2 x 96 tests - Diesse Diagnostica Senese Spa

Transcripción

IT/EN/ES/PT 1/27
ENZYWELL
SYPHILIS SCREEN RECOMBINANT
REF 91100 (2 x 96 tests)
REF 91104 (6 x 96 tests)
Prodotto da/Manufactured by/Fabricado por:
DIESSE Diagnostica Senese
Via delle Rose 10
53035 Monteriggioni (Siena) - Italy
Rif. IO - 09/162 – Inf. Tecn. 91100 – Ed. 17.10.2012
IT/EN/ES/PT 2/27
INDICE / INDEX/ ÍNDICE /INDEX
1.
UTILIZZAZIONE / INTENDED USE/ INDICACIONES DE USO / UTILIZAÇÃO PRETENDIDA
2.
INTRODUZIONE / SUMMARY AND EXPLANATION OF TEST / RESUMEN Y EXPLICACIÓN DEL TEST/
SUMÁRIO E EXPLICAÇÃA DO TESTE
3.
PRINCIPIO DEL METODO / PRINCIPLE OF THE TEST / PRINCIPIODEL MÉTODO / PRINCÍPIOS DO
TESTE
4.
COMPOSIZIONE DEL KIT E PREPARAZIONE DEI REAGENTI / KIT CONTENTS AND REAGENT
PREPARATION / COMPONENTES DEL KIT Y PREPARACIÓN DEL REACTIVO /CONTEÚDA DO KIT E
PREPARAÇÃA DO REAGENTE
5.
MODALITA’ DI CONSERVAZIONE E STABILITA’ DEI REAGENTI / STORAGE AND STABILITY OF
REAGENTS / CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS /ARMAZENAMENTO E
ESTABILIDADE
6.
PRECAUZIONI / PRECAUTIONS / PRECAUTIONS D’UTILISATIONPRECAUZIONI / PRECAUTIONS /
PRECAUCIONES DE USO / PRECAUÇÕES
7.
TIPO DI CAMPIONE E CONSERVAZIONE / TYPE AND STORAGE OF SAMPLE / TIPO DE MUESTRA
Y CONSERVACION /TIPO E ARMAZENAMENTO DAS AMOSTRAS
8.
PROCEDIMENTO / TEST PROCEDURE / PROCEDIMIENTO / PROCEDIMENTO DO TESTE
9.
SCHEMA DEL SAGGIO / SCHEME OF TEST PROCEDURE / ESQUEMA DEL PROCEDIMIENTO DEL
TEST / ESQUEMA DO PROCEDIMENTO DE TESTE
10.
VALIDAZIONE DEL TEST / VALIDATION OF THE TEST / VALIDACIÓN DEL TEST /VALIDAÇÃA DO
TESTE
11.
INTERPRETAZIONE DEL TEST / INTERPRETATION OF RESULTS / INTERPRETACIÓN DE
RESULTADOS /INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
12.
LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA /LIMITATIONS OF THE PROCEDURE / LIMITACIONES DEL TEST /
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
13.
SPECIFICITA’ ANALITICA / ANALYTICAL SPECIFICITY / ESPECIFICIDAD ANALÍTICA /
ESPECIFICIDADE ANALÍTICA
14.
SENSIBILITA’ E SPECIFICITA’ DIAGNOSTICA / DIAGNOSTIC SENSITIVITY AND SPECIFICITY /
SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DIAGNOSTICAS /ESPECIFICIDADE E SENSIBILIDADE DO
DIAGNÓSTICO
15.
PRECISIONE / PRECISION / PRECISIÓN /PRECISÃO
16.
GUIDA AI PROBLEMI DI UTILIZZO / “TROUBLE SHOOTING” / GUIA DE RESOLUCION DE
PROBLEMAS /RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS
17.
BIBLIOGRAFIA / REFERENCES / BIBLIOGRAFÍA / REFERÊNCIAS
Rif. IO - 09/162 – Inf. Tecn. 91100 – Ed. 17.10.2012
IT 3/27
ISTRUZIONI PER L’USO
ENZYWELL
REF 91100 (2 x 96 tests)
REF 91104 (6 x 96 tests)
(Italiano)
1.
UTILIZZAZIONE
KIT IMMUNOENZIMATICO PER LA DETERMINAZIONE QUALITATIVA DELLE IMMUNOGLOBULINE ANTI
TREPONEMA PALLIDUM NEL SIERO O PLASMA UMANO.
2.
INTRODUZIONE
La diagnosi sierologica della Sifilide si effettua stabilendo se ci sono nel siero del paziente anticorpi, a titolo significativo,
specifici per il Treponema pallidum (TP).
Il metodo di riferimento è l'FTA-ABS, ma poiché l'esecuzione è laboriosa e l'interpretazione del test non è agevole, si sono trovati
metodi alternativi in grado di semplificare la procedura.
Il TPHA è il test di elezione quando si tratta di effettuare uno screening in quanto è in grado di rivelare la presenza di Ig anche a
basso titolo. Purtroppo il risultato del test è dato con interpretazione soggettiva in quanto il test non può essere completamente
automatizzato. Il TPHA è insensibile nella fase primaria.
Il presente kit consente uno screening con tecnica ELISA che rileva la presenza di anticorpi specifici di qualunque classe ed è
completamente automatizzabile. L'antigene impiegato si è ottenuto con tecnica ricombinante.
3.
PRINCIPIO DEL METODO
Il kit Syphilis Screen Recombinant si basa sul principio “sandwich”, una tecnica di dosaggio immunoenzimatico in fase solida, per
la determinazione dei livelli sierici di anticorpi anti-Treponema pallidum. Durante l’incubazione gli anticorpi eventualmente
presenti si legano all’antigene in fase solida come anche all’antigene marcato con perossidasi (HRP), formando un complesso
antigene-anticorpo-antigene-HRP. Il coniugato non legato viene eliminato attraverso lavaggi e l’attività enzimatica legata viene
determinata con l’aggiunta di un substrato cromogeno. La colorazione blu che si sviluppa, diventa gialla dopo l’aggiunta della
soluzione bloccante. L’intensità del colore è proporzionale alla concentrazione di anticorpi nel campione.
Fase solida
Ag
} Ag -HRP conjugate
= Ig umane
4.
COMPOSIZIONE DEL KIT E PREPARAZIONE DEI REAGENTI
Portare i reagenti a temperatura ambiente prima dell’uso.
Il kit da 2 x 96 det. (cod. 91100) contiene:
MT PLATE MICROPIASTRA 2x 96 pozzetti sensibilizzati con antigeni ricombinanti del Treponema pallidum.
Uso: Aprire l'involucro della piastra dalla parte opposta al codice (SR, seguito dal numero di lotto), che serve per la sua
identificazione; prendere il supporto e gli strips necessari. Lasciare gli altri non utilizzati nella busta con il gel di silice; fare uscire
l'aria e sigillare.
CONTROL - CONTROLLO NEGATIVO 1 x 1 mL
Contenuto: Siero di vitello con fenolo 0.05% e bronidox 0.02%, liquido, pronto all'uso senza ulteriore diluizione.
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CONTROL + CONTROLLO POSITIVO 1 x 1 mL
Contenuto: Siero umano diluito in soluzione proteica stabilizzata contenente anticorpi anti Treponema pallidum
CONJ CONIUGATO 2 x 15 mL
Contenuto: una miscela di proteine ricombinanti del Treponema pallidum marcate con perossidasi in tampone fosfato con fenolo
0,05% e Bronidox 0.02%. Pronto all'uso senza ulteriore diluizione.
WASH BUF 10x TAMPONE DI LAVAGGIO 10X (PF93603) 1 x 100 mL INTERCAMBIABILE FRA LOTTI
Contenuto: Soluzione salina tamponata (PBS) concentrata 10 volte contenente Brij 0.5%.
Preparazione: Diluire il volume richiesto 1:10 con acqua distillata per ottenere il tampone di lavaggio pronto all'uso. Se sono
presenti cristalli, discioglierli a 37°C prima di diluire.
SUBS TMB SUBSTRATO (PF93619) 2 x 12 mL Pronto all'uso INTERCAMBIABILE FRA LOTTI
Contenuto: Tetrametilbenzidina 0,26 mg/mL ed H 2 O 2 0,01% stabilizzati in tampone citrato 0,05 mol/L (pH 3,8).
SOLUZIONE BLOCCANTE (PF93602) 2 x 16 mL INTERCAMBIABILE FRA LOTTI
H 2 SO 4 0,3 M
Soluzione di H 2 SO 4 0,3 mol/L pronta all'uso.
PELLICOLA PROTETTIVA (2).
BUSTA DI POLIETILENE (1).
Il kit da 6 x 96 det. (cod. 91104) contiene:
MT PLATE MICROPIASTRA 6x 96 pozzetti sensibilizzati con antigeni ricombinanti del Treponema pallidum.
Uso: Aprire l'involucro della piastra dalla parte opposta al codice (SR, seguito dal numero di lotto) che serve per la sua
identificazione; prendere il supporto e gli strips necessari. Lasciare gli altri non utilizzati nella busta con il gel di silice; fare uscire
l'aria e sigillare.
CONTROL - CONTROLLO NEGATIVO 2 x 1 mL
Contenuto: Siero di vitello con fenolo 0.05% e bronidox 0.02%, liquido, pronto all'uso senza ulteriore diluizione.
CONTROL + CONTROLLO POSITIVO 2 x 1 mL
Contenuto: Siero umano diluito in soluzione proteica stabilizzata contenente anticorpi anti Treponema pallidum.
CONJ CONIUGATO 6 x 15 mL
Contenuto: una miscela di proteine ricombinanti del Treponema pallidum marcate con perossidasi in tampone fosfato con fenolo
0,05% e Bronidox 0.02%. Pronto all'uso senza ulteriore diluizione.
WASH BUF 10x TAMPONE DI LAVAGGIO 10X (PF93603) 3 x 100 mL INTERCAMBIABILE FRA LOTTI
Contenuto: Soluzione salina tamponata (PBS) concentrata 10 volte contenente Brij 0.5%.
Preparazione: Diluire il volume richiesto 1:10 con acqua distillata per ottenere il tampone di lavaggio pronto all'uso. Se sono
presenti cristalli, discioglierli a 37°C prima di diluire.
SUBS TMB SUBSTRATO (PF93619) 6 x 12 mL Pronto all'uso INTERCAMBIABILE FRA LOTTI
Contenuto: Tetrametilbenzidina 0,26 mg/mL ed H 2 O 2 0,01% stabilizzati in tampone citrato 0,05 mol/L (pH 3,8).
H 2 SO 4 0,3 M SOLUZIONE BLOCCANTE (PF93602) 1 x 120 mL INTERCAMBIABILE FRA LOTTI
Soluzione di H 2 SO 4 0,3 mol/L pronta all'uso.
PELLICOLA PROTETTIVA (2).
BUSTA DI POLIETILENE (1).
MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI
- Incubatore a 37°C
- Lettore di micropiastre (lunghezza d'onda 450 o a 450/620 nm, con linearità fino ad OD >= 2,000)
- Lavatore di micropiastre (non indispensabile) capace di dispensare volumi da 225-375 µL
- Acqua distillata o deionizzata
- Normale vetreria di laboratorio: cilindri, provette, ecc.
- Micropipette capaci di prelevare accuratamente 10, 100, 1000 µL di soluzione
-Guanti mono-us
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- Contaminuti
- Soluzione al 5% di sodio ipoclorito
- Contenitori per la raccolta di materiali potenzialmente infetti
- Carta assorbente
5.
MODALITA’ DI CONSERVAZIONE E STABILITA’ DEI RAGENTI
I reagenti devono essere conservati a 2/8°C.
La data di scadenza è stampata su ogni componente e sull’ etichetta esterna della confezione.
I Reagenti hanno una stabilità limitata dopo apertura e/o preparazione:
REAGENTE
CONDIZIONI
MICROPIASTRA
8 SETTIMANE 2/8°C busta di polietilene
CONTROLLO NEGATIVO
1 SETTIMANA a 15-30°C, 8 settimane a 2-8°C.
CONTROLLO POSITIVO
1 SETTIMANA a 15-30°C, 8 settimane a 2-8°C
CONIUGATO
1 SETTIMANA a 15-30°C, 8 settimane a 2-8°C
SUBSTRATO
fino alla scadenza a 2/8°C , 1 settimana a15/30°C; conservare al buio
TAMPONE DI LAVAGGIO
p. uso 2 settimane 2/8°C 5 giorni 15/30 °C
SOLUZIONE BLOCCANTE
fino alla scadenza a 2/8°C
6.
PRECAUZIONI ED AVVERTENZE
SOLO PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO. CONSERVARE A 2-8°C
Attenzione:
Questo kit contiene materiali di origine umana che sono stati testati e trovati negativi con test approvati dall’FDA sia per
la ricerca di HbsAg che per quella degli anticorpi anti-HIV-1, anti-HIV-2 ed anti-HCV. Poiché nessun test diagnostico
può offrire una completa garanzia sull'assenza di agenti infettivi, qualunque materiale di origine umana deve essere
considerato potenzialmente infetto. Tutti i reagenti e i campioni devono essere maneggiati secondo le norme di sicurezza
normalmente adottate in laboratorio.
Smaltimento dei residui: i campioni di siero e i reagenti usati devono essere trattati come residui infetti, quindi smaltiti in
accordo alle disposizioni di legge vigenti.
Avvertenze per la sicurezza personale
1.
2.
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5.
6.
Non pipettare con la bocca. Usare guanti monouso e protezione per gli occhi nel maneggiare i campioni e durante la prova.
Lavare accuratamente le mani una volta terminato il test.
I seguenti reagenti contengono concentrazioni basse di sostanze dannose o irritanti:
a) Il tampone di lavaggio contiene detergenti
b) Il coniugato ed i controlli contengono fenolo
c) Il substrato è acido
Se un reagente viene a contatto con la pelle o con gli occhi, lavare abbondantemente con acqua.
Le apparecchiature che non sono monouso, devono essere sterilizzate dopo l'uso, ponendo preferibilmente in autoclave per 1 h
a 121°C; quelle monouso devono essere autoclavati o inceneriti, mediante impianto autorizzato.
L'acido solforico contenuto nello Stop Solution e l'acido cloridrico usato per lavare la vetreria sono corrosivi; tali sostanze
devono essere adoperate con cautela. In caso di contatto con la pelle o gli occhi, lavare abbondantemente con acqua.
I rifiuti liquidi, neutralizzati con sostanze alcaline, devono essere disinfettati aggiungendo sodio ipoclorito in un volume
sufficiente da ottenere una concentrazione finale almeno dell'1%. Un'esposizione al sodio ipoclorito all'1% per 30 minuti
dovrebbe essere sufficiente per garantire una disinfezione efficace.
Eventuali versamenti di materiali potenzialmente infetti devono essere rimossi immediatamente con carta assorbente e la zona
inquinata dovrà essere pulito, per esempio con sodio ipoclorito all'1%, prima di proseguire il lavoro. Se è presente un acido, il
sodio ipoclorito non deve essere usato prima che la zona sia stata asciugata. Tutti i materiali utilizzati per pulire eventuali
versamenti accidentali, compresi guanti, devono essere scartati come rifiuti infetti e quindi smaltiti in accordo alle
disposizioni di leggi vigenti. Non mettere in autoclave materiali contenenti sodio ipoclorito.
Avvertenze analitiche
1. Prima dell'uso, portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (18-30°C). Riporre i reagenti alla temperatura di
conservazione raccomandata immediatamente dopo l'uso. E' importante disporre di una corretta termostatazione per
l'incubazione delle strip. Controllare che il termostato non scenda sotto i 35°C e non salga oltre i 39°C.
Aprire la busta contenente le strip dopo almeno mezz'ora a temperatura ambiente.
2. Non utilizzare i reagenti dopo la data di scadenza. Evitare l'inquinamento microbico dei reagenti poiché ciò riduce la validità
del prodotto e può dare luogo a risultati errati.
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13.
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Non modificare la Procedura, né sostituire i reagenti con quelli di altri produttori o da altri lotti, a meno che non sia
specificamente riportato che il reagente è intercambiabile fra lotti. Non ridurre i tempi di incubazione raccomandati.
Tutta la vetreria da utilizzare nel test deve essere lavata accuratamente con acido cloridrico 2M e sciacquata con acqua
distillata o deionizzata.
Non esporre i reagenti a forte illuminazione né a vapori di ipoclorito durante la conservazione e le fasi di incubazione.
Evitare che i pozzetti si secchino durante il test.
Evitare la contaminazione incrociata fra reagenti. E' importante adoperare delle pipette "dedicate" per l'uso.
Evitare di toccare il bordo del pozzetto con il coniugato. Non soffiare sulle micropiastre.
I dosaggi immunoenzimatici possono talvolta presentare un particolare effetto sul bordo ("edge effect"); si può minimizzare
tale effetto aumentando l'umidità durante le fasi di incubazione. Le piastre devono essere coperte con i copripiastre ed
incubate a 37°C o in bagnomaria usando un sostegno per le piastre, o in incubatore. In alternativa, le piastre si possono
incubare in un analizzatore adatto. Per ulteriori dettagli consultare l'apposito manuale operativo dello strumento. Non si
possono utilizzare incubatori a CO 2.
Prima di leggere la piastra, assicurarsi che il fondo della piastra sia pulito ed asciutto e che non ci siano bolle d'aria sulla
superficie del liquido.
Può essere fonte di errori l'uso di campioni fortemente emolizzati, siero non completamente coagulato, plasma contenente
fibrina o campioni che presentano inquinamento microbico.
L’uso del kit con strumenti automatici deve essere validato dall’utilizzatore.
Leggere il manuale operativo relativo a qualsiasi strumento utilizzato, ed in particolare con riferimento ai seguenti punti:
- installazione e requisiti particolari
- principio operativo, istruzioni, precauzioni, rischi
- specifiche del produttore e performance dello strumento
- manutenzione e assistenza tecnica.
7.
TIPO DI CAMPIONI E CONSERVAZIONE
Non è richiesta alcuna preparazione particolare del paziente. Si possono usare campioni di siero o plasma. Non sono state
osservate interferenze in seguito all’uso di anticoagulanti come citrato, eparina o EDTA. Il campione può essere mantenuto per 7
giorni a 2/8°C. Per conservazioni più lunghe congelare a -20°C e può subire fino ad un massimo di 3 scongelamenti. Evitare l’uso
di congelatori auto sbrinanti per la conservazione dei campioni. Un ciclo di congelamento/scongelamento dei campioni o
un’inattivazione al calore per 30 min a 56°C non influenza i risultati.
Campioni fortemente lipemici, itterici o inquinati non dovrebbero essere utilizzati.
8.
PROCEDIMENTO
PREPARAZIONE
Preparazione del tampone di lavaggio: 18 mL di acqua distillata + 2 mL di WASH BUFFER 10x per strip
ESECUZIONE DEL TEST
1. Distribuzione dei campioni:
Dispensare 30 µL dei campioni in esame e successivamente 30 µL di controllo negativo e di controllo positivo (in duplicato) nei
rispettivi pozzetti.
Aggiungere in tutti i pozzetti 100 µL di coniugato. Miscelare accuratamente.
2. Incubazione:
Incubare la piastra coperta con foglio adesivo a 37°C per 40 min.
3. Lavaggio:
Rimuovere il foglio adesivo, aspirare il contenuto di tutti i pozzetti e lavare 4 volte riempendo ciascun pozzetto con circa 0,3 mL
di soluzione di lavaggio. Attendere 30 secondi ogni volta.
4. Distribuzione del substrato:
Dispensare 100 µL di substrato per ogni pozzetto.
5. Incubazione del substrato:
Incubare la piastra per 10 minuti a temperatura compresa tra 18 e 30°C.
6. Arresto della reazione:
Dispensare 100 µL di soluzione bloccante seguendo lo stesso ordine di aggiunta del punto 4.
7. Lettura:
Leggere fotometricamente entro 30 minuti a 450 nm o a 450/620 nm.
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9.
STEP 1
STEP 2
STEP 3
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SCHEMA DEL SAGGIO
Mettere il siero campione nei singoli pozzetti, 30 µL di controllo negativo, positivo (in duplicato) e aggiungere 100
µL di coniugato. Miscelare.
Incubare 40 min. a 37°C
Lavare 4 volte dispensando 300 µl di tampone di lavaggio e con tempo di attesa di 30 sec. tra erogazione ed
aspirazione
Mettere 100 µL di Substrato per pozzetto
Incubare 10 min. a 18-30°C
Aggiungere 100 µL di Stop Solution
Leggere l' O.D. a 450 nm entro 30 min.
10.
VALIDAZIONE DEL TEST
Dosare i Controlli Negativo e Positivo in duplicato.
La O.D. del Controllo negativo deve essere ≤ 0.200
La O.D. del Controllo positivo deve essere ≥ 0.600 ; ≤2.000 .
11.
INTERPRETAZIONE DEL TEST
Calcolo del valore di cut-off
Cut-off = (OD Controllo Negativo + OD Controllo Positivo)/3
Se il valore dell'assorbanza del campione è maggiore del Cut-off, il campione risulta positivo per la presenza di immunoglobuline
anti-Treponema pallidum.
12.
LIMITAZIONI DEL TEST
Il test non è in grado di discriminare la presenza di IgG da quella delle IgM.
Il risultato del test deve essere comunque valutato insieme a dati provenienti dalla storia del paziente e/o da altre indagini
diagnostiche.
13.
