Epidemiología y diagnóstico de la tuberculosis bovina

Epidemiología y diagnóstico de la tuberculosis bovina

Epidemiología y diagnóstico
de la tuberculosis bovina
J. Álvarez,
Á
L. de Juan, B. Romero, E. Castellanos, J. Bezos,
S. Rodríguez, A. Aranaz, A. Mateos, L. Domínguez
Laboratorio Vigilancia Sanitaria (VISAVET)
Departamento de Sanidad Animal
Facultad de Veterinaria
p
de Madrid
Universidad Complutense
•Género Mycobacterium
• > 50 especies bacterianas
M.a.p
- Ambientales
A bi t l (suelo,
(
l agua))
- Patógenas: ↑ rango de hospedadores
Animales homeotermos y poiquilotermos
Tuberculosis, lepra, paratuberculosis,
peces, tortugas,
t t
serpientes,
i t
etc.
t
Complejo Mycobacterium tuberculosis:
M. bovis
M
M. caprae
M tuberculosis
M.
M. africanum
M. pinnipedii
M. Microti
M. bovis BCG
Tuberculosis bovina
“Enfermedad en los
bovinos causada por
cualquiera de las
especies
p
incluidas
dentro del complejo
M. tuberculosis”
Complejo Mycobacterium avium (MAC):
M a.
M.
a paratuberculosis
Paratuberculosis
M. a. avium
Tuberculosis aviar
M. a. silvaticum
M. a. hominissuis
M. intracellulare
Tuberculosis y Paratuberculosis
- Enfermedades de curso crónico
- Parásitos intracelulares
- Transmisión:
-Fecal-oral
Fecal oral (PTB) / Aerógena (TBC)
-Otras: leche, semen, vertical, ambiente
Diagnóstico:
1. Clínico
2. Inmunológico
- Base celular: IDTB, γ-IFN
- Base humoral: serología
3. Anatomopatológico (matadero)
4. Microbiológico
1) Diagnóstico clínico
Enfermedad consuntiva
E
Emaciación
i ió
Diarrea (variable)
Lesiones Tuberculosis (granulomas)
Lesiones Paratuberculosis
Hipertrofia linfonodos
Granulomas caseosos/calcificados
Linfangiectasia
IInmunidad
id d
humoral
Ba
acilos
Inmunidad
celular
Ba
acilos
Re
espuestta inmu
une
2) Diagnóstico inmunológico
Tiempo
- Inmunidad de base celular
- Intradermotuberculinización (IDTB):
simple / comparada
- Técnica de gamma-interferon
- Inmunidad de base humoral: Detección de anticuerpos
2 1 IDTB simple
2.1.
i
l
• Calidad de la tuberculina –
contrastación
t t ió
• Buena praxis
• ↓ sensibilidad individual
•Interpretación standard →
• Imprescindible para
clasificar
l ifi
rebaños
b ñ
Resultado
Medida (mm)
Signos clínicos
Negativo
≤2
NO
Dudoso
>2 y <4
NO
Positivo
≥4
y/o
SÍ
En ciertas circunstancias los animales
dudosos se consideran positivos
• Especificidad → falsos positivos → exposición a
micobacterias no tuberculosas (ej. Complejo M.
avium). Solución → IDTB comparada
2.2. IDTB comparada
p
- Técnica de aplicación
- Lectura
- Interpretación
ó standard:
Resultado
Interpretación
Negativo
Reacción negativa a la tuberculina bovina o reacción positiva o dudosa a
la tuberculina bovina pero igual o inferior a una reacción positiva o
dudosa a la tuberculina aviar, con ausencia de signos clínicos.
Dudoso
Reacción a la tuberculina bovina positiva o dudosa y superior en 1 a 4 mm
a la
l reacción
ió a la
l tuberculina
t b
li
aviar,
i
con ausencia
i de
d signos
i
clínicos.
lí i
Positivo
Reacción a la tuberculina bovina superior en más de 4 mm a la reacción a
la tuberculina aviar o presencia de signos clínicos.
