For Reference Use Only - Bio-Rad

Transcripción

[UK]
823360/05 – 04/2008
microtest-cell plate
[COMP] complement
Intended Use
The microtest cell plate [MZP] Lymphoscreen ABC 60 is used for screening and
differentiation of complement-dependent cytotoxic HLA-ABC antibodies (1,5).
Each [MZP] contains a panel of deep-frozen HLA-ABC typed lymphocytes (6).
Summary and Explanation
Cytotoxic HLA-ABC antibodies can be formed after blood transfusions, after
organ transplantations and during pregnancy (2,3,4). Using Lymphoscreen ABC
60, sera from pregnant women, from transfused or transplanted patients can be
screened rapidly. The determination of cytotoxic HLA-ABC antibodies against a
panel of HLA typed lymphocytes is a method which can be carried out in any
HLA laboratory.
Principle of the Microlymphocytotoxicity Test
Lymphocytes with known antigens are incubated with an unknown serum and
rabbit complement.
If the corresponding antigens are present, the addition of the serum result in the
presence of complement in lysis of the lymphocytes. This is rendered visible by
staining (e.g. Eosin Y). The lysed and vital lymphocytes are assessed using an
inverted phase contrast microscope.
Reagent Description
In Lymphoscreen ABC 60, peripheral blood lymphocytes from various, healthy
blood donors with defined HLA antigens are deep-frozen in a microtest plate
[MZP]. The membrane of the frozen lymphocytes is stabilized using DMSO
(dimethyl sulphoxide). To perform the microlymphocytotoxicity test, Lymphoscreen ABC 60 is thawed at room temperature. The DMSO is removed using a
washing medium, as it is highly cytotoxic at room temperature.
One package of Lymphoscreen ABC 60 consists of 6 [MZP]. Each [MZP]
contains a deep-frozen panel of 56 HLA-ABC typed lymphocytes for screening of
one sample and 2 lymphocyte pools (each 2 wells) provided for positive and
negative double controls. The control positions are marked on the plate. Each
well of the plate contains 2 μl of lymphocyte suspension in 13 µl freezing
medium. The cell count is approx. 7000 lymphocytes per well.
Washing Procedure
1. Washing procedure by using of absorbent cellulose:
- Allow the Lymphoscreen ABC 60 to thaw briefly at room temperature
(18...22°C).
Note:
Ice should still be visible in the wells!
Do not thaw more than 2 [MZP] at once!
- Pipette 20μl washing medium immediately into each well, using the Terasaki
dispenser.
- Allow the [MZP] to stand for 15 minutes at room temperature (18...22°C).
- Using the absorbent cellulose, soak up the washing medium from one corner
of the [MZP]. With a second piece of cellulose remove the remaining washing
medium row by row.
Care: If the washing medium is not completely removed weakened reactions
may occur owing to dilution of the sera being tested.
- Cover the Lymphoscreen ABC 60 with cover oil (approx. 5 µl per well).
or alternatively
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ce
Statement of Precautions
[IVD] For in Vitro Diagnostic Use
The test must be performed by well-trained and authorised laboratory technicians.
All materials of human origin used in this product have been tested and found to
be non-reactive for HBsAg, anti-HCV and anti-HIV-1/2 using FDA licensed test
kits. However, all products of human origin should be considered to be potential
transmitters of hepatitis, HIV or other infectious agents. Appropriate safety
measures are recommended.
Preparation of the Reagents
- Prepare the washing medium: 10% (V/V) FCS in Lymphostabil.
- Reconstitute the control HLA (pos.) in the volume of distilled water as stated on
the label = positive control.
- Reconstitute the control HLA (neg.) in the volume of distilled water as stated
on the label = negative control.
