LAS LEVADURAS DEL LAS LEVADURAS DEL TERROIR

Transcripción

LAS LEVADURAS DEL
TERROIR
Dra. Laura MERCADO
Laboratorio de MICROBIOLOGÍA
Centro de Estudios de Enología
Estación Experimental Agropecuaria Mendoza-INTA
INTRODUCCIÓN
Saccharomyces cerevisiae
INTRODUCCIÓN
LEVADURAS:
h
hongos
unicelulares
i l l
-
R i F
Reino
Fungii
Modelo de estudio
INTRODUCCIÓN
MODELO de estudio
LEVADURAS:
h
hongos
unicelulares
i l l
-
R i F
Reino
Fungii
Pi
Primer
eucariota
i
secuenciado
i d
BIOTECNOLOGÍA:
BIOTECNOLOGÍA
Producción alimentos y bebidas
VINO
INTRODUCCIÓN
VINO fermentación
VINO:
f
t ió mosto
t de
d uva
Fermentación
alcohólica
C6H12O6 → 2 CO2
+ 2 CH3CH2OH
Fermentación inoculada
Fermentación espontánea
NICHO ECOLÓGICO
Saccharomyces
INTRODUCCIÓN
Fermentación inoculada
Adición inóculo (LSA)
Fermentación espontánea
“Flora nativa”
Origen:
g
•
UVA
•
BODEGA
INTRODUCCIÓN
MENDOZA
Principal provincia productora de vid y vino
ECOSISTEMA
LEVADURAS
(biota)
Catania y col. (2007).
MALBEC
INTRODUCCIÓN
¿Interrogantes….?
Falta de información procesos microbiológicos:
•
¿Las fermentaciones vínicas son llevadas a cabo exclusivamente por
microorganismos
i
i
presentes
t en lla uva, o también
t bié contribuyen
t ib
microorganismos
i
i
presentes en las superficies del equipamiento de la bodega?,
•
¿
¿Existe
en la bodega
g una biota de levaduras residente q
que actúa como inóculo
de las fermentaciones, incluso en años sucesivos?,
•
Si se inoculan los mostos con levaduras comerciales ¿pueden éstas instalarse
en la bodega y participar en otras fermentaciones no inoculadas?
•Cuál es la biodiversidad de las levaduras de
una determinada región geográfica y cuál es
la relación con su origen geográfico?
•¿Existen levaduras propias de una zona
vitivinícola
iti i í l d
determinada
t
i d o Terroir?,
T
i?
•¿Pueden las levaduras comerciales
colonizar el viñedo y afectar la diversidad de
levaduras nativas?
OBJETIVO GENERAL
Conocer la diversidad poblacional de cepas de Saccharomyces cerevisiae
presentes en bodegas,
b d
uvas y vinos
i
d
de lla región
ió vitícola
ií l Z
Zona Al
Alta d
dell Rí
Río
Mendoza.
PARTE 1
Oi
Origen
de
d las
l levaduras
l
d
responsables
bl
de la fermentación espontánea de los
mostos.
PARTE 2
BIODIVERSIDAD DE Saccharomyces
cerevisiae NATIVAS EN LA REGIÓN
VITÍCOLA “Zona Alta del Río
Mendoza
Mendoza”
PARTE 1
Origen
g de las levaduras responsables
p
de la fermentación
espontánea de los mostos
HIPOTESIS
población de
levaduras
Saccharomyces
cerevisiae.
PERMANENCIA
PARTICIPACION
DE
FERMENTACIÓN
RELACIÓN
GENÉTICA
É
OBJETIVOS
-Conocer la distribución de cepas de
Saccharomyces cerevisiae sobre
equipamientos de una bodega
bodega.
- Determinar la contribución a la
fermentación espontánea de cepas de
S. cerevisiae aisladas desde
i
i t d
d
equipamientos
de una b
bodega
- Evaluar el grado de relación genética
entre las cepas de S. cerevisiae aisladas
desde equipamientos de bodega y
fermentación, y su relación a cultivos
comerciales.
