metastasis in a 70 gene expression profile
Coumadin® (warfarin)
CYP2C9
Cardiovascular disease: «an increased bleeding risk for patients carrying either the CYP2C9*2 or CYP2C9*3 alleles»
VKORC1
Cardiovascular disease: «Certain single nucleotide polymorphisms
in the VKORC1 gene (especially the -1639G > A allele) have been
associated with lower dose requirements for warfarin»
PGx PredictTM:
Warfarin
Cardiovascular disease: Determines CYP2C9 and VKORC1 genotypes to predict likelihood of adverse events with warfarin therapy.
Protein C deficiencies Cardiovascular disease: Hereditary or acquired deficiencies of protein C or its cofactor, protein S, has been associated with tissue
necrosis following warfarin administration
Pharmaceutical and lifes- Familion® 5-gene
tyle prevention options profile
Cardiovascular disease: Guides prevention and drug selection for
patients with inherited cardiac channelopathies such as Long
QT Syndrome (LQTS ), which can lead to cardiac rhythm abnormalities
Statins
PhyzioType SINM
Cardiovascular disease: Predicts risk of statin-induced neuro-myopathy, based on a patient’s combinatorial genotype for 50 genes
Atorvastatin
LDLR
Cardiovascular disease: «Doses should be individualized according to the recommended goal of therapy. Homozygous
Familial Hypercholestremia (10-80mg/day)and heterozygous
(10-20mg/day)»
Camptosar® (irinotecan) UGTIA1
18
Colon cancer: «Variations in the UGT1A1 gene can influence a
patient’s ability to break down irinotecan, which can lead to increased blood levels of the drug and a higher risk of side effects»
Therapy
Biomarker/test
Indication
Erbitux® (cetuximab)
Gefitinib
Vectibix® (panitumab)
EGFR expression
Colon cancer: «Patients enrolled in the clinical studies were required to have…evidence of positive EGFR expression using the
DakoCytomation EGFR pharmDx™ test kit». EGFR positive individuals are more likely to respond to the drug than those with
reduced EGFR expression.
Erbitux® (cetuximab)
Gefitinib
KRAS
Colon cancer: Certain KRAS mutations lead to unresponsiveness
to the drug
Erbitux® (cetuximab) and Target GI™
Fluorouracil
Camptosar® (irinotecan)
Colon cancer: Provides information of the expression of key molecular targets–KRAS, TS, and TOPO1–to guide therapy
Tagretol
(carbamazepine)
HLA-B*1502
Epilepsy and bipolar disorder: Serious dermatologic reactions are
associated with the HLAB*1502 allele in patients treated with
carbamazepine. «Prior to initiating Tegretol therapy, testing for
HLA-B*1502 should be performed in patients with ancestry in
populations in which HLAB*1502 may be present»
Immunosuppressive
drugs
AlloMap® gene
profile
Heart transplantation: Monitors patient’s immune response to
heart transplant to guide immunosuppressive therapy.
Ziagen® (abacavir)
HLA-B*5701
HIV: «Patients who carry the HLA-B*5701 allele are at high risk for experiencing a hypersensitivity reaction to abacavir. Prior to initiating therapy
with abacavir, screening for the HLA-B*5701 allele is recommended»
Selzentry®
(maraviroc)
CCR5 receptor (1)
HIV: «Selzentry, in combination with other antiretroviral agents, is
indicated for treatment experienced adult patients infected with
only CCR5-tropic HIV-1 detectable...»
Budesonide IBD
Serology 7
Inflammatory bowel disease: Identifies subset of patients who will
benefit from budesonide.
Gleevec®
(imatinib mesylate)
BCR-ABL
Leukemia: «Gleevec® (imatinib mesylate) is indicated for the
treatment of newly diagnosed adult and pediatric patients with Philadelphia chromosome positive [indicated by presence of BCRABL]
chronic myeloid leukemia (CML) in chronic phase»
Dasatinib
Philadelphia
Chromosome
Leukemia: «Dasatinib is indicated for the treatment of adults with
Philadelphia chromosomepositive acute lymphoblastic leukemia
(Ph+ AL) with resistance or intolerance to prior therapy»
Busulfan
Philadelphia
Chromosome
Leukemia: «Busulfan is clearly less effective in patients with chronic myelogenous leukemia who lack the Philadelphia (Ph1) chromosome»
Purinethol®
(mercaptopurine)
Thiaguanine
Azathioprine
TPMT
Leukemia: Guides adjustment of dose in treatment of acute lymphoblastic leukemia: «Patients with inherited little or no thiopurine
S-methyltransferase (TPMT) activity are at increased risk for severe
Purinethol toxicity from conventional doses…»
19
Therapy
Biomarker/test
Indication
Tarceva® (erlotinib)
EGFR expression
Lung cancer: The test determines patients most likely to respond.
Capecitabine
DPD
Multiple cancers: «Rarely, unexpected severe toxicity (e.g., stomatitis, diarrhea, neutropenia and neurotoxicity) associated with
5-fluorouracil has been attributed to a deficiency of dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) activity»
Pharmaceutical and sur- MLH1, MSH2, MSH6 Multiple cancers: Guides surveillance and preventive treatment based on susceptibility risk for colon and other cancers.
gical treatment options
and surveillance
Chemotherapy
CupPrintTM
Chemotherapy
Aviara Cancer TYPE Multiple cancers: Classifies 39 tumor types from tumors of unkID®
nown primary origin, using a gene expression profile.
Elitek® (rasburicase)
G6PD deficiency
Drugs metabolized by
CYP P450
Amplichip®
Multiple diseases: FDA classification 21 CFR 862.3360: «This device
CYP2D6/CYP2C19 is used as an aid in determining treatment choice and individualizing
treatment dose for therapeutics that are metabolized primarily by
the specific enzyme about which the system provides genotypic
information»
2C19: Celecoxib, Codeine, Diazepam, Esomeprazole, Nelfinavir,
Omeprazole, Pantoprazole, Rabeprazole, Voriconazole
2D6: Acetaminophen, Aripiprazole, Atomoxetine, Carvedilol, Cevimeline hydrochloride, Clozapine, Fluoxetine HCl, Fluoxetine
HCL and Olanzapine, Metoprolol, Propranolol, Propafenone,
Protriptyline HCl, Risperidone,
Tamoxifen, Terbinafine, Thioridazine,Timolol maleate,Tiotropium
bromide inhalation, Tolterodine,
Tramadol, Venlafaxine
Multiple cancers: Determines cancer classification for tumors of
unknown primary origin.
Multiple cancers: «Rasburicase administered to patients with glucosephosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency can cause severe hemolysis. … It is recommended that patients at higher risk for G6PD
deficiency … be screened prior to starting ELITEK therapy»
Rifampin
Isoniazid
Pyrazinamide
NAT
Multiple diseases: N-acetyltransferase slow and fast acetylators and
toxicity- «slow acetylation may lead to higher blood levels of the
drug, and thus, an increase in toxic reactions»
Rituximab
PGx PredictTM:
Rituximab
Non-Hodgkin’s lymphoma: Detects CD-20 variant (polymorphism
in the IgG Fc receptor gene FcgRIIIa) to predict response to cancer
drug rituximab.
Celebrex® (celecoxib)
CYP2C9
Pain: «Patients who are known or suspected to be P450 2C9 poor
metabolizers based on a previous history should be administered
celecoxib with caution as they may have abnormally high plasma
levels due to reduced metabolic clearance»
Risperdal® (resperidone)
Zyprexa® (olanzapine)
PhyzioType PIMS
Psychiatric disorders: Predicts risk of psychotropic-induced metabolic
syndrome, based on a patient’s combinatorial genotype for 50 genes.
20
Therapy
Gleevec®
(imatinib mesylate)
Biomarker/test
c-KIT
Indication
Stomach cancer: «Gleevec® is also indicated for the treatment of
patients with Kit (CD117) positive unresectable and/or metastatic
malignant gastrointestinal stromal tumors (GIST)»
*This list is not intended to be comprehensive but reflects commonly used or available products as of March 2009. Some products, for which the
FDA recommends or requires pharmacogenomic testing or which have pharmacogenomic information in their label, are listed at the FDA’s Web
site (http://www.fda.gov/cder/genomics/genomic_biomarkers_table.htm). Other listed products that are novel, and/or that address large populations, have been identified via websites and public announcements.
Indications in quotes are taken from the therapeutic product label.
BCR-ABL = breakpoint cluster region – Abelson
BRCA 1,2 = breast cancer susceptibility gene 1 or 2 c-KIT = tyrosine kinase receptor CYP = cytochrome P450 enzyme DPD = dihydropyrimidine dehydrogenase TOPO1 = topoisomerase 1
G6PD = glucose 6 phosphate dehydrogenase
TPMT = thiopurine S-methyltransferase
HER2 = human epidermal growth factor receptor 2 TS = thymidylate synthase
NAT = N-acetyltransferase UGT1A1 = UDP-glucuronosyltransferase 1A1
Therapeutic product label contains pharmacogenomic information as:
forma que los fármacos (a veces en forma de
cóctel) interfieren con las redes o con los nudos
(intersecciones) que bloquean toda la red. Algunos test para el cáncer de mama, que evalúan
70 genes, orientan no sólo sobre el fármaco a
administrar sino que predicen la probabilidad
de desarrollar metástasis e incluso el grado de
malignidad. La MP, por tanto, se basa en análisis
moleculares, con frecuencia altamente complejos (perfiles genómicos de miles de genes, perfiles proteómicos de cientos de proteínas) y que
requiere un amplio apoyo de todo el sistema
de salud de los países que quieran implantarlo: nuevas regulaciones, revisión profunda de la
educación en biomedicina, sistemas integrados
de información sobre la salud, nueva legislación
que proteja frente a la discriminación (por razones genéticas), cobertura de los test por los
seguros públicos y privados, etc.
A pesar de los numerosos obstáculos, lentamente, pero con paso firme, la MP se va incorporando a los sistemas de salud de los países
desarrollados. La tecnología y las nuevas estrategias científicas han sido siempre los motores
de las revoluciones científicas y todo indica que
lo mismo va a ocurrir con la medicina. Países
como Estados Unidos o el Reino Unido han
aprobado recientemente en sus parlamentos
las directrices para el establecimiento de la MP
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como el camino óptimo para la salud de la población y, a la vez, el de menor costo a largo
plazo. El paradigma de la MP, y que plantea unos
objetivos más ambiciosos, es la denominada medicina 4P: preventiva, predictiva, personalizada y
participativa. Sus promotores (cuyo máximo representante es L. Hood, presidente del Institute
for Systems Biology, Seattle, Estados Unidos)
consideran que la aplicación de la biología de
sistemas (que hace uso de los datos y técnicas
genómicas, proteómicas y metabolómicas) (fig.
2), la emergencia de nuevas tecnologías (nanochips, microfluídica, técnicas de visualización), y
las nuevas herramientas computacionales, van a
modificar significativamente la medicina y el tratamiento de la enfermedad. El carácter predictivo proviene de la estimación de la probabilidad
de padecer o no una cierta enfermedad en
función del genoma individual. Es personalizada
porque las variaciones genéticas únicas de cada
individuo orientan y/o dirigen los tratamientos:
cada paciente se convierte en su propio control; a partir del genoma individual se poseen
billones de datos de cada individuo y cientos
de millones de individuos con esa cantidad de
información. Es preventiva porque pueden diseñarse fármacos terapéuticos/preventivos a
partir de la información generada mediante la
biología de sistemas. Y, finalmente, es participa-
21
• Parallel analyses of proteins, metabolites and mRNA from complex samples
• Determination of molecular function and elucidation of disease mechanisms
• Informatics tools to link gene response, protein activity and metabolite dynamics
• BioSystematics™ to translate covariant sets of genes, proteins, metabolites into biochemical
interaction and target information
Metabolites
protein index
Proteins
ge
ne
ind
ex
Clinical data
BioSystematicsTM
metabolite index
Genes
Target and
System information
Figura 2. Representación esquemática de los elementos que constituyen la biología de sistemas y su
aplicación en medicina.
tiva porque los pacientes entienden y participan en las opciones que toman los médicos, los
cuales deben actuar como integradores de la
información total.
Utilizando los análisis moleculares de la biología de sistemas para el tratamiento de la enfermedad o su predisposición, la medicina 4P
promete introducir nuevos estándares en la
salud humana. El resultado es que en los próximos 5-20 años la medicina puede cambiar de
ser prioritariamente reactiva (responde cuando
aparecen los síntomas de la enfermedad) a ser
proactiva, caracterizada por las 4P. Si se adoptan los test moleculares en la práctica clínica
se puede realmente transformar la salud de la
población. Gracias a la secuenciación ultrarrápida se puede obtener el perfil genómico de un
individuo (o de un tumor) en cuestión de días
e incluso horas, lo cual introduce unos niveles
de complejidad difícilmente controlables en la
actualidad. Sin embargo, el número de causas
o modificaciones (mutaciones) que hacen que
una célula sana se convierta en tumoral no pa22
rece ser muy elevado y son comunes a muchos
tumores, lo que facilita el diagnóstico y sobre
todo el tratamiento. Ya no es arriesgado decir
que en un futuro inmediato la determinación
del genoma completo de cada individuo es algo
no sólo factible, sino de un precio asequible
(unos 1.000 dólares, 800 euros): el primer genoma costó 3 billones de dólares, el segundo 100
millones y el tercero, el de James Watson, 1,5
millones (fig. 3). En el futuro cada recién nacido
tendrá determinado su genoma completo antes
de abandonar el hospital, lo que ya es un objetivo en Estados Unidos, donde el número de
nacimientos anuales ronda los 4 millones. Los
genomas individuales serán un estándar dentro
de las historias clínicas en los próximos años.
Sin embargo, algunas de las tecnologías de
hoy día necesitan ser mejoradas de forma importante si se quieren conseguir los objetivos
de la medicina 4P. Por ejemplo, los métodos nanotecnológicos para la medición de proteínas
–como medir 2.500 proteínas a partir de una
gota de sangre– no son posibles actualmente.
$3B
20
$ Millons
3,0
2,5
$ Billons
2,0
$20M
15
10
5
$2M
0
2006
1,5
2006
$5K
2006
2006
$1K
2006
1,0
0,5
0
1990
1992
1994
1996
1998
2000
2002
2004
2006
2008
Figura 3. Descenso progresivo en el costo (en $) estimado para la determinación del genoma completo
de un individuo.
Existen pequeños dispositivos que son capaces
de cuantificar 40-60 proteínas en líquidos fisiológicos (se han testado en saliva) que pueden
ser prototipos de desarrollos posteriores (fig.
4). La propuesta de que deben desarrollarse
test que evalúen 50-100 proteínas específicas
de los distintos órganos, como forma de preguntarnos acerca del estado de salud en vez
del estado de la enfermedad, está sin embargo mucho más cerca. Las técnicas proteómicas
más recientes, como el método MRM, ya son
capaces de cuantificar 50-100 proteínas/ensayo
en un breve tiempo y con gran sensibilidad y
exactitud. Igualmente, la capacidad de obtener
análisis detallados a partir de una única célula
o un pequeño grupo de ellas (actualmente se
está haciendo con 1.000 células) podrá ser real
en un futuro próximo. El desarrollo de herramientas computacionales y matemáticas con
capacidad de gestionar la dimensionalidad de
los datos es una tecnología con un alto poder
transformador. En los próximos 10 años vamos
a disponer de millones de datos procedentes
del genoma y proteomas de cada paciente.
¿Cómo reducir esa enorme cantidad de datos
a hipótesis simples de salud y enfermedad? El
modo de correlacionar los datos genómicos y
proteómicos con el fenotipo normal y asociado
a cada enfermedad es un gran reto. Dónde y
cómo se van a manejar informáticamente todos
esos datos es actualmente un desafío y un tema
para la reflexión. Hood considera que esta implementación abocará en una digitalización de la
medicina, de forma similar a lo que ha ocurrido
recientemente en el paso de la información analógica a la digital. Es posible que la medicina se
convierta así en una ciencia de la información.
Proteómica y medicina:
el proyecto proteoma
humano
En septiembre de 2010, dos centros independientes (The Institute for Systems Biology, en
Seattle, Washington y el Swiss Federal Institute
of Technology, ETH, en Zúrich) han anunciado
oficialmente que han completado la primera
fase para la generación de un mapa completo del proteoma humano, utilizando la espectrometría de masas (MS) para la identificación
23
A
Determinación de perfiles proteicos
órgano-específicos (cerebro, hígado) en el plasma
Distinción salud/enfermedad
B
Eliminar células
300 nl de plasma
Cuantificación
de proteínas
Nanochips (microfluídica) para el análisis del plasma sanguíneo (proteínas)
Figura 4. A) La presencia de proteínas órgano-específicas en el plasma permite la obtención de perfiles
proteicos asociados a la enfermedad. B) Representación esquemática de un nanochip para el análisis
de proteínas plasmáticas.
de las proteínas –estos datos están libremente accesibles a toda la comunidad científica en
(www.srmatlas.org; www.peptideatlas.org–. Los
investigadores han generado espectros de masas (análisis que permite identificar cada proteína) de referencia para cada una de las proteínas
correspondientes a los 20.300 genes humanos
presentes en el genoma. Este mapa de referencia permitirá a los investigadores de todo el
mundo detectar y cuantificar cualquier proteína
humana de cualquier muestra biológica (tejidos,
células, líquidos fisiológicos). Se utilizan para ello
técnicas específicas de MS, fundamentalmente
SRM (Selected Reaction Monitoring), que permiten detectar y cuantificar cada proteína indi24
vidual a partir de alguno de sus péptidos. Moritz, Hood y Aebersold han generado más de
150.000 SRM que incluyen al menos 5 péptidos
proteotípicos (específicos de cada proteína)
para la identificación de las proteínas. Además,
han dsarrollado ensayos de SRM específicos
para todas las proteínas de membrana y todas
las glucoproteínas con sitios de N-glucosilación.
Este ingente trabajo supone un avance comparable al primer borrador del genoma humano,
de forma que ahora las bases de datos con las
proteínas son de libre acceso; el costo estimado
ha sido de 5 millones de euros. El mapeo del
genoma humano requirió 10 años y un costo
de casi 3 billones de dólares; fue el origen de lo
que ahora comienza como Proyecto del Proteoma Humano (HPP), que se estima pueda estar completado en el año 2020. Con los datos,
ahora públicos, se da un paso de gigante para
reforzar el desarrollo de la MP porque facilita
hacer el tipo de análisis de alto rendimiento (miles de proteínas de un individuo) que se requiere en la MP o 4P. Pero el objetivo final del HPP
no es tener un mero listado de proteínas, sino
todas las posibles variantes de cada proteína
(isoformas), su función, abundancia, localización
subcelular y sus interacciones (redes y rutas de
señalización). Casi un tercio de los 21.000 genes del genoma humano no tiene una proteína
conocida asociada y de los otros dos tercios no
hay una información detallada. El HPP se propone obtener esta información detallada y tener
al menos una proteína correspondiente a cada
gen humano. Es un objetivo complicado, porque el proteoma es dinámico, está cambiando
constantemente y las proteínas son modificadas
de múltiples formas (fosforilación, glucosilación,
acetilación, etc.) y en distintos tiempos. Además,
se pretende tener una colección de anticuerpos
específicos para cada una de las proteínas.
De cara al futuro inmediato, uno de los mayores desafíos es almacenar, manejar y controlar
todos los datos que genera el HPP, especialmente de forma integrada entre sí y con los
datos genómicos. Es fundamental que presente
utilidad práctica y, en especial, que proporcione información útil para la medicina que pueda
trasladarse rápidamente a la práctica clínica. No
debe olvidarse que en último término son las
proteínas (y no sólo los genes) las moléculas
clave para el entendimiento de las enfermedades (y de la salud). Las proteínas son los contribuyentes fundamentales del fenotipo, y las
enfermedades se refieren fundamentalmente al
fenotipo y no al genotipo. Cualquier mejora e
implementación en la medicina y en la MP depende de un mayor conocimiento de las proteínas y del proteoma humano que ahora empieza
a desvelarse. Es importante recordar, además,
que más del 90% de las dianas terapéuticas son
proteínas, sobre las que actúan los fármacos.
Proteómica clínica
La proteómica ofrece una información altamente complementaria de la genómica;
como la mayoría de las funciones biológicas
las realizan las proteínas, la proteómica ofrece
una nueva visión de la enfermedad. A pesar
de su complejidad, el rápido y notable desarrollo en los últimos años ha conducido a su
aplicación a los procesos patológicos o proteómica clínica, la cual se ocupa de la identificación sistemática y exhaustiva, a gran escala,
de patrones proteicos de enfermedad y de la
aplicación de esos datos a los pacientes (estudio de la enfermedad, susceptibilidad, prevención, selección de terapias, seguimiento de los
tratamientos, etc.). Entender, por ejemplo, las
alteraciones tempranas en diversas enfermedades (típicamente en cáncer o en el síndrome coronario agudo), produciría una notable
mejora en la prevención e identificación de
pacientes con riesgo y/o en estado preclínico.
La proteómica clínica pretende definir patrones de proteínas que puedan generar información de valor clínico acerca de la susceptibilidad, diagnóstico, pronóstico y terapia de
la enfermedad; para que impacte de manera
real en la mejora de la salud debe identificar
y seleccionar patrones proteicos, validarlos en
estudios poblacionales muy amplios y trasladarlo a la práctica clínica. Entre sus objetivos,
se encuentran los que siguen.
Identificación de biomarcadores individuales
La búsqueda e identificación de biomarcadores individuales se lleva a cabo siguiendo
la metodología proteómica clásica de separación de proteínas (2-DE, DIGE, cromatografía
multidimensional y electroforesis capilar) y
su identificación por espectrometría de masas (MS, MALDI-TOF, ESI-Q-TOF o ESI-Trap,
MALDI-TOF/TOF). Su estrategia fundamental
es el análisis de la expresión diferencial de
proteínas entre controles y muestras patoGenómica, proteómica y medicina
25
lógicas (fig. 5), de proteomas completos (lisados celulares) o subproteomas específicos
(mitocondrias, membranas, etc.). Un aspecto
fundamental es la determinación de las modificaciones postraduccionales y su potencial
implicación en patología. En muchos casos los
biomarcadores se convierten simultáneamente en nuevas dianas terapéuticas.
Obtención de perfiles proteicos
Consiste en el estudio sistemático, a gran escala, de las proteínas de una muestra para la identificación de patrones o perfiles proteicos (huellas
dactilares proteicas), con carácter diagnóstico
(discriminatorio) y/o pronóstico. Los escasos
biomarcadores identificados y aprobados por la
FDA en los últimos años son un reflejo de la es-
trategia habitual de testar una proteína individual,
o llevar a cabo análisis en pequeña escala, etc.
Aunque existen excepciones (paraproteínas de
los mielomas, déficit de α-1-antitripsina) es muy
posible que no existan marcadores únicos de las
enfermedades complejas, por lo que la estrategia
proteómica de estudiar paneles proteicos, supone un paso cualitativo de gran trascendencia. Este
estudio se puede realizar mediante, al menos, las
tres estrategias que siguen.
Perfiles proteicos de plasma o suero
Se analiza el suero/plasma de los pacientes
con la patología objeto de estudio (cardiovascular, neurodegenerativa, infecciosas, cáncer, etc.)
y alternativamente en otros líquidos fisiológicos
(lavado broncoalveolar, líquido cefalorraquídeo,
orina). Se utiliza la técnica denominada SELDI-
Normal
RCC
Normal
RCC
Figura 5. Ejemplo de análisis proteómico de expresión diferencial mediante electroforesis bidimensional.
La comparación entre las proteínas (manchas en la figura) del tejido sano (Normal) y patológico (RCC),
permite detectar alteraciones en los niveles de expresión de varias proteínas (flechas en los paneles
de la derecha)
26
Perfiles proteicos de tejidos: MS-Imaging
En tejidos, pueden obtenerse perfiles o imágenes (mapas) bidimensionales de proteínas (MSImaging) aplicando directamente la MS sobre
cortes histológicos del tejido (cortes habituales
sobre portaobjetos para microscopia óptica, de
5-20 μm de grosor), utilizando el MALDI-TOF
o el MALDI-TOF/TOF. El mapa bidimensional se
consigue haciendo incidir el láser (que «barre»
la superficie de la muestra) del espectrómetro sobre los cortes histológicos y analizando
las proteínas que son vaporizadas. Típicamente
aparecen 500-1.000 señales de proteínas individuales en cada punto del tejido, con masas entre 2-70 kDa. De esta forma se obtiene la masa
(m/z) de las moléculas (péptidos, proteínas)
presentes en cada zona del tejido. Seleccionando una masa dada (m/z) en los distintos espectros de las diferentes zonas, se genera un mapa
3325.4
Relative intensity
TOF (Surface Enhanced Laser Desorption/
Ionization-Time of Flight) para la generación de
los perfiles proteicos, que combina la retención
de las proteínas del suero en biochips con la determinación de sus masas moleculares mediante
MS, permitiendo generar gráficos donde se representa la abundancia frente a la masa molecular de las proteínas, a modo de código de barras
proteicos constituidos por miles de líneas que
caracterizan el suero de cada individuo (fig. 6). Su
poder discriminatorio es muy superior al de marcadores únicos con los que se han comparado (p.
ej., PSA en cáncer de próstata, proteína C reactiva en infección e inflamación). Como el análisis
mediante SELDI-TOF utiliza muy poca muestra
(1 μl) y, además, es muy rápido (se pueden analizar cientos de muestras al día) y automatizado, su
potencial en clínica analítica es enorme y puede ir
sustituyendo muchas de las técnicas habituales de
los laboratorios de bioquímica clínica (enzimoinmunoanálisis), que son más lentos, más caros
(utilizan anticuerpos marcados con sondas fluorescentes), precisan mayor cantidad de muestra y
sólo informan de un único marcador, frente a los
miles que proporciona el SELDI-TOF.
3325.1
3,000
6593.8
4303.1
5392.1
6593.8
4303.1
5392.1
4,000
5,000
6,000
7,000
Figura 6. Representación de perfiles proteicos
obtenidos por SELDI-TOF.
bidimensional de la distribución de esa proteína
(esa m/z) a lo largo del corte de tejido (a modo
de cartografía proteica). Se pueden conseguir
dos tipos de datos: perfiles proteicos (mediante
una adquisición puntual) e imágenes (barriendo
todo el tejido con el láser) (fig. 7).
Las imágenes son generadas mediante un
software específico que clasifica y agrupa las
proteínas y compara diversas muestras, permitiendo obtener imágenes tridimensionales de
la distribución de las proteínas del tejido. Esta
tecnología implica un tipo de información totalmente nuevo para la descripción, clasificación
y caracterización de muestras histológicas que
está permitiendo la identificación de biomarcadores, la localización de proteínas específicas y,
en el campo de la oncología, la reclasificación de
tumores, por ejemplo.
Una técnica muy similar (SIMS-TOF, Secondary Ion Mass Spectrometry) permite el análisis
(identificación y caracterización) de moléculas
de bajo peso molecular presentes en la superficie de una muestra (determinación del metaboloma) hasta los 1.500 Da. Esta limitación en
el reducido rango de masas analizado es compensada en parte por la alta resolución obtenida (subcelular; hasta 200 nm/pixel) y por no
necesitar la utilización de ningún tipo de matriz
(evitando interferencia y deslocalización de las
muestras: se usa el tejido directamente), lo que
27
Tissue slide
Matrix application
Las
er
Laser ablation
Tandem MS
MS
MS/MS spectrum
Mass spectra for each xy coordinate
Single m/z values
Biocomputational analysis
Peptide fragments
Database search
0%
Protein identification
100%
Protein images
Class A
Class B
Classification images
Figura 7. Flujo de trabajo en el análisis de tejidos mediante MS-Imaging.
la convierte en una herramienta muy valiosa en
patología. Además, como ésta técnica se aplica
para localizar y mapear en el tejido moléculas
pequeñas, particularmente fármacos (y su colocalización con proteínas), es de gran interés
para la industria farmacéutica.
Chips (arrays) de proteínas
La obtención de perfiles proteicos, tanto de
suero (u otros líquidos fisiológicos) como de células o tejidos, también puede obtenerse a partir
de la utilización de chips (o micromatrices) de
proteínas. Éstos pueden clasificarse según mu28
chos parámetros (modo de fabricación, química de la superficie, especificidad, densidad, etc.),
aunque es mejor sistematizarlos en dos grandes
grupos, según lo que capturan o analizan.
Chips analíticos
Se utilizan para determinar las proteínas presentes en una muestra (perfil de expresión) y
su cuantificación. La disolución de la mezcla de
proteínas a analizar se aplica sobre el chip, que
contiene agentes de captura que actúan como
sondas. Los agentes de captura más conocidos
son los anticuerpos (Ab) en sus distintas moda-
lidades: monoclonales completos, Fab, scFv, afibodies (Ab sintéticos), dominios de Ab, etc. La
utilización de Ab no está exenta de problemas:
inespecificidad, reacciones cruzadas, orientación,
afinidad, etc. Otra alternativa son los chips de
antígeno para analizar el perfil sérico de Ab (y
autoAb en enfermedades autoinmunes), como
los chips de alérgenos para la detección de IgEs
en respuestas alérgicas.
Recientemente se está generando una plétora
de agentes de captura distintos a los Ab, como
péptidos, moléculas orgánicas, polímeros sintéticos, oligonucleótidos, aptámeros, ribozimas,
trinectinas (derivados de la fibronectina), MIP
(molecular imprinted polymers: compuestos que
se polimerizan sobre las proteínas creando moldes para su uso posterior), etc. A pesar de ésta
diversidad, la captura de las proteínas (y los métodos de detección) constituye el gran problema
de los chips proteicos: no existen todavía agentes
de captura de alta calidad que puedan inmovilizarse en la superficie de un chip y que permitan
unir, detectar y cuantificar una mezcla compleja
de proteínas. Este problema está retrasando no
sólo el desarrollo de los chips proteicos sino de
la industria proteómica en general.
Los chips de fase reversa son de especial relevancia en medicina porque permiten determinar las proteínas implicadas en las rutas de señalización celular en las biopsias de los pacientes.
En ellos, las biopsias (típicamente de tumores
o cardiacas) se lisan y se depositan en diluciones sucesivas como microgotas (utilizando los
mismos robots que para la fabricación de los
chips de ADN); posteriormente, son revelados
con Ab validados (que reconocen proteínas fosforiladas y cinasas, a fin de determinar el grado
de activación de las diferentes rutas de señalización), obteniéndose información cualitativa y
cuantitativa para cada paciente, lo que permite
un tratamiento personalizado; actualmente existen más de 1.000 Ab validados. Mediante estos
arrays puede determinarse simultáneamente el
estado de fosforilación de las proteínas impli-
cadas en las principales rutas de señalización
intracelular. La utilización de los arrays de fase
reversa permite así, obtener un tipo de información molecular único e individualizado de
cada muestra y, por tanto, de cada paciente.
Este nuevo tipo de array proporciona perfiles
de señalización intracelular, incluyendo las modificaciones postraduccionales, datos que no son
accesibles mediante técnicas genómicas.
Chips funcionales
Se utilizan para determinar actividades bioquímicas e interacciones moleculares. Las proteínas de interés se inmovilizan en el chip y se
analizan sus funciones biológicas e interacciones
incubándolas con distintas moléculas (otras
proteínas, metabolitos, sustratos de enzimas,
ADN, etc.). Los dos problemas principales de
estos chips son la producción de colecciones
extensas de proteínas y su mantenimiento en
forma activa en el chip. Sin embargo, para grupos de proteínas con características funcionales
similares (factores de trascripción, receptores,
cinasas) hay un gran campo por desarrollar en
clínica humana.
Referencias
Auffray C, Chen Z, Hood L. Systems medicine: the future of medical genomic healthcare. Genome Med.
2009;1:2.
Personalized Medicine Coalition. The case for personalized medicine, 2009. USA. (www.personalizedmedicinecoalition.org).
Genomic Medicine, vol 1. Report of Science and Technology Committee. House of Lords, 2009. London
(http://www.parliament.uk/hlscience/).
Hamburg MA, Collins FS. The path to personalized medicine. N Engl J Med. 2010;363(4):301-4.
Evans JP, Dale DC, Fomous C. Preparing for a consumerdriven genomic age. N Engl J Med. 2010;363:1099103.
Lotta LA. Genome-wide association studies in atherotrombosis. Eur J Int Med. 2010;21:74-8.
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septiembre;10:605-60.
Van Eyk J, Dunn M, editores. Clinical proteomics. From
diagnosis to therapy. Wiley-VCH; 2008.
29
3
Impact of pharmacogenetics
on drug use in individually
optimised pharmacotherapy
Arnold G.Vulto PharmD PhD and Monique J. Bijl PharmD PhD
Department of Hospital Pharmacy
Erasmus University Medical Centre , P.O. Box 2030, 3000 CA Rotterdam,
The Netherlands
Abstract
Introduction
Traditional pharmacotherapy is rather inefficient; on average only 40% of patients
will benefit from a particular drug as compared with placebo. Interindividual variability
in drug disposition and effect can be partly
explained by genetic variants. In the science
of pharmacogenetics the influences of genetic differences on patients’ drug response are
studied. The major causes of inefficient drug
treatment (like lack of effectiveness or the
occurrence of side effects or toxicity) are heterogeneity of the disease, variations in drug
disposition (pharmacokinetics) and drug response (pharmacodynamics).
Genetic variants can be detected by amplification of DNA using the Polymerase Chain
Reaction (PCR) followed by sequence analysis.
Other techniques, like micro-arrays, enable us to
screen the whole genome.
The influence of pharmacogenetics becomes
more and more important in clinical practice
and on drug development. In this review we will
discuss the principles of pharmacogenetics and
the practical implications, illustrated with examples taken from clinical practice. Pharmacogenetics is a new cornerstone in medicine!
Patients differ in their response to drugs. On
average only 40% of patients will benefit from
a particular drug as compared with placebo.
When treating risk factors (e.g. hypertension)
medically, we are grossly over treating the general population. A good measure to evaluate
treatment effect is the ‘Number Needed to
Treat’ (NNT): the total number of people that
are exposed to treatment to prevent one incident. For example >1000 patients younger
than 60 years with hypertension should be
treated to prevent one death. On the other
hand about 10% of the patients will experience adverse drug reactions (ADRs). From this
perspective, traditional drug treatment is rather inefficient.
The reason for this inefficiency is that we cannot point out beforehand which patients will
benefit from the treatment and which patients
will experience ADRs. Interindividual variability
in drug disposition and effect can be partly explained by genetic variants. Patients do not only
show a considerable variation in disease-development but also in drug disposition (pharmacokinetics) and drug effects (pharmacodynamics)
(Evans et al; 2003). In the science of pharmaco-
30
genetics the influences of genetic differences on
patients’ drug response are studied.
The mapping of the human genome is slowly
changing the scene. Based on genetic analysis
drugs can be produced tailor-made for specific
patients, based on their genetic constitution. Many
applications can be envisaged. Genetic predisposition can be spelled out: which patients carry a
serious disease risk and should be treated with
priority? Which patients will benefit most from
certain types of drugs? It may become possible
to repair genetically determined risk factors, or
to repair genetic defects (gene therapy). Gene
therapy can also be employed to change the biochemical repertoire of a cell in such a way that
the body is producing its own drugs. But also in
the use of traditional drugs, the scene will change.
Factors like absorption and metabolism are genetically determined by the structure of so-called
P-glycoprotein pumps in the cell membrane and
polymorphism of the drug metabolising cytochrome P450 (CYP) enzymes in the liver. In addition, it may become feasible to assess the sensitivity of target-tissues or even become possible to
change it in a desirable fashion.
Genetic variation
The whole DNA sequence is called the human genome. The arsenal of proteins is the
proteome. 99.9% of the genome of two unrelated persons is identical, but still there is genetic
variability in 0,1% of 3.3 billion base pairs (on
average one variant per 1000 bases).
The most common type of variant is a single
nucleotide polymorphism (SNP), a single-base
difference in the DNA sequence that can be
observed between individuals in the population.
A polymorphism has been defined as the minor
allele occurring in more than 1% of the population, whereas mutations are rare. Many mutations have been discovered in coding sequences
of genes causing rare inherited diseases.
The specific set of alleles observed on a single chromosome is called a haplotype. Haplo-
types are formed by recombination when the
paternal and maternal chromosomes exchange
corresponding segments of DNA. The co-inheritance of SNPs on these haplotypes leads to
associations between these alleles (linkage disequilibrium). Not a single SNP but the haplotype
is associated with the disease. This advantage
leads to optimal genotyping: carefully chosen
SNPs in a specific region will provide enough
information to predict much of the information
about the remaining SNPs in that region. These SNPs are called ‘tagSNPs’ and are used to
screen the whole genome (Burton et al; 2005).
The human genome is diploid (one paternal
and one maternal allele). A SNP can be present on 0, 1 or 2 alleles. If an individual has no
polymorphism on both alleles, this individual is
called homozygous wildtype. One speaks of
homozygous mutant if both alleles are affected.
An individual with one wildtype and one variant
allele is heterozygous. A SNP could lead to no
functional enzyme activity, decreased enzyme
activity or increased activity. To simplify different
combinations the term semi quantitative gene
dose (SGD) is introduced. Functional alleles have
a SGD of 1, completely dysfunctional alleles 0
(e.g. CYP2D6*4) and 0,5 for variant alleles with
decreased enzyme activity (Steimer et al; 2004).
Sources of Variation
The major causes of inefficient drug treatment
are heterogeneity in disease, variations in drug
disposition (pharmacokinetics) and drug response (pharmacodynamics). Figure 1 shows the
relationships in relation with the drugs response
/ therapy outcome and the targets we can use
to optimise pharmacotherapy. In the following
sections we will present some illustrative examples of genetic variability with practical consequences for the quality of pharmacotherapy.
Heterogeneity in disease
One of the interesting examples of diseases
showing the importance of genetic heteroge-
Impact of pharmacogenetics on drug use in individually optimised pharmacotherapy
31
neity is Alzheimer-disease. Currently, we know
that at least 3 gene-mutations are involved. In
addition, there are polymorphisms in susceptibility genes. Such genes may not cause the disease
themselves but may make an individual more
sensitive to acquire the disease if conditions
make this permissive.
The E4 variant of APOE (apolipoprotein E) is
associated with an increased risk of Alzheimer
disease. Homozygosity of the E4 allele increases
the risk of Alzheimer by a factor 33 in Japanese, 15 in Caucasians and 6 in African Americans.
Although this increased risk is known for 12
years, its identification did not help to develop
effective medicines or prevention strategies.
Alzheimer is also an illustrative example to
show heterogeneity in drug response. When
the cholinesterase-inhibiting drug tacrine was
investigated in clinical trials, the overall efficacy
was disappointing: only about 1/3 of the patients
benefited from the drug, in 1/3 there was no
apparent effect and the drug had to be discontinued in another 1/3 due to side effects. Only
later (when the drug was already dead) it was
found that patients with a ApoE 2/3 genotype
showed a 80% response while the ApoE 4 genotype predisposed for no effect / worsening
of the disease and suffering from side effects.
This example shows the potential promise of
genome technology.
Some drugs are very efficacious in some patients, but not in others. But how can we learn
this beforehand? That means that we have to
study the origins of variability in drug response
in more detail, and these may have to do with
disease state, pharmacokinetics and pharmacodynamics.
On the other hand success stories are also
Individually optimised pharmacotherapy
With the aid of pharmacogenetic profiling
Heterogeneity in disease e.g.
• Genetic variability in patients
• Genetic diversity in infective agents
Diagnosis
Incl. genetic profiling
Drug selection
Heterogeneity in pharmacodynamics e.g.
• Drug targets (e.g. receptors)
• Dose-response relationship
• Interactions
• Side effects
Heterogeneity in pharmacokinetics e.g.
• Absorption: active (PgP), passive
• Distribution: active, passive, compartments
• Metabolism: e.g. cytochrome P450
• Elimination: renal, hepatic
Dosage adjustment and monitoring
Response/Outcome
Figura 1. Variability in drug response scheme.
32
known. The monoclonal antibody trastuzumab
has a high affinity for the HER2 transmembrane
protein. HER2 (human epidermal growth factor)
is a member of the epidermal growth factor receptor (EGFR) family of tyrosine kinases and is involved in regulation of cell proliferation. In patients
with overexpression of HER2 or an amplification
of the gene, breast cancer is more aggressive:
enhanced growth and proliferation, increased invasive and metastatic capability and stimulation
of angiogenesis. In these patients treatment with
the selective HER2-antibody trastuzumab leads
to a response rate of 34%. In combination with
catatonic agents the response rate is further increased (Hortobagyi et al; 2005).
allele at the C3435T polymorphism predicts lower
plasma concentrations of nelfinavir, efavirenz (Fellay et al; 2002) and atazanavir (Rodriguez-Novoa
et al; 2007). These findings are contradictory, since the C >T change is associated with a decreased PGP activity. A possible explanation is that
CYP3A4 activity could be increased in patients
with ABCB1 polymorphisms, leading to lower
plasma concentrations of atazanavir, which is metabolized by CYP3A4 (Ma et al;2007).
The frequency of the TT genotype is very low
in Africans as compared to Caucasians (25%),
which partly explains the difference in response
between Caucasians and black Africans to these
drugs.
Heterogeneity
in Pharmacokinetics
Metabolism/polymorphism
in drug metabolising enzymes
Absorption/P-glycoprotein and Multi
ATP-binding cassette, sub-family B
member 1 (ABCB1) Genes
The P-glycoprotein efflux pump, which is encoded for by the ABCB1 gene, plays an important role in the export of substances from the
inside of cells and from membranes to the outside. P-gp (P-glycoprotein) protects cells from
toxic substances and many drugs by permitting
or inhibiting transportation through the intestine and other epithelial barriers. To date > 100
variants of the ABCB1 gene have been discovered. Not all these SNPs lead to an effect on
PGP; most of them are intronic or non-coding.
Of the 15 most common variants the C3435T
mutation at exon 26 is well known. This silent
mutation leads to an alteration in the effect of
PGP.The TT genotype (homozygous variant allele) is associated with a twofold lower ABCB1
expression level in the duodenum compared
with the CC genotype (wildtype) and resulted
for instance in a higher digoxine plasma concentration (Kerb; 2006).
HIV-protease inhibitors are known substrates
of PGP resulting in a low bioavailability and a limited penetration in targets.The presence of one T
Many drugs are metabolised by the oxidative cytochrome P450-enzyme complex. One
member of this family, CYP2D6, is extremely
polymorphic, with more than 75 allelic variants.
CYP2D6*4 is the most common variant (21%
allele frequency in Caucasians), which leads to a
non-functional allele. Subjects homozygous for a
non-functional variant allele lack enzyme activity
and are defined as ‘poor metabolisers’ (PMs).The
CYP2D6 PM phenotype results in an increased
plasma concentration of drugs predominantly
metabolised by CYP2D6 e.g. tricyclic antidepressants, codeine and tramadol. In case of a narrow
therapeutic window this will lead to toxicity.
CYP2D6 gene duplication/multiplication occurs relatively infrequent among Northern
Europeans (1-2% of the Swedish population),
but increases in Southern direction: 7-10% of
Spaniards and Southern Italians, and as high as
29% of Ethiopians. Such subjects can have an
inadequate response to standard doses of drugs
metabolised by CYP2D6 and are called ‘ultra rapid metabolisers’ (UMs) (Dahl et al; 2002).
