Producción, aislamiento y evaluación de la estabilidad de

Producción, aislamiento y evaluación de la estabilidad de

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Producción, aislamiento y evaluación de la
estabilidad de OMV’s provenientes de una
cepa de E. Coli JC8031-pTRC-ssTorA::gfp
Lorena Viuche, Aldemar Gutiérrez.
Resumen— Las bacterias Gram Negativas producen vesículas de
membrana externa (OMV’s) que contienen proteínas activas
biológicamente y que participan en diversos procesos biológicos.
Así pues se realizó el cultivo, remoción bacteriana y el
aislamiento
final
por
medio
de
ultrafiltración
y
ultracentrifugación requerido para la obtención de las OMV’s;
estas fueron obtenidas de cepas hipervesículantes de E. Coli como
la JC8031 y otra transformada para la producción de proteína
verde fluorescente (JC8031 pTRC-ssTorA::gfp). Posteriormente
las vesículas obtenidas fueron resuspendidas en buffer PBS y
otras en este mismo buffer junto con glicerol 50%; a
continuación, se almacenaron a distintas temperaturas (-20°C,
4°C y 15°C) y se evaluó la intensidad de fluorescencia de la GFP
por medio de la citometría de flujo durante dos meses y cada siete
días; luego se efectuó la cuantificación de proteínas de las OMV’s
por el método Bradford. Para finalizar se encontró que la
temperatura óptima para la estabilidad y alta intensidad de
fluorescencia de las OMV’s que contienen la GFP es de 15°C, sin
embargo al cabo de un mes la fluorescencia disminuyó
significativamente; por otra parte la cantidad de proteína total
obtenida por el método de Bradford fue de 98,83 µg/mL.
Palabras clave: Bacterias, proteína verde fluorescente,
ultracentrifugación,
ultrafiltración,
vesículas
de
membrana externa.
I.
(OMV’s, por sus siglas en inglés, Outer Membrane Vesicles) a
partir de bacterias gram-negativas como es el caso de la E.
Coli. Las OMV’s son pequeñas porciones de membrana
externa que cuentan con un tamaño entre 50-250 nm; estas son
formadas gracias al deterioro entre la membrana externa
bacteriana y la capa de peptidoglicano, generando
abultamientos los cuales contienen ácidos nucleicos, proteínas
provenientes del citosol o de la membrana externa. Por su
parte, una de las proteínas más explotadas y arduamente
estudiadas en la biología celular es la proteína verde
fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés, Green Fluorescent
Protein), gracias a su habilidad de generar gran visibilidad y
eficacia al emitir fluorescencia interna, lo cual permite
observar procesos antes invisibles permitiendo un mejor
entendimiento y un estudio más detallado y fructífero de la
mecánica celular.
Por lo anterior, el siguiente trabajo está enfocado en la
producción, aislamiento y almacenamiento adecuado de
OMV’s vacías y con una carga proteica (GFP) de una cepa de
E. Coli, por su amplio uso en la biología molecular como
biomarcador, para la producción de vacunas, observación de
interconexiones neuronales, evaluación de cambios de pH en
organismos entre otros; y con el fin de encontrar las
condiciones ambientales necesarias para la conservación
fisiológica y fluorescente de las OMV’s.
INTRODUCCIÓN
En la industria biotecnológica es ampliamente utilizada la
bacteria Escherichia Coli (E. Coli), ya que ha sido muy bien
caracterizada desde el punto de vista fisiológico y genético,
además de requerir procedimientos para sus análisis
relativamente económicos; este bacilo gram-negativo se
emplea en la producción de proteínas recombinantes con
diversos fines tales como diagnóstico, terapéuticos, entre
otros. Al mismo tiempo se han realizado numerosos estudios
acerca de la producción de vesículas de membrana externa
Este proyecto fue apoyado y desarrollado en la Universidad Antonio
Nariño.
L Viuche es estudiante de Licenciatura en Química de la Universidad Distrital
Francisco José de Caldas, Bogotá-Colombia ([email protected]).