PARTE 1
Origen de las levaduras responsables de la fermentación espontánea
de los mostos
MATERIALES Y MÉTODOS
MUESTRAS
AISLAMIENTO
EQUIPOS BODEGA
2 etapas
-AV
-DV
DV
AEM + RB
IDENTIFICACIÓN
y
Saccharomyces
cerevisiae
WL
SelMed
UVA
Arrivo
A
i a
bodega
Recuentos
Aislamientos
FERMENTACIÓN
Conservación
Fermentación
p
espontánea
3 etapas
CARACTERIZACIÓN
MOLECULAR
PCR interdelta
RFLP ADNmit
“CEPAS”
Patrones de PCR interdelta (arriba) y RFLP ADNmit (abajo) obtenidos para
S h
Saccharomyces
cerevisiae
i i aislados de equipos de bodega, viñedos y i l d d i d b d
iñ d fermentaciones espontáneas
PARTE 1
Origen de las levaduras responsables de la fermentación espontánea de los mostos
RESULTADOS
POBLACIONES TOTALES
-Equipos población levaduras
-Población residente
-Incremento durante vendimia
Equipamientos
q p
de
bodega
Lagar
Moledora
Caño de traslado
Caño de llenado
Tanque (interior)
Tanque
Número de levaduras totales (Log ufc/cm2 ± SD)
Temporada
p
2001
Temporada
p
2002
Antes de
Durante
Antes de
Durante
vendimia
vendimia
vendimia
vendimia
0.7 ± 0.1
2.7 ± 2.1
4.8 ± 3.9
nm
2.2 ± 1.6
2.1 ± 1.3
6.7 ± 5.7
4.7 ± 4.1
4.3 ± 3.7
3.7 ± 3.2
2.3 ± 1.3
4.2 ± 3.7
1.9 ± 1.0
2.0 ± 1.3
4.0 ± 3.9
1.7 ± 1.3
<1
<1
5.7 ± 5.1
4.4 ± 4.2
nm
nm
3.0 ± 2.9
5.1 ± 4.6
PARTE 1
Resultados
Patrón
Lagar
I02
II02
III02
IV02
V02
VI 02
VII 02
VIII02
XLII
XLIII
LII
LV
LVI
LXIV
LXV
LXVII
LXVIII
LXIX
LXX
LXXII
LXXIII
LXXIV
LXXV
LXXVI
LXXIX
LXXX
LXXXI
LXXII
LXXXIV
LXXXV
LXXXVI
LXXXVIII
LXXXIX
XCI
XCIII
XCVI
XCVIII
IX02
C
CI
CII
S. cerevisiae - diferenciación intraespecífica
ANTES VENDIMIA
Caño
Caño
Moledora
traslado
llenado A
18.75
Caño
llenado B
Lagar
42.8
8.33
8 33
8.33
20
12.5
20
DURANTE VENDIMIA
Tanque
Tanque
Moledora
interior
salidas
2002
Uva
Mosto
FERMENTACIÓN
Principio
Medio
7.14
21.4
5
55
5.5
5
14.3
12.5
7.14
5.5
14.3
5.5
11
Cepas perennes
5
10
5
5
33
7.7
15.4
20
7.14
7.14
7.14
Diferente diversidad en cada
equipo y etapa
5
5
7.7
7.7
7.7
Patrones únicos
8.33
8.33
23.1
5.5
7.7
7.7
7.7
7.7
Cepas comerciales20
(13)
20
11
7.7
15.4
Perfiles únicos*
7.7
23.1
coincidencias
8.33
5.5
5.5
5
7.7
5.5
67
Participación en fermentación
Final
20
15.4
10
5
5
5
5
10
5
INTRODUCCIÓN
•
microorganismos presentes en la uva, o también contribuyen microorganismos
presentes en las superficies del equipamiento de la bodega?
FERMENTACIONES ESPONTÁNEAS
Á
EN
NO hallaron cepas de uva
BODEGA:
(límites de muestreo y
Muy polimórficas
aislamiento)
sucesión
ió d
de dif
diferentes
t cepas S.
S cerevisiae.
i i
P
Pocos
30 % y 60% all fifinall d
de lla
patrones en más de una etapa de la fermentación.
fermentación: origen
incremento en la diversidad a lo largo del proceso
bodega
•
¿Existe en la bodega una biota de levaduras residente que
actúa como inóculo de las fermentaciones, incluso en años
sucesivos?
•
Si se inoculan los mostos con levaduras
comerciales ¿pueden éstas instalarse en
la bodega y participar en otras
fermentaciones no inoculadas?
INTRODUCCIÓN
•
•
¿Existe en la bodega una biota de levaduras residente que actúa como
inóculo de las fermentaciones, incluso en años sucesivos?
