anisoles y brettanomyces - Fundacion para la Cultura del Vino

Transcripción

INFORME TÉCNICO
ANISOLES Y BRETTANOMYCES
Causas, efectos y mecanismos de control
www.culturadelvino.org
Indice
ÍNDOLE, ORIGEN Y CONSECUENCIA
DE LA PRESENCIA DE ANISOLES
EN EL MUNDO VINÍCOLA ...................................7
CONTROL DE CALIDAD DE
LOS LOTES DE TAPONES NUEVOS
PARA PREVENIR EL RIESGO
DE CONTAMINACIÓN
POR CLOROANISOLES......................................20
ORIGEN Y BIOSÍNTESIS DE TCA
EN EL CORCHO:
MECANISMOS MOLECULARES
EN EL HONGO
TRICHODERMA LONGIBRACHIATUM..............33
MÉTODO ROSA PARA LA
REDUCCIÓN DE TCA EN EL
TAPÓN DE CORCHO ......................................... 81
LA CONTAMINACIÓN DE LOS
VINOS POR BRETTANOMYCES
DURANTE LA VINIFICACIÓN
Y LA CRIANZA ..................................................87
COMPARATIVA ENTRE DOS
TÉCNICAS DE TOSTADO DE
BARRICAS DE ROBLE FRANCÉS
PARA CHARDONNAY .........................................97
PRETRATAMIENTO DE DATOS
EN ANALISIS SENSORIAL...............................107
ÍNDOLE, ORIGEN Y CONSECUENCIA DE LA PRESENCIA DE ANISOLES EN EL MUNDO VINÍCOLA
Cloroanisoles y Bromoanisoles resultan de la sustitución del núcleo llamado “anisol”, presente en gran
número de moléculas volátiles y odoríferas, por
ambos halógenos. Esta modificación de la estructura
molecular da lugar a una molécula de características
organolépticas de carácter “mohoso” y de gran
potencial contaminante para la industria alimentaria
y en concreto la vinícola.
En este documento encontraremos el origen y las
consecuencias de dichas contaminaciones en el
vino.
Pascal CHATONNET
Laboratoire EXCELL
MERIGNAC
Francia
Índole, origen y consecuencia de
la presencia de anisoles en el
mundo vinícola
Introducción
a estructura química metoxibencil, correspondiente al núcleo llamado "anisol", está presente en un
gran número de moléculas volátiles y a menudo
odoríferas. Estas diversas moléculas están muy
presentes en la naturaleza, y en especial en el
entorno vinícola. La sustitución del núcleo anisol por átomos
de cloro o de bromo para originar haloanisoles da lugar a la
formación de una molécula con propiedades organolépticas
particulares. En un contexto vinícola, estas moléculas se
caracterizan concretamente por olores relativamente desagradables, que evocan el carácter "mohoso". Además, en
su mayoría presentan umbrales relativamente reducidos de
detección olfativa. Estas características confieren a los haloanisoles en su conjunto un potencial contaminante considerado muy serio por el sector. En este trabajo, estudiamos
las principales moléculas de cloroanisoles y de bromoanisoles que se pueden encontrar en el mundo vinícola, indicando, para cada una de ellas, tanto su origen como sus consecuencias en la calidad de los caldos.
L
1- Los cloroanisoles
En los vinos, los olores con carácter "mohoso" son uno de
los defectos organolépticos más desagradables y más severamente juzgados tanto por los catadores expertos como
por los consumidores. Se han identificado diversas moléculas que transmiten ese aroma desagradable a los caldos.
Entre ellas, los cloroanisoles, y en especial el 2,4,6-tricloroanisol (TCA) y el 2,3,4,6-tetracloroanisol (TeCA) constituyen
los compuestos identificables con mayor frecuencia en los
vinos considerados "mohosos" o "con sabor a corcho" en la
cata.
2,4,6-tricloroanisol (TCA) 2,3,4,6-tetracloroanisol (TeCA) pentacloroanisol
Informe Técnico 9
ÍNDOLE, ORIGEN Y CONSECUENCIA DE LA
PRESENCIA DE ANISOLES EN EL MUNDO VINÍCOLA
mica de algunos plaguicidas a base de 2,3,4,6-tetraclorofenol (TeCP) o, más frecuentemente, de pentaclorofenol (PCP)
que contiene TeCP como impureza (entre un 10 y un 15 %
El carácter "con sabor a corcho", que indica una contaminade TeCP en el PCP técnico industrial). La metilación de los
ción procedente del tapón de corcho utilizado tradicionalclorofenoles debida a una actividad O-metilasa, frecuente en
mente para el taponado de las botellas, se aplica equivocanumerosísimos microorganismos y en especial en los
damente con frecuencia, pese a ser cierto que,
mohos existentes en las bodegas, produce el cloroanisol
efectivamente, el corcorrespondiente (figura
cho procedente de la
2). A partir de una molécorteza del alcornocula poco volátil y práctique (Quercus suber)
camente inodora, se
puede transmitir TCA
obtiene un cloroanisol
a los caldos si la
que se transmite fácilcalidad de la materia
mente a la atmósfera y
prima o el proceso
que resulta muy maloliende fabricación de los
te. Estos compuestos
tapones no son
también pueden contamiFigura 2 - Metilación bioquímica del 2,3,4,6-tetraclorofenol en
satisfactorios
nar el caldo sin que éste
2,3,4,6-tetracloroanisol
(Tanner et al., 1981,
haya entrado en contacto
Buser et al., 1982,
con corcho (Dubois et
Tanner et Zannier, 1983). El lavado con cloro, largo tiempo
Rigaud, 1981, Chatonnet et al., 1994). Los mecanismos de
utilizado por los corchotaponeros, era un factor agravante,
degradación de estos precursores y las condiciones de conpero en ningún caso una causa de contaminación del cortaminación a distancia,
cho por el precursor
por vía de la atmósfera,
directo del TCA: el
han sido descritos deta2,4,6-triclorofenol
lladamente (Chatonnet et
(TCP). El abandono
al., 1994). Resulta sumade ese método en la
mente fácil la contaminaactualidad no por
ción del vino durante su
ello ha suprimido la
manipulación al aire, su
contaminación de
conservación en recipienlos tapones, lo cual
tes microporosos (barridemuestra claracas) o por contacto con
mente que el origen
materiales contaminados
de la contaminación
indirectamente (tapones
del corcho es múltide silicona, madera de
ple, y no obedece
las barricas, bentonita,
únicamente a una
colas, tapones de corcontaminación inicial
cho…).
Figura 3 - Formación de 2,4,6-triclorofenol por cloración química a partir de
de la materia prima
El uso inconsiderado de
solución clorada situada en un entorno ácido y al entrar en contacto con
por TCP.
productos de desinfecnúcleos fenilos
Ulteriormente a su
ción a base de sales de
abandono, se ha
hipoclorito también puede causar la contaminación de los
podido identificar otras fuentes de contaminación por cloroamateriales orgánicos (en especial la madera) que están en
nisoles. Y es que el corcho es un material da estructura
contacto con el caldo o del ambiente de la bodega tras la
microporosa rica en lípidos que puede fijar fácilmente los
formación química de TCP (Burtschell et al., 1959) y su
contaminantes presentes en fase gaseosa en la atmósfera
degradación por ciertos hongos filamentosos (Maujean et
de almacenamiento; tapones nuevos indemnes de contamial., 1985, Álvarez-Rodríguez et al., 2002). La utilización del
nación pueden acabar contaminados a niveles molestos si
cloro es indeseable para la limpieza y desinfección de cualhan permanecido almacenados en dependencias contaminaquier material poroso o microporoso, incluido el caucho
das (Chatonnet et al., 1994, Chatonnet et Labadie, 1995).
natural utilizado para la fabricación de canalizaciones flexiEl pentacloroanisol (PCA), poco oloroso (umbral de percepbles o de ciertos tapones para el cierre de las piqueras de
ción > 50 µg/l), y sobre todo el 2,3,4,6-tetracloroanisol
las barricas.
(TeCA), son moléculas procedentes de la degradación bioquí(PCA)
Figura 1 - Principales cloroanisoles considerados contaminantes
de los vinos y responsables de los defectos tipo "mohoso".
10 Anisoles y Brettanomyces
La reacción del cloro con el látex o los sedimentos de polifenoles produce químicamente TCP que se acumula en el
polímero y que posteriormente se puede degradar bioquímicamente generando TCA (figura 3). Por el contrario, las siliconas son insensibles a la acción del cloro. La formación
de tetra y de pentaclorofenol por esa misma reacción sólo
se puede producir con pH inferiores a 6, pero siempre es
limitada debido a la polaridad del medio de reacción
(Noilet, 1996).
El TCA tiene un umbral de detección olfativa relativamente
bajo (300 pg L-1 en el agua, según Curtis, 1972; o 30 pg L1 según Griffiths, 1974). Dependiendo del tipo de caldos,
las alteraciones del olor y sobre todo del aroma retroolfativo son significativas entre 1,5 y 3 ng L-1 (Duerr, 1985).
El análisis de las primeras muestras de vinos contaminados por TeCA en la época en que se empezó a tomar seria-
mente en cuenta el problema en el mundo vinícola se realizó
sobre muestras que presentaban niveles de contaminación
sumamente altos (varios µg/l) y se sobreestimó en buena
medida los umbrales de alteración (CHATONNET et al.,
1994). Se sospechaba entonces que el TeCA contaminaba
los caldos a partir de 150 ng/l. En realidad, aunque en efecto el TeCA es menos oloroso (4 ng L-1 en el agua según
Curtis, 1972) que el TCA, actualmente se detectan alteraciones notables a partir de 10-15 ng L-1 en los vinos tranquilos
y de menos de 5 ng L-1 en los vinos espumosos
(Chatonnet et Labadie, 1995).
En todos los casos de contaminación atmosférica de la
bodega - atmósferas a menudo húmedas y cerradas - la eliminación de la contaminación exige ante todo la identificación exhaustiva y previa de las fuentes contaminantes y su
eliminación. El aumento de la ventilación de las estancias
Tabla 1. Contenidos de halofenoles y haloanisoles en diversos vinos alterados por un carácter "mohoso" en la cata.
Evidencia de la presencia de TBA
MUESTRAS DE CALDOS
( NG L-1 )
TCA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
trazas
2,9
nd
nd
2,6
trazas
trazas
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
TCP
TeCA
TeCP
PCA
11,5
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
trazas
nd
nd
trazas
trazas
nd
nd
nd
nd
nd
6,5
nd
7,6
nd
8,5
nd
7,1
nd
5,4
nd
trazas
nd
trazas
nd
trazas
nd
12,3
nd
17,1
nd
21,5
nd
72,0
nd
14,3
nd
trazas
nd
nd
nd
trazas
nd
11,7
nd
64,6
nd
3,2
nd
trazas
nd
nd
nd
nd
nd
22,4
13,2
71,0
7,5
6,9
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
23,9
nd
nd
nd
27,0
nd
nd
nd
nd
59,2
nd
trazas
nd
trazas
nd
trazas
trazas
trazas
trazas
trazas
trazas
nd
trazas
nd
trazas
nd
trazas
nd
trazas
trazas
trazas
nd
nd
nd
nd
nd
nd
11,0
122,9
trazas
nd
PCP
TBA
TBP
16,8 12,9 68,5
113,5 34,4 17,8
19,5
2,1 trazas
33,7
3,9
8,3
8,3
12,1
5,4
675,4 2,2 252,8
147,6 12,0 67,0
48,0
0,0
68,3
nd
2,5
11,1
nd
trazas 7,2
40,2 12,3 37,1
28,5 26,7 31,3
nd
13,1 13,4
nd
9,1
14,6
trazas 26,1 32,4
trazas 17,9 36,1
nd
3,8
7,5
8,3
nd
3,6
29,8
3,5
37,4
45,2
6,3
18,8
10,7
nd
trazas
12,9 13,7 43,5
nd
16,8 104,1
87,7 12,8 78,2
nd
37,9 108,1
23,7 28,3 100,8
nd
4,0
9,6
38,0
4,0
30,1
81,2
6,5 392,6
nd
6,3
44,9
TeBP
PBP
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd: nd < DL trazas: > DL, < QL
Informe Técnico 11
ÍNDOLE, ORIGEN Y CONSECUENCIA DE LA PRESENCIA
DE ANISOLES EN EL MUNDO VINÍCOLA
siempre es deseable, pero no necesariamente suficiente.
Todo depende del caudal de contaminantes emitida por la o
las fuentes. La climatización de los locales a menudo agrava la contaminación del aire al reducir la renovación de la
atmósfera; la introducción de aire fresco es pues una necesidad imperiosa en las estancias destinadas al almacenamiento de vinos a granel.
2- Los bromoanisoles
Se ha recurrido mucho a los cloroanisoles para explicar la
presencia de defectos de carácter "mohoso" en los vinos.
Ahora bien, existen algunos caldos que presentan exactamente el mismo tipo de defecto organoléptico en la cata
pero que no contienen cantidades suficientes de cloroanisoles para explicar la presencia de un carácter "mohoso".
Soleas et al. (2002) señalan que en el control de un gran
número de muestras de vinos, sólo una fracción menor
(27 %) contenía una cantidad significativa de TCA (> 2 ng
L-1). No obstante, estos autores no han procedido a la
dosificación de los TeCA; por lo tanto no permiten una certeza concluyente sobre la intervención de otros cloroanisoles.
La investigación y la dosificación exhaustiva de los diversos cloroanisoles en un número suficientemente importante de vinos comparativamente sospechosos tras su cata
en nuestro laboratorio nos ha permitido identificar claramente situaciones que conducen a una frecuencia de alteración elevada sin que se pueda detectar o cuantificar TCA
o TeCA a un nivel suficientemente alto para poder comunicar un defecto.
Por primera vez, hemos evidenciado la presencia de 2,4,6-
caldos que presentan un carácter "mohoso" en la cata.
La tabla I presenta el resultado de la dosificación de diversos cloroanisoles y clorofenoles, considerados contaminantes clásicos de los vinos que presentan un defecto de
carácter "mohoso", así como del TBP y del TBA. Con
excepción de algunas muestras que contienen un contenido reducido de TCA, los vinos seleccionados en este trabajo son en su mayoría pobres (cantidades dosificadas inferiores al umbral de alteración) o incluso carentes de
cloroanisoles (< límite de cuantificación). Se observa que
la intensidad relativa del defecto "mohoso", medida sobre
una escala arbitraria de intensidad de 0 a 5, presenta
una correlación significativa (p< 0.05) con el contenido de
TBA del vino y no con los demás cloroanisoles estudiados
(figura 5). En los casos de fuerte contaminación por TBA
(> 20 ng L-1), además de un intenso carácter "mohoso",
los vinos presentan un carácter "fenólico" y "yodado"
más o menos intenso. Este defecto se percibe fundamentalmente en la cata del vino, en retro-olfato, y persiste
largo tiempo en boca. El olor evoca el del TBP, pero la
intensidad del defecto no está vinculada de forma evidente con las concentraciones dosificables en los caldos.
Además, el contenido de TBA de los vinos tampoco está
correlacionado significativamente con el TBP dosificable
Figura 4 - estructura molecular del 2,4,6-tribromoanisol (TBA)
tribromoanisol (TBA) (figura 4) en caldos significativamente
"mohosos" pero que no contenían cantidades suficientes
de cloroanisoles para comunicar un defecto. Esta nueva
forma de contaminación se ha podido demostrar en vinos
con o sin contacto directo con materiales susceptibles de
haberlos contaminado por contacto directo (Chatonnet et
al., 2004). Se ha especificado el umbral de percepción y
las condiciones de contaminación de los vinos en el transcurso de su elaboración, almacenamiento o crianza.
2.1- Identificación y aislamiento del 2,4,6-tribromoanisol en
Figura 5 - Relación entre la intensidad relativa del defecto "mohoso, con sabor a corcho" en vinos que no contienen o contienen
pocos cloroanisoles pero sí 2,',6-tribromoanisol
en esos mismos caldos, lo cual hace pensar que la transformación del TBP no se lleva a cabo en el vino, sino que
procede de una contaminación externa. A diferencia del
pentabromofenol, del tetrabromobisfenol A (TBBPA) y de
los éteres difenilpolibromados (polibrominated diphenyl
ethers, PBDEs), moléculas utilizadas masivamente como
ignífugos (Brominated Flame Retardants, BFR) que podrían ser perturbadores endocrinos (Ilonka et al., 2000), el
TBA y el TBP no parecen tener una toxicología severa en
las concentraciones medidas.
El TBA se ha identificado como un contaminante presente en trazas en la fauna marina y en cier tos sedimentos marinos (Miyazaki et al., 1981; Watanabe et
al., 1983) y en la atmósfera (Wittlinger and
Ballschmiter, 1990). El TBA deriva de su precursor
directo, el TBP, tras su O-metilación por microorganismos bacterianos (Allard et al., 1987). El TBP está presente en estado natural en numerosos organismos
marinos (Whitfield et al, 1992a, Whitfield et al., 1992
b, Whitfield et al., 1988, Boyle et al., 1992, Whitfield
et al., 1995) y concretamente en cier tas algas que
pueden sintetizar de novo el TBP a par tir de los bro-
muros de contenidos en el agua de mar, mediante un
equipo enzimático específico (Flodin and Whitfield,
1999).
El TBA es conocido por causar potentes defectos de
carácter "mohoso" y "terroso" en la fruta embalada en
cajas contaminadas por TBP degradado en TBA por
Paecelomyces variotii (Whitfield et al., 1997), un
hongo filamentoso también conocido por su capacidad
de transformar el TCP en TCA por O-metilación (Tindale
et al., 1989). Wylie (1997) también señala la presencia de TBP y de TBA en peras, aun cuando no se utilicen dichos productos en las huer tas. Hof fman et
Sponholz (1997) también han señalado la contaminación indirecta de productos farmacéuticos a través de
obturadores de polietileno contaminados por contacto
de la madera de los palets impregnados de TBP. Por
último, se sabe que el TBA en estado de trazas causa
este mismo tipo de defecto organoléptico en las redes
de abastecimiento de agua (Lahoussine, 2000,
Malleret and Bruchet, 2001, Malleret and Bruchet
2002).
Los umbrales de percepción del TBA contenidos en el
Figura 6 - Estimación del umbral de percepción y del umbral de recuperación del TBA
agua son sumamente bajos. Saxby et al (1982) han
medido un umbral de 8 pg L-1; Whitfield et al. (1997)
20 pg L-1; Malleret y Bruchet (2002) un umbral de 30
pg L-1. Estos umbrales convier ten al TBA en uno de
los contaminantes más potentes de todos los identificados; su potencial de perjuicio es parecido al del
TCA, cuyo umbral de percepción en el agua también
es próximo a 30 pg L-1 (Grif fiths, 1974). En el caso
del vino, solución hidroalcohólica ácida (pH 3,5 a 4,0)
que contiene entre un 10 y un 15 % vol. de etanol, los
umbrales que hemos estimado en un 50 % de los
catadores (entrenados pero no exper tos) en un medio
modelo (Pt) o en un vino estándar (Rt) arrojan valores
claramente más altos. El umbral de percepción Pt a: 50
% se estima en 3.4 ng L-1 y el umbral de recuperación
Rt a: 50 % en 7.9 ng L-1 (figura 6). Estos resultados
son compatibles con las catas de los vinos sospechosos estudiados en este trabajo (tabla I), pero es posible que el TBA altere la calidad y la tipicidad de los caldos por debajo de su umbral de detección o de
identificación (umbral de recuperación).
El TBP se puede formar químicamente en las aguas tratadas con cloro en presencia de iones bromuro y de trazas de fenoles orgánicos. El cloro puede oxidar los
Informe Técnico 13
iones bromuros, liberando bromo que se puede combinar rápidamente con muchos contaminantes orgánicos
y producir, además de clorofenoles, bromofenoles y bromoclorofenoles (Patnaik et al., 2002). En presencia de
hipoclorito de sodio y de radiaciones UV, los bromuros
presentes en las salmueras pueden formar 2-bromo-2metilfenol capaz de comunicar un potente olor "fenóli-
co" o "químico" identificable en algunos quesos Gouda
(Mills et al., 1997). En el presente estudio no se ha
investigado ese compuesto, pero tal vez pueda explicar
el carácter "yodado" y de "fenol" obser vado en algunos
caldos además del carácter "mohoso".
2.2- Origen de la contaminación de los vinos por TBA
El análisis de las diversas muestras de vinos tintos
Tabla 2. Análisis de diversas atmósferas de bodega por atrapado estático en kits EXCELL
ATMÓSFERA
( NG G-1 ABSORBENTE)
TCA
TCP
TeCA
TeCP
PCA
PCP
TBA
TBP
TeBP
PBP
1
2
3
4
5
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
54
64
2
nd
nd
5
2
15
nd
nd
210
393
179
28
26
30
10
26
72
52
0
0
nd
1
48
1
2
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd: nd < DL trazas: > DL, < QL
cuyas condiciones de vinificación y de almacenamiento
en diversas bodegas ha permitido evidenciar varios
modos de contaminación de los caldos. Al igual que los
cloroanisoles derivados del PCP y del TeCP capaces de
contaminar indirectamente los vinos a distancia a través de la atmósfera (Chatonnet et al., 1994, Chatonnet
et al., 1995), se ha detectado TBA procedente a todas
luces de la degradación microbiológica de TBP en la
atmósfera de diversas bodegas. Los ambientes contaminados por derivados del PCP y del TeCP no contienen
derivados del TBP y viceversa; nunca se ha identificado
TeBP ni PBP en los casos estudiados (tabla III).
Las características físico-químicas de estos contaminantes (tabla III) explican que, pese a sus puntos de ebullición elevados, los halofenoles y haloanisoles considerados se puedan encontrar tan fácilmente en las
atmósferas de estancias que contienen fuentes de emisión de dichas moléculas. Todos los contaminantes en
cuestión tienen una hidrofobia similar (log P). La escasa
presión de vapor saturado de TeCA explica la facilidad de
Tabla 3. Características físico-químicas de los halofenoles y haloanisoles (Fuente: PhysProp Database Syrres Inc. (2003))
MOLÉCULA
[ NºCASR]
PUNTO DE
PUNTO DE
Presión
EBULLICIÓN
FUSIÓN
de vapor
°C
°C
760 MM Hg 760 MM Hg 10-3.mm Hg
TCA [87-40-1]
241
61
0,228
TCP [88-06-2]
246
69
2,500
LOG P
OCTANOL/
AGUA
SOLUBILIDAD
CTE
EN AGUA
DE HENRY
MG L-1
10,0
130,000
4,11
800,0
2,600
1,0
20,200
TBA [607-99-8]
298
88
0,644
3,69
TBP [118-79-6]
286
95
0,303
4,74
70,0
0,035
1,4
96,100
TeCA [938-86-3]
-
84
3,190
4,18
TeCP [58-90-2]
232
70
0,666
4,65
23,0
8,840
4,09
0,4
1930,000
14,0
0,025
PCA [1825-21-4]
-
108
0,592
PCP [87-86-5]
309
174
0,110
En la bodega A (tabla IV), tanto los vinos conservados en
depósito de acero inoxidable, libre de cualquier traza de
contaminación, como los conservados en barricas que han
acumulado contaminantes pueden presentar altos niveles
5,29
de contaminación. En este caso, el TBP poco volátil emitido
por una fuente contaminante primaria se degrada microbiológicamente en TBA, más volátil y maloliente, que pasa fácilmente al aire. El vino manipulado en ese ambiente puede
disolver los contaminantes presentes en la fase gaseosa, o
contaminarse indirectamente por contacto con los materiales porosos fácilmente contaminados con los que está en
contacto directo (madera de las barricas).
En la bodega B (tabla V), la fuente que originaba contaminación fue suprimida varios años antes, pues en esa bodega
sólo quedan barricas que no estaban contaminadas a su llegada. Aún así, todavía se puede detectar la presencia de
cantidades notables de TBA en la atmósfera. Los contaminantes residuales, adsorbidos por la estructura microporosa
de la bodega recubierta de ladrillo de tierra, que representa
una considerable superficie desarrollada de intercambio, se
volatilizan poco a poco en el aire.
En la bodega C (tabla VI), los vinos criados en barricas
sufren una fuerte contaminación por TBA y TBP. La concentración de contaminantes en el vino aumenta regularmente
con la edad de las barricas, es decir con el tiempo que
pasan en esta bodega; el grado de contaminación de la
madera de las barricas aumenta en el mismo sentido. Pero
la contaminación de los vinos también debe proceder de los
tapones de silicona utilizadas para obturar las piqueras,
pues éstos se encuentran en contacto directo con el vino.
Igual que ocurre con los cloroanisoles, los materiales plásticos en general y las resinas elastómeras de silicona en particular pueden adsorber fácilmente el TBA, y en menor medida el TBP, igual de hidrófobo pero menos volátil (menor
presión de vapor saturado y constante de Henry mucho más
alta). El material a base de polietileno o de poliéster, las juntas de caucho vulcanizado y los tapones de silicona de las
barricas pueden fijar fácilmente los contaminantes del aire y
cederlos después a los caldos. El análisis de diversos materiales en contacto con la atmósfera de esta bodega permite
demostrar que los elementos estructurales de madera se
han impregnado masivamente de TBP que se degrada progresivamente en TBA debido a la acción de la microflora
ambiente. Además, algunas pinturas contienen TBP en su
formulación.
Más difícil de explicar resulta el análisis de los vinos en
botellas taponadas y contaminadas por TBA y, en ciertos
casos, por TCA (tabla VII). Y es que en esta fase del proceso, ya no se sabe si la alteración del caldo se ha producido
de resultas de la contaminación de los tapones almacenados en una atmósfera contaminada antes de su la utilización (en las depedencias del corchotaponero o del usuario),
o si, como en el caso descrito para los TCA, la contaminación se debe a un tapón contaminado por TBA formado en
situ en el corcho. Es obvio que evidencia de la presencia de
importantes cantidades de contaminantes en tapones de
polietileno extrusionado (PET) almacenados en un ambiente
viciado demuestra que es posible una contaminación aerológica de los obturadores a gran distancia, a través de la
atmósfera y de los embalajes, igual que en el caso de los
tapones de silicona estudiados más arriba. Este resultado
se debe considerar asimismo a la luz de las observaciones
de Whitfield et al. (1997) sobre el TBA y el TCA en láminas
de envasado de PET, y de Hoffman and Sponholz (1997) en
tapones PET roscados almacenados sobre palets de madera tratados con TBP. Ahora bien, no sabemos en qué propor-
Tabla 4. Concentración de halofenoles y haloanisoles en las atmósferas y en diversos materiales de la bodega (A)
MATERIALES
Atmósfera de bodega
(en ng g-1 adsorbente)
Bodega de cubas
Bodega de barricas
Caldos guardados en la bodega
(en ng L-1)
Guardados en cubas de acero inoxidable
Guardados en barricas de 12 meses de
antigüedad
Fuentes de contaminación potenciales (ha)
(en ng g-1)
Barricas de roble de 12 meses de antigüedad
Estructura de madera nueva de la bodega de
cubas
Estructura de madera antigua de la bodega de
cubas
(ha) parte externa del material, con espesor de 0-3 mm
TCA
TCP TeCA TeCP PCA
PCP TBA TBP TeBP PBP
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
3
trazas
nd
8
7
nd
nd
nd
trazas
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
33
nd: < DL
nd
nd
nd
nd
trazas 675
trazas 148
46
162
13
4
nd
nd
nd
nd
2
12
253
67
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
835
nd
nd
trazas 143 902
224 1158
6
trazas: > DL, < QL
Informe Técnico 15
Tabla 5. Concentración de halofenoles y haloanisoles en las atmósferas y en diversos materiales de la bodega (B)
TCA
MATERIALES
Bodega subterránea 1
Bodega subterránea 2
(en ng L-1)
Guardados en bodegas de barricas nuevas
1+2
TCP TeCA TeCP PCA
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
15
trazas 122
nd
5
nd
8
nd
trazas 13
trazas
15
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
78
Fuentes de contaminación residual (ha)
(en ng g-1)
Bodegas de suelo de tierra 1+2
Bodegas con paredes de hormigón 1+2
Bodega con paredes de ladrillo 1
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd: < DL
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
trazas trand
zas
nd
2
nd
trazas
trazas: > DL, < QL
Tabla 6. Concentración en halofenoles y haloanisoles en las atmósferas y en diversos materiales de la bodega (C)
MATERIALES
TCA
(en ng L-1)
Guardados en barricas nuevas
antigüedad
antigüedad
Fuentes de contaminación residual (ha)
(en ng g-1)
Barricas de roble nuevas (9 meses en la bodega)
Soportes de barricas
Tapones de silicona
Estructura de madera de la bodega:
Parte superficial (0-3 mm)
Parte interior (3-15 mm)
Barniz
nd
nd
nd
TCP TeCA TeCP PCA
trazas
nd
4
nd
PCP
TBA
TBP TeBP PBP
nd
trazas
nd
nd
190
38
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
13
38
78
108
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
28
101
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
22
143
224
1973
2185
1337
240
902
1158
2943
13127
57
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
trazas
trazas
6
trazas
trazas
nd
234 82363
201 963
tra39
zas 4933
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
12
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
trazas
trazas
nd
nd
nd
nd: < DL
trazas: > DL, < QL
MATERIALES
(en ng g-1 absorbente)
TCA
TCP TeCA TeCP PCA
nd
nd
tra- trazas trazas
5
14
2
nd
nd
zas
Tapón de corcho nacional nuevo
(ng por tapón)
Tapón sintético de PET nuevo
(ng por tapón)
16
13
nd
nd
3
nd
15
24
9
33
nd
nd
106
107
872
39
294
nd
nd
nd
nd
2
5
17
48
13
68
275 117
nd
nd
nd
nd
51
Vino embotellado contaminado:
Vino (ng L-1)
Tapón usado (ha) (ng por tapón)
nd
27
12
8
(ha) una vez retirado 1/3 de la parte externa del tapón para evitar el riesgo de contaminación a través de la atmósfera
nd: < DL
trazas: > DL, < QL
ciones pueden migrar al vino los contaminantes adsorbidos
por el PET.
2.3- Origen del TBP en los ambientes vinícolas
Los casos de contaminación de caldos por TBA y TBP
evidenciados en este trabajo proceden a todas luces de
elementos de madera o a base de madera impregnados
o tratados super ficialmente con TBP, de forma similar a
lo descrito sobre el PCP en contacto directo (Wurdig,
1975) o indirecto (Dubois and Rigaud, 1981, Chatonnet
et al., 1994). En los vinos y materiales estudiados no
se ha detectado PBP y TeBP, precursores potenciales
del TBP, o, en todo caso, sólo en estado de trazas no
cuantificables. El TBP y diversos derivados bromofenólicos se utilizan ampliamente como tratamiento fungicida
de la madera en Latinoamérica, como alternativa al PCP
(Towa Mokuzai, 1982; Pulido and Ayzaguer, 1991) y
antiincendios (pirorretardante), pero también en numerosos materiales plásticos (Takashi and Sato, 1992;
Nishibori and Kondo, 1993; Hoffman and Sponholz,
1997).
A diferencia del PCP, cuyo uso está regulado en buena
medida en todo el mundo o incluso prohibido, como es
el caso concretamente en Europa (CEE, 1991), el TBP
no está sujeto a restricción alguna. Además, el uso
muy extendido de derivados del TBP como agentes ignífugos en numerosos materiales hace temer un riesgo
muy generalizado de contaminación ambiental. La creciente utilización de materiales reciclados, tanto a base
de madera como de polímeros plásticos que pueden
estar más o menos impregnados de TBP o sus derivados, podría constituir una fuente de contaminación
latente susceptible de contaminar los productos alimentarios sensibles, pero también las aguas subterráneas
en caso de almacenamientos inconsiderados. La extensión de la presencia del TBP y de sus derivados mere-
cería pues investigaciones más amplias.
Conclusiones
Prácticamente ha desaparecido la utilización del cloro
para el lavado de tapones, sin que haya disminuido por
ello la frecuencia de contaminación de los caldos debida al TCA apor tado por cier tos tapones de corcho. El
corcho y el proceso de fabricación tradicional de tapones resultan fácilmente infestados por microorganismos
capaces, en ocasiones, de sintetizar grandes cantidades de TCA. Por lo tanto, el control de la calidad de los
lotes de tapones sigue siendo necesario. Otros materiales, como la madera de roble de las barricas nuevas,
presentan en ocasiones una contaminación aleatoria
por TCA. El origen de esta contaminación, poco frecuente, aún no se conoce bien; también por ello resulta
imperativo el control de la ausencia de anisoles.
La contaminación por productos de degradación de plaguicidas organoclorados a base de PCP utilizados en el
interior de las bodegas, concretamente para el tratamiento de la madera o de los productos a base de
madera, tiende a disminuir, pero se sigue produciendo.
Nuestros trabajos han evidenciado claramente la posibilidad de contaminación de los caldos a distancia, a través de la atmósfera. La atmósfera contaminada también puede contaminar los productos que están en
contacto directo con el vino, y por último los propios
caldos. Aunque la utilización del PCP ya está prohibida
en Europa, siguen subsistiendo numerosas fuentes de
contaminación antiguas, impregnadas o contaminadas
indirectamente por TeCA y accesoriamente por TCA.
Para reducir el riesgo de contaminación accidental, conviene cerciorarse siempre de la ausencia de dichos productos en el entorno de las bodegas, y más especialmente en los materiales que entran en contacto directo
Informe Técnico 17
ÍNDOLE, ORIGEN Y CONSECUENCIA DE LA
PRESENCIA DE ANISOLES EN EL MUNDO VINÍCOLA
con el vino. La selección de los materiales y revestimientos utilizados para la construcción o la reforma de
las naves vinícolas sigue siendo muy útil para garantizar una buena fabricación y unas buenas condiciones
de transpor te y almacenamiento.
La reciente identificación de TBA en bodegas indemnes
de clorofenoles impone el mantenimiento de una presión de control suficiente. La utilización del TBP como
sucedáneo del PCP procede contaminaciones idénticas
a las obser vadas con PCA y TeCA. La utilización de este
tipo de derivados órganobromados en numerosos productos complica la identificación y la rápida erradicación de las fuentes de contaminación.
Los anisoles constituyen una fuente de contaminación de
los caldos relativamente extendida. La multiplicidad de
moléculas implicadas, las reducidas cantidades de contaminantes suficientes para crear un defecto organoléptico
y la gran variedad de circunstancias que permiten la contaminación invitan a una vigilancia especialmente rigurosa
de todos los materiales y condiciones susceptibles de
representar un riesgo de contaminación molesta de los
vinos.
CEE Journal Officiel des Communautés Européennes.
Directive du conseil du 21 mars 1991. 91/173/CEE. 1991,
JO N° L 85/34 du 5/04/1991,
Chatonnet P. ; Labadie D. Contamination des locaux vinicoles
et altération des vins - contrôle de la qualité de l'atmosphère
des chais. Revue des Œnologues. 1995, 74, 19-21.
Chatonnet P., Guimberteau G., Dubourdieu D. ; Boidron J.N.
Nature et Origine des odeurs de "moisi" dans les caves.
Influence sur la contamination des vins. J. int. Sc. Vigne et
Vin. 1994, 28, 2, 131-151.
Chatonnet P.; Boutou S. ; Labadie M.D. Identification and responsability of 2,4,6-tribromoansiolein "musty/corked" odors
in wines. To be published J. Agricultural and Food Science,
2004.
Curtis R.F., Land D.G., Griffiths N.M., Gee M., Robinson D.;
Peel J.L, Chloroanisoles as a cause of musty taint in chicken
and their microbiological formation from chlorophénols. J. Sci.
Food Agric. 1974, 25, 811-828.
Dubois P. and Rihaud J. A propos des goûts de bouchons.
Vigne et vins. 1981, 301, 48-49.
Referencias bibliográficas
Allard A.S. ; Remberger M. ; Neilson A.H., Bacterial O-methylation of halogen-substitued phenols. Apll. Environ. Microbiol.
1987, 53, 839-845.
Avarez-Rodriguez M.L. ; Lopez-Ocana L. ; Lopez-Coronado J.M.
; Rodriguez E. ; Martinez M.J. ; Carriba G. and Coque J.J.
Cork taint of wine : Role of the filamentous fungi isolated
from cork in the synthesis of 2,4,6-trichloroanisole by Omethylation of 2,4,6-trichlorphenol. Appl. Environ. Microbiol.
2002, 68, 12, 5860-5869.
Boidron J.N. ; Chatonnet P. ; Pons M. Influence du bois sur
certaines substances odorantes des vins ; Conn. Vigne et
Vin, 1988, 22, 275-294.
Boyle J.L., Lindsay R.C., SuiberR D.A. Bromophenol distribution in salmon and selected seafoods of fresh and saltwater
origin,. J. Food Sci. 1992, 57, 918-922 ;
Burtschell R.H. ; Rosen A.A ; Middleton F.M.; Ettinger M.B.
Chlorine derivatives of phenol causing taste and odour. J. Am.
Water Ass. 1959, 205-214.
Buser H.R., Zanier C., Tanner H. Identification of 2,4,6-trichoranisole as a potent compound causing cork taint. J. Agric.
Food Chem. 1982, 30, 2, 359-362.
Duerr P. Wine quality evaluation. In Proceedings of the international symposium on cool climate viticulture and enology.
1985, Heatherbell A., Lombard P.D., Bodyfelt
F.W. and Price S.F (ed.), 257-266, Carvallis, Oregon State
University.
Flodin S., Whitfield K.J. Biosynthesis of bromophenols in
marine algae,. Water Sci. Technol. 1999, 40, 6, 53-58 ;
Griffiths N.M. Sensory properties of chloroanisoles, Chem.
Sens. Flavor. 1974 , 1, 187-195.
Hoffmann A., Sponholz W. 1997, American Laboratory, 2223.
Ilonka A., Meerts T.M., Van Zanden J.J., Luijks E.A.C., Van
Leuwen-Bol I., Mersh E., Jakobson E., Bergman A., Brouwer
A. Potent competitive interactions of some brominated flame
retardants and related compounds with human transthyretin
in vitro. Toxicol. Sci. 2000, 56, 95-104 ;
Knuuyinenj., Palm H., ,Hakala H., Haimi J. Huhta, Slamiene V.
Polychlorinated phenols and their metabolites in soil and
earthworms of sawmill environment. Chemosphere, 1990.
20, 609-623;
Lahoussine V. Génération de goûts de moisi en réseaux de
distribution d'eau potable. In "Résume d'étude Alimentation
en eau potable". 2000, N°01 AEP7, Agence de l'eau SeineNormandie, France ;
Malleret L., Bruchet A. Application of large volume injection
GC/MS to the picogram analysis of chlorinated and brominated anisoles in "earthy-musty" off-favor water samples. Water
Sci. Technol. 2001, 1, 4, 1-8;
Malleret L., Bruchet A. A taste and odour episode caused by
2,4,6-tribromoanisole. e-Journal of the American Water Work
Association,. 2002, 94, 7;
Maujean A.; Millery H.; Lemaresquier P. Explications biochimiques de la confusion entre goût de bouchon et goût de
moisi. Rev. Fr. Oenol. 1985, 99, 55-62.
Mills O.E., Gregory S.P., Visser F.R., Broome A.J. Chemical
taint in Rindless Gouda cheese. J. Agric. Food Chem. 1997,
45, 487-492 ;
Miyazaki T., Kaneko S., Horii S., Yamagishi T. Identification of
polyhagenated ansiols and phenols in oysters collected from
Tokyo bay. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1981, 26, 577584.
Nishibori S., Kondo H. Halogen-containing aromatic diester
flame retardants for organic polymers. Japan Patent JP 05,
295. 1993, 163;
Noilet O. Etude de l'évolution de la teneur du liège en contaminants organo-chlorés au cours de la fabrication des bouchons - Modélisation au laboratoire -Transposition à l'industrie. Mémoire pour le diplôme universitaire d'étude Technique
pour l'Industrie. Université de bordeaux I, 1996, Laboratoire
EXCELL, 16-34.
Pulido M.L., Ayzaguer J.M. Synergistic microbicidal combinations of 2-thiocyanomethylthio)benzothiazole and a trihalogenated phenols. US Patent US 4, 983, 618. 1991;
Saxby M.J., Reid W.J., WraggG S. Index of chemical taints.
1992, Leatherhead Food RA, Leatherhead ;
Sheik Y.M., Djerassi C. 2,6-dibromophenol and 2,4,6-tribromophenol antiseptic secondary metabolites of Phoronopsis
viridis. Experientia. 1975, 31, 265-266 ;
Syrres. Syracuse Research Corporation SRC environmental
science, PhysProp Database. 2003, ww.esc.syress.com;
Takashi K., Sato J. Fire-resistant thermoplastc resin compositions, fireproofing agents and manufacture of fire proofing
agents. Japan Patent JP 06, 157, 873. 1994;
Tanner H. and Zannier C. Unber die Bestimmung der chloroanisole in wein und Korkstopfen. Schweiz. Z. Obst. Weinbau.
1983, 119, 4, 468-473.
Tanner H., Zannier C., Würdig G. Zur analytischen
Differenzierung von Muffton und Korgeshmackes in Weinen,
Schweiz. Z. für Obst. Weinbau. 1981, 117, 26, 752-757.
Tindale C.R.; Whitfield F.B.; Levingston S.D.; NGuyen T.H.L.
Fungi isolated from packaging materials: their role in the production of trichloroanisole. J. agric Food Chem. 1989, 49, 437447.
Towa Mokuzai Co. Ltd. Preservation of wood. 1982, Japan
Patent, JP 57, 131, 506;
Watanabe I., Kashimoto T., Tatsukawa R. Polybrominated anisoles in marine fish, shellfish and sediments in Japan. Arch.
Environ. Contam. Toxicol. 1983, 12, 615-619.
Weber K., Ernst W. Occurence of brominated phenols in the
marine polychaete Lanice conchilega. Naturwissenschaften,
1978, 65, 262.
Whitfield F., Shaw K.J., Svoronos D. The volatile aroma compounds of Australian marine algae. 1992a, In Proceedings of
12th Int. Congr. Frag. Essen. Oils, 365-372;
Whitfield F., NGuyen T.H.L., ShawW K.J., Last J.H., Tindale
C.R. 2,6-dibromophenol : the cause of an iodoform-like offflavour in some Australian crustacea. 1988, J. Sci. Food
Agric., 46, 29-42 ;
Whitfield F., Shaw K.J., Walker D.I. The source of 2,6-dibromophenol : cause of an iodoform taint in Australian prawns.
1992b, Water Sci. Technol., 25, 131-138;
Whitfield F.B., HillL J.L., Shaw K.J. 2,4,6-tribromoanisole : a
potential cause of mustiness in packaged food. 1997, J.