En ciertas circunstancias los animales dudosos se consideran positivos
- Permite discriminar paratuberculosis u otras micobacterias
en rebaños sin tuberculosis
- Ojo! En rebaños con infección mixta → disminuye la
sensibilidad
Factores que interfieren en la detección de animales enfermos:
1. Mala realización de la prueba:
- incorrecta dosis de inoculación
- errores en medida de piel pre y post-inyección
- fallos en identificación de animales
- tuberculinas en mal estado
- repeticiones del test,
test …))
2. Animales en estado “prealérgico”.
3 Animales en estado de anergia
3.
anergia.
4. Coinfecciones con otras enfermedades que depriman
el sistema inmune.
5. Tratamientos con inmunosupresores.
6. Vacunación frente a la paratuberculosis.
7. Infección con micobacterias del complejo M. avium.
Tuberculosis + Paratuberculosis
(M. bovis + M.a.paratuberculosis)
↓ respuesta
p
inmune → anergia
g inmunitaria
Interferencia en el rendimiento de la IDTB comparada
(no reacción más intensa con la PPD aviar)
Fun
ndame
ento de
e la téc
cnica
2.3. Técnica de gamma-interferon
g
Plasma
GIFN
*
macrófago
g
linfocito T
Cultivo in vitro de la sangre
EIA
Dispensar sangre
γ-IFN: Bovigam
Estimular sangre
Incubar sangre
PPDbov
PPDaviar
PBS
Positivo:
(PPD bov – PBS) ≥ 0,05;
PPD bov > PPD aviar
Reactor aviar:
PPD av – PBS) ≥ 0,100; PPD
aviar
i > PPD b
bovina
i
PBS
Recoger
R
plasma
γ-IFN: Bovigam
- Prueba complementaria
p
- Recomendado por la Task Force en situaciones de alta
prevalencia
Ventajas de la técnica:
- Detecta animales en una fase de infección más
temprana → detecta una mayor proporción de
animales.
- Interpretación
ó menos subjetiva e influenciable por
causas que interfieren con la IDTB.
- Obtención de valor numérico (definición de punto
de corte).
γ-IFN: Bovigam
Puntos críticos de γ-interferon
- Efecto de la potencia de las PPDs
- Calidad de la sangre
- Transporte
p
de la sangre
g
- Tiempo entre extracción y estimulación
- Duplicados
- Mitógenos
- Tiempo transcurrido desde la última
ú
tuberculinización
ó
- Estado fisiológico de los animales
- Fenol
Hay que estandarizar la técnica!!!
Técnic
ca de ELLISA
6. Detección de anticuerpos
3) Diagnóstico postmortem en matadero
- En algunas CCAA ∼ 50% de casos nuevos
se detectan en matadero
4) Diagnóstico microbiológico
- Imprescindible confirmar la infección mediante cultivo
- Cultivo más sensible que lesiones (lesión-, cultivo+)
- Permite estudios epidemiológicos
Ziehl-Neelsen
Auramina
Cultivo
- Homogeneización de la muestra
- Medios de cultivo:
TBC: Coletsos, Löwenstein-Jensen
- Descontaminación HPC PTB: HEYM,
HEYM Middlebrook 7H11,
7H11 LJ
TBC 0,75% 1h / PTB 1,5% 18h
(+ micobactina)
M. bovis
PCR Múltiple
Múlti l
M.a.p
Identificación
Gé
Género
M
Mycobacterium
b t i
p j Mycobacterium
y
tuberculosis
Complejo
Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis
Caracterización molecular: DVR-spoligotyping
M. bovis
spb-4
spb-13
spb-23
M. tuberculosis
spt-1
M. caprae
spc-3
3
spc-2
spc-3
Epidemiología
Investigación
ó tradicional
+
tipificación
p
molecular
Tbc
Spc
Spc
Spb
Spc
Spb
p
Spb
Spb
Spb
Convenio de colaboración
Estudio y aplicación de nuevas técnicas de
diagnóstico como apoyo a los programas
nacionales de erradicación de
enfermedades de los animales y su estudio y
caracterización en fauna silvestre
Ministerio de Agricultura,
g
Pesca
y Alimentación
Junta de Castilla y León
Dirección General de Ganadería
Subdirección General de
Sanidad Animal
S
Universidad Complutense
de Madrid
Consejería de Agricultura y
Ganadería
Laboratorio de Vigilancia Sanitaria
Convenio MAPYA-UCM
Desarrollo convenio
Asesoría científica y técnica
•Asesoramiento Ministerio & CCAA.
