FARRZYME™ Human high avidity anti

Transcripción

•
metal azides. On disposal of reagents flush with a large volume of water, to
prevent azide build-up.
The buffers and serum supplied in this kit contain various enzyme inhibitors as
listed below. These should be handled with care.
INSTRUCTIONS FOR USE
FARRZYME™ Human high avidity anti-dsDNA
Enzyme Immunoassay Kit
MK072
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Product manufactured by:
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K.
www.bindingsite.co.uk
Telephone: +44 (0)121 436 1000
Fax: +44 (0)121 430 7061
e-mail: [email protected]
FDA (USA) Information
Analyte Name
Anti-DNA antibody enzyme labelled
Complexity Cat.
High
INTENDED USE
This assay is intended for the in-vitro measurement of specific, high avidity IgG
autoantibodies against double stranded deoxyribonucleic acid (dsDNA) present in
human serum, as an aid to the diagnosis of systemic lupus erythematosus (SLE),
in conjunction with other serological test results and clinical findings.
Sufficient materials are supplied to allow a maximum of 40 samples to be tested in
duplicate or 88 in single, with a calibration curve and positive, negative and single
stranded DNA controls.
This kit can be run either as a fully quantitative assay, or as a screening assay,
using the cut-off control.
BACKGROUND
The use of anti-dsDNA antibodies as a diagnostic marker for SLE and in the
subsequent monitoring of disease activity has been of great benefit to clinicians1
since first being recognised by Ceppelini et al in 19572 and confirmed by its
inclusion in the 1982 revised American College of Rheumatology criteria for the
classification of SLE3.
There are three commonly used assay methods employed today that can be
differentiated on the basis of the avidity of the dsDNA antibodies detected4:
Enzyme linked immunosorbant assay (ELISA), of which there are many variants,
classically detect a wide spectrum of antibody avidities. The Crithidia luciliae
immunofluorescent assay (IFA) detects antibodies biased to those with lower
avidities and Farr radioimmunoassays (RIA)5 classically measure only the high
avidity antibodies by virtue of the ammonium sulphate precipitation step which
precludes low avidity antibodies.
The FARRZYME assay incorporates a more stringent set of assay conditions8,
which are intended to remove the low avidity weakly bound antibodies.
Some studies6,7 have shown a relationship between antibody avidity and the
progression of the disease, where the selection of the assay facilitates the
differentiation between patients with a benign form of SLE and those with skin and
renal involvement, particularly in cases of lupus nephritis 8,9.
Generally there is good agreement among all the assays using sera from patients
with ‘definite’ systemic lupus erythematosus (SLE), however there is significant
discordance in patients with inactive disease, or those that do not meet the
standard classification for SLE.
3
PRINCIPLE OF THE ASSAY
Microwells are pre-coated with calf thymus dsDNA antigen. The calibrators,
controls and diluted patient samples are added to the wells and autoantibodies
recognising the dsDNA antigen bind during the first incubation. After washing the
wells to remove all unbound proteins, purified peroxidase labelled rabbit antihuman IgG (γ chain specific) conjugate is added. The conjugate binds to the
captured human autoantibody and the excess unbound conjugate is removed by a
further wash step. The bound conjugate is visualised with 3,3’, 5,5’
tetramethylbenzidine (TMB) substrate which gives a blue reaction product, the
intensity of which is proportional to the concentration of autoantibody in the
sample. Phosphoric acid is added to each well to stop the reaction. This produces
a yellow end point colour, which is read at 450nm.
4
PRECAUTIONS
4.1 WARNING
•
•
Kathon
Sodium Azide
ProClin™ 300
Bromonitrodioxane
Methylisothiazone
0.02%
0.099%
0.045%
0.002%
0.002%
All human sera supplied have been tested at donor level and found negative
for Hepatitis B surface antigens and antibodies to HIV 1 and 2 and Hepatitis C
virus. However, these tests cannot guarantee the absence of infectious
agents. Proper handling and disposal methods should be established and only
personnel qualified in handling of potentially infectious materials should be
permitted to use this kit.
Sodium azide may react with lead and copper plumbing to form explosive
Kathon is an irritant and may cause sensitisation by skin contact.
The stop solution contains 3M phosphoric acid which is an irritant. Avoid
contact with skin and eyes.
Reagent spills should be cleaned up appropriately, observing local and
environmental regulations.
4.2 CAUTION
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2
CONCENTRATION
ProClin™ is a trademark of Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA
This kit is for in-vitro diagnostic use.
1
INHIBITOR
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•
This product should only be used by appropriately trained personnel.
Strict adherence to the protocol is recommended. Any deviation may affect
assay performance, and the results obtained. Pay attention to specific ‘Notes’
and warnings throughout these Instructions for Use.
Reagents from different batch numbers of kits are NOT interchangeable. If
large numbers of tests are performed care should be taken to ensure that all
reagents are from the SAME batch. All strips used must be taken from the
same foil pouch. Substitution of any component may lead to incorrect results.
To avoid reagent contamination, only use new or clean plastic / glassware.
Never return unused reagents to the bottles.
Do not leave reagent bottles uncapped; any resulting evaporation or
contamination will lead to inconsistent results.
TMB substrate must not be exposed to light or water.
Microbially contaminated, haemolysed or lipaemic serum and specimens
containing particulate matter should not be used.
The use of calibrated pipettes and appropriate internal QC samples is
recommended.
The use of automated assay systems, sample dilutors and other automated
equipment may lead to differences in results when compared to the manual
procedure. It is the responsibility of any laboratory to fully validate the system,
and ensure the results fall within the limits as defined in this insert and
associated QC certificate.
All equipment used must be calibrated and maintained according to the
manufacturer’s instruction.
4.3 STORAGE AND STABILITY
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•
5
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•
6
The kit should be stored at 2-8°C and should not be frozen. Inappropriate
storage temperatures will affect the results.
Diluted wash buffer can be stored at room temperature (20-24°C) for a
maximum of 4 weeks.
The expiry date of the kit is shown on the outer label.
SAMPLE COLLECTION AND STORAGE
Blood samples should be collected by venepuncture allowed to clot naturally
and the serum separated.
The serum may be stored at 2-8°C for up to 7 days prior to assay10, or for
prolonged storage, aliquoted and stored at -20°C or below.
Repeated thawing and freezing should be avoided.
Serum samples should not be heat-inactivated, as this may give false
positive results.
MATERIALS
6.1 MATERIALS SUPPLIED
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•
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•
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Instruction leaflet: Giving full assay details.
QC Certificate: Indicating the expected performance of the batch.
dsDNA Coated Wells: 12 breakapart 8 well strips coated with calf thymus
dsDNA antigen. Each plate is packaged in a re-sealable foil bag containing
two desiccant pouches.
Type III Sample Diluent: 2 bottles containing 50mL of buffer for sample
dilution. Coloured yellow, ready to use.
dsDNA Wash Buffer (10x Concentrate): 2 bottles containing 50mL of a 10fold concentrated buffer for washing the wells.
dsDNA Calibrators: 5 vials each containing 1.2mL of diluted human serum,
with the following concentrations of anti-dsDNA autoantibody: 1000, 333,
111, 37, 12.3 IU/mL. Ready to use.
dsDNA Cut-off Control: 1 bottle containing 1.2mL of diluted human serum.
The expected value is given on the QC certificate. Ready to use.
dsDNA Positive Control: 1 vial containing 1.2mL of diluted human serum.
dsDNA Negative Control: 1 vial containing 1.2mL of diluted human serum.
dsDNA Single Stranded Control: 1 vial containing 1.2mL of diluted human
serum. The expected value is given on the QC certificate. Ready to use.
dsDNA Conjugate: 1 bottle containing 12mL of purified peroxidase labelled
antibody to human IgG. Coloured red, ready to use.
TMB Substrate: 1 bottle containing 14mL TMB substrate. Ready to use.
Stop Solution: 1 bottle containing 14mL of 3M phosphoric acid. Ready to
use.
Insert Code: E072, Version: 11 December 2008, Page 1 of 13
6.2 ADDITIONAL MATERIALS AND EQUIPMENT – not supplied
•
•
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•
•
7
Automatic microplate plate washer: This is recommended, however, plate
washing can be performed manually.
Plate reader: Capable of measuring optical densities at 450nm referenced
on air.
Distilled or deionised water: This should be of the highest quality available.
Calibrated micropipettes: For dispensing 1000, 100 & 10µL.
Multichannel pipette: Recommended for dispensing 100µL volumes of
conjugate, substrate and stop solution.
Glass/plastic tubes: For sample dilution.
ASSAY METHOD
7.1 PRE-ASSAY STEPS
1.
•
•
Bring the kit to room temperature
The kit is designed for room temperature operation (20-24°C).
Remove the kit from storage and stand at room temperature for
approximately 60 minutes. Wells must not be removed from the foil bag until
they have reached room temperature.
Note: The kits may be maintained at room temperature for up to 1 week.
2.
Kit components
Gently mix each kit component before use.
3.
Wash buffer (10 x concentrate) dilution
Add 100mL of the wash buffer concentrate to 900mL of distilled water (1 in
10 dilution) into a clean container and mix. Smaller volumes can be diluted as
appropriate.
Note: Diluted wash buffer can be stored at room temperature for up to 4
weeks, therefore only dilute the appropriate amount.
4.
Sample dilution
Dilute 10µL of each sample with 1000µL of sample diluent (1:100) and mix
well.
Note: Diluted sample must be used within 8 hours.
5.
Strip and frame handling
Place the required number of wells in the strip holder, position from well A1,
filling columns from left to right across the plate. When handling the plate,
squeeze the long edges of the frame to prevent the wells falling out.
Note: Return unused wells to the foil bag immediately with the two desiccant
pouches and re-seal tightly to minimise exposure to moisture.
Take care not to puncture or tear the foil bag, see below.
WARNING: Exposure of wells to moisture or contamination by dust or
other particulate matter will result in antigen degradation, leading to
poor assay precision and potentially false results.
7.2 ASSAY METHOD
Maintain the same dispensing sequence throughout the assay.
1.
2.
Sample addition
Dispense 100µL of each calibrator (quantitative assay) or cut-off control
(qualitative assay), assay controls and diluted (1:100) sample into the
appropriate wells of the plate provided.
Note: Samples should be added as quickly as possible to the plate to
minimise assay drift, and the timer started after the addition of the last
sample.
Incubate at room temperature for 30 minutes.
Washing
The washing procedure is critical and requires special attention. An
improperly washed plate will give inaccurate results, with poor precision and
high backgrounds.
After incubation remove the plate and wash wells 3 times with 250-350µL
wash buffer per well. Wash the plate either by using an automatic plate
washer or manually as indicated below. After the final automated wash, invert
the plate and tap the wells dry on absorbent paper.
8
2.
3.
Conjugate addition
Dispense 100µL of conjugate into each well, blot the top of the wells with a
tissue to remove any splashes.
Note: To avoid contamination, never return excess conjugate to the reagent
bottle.
Incubate at room temperature for 30 minutes.
4.
Washing
Repeat step 2.
5.
Substrate (TMB) addition
Dispense 100µL of TMB substrate into each well, blot the top of the wells
with a tissue to remove any splashes.
Note: To avoid contamination never return excess TMB to the reagent bottle.
Incubate at room temperature in the dark for 30 minutes.
6.
Stopping
Dispense 100µL of stop solution into each well. This causes a change in
colour from blue to yellow.
7.
Optical density measurement
Read the optical density (OD) of each well at 450nm on a microplate reader,
within 30 minutes of stopping the reaction.
Calculate mean optical densities (For assays run in duplicate only).
For each calibrator, control and sample calculate the mean OD of the
duplicate readings. The percentage coefficient of variation (%C.V.) for each
duplicate OD should be less than 15%.
8.2 SCREEN ASSAY – CALCULATION OF RESULTS
1. Quality assessment of the optical densities
•
The OD of the positive control should be greater than 0.5 and greater than
the OD of the cut-off control.
•
The OD of the negative control should be less than the OD of the cut-off
control.
•
The OD of the cut-off control should be greater than that of the negative
control but less than 0.5.
•
The OD of the single stranded control should be less than the OD of the cutoff control.
2.
Results interpretation
Using the cut off control, interpret the results according to the following table:
RESULT
OD equal to or greater
than cut-off control
OD less than cut-off
control
INTERPRETATION
Suspected of having
anti-dsDNA antibodies
ACTION
Test in the
quantitative assay
Negative
Report as negative
8.3 QUANTITATIVE ASSAY - CALCULATION OF RESULTS
1. Plot calibration curve
The calibration curve can be plotted either automatically or manually as
follows by plotting the anti-dsDNA autoantibody concentration on the log
scale against the OD on the linear scale for each calibrator:
•
Automatic - use appropriately validated software, and the curve fit that best
fits the data.
•
Manual - using log/linear graph paper, draw a smooth curve through the
points (not a straight line or point to point).
2.
Treatment of anomalous points
If any one point does not lie on the curve, it can be removed. If the absence
of this point means that the curve has a shape dissimilar to that of the sample
calibration curve, or more than one point appears to be anomalous, then the
assay should be repeated.
3.
Calculation of autoantibody levels in controls and diluted samples
Read the level of the anti-dsDNA autoantibody in the controls and diluted
samples directly from the calibration curve. The control values should fall
within the range given on the QC Certificate.