A Gutiérrez es estudiante de Licenciatura en química de la Universidad
Distrital Francisco José de Caldas ([email protected]).
II. DESARROLLO DE CONTENIDOS
Un creciente número de bacterias Gram-negativas han sido
reportadas por la secreción de vesículas de membrana externa
(OMV), cuyas funciones se ven frecuentemente envueltas en
la liberación de sustancias activas hacia un huésped y/o a la
modulación de una respuesta inmune de este. La producción
de OMV’s se ve provocada por diversas condiciones de vida
tales como la etapa de crecimiento y nutricional, temperatura y
estrés oxidativo generado. Por otra parte la secreción de
vesículas de membrana (MV) en las bacterias gram-positivas
han sido foco de poca atención en comparación con las
OMV’s de las bacterias gram-negativas; sin embargo existen
métodos que describen la producción, aislamiento y
purificación de estas.
A. Generalidades de las OMV’s
Las OMV’s son formadas de una porción de membrana
externa (OM) separada de la superficie bacterial, formando
consigo parte del espacio periplásmico; estas vesículas
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presentan un tamaño comprendido entre 50 y 250 nm cuya
composición es propia de la OM (lipopolisacáridos,
fosfolípidos y proteínas) y periplasma. Sin embargo en
algunos casos la carga de las OMV’s puede contener ácidos
nucleicos, proteínas citosólicas o de membrana interna, pero
no se conoce con certeza el mecanismo de introducción de
estos componentes. La OM de las bacterias gram negativas
están unidas a una capa de peptidoglicano subyacente con una
distribución más o menos homogénea, incluyendo además una
lipoproteína que la une de manera covalente al peptidoglicano,
el sistema Tol-Pal (sistema de proteínas que interconecta de
forma no covalente la membrana interna y la externa) y el
sistema OmpA (proteínas integrales de membrana).
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preconcentrar la cantidad de OMV’s. 4) Purificación: luego de
la obtención por ultracentrifugación y de acuerdo a la pureza
de OMV requerida se procede a realizar métodos que permiten
remover aquellas proteínas que no se asocian a OMV’s.
1) Biogénesis de las OMV’s
La generación de vesículas empieza por la expulsión de
abultamientos de OM hacia áreas donde los enlaces de
OM-Peptidoglicano están deteriorados, ya sea por su
reposición o por el rompimiento de estas conexiones. Más
adelante, estos abultamientos generados son extendidos
por la acumulación de proteínas periplásmicas, lo cual
conlleva a la formación de una futura carga de OMV.
Adicionalmente, la membrana que acaba de nacer es
activada por la acumulación localizada de proteínas
inductoras de curvatura provenientes de la OM.
2) Funciones de las OMV’s
Las OMV sirven para innumerables funciones en el estilo
de vida de la célula. Estas actúan como un sistema de
secreción que entrega su contenido al ambiente. La
secreción de factores de virulencia y toxinas dentro un
hospedero vía OMV ha sido descrito en muchas especies
bacterianas. Para algunas bacterias las OMV sirven como
armas entre especies para su desarrollo o como un señuelo
para bacteriófagos y péptidos antimicrobianos. El rol de las
OMV juega un papel importante en la comunicación y en
el suministro de pequeñas moléculas de señalización y
ADN. La liberación de proteínas agregadas y malformadas
vía OMV han sido descritas como las responsables de un
nuevo mecanismo de estrés.
B. Producción de las OMV’s
El procedimiento para llevar a cabo la producción de OMV’s
se realiza generalmente siguiendo estos pasos: cultivo,
remoción de la bacteria intacta y aislamiento de OMV’s del
cultivo filtrado y la opcional pre-concentración y purificación.