•Formación
F
ió de
d personal.
l
•Conferencias de formación.
•Asesoría a explotaciones
p
g
ganaderas bovinas y
caprinas.
•Envío de cepas de micobacterias para la puesta a
punto de la técnica de PCR/DVR-spoligotyping.
PCR/DVR spoligotyping
•Interpretación de resultados obtenidos mediante
pruebas inmunológicas.
•Recogida de muestras biológicas en mataderos
autorizados.
Prevale
encia rrebaño
o (%)
Evolución Castilla y León
Incidencia en animales
Prevalencia en rebaño
8
7
Campaña de
saneamiento
↓
↓ falsos negativos
↓
↑ sensibilidad de
pruebas
5,35
6
4,57
5
3,44
4
2,49
3
2
,
2,81
2,11
1 38
1,38
1 26
1,26
1
0,89 0,75
0,66
0,58
2,24
2,14 1,8
0,52 0,47
0,4
1,52
0,31
1,78
0,42
0
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
Diagnóstico en 4 situaciones posibles:
TBC
1
1.
PTB
Explotación con tuberculosis y paratuberculosis.
paratuberculosis
2. Explotación
PTB
tuberculosis.
3.
TBC
con
Explotación
con
paratuberculosis.
paratuberculosis
tuberculosis
4. Explotación sin tuberculosis
y sin p
paratuberculosis.
y
y
sin
sin
TBC
PTB
Tuberculosis y paratuberculosis
•17+
•201Tuberculosis
•118+
Detección de IFN-γ
•100•Pruebas diagnósticas
in-vivo
in
vivo
102
Paratuberculosis Æ Parachek •102+
•116IDTB comparada
n= 218
•Análisis p
post-mortem
Inspección macroscópica •32+
•186Cultivo microbiológico de M. bovis •48+
•170-
TBC
PTB
Sensibilidad y especificidad de las pruebas diagnósticas:
IDTB comp. Sensibilidad = 18,7% (9/48)
Especificidad = 95,3%
IFN-γ
γ (0,05)
( , )
Sensibilidad = 77,1% (85,4% sin aviar)
Especificidad = 67,1%
67 1% (54,7%
(54 7% sin aviar)
Sensibilidad = 81,2% (87,5% )
IDTB comp + IFN-γ Especificidad = 64,7% (52,4%)
(0,05)
Interpretación severa IDTB
TBC
PTB
Animales TBC+/PTBTBC+/PTB (n=30)
•IDTB comp.Æ S = 26,7%
•IFN-γÆ
γ S = 90% ((93,3%)
, )
•IDTB comp+IFN-γÆ S=96,7%
(96,7%)
Animales TBC+/PTB+ (n=18)
•IDTB comp.Æ S = 5,5%
•IFN-γÆ
γ S = 55,6%
,
((72,2%)
, )
•IDTB comp+IFN-γ Æ S=55,6%
(72,2%)
→ En
zonas
endémicas
de
tuberculosis
y
paratuberculosis
la
aplicación
de
pruebas
comparadas
d disminuye
di i
l sensibilidad
la
ibilid d de
d las
l pruebas.
b
→ Progreso lento de erradicación de la tuberculosis.
tuberculosis
→ Calificación de rebaños infectados – fuente de
infección.
