Protein S Ac

Protein S Ac
Procedure
Intended Use
For the determination of the functional activity of protein S in human plasma.
Summary and Explanation
Protein S, a vitamin K-dependent plasma protein, is the cofactor of activated protein C (protein Ca).
It stimulates the proteolytic inactivation of Factor Va and Factor VIIIa by protein Ca, thereby stimulating its coagulation-inhibiting effect 1, 2 . Protein S occurs in the plasma both as a free, physiologically
coagulation-active protein as well as in an inactive form bound to C4b binding protein (C4bBP). A
diminished protein S activity increases the thromboembolic risk. Homozygous protein S deficiency,
like homozygous protein C deficiency, leads to Purpura fulminans in neonates.
Causes of diminished protein S activities are2,3
- hereditary protein S deficiency
- hepatic disorders
- oral anticoagulation
- treatment with L-asparaginase
- pregnancy
- oral contraceptives
- estrogen therapy
- elevated plasma levels of C4bBP as an acute-phase reaction.
The relative Protein S activity can depend on the test method employed4.
Immunological methods are recommended for the determination of free and bound proteins if
hereditary or acquired deficiencies are to be identified or if the extent of a deficiency of Protein S
activity caused by increased C4bBP is to be determined.
For procedural details please refer to the manufacturer's instruction manuals and application
sheets for Protein S Ac on the suitable analyzers.
Results
The results are obtained using a reference curve prepared beforehand by serially diluting Standard Human
Plasma with Protein S Deficient Plasma. Sample testing must follow the determination of the reference curve
immediately. Care is to be taken to ensure that conditions for establishing the reference curves and for
performing the subsequent measurements are the same (e.g. temperature of the reagents).
Internal Quality Control
Normal range:
Control Plasma N, Code No. ORKE
Pathological range:
Control Plasma P, Code No. OUPZ
Controls should be run in each series of measurements.
If the result of the control is outside the confidence interval, the determination must be repeated.
If the repeated determination confirms the deviation, a new reference curve must be established.
Do not release patient results until the cause of the deviation has been identified and corrected.
Coagulation Analyzer (see "Limitation of the Procedure")
Protein S Ac Kit can be used with a variety of coagulation analyzers. (follow manufacturer’s
instruction manual!)
Limitation of the Procedure
Protein Ca proteolytically cleaves F Va which is generated during the activation of the coagulation cascade by RVV (venom of Vipera russelli). In this reaction protein S acts as a cofactor
which accelerates the reaction. As a result, the coagulation time increases proportionally to the
activity of protein S in the sample. The addition of deficient plasma ensures that the test mixture
has a sufficient supply of fibrinogen, Factor V and the other necessary coagulation factors.
Coagulation is triggered at the level of Factor X by the FX activator of RVV. FXa forms thrombin from prothrombin under the action of the remaining Factor Va. The resulting thrombin finally converts fibrinogen to fibrin.
The coagulation time can be detected mechanically, optically or by other measurement principles.
Suitable coagulation analyzers are those for which assay protocols are provided by Dade
Behring. The use of Protein S Ac on other coagulation analyzers must be validated by the test
laboratory. In such cases, the performance characteristics may differ from those stated.
The precision of the test is highly dependent on the precision of pipetting, especially in the case of
the small sample volumes!
With deep-frozen samples, the recovery of protein S may be diminished if platelets and leucocytes were not carefully separated off during withdrawal of the plasma. Before samples are frozen they must be centrifuged a second time.
The existence of a mutation in Factor V at its protein Ca cleavage site may lead to diminished
recovery of protein S8.
The antiphospholipid antibodies (e.g. Lupus anticoagulant) may be accompanied by either
increased5 or decreased6 Protein S activity test results.
Heparin activities up to 3 U/mL (UFH and LMWH) do not disturb the test.
Faktor VIII activities up to 400% do not interfere.
Reagents
Reference Intervals
Materials provided
Testkit Code No. OPAP
6 x for 1 mL Protein S Ac Deficient Plasma
2 x for 2 mL Protein S Ac APC Reagent
2 x for 5 mL Protein S Ac Starting Reagent
Composition
Protein S Ac Deficient Plasma: lyophilized, human citrated plasma with an unmeasurable
residual activity of protein S. The plasma is likewise free of C4bBP.
Protein S Ac APC Reagent, lyophilized: purified, activated human protein C containing calciumchloride.
Preservative:
5-chloro-2-methyl-isothiazole-3-one (3.8 mg/L)
2-methyl-isothiazole-3-one (1.3 mg/L)
Protein S Ac Starting Reagent, lyophilized; activator derived from the venom of Russell's Viper
(Vipera russelli) with added phospholipids.
Preservative:
Sodium azide (0.5 g/L)
Warnings and Precautions
1. For in vitro diagnostic use.
2. Reagents containing sodium azide must be handled with due caution:
Do not ingest or allow to contact skin or mucous membranes! Sodium azide can form explosive azides when contacting heavy metals such as copper or lead!
3. Each individual blood donation for use in manufacture of the Protein S Deficient Plasma is
tested for hepatitis B surface antigen, anti-HCV, anti-HIV1 and anti-HIV2 by FDA-required
testing. Only donations with negative findings are used for manufacture.
Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all materials obtained
from human blood should always be handled with due care, observing the precautions recommended for biohazardous material 7.
Preparation of the Reagents
Protein S Ac Deficient Plasma: Dissolve in the labeled quantity of distilled water and incubate
at +15 to +25 °C for 60 min.
Protein S Ac APC Reagent: Dissolve in the labeled quantity of distilled water and incubate at
+15 to +25 °C for 60 min.
Protein S Ac Starting Reagent: Dissolve in the labeled quantity of distilled water, incubate at
+37 °C for 60 min in the water bath and mix gently before use.
Storage and Stability
The test kit is to be stored unopened at +2 to +8 °C and used by the date given on the label.
Stability after reconstitution (closed vials):
In a study with ostensibly healthy subjects (n=218) using the Sysmex® CA-1500 the following
data were obtained (5. - 95. Percentile):
60% - > 130%, Median: 95% (Men: 75% - > 130%, Median: 104%; women without oral contraceptives: 59% - 118%, Median: 90%; women with oral contraceptives: 52% - 118%, Median: 81%).
Reference values vary from laboratory to laboratory depending on technique used, therefore,
each laboratory should establish its own reference interval (For more information on establishing
reference intervals see NCCLS document C28-A “ How to Define and Determine Reference
Intervals in the Clinical Laboratory”, Approved Guideline).
Principle of the Method
Temperature
Protein S Ac
Deficient Plasma
Protein S Ac
APC Reagent
+37 °C
+15 to +25 °C
8 hours
8 hours
+2 to +8 °C
2 days
≤ - 18 °C
2 months
2 months
Various analyzers do have individual stability data.
Materials required but not provided
Standard Human Plasma, Code No. ORKL
Control Plasma N, Code No. ORKE
Control Plasma P, Code No. OUPZ
Coagulation analyzer (see “Limitation of the Procedure”)
Protein S Ac
Starting Reagent
4 hours
8 hours
2 days
2 months
Specimens
Specific Performance Characteristics
Measuring Range
The measuring range for the Sysmex® CA-1500 extends from 10 to 130% of the norm.
Specificity
The test detects functionally active protein S.
Precision and Reproducibility
For normal plasma samples measured using the Sysmex® CA-1500, the resulting variation coefficients ranged between 3.6% and 5.1% within the series of measurements, and between 2.0%
and 4.1% from day to day. Total precision ranged from 4.6 to 5.5%.
For pathologically deficient plasma samples which were measured using the Sysmex® CA-1500,
the resulting variation coefficients ranged between 4.7% and 9.2% within the series of measurements, and between 1.9% and 7.7% from day to day. Total precision ranged from 4.8 to 11.6%.
Method Comparison
The Protein S Ac assay was compared to a commercially available protein S assay by evaluation
of 239 plasma samples.
A correlation coefficient of r = 0,92 was obtained, with a y-intercept value of 1,53 and a slope of 0,96.
The values cited for the specific performance characteristics of the assay represent typical results and are not to be regarded as specifications for Protein S Ac test.
Bibliography
1. B Dahlbäck: Factor V and Protein S as Cofactors to Activated Protein C. Haematologica 82
(1997) 91-95.
2. D Borgel: Protein S Deficiency. Thromb. Haemost. 78 (1997) 351–356.
3. B Kemkes-Matthes: Acquired Protein S Deficiency, Clin. Investig. 70 (1992) 529-534.
4. C Boyer-Neumann: Comparison of Functional Assays for Protein S: European Collaborative Study of Patients with Congenital and Acquired Deficiency. Thromb. Haemost. 70 (1993) 946-950.
