ESTUDIO DE LA INCIDENCIA DE Aspergillus spp. Y Penicilliumspp

ESTUDIO DE LA INCIDENCIA DE Aspergillus spp. Y Penicilliumspp

ESTUDIO DE LA INCIDENCIA DE Aspergillus spp. Y Penicilliumspp.EN ESPIGAS DE
MAÍZ Y SU CONTROL MEDIANTE LA APLICACIÓN DE ACEITE ESENCIAL DE LAUREL
Camiletti, B. X.124; Ferrer Lanfranchi2, M.; Magnoli, C.3; Lucini, E.1, Giménez Pecci, M. P.2
1
Facultad de Ciencias Agropecuarias (UNC),Córdoba,Argentina. 2Instituto de Patología Vegetal (INTA),Córdoba,
Argentina. 3Laboratorio de Micología(UNRC), Río Cuarto, Córdoba, Argentina.4 CONICET. [email protected],
[email protected]
ABSTRACT
Aspergillus and Penicillium species cause crop quality lost because of the presence of mycotoxins.
These toxic secondary metabolites can produce adverse effects in human and animal health. Essential
oils (EOs) have demonstrated antifungal activity and are GRAS (Generally considered as safe)
products. Previous studies showed that EO from Laurel (Laurusnobilis L.) can be used to control
Aspergillus and Penicillium species. The objectives in this work were (1) to determinate Aspergillus and
Penicillium incidence in corn samples; (2) to identify Aspergillusflavus and determinate theirs
aflatoxicogenic capacities; (3) to evaluate the antifungal activity of Laurel EO. Twenty four samples
were collected from Córdoba, Santiago del Estero and Santa Fe provinces (Argentina). General
microbiota was isolated and identified by morphologic characteristics to determinate Aspergillus and
Penicilliuminicidence. Species were identified by macro and microscopic characteristics. Aflatoxicogenic
capacities were studied by thin layer chromatography (TLC). Antifungal activity of Laurel EO was
evaluated obtaining its minimum fungicidal concentration (MFC). The results showed a variable
incidence of Aspergillusand Penicillium. Penicilliumolsonii and Penicilliumminioluteum were identified
from corn samples. Aspergillusflavus strains did not show capacity to produce mycotoxins. Laurel EO
was effective to control Penicilliumminioluteum and Aspergillusflavus(MFC 3200 ppm).
AspergillusyPenicillium species are present in corn´s ears that is grown in Argentina but the incidence
varies according to the collection places. Spraying with Laurel EO could be consider as a natural source
of fungi control and to reduce aflatoxins in corn kernels, giving a better quality of this raw material.
Key words: mycotoxins, corn, essential oil, ear, control.
Palabras claves: micotoxinas, maíz, aceite esencial, espiga, control
INTRODUCCIÓN
Bajo ciertas condiciones ambientales, el maíz es infectado por hongos que causan
“podredumbres de espiga”. Además de la pérdida de rendimiento, las especies fúngicas
ocasionan pérdida de la calidad del cultivo debido a la presencia de micotoxinas. Estos
metabolitos secundarios pueden inducir efectos adversos en la salud humana y animal. Los
géneros Aspergillusspp.yPenicilliumspp. son contaminantes frecuentes en granos de maíz.
Infecciones con Aspergillus flavus resultan en producción de aflatoxina, la más importante
micotoxina en materias primas para la producción de los alimentos del mundo(Pitt and
Hocking 2009).Los aceites esenciales (AEs) se presentan como una alternativa de manejo
para disminuir el impacto ambiental negativo de los fungicidas químicos. Su principal
mecanismo de acción es a nivel de membrana celular, donde interfieren con procesos vitales
como la ósmosis, la síntesis de esteroles y de fosfolípidos(Lucini et al. 2006). EL AE de laurel
(LaurusnobilisL.) ha sido reportado como un agente antifúngico(De Corato et al. 2010).
El objetivo de este trabajo fue (1) determinar la incidencia de los géneros Aspergillus y
Peniciliumen cultivos de maíz; (2) identificar presencia de Aspergillus flavus y determinar su
capacidad aflatoxicogénica; (3) iniciar estudios sobre
la actividad antifúngica del AE
delaurel.