PTB
Paratuberculosis sin tuberculosis
2 saneamientos separados por 6 meses (IDTBs y IFN
IFN-γ)
γ)
Primer saneamiento: 627 animales analizados
• IDTB:
Interpretación
p
Standard
Severa
IDTB
Positivo Dudoso
Negativo
g
Simple
4
17
606
Comparada
1
16
610
Simple
21
606
Comparada
17
610
• IFN-γ: 66+ (121+ sin PPD aviar)
C.tbc:
tbc: Neg!
•Cultivo: 21 animales sacrificados C
C.ptb: 1+
PTB
Paratuberculosis sin tuberculosis
2 saneamientos separados por 6 meses (IDTBs y IFN
IFN-γ)
γ)
Segundo
g
saneamiento: 555 animales analizados
• IDTB: IDTB simple: 3+
IDTB comp: 1d
• IFN-γ: 47+ (137+ sin PPD aviar)
•Cultivo: 10 animales sacrificados
C.tbc: Neg!
C.ptb: Neg
Imprescindible realizar técnicas comparadas y cultivo!!!
Diagnóstico en un rebaño con una infección mixta
de tuberculosis y paratuberculosis
Tabla 1. Resultados de cultivo (n=163)
Resultados
R
lt d de
d
cultivo
Map +
Map -
Total
M caprae +
M.
24
107
131
M. caprae -
6
26
32
Total
30
133
163
IDTB simple Vs. IDTB comparada
Animales con tuberculosis (n=131)
IDTB COMP+
IDTB COMP -
Total
IDBT SIMPLE+
50
32
82 (S=82.6%)
IDTB SIMPLE-
0
49
49
Total
50 (S=38.2%)
81
N=131
•Animales TBC+/PTB- ((n=61))
•Animales TBC+/PTB+ (n=24)
IDTB COMP+
IDTB COMP -
Total
IDBT SIMPLE+
27
17
44 (S=72.1%)
IDTB SIMPLE-
0
17
17
Total
27 (S=44.2%)
34
N=61
IDTB COMP
COMP+
IDTB COMP -
Total
IDBT SIMPLE+
6
5
11 (S=45.8%)
IDTB SIMPLE-
0
13
13
T t l
Total
6 (S=25%)
(S 25%)
18
N 24
N=24
IDTB simple Vs. IDTB comparada
Animales con tuberculosis (n=131)
18
Dif. Bov.
16
¡¡¡No
detectados
mediante IDTB
comparada!!!
14
12
10
8
6
¡¡¡Detectados
por IDTB
simple!!!
4
2
0
Detectados
por IDTB
simple + IFNγ
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Dif Aviar.
Dif.
A i
Tabla 2. Sensibilidad de las pruebas y falsos positivos (n
(n=163)
163)
Prueba diagnóstica
Positivos
IDTB simple (interpretación severa)
IDTB comparada (interpretación
severa)
IDTB comparada (interpretación
ultra-severa)
Standard IFN-γ (punto corte: 0,1)
105
Standard IFN-γ (no avian PPD)c
Severa IFN-γ (punto corte: 0,05)
Severa IFN-γγ ((no avian PPD)) c
Parachek d
a Animales
Sensibillidad
TP a
%
82
62 6
62.6
Falsos positivos
FP b
%
23
71 9
71,9
63
50
38.2
13
40,6
92
72
55 0
55,0
20
62 5
62,5
86
90
76
79
58
60 3
60,3
10
11
31,2
34 4
34,4
109
114
75
93
96
24 e
71
73,3
,
70,6
16
18
50
56,2
,
53,1
51f
cultivo positivo de M. caprae.
