Caracterización Genómica de HIV región de la proteasa.

Caracterización Genómica de HIV región de la proteasa.

Protocolos y métodos
Laboratorio de Genómica Viral y Humana
Facultad de Medicina UASLP
HIV Proteasa
Creado: 26 de Octubre del 2010
Ultima modificación: 26 de Octubre del 2010
Amplificación y secuenciación de la región codificante para la proteasa (gen pol) del
virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1).
Este protocolo describe los componentes y condiciones optimizados de PCR para la amplificación/secuenciación de la región
codificante para la proteasa del gen pol de HIV-1. Este protocolo ha sido opcreado con la finalidad de caracterizar la presencia
de mutaciones asociadas a resistencia a fármacos antiretrovirales (ARV’s) a partir de aislados clínicos por secuenciación directa
o por análisis conformacional de cadena de referencia (RSCA). El acercamiento anidado permite mayor sensibilidad para la
caracterización de virus presentes a bajos títulos virales obviando la necesidad de expander los aislados por cultivo.
Adicionalmente, el fragmento generado por esta PCR se empalma en el flanco derecho (3´) con el fragmento generado por la
PCR de amplificación/secuenciación de la región codificante para la transcriptasa inversa (RT) viral.
Oligonucleótidos:
Nombre
PCR
Secuencia
Bases
%GC
Tm
Posición
5´-TAA-TTT-TTT-AGG-GAA-GAT-CTG-GCC-TTC-C-3´
HIV
PROT1
PROT-RO
5'-GCA-AAT-ACT-GGA-GTA-TTG-TAT-GGA-TTT-TCW-GG-3'
28
39.3
57
2082-2108
32
37.5
57.6
2703-2734
PROT-FI
5´-TCA-GAG-CAG-ACC-AGA-GCC-AAC-AGC-CCC-3´
27
63
67.4
2136-2163
5'-AAT-GCT-TTT-ATT-TTY-TCT-TCT-GTY-AAT-GGC-3'
30
30
55.5
2621-2650
PROT-FO
PROT-RI
HIV
PROT2
Amplicón (bp)
Ref.
652
1
514
NOTA: Las secuencias de los oligos reversa son el complemento-reverso de la secuencia de DNA mostrada en los alineamientos.
Componentes: Ver notas 1 a 5.
1ra PCR (PROT1)
dH2O
Cƒ
10x Buffer PCR
1X
MgCl2 50 mM
1.50 mM
dNTPs 10 mM
200 µM
Oligos 10 µM
400 nM
Taq (Vivantis) 5 UI/µL 0.04 UI/µL
DNA
-
1x
6.02
1.25
0.38
0.25
0.50
0.10
4.00
Volumen final:
12.5
2da PCR (PROT2)
dH2O
Cƒ
10x Buffer
1X
MgCl2 50 mM
1.50mM
dNTPs 10 mM
200 µM
Oligos 10 µM
400 nM
Taq (Vivantis) 5 UI/µL
0.04 UI/µ
Producto 1ra PCR
-
1x
9.02
1.25
0.38
0.25
0.50
0.10
1.00
Volumen final:
12.5
Condiciones: (Tiempo Total 4 hrs).
Tiempo 1:48 hrs
Temperatura
HIV, INT1
Tiempo
Desnaturalización Hibridización
94°
94°
50°
2 min
30 seg
30 seg
x 30 ciclos
Extensión
72°
72°
1 min
5 min
RT
∞
Tiempo 2:08 hrs
Temperatura
HIV, INT2
Tiempo
Desnaturalización Hibridización
94°
94°
60°
2 min
30 seg
30 seg
x 30 ciclos
Extensión
72°
72°
1 min
5 min
RT
∞
Laboratorio de Genómica Viral y Humana
–
Facultad de Medicina
–
Universidad Autónoma de San Luis Potosí
Protocolos y métodos
Laboratorio de Genómica Viral y Humana
Facultad de Medicina UASLP
HIV Proteasa
Creado: 26 de Octubre del 2010
Ultima modificación: 26 de Octubre del 2010
Notas:
1.
2.
3.
4.
5.
Limpiese el área de trabajo con NaOCl 0.1% y etanol al 70% antes y después de preparar las PCR.
Preparanse las PCR’s en hielo o haciendo uso de los portatubos refrigerados.
Mezcle en vortex todos los reactivos excepto el DNA antes de preparar el master mix y antes de alicuotar las
reacciones individuales.
Haga uso de la micropipeta apropiada para cada rango de volumen a dispensar.
Para la primera PCR distribuya 8.5 µL de la mezcla madre a cada tubo y agregue 4 µL de cDNA (± 100 ng/µL); para
la segunda PCR distribuya 11.5 µL de la mezcla madre y agregue 1 µL del producto de la primera PCR sin diluir.
Referencias:
1.
Gonzalez, R. Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Antiretroviral Resistance Mutations by High-Density
DNA Probe Arrays. Journal of Clinical Microbiology Vol. 42, pág. 2907 - 2912 (2004).
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