Agric. Food Chem., 45, 889-893;
Soleas G.J, Yan J., Seaver T. et Goldberg S.M. Method for the
gas chromatographic assay with mass selective detection of
trichloro compounds in corks and wines applied to elucidate
the potential cause of cork taint. J. Agric. Food Chem. 2002,
50, 1032-1039.
Whitfield F.B., Helidoniotis F., Svoronos D., Shaw K.J., Ford
G.L. The source of bromophenols in some species of
Australian ocean fish. 1995, Water Sci. Technol., 31, 11,
113-120;
Sweetmann, J.A., SimmonsS M.S. The production of bromophenols resulting from the chlorination of waters containing
bromide ion and phenol, Water Res. 1980, 14, 287-290;
Wylie H. Trace level pesticides analysis by GC/MS using large
volume injection. Agilent Technologies Application Note. 1987,
September, 11 p.
Wittlinger R., Ballschmiter K. Studied of the global baseline
Informe Técnico 19
homogeneización del SO2 no es buena en los vinos conservados a baja temperatura (< 16°C). Con frecuencia es necesario bazuquear para mejorar la difusión de la dosis, y tanto
más cuanto más voluminoso es el recipiente (600 litros o
más).
rápida (figura 10), y tanto más cuanto más alta es la temperatura. Por lo tanto, sólo se puede aplicar con dosificadores
especiales cuando no hay posibilidad de recontaminación
(por ejemplo, al embotellar). En el caso contrario, habría que
reajustar continuamente la dosis de principio activo. De
momento, este producto está prohibido en Europa.
3- Alternativas al dióxido de azufre
El ácido sórbico no es eficaz respecto Brettanomyces sp. en
las dosis clásicas, y no se puede utilizar en los vinos tintos
debido a su inestabilidad en presencia de bacterias lácticas.
El pirocarbonato de etilo, propuesto por BAYER desde 1995
con el nombre de Baycovin™ actúa sobre las levaduras y
bacterias. Este compuesto no permanece estable en el vino,
pues se hidroliza rápidamente en etanol y en gas carbónico,
generando productos secundarios menores, entre ellos el
carbonato de etilo, que puede transmitir al vino cierto olor
"afrutado". La producción de uretanos (carbamato de etilo)
ha descartado su utilización en enología. Actualmente, este
producto muy antiguo reaparece en forma de dimetilo con el
nombre de Vercorin™ o DMDC. La dosis de 60 mg/l es fungistática para S. cerevisiae y la dosis de 150 mg/l es fungicida. B. bruxellensis se inhibe a partir de 120 mg/l, pero
para su destrucción total son necesarios más de 200 mg/l.
La utilización del DMDC permite la destrucción eficaz de los
gérmenes presentes, pero no una protección duradera, pues
la hidrólisis de este tipo de compuesto en el vino es muy
Conclusión
El desarrollo de técnicas modernas de detección adecuadas
para el seguimiento de la crianza de caldos y la elaboración
de métodos de desinfección y de control de los recipientes
de madera eficaces y que respeten el material permitirán
sin duda en un futuro próximo controlar perfectamente el
desarrollo de estos gérmenes de contaminación para reducir sus efectos indeseables, preservando al mismo tiempo
la pureza y la tipicidad del aroma de los vinos.
CHATONNET P., BOIDRON J.N. et PONS Monique, 1990,
Elevage des vins rouges en fûts de chêne: Evolution de certains composés volatils et de leur impact aromatique. Sci.
Alim., 10, 565-587;
CHATONNET P., BOIDRON J.N., DUBOURDIEU D., 1993
Influence des conditions d'élelevage et de sulfitage des vins
rouges en barriques sur leur teneur en acide acétique et en
éthyl-phénols. J. Int. Sci. Vigne et vin, 27, 4, 277-298 ;
TIPO DE ENSAYO
Nº de tapones
ensayados
Defecto grave
NQA = 1,5
(a)
Defecto crítico
NQA = 0,65
(b)
Clasificación
de la calidad
del lote
simple
80
Aceptado: 3
Rechazado: 4
Aceptado: 1
Rechazado: 2
Buena (1)
Media (2)
reforzado
200
Aceptado: 3
Rechazado: 4
Aceptado: 7
Rechazado: 8
Media (2)
Mala (3)
(1) defectos graves: ligero sabor a corcho, ligero sabor a moho, gasolina, cola
(2) defectos críticos: sabor a corcho medio, sabor a corcho fuerte, sabor a moho medio, sabor a moho fuerte, terroso fétido, estanca-
CHATONNET P., DUBOURDIEU D., BOIDRON J.N. et PONS
M., 1992. The origin of ethylphenols in wines. J. Sci. Food
Agric., 60, 165-178 .
Introducción
Informe Técnico 21
CONTROL DE CALIDAD DE LOS LOTES
DE TAPONES NUEVOS PARA PREVENIR
EL RIESGO DE CONTAMINACIÓN POR
CLOROANISOLES
Figura 1 - TCA total en diver-
sos lotes de tapones de
Champagne evaluados y clasificados previamente
mediante análisis sensorial
individual
Figura 2 - Figura 2 -
TCA total en diversos
lotes de tapones de
corcho natural previamente evaluados y
clasificados mediante
análisis sensorial individual.
Figura 3 - Relación entre el TCA total de los tapo-
nes de corcho natural y el TCA dosificado en los
vinos embotellados
a contaminación de los vinos por los tapones de
corcho es uno de los temas de mayor preocupación para la industria vinícola mundial. Los obturadores utilizados pueden causar diversos tipos
de defectos que afectan más o menos gravemente a la calidad de los productos embotellados. No
obstante, debido a su impacto y a las repercusiones económicas que conlleva, el problema del "sabor a tapón" es
el que más atención moviliza hoy en día. Las tergiversaciones de ciertos fabricantes a la hora de reconocer la
índole y la amplitud del problema, la exageración irracional de la frecuencia de alteración por este tipo de defecto
muy concreto, la tentación de sustituir el taponado de corcho por diversos tipos de obturadores totalmente sintéticos sin una previa reflexión profunda, y el eco excesivo en
los medios de comunicación han contribuido en buena
medida a la pérdida de racionalidad para atender y solucionar este delicado problema.
Los tapones de corcho o a base de corcho pueden ceder
diversos contaminantes a los caldos (BUSER et al.,
1982., RIBOULET, 1982., LEFEBVRE et al., 1983, BOIDRON et al., 1984., MAZZOLENI et al., 1993), incluidos
los sintéticos (CHATONNET et al., 1999, CHATONNET et
L
Labadie, 2003). Aunque se puede sospechar de otros
contaminantes organolépticamente muy activos (TANNER
et BUSER, 1981, CHATONNET, 1994, SOLEAS, 2002), de
hecho es el 2,4,6-tricloroanisol (TCA) identificado inicialmente por TANNER y BUSER en 1981, la molécula responsable de la gran mayoría de defectos calificados de
"sabor a tapón", pero que en realidad corresponden a un
olor a "moho"" (AMON et al., 1989). Los métodos de
fabricación tradicional de los tapones y las condiciones
que propician el desarrollo de un gran número de microorganismos en el material suberoso originan la aparición de
este contaminante en los tapones y de la contaminación
de los caldos (LEE y SIMPSON, 1993).
En este trabajo, realizado a partir de casos concretos
observados en la industria, estudiamos la distribución de
la contaminación de lotes de tapones compuestos utilizados para el taponado de los vinos espumosos (discos
pegados a un cuerpo de corcho aglomerado) y de tapones
de corcho natural empleados para el taponado de los
vinos tranquilos. Se comparan distintos enfoques de
medición del contenido y de la migración del TCA de los
tapones, con objeto de evaluar objetivamente el riesgo de
utilizar un lote de obturadores determinado. La primera
Figura 4 - Estimación de la variabili-
dad de la migración del TCA total
de los tapones en el interior de los
vinos embotellados juzgados significativamente alterados en la cata
(número de muestras: corcho natural
= 85, disco y aglomerado de corcho
compuesto = 33, corchos enteros
naturales = 57)
parte se dedica a un enfoque que toma en cuenta el contenido total (extraíble mediante un disolvente orgánico
potente, CHATONNET et al., 2003) de TCA presente en los
obturadores; la segunda parte trata sobre el interés del
concepto de TCA fácilmente extraíble desarrollado más
recientemente.
1-Utilización de la dosificación de los contaminantes totales presentes en los tapones
El control de calidad de los lotes de tapones mediante
análisis sensorial es una técnica laboriosa y más complicada de lo que podría parecer, pero hoy por hoy sigue
siendo la única técnica que permite un análisis individual
de una muestra sin resultar demasiado costosa. En el
mundo se utilizan diversos enfoques. Cada uno de ellos
presenta sus ventajas y sus inconvenientes, pero todos
ellos exigen mucho tiempo, personal y competencia. Los
lotes de tapones estudiados se han evaluado mediante la
Informe Técnico 23
CLOROANISOLES
Figura 5 - Distribución del TCA total en
los discos de corcho natural y en el cuerpo aglomerado de diversos tapones de
Champagne
cata individual de maceraciones acuosas de tapones; la
frecuencia de contaminación de los lotes de tapones por
olores de carácter "mohoso" permite clasificar los lotes
en diversos niveles de calidad. Los tapones tomados
como muestras de lotes de 140.000 unidades se aplican
a medias botellas que contienen 125 ml de agua mineral
controlada previamente mediante cata. Las botellas se
almacenan boca abajo durante 6 días. Pasado ese tiempo, se abren y catan individualmente les maceraciones
anotando la intensidad (sobre una escala que varía de 0
a 3) y el tipo de defecto detectado, en su caso (Tabla I).
Los tapones de corcho natural nuevos no han sido sometidos a lavado, y proceden de una selección visual realizada
entre la 2ª y la 3ª calidad según la escala de referencia de
la Fédération Nationale des Syndicats du Liège (FNSL,
1999) y una 1ª calidad para los tapones de Champagne
según la escala de referencia CIVC (1999). Los lotes llamados "buenos" son los lotes aceptados en su mayor
medida en un control de calidad rutinario, y en el control
de recepción presentan como máximo un tapón defectuoso. Los lotes "medios" se rechazan en el ensayo simple,
pero se aceptan en el control reforzado. Los lotes "malos"
Figura 6 - TCA liberable medido en diversos lotes de tapones de Champagne evaluados previamente por análisis
sensorial
Figura 7 - TCA liberable medido en diversos lotes de tapones de corcho natural evaluados previamente por análisis
sensorial
son lotes rechazados en el control reforzado.
La dosificación del TCA total del corcho se lleva a cabo
sobre una muestra de entre 25 y 50 tapones nuevos triturados (CHATONNET et al., 2003). Se extrae una alícuota
mediante un disolvente orgánico por agitación durante 60
minutos. El extracto así obtenido se separa del corcho, se
concentra y se analiza por cromatografía en fase gaseosa
combinada con la espectrometría de masa. La detección
específica del TCA y de su precursor directo, el TCP, por fragmentometría de masa permite detectar de niveles de contaminación muy bajos.
1.1-Heterogeneidad de la contaminación de los tapones en
los lotes comerciales
El estudio de la distribución de la contaminación dentro
de cada lote de tapones de corcho natural o compuesto
indica claramente que el TCA no está repartido uniformemente dentro de cada lote. Incluso en los lotes de riesgo
escasamente utilizados a la vista del resultado de los
ensayos sensoriales, sigue existiendo una proporción de
tapones que pueden contener grandes cantidades de
TCA. El nivel medio de contaminación de TCA total no permite diferenciar los lotes de alto riesgo de los de bajo
riesgo. Los lotes de riesgo potencialmente alto sólo se
distinguen de los lotes de bajo riesgo por una mayor proporción de tapones contaminados por encima de 50 ng/
tapón. En la práctica, se puede considerar que no existen
lotes totalmente indemnes de contaminantes y por tanto
de riesgo sea cual sea el tipo de obturadores (figuras 1 y
2).
1.2-Utilización del contenido de TCA total para predecir la
calidad de los lotes
Se observa poca o ninguna correlación significativa entre
el contenido total de TCA de los obturadores y la cantidad de TCA que afecta a los caldos (figura 3). En efecto,
la migración del contaminante de los tapones al conteni-
do de la botella depende de diversos factores, y no sólo
de la cantidad de contaminante. En el marco de un tapón
de corcho natural, o a fortiori compuesto, la contaminación no es homogénea.
El estudio de un número considerable de casos de contaminación de vinos embotellados por sus tapones de corcho indica por una parte que en el vino sólo se difunde
una fracción de los contaminantes totales, y por otra
parte que la magnitud de la migración es bastante variable (figura 4). En los tapones de corcho natural, los casos
marginales de fuerte migración (> 25% del TCA total)
representan en torno a un 2,4%. Este porcentaje es próximo a la tasa máxima de alteración de un lote de botellas
por encima de la cual son frecuentes las reclamaciones
(en torno a un 3% según nuestra experiencia). En estas
condiciones, teóricamente los obturadores no deberían
contener más de 15 ng/ tapón de TCA total, considerándose un límite máximo admisible de 3 ng/l de TCA en el
caldo. Pero en este caso, sólo estará en contacto con el
vino una fracción imprevisible del tapón. Salvo que se sea
excesivamente severo, esto impide sacar cualquier conclusión objetiva e irrefutable.
En los tapones de Champagne, el uso del tapón tiene una
orientación clara. A pesar de ello, la situación es más
compleja, debido a la estructura compuesta y a la gran
variabilidad inter-individual del nivel de contaminación de
los discos y del aglomerado (figura 5). Por su fabricación,
la migración del TCA de los discos es fácil. Sólo se oponen débilmente a una contaminación que puede proceder
del cuerpo aglomerado. Si también aquí se considerara la
fracción marginal del índice de migración (> 25%) con discos en contacto directo, situación que representa a una
gran mayoría de los casos observados (> 40%), habría
que admitir como máximo 6 ng de TCA total en la fracción
correspondiente a los discos (considerándose una canti-
Figura 9 - Correlación entre el TCA liberable medido en las maceraciones individuales de tapones de corcho natural y el
nivel de calidad estimado a partir de la evaluación sensorial de los lotes. Calidad del lote según el ensayo sensorial: 1 = bueno,
2 = medio, 3 = malo(LD: límite de detección = 0,6 ng/l; LQ: límite de cuantificación = 1,4 ng/l)
Informe Técnico 25
CLOROANISOLES
a) corcho natural
b) tapón de champagne
Figura 9 - Relación entre la dosificación del TCA liberable en maceración individual o conjunta (25 tapones/500 ml)
dad máxima admisible de TCA de 1.5 ng/l vino espumoso); es decir alrededor de 3 ng/g de TCA total en los discos de corcho natural. Dado el estado actual de las técnicas de fabricación, resulta bastante difícil garantizar
sistemáticamente un nivel de contaminación tan bajo.
2- Utilización de la dosificación de contaminantes
considerados fácilmente extraíbles o "TCA liberable"
Habida cuenta de los resultados expuestos más arriba,
de la localización superficial del TCA en las partes externas de los tapones (HOWLAND et al., 1997) y de la
ausencia de migración a través de importantes espesores
de tejidos suberosos (CAPONE et al., 2002), se estudia
la noción de "TCA fácilmente extraíble", es decir que
migra fácilmente en contacto con una solución hidroalcohólica modelo que simula el comportamiento de un obturador en una botella. Se trabaja con muestras de entre
25 y 50 tapones o con muestras múltiples de 10 tapones
por lote. Los tapones enteros se sumergen en una solución hidroalcohólica a 12% vol de etanol durante 24 h. Al
cabo de ese tiempo, se mide el TCA que ha migrado a la
solución (TCA liberable) para representar la fracción del
TCA del corcho susceptible de migrar al vino. Se utiliza la
técnica de "head-space solid phase micro-extraction"
(HSSPME) combinada con la cromatografía en fase gaseosa y con la detección de masa por fragmentometría
("selected ion monitoring" o SIM) para poder detectar y
dosificar el TCA a niveles muy bajos (en torno a 1,5 ng/l).
Apar te de los trabajos del Cork Quality Council en
Estados Unidos (HERVE et al, 1999), no se ha realizado
ningún otro trabajo de validación seria de este concepto. En efecto, la mayor par te de los trabajos se ha concentrado en la técnica de dosificación del TCA aplicando
el principio propuesto inicialmente por EVANS et al.
1997 (BUTZKE et al., 1998, RIBOULET et al., 2003),
pero nunca en la interpretación de los resultados obtenidos, es decir en la relación potencial entre el contenido medio de TCA extraíble medido en una muestra de
trabajo y la frecuencia de alteración previsible en caso
de utilización del lote de tapones en cuestión. En efecto,
desde un punto de vista práctico, no importa tanto conocer el contenido potencial de TCA cedido por el tapón si
no se puede estimar el número de botellas potencialmente afectadas por la utilización de tal o cual lote de
tapones.
2.1 -Estudio de la distribución del TCA liberable en los
lotes de tapones de corcho natural o compuestos
En los tapones compuestos destinados al taponado de
vinos espumosos, clasificados previamente en diversos
niveles de calidad mediante cata individual, se obser va
que no se puede diferenciar los lotes de tapones de uso
más o menos arriesgado en función de su contenido
medio de TCA liberable. En un lote de bajo riesgo
(bueno) se pueden encontrar algunos tapones capaces
de liberar cantidades impor tantes (> 7 ng/l) de TCA
(figura 6). Tampoco existe una diferencia obvia entre los
lotes considerados de riesgo "medio" y "alto". La única
diferencia existente entre los lotes de tapones clasificados como de bajo o alto riesgo reside en la proporción
de tapones que liberan más o menos de 3 ng/l de TCA
liberable. Aunque se lleve a cabo una maceración orientada, limitando el contacto con la par te aglomerada de
los tapones de Champagne, el cuerpo, con frecuencia
más contaminado (figura 7), per turba la medida del TCA
liberable. Dado el estado actual de las técnicas de fabricación y a la luz de los trabajos realizados en este estudio, parece pues más difícil prever la calidad de este
tipo de obturador mediante la dosificación del TCA liberable (figura 8a).
Por lo que se refiere a los tapones de corcho natural, se
obser va que en cier tos casos, los lotes considerados
satisfactorios por el ensayo sensorial individual pueden
contener asimismo un porcentaje considerable de tapo-
nes contaminados por encima de 8 ng/l/ tapón (figura 2). El contenido medio de TCA liberable de los tapones de
Figura 10 - Correlaciones existentes entre el contenido de TCA liberable medido en maceración individual o conjunta y la
frecuencia de contaminación medida en el lote para diversos tipos de tapones
Tabla 2 - Relación entre el riesgo de utilización teórico y la dosificación de TCA liberable obtenida a partir de maceraciones conjuntas de tapones de corcho natural
Ensayo
1
2
3
4
5
6
Nº total de tapones
25
25
25
25
25
25
Número de Tapones
sin contaminación*
25
24
24
23
22
21
Número de tapones con un
potencial significativo
de contaminación (> 6 ng/l)
y nivel individual
de contaminación (ng/l)
0
1 [13 ng/l]
3 [14, 17, 21ng/l]
4 [ 12, 8, 7, 6 ng/l]
12
16
6,5
1,6
9
2
16,1
1,8
1 [121
ng/l]
2 [13, 28
ng/l]
0
4
Riesgo real de utilización %
TCA liberable en la
maceración conjunta
Teórico
(ng/l)
0
Medido nd*
(ng/l)
Riesgo evaluado (1) %
0
4
8
4,8
1,7
13
5
24,2
7,9
nd
trazas **
0
Informe Técnico 27
CLOROANISOLES
corcho natural permite diferenciar más fácilmente los
lotes de riesgo del resto. Se obser va una buena correlación entre el nivel medio de TCA liberable dosificado
por maceración individual y la calidad del lote estimada
por el procedimiento de evaluación sensorial (figura 8b).
tenido de TCA liberable medido en una maceración conjunta (25 tapones/500 ml) y la media de las dosificaciones individuales de los mismos tapones de corcho natural y de Champagne.
Además, en los tapones de corcho natural, existe una
2.2- Utilización de la medida del TCA liberable para la
previsión del riesgo de la utilización
Si se admite que el muestreo de trabajo utilizado es
representativo de la realidad de un lote, la dosificación
del TCA liberable por maceración individual de los tapones de corcho natural y de los tapones de Champagne
debe permitir determinar la proporción de tapones cuya
utilización presenta un riesgo. Como sólo disponemos
de los datos obtenidos por HERVE et al (1999), consideraremos, como primera hipótesis, que la migración
efectiva del TCA liberable del tapón al vino es idéntica a
Figura 12 - Variabilidad y niveles de contaminación de diver-
sos tipos de tapones por el TCA liberable (maceraciones
individuales)
Figura 11 - Correlaciones existentes entre el contenido de
TCA liberable medido en maceración individual o conjunta
y la frecuencia de contaminación medida en el lote para
diversos tipos de tapones
la obser vada en los tapones de corcho natural, es decir
de alrededor de un 50%. En estas condiciones, admitiendo que una concentración de TCA superior a 1,5
ng/l en los vinos espumosos y a 3 ng/l en los vinos
tranquilos puede causar un trastorno organoléptico, los
tapones que liberan individualmente más de 3 ng/l en
el primer caso y más de 6 ng/l en el segundo podrían
causar contaminaciones excesivas y representan lo que
hemos llamado tapones de riesgo.
En un primer tiempo, hemos comparado el resultado de
la dosificación del TCA liberable obtenida a par tir de
maceraciones conjuntas o individuales de lotes de
tapones comerciales de corcho natural y de
Champagne. Los resultados de la dosificación del TCA
liberable se presentan en las figuras 9 a) y b). Se
obser va que existe una buena correlación entre el con-
buena correlación entre el contenido de TCA medido en
una maceración conjunta o en maceraciones individuales, y la frecuencia de contaminación por encima de 3 o
de 6 ng/l (figura 10). En el caso de un bajo potencial
contaminante (próximo al límite de detección en los
vinos, es decir en torno a 3 ng/l), la calidad de la correlación es más satisfactoria con los resultados procedentes de las maceraciones individuales que con los obtenidos a par tir de las maceraciones conjuntas. En el caso
de los tapones de Champagne, la correlación es más
baja, y no disponemos de ningún dato sobre la cuota de
migración del TCA liberable a la botella.
Para comprobar estos resultados, después hemos trabajado sobre muestras formadas por tapones de corcho
natural. Se han utilizado series de 25 tapones (2-3ª calidad de selección visual sin tratamiento super ficial) no
contaminados (TCA liberable < 0,6 ng/l) en las que
hemos incluido una proporción variable de tapones idénticos contaminados naturalmente a muy diversos niveles
(de 1 a 4 tapones por cada 25) y seleccionados tras la
maceración individual.
Los resultados de la tabla II presentan la relación existente entre el riesgo de utilización real y el riesgo estimado por el modelo de regresión obtenido a par tir de
las maceraciones conjuntas de tapones de corcho natural. Así pues, los tapones contaminados a un nivel no
detectable (< 0,6 ng/l) desembocan en una ausencia de
riesgo de la utilización (ensayo 1). En el caso de lotes
con una proporción de tapones contaminados a un nivel
moderado (13 ng/l individual de TCA liberable, potencial
de migración = 6.5 ng/l si la migración admitida es del
50%), pero cuyo riesgo de utilización ya es alto (1
tapón/25: 4%), la dosificación del TCA liberable a par tir
de una maceración conjunta no permite estimar la frecuencia de contaminación (ensayo 2). En el ensayo 3,
con la misma proporción de tapones contaminados
(4%), pero esta vez con un nivel muy alto (potencial
contaminante = 60 ng/l), el riesgo de utilización estimado por la dosificación está muy sobrevalorado (24%
frente al 4% en la realidad). Cuando los tapones tienen
un potencial contaminante bastante moderado (migración teórica de 6-10 ng/l) y están presentes con una
frecuencia superior al 4%, el riesgo de utilización se
aprecia bien mediante la dosificación del TCA liberable
en una maceración conjunta (ensayos 4 y 5). Pero en el
caso de una contaminación frecuente (ensayo 6) por
tapones cuyo potencial contaminante (3 a 6 ng/) supera más escasamente el límite de percepción organoléptica del TCA (# 3 ng/l), el riesgo de utilización está muy
infravalorado (2% frente al 16% en realidad).
En cuanto a los tapones de corcho natural, según el
modelo obtenido a par tir de nuestras obser vaciones
(figura 10b) y si se fija un riesgo máximo de utilización
en un 3% de tapones contaminantes (que liberan al
menos 6 ng/l de TCA liberable), no se debería aceptar
lotes de tapones que liberen más de 2,6 ng/l en maceración conjunta (25 tapones/500 ml) para los vinos
tranquilos (alteración por encima de 3 ng/l de TCA). Si
el riesgo de utilización se reduce al 1%, el TCA liberable
máximo alcanza 1,6 ng/l, es decir aproximadamente el
límite de cuantificación de la dosificación.
a) tapones contaminados a partir de 3 ng/l de TCA liberable (potencial contaminante teórico > 1,5 ng/l de vino)
2.3- Caso especial de los tapones sintéticos a base de corcho ALTEC de SABATE
La aparición de una nueva generación de tapones industriales fabricados a base de granulados de corcho y de diversos
coadytuvantes texturizantes ha permitido obtener obturadores técnicos muy eficaces y de calidad muy superior a la de
los tapones aglomerados tradicionales. Se han sucedido
varias fabricaciones tras el lanzamiento del tapón Altec de
SABATE en Francia. Diversas peripecias en la selección de
la materia prima utilizada y las técnicas de fabricación han
podido afectar a la calidad de ciertas remesas, y han alterado la confianza en este tipo de obturador.
Taras varias modificaciones del proceso de selección de
granulados y de métodos de fabricación, el grupo SABATE
ha recurrido a nosotros para validar los procedimientos de
control de calidad de los tapones Altec de nueva generación, para permitir certificar la presencia de TCA y posible
el riesgo de contaminación de los lotes de tapones fabricados.
Habida cuenta de los métodos de fabricación de los granulados empleados, de las diversas etapas de mezcla de
granulados con los distintos agentes aglomerantes y texturizantes utilizados y del moldeo individual de cada
tapón, hemos demostrado que la utilización de la dosificación del TCA liberable en maceración individual o conjunta
a partir de una muestra de tapones Altec nuevos daba
resultados sumamente homogéneos entre tapones (figura
11). Comparados con los demás tipos de obturadores y
concretamente con otros tipos de obturadores sintéticos
a base de corcho inspirados en el modelo Altec, todos los
demás tapones presentan un índice de variación del contenido de TCA contaminante muy superior (figura 12). Con
Altec, para una misma categoría, y dentro de un mismo
lote, la variación media es de 0,13 n/l de TCA liberable,
con una desviación mínima que varía entre 0,2 y 0,6 ng/l
(0,33 ng/l en promedio). Para un mismo tipo de fabricación,
la variación entre lotes es de 0,37 ng/l para un potencial
contaminante de 1,48 ng/l (la desviación mínima varía de
0,87 a 2,15 ng/l).
En los tapones de corcho naturales o los tapones compuestos, que siempre presentan un grado de variabilidad considerable, la problemática del muestreo representativo siempre resulta difícil de resolver. Con los tapones Altec, la gran
homogeneidad medida permite predecir fácil y seriamente la
calidad de un lote de fabricación a partir del análisis de un
solo tapón. Asimismo, en caso de mezcla de lotes considerados similares a raíz de un control previo, el control de calidad de lotes de Altec resulta infinitamente más sencillo, y
permite certificar el riesgo de utilización con mucha más
garantía.
3- Conclusiones
Los lotes de tapones de buena calidad no están necesariamente libres de tapones contaminados; en realidad sólo se
diferencian del resto por una menor proporción de tapones
significativamente contaminantes. Aunque sólo la frecuencia
de contaminación dentro de un lote es realmente representativa de su riesgo de utilización, hemos demostrado que se
puede establecer una relación entre la calidad de los lotes
de tapones de corcho natural y su contenido medio de TCA
liberable, pero no con su contenido de TCA total. Esta relación es mucho menos evidente en los tapones compuestos
de Champagne estudiados en este trabajo, pues, aunque se
realice una maceración orientada conforme a sus condiciones de uso, su composición heterogénea afecta mucho a
los resultados de dosificación.
La dosificación del TCA liberable en maceraciones conjuntas
está relativamente bien correlacionada con las dosificaciones en maceraciones individuales para todos los tipos de
tapones. En los tapones industriales a base de corcho
Altec, la gran homogeneidad de fabricación permite utilizar
Informe Técnico 29
CLOROANISOLES
muy fácilmente la dosificación del TCA liberable para controlar la calidad de los lotes.
En el corcho natural, la frecuencia de tapones contaminados individualmente por encima de 3 o de 6 ng/l de TCA se
puede relacionar satisfactoriamente con la dosificación del
TCA en una maceración conjunta. Por lo tanto, y a condición
de admitir que el muestreo de trabajo utilizado es realmente representativo, se puede estimar la frecuencia de contaminación de un lote de tapones en función del número de
tapones de riesgo, es decir por los tapones capaces de
liberar una cantidad suficiente de TCA para alterar la calidad
de un vino tranquilo, a partir de la dosificación de una
maceración conjunta. No obstante, los experimentos realizados sobre muestras compuestas demuestran bien que esta
metodología puede conducir a una infravaloración del riesgo
cuando el potencial contaminante de los tapones es moderado (3-6 ng/l) pero no por ello molesto. Por el contrario,
una fuerte contaminación de los tapones puede provocar
una importante sobrevaloración del riesgo y motivar el
rechazo de lotes que son no obstante utilizables, pues
poseen una frecuencia de tapones contaminados perfectamente aceptable. Por lo tanto, se podría considerar un control fácil y económico de los lotes de tapones antes de su
uso, siempre que se ponderen las conclusiones a la luz de
los resultados expuestos. Y es que según estos, los niveles
de 4 a 6 ng/l utilizados a menudo en la actualidad como
límite de rechazo parecen considerablemente excesivos.
Queda por estudiar más finamente la relación entre el TCA
liberable medido en las condiciones de dosificación en laboratorio y la migración real durante la crianza en botella. Hoy
por hoy, no disponemos de medidas suficientes para permitir la admisión y la generalización del valor aproximado de
50% medido por HERVE et al. (1999) en condiciones precisas. Es posible que en esta migración influyan la calidad
físico-mecánica del corcho y algunos de los tratamientos
aplicados a los tapones. Es pues necesario llevar a cabo
estudios complementarios para valorar mejor su variabilidad
en condiciones de uso reales. A partir de ese dato, sin
duda se podrá mejorar la estimación del riesgo de utilización en función del contenido medio de TCA de una maceración conjunta.
No parece que se pueda apreciar tan sencillamente la calidad de los tapones compuestos que combinan corchos de
diversas procedencias. La estructura heterogénea de estos
obturadores y el riesgo de migración de TCA a partir de la
parte aglomerada a pesar de la aplicación de uno o de
varios discos de corcho natural complica mucho el problema. No se sabe si este razonamiento se puede generalizar
a todos los tapones compuestos. Por lo tanto, es necesario
acometer trabajos específicos sobre este tipo de obturadores.
Hemos demostrado que la distribución de la contaminación
de los tapones, tanto en términos de TCA total que de TCA
liberable, dentro de un mismo lote no sigue claramente la
ley normal de distribución. Ahora bien, la mayor parte de las
técnicas de muestreo y de interpretación de resultados,
como ANSI/ASQC Z 1.4-1993 Plan/US Military Standards
(FUSELSANG et al.., 1995, AFNOR, 2000) se basan en la
hipótesis de una distribución homogénea que cumple la ley
normal o del binomio. El Sequential Probability Ratio Test
(SPRT) (SIMPSON y VEITCH, 1993) exige tomar muestras
hasta alcanzar el umbral de rechazo; esta solución resulta
pues muy pesada y poco compatible con las condiciones de
trabajo en enología. En realidad, es más conveniente utilizar,
como modelo de distribución de la contaminación por el
TCA, la ley de Poisson, que permite considerar los incidentes de escasa probabilidad dentro de una serie larga, en vez
de la ley de Laplace-Gauss. En la práctica, sólo se puede
utilizar el Fraction Defective Sampling Plan (FDSP) (BUTZKE y
SURPRENANT, 1997). Además, incluye la noción de riesgo
de proveedor a (probabilidad de rechazar un lote de calidad
aceptable) y de riesgo de usuario b (probabilidad de aceptar
un lote de mala calidad) para un nivel de calidad determinado (Average Quality Level AQL y la proporción de tapones
defectuosos que debe ser rechazada Pt), cosa que no hacen
el ANSI/ASQC o el SPRT.
Salvo para los tapones de tipo Altec que presentan muy
poca variación, la cuestión de la representatividad de la
muestra sigue completamente abierta. Hoy por hoy, habida
cuenta de la distribución y de la frecuencia de la contaminación del corcho observada en los lotes de tapones, es cierto que el examen de muestras de trabajo limitadas a 10, 25
o 50 unidades para controlar la calidad de un lote que contiene varias decenas de miles de tapones sólo permite descartar los lotes de peor calidad. La multiplicación de los
controles a escala de los subembalajes, que sólo contienen
algunos miles de unidades, es desde luego deseable, pero
todavía queda por especificar un método serio y práctico de
muestreo que responda satisfactoriamente a las exigencias
de los fabricantes y de los usuarios de tapones.
AFNOR 2000. Règle d'échantillonnage pour les contrôles par
attributs. Indice de classement X 06-022 (1991). Nouvelle
révision NF ISO 2859 2000, AFNOR (ed.) ;
AMON J.M., VANDEPEER, SIMPSON R.F., 1989. Compounds
responsible for cork taint. Australian & New Zealand Wine
Industry Journal, 4, 62-69;
BOIDRON J.N., LEFEBVRE A., RIBOULET J.M., RIBEREAUGAYON P., 1984. Les susbtances volatiles susceptibles d'ê-
tre cédées au vin par le bouchon liège, Sci. Alim., 4, 609616 ;
BUSER H.R., ZANIER C., TANNER H., 1982. identification of
2,4,6-trichoranisole as a potent compound causing cork
taint, J. Agric. Food Chem., 30, 2, 359-362.
BUTZKE C.E., EVANS T.J., EBELER S.E., 1998. Detection of
cork taint in wine using automated solid-phase micro-extraction in combination with GC/MS-SIM. In Chemistry of Wine
flavor, ACS Symposium, chapter 15, WATERHOUSE A.L and
EBELER S.E (ed.), ACS (pub.);
BUTZKE C.E., SURPRENANT A. 1997. Cork sensory quality
control manual, university of California, Cooperative
Extension Publication 21571 ;
CAPONE D.L., SKOUROUMONIS G.K., BARKER D.A., Mc
LEAN H.J., POLLNITZ A.P., SEFTON M.A., 1999. Absorption
of chloroanisoles from wine by corks and by other materials,
Austr. J. Grape Wine Res., 5, 91-98 ;
CAPONE D.L., SKOUROUMOUNIS G.K., SEFTON M., 2002.
Permeation of 2,4,6-trichloroanisole through cork closures in
wine bottles, Austr. J. Grape and Wine Res.,
CHATONNET P. 2003. Le TCA des bouchons neufs :
Montaigne à la rescousse, Revue des Œnologues 108, 4243 ;
CHATONNET P. et LABADIE D., 2003. Contrôle de la conformité des bouchons : objectifs et paramètres à l'usage des
professionnels, Rev. Fr. Oenol., 198, 20- 29 ;
CHATONNET P., GUIMBERTEAU G., DUBOURDIEU D. et BOIDRON J.N., 1994. Nature et Origine des odeurs de "moisi"
dans les caves. Influence sur la contamination des vins, J.
int. Sc. Vigne et Vin, 28, 2, 131-151 ;
CHATONNET P., LABADIE D., BOUTOU S., 2003. Dosage
simultané des chlorophénols et des chloroanisoles dans les
vins et les obturateurs en liège ou à base de liège. J. Int.
Sci Vigne et Vin 37, 3, 181-193;
CHATONNET P., LABADIE D., GUBBIOTTI M.C., 1999. Etude
comparative des caractéristiques de bouchons en liège et
en matériaux synthétiques - Premiers Résultats, Revue des
Œnologues, 92, 1-6 ;
CIVC, Comité Interprofessionnel du Vin de Champagne.
1999. Guide de qualité champagne du bouchon liège pour
col normalisé bague 29, Document CIVC/Syndicat des
Bouchonniers de Champagne, CIVC (Epernay) éd. ;
Informe Técnico 31
Informe Técnico 33
Origen y biosíntesis
de TCA en el corcho
1.- Introducción
1.1.- Breve historia del corcho y sus aplicaciones.
El corcho es un biopolímero de origen vegetal obtenido a
partir de la corteza externa del alcornoque (Quercus
suber L). Este árbol es típico de la región mediterránea y
ocupa extensas zonas de España, Portugal, Francia,
Italia, Grecia, Argelia, Marruecos y Túnez. En estos países existen aproximadamente unas 2.178.000 hectáreas
de alcornocales. La mayor extensión corresponde a
Portugal con 725.000 hectáreas (33%), situándose
España a continuación con 510.000 hectáreas, que se
localizan principalmente en Extremadura y Andalucía.
El corcho es un producto que tiene como principales propiedades una baja densidad, gran elasticidad, adherencia,
impermeabilidad y compresibilidad. Además, posee otra
serie de cualidades fundamentales: es compacto, resistente y se puede considerar inalterable. Estas características son bien conocidas desde la antigüedad. De hecho, ya
se utilizaba 3000 años antes de Cristo en China como elemento de flotación en artes de pesca. Más tardíamente
se utilizó en la Grecia antigua para cerrar vasijas de vino y
aceite. Los romanos también conocían las extraordinarias
propiedades del corcho como elemento capaz de proporcionar un cierre eficaz, como lo atestigua el hallazgo de
ánforas cerradas con corcho en excavaciones en
Pompeya, Campania o en numerosos barcos romanos hundidos a lo largo del Mediterráneo, y que en algunos casos
han permitido mantener inalterable el contenido de dichos
recipientes.
Son las propiedades anteriormente reseñadas las que
determinaron que desde el siglo XVIII se empezara a usar
regularmente en la industria, sobre todo después de que
el abad D. Perignon reinventara el tapón de corcho ya utilizado por griegos y romanos, aunque otros autores creen
que tomó la idea de peregrinos españoles que visitaban
la abadía. Ya en 1750 se estableció en la frontera francoespañola la primera factoría de tapones de corcho. En la
Informe Técnico 35
EN EL CORCHO
actualidad la principal aplicación del corcho es la fabricación de tapones para embotellar vinos y espumosos,
alcanzando la producción mundial los 25.000 millones de
unidades anuales ( http://www.amorimcork.com). En
menor medida, el corcho también se utiliza en la fabricación desde utensilios domésticos hasta pernos, plumillas,
papel de corcho, chalecos salvavidas, etc. Además es
importante como elemento aislante y decorativo en construcción.
Desde un punto de vista económico la producción mundial
de corcho alcanzó en 1999 las 335.000 toneladas, siendo Portugal el primer país productor (55% de la producción mundial), seguido de España, cuya producción se
elevó hasta 88.000 toneladas (26% del total). Sin embargo, y en lo que se refiere a producción de tapones,
Portugal ocupa el primer puesto (78% de la producción
mundial), mientras que la producción en España se reduce al 20%. Estos dos países prácticamente copan la producción mundial de tapones. De estos datos podemos
deducir que al valor económico intrínseco del proceso de
manufactura del corcho hay que sumarle el extraordinario
valor ecológico de los alcornocales, sin duda uno de los
más típicos ejemplos de bosque mediterráneo.
Sin embargo, la enorme importancia económica del tapón
de corcho se ve en la actualidad amenazada por el problema conocido como cork taint o contaminación del corcho,
fenómeno por el cual el tapón sería el responsable de
contaminar el vino con metabolitos de origen microbiano
que le proporcionan olores y/o sabores desagradables
que impiden su consumo.
- La composición en polifenoles del corcho es muy variable (aproximadamente el 33% en peso), pero el principal
componente de esta naturaleza es la lignina. La lignina
(aproximadamente el 27% en peso) es un polímero formado por restos fenilpropanoides derivados casi exclusivamente de los ácidos p-cumárico, coniferílico y sinapílico,
unidos entre sí por enlaces éter o carbono-carbono
(Azcón-Bieto y Talón, 1993). Es una estructura muy estable y extremadamente resistente a la degradación, hecho
que contribuye a aumentar tanto la resistencia química
como física del corcho. Su objetivo fundamental es actuar
como elemento de soporte que contribuye a la unión del
resto de los componentes.
Otros polifenoles presentes en corcho son los taninos
(aproximadamente el 6% del peso) responsables, en último término, de la peculiar coloración del corcho.
Muchos de estos polifenoles se descomponen, posiblemente por acción microbiana, en sus componentes básicos, de manera que en el corcho podemos encontrar una
gran cantidad de fenoles de bajo peso molecular como
ácidos (cinámicos, gálico, vainíllico, cafeico, ferúlico, protocatecuato y elágico), aldehídos (benzaldehído, vainillina,
1.2.- Composición química y estructura del corcho.
La pared celular es uno de los rasgos más característicos
de las células vegetales. Hay casos, como el del alcornoque, cuyas células tienen la capacidad de producir una
pared celular secundaria muy engrosada (además de la
primaria) que es lo que conocemos como corcho.
1.2.1. Composición química del corcho.
El corcho es un heteropolímero muy complejo en el que
químicamente se distinguen varias fracciones:
- La suberina es el componente mayoritario del corcho
(45%) y el principal agente responsable de su elasticidad.
Desde un punto de vista químico, la suberina de corcho
es una mezcla compleja de ácidos fenólicos (especialmente ácido ferúlico) esterificados a ácidos grasos de cadena
larga (C14-C30). También encontramos ácidos α,ω-dicarboxílicos y ω-hidroxiácidos (García-Vallejo et al., 1997).
Análisis realizados con suberina de peridermo de patata
indican que los principales componentes de la fracción
fenólica son polímeros derivados del ácido hidroxicinámico (Bernards et al., 1995). Una representación de su
estructura se puede apreciar en la Figura 1.1.
Figura 1.1. Representación simplificada de la estructura
de la suberina (Kolatukkudy, 1981). Se indican en recuadros algunos de los derivados fenólicos más significativos.
etilvainillina y aldehido coniferílico) y cumarinas (Conde et
al., 1997; Peña-Neira, et al., 1999).