La selección de métodos particulares se basa en muchos
factores, por ejemplo la cantidad de material para ser
procesada y pureza requerida para posteriores aplicaciones. En
la figura 1 se pueden observar los siguientes procedimientos:
1) cultivo en medio líquido: este tiene que ver con el tiempo
de crecimiento, así como también las diferentes condiciones
de estrés que influyen en la tasa de producción de OMV’s y su
contenido. 2) Remoción de bacterias: la baja velocidad de
centrifugación ayuda a remover la mayoría de bacteria y el
resto será retirada acudiendo a la filtración estéril. 3)
Concentración del cultivo filtrado: debido a que la
concentración de OMV’s después de la ultra centrifugación es
baja, se realiza una precipitación o ultrafiltración que permite
Fig. 1 Esquema general para la producción de OMV’s
1) Aislamiento de OMV’s
El aislamiento de las vesículas se empieza realizando una
remoción de bacterias por medio de una centrifugación de
baja velocidad, pero en algunos casos se emplean otros
pasos para remover escombros celulares, proteínas grandes
y agregados de membrana. El supernadante es filtrado
luego de esta centrifugación con el fin de remover residuos
bacterianos. Debe tenerse en cuenta, que el tamaño del
poro del filtro debe ser igual al tamaño de la bacteria que
se esté tratando; por otra parte cabe anotar que actualmente
se utiliza un filtro con un poro de 0,22 µm ya que el
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tamaño de las OMV’s circunda entre los 200-300 nm.
Debido a que el monto de vesículas aisladas es muy
pequeño, se realiza generalmente una pre-concentración
por medio de ultrafiltración.
C. Cuantificación del rendimiento de producción de OMV’s
La cuantificación es un paso clave para entender el proceso
de vesiculación; esta se basa generalmente en la medición de
proteínas y/o lípidos.
1) Cuantificación de proteínas por el método de Bradford
El método de Bradford, es una técnica que cuenta con una
alta sensibilidad (1-1,5ng), no muestra interferencia con
muchos compuestos excepto detergentes y soluciones
básicas; se basa en la unión covalente de un colorante (azul
de Coomassie) junto con la proteína de interés. El
colorante en medio acido existe en dos formas, una naranja
y la otra azul. La forma azul es la que forma el complejo
entre el colorante y la proteína permitiendo la
determinación colorimétrica.
D. Citometría de flujo
La citometría de flujo es una técnica de análisis celular
multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una
suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de
una en una por delante de un haz de láser focalizado. Esta
importante técnica permite la medida simultánea de múltiples
características físicas de una sola célula, las cuales se miden
mientras las células (o cualquier tipo de partícula) pasan a una
velocidad de 500 hasta 4000 células por segundo a través del
aparato de media por medio de una corriente de fluido. En la
actualidad, no existe un método fácil y eficiente para el
recuento y la caracterización de partículas membranosas a una
escala nanométrica tales como las OMV´s; sin embargo, la
citometría de flujo es una técnica que se adecua a esta
condición ya que es una técnica que se basa en la detección,
cuantificación y separación de partículas gracias a la
dispersión perpendicular de la luz.
III. METODOLOGIA
A continuación se describirán los distintos procedimientos
para la extracción de plásmido, células competentes,
transformación de E. Coli, aislamiento de vesículas de
membrana externa con contenido proteico (GFP), análisis de
fluorescencia gracias a la citometría de flujo y ensayos de
estabilidad de OMV’s a diferentes temperaturas.
A. Producción de células competentes de Escherichia Coli
JC8031
Se inocula 1,0 mL de un precultivo de Escherichia Coli
JC8031 en 250 mL de medio Luria-Bertani (LB), el cultivo se
incuba a 37°C y 220 rpm hasta alcanzar una densidad óptica a
600nm (OD600nm) entre 0,5 - 0,6. Las células fueron
colectadas mediantes centrifugación a 5000 rpm a 4°C durante
10 min, el sobrenadante se desecha y la biomasa bacteriana se
resuspende en 10 mL de una disolución de CaCl2 100 mM
enfriada previamente con hielo. La suspensión se dispone en
baño de hielo durante 30 min y las células son nuevamente
recolectadas por centrifugación a 5000 rpm durante 10 min.