These polymorphisms are illustrated in figure 2.
The following case is a nice example showing
the influence of CYP2D6 polymorphisms in
daily practice (Gasch et al; 2004).
33
A 62-year-old man with a history of chronic
lymphocytic leukaemia had complaints of fever,
fatigue, dyspnoea and a cough. Therapy with ceftriaxone, clarithromycine and voriconazol was
initiated for pneumonia infected by yeast. The
patient received a modest dose of codeine (25
mg 3 times daily) to relieve the cough. After 4
days, the patient’s level of consciousness deteriorated. His neurological status (a score of 6
on the Glasgow Coma Scale) was poor. After
the administration of naloxone, the patient recovered rapidly. Extremely high plasma levels
of codeine and morphine were found despite
of the modest dose of codeine. After analysis
of the patients CYP2D6 genotype, the patient
seemed to be an ultrarapid metaboliser. Along
with the CYP2D6 gene duplication, a drug interaction may have contributed to the observed
toxic effects. Voriconazole and clarithromycine
both inhibit CYP3A4, thereby decreasing the
amount of the metabolite norcodeine (and in-
creasing codeine concentration). At last due to
renal failure the excretion of the morphine metabolites was reduced, leading to the observed
respiratory problems.
A similar example demonstrating the impact
of the CYP2D6 genotype on codeine toxicity
was published in the Lancet (Koren et al; 2006).
A full term baby boy died due to an increased
morphine concentration (70 mg/ml in stead
of 0-2,2 ng/ml). The mother, who was breastfeeding her child, was prescribed codeine in a
standard dose. After genotyping for CYP2D6,
the mother seemed to be an ultrarapid metaboliser (gene duplication). This genotype leads
to increased formation of morphine from codeine, which she passed on to her boy.
Tamoxifen is one of the most widely used
drugs for treatment of post-menopausal women with oestrogen receptor-positive breast
cancer. CYP2D6 plays an important role in the
formation of endoxifen, the most active meta-
EM homozygous
90
80
N.o of individuals
70
60
50
EM heterozygous
x
x
MR = 12,6
40
30
UM
20
10
0
(
0,01
UM
0,1
1
10
PM
x
x
100
1000
)13
Figura 2. Schematic presentation of the relationship between the debrisoquine metabolic ratio and
CYP2D6 genotype in Caucasians (Dahl et al; 2002).
34
bolite of tamoxifen. Goetz et al. were the first to
describe that tamoxifen users with decreased
CYP2D6 enzyme activity, due to homozygous
carriership of CYP2D6 variant alleles or the intake of potent CYP2D6 inhibitors, had a higher
risk of breast cancer recurrence and disease
free survival (Goetz et al; 2007.).
In the Rotterdam study we found similar results. Breast cancer mortality was significantly
higher in tamoxifen users with the CYP2D6*4/*4
genotype (HR=4.1, CI 95% 1.1-15.9, p = 0.041)
compared to extensive metabolizers. A trend
test revealed a significant increased breast cancer mortality risk with a hazard ratio of 2.0 per
additional CYP2D6*4 variant allele (p = 0.015)
(M. Bijl, PhD-Thesis Erasmus University Rotterdam, 2009). Genotyping before the start of endocrine treatment in breast cancer could identify PMs who will better respond to aromatase
inhibitors than to tamoxifen therapy. CYP2D6
EMs could be prescribed tamoxifen, since aromatase inhibitors are more expensive.
Polymorphisms in another member of the
cytochrome P450 family, CYP2C9, are associated with overanticoagulation. Anticoagulants like acenocoumarol, phenprocoumon and
warfarin are metabolized by CYP2C9. Compared to CYP2C9 wild type patients, carriers
of CYP2C9*2 or *3 have an increased risk of
overanticoagulation with coumarins (Visser et
al; 2004, Schalekamp et al; 2007). Together with
polymorphisms in the VKORC1 gene (vitamin K
reductase complex subunit 1) a large part (up
to 40%) in the interindividual variability can be
explained.
Notwithstanding proven evidence that genotyping contributes to better drug response, genotyping is hardly performed in clinical practice
to predict drug response. It is mostly carried out
retrospectively to explain clinical symptoms as
seen in the cases mentioned above.
Thiopurine S-methyltransferase (TPMT) genotyping is a notable exception: it is clinically used
to prevent life-threatening myelosuppression
in patients with acute lymphoblastic leukaemia,
treated with mercaptopurine (Puri-Nethol®) or
azathioprine (Imuran®).
The immunosuppressant thiopurine drugs
mercaptopurine and azathioprine are metabolised by thiopurine S-methyltransferase (TMPT)
and xanthine oxidase (XO). Variation in TPMT
is of much greater impact than XO. Three important SNPs are found in the TPMT gene:
TPMT*3A, *3B and *3C. The presence of one
of these mutations leads to reduced enzyme
activity. Subjects homozygous for the variant
allele TPMT*3A (0,3% of the Caucasians) are
of increased risk of myelosuppression, a known
side effect of thiopurine drugs. *3C is the most
common variant allele in Asian subjects, while
*3B is very rare (Wang et al; 2006).
Phenotypic assays for TPMT, performed on
red blood cells, have also been developed.
However, the phenotypic assay is labour-intensive, requires qualified knowledge and expensive
instruments.
Some authors have doubts about the benefit
of genotyping, since TPMT polymorphism fails to
explain all cases of myelosuppression. However,
certainty is rare in clinical medicine. TPMT genotyping predicts myelosuppression and is proven
to be cost-effective (van den Akker et al; 2006).
Heterogeneity
in Pharmacodynamics
Pharmacodynamics of a drug is regulated by
the whole genome. We know for example that
drug response depends on the presence of
sufficient numbers and sensitivity of receptors.
Receptors are proteins that are encoded for by
genes. This means that the gene expression level
determines the amount of receptors and is thus
closely associated with drug response. Gene expression itself however, is determined by several
transcriptional, translational and post-translational
regulatory effects of other genes. In this way the
whole genome is involved in drug response.
Small genetic variations, such as variability
in receptors, can have a large impact on the
35
pharmacodynamics of a drug. It is no surprise
that the list of drugs that are subject to such an
effect is increasing almost daily.
In some cases a SNP or a point mutation
can modify drug response. Genetic variability
in receptors is either inherited or acquired. Resistence to the tyrosine-kinase inhibitor imatinib is for example associated with mutations in
the kinase domain of BCR-ABL that interfere
with drug binding. The acquired mutation in a
threonine residue of the ABL kinase is the cause
of resistance to imatinib in about 67% of the
cases (Gorre et al;2001). Increased expression
of BCR-ABL from genomic amplification could
also be a mechanism for resistance.
One of the first well documented examples
of genetically determined pharmacodynamics
relates to the efficacy of cholesterol synthesisinhibitors of the statin-type. Carriers of so called
B1-alleles on the receptor benefit more from
statin-therapy than individuals that have just one
allele (Kuivenhoven et al;1998).
Another example relates to the tachyphylaxis
of beta-2-agonists, a well known effect from drugs
like salbutamol. The ß2-receptor has three main
polymorphisms and two of them (Arg16Gly and
Gln27Glu) are found in the general population.
The two SNPs are in strong linkage disequilibrium
and can be considered together in haplotypes.
It is demonstrated that homozygous carriers of
Gly16/Gly16 desensitise faster than Arg16/Arg16
carriers. Arg16Gly and Gln27Glu are associated
with a decreased effect of ß2-agonists.
Patients with variant alleles of the promoter gene of ALOX5 (5-lipoxygenase) have a
diminished gene transcription, and therefore a
decreased receptor activity, which leads to a
decreased response to treatment with leukotriene antagonists (like montelukast) (Drazen et
al;1999).
Another interesting example relates to the
efficacy of antibodies towards the Epidermal
Growth Factor Receptor (EGFR) in the treatment
of colon-cancer. On average such drugs show
only low response rates, and this appears to be
36
related to the genotype of a downstream signal peptide K-RAS, which acts like a switch. The
wild type protein activity can be reduced with
VEGF antibodies like cetuximab or panitumumab.
However, if the K-RAS gene is mutated [which
is the case in ca. 40 of patients], the switch is
no longer functional, which renders the antibody ineffective and treatment with this expensive
drug useless. In many countries in Europe coloncancer patients are tested for K-RAS genotype
status before start of treatment with an VEGFantibody, and reimbursement of the drug is made
dependent on the test outcome.
Detecting genetic variation
One of the most frequently used techniques
in identifying genetic variability is the Polymerase
Chain Reaction (PCR). PCR is a simple method
by which a part of DNA or a transcript (RT-PCR)
is amplified. Subsequent sequence analysis on the
PCR product will reveal the presence of mutations or polymorphism. PCR is not only used to
detect sequential variability but also variability in
gene expression. By applying real-time PCR, we
are able to measure gene expression precisely. In
this way single nucleotide polymorphism can be
detected in genes encoding drug metabolising
enzymes, transporters and receptors.
Micro-arrays have been developed to detect
many SNPs in a short time period. The Amplichip CYP450 GeneChip® is an oligonucleotide
microarray hybridization method for genotyping
CYP2D6 and CYP2C19. This test distinguishes
29 polymorphisms in the CYP2D6 gene including gene deletion (*5) and gene duplication.
In this way the phenotype of a patient (PM, IM,
EM or UM) can be predicted. For CYP2C19
the test discriminates between PM and EM
by determining 2 common polymorphisms in
CYP2C19 (*2 and *3). The main disadvantage
of the test is its price (± 500 euro per patient).
It is expected that these costs will decrease due
to a higher demand and mass production.
For detecting disease related genes ‘whole genome screening’ can be used. Commercially available kits based on hybridisation technology (Illumina®, Affymetrix®) contain more than 550 000
tagSNP’s evenly distributed across the genome
(1 tagSNP every 5.5 Kb). None of these arrays
covers all variation in the human genome, but
come close by using haplotype tagging SNP’s.
Influence on drug discovery
Pharmacogenomics can enhance drug discovery in two ways:
•Identification of new drug targets
•Subpopulation-specific drug development
Pharmaceutical companies are interested in carrying out smaller, less expensive trials using pharmacogenetics. Identification of a genetic variant
associated with drug response can lead to smaller
phase III studies involving only those individuals who
are more likely to respond that lead to improved
efficacy, decreased toxicity and less side effects.
Although pharmacogenomics could lead to smaller
treatment groups, the increased effectiveness of the
targeted drug could provide the pharmaceutical
industry more sales. The uncertainty about adverse drug reactions is reduced, encouraging many
more physicians to prescribe and patients to use
the drug.
Many genetic variants vary in frequency
among ethnic populations. If a marker for drug
response has a low prevalence in a certain population, that population might be excluded
from research or treatment.
An example is the drug BiDil, a combination
of isosorbide dinitrate and hydralazine.This drug
was not sufficiently effective in treating heart failure in two large ethnically mixed clinical trials.
But in a subpopulation of African Americans
BiDil decreased the risk of death by 43%. The
FDA approved this drug for a single racial group
(Service; 2005).
Conclusion
Pharmacogenetics constitutes a rapidly evolving research field. Thousands of studies are published annually with great promise. However,
incorporation of these discoveries in medical
practice has been slower than expected.
The implementation of these promising prospects are complicated by several factors. Diagnostics have to be changed in such a way that genotyping of relevant PK/PD systems is included. Who
will translate this kind of sophisticated information
to a prescribing physician? By now, proper dosing
and avoiding drug interactions is already a formidable task. The number of disease-targets will
become almost incomprehensible for the average
physician. That means that an incredible information dissemination barrier has to be solved. As a
result, we foresee that a new specialty will develop: genetic information specialist. Not aimed at
diagnosing inherited diseases but at inherited risk
factors and drug-treatment success-factors. And
last but not least: the costs of these developments
– both for diagnosis and for more individualised
drug preparations – will be impressive. There will
be no way to deny patients the results of these new developments because they may prove
highly efficacious and possibly also cost-effective
(although very costly on an individual basis).
Hospital pharmacists and other healthcare
professionals should be aware of the upcoming
developments and should prepare both for a
proper information structure and sufficient expertise to advise doctors in the rapidly approaching era of genetically based medicine (pharmacogenetics). And of course of the formidable
resources needed to pay for this.
Pharmacogenetics is a new cornerstone in
medicine!
Acknowledgement
We wish to thank M.L. Becker PhD and pharmacist, for critically reading the manuscript.
37
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4
Biología de las células madre
Antonio Bernard
Departamento de Cardiología Regenerativa
Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC)
Resumen
Dos características son definitorias de una
células madre (CM), permitiendo además diferenciarlas de la gran mayoría de las células
constitutivas de un organismo adulto: a) poseer
una capacidad muy importante de proliferación,
pero manteniendo su estadio indiferenciado (automantenimiento), y b) ser capaces de generar
progenie, perteneciente a varios linajes celulares
del organismo (pluripotencia). El control de su
capacidad de proliferación versus diferenciación
se produce en localizaciones especializadas, denominadas nichos, y alteraciones de este mecanismo básico pueden estar implicadas en muchas
patologías humanas. El potencial terapéutico
que encierra el concepto de célula madre –en
su conjunto– es enorme, pero debemos de ser
capaces de explotarlo adecuadamente.
Introducción
¿Qué es una célula madre? ¿Dónde podemos
encontrar las células madre? ¿Para qué sirven las
células madre en el individuo adulto? ¿Cuantas
tenemos? ¿Qué podemos esperar de la revolución tecnológico-terapéutica que se nos avecina? Buenas preguntas que tienen una respuesta
cambiante cada semana que transcurre.
El misterio de la vida se concreta, desde una
perspectiva meramente biológica, en cómo la
complejidad de un organismo se encuentra pre-
programada en un minúsculo embrión (zigoto).
Cuanto más ampliamos nuestro conocimiento
molecular y celular, más lejos nos parece estar
del maravilloso modelo de regulación (a corto, medio y largo plazo) que se encierra en esa
célula.
El zigoto, tras su implantación, y con la ayuda del ambiente propicio aportado por las estructuras maternas, desarrolla todo su potencial
biológico, generando una constelación estructurada de tipos celulares cuyo resultado final es
un nuevo organismo.
Durante los estadios tempranos del desarrollo embrionario se pueden identificar y aislar
células con capacidad «totipotencial», término
que se emplea para indicar que a partir de ellas
se pueden generar todos los tipos celulares del
organismo adulto. Estas células totipotenciales embrionarias se denominan células madre
(también conocidas como células stem –del
inglés–, o células troncales). En ratón, hace más
de 20 años (Martín, 1981; Evans et al., 1981;
Bradley et al., 1984) aislaron y caracterizaron
líneas celulares (fig. 1) con estas características
(embryonic stem cells, ES), obtenidas de la masa
interna de embriones en estadios tempranos
de desarrollo, denominado blastocisto (Bongso
et al., 1994).
La caracterización inicial de estas células madre permitió el establecimiento indefinido in vitro de líneas celulares capaces de dar origen a un
ratón indistinguible de sus congéneres, siendo
además capaces de trasmitir su información en
39
la línea germinal. Posteriormente se demostró
la posibilidad de su manipulación génica convirtiéndose en células clave para la generación de
modelos animales capaces de desarrollar enfermedades análogas a las presentes en humanos
para el estudio de enfermedades humanas y en
una herramienta insustituible para desvelar la
función de los genes in vivo. La trascendencia de
este cuerpo de trabajo para el desarrollo de la
biomedicina moderna ha sido reconocida mediante la concesión del premio Nobel de Fisiología o Medicina (2007) a los doctores Mario R.
Capecchi, sir Martin J. Evans y Oliver Smithies.
Sin embargo, el concepto de CM se origina
mucho antes (Ferrebee et al., 1958), y deriva
de los trabajos pioneros que permitieron desarrollar el trasplante de médula ósea y salvar
muchas vidas. La médula ósea es el órgano don-
Ovocito fertilizado (129Svj)
Línea de ratón manipulada
genéticamente:
• Estudios básicos
• Modelos de enfermedad
Transmisión
a línea
germinal?
Hembra seudopreñada
receptora CD I–blanco–
Blastocistos
Implantación
ES (129Svj)
Blastocistos (CD I)
Microinyección
o agregación
Masa interna
del blastocisto
Manipulación
genética/
caracterización
Línea de células ES (129Svj)
–pardo–
Figura 1. Esquema de la obtención de animales manipulados genéticamente mediante la utilización de
células stem embrionarias (mES).
40
de se producen las células sanguíneas a partir
de distintos «progenitores» mediante una organización piramidal (fig. 2) que, tras ejecutar un
complejo programa de desarrollo, originan los
cientos de millones de células funcionales que
necesita el organismo diariamente en su sangre
y órganos linfoides secundarios (donde madura
la respuesta inmunitaria).
El «truco» es que el funcionamiento de por
vida de este dinámico sistema (linfohematopoyético) está garantizado si se consigue mantener un pequeño número de células madre
(0,01-0,1% de la celularidad de la médula ósea)
alojadas en lo más íntimo de los huesos del individuo. Si conseguimos extraer y trasplantar
un número suficiente de estas células madre
hematopoyéticas, conseguiremos que el organismo receptor pueda reconstituir y mantener
su sistema linfohematopoyético totalmente funcional durante el resto de la vida. Estos trabajos
pioneros merecieron la concesión del premio
Nobel de Fisiología o Medicina (1990) a E. Donnall Thomas.
En este sentido amplio, y desde la década de
1960, el estudio del sistema linfohematopoyético y el transplante de medula ósea ha sido la
escuela donde se han creado y desarrollado la
gran mayoría de los conceptos que hoy día se
manejan sobre la biología y fisiología de las células madre. En términos generales, el trasplante
de médula ósea, la reparación de cartílago articular y el trasplante de piel artificial a grandes
quemados (fig. 3) se pueden considerar los verdaderos antecedentes de la actual revolución
en medicina megenerativa.
Definición
de célula madre
Las características más impor tantes que
permiten definir a las CM y diferenciarlas de
la gran mayoría de las células constitutivas
de un organismo adulto son dos. La primera
es que en condiciones de cultivo adecuadas,
Figura 2. Esquema de la organización piramidal del sistema linfohematopoyético.
41
tienen una capacidad ilimitada de dividirse;
así una CM es capaz de generar un número
inmenso de células, manteniendo sus mismas características –por el contrario, todas
las demás células de las que todos estamos
constituidos, las denominadas células somáticas, poseen un número limitado de divisiones (se calcula que sólo pueden dividirse
alrededor de cincuenta veces, al cabo de las
cuales mueren)–. La segunda es que las CM
son capaces de generar varios de los linajes
celulares de los que está constituido un individuo: células de corazón, de hígado, de riñón,
neuronas, músculo, etc.
Hasta el momento se han identificado células con características de CM de 4 orígenes
distintos: de origen embrionario, células madre
germinales, células madre procedentes de carcinomas embrionarios (terato-carcinomas) y
células madre procedentes de tejidos somá-
ticos, y aisladas de individuos adultos, las que
denominaremos CMA (células madre adultas).
En la actualidad, aunque todavía se encuentran
en fase de estudio y evaluación, estas fronteras
estrictas han desaparecido debido al desarrollo
de la tecnología de reprogramación genética.
Esto permite obtener células con propiedades
muy similares a las embrionarias (iPS; induced
Pluripotent Stem Cells) a partir de numerosos
tipos celulares adultos (p. ej., Park et al; 2008)
que incluyen fibroblastos, queratinocitos, MSC,
etc. Aunque las posibilidades abiertas son
enormes, quedan por resolver varios temas
técnicos y garantizar su bioseguridad. Pero aun
más interesante es el hecho de que con esta
misma técnica de reprogramación genética
se han conseguido obtener de forma directa
cardiomiocitos a partir de fibroblastos (Ieda et
al., 2010) Claramente, el sinfín de posibilidades
que se abren está aún por desarrollarse.
Medicina regenerativa: de la realidad clínica actual a un futuro prometedor
Transplante de médula ósea
Reparación cartílago
Piel. Quemados
Sistema linfohematopoyético
Figura 3. Antecedentes de la medicina regenerativa.
42
Hasta hace una década, las únicas CMA de
mamíferos cuya existencia había sido demostrada de forma concluyente eran las células madre hematopoyéticas (CMH, o HSC, del inglés
Hematopoietic Stem Cells), responsables de la
producción de todos los linajes sanguíneos. Se
postulaba la existencia de CMA en otros tejidos
altamente proliferativos, como la piel y el hígado, pero el concepto genérico de «célula madre
adulta» como tipo celular existente en todos los
tejidos es un paradigma bastante reciente. En la
actualidad, sabemos que la diversidad de CMA
equivale prácticamente a la variedad de tejidos
del organismo adulto. De hecho, probablemente
es mayor, pues algunos tejidos, cómo la médula
ósea, contienen más de un tipo de CMA.
En la división celular típica, las dos células hijas
generadas son equivalente entre sí y a la célula
progenitora de la que derivan (división simétrica). Posteriormente, las células descendientes
(progenie) pueden evolucionar por distintas vías,
bien siguiendo unos programas determinados
de diferenciación o bien pueden mantener su
potencial inicial. El mantenimiento de una relación adecuada entre la tasa de proliferación y diferenciación permite en la mayoría de los tejidos
establecer un control homeostático de su forma
d
d
p
d
y tamaño, evitando un crecimiento descontrolado que se asocia, p. ej., con los procesos tumorales. Por el contrario, las CM parece que están
reguladas por un mecanismo de división conservador (asimétrico), de forma que en su división
se genera una célula equivalente a la original y
otra que da cuenta del resto del programa de
diferenciación. Este mecanismo de «automantenimiento» (en inglés, self-renewal) permite controlar de forma estricta el número de CM que
existe en un determinado órgano (fig. 4).
Se ha asumido que las CM presentes en el
organismo adulto (CMA) deben de poseer, en
términos generales, un menor potencial que las
presentes durante el desarrollo embrionario y
fetal. Sin embargo, aunque en lógica es fácil asumir este principio, demostrarlo es mucho más
complicado. Además, al menos en el organismo
adulto, no todas las células madre de un órgano
participan activamente en el proceso de regeneración y mantenimiento de la funcionalidad.
Sólo unas pocas están contribuyendo de forma
simultánea a la creación de un tejido, en un momento dado. La mayoría se encuentra en un estado de reposo (conocido como quiescencia),
lo que las protege tanto de agresiones externas,
físicas o químicas, como del proceso de enve-
p
GI/S
División simétrica
d
G0
División asimétrica
Figura 4. Esquema comparativo de la división simétrica en comparación con la división asimétrica.
43
jecimiento celular. Cuando las CMA responsables en un momento dado de la regeneración
tisular agotan sus posibilidades, son sustituidas
paulatinamente por la progenie de otras nuevas.
Las nuevas células así generadas representan diferentes clones y el fenómeno responsable del
proceso se denomina «sucesión clonal».
En definitiva, una CM se define, funcionalmente, como una célula capaz de «automantenerse» (mediante el mecanismo de división
asimétrica) y con potencial de generar (mediante diferenciación de sus células descendientes)
varios linajes celulares (pluripotencia) o todo un
organismo (totipotencia). Por lo tanto, no todas
las CM son equivalentes y aunque la mayoría
de las veces se definen por su origen (embrionarias, adultas, etc.) no siempre estos términos
equivalen necesariamente a un mayor potencial
de desarrollo o, incluso, de potenciales aplicaciones biomédicas. Los mecanismos por medio
de los cuales ocurre esta diferenciación, los genes implicados y la posibilidad de incrementar la
eficiencia en su aislamiento y/o caracterización
constituyen una de las áreas más relevantes en
la actualidad de la biología y de la biomedicina.
Células madre adultas.
Tipos y origen
El origen embrionario de todos los tipos de
CMA es, en última instancia, el mismo que el de
los restantes tipos de células somáticas presentes en el organismo adulto, es decir, las células
pluripotentes de la masa interna del blastocisto.
Sin embargo, es muy poco lo que se conoce
de los precursores específicos de cada tipo de
CMA, más allá de la hoja embrionaria a la que
pertenecen (ectodermo, mesodermo o endodermo).
En el organismo adulto la inmensa mayoría
de sus células se encuentran en un estado, que
denominamos «postmitótico», en el que raramente se dividen y multiplican. Están ejerciendo
las funciones para las que han sido programa44
das y sólo en casos excepcionales (daños de
diversa índole) salen de su letargo y, en la medida que les permita su entorno y su propio
potencial, repararán el daño producido. A esta
regla general sólo escapan cuatro órganos que
se encuentran en una situación de alta actividad
fisiológica: a) la médula ósea, por la exigente demanda de células sanguíneas y mediadoras de la
respuesta inmune; b) las gónadas, que generan
constantemente células germinales; c) el hígado,
que tiene una gran capacidad de regeneración,
y d) los epitelios, sobre todos el intestinal y el
epidérmico, que están en una continua renovación. En los cuatro órganos existen poblaciones
con características de CM, específicas de tejido,
que dan justificación a dicho potencial. En los
últimos años el panorama respecto al cerebro
ha cambiado dramáticamente. Se creía que el
número de neuronas y la estructura cerebral
quedaba determinado en los primeros años de
vida, y que posteriormente sólo se producían
re-estructuraciones y perdida de conexiones
(plasticidad neuronal). Sin embargo, actualmente
sabemos que el cerebro es también un órgano
muy activo que puede generar nuevas neuronas (se ha estimado que puede llegar a producir
105 al día). Estas células tienen que producirse a
partir a células madre alojadas en el cerebro.
De manera transitoria, en el momento del parto una gran proporción de células hematopoyéticas se encuentran en la sangre contenida en el
cordón umbilical y en la placenta. Si se recoge
entonces adecuadamente la sangre placentaria
se puede obtener una población muy sustancial
de células madre hematopoyéticas, con la que
se han establecido los denominados Bancos de
Sangre de Cordón. Esta fuente es ideal para el
trasplante en niños o adultos de bajo peso con
enfermedades hematológicas severas.
Células madre linfohematopoyéticas (CMH)
Como ocurre con muchos otros aspectos de
su biología, el origen embrionario de las CMH
es el mejor estudiado de todos los tipos de
CMA. Desde principios del siglo XX se cree
que las CMH derivan de un precursor más primitivo, común con el linaje endotelial, al que se
denomina hemangioblasto, cuya existencia ha
sido confirmada por diversos estudios experimentales en distintos estadios de desarrollo
(Pelosi et al., 2002). La hematopoyesis se inicia
en el embrión de mamífero en el saco vitelino
(semana 5 de gestación en humanos; d7-7,5 en
ratón). Sin embargo, los precursores hematopoyéticos del saco vitelino sólo son los responsables de la hematopoyesis embrionaria, y no dan
origen posteriormente a las CMH presentes en
el adulto. De hecho, la capacidad de los progenitores primitivos (CD34+/CD117+) aislados del
saco vitelino para contribuir a la hematopoyesis
en adultos es limitada. Las CMH responsables
de la hematopoyesis definitiva en adultos se originan en la región del mesodermo denominada
aorta-gónada-mesonefros (AGM), derivada de
la esplacnopleura para-aórtica. Tras el saco vitelino, la hematopoyesis tiene lugar en el bazo,
hígado y nódulos linfáticos, hasta el momento
en que se desarrolla la médula ósea, que eventualmente asume la tarea de producir células
sanguíneas para todo el organismo adulto.
Las CMH de la médula ósea se hallan en
una concentración aproximada de 1 por cada
10.000 células mononucleares; también pueden
obtenerse de la sangre periférica, ya que son
capaces de abandonar la médula ósea y pasar
a la circulación sanguínea, en un proceso denominado movilización. Las CMH se caracterizan por su pequeño tamaño, una gran relación
núcleo:citoplasma, la ausencia de marcadores
de linaje (Lin-), un bajo marcaje con tintes vitales como Hoechst 33342 y la presencia de
varios marcadores de superficie, entre los que
se encuentran (humano): CD34, CD90, CD117
(c-kit) y CD133. Una población celular altamente enriquecida con CMH puede obtenerse mediante selección por citometría de flujo de células que expresan alguno de dichos marcadores
(tradicionalmente CD34). Sin embargo, ninguno
de ellos por sí solo, ni en combinaciones simples,
permite identificar específicamente una CMH.
CMA no-linfohematopoyéticas
El mayor problema actual al que se enfrenta
el biotecnólogo, el ingeniero genético o celular,
o el clínico, que pretenden utilizar CM con fines
terapéuticos, es que, en la mayoría de los casos (hay notables excepciones), estas CM una
vez extraídas de su entorno natural tienen una
gran tendencia a «diferenciar» perdiendo, total
o parcialmente, su «toti- o pluripotencia». Este
problema parece estar relacionado con el bajo
nivel de conocimiento de su regulación. En el
momento que obtengamos la información adecuada, se podrán mantener ex vivo en mejores
condiciones que permitan preservar su potencial, aspirando incluso a expandir su número
para llegar a situaciones óptimas para su aplicación clínica. Esto debería de ser posible para todos los tipos de CMA que se conocen (fig. 5).
Células madre mesenquimales (CMM)
Además de CMH, la médula ósea contiene
al menos otro tipo de CMA, denominadas células madre mesenquimales (CMM, o MSC, del
inglés Mesenchymal Stem Cells), las cuales son
células fibroblastoides precursoras de todos
los tipos de tejidos conectivos no hematopoyéticos (hueso, grasa, cartílago, etc.) (Pittenger
et al., 1999). Las CMM no se encuentran sólo
en la médula ósea, sino también en el estroma
de virtualmente todos los órganos, por ejemplo en el tejido adiposo subcutáneo (Zuk et al.,
2002) o el cartílago articular (De la Fuente et
al., 2004). Las CMM se obtienen generalmente
mediante selección por adherencia a plástico de
cultivo celular, pues son capaces de adherirse y
crecer en condiciones en las que otros tipos celulares habitualmente no proliferan. No poseen
ningún marcador específico, pero presentan un
perfil homogéneo y reproducible de antígenos de superficie, que habitualmente se define
como: CD9+/CD13+/CD29+/CD14–/CD34–/
CD44+/CD45–/CD90+/CD105+.
Debido a su relativamente sencilla obtención, su elevada capacidad de proliferación ex
vivo (a diferencia de las CMH) y a su amplio
45
Tejidos embrionarios o adultos
Tejidos extraembrionarios
potencial de diferenciación, las CMM son uno
de los tipos de CMA más empleados en terapia celular. Además, en determinadas condiciones experimentales, las CMM han mostrado
la capacidad de diferenciarse en linajes celulares no conectivos, tales como el endotelial y
el neuronal. Por último, una propiedad especialmente interesante de las CMM, es que son
capaces, tanto in vitro como in vivo, de inhibir la
respuesta inmunitaria (Rasmusson et al., 2006).
Esta capacidad de inmunorregulación incluye la
inhibición de la activación de células T, B, NK
y de la maduración de células dendríticas, así
como la protección frente a patologías inflamatorias y/o autoinmunes, incluido el rechazo
a trasplantes.
CM
Líquido amniótico
CM
Membrana amniótica
CM
embrionarias
Células madre epidérmicas (CME)
Fuera de la médula ósea, uno de los tejidos donde se suponía desde hacía décadas la
existencia de CM, dado su carácter altamente
proliferante, era la epidermis. En la actualidad
sabemos que existen células madre epidérmicas
(CME o EpSC, del inglés Epidermal Stem Cells)
al menos en dos localizaciones distintas. En primer lugar, en la membrana basal interfolicular se
estima que entre el 1 y el 2% de las células son
CME, con fenotipo p63+, las cuales son capaces
de generar queratinocitos que, al migrar hacia la
superficie, dan lugar a la formación de la epidermis (Pellegrini et al., 2001). En segundo lugar, en
el interior de los folículos pilosos, en concreto
CM
Sangre de cordón umbilical
CM
Cordón umbilical
CM
fetales
CM
adultas
Nacimiento
CM linfohematopoyéticas
CM mesequimales
CM epiteliales
CM neuroepiteliales
CM germinales
CM intestinales
CM neurales
CM de músculo esquelético
(satélite)
CM hepáticas (ovales)
CM endoteliales
CM cardiacas
CM pancreáticas
CM renales
CM de neumocitos
MAPC?
?
CM tumorales
Figura 5. Células madre. Origen, ontogenia y tipos.
46
en la región denominada bulge, se ha descrito la
existencia de una población de células madre
más primitivas, con fenotipo CD34+/queratina
15+/integrina α6+, capaces de dar lugar no sólo
a la epidermis propiamente dicha, sino también
a los folículos y a las glándulas sebáceas. En el
hombre, sin embargo, la identificación de las
CME interfoliculares resulta más difícil, y se han
propuesto varios fenotipos diferentes para las
CME del bulge, siendo uno de ellos CD200+/
CD34–/CD24–/CD71–/CD146– (Ohyama et
al., 2006). Al igual que ocurre con otros tipos de
CMA, existen estudios que indican que las CME
muestran plasticidad en determinadas condiciones experimentales (Toma et al., 2001).
Células madre neurales (CMN)
Al contrario que la médula ósea o la epidermis, ambos tejidos con una elevada tasa de
recambio (turnover) celular, el descubrimiento
de CM en el SNC constituyó sin duda una de
las mayores sorpresas de la biología en los inicios del presente siglo (Doetsch et al., 1999).
Las células madre neurales (CMN o NSC, del
inglés Neural Stem Cells) presentes en el cerebro adulto de mamíferos tienen su origen en
células de la cresta neural, y se localizan principalmente en la región subventricular y en la
región subgranular del giro dentado del hipocampo. El principal marcador de estas células
es la nestina, y su aislamiento se realiza mediante el cultivo celular en presencia de los factores de crecimiento EGF y bFGF, condiciones
en las que crecen en forma de agregados esféricos en suspensión, denominados neuroesferas. Los cultivos de neuroesferas permiten
obtener grandes cantidades de CMN, capaces
de diferenciarse tanto a neuronas como a glía
(astrocitos y oligodendrocitos).
Otras CMA
Las CM hematopoyéticas, mesenquimales,
neurales y epidérmicas son las más estudiadas
y mejor conocidas hasta el momento, pero no
son los únicos tipos de CM demostrados en
los tejidos somáticos del adulto. Otros tipos de
CMA que han despertado un especial interés
en medicina regenerativa son los siguientes:
•Células madre endoteliales. Se ha descrito la
existencia de precursores endoteliales (que
algunos autores consideran células madre)
tanto en médula ósea como circulantes (Asahara et al., 1997). Estas células están relacionadas con las CME y han despertado un gran
interés por sus posibles usos en el tratamiento de la patología isquémica.
•Células madre de músculo esquelético. Tradicionalmente se han denominado células
satélite, y se definen por la expresión del
factor de transcripción Pax3. En ratón se ha
demostrado que esta población posee el fenotipo CD34+/CD45–/Sca1– (Montarras et
al., 2005).
•Células madre pancreáticas. La evidencia experimental sugiere la existencia de uno o varios tipos de células madre en el páncreas. Las
CM capaces de diferenciarse a células beta
parecen ser células presentes en los islotes y
en los ductos pancreáticos positivas en neurogenina-3 (Seaberg et al., 2005).
•Células madre cardiacas. Diversos grupos han
comunicado en los últimos años el aislamiento a partir de miocardio de células capaces
de diferenciarse a cardiomiocitos, endotelio
y músculo liso, aunque aún existe controversia sobre su relevancia, origen y fenotipo. La
mayor parte de los trabajos identifican como
células madre cardiacas a las CD117+/Sca-1+
(Barile et al., 2007).
Por último, diversos trabajos han descrito la
existencia de CMA «pluripotentes» (o, al menos, con una extensa multipotencia) en diversos
tejidos de mamíferos. Destacan en este campo
los trabajos de la doctora Catherine Verfaillie,
en los que se describe el aislamiento a partir
de la médula ósea y otros tejidos de diversas
especies de mamíferos de células capaces de
diferenciarse tanto in vitro como in vivo a prácticamente todos los linajes celulares somáticos, a
las cuales denominan MAPC (Multipotent Adult
47
Progenitor Cells), y que son similares a las CMM
pero negativas para los marcadores CD44 y
HLA-I (Jiang et al; 2002). Dichos trabajos, sin
embargo, no han podido ser adecuadamente
reproducidos por muchos grupos y, en la actualidad, las MAPC se consideran en general
más como el resultado de algún tipo de modificación inducida por las condiciones de cultivo
ex vivo que como un tipo celular presente en
condiciones fisiológicas in vivo.
El concepto de nicho
y el control
de la autorrenovación
Las CM son, junto con las células tumorales,
las únicas células de mamíferos capaces de proliferar y mantener su potencial de diferenciación
indefinidamente. Esta capacidad de dividirse de
forma ilimitada para dar lugar a otras CM equivalentes a ellas es lo que se denomina automantenimiento o autorrenovación (self-renewal).
La autorrenovación es un proceso biológico
de enorme relevancia, pues encierra las claves
tanto de la regeneración y homeostasis tisular
como del desarrollo, el envejecimiento y el cáncer. A pesar de ello, nuestra comprensión de dicho proceso es aún muy limitada. La mayoría de
lo que conocemos acerca de los mecanismos de
autorrenovación se ha averiguado en el modelo
de células madre embrionarias (ESC, del inglés
Embryonic Stem Cells). En dicho modelo se han
identificado una serie de señales extracelulares
(LIF, BMP, FGF, etc.) que contribuyen a mantener
la expresión de varios factores de transcripción
(Oct4, Nanog, Sox2 y otros), los cuales a su vez
actúan como genes maestros que mantienen el
estado pluripotente de las células (Rao et al.,
2004). No se comprende muy bien el posible
papel de los mencionados genes de pluripotencia en la autorrenovación de las CMA, pero
todas las evidencias indican que son bastante
específicos de ESC y que la autorrenovación en
CMA es regulada principalmente por otros fac48
tores. Sin embargo, algo que tienen en común
los mecanismos de autorrenovación de todas
las CM, es que todos ellos dependen de un conjunto específico de señales extracelulares, que
es distinto para cada tipo de CM y que incluye:
señales solubles, tanto paracrinas como autocrinas, interacciones con la matriz extracelular, e
interacciones célula-célula. Según su efecto sobre las células, dichas señales mantenedoras de
la autorrenovación pueden clasificarse en:
•Señales de proliferación: inducen la división
celular.
•Señales de quiescencia: inducen la ralentización del ciclo celular en G0, estado en el cual
la célula puede mantenerse durante periodos
prolongados sin diferenciarse ni sufrir daños
genéticos.
•Señales inhibidoras de la diferenciación: contribuyen a mantener la expresión de genes que
inhiben los procesos de diferenciación celular.
•Señales de supervivencia: proporcionan una
señal sin la cual la CM entraría en senescencia/apoptosis, o bien protegen de la acción de
otras señales capaces de inducir dicha apoptosis.
El conjunto de todas estas señales que constituyen el microambiente especializado de una
determinada CM es lo que se denomina nicho.
El concepto de nicho, derivado de nuevo del
estudio del sistema hematopoyético (fig. 6) es
fundamental para la comprensión de la biología
de las CM.
En el nicho adecuado, las CM son capaces de
autorrenovarse; fuera de él, las CM se diferencian o mueren. Por tanto, las características del
nicho fisiológico son dominantes y controlan
el equilibrio proliferación/quiescencia/diferenciación, así como determinantes de la «expresión» de potencial que se le permite a esa CM
en dicha localización anatómica. Cada tipo de
CMA reside por tanto sólo en localizaciones
anatómicas muy precisas dentro del organismo,
donde se dan las señales que constituyen su correspondiente nicho. Este estricto control de la
autorrenovación es una de las diferencias esenciales entre una CM y una célula tumoral, la cual
no parecen presentar dichas restricciones.
Los nichos de algunos tipos de CMA han sido
localizados de forma precisa, y ya han sido mencionados anteriormente, como por ejemplo los
de las CME (capa basal de la epidermis y bulge
de los folículos), las CMN (región subventricular
y giro dentado) y las CM intestinales (fondo de
las criptas). En otros tipos de CMA, sin embargo,
la localización del nicho es aún poco precisa. En
el caso de las CMH, se ha descrito que se localizan mayoritariamente cerca de la superficie
ósea, pero también asociadas con el endotelio
sinusoidal (Wilson et al., 2006). Aún no se comprende bien la relación entre ambos tipos de
nicho, ni su probable función diferencial en la
biología de las CMH.
Las principales rutas de señalización reguladoras de la autorrenovación conocidas en CMA
son Wnt, Notch y Hedgehog (Blank et al., 2008).
Una característica común de todas estas señales
es que pueden regular la autorrenovación en distintos sentidos (induciéndola o inhibiéndola) dependiendo del contexto, y probablemente como
resultado de equilibrios cuantitativos. Así, por
ejemplo, la activación de Notch es esencial para la
autorrenovación de las CMH, pero en CMN puede promover tanto la autorrenovación en algunos
casos como la diferenciación a glía en otros.
La señalización por Wnt a través de la ruta
canónica (ß-catenina) promueve la autorrenovación en CMH, CMM, CMN, CME y en las CM
intestinales. Sin embargo, en las CMH la deleción de ß-catenina no afecta a la capacidad de
autorrenovación, por lo que, o bien la señaliza-
Autorrenovación frente a diferenciación («el nicho»)
Mφ
Self-renewal
TGF-ß
pEEDCK
–
Commitment differentiation
IL-I
TNF
etc.
IL-I
TNF
IL-6
+
–
+
ECM-b GF
+
CSF’s
SCF
IL-3
sGF
IL-6
mb-GF
IL-II
etc. IL-6
–
LIF
TGF-ß
etc.
CAM
Stromal cell
MSC
Figura 6. Definición y estructura funcional del «nicho» hematopoyético.
49
ción por Wnt no es necesaria, o bien señaliza
por medio de la vía no canónica en estas células.
De forma contraria, la acumulación de Wnt-3a
en el suero plasmático del ratón se ha asociado
recientemente al fenómeno de envejecimiento
fisiológico, al menos de las células satélite musculares (Brack et al., 2008)
Por su parte, Sonic Hedgehog también promueve el mantenimiento de las CMH, CMN y
CME. Al menos en las CMH, dicha actividad tiene lugar a través de un mecanismo dependiente
de BMP-4. La ruta de señalización de TGF-ß/
BMP (mediada por Smads) se ha estudiado
extensamente en CMH, y se sabe que TGF-ß
es uno de los más potentes inhibidores de la
autorrenovación de CMH. Debido al alto nivel
de redundancia de las proteínas Smad, su papel
en el automantenimiento de las CMA aún no se
comprende de forma completa.
Los programas genéticos específicos responsables del control de la autorrenovación de CMA
son considerablemente menos conocidos que
las señales extracelulares que los regulan. Hasta
el momento, los genes de autorrenovación mejor
estudiados en CMA pertenecen a la familia de
las proteínas Polycomb. Las proteínas del grupo
Polycomb (PcG) se asocian en grandes complejos que reprimen la trascripción de otros genes
mediante modificaciones de la estructura de la
cromatina. Entre los genes PcG se han identificado varios que participan en la regulación de la
autorrenovación de CMA. Entre ellos, el mejor
conocido es Bmi1 (Park et al., 2003), cuya expresión es necesaria para el mantenimiento de las
CME y CMN. Bmi1 promueve la proliferación de
las CMA principalmente reprimiendo la ruta de
senescencia celular inducida por p16Ink4a y p19Arf.