- Los polisacáridos (en torno al 12% del peso) se localizan
sobre todo en la pared celular y contribuyen a definir la textura del corcho. Los más importantes son la celulosa y la
hemicelulosa. La celulosa es un polímero lineal no ramificado de alto peso molecular, formado por unidades de β-D-glucopiranosa unidas por enlaces glicosídicos β(1®4). Las
hemicelulosas son polímeros de pentosas y hexosas asocia-
das a celulosa y lignina en la pared celular (Cabral, 1988).
- Las ceras (aproximadamente el 5% del peso) son componentes muy hidrófobos que reducen drásticamente la permeabilidad del corcho al agua y solutos. (Azcón-Bieto y
Talón, 1993). Están formadas por mezclas complejas de
compuestos alifáticos, siendo los mayoritarios los alcanos
de número impar de carbonos (C29-C31). También podemos
encontrar compuestos terpenoides, concretamente triterpenos como cerina y friedelina (Caldas et al., 1985).
- El 5% restante está constituido por agua, minerales, sales
y otros componentes minoritarios como el glicerol.
1.2.2. Estructura del corcho.
El corcho estructuralmente se podría definir como un parénquima suberoso, producido por el meristemo felodérmico de
Quercus suber, que recubre el tronco y ramas del árbol, y
que tiene una gran capacidad de regeneración cada vez que
es retirado del árbol, por término medio cada 8-11 años. Al
microscopio está compuesto por células poligonales, ligeramente aplanadas, ocupadas principalmente por aire (Pérez y
Pérez, 1996) y que presentan una disposición bastante
regular en capas superpuestas. Esta estructura particular
es consecuencia del proceso de suberificación durante el
ciclo vegetativo de la planta. Con este proceso el lumen
celular se restringe y el protoplasto desaparece al ser totalmente reabsorbido. De la célula original sólo queda la
pared, formada por tres capas:
1.- Una capa celulósica, en contacto con las cavidades celulares.
2.- Otra capa suberificada de mayor espesor, compuesta por
estratos superpuestos de suberina y cera y que es la que
confiere al corcho su elasticidad.
3.- Otra más externa o capa lignificada.
El tejido suberoso no es homogéneo, y de hecho está atravesado en su interior por poros o canales, con paredes más
o menos lignificadas, que constituyen las lenticelas, rellenas de polvo rico en taninos (Suárez, 1992). La forma,
tamaño y porcentaje de lenticelas son responsables de la
porosidad del corcho y dependen fundamentalmente de factores genéticos.
1.3.- Microbiota del corcho.
El corcho es desde el punto de vista microbiano un ecosistema muy complejo en el que encontramos gran cantidad y
variedad de microorganismos, y ello a pesar de que el corcho es un material que por sus características tiende a limitar el crecimiento de los microorganismos. Entre ellas citaremos, la relativamente baja concentración de nutrientes y
su baja actividad de agua.
El valor de actividad del agua calculado para tapones de corcho almacenados en bolsas herméticamente cerradas es
de 0.55-0.56, valor por debajo del límite del crecimiento
microbiano (Beuchat, 1983; Sarrete et al., 1992), aunque
suficiente para permitir la supervivencia de los microorganismos. La disponibilidad de agua no siempre es un factor limitante, ya que a lo largo del proceso de fabricación del tapón
existen fases que suponen un gran incremento del nivel de
humedad del corcho. De hecho, tras una incubación de tapones durante una semana en cámaras con humedad atmosférica se aprecia un aumento gradual en sus niveles de humedad, obteniéndose valores de actividad de agua de
0.86-0.89 (Danesh et al., 1997), adecuados para el crecimiento microbiano.
En cuanto a la baja disponibilidad de nutrientes, debemos
tener en cuenta que la compleja estructura del corcho determina que sólo aquellos microorganismos con capacidad
suberolítica, ligninolítica, o con capacidad para degradar celulosas y hemicelulosas, puedan mediante su capacidad
degradativa acceder a compuestos más sencillos y fácilmente metabolizables. Ambos factores determinan que los microorganismos se desarrollen preferentemente en la superficie
del corcho. No obstante, algunos pueden penetrarlo profundamente y desarrollarse en las lenticelas, casi siempre como
consecuencia de heridas producidas mecánicamente o por
insectos.
Estudios realizados con técnicas de microscopía electrónica
confirman que en la mayor parte de los casos los hongos
filamentosos (los de mayor capacidad invasiva) no penetran
en profundidad más allá de ocho a 15 niveles celulares
(Silva Pereira et al., 2000a).
Estos microorganismos se pueden dividir en dos grandes
grupos:
I).- Aquellos con capacidad para crecer a expensas del corcho (microorganismos saprófitos del corcho).
II).- Microorganismos naturales de otros nichos ecológicos
(suelo, material vegetal, etc.) y que aparecen como contaminantes ocasionales del corcho.
Sin embargo, diferenciar entre ambos grupos es prácticamente imposible. Si acaso los primeros presentarían una
distribución prácticamente universal, mientras que la aparición de los segundos en el corcho sería ocasional. De
hecho, la mayoría de los microorganismos aislados se
encuentran en el corcho ya en el momento de la extracción
del árbol, mientras que otros colonizan el corcho durante la
etapa de reposo en patio, en el proceso de manufactura, en
la fase de bodega o durante el almacenamiento en fábrica
La microbiota del corcho es muy variada y podemos destacar
la presencia de un elevado número de bacterias, hongos filamentosos y levaduras. En la tabla 1.1 se indican los microorganismos más frecuentemente aislados a partir de corcho
(Bureau et al., 1974; Davis et al., 1981; Lefebvre et al.,
1983; Simpson y Lee, 1990; Lee y Simpson, 1993; Danesh
et al., 1997). Otros autores han descrito la presencia ocasional de otros microorganismos no incluidos en la tabla para
no alargarla excesivamente.
Informe Técnico 37
EN EL CORCHO
Algunos de estos estudios se han realizado en España. Así,
a partir de corteza de alcornoques y diferentes muestras de
corcho (correspondientes a distintas etapas del proceso de
fabricación de tapón) obtenidas de robledales de Cataluña
se han aislado numerosos microorganismos: casi 50 especies de hongos filamentosos o mohos, tres levaduras
(Cryptococcus sp., Rhodotorula glutinis y Saccharomyces
cerevisiae) y varias cepas bacterianas pertenecientes a
nueve géneros diferentes (Codina et al., 1993, Calvo et al.,
1993; Calvo y Agut, 1996; Calvo et al., 1995).
Por otro lado Muñoz et al. (1996) han detectado en la corteza de alcornoques del Parque Nacional de los
Alcornocales (Cádiz) un total de 112 hongos de los cuales
dos son zigomicetos, 24 ascomicetos, 42 basidiomicetos y
43 deuteromicetos.
La mayor parte de estos estudios se han centrado en la
caracterización de la microbiota de hongos filamentosos. Así
Lee y Simpson (1993) indican que los hongos predominantes en corcho recién recogido son los Penicillium, y en
menor medida Trichoderma y Acremonium. Por el contrario,
en una partida de tapones de Australia los géneros dominantes fueron Penicillium, Trichoderma, Cladosporium y
Rhizoctonia (Simpson y Lee, 1990). Otros autores indican
que el hongo dominante en muestras de corcho portugués
es Chrysonilia sitophila (Danesh et al., 1997).
En todo caso, la microbiota del corcho puede variar considerablemente dependiendo de su origen, tipo de muestra (corteza, tapón, etc.) y condiciones ambientales. A pesar de las
limitaciones del corcho para el crecimiento de los microorganismos, se trata de un material capaz de soportar poblacio-
Tabla 1.1.- Microorganismos detectados con mayor frecuencia en muestras de corcho.
BACTERIAS
HONGOS FILAMENTOSOS
Bacillus
Corynebacterium
Flavobacterium
Kurtia
Listeria
Micrococcus
M. luteus
Nocardia
Pseudomonas
Streptomyces
Acremonium
Alternaria
Aphanocladium
Aspergillus
A. niger
A. flavus
Armillaria
Aureobasidium
Cladosporium
Chrysonilia (Monilia)
C. sitophila
Eurotium
Fusarium
Mucor
M. hiemalis
Neurospora
Paecilomyces
Penicillium
P. glabrum
P. chrysogenum
P. citrinum
P. decumbens
P. frequentans
P. granulatum
P. glabrum
P. meleagrinum
P. purpurogenum
P. spinolosum
P. variabile
Phoma
Rhizopus
Stachybotrys
Trichoderma
T. longibrachiatum
T. viride
Troncatella
Verticillium
LEVADURAS
Candida
C. famata
Cryptococcus
Rhodotorula
R. glutinis
Saccharomyces
Sporodiobolus
S. johnsonii
nes microbianas enormes. Así, en corteza de corcho se han
detectado hasta 3 x 106 hongos filamentosos y 7 x 105 bacterias por gramo. Estos niveles aumentan hasta alcanzarse
en la fase de maduración en bodega unos valores máximos
de 1 x 108 hongos filamentosos y 5 x 103 bacterias por
gramo (Calvo y Agut, 1996).
No obstante y a pesar de su alto contenido microbiano sabemos muy poco acerca de la posible influencia de la microbiota
asociada a corcho en la calidad final del tapón.
Sin embargo, los productores mantienen que los hongos que
crecen sobre corcho tendrían un efecto beneficioso, ya que
producirían un emblandecimiento que favorecería su manejo,
además de producir el colapso de las lenticelas, lo cual resulta en un tapón más compacto y con menores pérdidas. Sin
embargo, estas afirmaciones deben ser tomadas con cautela,
ya que no existen datos experimentales que las confirmen
1.4.- Los microorganismos del corcho y el problema del
cork taint o contaminación del corcho (sabor a corcho
o sabor a moho de los vinos).
El término cork taint, o contaminación del corcho, hace alusión al aroma terroso y/o mohoso que presentan en ocasiones los vinos, y que impide su comercialización. Este fenómeno es reconocido como un problema muy serio en la industria
del vino, ya que a bajos niveles causa la pérdida de sus
características frutales y enmascara su aroma (Amón et al.,
1989).
Según algunos autores, la incidencia del problema oscila
entre el 2-7% del total de botellas (Butzke et al., 1999). Para
otros el porcentaje es ligeramente más bajo, variando entre el
0.5-6% (Lee y Simpson, 1993). No obstante, independientemente de la incidencia real del problema, se estima que el
vino estropeado por este fenómeno supone a las bodegas de
todo el mundo unas pérdidas anuales de 10.000 millones de
dólares, incluyendo las causadas por fugas y oxidaciones por
defectos físicos del corcho (Butzke et al., 1999).
Son muchas (unos 100 compuestos volátiles) las sustancias
identificadas como posibles agentes causantes del cork taint
(Amón et al., 1989). Ver Tabla 1.2. Entre ellos destacan los
cloroanisoles como el pentacloroanisol (PCA), el 2,3,4,6-tetracloroanisol (2,3,4,6-TeCA) y especialmente el 2,4,6-tricloroanisol (2,4,6-TCA) como los agentes que contribuyen en mayor
medida a este problema. Especialmente importante es el
papel del 2,4,6-TCA, considerado como el compuesto responsable del 80% de los casos detectados, y que en un estudio
sobre vinos australianos afectados por este problema, llegó a
detectarse en el 100% de las botellas (Pollnitz et al., 1996).
Además, algunos estudios establecen una clara correlación
entre la presencia 2,4,6-TCA en vino y tapón o entre la presencia de 2,4,6-TCA e intensidad de la contaminación del corcho (Peña-Neira et al., 2000).
Otro compuesto importante es el guayacol (un derivado del
ácido vainíllico) que proporciona al vino un sabor medicinal,
fenólico o a quemado y que podría originarse por la acción de
microorganismos que degradarían la lignina (Maga, 1978).
De menor importancia citaremos la geosmina (proporciona
aromas y sabores terrosos) y el 2-metilisoborneol, que aporta
desagradables sensaciones a lodo.
Ocasionalmente también se han detectado compuestos alifáticos como octanol, octanona-3-octanal, 1-octeno-3-ona y 1octen-3-ol. Finalmente, citemos pirazinas y metoxipirazinas y
diferentes sesquiterpenos identificados en muestras de corcho contaminadas por Penicillium roquefortii (Amón et al.,
1989).
Se cree que estas sustancias son producidas por microorganismos que crecen sobre el corcho utilizado en el taponado
de las botellas de vino, aunque las evidencias al respecto son
escasas. Sin embargo, es necesario mencionar que el fenómeno de la contaminación del corcho es muy complejo, ya
que a menudo no es posible establecer una relación directa
entre el cork taint y una única sustancia en una matriz químicamente tan compleja como el vino. Así, Silva Pereira et al.
(2000a) sostienen que es probable que en muchos casos,
varios compuestos contribuyan de forma simultánea y sinérgica a este fenómeno, siendo la contribución parcial de cada
compuesto difícil de determinar.
Tabla 1.2. Principales compuestos químicos y sus características organolépticas responsables
de la contaminación del corcho.
COMPUESTO QUÍMICO
CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICAS
POSIBLES MICROORGANISMOS PRODUCTORES
Cloroanisoles (2,4,6-TCA;
2,3,4,6-TeCA y PCA)
Sabor y olor a corcho y/o moho
Hongos filamentosos?
Guayacol
Sabor y olor fenólico, medicinal o a quemado
Geosmina
Sabores y olores terrosos
Actinomicetos?
Actinomicetos?
2-metilisoborneol
Compuestos alifáticos: octanol, octanona-3-octanal, etc
Sabores y olores a lodo
Sabores y olores a moho
Pirazinas y metoxipirazinas
Penicillium? / Aspergillus?
Sabores y olores terrosos y/o a moho
Sabor y olor a moho
Penicillium roquefortii
Terpenos (sesquiterpenos)
Informe Técnico 39
EN EL CORCHO
1.4.1.- Posibles mecanismos de formación del 2,4,6-tricloroanisol.
A pesar de la gran importancia del 2,4,6-TCA en el fenómeno
del cork taint, el conocimiento que existe acerca de los mecanismos que conducirían a su formación es más bien escaso.
Aunque son varias las hipótesis enunciadas, los datos experimentales para intentar confirmarlas o refutarlas son casi
inexistentes. Los hipotéticos mecanismos para su formación
se resumen en la Figura 1.2.
1.4.1.a.- Síntesis por catabolismo (deshalogenación y biometilación) de fenoles altamente clorados.
El 2,4,6-TCA se originaría por catabolismo de fenoles
altamente clorados (mecanismo 1 en Figura 1.2) como el
PCP o el 2,3,4,6-TeCP (Maarse et al ,1989; Tanner et al.,
1981). También el hexaclorobenceno o el lindano (hexaclorociclohexano) podrían originar 2,4,6-TCA por deshidrohalogenación (Neidlemann y Geigert, 1986). Estos compuestos son muy tóxicos y su metilación para dar lugar a
anisoles podría ser un mecanismo de detoxificación,
puesto que los fenoles menos clorados tienen una menor
toxicidad y además son más fácilmente biodegradables
por microorganismos anaerobios (Nicholson et al., 1992;
Mohn et al., 1992).
1.4.1.b.- Deshalogenación de anisoles altamente clorados.
El 2,4,6-TCA podría originarse por la eliminación de átomos de cloro (deshalogenación) de anisoles clorados
como el PCA o el 2,3,4,6-TeCA (Maarse et al., 1989;
Tanner et al., 1981). Ver mecanismo 2 en Figura 1.2.
1.4.1.c.- Síntesis por halogenación (cloración) de anisol
por lavado de corcho con hipoclorito.
Otros autores apuntan que la biometilación del fenol
podría ser anterior a la cloración (Neidleman y Geigert,
1986). Así, los cloroanisoles se formarían a partir de anisol (metoxibenceno) durante la etapa de lavado con hipoclorito que en ocasiones se realiza en el proceso de fabricación del tapón (mecanismo 3 en Figura 1.2). Algunos
estudios indican que el 18% del corcho lavado con hipoclorito contenía de 6 a 13 ng de 2,4,6-TCA por gramo y
todos contenían 2,4,6-TCP en el rango 19-301 ng por
gramo de corcho (Sponholz y Muno, 1994). Por ello, el
baño clorado ha sido reemplazado por un lavado con
peróxido de hidrógeno al 10% (conteniendo un 5% de
amonio). Este proceso de cloración podría ser un proceso
de destoxificación que algunos microorganismos poseerían para eliminar átomos de cloro presentes en el ambiente en el que crecen. También se ha postulado que la limpieza en la bodega con hipoclorito de los palés y
estanterías donde se almacenan las botellas de vino
sería otra posible causa de contaminación (Maujean et
al., 1985).
1.4.1.d.- Síntesis endógena del núcleo fenólico y posterior
cloración y metilación.
Maujean et al., (1985) sugieren que el núcleo fenólico del
2,4,6-TCA podría formarse a partir de glucosa; ésta a través de la ruta de las pentosas fosfato originaría ácido
siquímico que sería el precursor del fenol, el cual sería
clorado para dar lugar a 2,4,6-TCP. Finalmente, este compuesto sería metilado para su destoxificación mediante
una actividad metiltransferasa, en presencia de ácido fólico como cofactor y S- adenosilmetionina (SAM) como
donador de grupos metilo (mecanismo 4 de la Figura 1.2).
1.4.1.e.- Biometilación a partir de clorofenoles como el
2,4,6-TCP.
En este caso el 2,4,6-TCA se formaría por biometilación
directamente a partir del 2,4,6-TCP (modelo 5 en Figura 1.2)
(Silva Pereira et al., 2000b). Una posible fuente de clorofenoles sería su absorción por la corteza del árbol. Los clorofenoles podrían tener su origen en la contaminación ambiental, debido a su uso como fungicidas y pesticidas en los
alcornocales, o durante el almacenaje de las planchas para
prevenir el crecimiento de microorganismos (Kun y Suflita,
1989). Independientemente de cual sea el proceso que da
lugar a la formación de anisoles, parece claro que existe
una relación directa entre la contaminación del corcho con
clorofenoles y la aparición de cloroanisoles.
No podemos dejar de mencionar que los clorofenoles han
sido ampliamente utilizados durante décadas como pesticidas y preservantes de la madera, tanto en agricultura como
en industria. En consecuencia han llegado a convertirse en
contaminantes que pueden encontrarse en prácticamente
cualquier ecosistema (Chaudhry y Chapalamadugu, 1991).
De hecho, algunos estudios han demostrado que el 2,4,6TCP y el 2,4,6-TCA son contaminantes de los ecosistemas
acuáticos de agua dulce en Suecia (Nystrom et al., 1992).
Este hecho se agrava por la elevada recalcitrancia de estos
compuestos a la degradación, lo que determina su persistencia en los ecosistemas durante periodos de tiempo muy
largos.
1.4.2.- Los microorganismos del corcho y la producción de
2,4,6-TCA.
A pesar de que el 2,4,6-TCA es el principal agente responsable del cork taint (Amon et al., 1989; Buser et al.,
1982), no existen apenas estudios que de manera inequívoca identifiquen microorganismos productores de este
compuesto. La mayoría de los autores sugieren que los
hongos filamentosos son los responsables de la síntesis
de este compuesto: así Daly et al., (1984) y Sponholz y
Muno (1994) hablan de un hongo que produce esporas
negras que cuando crece sobre corcho puede producir
2,4,6-TCA. Silva Pereira y colaboradores (2000b) afirman
que algunos hongos aislados del corcho tienen bajo
potencial de producción de 2,4,6-TCA a partir de 2,4,6TCP (0.03% a 9,5%). Destacan el caso de Chrysonilia sitophila, hongo que tras la fase de cocido y durante el alma-
cenamiento en bodega experimenta un desarrollo incontrolado (Calvo et al.,1995), debido a que la elevada
humedad relativa favorece su desarrollo.
A pesar de ello este hongo apenas puede sintetizar 2,4,6TCA (sólo un 0.03% de 2,4,6-TCP es biometilado), lo cual
es un hecho muy beneficioso para el corcho dado que su
Figura 1.2. Posibles mecanismos para la formación de 2,4,6-TCA: 1.- Síntesis por catabolismo de compuestos clorados (Maarse et al., 1989; Tanner et al., 1981; Neidlemann y Geigert, 1986; Nicholson et al., 1992; Mohn et al,
1992). 2.- Síntesis por deshalogenación de anisoles altamente clorados (Maarse et al., 1989; Tanner et al., 1981).
3.- Halogenación de anisol mediante lavado de corcho con hipoclorito (Neidleman y Geigert, 1986; Sponholz y Muno,
1994; Maujean et al., 1985). 4.- Síntesis endógena del núcleo fenólico y posterior halogenación y biometilación
(Maujean et al., 1985). 5.- Biometilación directa de 2,4,6-TCP (Kun y Suflita, 1989; Silva Pereira et al., 2000b).
crecimiento imposibilitaría el crecimiento de otros microorganismos posiblemente nocivos, la mayoría de los cuales
habrían sido eliminados por el proceso de cocido.
1.4.3.- Posibles mejoras del proceso de fabricación para
evitar el cork taint o contaminación del corcho.
El grave problema que para las industrias que manufacturan tapón de corcho ha llegado a ser el cork taint ha
hecho que algunos investigadores hayan propuesto que el
tapón debiera ser considerado como una parte del vino y
en consecuencia, tratado como un producto alimenticio a
lo largo de todo el proceso de fabricación.
Así, Butzke et al. (1999) han propuesto las siguientes
medidas posibles a fin de disminuir la incidencia de este
problema, y que tienen como principal objetivo minimizar el
contacto de la materia prima, tanto con organoclorados,
como con posibles microorganismos productores de 2,4,6TCA:
1).- El uso de pesticidas y fungicidas conteniendo trazas
de clorofenoles debería ser prohibido en los alcornocales
y áreas próximas, y los árboles sistemáticamente analizados para verificar que están libres de este tipo de com-
Informe Técnico 41
EN EL CORCHO
puestos.
2).- Puesto que ciertos niveles de clorofenoles y 2,4,6TCA se han encontrado en muestras de corteza de alcornoques, los alcornocales deberían, en lo posible, ser protegidos de la polución industrial y aérea.
3).- La corteza del alcornoque una vez retirada del árbol
no debería entrar en contacto con el suelo, para evitar la
contaminación microbiana.
4).- Las planchas de corcho no deberían almacenarse en
el bosque, en condiciones ambientales que favorecen el
desarrollo de microorganismos, sino en instalaciones
industriales aireadas y saneadas (suelo de cemento).
5).- Las planchas no deberían ser almacenadas o transportadas en palés u otra estructura de madera que pueda
contener clorofenoles como conservantes de la madera.
6).- El crecimiento microbiano sobre el corcho debería ser
evitado a lo largo de todo el proceso de fabricación.
7).- El agua en que se cuece el corcho debería ser libre
de cloro y cambiada frecuentemente.
8).- El tratamiento blanqueador con hipoclorito debería ser
eliminado y en general se debería evitar el uso de cualquier agente halogenante.
9).- Los lotes de tapones deberían ser almacenados en
condiciones de baja humedad para evitar el desarrollo de
microorganismos, y siempre lejos de las planchas iniciales de alto contenido microbiano.
10).- Los tapones deberían ser almacenados en recipientes cerrados, sin contacto directo con el aire, para evitar
la contaminación microbiana y la absorción de clorofenoles y cloroanisoles presentes en la atmósfera.
1.5.- Los anisoles en la naturaleza.
Los anisoles no son compuestos que hayan merecido una
gran atención por parte de los investigadores. Vamos a
continuación a repasar las escasas referencias relacionadas con este tipo de compuestos.
1.5.1.- Significado de la O metilación de clorofenoles: los
cloroanisoles como productos resultantes de la destoxificación de clorofenoles.
Los clorofenoles son algunos de los xenobióticos más
recalcitrantes que podemos encontrar en la naturaleza,
con el agravante de su amplia utilización como pesticidas
y fungicidas en la agricultura o para la conservación de la
madera. Además, constituyen la base en muchas industrias químicas para la síntesis de otros plaguicidas más
complejos y efectivos. No es pues de extrañar que
muchos investigadores se estén centrando en la búsqueda de posibles estrategias degradativas de estos compuestos altamente contaminantes.
Algunos estudios han demostrado que diversos anisoles y
tioanisoles se pueden formar por O metilación a partir de
clorofenoles y clorotiofenoles por bacterias de los géneros
Rhodococcus, Acinetobacter y Pseudomonas aisladas del
Mar Báltico y de sedimentos de lagos de Suecia (Neilson
et al., 1988). Estos autores demuestran que dos especies del género Arthrobacter (aisladas de muestras de
suelo) son capaces de llevar a cabo la O metilación de
mono, di, tri y tetracloroguayacoles y PCP para dar lugar a
los correspondientes anisoles derivados (Neilson et al.,
1983).
Esta reacción de O metilación no está limitada a microorganismos procariotas. Así Cserjesi y Johnson (1972) aislaron a partir de material vegetal de un bosque canadiense una cepa del hongo Trichoderma virgatum capaz de
biometilar PCP para producir PCA.
Otros autores han demostrado la O metilación de varios
compuestos fenólicos por el alga Euglena gracilis (Drotar
y Fall, 1985a y 1985b), el protozoo Tetrahymena thermophila (Drotar y Fall, 1986) y la levadura Saccharomycopsis
lipolytica (Drotar et al., 1987).
Esta reacción de O metilación sería un mecanismo que
algunos microorganismos han desarrollado para destoxificar o neutralizar los clorofenoles altamente tóxicos,
mediante la metilación de su grupo hidroxilo muy reactivo.
Ello supone su transformación en cloroanisoles con una
toxicidad despreciable si se compara con la del clorofenol
del que proceden. De hecho, la importancia de la reacción de O metilación de clorofenoles como mecanismo de
destoxificación ha sido señalada por varios autores
(Cserjesi, 1967; Cserjesi y Johnson, 1972; Allard et al.,
1987 y Neilson et al., 1988).
Sin embargo, la información disponible sobre las reacciones de O metilación que conducen a la formación de anisoles es limitada. No obstante, en algunas bacterias
como Rhodococcus, Acinetobacter y Pseudomonas se ha
detectado una metiltransferasa constitutiva dependiente
de S-adenosilmetiononina (SAM) implicada en la formación de anisoles y tioanisoles. Esta actividad puede metilar una amplia variedad de sustratos (cloro y bromofenoles, clorotiofenoles, cloro y bromoguayacoles y cloro o
bromocatecoles) en mayor o menor grado, aunque muestra una mayor actividad hacia tiofenoles (Neilson et al.,
1988).
Por otro lado en el basidiomiceto Phanerochaete chrysosporium (hongo ligninolítico que causa la podredumbre
blanca de raices), se han detectado varias O-metiltransferasas. Estas enzimas podrían estar implicadas en la
degradación de lignina y secundariamente intervendrían
en la metilación de fenoles clorados y dioxinas, cuya
degradación parece tener lugar a través de intermediarios
metoxilados. De hecho, se cree que en estos procesos
degradativos el papel de la O metilación sería generar un
sustrato intermediario capaz de ser atacado más fácilmente por las lacasas y lignina peroxidasas de este
hongo (Jeffers et al., 1997).
Hasta la fecha se han descrito en P. chrysosporium tres
metiltransferasas diferentes implicadas en reacciones de
O metilación:
- Una 3-O-metiltransferasa específica de posición meta,
con alta actividad hacia el grupo 3-hidroxilo de varios ácidos benzoicos sustituidos (Jeffers et al., 1997).
- Una 4-O-metiltransferasa que podría participar en la
metilación de productos de degradación de la lignina
como ácidos vainíllicos y siríngicos específicamente en la
posición para (Eriksson et al., 1984).
- Una O-metiltransferasa específica de fenoles 2,4-disustituídos (Coulter et al., 1993). Esta enzima es interesante
porque, aunque metila preferentemente 3-metoxi y 3,5dimetoxi-4-hidroxibenzaldehídos y ácidos benzoicos y acetofenonas 3,5-disustituídas, también puede metilar eficientemente 2,4-diclorofenol y 2,4-dibromofenol, para
generar los correspondientes anisoles. Aunque el rango
de sustratos de esta enzima sugiere un papel en el catabolismo de lignina, no podemos excluir la posibilidad de
que sea responsable de la formación de 2,4,6-TCA y PCA
observados cuando P. chrysosporium crece bajo condiciones no limitantes de fuente de nitrógeno (Bhasker Reddy
et al., 1998 y 2000).
Debemos mencionar también que se han descrito reacciones de O metilación en las que intervienen metiltransferasas que usan clorometano como donador de grupos
metilo en vez de SAM. Estas enzimas son responsables
de la producción de alcohol veratrilo (3,4-dimetoxibencil
alcohol) por P. chrysosporium (Harper et al., 1990) y en
el hongo Phellinus pomaceus de la producción de anisoles a partir de distintos compuestos como 2-, 3- y 4-clorofenol y 2,6-diclorofenol (Harper et al., 1989; McNally et
al., 1991).
1.5.2.- Los cloroanisoles como intermediarios en la
degradación de clorofenoles por basidiomicetos ligninolíticos.
La lignina es el biopolímero más abundante en la naturaleza y es muy resistente a la degradación dada su
gran estabilidad química, debida a su estructura polifenólica, muy parecida a la de la suberina (ver Figura
1.1). Existen sin embargo algunos hongos basidiomicetos que causan la podredumbre blanca de la raíz, como
Phanerochaete chr ysosporium, que tienen una gran
capacidad de degradación de este biopolímero.
Curiosamente la batería de enzimas ligninolíticas son
de un gran interés como agentes que pueden degradar
clorofenoles. Bhasker Reddi et al., (1998) han demostrado que este hongo es capaz de mineralizar 2,4,6-TCP
cuando crece en un medio en el que existe una limitación de la fuente de nitrógeno. Curiosamente cuando
este microorganismo crece en un medio sin limitación
de nitrógeno no degrada el 2,4,6-TCP sino que lo metila,
aunque muy lentamente para producir 2,4,6-TCA.
1.5.3.- Los anisoles y su importancia en la industria alimentaria.
Además del papel ya mencionado de los anisoles como
responsables del cork taint, podemos encontrar en la
bibliografía algún ejemplo más en los que se cita a los
anisoles como agentes responsables de olores y sabores desagradables en distintos alimentos. La primera
mención que se conoce en la literatura sobre el papel
de los cloroanisoles como contaminantes de alimentos
data del año 1966, cuando Engel y colaboradores informaron de la presencia de 2,3,4,6-TeCA en partidas de
huevos y pollo con un desagradable sabor a moho
(Engel et al., 1966).
Más tarde se demostró que el 2,3,4,6-TeCA era el agente responsable del mal olor de un lote de pollos (Curtis
et al., 1972 y 1974). Estos autores demostraron que la
formación de este compuesto podía tener lugar a partir
de 2,3,4,6-TeCP por hongos filamentosos que crecían
sobre el pollo como Penicillium crustosum, Aspergillus
sydowi y Scopulariopsis brevicaulis. Estos microorganismos también podían metilar PCP.
En un trabajo paralelo Gee y Peel (1974) aislaron a partir de restos de comida de la basura en un restaurante
un total de 116 aislados fúngicos pertenecientes a un
total de 26 especies. De ellos 99 (el 85.3%) podían
metabolizar 2,3,4,6-TeCP, mientras que 68 de 116
(58.6%) metilaban este compuesto a 2,3,4,6-TeCA, siendo las especies más eficientes en ese proceso
Penicillium cor ylophilum, Paecilomyces variotii y
Aspergillus sydowi.
También se ha demostrado la implicación del 2,4,6-TCA
y el 2,3,4,6-TeCA en el desagradable olor y sabor de un
lote de frutas secas. En este caso se concluyó que
estos compuestos se originaron a par tir de los clorofenoles presentes en grandes cantidades en los embalajes de cartón reciclado utilizados, de donde pasaron a
los alimentos (Whitfield et al., 1985; Tindale et al.,
1989). El microorganismo identificado como responsable fue el hongo Paecilomyces variotii (Whitfield et al.,
Informe Técnico 43
EN EL CORCHO
1991).
También se ha demostrado la presencia de cloroanisoles
en una par tida brasileña de café contaminada con un
desagradable olor fúngico (Spadone et al., 1990).
Estos compuestos también han sido señalados como
productores de olores y sabores desagradables en agua
para el consumo humano en Suecia (Nystrom et al.,
1992). Así, el análisis de muestras de agua, tanto cloradas como no cloradas, permitió detectar niveles significativos de 2,4,6-TCA. Este estudio muestra que este
compuesto está presente en los ecosistemas acuáticos
de agua dulce (ríos y lagos) de Suecia. Los autores indican que el 2,4,6-TCA probablemente se originaría por
metilación de 2,4,6-TCP, el cual podría aparecer en las
muestras de agua como consecuencia del proceso de
cloración. En este estudio se aislaron varios microorganismos responsables de la metilación del 2,4,6-TCP:
hongos filamentosos de los géneros Acremonium,
Phialophora y Penicillium y sorprendentemente, también
varios actinomicetos con esta capacidad.
2.- RESULTADOS Y ANÁLISIS
APARTADO 2A: CARACTERIZACIÓN DE LA MICROBIOTA ASOCIADA A MUESTRAS DE CORCHO EXTREMEÑO.
Objetivo: Dado el escaso conocimiento de la microbiota
asociada a corcho en la Comunidad de Extremadura, pretendíamos profundizar en el análisis de la evolución de la
población microbiana a lo largo del proceso de fabricación del tapón, así como caracterizar aquellos grupos de
microorganismos aislados que pudieran ser de interés.
2A.1.- Aislamiento de microorganismos a partir de muestras de corcho.
Nuestro estudio comenzó con el aislamiento de microorganismos a partir de muestras de corcho correspondientes a distintas etapas del proceso de fabricación de tapón
de corcho aglomerado. Se aislaron un total de 55 microor-
ganismos diferentes, inicialmente seleccionados en base
a propiedades morfológicas y/o fisiológicas fácilmente
observables y típicas de cada grupo.
De esta manera inicialmente seleccionamos un total de
69 aislados que parecían diferentes y que fueron artificialmente agrupados como sigue:
- Hongos filamentosos. Se seleccionaron en base a características morfológicas macroscópicas un total de 25 aislados (denominados F1 a F25) que pertenecieron a 14
especies diferentes (ver apartado 2A.2.1).
- Levaduras. Un total de 11 aislados, llamados Y1 a Y11,
que correspondieron a ocho cepas diferentes (ver tabla
2.2)
2A.2.2. Su identificación se llevó a cabo mediante la
secuenciación del ADNr 26S.
- Bacterias no filamentosas. Aislamos 20 cepas (B1 a
B20). Se seleccionaron en base a forma y coloración de
la colonia en medio PCA, crecimiento a 30 ó 37ºC, tinción
de Gram, producción de endosporas y morfología celular.
- Finalmente, aislamos un total de 13 actinomicetos, (A1
a A13), seleccionados en base a su típica morfología filamentosa y el desarrollo de micelio en medio sólido. Los
caracteres empleados en su diferenciación fueron: color
de micelio sustrato y micelio aéreo, capacidad de esporulación y producción de exudado en medio MEY sólido, así
como la producción de pigmentos en medio YPD líquido.
2A.2.- Caracterización de los microorganismos aislados.
2A.2.1.- Identificación de los hongos filamentosos aislados
de corcho.
La identificación, en colaboración con la Colección
Española de Cultivos Tipo (CECT), se llevó a cabo en base
a aspectos morfológicos de la colonia, características
morfológicas macro y microscópicas del micelio y propiedades fisiológicas (capacidad de crecimiento en distintos
medios a diferentes temperaturas).
Tabla 2.1. Listado de las diferentes especies de hongos filamentosos aisladas a partir de corcho.
AISLADO
ESPECIE
DEPÓSITO EN LA CECT
F1, F2, F4, F5, F10
F3
F6
F7, F20, F25
F8
F11
F12
F13, F17
F14, F24
F15, F22, F23
F16
F18
F19
F21
Penicillium decumbens
Acremonium strictum
Fusarium oxysporum
Trichoderma longibrachiatum
Cladosporium oxysporum
Mucor plumbeus
Trichoderma viride
Chrysonilia sitophila
Penicillium purpurogenum
Penicillium citreonigrum
Paecilomyces viridis
Verticillium sp.
Penicillium chrysogenum
Mortierella alpina
Aislado F2: CECT 20418
CECT 20419
CECT 20420
CECT 20421
CECT 20422
CECT 20423
CECT 20427
CECT 20428
CECT 20429
CECT 20430
Para la identificación a nivel de especie del aislado F18
recurrimos a la secuenciación de su ADNr 28S, mientras
que las especies de Trichoderma se identificaron mediante un análisis RFLP de la región del ADNr 5.8S que contiene las regiones espaciadoras ITS1 e ITS2.
Los hongos aislados pertenecían a 14 especies diferentes (ver tabla 2.1). El género dominante fue Penicillium
con un total de cuatro especies aisladas. A continuación
destacaba el género Trichoderma (dos especies), mientras que sólo se aisló una especie de los géneros
Acremonium, Fusarium, Cladosporium, Mucor, Chrysonilia,
Paecilomyces, Verticillium y Mortierella.
En general se trata de hongos cosmopolitas que se pueden encontrar en suelo, aire y restos vegetales, especialmente cuando las condiciones ambientales son de humedad elevada. Muchos de ellos ya habían sido aislados de
corcho por otros autores (ver tabla 1.1 en introducción),
aunque hay que destacar que algunas especies como P.
citreonigrum, M. alpina o Verticillium sp. han sido detectadas en corcho por primera vez.
2A.2.2.- Identificación de las levaduras aisladas de corcho.
La identificación se llevó a cabo mediante la secuenciación
parcial de una región del ADN ribosomal 28S que incluye las
regiones D1 y D2. Las especies identificadas se recogen en la
Tabla 2.2. Listado de las diferentes especies de levaduras aisladas a partir de corcho.
AISLADO
ESPECIE
TIPO
Nº DE ACCESIÓN EN GENBANK
Y1
Cryptococcus sp. Y1
Basidiomiceto
AY167602
Y2
Rhodosporidium kratochvilovae
Basidiomiceto
AY167603
Y3
Debaryomyces hansenii var. fabryi
Ascomiceto
AY167604
Y4
Sporobolomyces nylandii
Basidiomiceto
AY167605
Y5
Rhodotorula slooffiae
Basidiomiceto
AY167606
Y6, Y9
Sporobolomyces salmonicolor
Basidiomiceto
AY167607
Y7, Y8
Sporidiobolus johnsonii
Basidiomiceto
AY167608
Y11
Aureobasidium sp. Y11
Levadura negra
(Hongo imperfecto?)
AY167611
tabla 2.2. Apreciamos como la mayor parte de las levaduras
aisladas son basidiomicetos, con la excepción del aislado Y3
perteneciente a los hongos ascomicetos, y del aislado Y11
perteneciente al enigmático grupo de las levaduras negras de
clasificación incierta, aunque algunos investigadores incluyen
el género Aureobasidium dentro de los hongos imperfectos
(Muñoz et al., 1996).
Un total de seis levaduras se identificaron a nivel de especie,
mientras que dos de ellas fueron sólo identificadas a nivel de
género y posiblemente se trate de nuevas especies.
2A.2.3.- Caracterización de las bacterias filamentosas aisladas
de corcho.
Se aislaron un total de 13 bacterias filamentosas con una
clara capacidad de formar micelio, y que por tanto se seleccionaron como actinomicetos.
De ellas únicamente se identificaron tres que para nosotros
tenían algún interés como microorganismos con capacidad
para degradar ácido vainíllico y producir guayacol (datos no
mostrados). En concreto, se trataba de los actinomicetos A3,
A5 y A13.
Para su identificación se secuenció su ADNr 16S. Las
secuencias obtenidas han sido depositadas en el
GenBank con las calves de acceso AY154478 (ADNr 16S
del actinomiceto A3) y AY154479 (la entrada uno corresponde al ADNr 16S del actinomiceto A5 y la entrada dos
al ADNr 16S del actinomiceto A13).
Las tres secuencias mostraron una homología mayor del
97% con secuencias de ADNr 16S de varias especies del
género Streptomyces. Por tanto, podemos afirmar que los
tres actinomicetos analizados pertenecen al género
Streptomyces y por ello han sido denominados
Streptomyces sp. A3, Streptomyces sp. A5 y
Streptomyces sp. A13.
2A.2.4.- Caracterización de las bacterias no filamentosas
aisladas de corcho.
Tradicionalmente las bacterias no filamentosas son el
grupo de microorganismos al que menos interés se ha
prestado en cuanto a su posible papel en el cork taint. En
nuestro caso obtuvimos 20 aislados diferentes, pero
dado su escaso interés como posibles productores de cloroanisoles nuestro estudio se centró en identificar aquellas cepas que pudieran llevar a cabo la degradación del
ácido vainíllico, como posibles responsables de la contaminación del corcho por guayacol.
Informe Técnico 45
EN EL CORCHO
Tabla 2.3. Número de microorganismos totales aislados a partir de las diferentes muestras correspondientes
al proceso de fabricación de tapón de corcho aglomerado.
MUESTRA
Nº DE MICROORGANISMOS TOTALES/
GRAMO DE CORCHO
(A) plancha no procesada de corcho crudo con corteza
3.57 (± 1.21) x 105
(B) plancha cocida (hervida)
1.17 (± 0.45) x 105
(C) plancha almacenada en bodega durante 3 semanas
6.91 (± 2.22) x 106
(D) plancha almacenada a la intemperie un periodo
de tiempo indeterminado
6.67 (± 2.34) x 106
(E) granulado de corcho de 2-4 milímetros de diámetro
1.35 (± 0.41) x 104
(F) tapón aglomerado y suavizado
1.55 (± 0.68) x 101
(G) tapón aglomerado suavizado y tratado
con SO2 (producto final)
0.40 (± 0.29) x 101
- El número de microorganismos decae notablemente a
partir de la obtención del granulado (muestra E), posiblemente debido a los procesos químicos (mezcla con látex,
poliuretano, colas, etc) y físicos (desintegración mecánica) a que se somete el granulado para la obtención del
tapón, y que son nocivos para los microorganismos.
- En el producto final (tapón aglomerado tratado con SO2 o
muestra G) el nivel de microorganismos es prácticamente
nulo. Sólo ocasionalmente se aislaron hongos filamentosos
o bacterias no filamentosas en un número máximo de 4-6
por gramo. En esta etapa nunca se detectaron levaduras ni
actinomicetos.
- El mayor número de microorganismos correspondió a la
muestra almacenada en bodega (muestra C) donde se
detectaron los siguientes valores de microorganismos:
* 2.23 (± 0.61) x 104 bacterias no filamentosas.
* 6.19 (± 2.36) x 106 hongos filamentosos.