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Luego de eliminar el sobrenadante, el precipitado celular se
resuspende en una mezcla de una disolución de CaCl2 100
mM con glicerol al 20 %. Las células fueron separadas y
conservadas a -20°C (Sambrook J, et al. 1989).
B. Extracción de plásmido pTRC-ssTorA::gfp con columna
Econospin
El plásmido pTRC-ssTorA::gfp (Perez-Rodriguez, et al,
2011) donado gentilmente por el Dr. Mathew DeLisa
(Universidad de Cornell, Facultad de Química e Ingeniería
Biomolecular, Ithaca, NY, USA) fue extraído de E. Coli
DH5α usando el kit de extracción para plásmidos
EconoSpinTM, y siguiendo el protocolo del fabricante. Las
células cultivadas en medio LB suplementado con ampicilina
100 µg/ml son recolectadas por centrifugación y usadas para
la extracción del plásmido pTRC-ssTorA::gfp. El plásmido es
resuspendido en buffer Tris-EDTA (Buffer TE) y analizado en
gel de agarosa al 1%, para asegurarse que se ha extraído
exitosamente el plásmido en cuestión.
C. Transformación E. Coli JC8031 con pTRC-ssTorA::gfp
Las células competentes de E. Coli JC8031, se mezclan
suavemente con 20 ng de plásmido. Las células son colocadas
en hielo durante 5 minutos, luego de este tiempo se agregan 50
µL de agua destilada estéril. Esta mezcla es trasvasada a un
tubo de vidrio con fondo plano y se lleva al sonicador durante
15 segundos a una temperatura de 22°C. A continuación se
lleva el tubo de vidrio a un baño termostatado durante 90
segundos a una temperatura de 42°C; y se coloca en hielo
durante 2 minutos. Después de cumplido el tiempo se adiciona
1 mL de medio LB y se incuba durante 40 minutos a 37°C y
200 rpm. Finalizado el tiempo de incubación se transfiere el
contenido del tubo de vidrio a un tubo eppendorf estéril de 1,5
mL y se lleva a centrifugación durante 5 minutos a 10000 rpm,
luego se descarta el sobrenadante y se resuspenden las células
entre 50 µL del medio LB. Las células se platean en medio LB
agar suplementado con ampicilina 100 µg/ml y se incuban a
37°C. (Sambrook J, et al. 1989).
D. Preparación, aislamiento y cuantificación de vesículas
externas (OMV´S) de E. Coli JC8031 y JC8031-pTRCssTorA::gfp
Para la obtención y aislamiento de las vesículas externas de
E. Coli se sigue el protocolo por Chen et al. 2010, como se
describe brevemente a continuación. Se inoculan 10 mL de un
precultivo de las cepas de E. Coli JC8031 y E. Coli JC8031pTRC-ssTorA::gfp en 100 mL de medio LB y LB
suplementado con 100 µg/ml de ampicilina, respectivamente.
Los cultivos se incuban a 30°C durante 24 horas a 220 rpm, el
cultivo de E. Coli JC8031-pTRC-ssTorA::gfp es protegido de
la luz para conservar la fluorescencia de la proteína verde
fluorescente GFP. Los cultivos son centrifugados durante 10
minutos a 10000 rpm y el sobrenadante obtenido es filtrado a
través de una membrana estéril con tamaño de poro de 0,22
µm. El sobrenadante filtrado se somete nuevamente a
centrifugación durante 3 horas a 28000 rpm. Al finalizar la
centrifugación, se desecha el sobrenadante y se resuspende el
sedimento que corresponden a las OMV’s vacías o a las
OMV’s que contienen la proteína verde fluorescente; estas a
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su vez son resuspendidas en 100 µL de buffer fosfato salino
estéril 100X (buffer PBS). Para descartar contaminación
bacteriana durante el proceso de obtención de OMV, se toman
10 µL de las OMV’s resuspendidas en PBS, se siembran e
incuban en un plato de agar LB durante 24 horas a 37°C. Las
OMV’s resuspendidas se almacenan a 4°C y su producción se
cuantifica mediante la colorimetría para la cuantificación de
proteína acudiendo al método de Bradford y finalmente
cuantificación por citometría de flujo. Las OMV’s así
obtenidas se conservan para experimentos posteriores de
electrofisiología, citometría de flujo y expresión de antígenos
de Leishmania Amazonensis.