•Población de S. cerevisiae residentes
carácter dinámico: fluctuando año a año y a lo largo de la temporada
cepas estables
estables, a lo largo de la temporada y en años consecutivos
consecutivos.
30 - 60% cepas al final de la fermentación
• población de levaduras de bodega fue diversa y numéricamente
importante
p
: sólo algunas
g
de estas cepas
p p
participaron
p
en la
fermentación.
•
comerciales ¿pueden éstas instalarse en
INTRODUCCIÓN
•
•
¿Existe en la bodega una biota de levaduras residente que
actúa como inóculo de las fermentaciones, incluso en años
sucesivos?
i
?
•
comerciales
co
e c a es ¿puede
¿pueden és
éstas
as instalarse
s a a se e
en
Cepas comerciales:
•No parte de biota “perenne”
perenne
•Coincidencias cepas fermentación y bodega
PARTE 1
RESULTADOS
INTERROGANTE
• ¿la no-identidad significa
f
que son totalmente diferentes?
f
?
• ¿hay algún tipo de relación entre ellas?
• ¿Cuál
C ál es ell grado
d de
d relación
l ió con llas cepas comerciales
i l
que masivamente se han utilizado desde hace
aproximadamente
p
25 años en nuestra zona?
ESTUDIO DE RELACIONES MOLECULARES
ESTUDIO DE RELACIONES MOLECULARES
Diferente agrupamiento por
marcador
PCR
interdelta
Tres clusters fueron
conservados (cepas bodega)
SSR
RFLP ADNmit
cepas comerciales mayoría separó,
cierta relación cepas fermentación
PARTE 2 BIODIVERSIDAD DE Saccharomyces cerevisiae EN LA
REGIÓN VITÍCOLA “Zona Alta del Río Mendoza”
HIPOTESIS
POBLACIÓN de
S cerevisiae
S.
propia y
característica.
OBJETIVOS
-Caracterizar las poblaciones de S.
cerevisiae en los viñedos ubicados
en la región vitícola Zona Alta del Río
Mendoza (ZARM).
-Determinar la contribución de las
cepas de S. cerevisiae de viñedos a
PERMANENCIA
PARTICIPACION
DE
FERMENTACIÓN
RELACIÓN
GENÉTICA
É
la población levuriana responsable de
la fermentación espontánea de los
mostos
t en condiciones
di i
iindustriales.
d ti l
-Evaluar el grado de relación
genética entre estas poblaciones y
en relación con su origen geográfico.
PARTE 2
BIODIVERSIDAD DE Saccharomyces cerevisiae NATIVAS EN LA
REGIÓN VITÍCOLA “Zona Alta del Río Mendoza”
VIÑEDO
8 viñedos -6 Bodegas
Bodega N: viñedos NL y NP
C: viñedos CB y CR
T: viñedo T
S: viñedo S
I: viñedo ID
CZ: viñedo CZ
Panquehua
800
900
1000
Carrodilla
Maipú
p
CR
ID
T
FERMENTACIONES
INDUSTRIALES
Vistalba
NP
Perdriel
CB
s
Agrelo
Luján NL
Barrancas
PARTE 2
BIODIVERSIDAD DE S. cerevisiae NATIVAS EN LA REGIÓN VITÍCOLA “Zona
Alta del Río Mendoza”
VIÑEDO
10 sectores
autoenriquecimiento
aislamiento
FERMENTACIONES
INDUSTRIALES
1 tanque (cada
parcela)
3 etapas
Identificación
Caracterización
molecular
PARTE 2
RESULTADOS
ab
CB
b
CR
Viñedo
Nº levaduras uva de
cada viñedo fue muy
diferente
c
CZ
b
ID
b
NL
b
NP
a
S
c
T
POBLACIÓN
TOTAL DE
LEVADURAS
0
1
2
3
4
5
6
log ufc/mL
5
Log u
ufc/mL
distribución no
homogénea dentro
de los mismos
6
4
3
2
1
0
CB
CR
CZ
ID
NL
Viñedo
NP
S
T
PARTE 2
BIODIVERSIDAD DE S. cerevisiae EN LA REGIÓN VITÍCOLA “Zona Alta del Río
Mendoza”
RESULTADOS
12
11
10
9
nº pa
atrones
8
7
6
5
4
3
S cerevisiae
S.
