real clean matrix kit

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RBMCM01
REAL CLEAN MATRIX KIT
Ref. RBMCM01 100 Preps.
1. INTRODUCCIÓN
1. INTRODUCTION
Real Clean Matrix Kit provee un método versátil y
efectivo para una rápida y eficiente purificación y
concentración de ADN a partir de soluciones, o
geles de agarosa ya sean de TAE o TBE, aunque se
recomienda el uso de geles de TAE para una óptima
recuperación.
Real Clean Matrix Kit provides a versatile and
effective method for a quick and efficient
purification and concentration of DNA from
solutions, or either TAE or TBE agarose gels,
although the use of TAE gels is recommended for
an optimum recovering.
La purificación se basa en la absorción selectiva de
los ácidos nucleicos en partículas de sílica
especialmente preparadas en presencia de sales
caotrópicas.
The purification is based on the nucleic acids
selective absorption in silica particles specially
prepared in presence of chaotropic agents.
The method uses a Real Silica Matrix and Sodium
iodure that dissolves agarose gels more easily than,
the usually employed, Sodium Perchlorate, and
requires less washing steps.
El método utiliza una Real Sílica Matrix y Ioduro
de Sodio que disuelve los geles de agarosa más
fácilmente que el tradicionalmente empleado
perclorato de sodio y que requiere menos fases de
lavado.
Real Clean Matrix Kit allows a DNA recovering of
0.2 – 0.5 Kb with an efficiency that varies between
60 – 90% depending on the DNA fragment size.
Real Clean Matrix Kit permite una recuperación de
ADN de 0.2- 50 Kb con una eficiencia que varía
entre el 60-90% dependiendo del tamaño.
Sistema de
producción
certificado
bajo norma
ISO
Tamaño del ADN
DNA Size
200 bp
Recuperación
Recovering
60 %
% Agarosa
% Agarose
0.3 %
Tamaño del ADN
DNA Size
5-60 Kb
500 bp
70 %
0.5 %
1-30 Kb
5 Kb
90 %
0.7 %
0.8-12 Kb
23 Kb
75 %
1.0 %
0.5-10 Kb
50 Kb
60 %
1.2 %
0.4- 7 Kb
1.5 %
0.2- 3 Kb
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REAL es una marca registrada por Durviz, s.l.u.
Production
system
certified
under ISO
2. COMPONENTES DEL KIT
KIT COMPONENTS
REAL Sílica Matrix
REAL Silica Matrix
Solución de Solubilización y Unión
Solubilization and Binding Solution
Solución de Lavado
Wash Solution
Equipos y reactivos necesarios no
incluidos en el kit:
Ref.
Ref. RBMCM01
100 preps
Tª
RSM
1.5 ml
RT
CM01
75 ml
4ºC
EP08
20 ml
RT
Equipment and additional reagents required
* 100 % Ethanol
* 1.5 ml microtubes
* Microcentrifuge
* Glacial Acetic Acid
* Water Bath.
* Etanol 100 %.
* Microtubos de 1.5 ml
* Microcentrifuga.
* Ácido Acético Glacial
* Baño de Agua
3. PROTOCOLO GENERAL
GENERAL PROCEDURE
3.1 Consideraciones preliminares
3.1 Preliminary conditions
1.
1.
2.
El protocolo implica los siguientes pasos:
• Solubilización del gel, el Ioduro de Sodio
solubiliza la agarosa y además promueve
la unión del ADN a la Real Sílica Matrix.
• Unión del ADN, la Real sílica Matrix se
añade a la solución o gel solubilizado y se
une al ADN.
• Purificación del ADN, lavado de la Real
sílica Matrix unida al ADN con una
solución de lavado que contiene etanol y
elimina los contaminantes, proteínas, etc.
• Secado, la Real sílica Matrix es secada
para eliminar el etanol residual que puede
inhibir las siguientes manipulaciones
enzimáticas.
• Recuperación del ADN, el ADN es eluido
de la Real sílica Matrix con Tris-Cl pH 8.5
o agua estéril.
Para purificaciones de fragmentos de 200500 pb. Se recomienda añadir 1/200
volúmenes de ácido acético al 10 %. Esto
producirá un descenso en el pH a 6.0-6.5
promoviendo una mayor eficiencia en la unión.
Además se recomienda testar pequeñas
cantidades de muestra de fragmentos de ADN
entre 200-500 pb con este kit antes de purificar
una muestra entera.
2.
2/6
The protocol implies the following steps:
• Gel solubilization, Sodium iodure
solubilizes the agarose and promotes the
DNA binding to the Real Silica Matrix.
• DNA binding, the Real Silica Matrix is
added to the solution or solubilized gel
and binds to DNA.
• DNA purification, wash the Real Silica
Matrix bounded to DNA with a wash
solution which contains ethanol and
removes contaminants, proteins, etc.