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestreo. Las muestras procedieron de zonas agrícola y ecológicas diferentes, ubicadas en
las provincias de Córdoba (CR), Santiago del Estero (SE) y Santa Fe (SF), de materiales
templados, templado por tropical y tropicales, de diferentes semilleros (DowAgrociences,
Dekalb, Pioneer, Nidera, SPS, ACA, La Tijereta, Agreseed y Baya Casal). Cada
muestraestuvo compuesta por 10mazorcas en estado de grano duro cosechadasal azar
dentro de un mismo lote y transportadas en bolsas para su posterior análisis.Se colocaron
en estufa con circulación forzada para reducir humedad por debajo del 12%. La medición de
humedad se realizó en 400 gramos de grano obtenidos de 3 o 4 mazorcas.Las muestras se
conservaron a 4ºC (Sepúlveda and Piontelli 2005)
Obtención de la microbiota general. Se realizó mediante la técnica de plaqueo directo.
Se colocaron 10 granos por placa. Cada muestra se plaqueó sobre dos medios de cultivo:
diclorán rosa de bengala cloranfenicol (DRBC) y diclorán- glicerol al 18% (DG18). Se
analizaron 100 granos por muestra. Las placas se incubaron durante 7 días a 25ºC. Colonias
pertenecientes al género Aspergillusy Penicillium, se subcultivaron en agar extracto de malta
(MEA)durante 7 días a 25ºC para su posterior identificación(Pitt and Hocking 2009). Se
determinó la incidencia de los géneros Aspergillus yPenicillium en cada muestra.
Identificación de especies del género Penicillium. Las colonias con características de
Penicillium de la muestra 03, 04 y 08 se subcultivaron en MEA. Desde allí se inocularon las
placas de petri con los medios de cultivo MEA, CYA y agar nitrato glicerol al 25% (G25N) en
tres puntos equidistantes entre sí para luego ser incubados a 5, 25, 37ºC. Cada cepa se
identificó de acuerdo a sus características macroscópicas y microscópicas siguiendo una
clave taxonómica(Pitt and Hocking 2009).
Presencia de Aspergillusflavus. A partir de cada cepa desarrollada en MEA se realizó una
suspensión de conidios en 0,5 mL de agar semisólido y desde allí se inocularon con ansa
“en punta” las placas de Petri con los medios de cultivo CYA, MEA y CY20S en tres puntos
equidistantes entre sí para luego ser incubados a 25°C y 37°C.Las placas se observaron
después de 7 días. Cada cepa se identificó de acuerdo a sus características macroscópicas y
microscópicas siguiendo una clave taxonómica(Pitt and Hocking 2009).
Producción de aflatoxinas (AFs).Se determinó mediante cromatografía de capa delgada
(TLC). Se utilizó una solución testigo que contenía 1,5 microgramos de AF B1 (Sigma, St.
Louis, USA) por mililitro. La detección se realizó mediante visualización de fluoresencia bajo
luz UV a 365 nm de longitud de onda larga (Geisen 1996).
Actividad antigúngica.Se prepararon placas de Petri de 9 cm de diámetro con 20 mL de
medio de cultivo agar papa glucosado(Lucini et al. 2006).Los AEs fueron agregados al medio
acorde a concentraciones finales deseadas. Igual cantidad de micelio de cada cepa fue
colocado en las placas. Los tratamientos fueron incubados a 25°C por 10 días en cámara de
cultivo. Luego, se midió el diámetro de micelio crecido.La actividad antifúngica fue
expresada en porcentaje de inhibición del crecimiento(PIC).EL valor de CFM fue definido
como la menor concentración de AE en la cual el PIC es igual al 100% (Abbaszadeh et al.
2014)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Microbiota General. Los porcentajes de incidencia de Aspergillus y Penicillium, son
presentados en la Tabla 1.Las muestras provenientes de SE no mostraron una alta incidencia
por Aspergillus y Penicillium, a excepción de la muestra 03 que tuvo a casi todos sus granos
contaminados por Aspergillus. Penicillium tuvo una fuerte incidencia en algunas muestras de
granos cultivados en CR. Otros autores (Sepúlveda and Piontelli 2005) reportaron que el
87,09 % de los granos de maíz con origen argentino estaban contaminados con especies del
género Aspergillus.
Tabla 1. Origen y porcentaje de infección con Aspergillus spp y Penicilliumspp. en muestras de espigas
de maíz cultivadas en Argentina.