5. A S Lawrie: Assay of protein S in Systemic Lupus Erythematosus. Blood Coagulation and
Fibrionolysis 6 (1995) 322-324.
6. E Rossi et al.: Functional Protein S in Women with Lupus Anticoagulant Inhibitor. Thromb Res
65 (1992) 253-262.
7. U.S. Department of Health and Human Services CDC, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, HHS Publication (CDC) 93-8395; 1999; Section II; 8-16
8. E M Faioni et al.: Another Protein S Functional Assay is Sensitive to Resistance to Activated
Protein C. Thromb. Haemost. 72 (1994) 643-651.
Sysmex is a registered trademark of SYSMEX CORPORATION in the USA, Germany and other countries.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
USA Distributor:
Dade Behring Inc.
Newark, DE 19714 U.S.A.
Edition December 2002
To obtain the plasma, carefully mix 1 part sodium citrate solution 0.11 mol/L (3.2%) with 9 parts
venous blood, avoiding the formation of foam. Centrifuge immediately at no less than 1500 x g
for at least 10 min. When removing the plasma, take care to ensure that no platelets are
withdrawn. If the sample is to be frozen repeat centrifugation, rapidly freeze the collected
plasma in a well-closed plastic container.
Stability of the sample:
≤ - 18 °C
1 month
+15 to +25 °C
4 hours
Plasma stored at ≤ - 18 °C is to be thawed within 10 minutes at +37 °C after which the assay is
to be performed within 4 hours.
OPAP G03 E0541 (257) W
1
OPAP G03 E0541 Satzdatei
1
04.03.2003, 17:25 Uhr
Protein S Ac
Stabilität der Probe:
≤ - 18 °C
1 Monat
+15 bis +25 °C
4 Stunden
Bei ≤ - 18 °C gelagerte Plasmen innerhalb von 10 min bei +37 °C auftauen, mischen und die
Bestimmung innerhalb von 4 Stunden durchführen.
Anwendungsbereich
Testdurchführung
Zur Bestimmung der funktionellen Aktivität von Protein S in menschlichem Plasma.
Detaillierte Informationen zur Testdurchführung können den Bedienungsanleitungen der geeigneten Gerinnungsmessgeräte und den gerätespezifischen Protein S Ac Anwendungsvorschriften entnommen werden.
Auswertung
Die Auswertung erfolgt anhand einer Bezugskurve, die vorher durch serielle Verdünnung des
Standard-Human-Plasma mit Protein S Ac-Mangelplasma erstellt wird. Die Untersuchung des
Probenmaterials muss unmittelbar nach der Ermittlung der Referenzkurve erfolgen. Es ist darauf zu achten, dass die Bedingungen für die Erstellung der Referenzkurven und den anschließenden Messungen gleich sind (z. B. Temperatur der Reagenzien).
Interne Qualitätskontrolle
Normalbereich:
Kontroll-Plasma N, Bestell-Nr. ORKE
Pathologischer Bereich:
Kontroll-Plasma P, Bestell-Nr. OUPZ
In jeder Messserie muss eine Kontrolle mitgeführt werden.
Liegt das Messergebnis der Kontrolle außerhalb des Vertrauensbereichs, muss die Bestimmung
wiederholt werden. Falls die Wiederholung das Messergebnis bestätigt, muss eine neue Referenzkurve erstellt werden. Erst wenn die Ursache der Abweichung identifiziert und korrigiert
wurde, dürfen Messwerte von Patienten weitergegeben werden.
Gerinnungsmessgeräte (siehe Kapitel "Einschränkungen der Testdurchführung")
Das Protein S Ac Kit kann bei einer Vielzahl von Gerinnungsmessgeräten eingesetzt werden
(Bedienungsanleitung des Herstellers beachten!).
Diagnostische Bedeutung
Protein S, ein Vitamin K-abhängiges Plasmaprotein, ist der Kofaktor von aktiviertem Protein C
(Protein Ca). Es stimuliert die proteolytische Inaktivierung von Faktor Va und VIIIa durch Protein
Ca und damit dessen gerinnungshemmende Wirkung 1, 2 . Protein S liegt im Plasma sowohl als
freies, gerinnungsphysiologisch aktives Protein als auch in einer inaktiven Form gebunden an
das C4b-Bindungsprotein (C4bBP) vor. Eine verringerte Protein S-Aktivität erhöht das thromboembolische Risiko. Homozygoter Protein S-Mangel führt bei Neugeborenen, ähnlich wie homozygoter Protein C-Mangel, zu Purpura fulminans.
Ursachen für verminderte Protein S-Aktivitäten sind 2,3
- hereditärer Protein S-Mangel
- Leberfunktionsstörungen
- orale Antikoagulation
- Behandlung mit L-Asparaginase
- Schwangerschaft
- orale Kontrazeptiva
- Östrogentherapie
- erhöhte Plasmaspiegel an C4bBP als akute Phase-Reaktion.
Die jeweilige Protein S Aktivität kann von der verwendeten Testmethode abhängen4.
Zur Abklärung hereditärer oder erworbener Mängel und zur Abgrenzung von einem durch erhöhtes C4bBP hervorgerufenen Mangel an Protein S-Aktivität wird empfohlen, mit immunologischen Methoden freies und gebundenes Protein S zu bestimmen.
Prinzip der Methode
Protein Ca spaltet proteolytisch F Va, der bei der Aktivierung der Gerinnungskaskade durch RVV
(Gift von Vipera russelli) entsteht. Protein S wirkt dabei als Kofaktor, der die Reaktion beträchtlich beschleunigt. Dadurch kommt es zu einer mit der Aktivität an Protein S in der Probe proportional zunehmenden Gerinnungszeit. Der Zusatz von Mangelplasma sorgt für eine ausreichende
Versorgung des Ansatzes mit Fibrinogen, F V und den anderen benötigten Gerinnungsfaktoren.
Die Gerinnung wird auf der Stufe des Faktors X durch den FX-Aktivator aus RVV angestossen.
FXa bildet unter Vermittlung des noch verbliebenen Faktors Va Thrombin aus Prothrombin.
Thrombin setzt schließlich Fibrinogen um.
Der Gerinnungszeitpunkt kann mechanisch, optisch oder durch andere Messprinzipien detektiert werden.
Reagenzien
Inhalt der Handelspackung
Testkit Bestell Nr. OPAP
6 x für 1 ml Protein S Ac Mangelplasma
2 x für 2 ml Protein S Ac APC Reagenz
2 x für 5 ml Protein S Ac Startreagenz
Zusammensetzung
Protein S Ac Mangelplasma: lyophilisiertes, humanes Citrat-Plasma mit nicht messbarer Restaktivität an Protein S. Das Plasma ist ebenfalls frei von C4bBP.
Protein S Ac APC Reagenz, lyophilisiert; gereinigtes und aktiviertes, humanes Protein C mit
Zusatz von Calciumchlorid.
Konservierungsmittel:
5-Chlor-2-methyl-isothiazol-3-on (3,8 mg/l),
2-methyl-isothiazol-3-on (1,3 mg/l)
Protein S Ac Startreagenz, lyophilisiert; Aktivator aus dem Gift der Russells Viper (Vipera russelli) mit Zusatz von Phospholipiden.
Konservierungsmittel:
Natriumazid (0,5 g/l)
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung
2. Beim Umgang mit Natriumazid-haltigen In-vitro-Diagnostica ist zu beachten:
Verschlucken und Kontakt mit Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Natriumazid kann mit
Schwermetallen, wie Kupfer oder Blei, explosive Azide bilden.
3. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung von Protein S Ac-Mangelplasma vorgesehen war, wurde auf HBsAg, auf Anti-HCV, auf Anti-HIV1 und auf Anti-HIV2 untersucht. Für die
Herstellung wurden nur Spenden mit negativem Befund verwendet.
Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wegen nie
auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden7.
Vorbereitung der Reagenzien
Protein S Ac Mangelplasma: mit der auf dem Etikett angegebenen Menge dest. Wasser lösen
und mindestens 60 min bei +15 bis +25 °C inkubieren.
Protein S Ac APC Reagenz: mit der auf dem Etikett angegebenen Menge dest. Wasser lösen
und mindestens 60 min bei +15 bis +25 °C inkubieren.
Protein S Ac Startreagenz: mit der auf dem Etikett angegebenen Menge dest. Wasser lösen, bei
+37 °C für 60 min in einem Wasserbad inkubieren und vor Gebrauch vorsichtig schütteln.
Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Der Testkit ist ungeöffnet bei +2 bis +8 °C zu lagern und bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Datum verwendbar.