* 6.90 (± 3.25) x 105 actinomicetos.
* 5.35 (± 1.35) x 103 levaduras.
En esta etapa y a diferencia con el resto de las muestras
los hongos filamentosos constituyen el grupo predominante.
Esto es debido a que las condiciones de baja temperatura
(20-24ºC) y alta humedad en bodega favorecen su crecimiento masivo.
- Hay que destacar también que las poblaciones de bacterias no filamentosas predominan siempre sobre los actinomicetos. Esta tendencia se invierte en la muestra C, donde
el número de actinomicetos se dispara y llega a triplicar el
número de otras bacterias. Aunque no hay una explicación
clara para este fenómeno podemos suponer que el gran
aumento de hongos filamentosos en esta fase podría resultar en la producción de antibióticos que llegarían a limitar el
crecimiento bacteriano, excepto en el caso de los actinomicetos, grupo que por su alta capacidad de producción de
antibióticos han desarrollado unos elevados niveles de
resistencia.
- Finalmente mencionemos que excepto en la muestra C el
grupo dominante es el de las bacterias no filamentosas, a
diferencia de lo descrito por otros autores, que apuntan a
los hongos filamentosos como población dominante a lo
largo del proceso de fabricación.
2A.3.1.- Evolución de la población de hongos filamentosos
a lo largo del proceso.
Tradicionalmente se ha considerado que los hongos filamentosos jugarían un papel fundamental en el proceso de
maduración del corcho y en la calidad final del tapón (Lee
y Simpson, 1993; Silva Pereira et al., 2000a). Por ello,
una vez realizada la cuantificación de la población de hongos filamentosos decidimos tratar de determinar que
cepas aparecían en cada etapa del proceso de fabricación, a fin de determinar la posible predominancia de
alguna especie en cada paso.
Los resultados obtenidos se recogen en la tabla 2.4. Las
conclusiones que pudimos obtener de este estudio son:
- Todas las especies pudieron ser aisladas a partir de corteza (muestra A).
- Además, dos de los aislados, Mortierella alpina y Mucor
plumbeus, sólo pudieron ser detectados en esta etapa.
- El cocido o calentamiento del corcho (muestra B) provoca la desaparición de buena parte de los hongos filamentosos, puesto que un total de cinco especies nunca
pudieron ser aisladas en esta etapa.
- La posterior incubación en bodega o a la intemperie provoca que dos de estas especies vuelvan a aparecer en
corcho (Acremonium strictum y Verticillium psalliotae).
- El tratamiento químico y/o mecanico que sufren las
muestras en la elaboración del tapón provoca en las
muestras E y F la desaparición de un buen número de
especies, manteniéndose sólo aquellas más resistentes a
este tipo de tratamientos.
- En el producto final (muestra F) sólo se han podido
detectar de manera ocasional Cladosporium oxysporum, Penicillium citreonigrum y Trichoderma longibrachiatum.
- El tratamiento del tapón con SO 2 es efectivo, puesto
que el número de microorganismos en el producto
final se reduce considerablemente. Este tratamiento
también produce una disminución de la variedad de
especies detectadas, ya que pasamos de siete espe-
Tabla 2.4. Abundancia relativa (%) de las distintas especies de hongos filamentosos detectados en cada etapa
del proceso de fabricación del tapón de corcho aglomerado.
HONGO FILAMENTOSO
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA MUESTRA D MUESTRA E MUESTRA F MUESTRA G
C
Acremonium strictum
3.0 (0.2)
ND
6.6 (0.4)
2.8 (0.3)
10.4 (1.2)
6.3 (0.4)
Fusarium oxysporum
2.1 (0.1)
ND
Mortierella alpina
1.8 (0.2)
ND
Mucor plumbeus
2.4 (0.2)
ND
5.2 (0.1)
8.4 (0.7)
12.9 (0.5)
9.2 (0.7)
10.2 (0.2)
15.2 (0.9)
14.8 (0.7)
2.8 (0.1)
4.0 (0.4)
12.1 (0.5)
Trichoderma longibrachia-
13.2 (1.0)
20.3 (1.6)
tum
10.3 (0.9)
18.5 (1.4)
Trichoderma viride
3.1 (0.4)
4.4 (0.1)
0.8 (0.1)
57.4 (3.9)
6.4 (0.3)
ND
ND
ND
2.5 (0.2)
3.4 (0.1)
3.0 (0.1)
4.6 (0.2)
1.0 (0.1)
11.3 (0.6)
9.6 (0.6)
0.8 (0.2)
ND
ND
ND
6.1 (0.3)
2.2 (0.2)
1.3 (0.3)
ND
15.0 (1.0)
20.4 (1.7)
38.5 (2.8)
34.2 (4.6)
1.6 (0.2)
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
6.0 (0.7)
ND
ND
ND
10.5 (0.8)
ND
8.4 (0.5)
ND
20.8 (1.2)
38.0 (4.1)
38.6 (3.2)
57.4 (7.8)
9.9 (1.0)
ND
3.0 (0.2)
ND
17.9 (2.0)
22.4 (3.3)
ND
ND
5.1 (0.4)
10.2 (1.2)
7.2 (0.8)
8.4 (1.3)
3.1 (0.4)
6.8 (0.7)
3.0 (0.5)
ND
3.2 (0.4)
ND
ND
ND
Muestras de corcho: (A) plancha no procesada de corcho crudo con corteza; (B) plancha cocida (hervida). (C) plancha almacenada en bodega
durante tres semanas; (D) plancha almacenada a la intemperie un tiempo indeterminado; (E) muestra de corcho granulado; (F) tapón aglomerado
y suavizado; (G) tapón aglomerado suavizado tratado con SO2 (producto final). Los valores mostrados son la media de estimaciones hechas por
duplicado en 3 experimentos independientes. La desviación estándar se muestra entre paréntesis.
ND: no detectado.
nas; (D) plancha almacenada a la intemperie un
tiempo indeterminado; (E)
muestra de corcho granuFigura 2.1. Evolución lado; (F) tapón aglomerade la población de
do y suavizado; (G) tapón
microorganismos a lo aglomerado suavizado tralargo del proceso de
tado con SO2 (producto
fabricación del tapón final). Los valores mostraaglomerado de cordos son la media de esticho. (A) plancha no
maciones hechas por
procesada de corcho duplicado en 3 experimencrudo con corteza;
tos independientes. La
(B) plancha cocida
desviación estándar se
(hervida). (C) plancha muestra entre paréntesis.
almacenada en bodega durante tres semaInforme Técnico 47
EN EL CORCHO
APARTADO 2B: ANÁLISIS DE LA FORMACIÓN DE 2,4,6TRICLOROANISOL POR HONGOS FILAMENTOSOS AISLADOS DE CORCHO.
Objetivo: El objetivo de este apartado era profundizar en
el conocimiento del origen y los posibles mecanismos
implicados en la producción de 2,4,6-TCA por hongos
filamentosos aislados de corcho.
2B.1.- Análisis de la formación de 2,4,6-TCA por hongos
filamentosos creciendo directamente sobre corcho.
Aunque son varias las hipótesis que intentan explicar el
origen del 2,4,6-TCA en corcho, los datos disponibles en
la bibliografía, sin ser concluyentes, indicaban que el
mecanismo más probable para la formación del 2,4,6TCA sería la O metilación de 2,4,6-TCP. Con estos antecedentes decidimos ensayar la posible capacidad de
todos los hongos filamentosos aislados para realizar
esta bioconversión, cuando creciesen directamente
sobre corcho. Para ello se desarrolló un ensayo que nos
permitió imitar las condiciones de crecimiento de los
hongos filamentosos en bodega durante el proceso de
fabricación del tapón. Los resultados obtenidos se recogen en la tabla 2.5.
En ella vemos como 11 de las 14 especies analizadas
incrementaban significativamente los niveles de 2,4,6TCA en corcho cuando el granulado de par tida fue suplementado con 2,4,6-TCP. Por el contrario, las muestras
de corcho no inoculadas con hongo filamentoso, o aquellas a las que no se adicionó 2,4,6-TCP, no mostraron
un incremento apreciable de los niveles endógenos de
2,4,6-TCA. Por tanto, podemos concluir que la conversión de 2,4,6-TCP a 2,4,6-TCA es un proceso biológico
mediado por la acción, en nuestro caso, de un hongo
filamentoso. En función de los resultados obtenidos los
hongos filamentosos se clasificaron en 4 grupos:
- Grandes productores de 2,4,6-TCA. Aquellas especies
como T. longibrachiatum, T. viride y F. oxysporum que
podían bioconver tir más del 25% del precursor.
- Moderados productores. La eficiencia de bioconversión
oscilaba entre el 10 y el 25%. En este grupo se incluían
A. strictum, C. sitophila y C. oxysporum.
- Bajos productores, cuando el grado de bioconversión
era del 5-10%. En este grupo se encontraban P. viridis,
P. chr ysogenum y V. psalliotae.
- Finalmente los no productores. Aquellos como M. alpina, M. plumbeus y P. decumbens para los que el porcentaje de bioconversión fue siempre menor del 5%, ya que
sólo pudieron ser detectadas trazas de 2,4,6-TCA (la
diferencia del contenido en 2,4,6-TCA respecto del control no era superior al 0.15%). Estas pequeñas variaciones podrían ser achacadas a variaciones normales del
método de medida. Es necesario indicar que de estas
tres cepas sólo P. decumbens mostró capacidad para
crecer sobre granulado de corcho, por lo que la ausencia de 2,4,6-TCA en el caso de los cultivos de M. alpina
y M. plumbeus podría ser debida a una falta de crecimiento más que a una incapacidad para sintetizar 2,4,6TCA. Sin embargo, puesto que en cultivos en medio
líquido de estas tres especies, tampoco se detectaron
niveles apreciables de 2,4,6-TCA podemos concluir que
su ausencia en los cultivos sobre corcho debería atri-
Tabla 2.5. Análisis por cromatografía de gases-masas de los niveles de 2,4,6-TCA formado a partir de 2,4,6-TCP por hongos
filamentosos creciendo directamente sobre granulado de corcho.
HONGO FILAMENTOSO
Muestra de corcho no inoculada
Acremonium strictum
Fusarium oxysporum
Mortierella alpina
Mucor plumbeus
Trichoderma longibrachiatum
Trichoderma viride
2,4,6-TCAa
2,4,6-TCAa BIOCONVERSION (%) DE CRECIMIENTO SOBRE
(- 2,4,6-TCP) (+ 2,4,6-TCP) 2,4,6-TCP EN 2,4,6-TCA
CORCHO
9.9
11.0
18.0
12.4
6.0
5.5
6.3
9.9
9.7
11.0
9.5
6.4
20.5
17.2
6.5
10.1
153.4
128.2
155.5
292.5
6.6
6.6
88.7
86.5
143.8
10.6
116.6
396.1
278.9
75.5
0
14.24
11.02
14.31
28.65
0.11
0.03
7.88
7.68
13.28
0.11
11.02
37.56
26.17
6.90
ND b
+c
+
+
+
-d
+
+
+
+
+
+
+
a Los valores indicados en ng/g de corcho son la media de medidas hechas por duplicado en dos experimentos independientes según la metodología descrita por Álvarez-Rodríguez et al., (2002a)
b ND, no detectado.
c El número de UFCs por gramo de corcho tras la incubación fue mayor de 5.5 x 105.
d El número de UFCs por gramo de corcho tras la incubación fue menor de 4.5 x 105.
buirse a la incapacidad de estas cepas para su formación.
2B.2.- Formación de 2,4,6-TCA a partir de distintos precursores.
Diversos autores han postulado que el 2,4,6-TCA podría formarse por varios mecanismos diferentes a partir de distintos precursores. Por ello, una vez que habíamos identificado
a T. longibrachiatum como el hongo filamentoso que podía
producir con mayor eficiencia 2,4,6-TCA por O metilación de
2,4,6-TCP, y que además presentaba una alta capacidad de
crecimiento sobre corcho, decidimos ensayar la posible existencia en este hongo de otros posibles de mecanismos de
formación de 2,4,6-TCA. Para ello, muestras de corcho conteniendo diferentes precursores, se inocularon con este
hongo (tanto en ausencia como en presencia de hipoclorito
sódico como agente halogenante) determinándose tras un
periodo de incubación adecuado el contenido de 2,4,6-TCA
del corcho.
Los resultados de este experimento (tabla 2.6) fueron los
siguientes:
- Los diclorofenoles, sólos o en presencia de hipoclorito, no
son sustratos efectivos para la formación de 2,4,6-TCA
mediante un mecanismo de O metilación y halogenación.
- Tampoco detectamos niveles apreciables de 2,4,6-TCA en
muestras que contenían como posibles precursores compuestos clorados como el hexaclorociclohexano, hexaclorobenceno, pentacloroanisol, 2,3,4,6-tetracloroanisol, PCP o
2,3,4,6-TeCP. En estos casos el 2,4,6-TCA podría haberse
formado mediante un proceso degradativo que implicaría
necesariamente la O metilación y deshalogenación del precursor.
- Entre los triclorofenoles ensayados el único sustrato efectivo para la formación de 2,4,6-TCA fue el 2,4,6-TCP: el nivel
de conversión detectado era del 34.72%.
Tabla 2.6. Análisis por cromatografía de gases-masas de la formación de 2,4,6-TCA por el hongo filamentoso
T. longibrachiatum a partir de diferentes posibles precursores.
PRECURSOR
2,3-DCP
2,3-DCP
2,3-DCP
2,4-DCP
2,4-DCP
2,4-DCP
2,5-DCP
2,5-DCP
2,5-DCP
2,6-DCP
2,6-DCP
2,6-DCP
3,4-DCP
3,4-DCP
3,4-DCP
Hexaclorociclohexano
Hexaclorobenceno
PCP
PCA
2,3,4,6-TeCP
2,3,4,6-TeCA
2,3,6-TCP
2,4,5-TCP
2,4,6-TCP
Anisol
Anisol
Anisol
Fenol
Fenol
Fenol
HIPOCLORITO T. LONGIBRACHIATUM
SÓDICO
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
2,4,6-TCAa
BIOCONVERSIÓN (%) DEL PRECURSOR EN 2,4,6-TCAb
8.6c
9.6
13.2
8.0
9.6
8.0
4.5
8.9
4.7
7.2
9.7
15.5
6.2
3.1
3.2
8.3
9.1
6.8
7.0
7.0
9.7
7.3
9.9
4.6
1.5
7.5
355.8
8.8
18.8
15.5
17.4
25.2
13.6
0
0.10
0
0
0.03
0
0
0.11
0.83
0
0
0
0
0.05
0
0
0
0.11
0
0.13
0
0
0
34.72
0
1.02
0.69
0.88
1.66
0.50
Informe Técnico 49
EN EL CORCHO
a Los valores mostrados en ng/g de corcho son la media de dos experimentos independientes realizados por duplicado según la metodología descrita por Álvarez-Rodríguez et al., (2002a).
b Los valores indicados son el resultado de restar en cada caso el contenido endógeno de 2,4,6-TCA del corcho.
c Valor considerado como contenido endógeno de 2,4,6-TCA del granulado de corcho utilizado en este experimento.
- Tampoco detectamos niveles apreciables de 2,4,6-TCA en
cultivos suplementados con anisol (ni siquiera en presencia
de hipoclorito), compuesto a partir del cual el 2,4,6-TCA
podría haberse producido directamente por halogenación.
Una situación similar se dio en los cultivos desarrollados
en presencia de fenol. En este caso la producción de
2,4,6-TCA implicaría una reacción de O metilación y una
halogenación para introducir átomos de cloro en la molé-
cula.
Por tanto, podemos decir que en el hongo T. longibrachiatum el único mecanismo efectivo detectado para la formación de 2,4,6-TCA es la O metilación de 2,4,6-TCP.
Dicha reacción, que resulta en la introducción de un
grupo metilo sobre el grupo hidroxilo del clorofenol,
podría ser llevada a cabo por un enzima metiltransferasa
que podría usar S-adenosilmetionina (SAM) como dona-
Figura 2.2. Probable mecanismo de formación por T. longibrachiatum de 2,4,6-TCA por O
metilación de 2,4,6-TCP en una reacción catalizada por una actividad enzimática O-metiltransferasa (2,4,6-TCP metiltransferasa) que quizás pudiera usar SAM como donador de
grupos metilo.
dor de grupos metilo, como podemos apreciar en la figura 2.2. Una actividad enzimática similar, implicada en la
formación de anisoles y tioanisoles, ha sido detectada
en bacterias aisladas a partir de lodos del Mar Báltico
(Neilson et al., 1988).
2B.3.- Bioconversión de 2,4,6-TCP a 2,4,6-TCA en medio
líquido y su regulación.
Los resultados resumidos en el apartado 2B.1 fueron
importantes porque demostraban la capacidad de varios
hongos filamentosos, y más específicamente de T. longibrachiatum, de producir 2,4,6-TCA en unas condiciones
naturales similares a las de maduración del corcho en
bodega.
Sin embargo, los ensayos a partir de cultivos sobre corcho nos planteaban varios problemas metodológicos graves: incubaciones muy largas en el tiempo (25-30 días) y
un complejo y costoso procedimiento de extracción del
2,4,6-TCA de las muestras.
Para evitar estos inconvenientes decidimos ensayar la
posible producción de 2,4,6-TCA en medio líquido y su
valoración a partir de sobrenadantes de cultivos por
HPLC, equipamiento disponible en nuestro laboratorio.
2B.3.1.- Desarrollo de un método para identificar 2,4,6-TCP
y 2,4,6-TCA por HPLC en sobrenadantes de medios de cultivo.
Nuestro primer paso consistió en la puesta a punto de un
método de HPLC que nos permitiera separar eficazmente
en sobrenadantes de cultivos el 2,4,6-TCP y el 2,4,6-TCA,
(además de otros compuestos como el 2,3,4,6-TeCP y el
2,3,4,6-TeCA utilizados como estándares internos).
La columna elegida fue una columna de fase reversa
Zórbax SB-C8 y se ensayaron diferentes fases móviles
(metanol:agua, acetonitrilo:agua y acetonitrilo:ácido fórmico 5mM) en distintas proporciones, y tanto en régimen
isocrático (lineal) como en gradiente. Tras varios intentos
se consiguió una eficaz separación de estos compuestos, que eluían en condiciones de régimen isocrático con
una fase móvil de metanol:agua (75:25) con los siguientes tiempos de retención: 2,3,4,6-TeCP (2.7 minutos);
2,4,6-TCP (3.2 minutos), 2,4,6-TCA (5.8 minutos) y
2,3,4,6-TeCA (6.8 minutos), como podemos apreciar en
la figura 2.3.
Figura 2.3. Perfil cromatográfico de elución por HPLC
de varios clorofenoles y cloroanisoles a una concentración de 50 mg/ml en una columna Zórbax SB-C8. La
separación se realizó en una fase móvil de
metanol:agua (75:25) a un flujo de 1 ml/minuto en régimen isocrático. Los compuestos se detectaron a una
longitud de onda de 230 nm.
2B.3.2.- Análisis de la bioconversión de 2,4,6-TCP en cultivos en medio líquido.
Una vez que disponíamos de un método de análisis por
HPLC y a fin de profundizar más en el mecanismo de la
reacción de O metilación decidimos comprobar si T. longibrachiatum podía producir 2,4,6-TCA en medio líquido. Para
ello realizamos en paralelo dos cultivos en caldo extracto
de malta: en uno adicionamos el precursor 2,4,6-TCP y en
otro no.
A continuación tomamos muestras a distintos tiempos de
cultivo en las que determinamos los siguientes parámetros:
crecimiento (determinado como peso seco de micelio), niveles de 2,4,6-TCP y 2,4,6-TCA en sobrenadantes y niveles de
la hipotética actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa asociada
a micelio que sería responsable de la formación de 2,4,6TCA. Los resultados se recogen en las figuras 2.4 y 2.5.
La figura 2.4 nos muestra el resultado de analizar por
HPLC los sobrenadantes del cultivo desarrollado en presencia de 2,4,6-TCP en los que detectamos un compuesto cuyo tiempo de retención coincidía con el del 2,4,6TCA. Así, apreciamos como en un cultivo de cero horas
(panel A) se aprecia un pico muy evidente de 2,4,6-TCP.
Este pico decrece rápidamente a las 24 horas (panel B),
a la vez que comienza a detectarse un pico incipiente de
2,4,6-TCA. Los mayores niveles de este compuesto se
detectan entre las 48 y 72 horas de cultivo, momento en
que los niveles de 2,4,6-TCP son indetectables (panel C).
La identificación de este compuesto como auténtico
2,4,6-TCA se basó en los siguientes datos:
- Su presencia en el medio de cultivo es dependiente de
la adición del precursor 2,4,6-TCP, no detectándose
nunca en caso contrario (datos no mostrados).
- La adición a un sobrenadante de cultivo de 72 horas de
una pequeña cantidad de 2,4,6-TCA exógeno produjo un
incremento del pico identificado como 2,4,6-TCA (panel D
de la figura 2.4).
- Este compuesto migra como auténtico 2,4,6-TCA en cromatografía en capa fina (datos no mostrados).
De las gráficas mostradas en la figura 2.5 podemos
extraer varias conclusiones:
- El hongo T. longibrachiatum tiene capacidad para transformar el 2,4,6-TCP presente en el medio de cultivo,
como se puede concluir al ver su desaparición progresiva
en el panel A. De hecho este compuesto no es detectado
después de las 60 horas de cultivo.
- Aproximadamente el 32% del 2,4,6-TCP es transformado a 2,4,6-TCA. Podemos apreciar como en el panel A ya
detectamos la presencia de este compuesto a las 48
horas de cultivo, acumulándose de manera progresiva
para alcanzar un máximo en torno a las 60-72 horas.
Posteriormente los niveles detectados decaen ligeramente hasta el final de la fermentación (120 horas). No
sabemos a que se debe esta ligera disminución de los
niveles de 2,4,6-TCA en el cultivo. Podría deberse a un
proceso de fijación al micelio, o a la posible evaporación
al abrir los matraces para tomar las muestras (el 2,4,6TCA es un compuesto relativamente volátil). Tampoco se
puede descartar una posible degradación, aunque creemos que es bastante improbable dada la gran estabilidad química de este compuesto.
- Es muy importante reseñar que no existe una correlación directa entre la cantidad de 2,4,6-TCP que desaparece del cultivo y la cantidad de 2,4,6-TCA que se produce.
El 68% restante de 2,4,6-TCP podría ser degradado, o
alternativamente convertirse en otro producto no detectado que fuese secretado al medio o metabolizado.
Sin embargo, debemos mencionar que ensayos de mineralización de 2,4,6-TCP [C14] por T. longibrachiatum realizados en el laboratorio de la Dra. Mª Jesús Martínez
(CIB, CSIC, Madrid) resultaron negativos. Por tanto, podemos concluir que el 2,4,6-TCP que no es convertido a
2,4,6-TCA no se degrada hasta CO2. Este dato puede
sugerir que parte del 2,4,6-TCP podría ser degradado
hasta algún producto intermediario que pudiera ser incor-
Informe Técnico 51
EN EL CORCHO
Figura 2.4. Cromatogramas de HPLC correspondientes a sobrenadantes de un cultivo de T. longibrachiatum. (A).
Cultivo de 0 horas. (B). Cultivo de 24 horas. (C) Cultivo de 72 horas y (D) cultivo de 72 horas al que se ha añadido
2,4,6-TCA exógeno para confirmar la identidad de este compuesto. Los picos correspondientes a 2,4,6-TCP y 2,4,6TCA se indican con flechas.
Figura 2.5. Comportamiento
de un cultivo de T. longibrachiatum crecido en presencia (A) y ausencia (B) de
2,4,6-TCP. Las gráficas mostradas son el resultado de
analizar por duplicado muestras correspondientes a tres
experimentos independientes. Los niveles de 2,4,6TCP y 2,4,6-TCA se determinaron por HPLC a partir de
sobrenadantes de cultivos.
porado como material celular, aunque la confirmación de
esta hipótesis requeriría complejos estudios.
- La producción de 2,4,6-TCA es absolutamente dependiente de la presencia de 2,4,6-TCP en el medio de cultivo (nótese la ausencia de 2,4,6-TCA en el panel B). Este
dato sugiere que al menos en las condiciones de nuestro
ensayo no hay síntesis endógena de 2,4,6-TCA a partir
de precursores celulares.
- Como era previsible detectamos asociada a micelio una
actividad O-metiltransferasa, que denominamos 2,4,6-TCP
metiltransferasa (ver panel A). Esta enzima sería la responsable de la O metilación del precursor 2,4,6-TCP. Esta actividad
comienza a detectarse a las 36 horas de cultivo, alcanzando
su actividad máxima alrededor de las 48 horas, precediendo
por tanto en unas 12 a 24 horas la máxima acumulación de
2,4,6-TCA en sobrenadantes. A partir de las 48 horas, coincidiendo con la desaparición del precursor 2,4,6-TCP, esta actividad decae rápidamente. Este comportamiento, y el hecho
de que esta actividad es sólo residual en cultivos desarrollados en ausencia de 2,4,6-TCP, (ver panel B), sugiere que se
trata de un enzima inducible por sustrato.
- Finalmente, se aprecia como en el caso del cultivo desarrollado en presencia de 2,4,6-TCP existe inicialmente un retardo notable del crecimiento del hongo de unas 20-24 horas
(compárense los paneles A y B). Coincidiendo con la desaparición del 2,4,6-TCP, a partir de las 60 horas, ambos cultivos
tienen un comportamiento similar. De hecho, los máximos
niveles de crecimiento se producen con un pequeño desfase
de sólo 6 horas, entre las 60 y 72 horas de cultivo y son
parecidos en ambas condiciones. Estos datos sugieren un
claro efecto tóxico del 2,4,6-TCP sobre el hongo, efecto transitorio que sin embargo desaparece en cuanto los niveles de
2,4,6-TCP en el medio de cultivo son bajos o indetectables.
2B.3.3.- Regulación de la formación de 2,4,6-TCA por glucosa
y amonio en cultivos en medio líquido.
En un intento de profundizar en la regulación de la formación
de 2,4,6-TCA en T. longibrachiatum y dado el gran desconocimiento sobre los procesos implicados en la formación de
este compuesto, decidimos abordar el estudio de su posible
regulación por mecanismos generales, como la represión
catabólica por fuente de carbono (glucosa) o la represión por
fuente de nitrógeno (amonio). Para ello desarrollamos cultivos
en caldo extracto de malta, en presencia de 2,4,6-TCP (10
mg/ml), que fueron suplementados con glucosa (2%), amonio
(50 mM) y glucosa más amonio. De estos cultivos procedimos a tomar muestras de sobrenadantes a distintos tiempos, en las que determinamos crecimiento (peso seco de
micelio) y niveles de 2,4,6-TCP y 2,4,6-TCA.
Los resultados obtenidos se reflejan en la figura 2.6, de cuyo
análisis podemos extraer las siguientes conclusiones:
- La formación de 2,4,6-TCA no está sujeta a regulación por
glucosa (2%), amonio (50 mM) o una combinación de ambos,
puesto que la eficiencia de bioconversión obtenida en todos
los casos fue muy parecida, variando ligeramente entre el
29.2 y el 39.5%. De hecho, el nivel de 2,4,6-TCA detectado
en sobrenadantes de medios de cultivo es muy similar en
todos los paneles (A, B, C y D), aunque con ligeras variaciones.
- La desaparición del 2,4,6-TCP de sobrenadantes de medios
de cultivo no está sometida a regulación nutricional. No obstante, se aprecia un aumento en el nivel de crecimiento del
cultivo que va asociado a un incremento de la velocidad con
que el 2,4,6-TCP desaparece del medio (compárense los
paneles A y D). Este dato es perfectamente lógico: una mayor
tasa de crecimiento va a permitir una eliminación más veloz
Informe Técnico 53
EN EL CORCHO
APARTADO 2C: PURIFICACIÓN Y
CARACTERIZACIÓN DEL ENZIMA 2,4,6-TCP METILTRANSFERASA DE Trichoderma longibrachiatum
IMPLICADA EN LA FORMACIÓN DE 2,4,6-TRICLO-
tores. Resultados similares se obtuvieron con anisoles
como el PCA o el 2,4,6-TCA, aunque en este caso si
apreciamos una mayor actividad relativa (5.21% ±
0.28) respecto del control negativo.
ROANISOL.
Objetivo: El objetivo fundamental de esta parte de
nuestro estudio era la purificación y caracterización
de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa de
Trichoderma longibrachiatum implicada en la formación de 2,4,6-TCA.
2C.1.- Análisis de la inducción de la actividad 2,4,6-TCP
metiltransferasa implicada en la formación de 2,4,6TCA
Como se indica en el apar tado 2B.3.2, los resultados
mostrados en la figura 2.5 sugerían que la actividad
2,4,6-TCP metiltransferasa se compor taba como un
enzima inducible. Para tratar de confirmar esta posibilidad realizamos un experimento con un sistema de
células en reposo. Los resultados obtenidos (figura
2.7), indicaban claramente la inducción de la actividad
metiltransferasa por su sustrato 2,4,6-TCP. En dicha
figura se aprecia como en ausencia de 2,4,6-TCP la
actividad asociada a micelio es sólo residual, mientras
que por el contrario los niveles de actividad enzimática
detectados aumentaban considerablemente en micelio
inducido. El efecto inductor se apreciaba rápidamente
una hora después de la adición de 2,4,6-TCP y los
niveles de actividad aumentaban notablemente hasta
ocho horas después de la inducción, para descender a
continuación.
Una vez demostrado el carácter inducible de esta enzima nos planteamos analizar el posible efecto inductor
de varios clorofenoles, anisoles y otros compuestos
clorados, así como también de compuestos aromáticos no halogenados. Como se aprecia en la figura 2.8
el mayor efecto inductor correspondió al 2,4,6-TCP, al
que arbitrariamente atribuimos un valor inductor de
100. Otros clorofenoles clorados como el 2,4,5-TCP, el
2,3,4,6-TeCP y el PCP también mostraron un claro
efecto inductor.
Por el contrario, tanto el 2-CP como el resto de diclorofenoles ensayados no fueron buenos inductores, puesto que los valores de actividad relativa obtenidos oscilaban entre el 5.89% (± 0.94) para el 2-CP y el
13.75% (± 0.81) del 3,4-DCP. Tengamos en cuenta
que un cultivo no inducido (control negativo) mostró
una actividad relativa del 4.02% (± 0.28).
Otros compuestos clorados, derivados o no del benceno, como el hexaclorobenceno, el hexaclorociclohexano o el 1,3,5-triclorobenceno no actuaron como induc-
Figura 2.7. Inducción de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa de T. longibrachiatum por el sustrato 2,4,6TCP en un sistema de células en reposo.
Por otro lado, los compuestos aromáticos no clorados
(fenol, ácido vainíllico, guayacol y catecol) no actuaron
como inductores. Estos resultados sugieren que la
inducción de esta actividad enzimática es ejercida de
manera específica por clorofenoles, especialmente si
tienen tres o más átomos de cloro en su molécula.
Un estudio complementario consistió en determinar la
cantidad mínima de 2,4,6-TCP que podía inducir la síntesis del enzima. Para ello a un sistema de células en
reposo se añadieron cantidades de 0, 1, 2.5, 5, 7.5,
10, 12.5, 15, 20, 30 y 40 mg/ml de 2,4,6-TCP. La cantidad más baja de este compuesto que fue capaz de
inducir un aumento de la actividad fue 7.5 mg/ml. Los
niveles de máxima actividad se obtuvieron para valores
de inductor comprendidos entre 10 y 20 mg/ml, mientras que cantidades superiores tenían un efecto negativo y producían un descenso de la actividad catalítica
detectada, posiblemente debido a que a estas concentraciones se pone de manifiesto el carácter tóxico del
compuesto.
Figura 2.8. Análisis de
varios compuestos aromáticos como posibles inductores de la actividad enzimática 2,4,6-TCP
metiltransferasa. El mayor
efecto inductor observado
correspondió al 2,4,6-TCP
al que se asignó un valor
arbitrario de 100. Los restantes datos mostrados
son valores relativos respecto de ese valor. La actividad metiltransferasa se
determinó según la metodología descrita por Coque
et al., (2003).
2C.2.- Optimización del ensayo enzimático para la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa.
Los primeros ensayos para detectar la actividad 2,4,6TCP metiltransferasa se realizaron según el método de
Neilson et al. (1988). Los niveles así detectados eran
bajos (Álvarez-Rodríguez, 2001) por lo que se intentó
mejorar el rendimiento del ensayo enzimático. Para ello
analizamos el efecto de varios parámetros en la reacción: pH, temperatura, tiempo de reacción, adición de
distintos compuestos, concentración de sustrato (2,4,6TCP) y donador de grupos metilo S-adenosilmetionina
(SAM).
2C.2.1.- Efecto de distintos compuestos sobre la actividad
2,4,6-TCP metiltransferasa.
La tabla 2.7 muestra el efecto de varios compuestos
sobre dicha actividad. Podemos apreciar como la reacción es absolutamente dependiente de la presencia del
donador de grupos metilo SAM en la mezcla de reacción.
La presencia de EDTA, compuesto cuya inclusión en la
mezcla de reacción es esencial para la actividad metiltransferasa de Rhodococcus sp. 1395 (Neilson et al.,
1988) no tuvo el mismo efecto en nuestro caso. De
hecho, su adición provocó un ligero descenso de la actividad enzimática.
La adición de metiltetrahidrofolato (MTHF), compuesto
utilizado por algunas metiltransferasas como cofactor,
produjo un ligero aumento de la actividad enzimática.
Además su adición permitía contrarrestar el ligero efecto
negativo que el EDTA tenía sobre la actividad.
Por el contrario, varios agentes reductores con grupos tíol
como el ditiotreitol (DTT), el β-mercaptoetanol y la cisteína
no incrementaron la actividad.
El fluoruro de p-metilenfenilsulfonilo (PMSF), uno de los
inhibidores de serina-cisteína proteasas más ampliamente
utilizados (Turini et al., 1969) para evitar problemas de
digestiones proteolíticas en mezclas proteicas, tampoco
tenía un claro efecto inhibidor de la actividad, a diferencia
de lo que ocurre con otras metiltransferasas (James et
al., 1995). Sorprendentemente la utilización conjunta de
DTT y PMSF provocó un aumento del 47% en la actividad
obtenida, revertiendo el pequeño efecto inhibidor del
PMSF.
Finalmente, la inclusión de glicerol al 10% (p/v) supuso
un incremento de casi el 36% en los niveles de actividad,
supuestamente debido a un efecto estabilizador sobre el
enzima.
A la vista de estos resultados decidimos incluir en la mezcla de reacción glicerol (10%,), DTT y PMSF (1 mM). Por el
contrario, decidimos no incluir el EDTA en la mezcla de
reacción, ni tampoco el MTHF, ya que aunque éste tenía
cierto estimulante dejó de ser suministrado por los fabricantes.
2C.2.2.- Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad
Para determinar el efecto del pH sobre la actividad enzimática obtuvimos extractos proteicos en diferentes tampones que cubrían el rango de pH 5-10. Los resultados
Informe Técnico 55
EN EL CORCHO
obtenidos al valorar la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa de las distintas preparaciones se muestra en el
panel A de la figura 2.9. El enzima mostró su máximo
de actividad en un estrecho rango de pH de 8.2-8.5. A
pH 8.0 y 9.0 el enzima retenía un 83.3% de actividad y
un 87.5% respectivamente. El descenso de actividad era
acusado para pHs superiores a 9.0 o inferiores a 7.0.
De hecho a pH 5.0, 6.0 ó 10.0 la actividad enzimática
detectada era casi nula.
Por lo que respecta a la temperatura (figura 2.9, panel
B), vemos como la máxima actividad se detectó en el
rango 25-28ºC, disminuyendo rápidamente a temperaturas superiores. La caída en los niveles de actividad es
apreciable a 30ºC y acusada a 37ºC, mientras que a
42ºC la actividad era sólo residual. A la vista de estos
resultados seleccionamos como temperatura óptima de
ensayo 28ºC y como pH óptimo de reacción el valor de
8.2.
2C.2.3.- Efecto del tiempo de incubación sobre la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa.
Se trataba de determinar durante cuanto tiempo la reacción enzimática tenía lugar de manera lineal. Para ello
realizamos varias reacciones enzimáticas con el mismo
extracto proteico, que fueron paradas a distintos tiempos, determinándose en cada caso la cantidad de 2,4,6TCA acumulada.
Los resultados obtenidos se representan en la figura
2.10. De la observación de esta gráfica se deduce que en
las condiciones del ensayo el enzima mantiene su actividad durante las cuatro primeras horas de incubación de
una manera casi lineal. Se trata de un aspecto llamativo
puesto que no es normal que en una mezcla de reacción
un enzima sea activa por un periodo de tiempo tan prolon-
Tabla 2.7. Efecto de diferentes compuestos sobre la actividad enzimática 2,4,6-TCP metiltransferasa.
REACCIÓN
Normal
- SAM
- 2,4,6-TCP
+ MTHF
+ EDTA
+ MTHF + EDTA
+ β-Mercaptoetanol
+ L-Cisteína
+ DTT
+ PMSF
+ DTT + PMSF
+ Glicerol
CONCENTRACIÓN
(MM)
ACTIVIDAD ESPECÍFICA a
ACTIVIDAD RELATIVA (%)b
-0
0
1
1
1+1
1
1
1
1
1+1
1085.7 (10% p/v)
11.71
0
0
13.97
10.01
11.95
9.81
10.25
10.62
9.31
17.22
15.91
100
0
0
119.3
85.5
102.0
83.8
87.5
90.7
85.2
147.0
135.9
a La actividad específica se expresa como picomoles de producto formados por minuto por mg de proteína. Los valores
mostrados son la media de dos experimentos independientes realizados por duplicado. Las variaciones detectadas en
todos los casos fueron menores del 10%.
b Arbitrariamente se atribuyó el valor de 100 a la actividad de una reacción enzimática normal sin ningún aditivo. La
actividad metiltransferasa se determinó según la metodología descrita por Coque et al., (2003).
2C.2.4.- Influencia de la concentración de los sustratos
de reacción (2,4,6-TCP y SAM) sobre la actividad 2,4,6TCP metiltransferasa.
Otros parámetros que tratamos de optimizar para mejorar el ensayo enzimático fueron la influencia de la concentración de los sustratos de reacción, 2,4,6-TCP y
SAM sobre la actividad enzimática.
Para ello realizamos dos series diferentes de reacciones:
a).- reacciones en las que la concentración de 2,4,6-TCP en
la mezcla de reacción variaba en el rango 0.04-4 MM, manteniéndose constante la concentración de SAM en un valor
saturante de 2 MM. El resultado obtenido se resume en el
panel A de la figura 2.11. Podemos apreciar como la máxima
actividad se obtuvo para una concentración de sustrato 0.25
MM, mientras que para valores superiores la actividad enzimática disminuía a valores de actividad relativa comprendidos entre el 41.6% y el 62.7%. Esta disminución del rendimiento de la reacción podría deberse a un fenómeno de
inhibición por altas concentraciones de sustrato, como se
indica también en el apartado 2C.6.4.
b).- reacciones en las que la concentración de 2,4,6-TCP se
mantuvo constante en 0.25 MM y variamos la concentración
del donador de grupos metilo SAM para valores comprendidos entre 0.25-2.5 mM. Los resultados obtenidos (panel B
de la figura 2.11) sugieren que la actividad enzimática
aumenta cuando se incrementa la concentración de SAM,
hasta alcanzar el máximo de actividad para una concentración 2 MM. En el ensayo decidimos, por una pura cuestión
Figura 2.9. Efecto del pH (A) y la temperatura (B) sobre
la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa. Los resultados
mostrados corresponden a la media de los valores obtenidos en tres experimentos independientes realizados
por duplicado. La actividad metiltransferasa se determinó según la metodología descrita por Coque et al.,
(2003).
Figura 2.11. Efecto de la concentración de 2,4,6-TCP y
SAM sobre la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa.
Figura 2.10. Formación de 2,4,6-TCA por extractos acelulares de T. longibrachiatum a lo largo
del tiempo. Los resultados mostrados son la
media de tres experimentos independientes realizados por duplicado.
económica, utilizar una concentración 1 mM de SAM, a pesar
de que la actividad enzimática detectada era aproximadamente un 36.75% menor.
Una vez analizados estos parámetros realizamos en paralelo
dos tipos diferentes de reacciones enzimáticas:
a).- reacciones según el ensayo inicialmente descrito por
Neilson y colaboradores (1988) para una metiltransferasa
bacteriana.
b).- reacciones en las cuales se modificaron varios parámetros, de acuerdo a los resultados descritos anteriormente de
pH y temperatura óptimas, influencia de distintos componentes en la mezcla de reacción, tiempo de reacción y concentración de sustratos, a fin de optimizar la reacción enzimática. Un resumen de las condiciones iniciales de reacción y
todas las mejoras y modificaciones realizadas en el ensayo
enzimático se recogen en la tabla 2.8. Las mejoras obtenidas en el ensayo enzimático nos permitieron aumentar de
manera muy notable el nivel de actividad enzimática detectada, como se pone de manifiesto en la figura 2.12.
Informe Técnico 57
EN EL CORCHO
Tabla 2.8. Cambios realizados a fin de optimizar el ensayo enzimático de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa (la
actividad se valoró según la metodología descrita por Coque et al., (2003).
REACCIÓN MEJORADACOQUE ET AL., (2003)
REACCIÓN INICIAL BASADA EN EL ENSAYO
DESCRITOPOR NEILSON ET AL., (1988)
*
*
*
*
*
*
*
*
Tampón fosfato 100 mM pH 7.0
MgCl2 1 mM
EDTA 1 mM
MTHF 0.04 mM
2,4,6-TCP 0.06 mM
SAM 0.1 mM
Temperatura de reacción: 30ºC
Tiempo de reacción: 1 hora+ Glicerol
Obsérvese la ausencia de actividad cuando el ensayo de
reacción no incluía SAM (panel A), la débil actividad detectada con el ensayo descrito por Neilson et al., (1988)
(panel B) y la mejora considerable de actividad detectada
con el ensayo optimizado en este trabajo (panel C), que
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Tris 50 mM pH 8.2
MgCl2 1 mM
No EDTA
No MTHF
2,4,6-TCP 0.25 mM
SAM 1 mM
Temperatura de reacción: 28ºC
Tiempo de reacción: 3 horas
DTT 1 mM
PMSF 1 mM
Glicerol 10% (p/v)
nos permitió pasar de una actividad específica de 108.7
pmoles minuto-1 mg de proteína-1 en el panel B, a una
actividad específica en el panel C de 523.2 pmoles
minuto-1 mg de proteína-1, lo que supuso una mejora de
un 381.3%.