Plasticidad de las CMA
En los últimos 7-8 años ha existido una amplia
polémica, que todavía persiste en algunos extremos, sobre el novedoso concepto de la «plasticidad» celular, principalmente establecido sobre
experimentación realizada con CMH (fig. 7). Por
SNC
PEC (médula ósea)
Sistema nervioso
Tumor in situ
Célula oval
Hígado
Célula satélite
SCE
Músculo
Folículo
piloso
Criptas
intestinales
Figura 7. Plasticidad de células madre hematopoyéticas (CMH).
50
Queratinocitos-epidermis
plasticidad celular entendemos el fenómeno por
el cual una CMA, extraída de su nicho natural,
manipulada o no ex vivo, y trasplantada en otro
entorno fisiológico, es capaz de dar lugar a otros
linajes celulares no previstos según su programa
de desarrollo estándar.
En este proceso se han implicado diferentes
mecanismos, no totalmente clarificados, y que
incluyen dediferenciación, transdiferenciación
y reprogramación. Hoy en día algunos de los
postulados iniciales no se han confirmado, pero
otros sí (Rovó y Gratwohl, 2008). En la actualidad se está investigando la terapia celular con
CMH como posible procedimiento terapéutico
para el tratamiento de muy diversas patologías
no relacionadas con el sistema linfohematopoyético. Las principales aplicaciones en este sentido son la reparación/regeneración hepática y el
tratamiento de la isquemia.
La capacidad de las CMH para generar nuevas células hepáticas se ha demostrado en varios modelos animales de insuficiencia hepática
(Lagasse et al., 2000), y su posible aplicación en
clínica ofrece una importante promesa terapéutica en este tipo de patologías. Sin embargo, la
formación de nuevos hepatocitos no se debe a
la diferenciación de las CMH, sino a un proceso
de fusión de dichas células (u otros tipos derivadas de ellas, como los macrófagos) con los
hepatocitos preexistentes (Wang et al., 2003).
Este descubrimiento, no obstante, no invalida la
posibilidad de tratar eficazmente enfermedades
metabólicas o infecciosas hepáticas mediante
el trasplante de CMH, y se están investigando
activamente las propiedades biológicas de las
células resultantes de la fusión.
La isquemia cardiaca es otra de las patologías
que se está abordando mediante el trasplante de CMH. Los trabajos iniciales en roedores
(Orlic et al., 2001) promovieron el desarrollo
de numerosos estudios preclínicos y clínicos de
terapia celular motivados por la hipótesis de
que las CMH poseen una plasticidad suficientemente elevada cómo para transdiferenciarse
a células del linaje cardiomiocítico. Sin embargo,
estudios posteriores parecen descartar que di-
cha transdiferenciación tenga lugar en una proporción significativa en las condiciones experimentales habituales (Murry et al; 2004) aunque
la transdiferenciación in vivo se ha sustanciado
en diferentes estudios realizados sobre varones
que recibieron un trasplante de corazón cuyo
donante era una mujer, sin la aparente mediación de mecanismos de fusión (Angelini et al.,
2007). Por tanto, sigue la polémica. Por otra
parte, la posible capacidad proangiogénica está
siendo investigada en el tratamiento de la isquemia periférica (Pearce et al., 2008).
De forma análoga, el potencial de las CMH
para la transdiferenciación in vivo en células del
sistema nervioso central también se ha sustanciado en diferentes estudios realizados sobre
mujeres que recibieron un trasplante de médula ósea cuyo donante era un varón (Cogle
et al., 2007).
En definitiva, la plasticidad celular de diferentes CMA es una nueva opción terapéutica que
necesitará mucho más tiempo para ser evaluada
con solidez, lo cual no la descarta cómo plausible –aunque complicada en términos de eficacia– en algunas indicaciones.
Células madre
embrionarias humanas
Recientemente (Thomson et al., 1998; Reubinoff et al., 2000) se han conseguido las primeras
líneas de células madre embrionarias humanas
(hES), aunque por el momento las condiciones
de cultivo y expansión in vitro no están definidas al nivel de sus homólogas de ratón. No
obstante, dada la amplia experiencia que se ha
adquirido con las células ES de ratón (mES), el
mero hecho de su existencia ha abierto un gran
debate social y científico-ético sobre lo que
puede y/o debe ser investigado al amparo de
la financiación pública, y sobre reformas en las
leyes correspondientes que regulen la actividad
general y económica en torno a este nuevo potencial terapéutico.
51
Como hemos comentado anteriormente,
la gran ventaja teórica de partir de hES es que
éstas células deben de poseer el potencial (por
definición) de generar cualquier tipo celular humano. Esta premisa, sin embargo, es difícil de confirmar experimentalmente. De hecho, no existe
una prueba formal de que las células hES que se
manejan sean totalmente equivalentes a las mES;
en este sentido, ambas células tienen diferentes
requerimientos de crecimiento y parecen ser
bastante más inestables genéticamente (Baker et
al., 2007). Sin duda es necesario acumular mucha más experiencia sobre el comportamiento
de éstas células en cultivo, antes de plantearse su
empleo en procedimientos clínicos.
En todo caso, la utilización de hES obliga a controlar, de forma reproducible, su capacidad de diferenciación a células o progenitores del linaje celular de interés. Así, se han realizado avances muy
significativos (p. ej., Narazaki et al., 2008), aunque
también se ha evidenciado que la identificación y
caracterización de las células derivadas ha de ser
exhaustiva, ya que los marcadores simples que
sirven en células primarias somáticas, pueden no
ser equivalentes sobre estas células obtenidas artificialmente (Martin et al., 2008).
Finalmente, la utilización generalizada de técnicas basadas en hES obligaría a disponer bien de
un panel amplio de líneas celulares que pudiesen
cubrir los haplotipos más comunes en una determinada población humana, o bien a desarrollar
una tecnología eficaz para conseguir el clonado
terapéutico. Ninguna de las dos situaciones son
posibles en la actualidad, aunque pueden convertirse en una realidad (Cibelli et al., 2007). En todo
caso, el traslado de esta tecnología a ensayos clínicos requerirá muy probablemente el disponer
las líneas equivalentes en algún modelo animal
grande, cómo recientemente se ha conseguido
en el perro (Schneider et al., 2008).
La tercera vía
Se han identificado recientemente, tanto en
ratón como en el hombre, varias combinacio52
nes de genes cuya expresión exógena en una
célula diferenciada puede, por sí sola, promover
su reprogramación y desdiferenciación a célula
pluripotente (Takahashi et al., 2007). Este resultado ha sido ya validado por numerosos grupos
y abre definitivamente una nueva vía (la tercera
vía) para obtener células pluripotenciales humanas. Evidentemente, este nuevo tipo celular, iPS,
debe poseer muchas de las propiedades/cualidades de las hES, pero con la ventaja de poder
obtener «fácilmente» una línea autóloga de un
ser humano concreto. Los resultados relacionados con la inducción selectiva de diferentes linajes todavía es muy reducida, pero prometedora
(p. ej., Park et al., 2008), y habrá que acumular
más experiencia sobre estas células para evaluar
su interés final como dianas de procedimientos
de ingeniería tisular. En todo caso, la mayoría de
las reflexiones realizadas en el apartado anterior (hES) se aplicarían también a ésta nueva
opción terapéutica.
Una realidad incipiente.
Una nueva visión de algunas
patologías humanas
Hay que seguir alimentando el entusiasmo y
el soporte social que las nuevas posibilidades
terapéuticas basadas en la utilización de CM han
resucitado, pero manteniendo paralelamente un
gran rigor y una extremada cautela. Es necesario transmitir a la población la información de
forma equilibrada, y explicando que cualquier
avance significativo en el laboratorio tardará
más de 10 años en convertirse en una realidad
clínica establecida.
Las expectativas que generó en su día la
posibilidad de introducir en el organismo vivo
nuevas versiones «correctas» de los genes que
contenían mutaciones asociadas a enfermedades genéticas humanas (terapia génica) fueron
extraordinarias. La realidad sin embargo se
mostró mucho más exigente que la voluntad, y
han sido necesarios más de 25 años para que
los primeros beneficios clínicos (y no exentos
de problemas) hayan sido una realidad. Las consecuencias las hemos sufrido todos, incluyendo
investigadores, clínicos y pacientes. Sinceramente, esperamos que no ocurra lo mismo con las
infinitas posibilidades que la combinación de
terapia celular/génica pueden abrir al arsenal
terapéutico de la humanidad.
Debemos reconocer que aunque los avances
en el conocimiento de la biología de las CM
han sido enormes en la última década, todavía
estamos lejos de controlar completamente los
sistemas. Sin ir más lejos, en los últimos años
han surgido del genoma humano «nuevos jugadores» que eran completamente desconocidos en mamíferos hace unos años; nos estamos
refiriendo a los RNA de corto tamaño y no
codificantes (microRNA; miRNA) que parecen
jugar un papel importante en el control fino de
las transcripción/traducción (Garzon y Croce,
2008). Su papel en cáncer humano es indudable, pero su potencial papel sobre la biología de
CMA es todavía muy mal conocido. Por tanto,
debemos de ser humildes, y avanzar al ritmo
que el conocimiento básico nos permita, sabiendo aprovechar, al máximo, las opciones realistas
que existan en cada momento.
Por último, no todo son bondades en el nuevo universo de la célula madre, y su estudio nos
ha abierto los ojos a nuevos conceptos que
hace unos años eran pura especulación. Se ha
demostrado que ciertas poblaciones celulares,
originarias de la médula ósea, pero que pueden
pasar a la circulación en determinadas circunstancias, tienen un papel importante en el desarrollo de lesiones arterioscleróticas, así como en
el establecimiento de la vasculatura tumoral en
varios modelos. Los mecanismos moleculares
que activan esta movilización patológica de células madre no se conocen en detalle, pero esta
realidad fisiológica se está intentando explotar
para generar nuevas posibilidades terapéuticas;
precursores angioblásticos, aislados de sangre
periférica o de médula ósea, se intentan utilizar
como «vehículos celulares» para conseguir pro-
ducir biomoléculas de interés terapéutico en
zonas localizadas del cuerpo (tumores secundarios, pre-lesiones malignas o arterioescleróticas,
etc.). Estas estrategias de terapias combinadas
(celular-génica) están dando sus primeros frutos
en un nivel básico.
Más aún, una vieja teoría se va convirtiendo
en una realidad clínica día a día. Los tumores
sólidos son aglomeraciones de células muy heterogéneas genética y funcionalmente. En varios
modelos de tumores sólidos humanos se ha podido constatar que dentro de los tumores existe
una población muy minoritaria de células que es
la responsable de garantizar la propiedades del
tumor y su agresividad (su trasplante en modelos animales es capaz de reestablecer el tumor).
Esto ha reabierto la discusión sobre la existencia de las «células madre tumorales» (CMT o
CSC, del inglés Cancer Stem Cells), inicialmente
propuesto desde la hematoncología, y las implicaciones que esto tiene sobre la efectividad de
las terapias (Glinsky, 2008). La realidad es que
las células tumorales y ciertas poblaciones de
células madre poseen ciertas propiedades muy
asimilables y pueden estar relacionadas (fig. 8);
los próximos años nos depararán con seguridad
nuevas sorpresas y, probablemente, una nueva
visión de muchas de las patologías humanas.
Homeostasis
de los tejidos
y los órganos
Fisiología normal
Positivos
Negativos
Nuevas
Nuevas Células madre adultas
implicaciones
posibilidades
fisiopatológicas
terapéuticas
Cáncer (stem cells)
Figura 8. Equilibrios funcionales en células madre adultas.
53
Aislamiento celular/caracterización
Implantación
alogénica
Reimplantación
autóloga
Diferenciación controlada
¿ex vivo?
Cultivo
ex vivo
¿Biomateriales?
¿Modificación genética?
Expansión
ex vivo
Figura 9. Estructura de un ensayo de terapia celular típico.
Un futuro prometedor
El potencial terapéutico de las células madre
es enorme. Basta pensar en la cantidad de personas que todavía mueren a la espera de un
trasplante de órgano vital, a sabiendas que de
conseguir un donante adecuado, esto les ofrecería unos cuantos años con calidad de vida.
En otros casos, algunos órganos del paciente
sufren daños debidos a procesos traumáticos,
patológicos o causados por hábitos insanos,
que solamente pueden ser aliviados mediante
complejos procedimientos clínico-quirúrgicos.
La tecnología asociada a la manipulación de
células madre empieza a ofrecer un futuro en
todos estos campos. Poniendo por delante
que estamos hablando casi siempre de resultados obtenidos en modelos animales de experimentación (rata, ratón y, en el mejor de los
casos, cerdo) y que su traslado al ser humano es abismal, el futuro es muy prometedor.
Prácticamente a diario se hacen públicos en las
revistas científicas más prestigiosas resultados
espectaculares. Como ejemplo citemos solamente los primeros resultados de seguridad/
factibilidad (fase I) de empleo de células de
medula ósea (movilizadas a sangre periférica)
en el tratamiento del fallo hepático crónico
(Levicar et al., 2008).
54
Sin embargo, cualquier revolución técnica, y
no digamos médica, requiere su tiempo de acumulación de experiencia, reflexión y evaluación
en una muestra significativa de la población. En
todas las diferentes etapas implicadas en el desarrollo de cualquier aplicación clínica de CM
(fig. 9) se esperan avances significativos y, muy
probablemente, el formato de la producción
celular asociada a los ensayos clínicos en los
próximos años se parecerá poco a los actuales.
Démosle tiempo al tiempo y dejemos que este
valor absoluto ponga a cada uno en su lugar.
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55
5
Clinical applications of cell
therapy
José López-Barneo
Instituto de Biomedicina de Sevilla-Ibis
Hospital Universitario Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla. Sevilla
Cell therapy: a challenge
of translational medicine
Replacement of damaged organs, tissues, and
cells is one of the fundamental objectives of
modern medicine, and the last decades have
witnessed spectacular advances in organ/tissue transplantation and related disciplines (organ preservation, immunosuppression, patient
clitical care, etc). Within this field, cell therapy
still remains in its initial stages of translation to
medicine, although it is the area that should
profit more of the numerous developments in
cell biology occurred in recent years. It is over
forty years that cell therapy is applied routinely
in hematology to replace bone marrow cells
damaged by accidental irradiation, mutations,
or cancer. There have been also clinical advances in cell therapy related with other areas of
medicine such as skin or bone/cartilage replacement and regeneration. However, it is in the
neurological diseases where the promises of cell
therapy have probably created the highest expectations, as the ability of regeneration of the
mammalian central nervous system is null, or
very low. In addition, neurological disorders, and
particularly neurodegenerative diseases, have
high individual, social, and economic costs, thus
representing one of the major challenges of developed societies.
56
Cell therapy in diseases
of the central nervous
system; introductory
remarks
Many diseases of the central nervous system (CNS) are a consequence of the acute or
chronic loss of neurons and/or glial cells owing,
among other causes, to degenerative, toxic,
traumatic, ischemic or inflammatory aggressions.
Therefore, the replacement of damaged cells by
new ones has been considered as a potential
therapeutic strategy in these CNS disorders.
Neurologic cell-based therapy implies not only
the transplantation of exogenous tissues to repair or restore function (cell replacement), but
also the use of cells for the delivery of trophic
factors with a protective action on the neurons
affected by the ongoing pathological processes
(neuroprotection) (1-3). Routes of cell or tissue administration include direct intracerebral
grafting by open surgery or through stereotaxic
needles, as well as intrathecal or intraventricular delivery. Systemic intravascular (arterial or
venous) injections are used in some cases and
migration of the putative therapeutic cells to
the site of lesion has been reported. Another
plausible form of cell therapy is the activation
of pre-existing neuronal precursors located in
neurogenic centers (i.e. the subventricular zone
of the lateral ventricles or the dentate gyrus of
the hippocampus) that could migrate and differentiate to replace destroyed cells in some
parts of the brain. This possibility is speculative
at present and based solely on preliminary experimental observations (4, 5).
In theory, the ultimate goal of neurologic cell
therapy is the histological and functional integration of grafts within the neighboring brain parenchyma. In this regard, synaptic connections
between grafted neurons and the host tissue
have been described in experimental studies.
However, it has become evident that physiological restoration of the intricate synaptic circuits
of the brain cannot be achieved through the cell
replacement protocols currently used to treat
CNS disorders. In contrast, the beneficial effects
of transplants are, in most cases, a consequence
of gross anatomical or neurochemical modifications in the recipient organ. For instance, the
amelioration of parkinsonism after intrastriatal
grafting of dopaminergic tissue is due to the tonic
release of dopamine and/or trophic factors from
grafted cells which, respectively, activate dopamine receptors in neighboring neurons and induce
sprouting of the dopaminergic nigrostriatal fibers in the host brain.Therefore, the best results
of cell therapy are obtained in CNS disorders,
such as Parkinson’s disease (PD), with relatively
focalized lesions and affecting diffuse synaptic
circuits in which pre-post synaptic specification
is not an absolute requisite for the restoration
of function. At present, it is difficult to envisage
how therapies based on cell replacement or the
activation of preexisting neurons could restore
the delicate cortical and hippocampal synaptic
circuits underlying memory storage and retrieval extensively damaged in Alzheimer’s disease
patients. Other limitations of cell therapy derive
from the scarcity of cells/tissues that are appropriate for transplantation. Although autografts can be performed in some cases, the most
frequently used clinical protocols are based on
allo- or even xenografts, thus requiring immunosuppression treatment. Allotransplants are also
rendered difficult because the use of tissue from
human donors (i.e. human fetuses or embryos)
raises numerous legal and ethical issues.
Despite the limitations described above, cell
therapies have been successfully applied to the
treatment of neurological diseases for over two
decades. The pioneer studies, designed to treat
advanced PD patients with excellent results in
some cases, stimulated the development of the
field and were followed by a great deal of experimental and clinical work. These studies have
boosted the development of animal models of
numerous CNS diseases and the appearance
of well-defined clinical protocols to evaluate
disease progression. Nevertheless, the initial
enthusiasm derived from the results of open
trials has been tempered by the less spectacular
clinical outcomes of double-blind and placebocontrolled studies performed with large patient
cohorts. Recently there has been, however, renewed interest in the cell therapy field due to
the appearance of new cell sources, particularly
stem cells, with potential clinical applicability. Currently, there are numerous ongoing experimental and clinical transplantation studies designed
to test the therapeutic efficacy of several cell
types in a variety of neurological diseases, such
as PD, Huntington’s disease (HD), amyotrophic
lateral sclerosis (ALS), stroke, and spinal cord injury (SCI), among others.
This chapter aims to provide a general overview of the current status of cell therapies
applied to CNS disorders. After a concise update of the preclinical knowledge available, the
studies and techniques that have already resulted in clinical application are discussed in more
detail. In this respect, the chapter’s main focus is
PD, a prototypical neurodegenerative disease in
which the most solid and promising conceptual
and technological advances in neurologic cell
therapy have been tested. In addition, recent
developments related with cell therapy applied
to other CNS disorders (i.e. HD, ALS, stroke,
or SCI) are briefly addressed. The chapter ends
with a concluding summary and look at future
perspectives in the field.
Clinical applications of cell therapy
57
Cell therapy in Parkinson’s
disease
Pathophysiology and novel
therapeutic strategies in
Parkinson’s disease
Parkinson’s disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder of unknown etiology.
Although several genetic forms have been described (6) the majority of cases are sporadic and
unrelated to familial traits. PD is a major health
problem in developed countries, as it affects to
100-300 subjects per 100,000 inhabitants and up
to 3% of people older than 65 (7, 8). The motor
symptoms of PD (tremor, bradykinesia/hypokinesia, rigidity, and alterations of gait and posture)
are due to the progressive loss of dopaminergic
neurons in the substantia nigra (SN) and their
projections to the striatum (Figure 1). The degenerative process also affects other areas of the
CNS and the peripheral autonomic nervous
system, thus causing several non-motor symptoms, such as depression, cognitive impairment,
and autonomic dysregulation (9). Although the
progressive neuronal loss is a common feature
of all neurodegenerative diseases, a typical pa-
A
thological hallmark of PD is the appearance of
cytoplasmic inclusions, called Lewy bodies, containing synuclein and ubiquitin among other proteins. The mechanism of neuronal death in PD is
likely multi-factorial, involving a cascade of events
among which cellular oxidative damage appears
to have a prominent role (Figure 1). Selective decrease of reduced glutathatione, mitochondrial
complex I activity, and reactive oxygen species
(ROS)-destroying enzymes, or elevated concentrations of iron, which can act as a catalyst
for detrimental oxidative reactions, have been
reported within the parkinsonian SN. Similarly,
there is evidence of oxidative damage to lipids,
proteins and DNA in the brains and leukocytes
of PD patients. Inflammatory-related events, such
as nitric oxide-derived reactive species produced
by glial inducible nitric oxide synthase, appear also
to participate in SN dopaminergic degeneration
(10). Besides mitochondrial dysfunction and the
oxidative or inflammatory stresses, alteration of
protein-degrading mechanisms at the proteasome is an additional factor that participates in
PD initiation and/or progression. For example,
mutations in α-synuclein (a presynaptic protein
of unknown function that is deposited in Lewy
bodies) or in parkin (a ubiquitin ligase necessary
for protein identification by the proteasome) are
responsible for some forms of genetic PD (6).
B
Nigrostriatal pathway in mouse
Striatal dopaminergic terminal
MAO DOPAC + H2O2
DA
DAT
St
SN
DA
Figura 1. Dopaminergic nigrostriatal pathway. A) Mouse dopaminergic nigrostriatal neurons and fibers
stained using antibodies anti tyroxine hydroxylase. SN, substantia nigra; St, Striatum. B) Schematic representation of a dopaminergic presynaptic terminal. Uptake of dopamine (DA) and its metabolization to
dihydroxyphenyl acetic acid (DOPAC) and hydrogen peroxide (H2O2) are illustrated. DAT, dopamine
transporter; MAO, monoamine oxidase.
58
PD treatment relies mainly on L-dopa, a drug
that is converted to dopamine in neuronal somata and presynaptic terminals. L-dopa is normally complemented with the administration
of dopamine receptor agonists or inhibitors
of dopamine-degrading enzymes (monoamine
oxidase and catechol-o-methyl transferase).
Patients who develop disabling motor complications (motor fluctuations and dyskinesias)
or drug-resistant tremor can be candidates for
surgical implantation of electrodes for electrical
stimulation, these normally being placed at the
subthalamic nuclei. This methodology, consisting
of the application of high frequency (> 100
Hz) electrical pulses to inhibit neuronal activity, can correct the alterations of basal ganglia
circuits in the parkinsonian brain. Although the
current pharmacological and surgical therapies
are symptomatically effective, their long-term
utility is limited because they do not halt the
disease progression (11). Therefore, there is a
need for neuroprotective and/or neurorestorative therapies capable of arresting or reversing
the neurodegenerative process. Dopamine cell
replacement and the intracerebral administration of trophic factors are cell-based promising
therapeutic approaches currently subjected to
intense basic research and clinical evaluation.
Transplantation of dopaminesecreting cells. Preclinical
studies
Mammalian models of Parkinson’s disease
Development of research on CNS cell therapy depends on the existence of animal models
of the neurological diseases, where the effectiveness, advantages, and limitations of the various
therapeutic approaches can be tested experimentally. A brief description of the mammalian
models of PD available is given below.
A commonly used PD animal model is the
hemiparkinsonian rat, generated by unilateral
stereotaxic injections of 6-hydroxydopamine
(6-OHDA) either into the SN, the neighboring
medial forebrain bundle, or the striatum. In all
cases the drug is metabolically converted to dopamine and generates H2O2, which subsequently
kills the dopaminergic nigrostriatal neurons due
to oxidative stress (Figure 2). Unilateral destruction of the dopaminergic nigrostriatal neurons
produces a spontaneous rotational behavior
towards the side of the lesion (greatly exacerbated by administration of D-amphetamine)
that is easily monitored with a rotameter. As
the number of rotations is proportional to the
degree of SN lesion (and to the extension of
striatal dopaminergic denervation) this model
permits the experimenter to test the recovery
of the syndrome after striatal transplantation of
dopamine (and/or trophic factor)-releasing cells
(Figure 2) (12). The 6-OHDA model has, however, numerous limitations since it is generated
by acute oxidative damage to SN dopaminergic
neurons, a phenomenon quite different from
the chronic and progressive death of this neuronal population characteristic of PD. Moreover,
the direct mesencephalic injection of 6-OHDA
makes it difficult to obtain animals with partial
lesions, which are required to test neuroprotective therapies based on the trophic action of
the transplanted cells on nigrostriatal neurons
spared by the lesions or still unaffected by the
ongoing neurodegenerative process. In the last
few years there have been several attempts
to generate chronic rat PD models, although
their feasibility and reproducibility are still under
scrutiny. Chronic intravenous or subcutaneous
administration of rotenone (a membrane-permeable inhibitor of mitochondrial complex I)
seems to produce bilateral destruction of dopaminergic SN neurons with Lewy body-like
cytoplasmic inclusions. Similar results have also
been reported after chronic administration of
proteasome inhibitors. Unfortunately, the validity and reproducibility of this model (that initially raised great expectations) is being seriously
questioned (10, 13).
The monkey model of PD is also broadly
used owing, among other reasons, to the need
for testing in non-human primates most of the
59
cell therapy procedures destined for clinical use.
Monkeys are chronically treated by subcutaneous injections of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6tetrahydropyridine (MPTP), a drug converted
in the primate brain to 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP+) which, in turn, is taken up
selectively by dopaminergic neurons via the
dopamine transporter (Figure 1). As MPP+ is
a potent mitochondrial complex I inhibitor, its
chronic application leads to progressive dopaminergic cell death. MPTP has similar actions in
mice (see below) but is ineffective in rats since
they do not express the enzymes required to
convert MPTP into MPP+. In primates (monkey
and human) MPTP produces a bilateral parkinsonian syndrome with motor features similar
to those present in sporadic PD (10, 14). The
objectives of experimental cell therapy in par-
kinsonian monkeys are similar to those described above for the rat. Dopamine- or trophic
factor-releasing cells are normally deposited stereotaxically in the striatum (normally at several
locations in the putamen) and clinical recovery
is monitored with ad hoc behavioral tests. The
MPTP monkey is particularly useful to perform
unilateral striatal transplants since the contralateral striatum (injected with saline solution) can
be used as control. In these cases, the success
of the procedure results in unilateral histological
and clinical recovery, with the animals behaving
in a hemiparkinsonian manner hence showing
a typical rotational behavior towards the side
contralateral to the transplant (15).
Systemic administration of MPTP in mice
produces bilateral destruction of dopaminergic
nigrostriatal neurons (10, 16, 17). The parkin-
Nigrostriatal denervation in the hemiparkinsonian rat
Striatal reinervation after CB grafting
Figura 2. Hemiparkinsonian rat model and intrastriatal grafting of dopaminergic cells. A) Coronal sections at the level of the striatum (St) and the mesencephalon (SN, substantia nigra;VTA, ventral tegmental area) showing the normal (left) and denervated (right) nigrostriatal pathway. B) Striatal dopaminergic
reinnervation after transplantation of carotid body glomus cells (g, graft).
60
sonian syndrome in mice is less amenable for
behavioral analysis than the syndrome in the rat;
however mice are sometimes chosen because
MPTP administration requires no surgery and,
as in the case of primates, if unilateral transplantation is performed the contralateral side can
be used as an internal control. In addition, susceptibility to MPTP-derived toxicity can be studied in the numerous genetically modified mice
strains available. An acute MPTP mice model is
normally generated by subcutaneous injections
(single or distributed over 12-24 h) of the drug.
Chronic models, based on the continuous delivery of MPTP using subcutaneous pumps or
repeated injections, are being assayed in several
laboratories but results differ among the various
groups and animals strains.
There are several mouse genetic models in
which some of the genes altered in familial PD
(i.e. α-synuclein or parkin) have been transgenically overexpressed in an attempt to reproduce
the disease. So far, none of these genetically modified animals exhibit clear histological, neurochemical or behavioral signs of parkinsonism. Another PD mouse model is the one obtained after
genetic disruption of the glial cell line-derived
neurotrophic factor (GDNF) signaling pathway.
GDNF is the most representative member of
a family of trophic factors (called dopaminotrophic factors) that promote the in vivo and
in vitro survival of dopaminergic neurons (see
below). GDNF null animals die at early neonatal
stages due to kidney agenesia and alterations of
the enteric nervous system, although in these
animals both the SN and the striatum are normal. In adult life, the overall GDNF expression in
the central nervous system decreases drastically,
although high levels of GDNF are maintained in
some striatal neurons and glial cells, possibly as
a mechanism to aid trophic maintenance of the
nigrostriatal pathway. Heterozygous GDNF+/animals develop normally, although it has been
reported that they show a mild reduction of the
dopaminergic neuronal pool at advanced age.
Thus, it seems that abolition of GDNF expres-
sion (or function) in the adult mouse could serve as a good PD mouse model. Conflicting results have recently been reported regarding the
effect of c-ret (a transmembrane component of
the GDNF receptor) knock-out in adult life (18,
19). The conditional GDNF null mouse recently
generated in our laboratory has demonstrated
that striatal GDNF production is absolutely necessary for the survival of adult mesencephalic
dopaminergic neurons. These animals show an
extensive loss of cells in SN and VTA as well as
in the Locus coeruleus. They also have a clear
akinetic syndrome that ameliorates after L-dopa
administration (19b).
Preclinical transplantation studies
The first cell therapy studies in animal models
of PD were performed in the late 1970s in rats
using fetal rat dopamine-containing neurons as
donors with the aim of restoring striatal dopamine levels. In these investigations, improvement
of the functional deficits in parkinsonian animals
was paralleled by the survival of intrastriatal grafts and axonal outgrowth (20, 21). After this pioneer work, numerous studies have been performed in the last 25 years in an effort to address
the following main objectives:
I. To establish the effectiveness of different types of donor tissue on recovery from the
parkinsonian syndrome.
II. To test the survival of the transplanted tissue
and its histological integration within the host
striatal parenchyma.
III. To evaluate electrophysiological and neurochemical activity in grafts and the establishment of functional connections (synapses)
between the graft and the host brain.
IV. To determine whether immunosuppression
facilitates long-lasting cross-species transplantation of neural and non-neural tissues.
After the initial transplantation of mesencephalic tissue from rat embryo to rats, a step
further was the transplantation of mesencepha-
61
lic dopaminergic neurons, taken from mouse
embryos or human fetuses, to the dopaminergically denervated neostriatum of recipient rats,
and the use of primates with MPTP-induced
Parkinson-like syndrome as graft receptors (22).
At the same time, adrenal chromaffin cells were
used as an alternative dopamine source in PD
animal models, from rats to primates, although
with poorer results than those obtained using
embryonic or fetal dopamine neurons (23).
In parallel with these studies there have been
several reports from groups using porcine mesencephalic neurons with good results (24). Similarly, tissues in the peripheral nervous system,
other than the adrenal medulla, have been used.
In those studies, transplants of sympathetic neurons from the superior cervical ganglion were
performed in experimental animal models as
well as in humans (25).
Among the most promising new experimental approaches developed within the last few
years are the transplantation of retinal pigment
epithelial cells and of carotid body tissue. In
the first case, stereotaxic intrastriatal implantation of human retinal pigment epithelial cells
attached to gelatin microcarriers in rodent and
non-human primate models of PD produced
long-term amelioration of motor and behavioral deficits, with histological and PET evidence of
cell survival without immunosuppression (26).
In the second case, the autotransplantation of
dopaminergic carotid body (CB) cell aggregates was able to effect notable histological and
functional recovery in parkinsonian rats (27, 28)
and MPTP-treated monkeys (15). The CB is a
tissue particularly attractive for antiparkinsonian
cell therapy because it combines the properties
necessary for dopamine cell replacement and
for neuroprotection. The CB contains neural
crest-derived dopaminergic glomus cells, which
function as arterial oxygen sensors and release large amounts of dopamine in response to
hypoxia. Long-term recovery of parkinsonian
animals after intrastriatal CB grafting is induced
not only by the release of dopamine, but also
62
through a trophic effect on nigrostriatal neurons. In fact, adult rodent CB cells express much
higher GDNF levels than any other paraneural
cells studied (adrenal medulla, superior cervical
ganglion, Zuckerland’s organ and PC12). Moreover, GDNF expression by CB glomus cells is
maintained after intrastriatal grafting and in CBs
of aged or MPTP-treated animals (29) (Figure
3). Thus, glomus cells appear to be miniaturized
biological pumps useful for the local delivery of
GDNF and possibly other trophic factors.
Besides the transplantation of dopamineproducing cells, other experimental strategies
have been designed to directly increase the
striatal concentration of trophic factors that
could eventually induce regeneration of the
dopaminergic nigrostriatal pathway. Among
these studies Sertoli cells from the testis, amniotic epithelial cells or genetically modified
cells overexpressing trophic factors have been
used. Some of these trophic factor-producing
cell types have been assayed in conjunction
with dopamine releasing cells (i.e. cotransplantation of peripheral nerve plus adrenal medulla, and Sertoli or CB cells plus ventral mesencephalic neurons) (30).
After more than 20 years of preclinical research in antiparkinsonian cell therapy, the studies performed can be retrospectively classified
into three major groups:
I.Intrastriatal transplantation of heterologous
dopaminergic neurons to compensate for
the loss of intrinsic dopaminergic fibers. For
these studies, fetal mesencephalic neurons
were normally used and the establishment
of synaptic connections between the graft
and host neurons was considered a good
indication of graft survival and integration in
the recipient brain. More recently, fetal mesencephalic neurons are being substituted by
stem cell-derived dopaminergic neurons (see
Section 3.2).
II.Intrastriatal transplantation of dopaminereleasing cells (adrenal chromaffin, retinal or
carotid body cells) with the sole objective of
increasing the average level of dopamine in
the striatal parenchyma. Functional connections between the graft and host tissues were
not expected.
III.Intrastriatal delivery of cells releasing trophic
factors (carotid body, retinal cells, Sertoli or
amniotic epithelial cells or genetically modified cells), to encourage striatal reinnervation
through sprouting of the intrinsic nigrostriatal
neurons.
Over the years, interest has shifted from procedures that could be included in categories i/ii
to those included in category iii. In the initial stages, the limiting factors in cell therapy research
were graft survival and accessibility to an abundant dopaminergic neuronal source. Currently,
it is considered more important to determine
the mechanisms of action of the transplants to
Intrastriatally grafted carotid body cells
help better define the type of patient that could
eventually benefit from cell therapy.
Current developments using stem cells
Embryonic stem (ES) cells are generally thought
to offer a promising source of dopaminergic neurons suitable for PD cell therapy.They are characterized by a high proliferation rate and the potential to give rise in vitro to any cell type of the
adult organism (2). In recent years, the differentiation of mouse embryonic stem cells into dopaminergic neurons has been repeatedly obtained
in different laboratories following two different
approaches. One involves the co-culture of ES
cells with stromal feeder cells (PA6, MS5) that facilitates the induction of the neural fate. Another
approach implies a five-stage method based on
the formation of a three-germ layer structure, the
embryoid body, from which neural cells can be
selected. In both protocols, neural progenitor cells
Carotid body cells in situ
Figura 3. Maintenance of carotid body glomus cell phenotype in situ (right) and several weeks after
intrastriatal transplantation (left). Immunocytochemical staining using anti tyroxine hydroxylase antibodies (brown-yellow) and X-galactosidase (green). The X-gal signal indicates that the GDNF promoter is
active in these dopaminergic cells. See reference (29) for further details.
63
can be expanded and induction to the midbrain
dopamine fate can be favoured by exposing the
cells to appropriate morphogenetic factors (31,
32). Neuronal differentiation is normally triggered
by mitogen withdrawal, and the dopaminergic
phenotype is normally demonstrated by identification of the cells with markers such as tyrosine
hydroxylase and the dopamine transporter (Figure 4). Embryonic stem cell-derived dopaminergic
neurons are normally obtained from established
ES cell lines, however, dopaminergic neurons have
also been derived from embryos obtained by nuclear transfer or from induced pluripotent stem
cells (iPSC).
Striatal transplantation of previously specified
midbrain ES cell-derived neural progenitors cells
has been reported to provide surviving dopaminergic neurons in the host brain and render
histological, neurochemical and behavioral recovery of hemiparkinsonian rats (33, 34) (Figure 4). If ES cells are genetically manipulated to
overexpress the nurr-1 gene, dopaminergic neuronal differentiation is markedly increased and,
subsequently, a higher yield of surviving dopaminergic neurons is achieved upon grafting (33).
One major drawback of ES cell-based therapy
is tumor generation, however this possibility is
greatly diminished with appropriate differentiation procedures that eliminate all proliferative ES
cells from the transplanted preparation. Several
recent studies performed in non-human primate
and human ES cells have demonstrated the ability of these cells to differentiate into dopaminergic neurons. However, survival of transplanted
dopaminergic neurons, an absence of proliferative cells in the grafts, and consistent behavioral
recovery are issues that seriously compromise
the clinical applicability of human ES cell-derived
neurons. Identification of key factors determining the survival of human ES cell-derived dopaminergic neurons is an active field of research
for regenerative medicine (35).
Neural stem cells derived from fetal or adult
brain have been shown to differentiate into
dopaminergic neurons, although the yield is re-
64
latively poor due to their limited capacity for
proliferation and because of their preferential
glial differentiation. Different factors have been
used to increase the dopaminergic differentiation of neural stem cells with relatively modest
success, although good results are beginning to
be reported by some laboratories (35b). Bone
marrow stromal cells and umbilical stem cells
are also attractive sources of multipotent stem/
progenitor cells, currently subjected to intense
research, that could eventually be used for autologous transplants. However, the ability for dopaminergic differentiation of these cells is quite
limited. Neural crest-derived progenitors have
also been recently described in the carotid body,
which permit the adaptive growth of this organ
in chronic hypoxia. In vitro, these progenitors can
differentiate to dopamine and GDNF producing
cells, hence they could be used for transplantation studies in PD (35c). In summary, several
critical challenges need to be overcome before fetal, adult or autologous stem cells can be
brought into the clinical field to treat PD (35).
Transplantation of dopaminesecreting cells. Clinical studies
General overview
Transplantation of dopamine-secreting cells in
advanced PD patients was initiated in the mid
1980s. A summary of the transplantation procedures, with indication of the donor tissue and
current status of the technique, is given in Table
1. Despite the highly variable clinical outcomes
of these studies, with excellent results reported
in selected patients but only modest effects in
most cases, the overall benefit experienced by
the patients stimulated further research and clinical tests. Clinical trials resulting in a higher impact have been those employing adrenal medulla or mesencephalic neurons as donor tissues.
The first stereotaxic intrastriatal implantation
of autologous adrenal medulla on four patients
was performed, with modest results, by the Lund
group in 1985 (36). In 1987, a Mexican group reported excellent clinical results (not confirmed
by others) after transplantation by open surgery
of adrenal tissue into a cavity made in the caudate nucleus (37). These pioneer trials were soon
followed by numerous studies in several hospitals all over the world. These studies differed in
the surgical approach (open versus stereotaxic)
A
Embryonic stem cells
as well as in the procedures followed for adrenalectomy and the treatment given to the cells
prior to transplantation. All studies performed
were open, with few patients (3 to 20) and without blind evaluation. In most cases the clinical
efficacy of adrenal medulla autografts was very
modest with a lack of neurochemical improvement based on positron emission tomography
Neural precursor cells
Dopaminergic neurons
Oct-4
TH
Dapi
B
Grafting
Rotations
1.000
500
0
-500
-2
0
2
4
Weeks
6
8
10
Figura 4. In vitro differentiation of dopaminergic neurons from embryonic stem (ES) cells. A) Left, Colonies
of mouse ES cells. Undifferentiated state is proved by Oct-4 staining. Calibration bars: 100 µm and 50 µm,
in phase contrast and immunostaining, respectively. Center, Monolayer of ES cells-derived neural precursors. Neural identity is proved by nestin staining on cells adopting typical rosette disposition. Calibration
bars: 100 µm and 50 µm, in phase contrast and immunostaining, respectively. Right, ES cells-derived dopaminergic neurons (tyroxine hydroxylase,TH +). Calibration bar: 100 µm. 4´-6-diamidino-2-phenylindole
(Dapi) shows nuclear counterstaining. B) Left. Photograph of the transplanted rat brain illustrating the
localization of the graft in the striatum. The inset shows the dopaminergic identity (TH+) of the ES cellsderived grafted neurons. Calibration bars: 500 µm and 200 µm (inset). Right. Schematic representation
of the rotational behavior of hemiparkinsonian rats non-transplanted (red) and transplanted (green) with
ES cells-derived dopaminergic neurons. See further details in the text and reference (33).
65
Transplantation of fetal mesencephalic
neurons
(PET). Postmortem analyses have demonstrated
an almost complete absence of chromaffin cells
at the transplanted sites. Several groups have
reported that the viability of adrenal medulla
grafts and their clinical efficacy increased if the
cells were treated with trophic factors or cotransplanted with other tissues (i.e. peripheral
nerve) (38). The transplantation of adrenal tissue to treat PD has, however, been abandoned
due among other factors to the relatively high
morbidity/mortality associated with the dual
(abdominal and cranial) surgery and the development of other therapeutic approaches. The
most compelling alternative to adrenal autografts is the transplantation of fetal mesencephalic
neurons (see below), a technology that has dominated the clinical trials on cell therapy applied
to PD patients for the last 15-20 years.
The first intrastriatal transplants of human
fetal mesencephalic tissue in PD patients were
carried out by the Lund group between 1989
and 1991, stimulated by the good results obtained with the same methodology in preclinical
studies . Since some patients treated with fetal
cells showed long lasting clinical improvement,
this methodology was extended to other laboratories. In most cases the technique used was
the bilateral stereotaxic implantation of dispersed cells or tissue fragments in the caudate/
putamen. It is believed that this technique has
been applied in open trials to several hundred
patients although only about 50 have been carefully evaluated in the scientific literature (see
Tabla 1. Transplantation procedures in patients with Parkinson’s disease
Tissue
Adrenal medulla
Type of
transplantation1
First
report2
Spread
of the technique
Level
of development
& current status
Autologous
(36)
Worldwide
Abandoned
Homologous
(human fetal)
(37)
Single or few centers
Abandoned
Adrenal medulla &
peripheral nerve
Autologous
(38)
Abandoned
Mesencephalic tissue
Homologous
(human fetal)
(39)
Worldwide
Phase III studies3 in
progress
Heterologous
(porcine embryonic)
(40)
Phase III study3 in
progress
Retinal pigment
epithelial cells
Homologous (postmortem eye donors)
(41)
Phase III study3 in
progress
Carotid body cells
Autologous
(42)
Phase II clinical and
PET study completed
Sympathetic ganglion Autologous
cells
(43)
Open-label series
Type of transplantation. Autologous: transplantation of tissue obtained from the same patient. Homologous: donor tissue obtained from other
individuals of the same species. Heterologous: donor tissue obtained from individuals of different species. 2 First report. Refers to the first full
publications of outcomes in patients. 3 Phase III studies refer to double-blind placebo-controlled trials.