E. Análisis por citometría de flujo de los ensayos de
estabilidad y fluorescencia de las vesículas de membrana
externa (OMV´S) de E. Coli JC8031 almacenadas a diferentes
temperaturas
Para determinar la estabilidad y fluorescencia de las OMV’s se
realizan tres ensayos cada uno por cuadruplicado. El primero
consiste en colocar en tubos Eppendorf 40 µL de OMV’s resuspendidas en buffer PBS estéril. Para el segundo ensayo se
colocan 40 µL de OMV’s re-suspendidas en buffer PBS estéril
y complementada con glicerol al 50%. Los tubos se protegen
de la luz pues la proteína verde fluorescente puede presentar
características fotosensibles y se reparten en tres grupos para
ser almacenados durante 8 días a temperatura ambiente
(15°C), en la nevera a 4°C y en el congelador a -20°C.
Transcurrido este tiempo, se realiza la evaluación de la
fluorescencia de las OMV’s por citometría de flujo, con ayuda
del citómetro Accuraci C6 flow citometer.
Fig. 2 Colonias de E.Coli JC8031-pTRC-ssTorA::gfp
Cabe resaltar que la producción y aislamiento de OMV’s se
realizará con estas células fluorescentes y con las bacterias sin
transformar, es decir aquellas que no contienen este plásmido,
con el fin de comparar en experimentos posteriores la
fluorescencia y los medios óptimos de almacenamiento. En la
figura 3 se observa un plato correspondiente a la cepa
hipervesiculante sin ser transformada.
F. Cuantificación de OMV’s por el método de Bradford
Para la cuantificación de proteínas por el método de Bradford
se realizará una curva patrón de albúmina sérica bovina (BSA
por sus siglas en inglés Bovine Serum Albumin) en un rango
de 0,00 µg/mL hasta una solución de 1000 µg/mL. 100 µL de
las diferentes concentraciones patrón de BSA o de muestras de
OMV’s se adicionaran por separado a 900 µL del reactivo de
Bradford incubándose durante 10 minutos a temperatura
ambiente. La absorbancia de los patrones de BSA y de las
muestras de OMV’s serán leídos a 595nm en un
espectrofotómetro “Shimadzu UV mini 1240 UV-visible
scanning” (Bradford MM (1976).
IV. ANÁLISIS DE RESULTADOS
Previo a la producción, aislamiento y evaluación de la
estabilidad de las OMV’s, se debe llevar a cabo la producción
de células competentes de Escherichia Coli JC8031, la cual es
una cepa hipervesiculante; luego de preparar las células, se
transforman con el plásmido que produce la proteína verde
fluorescente “pTRC-ssTorA::gfp” el cual le confiere una
resistencia a la ampicilina. En la figura 2 pueden apreciarse las
colonias de las células que han adquirido el plásmido y que
lograron crecer en el medio LB suplementado con el
antibiótico anteriormente nombrado.
Fig. 3 Colonias de E.Coli JC8031
Posteriormente, se realiza el correspondiente pre-inoculo e
inoculo de cada una de las cepas descritas; cabe aclarar que el
pre-inoculo se realiza para que en un volumen pequeño
crezcan suficientes colonias de bacterias y el inoculo en un
volumen más grande para que esta población se multiplique.
En principio cada uno de estos pre-inóculos e inóculos eran
dejados a una temperatura de 37°C y a 220 rpm durante 24
horas, pero se logró observar que esta temperatura afectaba
seriamente la fluorescencia de la GFP, por lo cual se tomó la
decisión de manejar ambas cepas a una temperatura de 30°C,
siendo esta la más adecuada para producir una alta
fluorescencia y para conservar óptimamente las bacterias
vacías. Es clave entender que la temperatura y la agitación no
sólo se hacen con el fin de hacer crecer la población de
bacterias, sino que también sirve para dar un estrés físico a las
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bacterias y que con esto empiece el ciclo de producción de
vesículas, cuyo inicio se da luego de estas condiciones.