• Drying, the Real Silica Matrix is dried to
remove the residual ethanol that can
inhibit following enzymatic manipulations.
• DNA recovering, DNA is eluted from the
Real silica Matrix with Tris-HCl pH 8.5 or
sterile water.
To purify 200- 500 bp fragments. It is
recommended to add 1/200 volumes of 10%
acetic acid. This will produce a decrease in the
pH to 6.0-6.5 stimulating a higher binding
efficiency. REAL recommends to test small
volumes of sample with DNA fragments
between 200-500 bp with this kit, prior to
purify a whole sample.
REAL es una marca registrada por Durviz, s.l.u.
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3.
4.
5.
Coloración de la solución CM01. Cuando se
expone al aire por un largo tiempo se vuelve de
color amarillo. A pesar de ello, el cambio de
color no inhibe la función de esta solución,
siempre y cuando el pH, normalmente entre
6.5-7.0, no exceda de 7.5, lo cual produce un
descenso en la eficiencia de unión. El pH
puede ser ajustado a 6.0-7.0 con 1/ 200
volúmenes de Acido acético 10% respecto el
volumen de Solución de Solubilización y
Unión.
Secado de la Real Sílica Matrix. Con el uso
se puede producir una evaporación de líquido
del vial de la Real sílica Matrix. Para
reconstituirlo añadir agua estéril de forma que
la cantidad de líquido y sólido sea igual.
Geles de TBE. Cuando se desea purificar
ADN a partir de geles de agarosa de TBE, que
tienen un efecto inhibidor en la unión de la
sílica al ADN, se recomienda añadir Acido
acético. Preparar una solución de Acido acético
al 50 % en agua, añadir 5 µl por cada 250 µl de
solución de Solubilización y Unión utilizados.
Puede observarse un cambio en la coloración.
Preparar cada vez esta solución, no conservar.
3.
4.
5.
CM01 Solution staining. When it is exposed to
air for a long time it will turn yellow.
Nevertheless, the change of colour does not
inhibit the solution function, as long as the pH,
usually between 6.5 – 7.0, is not higher than
7.5, as this decreases the binding efficiency.
The pH can be adjust to 6.0 – 7.0 with 1/200
volumes of 10% acetic acid according to the
Solubilization and Binding Solution volume.
Real Silica Matrix drying The liquid from the
vial of the Silica Matrix can be evaporated as it
is used. To reconstitute it add sterile water, so
the liquid quantity is the same as the solid
quantity.
TBE gels. When you want to purify DNA from
TBE agarose gels, which have an inhibition
effect on the DNA binding to the Silica, it is
recommended to add Acetic acid. Prepare a
50% Acetic acid solution in water; add 5 µl per
each 250ul of Solubilization and Binding
solution used. A change of colour can be
observed. Prepare the solution each time you
need it, do not store it.
3.2 Preparaciones preliminares
3.2 Preliminary Preparations
•
•
•
Añadir 80 ml de Etanol 100% a la Solución
de Lavado.
Marcar el envase y mantenerlo bien cerrado
para evitar la evaporación del etanol.
Resuspender bien la Real Sílica Matrix por
agitación con vortex.
•
Add 80 ml of 100% ethanol to the Wash
solution.
Label the container and keep it close to avoid
ethanol evaporation.
Resuspend the Real Silica Matrix by shaking
with vortex.
3.3 Protocolo de trabajo
1.
2.
Medir el volumen / peso del ADN.
1.1. Si el ADN se encuentra en solución medir
el volumen con una pipeta.
1.2. Para purificaciones de geles de agarosa,
cortar la banda e intentar minimizar el
tamaño del fragmento eliminando el
exceso de agarosa. Para la conversión
asumir que 1g de gel equivale a 1 ml. Si
el fragmento pesa menos de 0.4g utilizar
un microtubo de 1.5 ml.
Añadir 3 volúmenes de Solución de
Solubilización y Unión (ref. CM01)
Basándose en el volumen de la solución o peso
del gel más la cantidad de Real sílica Matrix
utilizada.
3.
4.
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2.1. Para fragmentos menores de 500 pb o
fragmentos mayores de 23 Kb añadir 4.5
volúmenes de Solución CM01.
2.2. Para geles de TBE añadir 4. 5 volúmenes
de solución CM01.
Añadir 15 µl de Real sílica Matrix.
Verificar que la Real sílica Matrix ha sido bien
resuspendida mediante agitación con vortex.
Incubar a 55ºC durante 5-10 minutos.
Para permitir la solubización de la agarosa y la
unión de la Real sílica Matrix al ADN. Mezclar
por inversión cada 1-2 minutos. Cuando se
trabaje con volúmenes mayores aumentar el
tiempo de incubación.
REAL es una marca registrada por Durviz, s.l.u.
5.
6.
7.
8.
9.