1
66
summary in Table 2). Although the transplantation methodology differs in the age and number
of donor fetuses, the preparation, storage and
dissociation of the tissue, and the protocol of
immunosuppression used, the clinical evaluation
of these patients has been more homogeneous
than in the case of adrenal transplants. Patient
evaluation was generally done with the Unified
Parkinson’s Disease Rating Scale (UPDRS) and
most assays followed the Core Assessment Program for Intracerebral Transplantations (CAPIT)
protocols (60). In the following sections we
summarize the clinical results and other relevant features of the main open studies and of
the two double-blind, placebo-controlled, trials
completed in recent years.
Tabla 2. Methodology of the main open-label trials on human fetal mesencephalic transplants
(see clinical outcomes in the text)
Country
(city)
Sweden
(Lund)
Ref.
n
Donors
N.o per
Age
hemisphere
Graft type/
technique
Location
of implants
IMS
Clinic
al followup
PET1
Necropsy2
(39, 44)
2
3-4
7-9 w
Cells C + P
Stereotaxic
Unilateral
6m
18 m
Yes
(–)
No
(45-47)
2
3-4
6-7 w
Cells
Stereotaxic
Unilateral
6m
3y
Yes
(++)
No
(48)
23
3-4
6-8 w
Cells C + P
Stereotaxic
Bilateral
12 m
2y
Yes
(++)
No
USA
(Denver)
(49, 50)
7
1
7-8 w
Cells or C + P Unilateral (2) 6 m (4)
strands of P
Bilateral (5) No (3)
tissue/
Stereotaxic
4y
Yes (+) (1) No
(–) (6)
USA
(New
Haven)
(51)
4
1
7-11 w
Tissue/
C
Stereotaxic
USA
(Tampa/
New York/
Chicago)
(52-54)
6
3-4
6-9 w
Tissue/
Stereotaxic
France
(Créteil)
(55-57)
5
2-3
6-9 w
Spain
(Madrid)
(58)
10
1
6-15 w
Tissue/
Open
surgery
C
USA
(59)
(Los Angeles)
13
1 (6)
≥ 2 (7)
6-9 w
Tissue/
Stereotaxic
P
P
Unilateral
6m
18 m
Bilateral (6-8
tracks/side)
6m
2y
Yes
(++)
Yes (+++) (2)
Cells C + P Unilateral (4)
Stereotaxic P Unilateral (1)
6m
1-3 y
Yes
(++)
No
Unilateral
Chronic
5y
No
No
Bilateral
18 m
6m
Yes
No
P
Yes (+) (1) Yes (+/–) (1)
Ref. (references): Publications where the results appeared. n: number of patients operated in the different trials. In other columns
the number of patients is given between parentheses. Location of implants: C: caudate. P: putamen. IMS: immunosuppression.
Other notations: w: weeks. m: months. y: years.
1
18F-dopa PET. Yes: at least some patients were studied. (−): no significant changes; lesser (+) or greater (++) increase in 18Fdopa uptake. 2 Necropsy. Yes: at least some patients were studied. Uncertain (+/-), minor (+), moderate (++), or major (+++)
graft survival and integration. 3 Two patients with MPTP-induced parkinsonism.
67
Clinical outcome. Open studies
The main methodological features of the
open clinical studies performed with heterologous implantation of mesencephalic neurons in
PD patients are summarized in Table 2. In most
trials the patients (between 2 and 13) suffered
advanced PD with motor complications, and
one study included two cases of MPTP-induced
parkinsonism. The surgical procedures are variable, with uni- or bilateral caudate and /or putaminal implantations. The clinical follow-up of the
patients varied between 6 months and 5 years
and in most cases included neurochemical evaluation with [18F]-dopa PET analyses. Despite the
methodological differences, all studies reported
some degree of motor improvement in most
Tabla 3. Methodology of the two double-blind placebo-controlled studies
on human fetal mesencephalic transplants (see clinical outcomes in the text)
Double-blind placebocontrolled trials
Denver/New York Group (61)
New York/Chicago/Tampa Group (62)
Patients
Transplant group: 20 (≤ 60 yrs: 10;
> 60: 10)
Placebo group: 20 (≤ 60 yrs.: 11; >
60: 9 )
Transplant group: 23 (1 donor: 11; 4 donors: 12)
Placebo group: 11
Follow-up
1 year
2 years
Loss of follow-up
1 (transplant group)
3 (group not specified)
Primary outcome
Subjective global self-rating of change
(scale from -3 to +3)
Change in UPDRS III
2
7-8 weeks
1 (11 patients); 4 (12 patients)
6-9 weeks
Graft type
Strands of tissue
(cultured up to 4 weeks)
Fragments of tissue
(stored in cool hibernation medium up to 2 days)
Surgical technique
Stereotaxic (bilateral in one stage)
2 twist-drill holes per side
Stereotaxic (bilateral in two stages)
1 burr hole per side
Location of implants
Putamen bilateral (4 tracks per side;
tissue deposited continuously)
Posterior putamen bilateral (8 tracks per side;
4 deposits per track)
Immunosuppression
No
Cyclosporine during 6 months
18
One year after surgery:
• mean increase in uptake (− in 3
patients)
• difference to placebo group
• no difference in ≤ 60 / > 60 years
groups
One and two years after surgery:
• mean increase in uptake
• difference to placebo group
• trend to a greater increase in the 4 donors
group
Necropsy1
2 patients (> 60 years): ++
2 patients (1 donor/side): ++
2 patients (4 donors/side): +++
Donors:
• N.o/hemisphere
• Age
F-dopa PET
III: motor sub-scale of the Unified Parkinson’s Disease Rating Scale. 1 Necropsy. See footnote of Table 2.
68
patients. In general, patients experienced an increase in the «on» period and improvement of
symptoms, particularly rigidity and bradykinesia,
in the «off» period. «On» dyskinesias were reduced in some patients but increased in others
(see «Complications» below). The clinical benefits of the transplants, perceived either immediately or around 3-6 months after the surgery,
reached a peak at approximately 1-2 years after surgery and then progressively disappeared.
There are, however, reports of persistent clinical
improvements 5 to 10 years after transplantation. In the few open studies that included controls the results reported are also quite distinct.
In the Los Angeles group study (Table 2) the
blinded evaluation of motor benefits was higher
in patients randomly assigned to receive more
tissue than a control group. However, the New
Haven group (Table 2) failed to see differences
between transplanted patients and a control
group of similar characteristics that received
only pharmacological treatment. In conclusion,
the open studies summarized in this section
represent hallmarks in the development of cell
therapy strategies to fight PD, although their
scientific value is limited because of the lack of
uniform analytical methodologies.
Clinical outcome. Double-blind studies
To progress in the evaluation of the clinical
applicability of fetal mesencephalic cell transplantation in PD, two double-blind, placebocontrolled studies have been performed in recent years. These are the first controlled phase
III clinical trials ever done to test a cell therapy
strategy applied to a CNS disease. The major
methodological features of these studies are
summarized in Table 3. Patients were subjected
to stereotaxic bilateral implantation of fetal tissue in the putamen. In the two trials a randomly
selected placebo group was subjected to sham
surgery consisting of craniectomy without duramater perforation. Both the patients and the
clinical evaluators were unaware of the type of
treatment (either «placebo» or «transplant»)
applied to each case. All patients were evalua-
ted pre- and post-surgically with [18F]-dopa PET
scans. The major objective of the studies was
the precise evaluation of «actual» symptomatic improvement of advanced PD patients after
transplantation. The trial of the Denver/New
York group (61) placed special emphasis on the
effect of patient age on the clinical outcome,
whereas the New York/Chicago/Tampa group
(62) focused on the clinical effects of transplantation of different amounts of tissue.
In the Denver/New York trial transplanted patients showed a statistically significant improvement of 18% in the UPDRS III scale in «off» with
respect to the placebo group one year after surgery. This improvement, affecting mainly rigidity
and bradykinesia, was due to the marked effect
of the transplants on patients below 60 years
of age (34% average improvement). The clinical benefit appeared during the first 4 months
and was maintained in open evaluations for up
3 years. More recent analysis of this patient cohort has suggested that the best prognostic factor was responsiveness to levodopa rather than
patient’s age. Fetal cell transplantation did not
induce significant changes in the diary of fluctuations, levodopa dose or cognitive function. In
the New York/Chicago/Tampa trial no statistically significant clinical differences in the UPDRS III
scale in «off» were observed between patients
of the transplanted and placebo groups two
years after surgery. There was, however, a trend
towards a clinical amelioration proportional to
the amount of tissue transplanted. Patients with
UPDRS III < 49 who received a larger amount
of tissue showed a statistically significant clinical
recovery with respect to the placebo controls.
In this last subgroup, the clinical effects were
perceived around three months after the surgery and reached a peak around 6-12 months.
There were no significant changes in the diary
of fluctuations or the levodopa dose.
Complications
In most of the transplantation trials done with
fetal mesencephalic tissue, the procedure was, in
general, well tolerated although some complicaClinical applications of cell therapy
69
tions associated with the cranial surgery were
reported. Intracerebral hemorrhages, epileptic
seizures, or postsurgical confusional syndromes
were the most frequent complications, normally
resolved after a few days of treatment. In one
case, patient death by hydrocephaly was reported due to migration of the transplanted tissue
to the fourth ventricle. In some patients transplanted with homologous fetal tissue, the administration of immunosuppressants has been
associated with renal dysfunction or nosocomial infections. Besides these complications, the
placebo-controlled studies have reported the
appearance in some transplanted patients of
severe and persistent dyskinesias (characterized
by stereotyped abnormal movements of the
limbs) during the «off» periods. In the Denver/
New York study this complication affected 15%
of the patients (younger than 65 years) that had
experienced clinical improvement. In the New
York/Chicago/Tampa trial, dyskinesias appeared
in more than 50% of the patients and were particularly severe in three cases. The «off» dyskinesias have been suggested to originate from
an excess of dopamine released from the transplant. However, no correlation between the
severity of the dyskinesias and the amount of
tissue transplanted or [18F]-dopa uptake in PET
studies (see below) has been reported. It has
been suggested that the dyskinesias reflect the
anomalous innervation of striatal cells by the
transplanted neurons, however it cannot be discounted that they are generated by other variables (i.e. tissue preparation) different from those
in previous open studies.
Neurochemical and histological data
The open trials testing the effect of fetal
neuronal transplants have generally included
the monitoring of striatal dopamine content
using [18F]-dopa PET scans (see Tables 2 and
3). Dopa (a dopamine precursor) is taken up
by the dopamine transporter in the nigrostriatal presynaptic terminals (Figure 1), as well as
in the soma and neurites of the transplanted
dopaminergic neurons. Therefore accumula70
tion of the marker (which results in a higher
amount of emitted radiation) provides an indication of striatal dopaminergic innervation.
Practically all the studies performed have reported an increase of [18F]-dopa uptake in the
transplanted area at one-year follow-up. In
one study synaptic release of dopamine in the
transplant was demonstrated by neuroimaging
using [11]C-raclopride, a drug that competes
with dopamine for binding to postsynaptic D2
receptors (63). In the two double blind-studies
[18F]-dopa uptake one year after the surgery
was significantly higher in the transplanted patients in comparison with the placebo group.
Thus, the neuroimaging data suggest that fetal
mesencephalic grafts survive for several years
after transplantation and remain neurochemically and functionally active.
In patients that died during the studies (generally for causes not related to the transplantation
procedure) and were subjected to necropsy, the
direct histological examination of the striatum
normally confirmed the in vivo PET data. These postmortem histological analyses have also
demonstrated that the surviving dopaminergic
neurons account for less than 5% of the several
hundreds or millions initially transplanted, which
suggests a marked mortality of donor cells during the transplantation procedure.
Current status of the methodology
and future developments
After almost 20 years of intense research,
the applicability of fetal mesencephalic tissue
for treatment of advanced PD is being seriously questioned. Besides the limitations of
this methodology already recognized in the
open studies (scarcity of donor tissue and poor
cell viability), the double-blind studies have suggested that the successful implantation of dopaminergic cells in the striatum is not sufficient
to induce significant clinical amelioration of
symptoms. The scarcity of donor tissue (several fetuses per patient) is heightened by ethical
and legal concerns regarding the use of human
embryonic material. Additionally, the dissection
and manipulation of fetal mesencephalic tissue
is technically difficult and results in a mixture
of different neural populations with a high incidence of cell death. The numerous attempts
to minimize these limitations have included the
treatment of cells with neurotrophic factors
or antioxidants as well as the use of porcine
mesencephalic tissue. Although both approaches have been tested in experimental animal
models as well as in open clinical studies with
some positive results, they have not provided
clear improvement with respect to the trials
utilizing human tissue. Porcine xenographs (40)
have been virtually abandoned because of the
danger of interspecies infections, although a
phase III clinical trial is in progress.
A major limitation of fetal mesencephalic tissue transplantation is the relatively poor clinical
effect of this procedure despite the fact that the
grafted dopaminergic cells remain neurochemically active. Therefore, it seems that the de novo
formation of an ectopic SN in the striatum (the
result of intrastriatal dopaminergic neuronal
grafts) is not sufficient to ameliorate PD patient
symptoms. In contrast, it seems that an excess
of dopamine or the establishment of aberrant
synaptic connections between the transplanted
cells and striatal neurons, might lead to severe
motor complications that, in terms of patient’s
life quality can be even worse than the manifestation of the disease.
The limitations and complications derived
from the use of fetal mesencephalic tissue have
led to the conclusion that, in its current state,
this procedure, although conceptually pioneering in the field, is not an advisable therapeutic
option for PD. Moreover, the double-blind placebo-controlled studies on fetal mesencephalic transplantation suggest that dopamine cell
replacement in the striatum is not the ideal
approach to compensate for the progressive
nigrostriatal neuronal loss. Given this scenario,
the clinical applicability of other transplantation
procedures based on a similar rationale (e.g.,
intrastriatal grafting of porcine mesencephalic neurons or stem cell-derived dopaminer-
gic neurons) is, for the moment, uncertain. It
is generally believed that other cell types and
methodologies, capable of delivering locally
the proper cocktail of trophic factors, might be
more effective in protecting the dopaminergic
nigrostriatal neurons from whatever insults
cause PD and to arrest or even reverse the
neurodegenerative process.
Recent pilot studies with other tissues
In recent years there have been numerous
attempts to evaluate the potential applicability
of dopamine-producing cells other than fetal
mesencephalic neurons for transplantation in
PD. In the context of this chapter the studies
done with carotid body (CB) and retinal cells
are particularly relevant since they have been
transferred from animal models to PD patients.
Transplantation of carotid body tissue
As described above, the CB is an organ composed of highly dopaminergic glomus cells whose efficacy for antiparkinsonian cell therapy has
been tested in animal models of PD (15, 27). A
priori, a major advantage of the CB with respect
to fetal mesencephalic neurons is that the former can be used for autotransplantation since
its unilateral surgical resection has no significant
side effects (42), thus circumventing most of the
limitations of fetal transplants. Intrastriatal CB
grafts can induce notable behavioral amelioration in parkinsonian rats and monkeys due not
only to increase of the intrastriatal dopamine
level but also to a trophic effect of the transplant on the dopaminergic nigrostriatal neurons
(28). In fact, CB glomus cells are among those
with the highest GDNF content in adult rodents
(29). The favorable results in preclinical studies
stimulated the execution of two pilot phase I/II
open trials to test the feasibility, safety and clinical efficacy of CB autotrasplantation in PD. The
experimental protocol in these studies consisted of the unilateral removal of the CB and
the preparation of cell aggregates, which were
bilaterally deposited at the putamen through
a stereotaxic needle (42) (Figure 5). Typically,
71
about 150-200 aggregates, with approximately
200 cells each, were obtained from a human CB
and, therefore the total number of cells transplanted was around 15,000-20,000 on each side
of the brain.
In the first CB trial, 5 of 6 PD patients showed
amelioration of the UPDRS III scale in «off» periods when blindly evaluated by an independent
neurologist using masked video recordings (42).
Clinical improvement was between 26-74% and
13-52% at 6 and 12 months of follow-up, respectively. The patient that did not receive any
benefit from the implantation had a fibrous carotid body with major absence of dopaminergic
A
glomus cells. In the long term a trend towards
the presurgical clinical status was observed,
although 3 patients still maintained a measurable motor improvement (15-48%) 36 months
after transplantation. A patient of this sub-study
who, for technical reasons, only received cells
in one side of the brain (although the needle
tracts were done bilaterally), showed clinical improvement only in the side contralateral to the
transplant. The clinical evolution of the patients
in the second sub-study performed by the same
group was essentially similar to that described
above (64). Patients of the second sub-study
were subjected to [18F]-dopa PET scans before
C
CS
CgS
Cd
1 mm
Th
B
Pt
STS
SNc
SNc
LS
Cd
DG
250 µm
Figura 5. Intraputaminal stereotaxic transplantation of dopaminergic cells in Parkinson disease patients.
A) Carotid body resected from a parkinsonian patient after it was cleaned of surrounding connective
tissue. B) Carotid body cells aggregates transplanted through a stereotaxic needle as illustrated in C. Pt,
putamen, Cd, caudate nucleus; Th, thalamus; SNc, substantia nigra pars compacta; SNr, substantia nigra
pars reticulata. See reference (42) for further details.
72
and 1 year after transplantation. This neurochemical analysis showed a non-significant 5% increase in mean putaminal [18F]-dopa uptake but
there was a significant inverse relationship between clinical amelioration and annual decline in
putaminal [18F]-dopa uptake. Complications of
CB grafting are similar to those reported for
other intracerebral transplantation procedures.
However, carotid body grafted patients, unlike
those subjected to fetal transplantation, do not
seem to develop off-period dyskinesias, which
might be related to the fact that they received a
much lower number of dopaminergic cells and
that the main effect of CB transplants is to stimulate intrinsic dopaminergic striatal reinnervation (42, 64).
The pilot studies performed have indicated
that CB autotransplantation is a feasible and
safe procedure with potential clinical applicability to treat PD patients. In addition, CB grafting
has demonstrated similar symptomatic efficacy
as the placebo-controlled mesencephalic grafts.
The beneficial effect of CB grafts is higher in
young patients with a well-preserved CB and
in individuals with a less severe disease. Altogether, these studies suggest that the clinical improvement observed after CB transplantation,
although modest, derive from a true neuroprotective effect of the transplanted glomus cells on
the nigrostriatal pathway. Nevertheless, at present, CB autotransplantation is not a methodology ready to be evaluated in large controlled
phase III trials until the characteristics of suitable
candidates and the objectives of the therapy
are clearly defined, and the origin and quantity of donor tissue are determined. Although
autotransplantation is conceptually attractive,
the amount of tissue obtained from a single CB
appears to be smaller than that needed to obtain significant clinical benefit consistently. The in
vitro expansion of CB tissue using either conditionally immortalized glomus cells or their differentiation from multipotent precursors (35c),
provides possible therapeutic strategies that will
surely be explored in future work.
Transplantation of retinal cells
The retinal pigment epithelium contains dopaminergic cells whose suitability for transplantation studies has recently been tested in animal
models of PD (26, 41). Good results in preclinical experiments led to the execution of an
open pilot study in six patients with advanced
PD. About 300,000 human pigment cells attached to gelatine microcarriers were grafted, without immunosuppression, into the most affected putamen of each patient. All subjects were
reported to have a clear improvement in the
UPDRS III motor scale in «off» periods that was
initiated during the first month of the surgery
and improved subsequently. Average reduction
of the UPDRS III score with respect to the basal
value was 48% at 12 months. No major complications or dyskinesias have been reported (65).
Therefore, allografts of retinal pigment epithelial cells seem to be well tolerated and clinically
effective in PD patients. The mechanism of action of these transplants is unknown, although a
recent study has proposed that, as for CB cells,
retinal cells could also release trophic factors
to support nigrostriatal neurons (66). This methodology is being evaluated in a double blind,
placebo-controlled study currently in progress
(Table 1).
Administration of trophic factors (GDNF delivery)
Neurotrophic factors are substances (generally proteins or peptides) that, among other
functions, regulate the differentiation and maintenance of neuronal phenotype. These factors
also protect neurons against cell death by apoptosis and/or exogenous pathological insults.
Numerous studies both in vivo and in vitro have
shown that mesencephalic dopaminergic neurons are sensitive to a variety of trophic factors
including the glial cell line-derived neurotrophic
factor (GDNF), brain-derived neurotrophic factor, neurotrophin 4, insulin-like growth factor,
fibroblast growth factor and platelet-derived
73
growth factor, among others. GDNF has consistently shown to exert the strongest and most
selective in vitro and in vivo trophic actions on
nigrostriatal dopaminergic cells (67). In animal
models of PD, GDNF can prevent neuronal degeneration and restore the striatal dopaminergic function (19b, 68-70). Depletion of GDNF
has been found in the SN of human PD brains,
which may constitute an additional pathogenic
mechanism of the disease.
Although all the precedents summarized in
the previous paragraph suggest that GDNF administration might be a valuable neuroprotective and neurorestorative therapy for PD, the
method of GDNF delivery into the striatum has
become a critical issue, since GDNF does not
cross the blood-brain barrier, diffuses poorly in
the extracellular environment and is easily destroyed by proteases. Different methods of direct
administration have been experimentally tested,
including intermittent injections, continuous
infusion, and implantation of GDNF-releasing
biodegradable microspheres (71). Intraventricular or intraputaminal GDNF administration
has been reported to promote structural and
functional recovery in advanced parkinsonian
monkeys (70). However, in a controlled clinical
trial, monthly intraventricular administration of
GDNF failed to provide clinical benefit in advanced PD patients but resulted in frequent adverse events (72). A post-mortem examination
in one patient suggested that GDNF did not
reach the target cells via this route. The safety
and clinical effects of a continuous intraputaminal GDNF infusion have been evaluated in two
open-label trials. An initial trial of a British group
on five PD patients reported encouraging clinical outcomes at one year, while [18F]-dopa PET
studies showed an increase in putaminal uptake
around the tip of each catheter (73). A second
American study on 10 patients using a different
delivery protocol also reported positive results
at six months (74). However, a randomized placebo-controlled trial involving 34 PD patients
showed no significant clinical differences bet-
74
ween groups at six months, despite increased
[18F]-dopa uptake in the recombinant GDNFtreated group (75). The open-label extension of
this study was halted due to safety concerns:
three patients developed neutralizing antibodies, which could potentially cross-react with
endogenous GDNF, while in a parallel toxicology study some monkeys developed cerebellar
damage.
In this context, research interest has focused
on other indirect methods of GDNF delivery,
such as cell therapy, i.e. the intrastriatal grafting
of GDNF-producing cells (CB or genetically
modified cells), and in vivo gene therapy using
GDNF-encoding viral vectors (71). CB cells
have already been tested in PD patients with
good results in less-affected and younger patients, this finding being compatible with the trophic action of the grafted tissue. Besides GDNF,
CB glomus cells also produce BDNF and other
factors, so they could supply damaged neurons
with the appropriate cocktail of trophic factors
to encourage nigrostriatal regeneration. Despite these stimulating results, the use of CB or
other cell types to deliver trophic factors in PD
patients is still under debate and experimental
evaluation.
Cell therapy in other CNS
disorders
Huntington’s disease
Huntington’s disease (HD) is a dominantly
inherited neurodegenerative disorder caused
by a polyglutamine expansion in the gene encoding the huntingtin protein. Its pathological
hallmark is the preferential loss of medium
size spiny GABAergic neurons in the striatum,
although degeneration progressively extends to
the cortex and other brain regions.The function
of huntingtin is unknown and the pathogenesis
of HD remains obscure. The disease is clinically
characterized by movement disorders (mainly
chorea), dementia and behavioral disturbances,
leading to progressive disability and death. The
relatively selective striatal damage at early stages of HD made this disease a potential target
for cell therapy shortly after the initial experimental work on PD. Animal (normally rodents)
models of HD are obtained by striatal neural
death-induction either with excitotoxic drugs or
after metabolic poisoning. There also transgenic
mouse models of HD expressing poliglutamine
repeat expansions. Numerous preclinical studies have demonstrated that transplants of fetal striatal cells survive in the host striatum and
induce reversion of the motor and behavioral
abnormalities. More recently, other donor tissues, such as neural progenitor cells, pre-differentiated GABAergic neurons obtained from a
neural stem cell line, or several types of trophic
factor-producing cells, have also been assayed in
rodent HD models (76).
Transplantation of human fetal striatal tissue
has been undertaken in a few open clinical trials
each involving each 4-7 mild to moderate HD
patients. A Core Assessment Program for Intracerebral Transplantation in HD (CAPIT-HD)
has been developed in order to standardize
the study protocols. Some bilaterally transplanted patients had small improvements in clinical
measures at one-year, which correlated with an
increase in the striatal and cortical metabolic
activity measured by PET. One autopsy study
performed 18 months after transplantation demonstrated surviving grafted cells innervated by
host-derived dopaminergic fibers (77). However,
in the long-term follow-up, a progressive clinical
and PET decline has been consistently observed
(78). Porcine xenografts have also been tried in
12 HD patients, with no change in functional
capacity one year after unilateral transplantation
(79). Although improvements in transplantation
procedures and patient selection could lead to
better outcomes, striatal cell replacement alone
seems unlikely to induce a long-lasting benefit
taking into account the progressive and exten-
sive nature of neurodegeneration in HD. In this
context, other strategies aiming to exert a neuroprotective effect on damaged neurons should
be further developed.
Amyotrophic lateral sclerosis
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a devastating disease characterized by progressive
upper (cortical) and lower (spinal) motor neuron degeneration.The absence of disease-modifying therapies has prompted experimental and
clinical research on cell therapy. Although the
etiopathogeny of ALS is unknown it seems that
alteration of redox regulation both in neurons
and astrocytes is a major cause of the disease.
In a minority of cases the disease is familial due
to a mutation (G93A) in the Cu-Zn superoxide
dismutase (SOD1), and overexpression of the
mutant human SOD1 in transgenic mice results
in a syndrome that resembles human ALS. Using
this animal model, several cell-replacement and/
or neuroprotective strategies have been tested
(80). Potential benefits have been advocated
after transplantation into the spinal cord of
hNT cells (derived from a human teratocarcinoma cell line), bone marrow cells, Sertoli cells,
neural precursor cells, astrocytes derived from
embryonic stem cells, or different genetically
modified cells to produce trophic factors. Intravenous administration of human umbilical cord
blood mononuclear cells has also been tried in
rodents with promising results.
Some cell therapy strategies have been assayed on ALS patients in small phase I-II clinical
trials: twelve subjects were subjected to intrathecal implantation of encapsulated genetically
engineered baby hamster kidney cells releasing
human ciliary neurotrophic factor (81), and seven patients participated in a study on intraspinal
cord implantation of autologous mesenchymal
stem cells (82). Although preliminary results of
the later study might be encouraging, the widespread nature of cell death in ALS (involving the
spinal cord, brainstem and cortex) is a daunting
75
challenge for focal cell replacement strategies.
On the other hand, diffuse trophic factor delivery from glial cells or combined approaches
(cell replacement plus growth factor delivery)
may show promise in modifying the course of
the disease.
Currently, numerous cell-based therapies for
ALS are being performed in institutions outside the academic environment without sufficient
scientific knowledge or medical control. The clinical outcome of these operations is not well
documented and therefore there is urgent need
of phase III (double-blind and placebo-controlled) studies to clarify the actual efficacy of cell
therapy in ALS.
Spinal cord injury
In recent years cell-based therapies have
been intensely studied to ascertain whether
they exert favorable effects on traumatic spinal
cord injury (SCI). Several groups have reported excellent results in animal models and some
pilot clinical studies are being performed. The
experimental strategies designed for cell therapy in SCI vary depending on the nature of the
lesion (complete or incomplete), and whether
the treatment is applied few hours/days (acute)
or weeks/months (chronic) after the lesion. In
the case of complete spinal cord lesions the ultimate goal is to induce neuronal regeneration,
a challenging but as yet unreachable scenario
that is worth pursuing since it is expected that
a significant functional recovery could be obtained even if only 1% of the severed axons are
replaced or regenerated. In incomplete spinal
cord lesions the functional failure is derived in
part from axons partially damaged by contusion, edema, or ischemia. In these cases neuroprotective measures can help to obtain axonal
re-myelinization and sprouting.
A variety of cell types tested in animal models
of SCI have shown considerable therapeutic
potential after intraspinal transplantation or following administration by other routes, such as
76
intravascular, intraventricular or intrathecal (83).
Schwann cells have been transplanted into spinal cord animal models based on the regenerative capacity of this cell type observed in the
peripheral nervous system. Similarly, olfactory
ensheathing glia, a specialized form of glial cell
able to promote regeneration of axons in the
olfactory nerve, have been tested, with some
success, for regeneration in spinal cord injuries
(84). Neural progenitor cells have been implanted in spinal cord animal models yielding behavioral recovery presumably due to neurogenesis
and synaptogenesis from the transplanted cell
preparation or from donor-host humoral interactions that may support regeneration of host
axons. Most of the effects exerted by either
neural or stem cell-derived progenitors appear
to be due to their preferential differentiation
to oligodendrocytes or astrocytes. In fact oligodendrocytes derived from human embryonic
stem cells have also been reported to myelinate
axon in foci of contused spinal cords. An entirely different approach relies on the capacity of
endogenous mesenchymal or immune cells to
provide axonal regeneration. With this objective
appropriately activated macrophages have been
shown to provide functional recovery.
Regarding the clinical application of cell therapy in SCI, several small phase I-II pilot studies
using various cells types have shown promising
but inconclusive results. Twenty patients with
acute (n = 7) or chronic (n = 13) SCI received autologous bone marrow transplantation
by intra-arterial (via catheterization of a. vertebralis) or intravenous route, with promising
results in the acute phase (up to 1 month after
injury) (85). Eight patients were subjected to
intraspinal injection of incubated autologous
macrophages within 14 days of injury, three
of whom achieved neurological improvement
(86). For the purpose of clinical applicability
a number of groups have demonstrated the
production of olfactory ensheathing glial cells
(OECs) by tissue culture of the olfactory epithelium obtained from biopsy samples of the
upper nasal lining. Others have used OECs
obtained from fetuses or cadavers. An initial
published clinical trial has shown no adverse
effects one year after transplanting autologous
cultured mucosal OECs into spinal injuries
(87). Two other neurosurgical teams (one in
Beijing and another in Lisbon), have adopted
transplantation of olfactory tissue as a clinical
procedure for treating patients with SCI. The
results from these groups are uncertain, not
well documented, and criticized by part of the
scientific community (84, 88). Apart from press
commentaries, no real breakthroughs in clinical achievements have been proved. Therefore,
validation of these and other procedures must
await the outcomes of independent randomized double-blind controlled trials that will surely be performed in the near future.
Stroke
Among neurological disorders, stroke represents a leading cause of death and disability in developed countries and despite intense research only a few options exist for the
treatment of stroke-related infarction of brain
tissue. Numerous preclinical experimental studies on cell therapy have been performed in
rodent models of stroke (endothelin-induced
transient middle cerebral artery occlusion or
collagenase-induced intracerebral hemorrhage), which include direct grafting of cells in the
infarcted area or surroundings as well as intraventricular, subarachnoidal, intra-arterial or intravenous cell administration. Among the cells
tested are adult stem cells from bone marrow,
umbilical cord and neural or adipose tissue,
as well as embryonic stem cell-derived neural (neurons and glial) cells. Some studies have
used engineered neural stem cells to produce
angiogenic factors (VEGF and others) as well
as the GDNF-secreting CB cells. In experimental stroke, cell therapy can partly reverse some
behavioral deficits. However, the underlying
mechanisms remain unknown as most studies
reveal little, if any, evidence for neuronal replacement and the observed behavioral improvements appeared to be related more to a graftderived induction of a positive response in the
remaining host tissue than to cell replacement
by the graft itself (89-91).
From a clinical standpoint the information
available pertains only to a few pilot studies
performed on a small patient cohort. The group
of Pittsburgh pioneered the clinical application
of cell therapy for stroke by performing stereotaxic implantation of human neuronal cell lines
with promising results. However, a controlled
randomized trial by the same group in patients
with ischemic or hemorrhagic subcortical motor strokes (treatment n = 14; control n = 4)
failed to show significant benefit in the primary
outcome measure (92). A study based on transplantation of fetal porcine cells was terminated
by the USA Food and Drug Administration
after the inclusion of five patients. Autologous
mesenchymal stem cell transplantation by intravenous infusion, which appear to migrate to the
site of the lesion, has also been tested in some
clinical trials. One of the most representative
studies is that performed by Bang et al. (93) on
five stroke patients and 25 controls. In this trial
the treated group achieved a better functional
outcome at six months compared with controls.
As indicated above, both the mechanisms of action of transplanted cells and their actual clinical
efficacy are still undetermined. Cell therapy in
stroke is a promising experimental approach
but for the moment not a realistic therapeutic
option.
Other diseases
Besides the preclinical and clinical studies
already discussed, cell-based neuroregenerative or protective therapies have been assayed
in several other neurological disorders. Neural
precursor cell transplantation has been shown
to attenuate the severity of experimental autoimmune encephalomyelitis, an animal model
77
of multiple sclerosis. Intraventricular transplanted cells migrated along white matter tracts and
seemed to down-regulate the acute inflammatory process and reduce axonal injury (94). A
different procedure, autologous hematopoietic stem cell transplantation, has been used to
treat patients with severe multiple sclerosis. In
a series of 178 patients, 63% were reported to
have neurological improvement or stabilization
at a median of 41.7 months after transplantation (95). However, a recent autopsy study on
five patients who received this transplant found
evidence for ongoing demyelination and neurodegeneration.
Hematopoietic stem cell transplantation, including umbilical cord blood transplantation, is
being currently under consideration as a possible therapy in young patients with storage
diseases such as mucopolysaccharidosis, mucolipidosis, leukodystrophies, Krabbe disease, TaySachs disease or neuronal ceroid lipofuscinosis.
Intracranial transplantation of neural stem cells
has recently shown striking beneficial effects in a
mouse model of Sandhoff disease, a lethal gangliosidosis (96). However, further basic research
in these areas is needed before the experimental data warrant the translation to patients of
safe procedures with reasonable and well-demonstrated clinical efficacy.
Conclusions
and perspectives
Although neuroregeneration and neurorepair
are concepts and goals intimately associated with
the development of modern neuroscience, it is
only in the last 25 years that experimental and
clinical studies have systematically addressed the
possibility of neural reparation by means of cell
therapy. Diseases of the brain and spinal cord
represent especially daunting challenges for cellbased strategies of repair, given the multiplicity
of cell types within the adult central nervous
78
system, and the precision with which they must
interact in both space and time. Nonetheless, a
number of diseases are, in principle, especially
appropriate for cell-based therapy, in particular
those in which single phenotypes are lost, and in
which the re-establishment of vectorially specific connections is not entirely requisite for therapeutic benefit. In recent years, the preclinical
and clinical studies on Parkinson’s disease initiated in the 1980s have been extended to other
neurological diseases, such as Huntington’s disease, amyotrophic lateral sclerosis, stroke, and
spinal cord injury, among others.
Originally, the goal of cell therapy was the
restoration of function by replacement of dead
cells with healthy ones. However, in most recent
studies the primary interest has shifted from cell
replacement to neuroprotection, in the hope
that application of the proper cocktail of trophic
factors released from cells grafted at the injured
sites or administered systemically would either
prevent neuronal damage or activate intrinsic
regenerative mechanisms leading to restoration
of the destroyed neurons or synaptic connections. The discovery of neurogenic centers in
the adult brain (in the subventricular zone of the
lateral ventricles and the dentate gyrus of the
hippocampus) has stimulated research on the
potential therapeutic applicability of pre-existing
neuronal precursors, which under appropriate
conditions could migrate and differentiate to
replace destroyed cells in other parts of the
brain. This possibility is, however, speculative and
only based on preliminary experimental observations. Recently, much attention has been
focused on the relevance of hippocampal neurogenesis to the pathophysiology and treatment
of mood disorders. Indeed all major pharmacological and non-pharmacological treatments for
depression enhance hippocampal neurogenesis
and suppressing hippocampal neurogenesis in
mice blocks behavioral responses in some antidepressant-sensitive tests.
Neurologic cell-based therapies have been
also much influenced by the development of
embryonic stem (ES) cell research, as these cells
have the potential to give rise in vitro to any cell
type of the adult organism. ES or iPS cells are
generally thought to offer a promising source of
neurons suitable for cell replacement therapy in
Parkinson’s disease and other disorders. Most
investigators in the field are, however, aware
that translation of ES/iPS cells to the clinical
setting is confronted with numerous limitations
and unsolved problems. Differentiation of ES/
iPS cells to mature neurons is still not well controlled and therefore the possibility of tumor
generation is high. In addition, the short lasting
viability of neurons derived from human ES(iPS
cells compromises their use in cell therapy. ES/
iPS cell-derived neuronal types may not possess
the complete set of phenotypic features of their
in vivo counterparts, which may contribute to
the limited success of these cells in repairing
injured or diseased brain and spinal cord in animal models. Hence, efficient generation of neural subtypes with correct phenotype remains a
challenge. Consequently, major hurdles still lie
ahead in applying human ES/iPS cell-derived
neural cells clinically.
Although cell therapy constitutes an actively
progressing research field, it is also the subject
of numerous criticisms and concerns. The scientific and technical advances being made are quite heterogeneous and erratic, as in many cases
transplantation studies are performed without a
precise knowledge of the putative therapeutic
products released by the cells, their mechanisms
of action, or even the type of cell transplanted.
Moreover, together with well-controlled pilot
clinical trials being performed in academic research environments, there are institutions offering cell-based therapies to heavily deteriorated
patients without having performed the necessary scientific preclinical studies and methodological (safety and feasibility) tests. In conclusion,
neurologic cell-based therapies still remain a
promise rather that a reality, and effective clinical
translation in this area will necessarily require a
period of sustained and solid basic research.
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83
6
Avances de la terapia génica
en el tratamiento
de enfermedades monogénicas
Juan A. Bueren
División de Hematopoyesis y Terapia Génica
CIEMAT y CIBER de Enfermedades Raras
Introducción
Los avances en el campo de la genética
molecular están teniendo una importante
repercusión en nuestra capacidad para comprender, diagnosticar y tratar variedad de
enfermedades congénitas y adquiridas. Así, la
posibilidad de introducir genes en células eucariotas ha permitido comenzar nuevos protocolos de marcado y de terapia génica (TG)
humana que no resultaban abordables hace
unos pocos años.
Tal como se muestra en la figura 1, la TG puede realizarse por medio de dos aproximaciones
diferentes. La primera, denominada «terapia génica de adición», se basa en la inserción del gen
terapéutico bajo el control de secuencias promotoras y potenciadoras de la expresión génica;
todos los protocolos de TG que actualmente se
realizan en la clínica utilizan esta aproximación.
La segunda, conocida cómo «terapia de sustitución», tiene por objeto la sustitución del gen
afectado por la versión correcta del mismo gen.
En ella, el gen introducido se encontraría en su
entorno natural y, por tanto, bajo el control de
los sistemas fisiológicos que regulan su expresión. Debido la baja eficacia de recombinación
homóloga actualmente conseguida en células
eucariotas, esta aproximación todavía no se encuentra en fase de aplicación clínica.
Desde el punto de vista práctico, la TG puede
realizarse tanto in vivo (inoculando el vector de
Terapia de adicción
Inserción génica
• Alta eficacia de inserción
• Inserción génica homo o heteróloga
• Limitaciones de regulación
Aplicable en terapia humana
Figura 1. Modalidades básicas de terapia génica.
84
Terapia de sustitución
Recombinación homóloga
• Baja eficacia de recombinación
• Precisa reparación génica
• Óptima regulación de expresión
No implantado en terapia humana
transferencia en el paciente) como in vitro. En este
caso, la transferencia génica se realiza sobre células
extraídas del paciente, las cuales, una vez modificadas genéticamente, son reinfundidas en él.
En general, los vectores de transferencia génica presentan una eficacia de transducción
notablemente superior cuando se utilizan in
vitro sobre las células diana a transducir frente
a cuando se inoculan in vivo. En una serie de
ensayos clínicos, no obstante, se utilizan protocolos de TG in vivo, en los cuales los vectores de
transferencia génica se introducen por vía sistémica o en los tejidos del paciente afectados por
la enfermedad (fig. 2).
La revista Journal of Gene Medicine (http://www.
abedia.com/wiley/index.html) ha reportado que
hasta junio de 2010 se habían puesto en marcha
un total de 1.644 ensayos clínicos de TG. Aunque
la mayor parte de estos protocolos han tenido
Terapia génica ex vivo
como objeto el tratamiento del cáncer (64,5%),
los resultados más significativos han estado relacionados con el tratamiento de enfermedades
monogénicas. Tal como puede observarse en la
figura 3, de todos los vectores utilizados, los retrovirales (gammarretrovirales) y los adenovirales
son los de uso más frecuente en estos ensayos.
No obstante, ya se observa la puesta en marcha
de un total de 27 ensayos (1,7% del total) con
vectores lentivirales, propuestos como una nueva
familia de vectores de mayor seguridad y eficacia
respecto a los retrovirales.
El fundamento para la utilización de vectores virales es el de aprovechar su gran capacidad infectiva y, en algunos casos, de integrar
su genoma en la célula huésped, eliminando
su potencial replicativo en la célula infectada
(transducida). El virus modificado (vector) sólo
será capaz de llevar a cabo un único ciclo de
Terapia génica in vivo
Medidas modificadas genéticamente
Vectores de transferencia génica
Tipos de medicamentos génicos
Figura 2. Modalidades básicas de terapia génica.
Avances de la terapia génica en el tratamiento de enfermedades monogénicas
85
Indications addressed by Gene Therapy Clinical Trials
Vectors used in Gene Therapy Clinical Trials
Adenovirus 23,8% (n = 400)
Retrovirus 20,5% (n = 344)
Naked/Plasmid DNA 17,7% (n = 304)
Vaccinia virus 7,9% (n = 133)
Lipofection 6,5% (n = 109)
Poxvirus 5,5% (n = 93)
Adeno-associated virus 4,5% (n = 75)
Herpes simplex virus 3,3% (n = 56)
Lentivirus 1,7% (n = 29)
Other categories 4,9% (n = 82)
Unknown 3,3% (n = 55)
Cancer diseases 64,5% (n = 1.060)
Cardiovascular diseases 8,7% (n = 143)
Monogenic diseases 8,2% (n = 134)
Infectious diseases 8% (n = 131)
Neurological diseases 1,8% (n = 30)
Ocular diseases 1,1% (n = 18)
Other diseases 2,4% (n = 40)
Gene marking 3% (n = 50)
Healthy volunteers 2,3% (n = 38)
Figura 3. Distribución de los ensayos clínicos de Terapia Génica por indicaciones y vectores.
Criterios para definir
el vector de transferencia
a utilizar
infección, lo que le permitirá actuar como vehículo seguro del gen terapéutico. Todos los
elementos necesarios para que el vector terapéutico pueda empaquetarse e infectar las células diana son aportados con las denominadas
líneas celulares empaquetadoras. En la figura
4 se muestra un ejemplo de cómo modificar
un gammarretrovirus para producir un vector
gammarretroviral.