SPECIFICITA’ ANALITICA
La specificità analitica è stata studiata testando campioni contenenti fattori potenzialmente interferenti come anticorpi Antinucleari EBV, anticorpi eterofili, anticorpi anti-Borrelia, Fattore Reumatoide (da 40 a 1080 UI/mL), Trigliceridi (<= 870 mg/dL),
Bilirubina (<= 11 mg/dL), ed emoglobina (<= 10 mg/dl). In nessun caso il risultato del test veniva alterato.
14.
SENSIBILITA’ E SPECIFICITA’ DIAGNOSTICA
E’ stato effettuato uno studio su 946 campioni provenienti da una routine di laboratorio. I campioni venivano dosati in parallelo
con un kit ELISA disponibile in commercio basato sul principio “a competizione”. Sono stati trovati 28 campioni positivi, 6 dei
quali in disaccordo fra i due metodi. Questi campioni venivano indagati ulteriormente con il metodo FTA-ABS, preso come
metodo di riferimento; 5 sieri venivano confermati come positivi ed uno era negativo. La specificità diagnostica del test in questa
sperimentazione è 99,9%.
La sensibilità diagnostica è stata studiata studiando la reazione di 74 campioni positivi per la presenza di immunoglobuline
specifiche anti-Treponema pallidum: tutti i campioni risultavano fortemente positivi, dando una sensibilità del 100%,
15.
PRECISIONE
1. Ripetibilità (intra-serie)
Dosaggi eseguiti in una stessa serie
Campione
Repliche
Media D.O.
CV %
Controllo
Negativo
24
0.09
3.23
Controllo
Positivo
24
1.466
10.02
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2. Riproducibilità (inter-serie)
Dosaggi eseguiti in 5 serie differenti
Campione
Media
CV%
16.
Controllo
Negativo
0.098
5.37
Controllo
Positivo
1.888
10.41
GUIDA AI PROBLEMI DI UTILIZZO
PROBLEMA
Seduta invalida (tutti negativi)
Seduta invalida (tutti positivi)
Scarsa precisione
Insufficiente sviluppo di colore
17.
POSSIBLI FONTI DI ERRORE
Uno o più reagenti non sono stati
aggiunti oppure sono stati aggiunti
in ordine errato
AZIONI DA INTRAPRENDERE
Controllare nuovamente la procedura.
Controllare se qualche reagente non è stato
aggiunto.
Ripetere il test.
Piastra non reattiva
Controllare il codice sulla busta della piastra
(vedi informazioni tecniche per il codice
corretto).
Controllare la presenza di umidità nella
piastra inutilizzata. (Il gel di silice deve
essere giallo pallido) Ripetere il test.
Inquinamento del substrato
Prelevare una nuova aliquota del substrato.
Lavaggio inadeguato
Assicurarsi del buon funzionamento del
lavatore
Lavaggio incompleto dei pozzetti
Assicurarsi del buon funzionamento del
lavatore
Aspirazione inadeguata dei pozzetti Assicurarsi del buon funzionamento del
lavatore
Errore del pipettamento
Controllare il funzionamento della pipetta
Aggiunta dei reagenti troppo lenta
Evitare l’essiccamento della piastra dopo il
lavaggio. Aggiungere i reattivi
immediatamente.
Presenza di bolle d’aria
Evitare la formazione di bolle d’aria durante
il pipettamento
Percorso ottico non limpido
Controllare la fonte luminosa per la presenza
di sporco. Pulire il fondo della piastra con
fazzoletto di carta.
Tempo o temperatura di incubazione Verificare il monitoraggio della temperatura
non corretto
ed il tempo di incubazione
Seguire attentamente le istruzioni per l’uso.
Substrato aggiunto in volume
Controllare il funzionamento della pipetta.
inadeguato
BIBLIOGRAFIA
S. J. Norris: Polypeptides of Treponema pallidum: progress toward understranding their structural, functional and
immunologic roles. Microbiological Reviews, 1993.
2. P.A. Hanff et al. Humoral immune response in human syphilis to polypeptides of Treponema pallidum. J. Immunology
129: 1287 (1982).
3. L. Lewis et al. Evaluation of immunoglobullin M Western blot analysis in the diagnosis of congenital syphilis. J. Clin.
Microbiol. 28: 296 (1990).
4. H. Young et al., Enzywell recombinant enzyme immunoassay for the serological diagnosis of syphilis. Int. J. STD and
AIDS. 11: 288-291 (2000).
1.
Rif. IO - 09/162 – Inf. Tecn. 91100 – Ed. 17.10.2012
EN
9/27
INSTRUCTIONS FOR USE
ENZYWELL
REF 91100 (2 x 96 tests)
REF 91104 (6 x 96 tests)
(English)
1.
INTENDED USE
IMMUNOENZYMATIC KIT FOR THE QUALITATIVE DETERMINATION OF ANTI-TREPONEMA PALLIDUM
IMMUNOGLOBULINS IN HUMAN SERUM OR PLASMA.
2.
SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST
The serological diagnosis of syphilis is performed by demonstrating the presence of significant levels of specific Treponema
pallidum (TP) antibodies in the serum sample.
The reference method used is the FTA-ABS technique but its execution is laborious and the interpretation of the results is not
simple; alternative methods have therefore been introduced to simplify the procedure.
The TPHA test is the preferred technique for screening purposes, in as far as it detects specific Ig even at low titers. Unfortunately,
the result of the test is determined by subjective interpretation as the test cannot be completely automated. The TPHA test is not
sensitive in the primary phase.
The present kit allows screening with the sandwich ELISA method. It reveals the presence of specific antibodies of any class, and
can be completely automated. The antigen used is obtained by a recombinant technique.
3.
PRINCIPLE OF THE TEST
The Syphilis Screen recombinant test is based on the “sandwich” principle, a solid phase enzyme-linked immunoassay technique,
to measure anti-Treponema pallidum levels in serum or plasma. During incubation, the .antibodies present in the sample are
immunologically coupled to the solid phase antigen as well as to the antigen labelled with horse-radish peroxidase (HRP), creating
an antigen-antibody-antigen-HRP “sandwich”. The unbound conjugate is eliminated by washing and the bound enzymatic activity
is determined by adding a chromogen substrate. The blue reaction which develops turns yellow on addition of the stop solution.
The intensity of the colour is proportional to the antibody concentration in the sample.
Solid phase
Ag
}Ag -HRP conjugate
= human Ig
4.
REAGENTS AND REAGENT PREPARATION
Bring to room temperature before use.
The kit for 2 x 96 tests contains the following materials:
MT PLATE
MICROPLATE 2 x 96 wells coated with recombinant proteins of Treponema pallidum antigens.
Use: open the package at the opposite end from the code (SR followed by the lot number) which is necessary for its identification,
remove the support and strips to be used from the foil package, and leave the unused strips in the package with the silica gel, expel
the air and seal.
CONTROL NEGATIVE CONTROL 1 x 1 mL
Contents: Newborn calf serum with phenol 0.05% and Bronidox 0.02%, liquid, ready for use without further dilution.
Rif. IO - 09/162 – Inf. Tecn. 91100 – Ed. 17.10.2012
EN
10/27
CONTROL +
POSITIVE CONTROL 1 x 1 mL
Contents: Human serum diluted in a stabilizing proteic solution, containing anti Treponema pallidum antibodies.
CONJ CONJUGATE 2 x 15 mL
Contents: Recombinant proteins of Treponema pallidum labelled with Peroxidase, in phosphate buffer with phenol 0.05% and
Bronidox 0.02%.
WASH BUF 10x WASH BUFFER 10X (PF93603) 1 x 100 mL INTERCHANGEABLE BETWEEN LOTS
Contents: Phosphate buffered saline, concentrated 10 times; contains Brij 0.5%.
Preparation: dilute the required volume 1:10 with distilled water in order to obtain the washing buffer ready for use. If crystals are
present, they should be dissolved at 37°C before dilution.
SUBS TMB SUBSTRATE (PF93619) 2 x 12 mL Ready for use. INTERCHANGEABLE BETWEEN LOTS
Contents: Tetramethylbenzidine 0.26 mg/mL and hydrogen peroxide 0.01% stabilised in citrate buffer 0.05 mol/L (pH 3.8).
H 2 SO 4 0,3 M STOP SOLUTION (PF93602) 2 x 16 mL INTERCHANGEABLE BETWEEN LOTS
H 2 SO 4 0.3 mol/L, in solution ready for use.
ADHESIVE FILMS (2).
POLYTHENE BAG (1).
The kit for 6 x 96 tests contains the following materials:
MT PLATE
MICROPLATE 6 x 96 wells coated with recombinant proteins of Treponema pallidum antigens.
Use: open the package at the opposite end from the code (SR followed by the lot number) which is necessary for its identification,
remove the support and strips to be used from the foil package, and leave the unused strips in the package with the silica gel, expel
the air and seal.
CONTROL NEGATIVE CONTROL 2 x 1 mL
Contents: Newborn calf serum with phenol 0.05% and Bronidox 0.02%, liquid, ready for use without further dilution.
CONTROL +
POSITIVE CONTROL 2 x 1 mL
Contents: Human serum diluted in a stabilizing proteic solution, containing anti Treponema pallidum antibodies.
CONJ CONJUGATE 6 x 15 mL
Contents: Recombinant proteins of Treponema pallidum labelled with Peroxidase, in phosphate buffer with phenol 0.05% and
Bronidox 0.02%.
WASH BUF 10x WASH BUFFER 10X (PF93603) 3 x 100 mL INTERCHANGEABLE BETWEEN LOTS
Contents: Phosphate buffered saline, concentrated 10 times; contains Brij 0.5%.
Preparation: dilute the required volume 1:10 with distilled water in order to obtain the washing buffer ready for use. If crystals are
present, they should be dissolved at 37°C before dilution.
SUBS TMB SUBSTRATE (PF93619) 6 x 12 mL Ready for use INTERCHANGEABLE BETWEEN LOTS
Contents: Tetramethylbenzidine 0.26 mg/mL and hydrogen peroxide 0.01% stabilised in citrate buffer 0.05 mol/L (pH 3.8).
H 2 SO 4 0,3 M STOP SOLUTION (PF93602) 1 x 120 mL INTERCHANGEABLE BETWEEN LOTS
H 2 SO 4 0.3 mol/L, in solution ready for use.
ADHESIVE FILMS (2).
POLYTHENE BAG (1).
MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
- Incubator at 37°C
- Microplate reader, wavelength 450 or at 450/620 nm, with OD linearity up to 2,000 (at least).
- Microplate washer (preferable) able to dispense volumes ranging between 225-375 µl
- Distilled or deionized water
- Normal laboratory glassware: cylinders, test-tubes etc.
- Micropipettes for the accurate collection of 10, 100, 1000 µl solution
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- Disposable gloves
- Timer
- Sodium Hypochlorite solution (5%)
- Containers for collection of potentially infectious materials
- Absorbent tissue
5.
STORAGE AND STABILITY OF REAGENTS
Reagents must be stored at 2/8°C.