Stabilität nach Rekonstitution (verschlossene Fläschen):
Temperatur
Protein S Ac
Mangelplasma
Protein S Ac
APC Reagenz
Protein S Ac
Startreagenz
8 Stunden
2 Monate
8 Stunden
2 Tage
2 Monate
4 Stunden
8 Stunden
2 Tage
2 Monate
+37 °C
+15 bis +25 °C
+2 bis +8 °C
≤ - 18 °C
Einschränkungen der Testdurchführung
Es sind Gerinnungsmessgeräte geeignet, für die Dade Behring Anwendungsvorschriften bereitstellt. Die Verwendung von Protein S Ac Reagenz an anderen Gerinnungsmessgeräten muss
vom Untersuchungslabor validiert werden. Dabei können andere als die angegebenen Leistungsdaten erhalten werden.
Die Präzision des Tests hängt stark von der Präzision der Pipettierung, speziell bei kleinen Probenvolumina, ab!
Bei tiefgefrorenen Proben kann es zu erniedrigter Wiederfindung von Protein S kommen, wenn
Plättchen und Leukozyten nicht sorgfältig bei der Plasmagewinnung abgetrennt wurden. Es ist
notwendig, einzufrierende Proben ein zweites Mal zu zentrifugieren.
Das Vorliegen einer Mutation des Faktors V an der Protein Ca-Spaltstelle kann zu einer erniedrigten Wiederfindung von Protein S führen8.
Antiphospholipid-Antikörper (z.B. Lupus Antikoagulans) können zu erhöhten5 oder erniedrigten6
Protein S-Aktivitätstestergebnissen führen.
Heparinaktivitäten bis 3 U/ml (UFH und LMWH) stören den Test nicht.
Faktor VIII-Aktivitäten bis 400% zeigen keine Interferenzen.
Referenzbereich
In einer am Sysmex® CA-1500 durchgeführten Studie mit augenscheinlich gesunden Probanden (n = 218) wurden folgende Daten erhoben (5. - 95. Percentile):
60% - > 130%, Median: 95% (Männer: 75% - > 130%, Median: 104%; Frauen ohne orale Kontrazeption: 59% - 118%, Median: 90%; Frauen mit oraler Kontrazeption: 52% - 118%, Median: 81%).
Die Referenzbereiche können in Abhängigkeit zur eingesetzten Technik von Labor zu Labor
variieren, daher sollte jedes Labor seinen eigenen Referenzbereich bestimmen (Weitere Informationen zur Bestimmung des Referenzbereiches siehe NCCLS-Dokument C28-A “ How to
Define and Determine Reference Intervals in the Clinical Laboratory”, Approved Guideline).
Leistungsmerkmale des Tests
Messbereich
Der Messbereich reicht für den Sysmex® CA-1500 von 10 bis 130% der Norm.
Spezifität
Der Test weist funktionell aktives Protein S nach.
Präzision und Reproduzierbarkeit
Für Normalplasmen wurden am Sysmex® CA-1500 Variationskoeffizienten in der Serie zwischen
3,6% und 5,1%, von Tag zu Tag zwischen 2,0% und 4,1% gefunden. Die Gesamtpräzision lag
zwischen 4,6% und 5,5%.
Für pathologisch erniedrigte Plasmen wurden am Sysmex® CA-1500 Variationskoeffizienten in
der Serie zwischen 4,7% und 9,2%, von Tag zu Tag zwischen 1,9% und 7,7% gefunden. Die
Gesamtpräzision lag zwischen 4,8% und 11,6%.
Methodenvergleich
Der Protein S Ac Test wurde mit einem anderen kommerziell erhältlichen Protein S Test durch
die Bewertung von 239 Plasma-Proben verglichen.
Erzielt wurden ein Korrelationskoeffizient r = 0,92, ein y-Achsenabschnitt von 1,53 und eine
Steigung von 0,96.
Die Daten, die als spezifische Leistungsdaten des Tests angegeben werden, stellen typische
Ergebnisse dar und sollen nicht als Spezifikationen des Protein S Ac-Tests angesehen werden.
Literatur
Siehe Seite 1.
Sysmex ist eine eingetragene Marke der SYSMEX CORPORATION in den USA, Deutschland
und anderen Ländern.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
Ausgabe Dezember 2002
Die verschiedenen Gerinnungs-Messgeräte haben individuelle Stabilitätsdaten.
Zusätzlich benötigte Materialien
Standard-Human-Plasma, Bestell-Nr. ORKL
Kontroll-Plasma N, Bestell-Nr. ORKE
Kontroll-Plasma P, Bestell-Nr. OUPZ
Gerinnungsmessgerät (siehe Kapitel “Einschränkungen der Testdurchführung”)
Untersuchungsmaterial
Zur Plasmagewinnung 1 Teil Natriumcitrat-Lösung 0,11 mol/l (3,2%) mit 9 Teilen Venenblut sorgfältig unter Vermeidung von Schaumbildung mischen. Sofort mindestens 10 min bei nicht weniger als 1500 x g zentrifugieren. Bei Entnahme des Plasmas darauf achten, dass keine Plättchen abpipettiert werden. Falls die Probe eingefroren werden soll, erneut zentrifugieren und
entnommenes Plasma in einem gut verschlossenen Kunststoffgefäß schnell einfrieren.
OPAP G03 E0541 (257) W
OPAP G03 E0541 Satzdatei
2
2
04.03.2003, 17:25 Uhr
Stabilité de l’échantillon :
1 mois à ≤ -18°C
4 heures à +15/+25°C
Décongeler les plasmas conservés à ≤ -18 °C en 10 mn à +37°C, les homogénéiser et les tester
dans les 4 heures.
Protein S Ac
Domaine d’utilisation
Pour la détermination de l’activité fonctionnelle de la protéine S dans le plasma humain.
Intérêt diagnostique
La protéine S, une protéine plasmatique vitamine K-dépendante, est le cofacteur de la protéine
C activée (protéine Ca). Elle stimule l’inactivation protéolytique des facteurs Va et VIIIa par la
protéine Ca, et par là leur effet inhibiteur sur la coagulation1,2. La protéine S est présente dans le
plasma aussi bien comme protéine libre et active sur le plan physiologique de la coagulation,
que, sous forme inactive, comme protéine liée à la protéine de fixation du C4b (C4bBP). Une
diminution de l’activité de protéine S augmente le risque thromboembolique. Un déficit homozygote en protéine S, tout comme un déficit homozygote en protéine C, provoque chez les nouveau-nés un purpura fulminans.
Les causes d’une activité de protéine S diminuées sont2,3 :
- déficit héréditaire en protéine S
- lésions hépatiques
- prise d’anticoagulants oraux
- traitement à la L-Aspariginase
- grossesse
- contraception orale
- traitement aux oestrogènes
- taux plasmatique de C4bBP augmenté comme réaction de la phase aiguë.
L’activité en protéine S peut varier selon la méthode de dosage utilisée4.
Pour déterminer un déficit héréditaire ou acquis en activité de protéine S, et le différencier d’un
déficit dû à une augmentation de C4bBP, il est recommandé de faire un dosage immunologique
de la protéine S libre et de la protéine S liée.
Principe de la méthode
La protéine Ca dégrade protéolytiquement le facteur Va qui apparaît, lors de l’activation de la
cascade de la coagulation, sous l’effet du VVR (venin de Vipera russelli). Dans ce processus, la
protéine S agit comme un cofacteur qui accélère considérablement la réaction. On obtient ainsi
un temps de coagulation qui s’allonge proportionnellement à l’activité de protéine S de
l’échantillon. L’addition de plasma exempt permet d’obtenir un mélange contenant suffisamment
de fibrinogène, de facteur V et d’autres facteurs de la coagulation nécessaires à la réaction.
La coagulation arrive au niveau du Facteur X par le FX-activateur provenant du VVR. Le FXa
transforme, en présence de Facteur Va résiduel, la prothrombine en thrombine. La thrombine
agit enfin sur le fibrinogène.
Le point final du temps de coagulation peut être détecté mécaniquement, photométriquement,
ou selon d’autres principes de mesure.
Réactifs
Réalisation du test
Pour toutes informations sur la réalisation du test, se reporter au manuel d’utilisation de
l’automate de coagulation utilisé et au protocole d’adaptation du test Protéine S Ac spécifique à
l’appareil.
Exploitation
L’exploitation se fait à l’aide d’une courbe d’étalonnage établie à partir d’une série de dilution du
Plasma Standard Humain avec le Plasma exempt de Protéine S Ac. Les échantillons de patients
doivent être testés immédiatement après la courbe d’étalonnage. Veiller à respecter les mêmes
conditions d’analyse pour l’établissement de la courbe d’étalonnage et pour la mesure des
échantillons de patients (par ex. température des réactifs).