Figura 2.12. Optimización del
ensayo de reacción para la
actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa. (A) Reacción
negativa sin SAM; (B)
Reacción realizada de acuerdo
con el ensayo desarrollado por
Neilson et al., (1988). (C)
Reacción optimizada realizada
según las condiciones indicadas en la tabla 2.8.
2C.3.- Estudios previos a la purificación de la actividad
2C.3.1.- Precipitación con sulfato amónico.
La precipitación con sulfato amónico es una técnica
usada rutinariamente en la purificación de proteínas,
generalmente como paso inicial del proceso. A veces
también se utiliza para precipitar y concentrar las proteínas presentes en una mezcla. En nuestro caso
varios experimentos de precipitación de las proteínas
presentes en un extracto crudo libre de células de T.
longibrachiatum, con distintos porcentajes de sulfato
amónico, nos permitieron obtener las siguientes conclusiones:
- La actividad enzimática se repar tía como sigue: un
0% en la fracción correspondiente a un porcentaje de
sal del 0-40%; un 32.1% en la fracción 40-60%; un
66.8% en la fracción 60-80% y sólo el 1.1% en la
fracción 80-100%.
- El 93.4% de la actividad precipitaba con un porcentaje de sal del 50-75%, mientras que en la fracción
correspondiente a un porcentaje de saturación 75100% se detectó únicamente el 6.6% de la actividad
restante.
- Estos estudios mostraron que concentraciones elevadas de sulfato amónico tenían un fuer te efecto inhibidor sobre la actividad metiltransferasa: la actividad
detectada tras el fraccionamiento por precipitación
nunca era superior al 10% de la actividad inicialmente
presente en el extracto. La actividad, además, no se
recuperaba aunque el sulfato amónico se eliminase
por diálisis prolongada o por desalado en una columna de Sephadex G-25.
2C.3.2.- Interacción de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa con columnas de interacción hidrofóbica.
Para comprobar la interacción de la actividad 2,4,6TCP metiltransferasa por interacción hidrofóbica con
varias resinas utilizamos el HiTrap HIC Selection Kit
(Amersham Pharmacia Biotech). A fin de favorecer la
interacción del enzima con cada resina se ensayaron
tres condiciones salinas diferentes: NaCl 3.5 M, tampón fosfato 1.5 M y Na2SO4 0.5 M.
El uso de tampón fosfato se desechó porque a la
temperatura de trabajo de 4ºC se producía precipitación proteica e indicios de precipitación salina. De
manera similar el uso de Na2SO4 se descar tó porque
a 4ºC precipitaba en grandes cantidades y tenía un
efecto inhibitorio de la actividad. Por tanto, la sal elegida fue el NaCl que no planteaba ningún problema
de precipitación o inhibición de la actividad.
El compor tamiento de las diferentes columnas del kit
se indica en la tabla 2.9. Como podemos ver la columna HiTrap Phenyl HP fue la que mostró un mejor compor tamiento y por tanto la elegida para su uso en el
proceso de purificación.
2C.3.3.- Interacción de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa con columnas de intercambio iónico.
Para comprobar la interacción de la actividad 2,4,6TCP metiltransferasa con varias resinas por intercambio iónico utilizamos el HiTrap IEX Selection Kit
(Amersham Pharmacia Biotech). El tampón utilizado
para ensayar la interacción con resinas de intercambio
aniónico fue Tris-HCl 50 mM (pH 8.0), mientras que en
el caso de intercambio catiónico utilizamos un tampón
fosfato 50 mM (pH 6.8).
El compor tamiento de las diferentes columnas del kit
se indica en la tabla 2.9. Podemos apreciar como la
metiltransferasa no se unía a los intercambiadores
catiónicos. Entre los intercambiadores aniónicos, los
que mostraron un mejor compor tamiento fueron el
HiTrap DEAE FF (intercambiador débil) y el HiTrap Q FF
(intercambiador fuer te) por lo que se seleccionaron
para su uso en el proceso de purificación.
2C.3.4.- Estudio de la interacción de la actividad 2,4,6TCP metiltransferasa con matrices cromatográficas por
afinidad o pseudoafinidad.
Las técnicas cromatográficas de afinidad y pseudoafinidad son muy útiles para purificar proteínas ya que
tienen la ventaja de permitir un alto grado de purificación en un único paso. Así, metiltransferasas de hojas
de Wollastonia biflora (James et al., 1995) y de
Brassica oleracea (Attieh et al., 1995) han sido purificadas gracias al uso de resinas de AMP-agarosa. Se
trata de una técnica de pseudoafinidad basada en el
parecido estructural que existe entre el AMP y la molécula de SAM. En nuestro caso intentamos dos estrategias diferentes para intentar purificar la metiltransferasa:
a).- una cromatografía de pseudoafinidad a una matriz
de AMP-agarosa. Desafor tunadamente todos los intentos realizados fueron negativos y aunque se repitieron
varias veces en distintas condiciones (variando la fuerza iónica y el pH, inclusión o no de glicerol en el tampón, etc.) el resultado siempre fue el mismo: la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa no era retenida por
ninguna de las dos matrices empleadas. Este resultado se puede considerar como normal, ya que de
hecho, sólo un pequeño porcentaje de metiltransferasas interaccionan con matrices de AMP-agarosa
(James et al., 1995).
b).- una cromatografía de afinidad sobre una resina
Informe Técnico 59
EN EL CORCHO
Tabla 2.9. Interacción de la actividad enzimática 2,4,6-TCP metiltransferasa con varias columnas cromatográficas de
interacción hidrofóbica e intercambio iónico.
1.2.3.4.5.-
HiTrap Phenyl FF (high sub)
HiTrap Phenyl FF (low sub)
HiTrap Phenyl HP
HiTrap Butyl FF
Hitrap Octyl FF
Aa
+++b
+++
+++
+++
+++
B
+/-
C
-
D
+
++
+++
+
++
aniónico
1.2.3.4.-
HiTrap
HiTrap
HiTrap
HiTrap
+++
+++
+++
+++
-
-
+++
+++
+
++
5.- HiTrap CM FF
6.- HiTrap SP FF
7.- HiTrap SP XL
+++
+++
+++
+++
+++
+++
-
-
Columnas de interacción hidrofóbica
Columnas de intercambio ióni-
NIVEL RELATIVO DE ACTIVIDAD 2,4,6-TCP METILTRANSFERASA DETECTADO EN CADA FRACCIÓN:
catiónico
COLUMNA
DEAE FF
Q FF
ANX FF
Q XL
a Fracciones ensayadas: extracto crudo (A); fracción no unida a la columna (B); lavado de la columna (C); eluído (D).
b Nivel relativo de actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa: actividad detectada superior al 90% (+++); actividad detectada
entre el 60-90% (++); actividad detectada entre el 30-60% (+); actividad detectada inferior al 30% (+/-); actividad no
detectada (-).
En cuanto a la columna de 2,4,6-TCPsefarosa creemos que la inmovilización del sustrato 2,4,6-TCP a través
de su grupo hidroxilo reactivo puede
suponer un impedimento a la interacción del sustrato con el enzima, ya
que es obvio que para que tenga
lugar el proceso catalítico, y posiblemente también el reconocimiento del
sustrato, el grupo hidroxilo debe
estar libre.
2C.3.5.- Estabilidad a 4ºC y -20ºC.
El conocimiento del grado de estabilidad del enzima 2,4,6-TCP metiltransferasa a 4ºC era de interés,
ya que todo el proceso de purificación se realizaría a
dicha temperatura. El estudio se llevó a cabo con una
preparación proteica semipurificada, correspondiente al
paso 4 del proceso de purificación (columna DEAE FF.
Ver apar tado 2C.4.4). La muestra en tampón A [Tris-HCl
50 mM (pH 8.0), MgCl2 2 mM] se suplementó con
varias sustancias: glicerol al 10% (p/v), DTT 1 mM y
Figura 2.13. Estabilidad a 4ºC del enzima 2,4,6-TCP
metiltransferasa en tampón A (pH 8.0) suplementado
con distintos compuestos. Los resultados mostrados son
la media de medidas realizadas por duplicado en dos
experimentos independientes. La actividad metiltransferasa se determinó según la metodología descrita por
Coque et al., (2003).
SAM 0.1 mM, solas o en combinación y a continuación
se mantuvo a 4ºC hasta un máximo de 15 días. Los resultados obtenidos se pueden apreciar en la figura 2.13.
El enzima mostró en tampón A una estabilidad pobre (vida
media de 50 horas): tras cuatro días de incubación a 4ºC
sólo retenía el 26.9% de la actividad inicial y únicamente el
6.6% cuando la incubación se prolongó a 15 días. Este
comportamiento no mejoró significativamente por la inclusión de un 10% de glicerol (p/v) en el tampón. La estabilidad aumentó por la adición de SAM (0.1 mM): el enzima
retenía el 24.7% de actividad el día 15 y su vida media
aumentó hasta las 170 horas. Fue, sin embargo, el DTT (1
mM) el compuesto que produjo un efecto más notable: el
enzima retenía el cuarto día el 100% de actividad y en torno
al 60.1% el día 15, siendo su vida media de 290 horas. Por
ello, en todos los pasos de purificación se procedió a incluir
DTT 1 mM a las preparaciones proteicas.
El estudio de estabilidad del enzima a -20ºC se realizó en el
mismo tampón A conteniendo glicerol al 10% (p/v): el enzima retenía más del 85% de actividad tras 6 meses de congelación. Por otro lado, cuando el enzima fue sometida a
cuatro ciclos de congelaciones y descongelaciones sucesivas experimentó una pérdida de actividad de aproximadamente el 35%.
Finalmente, indicar que el enzima mostró una alta inestabilidad tras el último paso de purificación (filtración en gel en
Superdex 200. Ver apartado 2C.4.6): su vida media a 4ºC
en tampón A conteniendo DTT decayó a 20 horas y la actividad se perdía casi completamente tras congelación de las
preparaciones a -20ºC.
2C.4.1.- Paso 1. Obtención de extractos enzimáticos acelulares.
El primer paso del proceso de purificación se realizó a partir de 6.0 gramos de micelio inducido con 2,4,6-TCP. A partir de dicho micelio se obtuvo por sonicación un extracto
crudo que fue filtrado en columnas PD-10 (G-25) a fin de
eliminar pequeñas moléculas, especialmente trazas de
2,4,6-TCP y 2,4,6-TCA que pudieran interferir en los ensayos de valoración enzimática. Tras dicha filtración obtuvimos un total de 20 ml de extracto crudo que contenía
480.89 mg de proteína (aproximadamente 24.04 mg de
proteína por ml de cultivo) y una actividad total de
1189.65 pmoles min-1.
2C.4.2.- Paso 2. Cromatografía de interacción hidrofóbica
en una columna Resource PHE.
El segundo paso del proceso de purificación fue una cromatografía de interacción hidrofóbica en columna
Resource PHE que nos permitió captar la mayor parte de
la actividad presente en el extracto. De hecho el rendimiento de este paso fue del 80.95%.
La actividad, unida a la columna en condiciones de alta
fuerza iónica (3.5 M de NaCl), se liberó a continuación
usando un gradiente decreciente de NaCl, eluyendo la metiltransferasa en el intervalo 1.26-0 M de NaCl (ver figura
2.15).
Este paso fue realmente el más efectivo de todo el proceso de purificación: sólo una pequeña fracción de las prote-
2C.3.6. Estabilidad a 42ºC.
También se ensayó la estabilidad del enzima a 42ºC: la preparación proteica en tampón A suplementado con DTT 1
mM, se incubó a esa temperatura, retirando muestras a distintos intervalos en las que valoramos la actividad metiltransferasa a 28ºC. Los resultados obtenidos se recogen en
la figura 2.14. El enzima mostró una baja tolerancia a la
incubación a 42ºC. De hecho tras 15 minutos de exposición
el enzima retenía sólo el 45.7% (±5.8) de actividad; para
incubaciones de 60 minutos la actividad disminuyó hasta el
8.4% (±2.3) y hasta el 4.6% (±1.8) para prolongaciones de
240 minutos.
2C.4.- Purificación de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa.
Los resultados de aplicar técnicas convencionales para la
purificación a homogeneidad de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa se resumen en la tabla 2.10. El enzima se purificó 222.67 veces hasta una aparente homogeneidad, obteniéndose una preparación de una actividad específica de
550.00 pmoles minuto-1 mg de proteína-1. El rendimiento
del proceso fue del 0.92%.
Figura 2.14. Estabilidad a 4ºC del enzima 2,4,6-TCP
metiltransferasa en tampón A (pH 8.0) suplementado
con distintos compuestos. Los resultados mostrados son
la media de medidas realizadas por duplicado en dos
experimentos independientes. La actividad metiltransferasa se determinó según la metodología descrita por
Coque et al., (2003).
Informe Técnico 61
EN EL CORCHO
Tabla 2.10. Etapas en la purificación de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa de T. longibrachiatum.
ETAPA DE
PURIFICACIÓN
1.2.3.4.5.6.-
ACTIVIDAD TOTAL PROTEÍNA TOTAL
(pmoles min-1)
(mg)
Extracto crudo
Resource PHE
Ultrafiltración
HiTrap DEAE
Resource Q
Superdex 200
1189.65
963.12
667.37
289.40
75.31
11.00
480.89
33.67
18.89
5.18
0.81
0.02
ACTIVIDAD
RENDIMIENTO PURIFICACIÓN
(%)
(veces)
ESPECÍFICA
(pmoles min-1 mg
de proteína-1)
2.47
28.60
35.32
55.87
92.97
550.00
100.00
80.95
56.10
24.33
6.33
0.92
1
11.58
14.30
22.62
37.64
222.67
2C.4.3.- Paso 3. Ultrafiltración.
Posteriormente las fracciones activas de la columna
Resource PHE (20 ml) se concentraron por ultrafiltración en
un Vivaspin 6 (con una membrana de polietersulfona de baja
adsorción de proteínas) con límite de exclusión molecular de
50.000 Da. Este paso nos permitió eliminar una buena cantidad de proteína (especialmente de tamaños nativos menores
de 50.000 Da), obteniéndose una muestra purificada 14.3
veces con una actividad total de 667.37 pmoles min-1.
Fig. 2.15. Comportamiento de la actividad 2,4,6-TCP
metiltransferasa en una columna de interacción hidrofóbica Resource PHE.
ínas del extracto crudo fueron retenidas en la columna,
2C.4.4.- Paso 4. Cromatografía de intercambio aniónico en
columna HiTrap DEAE FF.
La muestra se sometió luego a un intercambio aniónico débil
(DEAE FF) a pH 8. La actividad se eluyó de la columna utilizando un gradiente discontinuo de NaCl, detectándose actividad en las fracciones que eluían en el intervalo 40 a 125
mM de NaCl (máxima actividad a 75 mM), como podemos
apreciar en la figura 2.16. Este paso, aunque con una pérdida alta de actividad, nos permitió obtener una preparación
purificada 22.62 veces con una actividad total de 289.40
pmoles min-1.
2C.4.5.- Paso 5. Cromatografía de intercambio aniónico en
columna Resource Q.
El comportamiento de la actividad enzimática en una columna del intercambiador aniónico fuerte Resource Q a pH 8.2
se representa en la figura 2.17: la actividad eluía en un
rango muy estrecho de concentración de NaCl 25-65 mM
(máximo alrededor de 45 mM). Este paso nos permitió obtener una muestra purificada 37.63 veces, aunque el rendimiento del proceso decayó considerablemente al 6.33%
(equivalente a una actividad total de 75.31 pmoles min-1).
metiltransferasa en una columna de interacción aniónico
HiTrap DEAE FF.
2C.4.6.- Paso 6. Cromatografía de gel filtración en columna
Superdex 200.
El último paso del proceso de purificación fue una cromatografía de filtración en gel en una columna Superdex 200 que
fracciona proteínas cuyo peso molecular se sitúa entre
10.000 y 600.000 Da. Aunque el rendimiento obtenido en
este paso bajó hasta el 0.92% y la actividad total recuperada
fue de 11.00 pmoles min-1, se trató de una técnica efectiva,
ya que nos permitió obtener una preparación en la que la
metiltransferasa eluía en un pico bien definido (ver figura
2.18) que correspondía al enzima purificada aparentemente
a homogeneidad (el enzima había sido purificada 222.67
veces).
El análisis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida
(SDS-PAGE) de las fracciones correspondientes al pico en el
que detectamos actividad nos permitió detectar una única
Fig. 2.17.
Comportamiento
de la actividad
2,4,6-TCP metiltransferasa en
una columna de
intercambio aniónico Resource Q.
banda del tamaño esperado (52.500 Da)
Fig. 2.19. SDS-PAGE del enzima
2,4,6-TCP metiltransferasa obtenida
tras el último paso de purificación
(Superdex 200). Carrill 1: marcadores de peso molecular; carril 2: enzima purificada.
metiltransferasa en una columna de filtración en gel
Superdex 200.
banda proteica, que correspondía a un tamaño molecular de
52.500 Da (ver figura 2.19.)
2C.5.- Identificación del enzima 2,4,6-TCP metiltransferasa
por fotomarcaje con sustratos radiactivos.
Algunas metiltransferasas han podido identificarse mediante
fotomarcaje (cross-linking inducido por luz ultravioleta) utilizando
un sustrato radiactivo (Som et al., 1990; Ruíz et al., 1998). En
nuestro caso utilizamos dos sustratos diferentes:
- SAM[metil-3H]. En las fracciones correspondientes a los pasos
finales 4, 5 y 6 del proceso de purificación detectamos una proteína de un peso molecular aproximado de 52.000 Da, que
coincidía en tamaño con el enzima purificada, y que era marcada débilmente con SAM tritiada (figura 2.20). La reacción de
fotomarcaje era inhibida cuando la muestra se preincubaba
durante 10 minutos con SAHC 1 mM (compárense los carriles
3 y 4 de la figura), lo que indica la especificidad del fotomarcaje.
- La utilización de 2,4,5-TCP [UL-14C] en los experimentos
de fotomarcaje resultó insatisfactoria, debido al alto número
de bandas que se marcaban, incluso en muestras correspondientes a los pasos 4 y 5 del proceso de purificación
(datos no mostrados). Ello podría deberse a la gran reactividad del grupo hidroxilo de los clorofenoles (responsable de
su alta toxicidad), el cual reaccionaría de manera inespecífica con una gran cantidad de proteínas. No obstante una
se marcaba con
una intensidad ligeramente
superior al
resto
(datos no mostrados).
Figura 2.20. Detección de la
2,4,6-TCP metiltransferasa (indicada por una flecha) por fotomarcaje con SAM[metil-3H]. Carriles
1 y 2: tinción con Azul Brillante
de Coomasie de marcadores de
peso molecular (carril 1) y mezcla de las fracciones activas
del paso 4 del proceso de purificación -columna DEAE FF(carril 2). Carriles 3 y 4: reacciones de fotomarcaje de la
muestra proteica en ausencia (carril 3) y presencia (carril 4)
de SAHC. También se detectó fotomarcaje del enzima purificada y en una mezcla proteica de las fracciones activas de la
columna ResourceQ (datos no mostrados).
Informe Técnico 63
EN EL CORCHO
2C.6.- Caracterización de la actividad enzimática 2,4,6-TCP
metiltransferasa.
La purificación de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa nos
permitió abordar una serie de estudios que requieren un alto
grado de pureza de la preparación proteica.
La mayor parte de los estudios que se indican a continuación (a
excepción de la determinación del peso molecular nativo) se llevaron a cabo con una preparación proteica semipurificada
Tabla 2.11.Efecto de tioles y otros compuestos, así como diferentes cationes sobre la actividad 2,4,6-TCP
metiltransferasa de T. longibrachiatum
COMPUESTO
AÑADIDOa
CONCENTRACIÓN
FINAL (MM)
ACTIVIDAD
RELATIVA (%)b
CATIÓN
AÑADIDOa
Ninguno
MTHF
Glicerol
b-mercaptoetanol
DTT
L-Cys
Tioglicolato
PMSF
PMSF + DTT
-1
1085.7 (10% p/v)
1
1
1
1
1
1+1
100
122.5
121.7
104.8
96.7
91.5
102.5
80.6
142.5
Ca2+
Cu2+
Fe2+
Hg2+
Mg2+
Zn2+
Ag+
Cs+
Li+
NH4+
CONCENTRACIÓN ACTIVIDAD
FINAL (MM)
RELATIVA (%)b
1
1
1
0.1
1
0.1
1
1
1
1
84.5
3.8
82.0
3.75
96.8
18.2
5.9
84.6
100.9
84.1
correspondiente al paso 5 del proceso de purificación (columna Resource Q).
2C.6.1.- Efecto de tioles y otros compuestos.
El efecto de varios tioles (β-mercaptoetanol, DTT, L-Cys y ácido tioglicólico) y otros compuestos como el glicerol, el cofactor
de metiltransferasas metiltetrahidrofolato (MTHF) o el reactivo para residuos de Cys y Ser PMSF se recoge en la tabla 2.11.
La adición de glicerol o MTHF a la mezcla de reacción produjo un ligero incremento en la actividad (como ya vimos en el
apartado 2C.2.1).
a La preparación enzimática en Tris-HCl 50 mM (pH 8.0) se
preincubó con cada compuesto o catión durante 10 minutos
a 4ºC antes de añadir el resto de los componentes de la
reacción.
b Los valores de actividad relativa mostrados resultan de
asignar a la reacción sin aditivos el valor de actividad 100.
Los datos mostrados son la media de muestras ensayadas
por duplicado en dos experimentos independientes.
Por el contrario, los distintos tíoles ensayados no mostraron
un claro efecto inhibidor ni estimulante del proceso catalítico. Sin embargo, la adición conjunta de PMSF y DTT producía de manera repetida un claro incremento del 42.5% de la
actividad metiltransferasa. Resultados similares se obtuvieron con extractos crudos (apartado 2C.2.1).
2C.6.2.- Efecto de iones metálicos.
Con frecuencia las metiltransferasas, sobre todo de plantas
y animales, exhiben su máxima actividad en presencia de un
cation bivalente como el Mg2+, mientras que otros como el
Hg2+ pueden tener un claro efecto inhibitorio (Poulton,
1981). El efecto de varios cationes mono y divalentes
comúnmente utilizados en este tipo de estudios, sobre la
actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa se recoge en la tabla
2.11. La preparación enzimática en Tris-HCl 50 mM (pH 8.2)
se preincubó con cada ión durante 10 minutos a 4ºC, antes
de la adición del resto de los componentes de reacción
Ninguno de los cationes, ni siquiera el Mg2+, mostró un
claro efecto estimulatorio, lo que permite concluir que la
actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa no presenta requerimientos por cationes.
Por el contrario, los cationes Hg2+ y Zn2+ (0.1 mM) y Cu2+ y
Ag 1+ (1 mM), ejercieron un fuerte efecto inhibitorio.
2C.6.3.- Efecto de varios inhibidores de metiltransferasas.
Cálculo de Ki para SAHC.
La búsqueda de inhibidores se limitó a una serie de compuestos que con frecuencia actúan como tales para las
metiltransferasas dependientes de SAM.
Entre ellos podemos citar tres tipos fundamentales: en priFigura 2.21.
Representación
de LineweaverBurk para determinar el efecto
inhibitorio de la
SAHC sobre la
actividad 2,4,6TCP metiltransferasa.
Tabla 2.12. Inhibición de la 2,4,6-TCP metiltransferasa
por varios compuestos.
INHIBIDOR (1 MM)
Ninguno
Iodoacetamida
N-etilmaleimida
p-cloro-mercuriobenzoato
EDTA
S-adenosilhomocisteína
INHIBICIÓN (%)a
0
18.3 ± 2.9
16.5 ± 1.9
45.2 ± 6.6
5.8 ± 0.3
87.1 ± 5.6
la influencia en la velocidad de reacción de diferentes concentraciones de SAM (100, 150, 250, 350, 450 y 600 MM)
para cuatro cantidades constantes de 2,4,6-TCP (100, 150,
200 y 300 MM).
La representación gráfica generó varias líneas rectas que se
cortaban en el segundo cuadrante, en un punto que corres-
a Los datos mostrados son la media de tres experimentos
independientes por duplicado.
mer lugar reactivos de grupos tiol como la iodoacetamida, la
N-etilmaleimida o el ácido p-cloro-mercuriobenzoico; en
segundo lugar quelantes catiónicos, como el EDTA y finalmente inhibidores competitivos como la S-adenosilhomocisteína (SAHC). De hecho una de las características más notables de las metiltransferasas que utilizan SAM como
donador de grupos metilo es el fuerte efecto inhibitorio que
el producto desmetilado, SAHC, ejerce sobre ellas (Poulton,
1981). El efecto de todos estos compuestos sobre la actividad se refleja en la tabla 2.12. En primer lugar podemos
apreciar como entre los reactivos de grupos tiol únicamente
el p-cloro-mercuriobenzoato mostró un claro efecto inhibitorio.
Por el contrario, el EDTA no se comportó como inhibidor, de
acuerdo con las observaciones realizadas en el apartado
anterior que indicaban la ausencia de un requerimiento de
cationes para la actividad enzimática. Finalmente y como
era de esperar la SAHC mostró un claro efecto inhibidor. A
fin de determinar el tipo de inhibición así como la constante
de inhibición (Ki) se recurrió a una representación gráfica de
Lineweaver-Burk. El efecto de la SAHC (a una concentración
400 mM) sobre la actividad enzimática se analizó para una
concentración constante de 2,4,6-TCP (200 MM) y concentraciones variables de SAM (100, 150, 250, 350 y 400
MM).
La gráfica obtenida (figura 2.21) confirmaba que la SAHC se
comporta como un inhibidor competitivo de la metiltransferasa, ya que se obtenían dos líneas rectas que se cortaban
en el eje de ordenadas en un punto de valor 1/Vmax. El
valor deducido de Ki fue de 378.84 MM.
2C.6.4. Análisis cinético: cálculo de los valores de Km.
La 2,4,6-TCP metiltransferasa es una típica enzima bisustrato en la que intervienen el 2,4,6-TCP como sustrato aceptor
y la SAM como sustrato donador del grupo metilo. Los valores de Km se determinaron, recurriendo a la representación
de Lineweaver-Burk (figura 2.22). En primer lugar medimos
Figura 2.22. Representación de Lineweaver-Burk para
determinar el tipo de reacción bisustrato y los valores de
Km para los sustratos SAM (A) y 2,4,6-TCP (B) del enzima 2,4,6-TCP metiltransferasa.
pondía a una Km para el sustrato donador SAM de 284.1
MM (figura 2.22, panel A).
Análogamente una Km de 136.0 MM se dedujo para el sustrato aceptor, o 2,4,6-TCP, de la representación (figura 2.22,
panel B) de los valores de velocidad de reacción que se
obtuvieron para concentraciones variables de 2,4,6-TCP de
50, 100, 150, 200, 250 y 300 MM respecto de cuatro concentraciones constantes de SAM (100, 200, 300 y 400
MM). En ambos casos comprobamos como el uso de concentraciones de 2,4,6-TCP superiores a 300 mM provocaban una pérdida de la linealidad de los resultados, lo cual
sugiere un fenómeno de inhibición por altas concentraciones
de sustrato. Una conclusión similar se deduce de los resultados del apartado 2C.2.4.
Como en el caso anterior, se obtuvieron una serie de rectas
que se cortaban en un punto del segundo cuadrante. La gráfica obtenida es típica de enzimas bisustrato que presentan
Informe Técnico 65
EN EL CORCHO
un mecanismo de reacción secuencial al azar. Esto es, el
enzima tiene en su centro catalítico dos centros de unión,
uno para cada sustrato. Ambos centros, además no son
independientes, puesto que la unión de un sustrato va a
favorecer la unión del otro, de tal manera que en el transcurso de la reacción los sustratos pueden unirse al enzima de
manera alternativa en cualquier orden.
2C.6.5. Determinación del tamaño molecular de la proteína
nativa.
Como se ha indicado anteriormente en el apartado 2C.4, el
análisis en geles de poliacrilamida de la proteína purificada
nos permitió estimar un tamaño molecular de unos 52.500
Da para su forma desnaturalizada. Para calcular el tamaño
de la forma nativa recurrimos a la cromatografía de filtración
en gel, utilizando una preparación proteica correspondiente
a la quinta etapa del proceso de purificación (columna
Resource Q). Un estudio previo nos había permitido determinar que la actividad enzimática eluía en el volumen muerto
en una columna Superdex 75 HR 10/30 (Amersham
Pharmacia Biotech), que tiene un rango efectivo de fraccionamiento de 3.000 a 70.000 Da y un límite de exclusión de
100.000 Da para proteínas globulares, lo que obviamente
sugería que el enzima presentaba un tamaño mayor al del
límite de exclusión de dicha columna.
Por tanto utilizamos una columna Superdex 200 HR 10/30,
que tiene un límite de exclusión para proteínas globulares
de 1.300.000 Da y un rango efectivo de fraccionamiento de
10.000 a 600.000 Da. La columna, en las mismas condiciones en que se realizó el ensayo, había sido previamente
calibrada con varias proteínas globulares de peso molecular
conocido: tiroglobulina (669.000 Da), ferritina (440.000 Da),
aldolasa (158.000 Da), albúmina sérica bovina (67.000 Da)
y anhidrasa carbónica (29.000 Da). Con los valores de Kav
Figura 2.23. Determinación del tamaño molecular del enzima 2,4,6-TCP metiltransferasa por filtración en gel en una
columna Superdex 200 HR 10/30. El perfil de elución proteico de una mezcla de las fracciones activas del paso 5
del proceso del purificación (columna Resource Q) se muestra en negro, mientras que en azul se indica la detección
de la actividad enzimática en las fracciones recogidas. La calibración de la columna (ver recuadro de la parte superior derecha de la figura) se realizó con varias proteínas de tamaños conocidos.
obtenidos de los volúmenes de elución se construyó una
representación gráfica frente a los logaritmos de los pesos
moleculares correspondientes (ver recuadro pequeño de la
figura 2.23).
Como podemos ver en dicha figura la actividad 2,4,6-TCP
metiltransferasa eluyó entre los picos correspondientes a la
aldolasa y la albúmica sérica bovina, con un valor de Kav de
0.254, que correspondía a un peso molecular aproximado
de 112.202 ± 2000 Da. El valor obtenido sugiere que en su
forma nativa el enzima es un dímero, hecho por otro lado
relativamente común para muchas metiltransferasas (Jeffers
et al., 1997), aunque también es normal que puedan ser
monomeros, dímeros o incluso tetrámeros (James et al.,
1995; Dhar et al., 2000).
2C.6.6. Análisis de especifidad de sustratos de la actividad 2,4,6-TCP MT.
Una vez purificada el enzima 2,4,6-TCP metiltransferasa
realizamos un análisis sobre los posibles sustratos susceptibles de ser metilados por el enzima. Para ello elegimos una amplia variedad de alcoholes aromáticos y
derivados, tanto halogenados como no halogenados,
que se indican a continuación:
-- Fenoles no halogenados como fenol, 1,2-dihidroxibenceno (catecol) y 2-metoxifenol (guayacol).
-- Aldehídos aromáticos como el 3,4-dihidroxibenzaldehido y el 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído (vainillina).
-- Ácidos benzoicos hidroxilados como el 4-hidroxi-3metoxibenzoico (ácido vainíllico), el 3-hidroxi-4-metoxibenzoico (ácido isovainíllico) y el ácido 3,4-dihidroxibenzoico
-- Una amplia variedad de fenoles halogenados, sobre
todo clorofenoles (mono, di, tri, tetra y pentaclorofenoles) y algunos otros fenoles halogenados con bromo,
yodo y fluor. Los resultados obtenidos se resumen en la
tabla 2.13, pudiéndose realizar el siguiente análisis:
- La reacción es altamente específica para fenoles halogenados. De hecho el enzima no usa como sustratos
alcoholes aromáticos no halogenados como el fenol, 2metoxifenol o el 1,2-dihidroxibenceno, benzaldehídos y
derivados hidroxilados del ácido benzoico.
- El sustrato metilado con mayor eficiencia fue el 2,4DCP, mientras que el nivel de metilación de otros DCPs
disminuyó progresivamente para 2,3-DCP, 2,5-DCP, 2,6DCP y 3,4-DCP y no se detectó metilación del 3,5-DCP.
- Entre los TCPs el mayor nivel de O metilación correspondió al 2,3,4-TCP, disminuyendo sucesivamente para
2,4,5-TCP, 2,4,6-TCP y 2,3,6-TCP.
- El único TeCP biometilado fue el 2,3,4,5-TeCP, mientras que no se detectó el anisol correspondiente en el
caso de los sustratos 2,3,4,6-TeCP y 2,3,5,6-TeCP.
- Además el enzima puede metilar otros fenoles halogenados diferentes de los clorofenoles. De hecho se
Tabla 2.13. Especificidad de sustratos del enzima 2,4,6-TCP metiltransferasa
SUSTRATO
Ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico
Ácido 3-hidroxi-4-metoxibenzoico
Ácido 3,4-dihidroxibenzoico
2-Metoxifenol
1,2-Dihidroxibenceno
3,4-Dihidroxibenzaldehído
4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehído
Fenol
2-Clorofenol
3-Clorofenol
4-Clorofenol
2,3-Diclorofenol
2,4-Diclorofenol
2,5-Diclorofenol
2,6-Diclorofenol
GRADO DE
METILACIÓNa
SUSTRATO
GRADO DE
METILACIÓNa
0
0
0
0
0
0
0
0
9.61
0
0
22.51
100.00
19.58
10.36
3,4-Diclorofenol
3,5-Diclorofenol
2,3,4-Triclorofenol
2,3,6-Triclorofenol
2,4,5-Triclorofenol
2,4,6-Triclorofenol
2,3,4,5-Tetraclorofenol
Pentaclorofenol
2,4-Dibromofenol
2,4,6-Tribromofenol
2,4,6-Trifluorofenol
2,4,6-Triyodofenol
9.26
0
93.33
55.58
64.19
59.91
10.73
0
0
10.07
36.80
12.98
0
+ (NC)b
a Los datos mostrados son relativos respecto al sustrato metilado con más eficiencia (2,4-DCP), al que se le atribuyó un
valor arbitrario de 100. Los valores son la media de dos experimentos independientes realizados por duplicado. La actividad
metiltransferasa se determinó según la metodología descrita por Coque et al., (2003) pero variando en cada caso el sustrato de reacción.
b El sustrato 2,4,6-TIP fue metilado pero la cuantificación del producto 2,4,6-TIA no fue posible por no estar comercialmente
disponible.
Informe Técnico 67
EN EL CORCHO
detectó O metilación de bromofenoles como el 2,4-DBrP
y el 2,3,4-TBrP, además de fenoles yodados (2,4,6-TIP).
Curiosamente el derivado fluorado 2,4,6-TFP no fue
metilado.
En todos los casos el nivel de metilación detectado fue
inferior al del clorofenol correspondiente, lo cual sugiere que el enzima tiene una mayor preferencia por el uso
de clorofenoles. De estos datos parece deducirse que la
halogenación de la posición dos (orto) parece ser importante para la actividad enzimática. Por otro lado, en clorofenoles con la posición dos (orto) ocupada y que tienen dos o
más atomos de cloro, la introducción adicional de un átomo
de cloro en la posición seis (orto) parece suponer un impedimento para la actividad enzimática.
3.- DISCUSIÓN GENERAL
3.1.- Caracterización de la microbiota asociada a muestras
de corcho extremeño.
La caracterización de las especies microbianas, especialmente fúngicas, que pueden ser aisladas a partir de
muestras de corcho ha sido abordada por diversos autores (Davis et al. 1981; Lee y Simpson, 1993; Danesh et
al.,1997). Algunos de estos trabajos se han realizado en
España: así se ha caracterizado la microbiota de alcornoques y corcho de bosques catalanes (Codina et al., 1993;
Calvo et al., 1993 y 1995; Calvo y Agut, 1996), o del
Parque Nacional de los Alcornocales de Cádiz (Muñoz et
al., 1996). Los géneros y especies identificados más
representativos se han recopilado en la tabla 1.1.
Estos trabajos nos muestran que la microbiota fúngica
que podemos aislar de corcho es variable y está condicionada por la procedencia de las muestras, las condiciones
ambientales y otros factores locales propios de la región
origen de la muestra (Silva Pereira et al., 2000).
Existen, sin embargo, una serie de especies que son aisladas de manera recurrente y que por tanto deberían ser
consideradas como microorganismos saprófitos del corcho, ya que su presencia es casi universal, independientemente del origen de las muestras. Entre ellas podemos
citar a Chrysonilia sitophila que es el hongo dominante
durante la fase de crecimiento en bodega (Danesh et al.,
1997; Silva Pereira et al., 2000a y 2000b), especies de
Trichoderma como T. viride y T. longibrachiatum y varias
especies del género Penicillium.
En nuestro caso hemos aislado un total de 14 hongos
filamentosos de los cuales 11 habían sido previamente
descritos en corcho. Sin embargo, en nuestro trabajo
hemos detectado por primera vez en corcho las especies
Mortierella alpina, Penicillium citreonigrum y Verticillium
psalliotae (Álvarez-Rodríguez et al., 2002a y 2003b).
Del total de especies aisladas un total de 11 pudieron
crecer de manera eficiente sobre corcho (ver tabla 2.5).
Sin embargo, M. alpina, Mucor plumbeus y Penicillium
decumbens no fueron capaces de crecer sobre granulado
de corcho, lo que quizás sugiere que más que microorganismos saprófitos del corcho podrían ser considerados
como contaminantes ocasionales de las muestras (Álvarez-Rodríguez et al., 2002a, 2003b y 2003c).
En cuanto a la aparición de los aislados a lo largo de las
distintas etapas de fabricación del tapón podemos destacar (ver tabla 2.4) como sólo las especies C. oxisporum,
P. citreonigrum y T. longibrachiatum pudieron ser aisladas
a lo largo de todo el proceso. Además, el tratamiento del
tapón con S02, como método antimicrobiano, para prevenir el crecimiento de microorganismos durante el transporte y almacenamiento de los tapones es sólo parcialmente
efectivo en el caso de los hongos filamentosos, puesto
que pasamos de un total de siete especies detectadas en
la muestra F (no tratada), a sólo tres en la muestra G,
tras el tratamiento con este producto.
A diferencia del elevado número de estudios analizando
las poblaciones de hongos filamentosos asociadas a corcho, apenas si se han realizado intentos de aislar y caracterizar las levaduras presentes. Como consecuencia, de
las ocho levaduras aisladas en este trabajo, todas excepto Sporidiobolus johnsonii, Aureobasidium sp. Y11 y
Cryptococcus sp. Y1 han sido detectadas por primera vez
a partir de corcho (Álvarez-Rodríguez et al., 2003a). En
cuanto a las bacterias presentes en corcho, tradicionalmente se ha venido aceptando que su papel como microorganismos implicados en el cork taint es menos importante. Por ello en nuestro caso nos hemos centrado
únicamente en la caracterización de aquellas con capacidad de degradación de ácido vainíllico.
3.2.- Mecanismo de formación de 2,4,6-TCA por hongos
filamentosos creciendo directamente sobre corcho.
De entre la amplia variedad de microorganismos que pudimos aislar de corcho los hongos filamentosos eran los
candidatos más probables como agentes responsables
del cork taint. Por ello este trabajo se ha centrado fundamentalmente en su análisis.
3.2.1.- Formación de 2,4,6-TCA por O metilación de 2,4,6-TCP.
De todos los mecanismos posibles para la formación de
2,4,6-TCA propuestos por diferentes autores la O metilación de 2,4,6-TCP nos pareció el más probable. Para partir
de esta hipótesis tuvimos en cuenta los trabajos previos de
Cserjesi y Johnson (1972) que habían detectado biometilación de PCP por T. virgatum y los trabajos de Curtis et al.,
(1972, 1974) y Gee y Peel (1974) que habían detectado en
pollos la presencia de 2,3,4,6-TeCA sintetizado a partir de
2,3,4,6-TeCP por varios hongos filamentosos. Otros autores
han postulado que diferentes hongos filamentosos son los
principales responsables de la producción de este com-
puesto (Daly et al.,1984; Sponholz y Muno, 1994; Silva
Pereira et al., 2000a), y apuntan a los géneros Penicillium
y Trichoderma como los principales candidatos.
Los resultados mostrados en la tabla 2.5 son de gran interés, ya que es la primera vez que se demuestra de manera
concluyente que hongos filamentosos, creciendo directamente sobre corcho, pueden ser los responsables de la
formación de 2,4,6-TCA y su acumulación en el tapón de
corcho.
Sorprendentemente un total de 11 de los 14 aislados
(78.6%) mostraron capacidad, en mayor o menor medida,
para sintetizar este compuesto. Ello sugiere que la O
metilación de clorofenoles, en este caso 2,4,6-TCP,
podría ser una reacción muy común en los hongos filamentosos. De hecho Gee y Peel (1974) apuntan que de
116 aislados de muestras de pollo un total de 68 podían
producir 2,3,4,6-TeCA, porcentaje del 58.6% que es sensiblemente inferior al obtenido en nuestro caso.
De manera llamativa, en nuestro estudio C. sitophila
quedó incluido dentro del grupo de los moderados productores (eficiencia de bioconversión del 11.02%). Este resultado es de signo opuesto al apuntado por Silva Pereira et
al., (2000b), que indican que este microorganismo exhibe
una eficiencia de biometilacion del 2,4,6-TCP del 0.03%.
Esta diferencia en los resultados obtenidos podría deberse a la diferente metodología empleada, o quizás a una
distinta capacidad metabólica de las cepas empleadas en
ambos estudios.
3.2.2.- Análisis de otros posibles mecanismos de formación de 2,4,6-TCA por T. longibrachiatum.
Una vez establecido que un porcentaje elevado de los
hongos filamentosos aislados podían producir 2,4,6-TCA
decidimos elegir a T. longibrachiatum como microorganismo modelo de estudio. Para ello nos basamos en los
siguientes hechos:
a).- fue el hongo filamentoso que presentó un mayor nivel
de bioconversión.
b).- mostraba una buena capacidad de crecimiento sobre
corcho.
c).- se trata de un microorganismo para el que existen
distintas técnicas de manipulación genética puestas a
punto que podrían sernos de utilidad en un futuro.