El éxito terapéutico de la TG depende fundamentalmente de 3 cuestiones. En primer lugar,
resulta necesario insertar eficazmente el trans-
env (SU)
LTR
env (TM)
Gag
Pol
Env
LTR
gag
(matriz)
gag
(cápsida)
RNA
pol
LTR
Ciclo de infección del retrovirus MoMuLV
Generación de células empaquetadoras
de vectores terapéuticos
Célula productora
de vectores retrovirales
Ensamblaje
Fusión
de membranas
ARN
ARN
ADN
Integración
Citoplasma
PROT
LTR
Gen terapéutico
mRNA
ARN
Integración
Núcleo
ADNbc
Núcleo
ARNm
ARNm
ARNm
Vector retroviral
terapéutico
Figura 4. La Manipulación Genética de los Retrovirus: De virus patogénico a medicamento génico..
86
gén terapéutico en las células diana deseadas;
por otra parte, también es necesario que el gen
se exprese en cantidad suficiente y durante el
tiempo suficiente para que se obtenga beneficio clínico, y, por último, como en todo medicamento, la eficacia terapéutica de la TG viene
limitada por la relación entre el beneficio clínico
que produce y los riesgos que conlleva.
En el caso de enfermedades asociadas a defectos monogénicos resulta evidente que la curación de la enfermedad sólo se obtendrá cuando
las células de los tejidos afectados tengan acceso
permanente a niveles umbrales de la proteína
deficitaria. Una de las aproximaciones más directas para lograr este objetivo se fundamenta en
la transducción de la población celular afectada,
o de sus células progenitoras, con vectores que
permitan la integración estable del transgén en el
genoma celular. En los protocolos clínicos diseñados al efecto se han utilizado fundamentalmente
vectores gammarretrovirales, en particular los
derivados del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV). Como ya se ha indicado, los vectores lentivirales constituyen una herramienta de
reciente aplicación en el campo de la TG, ya que
permiten la integración del transgén en células
quiescentes y ofrecen una mayor seguridad en
comparación a los vectores gammarretrovirales.
Estudios y ensayos
clínicos representativos
sobre los beneficios y
limitaciones de la terapia
génica actual
Hasta que los laboratorios de genética molecular ofrezcan alternativas eficaces para el tratamiento de mutaciones dominantes, el tratamiento genético de las enfermedades monogénicas
se está centrando en las que están asociadas a
mutaciones monogénicas recesivas, en las cuales
la expresión de una copia funcional del corres-
pondiente transgén pueda ser suficiente para la
curación de la enfermedad.
En las patologías en las que no es posible o
no es del todo eficaz la administración exógena de la proteína deficitaria, se han planteado
alternativas de terapia celular o génica sobre
estos pacientes. En la actualidad existen unas 30
enfermedades monogénicas que habitualmente
se tratan mediante trasplante de progenitores
hematopoyéticos procedentes de donantes histocompatibles sanos. Puesto que en promedio
sólo 1 de cada 3 pacientes posee un donante familiar HLA idéntico, y debido a los riesgos
asociados al trasplante alogénico a partir de donantes alternativos, se considera una larga serie
de enfermedades monogénicas candidatas a ser
tratadas mediante TG.
A continuación se muestra el fundamento de
algunos de los protocolos de TG de enfermedades monogénicas que han sido más relevantes, bien por su eficacia terapéutica, bien por
las dudas levantadas respecto a los riesgos que
entraña esta nueva alternativa terapéutica.
Inmunodeficiencia ADA
Entre las enfermedades que primero se consideraron para su tratamiento génico destacan
las inmunodeficiencias severas combinadas
asociadas a mutaciones en los genes adenosina
deaminasa (ADA-SCID) y gamma-c, asociado a
la inmunodeficiencia X1-SCID. La ausencia de
ADA implica una acumulación celular del sustrato desoxiadenosina trifosfato, lo cual resulta particularmente tóxico en los linfocitos T (fig. 5).
Adenosina
Deoxidante
↑ dATP
Iosina
ADA
Deoxiinosa
Figura 5. Esquema del fundamento bioquímico
de la inmunodeficiencia severa combinada ADA.
87
Ésta fue una de las primeras patologías en ser
tratadas mediante TG con vectores retrovirales, primero en el National Institutes of Health
(NIH) de Estados Unidos [1, 2], y luego en el
Hospital S. Raffaelle de Milán [3-5]. Las alternativas que se consideraron para el tratamiento
genético de esta enfermedad tenían por objeto
la transferencia del gen ADA en los linfocitos T
de los pacientes o en las células madre hematopoyéticas (CMHs). En todos los casos se comprobó la presencia de células corregidas genéticamente en la sangre de los pacientes, aunque
tan sólo se obtuvieron modestas evidencias
de beneficio clínico. Los mejores resultados se
han obtenido recientemente por los grupos de
Milán (A. Aiuti) y de Londres (B. Gaspar y A.
Thrasher): utilizando un protocolo en donde se
retiró la administración de la proteína ADA, los
Acondicionamiento
submieloablativo
pacientes se acondicionaron con un tratamiento submieloablativo previo a la perfusión de las
células CD34+ transducidas con vectores gammarretrovirales portadores del gen ADA [5,
6]. El esquema básico seguido en estos ensayos clínicos es el que se muestra en la figura
6: se extrajeron células de la médula ósea de
los pacientes, se purificaron las células CD34+
y se transdujeron con los vectores terapéuticos;
finalmente, la población conteniendo las células corregidas genéticamente fueron perfundidas en los pacientes tras su acondicionamiento
con dosis submieloablativas de busulfán (fig. 6).
La gran mayoría de estos pacientes mostraron
beneficios clínicos incuestionables, sin que en
ninguno de ellos se produjeran efectos adversos graves. Este protocolo constituye uno de
los ejemplos más significativos de la eficacia y la
Recolección de células
de médula ósea
Infusióndel inóculo corregido
genéticamente
Selección de células
CD34+
Transducción con vectores
terapéuticos
Figura 6. Esquema básico del protocolo utilizado para la terapia génica de la inmunodeficiencia ADA-SCID.
88
IL-7R
IL-4R
a
a
γc
JACK3
IL-2R
b
γc
J3
γc
J3
a
J3
py-stat
NÚCLEO
Activación génica
Figura 7. Señalización defectiva por receptores de citoquinas en inmunodeficiencia X1-SCID.
Inmunodeficiencia X1-SCID
Ésta inmunodeficiencia representa aproximadamente la mitad de todas las inmunodeficiencias graves combinadas y está asociada a un
defecto en la cadena γc, una proteína que forma
parte de numerosos receptores de interleucinas (fig. 7).
La TG de estos pacientes también se ha realizado mediante la transferencia del vector terapéutico a células CD34+, en este caso sobre
pacientes que no recibieron acondicionamiento
alguno. En el 90% de los pacientes se observó reconstitución del sistema inmunitario con
células que contenían el gen terapéutico y una
evidente mejoría clínica, que, como en el caso
anterior, permitió que los pacientes abandonaran las unidades de aislamiento a las pocas
semanas del tratamiento [7]. Se considera que
este protocolo, desarrollado en Francia por A.
Fischer y M. Cavazzana-Calvo, es el primer protocolo de TG de una enfermedad monogénica
que ha demostrado eficacia terapéutica incuestionable (fig. 8). El equipo de Adrian Thrasher,
en Londres, ha obtenido resultados similares en
cuanto a la eficacia terapéutica del proceso [8]
9.000
P5
8.000
7.000
Linfocitos T/mcl
seguridad que la TG puede ofrecer a pacientes
con enfermedades monogénicas.
6.000
P8
5.000
P7
P4
4.000
3.000
P1
P9
P2
2.000
P6
1.000
P10
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Meses después de la terapia génica
Figura 8. Rescate de la inmunodeficiencia por
terapia génica en inmunodeficiencia SCID-X1.
89
¿¿??, pues todos los pacientes pediátricos tratados han mostrado clara mejoría clínica.
Como veremos más adelante, 5 de los 15
pacientes X1-SCID tratados por TG desarrollaron leucemia linfocítica como consecuencia de
esta intervención terapéutica, si bien 4 de ellos
respondieron satisfactoriamente al tratamiento
antitumoral. Las causas y consecuencias de este
proceso maligno producido como consecuencia del tratamiento con vectores retrovirales se
discuten, así mismo, más adelante.
Granulomatosis crónica
Constituye otra inmunodeficiencia que ha recibido atención particular para su tratamiento
genético. Esta enfermedad se caracteriza por
una deficiente respuesta de las células fagocíticas para generar anión superóxido, lo que se
manifiesta mediante un síndrome recurrente de
infecciones y formación de granulomas (fig. 9).
Estudios experimentales sugieren que la corrección genética de, aproximadamente, un 5%
de los granulocitos circulantes, será suficiente
para reportar un beneficio terapéutico [9]. Los
estudios clínicos basados en el trasplante de
células CD34+ transducidas con vectores retrovirales y trasplantadas en pacientes no acondicionados, no mostraron beneficio terapéutico.
No obstante, un ensayo clínico realizado por
Manuel Grez, en Frankfurt, en pacientes que
recibieron acondicionamiento mieloablativo,
ha mostrado evidente mejora clínica en los 2
pacientes tratados [10]; sin embargo, en este
ensayo clínico también se han descrito efectos
adversos graves similares a los descritos en pacientes X1-SCID [11].
Hemofilia
La hemofilia es una enfermedad ligada al cromosoma X originada por mutaciones en el gen
que codifica el factor VIII (hemofilia A) o el factor IX (hemofília B) de la coagulación. A pesar
de los avances producidos en la administración
intravenosa de estos factores, su corta vida media
90
y elevado coste han incentivado la investigación
en el campo de la TG de esta enfermedad. En el
tratamiento de la hemofilia A y B se han seguido
múltiples enfoques, que incluyen la transducción
de fibroblastos con plásmidos portadores del gen
del factor VIII truncado, perfusión intravenosa de
vectores retro o adenovirales con el gen del factor VIII, o la transducción de músculo esquelético
o hígado con vectores AAV portadores del gen
del factor VIII y el minigen del factor IX, respectivamente. Ninguno de los protocolos puestos
en marcha hasta el momento ha conseguido
expresar a largo plazo el factor de coagulación
correspondiente a niveles terapéuticos. Trabajos
más recientes han conseguido alcanzar niveles
del factor de coagulación del orden del 5-25% en
perros hemofílicos o primates no humanos, mediante 3 aproximaciones diferentes. En un caso se
administró por vía sistémica vectores retrovirales
en perros neonatales, en donde los hepatocitos
se encontraban con alta tasa proliferativa, y se
han utilizado también vectores AAV para transducir músculo esquelético por vía intravascular, o
el hígado por vía de la arteria hepática o portal.
La administración de vectores AAV al hígado se
contempla actualmente como uno de los procedimientos más prometedores para el tratamiento
de la hemofília, pues ya se han alcanzado valores
de alrededor del 10-12% de los valores normales,
aunque la expresión se mantuvo durante semanas, en lugar de años, como fue el caso de perros
hemofílicos [12]. La presencia de células CD8+
de memoria contra antígenos de la cápsida viral
parece ser la causante de la corta duración en la
que se expresó el factor. La inmunosupresión del
paciente hasta que la cápsida viral se aclare de sus
tejidos, o la utilización de serotipos diferentes de
AAV (AAV-8 en lugar de AAV-2), se contemplan
como alternativas de interés para mejorar la eficacia clínica del procedimiento.
Hemoglobinopatías
De entre ellas, destacan las talasemias y la
anemia de células falciformes. Algunos genes de
hemoglobinopatías (alpha-thal, beta-thal y HbS)
causan enfermedad (talasemia alfa, talasemia beta
y anemia drepanocítica, respectivamente), pero
otros (HbE y HbC) sólo causan manifestaciones
clínicas graves cuando se combinan con alguno
de los genes del primer grupo. Los niños con talasemia suelen nacer sin manifestaciones clínicas,
pero la anemia surge entre los 6 meses y los 2
años de vida. La sustitución de la globina-ß defectiva o ausente en pacientes con talasemia ß, puede ser curativa. Resultados preclínicos recientes
del grupo de G. Ferrari muestran la corrección
de células humanas de pacientes con talasemia
major. La caracterización de células derivadas de
la médula ósea de estos pacientes antes después
Figura 9. Fundamentos moleculares de la granulomatosis crónica.
91
de la transferencia del gen terapéutico mostró
una elevada eficacia de transducción, restauración de la síntesis de la hemoglobina, rescate de
la apoptosis y la corrección de los defectos en
eritropoyesis. En general, estos resultados proporcionan un fundamento sólido para una futura
traducción clínica de este protocolo de TG [13].
Anemia de Fanconi
La anemia de Fanconi (AF) es una enfermedad autosómica recesiva, poco frecuente entre
la población pero de muy mal pronóstico. Los
pacientes suelen desarrollar anomalías congénitas múltiples (en el 65% de los casos), fallo
de médula ósea y predisposición a cáncer. En
promedio, la manifestación de la aplasia se observa alrededor de los 8 años de edad, si bien
prácticamente todos los pacientes que alcanzan
los 40 años muestran fallo de médula ósea. Una
de las características de esta enfermedad, que la
hace particularmente apropiada para su tratamiento por TG, radica en la ventaja selectiva de
las células corregidas genéticamente respecto a
las células defectivas en los genes de Fanconi
[14]. La AF es consecuencia de mutaciones o
deleciones en cualquiera de los 13 genes de
AF relacionados con la estabilidad genómica de
estas células. Los resultados publicados sobre
los ensayos realizados en fase I no manifestaron beneficios terapéuticos evidentes (Liu et al.,
1999) [15]. Nuestro equipo de investigación ha
publicado recientemente resultados preclínicos
que abren nuevas expectativas al tratamiento
por TG de esta enfermedad mediante nuevos
procedimientos de manipulación celular y nuevos vectores lentivirales, más eficaces y seguros
respecto a los utilizados anteriormente [16].
Fibrosis quística
El gen de la fibrosis quística (FQ) está localizado en el cromosoma 7 y posee un tamaño de
6,7 kB. En el 75% de los pacientes enfermos de
FQ, la enfermedad se produce por un defecto
en la posición 508. Como consecuencia de las
92
deficiencias de este gen se produce una alteración física y química de las secreciones de las
vías respiratorias y de las enzimas pancreáticas.
Debido al defecto en el transporte del cloro
entre las células, las mucosidades se hacen muy
densas, dificultando la expulsión del moco bronquial y facilitando su infección con patógenos
difíciles de eliminar. La TG prioritaria de esta enfermedad radica en la inserción del gen de la FQ
en las células respiratorias. Se han desarrollado
diversos ensayos clínicos en fase I utilizando
fundamentalmente vectores adenovirales y, más
recientemente, vectores no virales. Los protocolos con vectores adenovirales han mostrado
ventajas respecto a su eficacia de transducción
de las células diana; sin embargo, también han
puesto de manifiesto su inmunogenicidad, al haberse generado anticuerpos que neutralizaron
la eficacia de los vectores. Las formulaciones no
virales facilitarán la administración repetida de
fármaco genético. En todo caso, estos ensayos
clínicos están mostrando mayores complicaciones de la inicialmente previstas.
La seguridad en terapia
génica
Problemas en el tratamiento
de la deficiencia de la ornitín
transcarbamilasa
Esta es una enfermedad en la que los pacientes carecen de una enzima clave del metabolismo de aminoácidos, la ornitín transcarbamilasa (OTC), lo que da lugar a una acumulación
potencialmente fatal de amoniaco en la sangre.
Puesto que la actividad OTC está normalmente presente en el hígado, se considera que éste
es el tejido diana de vectores que expresen la
versión correcta del gen OTC. En virtud de la
eficacia de los adenovirus para infectar células
hepáticas, se propuso utilizar tales vectores para
transducir las células hepáticas de estos pacientes con el gen OTC. Estudios in vitro, y también
en animales de experimentación, mostraron la
eficacia del protocolo propuesto. El tratamiento de 17 pacientes con dosis progresivamente
crecientes del vector no manifestó efectos tóxicos graves. No obstante, en 1 de los pacientes
tratados con la dosis más alta se manifestó un
proceso febril seguido de inflamación hepática y aumento descontrolado de los niveles de
amonio, dando lugar a la entrada en coma del
paciente. Lamentablemente, el paciente falleció
poco después, y está todavía en investigación la
causa primaria de su muerte. Este hecho, como
consecuencia de la inoculación del vector viral,
disparó las alarmas de los organismos reguladores, principalmente en lo que se refiere a la
inoculación in vivo de vectores de la familia de
los adenovirus. En la actualidad se han generado
nuevos vectores adenovirales desprovistos de
la mayor parte del esqueleto viral implicado en
su inmunogenicidad, por lo que se confía que su
empleo prevenga de la generación de respuestas inmunogénicas no previstas.
Incidencia de leucemias
en pacientes X1-SCID tratados
mediante terapia génica
De los 20 pacientes X1-SCID que fueron
tratados en París y Londres mediante TG, 5 desarrollaron leucemia linfocítica asociada a la inserción del gen terapéutico en la proximidad de
diferentes oncogenes [17]. De manera paralela a
la observación de las primeras leucemias en los
pacientes SCID-X1, C. Baum observó por primera vez en animales de experimentación un fenómeno similar. En sus experimentos trasplantó
células madre hematopopyéticas que habían sido
transducidas con vectores gamarretrovirales a
animales receptores [18] ¿¿??. Al cabo del tiempo
observó en algunos animales la aparición de una
leucemia clonal, que investigó en su nivel molecular. En su estudio, Baum observó que el vector retroviral se había insertado junto al oncogén evi1,
al cual había activado mediante las secuencias
promotoras presentes en el vector. De manera
análoga, en los ensayos clínicos con pacientes
X1-SCID se observó que una gran proporción
de las inserciones del vector terapéutico tuvo lugar en regiones próximas a (o dentro de) genes
de las células diana. De hecho, se observó que
la inserción del vector terapéutico ocurría con
frecuencia junto al oncogén LMO2, implicado en
leucemias linfocíticas [19] (fig. 10). ¿¿??
Estudios posteriores han evidenciado que los
vectores gamarretrovirales se insertan preferentemente en la proximidad o dentro de genes que
se están transcribiendo activamente en el momento de la transducción [20]. En estudios complementarios se observó que estos vectores se
insertan preferentemente en regiones próximas
al inicio de la transcripción, facilitando con ello la
transactivación de los genes próximos. Con objeto de minimizar el riesgo de transactivar oncogenes por la inserción de vectores terapéuticos, se
han desarrollado vectores de mayor seguridad.
Así, a diferencia de lo que ocurre con los vectores gamarretrovirales, los vectores lentivirales no
muestran una preferencia por integrarse junto al
inicio de la transcripción del gen [21]. Por otra
parte, la introducción de promotores menos potentes que los promotores virales anteriormente
utilizados constituye una alternativa complementaria que está mejorando significativamente la
seguridad de la TG [22].
En todo caso, los riesgos asociados a la TG
han de ser correctamente ponderados, por
una parte para minimizar en lo posible el riesgo asociado a su utilización, pero también para
no impedir su aplicación a pacientes que no
tienen alternativas terapéuticas de beneficio
comparable.
Puesta en marcha
de nuevos ensayos clínicos
con vectores terapéuticos
de nueva generación
Como consecuencia de los estudios de seguridad realizados desde que se pusieron de
93
La reprogramación celular,
una nueva estrategia
para la terapia génica
de enfermedades
monogénicas
manifiesto los primeros efectos adversos asociados a la terapia con vectores retrovirales,
comenzó el desarrollo de vectores lentivirales
para su aplicación clínica. El primer ensayo de
tratamiento de una enfermedad monogénica
con vectores lentivirales se realizó recientemente en París en pacientes con X-adrenoleucodistrofia (ALD) [23]. Esta enfermedad
cursa con una desmielinización severa en
cerebro, por deficiencia en la proteína ALD.
La progresión de la enfermedad puede ser
detenida mediante trasplante alogénico de
progenitores hematopoyéticos. En el ensayo
clínico realizado por N. Cartier et al., se transdujeron células CD34+ de la médula ósea de
los pacientes con vectores lentivirales portadores del gen de la ALD y se reinfundieron
tras un acondicionamiento mieloablativo de
los pacientes (fig. 11). Los resultados reportados en este trabajo demuestran por primera
vez la detención del proceso de desmielinización en pacientes tratados por TG, abriendo
una nueva expectativa para la terapia de esta
grave patología.
Ante el limitado número de células madre hematopoyéticas presentes en la médula ósea de
los pacientes con aplasias congénitas, como la
anemia de Fanconi (AF), por ejemplo, surgió la
necesidad de investigar la posibilidad de generar
progenitores hematopoyéticos a partir de fuentes alternativas a la médula ósea. Para ello resultó esencial el descubrimiento del investigador
japonés Yamanaka en el año 2006, que demostraba por primera vez que la transferencia de
tan sólo 4 genes podía reprogramar fibroblastos
de piel [24] y así generar células pluripotentes
inducidas (iPS) similares a las células madre embrionarias. Nuestro equipo, en colaboración
con el de Raya e Izpisúa-Belmonte, en el Centro
41.253
P4
6 13 17 24 31 34 -C 37 M
MFG γc
44.218
1
46.229
MFG γc
54.614
2
P5
Hacein-Bey et al., Science 302, 416;2003.
3’LTR
8
IS
10 ngWT
% de inmigración
7
198 pbs
5
4
3
2
1
50 c. IS
10 ngWT
0
CD3
T γδ PBL
PBL
-10 a -9
-9 a -8
-8 a -7
-7 a -6
-6 a -6
-5 a -1
-4 a -3
-3 a -2
-2 a -1
-1 a 0
0a1
1a2
2a3
3a4
4a6
6a6
6a7
7a8
8a9
9 a 10
500 c. IS
6
Distancia al origen de transcripción TSS (kb)
600 integraciones independientes: 63% a < 10 kb de genes
Figura 10. Oncogénesis insercional en dos pacientes X1-SCID tratados por terapia génica.
94
de Medicina Regenerativa de Barcelona, y el de
Surrallés, de la Universidad Autónoma de Barcelona/Ciber de Enfermedades Raras, demostramos recientemente la posibilidad de corregir
el defecto genético de fibroblastos de piel de
pacientes AF y, también, de reprogramar estas
células para generar progenitores hematopoyéticos con fenotipo sano [25] (fig. 12). Desde
20 months
ALD patient
(lipid storage disorder)
Lipid storage
relief
Gene-corrected HSCs
HIV-based vector with
therapeutic ABCD1 gene
Progeny
of gene-corrected
HSCs distribute
throughout
the body
HSCs
Figura 11. Terapia génica con vectores lentivirales en pacientes con X-adrenoleucodistrofia (tomado de L
Naldini. Science 326, 805-6, 2009).
95
+ Oct 3/4
+ Sox2
Células de la piel +
FANCA
+ c-Myc
+ Klf4
Célula iPS
CMH
CMH
Figura 12. Esquema seguido para la generación de progenitores hematopoyéticos a partir de fibroblastos de
piel de pacientes con anemia de Fanconi (Raya et al. Nature 460: 53-9, 2009).
esta primera demostración, la reprogramación
celular se contempla como un nuevo campo de
gran expectación en el cual la TG de adición y
también por recombinación homóloga tendrá
una oportunidad de traslación clínica.
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97
7
Nanomedicina:
apliación de la nanotecnología
en la salud
Laura M. Lechuga
Grupo de Nanobiosensores y Aplicaciones Bioanalíticas
Centro de Investigación en Nanociencia y Nanotecnología (CIN2)
Consejo Superior de Investigaciones Científicas
Resumen
La nanomedicina, aplicación de la nanotecnología en las ciencias de la salud, es la rama de la
nanotecnología que se perfila como la de mayor
proyección en un futuro próximo debido a sus
importantes aplicaciones, especialmente diagnósticas y terapéuticas. La detección temprana
de enfermedades, su tratamiento precoz personalizado y un preciso seguimiento posterior
de su evolución serán posibles en los próximos
años gracias a la aplicación de las herramientas
nanotecnológicas que se están desarrollando
actualmente. Los importantes avances en este
campo podrían dar lugar a sistemas de diagnosis
y tratamientos terapéuticos de mayor eficacia
que los existentes, lo que redundaría en una
mayor calidad de vida para el hombre. Una auténtica revolución se vislumbra en el horizonte
del cuidado de la salud y la tecnología médica.
Introducción:
¿qué es la nanomedicina?
Desde hace unos años la nanotecnología se
está perfilando como un área emergente en
98
ciencia y tecnología que nos está conduciendo
a una nueva revolución industrial. La nanotecnología se define como el «desarrollo de ciencia y
tecnología a niveles atómicos y moleculares, en la
escala de aproximadamente 1-100 nm, para obtener una comprensión fundamental de fenómenos
y materiales en dicha escala nanométrica y para
crear y usar estructuras, dispositivos y sistemas que
tengan nuevas propiedades y funciones debido a
su tamaño». Nanométro (del latín nanus, enano)
significa la milmillonésima parte de 1 metro. Lo
más interesante de la nanotecnología no es la
posibilidad de trabajar con materiales de reducidas dimensiones, sino el cambio a menudo radical que sufren las propiedades físicas y químicas
de la materia cuando se trabaja a esta escala: la
conductividad eléctrica, el color, la resistencia o
la elasticidad, entre otras propiedades, se comportan de manera diferente a como lo hace el
material volumétrico (fig. 1). Por ello, la nanotecnología tiene gran aplicación en diferentes
campos, entre los que destacan los materiales,
la electrónica, la medicina y la energía. Se han
alcanzado ya avances significativos en la fabricación de materiales de mayor dureza y resistencia, ordenadores más veloces y con mayor
capacidad de procesamiento gracias a los microprocesadores con componentes nanotecno-
Balón de fútbol
220.000.000 nm
Microchip ordenador
70 nm
Hormiga
10.000.000 nm
Cabello humano
80.000 nm
Nanoprisma de oro
lado 50 nm
Nanotubos de carbón
anchura 1,4 nm
Virus polio
10 nm
Molécula de C60
0,7 nm
Glóbulos rojos
7.000 nm
Molécula de ADN
anchura 2 nm
Átomo de hidrógeno
0,1 nm
Figura 1. Las medidas de la nanotecnología.
lógicos, diagnósticos médicos más eficaces o la
obtención de energía a bajo coste y respetuosa
con el medio ambiente. Ya existen multitud de
productos «nanotecnológicos» en el mercado,
como cosméticos más eficaces y protectores,
raquetas de tenis más flexibles y resistentes, gafas que no se rayan, ropa que no se arruga ni se
mancha, por citar algunos ejemplos.
La irrupción de la nanotecnología en las ciencias de la salud ha dado lugar a una nueva disciplina denominada nanomedicina, cuyo objetivo
principal es el desarrollo de herramientas para
diagnosticar, prevenir y tratar enfermedades
cuando están todavía en estados poco avanzados o en el inicio de su desarrollo. La nanomedicina estudia interacciones a la nanoescala y para
ello utiliza dispositivos, sistemas y tecnologías que
incluyen nanoestructuras capaces de interactuar
a escala molecular y que se interconectan a nivel
micro para interaccionar en el nivel celular. Uno
de los grandes retos en este proceso reside en
el desarrollo de «nanoterapias», dirigidas específicamente a los tejidos y órganos enfermos,
evitando dañar a las células sanas circundantes y,
por tanto, evitando los temidos efectos secundarios de los tratamientos actuales.
En los orígenes de la nanotecnología se llegó
a predecir la fabricación de «nanorobots», que
se inyectarían directamente y atacarían selectivamente los tejidos dañados, incluso protegiendo de ataques externos y reparando posibles
desperfectos. A pesar de que esto sigue siendo
Nanomedicina: ampliación de la nanotecnología en la salud
99
ciencia ficción, sí se puede afirmar que se ha
avanzado notablemente en el diseño de nanoestructuras que incorporan distintas funcionalidades y pueden desempeñar un papel muy similar.
El progresivo aumento que se observa de graves dolencias como el cáncer, las enfermedades
cardiovasculares, la diabetes, o las enfermedades
neurodegenerativas (Alzheimer y Parkinson),
para las que no existen tratamientos definitivos,
hacen necesarios nuevos métodos diagnósticos
y terapéuticos más rápidos, eficaces y específicos que los actuales y que además reduzcan al
máximo los costes implicados. La nanomedicina
promete resolver algunos de estos grandes retos mediante la capacidad de detectar de forma
precoz la presencia de enfermedades (como el
cáncer) o la capacidad de regenerar los órganos
y tejidos que estén dañados dentro del organismo proporcionado un diagnóstico precoz,
una terapia adecuada y un seguimiento posterior efectivo de la evolución del paciente. En un
futuro próximo se podrá incluso disponer de
tratamientos individualizados a distancia en el
propio hogar o lugar de trabajo del paciente.
La nanomedicina agrupa tres áreas principales: el nanodiagnóstico, la liberación controlada de fármacos (nanoterapia) y la medicina
regenerativa. El nanodiagnóstico consiste en el
desarrollo de sistemas de análisis y de imagen
para detectar una enfermedad o un mal funcionamiento celular en los estadios más tempranos
posibles tanto in vivo como in vitro. La nanoterapia pretende dirigir nanosistemas activos que
contengan elementos de reconocimiento para
actuar o transportar y liberar medicamentos
exclusivamente en las células o zonas afectadas,
a fin de conseguir un tratamiento más efectivo,
minimizando los efectos secundarios. La medicina regenerativa tiene como objetivo reparar o
reemplazar tejidos y órganos dañados aplicando
herramientas nanotecnológicas.
Dado que es imposible abarcar con profundidad todas las tecnologías que pueden surgir
de conceptos basados en nanomateriales y
nanodispostivos, se han seleccionado para este
100
capítulo algunos ejemplos clave de avances
conseguidos en las tres líneas principales de la
nanomedicina, haciendo especial hincapié en el
área del nanodiagnóstico.
Nanodiagnóstico
El objetivo del nanodiagnóstico es la identificación de enfermedades en sus estadios iniciales en el nivel celular o molecular e, idealmente,
al nivel de una sola célula, mediante la utilización
de nanodispositivos y sistemas de contraste.
Una identificación temprana permitiría una rápida capacidad de respuesta y la inmediata aplicación del tratamiento adecuado, ofreciendo así
mayores posibilidades de curación.
Los nanosistemas de diagnóstico se pueden
utilizar in vitro o in vivo. El diagnóstico in vivo normalmente requiere que los dispositivos puedan
penetrar en el cuerpo humano para identificar
y (idealmente) cuantificar la presencia de un determinado patógeno o de células cancerígenas,
por ejemplo. Esto conlleva una serie de problemas asociados con la biocompatibilidad del material del dispositivo, pero además requiere de
un sofisticado diseño para asegurar su eficacia y
minimizar los posibles efectos secundarios. Por
su parte, el diagnóstico in vitro ofrece una mayor
flexibilidad de diseño, ya que se puede aplicar a
muestras muy reducidas de fluidos corporales o
de tejidos, a partir de los cuales se puede llevar
a cabo una detección específica (de patógenos
o defectos genéticos, p. ej.) en tiempos muy
cortos, con gran precisión y sensibilidad. Debido
a estas diferencias fundamentales, se prevé que
la detección in vitro usando nanodispositivos llegue al mercado de una forma mucho más rápida y se pueda consolidar más fácilmente que los
métodos in vivo.
Dentro del nanodiagnóstico, dos son las
principales áreas de trabajo: los nanosistemas
de imagen y los nanobiosensores, dispositivos
capaces de detectar en tiempo real y con una
alta sensibilidad y selectividad agentes químicos
y biológicos. Los principales sistemas de nanodiagnóstico dentro de estas dos grandes áreas
se recogen en la tabla 1.
Nanosistemas de imagen
Estos sistemas se basan en el uso de nanopartículas, generalmente, semiconductoras, metálicas o magnéticas, como agentes de contraste para marcaje in vivo. Estos nuevos sistemas
permiten aumentar la sensibilidad y dan mayor
contraste en las técnicas de imagen.
Uno de los primeros sistemas de nanopartículas que se han propuesto para marcaje celular e identificación de zonas dañadas o tumores son las nanopartículas de semiconductores,
también conocidas como «puntos cuánticos»
(quantum dots).
Cuando el tamaño de estos semiconductores se reduce a unos pocos nanómetros (típicamente entre 1 y 10 nm), se produce una
modificación de su estructura electrónica, de
tal manera que se pierde la característica estructura de bandas y surgen niveles electrónicos
discretos. Esta nueva estructura electrónica les
Tabla 1. Resumen de los sistemas de nanodiagnóstico más desarrollados
Principales sistemas de nanodiagnóstico
Dispositivos de nanodiagnóstico
• Nanobiosensores
• Biochips genómicos y proteómicos
• Lab-on-a-chip
Diagnóstico por imagen
• Resonancia magnética muclear
• Espectroscopia y fluorescencia
• Microscopios de campo próximo (AFM, STM)
• Microscopia y tomografía electrónica
• Marcadores y agentes de contraste
– Puntos cuánticos
– Nanopartículas magnéticas
– Nanopartículas metálicas
confiere una respuesta óptica (fluorescencia, en
particular) que varía con el tamaño. Por lo tanto,
se pueden fabricar puntos cuánticos del mismo
material que emiten luz en diferentes longitudes
de onda (con distintos colores) dependiendo
de su tamaño, por lo que son extremadamente
útiles como marcadores biológicos (fig. 2).
De entre la gran variedad de materiales que
se han estudiado, los semiconductores más utilizados son los de CdSe y CdTe, ya que se pueden producir en grandes cantidades mediante
procesos químicos, con un excelente control
del tamaño, lo que permite obtener bandas de
emisión estrechas e intensas en una amplia variedad de colores y con un tiempo de vida muy
prolongado. Todas estas características, a las que
se puede añadir que la excitación de puntos
cuánticos de distintos tamaños se puede realizar
con una única lámpara (permitiendo así realizar
marcajes múltiples de forma simultánea), han
promovido su desarrollo como competencia a
los marcadores moleculares habituales. Existen
ya múltiples demostraciones de la utilidad de
los puntos cuánticos para la localización de pequeños tumores, lo cual significa que se podría
proceder a su extirpación inmediata. En la figura
2 se muestran algunos ejemplos.
Sin embargo, el diseño de los puntos cuánticos
(al igual que otros sistemas de nanopartículas)
es bastante más complicado. No es suficiente
con obtener un material de alta luminiscencia y
estabilidad, la nanopartícula también debe llegar
a su destino de forma selectiva e, idealmente,
debe eliminarse del organismo una vez realizada su función para evitar efectos secundarios.
Uno de los problemas a resolver es la captación
de las nanopartículas por los macrófagos antes
de alcanzar la zona afectada. Para ello es necesario recubrir las nanopartículas con materiales
que actúen como una capa de invisibilidad, p.
ej., con polímeros como el polietilenglicol. Una
vez resuelto este problema, es preciso indicarles cómo localizar el tumor, y para ello hay que
recubrir su superficie con biomoléculas (biorreceptores, como anticuerpos monoclonales) con
101
afinidad selectiva hacia un compuesto específico de la zona a reconocer (p. ej., la célula cancerosa). Así, hay ciertas proteínas o moléculas
que se encuentran en mayor proporción en la
membrana de las células cancerosas (como los
receptores de ácido fólico o la hormona luteinizante) y son características de cada tipo de
cáncer. Cuando los puntos cuánticos en función
con el biorreceptor específico se acercan a una
muestra que contiene dicha proteína, se produce una reacción de reconocimiento biomolecular (fig. 2), de forma que se acumularán allí, permitiendo la detección mediante iluminación con
luz ultravioleta y observación de la emisión de
fluorescencia característica del punto cuántico
empleado. La eliminación de las nanopartículas
a través del hígado o los riñones parece ser bastante eficiente para los tamaños de los puntos
cuánticos, pero pueden existir problemas ligados a procesos de agregación, que es necesario
resolver en algunos casos.
Hasta ahora, los experimentos in vivo con
puntos cuánticos se han realizado con animales, pero se prevé que una vez superados los
controles de las agencias de salud, se puedan
realizar estos ensayos en seres humanos.
Otra posibilidad para los agentes de contraste
es emplear nanopartículas metálicas, ya que su
frecuencia de resonancia (el color) es muy sensible a su tamaño y a su forma, lo cual permite
diseñarlas para que absorban o dispersen luz en
la región espectral que interese. Por ejemplo, se
pueden fabricar nanopartículas de oro que sean
muy eficientes absorbiendo o reflejando luz en
el infrarrojo cercano (700-900 nm), donde los
tejidos son más transparentes, de forma que es
posible diseñar métodos de marcaje celular, en
una forma similar a lo que se ha descrito para
los puntos cuánticos. Uno de los métodos utilizados se denomina tomografía de coherencia
óptica (optical coherence tomography, OCT), y
permite obtener mapas tridimensionales de los
A
B
C
Figura 2. A) Disoluciones de puntos cuánticos de distintos tamaños, con color de fluorescencia característico para cada tamaño. B) Esquema de funcionamiento de un punto cuántico. C) Imágenes de
experimentos en los que se han inyectado puntos cuánticos y cómo se acumulan en células u órganos
dañados..
102
tejidos y detectar las zonas en las que se han
acumulado las nanopartículas.
Otra posibilidad es utilizar nanopartículas
magnéticas (típicamente óxidos de hierro como
la magnetita) para aumentar el contraste en medidas de resonancia magnética. Estas nanopartículas podrían sustituir a los marcadores actuales
de metales pesados, reduciendo su toxicidad.
Además, el carácter magnético de estos materiales podría facilitar su transporte a través del
organismo mediante la utilización de un campo
magnético externo (como un imán).
marcadores fluorescentes o radioactivos y con
una alta sensibilidad y selectividad, todo tipo de
sustancias químicas y biológicas.
Un biosensor es un dispositivo integrado por
un receptor biológico (enzimas, ADN, anticuerpos, etc.) preparado para detectar específicamente una sustancia y un transductor o sensor,
capaz de medir la reacción de reconocimiento
biomolecular y traducirla en una señal cuantificable (fig. 3). Los dos constituyentes del biosensor están integrados conjuntamente y es precisamente esta íntima unión la que le confiere a
los dispositivos biosensores sus especiales características de sensibilidad y selectividad. Otra
de las características fundamentales que hace
atractivos a los biosensores es la posibilidad de
realizar el análisis de la sustancia a determinar
en tiempo real y de forma directa (sin necesidad de marcador) a diferencia de cualquier aná-
Nanobiosensores
Dentro del nanodiagnóstico, los principales
dispositivos de análisis que se están desarrollando son los nanobiosensores, dispositivos capaces de detectar en tiempo real, sin necesidad de
A
B
–S–(CH2)6-N=CH–(CH2)3-CH
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
Muestras
=
analítico
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
Superficie del nanosensor
Receptor Biológico
Transductor
Proceso datos
Señal
Figura 3. A) Esquema del funcionamiento de un biosensor. B) Fabricación de nanobiosensores con tecnología microelectrónica. El biosensor está formado por un transductor similar a los circuitos integrados
de silicio y una capa bioreceptora para el análisis específico.
103
lisis biológico o clínico que siempre requiere un
marcador (ya sea fluorescente o radioactivo).
Todo ello confiere a los biosensores la posibilidad de realizar no sólo un análisis cualitativo
(sí/no) y cuantitativo, sino también la posibilidad
de evaluar la cinética de la interacción (constante de afinidad, asociación, disociación, etc.) y, por
tanto, elucidar los mecanismos fundamentales
de dicha interacción. Las técnicas de análisis de
laboratorio más habituales, ya sea de sustancias
químicas o biológicas, suelen ser laboriosas, consumen mucho tiempo y en la mayoría de la ocasiones requieren personal especializado para su
empleo. Frente a ellas, los biosensores ofrecen
la posibilidad de hacer medidas directas, continuas, de forma rápida y con alta sensibilidad.
El término «nanobiosensor» designa a los
biosensores cuyas propiedades vienen moduladas por la escala nanotecnológica con la que
están fabricados. Los nanobiosensores pueden
mostrar una sensibilidad mucho mayor que la
de los dispositivos convencionales y además
ofrecen las ventajas del pequeño tamaño y la
portabilidad, lo que posibilita su utilización en
cualquier lugar, como el hogar o la consulta del
médico. Con estos nanodispositivos la cantidad
de muestra para hacer el análisis es relativamente baja (de micro a nanolitros), lo que significa
que los métodos de extracción de muestras de
pacientes pueden ser menos invasivos y menos
traumáticos. Además podrían ser fácilmente introducidos en el interior del cuerpo humano,
proporcionando datos mucho más fiables del
estado de salud real de un paciente.
Dentro de los desarrollos de nanobiosensores
son de destacar los nanobiosensores fotónicos,
nanoplasmónicos, basados en nanoestructuras
(nanopartículas, nanotubos de carbono, nanoalambres, etc.) y los biosensores nanomecánicos.
Biosensores nanofotónicos
Los biosensores nanofotónicos han demostrado un nivel de sensibilidad extremo para la
detección directa de proteínas y ADN. En estos
sensores (también llamados de onda evanescen-
104
te) se hace uso de la forma particular en que se
transmite la luz en el interior de los circuitos
ópticos; esta transmisión tiene lugar a lo largo
de la guía óptica mediante múltiples reflexiones
internas. A cada reflexión, una componente de
la luz, denominada onda evanescente, se propaga en el medio que envuelve a la guía. La longitud de penetración de la onda evanescente es
de unos cientos de nanómetros y ofrece una
oportunidad única e ideal para medir cualquier
interacción biomolecular que tenga lugar en su
interior. Con estos sensores es posible evaluar
concentraciones de proteínas en el nivel picomolar o variaciones de una única base en el
ADN en tan sólo unos minutos, necesitando
volúmenes de muestra del orden de microlitros
y, en ocasiones, las muestras a analizar (orina,
suero) no necesitan un pretratamiento previo.
Los nanosensores fotónicos también permiten
la medida en el interior de una única célula de su
estado metabólico. Para este fin existen nanosensores que consisten en una fibra óptica muy
afilada (su extremo final tiene sólo 30-50 nm)
lo que le permite penetrar a través de la membrana celular sin causar ningún daño y sin alterar
el funcionamiento normal de la célula. La fibra
óptica se biofuncionaliza con receptores específicos antes de su introducción. Una vez dentro, la
nanosonda puede detectar especies químicas y
señalizar procesos moleculares en localizaciones
específicas del interior de la célula. La detección
se realiza a través de la interacción del campo
evanescente de la luz que circula por la fibra óptica con la interacción biomolecular, debida al biorreceptor específico anclado en la superficie del
extremo final de la fibra. Con esta técnica se abre
la posibilidad de identificar cambios patológicos
dentro de una célula individual e incrementar el
conocimiento sobre las funciones celulares in vivo,
como la división celular, la apoptosis, el funcionamiento de las nanomáquinas biológicas, etc.
Biosensores nanoplasmónicos
El biosensor de Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) está basado en la variación de
reflectividad de una capa metálica en contacto
con un medio biológico. El biosensor SPR ha
sido ampliamente desarrollado, cientos de publicaciones aparecen cada año en la literatura
especializada y numerosas compañías lo comercializan en diferentes versiones. Este sensor permite detectar de forma directa concentraciones
en el rango nanomolar de forma directa y sin
necesidad de marcadores fluorescentes.