The expiry date is printed on each component and on the box label.
Reagents have a limited stability after opening and/or preparation
REAGENT
CONDITIONS
MICROPLATE
8 weeks at 2/8°C in the polythene bag
NEGATIVE CONTROL
1 week at 15-30°C, 8 weeks at 2-8°C
POSITIVE CONTROL
CONJUGATE
SUBSTRATE
until the expiry date at 2/8°C, 1 week at 15-30°C in the dark
WASH BUFFER
2 weeks at 2/8°C, 5 days at 15/30°C.
STOP SOLUTION
until the expiry date at 2/8°C
6.
PRECAUTIONS AND WARNINGS:
FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE. STORE AT 2-8°C.
Caution:
This kit contains materials of human origin which have been tested and gave a negative response by FDA-approved
methods for the presence of HbsAg and for anti-HIV-1, anti-HIV-2 and anti-HCV antibodies. As no diagnostic test can
offer a complete guarantee regarding the absence of infective agents, all material of human origin must be handled as
potentially infectious. All precautions normally adopted in laboratory practice should be followed when handling material
of human origin.
Waste disposal: serum samples and reagents once used must be treated as infectious residuals and eliminated according to
law.
Health and Safety Information
1. Do not pipette by mouth. Wear disposable gloves and eye protection while handling specimens and performing the assay.
Wash hands thoroughly when finished.
2. The following reagents contain low concentrations of harmful or irritant substances:
a)The Wash Buffer contains detergents
b)The conjugate and controls contain phenol
c)The substrate is acid.
If any of the reagents come into contact with the skin or eyes, wash the area extensively with water.
3. Non-disposable apparatus should be sterilized after use. The preferred method is to autoclave for 1 h at 121°C; disposables
should be autoclaved or incinerated.
4. Sulphuric acid required for the Stop Soution and hydrochloric acid used for washing glassware are corrosive and should be
handled with appropriate care. If they come into contact with the skin or eyes, wash thoroughly with water.
5. Neutralized acids and other liquid waste should be decontaminated by adding a sufficient volume of sodium hypochlorite to
obtain a final concentration of at least 1.0%. A 30 minute exposure to 1% sodium hypochlorite may be necessary to ensure
effective decontamination.
6. Spillage of potentially infectious materials should be removed immediately with adsorbent paper tissue and the contaminated
area swabbed with, for example, 1.0% sodium hypochlorite before work is continued. Sodium hypochlorite should not be
used on acid-containing spills unless the spill area is first wiped dry. Materials used to clean spills, including gloves, must be
disposed of according to the full requirements of the issue. Do not autoclave materials containing sodium hypochlorite.
Analytical precautions
1. Allow all reagents and samples to come to room temperature (18-30°C) before use. Immediately after use return reagents to
the recommended storage temperature. It is important to work at the correct temperature. Check that the thermostat
does not go below 35°C or over 39°C.
2. Do not use the reagents beyond the stated expiry date. Microbiological contamination of reagents must be avoided as this may
reduce the life of the product and cause erroneous results.
3. Do not modify the Test Procedure or substitute reagents from other manufacturers or other lots unless the reagent is stipulated
as interchangeable. Do not reduce any of the recommended incubation times.
4. Any glassware to be used with the reagents sbould be thoroughly washed with 2M hydrochloric acid and then rinsed with
distilled water or high quality deionized water.
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5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
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Do not expose reagents to strong light or hypochlorite fumes during storage or during incubation steps.
Do not allow wells to become dry during the assay procedure.
Care must be taken not to cross-contaminate reagents. It is important that pipettes are dedicated for excusive use with the
various reagents.
Care should be taken to avoid touching or splashing the rim of the well with conjugate. Do not "blow-out" from microplates.
Enzyme immunoassays can occasionally exhibit an "edge effect" which must be minimized by increasing the humidity during
incubation steps. Plates must be covered wth their covers and incubated at 37°C either in a water bath with a rack or float to
support the plates if necessary, or in an incubator. Alternatively, plates can be incubated in an approved analyzer. See the
appropriate operating manual for further details. CO 2 incubators must not be used.
Ensure tht the bottom of the plate is clean and dry, and that no bubbles are present on the surface of the iquid befor reading
the plate.
Use of highly hemolyzed samples, incompletely clotted sera, plasma samples containing fibrin or samples with microbial
contamination may give rise to erroneous results.
Use of the kit with automatic instruments must be validated by the user.
For each instrument used, read the manufacturer's instructions manual carefully to obtain additional information on the
following points:
- installation and particular requisites
- operating principles, instructions, precautions and risks
- manufacturer's specifications and instrument performance
- servicing and maintenance
7.
TYPE OF SPECIMENS AND STORAGE
No special preparation of the patient is necessary. Serum or plama samples can be used. The use of anticoagulants such as citrate,
heparin or EDTA does not interfere in the test. Samples can be stored for 7 days at 2-8°C. For longer storage, freeze at –20°C.
They can be thawed a maximum of 3 times.
Avoid to use self-defrosting freezers for the storage of the samples.
Freezing/thawing of the samples or heat inactivation for 30 min at 56°C does not influence the results.
Strongly lipemic, icteric or contaminated samples should be avoided.
8.
TEST PROCEDURE
PREPARATION
Preparation of the washing buffer: 18 mL of distilled water + 2 mL WASH BUFFER 10x per strip.
1. Distribution of the samples:
Dispense 30 µL of the samples being tested and subsequently 30 µl of negative control and positive control (in duplicate), in the
respective wells.
Add 100 µL of conjugate to each well. Mix carefully.
2. Incubation:
Incubate the plate covered with the adhesive foil at 37°C for 40 minutes.
3. Rinsing:
Remove the adhesive film, aspirate the contents of all the wells and rinse 4 times, filling each well with about 0.3 mL of washing
solution. Wait 30 seconds between each rinse.
4. Distribution of the substrate:
Dispense 100 µL of the substrate in each well.
5. Substrate incubation:
Incubate the plate for 10 minutes at room temperature (18-30°C).
6. Interruption of the reaction:
Dispense 100 µL of stop solution, in the same order as that followed for point 4.
7. Reading:
Take the photometric readings within 30 minutes at 450 nm or at 450/620 nm.
9.
STEP 1
STEP 2
SCHEME OF TEST PROCEDURE
Place serum samples and 30 µL of negative and positive controls (in duplicate)i n the wells of the strips
and add 100 µL of conjugate. Mix well.
Incubate for 40 min. at 37°C
Wash 4 times (300 µL) - wait 30 seconds each time
Place 100 µL of Substrate in each well
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STEP 3
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Incubate for 10 min. at room temperature (18-30°C)
Add 100 µL of Stop Solution
Read absorbance at 450 nm within 30 min
10.
VALIDATION OF THE TEST
Test the Negative and Positive Controls in duplicate.
Individual Negative Control values should be ≤ 0.200.
Individual Positive Control values should be ≥ 0.600; ≤ 2.000.
11.
INTERPRETATION OF THE TEST
Calculation of the cut-off value
Cut-off = (OD Negative Control + OD Positive Control)/3
If the absorbance value of the sample is higher than that of the Cut-off, the sample is positive for the presence of anti-Treponema
pallidum immunoglobulins.
12.
LIMITATIONS
The test is not able to discriminate between the presence of IgG and that of IgM.
The test result should be used in conjunction with information available from the evaluation of the case history or other diagnostic
procedures.
13.
ANALYTICAL SPECIFICITY
Analytical specificity was studied by testing samples containing potentially interfering factors such as Anti-Nuclear EBV
antibodies, heterophile antibodies, Borrelia antibodies, Rheumatoid Factor (from 40 to 1080 IU/mL), Triglycerides (<= 870
mg/dL), bilirubin (<= 11 mg/dL), hemoglobin (<=10 mg/dl). None of these factors caused interference in the test.
14.
DIAGNOSTIC SENSITIVITY AND SPECIFICITY
A study was performed on 946 samples taken from routine laboratory practice. The specimens were tested in parallel by a
commercial ELISA kit based on the competitive principle. 28 positive sera were found, of which 6 samples were in disagreement;
these were further investigated by FTA-Abs, taken as reference method. Five were confirmed positive, and one was negative. The
diagnostic specificity of the test in this experimentation is 99.9%.
The diagnostic sensitivity was investigated by studying the reaction of 74 samples known to be positive for the presence of
specific immunoglobulins against Treponema pallidum. All the samples were strongly positive, giving 100% sensitivity.
15.
1.
PRECISION
Intra-assay reproducibility
Sample
Repeats
Average
O.D..
CV %
Negative
Control
24
0.09
Positive
Control
24
1.466
3.23
10.02
2. Assays performed in 5 different series
Sample
Average
CV%
Negative
Control
0.098
5.37
Positive
Control
1.888
10.41
Rif. IO - 09/162 – Inf. Tecn. 91100 – Ed. 17.10.2012
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16.
TROUBLE SHOOTING GUIDE
PROBLEM
POSSIBLE SOURCE
Invalid run (all negative)
One or more reagents not added or
added in wrong sequence
Unreactive plate
Invalid run (all positive)
Poor precision
Contamination of substrate
Inadequate washing
Incomplete washing of wells
Inadequate aspiration of wells
Pipetting error
Reagent addition too slow
Presence of bubbles
Optical pathway not clean
Inadequate Color development
Incorrect incubation times or
temperature
Inadequate volume of substrate
added to the plate
17.
1.
2
3
4
14/27
TEST OR ACTION
Recheck procedure
Check for unused solutions. Repeat test.
Check the code on the package containing
the plate (see package insert point 4 for
correct code).
Check for moisture in unused plate. (Silica
gel desiccant must be pale yellow ).Repeat
test
Take new aliquot of substrate.
Ensure that wash apparatus works well
Check pipette function
Avoid drying of the plate after washing step.
Add reagents immediately
Avoid air bubbles during pipetting.
Check instrument light source and detector
for dirt. Wipe bottom of plate with soft
tissue.
Check for temperature control and time
monitoring
Adhere to recommended instruction for use.
Check pipette function.
REFERENCES
P.A. Hanff et al. Humoral immune response in human syphilis to polypeptides of Treponema pallidum. J. Immunology
129: 1287 (1982).
L. Lewis et al. Evaluation of immunoglobullin M Western blot analysis in the diagnosis of congenital syphilis. J. Clin.
Microbiol. 28: 296 (1990).
H. Young et al., Enzywell recombinant enzyme immunoassay for the serological diagnosis of syphilis. Int. J. STD and
AIDS. 11: 288-291 (2000).
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ES
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INSTRUCCIONES DE USO
ENZYWELL
REF 91100 (2 x 96 tests)
REF 91104 (6 x 96 tests)
(Español)
1.
INDICACIONES DE USOKIT INMUNOENZIMÁTICO PARA LA DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE
LAS IMUNOGLOBULINAS ANTI TREPONEMA PALLIDUM EN SUERO O PLASMA HUMANOS.