El análisis de otros posibles mecanismos para la formación
de 2,4,6-TCA a partir de otros sustratos y por diferentes
mecanismos fue negativo (ver tabla 2.6). Esto no es sorprendente si tenemos en cuenta los siguientes razonamientos:
1).- Parece improbable que el 2,4,6-TCA pueda originarse
a partir del catabolismo de otros fenoles o anisoles altamente clorados como el PCP, PCA, hexaclorociclohexano,
hexaclorobenceno, 2,3,4,6-TeCP o 2,3,4,6-TeCA como
plantean diferentes autores (Maarse et al., 1989; Tanner
et al., 1981; Neidlemann y Geigert, 1986; Nicholson et
al, 1992; Mohn et al, 1992). Tengamos en cuenta que la
degradación de clorofenoles es un proceso complejo en el
que se originan intermediarios de tipo quinonas, como
resultado de reacciones del tipo deshalogenación oxidativa (Bhasker Reddi et al., 1998 y 2000; Wieser et al.,
1997; Xun, 1996 y Xun y Orser, 1991) que en ningún
caso permiten explicar la aparición de 2,4,6-TCA como
producto intermedio.
2).- Tampoco detectamos formación de 2,4,6-TCA por un
mecanismo de síntesis endógena de fenol y posterior
halogenación para dar lugar a 2,4,6-TCP que debería ser
biometilado. Parece muy extraño que un microorganismo
sintetice un compuesto tan tóxico como el fenol o el
2,4,6-TCP, con el elevado gasto energético que conlleva,
para luego tener que detoxificarlo por un mecanismo de O
metilación.
3).- El tratamiento de corcho con hipoclorito sódico en
presencia de distintos compuestos susceptibles de ser
clorados, como fenol, anisol o varios diclorofenoles
(mecanismo propuesto por autores como Neidleman and
Geigert, 1986; Sponholz y Muno, 1994 y Maujean et al.,
1985) tampoco nos permitió detectar niveles apreciables
de 2,4,6-TCA.
4).- La biometilación directa de 2,4,6-TCP fue el único
mecanismo que permite explicar la formación de 2,4,6TCA. El uso como posible precursor de otros triclorofenoles también dio resultados negativos, lo cual es lógico
porque la O metilación de 2,3,6-TCP debería producir
2,3,6-TCA y no se conoce ningún mecanismo que pueda
explicar la transformación de éste a 2,4,6-TCA.
Los resultados obtenidos, sin embargo, no nos permiten
excluir la posibilidad de que el 2,4,6-TCA pueda ser sintetizado por alguno de estos mecanismos u otros, como
resultado de la acción conjunta de dos o más microorganismos presentes en el corcho, en un típico ejemplo de
cometabolismo.
3.3.- Análisis de la bioconversión en medio líquido de 2,4,6TCP por T. longibrachiatum.
En un trabajo previo (Álvarez- Rodríguez, 2001) ya habíamos demostrado que T. longibrachiatum era capaz de biometilar aproximadamente un 35% de 2,4,6-TCP para dar
lugar a 2,4,6-TCA, mientras que el resto de precursor desaparecía del cultivo líquido.
3.3.1.- O metilación del 2,4,6-TCP.
El estudio realizado en medio líquido que se representa
en la figura 2.5 confirmó que una parte del 2,4,6-TCP presente en el medio de cultivo era O metilado a 2,4,6-TCA.
Este estudio nos permitió además extraer otra serie de
conclusiones importantes:
1).- En ausencia de precursor no pudimos nunca detectar
Informe Técnico 69
ORIGEN Y BIOSÍNTESIS DE
TCA
EN EL CORCHO
2,4,6-TCA, lo cual sugiere que no se sintetiza de manera
endógena, como podemos también deducir de los resultados recogidos en la tabla 2.5.
2).- Se ha detectado una actividad enzimática 2,4,6-TCP
metiltransferasa asociada a micelio que mostraba una
cinética de expresión típica de enzimas inducibles. El análisis de la regulación de esta actividad enzimática por glucosa y amonio fue negativo (ver figura 2.6). De hecho los
niveles de 2,4,6-TCA detectados en sobrenadantes de cultivo en todas las condiciones ensayadas fueron muy parecidos, oscilando el nivel de bioconversión en el rango 2939%. Este hecho es significativo si tenemos en cuenta
que en el caso del basidiomiceto P. chrysosporium se ha
observado formación de 2,4,6.-TCA y PCA, a partir de
2,4,6-TCP y PCP respectivamente, cuando el microorganismo crece en un medio que contiente amonio 12 mM
(Bhasker Reddi et al., 1998 y 2000). Sin embargo, en
ausencia de amonio el 2,4,6-TCP es mineralizado a CO2 y
no se detectan niveles de 2,4,6-TCA, lo que sugiere la
existencia de mecanismos regulatorios por fuente de carbono y nitrógeno que controlan la degradación de clorofenoles y lignina y la reacción de O metilación de estos
compuestos en este hongo basidiomiceto.
3.3.2.- ¿Qué ocurre con el resto del 2,4,6-TCP que no es O
metilado a 2,4,6-TCA?.
La degradación de clorofenoles en condiciones aeróbicas
es un fenómeno ampliamente estudiado tanto en hongos
basidiomicetos (Bhasker Reddi et al., 1998 y 2000; Ullah
et al., 2000; Leontievsky et al., 1997 y 2000) como en
bacterias (Xun y Orser, 1991; Xun, 1996; Wieser et al.,
1997). Sin embargo, no existen en la literatura trabajos
sobre la degradación de estos compuestos por hongos
filamentosos, a pesar de que como indican Gee y Peel
(1974) un total de 99 de 116 aislados fúngicos de pollo
podían metabolizar 2,3,4,6-TeCP. También Cserjesi y
Johnson (1972) detectaron que T. virgatum podía metabolizar PCP.
En este trabajo hemos detectado que T. longibrachiatum
es capaz de biometilar del 29.2 al 39.5% del 2,4,6-TCP
presente en el medio de cultivo, mientras que el resto del
precursor desaparece totalmente (Álvarez-Rodríguez et al.,
2002a y 2003c). Existen varias posibilidades para explicar este hecho:
1).- Puede que el 2,4,6-TCP sea fijado por el micelio del
hongo. La extracción de éste con metanol y el posterior
análisis por HPLC no permitieron detectar trazas de este
compuesto, lo cual sugiere que no es esta la causa de su
desaparición.
2).- Otra posibilidad es que el compuesto sea degradado
totalmente hasta CO2 (mineralización). Sin embargo, estudios de mineralización de 2,4,6-TCP[14C] realizados en el
laboratorio de la Dra. Mª Jesús Martínez (CIB, CSIC,
Madrid) resultaron negativos, lo cual sugiere que T. longibrachiatum no puede mineralizar este compuesto.
3).- Una tercera posibilidad es que el 2,4,6-TCP sea parcialmente degradado hasta un intermediario incorporado a
biomasa celular o eliminado al medio de cultivo. Dada la
dificultad técnica de este tipo de análisis abordamos el
estudio de esta hipótesis intentando detectar en el hongo
alguna actividad enzimática que pudiera explicar su degradación.
En condiciones aerobias la degradación de 2,4,6-TCP y
PCP consiste en unos pasos iniciales de deshalogenación
oxidativa (en bacterias y hongos) o deshalogenación
reductora (detectada en P. chrysosporium) que producen
intermediarios tipo quinonas, que normalmente son hidroxilados (ver figura 3.1). Sin embargo, las enzimas que llevan a cabo este paso inicial de deshalogenación son diferentes en bacterias y hongos:
- en bacterias la desahalogenación inicial es catalizada
por monooxigenasas intracelulares como la clorofenol 4monooxigenasa de Burkholderia cepacia (Xun, 1996) o
la 2,4,6-TCP-4-monooxigenasa de Azotobacter sp. cepa
G1 (Wieser et al., 1997), que convier ten 2,4,6-TCP en
2,4-diclorobenzoquinona; o la pentaclorofenol hidroxilasa
de Flavobacterium sp. ATCC 39723 (Xun y Roser, 1991),
que transforma PCP en tetraclorodihidroxibenceno.
- por el contrario, en hongos la deshalogenación inicial
es llevada a cabo por enzimas extracelulares del sistema ligninolítico. Así lignina peroxidasa y manganeso
peroxidasa purificadas de Phanerochaete chr ysosporium
pueden catalizar la conversión de PCP a tetraclorodihidroxibenceno (Bhasker Reddy et al., 2000) o de 2,4,6TCP a 2,6-dicloro-1,4-dihidroxibenceno (Bhasker Reddy et
al., 1998). En otros basidiomicetos como Panus tigrinus
o Coriolus versicolor, el 2,4,6-TCP se transforma en 2,6dicloro-1,4-dihidroxibenceno por la acción de manganeso
peroxidasas y lacasas (Leontievsky et al., 2000).
En nuestro laboratorio y en las condiciones en las que
detectamos formación de 2,4,6-TCA y desaparición de
2,4,6-TCP hemos sido incapaces de detectar actividad
monooxigenasa sobre diferentes sustratos como 2,4,5TCP, 2,4,6-TCP o PCP. Este hecho lo podríamos considerar como normal ya que se trata de actividades bacterianas.
Por el contrario, el análisis realizado con sobrenadantes
concentrados de cultivos nos ha permitido detectar la
presencia en T. logibrachiatum de débiles actividades
arilalcohol oxidasa, lacasa y peroxidasa independiente
de manganeso. Estos datos sugieren que la desaparición de 2,4,6-TCP detectada podría deberse a la acción
de estas actividades. En estas preparaciones no pudimos detectar actividad manganeso peroxidasa o lignina
peroxidasa.
En apoyo de esta posibilidad debemos mencionar que la
presencia de lacasas está bien documentada en hongos
filamentosos, aunque su función no es bien conocida:
así en Aspergillus nidulans (Scherer et al., 2001) la
lacasa TILA aparece en el extremo de hifas en crecimiento, aunque su papel se desconoce; en Botr ytis
cinerea las lacasas están implicadas en la degradación
de la fitoalexina resveratrol que actúa como un protector
frente a infecciones fúngicas (Schouten et al., 2002);
por último en Penicillium chr ysogenum se han detectado
varias lacasas implicadas en la degradación de lignina
(Rodríguez et al., 1996).
4).- Otra posibilidad es que el 2,4,6-TCP no sea degradado, sino polimerizado por alguna lacasa para generar
polimeros de alto peso molecular. Así lacasa purificada
de Coriolus versicolor puede destoxificar PCP generando
polímeros de alto peso molecular y sin que exista liberación de cloro (deshalogenación) al medio (Ullah et al.,
2000).
En resumen, estudios preliminares sugieren que la desaparición de 2,4,6-TCP observada en las condiciones de
cultivo utilizadas no es debida a la mineralización del
compuesto o su unión a micelio, y sin descar tar una
posible polimerización, podría deberse a una acción
degradativa mediada por una actividad lacasa o peroxidasa independiente de manganeso.
3.4.- Caracterización de la actividad enzimática 2,4,6TCP metiltransferasa del hongo filamentoso T. longibrachiatum.
Una vez detectada esta actividad enzimática en T. longibrachiatum abordamos su caracterización.
3.4.1.- La actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa es inducible.
Como hemos demostrado la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa de T. longibrachiatum es inducible. Este
hecho es una diferencia notable con la metiltransferasa
bacteriana implicada en la formación de anisoles y tioanisoles detectada en Rhodococcus y Acinetobacter (Neilson
et al., 1988), que es constitutiva, por lo que para realizar
la O metilación de un sustrato no se requiere una exposición previa a clorofenoles. Es posible que el carácter
inducible del enzima de T. longibrachiatum proporcione al
hongo alguna ventaja, ya que probablemente resulte en
una respuesta más fuerte frente a clorofenoles en un
tiempo más corto, con la posibilidad adicional de una
modulación de la intensidad de la respuesta y el consiguiente ahorro energético para la célula.
El análisis de diferentes compuestos aromáticos y organoclorados como posibles inductores indicó que esta actividad es inducida de manera eficaz y específica no sólo
por 2,4,6-TCP, sino por clorofenoles con al menos tres
átomos de cloro en su molécula.
Otros compuestos clorados y derivados o no del fenol
como triclorobenceno, hexaclorobenceno y hexaclorociclohexano no se comportaron como inductores, como tampoco el fenol y otros compuestos aromáticos no clorados.
El efecto inductor parece ser independiente de las condiciones nutricionales del cultivo, como se deduce de las
gráficas de la figura 2.6. En efecto, los niveles de bioconversión detectados variaban ligeramente en el rango 29.239.5%, aunque en el medio hubiese una alta concentración de glucosa (2%), amonio (50 mM) o ambos. Por el
contrario, la formación de 2,4,6-TCA y PCA por P. chrysosporium (Bhasker Reddy et al., 1998, 2000) está regulada
nutricionalmente, ya que sólo se detecta en condiciones
HCHN (del inglés High Carbon-High Nitrogen); esto es,
cuando el cultivo se desarrolla en condiciones no limitantes de fuente de nitrógeno (amonio 12 mM). Cuando el
cultivo se realiza en condiciones limitantes de nitrógeno
(condiciones HCLN) no se detecta producción de anisoles.
La ausencia de regulación nutricional de la 2,4,6-TCP
metiltransferasa de T. longibrachiatum sugiere un posible
papel de la O metilación de clorofenoles en la destoxificación de estos compuestos altamente contaminantes.
Parece claro que en la naturaleza podría ser peligroso
para un microorganismos estar expuesto a clorofenoles en
unas condiciones de represión de la reacción de O metilación, lo que evitaría su detoxificación y podría resultar en
la muerte del microorganismo.
3.4.2.- Características de la 2,4,6-TCP metiltransferasa.
La producción de anisoles está ampliamente documentada
en la naturaleza. De hecho se han encontrado como contaminantes en alimentos como huevos y pollos (Engel et al.,
1966; Curtis et al., 1974), patatas (Cserjesi y Johnson,
1972), frutas secas (Tindale et al., 1989), café (Spadone
et al., 1990) y agua para bebida (Nystrom et al., 1992).
Además se ha detectado la producción de anisoles por
cepas de Rhodococcus y Acinetobacter (Allard et al.,
1987, Neilson et al., 1988), el alga unicelular Euglena gracilis (Drotar y Fall, 1985a y 1985b), el protozoo
Tetrahymena termophila (Drotar y Fall, 1986), la levadura
Sacharomycopsis lipolytica (Drotar et al., 1987) y hongos
basidiomicetos como Phanerochaete chrysosporium
(Bhasker Reddy et al., 1998 y 2000) y Phellinus pomaceus (Harper et al., 1989; McNally y Harper, 1991).
A pesar de ello, el significado biológico de las reacciones
de O metilación es poco conocido: únicamente se ha
caracterizado de manera muy preliminar una metiltransferasa de Rhodococcus sp. 1395 implicada en la formación
de anisoles y tioanisoles (Neilson et al., 1988) y se ha
purificado una metiltransferasa específica para fenoles
2,4-disustituídos de P. chrysosporium (Coulter et al.,
1993), que puede O metilar 2,4-DCP y 2,4-DBrP.
La 2,4,6-TCP metiltransferasa de T. longibrachiatum muestra una serie de características que podemos destacar:
Informe Técnico 71
EN EL CORCHO
- El pH óptimo del enzima se sitúa entre 8.2-8.5 (figura
2.9) frente a un pH de 7.0 del enzima de Rhodococcus
sp. 1395 y un rango amplio de pH (7-9) en el caso de la
metiltransferasa de P. chrysosporium.
- La reacción transcurre de manera lineal durante las cuatro primeras horas de reacción (figura 2.10), mientras que
en el caso del enzima bacteriana la linealidad sólo se
mantiene durante la primera hora de reacción.
- El enzima fúngica no requiere EDTA para su actividad, a
diferencia del enzima bacteriano.
- La influencia de varios grupos tíoles sobre la actividad
enzimática fue escasa: únicamente la adición conjunta de
DTT y PMSF supuso un incremento notable del rendimiento de la reacción (42.5%). Por otro lado, el efecto inhibitorio de varios reactivos de grupos tiol (iodoacetamida, Netilmaleimida o p-cloro-mercuriobenzoato) que
generalmente se comportan como inhibidores de metiltransferasas fue pobre. Únicamente el p-cloro-mercuriobenzoato (1 mM) supuso una inhibición de la reacción del
45.2% (± 6.6). Estos datos parecen sugerir la existencia
en el centro activo de al menos un grupo sulfidrilo (-SH),
aunque su papel en el proceso catalítico pudiera no ser
esencial, dado el escaso efecto inhibitorio de este tipo de
compuestos.
- Una de las características más notables de las metiltransferasas que utilizan SAM como donador de grupos
metilo es que la reacción es fuertemente inhibida por el
producto de la reacción SAHC (Poulton, 1981). Esta
norma también es aplicable a la 2,4,6-TCP metiltransferasa de T. longibrachiatum: la inclusión de SAHC 1 mM en
le mezcla de reacción producía una inhibición del 87.1%
(± 5.6).
3.4.3.- Rango de sustratos utilizados por la 2,4,6-TCP metiltransferasa.
Las dos metiltransferasas conocidas hasta la fecha implicadas en la formación de anisoles tienen una amplio
rango de sustratos. Así el enzima de Rhodococcus sp.
1395 es capaz de llevar a cabo la O metilación de una
amplia variedad de cloro y bromofenoles, cloro y bromoguayacoles y cloro y bromocatecoles.
Por otro, la O-metiltransferasa específica para 2,4-fenoles
disustituídos de Phanerochaete chrysosporium tiene,
como indica su nombre, una alta afinidad por fenoles
disustituídos en posiciones orto y para (Coulter et al.,
1993). De hecho metila una gran variedad de 3-metoxi y
3,5-dimetoxi 4-hidroxibenzaldehídos, 4-hidroxiácidos benzoicos y 4-hidroxiacetofenonas. Ello sugiere un posible
papel de esta enzima en la O metilación de compuestos
generados en la degradación de la lignina, posiblemente
para hacerlos más fácilmente atacables por enzimas del
aparato ligninolítico. Además, de manera secundaria esta
enzima metila con alta eficiencia 2,4-DCP y 2,4-DBrP. Esta
enzima pudiera ser responsable de la formación del
2,4,6-TCA y PCA detectados en cultivos de este basidiomiceto en condiciones no limitantes de fuente de nitrógeno.
El enzima 2,4,6-TCP metiltransferasa detectada en T. longibrachiatum tiene un rango de sustratos claramente diferente a ambas enzimas (ver tabla 2.13). Son varias sus
características destacables al respecto:
- Es altamente específica de fenoles halogenados. De
hecho no es capaz de O metilar una amplia variedad de
compuestos aromáticos no halogenados como fenol, guayacol (2-metoxifenol), catecol (1,2-dihidroxibenceno); aldehídos como el 3,4-hidroxibenzaldehído o la vainillina (4hidroxi-3-metoxi benzaldehído); o ácidos benzoicos como
el vainíllico (4-hidroxi-3-metoxi benzoico) o el isovainíllico
(3-hidroxi-4-metoxi benzoico). Este hecho la diferencia claramente de las dos enzimas antes mencionadas. A la
vista de estos datos, y aunque a lo largo del texto el nombre que se ha utilizado para el enzima es el de 2,4,6-TCP
metiltransferasa, creemos que una denominación más
acertada seria la de clorofenol O-metiltransferasa o de
manera abreviada CPOMT.
- Entre los fenoles halogenados el enzima metila con
mayor eficiencia clorofenoles que bromo o yodofenoles.
Así la actividad relativa desarrollada frente a 2,4,6-TCP
fue de 59.91%; muy superior que frente a 2,4,6-TBrP
(12.98%) o 2,4,6-TIP. Curiosamente no pudimos detectar
O metilación de 2,4,6-TFP.
Estos datos son muy interesantes ya que parecen sugerir
que la capacidad de metilación de esta metiltransferasa
depende de características estructurales o estéricas de
los sustratos, más que de propiedades electrónicas, pues
en este caso cabría haberse detectado metilación del
2,4,6-TFP. Un comportamiento similar ha sido detectado
para la O-metiltransferasa específica de fenoles 2,4-disustituídos de P. chysosporium (Coulter et al., 1993). El enzima parece poseer una mayor actividad hacia clorofenoles,
posiblemente por ser más abundantes en la naturaleza
que bromo y yodofenoles. De hecho a medida que el volumen del halógeno sustituyente aumenta el actividad del
enzima parece disminuir.
- En función de los niveles de metilación de los diferentes
sustratos ensayados parece ser que la halogenación de la
posición dos (orto) parece ser importante para la actividad, aunque no necesaria. De hecho el único CP metilado
fue el 2-CP, mientras que 3-CP y 4-CP no fueron sustratos
efectivos en la reacción. Además, entre los DCPs el sustrato biometilado con mayor eficiencia fue el 2,4-DCP,
mientras que la eficiencia de la reacción disminuyó de
manera progresiva para el 2,3-DCP, 2,5-DCP, 2,6-DCP y
3,4-DCP (no detectándose actividad sobre el 3,5-DCP).
- Cuando se analiza el nivel de actividad frente a DCPs,
TCP, y TeCPs se deduce que, una vez halogenada la posición dos, la introducción adicional de un átomo de cloro
en la posición seis supone un impedimento estérico para
la actividad enzimática. Para realizar esta aseveración
nos basamos en los siguientes datos:
* La actividad frente a 2,4-DCP (100%) es mucho mayor
que frente a 2,6-DCP (10.36%) o 2,4,6-TCP (59.91%).
* Si analizamos el nivel de metilación de TCPs y TeCPs
vemos que la actividad frente a 2,3,4-TCP (93.33%) es
mayor que frente a 2,3,6-TCP (55.58%), mientras que la
halogenación de la posición seis del 2,3,4-TCP produce
2,3,4,6-TeCP, compuesto que no es metilado. Por otro
lado el nivel de metilación del 2,4,5-TCP (64.19%) es
superior que el del sustrato 2,4,6-TCP.
* Entre los TeCPs el único metilado fue el 2,3,4,5-TeCP,
mientras que la actividad fue nula frente a 2,3,4,6-TeCP y
2,3,5,6-TeCP, ambos con un átomo de cloro en posición
seis.
* Sin embargo, es necesario hacer notar que el nivel de
O metilación del PCP (10.07%) fue sólo ligeramente
menor que el del 2,3,4,5-TeCP (10.73%), cuando quizás
habría cabido esperar una ausencia total de actividad
frente a este compuesto, si tenemos en cuenta que el
PCP tiene ocupada la posición seis y un átomo más de
cloro que 2,3,4,6-TeCP y 2,3,5,6-TeCP.
3.5.- Perspectivas futuras.
El trabajo que hemos descrito se enmarca dentro de una
línea de investigación (iniciada en enero de 2000) que
tiene como objeto la búsqueda de posibles soluciones
biotecnológicas al problema de la contaminación del corcho, producido por 2,4,6-TCA. Este planteamiento tiene,
sin embargo, que enfrentarse a un serio problema: el
escaso conocimiento general sobre el cork taint. En efecto, aunque los compuestos químicos responsables de
este fenómeno se identificaron en la década de los años
80 (Maujean et al., 1985; Amón et al., 1989), el conocimiento acerca de los microorganismos productores y,
sobre todo, de los mecanismos moleculares implicados
en su formación es muy escaso.
Nuestro trabajo ha pretendido tratar de identificar los
microorganismos productores de 2,4,6-TCA, así como los
procesos implicados en su producción. A la vista de los
resultados expuestos en este trabajo podemos establecer
las siguientes premisas:
- El verdadero problema del cork taint no es la presencia
de microorganismos en el corcho, sino la absorción de
pesticidas clorofenólicos por la corteza. Dichos clorofenoles serían destoxificados, principalmente por hongos filamentosos, para producir cloroanisoles no tóxicos.
- Controlar el contacto de clorofenoles con el árbol es
casi imposible si tenemos en cuenta que el amplio uso
de estas sustancias durante décadas, unido a su recalcitrancia a la degradación, ha provocado que contaminen
todos los ecosistemas aéreos, acuáticos y terrestres.
- Algunos autores han postulado la posibilidad de manu-
facturar los tapones de corcho en un ambiente libre de
microorganismos (Butzke et al., 1999). Creemos que este
planteamiento es equivocado por dos razones: en primer
lugar, prácticamente todas las planchas de corcho tienen
unos niveles basales de 2,4,6-TCA; por otro lado, la manufactura de tapones en un ambiente estéril encarecería tanto
el tapón que posiblemente el coste económico para las
bodegas sería inasumible. Por ello, planteamos como posible solución biotecnológica el desarrollo de dos tipos de
estrategias para controlar la presencia de cloroanisoles en
corcho:
1).- En primer lugar el desarrollo de inóculos microbianos
para crecer sobre corcho basados en la cepa Trichoderma
longibrachiatum CECT 20431 (caracterizada en este trabajo), aprovechando las propiedades que hacen del género
Trichoderma un microorganismo ideal para su uso como
agente de control biológico (Hjeljord y Tronsmo, 1998).
Las características de estos inóculos serían las siguientes:
a).- Buena capacidad de crecimiento sobre corcho. Esta
cepa muestra un crecimiento invasivo sobre corcho, de
manera que podría evitar el crecimiento de otros hongos
indeseables.
b).- Capacidad de degradar el precursor 2,4,6-TCP. En
ensayos en medio líquido sólo una parte del 2,4,6-TCP se
convierte a 2,4,6-TCA siendo el resto del precursor degradado (Álvarez-Rodríguez et al., 2002a y Álvarez-Rodríguez,
2003c)
c).- Incapacidad de producir 2,4,6-TCA por interrupción del
gen codificante de la metiltransferasa. La purificación de
la clorofenol O-metiltransferasa (CPOMT) nos permitirá la
determinación de la secuencia de algún péptido de la proteína. A partir de sus secuencias podremos clonar el gen.
Una vez clonado el gen se procederá a su interrupción
génica para obtener cepas deficientes en CPOMT.
d).- Producción de lacasas por expresión de genes codificantes de lacasas que permitan la oxidación (polimerización) del precursor 2,4,6-TCP, evitando su disponibilidad
para la síntesis de 2,4,6-TCA. Las lacasas son enzimas
que muestran una alta capacidad de oxidación de derivados fenólicos (Reinhammar y Malmstrom, 1981; Bollag et
al., 1988; Ullah et al., 2000).
e).- Muy baja probabilidad de producción de micotoxinas.
El género Trichoderma es reconocido como GRAS
(Generally Recognized As Safe) (Nevalainen et al., 1994) y
la producción de micotoxinas es anecdótica. Este hecho
Informe Técnico 73
EN EL CORCHO
hace del género Trichoderma un candidato ideales para
su posible uso en aplicaciones agroalimentarias.
2).- Producción de preparados enzimáticos a base de lacasas para lavar el tapón antes del envasado y eliminar
cualquier resto de clorofenoles y cloroanisoles. Se trata
de obtener a partir de cultivos de hongos preparados que
contengan lacasas que se utilizarían para el lavado superficial de tapones, a fin de eliminar cualquier resto de clorofenoles o cloroanisoles presentes en el tapón.
La obtención de este tipo de extractos semipurificados
podría una solución adicional y barata para el problema
del cork taint. Para ello optimizaríamos la expresión de
genes codificantes de lacasas de basidiomicetos en T.
longibrachiatum. Una preparación de lacasa con el nombre comercial de SUBERASE es comercializada por Novo
Nordisk. Sin embargo, su utilización por las industrias que
manufacturan corcho ha sido ampliamente rechazada
ante el prohibitivo precio de las preparaciones. En nuestro
caso se trataría de transferir a las empresas una tecnología barata de producción propia o en su defecto poder
proporcionar una alternativa mucho más económica.
Ambos tratamientos deberían permitirnos obtener tapones
libres de cloroanisoles, cuya utilización en el envasado de
vinos españoles podría, sin duda, aumentar su calidad
frente a vinos competidores producidos en otros países.
5.- La producción de 2,4,6-TCA en cultivos de T. longibrachiatum en medio líquido no está sometida a regulación catabólica por glucosa ni a represión por amonio.
6.- En T. longibrachiatum la O metilación de 2,4,6-TCP
es llevada a cabo por una O-metiltransferasa inducible
dependiente de S-adenosilmetionina como donador de
grupos metilo que denominaremos clorofenol O-metiltransferasa.
7.- T. longibrachiatum posee unos niveles basales bajos
de esta metiltransferasa, pero su síntesis es inducida
de manera específica por exposición a clorofenoles,
especialmente si tienen tres o más átomos de cloro en
su molécula.
8.- El enzima clorofenol O-metiltransferasa de T. longibrachiatum ha sido purificada a homogeneidad, un total
de 222.67 veces a par tir de extractos acelulares.
9.- Esta enzima tiene un peso molecular nativo de
112.000 daltons, mientras que el tamaño molecular en
condiciones desnaturalizantes es de 52.500 daltons, lo
que indica que en su forma nativa es un dímero.
4.- CONCLUSIONES
1.- El corcho es un ecosistema microbiano complejo a
par tir del cual podemos aislar una gran variedad y cantidad de microorganismos. En nuestro caso se aislaron
55 microorganismos diferentes: 14 hongos filamentosos, 8 levaduras, 13 actinomicetos y 20 bacterias no
filamentosas.
2.- La capacidad de producir 2,4,6-TCA a par tir de
2,4,6-TCP está muy extendida entre los hongos filamentosos. De un total de 14 aislados, 11 fueron capaces
de producir este compuesto cuando crecían directamente sobre corcho.
3.- En Trichoderma longibrachiatum el único mecanismo
detectado capaz de generar 2,4,6-TCA fue la O metilación de 2,4,6-TCP.
4.- En cultivos en medio líquido la eficiencia de O metilación del 2,4,6-TCP por T. longibrachiatum oscila entre
el 29.2 y el 39.5%, mientras que el resto del pesticida
desaparece del medio de cultivo.
10.- La clorofenol O-metiltransferasa de T. longibrachiatum puede ser identificada mediante fotomarcaje con Sadenosilmetionina tritiada.
11.- La reacción catalizada por esta enzima es altamente específica de fenoles halogenados, siendo el 2,4DCP el compuesto metilado con mayor eficiencia.
12.- La clorofenol O-metiltransferasa metila de mayor a
menor eficiencia los sustratos 2,4,6-TCP, 2,4,6-TBrP y
2,4,6-TIF, mientras que no metila 2,4,6-TFP. Por lo tanto
desarrolla una mayor actividad frente a clorofenoles
que frente a fenoles halogenados con bromo, yodo o
fluor.
13.- El corcho es por tanto un ecosistema microbiano
en el que podemos encontrar microorganismos potencialmente responsables del problema del sabor a corcho y/o moho de los vinos (cork taint).
ABREVIATURAS
A: absorbancia
ADN: ácido desoxirribonucleico
ADNr: ADN ribosomal
5'-AMP: adenosina-5'-monofosfato
ARN: ácido ribonucleico
AU: unidades de absorbancia
BSA: albúmina sérica bovina
ºC: grado centígrado
CECT: Colección Española de Cultivos Tipo
Ci: curio
CPOMT: clorofenol O-metiltransferasa
Cys: cisteína
Da: dalton
DEAE: dietilaminoetil
DMSO: dimetilsulfóxido
DNAsa: desoxirribonucleasa
DO: densidad óptica
DTT: ditiotreitol
EDTA: ácido etilén diaminotetraacético
FPLC: cromatografía líquida de desarrollo rápido
g: gramo
h: hora
HPLC: cromatografía líquida de alta presión
Kav: constante de proporcionalidad de filtración en gel
kb: kilobase.
Ki: constante de inhibición
Km: constante de Michaelis-Menten
M: molar
mAU: miliunidades de absorbancia
Mr: masa molecular
MTHF: 5-metiltetrahidrofolato
p/v: relación peso-volumen
PAGE: electroforesis en geles de poliacrilamida
PMSF: fluoruro de p-metilenfenilsulfonilo
RFLP: polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción
r.p.m.: revoluciones por minuto
SAHC: S-adenosil-homocisteína
SAM: S-adenosil-L-metionina
SDS: dodecil sulfato sódico
SDS-PAGE: electroforesis en geles de poliacrilamida con
dodecil sulfato sódico
Ser: serina
Tris: tris (hidroximetil) aminometano
U: unidad (de actividad enzimática)
UFC: unidad formadora de colonia
UV: ultravioleta
v: velocidad de reacción
Vmax: velocidad máxima de reacción
v/v: relación volumen-volumen
Abreviaturas de compuestos aromáticos y fenoles halogenados
CA: cloroanisol
CP: clorofenol
DBrP: dibromofenol
DCA: dicloroanisol
DCP: diclorofenol
2,6-DMP: 2,6-dimetoxifenol
HCB: hexaclorobenceno
HCCH: hexaclorociclohexano
TBrA: tribromoanisol
TBrP: tribromofenol
TCA: tricloroanisol
TCB: triclorobenceno
TCP: triclorofenol
TeCA: tetracloroanisol
TeCP: tetraclorofenol
TFA: trifluoroanisol
TFP: trifluorofenol
TIA: triyodoanisol
TIP: triyodofenol
PCA: pentacloroanisol
PCP: pentaclorofenol
Informe Técnico 75
EN EL CORCHO
5.- Referencias bibliográficas
- Álvarez-Rodríguez, ML. (2001). "Aislamiento y caracterización de microorganismos productores de guayacol y
2,4,6-tricloroanisol a partir de corcho". Tesis de
Licenciatura. Facultad de Ciencias. Universidad de
Extremadura.
- Álvarez-Rodríguez, ML; López-Ocaña, L; López-Coronado,
JM; Rodríguez, E; Martínez, MJ; Larriba, G y Coque, JJR.
(2002a). "Cork taint of wines: role of the filamentous fungi
isolated from cork in the formation of 2,4,6-trichloroanisole by O methylation of 2,4,6-trichlorophenol". Appl.
Environ. Microbiol. 68: 5860-5869.
- Álvarez-Rodríguez, ML; Larriba, G y Coque, JJR. (2002b).
"Microbiology of cork: isolation of microorganisms producing 2,4,6-trichloroanisole and suberolytic microorganisms". En: "Proceedings of the I World Cork Congress on
Cork and Cork Oak". Pag. 831-837. Ed. APCOR. Santa Mª
de Lamas, Portugal.
- Álvarez-Rodríguez, ML; Belloch, C; Villa, M; Uruburu, F;
Larriba, G y Coque, JJR. (2003a). "Degradation of vainillic
acid and biosynthesis of guaiacol by microorganisms isolated from cork samples". FEMS Microbiol. Letters 220: 4955.
- Álvarez-Rodríguez, ML; Larriba, G y Coque, JJR. (2003b).
"Cork taint of wines: a microbiological problem with a biotechnological solution?". En "Useful Microorganisms for
health care, foods and enzyme production". Pag. 257-268.
Ed. Research Signpost. Kerala, India.
- Álvarez-Rodríguez, ML. (2003). "Análisis de la producción 2,4,6-tricloroanisol por hongos filamentosos aislados
de corcho". Tesis Doctoral. Universidad de Extremadura.
- Aleixandre, L y García, M. (1993). "El tapón de corcho".
Vitivinicultura. 5(6): 52-65.
- Allard, AS; Remberger, M y Neilson, AH. (1987).
"Bacterial O-Methylation of Halogen-Substituted Phenols".
Appl. Environ. Microbiol. 54: 839-845.
- Amon, JM; Vandeepeer, JM y Simpson, RF. (1989).
"Compounds responsable for cork taint". Aust. Ans New
Zeal. Wine. Ind. J. 4: 62-69.
- Attieh, JM; Hanson, AD y Saini, HS. (1995). "Purification
and characterization of a novel methyltransferase responsible for biosynthesis of halomethanes and methanethiol in
Brassica oleracea". J. Biol. Chem. 270: 9250-9257.
- Azcón-Bieto, J y Talón, M. (1993)."Fisiología y bioquímica vegetal". Ed. Interamericana McGraw-Hill.
- Bhasker Reddy, GV; Sollewijn, MD y Gold, MH. (1998).
"Degradation of 2,4,6-trichlorophenol by Phanerochaete
chrysosporium: involvementof reductive dechlorination".
Appl. Environ. Microbiol.180: 5159-5164.
- Bhasker Reddy, GV y Gold, MH. (2000). "Degradation of
pentachlorophenol by Phanerochaete chrysosporium: intermediates and reactions involved". Microbiology 146: 405413.
- Bernards, MA; Lopez, ML; Zajicek, J y Lewis, NG. (1995).
"Hydroxycinnamic acid-derived polymers constitute the polyaromatic domain of suberin". J. Biol. Chem. 270: 73827386.
- Beuchat, L.R. (1983). "Influence of water activity on
growth, metabolic activities and survival of yeasts and
moulds". J. Food Protect. 46: 135-141.
- Bollag, JM; Shuttleworth, KL y Anderson, DH (1988).
"Laccase-Mediated detoxification of phenolic compounds".
- Bureau, G; Charpentier-Massonat, M, y Pansu, M.
(1974). "Etude des gouts anormaux apportes per le bouchon sur le vin de Champagne". Revue Francaise
d`Oenologie 56: 22-24.
- Buser, H-R; Zanier, C y Tanner, H. (1982). "Identification
of 2,4,6-trichloroanisole as a potent compound causing
cork taint in wine". J. Agr. Food. Chem. 30: 359-363.
- Butzke, CE; Evans, TJ y Ebeler, SE. (1999). "Detection of
cork taint in wine using automated solid-phase microextraction in combination with GC/MS-SIM". Chemistry of wine
flavor. Waterhouse, AL and Ebeler, SE. Editores.ACS
Symposium Series. American Chemical Society. Washington
D.C.
- Caldas, MM; Ferreira, JM y Borges, J. (1985). "Abordaje
de la caracterización química del corcho en las varias etapas de aprovechamiento industrial". Cortiça. 560: 549.
- Calvo, MA; Larrondo, J y Agut, M. (1993). "Microbiología
de los tapones de corcho". Aecork News 12: 18-19.
- Calvo, MA; Agut, M; Larrondo, J; Esteban, C y Codina J.
(1995). "Identification of fungal hyphae an conidia in sampled of altered corks". Microbios 81: 41-44.
- Calvo, MA y Agut, M. (1996). "Microbiological aspects of
cork". Atti del 2º Simposio Internazionale sul sughero. Pavia
(Italia). Editori Pinirolo. Pp. 33-36.
- Chaudhry, GO y Chapalamadugu, S. (1991).
"Biodegradation of halogenated organic compounds".
Microbiol. Rev. 55: 59-79.
- Codina, J; Esteban, C; Calvo, MA y Agut M. (1993).
"Influence of microorganisms in cases of cork taint". Atti
del 5º Simposio Internazionale sul vino. Pavia (Italia). Editori
Pinirolo. Pp. 114-116.
- Conde, E; Cadahía, E; García -Vallejo, MC; Fernández de
Simón, B y González Adrados, JR. (1997). "Low molecular
weight polyphenols in cork of Quercus suber". J. Agric. Food
Chem. 45: 2695-2700.
- Coque, JJR, Álvarez-Rodríguez, ML y Larriba, G. (2003).
"Characterization of an inducible chlorophenol O-methyltransferase from Trichoderma longibrachiatum involved in
the formation of chloroanisoles and determination of its
role in cork taint of wines". Appl. Environ. Microbiol. 69:
5089-5095.
- Coulter, C; Kennedy, JT; McRoberts, WC y Harper, DB.
(1993). "Purification and properties of an S-adenosylmethionine: 2,4-disubstitued phenol O-methyltransferase from
Phanerochaete chrysosporium". Appl. Environ. Microbiol.
59: 706-711.
- Cserjesi, AJ. (1967). "The adaptation of fungi to pentachlorophenol and its biodegradation". Can. J. Microbiol. 13:
1243-1249.
- Cserjesi, AJ y Johnson, EL. (1972). "Methylation of pentachlorophenol by Trichoderma virgatum". Can. J.
Microbiol. 18: 45-49.
- Curtis, RF; Land, DG; Griffiths, MN; Gee, MG; Robinson,
D; Peel, JL; Dennis, C y Gee. JM. (1972). "2,3,4,6-tetrachloroanisol: association with musty taint in chickens and
microbiological formation". Nature. 235: 223-224.
- Curtis, RF; Dennis, C; Gee, JM; Gee, MG; Griffiths, MN;
Land, DG; Peel, JL y Robinson, D. (1974). "Chloroanisoles
as a cause of musty taint in chickens and their microbiological formation from chlorophenols in broiler house liter".
J. Sci. Food. Agr. 25: 811-828.
- Daly, NM; Lee, TH y Fleet, GH. (1984). "Growth of fungi
on wine corks and its contribution to corky taints in wine".
Food Techn. In Australia. 36: 22-24.
- Danesh, P; Velez Caldas, FM; Figueiredo Marques, JJ y
San Romao, MV.(1997). "Mycobiota in Portuguese 'normal' and 'green' cork throughout the manufacturing process of stoppers". J. Applied Microbiol. 82: 689-694.
- Davis, CR; Fleet, GH y Lee, TH. (1981). "The microflora
of wine corks". Grapegrower Winemaker 208: 42-44.
- Dhar, K. y Rosaza, JPN. (2000). "Purification and characterization of Streptomyces griseus catechol O-methyltransferase". Appl. Environ. Microbiol. 66: 4877-4882.
- Drotar, AM y Fall, R. (1985a). "Microbial methylation of
benzenethiols and release of methythiobenzenes".
Experientia. 41: 762-764.
- Drotar, AM y Fall, R. (1985b). "Methylation of xenobiotic
thiols by Euglena gracilis: characterization of a cytoplasmic
thiol methyltransferases". Plant Cell Physiol. 26: 847-850.
- Drotar, AM y Fall, R. (1986). "Characterizationof a xenobiotic methyltransferase and its role in detoxification in
Tetrahymena thermophila". Pest. Biochem. Physiol. 25:
396-406.
- Drotar, AM; Burton, Jr. GA; Tavernier, JE y Fall, R.
(1987). "Widespread occurrence of bacterial thiol methyltransferases and the biogenic emission of methyllated sulfur gases". Appl. Environ. Microbiol. 53: 1626-1631.
- Engel, C; de Groot, AP y Weurman, C. (1966).
"Tetrachloroanisole: a source of musty taste in eggs and
broilers". Science 154: 20-271.
- Eriksson, K.-E; Gupta, JK; Nishida, A y Rao, R. (1984).
"Syringic acid metabolism by some white rot, soft rot and
brown rot fungi". J. Gen. Microbiol. 130: 2457-2464.
- Fumi, MD; Colombi, MG y Bianchi, F. (1985)."Microflora
presente in tappi de sughero non sterlizzati: esame al
microscopio elettronico". Industrie delle Bevande. 14: 450455.
- García-Vallejo, MC; Conde, E; Cadahía, E y Fernández de
Simón, B. (1997). "Suberin composition of reproduction
cork from Quercus suber". Holzforschung 51: 219-224.