Note: The calibrator values have been adjusted by a factor of 100 to account
for a 1:100 sample dilution. No further correction is required.
4.
Assay calibration
The assay is calibrated in IU/mL against the WHO reference calibrator
Wo806.
5.
•
Limitations
This assay, by virtue of its ability to detect only high avidity anti-dsDNA
antibodies, may miss some forms of SLE where patients have only
antibodies of low avidity. It might not be suitable for applications where a
total anti-dsDNA antibody measurement is required.
This kit is used to aid diagnosis only. A positive result suggests certain
diseases, which must be confirmed by clinical findings and other serological
tests.
The results obtained from this assay are not diagnostic proof of the presence
or absence of disease.
Automated plate washers should not be programmed to include a soak
step.
Plates can be washed manually as follows:
a. Flick out the contents of the plate into a sink.
b. Tap the wells dry on absorbent paper.
c. Fill each well with 250-350µL of wash buffer using a multichannel
pipette.
d. Gently shake the plate on a flat surface.
e. Repeat a-d twice.
f.
Repeat a and b
Do not leave the wash in the wells for longer than it takes to fill the
whole plate.
RESULTS AND QUALITY CONTROL
8.1 QUANTITATIVE/QUALITATIVE ASSAYS
1. Quality control
In order for an assay to be valid, all the following criteria must be met:
•
Calibrators /cut-off control (as applicable) and positive, negative and single
stranded controls must be included in each run.
•
The values /ODs obtained for all the controls should be in the ranges
specified on the QC Certificate.
•
Quantitative assay only: the curve shape should be similar to the calibration
curve, shown on the QC Certificate.
If the above criteria are not met, the assay is invalid and the test should
be repeated.
•
•
9
EXPECTED VALUES
The following ranges have been established based on the results obtained from
testing samples from both and healthy blood donors (n=150) and SLE patients
(n = 224) on FARRZYME:
INTERPRETATION
Negative result
≤ 30 IU/mL
> 30 IU/mL
Positive result
The 150 sera from normal blood donors all gave results below 17.0 IU/mL, with
146 (97%) of the results below 12.3 IU/mL which is the lower measuring limit of
the kit. 22.8% of the SLE patient sera gave positive FARRZYME results (>30
IU/mL).
The results shown below are of a comparision study between the same 224 SLE
samples of the FARRZYME and a conventional anti-dsDNA EIA assay, which
measures both low and high avidity antibodies to dsDNA. Samples giving
borderline results in the conventional dsDNA assay were treated as negative
when calculating positive and negative percentage agreement and overall
agreement.
Conventional Anti-dsDNA ELISA
Positive
Borderline
Negative
Positive
47
3
1
FARRZYME
Negative
33
51
89
Positive percent agreement = 58.8%
Negative percent agreement = 97.2%
Overall agreement = 83.5%
The incidence of high avidity anti-dsDNA antibodies detected by FARRZYME and
by Farr RIA in 100 SLE patients has been reported to be 36% and 38%,
respectively8. By contrast, in 100 patients with various connective tissue diseases
and other autoimmune diseases the incidence was 4% and 5% respectively for
the two assays.
Unit values obtained with the FARRZYME assay may not agree with those
obtained in other assays reporting in IU/mL, as FARRZYME only measures the
high avidity anti-dsDNA antibody subset.
The ranges are provided as a guide only. ELISA assays are very sensitive and
capable of detecting small differences in sample populations. It is recommended
that each laboratory determine its own normal range, based on the population
techniques and equipment employed.
10
10.1
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
MEASURING RANGE
The measuring range of the assay is 12.3 – 1000 IU/mL.
10.2
CONFIRMATION OF ASSAY SENSITIVITY
Confirmation that the FARRZYME assay can distinguish between two samples
with values close to the bottom of the measuring range (120 and 165% of the
lowest calibrator) was obtained by statistical analysis (Student’s t-test) of the
results obtained from testing multiple replicates of each sample.
10.3
SPECIFICITY, AGREEMENT
189 samples from patients with SLE, together with 35 samples positive for dsDNA
antibodies by Crithidia or ELISA and 28 samples from healthy normals were
tested by FARRZYME, by Crithidia luciliae immunofluorescent assay and also in a
conventional dsDNA ELISA.
+
Positive percent agreement
Negative percent agreement
Overall agreement
FARRZYME
14
183
+
*Positive percent agreement
Negative percent agreement
Overall agreement
67.3%
92.9%
87.3%
Conventional dsDNA ELISA
+
Border-line
47
3
1
33
51
117
58.8%
97.7%
85.3%
INTERFERING SUBSTANCES
Various serum types were assayed to test the possible effect of interfering
substances using an Interference Check A plus kit (Kokusai, Japan).
Substance
Bilirubin F (free)
Bilirubin C (conjugate)
Haemolysed haemoglobin
Chyle
Rheumatoid factor
PLATE TEMPLATE
Summary of procedure
*For the calculation of agreement between the two assays, samples in the
borderline region of the conventional dsDNA assay were classified as
negative.The conventional ELISA detects antibodies of both high and low avidity,
resulting in reduced positive agreement for the FARRZYME assay.
10.4
Isenberg D and Smeenk R. Clinical laboratory assays for measuring antidsDNA antibodies. Where are we now? Lupus, 2002; 11: 797-800.
Ceppelini R, Polli E and Celada F. A DNA-reacting factor in serum of a
patient with lupus erythematosus diffuses. Proc Soc Exp Biol Med, 1957; 96:
572-574.
3. Tan et al. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus
erythematosus. Arthritis Rheumatism, 1982; 25:1271-7.
4. Riboldi P et al. Anti-DNA antibodies: a diagnostic and prognostic tool for
systemic lupus erythematosus? Autoimmunity. 2005; 38: 39-45.
5. Werle E et al. The clinical significance of measuring different ant-dsDNA
antibodies by using the Farr assay, an enzyme immunoassay and a crithidia
luciliae immunofluorescence test. Lupus, 1992; 1: 369-377.
6. Isenberg D. Anti-dsDNA antibodies: still a useful criterion for patients with
systemic lupus erythematosus? Lupus, 2004; 13: 881-885.
7. Nossent H C and Rekvig O P. Is closer linkage between systemic lupus
erythematosus and anti-double-stranded DNA antibodies a desirable and
attainable goal? Artheritis Res Ther, 2005; 7(2): 85-7.
8. Jaekel HP et al. Anti-dsDNA antibody subtypes and anti-C1q antibodies:
toward a more reliable diagnosis and monitoring of systemic lupus
erythematosus and lupus nephritis. Lupus, 2006; 15: 1-11.
9. Renaudineau Y et al. Association of α-actinin-binding anti-dsDNA antibody
Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A
with lupus nephritis. Arthritis Rheumatism, 2006 (in press)
10. Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A
Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
11. Smeenk R, van der Lelij G and Aarden L. Measurement of low avidity antidsDNA by the Crithidia luciliae test and the PEG assay. Clin Exp Immunol,
1982; 49: 603-610.
2.
Please see back of insert.
FARRZYME EIA demonstrated good negative agreement with the Crithidia luciliae
immunofluorescent assay. Positive percent agreement was reduced because the
latter assay is known to detect anti-DNA antibodies of low avidity11, unlike the
FARRZYME assay.
FARRZYME
REFERENCES
1.
12
Crithidia IFA
+
37
18
11
1.
Add 100µL of each calibrator, control and 1:100 diluted
sample to the appropriate wells.
Incubate for 30 minutes.
Wash.
2.
Add 100µL of conjugate to each well.
Wash.
3.
Add 100µL of substrate to each well.
4.
Add 100µL of stop solution to each well.
Measure the absorbance at 450nm.
FARRZYME™ and BINDAZYME™ are trademarks
of The Binding Site Ltd.
P.O. Box 11712, Birmingham
B14 4ZB. England
Concentration
20.3mg/dL
20.2mg/dL
486mg/dL
1460 Units
45 IU/mL
No interference was observed with free or conjugated bilirubin, haemoglobin, lipid
or rheumatoid factor.
In a separate study 6 IgG myeloma sera were tested on the FARRZYME assay
and none of these gave a positive result.
10.5
PRECISION
The intra- and inter-assay precision was measured using six samples covering the
range of the calibration curve. The mean and % C.V. for each sample are given
below:
Intra-assay precision was measured using 20 replicates in one assay.
n = 20
Sample 1
Sample 2
Sample 3
Sample 4
Sample 5
Sample 6
INTRA-ASSAY PRECISION
Concentration (IU/mL)
25.1
39.0
74.5
205.5
361.2
528.6
% C.V.
5.4
4.8
2.2
3.3
4.3
5.1
Inter-assay precision was measured by testing samples in duplicate in 6 assays
performed over 3 days.
n=6
Sample 1
Sample 2
Sample 3
Sample 4
Sample 5
Sample 6
INTRA-ASSAY PRECISION
Concentration (IU/mL)
24.6
42.3
61.3
123.2
272.4
474.1
% C.V.
13.5
3.9
11.6
4.9
7.0
6.9
•
ARBEITSSANLEITUNG
•
FARRZYME™ Anti-dsDNA Antikörper
Enzym-Immunoassay-Kit
MK072
Nur zur in-vitro Diagnostik
Natriumazid kann mit Blei- oder Kupferrohren explosive Metallazide bilden.
Nach der Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser nachspülen um
Azidablagerungen zu vermeiden.
Alle Puffer und Seren im Kit enthalten die unten aufgelisteten EnzymInhibitoren als Konservierungsmittel. Diese sollten mit der entsprechenden
Vorsicht behandelt werden.
INHIBITOR
KONZENTRATION
Kathon
0,02%
Natriumazid
0,099%
ProClin™ 300
0,045%
0,002%
Bromonitrodioxan
0,002%
Methylisothiazon
ProClin™ ist ein eingetragenes Warenzeichen der Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA
Hergestellt von:
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK.
Vertrieb in Deutschland und Österreich durch:
The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straβe 2A
D-68723 Schwetzingen, Deutschland
Telefon: +49 (0) 6202 92 62 0
Fax: +49 (0) 6202 92 62 222
•
•
•
4.2 VORSICHTSMAßNAHMEN
•
•
•
1
VERWENDUNGSZWECK
Dieser Kit dient zur in-vitro Bestimmung spezifischer, hoch-avider IgG-Autoantikörper gegen doppelsträngige Desoxyribonukleinsäure (dsDNA) in Humanserum. Dieser Test soll zusammen mit anderen serologischen und klinischen
Befunden bei der Diagnosestellung von Systemischem Lupus Erythematodes
(SLE) helfen.
•
Der Kit enthält ausreichend Material, um maximal 40 Proben in
Doppelbestimmung oder 88 Proben in Einzelbestimmung, sowie eine
Kalibrationskurve, Positiv-, Negativ- und DNA-Einzelstrangkontrollen zu messen.
•
•
Der Kit kann sowohl als quantitativer Test als auch als Screening Test verwendet
werden. Im Screening-Test wird eine Cut-Off-Kontrolle eingesetzt.
2
3
TESTPRINZIP
Die Vertiefungen (Wells) der Mikrotiterplatten sind mit dsDNA-Antigen aus
Kalbsthymus beschichtet. Die Kalibratoren, Kontrollen und verdünnten
Patientenproben werden in den Vertiefungen inkubiert, so dass in diesem ersten
Inkubationsschritt dsDNA-Autoantikörper an das immobilisierte Antigen binden
können. Nach dem Waschen der Vertiefungen - um ungebundenes Protein zu
entfernen - wird Peroxidase-markiertes Kaninchen anti-Human-IgG-Konjugat
zugegegeben. Das Konjugat bindet an die gebundenen humanen Autoantikörper.
Ungebundenes Konjugat wird durch einen weiteren Waschschritt entfernt. Das
gebundene Konjugat wird mit Hilfe von 3,3’,5,5’ Tetramethylbenzidin (TMB)
sichtbar gemacht. TMB ergibt ein blaues Reaktionsprodukt, dessen Intensität
proportional zur Autoantikörper-Konzentration der Probe ist. Um die Reaktion zu
stoppen, wird in jede Vertiefung Phosphorsäure pipettiert. Das daraus
resultierende gelbe Reaktionsprodukt wird bei 450nm gemessen.
4
WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN
4.1 WARNUNGEN
•
•
•
•
EINFÜHRUNG
Die Verwendung von anti-dsDNA-Antikörper als diagnostischer Marker und zur
Verlaufskontrolle der Krankheitsaktivität bei SLE hat seit der erstmaligen
Beschreibung von Ceppelini et al im Jahr 19572 den behandelnden Ärzten1 große
Verbesserungen gebracht. Diese Erkenntnisse wurden 1982 bestätigt, indem sie
vom
American
College
of
Rheumatology
in
die
überarbeiteten
Klassifikationskriterien für SLE3 aufgenommen wurden.