Centrifugar durante 30 segundos y eliminar
todo el sobrenadante por aspiración o
pipeta.
Lavar el pellet de Real sílica Matrix con 600
µl de Solución de Lavado.
Resuspender el pellet mediante agitación con
vortex o con una pipeta. Centrifugar durante 30
segundos y eliminar el sobrenadante. No
excederse con el vortex.
Para mayores cantidades de Real sílica Matrix
ver la cantidad de solución de lavado a utilizar
en la tabla adjunta al final del protocolo.
Repetir el lavado pero añadiendo la mitad
de solución de lavado que en el punto 6
Centrifugar el microtubo durante unos
segundos. Eliminar las gotas residuales de
etanol con una pipeta si es necesario, puesto
que podrían inhibir las siguientes
manipulaciones enzimáticas.
Secar el pellet a 55ºC durante 4 minutos. De
esta manera se elimina el etanol que ha podido
quedar atrapado en el pellet de Real sílica
Matrix. No prolongar más tiempo el secado ya
que un exceso en el secado produciría una
pobre recuperación en el proceso de elución.
10.
11.
12.
13.
14.
Únicamente en el caso de que se esté utilizando
una cantidad mayor de Real Sílica Matriz, se
puede aumentar el tiempo de secado.
Eluir el ADN con 30 µl de agua estéril o 10
mM Tris-Cl pH 8.5. Resuspender el pellet
por agitación con vortex o pipeta.
Incubar a 55 ºC durante 5-10 minutos.
Mezclar cada 1-2 minutos.
Centrifugar a máxima velocidad durante 90
segundos en una microcentrifuga. Recoger el
sobrenadante (aproximadamente de 27 µl) que
contiene el ADN en un nuevo microtubo.
ATENCION si se observa Real Sílica Matrix
en la muestra eluida, volver a centrifugar y
cuidadosamente pasar el sobrenadante a un
nuevo microtubo, evitando tocar el pellet de
Real Sílica Matrix.
Aunque no se observe Real Sílica Matrix, SE
RECOMIENDA, efectuar esta segunda
centrifugación, ya que la presencia de
partículas de Real Sílica Matrix podría inhibir
las siguientes manipulaciones enzimáticas.
Opcional. Repetir el proceso de elución. Una
segunda elución puede rendir un 10-20%
adicional de recuperación de ADN.
3.3 Working Protocol
1.
2.
3.
4.
5.
Wash the Real silica Matrix pellet with 600 µl
of washing Solution.
Dissolve the pellet by shaking it with a vortex
or with a pipette. Centrifuge for 30 seconds
and remove the supernatant. Do not use the
vortex too much.
For bigger Real Silica Matrix quantities, see
the washing solution quantity you must use on
the table above.
7. Repeat the washing step, but adding half of
the washing solution used in step 6.
8. Centrifuge the microtube for several seconds.
Remove the residual ethanol drops with a
pipette if necessary, as they could inhibit
following enzymatic manipulations.
9. Dry the pellet at 55º C for 4 minutes. This way
the ethanol that could have been retained in
the Real silica Matrix is removed.
10. Elute DNA with 30 µl of sterile water or 10
mM Tris-HCl pH 8.5. Dissolve the pellet
shaking with vortex or pipette.
11. Incubate at 55 ºC for 5-10 minutes. Mix every
1-2 minutes.
12. Centrifuge at maximum speed for 90 seconds
in a microcentrifuge. Collect the supernatant
(27 µl approximately) contained the DNA in a
new microtube. CAUTION if you can see Real
Silica Matrix in the eluted sample, centrifuge
once more and carefully change the
supernatant into a new microtube avoiding
touching the Real Silica Matrix pellet.
Measure the volume / weight of DNA.
1.1. If the DNA is in solution, measure the
volume with the use of a pipette.
1.2. For agarose gels purifications, cut the
band and try to minimize the fragment
size removing the excess of agarose. For
the conversion, assume that g of gel is
equivalent to 1ml. If the fragment weights
less than 0.4g use a 1.5 ml micro tube.
Add 3 volumes of Solubilizaton and Binding
Solution (ref. CM01) According to the solution
volume or weight of gel plus Real Matrix
quantity used.
2.1. For smaller than 500 bp fragments, or
larger than 23 Kb fragments, add 4.5
volumes of CM01 Solution.
2.2. For TBE gels, add 4.5 volumes of CM01
Solution
Add 15 µl of Real silica Matrix.
Verify that the Real silica Matrix has been well
resuspended shaking it well
Incubate at 55ºC for 5-10 minutes.
To allow the agarose solubilization and the
DNA binding to the Real silica Matrix, gently,
mix every 1-2 minutes. If you are working with
bigger volumes increase the incubation time.
Centrifuge for 30 seconds and remove all the
supernatant by aspiration or pipette.
6.