Contrôle de qualité interne
Domaine normal :
Plasma de contrôle N, code ORKE
Domaine thérapeutique :
Plasma de contrôle P, code OUPZ
Introduire un contrôle dans chaque série de mesures.
Si le résultat du contrôle sort de son domaine de confiance, le retester. Si la déviation est confirmée lors du deuxième test, refaire une nouvelle courbe d’étalonnage. Les résultats des patients
ne peuvent être rendus qu’après avoir identifié et corrigé l’origine de la déviation.
Automates de coagulation (cf. Chapitre “Limites de réalisation du test”)
Le coffret Protéine S Ac peut être utilisé sur un grand nombre d’automates de coagulation (respecter les instructions du fabricant !).
Limites de réalisation du test
Dade Behring propose des protocoles d’adaptation pour certains automates de coagulation.
L’utilisation du Réactif Protéine S Ac sur d’autres automates doit être validée par chaque laboratoire. Dans ce cadre, des caractéristiques différentes que celles indiquées ci-dessous pour le
test peuvent être obtenues.
La précision du test dépend largement de la précision du pipetage, surtout lorsque les volumes
sont faibles !
Lorsqu’on utilise des échantillons congelés, la restitution de protéine S peut être diminuée si les
plaquettes et les leucocytes n’ont pas été correctement séparés au moment du prélèvement du
plasma. Il est nécessaire de centrifuger deux fois les échantillons devant être congelés.
Une mutation du Facteur V au niveau du site de dégradation par la protéine Ca peut entraîner
une restitution diminuée de protéine S8.
La présence d’anticorps antiphospholipidiques (par ex. Lupus anticoagulant) peut provoquer
une augmentation5 ou une diminution6 de l’activité en protéine S.
Une activité d’héparine jusqu’à 3 U/ml (UFH et LMWH) ne perturbe pas le test.
Aucune interférence n’a été observée avec des activités de Facteur VIII jusqu’à 400%.
Domaine de référence
Conditionnement
Coffret, code OPAP
6 x pour 1 ml de Plasma exempt de Protéine S Ac
2 x pour 2 ml de Réactif APC Protéine S Ac
2 x pour 5 ml de Réactif déclenchant Protéine S Ac
Composition
Plasma exempt de Protéine S Ac : plasma citraté humain, lyophilisé, ayant une activité résiduelle de protéine S non mesurable. Le plasma est également exempt de C4BBP.
Réactif APC Protéine S Ac, lyophilisé : protéine C humaine, purifiée, activée, et additionnée de
chlorure de calcium.
Agents de conservation :
5-chloro-2-méthyl-isothiazol-3-one (3,8 mg/l),
2-méthyl-isothiazole-3-one (1,3 mg/l)
Réactif déclenchant Protéine S Ac, lyophilisé : activateur obtenu à partir de venin de vipère de
Russell (Vipera russelli), additionné de phospholipides.
Agent de conservation :
azide de sodium (0,5 g/l)
Mises en garde et précautions d’emploi
1. Réservé à un usage in vitro.
2. Les réactifs contenant de l’azide de sodium doivent être manipulés avec précaution : ne pas
avaler et éviter tout contact avec la peau et les muqueuses. L’azide de sodium peut devenir
explosif au contact de métaux lourds comme le cuivre ou le plomb.
3. Tout don de sang individuel prévu pour la préparation du Plasma exempt de Protéine S Ac est
testé vis-à-vis de l’antigène HBs, de l’anticorps anti-VHC, de l’anticorps anti-VIH 1 et de
l’anticorps anti-VIH 2. Seuls les dons trouvés négatifs sont utilisés.
Indépendamment de cela, tout échantillon (par ex. sérum ou plasma de patient) ou préparation
obtenu à partir de sang humain doit être manipulé avec les précautions nécessaires en cas de
risque biologique, dans la mesure où on ne peut exclure totalement un risque d’infection7.
Préparation des réactifs
Plasma exempt de Protéine S Ac : le reconstituer avec la quantité d’eau distillée indiquée sur
l’étiquette, et le laisser incuber au moins 60 mn à +15/+25°C.
Réactif APC Protéine S Ac : le reconstituer avec la quantité d’eau distillée indiquée sur
l’étiquette, et le laisser incuber au moins 60 mn à +15/+25°C.
Réactif déclenchant Protéine S Ac : le reconstituer avec la quantité d’eau distillée indiquée sur
l’étiquette, le laisser incuber au bain-marie 60 mn à +37°C, et l’agiter avec précaution avant
emploi.
Stabilités et conditions de conservation
Le coffret non ouvert se conserve à +2/+8°C jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’étiquette.
Stabilités après reconstitution (flacons fermés) :
Température
Plasma exempt
de Protéine S Ac
Réactif APC
Protéine S Ac
Réactif déclenchant
Protéine S Ac
+37 °C
+15 / +25 °C
+2 / +8 °C
≤ - 18 °C
8 heures
2 mois
8 heures
2 jours
2 mois
4 heures
8 heures
2 jours
2 mois
Une étude réalisée avec le Sysmex® CA-1500 sur des sujets apparemment sains (n = 218) a
donné les résultats suivants (5ème – 95ème percentile) :
60% à >130%, médiane : 95% (hommes : 75% à >130%, médiane : 104% ; femmes sans
contraception orale : 59% à 118%, médiane : 90% ; femmes sous contraception orale : 52% à
118%, médiane : 81%).
Les domaines de références peuvent varier d’un laboratoire à un autre selon la technique utilisée. C’est pourquoi chaque laboratoire doit déterminer son propre domaine de référence (pour
plus d’informations sur la détermination du domaine de référence, se reporter au document
NCCLS C28-A ” How to Define and Determine Reference Intervals in the Clinical Laboratory”,
Approved Guideline).
Caractéristiques du test
Domaine de mesure
Le domaine de mesure pour le Sysmex® CA-1500 s’étend de 10 à 130% de la normale.
Spécificité
Le test révèle la protéine S fonctionnellement active.
Précision et reproductibilité
Pour des plasmas normaux, les coefficients de variation suivants ont été trouvés sur le Sysmex®
CA-1500 : répétabilité de 3,6% à 5,1%, et reproductibilité de 2,0% à 4,1%. La précision globale
a été trouvée entre 4,6% et 5,5%.
Pour des plasmas pathologiquement diminués , les coefficients de variation suivants ont été
trouvés sur le Sysmex® CA-1500 : répétabilité de 4,7% à 9,2%, et reproductibilité de 1,9% à
7,7%. La précision globale a été trouvée entre 4,8% et 11,6%.
Comparaison avec une autre méthode
Le test Protéine S Ac a été comparé à un autre test Protéine S du commerce, en testant 239
échantillons plasmatiques. Les données suivantes ont été obtenues : coefficient de corrélation
de r = 0,92, intersection de l’axe des y à 1,53 et pente de 0,96.
Les valeurs indiquées comme caractéristiques du dosage représentent des résultats types et ne
doivent pas être considérées comme des spécifications du test Protéine S Ac.
Littératur
Cf. page 1.
Sysmex est une marque déposée de SYSMEX CORPORATION aux USA, en Allemagne et
dans d’autres pays.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
Edition Décembre 2002
Chaque automate de coagulation possède des données de stabilité spécifiques.
Matériel et autres réactifs nécessaires
Plasma Standard Humain, code ORKL
Plasma de contrôle N, code ORKE
Plasma de contrôle P, code OUPZ
Automate de coagulation (cf. Chapitre “Limites de réalisation du test”)
Echantillons à tester
Pour obtenir les plasmas, prélever 1 volume de solution de citrate de sodium 0,11 mol/l (3,2 %)
avec 9 volumes de sang veineux, et mélanger avec précaution en évitant la formation de
mousse. Centrifuger immédiatement pendant au moins 10 minutes à au moins 1500 g. Lors du
prélèvement du plasma à l’aide d’une pipette, veiller à ne prélever aucune plaquette. Si le
plasma doit être congelé, le centrifuger à nouveau, prélever le plasma surnageant, le distribuer
dans un récipient en plastique, bien fermer celui-ci, et congeler rapidement.
OPAP G03 E0541 (257) W
OPAP G03 E0541 Satzdatei
3
3
04.03.2003, 17:25 Uhr
Protein S Ac
Stabilità del campione:
≤ -18°C
1 mese
+15/+25°C
4 ore
Scongelare entro 10 min. a + 37°C il plasma conservato a ≤ -18°C ed effettuare l’analisi entro 4
ore.
Uso previsto
Per la determinazione dell’attività funzionale della proteina S nel plasma umano.