2.
RESUMEN Y EXPLICACIÓN DEL TEST
El diagnóstico serológico de la Sífilis es realizado demostrando la presencia de niveles significativos de anticuerpos específicos
para Treponema pallidum (TP) en el suero del paciente.
El método de referencia es el FTA-ABS, pero dado que la ejecución es laboriosa y la interpretación del test no es simple, se han
introducido métodos alternativos para simplificar el procedimiento.
El TPHA es la técnica preferida cuando se \trata de ejecutar un screening en cuanto que puede detectar la presencia de IgG
también a titulación muy baja. Desafortunadamente, el resultado del test es determinado con interpretación subjetiva pues la
prueba no puede ser completamente automatizada. El TPHA no es sensible en la fase primaria.
Este kit permite el cribado mediante un ELISA que revela la presencia de anticuerpos específicos de cualquier clase y es
completamente automatizable. El antígeno utilizado se obtuvo con método recombinante.
3.
PRINCIPIO DEL MÉTODO
El kit Syphilis Screen Recombinant se basa en el principio de “sandwich”, un método inmunoenzimático en fase sólida, para la
determinación de los niveles de anticuerpos anti-Treponema pallidum en suero. Durante la incubación los anticuerpos presentes se
unen al antígeno en fase sólida y también al antígeno marcado con peroxidasa de rábano picante(HRP), creando un complejo
antígeno-anticuerpo-antígeno-HRP. El conjugado que no se ha unido se elimina a través de lavados y la actividad enzimática
unida se determina por adición de un sustrato cromógeno. La coloración azul que se desarrolla, se vulve amarilla después de la
adición de la solución bloqueante. La intensidad del color es proporcional a la concentración de anticuerpos en la muestra.
Fase sólida
Ag
} Ag -HRP conjugado
= Ig humanas
4.
COMPONENTES DEL KIT Y PREPARACIÓN DEL REACTIVO
Poner los reactivos a temperatura ambiente antes de su uso.
El kit de 2 x 96 det. contiene:
MT PLATE MICROPLACA 2x96 pocillos recubiertos de antígenos recombinantes del Treponema pallidum
Uso: Abrir el envase de la placa por el lado opuesto al código (SR seguido por el número de lote), el cual es necesario para su
identificación; retirar el soporte y las tiras necesarias del envase. Colocar las tiras no utilizadas en la bolsa de plástico con el gel de
sílice, extraer el aire y sellar. .
CONTROL
-
CONTROL NEGATIVO 1 x 1 mL
Rif. IO - 09/162 – Inf. Tecn. 91100 – Ed. 17.10.2012
ES
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Contenido: Suero de ternero recién nacido con fenol 0,05% y Bronidox 0,02%, líquido, listo para su uso sin diluición adicional.
CONTROL + CONTROL POSITIVO 1 x 1 mL
Contenido: Suero humano diluido en solución proteica estabilizadora conteniendo anticuerpos anti Treponema pallidum.
CONJ CONJUGADO 2 x 15 mL
Contenido: una mezcla de proteinas recombinantes de Treponema pallidum marcadas con peroxidasa en tampón fosfato con fenol
al 0.05% y Bronidox al 0.02%.
WASH BUF 10x TAMPÓN DE LAVADO 10X (PF93603) 1 x 100 mL INTERCAMBIABLE ENTRE LOTES
Contenido: Solución salina fosfato tamponada , concentrada 10 veces; contiene Brij al 0,5%.
Preparación: Diluir el volumen requerido 1:10 con agua destilada con el fin de obtener el tampón de lavado listo para su uso. Si
hay cristales presentes, disolverlos a 37°C antes de diluir.
SUBS TMB SUSTRATO (PF93619) 2 X 12 mL Listo para su uso INTERCAMBIABLE ENTRE LOTES
Contenido: Tetrametilbenzidina 0,26 mg/mL y peróxido de hidrógeno 0,01% estabilizados en tampón citrato 0,05 mol/l (pH 3,8).
H 2 SO 4 0.3 M SOLUCIÓN BLOQUEANTE (PF93602) 2x16 mL INTERCAMBIABLE ENTRE LOTES
Solución de H 2 SO 4 0,3 mol/l, lista para su uso.
CINTA ADHESIVA (2).
BOLSA DE PLÁSTICO (1).
El kit de 6 x 96 det. contiene:
MT PLATE MICROPLACA 6x96 pocillos recubiertos de antígenos recombinantes del Treponema pallidum
Uso: Abrir el envase de la placa por el lado opuesto al código (SR seguido por el número de lote) el cual es necesario para su
identificación; retirar el soporte y las tiras necesarias del envase. Colocar las tiras no utilizadas en la bolsa de plástico con el gel de
sílice, extraer el aire y sellar .
CONTROL - CONTROL NEGATIVO 2 x 1 mL
Contenido: Suero de ternero recién nacido con fenol 0,05% y Bronidox 0,02%, líquido, listo para su uso sin diluición adicional.
CONTROL + CONTROL POSITIVO 2 x 1 mL
Contenido: Suero humano diluido en solución proteica estabilizada conteniente anticuerpos anti Treponema pallidum.
Contenido: una mezcla de proteinas recombinantes de Treponema pallidum marcadas con peroxidasa en tampón fosfato con
fenol al 0,05% y Bronidox al 0,02%...
WASH BUF 10x TAMPÓN DE LAVADO 10X (PF93603) 3 x 100 mL INTERCAMBIABLE ENTRE LOTES
Contenido: Solución salina fosfato tamponada , concentrada 10 veces; contiene Brij al 0,5%.
Preparación: Diluir el volumen requerido 1:10 con agua destilada con el fin de obtener el tampón de lavado listo para su uso. Si
hay cristales presentes, disolverlos a 37°C antes de diluir.
SUBS TMB SUSTRATO (PF93619) 6 X 12 mL Listo para su uso INTERCAMBIABLE ENTRE LOTES
Contenido: Tetrametilbenzidina 0,26 mg/ml y peróxido de hidrógeno 0,01% estabilizados en tampón citrato 0,05 mol/l (pH 3,8).
H 2 SO 4 0.3 M SOLUCIÓN BLOQUEANTE (PF93602) 1x120 mL INTERCAMBIABLE ENTRE LOTES
Solución de H 2 SO 4 0,3 mol/L, lista para su uso.
CINTA ADHESIVA (2).
BOLSA DE PLÁSTICO (1).
MATERIALES REQUERIDOS NO SUMINISTRADOS:
- Incubador a 37°C
- Lector de Microplacas (longitud de onda 450 ó 450/620 nm con linealidades de OD hasta 2000 (por lo menos)
- Lavadora de Microplacas (no indispensable) para dispensar volumenes entre 225-375 µL
- Material de laboratorio: probetas , tubos de ensayo, etc.
- Micropipetas de precisión para extraer 10,100,1000 µL de solución
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-
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Agua Destilada u desionizada
Guantes de un solo uso
Cronómetro
Solución de hipoclorito del sodio (5%)
Envases para la recogida de materiales potencialmente infecciosos
Papel absorbente
5.
CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS
Los reactivos deben ser conservados a 2/8°C. La fecha de caducidad está impresa en cada uno de los componentes y en la
etiqueta exterior de la caja .
Los reactivos tienen una estabilidad limitada después de la apertura y/o de la preparación
REACTIVO
CONDICIONES
MICROPLACA
8 semanas 2/8°C en la bolsa de plástico
SUEROS DE CONTROL
1 semana a 15-30°C, 8 semanas a 2/8°C
CONJUGADO
1 semana a 15-30°C, 8 semanas a 2/8°C
SUSTRATO
hasta la caducidad a 2/8°C ; 1 semana a 15/30°C; en ambiente oscuro
SOLUCIÓN DE LAVADO
2 semanas a 2/8°C 5 días a 15/30 °C
SOLUCIÓN BLOQUEANTE
hasta la caducidad a 2/8°C
6.
PRECAUCIONES DE USO
SOLAMENTE PARA USO EN DIAGNÓSTICO IN VITRO. CONSERVAR A 2-8°C
Cuidado:
Este kit contiene materiales de origen humano que han sido probados y dieron resultados negativos en las pruebas
aprobadas por la FDA para la presencia de HbsAg y de los anticuerpos anti-VIH-1, anti-VIH-2 y anti-HCV. Dado que
ninguna prueba diagnóstica puede ofrecer una completa garantía sobre la ausencia de agentes infecciosos , cualquier
material de origen humana debe ser considerado potencialmente infecto. Todos los materiales de origen humano tienen
que manejarse según las prácticas comúnmente adoptadas en la práctica diaria de laboratorio.
Desecho de los residuos: las muestras de suero y los reactivos
infecciosos, segun disposiciones normativas vigentes.
se deben desechar como residuos potencialmente
Informaciones de Salud y Seguridad:
1. No pipetear por via oral. Usar los guantes de un solo uso y la protección para los ojos al manejar las muestras y durante la
prueba. Lavar las manos a fondo después de terminar el test.
2. Los reactivos siguientes contienen baja concentración de sustancias dañinas o irritantes:
a) El tampón de lavado contiene detergentes
b) El conjugado contiene fenol
c) El substrato es ácido
Si cualquier reactivo entra en contacto con la piel u ojos, lavar con mucha agua.
3. Los aparatos no desechables se deben esterilizar después su uso. El método preferido es autoclavar durante 1 h a 121°C; los
materiales desechables deben ser autoclavados o incinerados.
4. El ácido sulfúrico contenido en la Solución Bloqueante y el ácido clorhídrico usado para limpiar la cristalería son corrosivos;
utilizar estos materiales con cuidado. En caso de contacto con la piel u ojos, limpiar con mucha agua.
5. Los ácidos neutralizados y la otros residuos líquidos se deben disinfectar añadiendo hipoclorito de sodio en un volumen
suficiente para obtener una concentración final por lo menos del 1,0%. Se requier una exposición al hipoclorito de sodio al
1% durante 30 minutos para garantizar una disinfección eficaz.
6. El derrame de materiales potencialmente infecciosos se debe eliminar inmediatamente con papel absorbente y el área
contaminada tendrá que ser limpiada, por ejemplo con hipoclorito de sodio al 1,0%, antes de se que se continúe el trabajo. El
hipoclorito de sodio no se debe utilizar en derrames que contengan ácido antes de que la zona sea limpiada. Todos los
materiales utilizados para limpiar derrames, incluídos los guantes, se deben desechar como residuos infecciosos, segun
disposiciones normativas vigentes. No autoclavar materiales que contengan hipoclorito de sodio.
Precauciones analíticas
1. Poner todos los reactivos y las muestras a temperatura ambiente (18-30°C) antes de su uso. Inmediatamente después del
uso poner los reactivos a la temperatura de conservación recomendada. Es importante trabajar a la temperatura
correcta. Compruebe que el termostato no esté por debajo de 35°C ó por encima de 39°C..