2
1
1020 aislados
0
P
L
T
CB
CR
Caracterización:
DISTRIBUCIÓN NO HOMOGÉNEA:
-PCR Interdelta
-nº diferente cada sector,
-RFLP ADNmit
-1 a 12 patrones en cada sitio
CZ
S
ID
-4 viñedos no S. cerevisiae en algún punto
Patrón: combinación
patrones amplificación +
restricción
-DIFERENTE
DIFERENTE DIVERSIDAD:
DIVERSIDAD 9 h
hasta
t 36 patrones
t
dif
diferentes
t
por viñedo
DOS TIPOS: Alto / Bajo polimorfismo
PARTE 2
viñedoT
Sector del viñedo
RESULTADOS
S. cerevisiae
VIÑEDOS DE ALTO POLIMORFISMO
• 6 viñedos (CR, L, P, ID, CZ y T)
población muy variada: + 20 patrones.
•distintas poblaciones de S.
S cerevisiae
cada viñedo
• una distribución irregular
g
• Sitios + o - polimorficos
Algunos patrones más distribuidos
90 % patrones únicos: sólo presentes
en un único sector en toda la región
evaluada
Participación en fermentación
P t ó
Patrón
1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
75
25
2
3
4
7,14
7,14
7 14
7,14
14,3
7,14
7,14
7,14
25,3
7 14
7,14
7,14
14,3 7,14
7,14
7,14
7,14 14,3
21,43 8,3
21,43
21,43
8,3
8,3
83
8,3
16,6
8,3
16,6
5
6
7
8
9
75
25
50
37,5
NS1
37,5
12,5
50
12,5
12,5
25
25
12,5
12,5
12,5
33,3
66,7
7,14
10
PARTE 2
RESULTADOS
S. cerevisiae
VIÑEDOS DE BAJO POLIMORFISMO
Punto de muestreo en viñedo
Patrón1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
NS1
NS1
9
10
Viñedo S
•drástica
drástica disminución en la biodiversidad
→ 10 y 9 patrones
1
49,9
2
16,7
3
16,7
100
100
61,5
4
23,1
5
7,7
6
16,7
85,7
1
7,7
14,3
8
33 34
33,34
9
33,3
20
11
16,76
20
•Algunos patrones estuvieron muy distribuidos
•Presencia diferentes sectores
•Población única por sector
•presencia de cepas comerciales
Punto de muestreo en viñedo
Patrón
1
2
3
4
5
6
7
8
Viñedo CB
1
100
80
2
55,6
3
11,1
4
11,1
5
22,2
100
42,9
7
57,1
9
100
100
NS1
6
8
• próximos a bodega
16,76
NS
7
• sectores no aisló S.cerevisiae
60
NS1
1
20
100
PARTE 2
RESULTADOS
S. cerevisiae
VIÑEDOS
BAJO POLIMORFISMO
S
C
CB
Transferencia de cepas de
bodega a viñedos:
disminuyen la biodiversidad
Efluentes
Almacenamiento de orujos fuera de la
bodega
A
Agua
d
de riego
i
((acequias)
i )
Abono con orujos
Vectores: moscas - vientos
S
PARTE 2
RESULTADOS
Transferencia de cepas de
bodega a viñedos:
afecta la biodiversidad
S
C
CB
S
P bl ió propia
Población
i de
d región:
ió
Viñedos cercanos
NL
CZ
RESULTADOS
FERMENTACIONES
CO S
INDUSTRIALES
poblaciones diferentes en su mayoría
carácter altamente p
polimórfico y variable
Viñedo
NL
5 a 21 patrones en cada una de ellas.
En cada etapa: 1 a 13 patrones diferentes.
sustitución de poblaciones
dinámica diferente en cada fermentación
no predominios: fermentaciones múltiples
cepas
La participación de las cepas del viñedo:
escasa .
Presencia cepas comerciales: transferencia
bodega
S
Patrón
13
20
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35c
36
37
38
39
40
41
42
43
3
9b
10
11
12
P
M
F
5,9
5
9
33
33
33
11
22
11
11
11
34
20
60
20
71,4
14,3
14,3
17,5
11,75
11
75
5,9
5,9
5,9
5,9
5,9
11,75
5,9
5,9
5,9
,
5,9
37,5
12,5
12,5
25
12,5
Relaciones
moleculares
PARTE 2 BIODIVERSIDAD DE S. cerevisiae EN LA REGIÓN “Zona Alta del Río Mendoza”
RESULTADOS
PCR
interdelta
RELACIONES
MOLECULARES
Agrupan diferente de
acuerdo al marcador
RELACIONES
COMPLEJAS
RFLP
ADNmit
RESULTADOS
RELACIONES MOLECULARES
Agrupan diferente 1-4 clusters mantienen: =
sector o contiguo)
¾La mayor relación genética entre aislados de un
mismo sector o sectores contiguos de un mismo
viñedo.