Es werden heute drei allgemeine Testmethoden eingesetzt, die sich darin
unterscheiden, dass anti-dsDNA-Antikörper unterschiedlicher Avidität erfasst
werden4. Enzym-Immunoassays (ELISA), die es in verschiedenen Varianten gibt,
erfassen in der Regel Antikörper von sehr unterschiedlicher Avidität. In der
indirekten Immunfluoreszenz (IFT) mit Crithidia luciliae werden Antikörper mit
niedriger Avidität auch miterfasst, wohingegen im Farr Radioimmunoassay (RIA)5
nur die hoch-aviden Antikörper erfasst werden, da aufgrund eines
Fällungsschrittes mit Ammoniumsulfat die niedrig-aviden Antikörper entfernt
werden.
Bei dem FARRZYME-Test wurden stringentere Testbedingungen gewählt8,
wodurch die nur schwach bindenden niedrig-aviden Antikörper entfernt werden.
In einigen Studien6,7 konnte ein Zusammenhang zwischen der Antikörper-Avidität
und der Krankheitsprogression gezeigt werden, wobei die Wahl der Testmethode
die Unterscheidung zwischen Patienten mit einer benignen Form des SLE und
solchen mit Haut- und Nierenbeteiligung, besonders bei einer Lupus-Nephritis8,9,
erleichtert.
Im allgemeinen zeigen alle Methoden bei Seren von Patienten mit bestätigtem
systemischen Lupus erythematodes (SLE) eine gute Übereinstimmung, aber eine
signifikante Varianz bei Patienten mit inaktivem SLE, oder bei Patienten, die nicht
der Standardklassifikation von SLE entsprechen.
Das Ausgangsmaterial zur Erstellung der Kalibratoren und Kontrollen stammt
aus menschlichem Blut. Jede Einzelspende wurde bezüglich Antikörpern
gegen Human-Immunschwäche-Virus (HIV 1 & 2), Hepatitis C-Virus und
Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAG) untersucht und als negativ befunden. Es gibt aber zur Zeit keine absolut sicheren Testmethoden zum
Auschluss von Infektionsträgern. Deshalb sollten die Reagenzien als
potentiell infektiös behandelt werden. Umgangs- und Entsorgungsmethoden
sollten denen für potentiell infektiösem Materi al entsprechen und der Test
nur von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden.
Kathon wirkt reizend und kann bei Hautkontakt zu einer Sensibilisierung führen.
Die Stopp-Lösung enthält 3M Phosphorsäure. Sie ist reizend, deshalb
Kontakt mit Haut und Augen vermeiden.
Verschüttete Reagenzien entsprechend beseitigen, dabei sind ökologische
und gesetzliche Bestimmung zu beachten.
•
Dieser Test sollte nur von entsprechend geschultem Laborpersonal
durchgeführt werden.
Testdurchführung strikt nach Arbeitsanleitung. Jegliche Abweichung kann die
Testqualität und Ergebnisse beeinflussen. Beachten Sie die spezifischen
‚Hinweise‘ und Warnungen in dieser Arbeitsanleitung.
Reagenzien unterschiedlicher Chargen dürfen NICHT untereinander
gemischt oder gemeinsam verwendet werden. Bei großem Testdurchsatz
muss darauf geachtet werden, dass alle Reagenzien der GLEICHEN Charge
entstammen. Alle Mikrotiterstreifen müsen aus demselben Folienbeutel
entnommen werden. Der Austausch einer Testkomponente kann inkorrekte
Ergebnisse zur Folge haben.
Zur Vermeidung von Kontaminationen der Reagenzien immer saubere
Plastik- oder Glasgefäße verwenden. Niemals unbenutztes Reagenz in die
Flaschen zurückgeben.
Reagenzienflaschen nicht für längere Zeit offen stehenlassen. Die daraus
resultierende Verdunstung oder Verunreinigung führt zu widersprüchlichen
Ergebnissen.
TMB darf weder mit Licht noch mit Wasser in Berührung kommen!
Die Verwendung von mikrobiell oder mit Partikeln verunreinigter,
hämolytischer oder lipämischer Seren vermeiden.
Es wird empfohlen kalibrierte Pipetten und geeignete interne Kontrollen zu
verwenden.
Die Verwendung von ELISA-Automaten, Pipettierautomaten oder anderen
automatisierten Geräten kann im Vergleich zur manuellen Testdurchführung
zu abweichenden Ergebnissen führen. Jedes Labor muss das System
vollständig validieren und sicherstellen, dass die Ergebnisse innerhalb des in
dieser Arbeitsanleitung und dem beigefügten QC-Zertifikat Spezifikationen
liegen.
Die verwendeten Geräte und Pipetten müssen gemäß der Herstellerangaben
kalibriert und gewartet werden.
4.3 LAGERUNG UND STABILITÄT
•
•
•
5
•
•
•
•
6
Den Kit bei 2-8°C lagern, nicht einfrieren. Lagerung bei falscher Temperatur
beeinflusst die Ergebnisse.
Der verdünnte Waschpuffer ist in einem sauberen Gefäß bei Raumtemperatur (20-24°C) bis maximal 4 Wochen haltbar.
Die Haltbarkeit des Kits wird auf dem Außenetikett angegeben.
PROBENENTNAHME UND -VORBEREITUNG
Blutproben über Venenpunktur sammeln und auf natürliche Weise gerinnen
lassen. Serum vom Gerinnsel trennen.
Die Seren können bei 2-8°C bis zu 7 Tage vor dem Test gelagert werden10.
Für eine längere Lagerung empfiehlt es sich, die Seren unverdünnt und
aliquotiert bei mindestens -20°C einzufrieren.
Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben vermeiden.
Serumproben nicht hitzeinaktivieren, dies kann zu falsch-positiven
Ergebnissen führen.
MATERIALIEN
6.1 GELIEFERTE MATERIALIEN
•
Arbeitsanleitung: mit genauen Angaben zur Testdurchführung.
•
QC-Zertifikat: mit Angabe der Leistungsdaten der Charge.
•
dsDNA Coated Wells (dsDNA-beschichtete Mikrotiterstreifen): 12
Mikrotiterstreifen mit 8 vereinzelbaren Vertiefungen, die mit KalbsthymusdsDNA beschichtet sind. Die Streifen sind in einem wiederverschließbaren
Folienbeutel, der ein Trockenmittel enthält, verpackt.
Type III Sample Diluent (Probendiluens Typ III): 2 Flaschen mit je 50mL
gebrauchsfertigem Puffer zur Probenverdünnung. Farbcodierung: gelb.
dsDNA Wash Buffer (10x Concentrate) (Waschpuffer dsDNA 10-fach
Konzentrat): 2 Flaschen mit 50mL eines 10-fach konzentrierten Puffers zum
Waschen der Vertiefungen.
dsDNA Calibrator(s) (dsDNA-Kalibratoren): 5 Flaschen mit je 1,2mL
verdünntem Humanserum mit den folgenden Konzentrationen an antidsDNA-Autoantikörpern: 1000; 333; 111; 37; 12,3 IU/mL. Gebrauchsfertig.
dsDNA Cut-off Control (dsDNA-Cut-Off-Kontrolle): 1 Flasche mit 1,2 mL
verdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegeben.
Gebrauchsfertig.
dsDNA Positive Control (dsDNA-Positivkontrolle): 1 Flasche mit 1,2mL
vorverdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat
angegeben. Gebrauchsfertig.
dsDNA Negative Control (dsDNA-Negativkontrolle): 1 Flasche mit 1,2mL
vorverdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat
angegeben. Gebrauchsfertig.
dsDNA Single Stranded Control (dsDNA-Einzelstrangkontrolle): 1 Flasche
mit 1,2mL vorverdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QCZertifikat angegeben. Gebrauchsfertig.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
dsDNA Conjugate (dsDNA-Konjugat): 1 Flasche mit 12mL gereinigtem,
Peroxidase-markiertem Antikörper gegen Human-IgG. Farbcodierung: rot.
Gebrauchsfertig.
TMB Substrate (TMB-Substrat): 1 Flasche mit 14mL TMB-Lösung.
Gebrauchsfertig.
Stop Solution (Stopp-Lösung): 1 Flasche mit 14mL 3M Phosphorsäure.
Gebrauchsfertig.
4.
Waschen der Platte
Siehe Abschnitt 2.
5.
Pipettieren von Substrat (TMB)
Nach dem Waschen 100µL TMB in jedes Well pipettieren. Die Ränder der
Wells mit Filterpapier abblotten um Spritzer zu entfernen.
Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges TMB
in die TMB-Flasche zurückgeben.
30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
6.
Reaktionsende
100µL Stopp-Lösung in jedes Well pipettieren. Die Farbe schlägt von blau
nach gelb um.
7.
Farbmessung
Die optische Dichte (OD) bei 450nm in jedem Well mit einem
Mikrotiterplatten-Reader innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der StoppLösung bestimmen.
6.2 BENÖTIGTE, NICHT IM KIT ENTHALTENE MATERIALIEN
•
•
•
•
•
•
7
Automatisches Mikrotiterplatten-Waschgerät: ist empfehlenswert, aber
die Platten können auch manuell gewaschen werden.
Mikrotiterplatten-Reader: Messung der optischen Dichte in den
Vertiefungen bei 450nm.
Destilliertes Wasser: Es sollte von höchster Qualität sein.
Kalibrierte Micropipetten: zum Pipettieren von 1000, 100 & 10µL.
Mehrkanal-Pipette: zum Pipettieren von Volumina von 100µL.
Glas-oder Plastikgefäße: zur Probenverdünnung.
TESTDURCHFÜHRUNG
7.1 TESTVORBEREITUNG
1.
•
•
Kit auf Raumtemperatur erwärmen:
Die optimale Temperatur für die Testdurchführung liegt bei 20-24°C.
Den Kit nach Entnahme aus dem Kühlschrank ca. 60 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Die Wells dürfen erst nach Errreichen der
Raumtemperatur aus dem Folienbeutel entnommen werden.
Hinweis: Der Kit kann bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur gelagert werden.
2.
Kit-Komponenten
Jede Kit-Komponente vor Gebrauch kurz schütteln.
3.
Waschpuffer (10-fach-Konzentrat) verdünnen
Dazu 100mL Waschpuffer-Konzentrat und 900mL destilliertes Wasser (1/10Verdünnung) in ein sauberes Gefäß geben und mischen. Es können auch
entsprechend kleinere Volumina verdünnt werden.
Hinweis: Der verdünnte Puffer ist bei Raumtemperatur bis zu 4 Wochen
haltbar; deshalb nur die benötigte Menge verdünnen.
4.
5.
Verdünnung der Proben
10µL jeder Probe mit 1000µL Probendiluens verdünnen (1:100) und gut
mischen.
Hinweis: Die verdünnten Proben müssen innerhalb von 8 h gemessen
werden.
Umgang mit Streifen und Rahmen
Die benötigte Anzahl Wells aus dem Folienbeutel entnehmen und in den
Rahmen setzen. Dabei von Position A1 ausgehend die Spalten von links
nach rechts auffüllen. Achten Sie darauf, die langen Seiten des Rahmens
zusammenzudrücken, damit die Wells nicht herausfallen können.
Hinweis: Um die Kontaktzeit mit der Luftfeuchtigkeit zu minimieren die nicht
verwendeten Wells sofort in den wiederverschließbaren Folienbeutel mit dem
Trockenmittel geben und gut verschließen.
Darauf achten, dass der Folienbeutel nicht beschädigt wird.
ACHTUNG: Kontakt mit Feuchtigkeit oder Verunreinigung durch Staub
oder anderen Partikeln kann einen Antigen-Abbau verursachen. Daraus
resultiert eine schlechte Präzision und potentiell falsche Ergebnisse.
8
1.
•
•
•
2.
1.
Pipettieren der Kalibratoren, Kontrolle und Proben
100µL von jedem Kalibrator (quantitative Bestimmung) oder Cut-Off-Kontrolle
(qualitative Bestimmung), jeder Kontrolle und verdünnten (1:100) Proben in
das dafür laut Plattenschema vorgesehene Well pipettieren.
Hinweis: Die Proben müssen so schnell wie möglich pipettiert werden um
eine ‚Assay-Drift’ zu vermeiden; die Inkubationszeit läuft ab Zugabe der
letzten Probe.
30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
2.
Waschen der Platte
Sorgfältiges Waschen der Wells ist wichtig für eine hohe Präzision und
genaue Testergebnisse. Bei nicht korrekt gewaschenen Wells können
ungenaue Ergebnisse mit schlechter Präzision und hohem Hintergrund
auftreten.
Nach der Inkubation die Wells dreimal mit 250-350µL Waschpuffer waschen.
Das Waschen kann mit einem automatischen Platten-Waschgerät oder
manuell erfolgen. Nach dem letzten Waschschritt die Wells durch leichtes
Klopfen auf eine absorbierende Unterlage (z.B. Papiertücher) trocknen.
1.
•
•
•
•
2.
Lassen Sie den Waschpfuffer nur solange in den Wells, bis alle
Wells gefüllt sind.
3.
Pipettieren des Konjugats
100µL Konjugat in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit
Filterpapier abtrocknen um Spritzer zu entfernen.
Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges
Konjugat in die Konjugat-Flasche zurückgeben.
30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Berechnung der mittleren optischen Dichte (OD) (nur bei Doppelbestimmung): Für jeden Kalibrator und jede Kontrolle und Probe die mittlere
optischen Dichte (OD) der Doppelbestimmungen berechnen. Der Variationskoeffizient (%VK) der Doppelbestimmungen sollte jeweils unter 15% liegen.