2. No usar los reactivos después de la fecha de caducidad. La contaminación microbiológica de los reactivos debe ser
evitada ya que esta puede acortar la vida del producto y causar resultados erróneos.
Rif. IO - 09/162 – Inf. Tecn. 91100 – Ed. 17.10.2012
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3.
No modificar el método, ni reemplazar los reactivos con los de otros fabricantes o de otros lotes, a no ser que esté
específicamente indicado que el reactivo es intercambiable. No reducir los tiempos de incubación recomendados.
4. Lavar con ácido hidroclórico 2M todos los materiales de laboratorio que se utilizan en las pruebas y aclarar con agua
destilada o desionizada.
5. No exponer los reactivos a fuerte iluminación ni a humos de hipoclorito durante la conservación o las fases de
incubación.
6. Evitar que los pocillos se sequen durante el ensayo.
7. Evitar la contaminación cruzada entre reactivos. Es importante usar pipetas exclusivas para cada reactivo..
8. Evitar de tocar el borde del pocillo con el conjugado. No salpicar sobre las microplacas.
9. Las titulaciones inmunoenzimáticas de vez en cuando pueden presentar un particular efecto llamado "edge effect" (“efecto
filo”) que debe reducirse al mínimo aumentando el valor de la humedad durante las fases de la incubación. Las placas se
deben cubrir con sus tapas y deben ser incubadas a 37°C en un baño de agua usando un soporte para placas, o un
incubador. Alternativamente, incubar las placas en un analizador aprobado. Para más información consultar el manual de
usuario del equipo. No utilizar incubadores de CO 2 .
10. Asegurarse de que el fondo de la placa esté limpio y seco, y de que no haya burbujas presentes en la superficie del líquido
antes de leer la placa.
11. Puede ser fuente de error el uso de muestras altamente hemolizadas, suero no coagulado en su totalidad, plasma con
fibrina o muestras que presentan contaminación micróbiana.
12. El uso del kit con equipos automáticos debe ser convalidado por el usuario.
13. Leer el manual de usuario de cada equipo y en especial si desea obtener información sobre los puntos siguientes:
- instalación y requisitos específicos
- principios operativos, instrucciones, precauciones y riesgos
- especificaciones del fabricante y rendimiento del equipo
- mantenimiento y servicio técnico
7.
TIPO DE MUESTRA Y CONSERVACIÓN
No se requiere ninguna preparación especial del paciente. Se pueden utilizar muestras de suero o plasma. No se observaron
interferencias debidas al uso de anticoagulantes como citrato, heparina o EDTA. Las muestras se pueden conservar durante 7 días
a 2/8°C. Para conservaciones más largas congelar a –20ºC. La muestra se puede descongelar hasta un máximo de 3 veces. Las
muestras no deben ser almacenadas en congeladores autodescongelantes. La congelación, descongelación de las muestras o la
inactivación al calor durante 30 min. a 56°C no afecta los resultados.
No utilizar muestras muy lipémicas, ictéricas, hemolizadas o contaminadas.
8.
PROCEDIMIENTO DEL TEST
PREPARACIÓN
Preparación del tampón de lavado: 18 ml de agua destilada + 2 ml detampón de lavado 10x por cada tira
EJECUCIÓN DEL TEST
1. Distribución de muestras:
Dispensar 30 µl de las muestras examinadas y sucesivamente 30 µl de control negativo y positivo (en doble prueba) en los
pocillos respectivos.
Añadir a cada pocillo 100 µl de conjugado. Mezclar con cuidado.
2. Incubación:
Incubar la placa cubierta con cinta adhesiva a 37°C durante 40 minutos.
3. Lavado:
Retirar la cinta adhesiva, aspirar el contendo de todos los pocillos y lavar 4 veces rellenando cada pocillo con aproximadamente
de 0,3 ml de solución de lavado. Esperar 30 segundos entre cada lavado.
4. Distribución del sustrato:
Dispensar 100 µl de sustrato en cada pocillo.
5. Incubación del sustrato:
Incubar la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente (entre 18 y 30°C).
6. Bloqueo de la reaccción:
Dispensar 100 µl de solución bloqueante siguiendo la misma orden de adición del punto 4.
7. Lectura:
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ES
19/27
Leer fotométricamente a los 30 minutos a 450 nm ó a 450/620 nm.
9.
PASO 1
PASO 2
PASO 3
ESQUEMA DEL PROCEDIMIENTO DEL TEST
Poner las muestras de suero en los pocillos, y 30 µl de controles negativo y positivo (en doble prueba) y
añadir 100 µl de conjugado a cada pocillo. Mezclar bien.
Incubar 40 min. a 37°C
Lavar 4 veces dispensando 300 µl de tampón de lavado. Esperar 30 segundos entre cada lavado.
Añadir 100 µl de Sustrato a cada pocillo
Incubar 10 min. a 18-30°C (Temperatura ambiente)
Añadir 100 µl de Solución Bloqueante
Leer la absorbancia a 450 nm al cabo de 30 min.
10.
VALIDACIÓN DEL TEST
Titular los controles Negativo y positivo en doble prueba.
La absorbancia del Control negativo debe ser ≤ 0.200
La absorbancia del Control positivo debe ser ≥ 0.600; ≤ 2.000.
11.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Calculación del valor de corte
Valor de corte = (Densidad Optica (D.O.) Control Negativo + Densidad Optica (D.O.) Control Positivo)/3
Si el valor de la absorbancia de la muestra es mayor del valor de corte , la muestra resulta positiva por la presencia de
inmunoglobulinas anti-Treponema pallidum.
12.
LIMITACIONES DEL TEST
El test no es capaz de discriminar entre la presencia de IgG de la presencia de IgM.
El resultado de test tendría que ser evaluado conjuntamente con otros resultados procedentes de la historia del paciente u de otros
procedimientos de diagnóstico.
13.
ESPECIFICIDAD ANALÍTICA
La especificidad de diagnóstico ha sido estudiada probando muestras conteniendo factores potencialmente interferentes como
anticuerpos Anti-nucleares VEB , anticuerpos heterófilos, anticuerpos anti-Borrelia, Factor reumatoide (de 40 a 1080 UI/ml ),
Triglicéridos (<= 870 mg/dl ), Bilirubina (<= 11 mg/dl ), y hemoglobina (<= 10 mg/dl). En ningún caso el resultado del test se vio
alterado por la presencia de estos factores .
14.
SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DIAGNOSTICAS
Se realizó un estudio en 946 muestras procedentes de laboratorio. Las muestras se analizaron a la vez en un método ELISA
comercializado basado en el principio de competitividad. . Se encontraron 28 muestras positivas, 6 de las cuales en desacuerdo
entre los dos métodos. Estas muestras fueron analizadas de nuevo con el método FTA-ABS, tomado como método referencia; 5
sueros se confirmaron como positivos y uno fue negativo. La especificidad de diagnóstico del test en esta prueba es del 99,9%.
La sensibilidad de diagnóstico ha sido analizada estudiando la reacción de 74 muestras conocidas positivas por la presencia de
inmunoglobulinas específicas anti-Treponema pallidum: todas las muestras resultaron marcadamente positivas, dando una
sensibilidad del 100%,
15.
PRECISIÓN
1. Reproducibilidad intra-ensayo
Muestras
Control
Control
Negativo
Positivo
Replicados
24
24
Media D.O.
0,09
1,466
CV %
3,23
10,02
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20/27
2 Ensayos realizados en 5 series diferentes
Muestra
Control
Control
Negativo
Positivo
Media
0,098
1,888
CV%
5,37
10,41
16.
GUÍA DE RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS
PROBLEMA
Serie no valida (todos negativos)
POSSIBLES FUENTES DE
ERROR
Uno o más reactivos no han sido
añadidos o han sido añadidos en
secuencia errónea .
Placa no reactiva
Serie no válida (todos positivos)
Contaminación del sustrato
Lavado inadecuado
Escasa precisión
Aspiración incompleta de los
pocillos
PRUEBA U ACCIONES
Controlar de nuevo el procedimiento
Controlar si hay disoluciones que no se
hayan utilizado.
Controlar el código del envase de la placa
(ver punto 4 de la información técnica para
el código correcto).
Controlar la presencia de humedad en la
placa no utilizada. (El gel de sílice debe ser
amarillo pálido) Repetir el test.
Recoger una nueva alícuota de sustrato.
Asegurarse del buen funcionamento de la
lavadora
lavadora
Aspiración inadecuada de los
pocillos
Error de pipeteado
Adición de los reactivos demasiado
lenta
Desarrollo escaso del color
17.
1
2
3
4
lavadora
Controlar el funcionamiento de la pipeta
Evitar la sequedad de la placa después del
lavado. Añadir los reactivos
inmediatamente.
Presencia de burbujas
Evitar la formación de burbujas mientras se
pipetea
Sistema óptico no limpio
Controlar la fuente de luz y el detector para
la presencia de suciedad . Limpiar el fondo
de la placa con papel suave.
Tiempo o temperatura de incubación Verificar el control de la temperatura y el
incorrectos
tiempo de incubación.
Seguir cuidadosamente las instrucciones.
Volumen inadecuado de substrato
Controlar el funcionamiento de la pipeta.
añadido a la placa
BIBLIOGRAFIA
P.A. Hanff et al. Humoral immune response in human syphilis to polypeptides of Treponema pallidum. J. Immunology
129: 1287 (1982).
L. Lewis et al. Evaluation of immunoglobullin M Western blot analysis in the diagnosis of congenital syphilis. J. Clin.
Microbiol. 28: 296 (1990).
H. Young et al., Enzywell recombinant enzyme immunoassay for the serological diagnosis of syphilis. Int. J. STD and
AIDS. 11: 288-291 (2000).
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INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
ENZYWELL
PAINEL RECOMBINANTE DA SÍFILIS
REF 91100
(2 x 96 testes)
REF 91104
(6 x 96 testes)
(Português)
1.
UTILIZAÇÃO PRETENDIDA
KIT IMUNO-ENZIMÁTICO PARA DETERMINAÇÃO QUALITATIVA DE IMUNOGLOBULINAS DO ANTITREPONEMA PALLIDUM EM SORO HUMANO OU NO PLASMA.
2.
SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO DO TESTE
O diagnóstico serológico da sífilis é efectuado demonstrando a presença de níveis significativos de anticorpos do Treponema
pallidum (TP) numa amostra de soro.
O método de referência usado é a técnica FTA-ABS, mas a sua execução é laboriosa e a interpretação dos resultados não é
simples, métodos alternativos foram por isso introduzidos para simplificar o procedimento.
O teste TPHA é a técnica preferida para fins de exposição, já que detecta Ig específico mesmo com titulagens baixas. Infelizmente,
o resultado do teste é determinado pela interpretação subjectiva, porque o teste não pode ser completamente automatizado. O teste
TPHA não é sensível na fase primária.