Muestra
Provincia
Localidad
% Aspergillusspp.
% Penicilliumspp.
Nº
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
Santiago
del Estero
Sachayoj
Manfredi
Córdoba
General Paz
Jesús María
Cañada Luque
Despeñaderos
Pampa de Pocho
Santiago
del Estero
La Abrita
Santa Fe
Videla
07
00
97
00
00
00
00
00
01
00
00
02
02
00
02
00
01
02
00
01
00
00
01
00
00
00
1
92
50
93
40
100
55
34
32
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
00
Identificación de especies del género Penicillium.Se determinó la presencia de
Penicilliumminioluteum yPenicilliumolsoniien las muestras 03, 04 y 08 respectivamente.
Presencia de Aspergillus flavus. Se determinó la presencia de Aspergillus flavusen las
muestras 03, 09, 12, 15 y 20. Otros autores (Sepúlveda and Piontelli, 2005) han indicado
que granos de maíz provenientes de Argentina estuvieron contaminados en un 50,96% con
esta especie fúngica.
Producción de aflatoxinas. Las cepas de Aspergillus flavus aisladas a partir de la
muestras 09, 12 y 15 podrían no ser productoras de aflatoxinas. No se observó fluorescencia
a excepción del control estándar. Sin embargo, Sepúlveda & Piontelli (2005) reportaron que
solo el 18% de los aislamientos de Aspergillus flavus eran productores de aflatoxinas.
Actividad antifúngica.El AE de laurel inhibió completamente el crecimiento de Aspergillus
flavus y Penicilliumminioluteum a una concentración de 3200 ppm (CFM) de acuerdo al
método propuesto por Abbaszadeh et al.(2014). El AE de Laurel parece ser efectivo para el
control de estos hongos en maíz. Por tal motivo se continúan estudios con este aceite
esencial y en un futuro se probarán nuevos aceites.
CONCLUSIÓN
En base a este trabajo podemos concluir que los géneros fúngicos Aspergillus y Penicillium
están presentes en espigas de maíz cultivadas en las zonas de Córdoba y Santiago del
Estero, en Argentina. Penicilliumolsonii yPenicilliumminioluteumson algunas especies que
pueden afectar a los granos. Aspergillus flavus está presente en espigas de maíz, con
incidencia muy variable, y máxima de 97%. Con la técnica empleada no se detectaron cepas
productoras de aflatoxinas, debido a lo cualserán analizadas mediante una técnica de mayor
precisión. Se podría considerar el rociado con AE de laurel como una manera sustentable
para el control de hongos y disminuir la presencia de aflatoxinas en los granos de maíz,
dando una mejor calidad de esta materia prima.
AGRADECIMIENTOS
A INTA PNCYO 1127023, 1135022 y 1127021 por el soporte económico brindado.Al Dr. Ricardo
Comerio por la actualización en bases morfológicas de los hongos filamentosos y a los Ing. Agr.
Federico Piatti, José Simondi, Raúl Candela, Matías Romaní, Ignacio Luna, Alfredo González y Gustavo
Negro por el envío de espigas.
BIBLIOGRAFÍA
Abbaszadeh S.; Sharifzadeh A.; Shokri H. 2014. Antifungal efficacy of thymol, carvacrol, eugenol and menthol as
alternative agents to control the growth of food-relevant fungi. J Mycol Med 24 (2): 51-56.
De Corato U.; Maccioni O.; Trupo M.; Di Sanzo G. 2010. Use of essential oil of Laurus nobilis obtained by means of
a supercritical carbon dioxide technique against post harvest spoilage fungi. Crop Prot 29:142–147.
Geisen R. 1996. Multiplex polymerase chain reaction for the detection of potential aflatoxin and sterigmatocystin
producing fungi. Syst Appl Microbiol 19:388–392.
Lucini E.I.; Zunino M.P.; Lopez M. L.; Zygadlo J. 2006. Effect of monoterpene on lipid composition and sclerotial
development in Sclerotium cepivorum Berk. J Phytopathol 154:1–6.
Pitt J.I.; Hocking A.D. 2009. Fungi and Food Spoilage. Springer. New York.
Sepúlveda C.; Piontelli E. 2005.Aspergillus population in maize and soja seed imported from Argentina: ephasis on
section Flavi. Bol Micol 20:41–55.