En este sensor se deposita una capa metálica
delgada (generalmente una capa de oro de 50
nm de espesor) sobre un material dieléctrico (p.
ej., un cristal). Excitando la interfase del metal y
el dieléctrico en condiciones de reflexión interna total, se obtiene una resonancia plasmónica
para un cierto ángulo de incidencia de la luz,
resonancia que se manifiesta en una absorción
de la luz y, por tanto, un mínimo agudo en la
intensidad de la luz reflejada. La característica
más interesante de este efecto es que el ángulo de resonancia al que se genera la onda
plasmónica (de carácter evanescente) es muy
sensible a cualquier variación que tenga lugar
en la superficie metálica, como puede ser una
inmunorreación o cualquier otro tipo de interacción biomolecular. La interacción se detecta
entonces como una variación del ángulo de resonancia. En la figura 4 se muestra el esquema
de un sensor de SPR y su mecanismo de funcionamiento.
Como alternativa, se están desarrollando actualmente biosensores basados en el fenómeno
de resonancia de plasmón en nanopartículas. En
el caso de éstas, y debido a su pequeño tamaño,
la oscilación de los electrones está muy localizada en ciertas zonas de las nanopartículas (v.
mapas de intensidad en la fig. 4), por lo que el
fenómeno se denomina resonancia de plasmón
superficial localizada (LSPR). Tal como se indica
en la figura 4, la adsorción de (bio)moléculas
sobre las nanopartículas provoca cambios de
color, que se pueden emplear para la detección.
A pesar de que los límites de detección podrían
ser similares que los obtenidos con los biosensores SPR, el sistema experimental es mucho
más sencillo en LSPR, ya que se mide transmisión en lugar de reflexión y además se puede
facilitar la miniaturización.
En ambos casos, los dispositivos permiten
portabilidad y requieren una cantidad de muestra relativamente baja (de micro a nanolitros)
para hacer el análisis y ya se ha demostrado su
utilidad en la detección de proteínas en el nivel nanomolar en muestras de pacientes (orina,
suero) sin necesidad de pretratarlas o de mutaciones puntuales en las cadenas de ADN sin
necesidad de marcadores fluorescentes.
Existen otros métodos de detección que hacen uso del fenómeno de LSPR de una forma
diferente. Por ejemplo, se han desarrollado detectores de ADN basados en los cambios de
color que se producen debido a la agregación
de nanopartículas de oro marcadas con cadenas de ADN complementarias a la que se intenta reconocer.
Biosensores nanomecánicos
Otro tipo de nanobiosensor con grandes
perspectivas en nanodiagnóstico son los biosensores nanomecánicos, que emplean como
sistema de transducción la deflexión nanométrica de una micropalanca o el desplazamiento
de su frecuencia de resonancia al interaccionar
con el sistema biológico. El cambio en la posición y movimiento de la micropalanca inducido por el reconocimiento molecular ocurre a
escala de unos pocos nanómetros, y de aquí
deriva el nombre de biosensores «nanomecánicos». La figura 5 muestra las imágenes de
algunos de estos sensores. Las micropalancas
tienen un área sensora muy pequeña (del orden de 1.000 μm2), lo que permite el análisis
de cantidades de sustancia inferiores al femtomol. Además se fabrican con tecnología
microelectrónica estándar, lo que proporciona
producción en masa a bajo coste y permite la
fabricación de miles de micropalancas en un
mismo proceso, que podrían ser empleadas
para la detección simultánea de miles de analitos de la misma muestra.
105
Desarrollos como los nanosensores fotónicos
o los nanomecánicos, fabricados a miles gracias
a la tecnología microelectrónica, abren un camino para la fabricación de nanobiochips genómicos y proteómicos, que a diferencia de los
actuales biochips, llevan incorporado un sistema
de transducción de la interacción (no se necesitarían marcadores fluorescentes), con los que
sería posible conseguir en muy poco tiempo
una inmensa cantidad de información genética
y proteómica que permitirá elaborar vacunas,
identificar mutaciones indicativas de enferme-
dades, identificar nuevos fármacos, identificar
patógenos, etc. de forma mucho más rápida que
utilizando las tecnologías convencionales.
Sistemas “laboratorio-en-unchip”
La integración en sistemas «lab-on-a-chip»
será otra de las áreas fundamentales de trabajo,
que permitirá la descentralización de las medidas. El término «lab-on-a-chip» (o «laboratorio
en un chip») describe el desarrollo de platafor-
A
Photodetectora array
LASER
I
II
I
II
priam
Au layer
Flow of anlytea
B
1.200
Scattering Intensity
1
2
800
400
0
450
500
550
Wavelength (nm)
600
Figura 4. A) Funcionamiento de un biosensor SPR. La interacción biomolecular que tiene lugar sobre
el oro se detecta mediante el desplazamiento de la curva plasmónica. B) Fotografías de microscopia
electrónica de nanopartículas de oro (esferas y cilindros) y la localización de la resonancia plasmónica.
La resonancia varía cuando se colocan los analitos en la superficie.
106
mas integradas y miniaturizadas donde tienen
lugar complejas reacciones químicas y bioquímicas. Estas plataformas se están constituyendo
como una tecnología revolucionaria en el sector clínico. Las micro y las nanotecnologías han
proporcionado las herramientas necesarias para
llevar a cabo esta innovación en el diagnóstico
molecular, al permitir la fabricación e integración
de micro/nanobiosensores, microcanales, microactuadores, etc. en un mismo chip. El empleo de
estos dispositivos aporta las ventajas de rapidez
en el análisis, reducido volúmenes de muestra,
alto grado de automatización y su carácter portátil y desechable.
Un simple microsistema con nanosensores incorporados podría ofrecer un diagnóstico completo a partir de una gota de sangre mediante
la identificación (de otra manera imperceptible)
de cambios moleculares; esto implica que los
análisis podrían hacerse a domicilio. Cuando se
empiecen a reemplazar los caros y lentos análisis
de laboratorio por estos análisis de microchips
más baratos, rápidos y cómodos, el impacto en
organizaciones sanitarias y sus pacientes será
muy importante.
Pero, a pesar de estos incipientes desarrollos,
todavía queda mucho camino por recorrer y para
al futuro, sería deseable contar con nanodisposi-
tivos que cumplieran la mayoría de los siguientes
requisitos: robusto, barato, posibilidad de multianalito, detección a niveles de pico/femtomolar o
incluso en el nivel de una sola molécula, rápidos y
directos, portátiles, de fácil manejo por parte de
personal no especializado, de multiuso o suficientemente barato para ser de un único uso.
El trabajo futuro se encamina tanto al desarrollo
de nuevas estrategias de inmovilización y de protección, para permitir nanobiosensores completamente reversibles y regenerables y que puedan
funcionar in situ en muestras complejas (como
es la sangre) y que sean biocompatibles para ser
implantados in vivo. La inclusión de los nanodispositivos en el interior del cuerpo preservando
su funcionalidad será un logro paradigmático en
nanodiagnóstico. Los nanobiosensores implantados podrían funcionar como «centinelas» dentro
del cuerpo humano y emitir una señal de alarma
ante la aparición de las primeras células enfermas.
Ya se han obtenido pequeños avances (a nivel
micro), como píldoras con cámaras de imagen
que pueden tragarse, sensores que pueden realizar medidas in vivo durante operaciones, etc. Está
será sin duda una de las grandes áreas de trabajo
de la nanomedicina en los años venideros. La figura 6 recoge una visión del empleo futuro de
los dispositivos nanobiosensores.
Figura 5. Biosensores nanomecánicos empleados en nanodiagnóstico.Las micropalancas se doblan unos nanómetros cuando
tiene lugar una reacción de reconocimiento molecular en su
superficie. El nanobiosensor de
matrices de micropalancas puede emplearse como biochip de
ADN o proteómico según la
biofuncionalizacións.
107
Liberación controlada
de fármacos
La nanomedicina se ha propuesto como una
posible solución para el desarrollo de nuevos
sistemas de liberación controlada de fármacos.
La idea consiste en utilizar nanoestructuras que
transporten el fármaco hasta la zona dañada y,
solamente cuando han reconocido esa zona, lo
liberen como respuesta a un cierto estímulo.
Para ello es necesaria la previa encapsulación o
desactivación de los fármacos para que no actúen durante su tránsito por el cuerpo hasta llegar al lugar afectado, de forma que mantengan
intactas sus propiedades físico-químicas y que
se minimicen posibles efectos secundarios en
otras zonas del cuerpo. Una vez que el fármaco
ha llegado a su destino, debe liberarse a una
velocidad apropiada para que sea efectivo, lo
cual se puede hacer mediante una variación de
ciertas condiciones (pH o temperatura, p. ej.)
en la zona dañada, o mediante un control preciso de la velocidad de degradación del material
encapsulante, permitiendo que la liberación del
fármaco sea controlada.
Para la administración de fármacos se ha propuesto una gran variedad de nanoestructuras,
como nanopartículas, nanocápsulas, dendríme-
Nanobiosensores en urgencias
Tecnologías
Nanofotónica
Nanotubos, nanopartículas
Nanomecánica, NEMS
Beneficios
Datos en tiempo real e in-situ
Imagen a nivel celular
Herramientas quirúrgicas de precisión guiadas por sensores
Nanobiosensores en la consulta
Beneficios
Análisis completo en minutos
Diagnósticos rápidos y precisos
Tratamientos específicos y personalizados
Tecnologías
Biochips
Nanoarrays de alta densidad
Nanobiosensores en casa
Tecnologías
Wireless
Dispositivos portátiles con batería
Displays de alta resolución
Beneficios
Auto pruebas diagnósticas simples
Transmisión automática de datos a historial clínico
Figura 6. Futuro de la utilización de nanobiosensores como sistemas de nanodiagnóstico. Adaptado de
General Electric.
108
Nanopartículas
Dendrímeros
Nanocápsulas
poliméricas
Liposomas
Figura 7. Diferentes tipos de nanosistemas que pueden emplearse en la dosificación de fármacos.
ros, liposomas, micelas, nanotubos, conjugados
poliméricos, microgeles, etc. (fig. 7). La nanotecnología permite que la liberación del fármaco
sea mínimamente invasiva, ya que estos nanosistemas pueden atravesar poros y membranas
celulares. Otra gran ventaja es que la efectividad
del medicamento se ve incrementada mediante
el control preciso de la dosis requerida y del
tamaño, la morfología y las propiedades superficiales del compuesto.
En la actualidad ya se encuentran disponibles
en el mercado numerosos fármacos desarrollados basados en principios de la nanotecnología;
algunos de ellos se recogen en la tabla 2, así
como la fase de desarrollo en la que se encuentran actualmente.
Terapia basada
en nanopartículas
Además de elementos de reconocimiento y
diagnóstico, las nanopartículas pueden utilizarse también como agentes terapéuticos. Una
vez que las nanopartículas se unen a tejidos
Tabla 2. Ejemplos de fármacos nanoestructurados
Nano estructura
Fase de desarrollo
Ejemplos
Liposoma
Aprobado por la FDA
DaunoXone, Docil
Albuminoso
Aprobado por la FDA
Abraxane
Micela polimérica
Ensayos clínicos
Genesol-FM, SP1049C, NK911, NCQ12,
NC105, NC-6004
Conjugado polímero/fármaco
Ensayos clínicos
XYQTAX, Pegamotrecan, APS346, etc.
Liposoma dirigido
Ensayos clínicos
MCC-465,MBP-426, SGT-53
Nanopartícula de polímero
Ensayos clínicos
FCE28069 (PK2), CALAA-01
Partícula inorgánica o metálica
Ensayos clínicos (oro) y
preclínicos
Nanotubos de carbono, partículas de sílice,
nanopartículas de oro
Dendrímero
Ensayos preclínicos
Poliamidoamina (PAMAM)
109
dañados o a células cancerosas, se puede inducir su calentamiento mediante aplicación de un
campo magnético de baja intensidad (para nanopartículas magnéticas) o por irradiación con
luz infrarroja (para nanopartículas metálicas). A
pesar de que los mecanismos son diferentes, en
ambos casos el calentamiento provoca la destrucción de las células tumorales por hipertermia, sin afectar a las células o tejidos sanos que
las rodean. La utilización de esta tecnología para
el tratamiento del cáncer evitaría los graves problemas de efectos secundarios de los actuales
tratamientos de quimioterapia o radioterapia.
Estos experimentos ya han demostrado
su utilidad en pacientes humanos. Una de las
principales nanoterapias es la desarrollada por
la empresa alemana MagForce Nanotechnologies AG, que ha recibido recientemente (julio
de 2010) la aprobación de la Agencia Europa.
El sistema de nanoterapia de MagForce se basa
en el uso de nanopartículas de óxido de hierro
recubiertas de aminosilano. La aplicación concreta, recientemente aprobada para su uso en la
clínica para tratamiento de tumores cerebrales,
consiste en inyectar estas nanopartículas magnéticas en la zona del tumor y posteriormente
aplicar un campo magnético alternante de alta
frecuencia, que produce un calentamiento local
de la zona tumoral debido la vibración de las
nanopartículas y, por consiguiente, la destrucción de las células cancerosas. La terapia podría
aplicarse a diferentes tipos de tumores sólidos.
La aprobación de este nuevo método terapéutico abre las puertas a los métodos terapéuticos
basados en la nanotecnología.
Nanomedicina regenerativa
La nanomedicina regenerativa se ocupa de la
reparación o sustitución de tejidos y órganos
enfermos o dañados mediante la aplicación de
métodos procedentes de la terapia génica, la
terapia celular, la dosificación de sustancias biorregenerativas y la ingeniería de tejidos, estimu-
110
lando los propios mecanismos reparadores del
cuerpo humano. Las principales aportaciones
de la nanotecnología a la medicina regenerativa
están relacionadas con la producción de nuevos
materiales y sistemas de soporte, la utilización
de células madre embrionarias y adultas y la
producción de moléculas bioactivas que sirvan
como señales de diferenciación celular.
En la ingeniera de tejidos, la nanotecnología
puede jugar un papel predominante, al facilitar
nuevos materiales y técnicas que permiten una
integración de los tejidos de forma más eficiente por la posibilidad de generar microambientes más propicios para la regeneración tisular.
La principal dificultad radica en encontrar materiales adecuados que permitan la fabricación
de estructuras que mantengan activo el órgano
afectado mientras se regenera la zona dañada.
Entre los materiales que se están utilizando
cabe destacar los nanotubos de carbono, las
nanopartículas como hidroxiapatita o zirconia,
las nanofibras de polímeros biodegradables, los
nanocomposites, etc.
Uno de los mayores logros es el desarrollo
de biomateriales con capacidad de imitar a la
matriz extracelular, constituyendo un auténtico
soporte, idéntico al que aparece de forma natural en las células, sobre el que pueden crecer las
células progenitoras para posteriormente implantarlo en el paciente y así reparar o sustituir
el órgano dañado.
También se pueden utilizar superficies nanoestructuradas que pueden actuar como incubadoras de líneas celulares, favoreciendo el
proceso de diferenciación celular. Un ejemplo
se muestra en la figura 8, donde una superficie
nanoestructurada con nanotubos de carbono
ha permitido el crecimiento y proliferación de
redes neuronales; también puede observarse
una estructura tridimensional con huecos ordenados, fabricada mediante replicación inversa
de un cristal opalino, en cuyo interior se han
crecido hepatocitos. Esta estructura podría proporcionar la rigidez necesaria para mantener el
hígado mientras se desarrolla el crecimiento de
las células encargadas de regenerarlo.
Otra posibilidad es el diseño de biomateriales
inteligentes que incorporen en su seno moléculas de señalización que, una vez insertadas en
el paciente, sean liberadas de forma gradual y
activen la regeneración tisular in vivo.
Gracias a la nanomedicina, las células madre
pluripotenciales y los factores de señalización serán componentes esenciales de implantes inteligentes y multifuncionales que podrán reaccionar
en función del microambiente que le rodee y facilitar entonces la regeneración del tejido dañado
de forma específica y en el mismo lugar.
Es de prever también que se puedan desarrollar nanoestructuras artificiales que puedan
detectar y reparar daños en el organismo, de la
misma forma que las nanoestructuras naturales
lo hacen (p. ej., los linfocitos de la sangre). Así,
se ha propuesto de forma teórica la fabricación
de unas nanoestructuras para sustituir la hemoglobina, denominadas «respirocitos». Los respirocitos son células rojas nanofabricadas con una
enorme capacidad para transportar oxígeno y
que puede permitir pasar varias horas bajo el
agua sin respirar. Según los cálculos de su creador, con una inyección de respirocitos podríamos
vivir con el corazón parado durante 4 horas o
bucear durante 2,5 horas. Otros interesantes
desarrollos incluyen motores biomoleculares,
interruptores moleculares o nanoagujas que penetren en el núcleo de células vivas con un alto
grado de precisión para realizar cirugía celular.
A
B
C
D
Figura 8. A) Red bidimensional nanoestructurada con nanotubos de carbono y utilizada como soporte
para la proliferación de redes neuronales. B) Imágenes de microscopia electrónica del crecimiento de
osteoblastos. C) Crecimiento de vasos sanguíneos artificiales. D) Crecimiento de células de fibroblasto
sobre un sustrato nanoestructurado.
111
Conclusiones
El enorme avance de la nanotecnología durante las últimas décadas ha permitido grandes
desarrollos en muchos campos, incluidas las
ciencias de la salud. Los conceptos de la nanotecnología se están aplicando en métodos de
diagnóstico más sensibles, sistemas de terapia y
de administración controlada de fármacos, así
como en herramientas que permiten la regeneración de tejidos y órganos dañados. Los sistemas y métodos descritos en este capítulo son
solamente ejemplos seleccionados de la ingente
actividad que se está desarrollando en miles de
laboratorios de todo el mundo para mejorar
las condiciones de salud y la calidad de vida de
toda la sociedad.
En el futuro, estos sistemas se integrarán en
microchips implantables que permitirán la administración programada de fármacos con un tratamiento personalizado y que, al mismo tiempo,
podrán medir los parámetros vitales del paciente y trasmitir esta información directamente a
una estación central de datos, para tener controlado al paciente mientras éste hace su vida
normal.Ya existen chips subcutáneos para medir
de forma continua parámetros cruciales como
el pulso o la temperatura, nanopartículas que
pueden reconocer, detectar y atacar selectivamente células cancerosas, así como nanosensores que permiten detectar en fluidos biológicos
cantidades extremadamente bajas de moléculas
que revelan la existencia de cáncer u otras enfermedades. Se están fabricando actualmente
dispositivos «laboratorio-en-un-chip» y se ha
pasado a la etapa de ensayo clínico para nanopartículas que realizan una liberación controlada de fármacos. Sin embargo, los largos procesos de aprobación en los sectores médicos y
farmacéuticos pueden significar que los beneficios para la salud sólo podrán apreciarse a largo
plazo. Aunque todavía es necesario llevar a cabo
una gran cantidad de investigación y desarrollo,
112
no cabe duda de que la nanotecnología seguirá
sorprendiéndonos con avances que redundarán
en una mejora de la calidad de vida de nuestra
envejecida sociedad y que ayudará a resolver
los problemas causados por las principales enfermedades (cáncer, desórdenes neurodegenerativos y enfermedades cardiovasculares).
Referencias
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www.magforce.com
8
Farmacocinética
de los medicamentos
obtenidos por biotecnología
Alfonso Domínguez-Gil Hurlé
Servicio de Farmacia
Hospital Universitario de Salamanca
Introducción
Los medicamentos obtenidos por biotecnología constituyen una clase terapéutica emergente
en la clínica que presenta unas características
diferenciales no sólo por su origen, sino también
por su estructura química y algunas propiedades farmacológicas.
Los medicamentos biotecnológicos incluyen
proteínas obtenidas por ingeniería genética,
anticuerpos monoclonales producidos mediante la tecnología del hibridoma, vectores
para el transporte de material genético, fragmentos de anticuerpos, oligonucleótidos antisentido, vacunas, etc. Estos productos presentan algunas características que los diferencia
de los medica-mentos tradicionales. Su estructura química, por ejemplo, es más compleja, ya
que se trata con frecuencia de proteínas que
contienen un número elevado de aminoácidos (filgastrim 174, somatropina 191, alteplasa
527, etc.) con una determinada secuencia, con
especificidad en el número y localización de
los puen-tes disulfuro e incorporación de una
o varias moléculas de carbohidratos que son
necesarias para la actividad biológica. La cadena proteica puede presentar además hélices
en distinto número, tamaño y configuración.
Asimismo, algunas proteínas activas requieren
la asociación de varias subunidades proteicas
para formar un gran agregado activo, estructura cuaternaria, como ocurre, por ejemplo con
el interferón-α-1b formado por dos proteínas
idénticas de 165 kDa unidas por uniones no
covalentes [1].
Toda sustancia con actividad farmacológica
queda definida no solamente por su configuración estructural, sino también por sus propiedades fisicoquímicas y biológicas, entre las que se
incluye el perfil farmacocinético que cuantifica,
mediante diversos parámetros, los procesos de
absorción, distribución, metabolismo y excreción [2].
La farmacocinética se ha consolidado durante los últimos años como una disciplina de
gran interés sanitario. Su aplicación se dirige,
principalmente, hacia el desarrollo de nuevos
medicamentos y a la optimización de los tratamientos farmacológicos [3]. Otras aplicaciones
menos conocidas son la detección diagnóstica
de respuestas anómalas, el análisis retrospectivo
de errores terapéuticos o tratamientos inadecuados y las actividades educativas encaminadas
a asegurar el uso seguro y eficaz de los medicamentos. Dentro de la investigación farmacológica, la farmacocinética puede dirigirse también
a la resolución de aspectos clínicos concretos,
como la detección de interacciones, problemas
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por biotecnología
113
Parémetros farmacocinéticos
Relacionados con el régimen de dosificación
Cmáx, AUC
Otros:
Fármaco
en el lugar de acción
F, Vd, CI
Parámetros farmacodinámicos
CE50
Fijación a receptores
Procesos posreceptor
Efecto
terapéutico
Efectos bioquímicos
Respuesta farmacológica
Figura 1. Relación de la farmacocinética y de la farmacodinamia con la respuesta terapéutica.
de biodisponibilidad, o a la definición de parámetros útiles para el diseño de regímenes de
dosificación individualizados. La farmacocinética
es hoy de gran utilidad para todos los profesionales implicados en el desarrollo, evaluación
y uso de los medicamentos. Para la profesión
farmacéutica tiene un especial interés, aunque
para su dominio se requiere, además, una sólida
formación en terapéutica farmacológica y en el
seguimiento clínico de los pacientes.
La actividad intrínseca que presenta un fármaco es condición necesaria, pero no suficiente
para asegurar la eficacia terapéutica. El fármaco
precisa, necesariamente, alcanzar su lugar de acción, no siempre bien definido, en ocasiones difícilmente accesible o cuya accesibilidad se modifica con la gravedad de la enfermedad. Para ello
se puede requerir, por ejemplo, una biodisponibilidad elevada, una amplia distribución tisular o
un lento aclaramiento plasmático. Unas propiedades farmacocinéticas desfavorables pueden
llegar a condicionar el potencial terapéutico de
un nuevo fármaco y aconsejar la interrupción
de los ensayos clínicos programados en su desarrollo. La figura 1 muestra esquemáticamente
la contribución de la farmacocinética y la farmacodinamia en la respuesta a un tratamiento
farmacológico [4].
114
Los resultados obtenidos en los estudios farmacocinéticos, junto a los procedentes de los
ensayos de eficacia y seguridad, configuran el
perfil farmacológico de un nuevo medicamento, permitiendo establecer los principios básicos
para su correcta utilización en la práctica clínica.
La investigación de nuevos fármacos se
orienta, con frecuencia, a mejorar algunas características farmacocinéticas, especialmente la
absorción gastrointestinal, la distribución tisular
y la velocidad de eliminación. Ello se consigue
mediante cambios en la estructura química o
en la formulación farmacéutica, que puede modificar la cinética de liberación, el acceso a los
tejidos e incluso los procesos de metabolismo y
excreción [5]. Estos cambios permiten mejorar
la efectividad de los tratamientos, bien por cambios en el perfil de la respuesta o facilitando la
administración y mejorando el cumplimiento de
la prescripción.
La estructura química que presentan la mayoría de los productos biotecnológicos condiciona
algunas propiedades que pueden dificultar su
utilización terapéutica y que se reflejan en su
perfil farmacocinético. Entre ellas destacan la
baja biodisponibilidad por vía oral, ciertas exigencias en la distribución tisular y celular y un
aclaramiento plasmático elevado.
Biodisponibilidad oral,
pulmonar y nasal
Los péptidos y las proteínas presentan una
baja biodisponibilidad por vía oral, generalmente inferior al 1%, por lo que en principio
no son candidatos idóneos para utilizar esta
vía de administración. Ello es debido a su inestabilidad en el medio fuertemente ácido del
estómago, al efecto producido por las peptidasas intestinales y, especialmente, a su escasa
permeabilidad como consecuencia del tamaño
molecular, la carga eléctrica y la elevada polaridad. La mayoría de las proteínas recombinantes se incluyen dentro de la clase III del sistema
de clasificación biofarmacéutica, solamente algunas pertenecen a la clase IV y es excepcional que algunas biomoléculas se incluyan en la
clase I. Es decir, los productos obtenidos por
biotecnología suelen presentar una solubilidad
en agua alta o moderada y una permeabilidad
intrínseca baja o muy baja [6]. Actualmente se
están desarrollando diferentes estrategias para
mejorar la biodisponibilidad oral de péptidos
y proteínas.
La vía pulmonar constituye una alternativa a
la vía oral para la administración de péptidos y
proteínas destinadas tanto a conseguir una acción local en el sistema respiratorio como para
producir efectos sistémicos. El empleo de biomoléculas se inició hace más de 70 años, cuando
se comprobó la absorción parcial de la insulina
administrada en forma de aerosol.
Para ejercer un efecto localizado, el fármaco
debe alcanzar de forma eficiente la superficie
a través del flujo aéreo, penetrando o incluso
atravesando la barrera mucosa para alcanzar su
lugar de acción. La tecnología de los aerosoles
ha alcanzado en los últimos años un desarrollo
que permite el control de las variables que pueden reducir el rendimiento del proceso.
Los agentes mucolíticos (dornasa-α) y las antiproteasas (inhibidores leucoproteasa, proteinasaα1, etc.) son más efectivos cuando se dispersan
en las secreciones del flujo aéreo en las zonas en
las que se produce una mayor obstrucción. Los
antioxidantes y los factores de crecimiento precisan, sin embargo, alcanzar las células epiteliales,
mientras que la terapia de transferencia génica
precisa no sólo alcanzar el epitelio pulmonar,
sino también las glándulas submucosas o las células progenitoras de epitelio.
La mucosa pulmonar constituye una barrera
importante para el paso de los fármacos que
están destinados a alcanzar el epitelio, acentuada en presencia de procesos inflamatorios o
infecciosos.
Diversos factores dependientes del fármaco,
como carga de las partículas, solubilidad y tamaño, así como las propiedades biofísicas del
mucus, afectan a la capacidad para atravesar esta
barrera [7]. Así, se ha demostrado la existencia
de una relación inversa entre el peso molecular
del fármaco y la difusión a través del mucus, que
es especialmente manifiesta a partir de 30 kDa.
La difusión a través del mucus se ve dificultada
por la fijación a algunos componentes, como la
mucina, ADN, etc. y al efecto de diversas enzimas. Entre los factores que aumentan la capacidad de difusión figuran la superficie efectiva
de tensoactivo y el incremento en el tiempo de
retención de las partículas.
La vía inhalatoria presenta algunas características ideales para la consecución de efectos sistémicos; así, destaca especialmente la superficie
de absorción, aproximadamente de 100 m2 con
pequeño espesor, de 100-200 nm.
Las moléculas pequeñas se absorben por difusión pasiva o transporte mediado por receptores. En el caso de macromoléculas, los péptidos pequeños, con un peso molecular inferior
a 40 kDa, pueden absorberse por transporte
paracelular, mientras que para valores superiores participa la transcitosis, mediada, en algunos
casos, por receptores de membrana. El proceso
puede ser relativamente rápido, con valores de
Cmáx de 10-30 minutos para pequeños péptidos
solubles, hasta varias horas cuando se trata de
grandes proteínas.
115
La vía nasal ha recibido en los últimos años
considerable atención debido a algunas características diferenciales respecto al tracto gastrointestinal y otras mucosas, como la escasa
actividad proteolítica, la reducida cobertura
mucosa, el pH, que se mantiene próximo a la
neutralidad, y la ausencia de alimentos o productos de la digestión que pueden reducir la
biodisponibilidad.
La vía nasal también puede utilizarse para la
administración de péptidos y proteínas destinadas a ejercer efectos sistémicos. Para moléculas
pequeñas, constituidas por 10 aminoácidos, la
biodisponibilidad es elevada, alcanzando en algunos casos el 100%. Sin embargo, para moléculas mayores de 25 aminoácidos se produce
un descenso muy acusado de la biodisponibilidad, hasta el 1% o incluso valores inferiores.
Las posibilidades de la vía nasal para la administración de biomoléculas pueden verse
aumentadas con la incorporación de agentes
viscosizantes, que aumentan su tiempo de contacto con la mucosa, y moléculas bioadhesivas,
que incrementan la permeabilidad.
La vía nasal ha sido utilizada por sus ventajas
para la administración de hormonas peptídicas
(desmopresina, oxitocina, calcitonina, etc.), aunque debe asegurarse el cumplimiento terapéutico por parte de los pacientes. Se encuentran
formulaciones en avanzado estado de desarrollo para administración endonasal de glucagón,
insulina, hormona de crecimiento, hormona
liberadora de hormona de crecimiento, somatostatina, etc. La formulación de insulina ha tenido mayores dificultades, debido a su tendencia a
la agregación de hexámeros en disolución acuosa y a su naturaleza hidrofílica. Por ello, para su
introducción en clínica ha precisado de la incorporación de promotores de absorción.
La vía nasal parece ofrecer buenas expectativas para la administración de vacunas. Los antígenos administrados por vía intranasal pueden
absorberse a través de los nódulos linfáticos
cervicales, pasar directamente a la circulación
sistémica debido a la alta densidad en la vas-
116
cularización de la mucosa o ser captados por
el tejido linfoide nasal (NALT) rico en células
M con capacidad para el transporte vesicular
transcelular de partículas y macromoléculas.
Administración parenteral
Debido a las limitaciones de la vía oral, los
péptidos y las proteínas se administran habitualmente por vía parenteral, preferentemente
intravenosa. La mayoría de estas moléculas presentan un rápido aclaración, lo que conduce a
valores bajos en la semivida de eliminación.
Los problemas que surgen con la administración parenteral de macromoléculas que presentan un rápido aclaramiento ha estimulado el desarrollo de diferentes actuaciones dirigidas, en
principio, a modificar el perfil farmacocinético y,
en consecuencia, facilitar su administración. Esto
se ha conseguido mediante cambios estructurales, por conjugación con diversos polímeros,
por hiperglicosilación de las proteínas y con el
desarrollo de formulaciones parenterales de liberación controlada [8-10].
La conjugación de péptidos y proteínas con
diversos polímeros constituye actualmente un
área de gran interés, especialmente en la terapéutica oncológica, a la que se han incorporado
proteínas antitumorales, enzimas, citocinas, etc.
La conjugación con polímeros produce cambios
significativos en el perfil farmacocinético de las
macromoléculas, permitiendo superar algunas
de las limitaciones que presentaban para su
utilización clínica. El principal cambio es un incremento en la semivida de eliminación con un
aumento de la captación celular por endocitosis.
Una vez en sangre, se produce la liberación del
conjugado a los compartimentos endosómicos
y lisosómicos de la célula, con descenso del pH
(5,5-6,0). Una vez alcanzado el lisosoma se produce la degradación metabólica por acción de
las hidrolasas intracelulares.
La pegilación de proteínas con una o varias
cadenas de polietilenglicoles (PEG) es, posible-
mente, el mecanismo de conjugación más desarrollado. Los PEG son polímeros lineales o
ramificados constituidos por unidades de óxido
de etileno (-CH2-O-CH2-) que presentan dos
grupos hidroxilo terminales, los cuales pueden
ser activados químicamente [11]. La reacción
de pegilación más frecuente implica al grupo
ε-amino de la lisina o grupos amino terminales
de las proteínas. Las biomoléculas conjugadas
presentan propiedades fisicoquímicas diferentes
de las proteínas originales, como cambios en la
conformación, impedimento estérico, capacidad
de unión electrostática, valores de pK locales de
la lisina, hidrofobia, punto isoeléctrico, etc. Estos
cambios pueden quedar reflejados, en principio,
por variaciones en la actividad, detectada mediante ensayos in vitro, y en la eficacia, establecida con ensayos in vivo. La fijación a receptores
se reduce progresivamente al aumentar la masa
molecular del polímero, lo que produce un descenso de la actividad in vitro con tiempos de
incubación cortos. Sin embargo, la eficacia de la
proteína se incrementa como consecuencia de
los siguientes mecanismos:
•Retraso en el aclaramiento renal de la proteína, que produce un incremento en la semivida de eliminación y en el valor del área
bajo la curva de niveles séricos. Este último
parámetro refleja el «periodo de exposición»
y se relaciona, en ocasiones, con la eficacia en
modelos pK-pD.
•Mayor estabilidad frente a las enzimas responsables de la degradación de péptidos y proteínas, frecuentemente como consecuencia del
impedimento estérico.
•Menores efectos adversos debido a que el
PEG reduce significativamente la inmunogenicidad y antigenicidad de las proteínas.
La pegilación produce importantes cambios
en el perfil pK-pD de los péptidos y proteínas
utilizados en clínica. Actualmente se dispone de
varias proteínas pegiladas y son numerosas las
que se encuentran en diferentes fases de de-
sarrollo. La PEG-ADA (adenosina desaminasa)
está aprobada para el tratamiento de la deficiencia de ADA en pacientes con inmunodeficiencia combinada grave. Se trata de un conjugado de ADA con múltiples cadenas de PEG de
un peso molecular de 5 kDa. La consecuencia
más inmediata es un cambio en la semivida de
eliminación de la enzima de unos pocos minutos a aproximadamente 24 horas.
La pegilación de interferones también produce cambios significativos en el perfil farmacocinético-farmacodinámico que pueden suponer
un progreso en el tratamiento de la hepatitis C
y otras indicaciones. La figura 2 muestra el efecto provocado en las concentraciones séricas
del interferón-α-2a como consecuencia de su
conjugación con el PEG. El efecto depende del
tamaño del polímero y se ha considerado que
dos cadenas ramificadas de 20 kDa proporcionaban un perfil farmacológico idóneo para el
desarrollo clínico [12].
Durante los pasados 20 años se han estudiado numerosos conjugados de proteínas
con PEG (citotóxicos, antioxidantes, enzimas,
trombolíticos, citocinas y factores de crecimiento hematopoyético, etc.), aunque sólo
algunos se encuentran en fase de desarrollo
clínico. La conjugación con PEG también se ha
aplicado a oligonucleótidos y lípidos para aumentar su solubilidad, estabilizar las moléculas, incrementar la permeabilidad o disminuir
el aclaramiento [13].
Los glucoconjugados son los compuestos resultantes de la unión covalente de una fracción
glucídica con otro compuesto, que puede ser
protídico o lipídico. La eritropoyetina recombinante es una glucoproteína utilizada desde hace
más de 10 años en el tratamiento de la anemia
renal. Su excreción renal es mínima, y es ampliamente metabolizada en el hígado vía receptores de la galactosa. Los residuos de ácido siálico
eliminados en el proceso de biotransformación
aseguran la estabilidad de la hormona y su actividad biológica. El metabolito desprovisto de
ácido siálico es rápidamente eliminado, siendo
117
Interferón-α-2a
PEG-Interferón-α-2a (5 kDa)
1,6
Concentración
Concentración
12
8
4
0
0
25
50
75 100 125
Tiempo (h)
0,8
0,4
0
150
0
25
50
75 100
Tiempo (h)
125 150
PEG-Interferón-α-2a (40 kDa)
25
Concentración
1,2
20
15
10
5
0
0
25
50 75 100 125 150
Tiempo (h)
Figura 2. Farmacocinética de interferón y dos derivados pegilados.
la semivida de eliminación de la eritropoyetina
de 4-8 horas.
Diversos estudios experimentales han demostrado que hay una relación directa entre el contenido de ácido siálico y la semivida de eliminación
de las glucoproteínas, lo que ha sido un estímulo
para la búsqueda de nuevas moléculas.
Darbepoetina es un análogo hiperglicosilado
de eritropoyetina que presenta distintas propiedades fisicoquímicas y biológicas. La figura 3
recoge la estructura de ambas moléculas estimulantes de la eritropoyesis, así como la evolución de los valores séricos obtenidos tras su
administración por vía intravenosa. La principal
consecuencia del cambio producido en el perfil
farmacocinético es la modificación del intervalo
de la posología, que pasará de 3 a 4 días con eritropoyetina a 7-14 días con darbepoetina [14].
En los últimos años se han desarrollado numerosas matrices poliméricas biodegradables y
biocompatibles que se han incorporado a mi118
crocápsulas, microesferas, nanoesferas e implantes para conseguir una liberación prolongada de
pequeñas moléculas. Actualmente algunos de
estos polímeros se utilizan en el diseño de formulaciones parenterales de medicamentos obtenidos por biotecnología [15]. Entre ellos destacan los poli (±-hidroxiácidos) –como el ácido
poliláctico y el polihidroxibutírico– y los copolímeros, especialmente el ácido láctico-ácido glicólico. Estos productos no son inmunogénicos
y permiten, por sus propiedades fisicoquímicas,
controlar la velocidad de liberación de péptidos
y de proteínas.
Distribución tisular
y celular
La incorporación de los fármacos a órganos y
tejidos corporales es un proceso cinético com-
Eritropoyetina
Darbepoetina
• 3 enlaces-NH-glicosídicos
• ≤ 14 residuos ácido sialico
• 5 enlaces-NH-glicosídicos
• ≤ 22 residuos ácido sialico
• 30.400 Da
• 40% carbohidratos
• 38.500 Da
• 52% carbohidratos
Concentración sérica (ng/ml)
Darbepoetina
10
Eritropoyetina
1
0,1
0,01
0
12
24
36
48
60
72
84
96
Tiempo posinyección i.v. (horas)
Figura 3. Estructura y farmacocinética de eritropoyetina y darbepoetina.
plejo con una gran repercusión en la respuesta
terapéutica. La velocidad de distribución puede
estar limitada por la perfusión sanguínea o por
la permeabilidad lo que condiciona el acceso y
permanencia en su lugar de acción. La fracción
de la dosis de un fármaco que alcanza finalmente los tejidos o incluso los espacios intracelulares obedece a numerosos factores, muchos de
ellos dependientes de sus propiedades fisicoquímicas. Por ello, las pequeñas moléculas con
un óptimo coeficiente de reparto acceden con
facilidad a los compartimentos periféricos y presentan valores elevados del volumen aparente
de distribución, a diferencia de los péptidos y
proteínas que muestran valores relativamente
pequeños. El elevado peso molecular de algunas
biomoléculas constituye un factor limitante de
la distribución tisular. Sin embargo, en algunos
casos es posible alcanzar el lugar de acción en
concentración suficiente para producir una respuesta terapéutica adecuada.
La especificidad en la localización del lugar
de acción de muchos fármacos obtenidos por
biotecnología obliga a mayores exigencias en su
perfil de distribución. El desarrollo de los factores de crecimiento y genes recombinantes para
promover la angiogénesis en el infarto de miocardio es un buen ejemplo de la importancia
de esta característica farmacocinética [16]. La
administración intravenosa del factor de creci-
miento de fibroblastos (FCF) no produce respuesta angiogénica en modelos experimentales
de isquemia miocárdica. Por esto ha sido necesario recurrir a la administración directa en el
miocardio, en el saco pericárdico o en el espacio perivascular para alcanzar la respuesta terapéutica deseada. La eficacia de estas alternativas
fue confirmada y evaluada por la medida del flujo y función miocárdica, aunque se hace preciso
aún aplicar nuevas técnicas, como la tomografía
de emisión de positrones o la resonancia magnética para establecer, de forma más precisa, la
extensión de la respuesta angiogénica.
Una situación más problemática se plantea
cuando se precisa el acceso intracelular de genes y oligonucleótidos antisentido cuya diana
está localizada en el compartimento citosol/
núcleo [17]. Se han propuesto diferentes mecanismos para explicar la interiorización de estas
moléculas, como la endocitosis en fase fluida y
la endocitosis mediada por receptores, ya que
no hay evidencia de paso por difusión pasiva,
ni siquiera recurriendo a biomoléculas neutras.
En el momento actual, la escasa capacidad de
interiorización y la inadecuada compartimentación intracelular constituyen un problema básico en el progreso de la terapéutica antisentido.
Recientemente se han desarrollado diferentes
métodos físicos (microinyección, permeabilización, electroporización, etc.), que mejoran
119
la captación celular de los oligonucleótidos en
relación con los métodos convencionales de
conjugación o los que recurren a transportadores (liposomas, lipoplexes, policationes, etc.).
También puede recurrirse a la administración
de estos medicamentos en el tejido diana, como
el fomivirsen, administrado por inyección intravítrea directa en el tratamiento de la retinitis
por citomegalovirus.
La selectividad en la distribución permite mejorar la relación beneficio-riesgo de numerosos
medicamentos, lo que puede incrementar su
potencial terapéutico. Esta última consideración
ha vuelto a poner de actualidad el concepto de
«bala mágica», idealización introducida por Paul
Erlich hace casi un siglo y que, gracias a la biotecnología, puede convertirse en una realidad [18].
Los sistemas de transporte coloidal, como
liposomas, nanopartículas, microsferas, etc., se
han utilizado para prolongar el tiempo de circulación de numerosas moléculas, protegerlas de
la degradación y dirigirlas a tejidos diana. Estos
sistemas tienen dificultades para acceder a los
tejidos sanos, debido, entre otros factores, a su
tamaño, especialmente si supera 20 nm, considerado el tamaño crítico para la mayoría de los
tejidos.
El desarrollo de los anticuerpos monoclonales representa una de las técnicas más poderosas para dirigir fármacos, tóxicos, isótopos y
enzimas a su lugar de acción. El gemtuzumab
es un anticuerpo recombinante humanizado
dirigido frente al antígeno CD33 y unido a la
calicheamicina, un potente antibiótico tumoral.
Se trata del primer fármaco vectorizado introducido en quimioterapia y fue aprobado por la
FDA a finales del año 2000 en el tratamiento
de la leucemia mieloide aguda en casos de recidivas. Gemtuzumab se une al antígeno CD33,
expresado en el 80-90% de los pacientes con
leucemia mieloide aguda, penetrando en la célula y liberando el agente citotóxico que provoca
la muerte celular.