Clusters viñedo/fermentación
Mayoría clusters combinados
Cepa de viñedo en fermentación: asocian a
viñedo o fermentación
Cepa comercial: separada /no
Se observó una estrecha relación molecular con
aisladas de viñedo y/o fermentación.
RESULTADOS
RELACIONES
MOLECULARES
POBLACIONES MUY RELACIONADAS
Población de
la ZARM
•Cuál
Cuál es la biodiversidad de las levaduras de una determinada región
geográfica y cuál es la relación con su origen geográfico?
Los viñedos de la ZARM presentaron diferentes poblaciones de S. cerevisiae,
tanto en número como en diversidad de patrones aislados, evidenciándose la
existencia de viñedos de alto y bajo polimorfismo
Dentro de un mismo viñedo se observó una distribución muy heterogénea de
l
levaduras
d
•¿Existen levaduras propias de una zona vitivinícola determinada o Terroir?,
No pudo
N
d evidenciarse
id
i
lla existencia
i t
i d
de cepas
distribuidas representativas de la región vitivinícola
estudiada
Sólo población común a nivel área más pequeña
Población de MUCHAS cepas diferentes
estrechamente relacionadas
¿Pueden las levaduras comerciales
colonizar el viñedo y afectar la diversidad de
levaduras nativas?
•Cuál es la biodiversidad de las levaduras de una determinada región
geográfica y cuál
c ál es la relación con ssu origen geográfico?
•¿Existen levaduras propias de una zona vitivinícola determinada o Terroir?,
•¿Pueden las levaduras comerciales colonizar el viñedo y afectar la diversidad
de levaduras nativas?
En general se evidenció una escasa presencia de
levaduras comerciales en los viñedos, las cuales
fueron más frecuentes en las fermentaciones
espontáneas conducidas en bodega.
Se evidenció una drástica disminución de la
diversidad de levaduras en viñedos ubicados muy
próximos a bodegas y una elevada y distribuida
presencia de cepas
p
p comerciales en los mismos.
CONCLUSIONES
Las superficies de la bodega
albergan una población de S. cerevisiae tanto antes del inicio
de las actividades de la temporada de vendimia como durante el
transcurso de la misma y en temporadas consecutivas.
muestra una amplia diversidad y un comportamiento dinámico.
estas levaduras de bodega participan en las fermentaciones,
siendo la contribución dependiente de las condiciones del mosto
CONCLUSIONES
Los viñedos de la ZARM
presentan una p
p
población de S. cerevisiae muyy p
polimórfica y
aleatoriamente distribuida dentro de cada viñedo.
Cada viñedo alberga una población de S. cerevisiae única, sin
una distribución
di t ib ió ubicua
bi
d
dentro
t d
de esta
t región
ió agroecológica.
ló i
Los viñedos muy próximos a bodegas presentan una reducción
en la diversidad de las cepas de S. cerevisiae encontradas y
presencia de levaduras comerciales.
CONCLUSIONES
Las fermentaciones espontáneas conducidas en bodega se
d
desarrollan
ll con un número
ú
variable
i bl d
de cepas y una di
dinámica
á i d
de
sustitución de las mismas a lo largo de todo el proceso.
Sól algunas
Sólo
l
cepas d
dell viñedo
iñ d participaron
ti i
d
dell proceso
fermentativo en diferentes proporciones.
Las poblaciones de S. cerevisiae presentes en cada viñedo
mostraron una estrecha relación genética.
Carrera de Doctorado en Ciencias Biológicas PROBIOL
Universidad Nacional de Cuyo 2009
Biodiversidad de Biodiversidad de Saccharomyces cerevisiae
Biodiversidad de Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae en viñedos y en viñedos y
bodegas de la región vitícola “Zona Alta del Río Mendoza”
Mendoza
Doctorando: Lic
Lic. Laura Analía Mercado
Director: Dra. Mariana Combina
Co
Director: Dr. Ricardo W. Masuelli
Co-Director:
[email protected]

LAS LEVADURAS DEL LAS LEVADURAS DEL TERROIR

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