Animales cultivo negativo
g
de M. caprae.
p
c Resultados obtenidos sin tener en cuenta los resultados de la estimulación con PPD aviar.
d Valores calculados sin incluir los animales con cultivo contaminado.
e Animales cultivo positivo de M.a.p.
f Animales cultivo negativo de M.a.p.
b
Table 3. Sensibilidad y falsos positivos combinando las pruebas diagnósticas
138
140
145
147
117
TP a
113
114
117
118
98
%
86,2
87
89,3
90,1
74 8
74,8
Falsos
positivos
FP b
%
25
78,1
26
81,2
28
87,0
29
90,6
19
59 4
59,4
120
100
76,3
20
62,5
130
107
81,7
23
71,9
133
109
83,2
24
75
133
110
84
23
71,9
135
111
84,7
24
75
143
116
88,5
27
84,4
145
117
89 3
89,3
28
87 5
87,5
Pruebas diagnósticas en paralelo
Positivos
IDTB simple severa + Standard IFN-γ
IDTB simple severa + Standard IFN-γ (no av PPD) c
IDTB simple severa + Severa IFN-γ
IDTB simple severa + Severa IFN-γ (no av PPD) c
IDTB comparada severa + Standard IFN-γ
IDTB comparada severa + Standard IFN-γ (no av
PPD) c
IDTB comparada severa + Severa IFN-γ
IDTB comparada severa + Severa IFN-γ (no
avian PPD) c
IDTB comparada ultra-severa + Standard IFN-γ
IDTB comparada ultra-severa + Standard IFN-γ
(no av PPD) c
IDTB comparada ultra-severa + Severa IFN-γ
IDTB comparada ultra-severa + Severa IFN-γ (no
av PPD) c
a Animales
Sensibilidad
cultivo positivo de M. caprae.
Animales cultivo negativo de M. caprae.
c Resultados obtenidos sin tener en cuenta los resultados de la estimulación con PPD aviar.
b
Tabla 4. Cultivo microbiológico: sensibilidad y falsos positivos.
Tbc+/Ptb- Tbc+/Ptb+
Prueba diagnóstica
(n=61)
(n=24)
IDTB simple severa
S = 0,72
S = 0,46
IDTB comparada
d severa
S = 0,44
0 44
S = 0,25
0 25
IDTB comparada ultra-severa
S = 0,62
S = 0,42
Standard IFN-γ
IFN (0,1)
(0 1)
S = 0,47
0 47
S = 0,58
0 58
Severa IFN-γ (0,05)
S = 0,72
S = 0,67
IDTB simple severa + Standard IFN-γ
S = 0,88
0 88
S = 0,75
0 75
IDTB simple severa + Severa IFN-γ
S = 0,93
S = 0,79
IDTB comparada severa + Standard IFN
IFN-γγ
S = 0,72
0 72
S = 0,71
0 71
IDTB comparada severa + Severa IFN-γ
S = 0,85
S = 0,75
IDTB comparada ultra
ultra-severa
severa + Standard IFN
IFN-γγ
S = 0,85
S = 0,75
IDTB comparada ultra-severa + Severa IFN-γ
S = 0,93
S = 0,79
Parachek
FP = 0,59
S = 0,71
Programa de control - Factores a tener en cuenta
-Estado de infección del rebaño
-Técnicas
Técnicas sensibles de diagnóstico para detectar todos los
animales infectados
salvajes
- Animales salvajes.
- Otros reservorios
-Vacunación de paratuberculosis.
p más susceptible.
p
- Vías de transmisión de la enfermedad y etapa
- Interferencia diagnóstica por otras micobacterias: infecciones
mixtas.
- Características de la explotación
- Colaboración
ó activa del ganadero/trabajadores.
Bases del programa de control en cabras
1. Instauración de pautas estrictas de control y manejo.
2. Análisis periódico de todo el rebaño mediante pruebas
inmunológicas:
· Intradermotuberculinización
I t d
t b
li i
ió
· gamma-interferon
· serología
g p
paratuberculosis
3. Separación física de animales positivos y negativos.
4. Estudio microbiológico.
5. Separación de los animales recién
nacidos.
Muchas gracias
VISAVET
Fac. Veterinaria
U.C.M.
[email protected]
℡ (+ 34) 913944083
(+ 34) 913943795