El potencial terapéutico de estos agentes se
ha incrementado desde la introducción de la
120
tecnología del hibridoma en la década de 1970,
y actualmente se dispone de fármacos inhibidores de la reactividad aloninmune y autoinmune,
antitumorales, antiplaquetarios antivirales, etc. En
España, se han introducido recientemente trastuzumab, infliximab y rituzimab, aunque otros
muchos se encuentran en diferentes fases de
desarrollo, alcanzando casi el 25% de todos los
productos obtenidos por biotecnología [19].
A pesar de las ventajas potenciales que presentan al fijarse selectivamente a las células
diana, su incorporación a la terapéutica mostró
mayores dificultades de las inicialmente previstas. Entre ellas, la capacidad limitada de penetración tisular que depende, entre otros factores,
de las dimensiones del anticuerpo. Los anticuerpos convencionales son proteínas de elevado
peso molecular que presentan una baja capacidad de acceso a los tejidos –especialmente
los que tienen una escasa vascularización–. En
terapéutica oncológica con anticuerpos monoclonales, la relación de concentraciones entre el
tumor y la circulación sistémica se incrementa
lentamente durante varios días debido, a la eliminación del anticuerpo y, en menor grado, a la
captación tumoral [20].
Conclusión
La efectividad clínica de los medicamentos
obtenidos por biotecnología está condicionada
por su perfil farmacocinético. Algunas relaciones
pK-pD confirman que los parámetros farmacocinéticos son buenos factores de predicción de
la respuesta terapéutica.
Por su estructura química, estas biomoléculas
presentan algunas limitaciones para su utilización clínica, especialmente una biodisponibilidad
oral baja y un rápido aclaramiento plasmático.
Por ello, se han realizado importantes esfuerzos
para mejorar sus características farmacocinéticas, entre las que debe destacarse la importante contribución de la tecnología farmacéutica
mediante el diseño de diferentes formulaciones
que mejoran sensiblemente el perfil farmacocinético. El profesor Robert S. Langer, del Massachusetts Institute of Technology, uno de los
investigadores de mayor prestigio en el diseño
de formas de liberación de medicamentos señalaba recientemente: «I am very excited by the fact
that the first protein delivery systems are coming
on the market and that a lot of a protein delivery
systems are moving into the clinic...».
De forma progresiva se van incorporando
nuevas biomoléculas al arsenal terapéutico, indicadas especialmente en el diagnóstico y tratamiento de patologías graves. Una progresión
similar experimenta la formulación farmacéutica,
que ha culminado recientemente con la presentación de un microchip aplicado a la liberación
controlada de medicamentos, incluidos péptidos y proteínas.
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121
9
Aplicaciones
de la biotecnología
recombinante vegetal
a la terapéutica humana
Fernando Ponz
Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (UPM-INIA)
Campus de Montegancedo. Pozuelo de Alarcón. Madrid
Desarrollo
de la biotecnología vegetal
Durante las dos últimas décadas se han producido en el conjunto de las actividades ligadas a la investigación genética en plantas una
serie de innovaciones y cambios tecnológicos
que se han englobado bajo la denominación
de biotecnología vegetal y que constituyen una
verdadera revolución, no sólo de la investigación y el desarrollo agrario, sino de toda una
concepción de la agricultura tradicional y de la
utilización económica de las plantas. Sin duda
la capacidad de generar plantas transgénicas
constituye una de estas nuevas tecnologías sobre las que pivota el cambio global que se está
produciendo. Hoy día, prácticamente ya no hay
ninguna especie vegetal cultivada importante
para la que no se disponga de la capacidad de
transgénesis.
Transgénesis vegetal mediante
Agrobacterium tumefaciens
La transgénesis vegetal no se realiza en la
actualidad de un modo único. Los primeros
122
desarrollos, todavía ampliamente utilizados,
se basaron en la capacidad natural de la
bacteria A. tumefaciens y relacionadas para
in¬tegrar de forma estable par te de su material genético en el genoma de sus plantas
huésped. La manipulación subsiguiente del
genoma de Agrobacterium permitió disponer en breve plazo de vectores desarmados
(exentos de la capacidad de inducir enfermedad que poseen los aislados naturales de
la bacteria) para llevar a cabo integraciones
estables de genes foráneos. La clonación de
estos genes en los vectores de Agrobacterium permite que la bacteria los integre en el
genoma de las futuras plantas transgénicas.
En general, el proceso de transformación se
complementa con un conjunto de tecnologías de cultivo in vitro de tejidos vegetales,
que permiten regenerar plantas enteras fértiles a par tir de determinados tejidos transformados cultivados. Como se ha dicho, esta
tecnología de generación de plantas transgénicas se utiliza todavía ampliamente, aunque más recientemente se han desarrollado
otras formas de transformación de plantas,
lo cual a su vez ha permitido ampliar el abanico de especies transformables.
Otros métodos
de transformación de plantas
De entre todos los desarrollos habidos desde las primeras transformaciones de discos de
hojas de tabaco con Agrobacterium, merecen
destacarse 2 por la simplicidad que han añadido al proceso. En primer lugar la biolística, que
implica el disparo de microproyectiles de oro,
wolframio, etc., recubiertos del ADN que se
desea integrar en el genoma de la planta. Esta
técnica evita la utilización de la bacteria en el
proceso de transformación y es especialmente
interesante en los casos de especies vegetales
que no son huéspedes naturales de la bacteria,
como es el caso de los cereales (en general, de
las plantas monocotiledóneas). El otro desarrollo reciente es el que permite en algunas especies, sobre todo experimentales, llevar a cabo
la transformación con la bacteria directamente
sobre las flores, lo que posibilita la obtención
directa de semillas de plantas transgénicas sin
necesidad de recurrir al cultivo in vitro.
Genómica y proteómica
vegetales
Disponer de plantas transgénicas constituye
un hito importante en el desarrollo de la biotecnología vegetal, pero no es el único. En efecto,
la capacidad para el análisis pormenorizado de
los genomas vegetales, tanto en su vertiente estructural como funcional, se ha desarrollado en
paralelo con la transgénesis y empieza a permitir la racionalización de muchos de los procesos
clásicos de la mejora genética y, también, de la
propia transgénesis. Las nuevas disciplinas de la
genómica y la proteómica, cuyas aplicaciones al
estudio del genoma humano están provocando
toda una nueva forma de buscar y diseñar fármacos, están también teniendo un fuerte impacto en la biotecnología vegetal. La conjunción de
ambas tecnologías supone un potencial enorme
de incidencia en procesos de desarrollo controlado de las plantas, así como de su utilización para
otras áreas biotecnológicas, como por ejemplo
la farmacia. Como en tantas otras ocasiones anteriores, el desarrollo tecnológico ha permitido
poner de manifiesto conceptos de índole más
fundamental, en un proceso de alimentación mutua muy característico de todas las actividades
de I + D. Así, por ejemplo, fenómenos como la
cosupresión y el silenciamiento génico mediado
por ARN se han descubierto y estudiado por
primera vez en plantas, gracias al propio desarrollo tecnológico de la biotecnología vegetal. Tras
su descubrimiento en el campo vegetal, se ha
demostrado en los últimos 2-3 años la existencia de fenómenos similares en animales, incluido
el hombre, abarcando todo un nuevo sistema
de regulación de la expresión génica basado en
micro-ARN. Las implicaciones de este descubrimiento en las aproximaciones terapéuticas a enfermedades, tanto genéticas como infecciosas, se
están revelando en la actualidad de una enorme
importancia.
Generaciones de productos
vegetales biotecnológicos
Primera generación de plantas y productos vegetales
transgénicos
Las primeras variedades transgénicas de algunas plantas de cultivo mundial muy extenso
como, por ejemplo, el maíz, la soja, la colza o
el algodón, ya han llegado al mercado y tanto
ellas como sus productos derivados están en
estos momentos en el centro de una fuerte polémica social que se está desarrollando en varios frentes y a diferentes niveles. Los ejemplos
citados forman parte de lo que se ha dado en
llamar la primera generación de plantas y productos transgénicos. Su principal característica
es que las modificaciones genéticas que se les
han introducido van a dirigidas a mejorar características de las plantas que son de interés
fundamentalmente para sus productores, o sea,
para los agricultores. Así, plantas que expresan
Aplicaciones de la biotecnología recombinante vegetal a la terapéutica humana
123
constitutivamente un gen de una toxina para
insectos procedente de una bacteria, que sobrexpresan una enzima que inactiva la acción
de un herbicida o que son resistentes a una
virosis gracias a la resistencia conferida por la
producción en planta de fragmentos del propio
virus, son plantas de un interés obvio e inmediato para el productor primario. La Organización
para la Cooperación y Desarrollo Económico
(OCDE), que ha estudiado intensamente en los
últimos años el fenómeno de la biotecnología
desde muchos ángulos, ha definido esta primera
generación de cultivos transgénicos «centrada
en características agronómicas para conferir
mayores rendimientos en las cosechas mediante la reducción de pérdidas y espaciamientos
menores entre hileras, y para reducir costes de
insumos mediante la disminución del uso de
plaguicidas y herbicidas». Otras dos características de los productos de la primera generación
son su irrelevancia para el consumidor final, así
como que no suponen un cambio de mercado.
Se trata, en definitiva, de plantas cuyos productos van dirigidos a los mismos mercados que
sus parientes no transgénicas y que no suponen
cambios sustanciales para el consumidor, excepto quizá su menor precio, consecuencia de unos
menores costes de producción.
Segunda generación
de plantas y productos vegetales
transgénicos
Existen ya una segunda y una tercera generación de plantas transgénicas, cuya llegada al mercado se está produciendo aún con timidez, pero
de las que se espera un gran impacto comercial
en los próximos años. De nuevo según la OCDE,
la segunda generación de plantas transgénicas
«se centra en una serie de caracteres relacionados con la calidad, que mejorarán su aplicación
en los sistemas de producción de alimentos así
como sus características de uso finales. Cosechas con modificaciones en las grasas, aceites
y almidones para mejorar el procesamiento y
124
la digestibilidad, como sojas de alto contenido
en ácido oleico, colzas de alto estearato o ácido
láurico (cultivándose ya en los Estados Unidos),
maíz de bajo fitato o ácido fítico. Desde un
punto de vista industrial se pueden esperar, p.
ej., plantas de algodón coloreado que eviten o
disminuyan la necesidad de tintes químicos (algunas ya disponibles)». Se aprecian en esta segunda generación algunos cambios sustanciales
en relación con la primera. En primer lugar hay
un cambio de mercado final. Las modificaciones
genéticas ya no se hacen pensando fundamentalmente en el productor, sino en el consumidor
del producto final, al cual se le proporciona un
producto de mayor calidad. Por supuesto es
posible combinar características típicas de esta
segunda generación con otras de la primera, si
se desea o el mercado lo demanda. Así, es posible producir patatas con unas características
de almidón más adecuadas para su congelación
y fritura directa en freidora, que además sean
resistentes al escarabajo de la patata mediante la expresión de la toxina bacteriana. La otra
característica de algunos de los productos de
la segunda generación es que presentan un
aspecto de interfase con cuestiones más clásicamente relacionadas con problemas de salud
humana que con consideraciones meramente
agroalimentarias. Por ejemplo, la producción de
aceite de soja con un mayor contenido en ácido
oleico se hará teniendo muy en cuenta factores
de salud relacionados con enfermedades cardiovasculares, además de otros factores de producción agraria,o algunas de las modificaciones
en los metabolismos de hidratos de carbono de
plantas como la patata o algunos cereales considerarán el tamaño creciente de mercado que
suponen los consumidores diabéticos.
Tercera generación de plantas
y productos vegetales
transgénicos
Si la segunda generación de productos biotecnológicos vegetales supone un grado de so-
fisticación considerable en relación con los de la
primera, aun lo será más con los productos de
la tercera generación. La OCDE predice que estas plantas «producirán más factores de calidad
de cara a un producto final, como productos
de nutricéutica o alimentos funcionales, que son
cosechas modificadas para producir medicinas
o suplementos alimentarios en la planta. Estas
plantas podrían inducir inmunidad a enfermedades o mejorar características sanitarias de los
alimentos tradicionales, como, p. ej., colza con ßcarotenos o arroz suplementado con vitamina
A. También se prevén plantas que fijen nitrógeno con mayor eficacia, disminuyendo por tanto
la necesidad de abonos, o plantas resistentes a
la sequía, las inundaciones y las temperaturas
extremas, así como plantas que se puedan utilizar en procesos de biorremediación de suelos
y aguas. También se ha sugerido la posibilidad
de producir plantas de algodón incombustible o
que no se arrugue, o plantas de colza que produzcan plásticos biodegradables (esto ya se ha
conseguido)». Es en estos productos de tercera
generación donde se producirá el verdadero
cambio que aporta la biotecnología a la producción vegetal. Los mercados a los que se dirigen
estos productos pueden ser tradicionales del
producto agrario, pero serán básicamente mercados nuevos. La interfase entre la producción
vegetal e industrias que son en estos momentos
ajenas a la agricultura o utilizan productos agrarios de manera muy minoritaria, se verá fuertemente incrementada cuando estos productos
alcancen masivamente el mercado. De entre
todas estas industrias es quizá la farmacéutica la
que se prevé que se afecte antes en sus estructuras de producción de determinados productos por el impacto de la biotecnología vegetal.
Hay dos niveles de impacto entre productos
biotecnológicos vegetales y la producción de
medicamentos. El primero es el de utilizar las
plantas como biofactorías de producción de
fármacos o productos de interés farmacéutico.
Esta actividad constituye el factor más importante de lo que se denomina «agricultura mo-
lecular» (molecular pharming) y que se describe
con algo más de detalle en el siguiente apartado. La otra constituye una verdadera síntesis
entre la agricultura, la alimentación y la farmacia,
y es la base de una nueva disciplina científica
emergente, la «nutricéutica», como parte de un
concepto más general que es el del «alimento
funcional». Conferir una funcionalidad sanitaria
al hecho de alimentarse supone profundizar en
una tendencia creciente en las sociedades avanzadas, como es la de la «comida sana», confiriendo al hecho de alimentarse una vertiente
curativa, o más bien, y en mayor medida, preventiva. Quedan mencionadas anteriormente
las posibilidades de plantas con suplementos
vitamínicos, pero quizá el paradigma de lo que
puede ser esta nueva actividad farmacéutica lo
constituyan las llamadas «vacunas comestibles».
Esta idea intenta explotar la inmunidad mucosal
de las personas y los animales (también aplicaciones veterinarias) mediante la presentación
de antígenos con potencial vacunal por medio
de alimentos procedentes de plantas transgénicas que expresen dichos antígenos. Algunas de
las primeras pruebas realizadas en animales de
experimentación han resultado muy prometedoras y las pruebas clínicas ya han empezado
en algún caso. Además de la posible implantación de este tipo de vacuna alimenticia en las
poblaciones infantiles de países desarrollados,
lo cual resulta algo cuestionable desde el punto
de vista de la rentabilidad y ventajas económicas y de gestión, esta aproximación presenta
una vertiente social de indudable valor, como
es poder alcanzar segmentos de población que
en estos momentos no está sometida a programas de vacunación, fundamentalmente por
motivos económicos –especialmente en países
no desarrollados–. Ello podría incluir enfermedades infecciosas tropicales de baja incidencia
en países desarrollados, como el cólera, la malaria o la fiebre amarilla, para las que se podrían
plantear vacunaciones fundamentadas en vacunas comestibles basadas en productos de alto
consumo (yucas, bananas, etc.).
125
Producción de fármacos
en plantas
Producción en plantas
transgénicas
La agricultura molecular ha comenzado su
andadura orientada básicamente a la producción de fármacos en plantas y, de entre ellas,
los primeros productos que han despertado
el mayor interés entre los biotecnólogos vegetales han sido las proteínas terapéuticas.
Existen ya en la literatura científica numerosos
ejemplos de plantas transgénicas productoras
de proteínas humanas con valor terapéutico.
Los resultados obtenidos hasta el momento
permiten ser muy optimista con respecto a la
evolución creciente de esta tecnología, pero al
tiempo ilustran con claridad la complejidad de
situaciones que se pueden producir al generar
las plantas productoras. Algunos de los puntos
que se están revelando claves para el éxito o el
fracaso de esta aproximación global son variados como, p. ej., las enormes diferencias de expresión del transgén que se encuentran en los
distintos casos, la problemática de extracción
de las proteínas producidas, el grado de similitud en el procesamiento post-traduccional
de las proteínas, etc. Cada uno de estos puntos requerirá un esfuerzo de afinamiento de
las condiciones de producción que necesitará soluciones parcialmente distintas para cada
caso, por lo que es difícil en estos momentos
ir mucho más allá en las generalizaciones. En
la actualidad no hay todavía ninguna proteína
terapéutica humana producida en plantas que
se encuentre en el mercado, pero ya hay algunas en las fases de pruebas clínicas. Quizá
la más avanzada sea un anticuerpo producido
en la planta del tabaco que se pretende utilizar, por medio de colutorios, en el tratamiento y prevención de las caries y enfermedades
infecciosas de las encías. Los costes menores
de producción de grandes volúmenes de un
anticuerpo de estas características en plantas
126
de tabaco posiblemente permitan lanzar al
mercado ese tipo de producto sin disparar el
precio para el consumidor final. Al margen de
los problemas nuevos que se vayan poniendo
de manifiesto en la producción de fármacos
en plantas según se vayan desarrollando los
procesos, esta estrategia de producción presenta algunas ventajas inherentes respecto de
los métodos tradicionales de extracción de
tejidos humanos y animales o de procesos de
fermentación. Queda ya mencionado el probable menor coste, pero hay más: p. ej., el de la
seguridad sanitaria del fármaco. La reciente crisis de las encefalopatías espongiformes bovinas
y su probable relación con algunas enfermedades humanas del tejido nervioso ha puesto
claramente de manifiesto el riesgo de arrastrar
desde tejidos animales en los procesos de extracción, patógenos de difícil detección o eliminación. Este riesgo se elimina totalmente en
las plantas, ya que éstas no permiten la multiplicación de estos patógenos (priones, virus
del SIDA, virus de las diferentes hepatitis, etc.).
Además, las plantas pueden constituir el único
sistema capaz de producir eficientemente ciertas proteínas humanas, como reguladores del
crecimiento e inhibidores del ciclo celular, que
tendrían un impacto negativo en los animales
transgénicos o en las células animales cultivadas
en las que se expresaran. Otra consideración
es la de capacidad de producción del fármaco,
la cual puede llegar a ser limitante en algunos
casos. Un caso citado con frecuencia de esta
última situación es el del potencial tratamiento
del cáncer mediante inmunoterapia. Cálculos
efectuados en Estados Unidos predicen que
cada paciente puede llegar a necesitar entre
10 y 200 mg de anticuerpo recombinante antitumoral, lo cual, dado el ritmo de diagnóstico
de nuevos casos (al año, 650,000 de cánceres
de mama, pulmón y colon sólo en los Estados
Unidos), puede llegar a crear una demanda de
unos 130 kg por año en aquel país. Prácticamente, sólo la producción en plantas puede
asegurar ese nivel de producción a un precio
razonable.
Producción mediada por virus
vegetales
El punto de la producción de grandes cantidades del fármaco que se desea obtener ha
puesto de manifiesto un problema al que se
enfrentan las plantas transgénicas como vía de
producción. Como se ha mencionado previamente, con la tecnología disponible en la actualidad es prácticamente imposible predecir los
niveles de expresión del gen foráneo que se
alcanzarán en una línea transgénica determinada y, de todas formas, parece razonable pensar
que la expresión a partir de un promotor tiene
que presentar límites cuantitativos difíciles de
sobrepasar. Por otra parte, establecer una línea
transgénica productiva y genéticamente estable
puede llevar muchos meses, incluso años. Situaciones como la de los anticuerpos antitumorales, mencionada anteriormente, son claramente
incompatibles con estas limitaciones pues se
trata de fármacos personalizados de los que se
necesitan grandes cantidades en períodos breves de tiempo (semanas a unos pocos meses).
Este tipo de consideraciones, junto con algunas
otras de carácter más cercano a la estrategia
comercial, han hecho que bastantes investigadores y empresas de biotecnología se hayan
fijado en los virus vegetales como vehículos de
expresión de los genes foráneos. Los virus vegetales suelen ser agentes infecciosos muy simples
genéticamente, por lo que su manipulación genética no resulta excesivamente compleja. Generalmente se multiplican hasta alcanzar niveles
de acumulación de viriones bastante elevados,
lo cual se encuentra también para algunos de
sus productos génicos individuales y, por extrapolación, para proteínas producidas a partir de
genes foráneos introducidos en ellos. Además,
desde el punto de vista de la rapidez de producción, resulta mucho más rápido generar un
virus transgénico que una planta transgénica. Estas características hacen de los virus vehículos
de expresión muy interesantes y que se están
desarrollando rápidamente en la actualidad. Una
consideración adicional para algunas aplicacio-
nes es que es factible combinar ambas estrategias (plantas transgénicas y vectores virales), lo
cual permitiría elegir lo mejor de ambas.
La interfase virus vegetales/
nanobiotecnología biomédica
En los últimos 5 o 6 años varios grupos pioneros en algunos centros de investigación están explorando intensamente la posibilidad de
aprovechar los viriones vegetales como nanopartículas con aplicaciones biomédicas. El desarrollo de la nanotecnología en biomedicina está
acelerándose notablemente y el hecho de que
los viriones sean en sí mismos nanopartículas
biológicas naturales, no ha pasado desapercibido. Viriones vegetales pertenecientes a distintos
virus han sido convertidos en plataformas portadoras de péptidos, anticuerpos, antígenos de
todo tipo, moléculas contraste para utilización
en diagnóstico por imagen, o nanovasijas portadoras de drogas antitumorales, por citar sólo
unas cuantas aplicaciones. Aunque todavía lejos
de la utilización clínica, los resultados obtenidos
hasta la fecha permiten ser muy optimista en
este campo, que sin duda va ser uno de los de
mayor expansión en el futuro próximo.
La estructura de la empresa
biotecnológica farmacéutica
vegetal
El rápido desarrollo de la biotecnología vegetal está contribuyendo también, junto con otros
desarrollos biotecnológicos, a la profunda transformación que se está experimentando en la actualidad en la estructura empresarial de varios
sectores industriales ligados a las ciencias de la
vida. Hay características muy llamativas de la nueva situación. Por un lado, surgen constantemente
(sobre todo en Estados Unidos) nuevas pequeñas empresas con un alto contenido tecnológico
que contribuyen de manera muy significativa al
rápido desarrollo de la biotecnología; muchas
de estas empresas fracasan en su proyecto empresarial o son finalmente absorbidas por otras
127
empresas mayores. Por otro, este proceso de absorción empresarial se da también entre grandes
empresas multinacionales, lo cual está generando
una situación de concentración empresarial sin
precedentes. Otra característica es la de la creación de un sector industrial completamente nuevo, que se denomina «de empresas de ciencias
de la vida». Este tipo de empresas se diferencian
de las clásicas farmacéuticas –o de productos
agrarios o alimentarios– en que integran en su
seno ambos mundos, reflejo de la interfase creciente entre ambas actividades, que se ha comentado varias veces a lo largo de este capítulo.
Con referencia al futuro, es razonable pensar que
ambas tendencias (nuevas pequeñas empresas
tecnológicas y grandes grupos empresariales) seguirán desarrollándose, creando una estructura
de producción farmacéutica nueva. Sin embargo,
el fenómeno es todavía muy reciente y habrá que
estar atento a su evolución.
Referencias
El número de trabajos que abordan de manera pública los temas referidos a la producción de
fármacos en plantas mediante biotecnología es
aún limitado, dada su relativa novedad. Además,
bastantes de estos trabajos se publican en revistas especializadas de investigación en plantas de
menor difusión en los ambientes médicos o farmacéuticos. Sin embargo, en los últimos años se
han publicado un número importante de buenos artículos de revisión sobre este tema que
proporcionan una visión general y un buen nivel
de información al lector interesado. Se presenta
a continuación, como orientación, una lista de
algunas de estas revisiones.
1. Gomord W, Sourrouille C, Fitchette AC, Bardor M,
Pagny S, Lerouge P, Faye L. Production and glycosylation of plant-made pharmaceuticals: the antibodies as
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128
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moving from diagnostic protein and antibody production in microbes to plants. Biotechnol Appl Biochem.
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produce novel products. Curr Opinion Plant Biol.
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10
Evaluación de medicamentos
biotecnológicos en la Agencia
Europea de Medicamentos
(EMA), BWP (Grupo
de Biológicos) y CHMP
(Comité de Medicamentos
de Uso Humano)
Sol Ruiz
Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios (AEMPS)
Introducción
Durante la década de 1980, los avances en
ingeniería genética y en el establecimiento y
cultivo de líneas celulares han permitido la obtención de multitud de proteínas terapéuticas
(p. ej., eritropoyetina, hormona de crecimiento,
interferón) que nunca hubiese sido posible obtener en cantidad suficiente de sus fuentes naturales. Además, el desarrollo de las técnicas de
ingeniería de proteínas ha permitido disponer
de proteínas modificadas respecto a sus equivalentes naturales que presentan una mejor eficacia clínica, un mejor perfil de seguridad o una
nueva aplicación terapéutica. Así, se encuentran
disponibles análogos de insulina o eritropoyetina (p. ej., insulina lispro, darbepoetin alfa), proteínas de fusión que combinan características
de dos proteínas diferentes (p. ej., etanercept),
proteínas conjugadas a polietilénglicol (p. ej., peginterferon, pegfilgrastim) o anticuerpos monoclonales «humanizados» (p. ej., alemtuzumab).
Desde la creación de la EMEA, actualmente EMA, en 1995, la evaluación de estos medicamentos obtenidos mediante tecnología
del ADN recombinante se realiza, por requerimiento legal, mediante un procedimiento de
tipo centralizado, es decir, efectuado en todos
los países de la Unión Europea a la vez y coordinado por la EMA. Hasta la fecha se han autorizado más de 70 productos biotecnológicos y
se espera que este número siga aumentando
durante los próximos años. Además, la investigación en nuevos sistemas de expresión permitirá obtener medicamentos biotecnológicos
de fuentes «menos convencionales» como, p.
ej., animales transgénicos o plantas. La EMEA
autorizó en junio de 2006 el primer medicamento biotecnológico (antitrombina III humana
recombinante) producido en la leche de cabras
transgénicas. Otros productos obtenidos en
conejos transgénicos, como C1 inhibidor, lactoferrina y fibrinógeno humano, se encuentran
en fase de desarrollo clínico o preclínico. Otros
Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la Agencia Europea de Medicamentos (EMA)...
129
medicamentos considerados de alta tecnología
incluyen las denominadas «terapias avanzadas»,
que incluyen terapia génica, terapia celular somática e ingeniería de tejidos. Las solicitudes de
comercialización para estos productos se evalúan también mediante el procedimiento centralizado (solamente la autorización de ensayos
clínicos es responsabilidad nacional).
La legislación comunitaria actual permite la
autorización de medicamentos biosimilares, es
decir, medicamentos biotecnológicos equivalentes a otros ya autorizados y cuya patente ha
expirado. Su autorización es también mediante
el procedimiento centralizado coordinado por
la EMA. Hasta ahora, siguiendo esta nueva vía de
autorización, se han aprobado 14 medicamentos biotecnológicos que incluyen la hormona de
crecimiento humana, la eritropoyetina humana y
los factores estimuladores de colonias de granulocitos.
Marco legal y bases
para la creación de una agencia
europea de evaluación
de medicamentos
Los fundamentos de la UE se recogen en
el Tratado de Roma, ratificado inicialmente en
1957 por 6 países. Aunque el tratado comprometía a sus signatarios a establecer un amplio
rango de medidas de armonización, dejaba la
organización de la sanidad y los sistemas de seguridad social a la decisión de cada país. Cada
EM, por tanto, desarrolló su propia regulación
farmacéutica.
Desde 1965, fecha de adopción de la primera directiva de la UE, la legislación farmacéutica
comunitaria ha buscado dos objetivos fundamentales: la protección de la salud pública y la
creación de un mercado común que permita la
libre circulación de medicamentos.
La Comisión Europea (en adelante referida
como Comisión) comenzó en 1965 a promulgar
Directivas (del inglés, Directives), es decir, leyes o
disposiciones comunitarias de carácter obligatorio, relacionadas con la regulación farmacéutica.
130
La Directiva 65/65/EEC del Consejo de 26 de
enero de 1965 estableció el principio de concesión de autorizaciones de comercialización de
especialidades farmacéuticas en todos los EM
sobre criterios científicos de calidad, seguridad
y eficacia, sin tener en cuenta consideraciones
de tipo socioeconómico. Diez años más tarde,
los EM consolidaron la experiencia adquirida
y se pusieron de acuerdo sobre principios comunes para la autorización y control de medicamentos de uso humano (Directivas 75/318/
CEE y 75/319/CEE del Consejo de 20 de mayo
de 1975). No obstante, cada EM mantenía la
responsabilidad de conceder o denegar la autorización para comercializar cada medicamento
en particular. Actualmente, tanto las directivas
citadas anteriormente como otras relacionadas
con medicamentos humanos han sido derogadas y sustituidas por la Directiva 2001/83/EC
del 6 de noviembre, posteriormente modificada y ampliada por la Directiva 2003/63/EC
del 25 de junio. Estas dos directivas constituyen
actualmente la legislación básica que regula los
medicamentos para uso humano. Otra directiva
posterior, 2004/27/EC, y la Regulación (EC) No.
726/2004 modifican y delimitan también el ámbito de aplicación de la directiva 2001/83/EC.
En 1977 se constituyó el denominado Comité de Especialidades Farmacéuticas o CPMP
(Committee for Proprietary Medicinal Products),
formado por representantes de todos los EM
y de la Comisión. A solicitud de un EM o de la
Comisión, el CPMP podía emitir un dictamen
consultivo sobre temas relacionados con la autorización de medicamentos y sobre el control
de reacciones adversas de los mismos (farmacovigilancia).
En 1981 se adoptaron provisiones similares
para medicamentos de uso veterinario (Directivas 81/51/CEE y 81/52/CEE del Consejo de 28
de septiembre de 1981), incluyendo la creación
del Comité de Medicamentos Veterinarios o
CVMP (Committee for Veterinary Medicinal Products). Al igual que para medicamentos humanos, estas directivas han sido sustituidas por otra
más reciente, la Directiva 2001/82/EC.
La creación de estos comités supuso también el inicio de un procedimiento coordinado
de evaluación, con dictamen no vinculante, que
marcó un paso importante en la cooperación
entre EM. Aparte de los procedimientos de registro nacionales, las compañías farmacéuticas
podían utilizar dos tipos de procedimiento de
registro comunitario: el «procedimiento multiestado» (ampliación de la autorización existente en 1 EM a 2 o más de los restantes EM) o
el «procedimiento de concertación» (evaluación coordinada de la solicitud de autorización
en todos los EM; ningún EM podía tomar una
decisión individual sobre una autorización de
comercialización antes de su discusión previa y
dictamen por el CPMP). Este último procedimiento estaba reservado a los medicamentos
obtenidos por procesos biotecnológicos y para
otros medicamentos de alta tecnología.
Con el objeto de colaborar con el CPMP en
determinados aspectos de la evaluación de medicamentos, se crearon grupos de trabajo sobre calidad, seguridad y eficacia con objeto de
aproximar la forma en que cada EM ponía en
práctica las obligaciones derivadas de las directivas comunitarias. Estos grupos de trabajo han
tenido su continuación en grupos equivalentes
en el seno de la EMA.
Primeros pasos en la creación
del grupo de biotecnología
En 1985 se creó el denominado Ad Hoc Working Group on Biotechnology/Pharmacy (precedente del grupo de biotecnología de la EMA)
con dos objetivos fundamentales: asesorar al
CPMP sobre solicitudes de autorización de productos biotecnológicos y establecer recomendaciones específicas sobre la producción y control de calidad y seguridad de estos productos.
Esta segunda finalidad se llevó a cabo mediante la elaboración de directrices (guidelines) (disposiciones de carácter no obligatorio basadas
en los conocimientos científicos del momento
sobre un aspecto concreto). Se ha preferido la
utilización de directrices, que no obligan jurídi-
camente, en vez de un instrumento jurídico formal, como una directiva, con el fin de mantener
la flexibilidad y no poner obstáculos legales al
progreso científico. Se admite que en algunos
casos, como resultado de los avances científicos,
pueda ser adecuado otro enfoque. Sin embargo, cuando un solicitante decida no seguir una
determinada directriz debe explicar y justificar
dicha decisión en los informes que presente la
compañía en apoyo de su solicitud.
El Ad Hoc Working Group on Biotechnology/
Pharmacy estaba formado por expertos (alrededor de 20) procedentes de diferentes áreas
relacionadas con la biomedicina, desde autoridades reguladoras, laboratorios nacionales
de control o investigadores a un representante (observador) de la Farmacopea Europea
(PhEur). En esta etapa inicial se completaron
y/o iniciaron varias directrices sobre citocinas,
anticuerpos monoclonales y reducción del riesgo de transmisión de encefalopatías espongiformes por medio de medicamentos. Este grupo
ha tenido continuación como el Biotechnology
Working Party (BWP) dentro de la estructura de
la EMA, y recientemente ha pasado a denominarse Biologics Working Party (BWP) sin que sus
funciones hayan variado.
Agencia Europea
de Medicamentos.
Procedimientos
de autorización
A finales de 1990 se publicaron varias propuestas relacionadas con la creación de la Agencia y el nuevo sistema comunitario para autorización de medicamentos. En 1993 se decidió
fijar la sede de la EMEA en Londres y comenzó
a funcionar como tal en febrero de 1995. La
función principal de la EMEA (hoy EMA) es
coordinar y organizar el sistema de autorización de medicamentos en Europa. Este sistema
evalúa cualquier solicitud de comercialización
131
bien mediante el denominado «procedimiento
centralizado» (autorización de comercialización
en todos los países de la UE a la vez; decisión
unánime o por mayoría) o «descentralizado»
(también conocido como «reconocimiento
mutuo», equivalente al anterior procedimiento
«multi-estado» (extensión de la autorización
existente en un EM a otros). El procedimiento
centralizado de autorización está reglamentado
por la Regulación (EC) No. 726/2004. Este procedimiento es obligatorio para los medicamentos que se describen a continuación:
•Obtenidos a partir de tecnología del ADN
recombinante, o de la expresión controlada
de genes que codifican proteínas biológicamente activas en procariotas o eucariotas, incluyendo las células de mamífero transformadas, u obtenidos a partir de hibridomas o que
emplean anticuerpos monoclonales durante
su producción
•Veterinarios empleados como potenciadores
para aumentar el crecimiento o rendimiento
de los animales tratados
•Humanos para el tratamiento del síndrome
de inmunodeficiencia adquirida, cáncer, diabetes y enfermedades neurodegenerativas. A
partir de 2008 también será aplicable a enfermedades autoinmunes u otras alteraciones
inmunitarias y para enfermedades virales.
•Medicamentos huérfanos (según la Regulación (EC) No 141/2000).
Existen actualmente 6 comités científicos
principales dentro de la EMA: CHMP (Comité de Medicamentos Humanos, previamente
CPMP), CVMP (Comité de Medicamentos Veterinarios), COMP (Committee for Orphan Medicinal Products; encargado de la concesión este
tipo de clasificación a un medicamento), HMPC
(Committee for Herbal Medicinal Products;
encargado de plantas medicinales), PDCO
(Paediatric Committee; revisión de planes de investigación pediátricos) y CAT (Committee for
Advanced Therapies; propuesta de opinión sobre
132
medicamentos basados en terapias avanzadas
al CHMP) . Cada uno de estos comités está
formado por un representante de cada uno de
los EM. La EMA actúa como el eje central del
sistema europeo, organizando y coordinando el
trabajo de evaluación que es llevado a cabo por
expertos nacionales de cada una de las agencias
reguladoras.
Los comités PDCO y CAT son los de más reciente creación. La función del PDCO (comité
pediátrico) es evaluar los planes de investigación pediátricos y emitir opiniones de acuerdo
a la Regulación (EC) 1901/2006 (y sus modificaciones posteriores). Este comité, sin embargo,
no es responsable de las autorizaciones de comercialización de medicamentos para uso pediátrico, ya que esto sigue siendo competencia
del CHMP. El otro comité, CAT (Comité de Terapias Avanzadas), comenzó a trabajar en enero
de 2009. Su función principal es la evaluación
de medicamentos de terapia avanzada (es decir,
de terapia génica, terapia celular somática e ingeniería de tejidos) aunque su autorización final
corresponderá también al CHMP. Se puede encontrar información adicional sobre este comité
en la Regulación (EC) 1394/2007.
Evaluación
de medicamentos de uso
humano y veterinario:
CHMP y CVMP
Desde la creación de la EMEA ambos comités de medicamentos humanos y veterinarios,
CHMP y CVMP, respectivamente, continúan su
labor mediante reuniones mensuales de varios
días de duración. Una gran parte de la agenda
consiste en la discusión y emisión de dictámenes
respecto a nuevas solicitudes de comercialización,
bien por el procedimiento centralizado o por el
descentralizado. En el procedimiento centralizado, 2 miembros del comité (representantes de
países distintos) son designados como ponentes (rapporteur y co-rapporteur) para coordinar la
evaluación de cada solicitud. Tras la evaluación
en el ámbito nacional, los informes de cada uno
de los ponentes son discutidos en las reuniones
del comité científico correspondiente (CHMP o
CVMP), y se emite un informe final vinculante
sobre dicho producto. La decisión final se transmite a la Comisión que convertirá dicha opinión
en una única autorización de comercialización
para toda la UE. Solamente quedan a decisión
nacional los aspectos relacionados con el precio
del medicamento y su posible financiación por el
sistema nacional de salud.
El procedimiento descentralizado está basado
en el principio de reconocimiento mutuo de autorizaciones nacionales. Permite la extensión de
una autorización de comercialización dada por
un EM (denominado EM de referencia o RMS) a
otro(s) EM identificados por el solicitante. Cuando no sea posible llegar a un acuerdo porque
algún EM no acepte la autorización nacional original concedida por el RMS, los puntos de desacuerdo serán discutidos en el recientemente
creado Grupo de Coordinación. Si el desacuerdo permanece, la decisión del comité correspondiente (CHMP o CVMP) es siempre vinculante.
Independientemente del procedimiento
seguido, la decisión final la toma la Comisión
Europea o, en caso de desacuerdo importante
entre EM, el Consejo de la UE.
Los productos que vayan a comercializarse
únicamente en 1 EM pueden continuar utilizando la vía de autorización nacional. Como se
ha descrito anteriormente, los productos biotecnológicos nunca podrían utilizar esta vía de
autorización.
Grupos de trabajo del CHMP
Con objeto de emitir una opinión sobre cualquier cuestión planteada a la EMA relacionada
con medicamentos, el CHMP cuenta con el
apoyo de grupos de trabajo que le asesoran en
aspectos específicos relacionados con la calidad,
eficacia y seguridad de medicamentos y que
participan en las actividades de armonización
internacionales (ICH).
Actualmente existen diferentes grupos de
trabajo del CHMP y uno conjunto del CHMP/
CVMP (QWP). Algunos de ellos se mencionan
a continuación:
•Grupo de biológicos (Biologics Working Party,
BWP; previamente Biotechnology Working
Party): asesora al CHMP, CAT y COMP sobre
aspectos relacionados con la producción y
control de productos biológicos y biotecnológicos, incluyendo terapias avanzadas.
•Grupo de eficacia (EfficacyWorking Party,EWP),
responsable de elaborar recomendaciones
metodológicas en áreas terapéuticas establecidas y documentos de opinión sobre aspectos de eficacia de medicamentos en áreas en
desarrollo clínico.
•Grupo de seguridad (SafetyWorking Party,SWP),
discusión y recomendaciones sobre aspectos
de seguridad preclínicos.
•Grupo de farmacovigilancia (Pharmacovigilance Working Party, PhWP), grupo de discusión
y evaluación de aspectos relacionados con la
seguridad o cambios en la relación riesgo/beneficio de medicamentos autorizados.
•Grupo de hemoderivados (Blood Products Working Group, BPWG), encargado de aspectos de
seguridad y evaluación clínica de productos
derivados de sangre o plasma humanos.
•Grupo de vacunas (VaccineWorking Party,VWP),
evaluación y discusión de aspectos relacionados con la calidad, eficacia y seguridad de
vacunas.
•Grupo de biosimilares (Similar Biological Medicinal Products, BMWP), grupo encargado de
aspectos de seguridad y evaluación clínica de
medicamentos biológicos o biotecnológicos
que se presentan como equivalentes a otro
ya autorizado.
•Grupo de farmacogenética (Pharmacogenetics
Working Party, PgWP), grupo asesor del CHMP
en materias relacionadas con farmacogenética.
133
•Grupo de calidad (QualityWorking Party, QWP),
grupo conjunto del CHMP y CVMP para armonizar y asesorar sobre aspectos de calidad
de medicamentos humanos y veterinarios.
Grupo de biológicos (BWP)
Desde 1995 hasta ahora, el BWP viene celebrando unas 10-12 reuniones anuales, de varios
días de duración, en la sede de la EMA. Este grupo está formado por un representante de cada
uno de los EM de la UE, un representante de la
Comisión, un representante de la Farmacopea
Europea, personal técnico de la EMA y, desde
febrero de 2000, un representante de Noruega y otro de Islandia se han incorporado como
miembros de pleno derecho (presentes desde
1999 en calidad de observadores).
El BWP es responsable de proporcionar asistencia técnica al CHMP y CAT sobre aspectos
relacionados con la fabricación y control de
medicamentos biotecnológicos y de origen biológico, incluyendo aquellos derivados de sangre
o plasma y productos inmunológicos y medicamentos de terapias avanzadas. El BWP es también el grupo asesor del COMP para productos
de origen biológico o biotecnológico y de la
OMS en los casos en que este organismo lo
solicite.
Las actividades principales del BWP se describen a continuación:
•Elaboración de informes sobre los procesos de
producción y control de las solicitudes de comercialización de medicamentos humanos de
origen biológico y biotecnológico. Los aspectos
relacionados con la calidad este grupo de medicamentos se discuten en la reunión correspondiente del BWP y se emite un informe
para su consideración por el CHMP que, tras
la discusión de los aspectos toxicológicos y
clínicos del medicamento en cuestión, emitirá
un dictamen final sobre la aprobación o rechazo de la solicitud correspondiente.
•Elaboración de directrices o recomendaciones
europeas e internacionales sobre temas específicos relacionados con productos biológicos y
134
biotecnológicos. Al igual que el resto de grupos
de trabajo, una de las tareas fundamentales
del BWP es la elaboración de directrices o
recomendaciones, que serán después aprobadas por el CHMP, sobre temas específicos
relacionados con productos biológicos y biotecnológicos. Con este fin, se suelen crear
subgrupos dentro del BWP que elaboran un
documento inicial sobre un tema especifico
que es discutido posteriormente en las sesiones plenarias del BWP. En general, las directrices elaboradas por el BWP son objeto
de evaluación continua a medida que se producen avances científicos en temas específicos. Expertos del BWP participan también en
grupos de trabajo internacionales para armonizar criterios y recomendaciones entre la UE,
Estados Unidos y Japón (actividades ICH) sobre este grupo particular de medicamentos.
