Servicios microbiológicos especializados en la industria del vino

Servicios microbiológicos
especializados en la industria del
vino
Laboratorio de Microbiología Enológica
EEA Mendoza - INTA
Equipo Microbiología Enológica
Dra. Mariana Combina (Responsable)
Dra. Laura Mercado
Dr. Iván Ciklic
Microbiol María Elena Sturm
Microbiol. María Cecilia Rojo
Brom. Paola Falconi
Tec. Enol. Vanesa García
Lic. Brom. Adriana Soria
OPORTUNIDADES
VINO
Topografía
Clima
Uva variedad
Manejo viñedo
Suelo
Tecnología de
bodega
Elaboración
Levaduras
AHORA
ANTES
Control
Calidad
Higiene
Tecnología
Transformación microbiológica
Levaduras
Bacterias lácticas
microorganismo benéfico
microorganismo alterador
Estabilidad
Química
Análisis microbiológico
Microbiológica
Elevado etanol
Bajo pH
Presencia de SO2
Escasa fuente de carbono
Grupos microbianos más importantes botella
Bacterias mesófilas aerobias
Hongos y levaduras
Bacterias lácticas
Bacterias acéticas
Levaduras: distintas especies importancia
de algunas no-Saccharomyces
Bacterias: elección de medios
Métodos específicos para vinos
Interpretación del resultado
Levaduras
Oxidativas
Velo
Reducen el etanol, acético, oxidaciones
Acetato de etilo, pérdidas de aromas
Pichia membranifaciens, Candida vini
Candida krusei
Apiculadas
Acido acético, acetato de etilo, acetaldehido
Kloeckera apiculata (maceraciones frío)
Refermentaciones
Saccharomyces cerevisiae
Zygosaccharomyces bailli
Schizosaccharomyces spp
Saccharomycodes spp
(Gas, turbidez)
(Gas, turbidez)
(sedimento botella)
(flóculos, turbidez, gas)
Bacterias lácticas
Picado láctico
Fermentación láctica
Piridinas
(aa lisina y
ornitina)
glicerol
homo
Ac.láctico
acroleína
Olor Ratón
reptrogusto
Amargo +
fenoles
Fructosa
Fermentación manítica
(agridulce)
Polisacáridos
extracelulares
Aceite
BAL
hetero
láctico, acético
glicerol, etanol
diacetilo
Acidez volátil
Gas
Turbidez
Lactobacillus spp
Oenococcus oeni
Pediococcus spp
Bacterias acéticas
Gluconobacter
Acetobacter
Metabolismo oxidativo del etanol (acético, éster de
acetato y acetaldehído – acetoína por oxidación de
láctico)
Oxígeno
Higiene
prevención embotellado
fermentaciones detenidas
Barricas mermas
Corchos defectuosos
Control de Brettanomyces
Uva
Cepajes
Madurez
Sol
Lugar-año
Maceración
Medicinal
Clavel
Clavo de olor
Estables
Vinos
Conservación
Brettanomyces
No compite con Saccharomyces
FA-FML
Inicios de fermentación lentos (acético)
Finales lentos
aireación
Espera de FML retardada (bajo S02, alta T°C)
Conservación
Barricas contaminadas
Oxígeno –Micro-oxigenación
Barrica de 225 L
absorbe 5-6 L de vino
Brett
Normal  1-10 cel/mL
Vino
Aumento  102-103 cel/ml
Defecto
Cepa de levadura
sustrato
Oxígeno-autólisis
FOH lenta
VBNC
Monitorear
Alarma
Vino seguro
<1%
Calidad de Levaduras Secas Activas
Los límites microbiológicos tolerados para LSA son:
Hongos filamentosos
Bacterias mesófilas aerobias
Levaduras tipo Saccharomyces
Levaduras no-Saccharomyces
<103 ufc/g
< 105 ufc/g
≥ 109 ufc/g
< 0.01 % (1 no-Sacc cada 10.000 Sacc)
Actividad fermentativa o Clinitest:
Se define como el tiempo en el que 5 g de LSA degradan 5 g de sacarosa
en condiciones controladas.