Significato diagnostico
La proteina S, una plasmaproteina vitamina K-dipendente, è il cofattore della proteina C attivata
(proteina Ca). Essa stimola l’inattivazione proteolitica del fattore Va e VIIIa mediante la proteina
Ca e quindi il suo effetto inibitorio sulla coagulazione1,2. La proteina S si riscontra nel plasma, sia
come proteina coagulante libera fisiologicamente attiva, sia in forma inattiva legata alla proteina
legante il C4b (C4bBP). Una ridotta attività della proteina S fa aumentare il rischio tromboembolico. Nei neonati la carenza omozigote di proteina S, analogamente alla carenza omozigote di
proteina C, è causa di Purpura fulminans.
Le cause di ridotta attività della proteina S sono2,3:
- carenze congenite di proteina S
- affezioni epatiche
- terapia con anticoagulanti orali
- trattamento con L-asparaginasi
- gravidanza
- contraccezione orale
- terapia a base di estrogeni
- aumentato livello plasmatico di C4bBP quale reazione della fase acuta.
L’attività della proteina S è legata ai metodi impiegati4.
Per la diagnosi di carenze congenite e per distinguere una carenza dell’attività della proteina S
dovuta ad un aumento della C4bBP, si consiglia di determinare la proteina S libera e legata con
metodi immunologici.
Principio del metodo
La proteina Ca scinde proteoliticamente il F Va, generato durante l’attivazione della cascata
della coagulazione, mediante RVV (veleno di Vipera russell). La proteina S agisce quindi da
cofattore che accelera la reazione, conducendo così a tempi di coagulazione che crescono in
proporzione al contenuto di proteina S presente nel campione. L’aggiunta di plasma carente
permette di ottenere una miscela contenente sufficiente fibrinogeno, Fattore V e altri fattori della
coagulazione, necessari alla coagulazione.
La coagulazione viene stimolata fino al livello del Fattore X, mediante l’attivatore FX ottenuto da
RVV. Per l’azione del Fattore Va residuo, il FXa, trasforma la protrombina in trombina. La trombina infine trasforma il fibrinogeno in fibrina.
Il tempo di coagulazione può essere individuato meccanicamente, otticamente o con altri metodi
di misura.
Reagenti
Contenuto della confezione
Kit, codice OPAP
6 x 1 mL Plasma carente di proteina S Ac
2 x 2 mL Reagente proteina S Ac APC
2 x 5 mL Reagente attivatore per proteina S Ac
Composizione
Plasma carente di proteina S Ac: plasma umano liofilizzato citratato con un’attività residua di
proteina S non misurabile. Il plasma è pure esente da C4bBP.
Reagente proteina S Ac APC, liofilizzato: proteina C umana purificata e attivata con aggiunta di
cloruro di calcio.
Conservante:
5-cloro-2-metil-isotiazolo-3-one (3,8 mg/L).
2-metil-isotiazolo-3-one (1,3 mg/L).
Reagente attivatore per proteina S Ac, liofilizzato: attivatore estratto da veleno di vipera Russell Viper (Vipera russelli) con aggiunta di fosfolipidi
Conservante:
sodio azide (0,5 g/L)
Avvertenze e precauzioni
1. Solo per uso diagnostico in vitro.
2. Quando si impiegano diagnostici in vitro contenenti sodio azide osservare le seguenti precauzioni: non ingerire ed evitare contatti con la cute e le mucose.
La sodio azide a contatto con metalli pesanti, come rame e/o piombo, può formare azidi
esplosive.
3. Ogni donazione di sangue utilizzata per la produzione del plasma carente di proteina S è
stata esaminata per la ricerca dell’antigene di superficie del virus dell’epatite B e degli anticorpi anti-HCV, anti-HIV1 e anti-HIV2. Solo i campioni risultati negativi sono stati impiegati
per la produzione.
Tuttavia, poiché non è possibile escludere con assoluta certezza il pericolo di agenti patogeni, tutti i derivati da sangue umano devono essere trattati con le necessarie precauzioni rispettando le norme di sicurezza sul rischio biologico7.
Preparazione dei reagenti
Plasma carente di proteina S Ac: sciogliere con la quantità di acqua distillata indicata in etichetta e incubare per almeno 60 min. a +15/+25°C.
Reagente proteina S Ac APC: sciogliere con la quantità di acqua distillata indicata in etichetta
e incubare per almeno 60 min. a +15 /+25°C.
Reagente attivatore per proteina S Ac: sciogliere con la quantità di acqua distillata indicata in
etichetta, incubare in bagnomaria per 60 min. a +37°C e mescolare delicatamente prima
dell’uso.
Conservazione e stabilità
I reagenti in confezione originale, conservati a +2/+8°C, sono stabili fino alla data di scadenza
indicata sull’etichetta. Stabilità dopo ricostituzione (flaconi chiusi):
Temperatura
Plasma carente di
proteina S Ac
Reagente
proteina S Ac APC
+37 °C
+15/+25 °C
8 ore
8 ore
+2/+8 °C
2 giorni
≤ - 18 °C
2 mesi
2 mesi
I diversi analizzatori hanno dati di stabilità individuali.
Reagente attivatore
per proteina S Ac
Metodica
Per maggiori informazioni fare riferimento al manuale d’uso del produttore e ai fogli applicativi
per la Proteina S specifici dell’analizzatore.
Risultati
La valutazione avviene mediante una curva di calibrazione, allestita in precedenza dosando
diluizioni seriali di Plasma umano standard con Plasma carente di proteina S. Dopo la preparazione della curva di calibrazione procedere immediatamente con l’analisi del campione. Occorre
fare attenzione affinché le condizioni per l’allestimento delle curve di calibrazione siano le stesse
di quelle rispettate per la successiva misura dei campioni (ad es. temperatura dei reagenti).
Controllo di qualità interno
Intervallo normale:
Plasma di controllo N, codice ORKE
Intervallo patologico:
Plasma di controllo P, codice OUPZ
In ciascuna serie di misure occorre inserire un controllo.
In caso di variazione dei controlli rispetto all’intervallo di accettabilità, ripetere la determinazione.
Se anche questa seconda determinazione conferma la deviazione, preparare una nuova curva
di calibrazione. Non rilasciare i risultati del paziente, se prima non sono state identificate e rimosse le cause della deviazione.
Analizzatori per coagulazione (v. “Limitazioni della procedura”)
Il kit Proteina S Ac può essere utilizzato con una varietà di analizzatori per coagulazione (consultare il manuale d’uso del produttore).
Limitazioni della procedura
Utilizzare analizzatori per coagulazione per i quali la Dade Behring fornisce i protocolli analitici.
L’utilizzo della Proteina S Ac su altri analizzatori per coagulazione deve essere validato dal laboratorio. In tal caso, le caratteristiche del test possono differire da quelle indicate.
La precisione del test è strettamente legata alla precisione con cui si esegue il pipettamento,
specialmente di piccoli volumi!
In campioni congelati è possibile ottenere un basso recupero di proteina S, se durante la preparazione del plasma, le piastrine e i leucociti non sono stati accuratamente separati. Si raccomanda di centrifugare una seconda volta i campioni prima di congelarli.
La presenza di una mutazione al livello del sito di scissione del Fattore V da parte della proteina
Ca può portare ad un recupero ridotto di proteina S8.
Gli anticorpi anti-fosfolipidi (ad es. anticoagulante Lupus) possono portare ad un aumento5 o una
diminuzione6 dei risultati del test di attività della Proteina S.
L’attività di eparina fino a 3 U/mL (UFH e LMWH) non influenza il test.
L’attività di Fattore VIII fino al 400% non interferisce con il test.
Intervalli di riferimento
In uno studio condotto su soggetti apparentemente sani (n= 218) con Sysmex® CA-1500 si sono
ottenuti i seguenti risultati (5-95° percentile):
60% - > 130%, mediana: 95% (uomini: 75% - > 130%, mediana: 104%; donne senza contraccezione orale: 59% - 118%, mediana: 90%; donne con contraccezione orale: 52% - 118%, mediana: 81%).
I valori di riferimento differiscono da laboratorio a laboratorio, a seconda della tecnica utilizzata;
pertanto ogni laboratorio dovrebbe stabilire il proprio intervallo di riferimento (per maggiori informazioni consultare il documento NCCLS C28-A “How to Difine and Determine Reference Intervals in the Clinical Laboraotory”. Linee Guide approvate).
Caratteristiche specifiche del test
Intervallo di misura
L’intervallo di misura per il Sysmex® CA-1500 si estende da 10 a 130% della norma.
Specificità
Il test rivela la proteina S funzionalmente attiva.