Qualitätskriterien für die OD
Die OD der Positivkontrolle sollte größer als 0,5 und größer als die OD der
Cut-Off-Kontrolle sein.
Die OD der Negativkontrolle sollte kleiner als die OD der Cut-Off-Kontrolle
sein.
Die OD der Cut-Off-Kontrolle sollte größer als die der Negativkontrolle aber
kleiner als 0,5 sein.
Die OD der Einzelstrangkontrolle sollte kleiner als die OD der Cut-OffKontrolle sein.
Interpretation der Ergebnisse
Bei Verwendung der Cut-Off-Kontrolle sind die Ergebnisse wie in der
folgenden Tabelle angegeben zu interpretieren:
OD ≥ Cut-Off-Kontrolle
Ergebnis
Interpretation
Verdacht auf antidsDNA-Autoantikörper
Aktion
Im quantitativen Test
messen
OD < Cut-Off-Kontrolle
Negativ
Befund: Negativ
8.3 QUANTITATIVE PROBE - BERECHNUNG VON RESULTATEN
1. Erstellen der Kalibrationskurve
Die Kalibrationskurve kann entweder automatisch oder manuell erstellt
werden. Dazu wird die anti-dsDNA-Autoantikörper-Konzentration auf der
logarithmischen Skala gegen die OD-Werte auf der linearen Skala für jeden
Kalibrator aufgetragen.
•
Automatisch: Geeignete, validierte Software verwenden. Kalkulationsmodus
verwenden, der am besten zu den Daten passt.
•
Manuell: Halblogarithmisches Millimeterpapier verwenden, eine Ausgleichskurve durch die Punkte legen (keine Gerade oder Punkt-zu-PunktVerbindung).
2.
Umgang mit abweichenden Kalibrationspunkten
Liegt ein Messpunkt nicht auf der Kalibrationskurve, so kann er weggelassen
werden. Der Test sollte wiederholt werden, wenn die daraus resultierende
Kalibrationskurve deutlich von der im QC-Zertifikat angegebenen Kurvenform
abweicht oder, wenn mehrere Kalibrationspunkte zu starke Abweichungen
aufweisen.
3.
Berechnung der Autoantikörper-Konzentrationen in den Kontrollen und
verdünnten Proben
Die anti-dsDNA-Autoantikörper-Konzentrationen der Kontrollen und verdünnten Proben direkt aus der Kalibrationskurve ablesen. Die Kontrollwerte
müssen in den im QC-Zertifikat angegebenen Bereich fallen.
Hinweis: Die Standard-Probenverdünnung von 1:100 ist in der Kalibrationskurve bereits berücksichtigt. Es sind keine weiteren Berechnungen nötig.
4.
Kalibration des Tests
Der Test ist in IU/mL gegen den Referenzkalibrator Wo80 der WHO
kalibriert6.
5.
•
Grenzen des Tests
Mit diesem Test, der nur hoch-avide anti-dsDNA-Antikörper erfasst, können
einige Formen von SLE, bei denen die Patienten nur niedrig-avide Antikörper
produzieren, als negativ gefunden werden. Daher kann der Test für solche
Fälle, in denen die gesamte Population der anti-dsDNA-Antikörper erfasst
werden soll, nicht eingesetzt werden.
Dieser Test dient nur zur Unterstützung der Diagnose. Ein positives Ergebnis
ist ein Hinweis auf bestimmte Erkrankungen, es muss aber durch den
klinischen Befund und andere serologische Untersuchungen bestätigt
werden.
Die Testergebnisse können nicht als diagnostischer Beweis für das Vorliegen
bzw. Nichtvorliegen einer Krankheit verwendet werden.
Bei Verwendung von automatischen Mikrotiterstreifen-Waschgeräte
sollte keine Standzeit einprogrammiert werden.
Manuelles Waschen:
a.
Den Inhalt der Wells in den Ausguss schütten, dabei die
langen Seiten des Rahmens zusammendrücken.
b.
Die Wells auf einer absorbierenden Unterlage (z.B.
Papiertücher) leicht ausklopfen.
c.
250-350µL Waschpuffer in der Arbeitskonzentration mit einer
Mehrkanalpipette in die Wells pipettieren.
d.
Die Mikrotiterplatte auf einer flachen Unterlage stehend leicht
schütteln
e.
Zweimaliges Wiederholen der Schritte a bis d.
f.
Die Wells wie unter a und b entleeren.
Qualitätskontrolle
Nur, wenn alle nachfolgend aufgeführten Kriterien erfüllt sind, ist der Test
gültig.
Kalibratoren/Cut-off-Kontrolle (je nach Ansatz) und die Kontrollen (Positiv,
Negativ, Einzelstrang) müssen bei jedem Testansatz mitgeführt werden.
Das Ergebnis/OD der Kontrollen muss in dem angegebenen Wertebereich
(siehe QC-Zertifikat) liegen.
Nur bei quantitativer Bestimmung: Die berechnete Kalibrationskurve sollte
der auf dem QC-Zertifikat abgebildeten Kalibrationskurve ähnlich sein.
Ist dies nicht der Fall, ist der Test ungültig und muss wiederholt
werden.
8.2 Screening Test - Berechnung der Ergebnisse
7.2 TESTDURCHFÜHRUNG
Alle Reagenzien in der gleichen Reihenfolge pipettieren.
ERGEBNISSE UND QUALITÄTSKONTROLLE
8.1 Quantitativer/ Qualitativer Test
•
•
9
ERWARTETE WERTE
10.5
Die nachfolgenden Bereiche wurden anhand von Proben von 150 gesunden
Blutspendern und 224 SLE-Patienten, mit FARRZYME ermittelt.
INTERPRETATION
Negativ
≤ 30 IU/mL
> 30 IU/mL
Positiv
PRÄZISION
Die Intra- und Inter-Assay-Präzision wurden anhand von 6 Proben, deren Konzentrationen im Bereich der Kalibrationskurve lagen, ermittelt. Der Mittelwert und der
Variationskoeffizient VK% sind nachfolgend für jede Probe aufgelistet.
Die Intra-Assay Präzision wurde durch 20-fache Messung in einem Assay
bestimmt.
Bei allen 150 Blutspendern wurden Konzentrationen unterhalb von 17,0 IU/mL
gefunden, wobei 146 (97%) unterhalb von 12,3 IU/mL, der unteren Nachweisgrenze des Tests, lagen. 22,8% der SLE-Seren waren im FARRZYME-Test postiv
(>30 IU/mL).
In der nachfolgenden Tabelle ist eine Vergleichsstudie mit 224 SLE-Seren
zwischen FARRZYME und einem konventionellen anti-dsDNA ELISA, der sowohl
niedrig- als auch hoch-avide Antikörper erfasst, zusammengefasst. Proben, die in
dem konventionellen anti-dsDNA ELISA ein grenzwertiges Ergebnis aufwiesen,
wurden für die Berechnung der positiven und negativen Übereinstimmung und der
gesamten Übereinstimmung, als negativ bewertet.
FARRZYME
Positiv
Negativ
Die oben angegebenen Werte dienen nur der Orientierung. ELISAs sind sehr
sensitiv und in der Lage kleine Unterschiede in der ,Probenpopulation’
festzustellen. Daher wird empfohlen, dass jedes Labor auf der Basis der lokalen
Population und der verwendeten Geräte und Techniken seinen eigenen
Normalbereich ermittelt.
10
10.1
LEISTUNGSDATEN
MESSBEREICH
Der Messbereich dieses Kits ist 12,3 – 1000 IU/mL.
10.2
SENSITIVITÄT
Es wurde durch eine statistische Analyse (Student-t-Test) bestätigt, dass der
FARRZYME-Test zwischen zwei Proben mit Konzentrationen im untersten
Messbereich (120% bzw. 165% des niedrigsten Kalibrators) unterscheiden kann.
Hierzu wurde jede Probe mehrfach gemessen.
10.3
SPEZIFITÄT UND ÜBEREINSTIMMUNG
189 Proben von SLE-Patienen wurden zusammen mit 35 Proben, die entweder
auf Crithidien oder im ELISA dsDNA-positiv waren, und 28 Proben von gesunden
Blutspendern mit dem FARRZYME, in dem IFT auf Crithidia luciliae und in einem
konventionellen anti-dsDNA ELISA gemessen.
+
Positive Übereinstimmung %
Negative Übereinstimmung %
Gesamt-Übereinstimmung
FARRZYME
+
*Positive Übereinstimmung %
Negative Übereinstimmung %
Gesamt-Übereinstimmung
67,3%
92,9%
87,3%
Konventioneller dsDNA ELISA
+
Grenzwertig
47
3
1
33
51
117
58,8%
97,7%
85,3%
*Für die Berechnung der Übereinstimmung der beiden Tests, wurden die im
konventionellen ELISA im grenzwertigen Bereich liegenden Proben als negativ
eingestuft. Der konventionelle ELISA erfasst sowohl hoch- als auch niedrig-avide
Antikörper, was zu einer reduzierten positiven Übereinstimmung mit der
FARRZYME-Methode führt.
10.4
REFERENZEN
Isenberg D and Smeenk R Clinical laboratory assays for measuring antidsDNA antibodies. Where are we now? Lupus, 2002; 11: 797-800.
2. Ceppelini R, Polli E and Celada F A DNA-reacting factor in serum of a patient
with lupus erythematosus diffuses. Proc Soc Exp Biol Med, 1957; 96: 572574.
11. Smeenk R, van der Lelij G and Aarden L Measurement of low avidity antidsDNA by the Crithidia luciliae test and the PEG assay. Clin Exp Immunol,
1982; 49: 603-610.
PLATTENSCHEMA
14
183
Der FARRZYME ELISA zeigte eine gute Übereinstimmung bei den negativen
Proben mit dem Crithidia luciliae IFT. Die positive Übereinstimmung war etwas
erniedrigt, da in der IFT auch niedrig-avide anti-dsDNA-Antikörper, im Gegensatz
zum FARRZYME-Test, erfasst werden11.
FARRZYME
11
VK%
13,5
3,9
11,6
4,9
7,0
6,9
1.
12
Crithidia IFT
+
37
18
INTER-ASSAY-PRÄZISION
Konzentration (IU/mL)
24,6
42,3
61,3
123,2
272,4
474,1
n=6
Probe 1
Probe 2
Probe 3
Probe 4
Probe 5
Probe 6
Positive prozentuale Übereinstimmung = 58,8%
Negative prozentuale Übereinstimmung = 97,2%
Gesamte Übereinstimmung = 83,5%
Die Messergebnisse in Einheiten, die mit dem FARRZYME Assay erhalten
werden, müssen nicht mit den Werten anderer Assays, die in IU/mL angegeben
werden, übereinstimmen. Die Ursache hierfür ist, dass dieser Assay nur die
Subgruppe der hoch-aviden anti-dsDNA Antikörper misst.
VK%
5,4
4,8
2,2
3,3
4,3
5,1
Für die Bestimmung der Inter-Assay-Präzision wurde jede Probe in Doppelbestimmung in 6 verschiedenen Testansätzen über 3 Tage gemessen.
Konventioneller anti-dsDNA ELISA
Positiv
Grenzwertig
Negativ
47
3
1
33
51
89
Mit dem Farr-RIA und dem FARRZYME-ELISA wurden bei 100 SLE-Patienten
hoch-avide anti-dsDNA-Antikörper mit einer Häufigkeit von 36% bzw. 38%
berichtet8. Bei 100 Patienten mit verschiedenen Bindegewebserkrankungen und
anderen Autoimmunerkrankungen lag die Häufigkeit im Gegensatz hierzu bei 4%
bzw. 5% in diesen beiden Methoden.
INTRA-ASSAY-PRÄZISION
Konzentration (IU/mL)
25,1
39,0
74,5
205,5
361,2
528,6
n = 20
Probe 1
Probe 2
Probe 3
Probe 4
Probe 5
Probe 6
Siehe Ende der Arbeitsanleitung.
Kurzarbeitsanleitung
1.
100µL von jedem Kalibrator und jeder Kontrolle und 1:100
verdünnten Proben in das entsprechende Well pipettieren.
30 Minuten inkubieren. Waschen.
2.
100µL Konjugat in jedes Well geben.
30 Minuten inkubieren. Waschen.
3.
100µL Substrat in jedes Well geben.
30 Minuten im Dunkeln inkubieren.
4.
100µL Stopp-Lösung in jedes Well pipettieren.
Absorption bei 450nm messen.
FARRZYME™ und BINDAZYME™
sind eingetragene Warenzeichen von
The Binding Site Ltd., UK.
P.O. Box 11712, Birmingham
B14 4ZB. England
INTERFERIERIENDE SUBSTANZEN
Verschiedene Serumtypen wurden getestet um mögliche Effekte von
interferierenden Substanzen zu ermitteln. Hierzu wurde ein Interference Check A
plus™ Kit (Kokusai, Japan) verwendet.
Substanz
Bilirubin F (Frei)
Bilirubin C (Konjugiert)
Hämolysiertes Hämoglobin
Chylus
Rheumafaktor
Konzentration
20,3mg/dL
20,2mg/dL
486mg/dL
1460 Units
45 IU/mL
Kein störender Einfluss wurde bei freiem oder konjugierten Bilirubin, Hämoglobin,
Lipiden oder Rheumafaktoren gefunden.