El BWP también proporciona asesoramiento
al CHMP en forma de documentos de opinión o recomendaciones puntuales (Points to
Consider) sobre aspectos concretos relacionados con un grupo particular de medicamentos
(p. ej., aspectos relacionados con la evaluación
de posibles vacunas de gripe atenuadas), introducción de nuevos requerimientos de control
(p. ej., test de PCR para la detección del virus
de la hepatitis C en volúmenes de plasma para
la obtención de hemoderivados), etc.
•Asesoramiento científico. Las compañías farmacéuticas tienen la posibilidad de solicitar asesoramiento científico en cualquier momento
durante el desarrollo de un medicamento
previo a la presentación de una solicitud de
autorización de comercialización o antes de
introducir determinados cambios en la fabricación de un medicamento ya autorizado. El
asesoramiento en aspectos de producción y
control de medicamentos biotecnológicos lo
realiza el BWP.
•Organización de «workshops» y reuniones sobre
temas relacionados con medicamentos biológicos y biotecnológicos. El BWP organiza reuniones con expertos europeos e internacionales
con objeto de discutir los últimos avances
científicos en determinadas áreas que permitan la elaboración de recomendaciones
especificas, p. ej. productos de terapia génica, ensayos para la detección de marcadores
de encefalopatías espongiformes y su posible
aplicación a medicamentos, etc. El BWP también efectúa reuniones con representantes de
la industria farmacéutica implicados en temas
concretos con objeto de evaluar las implicaciones o consecuencias de la introducción
de determinadas medidas de control o de
discutir la aplicación de las mismas de forma
coordinada, p. ej. con representantes de fabricantes de gelatinas y derivados de grasas
animales empleados en la fabricación de medicamentos.
•Reuniones con otros grupos de trabajo de la EMEA
y de la PhEur.Miembros del BWP participan también en reuniones conjuntas con miembros de
otros grupos de trabajo con objeto de coor-
dinar y facilitar la adopción de recomendaciones concretas, p. ej. la discusión sobre aspectos de seguridad del tiomersal (empleado
en la fabricación de determinadas vacunas) se
llevó a cabo junto con los Grupos de Seguridad (SWP) y el de Farmacovigilancia (PhWP).
Miembros del BWP también forman parte de
grupos de trabajo de la PhEur para coordinar
actividades y recomendaciones en temas relacionados con el control de calidad de productos biológicos y biotecnológicos en general.
Bibliografia
www.ema.europa.eu Información adicional sobre el BWP
y actividades de la EMA en general (incluyendo los documentos elaborados por los grupos de trabajo).
http://ec.europa.eu/health/index_en.htm
Salud Pública y legislación sobre medicamentos en la
Unión Europea.
Abreviaturas
BWP
Biologics Working Party (previamente Biotechnology Working Party)
CAT
Committee for Advanced Therapies
CHMP
Committee for Human Medicinal products (previamente CPMP)
COMP
Committee for Orphan Medicinal Products
CPMP
Committee for Proprietary Medicinal Products (actualmente CHMP)
CVMP
Committee for Veterinary Medicinal Products
EM
Estado(s) Miembro(s)
EMA/EMEA European Medicines Agency (actualmente EMA)
HMCP
Committee for Herbal Medicinal Products
ICH
International Conference for Harmonization of Technical Requirements for Registration
of Pharmaceuticals for Human Use
OMS
Organización Mundial de la Salud
PDCO
Paediatric Committee
PhEur
Farmacopea Europea
RMS
Reference Member State
UE
Unión Europea
135
11
Las empresas biotecnológicas
y su importancia
en la terapia humana
José Luis Motellón
AMGEN
Resumen
Ante la creciente demanda de nuevos fármacos que mejoren la salud humana, la biotecnología proporciona una nueva solución a las necesidades médicas no cubiertas por el desarrollo
tradicional de fármacos químicos. Hace 30 años
se formaron las primeras compañías de biotecnología, y su crecimiento ha sido exponencial
en los últimos 5 años, tanto en Estados Unidos,
cuyas empresas lideran el sector, como en la
Unión Europea. Las nuevas técnicas diagnósticas
que aplican la inmunología y la biología molecular han ayudado a este crecimiento, junto con
las previsiones de un adecuado retorno de la
inversión. Las grandes empresas farmacéuticas
tienden cada vez más a fusionarse o comprar
biotecnológicas para incrementar su pipeline
de productos. En España se ha cuadriplicado el
número de empresas biotecnológicas en los últimos 5 años, contabilizándose 305 en el 2008.
Cataluña y la Comunidad de Madrid concentran
la mayor actividad. La colaboración en el futuro entre empresas, universidades, laboratorios
públicos e instituciones reguladoras será imprescindible para impulsar la biotecnología en
España.
136
Introducción: retos
para la terapia humana
en el futuro
La evolución demográfica de la población
mundial, marcada por un número creciente
de habitantes y un envejecimiento progresivo,
comportará un aumento exponencial en la necesidad de nuevos medicamentos. Para el año
2020 se estima una población de 7.600 millones
de personas, frente a los 6.500 millones actuales, de los cuales casi el 10% serán mayores de
65 años, con un aumento esperado del 3% en
esta franja de población con respecto al año
2005 [PDDESAUNS, 2004] La población de
edad avanzada requiere un mayor número de
tratamientos. Se calcula que 3 de cada 4 personas con más de 75 años consume al menos 1
fármaco de prescripción, mientras que el 36%
consume 4 o más [UKDH, 2001].
Por otro lado, la mejora en las condiciones
económicas de los países emergentes, como
Brasil, China, India, Indonesia, México, Rusia y Turquía (países E7), repercutirá en un aumento de
la esperanza de vida y un cambio en el patrón
de alimentación y costumbres. Se estima que el
producto interior bruto de estos países se triplicará en los próximos 13 años, y que los cambios
asociados convertirán la diabetes y la obesidad,
por ejemplo, en un problema público. El número
de pacientes con diabetes en países en desarrollo podría pasar de 84 millones en 1995 a 228
millones en 2025. Por todo ello, se calcula que
en el año 2020 los países emergentes representarán el 20% de la demanda de medicamentos.
Además de estos cambios demográficos, los
avances en la medicina están permitiendo que
enfermedades que antes presentaban una elevada mortalidad a corto plazo se conviertan
en enfermedades crónicas. Las enfermedades
cardiovasculares, el SIDA y el cáncer constituyen los principales ejemplos. El número de
muertes por ataques al corazón ha descendido un 50% en la mayoría de los países industrializados [TCU, 2004] y la expectativa de vida
a los 5 años de pacientes con cáncer entre
1999-2005 ha aumentado el 68% entre 1975
y 1977 [ACS, 2010]. Este aumento en la esperanza de vida se asociará al repunte de otras
enfermedades distintas que antes presentaban
una incidencia muy baja, por lo que será necesario desarrollar nuevos fármacos dirigidos
contra estas patologías.
Otro factor que puede generar la necesidad
de nuevos medicamentos es la aparición de
resistencias a fármacos clásicos o de mutaciones de organismos patógenos en el caso de las
enfermedades infecciosas. El CDC (Centers for
Disease Control and Prevention) de Estados
Unidos calcula que más del 70% de las infecciones en hospitales americanos son resistentes al
menos a 1 de los antibióticos que más frecuentemente se emplean para tratarlas [USNIAID,
2006]. Al mismo tiempo, están apareciendo mutaciones en enfermedades existentes, como es
el caso del SARS (síndrome respiratorio agudo
severo), y el virus H5N1 de la gripe aviar. Por
todo ello deberá continuar la búsqueda de nuevos antiinfecciosos.
El cambio climático aumentará la temperatura del planeta, con una media aproximada de
0,2 ºC por década. Aunque se desconoce el impacto que ello puede tener en la salud mundial,
se teme que enfermedades como la malaria, el
cólera, la difteria y el dengue se trasladen a países industrializados de latitudes más elevadas.
En estos países se ha observado ya un aumento
de la incidencia de asma y bronquitis, atribuido
al calentamiento del clima por una mayor presencia de polen en la atmósfera.
Todos estos cambios repercutirán de modo
significativo en la industria farmacéutica, que deberá invertir en I + D (investigación y desarrollo) para desarrollar nuevos medicamentos para
una mayor población de edad avanzada y con
numerosas comorbilidades. En el marco de esta
investigación, las compañías biofarmacéuticas
serán imprescindibles para afrontar los nuevos
retos de la salud global, dadas las características
diferenciales de sus productos y procesos, que
representan un avance en el desarrollo de nuevos fármacos frente a los métodos tradicionales.
La crisis en la generación
de nuevos medicamentos
La productividad de la I + D en la industria
farmacéutica debe aumentar en el futuro, en
paralelo con el incremento y envejecimiento
de población mundial. Pero en la actualidad, el
desarrollo de nuevos fármacos representa un
enorme esfuerzo y se lleva a cabo con gran dificultad. Como reflejo de ello, la industria farmacéutica gasta mucho más en I + D y produce
menos medicamentos que hace 20 años.
Diversos factores intervienen en esta creciente complejidad. La preocupación por la seguridad de los fármacos hace que las agencias
reguladoras cada vez sean más conservadoras y
tengan requerimientos más estrictos. Los ensayos clínicos son más difíciles de iniciar, requieren
Las empresas biotecnológicas y su importancia en la terapia humana
137
mayor número de pacientes y tiempo de seguimiento, y son mucho más caros de realizar que
hace 20 años. Esto se debe a los crecientes requisitos de control y rigurosidad que se aplican
para proteger la seguridad en los pacientes, la
primera prioridad de las empresas farmacéuticas y los profesionales sanitarios. Por otra parte, estas exigencias acarrean unos costes que
disparan la inversión en I + D de las empresas;
muchas pequeñas compañías, o las entidades financieras que las respaldan, no pueden asumir
dicho riesgo. A la vez, la presión en los precios
y, en algunos casos, una inadecuada política de
la protección de la propiedad intelectual por algunas autoridades, hace más difícil un retorno
de la inversión y tiene un efecto negativo en el
desarrollo de ciertos fármacos, sobre todo en
determinadas áreas terapéuticas.
El coste de la investigación
en la industria farmacéutica
a
2005
2006
2007
España
Italia
0,64
0,57
0,56
0,57
1,05
1,09
1,13
1,18
1,0
0,91
1,12
1,20
1,27
1,74
1,74
1,76
1,77
1,81
1,73
1,76
1,82
1,91
2,05
1,97
1,90
1,51
1,78b
2,06
2,06c
1,5
2,15
2,10
2,10
2,04
2,0
2,19
2,21
2,24
2,28
2,30
2,5
2000
2,45
2,49
2,53
2,53
3,0
2,71
2,57
2,61
2,66
3,5
2,79
3,10
3,21
4,0
3,04
3,32
3,40
3,44
Gasto total en I + D en porcentaje del PIBpm
Los costes del desarrollo de un nuevo fármaco en Estados Unidos casi se han triplicado entre la década de 1980 y la de 1990 (de
318 a 802 millones de dólares), principalmente
porque se han multiplicado por 4 los costes
en la fase de desarrollo clínico. El coste total
de la I + D de un nuevo fármaco ha pasado
del equivalente a 100 millones de euros (MÜ)
(( ¿¿?? )) en 1975 a 1.000 MÜ en la actualidad
[PhRMA, 2005].
Aunque existen importantes diferencias entre países industrializados, la investigación que
genera la industria farmacéutica representa alrededor del 2% del producto interior bruto (PIB)
de cada país (fig. 1). España se encuentra en un
nivel relativamente bajo de gasto en I + D por
parte de la industria farmacéutica, con un 1,3%
del PIB en el año 2007. Este gasto ha aumento
progresivamente en los últimos años. En 2006,
las principales empresas biofarmacéuticas invirtieron 55.200 millones de dólares en I + D, el
doble de lo invertido en 1996 [USFDA, 2006] y
esto representa tan sólo las tres terceras partes
de todo el gasto mundial en investigación biotecnológica [PhRMA, 2007]. Entre 1995 y 2005,
el porcentaje que representa la I + D en la inversión total de la industria farmacéutica pasó
del 15,0% al 17,1% [Barrie; 2006].
En paralelo con el aumento en la inversión en
I + D por parte de la industria farmacéutica, se
0,5
0
Japón
Coreaa
EE.UU. Alemania OCDE Francia Australia Canadá
Reino UE-27
Unido
Polonia
No incluye la I + D en ciencias sociales y humanidades. b Dato de 2004. c Dato de 2006.
Figura 1. Esfuerzo en I + D en los países industrializados. Gasto total en I + D en porcentaje del producto interior bruto (PIB) a precios de mercado (PIBpm) en 2000, 2005, 2006 y 2007. Fuente: Main Science
& Technology Indicators. Vol. 2009/2 [OECD, 2009]. Tabla 1.8, 2.ª parte [Fundación COTEC, 2010].
138
ha observado un progresivo declive en el número y, especialmente, la proporción relativa de
fármacos aprobados anualmente con respecto
a todos los que inician el proceso de desarrollo
clínico [DiMasi, 2001]. En el año 2006, la Food
and Drug Administration (FDA) autorizó únicamente 22 moléculas, frente a las 53 de 1996.
Aproximadamente el 5% de nuevas moléculas
con potencial terapéutico llegan a iniciar la fase
de ensayos preclínicos y, de ellas, se comercializa
tan sólo el 11% de los productos que inician la
fase I, el 16% de los que alcanzan la fase II, el
44% de la fase III y el 79% de los se presentan a
registro [Galduf et al., 2006].
La creciente complejidad del proceso debido
al aumento de requisitos de las agencias reguladoras, como se ha comentado anteriormente, es
la principal causa del incremento en el coste de
la investigación. Desde la fase de cribado hasta
la comercialización pasan unos 10-15 años. Además, debido a la carestía de fármacos en investigación potencialmente atractivos, las empresas
de biotecnología que venden sus productos a las
grandes farmacéuticas han exigido un mayor precio por sus compuestos en etapas iniciales [Chan,
2006]. Como resultado, los nuevos fármacos deben financiar su propio desarrollo y el de muchas otras moléculas que no fueron aprobadas.
Esta realidad confronta con la enorme presión
pública para la contención del gasto sanitario. La
investigación farmacéutica en el futuro, pues, deberá realizar un gran esfuerzo para equilibrar la
contención del gasto farmacéutico y la creciente
inversión necesaria para el descubrimiento y desarrollo de medicamentos. Para ello, será necesaria la participación tanto de entidades públicas
como privadas, y la racionalización y renovación
de recursos y conocimientos.
Posibles soluciones
Frente a esta situación, la industria farmacéutica tendrá que apoyarse cada vez más en el
desarrollo de nuevas tecnologías que permitan
desarrollar medicamentos más eficaces y se-
guros de una manera más eficiente; entre ellas,
la genómica y la biología computacional en la
identificación y validación de las dianas biológicas, el diseño y cribado virtual de potenciales
candidatos moleculares y la biomodelización/
biosimulación de los ensayos clínicos. Los dos
grandes métodos de producción de fármacos,
la síntesis y la biotecnología, deberán sufrir una
revolución y una mejora en los procesos que
les permita afrontar un necesario aumento de la
productividad en la I + D de la industria.
Énfasis en la fisiopatología
de la enfermedad
La industria está en un punto de inflexión en
la manera en que investiga nuevos fármacos. Un
análisis reciente ha demostrado que aproximadamente el 50% de las moléculas que fallaron
en fase III se debió a la falta de eficacia [Gordian
et al., 2006]. En medicamentos con un mecanismo de acción novedoso (primeros en clase), el
fallo fue el doble de los que tienen un mecanismo de acción probado. Esto quiere decir que la
industria está invirtiendo ingentes cantidades de
dinero en desarrollar moléculas cuyo impacto
farmacológico no es bien comprendido debido
a la falta de conocimiento de la fisiopatología de
la enfermedad.
Hasta ahora, el típico proceso ha sido conocer
las vías, las dianas potenciales y la epidemiología
de la enfermedad a través de la información científica pública. Posteriormente, se generan datos
internamente in vitro o in vivo en modelos celulares y animales, y cuando se ha establecido cierta
confianza en el racional, se realiza un cribado masivo de moléculas y de optimización de las seleccionadas, que pasan a ser testadas en humanos.
Estos primeros estudios en muchos casos no se
centran en probar el racional para esa diana y esa
molécula, sino en caracterizar su farmacodinamia
o farmacocinética –aunque esta aproximación
está ya cambiando–. No es hasta la fase II en la
que realmente se testa la prueba o racional del
concepto, y esto es normalmente entre 5 y 7
años después del cribado masivo inicial.
139
Con el incremento de los costes y la presión
para desarrollar nuevas moléculas, este modelo
será insostenible en los próximos años. La investigación de la industria en el futuro se deberá focalizar en probar el concepto o racional de la diana
y la molécula en el hombre de una forma segura,
tan pronto sea posible, e invertir mucho más en
entender la fisiopatología antes de embarcarse en costosos ensayos clínicos fase III. De esta
manera, al igual que ahora las grandes empresas
farmacéuticas utilizan las pequeñas biotecnológicas como fuente de moléculas prometedoras, es
probable que en los años venideros se formen
compañías especializadas en el estudio de vías
biológicas y la validación de conceptos que vendan sus datos a las compañías farmacéuticas.
La medicina personalizada
El proceso de desarrollo de medicamentos
está en la actualidad basado en el método estadístico, que proporciona una probabilidad de
que poblaciones semejantes a las que han sido
estudiadas respondan a un determinado tratamiento. Sin embargo, los médicos no tratan a
poblaciones, sino a pacientes individualmente.
El futuro está en la «medicina estratificada» o
medicina personalizada.
El primer paso en esta personalización del
tratamiento es entender el mecanismo fisiopatológico de la enfermedad y las vías alteradas
que crean dicha patología. Una vez identificadas, se analiza cual es la diana más adecuada
para activar o inhibir dicha vía. Posteriormente,
se desarrolla la molécula que mejor interactúa
con dicha diana. Estas «terapias dirigidas» han
supuesto un gran paso en el tratamiento de
muchas enfermedades. Sin embargo, no todos
los pacientes responden de la misma manera,
o presentan los mismos efectos secundarios. La
medicina estratificada depende de la posibilidad
de identificar a los pacientes más susceptibles
de responder a una determinada terapia.
La medicina estratificada o individualizada ha
impulsado el estudio de factores predictivos
140
de respuesta, que permiten diferenciar ciertos
tipos de pacientes según unos determinados
«biomarcadores». Por medio de esta diferenciación, el paciente recibirá el tratamiento que
más beneficios le aporte. Se individualiza así el
tratamiento, paciente a paciente.
Estamos dando los primeros pasos para utilizar este tipo de biomarcadores, pero existen
ya ejemplos interesantes en oncología, como
el gen K-ras en cáncer de colon. Panitumumab,
un anticuerpo monoclonal totalmente humano
frente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFr), ha demostrado un aumento de
la supervivencia libre de progresión en pacientes con cáncer colorrectal metastático previamente tratados con quimioterapia [Van Cutsem
et al., 2007]. Sin embargo, los pacientes con un
gen K-ras no mutado («wild type») presentan
una respuesta mucho mayor que los que presentan mutaciones en este gen [Amado et al.,
2008]. Esto tiene unos claros beneficios, dado
que se identifica a la población susceptible de
ser tratada con éxito. De esta manera, la eficacia del fármaco aumenta, no se administra a los
pacientes en los que no será beneficioso y no se
expone a estos pacientes a los efectos secundarios innecesarios que todo tiene fármaco.
Los tratamientos dirigidos unidos a la utilización de biomarcadores presentan un modelo
económico muy diferente al de las medicinas
convencionales. La población a tratar es mucho
más reducida. Por ejemplo, antes de conocer el
gen K-ras como factor de predicción, la inhibición del EGFr con panitumumab se utilizaba en
los pacientes con cáncer colorrectal metastático
en general. Sin embargo, aproximadamente el
50% de los pacientes presentan K-ras mutado y
no son susceptibles de ser tratados: el gasto potencial en este fármaco se reduce teóricamente
a la mitad. Además, debido a su especificidad, la
utilización de biomarcadores mejora la identificación de los pacientes susceptibles de lograr un
beneficio, por lo que la relación coste-beneficio
del tratamiento es más positiva. Tiene también
un impacto en el proceso de desarrollo farma-
céutico, dado que al estudiar subpoblaciones
más limitadas se reduce el número y tamaño de
los ensayos clínicos requeridos en el proceso de
investigación.
Por lo tanto, la introducción de biomarcadores permitirá a la industria desarrollar terapias
más seguras, efectivas, y de una manera más
económica, que permitirán a la larga una mejora
de la eficiencia en el sistema de salud.
Mejora de la síntesis química
La síntesis química ha sido la tecnología tradicional para la producción de potenciales
candidatos de fármacos (llamados también pequeñas moléculas, a diferencia de las grandes
moléculas producidas mediante procesos biotecnológicos) en los que se ha basado la I +
D en la industria. El futuro de esta tecnología
dependerá, sin duda, en mejoras en la química
combinatoria, que permitirá obtener compuestos con una rapidez y variedad muy superior a
la de la química convencional. La identificación
de estos compuestos mediante uHTS (ultraHigh Throughput Screening methods) permite
ya hoy en día producir hasta 50-60.000 moléculas por semana [Sánchez, 2002] que pueden,
a través de la bioinformática, ser integradas en
bibliotecas masivas de compuestos con potencial interés terapéutico.
Impulso a la biotecnología
Sin embargo, la aparición de la biotecnología
ha supuesto la verdadera gran revolución en la
industria. El futuro de la I + D industrial dependerá en gran medida de su expansión. Hoy en
día, los pacientes tienen acceso a 160 fármacos
biotecnológicos, y se estima que 325 millones
de pacientes se han beneficiado ya de estas terapias. En la actualidad representan el 20% de
todos los fármacos que están en el mercado y
el 50% de todos los nuevos fármacos que están en desarrollo. Hace 30 años se formaron las
primeras compañías de biotecnología, y ya en
2006 existían sólo en Europa 2.330 empresas,
con 98.800 trabajadores y un gasto en I + D de
7.600 MÛ. En Estados Unidos estas cifras son
mucho mayores [European Association for Bioindustries, 2008]. Con este crecimiento exponencial, dentro de 20-30 años gran parte de la
I + D la realizarán compañías biofarmacéuticas
o divisiones biotecnológicas de las tradicionales
empresas farmacéuticas.
El cáncer es con gran diferencia el área en la
que la biotecnología se está concentrando con
más intensidad (fig. 2). Según la encuesta de Pharmaceutical Research and Manufacturers of America [PhRMA], en el año 2002 se estaban desarrollando 178 compuestos oncológicos, frente
a los 47 para tratar enfermedades infecciosas y
26 en las enfermedades autoinmunes, los cuales
ocupaban el segundo y el tercer lugar respectivamente. Se espera que este predominio de la I
+ D de medicamentos oncológicos dentro de la
industria aumente en los próximos años.
En general, puede admitirse que la cifra de
fracaso en la etapa de I + D clínico para los
productos biotecnológicos está en torno al
75%, mientras que se aproxima al 94% para los
fármacos de síntesis química [Farmaindustria,
2005]. Dada la mayor probabilidad de éxito y las
aportaciones en su especificidad, el número de
estos fármacos en I + D en el año 2030 habrá
aumentado sin duda dramáticamente.
Sin embargo, el predominio de los medicamentos biotecnológicos incrementará la complejidad de la I + D, ya que estas terapias presentan características muy peculiares y diferentes
de los fármacos obtenidos mediante síntesis
química [Farmaindustria, 2005]. Su característica diferencial es que estas terapias están producidas mediante células de organismos vivos,
las cuales por su naturaleza son únicas y, por lo
tanto, el fármaco que elaboran es también único. Cada línea celular (que es propiedad intelectual de cada compañía farmacéutica) produce
una molécula con atributos específicos y diferentes a otra producida por otra línea celular.
Además, son moléculas mucho más complejas.
141
Por ejemplo, la darbepoetina es 200 veces más
grande que la molécula de la aspirina. Es la misma escala que si comparamos un Airbus con
una bicicleta. Por estas razones, es necesaria una
alta dotación tecnológica para su investigación,
desarrollo, producción y purificación, requiriéndose una monitorización y unos controles de
calidad más estrictos. Son necesarios alrededor
Fármacos biotecnológicos en desarrollo
Factores estimuladores de colonia
Receptores solubles combinables
Señalización
Inhibidores de angiogénesis
Terapia de sustitución enzimática
Factores de crecimiento
Interleuquinas
Inmunoterapia
Interferones
Terapia celular
Oligonucleótidos antisentido
Terapia celular
Proteínas recombinantes
Otros
Anticuerpos monoclonales
Vacunas
2
2
3
4
5
7
8
10
10
11
14
23
23
34
76
90
0
20
40
60
80
100
Número de fármacos
Aplicaciones terapéuticas de fármacos biotecnológicos
Trastornos sanguíneos
2
Trastornos del crecimiento
3
Enfermedades oculares
5
Patologías dermatológicas
7
Trastornos genéticos
9
Diabetes
10
Patologías digestivas
11
Enfermedades respiratorias
14
Enfermedades neurológicas
16
SIDA/VIH patologías relacionadas
17
Enfermedades cardiovasculares
19
Enfermedades autoinmunes
26
Enfermedades infecciosas
43
Cáncer/patologías relacionadas
154
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Número de fármacos
Figura 2. Fármacos biotecnológicos en desarrollo y aplicaciones terapéuticas. Fuente: «2004 Survey
Medicines in Development» [PhRMA, 2004]. En: Biotecnología en la medicina del futuro [Fundación
COTEC, 2006].
142
de 250 controles en la producción de cada molécula, comparados con los 50 requeridos para
los fármacos químicos tradicionales. Esto origina
que pequeñas variaciones en la línea celular, en
el proceso de fabricación, en el almacenamiento
o transporte, creen cambios sustanciales en su
estructura, con repercusiones importantes en
su perfil de eficacia y, sobre todo, de seguridad,
fundamentalmente en relación con la respuesta
inmunogénica.
Como consecuencia de este incremento en
la biotecnología, las relaciones de la I + D industrial con las agencias reguladoras necesitarán en
el futuro un proceso de adaptación. Las características especiales de las terapias biológicas han
hecho que las exigencias de registro y aprobación para estos productos sean diferentes a las
de los fármacos de síntesis química. Por ejemplo,
el proceso de aprobación centralizado por la
EMA es obligatorio. Como consecuencia, el mecanismo de reconocimiento mutuo por estados
miembros irá descendiendo sin duda.
Empresas biotecnológicas
A nivel mundial
La industria biotecnológica global ha venido
disfrutando de un incremento anual superior al
15% durante los últimos 5 años, con inversiones
en I + D que han aumentado anualmente un
34% [European Commission, EC, 2003]. En 2006
estaban identificadas 1.991 compañías biotecnológicas en Estados Unidos frente a 2.330 en la
UE-15 [European Association for Bioindustries,
EUROPABIO, 2008]. A pesar de las cifras muy parecidas de compañías en ambas áreas geográficas,
el número de empleados (190.500 trabajadores
frente a 98.500), la inversión en I + D (21.000
MÛ frente a 7.600 MÛ) y los ingresos (41.500
MÛ frente a 21.500 MÛ) son significativamente
mayores en Estados Unidos. Según la Asociación
Europea de Bioindustrias [EUROPABIO, 2008], la
principal causa de la menor competitividad eu-
ropea es la falta de una infraestructura adecuada
de financiación, que hace que muchas compañías
desaparezcan en un periodo de 3 a 5 años. En
la figura 3 se presentan las principales empresas
biotecnológicas ordenadas por el volumen de
sus ventas en 2007; es significativo el predominio
absoluto de empresas americanas dentro de las
de mayor tamaño.
Hay que destacar el crecimiento llamativo de
nuevas empresas pequeñas en la Unión Europea, promovidas por la acción estatal y la voluntad de los gobiernos de impulsar el sector. Las
universidades, sobre todo las del Reino Unido y
Alemania, son el origen de un buen número de
nuevas empresas spin-off creadas a partir de los
laboratorios de investigación básica. Las oficinas
de transferencia de tecnología en estos países
han actuado de puente entre los investigadores,
las fuentes de financiación y los emprendedores.
Otra herramienta ampliamente utilizada en la
UE es la generación de biopolos o la potenciación de desarrollos tecnológicos regionales impulsados por los gobiernos locales. En España,
los proyectos más ambiciosos en este sentido
se están llevando a cabo en el País Vasco, dentro
del plan Biogune y su Centro de Investigación
Cooperativo, y en Cataluña, desde los parques
científicos, ligados a las universidades y a la investigación clínica. Según datos del informe de la
Asociación Española de Bioempresas [ASEBIO,
2009], la inversión en I + D de las empresas
biotecnológicas españolas dedicadas a salud humana fue de 460 MÛ en 2008, el doble de la
dedicada a I + D en 2005. A efectos comparativos, la inversión en I + D por las empresas biotecnológicas de Estados Unidos, en 2006, fue de
21.000 MÛ, según datos de BIO, la Asociación
de Industrias Biotecnológicas de aquel país.
El diagnóstico in vitro ha sido uno de los
ámbitos de la medicina que ha crecido de un
modo más espectacular gracias a los productos
biotecnológicos, especialmente debido a la mayor diversificación de inmunoensayos y técnicas
moleculares. Estas nuevas técnicas han permitido la ampliación de nuevas áreas de negocio en
143
tas compañías dan empleo a unos 40.000 profesionales, lo que representa aproximadamente
el 7% de la mano de obra de la industria farmacéutica europea [European Federation of Pharmaceutical Industry Associations, EFPIA, 2002].
Según datos del año 2006 del Instituto Nacional de Estadística (INE) sobre la I + D en España,
el sector farmacéutico se mantiene el segundo
en la clasificación, por encima de sectores con
fuerte imagen en I + D como son la aeronáutica,
las comunicaciones o incluso la automoción. En
2006, la industria farmacéutica invirtió en I + D
792 MÛ, dedicando a estas labores 4.615 personas [INE; 2006]. Estas cifras representan el 17% y
5,57% respectivamente del total de la I + D de la
industria en España. El porcentaje de la inversión
respecto a facturación es mucho más alto que
en otros sectores. Además, mientras que en el
periodo 1995-2005 la cifra de negocio del sector
farmacéutico creció a una tasa anual del 6,1%, el
gasto en investigación aumentó en este mismo
periodo un 12,2%, una tendencia que no se observó en otros sectores [INE, 2006].
Durante las últimas 2 décadas, España se ha
transformado en un referente para muchos laboratorios en las fases de investigación clínica,
con una expansión muy notable del número
compañías ya existentes, como Roche o Abbott,
o la creación de nuevas empresas, como Digene o Innogenetics, empresas norteamericana
y belga, respectivamente. En España, cabe citar
Genómica, Progenika, BioKit y Biotools.
La investigación biotecnológica ha generado
además un amplio mercado de clientes públicos y privados de I + D que consumen reactivos, aparatos y material fungible de laboratorio
en cantidades cada vez mayores. Por ello han
surgido numerosas compañías de nueva creación, como Qiagen o Promega, o por fusiones
de compañías previas, como puede ser Applera (empresa resultante de la unión de Applied
Biosystems y Celera) y Perkin-Elmer, ambas de
Estados Unidos, que constituyen una industria
auxiliar de la investigación biotecnológica.
Las empresas biotecnológicas
en España
La investigación de la industria farmacéutica
en España
16.000,00 14.311,00
12.000,00
9.443,00
8.000,00
4.000,00
BioMarin
Pharmaceutical
Enzon
Pharmaceutical
Fornix
BioSciences
Emergent
BioSolutions
Simcere
BioSolutions
CK Life Sciences
Crucell
Orchid
Pharmaceuticals
Biotest
Daewoong
Pharmaceutical
Biogen Idec
CSL
Gwenzyme
522,98 338,70 315,22 243,40 190,73 179,47 169,80 116,14 100,69 86,80
Genentech*
0,00
2.883,28 2.661,61 2.136,82
Amgen
Volumen de ventas en 2007 (m$)
En la actualidad hay afincadas en España alrededor de 270 compañías farmacéuticas con
actividad de fabricación y 375 laboratorios. Es-
Figura 3. Principales empresas biotecnológicas, según volumen de ventas, en 2007. Fuente: «Scrip Executive Briefing» [Informa UK Ltd]. Vol. 2008/1 n.º 8; 2008. * Genentech se fusionó con Roche en marzo
de 2009.
144
de ensayos, centros sanitarios, colaboradores y
personal de los departamentos de I + D. Esto
se ha debido sin duda a su desarrollo como potencia científica, y aporta unos claros beneficios
a la sociedad, en su conjunto, en cuanto a inversión, creación de puestos de trabajo y prestigio
en el mundo. Sin embargo, nos enfrentamos a la
posibilidad de perder una parte importante de
las inversiones del sector debido especialmente a la creciente competitividad de otros países,
básicamente de Asia y Sudamérica, que ofrecen
unos costes más bajos, un potencial inmenso
para el reclutamiento de pacientes y unos tiempos de aprobación razonables.
La investigación en empresas biotecnológicas
españolas
En los últimos 5 años, los informes anuales de
la Asociación Española de Bioempresas (ASEBIO) han puesto de manifiesto un crecimiento
exponencial del sector biotecnológico español.
Según datos del informe ASEBIO 2009, en el
año 2008 había 305 empresas en España completamente dedicadas a la biotecnología, más de
cuatro veces las existentes en 2003 (71), y otras
637 que realizaban actividades relacionadas con
la biotecnología (127 en 2003) (fig. 4). La tasa
de crecimiento de las empresas biotecnológicas
entre 2007 y 2008 fue del 23,3%. Cataluña y la
Comunidad de Madrid lideran a nivel autonómico los principales indicadores, seguidos por
Andalucía y País Vasco (fig. 4).
El empleo total proporcionado por estas empresas fue de 108.374 trabajadores en 2008,
el 4,3% más que el año precedente, y el gasto interno privado en I + D en biotecnología
ascendió a 460 millones de euros en 2008, el
22,5% más que en 2007. Esta cifra es el doble
de la dedicada a I + D en 2005, que llegaba a
los 201 millones de euros, lo que representa el
gran esfuerzo en I + D que están haciendo las
empresas que utilizan la biotecnología en su negocio. Dicho esfuerzo se vio recompensado por
un aumento paralelo en la cifra de negocio del
sector, que alcanzó los 31.101 millones de euros
en 2008, el 18,9% más respecto al año anterior.
La mayoría de estas empresas desarrollan sus
actividades en el campo de la salud humana, seguidas a distancia de las que trabajan en el área
de la biotecnología agroalimentaria.
El Parque Científico de Madrid, en colaboración
con ASEBIO, identificó 430 invenciones biotecnológicas durante el año 2009. De las mismas, el
84% correspondió a solicitudes y el 16% restante
a concesiones. En cuanto a las publicaciones científicas de empresas españolas en distintas revistas
o medios especializados, se computaron un total
de 177 impactos, cuya titularidad correspondió a
24 entidades. Comparándolo con el año anterior
(140 impactos de 22 empresas), se refleja el aumento de actividad de estas compañías.
En 2009 se crearon 58 nuevas empresas biotecnológicas. Las regiones en las que más empre-
Inferior al 1% del total
Entre el 1% y el 5% del total
Entre el 5% y el 30% del total
Superior al 30% del total
Figura 4. Número de empresas del sector biotecnológico en España en 2006, 2007 y 2008
(izquierda). Distribución del gasto interno en I
+ D biotecnológica del sector privado por comunidad autónoma en 2007 (derecha). Fuente:
«Encuesta sobre Innovación tecnológica en las
empresas. Estadística sobre el uso de biotecnología». INE (2006 y 2007) [Fundación COTEC,
2010; ASEBIO, 2009].
sas se crearon fueron Andalucía, el 26% del total, y
Cataluña, el 24%, seguidas de Valencia (9%) y Madrid (7%). En el mismo año se contabilizaron 101
alianzas, de las cuales el 42% fueron entre empresas biotec y entidades públicas, el 38% con otra
empresa biotec y el 28% con empresas usuarias.
Entre las operaciones realizadas por las entidades privadas en el área de la biotecnología
centrada en salud, destaca en el último año la
de Cellerix (grupo Genetrix) que encabeza el
ranking por un importe de 27,2 millones de
euros. Se trata de la segunda ronda de financiación internacional de la compañía española
que trabaja en el desarrollo de medicamentos
con células madre, y en la que participaron Ysios
Capital Partners, Life Science Partners, Ventech,
Bankinter, Capital Riesgo Madrid, JV Risk Technologies; en ella destacaba la contribución clave
del grupo Genetrix.
La segunda operación más grande del año, si
bien se cerraba al comienzo de 2010, era realizada por la división biofarmacéutica del grupo
Lipotec, GP-Pharm, por medio de un préstamo
sindicado. En esta operación, que supuso un
total de 20 millones de euros, participaron las
siguientes entidades: Caixa Catalunya, Banco de
Sabadell, Bancaja, Institut Català de Finances y el
Instituto de Crédito Oficial (ICO). Por su parte,
Noscira, compañía del Grupo Zeltia, conseguía
su tercera ronda de financiación alcanzando
11,1 millones de euros. Esta operación, realizada
en 2009, fue suscrita por inversores privados.
Cabe destacar también en el año 2009 la autorización de la Comisión Europea a comercializar Yondelis, de Pharmamar, para cáncer de ovario. En el área de diagnóstico, Araclon Biotech
comenzó el estudio de su kit Abtest, único kit
en el mercado para el diagnóstico del Alzheimer en sus estadios iniciales.
Entre los factores que pueden explicar el crecimiento del sector se encuentran el esfuerzo
inversor realizado por el gobierno en los últimos años, tal y como reflejan los 958 millones
de euros que se han destinado a proyectos de
I + D en el ámbito biotecnológico desde 2005
146
hasta 2008. Aún así, sería necesario en los próximos años poner en marcha incentivos fiscales
para dotar de liquidez a las empresas como, por
ejemplo, aumentar los porcentajes de la deducción por actividades de I + D biotecnológica
del impuesto de sociedades, el límite a la aplicación de la deducción por actividades de I + D
e innovación biotecnológica, e incentivar a los
inversores para conseguir un mayor dinamismo
del sector biotecnológico.
Otro de los objetivos para las empresas biotecnológicas españolas en los próximos años
es la internacionalización. La maduración de los
proyectos empresariales y la necesidad de acceder a nuevos mercados ante la difícil coyuntura
económica actual, son en parte responsables de
que el negocio exterior se haya convertido en
una prioridad en la estrategia de crecimiento
del sector biotecnológico español. En la actualidad, la contribución de las actividades internacionales en la facturación de las empresas ha
representado de media, en el año 2009, el 26%.
Como menciona Genoma España en su
«Avance del Estudio Estratégico de la Biotecnología en España: descripción e indicadores»
[Genoma España, 2004], el principal retorno
de la inversión pública son las publicaciones
científicas, que paradójicamente y en muchas
ocasiones, son utilizadas por empresas norteamericanas para patentar. Los indicadores de
producción científica biotecnológica son excelentes respecto a la investigación básica (España
es la cuarta potencia europea en producción
científica) y no se corresponden con la producción de patentes, que es muy escasa. Dado el
valor estratégico del sector biotecnológico, así
como las peculiaridades propias de estas empresas, es importante trabajar en identificar los
criterios que den una idea real de su estado
actual y de su potencial evolución. El objetivo es
completar la información actualmente disponible con una serie de indicadores que muestren
su grado de competitividad, a la vez que permitan definir y evaluar la efectividad de las políticas
aplicadas. Los indicadores clave deberían cubrir,
aparte de la capacidad científica donde se valore la formación del personal o el número de
patentes, otras áreas fundamentales para el éxito de estas empresas, como son su capacidad
financiera y de gestión junto a resultados en términos de alianzas estratégicas. Según esto, sería
importante considerar la perspectiva temporal
en función de la caja disponible antes de una
ronda siguiente de financiación (el valor medio
es 2 años de vida), el origen de sus fuentes de
financiación (el capital privado es un indicador
de profesionalización frente a las meras ayudas
públicas), el nivel de ingresos (su modelo de negocio es la referencia), la composición de los
equipos directivos (la existencia de directivos
independientes de los fundadores es una garantía en la gestión), los acuerdos estratégicos o de
licencia realizados (los acuerdos internacionales
son un indicador) y la existencia de comités
científicos y asesores.
El futuro de la I + D
en biotecnología
El movimiento hacia Asia
Como en otros aspectos que ya se han comentado, el movimiento de la investigación básica fuera de Estados Unidos y Europa aumentará
sin duda principalmente hacia Asia. El número
de doctorados en el mundo occidental ha ido
decreciendo desde la década de 1990 [USNSF,
2006]. El porcentaje de literatura científica producida en Estados Unidos ha disminuido desde
1988 al 2003 del 38 al 30, y aunque en Europa
creció del 28,9 al 31, 5, en China lo hizo de un
530, y en los 8 países más importantes de Asia,
en un 235%. Asia ha pasado de contribuir con
menos del 4% de las publicaciones a más del
10% en el año 2003. Además, los costes de la investigación científica se han vuelto tan enormes
en el mundo occidental que no pueden competir con los de Asia, mucho más reducidos.
Colaboraciones externas
La carestía de nuevos fármacos que se está
viviendo en la actualidad llevará cada vez más
a la industria a intentar aumentar las fuentes de
potenciales entidades moleculares atractivas,
creando más colaboraciones con investigadores externos, entidades académicas y pequeñas
compañías especializadas. El mundo académico
ha entendido que su integración en el mundo
industrial es crítica; desde el año 2000 al 2004, el
número de patentes de instituciones académicas americanas se ha incrementado en un 70%,
y en el futuro este número deberá aumentar
aun más.
Conclusiones
El descubrimiento y desarrollo de nuevas terapias es un proceso cada vez más complejo.
El número de nuevos fármacos aprobados ha
disminuido en la última década, mientras que los
gastos de investigación y desarrollo han aumentado. La síntesis química está siendo sustituida
por la biotecnología, que abre la posibilidad de
desarrollar tratamientos con mecanismos de
acción distintos. Para mejorar la salud humana
con la biotecnología, será necesario en el futuro garantizar el reembolso de nuevas terapias,
como las herramientas de diagnóstico, que pueden mejorar considerablemente la atención al
paciente (p. ej., evitar biopsias o cirugías innecesarias en pacientes con cáncer). El desarrollo
de nuevos marcadores biológicos será vital para
personalizar la medicina, así como la estratificación de pacientes candidatos a cada terapia
en función de su perfil molecular. Traducir la
emergente ciencia genómica a la medicina personalizada es una tarea compleja, y se deberían
recompensar las intervenciones en función de
su eficacia, eficiencia y seguridad. Será necesario
fomentar una nueva generación de estudios de
colaboración público-privados para conocer el
valor real de la medicina personalizada, inclu-
147
yendo pacientes en el mundo real, sin basarse
necesariamente en los tradicionales ensayos
clínicos controlados aleatorios. Se deberán
aunar esfuerzos y mejorar los incentivos para
que todas las partes interesadas –incluyendo las
compañías farmacéuticas y de diagnóstico, los
agentes reguladores, los responsables políticos y
las instituciones de investigación públicas– participen del objetivo común de mejorar la salud
de los pacientes desarrollando fármacos más
seguros y eficaces.
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Biotecnología Aplicada a la Salud Humana

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