Precisione e riproducibilità
Per i plasmi normali misurati con l’uso di Sysmex® CA-1500, i coefficienti di variazione nelle serie
sono risultati essere compresi tra 3,6% e 5,1%, e tra serie sono risultati essere compresi tra
2,0% e 4,1%. La precisione totale è compresa tra il 4,6% e 5,5%.
Per i plasmi patologicamente carenti, misurati con l’uso del Sysmex® CA-1500, i coefficienti di
variazione nelle serie sono risultati essere compresi tra 4,7% e 9,2%, e tra serie sono risultati
essere compresi tra 1,9% e 7,7%. La precisione totale è compresa tra il 4,8% e 11,6%.
Confronto fra i metodi
Il test Proteina S Ac è stato confrontato con un test proteina S disponibile in commercio, mediante la valutazione di 239 campioni di plasma.
Si è ottenuto un coefficiente di correlazione di r = 0,92 con una intercetta y = 1,53 ed un pendenza di 0,96.
I valori indicati per le caratteristiche specifiche del test rappresentano risultati tipici e non devono
essere considerati come specifiche per il test Proteina S Ac.
Bibliografia
Vedere pagina 1.
Sysmex è un marchio registrato della SYSMEX CORPORATION negli USA, in Germania e negli
altri Paesi.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
Edizione Dicembre 2002
4 ore
8 ore
2 giorni
2 mesi
Materiale necessario ma non fornito
Plasma umano standard, codice ORKL
Plasma di controllo N, codice ORKE
Plasma di controllo P, codice OUPZ
Analizzatore per coagulazione (v. “Limitazioni della procedura”).
Campioni in esame
Per la preparazione del plasma mescolare accuratamente, evitando la formazione di schiuma, 1
parte della soluzione di citrato di sodio, 0,11 mol/L (3,2 %), con 9 parti di sangue venoso. Centrifugare subito per 10 min. ad almeno 1500 x g. Nel separare il plasma accertarsi che le piastrine
non vengano rimosse con la pipetta. Se il campione dovesse essere congelato, ripetere la
centrifugazione e congelare velocemente il plasma prelevato ben sigillato in contenitori di plastica.
OPAP G03 E0541 (257) W
OPAP G03 E0541 Satzdatei
4
4
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Estabilidad de la muestra:
< - 18°C
1 mes
entre +15 y +25°C
4 horas
Las muestras almacenadas a < - 18°C se deben descongelar en máximo 10 min. a 37°C, mezclarse y su determinación debe efectuarse dentro de las 4 horas siguientes.
Protein S Ac
Campos de aplicación
Para la determinación de la actividad funcional de la Proteína S en plasmas humanos.
Significado diagnóstico
La proteína S, una proteína del plasma dependiente de la vitamina K, es el cofactor de la proteína C activada (proteína Ca). La proteína S estimula la inactivación proteolítica de los factores Va
y VIIa mediante la proteína Ca y de esta manera su acción inhibidora en la coagulación1, 2. La
proteína S existe en el plasma tanto en forma libre, proteína activa en la fisiología de la coagulación, como en una forma inactiva unida a la proteína fijadora del C4b (C4bBP). Una baja
actividad de proteína S aumenta el riesgo tromboembólico. El déficit de proteína S en homocigotos, al igual que el déficit de proteína C en los mismos, ocasiona en recién nacidos púrpura
fulminans.
Las causas para una disminución en la actividad de la proteína S son2, 3
- deficiencias hereditarias de proteína S
- alteraciones de las funciones del hígado
- anticoagulantes orales
- tratamiento con L-asparaginasa
- embarazo
- anticonceptivos orales
- terapéutica con estrógenos
- un nivel elevado de C4bBP en plasma como reacciones de fase aguda.
La correspondiente actividad de la proteína S depende del método de ensayo utilizado4.
Para aclarar las deficiencias hereditarias o adquiridas y para delimitar una deficiencia en la
actividad de la proteína S, ocasionada por un aumento en C4bBP, se recomienda la determinación de la proteína S libre y unida, empleando métodos inmunoquímicos.
Principio del método
La proteína Ca disocia proteolíticamente el factor Va, el cual se produce durante la activación de
la cascada de la coagulación por medio del RVV (veneno de Vipera russelli). La proteína S actúa
en este caso como cofactor acelerando considerablemente la reacción. Así, se produce un aumento en el tiempo de coagulación proporcional a la actividad de la proteína S en la muestra. La
adición, a la preparación, de un plasma deficiente permite el suministro adecuado de fibrinógeno, factor V y de otros factores necesarios para la coagulación.
La coagulación se activa en la etapa del factor X por medio del activador FX, proveniente del
RVV. El factor Xa genera, bajo la mediación del factor Va restante, trombina a partir de protrombina. La trombina transforma finalmente el fibrinógeno.
El tiempo de coagulación se puede determinar mecánicamente, ópticamente o por otros principios de medida.
Reactivos
Contenido del envase comercial
Teskit, N° de pedido OPAP
6 x para 1 ml Protein S Ac Plasma deficiente
2 x para 2 ml Protein S Ac Reactivo APC
2 x para 5 ml Protein S Ac Reactivo iniciador
Composición
Protein S Ac Plasma deficiente: Plasma humano citratado, liofilizado y sin actividad restante
medible de proteína S. Este plasma está igualmente libre de C4bBP.
Protein S Ac Reactivo APC, liofilizado; Proteína C-humana purificada y activa, con adición de
cloruro de calcio.
Agentes de conservación:
5-cloro-2-metil-isotiazol-3-ona (3,8 mg/l),
2-metil-isotiazol-3-ona (1,3 mg/l).
Protein S Ac Reactivo iniciador, liofilizado; activador obtenido del veneno de Russells Viper
(Vipera russelli), con adición de fosfolípidos.
Agente de conservación:
azida de sodio (0,5 g/l).
Advertencias y medidas de seguridad
1. Sólo para ser utilizado en diagnósticos in-vitro.
2. En el manejo de diagnósticos in-vitro que contengan azida sódica debe observarse la siguiente regla:
No ingerir y evitar contacto con la piel y mucosas. La azida sódica puede formar azidas
explosivas con metales como cobre y plomo.
3. Cada donación de sangre destinada a la preparación del Protein S Ac Plasma deficiente, fue
sometida a pruebas para detectar la presencia de HBsAg, anti-HCV, anti-HIV 1 y anti-HIV.
Para la elaboración sólo se utilizaron donaciones con resultados negativos.
Independientemente de esto, todos los materiales obtenidos a partir sangre humana deben
ser manipulados con las precauciones necesarias, siguiendo las medidas de seguridad recomendadas en caso de riesgo biológico, puesto que nunca se puede excluir completamente la
existencia de agentes patógenos7.
Preparación de reactivos
Protein S Ac Plasma deficiente: Disolver en la cantidad de agua destilada indicada en la
etiqueta e incubar entre +15 y +25°C por lo menos durante 60 min.
Protein S Ac Reactivo APC: Disolver en la cantidad de agua destilada indicada en la etiqueta
e incubar entre +15 y +25°C por lo menos durante 60 min.
Protein S Ac Reactivo iniciador: Disolver en la cantidad de agua destilada indicada en la etiqueta
e incubar, en baño de agua, durante 60 min. a +37°C. Agitar cuidadosamente antes de usarse.
Estabilidad y almacenaje
El testkit aún cerrado y almacenado a una temperatura entre +2 y +8°C puede ser utilizado
hasta la fecha de vencimiento dada en la etiqueta.
Estabilidad después de la reconstitución (frascos cerrados):
Temperatura
Protein S Ac
Plasma deficiente
Protein S Ac
Reactivo APC
Protein S Ac
Reactivo iniciador
+37 °C
4 horas
entre +15 y +25 °C
8 horas
8 horas
8 horas
entre +2 y +8 °C
2 días
2 días
≤ - 18 °C
2 meses
2 meses
2 meses
Los diferentes aparatos de medida de la coagulación tienen datos individuales de estabilidad.
Materiales adicionales necesarios
Plasma humano estándar, N° de pedido ORKL
Plasma de control N, N° de pedido ORKE
Plasma de control P, N° de pedido OUPZ
Aparato de medida de la coagulación (ver capitulo „ Limitaciones del procedimiento“)
Procedimiento
Detallada información sobre el desarrollo del test se puede tomar del manual de operaciones del
aparato apropiado para medir la coagulación y de las instrucciones de aplicación especificas del
aparato para proteína S.
Valoración
La valoración se hace por medio de una curva de referencia, preparada con anterioridad, con
una serie de diluciones del plasma humano estándar con el Protein S Ac Plasma deficiente. El
estudio de las muestras debe hacerse inmediatamente después de preparar la curva de referencia. Es importante tener en cuenta, que las condiciones para la preparación de las curvas de
referencia y las utilizadas para las medidas sean las mismas (por ej. la temperatura de los
reactivos).