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[MZP]
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823 300
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[REF] 7
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For the detection of HLA-ABC antibodies
Additional Materials Required
1. * Lymphostabil (McCoy's medium 5A modified according to Park and
Terasaki, Ca++ and Mg++ free)
2. Fetal calf serum (FCS), heat-inactivated, e.g. Sigma
3. * Control HLA (pos)
4. * Control HLA (neg)
5. Eosin Y (dissolved 5% in distilled water and filtered), e.g. Merck
6. Formaldehyde for histology, 37%, acid-free (filtered and adjusted to pH 7.2 ±
0.2 with 0.1 N sodium hydroxide solution), e.g. Merck
7. * Cover oil
8. Absorbent cellulose
9. * Cover slips 50x75 mm
10. Microlitre syringe, e.g. Hamilton no. 710 (0.100 ml syringe)
11. Volume dispenser, e.g. Hamilton PB 600-1
12. Terasaki dispenser, e.g. Hamilton no. 1725 (6 x 0.250 ml syringes)
13. Microdispenser for microtest plates, e.g. Greiner
14. Inverted phase contrast microscope
only for alternative washing procedure with microplate centrifuge
15. Microplate centrifuge
16. 6-channel aspiration head, e.g. Greiner
17. Water-jet pump
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Biotest Lymphoscreen ABC 60
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Storage
Lymphoscreen ABC 60 is stable up to the date stated on its label.
Lymphoscreen ABC 60 must be stored at -70° C or below. The packages, which
are delivered in dry ice, must be transferred immediately into storage at -70°C.
Opened Lymphoscreen ABC 60 packages must not be stored together with dry
ice.
Indication of Deterioration
If the negative control shows over 10% lysed lymphocytes and the background
toxicity is >10%, the test should be repeated.
If the positive control shows less than 80% lysed lymphocytes, the test must be
repeated.
Specimen Collection and Preparation
Obtain the serum sample from:
- approx. 3 ml native blood or
- approx. 3 ml heparinised blood ( convert plasma to serum by adding
thrombin) or
- approx. 3 ml EDTA or ACD blood (convert plasma to serum by adding
calcium chloride)
The serum sample should either be used fresh or stored frozen at -20°C or
below.
Procedure
Materials Provided
Lymphoscreen ABC 60 (1 microtest plate [MZP] for 1 sample)
lyophilised rabbit complement [COMP] (3x1 ml are added to each package)
worksheet (6 are added to each package)
2. Washing procedure by using of microplate centrifuge:
- Allow the Lymphoscreen ABC 60 to thaw briefly at room temperature
(18...22°C).
Note:
Ice should still be visible in the wells!
Do not thaw more than 2 [MZP] at once!
- Pipette 20μl washing medium immediately into each well, using the Terasaki
dispenser.
- Centrifuge [MZP] immediately at 1000 x g for 30 seconds (without braking).
- Carefully aspirate off the washing medium using the 6-channel aspiration head
attached to the water-jet pump.
Warning: Place manifold tips at the edge of the wells, so that only the washing
medium is aspirated off, and not the sedimented cells.
- Cover Lymphoscreen ABC 60 with cover oil (approx. 5 µl per well).
Lymphoscreen ABC 60 is now ready to be used for the microlymphocytotoxicity
test.
Microlymphocytotoxicity Test Procedure
- Pipette 2μl of the negative control into each of the wells 1A and 1B.
- Pipette 2μl of the positive control into each of the wells 10A and 10B. The
control positions are marked on each [MZP].
- Pipette 2μl of the serum sample into each of the remaining wells (1C up to
10C).
- Incubate for 30 minutes at room temperature (18...22°C).
- Reconstitute the complement [COMP]15 minutes before the incubation period
is over in the volume of distilled water as stated on the label, under gentle
swirling. DO NOT REFREEZE! DISCARD ANY RESIDUAL COMPLEMENT!
- Add 5-6μl complement [COMP] per well and incubate for 60 minutes at room
temperature (18...22°C).
- Stain the cells for approx. 3 minutes with 3-4 μl of 5% Eosin Y per well.
- Fix the reactions by adding of 6-7 µl of buffered formaldehyde per well.
- If necessary, oil should be added to the microtest plates.
- Cover the completed plate with a cover slip and read the results at least 30
minutes after completion of the test. If stored at 2...8°C evaluation will still be
possible for up to 3 days. Read the tray in the following serpentine pattern
which corresponds to the worksheet. 1A through 1F; 2F through 2A; 3A
through 3F; etc.
Quality Control
The negative controls are in positions 1A and 1B and are used to test the viability
of the lymphocytes. The viability should be higher than 90%.
The positive controls are in position 10A and 10B and are used to check the
complement activity. The positive control should yield more than 80% lysed
lymphocytes.
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available from Biotest
FOR REFERENCE USE ONLY: DO NOT USE in place
of package inserts provided with each product.
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Limitations
If the negative control shows over 10% lysed lymphocytes and the background
toxicity is >10%, the test should be repeated. Possible reasons are:
1. Lymphoscreen ABC 60 was exposed to room temperature too long during
unpacking.