- Gee, JM y Peel, JL. (1974). "Metabolism of 2,3,4,6tetrachlorophenol by microorganisms from broiler house litter". J. Gen. Microbiol. 85: 237-243.
- Harper, DB, Hamilton, JTG, Kennedy, JT y McNally, KJ.
(1989). "Chloromethane, a novel methyl donor for biosynthesis of esters and anisoles in Phellinus pomaceus".
- Harper, DB; Buswell, JA; Kennedy, JT y McNally, KJ.
(1990). "Chloromethane, methyl donor in veratryl alcohol
biosynthesis in Phanerochaete chrysosporium and other lignin-degrading fungi". Appl. Environ. Microbiol. 56: 34503457.
- Hjeljord L y Tronsmo, A. (1998). "Trichoderma and
Glyocladium in biological control: an overview". Pag. 131151. En: Trichoderma and Ghlyocladium. Vol2. G.E. Harman
and C.K. Kubicek, eds. Taylor and Francis, Ltd. London.
- James, F; Nolte, KD y Hanson, AD. (1995). "Purification
and properties of S-adenosyl-L-methionine:L-methionine Smethyltransferase form Wollastonia biflora leaves". J. Biol.
Chem. 270: 22344-22350.
- Jeffers, MR; McRoberts, WC y Harper, DB. (1997).
"Identification of a phenolic 3-O-methyltransferase in the lignin-degrading fungus Phanerochaete chrysosporium".
Microbiology 143: 1975-1981.
- Kolattukudy, PE. (1981). "Structure, biosynthesis and biodegradation of cutin and suberin". Ann. Rev. Plant. Physiol.
32: 539-567.
- Kun, EP y Suflita, JM. (1989). "Dehalogenation of pesticides by aeróbic microorganisms in soil and groundwater - A
review -". En: Reactions and movements of organic chemical in soils. Pag. 111-180. Ed. Soil Science Society of
America and American Society of Agronomy. Madison, Wis.
- Lee, TH y Simpson, RF. (1993)."Microbiology and chemistry of cork taints in wine". Wine Microbiology and
Biotechnology. Ed. GH Fleet (Harwood Academic Publishers:
Chur. Switzerland) : 353-372.
- Lefebvre, A; Riboulet, M; Boidron, N y Ribereau-Gayon P.
(1983). "Incidence des microorganismes du liege sur les
alterations olfactives du vin". Science des Aliments. 3:
265-278.
- Leontievsky, AA; Vares, T; Lankinen, P; Shergill, JK;
Pozdnyakova, NN; Myasoedova, NM; Kalkkinen, N;
Golovleva, LA; Cammack, R; Thurston, CF y Hatakka, A.
(1997). "Blue and yellow laccases of ligninolytic fungi".
FEMS Microbiol. Letters. 156: 9-14.
- Leontievsky, AA; Myasoedova, NM; Baskunov, BP;
Informe Técnico 77
EN EL CORCHO
Evans, CS y Golovleva, LA. (2000). "Transformation of
2,4,6-trichlorophenol by the whit rot fungi Panus tigrinus
and Coriolus versicolor". Biodegradation 11: 331-340.
- Maarse, H; Nijssen LM y Angelinas S. (1989).
"Halogenated phenols and chloroanisoles: occurrence, formation and prevention". Actas del 2nd Wartburg Aroma
Symposium.
- Maga, JA. (1978). "Simple phenol and phenolic compounds in food flavour". Cri. Rev. Food Sci. 10: 323-372.
- Maujean, A; Millery, P y Lemaresquier, H. (1985).
"Explications biochimiques et metaboliques de la confusión entre gout de bouchon et gout de moisi". Rev. Franc.
Oenol. 24: 55-62.
- McNally, KJ y Harper, DB. (1991). "Methylation of phenol
by chloromethane in the fungus Phellinus pomaceus". J.
Gen. Microbiol. 137: 1029-1032.
- Mohn, WW y Kennedy, KJ. (1992). "Reductive
Dehalogenation of Chlorophenols by Desulfomonile tiedjei
DCB-1". Appl. Environ. Microbiol. 58: 1367-1370.
- Muñoz, C; Cobos, P; Martínez, G; Soldevilla, C y Díaz,
M. (1996) "Micoflora y patología del alcornoque (Quercus
suber L.)." Ministerio de Agricultura, pesca y Alimentación.
Madrid, España.
- Neidlemann, SL y Geigert, J. (1986). "Biohalogenation:
principles, basic roles and applications". Ellis Harwood,
Chichester chapters.
- Neilson, AH; Allard, A-S; Hynning, P-A; Remberger, M y
Landner, L. (1983). "Bacterial methylation of chlorinated
phenols and guaiacols: formation of veratroles from guaiacols and high-molecular-wight chlorinated lignin". Appl.
Environ. Microbiol. 45: 774-783.
- Neilson, AH, Lindgren, C, Hynning, P y Remberger, M.
(1988). "Methylation of halogenated phenols and thiophenols by cell extracts of Gram-Positive and Gram-Negative
bacteria". Appl. Environ. Microbiology. 54: 524-530.
- Nevalainen, H; Suominen, P y Taimisto, K. (1994). "On
the safety of Trichoderma reesei". J. Biotechnol. 37: 193200.
- Nicholson, DK; Woods, SL; Istok, JD y Peek, DC.(1992).
"Reductive Dechlorination of Chlorophenols by a
Pentachlorophenol Acclimated Methanogenic Consortium"
- Nystrom, A; Grimvall, A; Krantzrulcker, C; Savenhed, R y
Akerstrand, K. (1992). "Drinking-water off-flavor caused by
2,4,6-trichloroanisole". Water Sci. Technol. 25: 241-249.
- Péña-Neira, A; Fernández de Simón, B; García-Vallejo,
MC; Hernández, T; Cadahía, E, y Suárez, JA. (1999)."Low
molecular weight phenols in cork stoppers". Am. J. Enol.
Vitic. 50: 285-290.
- Péña-Neira, A; Hernández, T; García-Vallejo, MC;
Cadahía, E; Fernández de Simón, B y Suárez, JA. (2000).
"Presence of cork-taint responsible compounds in wines
and their cork stoppers". Eur. Food Res. Technol. 211:
257-261.
- Pérez, F y Pérez, MC. (1996)."El alcornoque y el corcho".
Ed. Vicente Rollano. Badajoz. Pag. 149.
- Pollnitz, AP; Pardon, D; Liacopoulos, D; Skouromounis,
GK y Sefton, MA. (1996). "The analisis of 2,4,6-trichloroanisoles in tainted wine corks". Australian J. Grape and
wine Research. 2: 184-190.
- Poulton, JE. (1981). "Transmethylation and demethylation
reactions in the metabolism of secondary plant products".
En: The Biochemistry of plants. (Stumpf, PK y Conn, EE,
editors). Academic Press, London.
- Reinhammar, B y Malmstrom, J. (1981). "Blue Koper-containing oxidases". En: Copper proteins (Metal ions in
Biology). Vol. 3. Spiro TG, editor. Pag. 109-149. John Wiley
and Sons, New York.
- Rodríguez, J; Feraz, A; Nogueira, RFP; Ferrer, I; Esposito,
E y Durán, N. (1997). "Lignin biodegradation by the
Ascomycete Chrysonilia sitophila". Appl. Biochem.
Biotechnol. 62: 233-242.
- Ruiz, OA y Ugalde, RA. (1998). "Partial characterization
and photolabeling of a Rhizobium meliloti polysaccharide
methyltransferase with S-adenosylmethionine". Int.
Microbiol. 1: 225-230.
- Sarrete, M; Nout, MJR; Gervais, P, y Rombouts, FM.
(1992). "Effect of water activity on production and activity
of Rhizopus oligosporus polysacharidases". Appl. and
Microb. Biotechnol. 37: 420-425.
- Scherer, M y Fischer, R. (2001). "Molecular characterization of a blue-copper laccase, TILA, of Aspergillus nidulans". FEMS Microbiol. Lett. 199: 207-213.
- Schouten, A; Wagemakers, L; Stefanato, FL; van der
Kaaij, R y van Kan, JA. (2002). "Resveratrol acts as a
natural profungicide and induces self-intoxication by a specific laccase". Mol. Microbiol. 43: 883-894.
- Silva Pereira, C; Figueiredo Marques, JJ y San Romao
MV. (2000a). "Cork taint in wine: scientific knowledge and
public perception. A critical review". Crit. Rev. Microbiol.
26:147-162.
- Silva Pereira, C; Pires, A; Valle, MJ; Vilas Boas, L;
Figueiredo Marques, JJ y San Romao, MV. (2000b). "Role
of Chrysonilia sitophila in the quality of cork stoppers for
sealing wine bottles". J. Ind. Microbiol. Biotech. 24: 256261.
- Simpson, RF. y Lee, TH. (1990). "The microbiology and
taints of cork and oak". En: Proceedings of the 9th
Internacional Oenological Symposium. (Lemperle, EE. y
Figlestahler, E. editores). Pag. 653-667. International
Association for Modern Winery Technology and
Management.
- Som, S y Friedman, S. (1990). "Direct photolabelling fo
the EcoRII methyltransferase with S-adenosyl-L-methionine". J. Biol. Chem. 265: 4278-4283.
- Spadone, J-C; Takeoka, G y Liadron, R. (1990).
"Analytical investigation of Rio off-flavor in green coffee".
J. Agr. Food. Chem. 38: 226-232.
- Sponholz, WR y Muno, H. (1994). " Corkiness: a microbiological problem?". En: The cork in oenology.
Proceedings of 5th International Congress of Wine.
Chiriotti Editori Pinerolo. Pp. 100-106.
- Suárez, JA. (1992). "El falso gusto del corcho".
Vitivinicultura. 3: 24-26.
- Tanner, H; Zanier, C y Würdig. (1981). "Zur analytischen
differenzierung von muffon und korkgeschmack in wein".
Schweiz. Z. Obst. u. Weinbau. 117: 752-757.
- Tindale, CR; Whitfield, FB; Levingston, SD y Nguyen,
THL. (1989). "Fungi isolated from packaging materials:
their role in the production of 2,4,6-trichloroanisole". J.
Sci. Food Agr. 49: 437-447.
- Turini, P; Kurooka, S; Ster, M; Corbascio, AM y Singer
TP. (1969). "The action of phenylmethylsulfonyl fluoride
on human acetylcholinesterase, chymotyrpsin and
trypsin". J Pharmacol Exp Ther. 167:98-104.
- Ullah, MA; Bedford, CT y Evans, CS. (2000). "Reactions
of pentachlorophenol with laccase from Coriolus versicolor". Appl. Microbiol. Biotechnol. 53: 230-234.
- Whitfield, F; Nguyen, L; Shaw, KJ; Last, JH; Tindale, CR
y Stanley, G. (1985). "Contamination of dried fruits by
2,4,6-trichloroanisole and 2,3,4,6-tetrachloroanisole
absorbed from packaging materials". En: Chem. Ind.
(London); pag. 661-666.
- Whitfield, F; Nguyen, L y Tindale, CR. (1991). "Effect of
relative humidity and incubation time on the O-methylation
of chlorophenols in fibreboard by Paecilomyces varotii". J.
Sci. Food. Agric. 55: 19-26.
- Wieser, M; Wagner, B; Eberspächer, J y Lingens, F.
(1997). "Purification and Characterization of 2,4,6Trichlorophenol-4-Monooxigenase, a Dehalogenating
Enzyme from Azotobacter sp. Strain GP1". J. Bacteriol.
179: 202-208.
- Xun, L. (1996). "Purification and Characterization of
Chorophenol 4-Monooxygenase from Burkhholderia cepacia AC1100". J. Bacteriol. 178: 2645-2649.
- Xun, L y Orser, CS. (1991). "Purification and Properties
of Pentachlorophenol Hydroxilase, a Flavoprotein from
Flavobacterium sp. Srain ATCC 39723". J. Bacteriol. 173:
4447-4453
6.- Agradecimientos
El trabajo aquí expuesto ha sido posible gracias a la financiación del Ministerio de Educación y Cultura y la
Comunidad Europea (Proyecto FEDER 1FD97-1172) y de la
Junta de Extremadura -Consejería de Educación, Ciencia y
Tecnología- (Proyectos IPR00C004 y 2PR01A009).
Deseamos agradecer también el apoyo prestado por el
Instituto para la promoción del corcho (IPROCOR, Mérida),
que amablemente nos ha cedido sus instalaciones para
la realización de todos aquellos estudios que pudieran ser
necesarios y especialmente a D. Miguel Elena Roselló y
D. Luis Javier Ávila por su apoyo y su colaboración técnica
en la realización de los análisis por cromatografía de
gases-masas.
A SANVICORK S.A. (San Vicente de Alcántara, Badajoz) y
especialmente a su director D. Andrés Gilo, por el firme
apoyo al trabajo realizado y la donación de muestras para
su análisis.
Informe Técnico 79
MÉTODO ROSA PARA LA REDUCCIÓN DE TCA EN EL TAPÓN DE
CORCHO
ROSA es la nueva arma de Amorim para combatir el TCA (2,4,6 tricloroanisol) en los tapones de
corcho de las botellas de vino. Los ensayos científicos demuestran que ROSA reduce espectacularmente los TCA y la incidencia de la contaminación por mohos en el vino embotellado.
Miguel Cabral
AMORIM
Sta. María de Lamas
Portugal
Informe Técnico 83
MÉTODO ROSA PARA LA REDUCCIÓN
DE TCA EN EL TAPÓN DE CORCHO
os TCA siguen siendo el mayor obstáculo para
mejorar la regularidad de la fabricación de corchos para vinos.
Se estima que los TCA, contaminantes en trazas
corrientes en las industrias de alimentos y bebidas envasados, son responsables de entre un 70 y un
80% de las incidencias de contaminación relacionada con
el corcho en los vinos. Confieren un sabor a humedad o a
moho a la comida o las bebidas, y, en el vino, pueden
empañar las cualidades afrutadas o volverlo simplemente
imbebible.
Los TCA son detectables en nariz y en el paladar a concentraciones extraordinariamente bajas, una característica que representa una tremenda dificultad para el control de calidad del proceso de producción de tapones de
corcho y de la manipulación y el almacenamiento en
post-producción. Los TCA, compuestos organoclorados
L
Prevención
presentes en la cor teza del alcornoque y en el entorno
de fábrica o de almacén, pueden ser absorbidos rápidamente por el corcho prácticamente en cualquier etapa
de su proceso de fabricación.
Derrotar un contaminante en trazas infinitesimales en
estas circunstancias ha exigido tanto un enorme esfuerzo en I+D como una gran inversión en una nueva planta
y en maquinaria, que, en su momento, se extenderá a
todas las fábricas que Amorim tiene repar tidas por el
mundo.
La estrategia anti-TCA de Amorim
A finales de los años 1990, Amorim acometió un esfuerzo coordinado para atacar las fuentes de TCA en la corteza de alcornoque y la formación de TCA durante el proceso de transformación del corcho. El objetivo consistía
en
Materias primas
· Almacenamiento
selectivo
Limpieza
· Nuevo sistema de
cocción
· Inos II
Higiene
· Ozono
Control de calidad
· Análisis químico
Reducir los TCA
Eliminación
reducir drásticamente la incidencia de TCA en el vino, y,
en última instancia, en conseguir que el corcho dejara
de ser causa de contaminaciones por mohos.
La estrategia adoptada por Amorim consistió en examinar y validar su proceso de producción y desarrollar una
serie de técnicas para prevenir o evitar los TCA y suprimir o eliminar el contaminante en los productos de corcho de Amorim.
Entre las técnicas preventivas aplicadas desde que se
adoptó esta estrategia figuran las siguientes:
·Mejora de los métodos de cosecha del corcho y sus controles
·Controles rigurosos sobre el almacenamiento y el secado de la corteza bruta
·Nuevos procedimientos de compra y selección de corcho
·Sistema de cocción totalmente nuevo para la limpieza
de las planchas de corcho
ROSA
·Proceso de lavado agresivo (INOS I) para los discos de
corcho
·Aplicación de ozono para desodorizar los corchos y prevenir la contaminación microbiana
·Análisis químico exhaustivo para detectar el corcho sospechoso
Estas iniciativas han permitido conseguir un avance significativo en la lucha contra los TCA. Por ejemplo, el
ensayo químico exhaustivo de las planchas de corcho
para detectar la presencia de TCA ha eliminado prácticamente el rechazo sensorial de los tapones de corcho
suministrados a los clientes estadounidenses de
Amorim, gracias a lo cual han cesado las reclamaciones
por presencia de TCA.
Gracias a la utilización de las máquinas de cromatografía de gases quíntuples de que actualmente dispone el
depar tamento de I + D de Amorim, esta sociedad puede
analizar cerca de 2.500 muestras de corcho por semana, y detectar los TCA a muy bajas concentraciones.
Una capacidad analítica de esta magnitud ha permitido
al personal identificar y aislar rutinariamente los lotes
de corcho sospechosos en todas las etapas de producción, mejorando significativamente con ello los procedimientos de control de calidad de Amorim.
La introducción del sistema ROSA constituye el primer
proceso a escala industrial que extrae fiable y significativamente los TCA y otros compuestos volátiles de los
componentes del corcho y de los tapones enteros.
Cómo funciona ROSA
ROSA es la novedad más reciente, y tal vez más importante hasta la fecha de Amorim en su estrategia contra el
TCA.
Es un sistema de purificación patentado, desarrollado
por Amorim a raíz de una intensa labor de investigación
realizada durante más de tres años, que ha conllevado
miles de experimentos y de análisis químicos y un programa de profunda revisión del diseño de procesos.
Los ensayos de validación tanto internos como externos
han confirmado que ROSA reduce los niveles de TCA
volátil hasta en un 80%.
Como consecuencia de estos ensayos, actualmente se
está introduciendo progresivamente el sistema en las
fábricas de productos de corcho para el vino de Amorim.
ROSA se basa en una destilación al vapor controlada,
mediante la cual el vapor y el agua a presión expulsan
los compuestos presentes en cantidades infinitesimales
en las células del corcho.
Para reproducir los ensayos de laboratorio de ROSA a
escala semi-industrial primero e industrial después para
integrar el sistema en el proceso de fabricación industrial
de tapones de corcho, los investigadores e ingenieros de
Amorim han tenido que superar numerosos obstáculos,
entre los que cabe destacar los siguientes.
·Irregularidad de los niveles de reducción de TCA
·Efecto adverso del proceso sobre las propiedades físicas
y la apariencia visual del corcho
·Recontaminación del corcho debida a la condensación
del vapor.
El tratamiento al vapor puede alterar por ejemplo las
propiedades mecánicas del corcho, reduciendo su
elasticidad o compresibilidad y por ende su eficacia
de cierre. También puede modificar su apariencia
visual, que afecta a su clasificación y por lo tanto al
valor comercial del corcho. En el caso de un disco de
corcho o de un tapón de corcho acabado, el tratamiento al vapor puede deformar las dimensiones físicas del
producto, y exigir una rectificación laboriosa y costosa.
En su investigación de estos fenómenos, Amorim ha
obser vado que el vapor a altas temperaturas - aún
siendo más eficaz para eliminar los TCA - afecta proporcionalmente más al corcho que el vapor a menor
temperatura.
Esta obser vación ha exigido la realización de pruebas
para determinar el equilibrio óptimo entre la supresión
de TCA y el nivel de deformación o alteración mecánica, una labor de investigación que continúa todavía.
En 2003, ya se ha per feccionado el proceso ROSA
para el serrín de corcho utilizado en la fabricación de
Informe Técnico 85
MÉTODO ROSA PARA LA REDUCCIÓN
DE TCA EN EL TAPÓN DE CORCHO
tapones aglomerados. El resultado son los tapones
aglomerados tratados con ROSA que, desde el punto
de vista mecánico y funcional, son casi idénticos a los
tapones sin tratar - con la salvedad de que presentan
un riesgo mucho más reducido de contaminación por
TCA. Al día de hoy, la sociedad sigue realizando un
gran esfuerzo de I + D con objeto de optimizar el pro-
ceso para los tapones de corcho enteros.
Incorporación de ROSA a la cadena de producción
Durante los años 2003 y 2004 se irá integrando progresivamente el proceso ROSA en las plantas de pro-
Pruebas de embotellado
El objeto de esta investigación consiste en evaluar la incidencia de contaminación por TCA registrada en el vino embotellado con tapones tratados con ROSA y conservados en condiciones típicas de bodega.
Conversaciones en el Reino Unido
A los ocho meses de su creación, el Centro de Contacto
Minorista de Amorim en el Reino Unido ya ha entablado
un diálogo productivo con todos grandes minoristas de
vino en Gran Bretaña. El centro dirigido por Ann Harkins,
anteriormente directora de control de calidad de una destacada cadena de supermercados en el Reino Unido, es
una iniciativa de Amorim. Se ha creado para fomentar aún
más el contacto directo entre los minoristas del vino y los
proveedores de tapones, con objeto de propiciar una mayor
comprensión entre ellos.
Uno de sus principales objetivos ha sido alejar a los minoristas y a los proveedores de tapones de los estériles debates
públicos sobre asuntos referentes a los tapones de vino,
para que inicien un proceso proactivo de diálogo privado y
constructivo.
Tras la última ronda de conversaciones celebrada en el
mes de septiembre, la retroacción ha sido especialmente
positiva.. "Los minoristas se han quedado impresionados
ante el compromiso de Amorim con el mercado británico y
el hecho de que haya dedicado recursos para atenderlo",
dice la Sra. Harkins.
"También se han enterado de lo que lleva conseguido
Amorim hasta la fecha en su lucha contra los TCA, y la
envergadura del esfuerzo continuo realizado por la empresa en este sentido." Se espera que el centro sea beneficioso para las dos partes. Para los minoristas, este diálogo es una oportunidad de conocer mejor el corcho y sus
capacidades técnicas como tapón, y de transmitir directamente sus necesidades al proveedor de corcho.
Según Ann Harkins, los minoristas valoran la formación
técnica que Amorim está impartiendo a su personal.
También han acogido favorablemente la disposición de
Amorim para ayudarles a desarrollar normas para los
tapones de sus vinos de marca propia.
Además, por primera vez, Amorim recibe información directa
sobre las necesidades del negocio británico del vino y sus
LA CONTAMINACIÓN DE LOS VINOS
POR BRETTANOMYCES DURANTE
VINIFICACIÓN Y LA CRIANZA:
Incidencia, Detección y Medios de
lucha
La aparición de olores fenólicos, animales, con
recuerdos a cueros y orina de caballo en los vinos tintos se deben a la contaminación por levaduras del
género Brettanomyces/Dekkera. Dichas levaduras se
sientes especialmente confortables en ambientes con
poca higiene y son capaces de contaminar el vino el
los diferentes procesos de elaboración y crianza.
Sólo una adecuada técnica de detección de la contaminación y unos procesos de desinfección de los recipientes eficaces y respetuosos con el material, reducirá los efectos indeseables producidos por estos
gérmenes.
Pascal CHATONNET
Laboratoire EXCELL
MERIGNAC
Francia
Figura 2-Limitación de la limpieza de barricas con los caños de
Informe Técnico 89
POR BRETTANOMYCES DURANTE LA
Incidencia, Detección y Medios de lucha
pollution. XIII C6-C14 organohalogens in the lower troposphere of the southern Indian ocean. 1990, Fresenius J.
Anal. Chem., 336, 193-200.
Würdig G. Vorsicht bei der Anwendung von
Fassaussendesinfektionmitteln. Die Weinwir tschaft.
1975, 111, 44, 1250-1251.
Introducción
as levaduras de contaminación pertenecientes
al género Brettanomyces (o a su forma esporulante Dekkera) son conocidas en enología por
los numerosos disgustos que causan (figura 1).
En efecto, el desarrollo de estos gérmenes provoca concretamente la aparición de olores "fenólicos" y
"animales" que evocan el "cuero" o la "orina de caballo"
en los vinos tintos. En el marco del programa de investigación de la tonelería SEGUIN MOREAU, hemos demostrado que este tipo de defecto, calificado de carácter
"fenolado" de los vinos tintos, está directamente vinculado con la presencia de una cantidad excesiva (superior al
valor de su umbral de recuperación en el vino, > 450
µg/l) de etilfenoles malolientes (etil-4-fenol y etil-4guaiacol # 8:1) (CHATONNET et al., 1990, 1992). El olor típico
del etil-4-fenol pasa a ser claramente perceptible a partir
de unos 600 µg/l, y especialmente dominante en concentraciones superiores a dicho valor. Debido a su equipo
enzimático especialmente adaptado, sólo las levaduras
del género Brettanomyces/Dekkera son capaces de formar cantidades importantes de etilfenoles en los vinos
tintos; las bacterias lácticas son incapaces de generar
los niveles necesarios para que aparezca un olor perceptible (CHATONNET et al., 1997).
L
A-Contaminación de los vinos durante su elaboración
Brettanomyces/Dekkera es una levadura sumamente
extendida. Siente predilección ante todo por los grifos
poco limpios, los canalones, las piqueras de las barricas
y las lías. Por lo tanto, no se puede hablar con propiedad
de bodega contaminada o indemne: todas las dependencias de vinificación y de crianza alojan este tipo de gérmenes. Lo único que importa realmente es el nivel de
contaminación y las condiciones de control de las poblaciones en la bodega.
La contaminación más frecuente se produce en el caldo
terminado, durante el proceso de crianza, cuando han
concluido las fermentaciones alcohólica y maloláctica. A
partir de ese momento cesan los fenómenos de antagonismo y de competencia entre microorganismos, y
Brettanomyces bruxellensis, la especie más corriente en
el vino, puede explotar las trazas de azúcares residuales
presentes en todos los caldos (glucosa, fructosa, mano-
sa, galactosa, trehalosa y sacarosa). El desarrollo de
estos gérmenes se puede producir en estricta anaerobiosis; la fermentación de una cantidad próxima a 300 mg/l
de azúcares residuales es suficiente para formar una cantidad de etilfenoles equivalente al valor de su umbral de
percepción (425 µg/l) (CHATONNET et al., 1995). Al final
de la fermentación maloláctica, los vinos secos contienen
en promedio más de 400 mg/l de azúcares fermentables
por Brettanomyces que, teóricamente, permiten la formación de cerca de 600 µg/l de etilfenoles, el valor del
umbral de percepción del etil-4-fenol. Así pues, en principio todos los vinos podrían presentar un carácter "fenolado" en caso de contaminación y de desarrollo de
Brettanomyces.
Sin embargo, existe un "factor de terreno" importante.
Los vinos más ricos, es decir de fuerte graduación alcohólica por proceder de las uvas más maduras, y por tanto de
baja acidez y maceración prolongada, a menudo son más
ricos en sustratos asimilables, y por lo tanto potencialmente más favorables al desarrollo de Brettanomyces sp.
El control exacto del contenido de azúcares residuales al
final de la fermentación alcohólica y maloláctica, en especial de la suma glucosa + fructosa fácilmente accesible,
indica mucho mejor la "sensibilidad" de un vino respecto
al desarrollo de Brettanomyces que la clásica medición de
azúcares reductores químicos, totalmente superada hoy
en día. Esta dosificación basada en ciertas propiedades
reductoras de los azúcares se ve cada vez más expuesta
a numerosas interferencias. Dependiendo de las cantidades de azúcares residuales dosificados, se podrá prestar
más atención a ciertos lotes que a otros; de ese modo se
podrá razonar de forma distinta ciertas mezclas con objeto
de reducir el riesgo de desarrollo de los gérmenes.
La crianza en barricas no induce sistemáticamente una
contaminación de los caldos ni la aparición de un carácter
"fenolado". Ahora bien, la conservación en madera, la utilización de barricas usadas sin someterlas a un buen tratamiento, de bodegas de crianza inadecuadas (variaciones
de temperaturas), de rellenos (oxidación excesiva) y de trasiegos insuficientes (frecuencia de desinfección de barricas…), constituyen una suma de circunstancias que propician la contaminación y el ulterior desarrollo de gérmenes
de contaminación en general y de Brettanomyces sp. en
particular. La utilización de barricas nuevas también es
favorable al desarrollo de estos gérmenes. Se barajan
muchas hipótesis extravagantes para explicar la mayor frecuencia de contaminación de las barricas nuevas en ciertas salas de crianza. La madera de barricas no aporta
azúcares en cantidad suficiente para crear un medio favorable al desarrollo de estas levaduras contaminantes; la
madera nueva tampoco es fuente de innoculum pues el
tueste esteriliza perfectamente las barricas. La realidad
es que, debido a su potencial oxidante mucho mayor y a
la merma a menudo más alta, en especial durante el
periodo estival cuando sube la temperatura de la bodega,
el contenido de dióxido de azufre libre tiende a disminuir
mucho más rápidamente en las barricas nuevas que en
las usadas. Se sabe que por debajo de cierto umbral de
dióxido de azufre libre (ver más abajo), cesa la inhibición
de Brettanomyces, y aparece una alteración proporcional
a la población microbiana.
La contaminación de los vinos también se observa con
frecuencia en caso de dificultad en la terminación de la
fermentación alcohólica y / o maloláctica. En estas condiciones, los caldos permanecen expuestos al calor durante
vinos varias semanas o incluso meses, sin ninguna protección a base de dióxido de azufre y en presencia de
altos contenidos de azúcares. Si por desgracia, los caldos
entran en contacto con Brettanomyces/Dekkera, el resultado puede ser un incremento fuerte y rápido del contenido de etilfenoles. En caso de detección precoz de la contaminación, es preferible sulfitar y filtrar antes de volver a
sembrar, con objeto de prevenir la alteración de todo el
volumen, y sobre todo la contaminación masiva de la
bodega. La flash-pasteurización es un procedimiento eficaz pero especialmente enérgico, y hay que reservarlo
alas situaciones más críticas.
La contaminación durante la fermentación alcohólica, aunque se puede producir, es mucho menos frecuente. En
cambio, cuando se desencadena en el mosto durante la
maceración (vinificación del tinto), a menudo tiene consecuencias dramáticas. Además de la aparición de olores
desagradables, Brettanomyces puede formar cantidades
importantes de acidez volátil (ácidos grasos volátiles, y en
especial ácido acético). Hay que adelantar el trasiego,
pero la contaminación rara vez se limita a una sola cuba,
debido a las contaminaciones cruzadas provocadas por el
material de bodega. Para prevenir este tipo de accidente
son imprescindibles una higiene intachable y una sulfitación adecuada de la vendimia.
En algunas situaciones, hemos observado que ciertas
parcelas presentaban incidentes de contaminación precoz
del mosto con mayor frecuencia que otras. Se ha demostrado (CHATONNET et al., 1999) que las viñas situadas a
sotavento de destilerías, de desagües de bodega o de
montones de orujos en ciertos casos pueden presentar
contaminación en la uva. En efecto, en ocasiones los
montones de orujos almacenados al aire libre contienen
grandes cantidades de gérmenes que el viento y los
insectos que habitan ese medio (en especial las drosófilas) pueden transportar fácilmente hasta las parcelas de
viña. Normalmente, una sulfitación adecuada de la vendimia (al menos 5 g/hl) permite prevenir cualquier accidente durante la fermentación. En caso de cosecha mecánica, se recomienda desinfectar las parcelas de riesgo
después de la vendimia.
B- Detección precoz de la contaminación de los caldos
Las técnicas de microbiología clásica utilizan el cultivo
sobre medios que permiten el recuento específico de los
gérmenes del género Brettanomyces/Dekkera gracias a la
presencia de inhibidores específicos. El principal inconveniente del recuento por cultivo es el tiempo que lleva: hay
que cultivar entre 5 y 8 días para obtener un recuento fiable.
Con objeto de acelerar la respuesta, se puede combinar
la técnica de cultivo con una hibridación directa de las
colonias mediante una sonda específica de
Figura 3 - Detección precoz del desarrollo de Brettanomyces en
vinos en barricas por la método Suivi BRETT® de EXCELL
(en línea de puntos … = umbral de percepción de etilfenoles #
430 µg/l, en línea continua __ = umbral de percepción del etil4-fenol # 600 µg/l)
Brettanomyces sp. acoplada a una peroxidasa (STENDER
H., et al., 1999). Tras el filtrado del cultivo sobre una
membrana durante al menos 40 h, tras la hibridación con
la sonda las microcolonias de Brettanomyces se detectan
gracias a una reacción quimiluminescente. MILLIPORE™
fabrica un kit comercial (Brettanomyces Assay) basado en
este principio, que teóricamente permite un recuento
específico en 48 h. La sensibilidad es de menos de 10
colonias/ml. Sus mediocres resultados parecen ser el
motivo de la retirada temporal de este kit.
Los ensayos de detección immunoquímicos (ELISA) siguen
siendo pesados y poco sensibles. La reacción de polimerización en cadena (PCR) permite amplificar específicamente determinados fragmentos de ADN. Tras la desnaturalización del ADN y la hibridación con ciertos
oligonucleótidos para delimitar fragmentos específicos de
ADN, se lleva a cabo la amplificación mediante una enzima termosensible (Taq DNA Polimerasa) que permite realizar un gran número de ciclos de amplificación con objeto
de obtener una señal detectable en forma de una banda
Informe Técnico 91
de electroforesis. Este método permite un diagnóstico de
presencia / ausencia, pero no una cuantificación de las
poblaciones viables realmente presentes, ni siquiera la
perfecta discriminación entre gérmenes vivos y muertos.
Durante la crianza, en última instancia al vinificador no le
interesa demasiado el recuento de las poblaciones de
gérmenes. Aparte del momento del embotellado, no se
intenta ni se puede perseguir el "cero Brettanomyces"; el
mantenimiento de las poblaciones a un nivel tolerable es
perfectamente suficiente. Ahora bien, esta población tolerable varía de un caldo a otro, y de una bodega a otra.
Por ello, el seguimiento periódico de la evolución del contenido de etilfenoles durante la crianza, y concretamente
durante el periodo estival crítico (periodicidad de mensual
a bimensual), permite dar una respuesta mucho más
adecuada a las necesidades del enólogo y del vinificador
de terreno. El incremento del contenido de fenoles entre
dos controles sucesivos es un indicio indudable de una
multiplicación anómala de Brettanomyces/Dekkera. Pero
sobre todo, se puede comparar directamente el contenido de etilfenoles observado y su tasa de incremento con
el umbral de alteración máximo, con objeto de determinar
la estrategia de acción más adecuada para la situación
(sulfitación de corrección sin trasiego, trasiego, trasiego y
desinfección de recipientes, aislamiento de lotes…). Se
puede tomar una decisión eficaz en 48h.
La Figura 3 presenta un ejemplo concreto de seguimiento
de bodega en 1999. En el lote A, en todo el periodo estival
propicio al desarrollo de gérmenes de contaminación,
nunca hemos detectado contaminación. El lote B de la
misma bodega (Pomerol), pero guardado en barricas distintas (nuevas), ha presentado un ligero incremento del contenido de fenoles en el mes de agosto. Dado que la medición
del SO2 ha indicado un contenido un poco bajo (15 mg/l) y
el trasiego no estaba programado hasta dos meses más
tarde, el reajuste del SO2 en la barrica a un nivel suficiente
(25 mg/l) ha permitido detener la formación de fenoles. En
el lote C, procedente de otra bodega (Châteauneuf-duPape), se ha detectado un fuerte incremento durante el
mismo periodo; también en este caso, el SO2 libre era
demasiado escaso (12 mg/l) pero habida cuenta de la tasa
de incremento de etilfenoles (rebasándose el umbral de
percepción de los etilfenoles), se ha preferido adelantar
más de un mes el trasiego del lote y desinfectar el tonel
(lavado con agua caliente y azufrado a 5 g) antes de volver
a embarrilar el vino sulfitado a 30 mg/l. El lote D corresponde al mismo caldo que el lote C pero sin ninguna intervención: el contenido de etilfenoles ha aumentado rápidamente, superando considerablemente el umbral de
alteración (1780 g/l, indicio de carácter "fenolado" = 4
(concentración / umbral de percepción)); el vino presentaba
un carácter "fenolado" característico que alteraba gravemente su tipicidad aromática. Se puede utilizar esta misma
técnica para detectar las oxidaciones anómalas o el desarrollo de gérmenes bacterianos aerobios.
El desarrollo de técnicas modernas de detección adecuadas
para el seguimiento de la crianza de los vinos y la elabora-
Figura 4 - Evolución de la temperatura de una barrica de 225 l a
distintos niveles durante su lavado (cabezal EKINSA, 25 l/min,
temperatura de salida del agua 85°C,
Generador de agua caliente KARCHER)
La línea de puntos indica el tiempo necesario para alcanzar
55°C a 6 mm en el centro de las duelas
ción de métodos de desinfección de los recipientes de
madera eficaces y que respeten el material permitirán en un
futuro próximo controlar perfectamente el desarrollo de
estos gérmenes de contaminación con objeto de reducir sus
efectos indeseables y de preservar la pureza y la tipicidad
de nuestros vinos.
C- Medios de lucha contra Brettanomyces
1-Higiene de la bodega y los toneles
La utilización de la madera facilita la contaminación de los
vinos, pues este material puede albergar y proteger fácilmente los gérmenes. En caso de crianza prolongada en
barricas (12 meses o más), el mantenimiento de los toneles
y la higiene de la bodega son las únicas herramientas profilácticas de que dispone el bodeguero. Ya hemos demostrado que, a dosis de sulfitación equivalente, las condiciones
de utilización del dióxido de azufre tienen una influencia considerable en la protección del vino. Así pues, el azufrado de
las barricas, al permitir la desinfección simultánea de la
madera y del vino, es la técnica preferente cuando no se
dispone de un medio eficaz para la limpieza de las barricas.
La mera sulfitación del vino no actúa sobre la madera. Los
lavabarricas clásicos no permiten una limpieza suficiente de
las barricas. El lavado in situ, a menos que se utilice hidrolimpiadoras de alta presión con sistemas eficaces de elimi-
e incluso peligrosa. La limpieza de grandes contenedores por estabulación de agua caliente durante varias
horas y con agitación a fin de reducir las diferencias de
temperatura entre la par te superior y el fondo del recipiente resulta sencilla y más eficaz (Figura 5). Para
reducir significativamente las poblaciones microbianas,
es deseable una temperatura mínima de 65° C en el
corazón de la madera. El tratamiento de grandes contenedores por aspersión a baja o a alta presión permite
limpiar adecuadamente las paredes de las cubas, pero
no calentar la masa de la madera a una temperatura
suficientemente elevada.
Incluso después del vaciado, la temperatura de las
capas profundas sigue aumentando, pues el calor de
las capas super ficiales se sigue difundiendo en la
masa durante más de una hora (Figura 5). El agua
caliente se puede reciclar para tratar entre dos y tres
cubas seguidas, siempre que éstas hayan sido per fectamente limpiadas previamente.
Figura 5 - Desinfección de una cuba de 35 hl por estabulación
de agua caliente (temperatura de entrada 85° C, altura: 2,20
m). La flecha indica el comienzo del vaciado del contenedor
nación del agua de lavado para evitar el impacto al fondo de
la barrica y para reducir el agua residual, no asegura una
limpieza suficientemente enérgica (Figura 2, Pag.89).
Para reacondicionar las barricas para cambiar de caldo o de
añada, es imprescindible utilizar agua caliente (85-95°C), a
ser posible a alta presión. Si se desea limpiar realmente la
madera, siempre hay que preferir la utilización de alta presión (120-180 bar) a la baja presión. La alta presión permite
acelerar la limpieza, pero por lo general, el tiempo de tratamiento que se suele dedicar a una barrica resulta insuficiente para desinfectar perfectamente todo el espesor (5 a 10
mm de profundidad) de las barricas usadas. No hay que
temer ningún deterioro de la fibra de la madera por debajo
de 200 bar de presión. Siempre que se utilice agua a temperaturas próximas a 80°C, calentada mediante un generador adecuado, el aumento de la presión y la utilización de
cabezales con rotación tridimensional rápida equipados con
tubos adecuados (chorro de pincel, chorro de pincel giratorio…) permiten acortar el tiempo de tratamiento (que difícilmente podrá ser inferior a 5 minutos/ barrica) y conseguir
un importante ahorro de agua (45 a 75 l/ barrica) con un
resultado satisfactorio (Figura 4).
La desinfección profunda de las barricas contaminadas
exige un lavado prolongado con agua caliente, o, mejor
aún, una pasada de vapor. Incluso al vapor, necesariamente aplicado a madera limpiada previamente, el tratamiento debe durar lo suficiente para eliminar totalidad
de los gérmenes, pues la madera los protege mucho
contra la subida de temperatura. Sin embargo, la manipulación del vapor en grandes cantidades resulta difícil
Si se compran barricas de ocasión, es imprescindible comprobar que no estén contaminadas por contaminantes químicos ni microbiológicos (bacterias acéticas y
Figura 6 - Relación entre el contenido de dióxido de azufre y la
formación de etilfenoles en distintas barricas de un mismo vino
en una misma bodega (según CHATONNET et al, 1992)
Brettanomyces). La introducción de barricas mal conocidas
en un parque sano es una fuente clásica de contaminación
de bodegas cuyas condiciones de crianza y de trabajo de los
vinos son por lo demás satisfactorias.
El aclarado de barricas con agua cargada de ozono (O3), un
gas dotado de importantes propiedades desinfectantes
debido a su fuerte poder oxidante, se presenta actualmente
como una técnica revolucionaria. Si bien es cierto que esta
solución resulta eficaz en materiales lisos e impermeables
(acero y resinas epoxias, por ejemplo), ¡hasta ahora no se
ha aportado ninguna prueba seria de su eficacia sobre las
Informe Técnico 93
barricas de madera, material poroso por excelencia y que
alberga gérmenes a una profundidad de hasta varios milímetros! Por una parte, la reacción muy rápida del ozono con
los componentes de la madera y del vino en la superficie de
las barricas puede impedir gravemente su difusión y su
acción en profundidad. Por otra parte, la oxidación subsiguiente puede favorecer la aparición de ciertas sustancias
volátiles (aunque no necesariamente nauseabundas) que
pueden influir en el aroma de los vinos y de la madera de
forma similar a lo observado en el caso del tratamiento del
agua potable (producción de aldehídos volátiles por oxidación de materias orgánicas). El uso reiterado, así como con
detergentes químicos, también puede reducir más rápidamente los aportes de la madera al vino.
La utilización de productos de limpieza en las barricas se
debe limitar a las barricas muy incrustadas o cuyo origen no
se conozca bien. Los productos utilizados tienen que ser
específicos para esta aplicación, y no se deben utilizar en
cada trasiego, sino sólo para la recuperación periódica
(como mucho anual) del parque de barricas usadas. Hay
Figura 8 - Influencia de las condiciones de crianza en el contenido de etilfenoles de un vino (según CHATONNET et al., 1990).