Control de calidad interno
Rango normal:
Plasma de control N, N° de pedido ORKE
Rango patológico: Plasma de control P, N° de pedido OUPZ
Con cada serie de medidas se debe medir un control.
Si los resultados de las medidas del control se encuentran por fuera de su rango de confianza,
se debe repetir la determinación del control. Si después de la repetición, se comprueba la desviación, se debe realizar una nueva curva de referencia. Los resultados de los pacientes deben
ser entregados únicamente cuando la causa de esta desviación sea conocida y eliminada.
Aparato de medida de la coagulación (ver capítulo „Limitaciones del procedimiento“)
El kit Proteína S Ac puede ser utilizado en un gran número de aparatos de medida de la coagulación (¡Observe las instrucciones de manejo del fabricante!).
Limitaciones del procedimiento
Existen aparatos de medida de la coagulación apropiados, para los cuales Dade Behring tiene
listo instrucciones de manejo. El uso del reactivo Protein S Ac en otros aparatos de medida de la
coagulación debe ser validado por el laboratorio que realiza la investigación. En este caso, se
pueden obtener para las características otros valores diferentes a los dados.
¡La precisión del test depende especialmente de la precisión al pipetear, especialmente para
volúmenes pequeños de muestra!
En muestras congeladas se puede llegar a tener una muy baja recuperación de la proteína S,
cuando las plaquetas y los leucocitos no son separados completamente al obtener el plasma.
Las muestras que se van a congelar deben centrifugarse por una segunda vez.
La existencia de una mutación del factor V en el sitio de ruptura de la proteína Ca puede conducir a una reducción de la recuperación de la proteína S8.
Anticuerpos antifosfolípidos (por ej., anticoagulante lúpico) pueden conllevar a resultados de la
actividad de la proteína S elevados5 o disminuidos6.
Actividades de heparina hasta de 3 U/ml (UFH y LMWH) no alteran el test.
Actividades del factor VIII hasta de 400% no muestran ninguna interferencia.
Rango de referencia
En un estudio realizado con el Sysmex® CA-1500, con sujetos de apariencia sana (n = 218) se
obtuvieron los siguientes datos (5. - 95. percentile):
60% - > 130 %, mediana: 95% (Hombres: 75% -> 130%, mediana 104%; Mujeres sin anticoncepción oral: 59% - 118%, mediana: 90%; Mujeres con anticoncepción oral: 52% - 118%, mediana: 81%).
Los rangos de referencia pueden variar de laboratorio a laboratorio dependiendo de la técnica
utilizada, por esta razón deberá cada laboratorio determinar sus propios rangos de referencia.
(Para mayor información sobre la determinación de los rangos de referencia ver los documentos
NCCLS C28-A „How to Define and Determinate Reference Intervals in the Clinical Laboratory“,
Approved Guideline).
Características del test
Rango de medida
El rango de medida para el Sysmex® CA-1500 va de 10 a 130% del valor normal.
Especificidad
El test registra proteína S activa funcional.
Precisión y reproducibilidad
Para plasmas normales el coeficiente de variación de la serie en el Sysmex® CA-1500 se encuentra entre 3,6 % y 5,1 % y para las medidas día a día entre 2,0 % y 4,1 %. La precisión total se
encontró entre 4,6% y 5,5%.
Para plasmas patológicamente disminuidos se encontraron en el Sysmex® CA-1500 coeficientes
de variación de la serie entre 4,7 % y 9,2 %, y para las medidas día a día entre 1,9 % y 7,7 %. La
precisión total se encontró entre 4,8% y 11,6%.
Comparación de métodos
El test Protein S Ac fue comparado con otro test para proteína S existente en el comercio mediante la valoración de 239 muestras de plasmas.
Se obtuvo un coeficiente de correlación r = 0,92, un corte del eje-y de 1,53 y una pendiente de
0,96.
Los datos dados como datos específicos de las características del test, representan resultados
típicos y no se deben tomar como especificaciones del test Protein S Ac.
Literatura
Ver la página 1.
Sysmex es una marca de fábrica registrada de SYSMEX CORPORATION en USA, Alemania y
en otros países.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
Edición Diciembre 2002
Material a investigar
Para obtener el plasma mezclar cuidadosamente 1 parte de solución de citrato de sodio 0,11
mol/l (3,2 %) con 9 partes de sangre venosa, evitando la formación de espuma. Centrifugar
inmediatamente durante 10 min. por lo menos a 1500 x g.
Al retirar el plasma tener cuidado de no pipetear las plaquetas. En caso de que las muestras tengan que ser congeladas, centrifugarlas de nuevo y congelar el plasma separado rápidamente en un recipiente plástico herméticamente cerrado.
OPAP G03 E0541 (257) W
OPAP G03 E0541 Satzdatei
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Execução do teste
Protein S Ac
Campo de aplicação
Para determinação da actividade funcional da proteína S no plasma humano.
Significado diagnóstico
A proteína S, uma proteína plasmática dependente da vitamina K, é o co-factor da proteína C
activada (proteína Ca). Ela estimula a inactivação proteolítica dos factores Va e VIIIa através da
proteína C e, dessa maneira, o seu efeito inibidor da coagulação 1,2. A proteína S existe no
plasma sob a forma de uma proteína livre activa da coagulação fisiológica e sob a forma de uma
proteína inactiva ligada à proteína de ligação C4b (C4bBP). Uma redução da actividade da
proteína S aumenta o risco tromboembólico. Nos recém-nascidos, a deficiência homozigótica
de proteína S provoca, tal como a deficiência homozigótica de proteína C, Purpura fulminans.
As causas para a redução de actividade da proteína S são 2,3
- Deficiência hereditária de proteína S
- Perturbações hepáticas funcionais
- Anti-coagulação oral
- tratamento com L-Asparaginase
- Gravidez
- Anticoncepcionais orais
- Terapia com estrogéneo
- Nível elevado de CAbMP no plasma como reacção de fase aguda.
A actividade da respectiva proteína S pode depender do método de ensaio utilizado 4.
Para a clarificação das deficiências hereditárias ou adquiridas de proteína S e a demarcação da
deficiência de actividade da proteína S provocada pelo nível elevado de C4bBP, é aconselhável
proceder à determinação da proteína S, na sua forma livre e ligada, com métodos imunológicos.
Princípio metodológico
A proteína Ca produz a degradação proteolítica do F Va originado pelo RVV (veneno da Vipera
russelli) durante a activação da cascata da coagulação.
Neste caso, a proteína S actua como co-factor que acelera a reacção consideravelmente. Desse
modo, ocorre um aumento do tempo de coagulação que é proporcional à actividade da proteína S na
amostra. A adição de plasma deficiente encarrega-se de fornecer à preparação fibrinogénio, F V e os
outros factores de coagulação necessários, de forma suficiente. A coagulação é impulsionada ao nível
do factor X pelo activador FX do RVV. Com a intervenção do factor Va ainda remanescente, o FXa
forma trombina a partir da protrombina. Por fim, a trombina transforma o fibrinogénio. O momento da
coagulação pode ser detectado de forma mecânica, óptica ou através de outros princípios de medição.
Reagentes
Conteúdo da embalagem comercial
Kit de teste ref. OPAP
6 x para 1 ml Protein S Ac Plasma deficiente
2 x para 2 ml Protein S Ac APC Reagente
2 x para 5 ml Protein S Ac Reagente inicial
Composição
Protein S Ac Plasma deficiente: Liofilizado de plasma humano citratado com actividade residual da proteína S não mensurável. O plasma também está isento de C4bBP.
Protein S Ac APC Reagente, liofilizado de proteína C humana purificada e activada, com
adição de cloreto de cálcio.
Conservante:
5-cloro-2-metil-isotiazol-3-on (3,8 mg/l),
2-metil-isotiazol-3-on (1,3 mg/l)
Protein S Ac Reagente inicial, liofilizado, activador de veneno da víbora de Russell (Vipera
russelli) com adição de fosfolípidos.
Conservante:
Azida de sódio (0,5 g/l).
Advertências e medidas de precaução
1. Só para uso diagnóstico in vitro.
2. Ao manipular diagnósticos in vitro que contêm azida de sódio, é necessário prestar atenção
ao seguinte: Evitar a ingestão ou o contacto com a pele ou mucosas. A azida de sódio em
contacto com os metais pesados como o cobre ou o chumbo pode formar azidas explosivas.