In einer separaten Studie wurden 6 IgG-Myelomseren mit dem FARRZYME-Test
gemessen und bei keiner dieser Proben wurde ein positives Ergebnis erhalten.
INHIBITEURS
Kathon
Azide de sodium
ProClin™ 300
Bromonitrodioxane
Methylisothiazone
INSTRUCTIONS D’UTILISATION
Coffret FARRZYME™ pour le dosage
des anticorps haute avidité
anti-ADN double brin en ELISA
MK072
Pour un usage en diagnostic in vitro uniquement
CONCENTRATION
0,02%
0,099%
0,045%
0,002%
0,002%
ProClin est une marque déposée par la Rohm and Haas Corp. Philadelphie, PA.
•
Le kathon est un irritant et peut induire une sensibilisation en cas de contact
avec la peau.
La solution d'arrêt contient de l'acide phosphorique 3M qui est un irritant.
Eviter le contact avec la peau et les yeux.
Les éclaboussures de réactifs doivent être nettoyées en respectant la
réglementation locale et l’environnement.
•
•
4.2 PRECAUTIONS
Produit fabriqué en Angleterre par la société :
Distribués en France par la société :
The Binding Site, 14 rue des Glairaux, BP226, 38522 Saint-Egrève Cedex.
Téléphone : 04.38.02.19.19
Fax : 04.38.02.19.20
e-mail : [email protected]
•
•
Ce réactif doit être utilisé par un personnel formé.
Il est recommandé de suivre scrupuleusement le protocole. Toute déviation
peut affecter les performances et les résultats obtenus. Lire attentivement les
« Notes » et les « Avertissements ».
Les réactifs des coffrets ayant des numéros de lots differents ne sont pas
interchangeables. Si de grandes séries de tests doivent être réalisées,
vérifier que tous les réactifs aient le même numéro de lot. Toutes les
barrettes utilisées doivent être issues du même sachet aluminium. La
substitution de certains réactifs peut induire des résultats incorrects.
Afin d’éviter la contamination des réactifs, utiliser uniquement de nouveaux
récipients ou des récipients propres en verre ou en plastique. Ne jamais
remettre les réactifs non utilisés dans leur flacon d’origine.
Eviter de laisser les réactifs sans bouchon ; l’évaporation ou la contamination
des réactifs peut induire des résultats incorrects.
Le substrat TMB ne doit pas être exposé à la lumière ou mis en contact avec
de l’eau.
Les échantillons hémolysés, lipidiques, contaminés par des bactéries ou
contenant des particules de matières ne doivent pas être utilisés.
L’utilisation de pipettes calibrées et de contrôles de qualité internes est
recommandée.
L’utilisation d’automates, de diluteurs et d’autres équipements automatiques
peut induire des différences de résultats par rapport à la technique manuelle.
Il est de la responsabilité de chaque laboratoire de valider complètement le
système et de s’assurer que les résultats soient conformes à la fiche
technique et au certificat de contrôle de qualité.
Tous les équipements doivent être calibrés et doivent respecter les
instructions du fabricant.
•
•
•
•
1
INDICATIONS
Ce coffret permet de quantifier in vitro les autoanticorps IgG spécifiques de haute
affinité dirigés contre l’acide désoxyribonucléique double brin (ADN db) dans le
sérum humain. Il apporte une aide au diagnostic du lupus érythémateux
disséminé (LED) en conjonction avec des résultats d’autres tests sérologiques et
les aspects cliniques.
Le matériel fourni est suffisant pour tester au maximum 40 échantillons en double
ou 88 échantillons en simple avec une courbe de calibration, un contrôle positif,
un contrôle négatif et un contrôle ADN simple brin.
Ce coffret peut-être utilisé comme test quantitatif ou de dépistage en utilisant un
contrôle seuil cut-off.
2
PRESENTATION GENERALE
L’utilisation des autoanticorps anti-ADN double brin en tant que marqueur
diagnostic du LED et de suivi de l’activité de la maladie est un grand bénéfice
pour les cliniciens1 depuis qu’ils ont été découverts par Ceppelini et al en 19572 et
confirmés par leur inclusion en 1982 par l’institut américain de rhumatologie
comme critères de classification du LED3.
Il existe trois méthodologies couramment utilisées actuellement qui peuvent être
différenciées par l’avidité des anticorps ADNdb détectés4: La technique ELISA qui
comporte plusieurs variantes détecte un large éventail d’avidité d’anticorps.
L’immunofluorescence (IFA) sur lame de Crithidia luciliae détecte les anticorps de
faible avidité et le test de Farr RIA5 mesure seulement les anticorps de haute
avidité par précipitation avec du sulphate d’ammonium excluant ainsi les anticorps
de faible avidité.
Le test FARRZYME comprend un ensemble de conditions d’analyses plus
strictes8, qui sont destinées à enlever les anticorps faiblement liés et de faible
avidité.
Quelques éudes6,7 ont montré un lien entre l’avidité des anticorps et la
progression de la maladie, où la sélection de l’analyse facilite la différenciation
entre les patients avec une forme bénigne de LED et ceux avec complications
rénales ou de peau, particulièrement dans le cas des néphrites lupiques8,9.
En générale, il existe une bonne corrélation entre toutes les techniques pour des
sérums provenant de malades ayant un lupus érythémateux disséminé (LED)
défini. Par contre pour des sérums provenant de patients dont la maladie est non
active ou de patients non classifiables, il existe une discordance significative.
3
PRINCIPE
Les micropuits sont recouverts de l’antigène ADN db de thymus de veau. Les
calibrateurs, les contrôles et les échantillons dilués sont déposés dans les puits
permettant ainsi la liaison spécifique de l’anticorps à l’ADN db fixé. Après avoir
rincé les puits pour éliminer toute trace de protéines non accrochées, un anticorps
de lapin anti IgG humaines (spécifique de la chaîne γ) purifié et conjugué à la
péroxydase est déposé. Au cours de l’incubation, le conjugué enzymatique se lie
aux IgG ayant reconnu l’ADN db. L’excès de conjugué marqué non accroché est
éliminé par des lavages. Le conjugué accroché est visualisé en utilisant du
3,3',5,5' tétraméthyl benzidine (TMB) qui donne un produit de réaction bleu,
l’intensité est proportionnelle à la concentration d’autoanticorps dans l’échantillon.
L’acide phosphorique est ajouté à chaque puits pour arrêter la réaction. Le produit
final induit est coloré en jaune et la densité optique est lue à 450nm.
4
•
•
•
•
•
4.3 STOCKAGE ET STABILITE
•
Tous les sérums des donneurs humains ont subi un dépistage négatif pour
les anticorps anti-VIH 1 et 2, les anticorps anti-VHC et l’Ag Hbs. Toutefois,
ces tests ne peuvent garantir l’absence totale d’agents infectieux. Tous les
échantillons doivent donc être manipulés comme des produits
potentiellement infectieux. Seul un personnel qualifié dans la manipulation
d’échantillons potentiellement infectieux est autorisé à utiliser ce coffret.
L’azide de sodium peut réagir avec les tuyauteries en plomb ou cuivre pour
former des azides de métaux explosifs. Il est nécessaire d’ajouter de grands
volumes d’eau pour éviter la formation d’azides.
Les tampons et sérums fournis dans ce coffret contiennent plusieurs
inhibiteurs d’enzymes listés ci-dessous. Les manipuler avec précaution.
Le coffret doit être stocké à 2-8°C et ne doit pas être congelé. Un stockage à
des températures non appropriées peut entraîner de faux résultats.
Le tampon de lavage dilué peut être stocké à température ambiante (2024°C) pendant 4 semaines.
La date de péremption figure sur l’étiquette du coffret.
•
•
5
•
•
•
•
6
ECHANTILLONS
Les échantillons doivent être prélevés par ponction veineuse et le sérum doit
être séparé après coagulation.
Les sérums peuvent être conservés à 2-8°C pendant 7 jours avant les tests10
ou aliquotés et congelés à -20°C minimum pour une conservation plus
longue.
Eviter les congélations et décongélations répétées.
Les sérums ne doivent pas être inactivés par la chaleur, ceci peut induire de
faux positifs.
MATERIEL
6.1 MATERIEL FOURNI
•
•
•
•
•
•
•
•
PRECAUTIONS
4.1 AVERTISSEMENT
•
•
•
•
•
•
•
Une fiche technique : donnant tous les détails de la technique.
Un certificat de contrôle qualité : indiquant les performances du lot.
dsDNA Coated Wells (Puits) : 12 barrettes de 8 puits sécables coatés avec
l’ADN db de thymus de veau. Chaque plaque est emballée dans un étui
contenant deux dessicateurs.
Type III Sample Diluent (diluant de l’échantillon de type III) : 2 flacons de
50mL de tampon prêt à l’emploi et coloré en jaune. Nécessaire à la dilution
des échantillons.
dsDNA Wash Buffer (10x Concentrate) (tampon de lavage ADN db,
concentré 10 fois) : 2 flacons de 50mL de tampon concentré 10 fois pour le
lavage des puits.
dsDNA Calibrator(s) (calibrateurs ADN db) : 5 flacons de 1,2mL de sérum
humain dilué dont les concentrations en autoanticorps anti-ADN db sont les
suivantes : 1000 ; 333 ; 111 ; 37 ; 12,3 UI/mL; chacun étant prêt à l’emploi.
dsDNA Cut-off Control (contrôle seuil): 1 flacon contenant 1,2mL de sérum
humain dilué. La valeur attendue est donné sur le certificat de contrôle
qualité. Prêt à l’emploi.
dsDNA Positive Control (contrôle positif ADN db) : 1 flacon de 1,2mL de
sérum humain dilué. La valeur est indiquée sur le certificat de contrôle
qualité. Il est fourni prêt à l’emploi.
dsDNA Negative Control (contrôle négatif ADN db) : 1 flacon de 1,2mL de
dsDNA Single Stranded Control (contrôle ADN sb) : 1 flacon de 1,2mL de
dsDNA Conjugate (conjugué) : 1 flacon de 12mL d’antisérum anti-IgG
humaines purifié et conjugué à la péroxydase. Il est prêt à l’emploi et coloré
en rouge.
TMB Substrate (substrat (TMB) : 1 flacon de 14mL de TMB prêt à l’emploi.
Stop Solution (solution d’arrêt) : 1 flacon de 14mL d’acide phosphorique 3M
prêt à l’emploi.
6.2 MATERIEL NECESSAIRE ET NON FOURNI
•
Laveur automatique de plaque : recommandé, cependant les lavages
manuels sont également possibles.
•
•
•
•
•
7
Lecteur de microplaques : capable de mesurer la densité optique à 450nm.
Eau distillée ou eau désionisée : elle doit être de très bonne qualité.
Micropipettes calibrées : pour la distribution de volumes de 1000, 100 et
10µL.
Pipette multicanaux : recommandée pour la distribution de volumes de
100µL de conjugué, de substrat et de solution d’arrêt.
Tubes en verre ou en plastique : pour la dilution des échantillons.
PROCEDURE
7.1 ETAPES PREALABLES
1.
•
•
Ramener le coffret à température ambiante
Ces coffrets sont opérationnels à une température comprise entre 20 et
24°C.
Avant utilisation, laisser le coffret à température ambiante pendant environ
60 minutes. Ne pas retirer les barrettes de leur sachet aluminium durant
cette période. Attendre que les barrettes soient à température ambiante.
Note : Les coffrets peuvent être gardés à température ambiante pendant une
semaine.
2.
Composants du coffret
Mélanger chaque composant du coffret avant utilisation.
3.
Dilution du tampon lavage (concentré 10 fois)
Ajouter 100mL de tampon de lavage concentré à 900mL d’eau distillée
(dilution au 1/10) dans un recipient propre et mélanger. De plus petits
volumes peuvent être dilués.
Note : Le tampon de lavage dilué peut être stocké à température ambiante
pendant 4 semaines. Il est recommandé de ne diluer que le volume
nécessaire.
4.
Dilution des échantillons
Diluer 10µL de chaque échantillon avec 1000µL de diluant (dilution 1:100) et
mélanger.
Note : Les échantillons dilués doivent être utilisés dans les 8 heures suivant
la dilution.
5.
Manipulation des barrettes
Sortir le nombre nécessaire de puits et les enfiler sur le cadre. A partir de la
position A1, remplir les colonnes de gauche à droite. Lors de la manipulation
du cadre, le maintenir dans le sens de la longueur afin d’empêcher les
barrettes de sortir de leur logement.
Note : les puits non utilisés doivent être immédiatement replacés dans leurs
étuis contenant un dessicateur. Fermer hermétiquement les étuis afin de
minimiser l’exposition à l’humidité.
Faire attention de ne pas percer l’étui.
AVERTISSEMENT : L’exposition des puits à l’humidité ou à la
contamination avec de la poussière ou des particules de matière induit
une dégradation de l’antigène, induisant une faible précision des
résultats et potentiellement des résultats faux positifs.
7.2 PROCEDURE
8
2.
2.
Dépôt de l’échantillon
Déposer 100µL de chaque calibrateur (test quantitatif) ou de contrôle seuil
(test qualitatif), contrôle et échantillon dilué (1:100) dans les puits appropriés
suivant le plan de plaque.