2-Utilización de dióxido de azufre
En la actualidad, el dióxido de azufre es el único antiséptico
activo sobre Brettanomyces sp. y autorizado en enología.
Por debajo de cierta cantidad de SO2 libre, ya no se inhibe
el desarrollo de Brettanomyces y puede aumentar el contenido de etilfenol (Figura 6).
Figura 7 - Evolución del SO2 molecular activo (A) y de la forma
salificada (S) en función del pH del vino (log S/A = pH - pK con
pK1 = 1,81 y pK2 = 6,91)
que descartar el uso de cualquier producto que contenga
sales de cloro que puedan entrar en contacto directo con la
madera, debido a la formación sistemática de 2,4,6-triclorofenol y al riesgo de degradación de este último en 2,4,6-tricloroanisol (TCA) especialmente maloliente (olor a "moho").
Las formulaciones básicas que contienen fungicidas de
amonio cuaternario son eficaces sobre Brettanomyces, aunque siempre resultan difíciles de eliminar perfectamente en
el aclarado. La utilización de detergentes químicos exige
siempre controlar la ausencia de residuos (control del pH
del agua de aclarado y de la ausencia de residuos tensoactivos).
En realidad, lo que conviene considerar es el SO2 molecular
activo, y no el SO2 libre dosificable propiamente dicho. La
cantidad de SO2 molecular activo depende en buena parte
en primer lugar del pH del vino (Figura 7) y en segundo lugar
de la temperatura; también el contenido de etanol, aunque
en menor medida. El aumento del contenido de etanol y de
la temperatura de crianza del vino incrementa el pK1 del
SO2 lo cual favorece un aumento del SO2 molecular activo y
por lo tanto una mayor protección. Brettanomyces sp. se
inhibe con valores de SO2 molecular activo superiores a
0,30 mg/l aproximadamente, y se destruye rápidamente
por encima de 0,50 mg/l.
Así se explica que los vinos blancos, cuyo pH a menudo
está comprendido entre 3,3 y 3,6 que permite entre un 2%
y un 3% de SO2 molecular, rara vez sean terreno de desarrollo de Brettanomyces sp y en cualquier caso nunca "fenolado". Por ese mismo motivo, muchos de los vinos tintos, con
pH comprendidos entre 3,6 y 4,0 y hoy en día a menudo
entre 3,7 y 3,9, que permite como máximo entre un 1,5 y
un 0,64% de SO2 activo, a menudo son terreno de importante desarrollo de esas mismas levaduras, pese al mantenimiento permanente de niveles de SO2 libre superiores a
25 mg/l.
Para obtener la misma eficacia antiséptica, un vino correctamente protegido por 25 mg/l de SO2 libre a pH 3,65 debe-
SO2 libre (mg/l)
Figura 9 - Evolución del contenido de dióxido de azufre libre de los vinos en barricas entre Junio y Septiembre - Influencia de la edad
de barricas
ría contener más de 35 mg/l de SO2 libre a partir de pH
3,80 y cerca de 60 mg/l con pH 4,0. El incremento regular
del pH de los vinos durante estos últimos años sin duda es
responsable en buena parte del sensible aumento de los
vinos tintos "fenolados"
La crianza en barricas no induce sistemáticamente una contaminación de los vinos ni la aparición de un carácter "fenolado". No obstante, la conservación en madera, la utilización de barricas usadas mal recuperadas, de salas de
crianza inadecuadas (variaciones de temperaturas) y de trasiegos insuficientes (frecuencia, desinfección de las barricas…), constituyen una suma de circunstancias que favorecen la contaminación y el desarrollo excesivo de
Brettanomyces.
La utilización de barricas usadas mal recuperadas facilita la
contaminación de los vinos y los contamina precozmente, al
aportar directamente etilfenoles atrapados en la masa de la
madera (figura 8); este material es sumamente poroso y
alberga las levaduras a mayor o menor profundidad, lo cual
dificulta su eliminación. Pero el uso de barricas nuevas también propicia el desarrollo de esos mismos gérmenes.
Circulan muchas hipótesis extravagantes para explicar la
mayor frecuencia de contaminación de barricas las nuevas
en ciertas salas de crianza: según se dice, las barricas nuevas se contaminan por Brettanomyces en la tonelería; o la
madera aporta azúcar asimilables en cantidades importantes... Pero nada de eso es cierto. La explicación es mucho
más sencilla. En una situación de contaminación, únicamente el contenido de dióxido de azufre libre y activo permite
controlar las poblaciones de Brettanomyces. Debido su
potencial oxidativo muy superior (mayor contenido de taninos elágicos), sobre todo durante el periodo estival, cuando
Figura 10 - Hidrólisis del pirocarbonato de etilo en el vino
sube la temperatura en la bodega, el contenido de dióxido
de azufre libre tiene tendencia a disminuir mucho más deprisa en las barricas nuevas que en las barricas usadas
(Figura 9). Por debajo de cierto umbral, próximo a 20 mg/l
con un pH normal (3,6-3,7), ya no se inhibe Brettanomyces
y aparece una alteración proporcional a la población microbiana.
Las condiciones de utilización del dióxido de azufre pueden
influir considerablemente en la eficacia de la protección
(CHATONNET et al. 1993). Para los vinos en barrica, si no
se utiliza regularmente el agua caliente o el vapor, la sulfitación por sulfatado siempre es más eficaz que el aporte
directo al vino. La forma gaseosa del dióxido de azufre en la
barrica vacía permite una desinfección más eficaz de la
superficie interna de las barricas. La utilización de pastillas
de azufre, siempre que se conserven perfectamente secas,
es preferible a la de mechas, pues permite una dosificación
más precisa. La utilización del SO2 licuado con un dispositivo dosificador adecuado es muy eficaz y de rápida aplicación.
Las pastillas efervescentes de metabisulfito de sodio son
muy fáciles de utilizar y permiten corregir sencillamente el
contenido de dióxido de azufre. No obstante, a veces la
Informe Técnico 95
COMPARACIÓN ENTRE DOS TÉCNICAS DE TOSTADO DE BARRICAS DE
ROBLE FRANCÉS PARA
CHARDONNAY
La intensidad y la técnica de tostado influyen de manera decisiva sobre las características organolépticas que
la barrica va a conferir al vino. La técnica sin circulación de aire aporta una mejor concentración de compuestos aromáticos que la técnica con circulación de
aire. Organolépticamente, el vino queda significativamente más marcado por los aromas procedentes de la
madera en el caso de la técnica de tostado sin circulación de aire, y en particular si la intensidad de tostado
es fuerte.
J. García-Berro Montilla
Bodegas Miguel Torres S.A.
Vilafranca del Penedès (Barcelona), España.
N. Mourey
Tonnellerie Radoux.
Jonzac. France.
M. Torres Maczassek
R. Bobet
Con la colaboración de J.L. Puech, J.C. Boulet y
A. Razungles de INRA de Montpellier.
Informe Técnico 99
COMPARACIÓN ENTRE DOS TÉCNICAS DE TOSTADO
DE BARRICAS DE ROBLE FRANCÉS PARA
e todas las fases de fabricación de la barrica,
una de las que tiene una mayor incidencia
sobre el carácter organoléptico final que se
otorga al vino es, sin lugar a dudas, el tostado.
Tradicionalmente, esta fase se confiaba al personal más experimentado de la tonelería, cuyo juicio y "pericia técnica" imprimían una huella muy personal al resultado
final.
Durante el proceso de tostado se producen aldehídos
furánicos (Furfural, 5-hidroxi-metil-furfural, metil-furfural)
debido a la degradación térmica de los polisacáridos de
las paredes celulares. Chatonnet et al. (1996) indican
una gran concentración de estos compuestos con los tostados de una intensidad considerada como "media", y
una disminución con una intensidad "fuerte". La degradación de la lignina da lugar a la producción de diferentes
fenoles volátiles como el eugenol y el guayacol con aromas de especias y de tostado.
Las concentraciones de isómeros Cis y Trans de la ßmetil-γ-octalactona también se ven afectadas por el proceso de tostado, disminuyendo con los tostados más intensos (Pérez Prieto et al. 2001) y consiguiendo un nivel
óptimo con las intensidades "medias".
La mayoría de los compuestos sufren también los efectos
de una pirólisis a altas temperaturas: al analizar las concentraciones de ácido gálico, de vanillina y de siringaldehído en función de la temperatura de tratamiento de la
madera, Gimenez Martínez R. et al. (1996) determinan
que las concentraciones máximas aparecen a una temperatura próxima a los 165ºC para el ácido gálico y de
185ºC-215ºC para la vanillina y el siringaldehído; Hale
M.D. et al. (1999) llegan a una conclusión similar, precisando que la concentración óptima de vanillina y de siringaldehído se obtiene con temperaturas entre 180ºC200ºC.
Los principales parámetros que el tonelero puede controlar durante el proceso de tostado son la intensidad del
fuego y la circulación de aire en el interior de la barrica.
Estos parámetros condicionan la velocidad de incremento
de la temperatura de las duelas, los umbrales de temperatura a que se llega y la penetración del calor en el interior de la madera. Matricardi L. et al. (1999) han estudiado la influencia de estos parámetros, y han llegado a la
conclusión de que limitando la circulación de aire se producen temperaturas superiores en la superficie de la
madera; una de las consecuencias de ello, entre otras, es
una mayor degradación de los elagitaninos. También han
analizado la variación en el nivel de ennegrecimiento del
interior de la barrica en relación con la concentración de
elagitaninos, y han llegado a la conclusión de que el color
no es un buen indicador de la concentración de elagitaninos de la barrica.
En el trabajo presentado aquí intentaremos caracterizar
D
dos técnicas de tostado diferentes, prestando una atención especial al carácter organoléptico final del vino.
1.- Materiales y métodos
1.1.-Fabricación de las barricas
Las barricas han sido fabricadas por la Tonelería Radoux
en roble francés "Tradition Radoux". Las dos técnicas de
tostado que evaluaremos son las conocidas como "Tipo
Bordeaux" (BU) y "Tipo Bourgogne" (BO). Estas técnicas
se diferencian, en la práctica, por el control de la evacuación del aire caliente en el momento del tostado.
En efecto, en la técnica "Tipo Bordeaux" se limita la evacuación del aire caliente y la circulación de aire fresco.
Los objetivos son dobles:
- por un lado, conseguir una temperatura elevada en la
superficie de la madera (> 230°C) que permita una generación más rápida de aromas de tostado
- por otro lado, mantener una actividad moderada del fuego
que permita un mantenimiento prolongado de la superficie
de la madera a la temperatura de tostado y, en consecuencia, una buena penetración del calor en el interior de las
duelas.
En la técnica "Tipo Bourgogne" se permite una evacuación continua del aire caliente y una circulación de aire
fresco manteniendo abierta la barrica durante el tostado.
De esta manera, la temperatura obtenida en la superficie
interior de la madera es menor (<230ºC) que en el "Tipo
Bordeaux".
La intensidad de tostado se controla mediante la duración
de la fase de tostado. Aquí comparamos dos intensidades: Tostado Medio (TM) y Tostado Fuerte (TF). Los fondos no se tuestan en ninguno de los dos casos. La codificación de las muestras de ensayo es la siguiente:
- CHNM Tostado medio técnica Bordeaux
- CHNF Tostado fuerte técnica Bordeaux
- CHNB Tostado medio técnica Bourgogne
- CHNC Tostado fuerte técnica Bourgogne
Para preparar las barricas antes de su uso, estas se llenan con agua fría a la que se han añadido 25 ppm de
SO2, y se guardan 24 horas de esta manera antes de
vaciarse y entonelarse.
1.2.- Vinificación
La vinificación empezó al final de la vendimia de 2000 en
una partida de Chardonnay. Después del prensado y desburbado, la fermentación alcohólica tuvo lugar en una
cuba de acero inoxidable hasta una densidad 1050. A
continuación pusimos el vino en barrica para terminar la
fermentación alcohólica hasta un azúcar residual inferior
a los 2 g/l. Una vez terminadas las fermentaciones alcohólica y maloláctica, añadimos 5 g/Hl de SO2 y los vinos
se guardaron en lías, sin trasiego, y con un bastoneado
regular. La duración total de la crianza en barrica fue de 8
meses antes de la clarificación (0,5 g/Hl de cola de pescado y 30 g/Hl de bentonita) y embotellado de las muestras. Los análisis químicos y sensoriales que se presentan aquí se realizaron después de una conservación de
6,5 meses en botella.
Inyección directa para Columna Teknokroma Tracer Excel
120 ODSA 5µmx0,25x0,46.
1.3.- Análisis químicos
Para los análisis por CLAR (cromatografía líquida de alta
resolución) se ha utilizado un sistema compuesto por:
- Bombas Waters 510
- Inyectores Waters 712WISP
- Detector de fluorescencia Waters 474
- Detector Diodo-Array PDA 996
Para los análisis por GC-MS hemos realizado una extracción con cartucho LiChrolut Merck EN 200 mg/3ml
Ref 1.19870.000, con el n-octanol como patrón interno.
La cromatografía utilizada es un detector Agilent 6890 MS
Ref 5973 con una columna DB-WAX (30m x 0,32mm x
0,50 µm) J&W Ref 123-7333
1.4.- Análisis sensorial
Para el análisis sensorial, el formulario presentaba siete
descriptores olfativos y cuatro descriptores gustativos, que
debían valorarse sobre una escala continua de 0 a 5 para
cada muestra. Los descriptores utilizados eran:
- Carácter de madera en nariz
- Especias
- Vainilla
- Mantequilla
- Madera verde
- Tostado
- Ahumado
- Carácter de madera en boca
- Astringencia
- Amargor
- Persistencia
p
DESCRIPTOR
Carácter de madera en nariz
0,000013**
Especias
0,903966
Vainilla
0,069021*
Mantequilla
0,085139*
Madera verde
0,550241
Tostado
0,160454
Ahumado
0,090739*
Carácter de madera en boca
0,016336**
Astringencia
0,423483
Amargor
0,251211
Persistencia
0,000007*
Para los análisis por GC-FID hemos realizado una extracción
con freón, con el n-decanol como patrón interno. La cromatografía utilizada es un HP 5890 Serie II con una columna
TR-WAX (60m x 0,25mm x 0,25 µm) Tracer Ref TR-140262.
Al final de la degustación, cada miembro del jurado (once
personas en total) tenía que clasificar las muestras por
orden de preferencia (1ª, 2ª, 3ª, 4ª). Para eliminar el desvío ligado a la amplitud de notación propia de cada miemTécnica Bourdeaux
Tostado medio Tostado fuerte
5-HMF
Técnica Bourgogne
Tostado medio
Tostado fuerte
3,24
2,98
2,33
2,36
Almendra tostada
0,42
0,49
0,21
0,39
Herbáceo
0,047
0,039
0,022
0,025
Coco
0,129
0,135
0,057
0,063
Eugenol
Especias, clavo
0,033
0,032
0,024
0,029
Guayacol
Especias
0,009
0,018
0,007
0,012
Siringol
Ahumado
0,027
0,058
0,028
0,051
Siringaldehído
Vainilla
0,330
0,380
0,290
0,345
Vainillina
Vainilla
0,070
0,073
0,060
0,061
0,013
0,010
0,013
0,009
Metil-furfural
Trans-w-lactona
Cis-w-lactona
Escopoletina
Informe Técnico 101
COMPARACIÓN ENTRE DOS TÉCNICAS DE TOSTADO DE
BARRICAS DE ROBLE FRANCÉS PARA CHARDONNAY
Figura 17
Figura 18
5,00
Figura 19
0,06
0,14
0,05
0,12
4,00
0,10
0,04
3,00
0,06
2,00
0,02
1,00
0,00
0,08
0,03
0,04
0,01
0,02
0,00
CHNM
CHNF
5-HMF
CHNB
CHNC
0,00
CHNM
Metil-Furfural x 10
CHNF
Guayacol
CHNB
Eugenol
CHNC
0,40
0,08
0,35
0,07
0,30
0,06
0,25
0,05
0,20
0,04
0,15
0,03
0,10
0,02
0,05
0,01
0,00
CHNB
CHNC
CHNC
c-w-Lactona
0,016
0,012
0,008
0,004
0,000
CHNM
CHNF
Siringaldehído
bro del jurado, las notas se han centrado y reducido por
miembro y por descriptor antes de su procesamiento estadístico, tal como ha sido explicado por X. Tomàs et al.
(2002). La obtención de los resultados del análisis sensorial y el procesamiento estadístico de los datos se ha realizado con la aplicación FIZZ. Las gráficas se han realizado con Microsoft Graph 2000.
2.- Resultados
2.1.- Análisis sensorial
Después de la normalización de los datos y la aplicación
de un análisis de varianza, aparecen diferencias significativas para los descriptores Carácter de madera en nariz,
Carácter de madera en boca y Persistencia para un
umbral de confianza del 95% (marcados **) y para los
descriptores Vainilla, Mantequilla y Ahumado para un
umbral de confianza del 90% (marcados *). La p representa la probabilidad del ensayo F.
Las figuras 1 a 6 nos muestran estas diferencias con la
media y el intervalo de confianza (95%) para cada uno de
los descriptores.
Si comparamos las técnicas de tostado a una intensidad
CHNB
Figura 22
0,00
CHNF
CHNF
t-w-Lactona
Figura 21
Figura 20
CHNM
CHNM
Siringol
CHNB
Vainillina
CHNC
CHNM
CHNF
CHNB
CHNC
Escopoletina
de tostado equivalente con el ensayo de Student, constatamos que para la intensidad Media aparecen diferencias
significativas para el descriptor Carácter de madera en
nariz en el umbral del 95% y para el descriptor Carácter
de madera en boca en el umbral del 90%, y que los dos
son más evidentes con la técnica "Bordeaux". Las figuras
7 y 8 nos muestran estas diferencias.
Para la intensidad de tostado "Fuerte", aparecen diferencias significativas en el umbral del 95% entre las dos técnicas para los descriptores Carácter de madera en nariz,
Vainilla, Mantequilla, Carácter de madera en boca y
Persistencia; para el descriptor Tostado las diferencias
son significativas en el límite del umbral del 90%. Todos
los descriptores significativos son más marcados con la
técnica de tostado "Bordeaux". Las figuras 9 a 14 nos
muestran estas diferencias.
Si analizamos las preferencias de los catadores, podemos ver muy bien que se prefieren los tostados "Tipo
Bordeaux" (CH1NM y CH1NF) a los tostados "Tipo
Bourgogne" (CH1NB y CH1NC), y que la modalidad menos
apreciada es la Fuerte "Tipo Bourgogne" (ver las figuras
15 y 16).
2.2.- Análisis químico
Los resultados analíticos más significativos son los
siguientes:
La técnica de tostado "Tipo Bordeaux" presenta las concen-
GRÁFICAS
Figura 2. Vainilla
Figura 1. Carácter de madera en nariz.
1,5
1,5
1,0
1,0
0,5
0,5
0,0
0,0
-0,5
-0,5
-1,0
-1,0
-1,5
-1,5
CH1NB
CH1NC
CH1NM
CH1NF
CH1NB
CH1NC
CH1NM
CH1NF
Figura 4. Ahumado.
Figura 3. Mantequilla.
1,5
1,5
1,0
1,0
0,5
0,5
0,0
0,0
-0,5
-0,5
-1,0
-1,0
-1,5
-1,5
CH1NB
CH1NC
CH1NM
CH1NF
CH1NB
CH1NC
CH1NM
CH1NF
Figura 5. Carácter de madera en boca.
1,5
1,0
0,5
0,0
-0,5
-1,0
-1,5
CH1NB
CH1NC
CH1NM
CH1NF
COMPARACIÓN ENTRE DOS TÉCNICAS DE TOSTADO
DE BARRICAS DE ROBLE FRANCÉS PARA
CHARDONNAY
Figura 6. Persistencia.
Tostado medio.
1,5
1,5
1,0
1,0
0,5
0,5
0,0
0,0
-0,5
-0,5
-1,0
-1,0
-1,5
-1,5
CH1NB
CH1NC
CH1NM
Tipo Bourgogne
CH1NF
Tipo Bourdeaux
Tostado fuerte
Tostado medio.
1,5
1,5
1,0
1,0
0,5
0,5
0,0
0,0
-0,5
-0,5
-1,0
-1,0
-1,5
-1,5
Tipo Bourgogne
Tipo Bourgogne
Tipo Bourdeaux
Figura 10. Vainilla
Tostado fuerte
1,5
1,0
0,5
0,0
-0,5
-1,0
-1,5
Tipo Bourgogne
Tipo Bourdeaux
Tipo Bourdeaux
Figura 12. Tostado.
Tostado fuerte
Figura 11. Mantequilla.
Tostado fuerte
1,5
1,5
1,0
1,0
0,5
0,5
0,0
0,0
-0,5
-0,5
-1,0
-1,0
-1,5
-1,5
Tipo Bourgogne
Tipo Bourdeaux
Tipo Bourgogne
Tipo Bourdeaux
Figura 14. Persistencia.
Tostado fuerte
Figura 13. Carácter de madera en boca.
Tostado fuerte
1,5
1,5
1,0
1,0
0,5
0,5
0,0
0,0
-0,5
-0,5
-1,0
-1,0
-1,5
-1,5
Tipo Bourgogne
Tipo Bourdeaux
Tipo Bourgogne
Tipo Bourdeaux
Figura 15. Preferencias
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
CH1NB
CH1NC
CH1NM
CH1NF
COMPARACIÓN ENTRE DOS TÉCNICAS DE TOSTADO DE
BARRICAS DE ROBLE FRANCÉS PARA CHARDONNAY
Nº de observaciones
Figura 16. Preferencias
10
10
8
8
6
6
4
4
2
2
0
0
1
2
3
4
1
2
CH1NB
4
3
4
CH1NC
10
10
8
8
6
6
4
4
2
2
0
0
1
2
3
4
CH1NM
Bibliografía
Chatonnet P., Boidron J.N., 1996. INCIDENCE DU TRAITMENT
THERMIQUE DU BOIS DE CHÊNE SUR SA COMPOSITION CHIMIQUE
1E PARTIE: DÉFINITION DES PARAMÈTRES THERMIQUES DE LA
CHAUFFE DES FÛTS EN TONNELLERIE. J. Int. Sci. Vigne et Vin, vol
23 Nº 2, p. 77-87.
Chatonnet P., Boidron J.N., 1996. INCIDENCE DU TRAITMENT
THERMIQUE DU BOIS DE CHÊNE SUR SA COMPOSITION CHIMIQUE
2E PARTIE: ÉVOLUTION DE CERTAINS COMPOSÉS EN FONCTION DE
L'INTENSITÉ DE BRÛLAGE. J. Int. Sci. Vigne et Vin, vol 23 Nº 4, p.
223-251.
Gimenez Martinez R., López Garcia de la Serrana H., Villalon M.,
Quesada J., López Martinez M.C., 1996. INFLUENCE OF WOOD
HEAT TREATMENT, TEMPERATURE AND MACERATION TIME ON VAINILLIN, SYRINGALDEHYDE, AND GALLIC ACID CONTENTS IN OAK
WOOD AND WINE SPIRIT MIXTURES. American Journal of Enology &
Viticulture, vol 47 Nº 4, p. 441-446.
Hale M.D., McCafferty K., Larmie E., Newton J, Swan J.S, 1999.
THE INFLUENCE OF OAK SEASONING AND TOASTING PARAMETERS
ON THE COMPOSITION AND QUALITY OF WINE. American Journal of
Enology & Viticulture, vol 50 Nº 4, p. 495-502.
3
1
2
CH1NF
Matricardi L. Waterhouse A.L., 1999. INFLUENCE OF TOASTING
TECHNIQUE ON COLOR AND ELLAGITANNINS OF OAK WOOD IN
BARREL MAKING. American Journal of Enology & Viticulture, vol 50
Nº 4, 519-526.
Pérez Prieto L.J., Moya Gálvez M., López Roca J.M., Gómez Plaza
E., 2001. INFLUENCIA DEL ORIGEN DE LA MADERA Y EL NIVEL DE
TOSTADO SOBRE LOS COMPUESTOS AROMÁTICOS EXTRAIBLES DE
VIRUTAS DE ROBLE. Enólogos, Nº 13, 14-18.
Tomàs X., Garcia-Berro J, Torres M., Bobet R., Mourey N., 2002.
PRÉ-TRAITEMENT DE DONNÉES EN ANALYSE SENSORIELLE. Revue
Française d'Oenologie, Nº 197, p. 26-29.
Pretratamiento de datos en
análisis sensorial
Introducción
a colaboración entre Tonnellerie Radoux y
Bodegas Torres nos ha conducido a llevar a cabo
un estudio sobre los diferentes tipos de tostado
(tipo Burdeos y tipo Borgoña), las diferentes
intensidades de tostado (tostado mediano y tostado fuerte) y los diferentes orígenes de la madera de las
barricas.
Los tostados tipo " Burdeos " o " Borgoña " se diferencian
en la práctica en el control de la evacuación del aire caliente
y en el control de la circulación del aire fresco, rico en oxígeno.
El tostado tipo " Burdeos " limita la evacuación del aire
caliente y la circulación del aire fresco. Los objetivos son
dobles:
L
-Por un lado alcanzar un nivel de temperatura elevado en la
superficie de la madera (> 230°C), lo que permite una
generación más rápida de los aromas de tostado.
-Por otro lado mantener una actividad moderada del fuego
(ambiente de combustión progresivamente empobrecido
en O2) que permite un mantenimiento prolongado de la
superficie de la madera a esta temperatura, una mayor
degradación de los taninos elágicos y la generación en la
madera de aromas en profundidad (Matricardi (1)). La consecuencia principal es una cantidad de aromas de tostado
extraíbles más importante.
El tostado tipo " Borgoña " permite una evacuación continua del aire caliente y una circulación ligeramente más
importante de aire fresco. La temperatura alcanzada en la
superficie de la madera es menor (<230°C); la actividad
moderada del fuego permite un mantenimiento prolongado
a esta temperatura.
La cantidad de aromas generados es más débil y la gama
de aromas ligeramente diferente.
Los tostados mediano y fuerte se diferencian al final del
proceso por un calentamiento (bousinage) más o menos
prolongado a niveles de temperatura diferentes (situándose el tostado mediano a niveles de temperatura más
moderados).
Para el estudio de los diferentes orígenes de las maderas,
PRETRATAMIENTO DE DATOS EN ANALISIS SENSORIAL
comparamos una selección de robles de la Europa del
Este de grano fino (" Tradition Centre Europe ") con una
selección de robles del Centro de Francia igualmente de
grano fino (" Tradition Centre France ") efectuadas según
las especificaciones de requisitos de la Tonnellerie
Radoux.
En principio, es conveniente suponer que las puntuaciones
de cada juez en la valoración sensorial de las diferentes
muestras serán homogéneas, de manera que cualquier
diferencia en la puntuación no se deberá más que al tipo,
a la intensidad del tostado o al origen del roble. También
es conveniente suponer que los jueces que tengan un sentido crítico utilizarán un nivel de puntuación más desfavorable que los jueces que tengan un sentido crítico menos
estricto. Este hecho puede introducir en los resultados de
cualquier degustación una desviación debida al criterio previo y subjetivo propio de cada juez.
La posible existencia de esta heterogeneidad obliga, cuando se analizan los resultados de una degustación, a considerar a los jueces como un posible factor de influencia
sobre los resultados, pudiendo llegar a desnaturalizar las
conclusiones sobre la posible existencia de diferencias significativas entre las muestras.
Aparte de esta heterogeneidad, se debe considerar igualmente la que puede provenir de las diferentes sensibilidades (precisiones) con las cuales los distintos jueces puntúan (evalúan) las muestras. Otra hipótesis ideal de trabajo,
muy utilizada en los numerosos tests estadísticos, como
por ejemplo el análisis de la varianza, es que esta variabilidad en la puntuación de cada juez sea también estadísticamente homogénea para todos ellos (Bowker (2)).
Todo lo que ha sido expuesto hasta el presente puede ser
comprendido más fácilmente si se considera a cada juez
como a un complejo instrumento de medida dotado de su
exactitud y precisión propias.
Con el fin de evitar estas dificultades, la Quimiometría
ofrece la posibilidad de realizar, sobre los resultados de
un análisis sensorial, tratamientos previos a su análisis
estadístico, eliminando de esta forma estas posibles heterogeneidades y facilitando su estudio posterior (Meloun
(3)).
En este trabajo en curso exponemos dos tratamientos preventivos de los datos, el centrado y la normalización de
éstos (en inglés " autoscaling "), aplicados a pruebas de
puntuación sensorial realizadas sobre muestras del mismo
vino, otorgadas por diez jueces expertos
Técnicas experimentales y material utilizado
Las pruebas han sido llevadas a cabo con el vino de variedad Merlot, habiendo realizado su fermentación maloláctica en barrica y que en el momento de la degustación de
control había permanecido 2 meses en madera. El vino va
a mantenerse todavía 10 meses en contacto con la barrica y va a estar sometido a otras degustaciones de control.
Ha sido creado un panel de cata compuesto por personal
de dos organizaciones y del INRA y que, además de la
caracterización de cada muestra (ADQ), ha procedido a dar
una puntuación global (escala predefinida 0-10).
Resultados
La codificación de las diferentes muestras es la siguiente :
VINO
VINO
VINO
VINO
VINO
VINO
VINO
VINO
1
2
3
4
5
6
7
8
Madera francesa Tostado mediano tipo Borgoña
Madera francesa Tostado fuerte tipo Borgoña
Madera francesa Tostado fuerte tipo Burdeos
Madera francesa Tostado mediano tipo Burdeos
Madera del Este Tostado fuerte tipo Burdeos
Madera del Este Tostado mediano tipo Burdeos
Madera francesa Tostado fuerte tipo Burdeos
Madera francesa Tostado mediano tipo Burdeos
El cuadro 1 resume los resultados experimentales obteniCuadro 1.- Datos brutos tras la degustación de 8 muestras de vino Merlot por 10 jueces:
Nº Juez
VINO 1
VINO 2
VINO 3
VINO 4
VINO 5
VINO 6
VINO 7
VINO 8
1
7,8
7,5
7,6
7,7
7,8
7,6
7,7
7,5
2
7,6
7,5
7,5
7,6
7,8
7,7
7,9
7,7
3
8
7,2
7,7
7,3
8,2
8
8,2
7,8
4
8,2
7
8,1
8,3
8,7
8
7,9
7,5
5
7,4
7,2
7,6
7
8
7,1
7,2
7
6
7,6
7,2
7,7
7,9
7,5
8
7,6
7
7
6
5
6
4
7
5
5
4
8
4
5
7
5
5
7
6
6
9
5
3,5
4,5
3
5
4,5
4
4
10
5
2
3
3
6
6
3
3
Comentarios
1. El centrado de los datos
Puede ser útil transformar las muestras brutas en muestras centradas para minimizar los efectos de escalón producidos entre los degustadores que puntúan con severidad y los que lo hacen de una forma más generosa
(Samson (4)).
Si se admite que su percepción para diferenciar los vinos
será la misma, pero utilizando de manera diferente la
escala de puntuación, el centrado de los datos puede
minimizar esta diferencia y su tratamiento estadístico ten-
drá más posibilidad de determinar las diferencias entre
los vinos.
El proceso consiste en calcular la puntuación media global ( x ) y las puntuaciones medias de cada uno de los i
jueces ( xi ).
Se obtendrá la nota centrada según la transformación :
cij=xij + ( x - xi ) donde xij es la j-ésima nota del i-ésimo juez
y donde ( x - xi ) es el punto de vista del juez i.
De este modo, sobre los datos brutos obtenidos en los
Cuadro 2.- Notas medias, desviación típica y desvío de cada juez.
Nº de Juez
Nota Media
Desviación típica
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
GLOBAL
7.65
7.66
7.80
7.96
7.31
7.56
5.25
5.63
4.19
3.88
6.49
0.1195
0.1408
0.3817
0.5181
0.3441
0.3335
1.0351
1.0607
0.7039
1.5527
1.6813
Desvío
-
1.16
1.17
1.31
1.47
0.82
1.07
1.24
0.86
2.30
2.61
Lo cual nos conduce a los datos centrados (Cuadro 3).
Cuadro 3.- Datos centrados tras la degustación de 8 muestras de vino Merlot por 10 jueces.
Nº Juez
VINO 1
VINO 2
VINO 3
VINO 4
VINO 5
VINO 6
VINO 7
VINO 8
1
6,64
6,34
6,44
6,54
6,64
6,44
6,54
6,34
2
6,43
6,33
6,33
6,43
6,63
6,53
6,73
6,53
3
6,69
5,89
6,39
5,99
6,89
6,69
6,89
6,49
4
6,73
5,53
6,63
6,83
7,23
6,53
6,43
6,03
5
6,58
6,38
6,78
6,18
7,18
6,28
6,38
6,18
6
6,53
6,13
6,63
6,83
6,43
6,93
6,53
5,93
7
7,24
6,24
7,24
5,24
8,24
6,24
6,24
5,24
8
4,86
5,86
7,86
5,86
5,86
7,86
6,86
6,86
9
7,30
5,80
6,80
5,30
7,30
6,80
6,30
6,30
10
7,61
4,61
5,61
5,61
8,61
8,61
5,61
5,61
Las figuras 1 y 2 nos muestran, con la ayuda de diagramas de cajas, el efecto de estos procedimientos. Hay que
resaltar la homogeneización de la escala de puntuación, siempre conservando la variabilidad propia de cada juez.
Figura 1.- Datos brutos, diagramas de cajas para cada juez.
10
Nota bruta
8
6
4
2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
6
7
8
9
10
JUEZ
Figura 2.- Datos centrados, diagramas de cajas para cada juez.
Nota centrada
10
8
6
4
2
0
1
2
3
4
5
JUEZ
Se puede apreciar la homogeneización de las notas centradas sobre la media global 6,49 y la conservación de la
variabilidad de cada juez.
Si se comprueba la homocedasticidad de los jueces, el
test de Bartlett conduce a desestimar la hipótesis de la
homogeneidad de las varianzas (Discriminante = 2.6899 ;
p < 9,997 10 -11).
Esto puede ser un problema para la aplicación posterior de
otras pruebas estadísticas destinadas a la detección de
las diferencias entre las muestras, como en el caso del
análisis de varianza, debido a la no ejecución de las hipótesis de trabajo.
2. Normalización
Un tratamiento alternativo anterior de los datos, muy frecuentemente utilizado en Quimiometría si se trabaja con
las variables de diferentes magnitudes y/o variabilidad
diferente, es la normalización.
Esto consiste en evaluar para cada juez la puntuación
media ( xi ) y su desviación típica (si), transformando a
continuación cada nota siguiendo la formula :
zij = (xij - xi ) / si
Este tratamiento previo pretende otorgar a cada juez la
misma importancia, independientemente de su percepción
para diferenciar las muestras y de su poder de discriminación, dado que las nuevas puntuaciones transformadas
corresponden, desde el punto de vista estadístico, a variables centradas y reducidas.
De este modo, a partir de los datos brutos obtenidos en
los casos del vino Merlot, se obtienen los datos transformados indicados en el cuadro 4.
Cuadro 4.- Normalización. Notas transformadas (Z) tras la degustación de
8 muestras de vino Merlot por 10 jueces.
Nº Juez
VINO 1
VINO 2
VINO 3
VINO 4
VINO 5
VINO 6
VINO 7
VINO 8
1
1,255
-1,255
-0,418
0,418
1,255
-0,418
0,418
-1,255
2
-0,444
-1,154
-1,154
-0,444
0,977
0,266
1,687
0,266
3
0,524
-1,572
-0,262
-1,310
1,048
0,524
1,048
0,000
4
0,458
-1,858
0,265
0,651
1,424
0,072
-0,121
-0,893
5
0,254
-0,327
0,836
-0,908
1,998
-0,618
-0,327
-0,908
6
0,112
-1,087
0,412
1,012
-0,187
1,312
0,112
-1,686
7
0,725
-0,242
0,725
-1,208
1,691
-0,242
-0,242
-1,208
8
-1,532
-0,589
1,296
-0,589
-0,589
1,296
0,354
0,354
9
1,154
-0,977
0,444
-1,687
1,154
0,444
-0,266
-0,266
10
0,725
-1,208
-0,564
-0,564
1,369
1,369
-0,564
-0,564
La figura 3 nos muestra los diagramas de cajas del efecto de estos procedimientos. Es preciso destacar la homogenización de la escala de puntuación y la variabilidad propia de cada juez.
Figura 3.- Notas transformadas (Z), diagramas de cajas para cada juez.
2.5
Nota Z
1.5
0.5
-0.5
-1.5
-2.5
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
JUEZ
Como era de esperar, se puede apreciar la homogenización de las puntuaciones tanto en lo que concierne al valor
medio como en lo que concierne a la dispersión de cada juez. Si se realiza la prueba de Bartlett sobre estas puntuaciones Z se aprecia que no hay diferencias significativas entre las varianzas de las puntuaciones de cada juez.
En consecuencia, estas puntuaciones han sido analizadas por medio de un ANOVA con dos factores (jueces, vinos) y se
han obtenido los resultados siguientes :
Análisis de varianza: Nota Z para Vinos Merlot
Fuente de
variabilidad
Total
JUECES
Suma de los
cuadrados
Grados de
libertad
69.9998
79
1.8624 10
-10
Cuadrado
medio
9
2.06934 10
VINOS
30.0961
7
1.29944
Residual
39.0937
63
0.633393
-11
Factor F
Valor P
0.00
1.0000
6.79
0.0000
Por consiguiente, se puede llegar a la conclusión de que no existen diferencias significativas entre las puntuaciones de
los jueces, mientras que se detectan diferencias significativas entre las 8 muestras de vino Merlot, como lo demuestran las figuras 4 y 5.
Figura 4.-Merlot: Transformada Z. Promedio e Intervalo de confianza (95%) para cada juez.
1
0,5
0
-0,5
-1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
JUEZ
Figura 5.- Merlot: Transformada Z. Promedio e Intervalo de confianza (95%) para cada muestra.
2
1
0
-1
-2
1
2
3
4
5
6
7
8
Vino Marlet
La muestra mejor calificada es la de roble del Este tostado fuerte tipo Burdeos (Vino 5). Después viene un grupo
formado por el roble del Este tostado mediano tipo
Burdeos (Vino 6) y el roble francés tostado mediano tipo
Borgoña (Vino 1), seguido de cerca por un grupo formado
por el roble francés tostado fuerte tipo Burdeos (Vinos 3 y
7).
Como grupo menos bien clasificado encontramos al de
roble francés tostado mediano tipo Burdeos (Vinos 4 y 8)
y al de roble francés tostado fuerte tipo Borgoña (Vino 2).
para diferenciar los vinos será la misma, pero utilizando
diferentemente la escala de puntuación, el centrado de
los datos puede minimizar esta diferencia y su tratamiento estadístico tendrá más oportunidad de determinar la
diferencia entre los vinos.
Si además de esta heterogeneidad se pretende minimizar
la que puede derivarse de las diferentes sensibilidades
(precisiones) con las cuales los distintos jueces puntúan
(evalúan) las muestras, la normalización ofrece una posibilidad alternativa a la utilización de otros tests estadísticos para el análisis de resultados, como por ejemplo el
test de Kruskal - Wallis o bien el test de Wilcoxon.
3. Conclusiones
Este estudio describe dos formas de realizar un pretratamiento de los datos provenientes del análisis sensorial
de diferentes muestras de un mismo vino.
Por medio del centrado de los datos brutos, se minimizan
los efectos de escalón producidos entre los degustadores
que puntúan con severidad y los que lo hacen de una
forma más generosa. Si se admite que su percepción
En este caso, el tratamiento de normalización permite (a
pesar de la heterogeneidad de las puntuaciones) clasificar
las muestras con diferencias significativas (α = 0.05). La
muestra mejor calificada después de dos meses es la de
roble del Este tostado fuerte tipo Burdeos y un grupo formado por roble del Este tostado mediano tipo Burdeos y
roble francés tostado mediano tipo Borgoña, seguido de
cerca por un grupo formado por roble francés tostado
fuerte tipo Burdeos.
Los grupos con la peor nota son los de roble francés tostado mediano tipo Burdeos y roble francés tostado fuerte
tipo Borgoña.
Conviene hacer notar que los resultados son provisionales puesto que el vino permanece durante un año en
barricas, pero son coherentes a pesar de todo puesto que
muestras diferentes del mismo lote son calificadas de la
misma manera.
Agradecimientos
Hacemos presente nuestro más vivo agradecimiento a J.L
Puech, A.Razungles y J.C. Boulet del INRA(*) de
Montpellier.
Huelga decir que la normalización confiere la misma
importancia a los jueces con un poder de discriminación
bajo que a los que poseen una mayor sensibilidad. Cada
situación concreta implicará el estimar la utilización de
este pretratamiento de las calificaciones.
Resumen
En un estudio sobre la incidencia de los diferentes tipos
de tostado (Burdeos y Borgoña), de las diferentes intensidades de tostado (tostado mediano y fuerte) y de los diferentes orígenes (roble francés y del Este) sobre un vino
de Merlot, se han llevado a cabo diferentes pretratamientos estadísticos de los datos resultantes y del análisis
sensorial. El centrado de los datos ha sido comparado
con la normalización.
(1): Matricardi L y Waterhouse A.L. 1999. Influence of
Toasting Technique on Color and Ellagitanins of Oak in
Barrel Making. Am. J. Enol. Vitic, vol 50, nº 4, 519-526.
(2): Bowker A.H. y Lieberman G.J. 1965. Méthodes statistiques de l'ingénieur. Dunod. Paris
(3): Meloun M., Militky J et Forina M. 1992.
Chemometrics for Analytical Chemistry. Ellis Horwood.
New York.
(4): Samson A.et Saint-Pierre B. 2000. Les systèmes de
saisie et d'acquisition des données de l'analyse sensorielle. Revue Française d'Enologie.nº 182, 25-30.
(*) Institute National de la Recherche Agronomique.
Palabras clave : Análisis sensorial, Pretratamiento,
Normalización, Centrado, Vino Merlot.
Dos técnicas de pretratamientos de datos, centrado y normalización son comparadas en el estudio del efecto del
tostado (tipo Burdeos y Borgoña), la intensidad de tostado (mediano y fuerte) y el origen (roble francés o del Este)
en la evaluación sensorial de una muestra de vino Merlot.
Palabras clave : Evaluación sensorial, Pretratamiento de
datos, Normalización, Centrado, Vino Merlot.

anisoles y brettanomyces - Fundacion para la Cultura del Vino

Transcripción

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