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REAL es una marca registrada por Durviz, s.l.u.
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14. Optional. Repeat the elution process. A second
13. Even though you can not see Real Silica
Matrix, IT IS RECOMMENDED, to do this
second centrifugation, as the presence of Real
Silica Matrix particles could inhibit the
following enzymatic manipulations.
elution can provide an additional 10-20 %
DNA recovering.
3.3.1. Tabla
para el cálculo de la cantidad de Solución de Lavado necesaria
Wash solution needing calculation table
Cantidad de ADN
DNA Quantity
REAL Sílica Matrix
REAL Silica Matrix
Solución de Lavado
Wash Solution
< 7.5 µg
15 µl
600 µl
< 12.5 µg
25 µl
750 µl
< 25 µg
50 µl
900 µl
< 50 µg
100 µl
1500 µl
4. GUIA DE PROBLEMAS Y POSIBLES SOLUCIONES
TROUBLESHOOTING
1.
Baja recuperación de ADN.
1.1. Debido a que el Etanol 100% no fue
añadido a la solución de lavado o su
concentración es inadecuada. Comprobar
que se añade y marcar el envase
convenientemente. Evitar también la
evaporación conservando la Solución de
lavado a 4ºC.
1.2. Debido a que los fragmentos de agarosa
no fueron disueltos completamente con
la Solución de Solubilización y Unión.
Esto puede ocurrir si se añade demasiada
agarosa y no se mezcla cada 1-2 minutos
durante el periodo de incubación a 55ºC.
1.3. Debido al uso de un tampón de elución
inadecuado. Utilizar 10 mM Tris-Cl pH
8.5 o agua estéril. Chequear el pH del
tampón de elución.
1.4. Debido a que en geles de TBE no se
utilizó la solución al 50 % de ácido
acético para optimizar la recuperación.
1.5. Debido a que la Real Clean Matrix no
fue lavada correctamente para eliminar
las sales, sino son eliminadas, el ADN
puede permanecer unido a la Real sílica
Matrix en el paso de elución.
1.
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Low DNA recovering.
1.1. Due to 100% Ethanol was not added to
the washing solution or its concentration
is not the correct one. Be sure it is added
and label the container. Avoid
evaporation, storing the washing solution
at 4ºC.
1.2. Due to agarose fragments were not
completely dissolved with the
Solubilization and Binding Solution. This
may happen if too much agarose is added
and it is not mixed every 1-2 minutes
during the incubation period at 55º C.
1.3. Due to the elution buffer is not the
correct one. Use 10 mM Tris-HCl pH 8.5
or sterile water. Check the elution buffer
pH.
1.4. Due to in TBE gels, the 50% Acetic acid
solution, to optimize the recovering, was
not used.
1.5. Due to the Real Clean Matrix was not
correctly cleaned to remove salts, if they
are not removed, DNA may be kept
bounded to the Real silica Matrix in the
elution step
REAL es una marca registrada por Durviz, s.l.u.
2.
El ADN eluido no es funcional en las
siguientes manipulaciones enzimáticas.
2.1. Debido a que en el paso de lavado y
secado del pellet de Real Sílica Matrix
con la Solución de lavado no se elimina
todo el etanol, la presencia de etanol
residual inhibe las posteriores
manipulaciones enzimáticas.
2.2. Debido a la presencia de Real Sílica
Matrix en el ADN eluido. Se recomienda
una segunda centrifugación y no tocar el
pellet en el momento de recoger el
sobrenadante que contiene el ADN.
2.3. Debido a la presencia residual de
ioduro de sodio o sal. Insuficiente lavado
de la Real sílica Matrix previo a la
elución. Esto puede ocurrir sino se
resuspende bien la Real sílica Matrix en
el proceso de lavado. Se puede realizar un
lavado extra con la solución de lavado o
con etanol 70 %. Además la presencia de
ioduro de sodio residual puede afectar en
las estimaciones espectrofotométricas del
ADN ya que absorbe a 260 nm.
2.
6/6
The eluted DNA is not functional in following
enzymatic manipulations.
2.1. Due to during the washing and drying
step of the Real Silica Matrix pellet with
the washing solution, not all the ethanol
was removed; the presence of residual
ethanol inhibits later enzymatic
manipulations.
2.2. Due to Real silica Matrix presence in the
eluted DNA .It is recommended to do a
second centrifugation, as well as to avoid
touching the pellet when the supernatant
that contains the DNA is collected.
2.3. Due to residual presence of Sodium
iodure or Salt. The Real Silica Matrix
washing step before the elution was not
enough. This may happen if the Real
Silica Matrix is not dissolved in the
correct way during the washing step. An
extra washing step can be done using
washing solution or 70% ethanol.
Moreover, the presence of residual
Sodium Iodure may affect the
spectrophotometric DNA estimations, as
it absorbs at 260nm.
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