Note : Les échantillons doivent être déposés sur la plaque aussi rapidement
que possible afin de minimiser les écarts, le décompte du temps doit
commencer aprés l’addition du dernier échantillon.
Incuber pendant 30 minutes à température ambiante.
Lavage de la plaque
La procédure de lavage est très importante et requiert une attention spéciale.
Une plaque mal lavée donnera des résultats incorrects avec une précision
faible et un bruit de fond important. Après incubation, laver trois fois les puits
avec 250 à 350µL de tampon de lavage en utilisant un laveur automatique ou
manuellement comme indiqué ci-dessous. Après le lavage final, renverser la
plaque et sécher les puits en tapant la plaque sur du papier absorbant.
Ne pas programmer d’étape de trempage pour les laveurs de plaques.
Pour un lavage manuel :
a.
Jeter le contenu des plaques dans un évier.
b.
Tapoter les puits sur un papier absorbant.
c.
Remplir chaque puits avec 250 à 350µL de tampon de
lavage à l’aide d’une pipette multicanaux.
d.
Agiter délicatement la plaque sur une surface plate.
e.
Répéter 2 fois cette procédure.
f.
Terminer en tapotant la plaque sur du papier absorbant.
Ne pas laisser la solution de lavage dans les puits plus
longtemps que le temps nécessaire au remplissage total de la
plaque.
3.
Addition du conjugué
Déposer 100µL de conjugué par puits.
Note : Afin d’éviter les contaminations, ne jamais remettre l’excès de
conjugué dans le flacon d’origine.
Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
4.
Lavage de la plaque (cf. 2)
5.
Addition du substrat TMB
Déposer 100µL de TMB dans chaque puits. Cette étape doit être effectuée
rapidement.
Note : Afin d’éviter les contaminations, ne jamais remettre l’excès de TMB
dans le flacon d’origine.
Incuber 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
6.
Arrêt de la réaction
Ajouter 100µL de solution d ‘arrêt dans chaque puits. Ceci induit un
changement de couleur du bleu au jaune.
7.
Mesure de la densité optique
La densité optique (DO) de chaque puits doit être lue à 450nm à l’aide d’un
lecteur de plaques dans les 30 minutes suivant l’arrêt de la réaction.
Calcul des moyennes de DO (Pour les tests ayant été faits en double.)
Pour chaque calibrateur, contrôle et échantillon, calculer la DO moyenne. Le
pourcentage du coefficient de variation (% CV) pour chaque duplicat doit être
inférieur à 15%.
8.2 TEST DE DEPISTAGE – CALCUL DES RESULTATS
1.
Evaluation de la qualité des densité optiques
•
La DO du contrôle positif doit être supérieure à 0.5 et supérieure à la DO du
contrôle seuil (cut-off).
•
La DO du contrôle négatif doit être inférieure à la DO du contrôle seuil.
•
La DO du contrôle seuil doit supérieure à la DO du contrôle négatif mais
inférieure à 0.5.
•
La DO du contrôle simple brin doit être inférieure à la DO du contrôle seuil.
2.
Interpretation des résultats
En utilisant le contrôle seuil, interpréter les résultats en accord avec le
tableau ci-dessous.
RESULTATS
INTERPRETATION
ACTION
DO égale ou supérieure à Suspicion d’anticorps antiTester par méthode
la DO du cut-off
ADN double brin.
quantitative.
DO inférieure à la DO du
Négatif
Rendre négatif
cut-off
8.3 ANALYSE QUANTITATIVE - CALCUL DES RÉSULTATS
1.
•
•
Etablissement de la courbe de calibration
La courbe de calibration peut être tracée automatique ou manuellement en
plaçant les concentrations en anticorps anti-ADN db (échelle logarithmique)
sur l’axe des X et la densité optique de chaque calibrateur sur l’axe des Y
(échelle linéaire).
Automatique : choisir un tracé de courbe pour lequel les résultats sont les
meilleurs.
Manuel : utiliser du papier log/linéaire, tracer une courbe qui joints les points
(pas une droite, ni une courbe point à point).
2.
Traitement des points anormaux
Si seul un point n’est pas sur la courbe, il peut être supprimé. Si en l’absence
de ce point, la courbe a une forme différente de celle du certificat de contrôle
de qualité ou si plusieurs points ne sont pas sur la courbe, le test doit être
répété.
3.
Calcul des concentrations d’autoanticorps dans les contrôles et les
échantillons dilués
Lire la concentration en autoanticorps anti-ADN db des contrôles et des
échantillons dilués à partir de la courbe de calibration. Les valeurs des
contrôles doivent être comprises dans les limites indiquées sur le certificat de
contrôle qualité.
Note : Les valeurs des calibrateurs ont été ajustées d’un facteur 100 pour
tenir compte de la dilution des échantillons (1:100). Aucune autre correction
n’est nécessaire.
4.
Calibration du test
Le test est calibré en UI/mL par rapport au calibrateur de référence OMS
Wo806.
5.
•
Limites
Ce test, par sa faculté de détecter uniquement les anticorps anti-ADNdb de
hautes avidités, peut omettre quelques formes de LED chez les patients
présentant uniquement des anticorps de faibles avidités. Il peut ne pas être
convenable si le taux global des anticorps anti-ADNdb doit être mesuré.
Ce coffret est utilisé pour aider au diagnostic seulement. Un résultat positif
suggère certaines maladies qui doivent être confirmées par les données
cliniques et par d’autres tests sérologiques.
Les résultats obtenus ne sont pas une preuve diagnostique de la présence
ou de l’absence de maladies.
Suivre la même séquence de dépôt durant tout le test.
1.
RESULTATS ET CONTROLE DE QUALITE
8.1 QUANTITATIVE/QUALITATIVE ASSAYS
1. Contrôle de qualité
Pour valider le test, tous les critères suivants doivent être respectés:
•
Les calibrateurs/contrôles seuil (si besoin) le contrôle positif ADN db, le
contrôle négatif et le contrôle ADN sb doivent être inclus dans chaque test.
•
Les valeurs obtenues pour tous les contrôles doivent être dans les gammes
spécifiées sur la fiche de contrôle qualité.
•
Test quantitatif uniquement: La forme de la courbe doit être similaire à celle
fournie sur le certificat de contrôle qualité.
Si les critères ci-dessus ne sont pas respectés, le test est invalide et
doit être répété.
•
•
9
VALEURS NORMALES
Les gammes suivantes ont été établies sur la base des résultats obtenus à partir
d’échantillons de donneurs de sang sains (n=150) et de patients présentant un
LED (n=224) avec FARRZYME.
INTERPRETATION
Résultat négatif
≤ 30 UI/mL
> 30 UI/mL
Résultat positif
Les 150 sérums de donneurs de sang sains ont donné des résultats inférieurs à
17,0 UI/mL avec pour 146 (97%) des résultats inférieurs à 12,3 UI/mL, ce qui est
la limite basse de détection du coffret. 22,8% des sérums de patients présentant
un LED ont donné des résultats positifs sur FARRZYME (> 30 UI/mL).
Les résultats ci-dessous montrent une étude comparative entre 224 échantillons
LED analysés par FARRZYME et un test ELISA anti-ADNdb classique qui mesure
les anticorps anti-ADNdb de haute et de basse avidité. Les échantillons donnant
des résultats douteux avec le test ELISA conventionnel ont été traités comme
négatifs lors du calcul des pourcentages de négatifs et postifs et pour la
corrélation d’ensemble.
ELISA anti-ADNdb conventionnel
Positifs
Douteux
Négatifs
Positifs
47
3
1
FARRZYME
Négatifs
33
51
89
Pourcentage de corrélation des positifs : 58,8%
Pourcentage de corrélation des négatifs : 97,2%
Corrélation d’ensemble : 83,5%
Les fréquences de détection des anticorps anti-ADNdb de haute avidité par
FARRZYME et Farr RIA chez 100 patients LED ont été trouvées comme étant de
36% et 38% respectivement8. Par contre, chez 100 patients ayant des maladies
des tissus connectifs et d’autres maladies autoimmunes, les fréquences étaient de
4% et 5% respectivement.
Les valeurs des unités obtenues avec le test FARRZYME peuvent ne pas corréler
avec celles obtenues avec d'autres tests en UI/mL car ce test ne mesure que les
anticorps anti-ADNdb de haute avidité.
Les gammes sont fournies à titre indicatif uniquement. Les tests ELISA sont très
sensibles et capables de détecter de faibles différences dans la population. Il est
recommandé que chaque laboratoire détermine ses propres normes basées sur
les techniques et l’équipement employés.
10
10.1
PERFORMANCES
GAMME DE MESURE
La gamme de mesure du test va de 12,3 à 1000 UI/mL.
10.2
SENSIBILITE DU TEST
La confirmation que FARRZYME peut distinguer 2 échantillons avec des valeurs
proches du point inférieur de la gamme de mesure (120 et 165% de la valeur du
calibrateur inférieur) a été obtenue par analyse statistique (test t de Student) des
résultats du test de chaque échantillon en multiples réplicats.
10.3
SPECIFICITE, CORRELATION
189 échantillons de patients LED, avec 35 échantillons positifs en ADNdb par
Crithidia ou ELISA et 28 de donneurs sains ont été testés par FARRZYME, par
IFA sur Crithidia luciliae et aussi par un coffret ELISA anti-ADNdb classique.
+
FARRZYME
Pourcentage de corrélation des positifs
Pourcentage de corrélation des négatifs
Corrélation d’ensemble
IFA sur Crithidia
+
37
14
18
183
67,3%
92,9%
87,3%
+
*Pourcentage de corrélation des positifs
Pourcentage de corrélation des négatifs
Corrélation d’ensemble
PLAN DE PLAQUE
Résumé de la procédure
ELISA anti-ADNdb conventionnel
+
Douteux
47
3
1
33
51
117
58,8%
97,7%
85,3%
SUBSTANCES INTERFERENTES
Différents types de sérums ont été utilisés pour tester l’effet possible de
substances interférentes en utilisant le coffret Interference Check A plus™
(Kokusai, Japon).
Substances
Bilirubine F (libre)
Bilirubine C (conjugué)
Hémoglobine hémolysée
Chyle
Facteur rhumatoïde
BIBLIOGRAPHIE
2. Ceppelini R, Polli E and Celada F. A DNA-reacting factor in serum of a
572-574.
with lupus nephritis. Arthritis Rheumatism, 2006 (in press).
1982; 49: 603-610.
Veuillez regarder au dos de la fiche technique.
* Pour le calcul de la corrélation entre les deux tests, les échantillons douteux ont
été comptés comme négatifs sur l’ELISA conventionnel pour ADNdb. L’ELISA
conventionnel détecte les anticorps de haute et faible avidité, ce qui se traduit par
un faible pourcentage de corrélation des positifs.
10.4
11
C.V. en %
13,5
3,9
11,6
4,9
7,0
6,9
1.
12
L’ELISA FARRZYME a montré une bonne corrélation des négatifs avec le test sur
Crithidia luciliae. Le pourcentage de corrélation des positifs est plus faible car ce
dernier test est connu pour détecter les anticorps anti-ADNdb de faible avidité11 à
la différence de FARRZYME.
FARRZYME
PRECISION INTER-ESSAI
Concentration (UI/mL)
24,6
42,3
61,3
123,2
272,4
474,1
n=6
Echantillon 1
Echantillon 2
Echantillon 3
Echantillon 4
Echantillon 5
Echantillon 6
1.
Ajouter 100µL de chaque calibrateur, contrôle et échantillon
dilué au 1:100 aux puits appropriés.
Incuber 30 minutes. Laver.
2
Ajouter 100µL de conjugué à chaque puits.
Incuber 30 minutes. Laver.
3.
Ajouter 100µL de substrat à chaque puits.
Incuber 30 minutes.
4.
Ajouter 100µL de solution d’arrêt à chaque puits.
Lire l’absorbance à 450nm.
BINDAZYME™ et Farrzyme™ sont des marques par
The Binding Site Ltd, UK.
PO Box 11712
Birmingham B14 4ZB
UK
Concentration
20,3mg/dL
20,2mg/dL
486mg/dL
1460 unités
45 UI/mL
Aucune interférence n’a été observée avec la bilirubine libre ou conjuguée,
l’hémoglobine, les lipides ou le facteur rhumatoïde.
Dans une étude à part, 6 échantillons de myélome IgG ont été testés avec
FARRZYME et aucun n’a donné de résultat positif.
10.5
PRECISION
Les précisions intra- et inter-essai ont été mesurées en utilisant six échantillons
dans la gamme de la courbe de calibration. La moyenne et le CV en % pour
chaque échantillon sont donnés ci-dessous :
La précision intra-essai a été mesurée en utilisant 20 replicats en un essai.
n=20
Echantillon 1
Echantillon 2
Echantillon 3
Echantillon 4
Echantillon 5
Echantillon 6
PRECISION INTRA-ESSAI
Concentration (UI/mL)
25,1
39,0
74,5
205,5
361,2
528,6
C.V. en %
5,4
4,8
2,2
3,3
4,3
5,1
La précision inter-essai a été mesurée en testant les échantillons en duplicat lors
de 6 tests pendant 3 jours.