Caracterización enológica de levaduras
Etanol
Acido acético
Aromas
Glicerol
Saccharomyces cerevisiae
Toxina killer
Enzimas
Ésteres
Paramétros tecnológicos
•Velocidad, pureza y poder fermentativo (parámetros medibles)
•Capacidad para fermentar en altas concentraciones de azúcares
•Resistencia al SO2 y etanol
•Tolerancia a bajas temperaturas
•Baja producción de espuma
•Carácter killer
Parámetros de calidad
• Baja producción de acidez volátil
• Baja producción de SH2
• Bajos requerimientos de nitrógeno
• Actividad  glicosidadas y esterasa
Pérdida de peso (g)
Caracterización enológica
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Ma S - 1C
Ma B-2C
ULA-16
INTA Mza
VL3
0
5
10
15
20
Tiem po (días)
25
30
35
PARAMETROS MEDIBLES
Velocidad de fermentación: calculada como la cantidad de CO2 producida
después de 3 días de fermentación (CO2/d). Se consideraran tres días
durante la fase exponencial.
Eficiencia de fermentación o rendimiento: calculada como los gramos de
azúcar necesarios para producir 1 grado alcohólico
Pureza fermentativa: indica la cantidad de acidez volátil producida en
relación al etanol producido (g AV/L%de etanol v/v)
Vigor fermentativo: la máxima cantidad de etanol producido en condiciones
de exceso de azucares (300mg/L)
Producción de SH2
-
+/-
+
++
++
+++
Carácter killer
Identificación de levaduras
Taxonomía clásica
Perfil metabólico
Taxonomía molecular
Caracterización de la levadura
Donde crece?
A expensas de que?
RFLP 5.8S-ITS
Secuenciación de gen
ribosomal 26S
ETS NTS
NTS ETS
5.8S
18S
26S
ITS1 ITS2
RFPL 5.8S-ITS
S38
M S38 S40 S41 S42 S43 S44 S45
S40
S41
S42
M I II III I II III M I II III I II III I
1500 pb
800 pb
600 pb
500 pb
400 pb
300 pb
2072 pb
800 pb
600 pb
500 pb
400 pb
300 pb
200 pb
200 pb
100 pb
100 pb
Código
S38
S40
S41
S42
S43
S44
S45
Especies
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Ap (pb)a
5.8- ITS
850
850
850
850
850
850
850
Longitud de los Fragmentos luego
de la Restricción con:
Hae III
Hpa II
ScrF I
325+230+170+ 125
325+230+170+ 125
325+230+170+ 125
325+230+170+ 125
325+230+170+ 125
325+230+170+ 125
325+230+170+ 125
725+125
725+125
725+125
725+125
725+125
725+125
725+125
400+320+120
400+320+120
400+320+120
400+320+120
400+320+120
400+320+120
400+320+120
S43
S44
II III I II III
Secuenciación
Amplificación del 26S
Comparación de secuencia con base de datos (BLAST)
S. cerevisiae: Diferenciación a nivel de cepa
Control LSA
Procesos de selección (cepas duplicadas)
Origen de cepa
Control de implantación
Otros…
Amplificación de Secuencias interdelta
Sec delta: 100 copias – nº y localización variabilidad
ADN total
PCR
Primers delta
Electroforesis
gel agarosa
i
Fermentación 1
Fermentación 2
Análisis de restricción del ADNmitocondrial
ADN mit molec 65-80 kb muy polimórfica
Técnica simple, rápida
ADN total
Digestión
enzimas de
restricción
Electroforesis
gel agarosa
Control de implantación de microvinificaciones
Futuro
Citometría de flujo
PCR tiempo real
VBNC
Fermentaciones
detenidas
VBNC
Reducción tiempos
Conocer
Controlar
Prevenir
Muchas gracias!!!
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