O kit presente permite a exposição com o método ELISA de sanduíche. Revela a presença de anticorpos específicos de qualquer
classe, e pode ser completamente automatizado. O antigénio usado é obtido por uma técnica recombinante.
3.
PRINCÍPIO DO TESTE
O teste recombinante da sífilis é baseado no princípio de “sanduíche”, uma técnica de imuno-ensaio por fase sólida de enzima,
para medição de níveis anti-Treponema pallidum no soro ou plasma. Durante a incubação, os anticorpos presentes na amostra são
ligados imunologicamente à fase sólida de antigénio, assim como ao antigénio marcado com peroxidase de rábano (HRP), criando
uma sanduíche antigénio-anticorpo-antigénio-HRP. O conjugado não ligado é eliminado lavando e a actividade enzimática ligada
é determinada juntando um substracto cromogénico. A reacção azul que se desenvolve fica amarela ao adicionar a solução de
paragem. A intensidade da cor é proporcional à quantidade de auto-anticorpos presentes na amostra.
Fase sólida
Ag
Conjugado }Ag -HRP
= Ig humano
4.
REAGENTES E PREPARAÇÃO DO REAGENTE
Ponha à temperatura ambiente antes da utilização.
O kit para 2 x 96 testes (91100) contém os seguintes materiais:
MT PLATE
MICROPLACA 2 x 96 poços cobertos com proteínas recombinantes de antigénios do Treponema pallidum.
Utilização: abra a embalagem no lado oposto do código (SR mais o número do lote), retire o suporte e as barras da embalagem
folheada para serem usadas, e coloque as barras não usadas no saco de polietileno com gel de sílica, retire o ar e vede premindo o
fecho.
CONTROL CONTROLO NEGATIVO 1 x 1 mL
Conteúdo: Soro de vitela recém-nascida com solução de fenol a 0.05% e Bronidox a 0.02%, líquido, pronto a usar sem qualquer
diluição posterior.
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CONTROL +
CONTROLO POSITIVO 1 x 1 mL
Conteúdo: O soro humano diluído numa solução proteica estabilizadora, contendo anticorpos anti-Treponema pallidum.
Conteúdo: Proteínas recombinantes de Treponema pallidum marcadas com Peroxidase, num tampão fosfatado com fenol a 0.05%
e Bronidox a 0.02%.
WASH BUF 10x TAMPÃO DE LAVAGEM 10X (PF93603) 1 x 100 mL INTERMUTÁVEL ENTRE LOTES
Conteúdo: Tampão fosfatado salino, concentrado 10 vezes, contendo Brij 0.5% .
Preparação: diluir o volume requerido 1:10 com água destilada para obtenção do tampão de lavagem pronto a ser usado. Se houver
cristais, devem ser dissolvidos a 37ºC antes da diluição.
SUBS TMB SUBSTRATO (PF93619) 2 x 12 mL Prontos a usarINTERMUTÁVEL ENTRE LOTES
Conteúdo: Tetrametilbenzidina a 0.26 mg/mL e peróxido de hidrogénio a 0.01% estabilizado num tampão de citrato a 0.05 mol/L
(pH 3.8).
H 2 SO 4 0.3 M SOLUÇÃO DE PARAGEM (PF93602) 2 x 16 mL INTERMUTÁVEL ENTRE LOTES
H 2 SO 4 0.3 mol/L, em solução pronta a ser usada.
PELÍCULAS ADESIVAS (2).
SACO DE POLIETILENO (1).
O kit para 6 x 96 testes (91104) contém os seguintes materiais:
MT PLATE
MICROPLACA. 6 x 96 poços cobertos com proteínas recombinantes de antigénios do Treponema pallidum.
Utilização: abra a embalagem no lado oposto do código (SR mais o número do lote), retire o suporte e as barras da embalagem
folheada para serem usadas, e coloque as barras não usadas no saco de polietileno com gel de sílica, retire o ar e vede premindo o
fecho.
CONTROL CONTROLO NEGATIVO 2 x 1 mL
Conteúdo: Soro de vitela recém-nascida com solução de fenol a 0.05% e Bronidox a 0.02%, líquido, pronto a usar sem qualquer
diluição posterior.
CONTROL +
CONTROLO POSITIVO 2 x 1 mL
Conteúdo: O soro humano diluído numa solução proteica estabilizadora, contendo anticorpos anti-Treponema pallidum.
Conteúdo: Proteínas recombinantes de Treponema pallidum marcadas com peroxidase, num tampão fosfatado com fenol a 0.05%
e Bronidox a 0.02%.
WASH BUF 10x TAMPÃO DE LAVAGEM 10X (PF93603) 3 x 100 mL INTERMUTÁVEL ENTRE LOTES
Conteúdo: Tampão fosfatado salino, concentrado 10 vezes, contendo Brij 0.5% .
Preparação: diluir o volume requerido 1:10 com água destilada para obtenção do tampão de lavagem pronto a ser usado. Se houver
cristais, devem ser dissolvidos a 37ºC antes da diluição.
SUBS TMB SUBSTRATO (PF93619) 6 x 12 mL Prontos a usar INTERMUTÁVEL ENTRE LOTES
Conteúdo: Tetrametilbenzidina a 0.26 mg/mL e peróxido de hidrogénio a 0.01% estabilizado num tampão de citrato a 0.05 mol/L
(pH 3.8).
H 2 SO 4 0.3 M SOLUÇÃO DE PARAGEM (PF93602) 1 x 120 mL INTERMUTÁVEL ENTRE LOTES
H 2 SO 4 0.3 mol/L, em solução pronta a ser usada.
PELÍCULAS ADESIVAS (2).
SACO DE POLIETILENO (1).
MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
Incubador a 37°C
- Leitor de microplacas (comprimento de onda 450 ou 450/620 nm e 405 nm, com uma linearidade até DO >= 2000 no mínimo.
- Água destilada ou desionizada.
- Recipientes de vidro normais para laboratório: cilindros, tubos de teste etc.
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- Micropipetas para colheita adequada de solução 10, 100, 1000 µl
- Luvas descartáveis
- Temporizador
- Solução de hipoclorito de sódio (5%)
- Recipientes para colheita de materiais potencialmente infecciosos
- Lenço absorvente.
5.
ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE DE REAGENTES
Os reagentes devem ser mantidos a 2/8°C.
A data de validade está impressa em cada componente e na etiqueta da embalagem
Os reagentes têm uma estabilidade limitada após abertura e/ou preparação
REAGENTE
CONDIÇÕES
MICROPLACA
8 semanas a 2/8°C, em saco de polietileno
CALIBRADORES
Deixe uma semana à 15-30°C, 8 semanas 2/8°C
SORO DE CONTROLO
CONJUGADO
SUBSTRATO
até à data de validade a 2/8°C, 1 semana a 15--30°C no escuro
TAMPÃO DE LAVAGEM
2 semanas a 2/8°C, 5 dias a 15/30°C.
SOLUÇÃO DE PARAGEM
até à data de validade a 2/8°C
6.
PRECAUÇÕES E AVISOS
PARA USO DIAGNÓSTICO IN VITRO. CONSERVAR A 2-8°C.
Cuidado: Este kit contém componentes de origem humana. Nenhum método de teste pode oferecer segurança completa
que os produtos derivados de fontes humanas não transmitam infecções. Todos os materiais de origem humana podem ser
considerados potencialmente infecciosos. Recomenda-se que estes reagentes e variedades de teste sejam manuseados
usando as boas práticas de laboratório estabelecidas. Um controlo positivo foi inactivado mas deve ser manuseado de
forma apropriada.
Eliminação de resíduos: as amostras de soro e os reagentes utilizadas devem ser tratados como resíduos infecciosos e
portanto, eliminados em conformidade com as disposições legais aplicáveis.
Informação de Saúde e Segurança
1.Não utilize a boca na pipetagem. Utilize luvas descartáveis e protecção para os olhos quando manusear amostras e executar o
ensaio. Lave as mãos meticulosamente quando tiver acabado.
2.Os seguintes reagentes contêm baixas concentrações de substâncias nocivas ou irritantes.
a)O tampão para enxaguar contém detergentes
b)O conjugado e os controlos contêm fenol
c)O substracto é ácido
Se algum dos reagentes entrar em contacto com a pele ou olhos, lave a área profusamente com água.
3.Aparelhos não descartáveis devem ser esterilizados após a utilização. O método preferido é a autoclave para 1 hora a 121°C; os
descartáveis devem ser colocados em autoclave ou incinerados.
4.O ácido sulfúrico necessário para a solução de paragem e ácido hidroclórico usado na lavagem de recipientes de vidros são
corrosivos e devem ser manuseados com cuidado apropriado. Se algum dos reagentes entrar em contacto com a pele ou olhos, lave
a área profusamente com água.
5.Ácidos neutralizados e outros líquidos dispensáveis devem ser descontaminados juntando um volume suficiente de hipoclorito
de sódio para obter uma concentração final de pelo menos 1.0%. Uma exposição de 30 minutos a hipoclorito de sódio a 1% pode
ser necessária para assegurar uma descontaminação efectiva.
6.Salpicos de materiais potencialmente infecciosos devem ser removidos imediatamente com lenço de papel absorvente e a área
contaminada esfregada com hipoclorito de sódio a 1.0%, por exemplo, antes de o trabalho continuar. O hipoclorito de sódio não
deve ser usado com salpicos que contenham ácidos, excepto se a área salpicada for primeiro seca. Os materiais usados para limpar
salpicos, incluindo as luvas, devem ser descartados como lixo biológico potencialmente perigoso. Não coloque em autoclave
materiais que contenham hipoclorito de sódio.
Precauções analíticas
1.Aguarde que todos os reagentes atinjam a temperatura ambiente (18-30°C°C) antes da utilização. Reponha imediatamente os
reagentes à temperatura recomendada para armazenamento após utilização. É importante trabalhar à temperatura correcta.
Verifique se o termostato não desce abaixo de 35ºC ou acima de 39ºC.
2.Não utilize reagentes além da data de validade anunciada. Contaminação microbiológica de reagentes deve ser evitada, dado que
poderá reduzir a duração do produto e provocar resultados errados.
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3.Não modifique o procedimento de teste ou substitua reagentes por outros de outros fabricantes ou outros lotes de reagente a
menos que sejam estipulados como intermutáveis. Não reduza nenhum dos tempos recomendados para incubação.
4.Qualquer recipiente de vidro a ser usado com os reagentes deve ser lavado profusamente com ácido hidroclórico 2M e depois
enxaguado com água destilada ou água desionizada de alta qualidade.
5.Não exponha reagentes a luz intensa ou a vapores de hipoclorito durante o armazenamento ou durante os passos de incubação.
6.Não deixe que os poços sequem durante o procedimento de ensaio.
7.Deve-se ter cuidado para não haver contaminação cruzada entre reagentes. É importante que as pipetas sejam dedicadas a uso
exclusivo com os vários reagentes.
8.Deve ser tomado cuidado para evitar tocar ou salpicar a borda do poço com o conjugado. Não “assopre” as microplacas.