Luego se realiza una pre-centrifugación durante 10 minutos y
a 10000 rpm con el fin de separar las vesículas liberadas en
este período de estrés de las bacterias, allí las OMV’s
quedarán en el supernadante y las células por tener un mayor
peso, migrarán al fondo del tubo por la fuerza centrífuga. En la
figura 4 se pueden apreciar las células obtenidas luego de la
pre-centrifugación de la cepa de E. Coli transformada; allí
puede apreciarse la fluorescencia característica de estas
bacterias, lo cual es un buen indicador de que la cepa está en
buen estado y no hay contaminación, si la hubiese la
fluorescencia sería nula. Por el contrario para la cepa no
transformada debe verse un precipitado color hueso.
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adiciona 1µL de gentamicina 1000X con el fin de terminar
cualquier tipo de contaminación. Para cerciorarse de que
efectivamente las OMV’s no presentan células que se hayan
escapada en alguno de los procesos anteriores, se toman 10 µL
de OMV’s y se siembran en un plato con LB sin ningún
antibiótico el cual se deja a 37°C durante 24 horas, luego de
este lapso no debe crecer ninguna colonia.
Fig 5. OMV’s obtenidas por ultracentrifugación
Fig 4. Células de E.Coli obtenidas luego de la pre-centrifugación
Es crucial para el éxito de la obtención de OMV’s limpias la
filtración por medio de una membrana porosa de 0.22 µm, ya
que con ella se pueden retener restos de bacteria que pudieron
quedar en el sobrenadante y se asegura el paso de únicamente
las vesículas. Para este procedimiento es de suma importancia
la completa esterilidad, ya que se disminuye el riesgo de
contaminar las OMV’s.
Al lograr la filtración de las OMV’s encontradas en el
supernadante, se somete nuevamente a centrifugación este
líquido durante 3 horas y a 28000 rpm, esta se conoce como la
etapa de “ultracentrifugación” (su nombre hace alusión al uso
de la ultracentrífuga) , en la cual por la alta aceleración y
fuerza allí imprimida, provoca que las OMV’s queden en el
fondo del tubo y se separen de la fase líquida; para este caso
ya no es necesario realizar una filtración como en la precentrifugación, sino que tan sólo se descarta la fase líquida
inmediatamente después de que los tubos son extraídos de la
ultracentrífuga. En la figura 5 se puede apreciar un pellet
pequeño con característica fluorescente y que corresponde a
las vesículas precipitadas de la cepa de E.Coli transformada.
Una vez ha finalizado la ultracentrifugación, se procede a
resuspender las OMV’s obtenidas en un buffer óptimo y
generalmente se utiliza PBS, ya que confiere a las vesículas un
medio favorable para su almacenamiento, además de que se
Para realizar los posteriores ensayos de estabilidad de las
OMV’s, se toma un lote de 100 µL de estas vesículas
resuspendidas en PBS y se almacenan en el refrigerador a 4°C.
Por otra parte se toman 100µL de otro lote de OMV’s
resuspendidas en PBS y a estas se adicionan a su vez 100 µL
de glicerol al 50%, luego se almacenan en el congelador a una
temperatura de -20°C; este glicerol es agregado para impedir
que se formen cristales por el congelamiento que pueden
romper y afectar a las OMV’s.
La estabilidad de las OMV’s puede analizarse por medio de la
citometría de flujo, para ello se realizan tres ensayos a 15°C, a
4°C y a -20°C. Estos ensayos consisten básicamente en tomar
para cada temperatura 25 µL de OMV’s resuspendidas en PBS
almacenadas a 4°C y se diluyen en 25µL de PBS. Cabe aclarar
que se realiza el mismo procedimiento para las OMV’s
almacenadas a -20°C que se encuentran en PBS y glicerol. Al
final se obtienen un total de 6 tubos los cuales son analizados
gracias al citómetro de flujo “Accuraci C6 flow citometer” y
al software “BD Csampler”.