INSTRUCCIONES DE USO
FARRZYME™ Kit inmunoensayo para
anticuerpos humanos anti ADN doble cadena
de elevada avidez
Este kit es para uso en diagnóstico in vitro
Spanish
Producto fabricado por:
The Binding Site sucursal en España,
C/ Balmes 243 4º 3ª, 08006 Barcelona
Teléfono 902027750
Fax: 902027752
web: www.bindingsite.es
•
PRINCIPIO
Este ensayo está pensado para la determinación in vitro de autoanticuerpos de
alta avidez específicos contra el ADN de doble cadena (dsDNA) presentes en el
suero humano, como una ayuda al diagnóstico del Lupus eritematoso sistémico
(LES), junto con los resultados de otras pruebas clínicas.
Se suministra material suficiente para analizar 40 muestras en duplicado (o bien
88 muestras sin duplicado), con una curva de calibración, control positivo y
negativo y de cadena simple de ADN.
Este kit se puede ejecutar como ensayo totalmente cuantitativo, o como
screening, usando el control cut-off.
RESUMEN Y EXPLICACIÓN
El uso de anticuerpos anti-dsDNA como marcadores diagnósticos del LES y la
consecuente monitorización de la actividad de la enfermedad ha sido de gran
beneficio para los profesionales de laboratorio clínico1 desde que se reconoció
por primera vez en Ceppelini et al en 19572 y fue confirmado en 1982 en los
criterios revisados del American College of Rheumatology para la clasificación del
LES3.
Hoy en día hay tres métodos de análisis de uso común que se diferencian según
la avidez de los anticuerpos dsDNA detectada4: El análisis inmunoabsorbente
ligado a enzimas (ELISA), del que hay muchas variantes, detecta generalmente
un amplio espectro de avidez de anticuerpos. El análisis por inmunofluorescencia
Crithidia luciliae (IFA) detecta los anticuerpos unidos a aquellos de más baja
avidez y los radioinmunoensayos Farr (RIA)5 determinan generalmente sólo
aquellos anticuerpos de alta avidez mediante el paso de precipitación de sulfato
de amonio que impide la baja avidez de anticuerpos.
El análisis FARRZYME incorpora un conjunto de condiciones analíticas más
estrictas8, que tienen como objetivo eliminar los anticuerpos débilmente unidos.
Algunos estudios6,7 han demostrado que la avidez de anticuerpos está
relacionada con la progresión de la enfermedad. La selección de un análisis u
otro facilita la diferenciación entre pacientes con una forma benigna de LES y
pacientes con problemas renales y dermatológicos, especialmente en casos de
lupus de riñón8,9.
Por lo general hay concordancia entre todos los análisis que usan suero de
pacientes con lupus eritematosos sistémicos (LES) ‘definidos’, sin embargo hay
una discrepancia significativa entre pacientes con la enfermedad inactiva, o que
no cumplen los parámetros estándard de clasificación para LES.
3
PRINCIPIO DEL ENSAYO
Los pocillos de la placa están tapizados con antígeno (ADN de doble cadena de
timo de ternera). Los calibradores, controles y muestras del paciente diluidas se
añaden a los pocillos, los autoanticuerpos presentes que reconozcan el antígeno
(ADN de doble cadena) se unirán durante la primera incubación. Después de
lavar los pocillos para eliminar las proteínas no unidas, se añade un anticuerpo de
conejo contra IgGs humanas (específico de cadena γ) marcado con peroxidasa
purificada. El conjugado se unirá a los anticuerpos capturados en la placa y el
conjugado que está en exceso y no se ha unido se eliminará con los siguientes
pasos de lavado. El conjugado unido se visualizará con sustrato 3,3’,5,5’
tetrametilbenzidina (TMB) que da lugar a un producto de reacción de color azul, la
intensidad de éste es proporcional a la concentración de autoanticuerpos en la
muestra. Se añade ácido fosfórico a cada pocillo para parar la reacción. La
adición del ácido da lugar a un color amarillo final que se leerá a 450nm.
4
•
•
•
PRECAUCIONES
•
•
•
•
•
•
•
•
Todos los sueros humanos suministrados se han testado a nivel de donante y
se han encontrado negativos para antígenos de superficie de Hepatitis B y
para anticuerpos contra HIV 1 y 2 y virus Hepatitis C. Por otra parte, estos
tests no pueden garantizar la ausencia de agentes infecciosos. Se debe
utilizar métodos correctos de manipulación y de eliminación de residuos. Este
kit solo debe utilizado por personal cualificado en la manipulación de material
potencialmente infeccioso.
La azida sódica puede reaccionar con el plomo y el cobre produciendo azidas
metálicas explosivas. Para la eliminación de residuos con azida, lavar con
agua abundante.
Los tampones y los sueros suministrados con el kit contienen varios
inhibidores enzimáticos que están detallados a continuación. Se deben
manipular cuidadosamente.
Kathon es un irritante y puede causar sensibilización por contacto con la piel.
La solución de parada contiene ácido fosfórico 3M y es un irritante. Evitad el
contacto con la piel y los ojos.
Si se derrama algún reactivo se debe limpiar de forma apropiada y eliminar los
residuos siguiendo la normativa local y la legislación medioambiental vigente.
Este producto sólo debe ser utilizado por personal adecuadamente preparado.
Se recomienda seguir estrictamente el protocolo. Cualquier variación sobre el
protocolo puede afectar a los resultados. Prestad especial atención a las
Notas específicas y a todas las advertencias presentes en estas Instrucciones
de Uso.
No se pueden intercambiar reactivos de distintos lotes y/o kits. Si se deben
realizar muchos tests, prestad atención a que todos los reactivos sean del
mismo lote. Todas las tiras de pocillos deben provenir de una misma bolsa. La
substitución de alguno de los componentes del kit puede dar lugar a
resultados incorrectos.
Para evitar que se contaminen los reactivos se debe usar siempre material
plástico o de cristal nuevo o limpio. No se debe retornar el reactivo no utilizado
a la botella original.
Nunca se deben dejar las botellas destapadas, cualquier evaporación o
contaminación puede dar lugar a resultados incorrectos.
El sustrato TMB no puede estar expuesto a la luz ni al agua.
Los sueros que muestren contaminación bacteriana, que sean lipémicos o
hemolizados o bien que contengan partículas deberán ser descartados.
Se recomienda usar pipetas calibradas y controles de calidad internos.
El uso de sistemas automáticos de ensayo, dilutores de muestras y otros
equipos automáticos puede dar lugar a diferencias cuando se comparan
resultados con el método manual. Es responsabilidad del laboratorio validar
completamente el sistema utilizado y asegurarse de que los resultados estén
dentro de los límites que se han definido en este protocolo y en el certificado
de Control de Calidad lo acompaña.
Todo el equipamiento se debe calibrar y mantener siguiendo las instrucciones
del fabricante.
4.3 ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
•
•
•
5
•
•
•
•
6
El kit se debe almacenar entre 2-8°C y no debe ser congelado. Una
temperatura de almacenamiento inapropiada puede afectar los resultados
obtenidos con el kit.
El tampón de lavados diluido se debe almacenar a temperatura ambiente
(20-24°C) como máximo 4 semanas.
La fecha de caducidad del kit está detallada en la etiqueta.
RECOLECCIÓN Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS
Las muestras de sangre se deben recoger por punción venosa, permitir que
coagule de forma natural y separar el suero.
El suero puede conservarse a 2-8°C durante un máximo de 7 días10, o para
periodos más largos, distribuir el suero en alícuotas y conservarlo a -20°C, o
temperatura inferior.
Se debe evitar realizar congelaciones y descongelaciones de forma repetida.
Las muestras de suero no deben ser inactivadas por calor, esto podría
producir falsos positivos.
MATERIALES
6.1 MATERIAL SUMINISTRADO
•
•
•
•
•
•
•
•
4.1 ATENCION
•
0,02%
0,099%
0,045%
0,002%
0,002%
4.2 CUIDADO
•
2
CONCENTRACIÓN
Kathon
Sodium Azide
ProClin™ 300
Bromonitrodioxane
Methylisothiazone
ProClin™ es una marca registrada de Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA
•
•
MK072
1
INHIBIDOR
•
•
•
•
•
Hoja de instrucciones: con todos los detalles del ensayo.
Certificado de control de calidad: Indicando el funcionamiento esperado
del lote.
dsDNA Coated Wells (Pocillos tapizados con ADN de cadena doble): 12
tiras de 8 pocillos removibles, tapizados con el antígeno (ADN de doble
cadena de timo de ternera). Cada placa está envasada en una bolsa auto
cierre con dos desecantes.
Type III Sample Diluent (Diluyente de muestra de tipo III): 2 botellas con
50mL de tampón para dilución de muestra. Color amarillo, listo para usar.
dsDNA Wash Buffer (10x Concentrate) (Tampón de lavado de ADN de
doble cadena (10x concentrado)): 2 botellas con 50mL de tampón
concentrado 10 veces para el lavado de los pocillos.
dsDNA Calibrators (Calibradores ADN doble cadena): 5 viales con 1,2mL
de suero humano diluido, con las siguientes concentraciones de anticuerpos
anti ADN doble cadena: 1000, 333, 111, 37, 12,3 IU/mL. Listo para usar.
dsDNA Cut-off Control: (Control cut-off ADN doble cadena): 1 vial con
1,2mL de suero humano diluido. El valor esperado está detallado en el
certificado de control de calidad. Listo para usar.
dsDNA Positive Control (Control positivo ADN doble cadena): 1 vial con
Certificado de Control de Calidad. Listo para usar.
dsDNA Negative Control (Control negativo ADN doble cadena): 1 vial con
Certificado de Control de Calidad. Listo para usar.
dsDNA Single Stranded Control (Control cadena simple ADN doble
cadena): 1 vial con 1,2mL de suero humano diluido. El valor esperado está
detallado en el Certificado de Control de Calidad. Listo para usar.
dsDNA Conjugate (Conjugado ADN doble cadena): 1 botella con 12mL de
anticuerpo purificado contra IgG humana marcado con peroxidasa. Color
rojo, listo para usar.
TMB Substrate (Sustrato TMB): 1 botella con 14mL sustrato TMB. Listo para
usar.
Stop Solution (Solución parada): 1 botella con 14mL de ácido fosfórico 3M.
Listo para usar.
6.2 MATERIAL Y EQUIPAMINETO ADICIONAL – no suministrado
•
•
•
•
•
•
7
Lavador de microplacas automático: es un equipamiento recomendadao,
pero los lavados se pueden realizar a mano.
Lector de placas: para medir densidades ópticas a 450nm en aire.
Agua destilada o desionizada: de la mejor calidad posible.
Micropipetas calibradas: para dispensar 1000, 100 y 10µL.
Pipeta multicanal: recomendada para dispensar volúmenes de 100µL de
conjugado, sustrato y solución parada.
Tubos de plástico/vidrio: para la dilución de las muestras.
MÉTODO ENSAYO
7.1 PASOS PREVIOS AL ENSAYO
1.
Dejar el kit a temperatura ambiente
Este kit está pensado para ser procesado a temperatura ambiente (20-24°C).
Sacar el kit del almacenamiento y dejarlo a temperatura ambiente unos 60
minutos. Los pocillos no se deben sacar de la bolsa hasta que no se hayan
atemperado.
Nota: Este kit se puede mantener a temperatura ambiente durante una
semana.
2.
Componentes del kit
Mezclar generosamente cada componente del kit antes de ser utilizado.
3.
Tampón de lavado (concentrado 10 x) dilución.
Añadir 100mL del tampón de lavado concentrado a 900mL de agua destilada
(dilución 1 en 10) en un contenedor limpio y mezclar. Se pueden diluir
volúmenes pequeños de forma apropiada.
Nota: El tampón de lavados diluido se puede almacenar a temperatura
ambiente durante 4 semanas, se recomienda diluir solo la cantidad
necesaria.
4.
Dilución de la muestra
Diluir 10µL de cada muestra con 1000µL de diluyente de muestras (1:100) y
mezclar bien.
Nota: La muestra diluida se debe usar en las 8 horas siguientes.
5.
Manipulación del marco y las tiras
Disponer el número necesario de pocillos en la tira. Disponerlos desde la
posición A1, rellenando columnas de izquierda a derecha a lo ancho de la
placaAl manipular la placa, apretar los extremos del marco para evitar que
caigan los pocillos.
Nota: Los pocillos no usados se deben volver a guardar en la bolsa con
autocierre con los dos desecantes rápidamente, de esta forma se evitará una
exposición excesiva a la humedad.
Cuidado al manipular la bolsa, no agujerearla o cortarla.
ATENCION: Si los pocillos se exponen a la humedad o a la
contaminación por polvo, el antígeno puede degradarse, esto daría
lugar a un ensayo con una baja precisión y resultados potencialmente
erróneos.
7.2
MÉTODO DE ENSAYO
Mantener la misma secuencia de dispensación a lo largo de todo el ensayo.
1.
2.
Dispensación de la muestra
Dispensar 100µL de cada calibrador (análisis cuantitativo), o control cut-off
(análisis cualitativo), controles del ensayo y muestra diluida (1:100) en los
pocillos de la placa.