9.Os ensaios de imuno-enzimas podem exibir ocasionalmente um "efeito de margem" que deve ser minimizado aumentando a
humidade durante os passos de incubação. As placas devem ser cobertas com as suas tampas e incubadas a 37°C tanto num banho
de água com suporte flutuante ou para rack para suportar as placas se for necessário, ou num incubador. Alternativamente, as
placas podem ser incubadas num analisador aprovado. Veja o manual de instruções apropriado para mais detalhes. Os incubadores
de CO 2 não devem ser utilizados.
10.Assegure-se que a parte inferior da placa está limpa e seca, e que nenhumas bolhas estão presentes na superfície do líquido
antes de a ler.
11.A utilização de amostras altamente hemolizadas, soros incompletamente coagulados, amostras de plasma contendo fibrina ou
amostras com contaminação microbiana pode dar resultados erróneos.
12.O uso do kit com instrumentos automáticos deve ser validado por o usuário.
13.Para cada instrumento utilizado, leia o manual de instruções do fabricante cuidadosamente para obter informação adicional
sobre os seguintes pontos:
- instalação e requisitos particulares
- princípios de operação, instruções, precauções e riscos
- especificações do fabricante e desempenho dos instrumentos
- manutenção e reparação
7.
TIPO DE ESPÉCIMENS E ARMAZENAMENTO
Não é necessária nenhuma preparação especial do paciente. Amostras de soro ou de plasma podem ser usadas. A utilização de
anticoagulantes como o citrato, heparina ou EDTA não interfere com o teste. As amostras podem ser armazenadas durante 7 dias a
2-8°C. Conserve as amostras a -20°C se for necessária uma conservação mais prolongada. As amostras podem ser descongelado
um máximo de três vezes. Evite a utilização de congeladores autodescongeláveis para armazenamento de amostras.
Congelamento/descongelamento das amostras ou activação por 30 min a 56ºC não afecta os resultados.
Amostras fortemente lipémicas, contaminadas ou ictéricas devem ser evitadas.
8.
PROCEDIMENTO DE TESTE
PREPARAÇÃO
Preparação do tampão de lavagem. 18 mL de água distilada + 2 mL Tampão de lavagem 10x por tira.
1. Distribuição das amostras.
Disponha 30 µL de amostras a serem testadas e subsequentemente 30 µl de controlo negativo e positivo (em duplicado), nos
respectivos poços.
Junte 100 µL de conjugado a cada poço Misture cuidadosamente..
2. Incubação:
Incube a placa coberta com folha aderente a 37ºC durante 40 minutos.
3. Enxaguar:
Retire a folha adesiva, aspire o conteúdo dos poços e enxagúe 4 vezes, enchendo cada poço com cerca de 0.3 mL de solução de
lavagem. Espere cerca de 30 segundos por cada enxaguamento.
4. Distribuição das amostras.
Disponha de 100 µL de substrato em cada poço
5. Incubação de substractos.
Incube a placa à temperatura ambiente (18-30ºC) durante 10 minutos.
6. Interrupção da reacção.
Disponha de 100 µL de solução de paragem, na mesma ordem que seguiu no ponto 4.
7. Leitura.
Obtenha as leituras fotométricas dentro de 30 minutos a 450 nm ou a 450/620 nm..
9.
PASSO 1
ESQUEMA DE PROCEDIMENTO DE TESTE
Coloque as amostras de soro e 30 µL dos controlos positivos e negativos (em duplicado) nos poços das tiras.
e junte 100 µL de conjugado Agite bem.
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PASSO 2
PASSO 3
25/27
Incube durante 40 minutos a 37°C
Lave 4 vezes (300 µL) - e espere 30 segundos de cada vez.
Coloque 100 µL de substrato em cada poço
Incube durante 10 min à temperatura ambiente (18-30° C).
Adicione 100 µL de solução de paragem.
Leia a adsorção a 450 nm dentro de 30 min.
10.
VALIDAÇÃO DO TESTE
Teste os controlos positivos e negativos em duplicado.
Os valores individuais de controlo devem ser ≤ 0.200.
Os valores individuais de controlo positivo devem ser ≥ 0.600; ≤ 2.000.
11.
INTERPRETAÇÃO DO TESTE
Cálculo do valor directo.
Valor directo - = (OD Controlo Negativo + DO Controlo Positivo)/3
Se o valor de adsorção da amostra for maior que a de controlo, a amostra é positiva para a presença de imunoglobulinas antiTreponema pallidum.
12.
LIMITAÇÕES
O teste não tem capacidade para determinar a presença de IgG e de IgM.
O resultado do teste deve ser avaliado juntamente com as informações históricas do paciente e/ou outras avaliações diagnósticas.
13.
ESPECIFICIDADE ANALÍTICA
Especificidade de diagnóstico foi estudada testando amostras contendo factores potencialmente interferentes, como anticorpos
Anti-Nuclear EBV, anticorpos heterófilos, anticorpos Borrelia, factor reumatóide (de 40 a 1080 UI/ml), triglicéridos (<= 870
mg/dL), bilirrubina (<= 11 mg/dL), hemoglobina (<=10 mg/dl). Nenhum destes factores provocou interferência no teste.
14.
ESPECIFICIDADE E SENSIBILIDADE DO DIAGNÓSTICO
Foi efectuado um estudo em 946 amostras obtidas por práticas laboratoriais d rotina. Os espécimes foram testados em paralelo
com um kit ELISA comercial baseado no princípio competitivo. Foram encontrados 28 soros positivos, dos quais 6 amostras
estavam em desacordo; estas foram posteriormente investigadas por FTA-Abs, tomado como modelo de referência. Cinco foram
confirmadas como positivas, e uma negativa. A especificidade de diagnóstico do teste neste teste foi de 99.9%.
A sensibilidade de diagnóstico foi investigada estudando a reacção de 74 amostras conhecidas como positivas para a presença de
imunoglobulinas específicas para Treponema pallidum. Todas as amostras revelaram-se fortemente positivas, dando uma
sensibilidade de 100%.
15.
PRECISÃO
1. Capacidade de reprodução intra-ensaio
Amostra
Negativo
Controlo
Controlo
Positivo
Repetições
24
24
Média DO
0.09
1.466
CV %
3.23
10.02
2. Ensaios executados em ´5 séries diferentes
Amostra
Controlo
Controlo
Negativo
Positivo
Média
0.098
1.888
CV%
5.37
10.41
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PT
16.
RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS
PROBLEMA
Passagem inválida (todos
negativos)
Passagem inválida (todos
positivos)
POSSÍVEIS CAUSAS /
SUGESTÕES
Um ou mais reagentes não foram
adicionados ou estão na sequência
incorrecta
Placa não reactiva
Contaminação do substrato
Lavagem inadequada
Pouca precisão
Lavagem incompleta de poços
Aspiração inadequada de poços
Erro de pipetagem
A adição de reagente é muito lenta
Presença de bolhas
A passagem óptica não está limpa
Desenvolvimento inadequado de
cor.
Tempos ou temperatura de
incubação inadequados
Volume inadequado do substracto
adicionado à placa
17.
26/27
TESTE OU ACÇÃO
Verifique o procedimento
Verifique se existem soluções não usadas.
Repita o teste
Verifique o código na embalagem que
contém a placa (ver o código correcto no
ponto 4 do anexo da embalagem).
Verifique a existência de humidade na placa
não utilizada. (O dissecante de gel de sílica
deve estar amarelo pálido). Repita o teste
Obtenha nova aliquota de substracto.
Assegure-se que o aparelho de lavagem
funciona bem
funciona bem
funciona bem
Verifique a função de pipetagem
Evite a secagem da placa após o passo de
lavagem. Adicione os reagentes
imediatamente
Evite bolhas de ar durante a pipetagem.
Verifique se o instrumento luminoso e o
detector têm sujidade. Limpe a parte inferior
da placa com um pano suave.
Verifique o controlo de temperatura e a
monitorização do tempo.
Observe as instruções recomendadas de
utilização.
Verifique a função de pipetagem
BIBLIOGRAFIA
1. S. J. Norris: Polypeptides of Treponema pallidum: progress toward understranding their structural, functional and
2. P.A. Hanff et al. Humoral immune response in human syphilis to polypeptides of Treponema pallidum. J. Immunology
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3. L Lewis et al. Evaluation of immunoglobullin M Western blot analysis in the diagnosis of congenital syphilis. J. Clin.
Microbiol. 28: 296 (1990).
4. H Young et al., Enzywell recombinant enzyme immunoassay for the serological diagnosis of syphilis. Int. J. STD and
AIDS. 11: 288-291 (2000).
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EN
ES
IT
Date of manufacture
Fecha de fabricación
Data di fabbricazione
FR
GR
PT
Date de fabrication
Ημερομηνία Παραγωγής
Data de fabrico
EN
ES
IT
Use By
Fecha de caducidad
Utilizzare entro
FR
GR
PT
Utiliser jusque
Ημερομηνία λήξης
Prazo de validade
EN
ES
IT
Caution,consult accompanying
documents
Atención,ver instrucciones de uso
Attenzione, vedere le istruzioni per l'uso
FR
GR
PT
Attention voir notice d'instructions
Προειδοποίηση, συμβουλευτείτε τα συνοδά
έντυπα
Atenção, consulte a documentação incluída
EN
ES
IT
Manufacturer
Fabricante
Fabbricante
FR
GR
PT
Fabricant
Κατασκευαστής
Fabricante
EN
ES
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Contains sufficient for <n> tests
Contenido suficiente para <n> ensayos
Contenuto sufficiente per "n" saggi
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Contenu suffisant pour "n"tests
Περιεχόμενο επαρκές για «ν» εξετάσεις
Conteúdo suficiente para “n” ensaios
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Temperature limitation
Límite de temperatura
Limiti di temperatura
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Limites de température
Περιορισμοί θερμοκρασίας
Limites de temperatura
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Consult Instructions for Use
Consulte las instrucciones de uso
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Biological risks
Riesgo biológico
Rischio biologico
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Risques biologiques
Βιολογικοί κίνδυνοι
Risco biológico
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Catalogue number
Número de catálogo
Numero di catalogo
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Référence du catalogue
Αριθμός καταλόγου
Referência de catálogo
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In Vitro Diagnostic Medical Device
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
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Dispositif médical de diagnostic in vitro
In Vitro Διαγνωστικό Ιατροτεχνολογικό προϊόν
Dispositivo médico para diagnóstico in vitro
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Batch code
Código de lote
Codice del lotto
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Code du lot
Αριθμός Παρτίδας
Código do lote
Producto sanitario para diagnóstico in vitro
Diesse Diagnostica Senese
Via delle Rose 10
53035 Monteriggioni, Italy
Tel. 0577-587111
Rif. IO - 09/162 – Inf. Tecn. 91100 – Ed. 17.10.2012

2 x 96 tests - Diesse Diagnostica Senese Spa

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