Para el primer grupo de muestras es decir las que estaban en
PBS, se obtuvo que la temperatura más estable para las
OMV’s es a temperatura ambiente es decir 15°C. En la figura
6 se pueden observar los diagramas obtenidos en la citometría
de flujo y se evidencia que en 50000 eventos analizados por el
canal 1 que refleja el color verde es decir, el FL1-H; el 8,8%
de los eventos fluoresce lo suficiente para ser detectado a
temperatura ambiente; por otro lado el 1,3% de los eventos
emite fluorescencia a 4 ºC y el 7,3% de ellos fluoresce a -20
ºC, por lo tanto la temperatura adecuada para el
almacenamiento resulta ser la ya nombrada con anterioridad.
Los diagramas que se evidencian inicialmente muestran el
tamaño de los eventos analizados, lo cual asegura que el
tamaño de la población es el esperado para las OMV’s.
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6
Curva de calibración método de Bradford
0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 y = 0.0002x + 0.0719
R² = 0.97366
0.05 0 0 200 400 600 800 1000 1200 Fig. 7 Curva de calibración de BSA
Posteriormente, se realizó la cuantificación de GFP junto con
la carga proteica encapsulada por las OMV´s y se determinó
con ayuda de la curva de calibración que su concentración es
de 98,83 µg/mL. A su vez, se realizó la cuantificación de
proteínas totales a las vesículas sin carga proteica de GFP es
decir, a las provenientes de la cepa hipervesiculate JC8031
obteniendo una concentración de 10,87 µg/mL, lo que podría
significar que 87,96 µg/mL corresponden solamente a GFP.
V. CONCLUSIONES
A. Las OMV’s provenientes de células de E. Coli JC8031pTRC-ssTorA::gfp son estables a 15ºC y en buffer PBS.
Fig. 6 Diagramas obtenidos en el clitómetro de flujo
Por otro lado, para la estimación de la cantidad de proteínas
totales presentes en las OMV´s se realizó el método de
Bradford como se describe detalladamente con anterioridad
utilizando una curva de BSA con un rango entre 0 hasta 1000
µg/mL. Las concentraciones de BSA y las absorbancias
registradas se presentan en la tabla 1.
Tabla 1. Curva de calibración de BSA junto con las absorbancias
correspondientes
Concentración
Absorbancia (A)
(µg/mL)
1000
0,278
500
0,209
125
0,097
31,25
0,075
7,8125
0,0755
0
0,062
Para utilizar la curva de calibración y realizar la debida
cuantificación de proteína, fue necesario revisar el coeficiente
de correlación R y observar el comportamiento de la
absorbancia a medida que incrementa la concentración; para
ello, se presenta la grafico de la curva de calibración (Figura
7) junto con los valores de la ecuación de la curva.
B. El precultivo y cultivo de las cepas de E. Coli JC8031 y E.
Coli JC8031-pTRC-ssTorA::gfp tienen mejores rendimientos
cuando son incubados a 30ºC.
C. Las OMV’s provenientes de E. Coli JC8031-pTRCssTorA::gfp son más fluorescentes cuando son protegidas de
la luz al ser cultivadas y almacenadas.
VI. RECOMENDACIONES
A. Se recomienda que los cultivos de las células de E. Coli
JC8031 y E. Coli
JC8031-pTRC-ssTorA::gfp sean
preinoculados y cultivados a 30ºC.
B. Para el análisis en el citometro de flujo de OMV’s
provenientes de E. Coli JC8031 y E. Coli JC8031-pTRCssTorA::gfp se recomienda realizar vortex durante 1 min
aproximadamente para evitar aglomerados en la medición.
VII. REFERENCIAS
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fluorescente (GFP) en la biología celular y en la visualización
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