3. Cada dávida individual de sangue destinada à preparação de Proteína S Ac plasma deficiente, foi previamente examinada com vista à detecção de HBsAg, Anti-HCV, Anti-HIV1 e AntiHIV2. Na preparação só foram utilizadas dávidas com resultado negativo. Independentemente disso, todos as amostras e produtos obtidos a partir de sangue humano (p. ex., soros
e plasmas de pacientes) devem ser manuseados com as precauções devidas, seguindo as
medidas de segurança recomendadas em caso de risco biológico, uma vez que o risco de
contaminação por agentes patogénicos nunca pode ser inteiramente excluído 7.
Preparação dos reagentes
Protein S Ac Plasma deficiente: Dissolver com a quantidade de água destilada indicada no
rótulo e deixar incubar 60 min., no mínimo, entre +15 e +25 °C.
Protein S Ac APC Reagente: Dissolver com a quantidade de água destilada indicada no rótulo
e deixar incubar 60 min., no mínimo, entre +15 e +25 °C.
Protein S Ac Reagente inicial: Dissolver com a quantidade de água destilada indicada no rótulo, incubar
durante 60 min. em banho-maria à temperatura de +37 °C e agitar cuidadosamente antes de usar.
Estabilidade e condições de conservação
O kit de teste deverá ser conservado, não aberto, entre +2 e +8 °C e poderá ser usado até à data
indicada no rótulo.
Estabilidade após a reconstituição (frascos fechados):
Temperatura
Protein S Ac
Plasma deficiente
Protein S Ac
APC Reagente
Informações detalhadas sobre a execução do teste podem ser consultadas no manual de instruções dos coagulómetros apropriados e nas instruções de uso da Proteína S Ac específicas
do aparelho.
Avaliação dos resultados
A avaliação é feita com base numa curva de referência que foi estabelecida previamente através
de diluições em série do plasma humano padrão com Protein S Ac Plasma deficiente. A análise do
material da amostra tem de ser feita imediatamente após a determinação da curva de referência.
Dar atenção a que as condições para o estabelecimento das curvas de referência e as medições seguintes sejam as mesmas (p. ex., a temperatura dos reagentes).
Controlo de qualidade interno
Intervalo normal:
Plasma de controlo N, ref. ORKE
Intervalo patológico: Plasma de controlo P, ref. OUPZ
Em cada série de medição deverá ser efectuado um controlo conjuntamente.
Se o resultado da medição do controlo se situar fora do intervalo de confiança, a determinação
terá de ser repetida. Caso a repetição confirme o resultado da medição, é necessário estabelecer uma curva de referência nova. Os valores de medição dos pacientes só poderão ser divulgados, depois da causa do desvio ter sido identificada e eliminada.
Coagulómetros (vide o capítulo “Limitações de execução do teste”)
O Kit de Protein S Ac pode ser utilizado numa multiplicidade de coagulómetros (Seguir o manual de utilização do fabricante!).
Limitações de execução do teste
São apropriados os coagulómetros para os quais a Dade Behring disponibiliza instruções de uso.
A utilização do Reagente Protein S Ac noutros coagulómetros tem de ser validada pelo laboratório
de análise. Neste caso, podem obter-se características de performance diferentes das indicadas.
A precisão do teste depende muito da precisão da pipetagem, em especial com volumes de
amostras pequenos! Nas amostras congeladas rapidamente, se as plaquetas e os leucócitos
não forem removidos cuidadosamente durante a extracção do plasma, a recuperação de proteína S pode ser reduzida. É necessário centrifugar as amostras a congelar uma segunda vez.
A presença de uma mutação do factor V no ponto de desagregação da proteína Ca pode provocar uma recuperação reduzida da proteína S 8.
Os anticorpos antifosfolípidos (p. ex., o anticoagulante lúpus), podem provocar resultados de
teste de actividade da proteína S elevados 5 ou reduzidos6.
Actividades de heparina até 3U/ml (UFH e LMWH) não perturbam o teste.
Actividades do factor VIII até 400% não apresentam interferências.
Intervalo de referência
Num estudo executado no Sysmex® CA-1500 com indivíduos testados aparentemente saudáveis (n = 218) foram colhidos os seguintes dados (5. - 95. percentis):
60% - > 130%, valor médio: 95% (homens: 75% - > 130%, valor médio: 104%; mulheres com
contracepção oral: 59% - 118%, valor médio: 90%; mulheres com contracepção oral: 52% 118%, valor médio: 81%).
Os intervalos de referência podem variar de laboratório para laboratório em função da técnica utilizada e, por isso, cada laboratório deverá definir o seu intervalo de referência próprio. (Vide mais informações sobre a definição do intervalo de referência no documento C 28-A do NCCLS ”How to
Define and Determine Reference Intervals in the Clinical Laboratory”, Approved Guideline).
Características do teste
Intervalo de medição
Para o Sysmex® CA-1500 é suficiente um intervalo de referência de 10 a 130% da norma.
Especificidade
O teste detecta a proteína S funcionalmente activa.
Precisão e reprodutibilidade
Nos plasmas normais, no Sysmex® CA-1500 foram encontrados coeficientes de variação na
série de 3,6% e 5,1% e de 2,0% a 4,1% no dia a dia. . A precisão total situou-se entre 4,6% e
5,5%.
Nos plasmas com valores patológicos reduzidos, no Sysmex® CA-1500 foram encontrados
coeficientes de variação na série de 4,7% e 9,2%, e de 1,9% e 7,7% no dia a dia. . A precisão
total situou-se entre 4,8% e 11,6%.
Comparação de métodos
O teste Protein S Ac foi comparado com um outro teste de proteína S disponível no mercado,
através da avaliação de 239 amostras de plasma.
Obteve-se um coeficiente de correlação de r = 0,92, um segmento axial y 1,53 e um aumento 0,96.
Os valores indicados para as características específicas do teste representam resultados típicos e não devem ser considerados como especificação para o teste Protein S Ac.
Bibliografia
Vide a página 1.
Sysmex é uma marca registada da SYSMEX CORPORATION nos EUA, na Alemanha e noutros países.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
Edição Dezembro 2002
Protein S Ac
Reagente inicial
+37 °C
4 horas
+15 a +25 °C
8 horas
8 horas
8 horas
+2 a +8 °C
2 dias
2 dias
≤ - 18 °C
2 meses
2 meses
2 meses
Os diversos aparelhos de medição da coagulação possuem dados individuais de estabilidade.
Outros materiais necessários
Plasma humano padrão, ref. ORKL
Plasma de controlo, ref. ORKE
Plasma de controlo P, ref. OUPZ
Aparelho de medição de coagulação (vide o capítulo ”Limitações de realização do teste”)
Symbols Key / Symbolschlüssel / Explication des Symboles / Interpretazione
simboli / Clave de los Símbolos / Chave dos Símbolos
Manufactured by / Hergestellt von / Fabriqué par / Prodotto da / Fabricado por
IVD
In Vitro Diagnostic Medical Device / In Vitro Diagnosticum / Dispositif Médical Diagnostic In
Vitro / Dispositivo Medico per Diagnostica In Vitro / Producto sanitario para Diagnóstico In Vitro
LOT
Lot Number / Chargenbezeichnung / Numéro de Lot / Numero di Lotto / Número de Lote
EXP
CCYY-MM-DD
Material de análise
Para a obtenção de plasma, misturar cuidadosamente 1 parte de solução de citrato de sódio
0,11 molar/l (3,2 %) com 9 partes de sangue venoso, evitando a formação de espuma. Centrifugar, imediatamente, durante 10 min., a não menos de 1500 x g. Ao extrair o plasma, prestar
atenção a que as plaquetas não sejam retiradas com a pipeta.
Se se pretender congelar esta amostra, centrifugar uma vez mais e congelar rapidamente o
plasma extraído num recipiente de plástico bem fechado.
Estabilidade da amostra:
≤ - 18 °C
1 mês
+15 a +25 °C
4 horas
Descongelar a +37° C os plasmas conservados a ≤ - 18 °C num espaço de tempo de 10 min.,
misturar e executar a análise num espaço de 4 horas.
OPAP G03 E0541 (257) W
OPAP G03 E0541 Satzdatei
Expiration Date / Verfalldatum / Date de Péremtion / data di scadenza / Fecha de
vencimiento / termo da validade
Storage Temperature / Lagertemperatur / Température de Conservation / Temperatura
di conservazione / Temperatura de almacenamiento / Temperatura de armazenagem
CE Mark / CE-Zeichen / Marquage CE / Marchio CE / CE Marca / Marca CE
REF
Catalogue Number / Katalog Nummer / Référence / Codice Catalogo / Número de Catálogo
Consult Instructions for Use / Gebrauchsanweisung beachten / Consulter la Notice d’Utilisation /
Istruzioni per l’uso / Consultar Instucciones para el Uso / Consulte as Instruções de Utilização
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04.03.2003, 17:25 Uhr