Nota: Las muestras se deben dispensar rápidamente a la placa para
disminuir el tiempo de procesado de la placa y también la diferencia de
tiempo entre la dispensación de la primera y la última muestra.
Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Lavados
El procedimiento de lavados es un punto crítico y requiere una atención
especial. Un mal lavado de la placa puede dar lugar a resultados poco
precisos, con una baja precisión y mucho fondo.
Después de la incubación, lavar los pocillos 3 veces con 250-350µL cada
pocillo con tampón de lavados. La placa se puede lavar de forma automática
o manual. Después del lavado automático invertir la placa sobre un papel de
filtro y dar unos golpecitos sobre los pocillos para permitir que se sequen.
6.
Parada de la reacción
Dispensar 100µL de la solución de parada a cada pocillo. Esto provoca un
cambio de color pasando del azul al amarillo.
7.
Determinación de la densidad óptica
Leer la densidad óptica (DO) de cada pocillo a 450nm en un lector de
microplacas, durante los 30 minutos siguientes a la parada de la reacción.
8
8.1 ENSAYOS CUANTITATIVOS/CUALITATIVOS
1. Control de calidad
Para que un ensayo se considere válido, debe cumplir los siguientes
criterios:
•
Calibradores / control cut-off (según convenga), control positivo y negativo y
el control de cadena simple de ADN siempre se deben incluir cada vez que
se realiza un ensayo.
•
Los valores obtenidos con los controles deben estar dentro del rango
descrito en el Certificado de Control de Calidad.
•
Sólo análisis cuantitativo: La forma de la curva debe ser similar a la curva
que se incluye en el Certificado de Control de Calidad.
Si no se cumplen estos criterios, el ensayo no se puede considerar
válido y el test se debe repetir.
2.
Calcular la media de las densidades ópticas (Sólo para ensayos que se
realicen por duplicado)
Para cada calibrador, control y muestra, calcular la media de las DO de los
duplicados de las lecturas. El porcentaje del coeficiente de variación (%CV)
para cada duplicado de DO debe ser inferior al 15%.
8.2 SCREENING - CÁLCULO DE RESULTADOS
1. Evaluación de calidad de las densidades ópticas
•
La DO del control positivo debería ser mayor que 0,5 y superior a la DO del
control cut-off.
•
La DO del control negativo debería ser menor que la DO del control cut-off.
•
La DO del control cut-off debería ser superior al del control negativo pero
menos que 0,5.
•
La DO del control de cadena simple debería ser menor que la DO del control
cut-off.
2.
Interpretación de los resultados
Interprete los resultados usando el control cut-off, de acuerdo a la siguiente
tabla:
RESULTADO
INTERPRETACIÓN
ACCIÓN
DO igual o mayor que el
control cut-off
DO menor que el control
cut-off
Sospecha de presencia de
anticuerpos anti-dsDNA
Análisis cuantitativo
Negativo
Comunicar el resultado
negativo
8.3 ENSAYO CUANTITATIVO - CÁLCULO DE RESULTADOS
1.
•
•
3.
Dispensación del conjugado
Dispense 100µL del conjugado en cada pocillo, secar la parte superior de
los pocillos con un pañuelo para eliminar cualquier posible salpicadura.
Nota: Para evitar contaminaciones no devolver nunca el conjugado no
utilizado a la botella de reactivo.
Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
4.
Lavado
Repetir el paso 2.
5.
Dispensación del sustrato (TMB)
Dispensar 100µL de sustrato TMB en cada pocillo, secar la parte superior de
los pocillos con un pañuelo para eliminar cualquier posible salpicadura.
Nota: Para evitar contaminaciones no devolver nunca el TMB no utilizado a
la botella de reactivo.
Incubar a temperatura ambiente, en la oscuridad, durante 30 minutos.
Dibujar la curva de calibración
La curva de calibración se debe dibujar de forma automática o manual como
sigue: dibujar la concentración de anticuerpos contra ADN de doble cadena
en la escala logarítmica y la DO en la escala lineal para cada uno de los
calibradores.
Automática – usar un Software validado y dibujar la curva que mejor
represente a los datos.
Manual – usando un papel de gráfica semi-logarítmico, dibujar una curva
entre los puntos (no una recta o punto a punto).
2.
Tratamiento de los puntos anómalos
Si alguno de los puntos está muy alejado de la curva, éste se puede
eliminar. Si la eliminación de este punto, hace variar mucho la curva y ésta
no se asemeja en forma a la curva de calibración o bien hay más de un
punto anómalo, se deberá repetir el ensayo.
3.
Cálculos de los niveles de autoanticuerpos y muestras diluidas.
Leer el nivel de los anticuerpos anti ADN de doble cadena a partir de la
curva de calibración. Los valores de los controles deben estar dentro del
rango definido en el Certificado de Control de Calidad.
Nota: Los valores de los calibradores se deben ajustar por un factor 100
para compensar la dilución 1:100 de la dilución de la muestra. No se
necesitan más correcciones.
4.
Calibración del ensayo
El ensayo está calibrado en IU/mL contra un calibrador de referencia OMS
(Wo80)6.
5.
•
Limitaciones
Este análisis, dada su habilidad para detectar únicamente los anticuerpos
anti-dsDNA de alta avidez, puede no funcionar en algunas formas de LES en
las que el paciente sólo presenta anticuerpos de baja avidez. Puede no ser
adecuado para aplicaciones en las que se precisa la determinación total de
anticuerpos anti-dsDN.
Este kit debe ser usado tan solo como una ayuda al diagnóstico. Un
resultado positivo sugiere la presencia de determinadas enfermedades, pero
debe ser confirmado por los síntomas clínicos y otros tests serológicos.
Los resultados obtenidos con este ensayo no son una prueba diagnóstica de
la presencia o ausencia de enfermedad.
En los lavadores automáticos no se debe programar ningún paso en el
que se deje la placa en remojo.
Las placas se pueden lavar manualmente de la siguiente forma:
a. Eliminar el contenido de la placa en un fregadero.
b. Dejar secar la placa invertida en un papel absorbente.
c. Llenar cada pocillo con 250-350µL de tampón de lavados
usando una pipeta multicanal.
d. Agitar la placa sobre una superficie plana.
e. Repetir a-d dos veces.
f.
Repetir a y b.
No dejar el tampón de lavados en los pocillos más
tiempo que el necesario para llenar toda la placa.
RESULTADOS Y CONTROL DE CALIDAD
•
•
9
VALORES ESPERADOS
Los siguientes rangos se han establecido en base a los resultados obtenidos con
FARRZYME del análisis de muestras de donantes de sangre sanos (n=150) y de
pacientes con LES (n = 224):
INTERPRETACION
Resultado negativo
≤ 30 IU/mL
> 30 IU/mL
Resultado positivo
Todas las 150 muestras de suero de donantes normales dieron resultados por
debajo de 17,0 IU/mL, con 146 (97%) de los resultados por debajo de 12,3 IU/mL
que es el límite inferior de medición del kit. El 22,8% de los sueros de pacientes
de LES dieron resultados positivos con FARRZYME (>30 IU/mL).
Los resultados mostrados a continuación proceden de un estudio comparativo
entre las mismas 224 muestras de LES del FARRZYME y un análisis
convencional EIA anti-dsDNA, que determina los anticuerpos dsDNA de alta y
baja avidez. Las muestras que dieron resultados borderline en el análisis dsDNA
convencional fueron tratadas como negativas al calcular el porcentaje de
concordancia y concordancia global positiva y negativa.
FARRZYME
Positivo
Negativo
ELISA Anti-dsDNA Convencional
Positivo
Borderline
Negativo
47
3
1
33
51
89
Porcentaje de concordancia positiva = 58,8%
Porcentaje de concordancia negativa = 97,2%
Concordancia global = 83.5%
La precisión intra- ensayo se determinó mediante 20 réplicas.
n = 20
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 4
Muestra 5
Muestra 6
Los rangos proporcionados son sólo una pauta. Los análisis ELISA son muy
sensibles y capaces de detectar pequeñas diferencias entre distintas poblaciones
de muestras. Se recomienda que cada laboratorio determine su propio rango
normal, en base a la población, las técnicas y los equipos empleados.
10
CARACTERÍSTICAS DE FUNCIONAMIENTO
10.1 RANGO DE MEDICIÓN
El rango de medición del análisis es 12,3 – 1000 IU/mL.
10.2 CONFIRMACIÓN DE LA SENSIBILIDAD DEL ANÁLISIS
La confirmación de que el análisis FARRZYME puede distinguir entre dos
muestras con valores cercanos al final del rango de medición (120 y 165% del
calibrador inferior) se obtuvo por análisis estadístico (el t-test de Student) de los
resultados obtenidos al analizar múltiples réplicas de cada muestra.
10.3 ESPECIFICIDAD, CONCORDANCIA
189 muestras procedentes de pacientes con LES, junto con 35 muestras positivas
en anticuerpos dsDNA por Crithidia o ELISA y 28 muestras normales sanas,
fueron analizadas con FARRZYME, con el análisis por inmunofluorescencia
Crithidia luciliae y también con un ELISA dsDNA convencional.
+
Porcentaje de concordancia positiva
Porcentaje de concordancia negativa
Concordancia global
FARRZYME
+
37
18
Crithidia IFA
14
183
67,3%
92,9%
87,3%
EIA FARRZYME demostró buena concordancia negativa con el análisis por
inmunofluorescencia Crithidia luciliae. El porcentaje de concordancia positiva se
redujo porque se sabe que este último análisis es conocido por detectar
anticuerpos anti-DNA de baja avidez11, a diferencia del análisis FARRZYME.
+
* Porcentaje de concordancia positiva
Porcentaje de concordancia negativa
Concordancia global
FARRZYME
ELISA dsDNA Convencional
+
Border-line
47
3
1
33
51
117
58,8%
97,7%
85,3%
*Para el cálculo de la concordancia entre ambos análisis, se clasificaron como
negativas las muestras en la región borderline del análisis dsDNA convencional.
El ELISA convencional detecta anticuerpos tanto de alta como de baja avidez,
dando como resultado una concordancia positiva reducida con el análisis
FARRZYME.
10.4 SUSTANCIAS INTERFERENTES
Se analizaron varios tipos de suero para determinar el posible efecto de
sustancias interferentes mediante el kit plus Interference Check A (Kokusai,
Japón).
Sustancia
Bilirrubina F (libre)
Bilirrubina C (conjugada)
Hemoglobina hemolizada
Quilo
Factor reumatoide
% C.V.
5,4
4,8
2,2
3,3
4,3
5,1
La precisión inter- ensayo se determinó mediante 6 análisis realizados por
duplicado durante 3 días.
n=6
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 4
Muestra 5
Muestra 6
La incidencia de anticuerpos anti-dsDNA de alta avidez detectados por
FARRZYME y por Farr RIA en 100 pacientes de LES resultó ser de 36% y 38%,
respectivamente8. En cambio, en 100 pacientes con enfermedades varias del
tejido conectivo y otras enfermedades autoinmunes, la incidencia fue del 4% y 5%
respectivamente para los dos análisis.
Los valores unitarios obtenidos con el análisis FARRZYME pueden no ser
acordes a los obtenidos con otros análisis que dan resultados en IU/mL, ya que
FARRZYME sólo determina el subconjunto de anticuerpos anti-dsDNA de alta
avidez.
PRECISIÓN INTRA-ENSAYO
Concentración (IU/mL)
25,1
39,0
74,5
205,5
361,2
528,6
11
PRECISIÓN INTER-ENSAYO
Concentración (IU/mL)
24,6
42,3
61,3
123,2
272,4
474,1
% C.V.
13,5
3,9
11,6
4,9
7,0
6,9
REFERENCIAS
1.
Ceppelini R, Polli E and Celada F. A DNA-reacting factor in serum of a
572-574.
1982; 49: 603-610.
2.
12
ESQUEMA DE LA PLACA
Por favour, mire en la parte posterior de la hoja de instrucciones.
Resumen del procedimiento
1.
2.
3.
4.
Añadir 100µL de cada calibrador, control y muestras
diluidas 1:100 a los pocillos apropiados.
Incubar 30 minutos.
Lavar.
Añadir 100µL del conjugado a cada pocillo.
Incubar 30 minutos.
Lavar.
Añadir 100µL de sustrato a cada pocillo.
Incubar 30 minutos.
Añadir 100µL de solución de parada a cada pocillo.
Medir la absorbancia a 450nm.
FARRZYME™ / BINDAZYME™ es marca de
The Binding Site Ltd.
P.O.Box 11712, Birmingham
B14 4ZB England
Concentración
20,3mg/dL
20,2mg/dL
486mg/dL
1460 Units
45 IU/mL
No se observaron interferencias con bilirrubina libre ni conjugada, hemoglobina,
lípidos ni factor reumatoide.
En un estudio aparte se analizaron 6 IgG de suero con mieloma mediante
FARRZYME y ninguna dio resultado positivo.
10.5 PRECISIÓN
La precisión intra- e inter-ensayo se determinó mediante seis muestras que
cubrían el rango de la curva de calibración. El valor medio y el % C.V. para cada
muestra son los de la tabla inferior:
Plate Template
Plattenschema
Plan de plaque
Plantilla de la placa
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
C
D
E
F
+
G
H

FARRZYME™ Human high avidity anti

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