2. Lymphoscreen ABC 60 was stored at a temperature less than -70°C.
3. Lymphoscreen ABC 60 was completely thawed before adding the washing
medium.
If the positive control shows less than 80% lysed lymphocytes, the test must be
repeated.
Possible reasons are:
1. Complement activity inadequate.
2. Dilution of the antibody in question through inadequate removal of the
washing medium.
3. Opened packages or individual [MZP] have been stored together with dry
ice.
The guidelines of ASHI (American Society for Histocompatibility and
Immunogenetics) and EFI (European Federation of Immunogenetics) do not
stipulate which HLA anigens should be represented on a panel used for HLA
antibody screening. Therefore based on the donors available at the time, we
select those that will give us the most complete representation of the known HLA
antigens.
The phenotype frequencies for HLA-ABC will vary among different populations.
The represented antigens in Lymphoscreen ABC may be different to the
incidence of antigens in the population being tested. In Lymphoscreen ABC 60
mainly cells of Caucasian source are used.
The test should only be used for initial HLA antibody determination. Other clinical
and diagnostic findings should be used in addition when determining suitability
for transplant.
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Results
The reactions are read under an inverted phase contrast microscope. Viable
lymphocytes are bright and shining (= negative reaction); lysed lymphocytes are
dark and larger (= positive reaction). The percentage of lysed lymphocytes in the
total lymphocyte count is expressed as score values.
% lysed cells
evaluation
0 10%
=
score 1
negative
11 20%
=
score 2
doubtful negative
21 50%
=
score 4
weakly positive
51 80%
=
score 6
positive
81 100%
=
score 8
strongly positive
score 0
unreadable
The reactions read off must be entered in the appropriate column of the
worksheet. The antigens of the positively reacting cells can be marked in the
antigen table with a coloured marking pen. By selection of the antigens which are
completely marked, the HLA specificity of the antibody is defined.
If the specificity cannot be determined, the total of the positive reactions is
expressed as a percentage of the size of the panel (% PRA = % Panel Reactive
Antibodies).
Number of positive reactions
%PRA = ----------------------------------------- x 100
Number of cells in the panel
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Specific Performance Characteristics
Lymphoscreen ABC 60 for screening and differentiation of complementdependent cytotoxic HLA-ABC antibodies is preparaed using lymphocytes from
donors whose cells have been tested with appropriate antisera and shown to
possess or lack the antigens listed on the accompanying worksheet.
Each lot is tested with at least 10 wellknown selected anti-HLA-ABC test sera,
whereby the proportion of 10% false positive and 5% false negative reactions
must not be exceeded. On testing with a negative control serum, the viability of
the lymphocytes must be at least 90%. On testing with a positive control serum,
at least 90% of the cells in each well must be lysed.
Comparison data of Lymphoscreen ABC 60 and cell panel trays produced under
guidelines and regulations of ASHI:
78/ 101 were non-reactive for both assays
22/ 101 were positive in both assays
1/ 101 were positive only in Lymphoscreen ABC 60
References
1. Ruder, H., Opelz, G., Lenhard, V., Schäfer, A., Daniel, V.: A Rapid
Screening Technique for Lymphocytotoxic Antibodies Using Tray-Frozen
Lymphocytes. Cryobiology 21:480-485, 1984.
2. Groth, J., Leverenz, S., Schönemann, C., Kaden, J., May, G., Strobelt, V.,
Schirmer, R.: Donorreaktive und panelreaktive Antikörper bei Nierentransplantatempfängern - Ursachen und Einfluß auf das Transplantatschicksal.
Transplantationsmedizin 7:80-86, 1995.
3. Mueller-Eckhardt, G.: Serologischer Nachweis von HLA-Antigenen und
HLA-Antikörpern. Infusionsther. Transfusionsmed. 21:192-197, 1994.
4. Waßmuth,R.: Immungenetik, in: Medizinische Immunologie, ed. Baenkler
H.W., Ecomed Verlagsgesellschaft Landsberg/Lech, 1995
5. Middleton, D., Bodmer, J., Heyes, J., Marsh, S.:HLA typing reagents:
alloantisera and monoclonal antibodies, in: Histocompatibility Testing - A
Practical Approach, eds. P. Dyer, D. Middleton, Oxford University Press,
1992.
6. Bodmer, J.G., Marsh, S.G.E., Albert, E.D., Bodmer, W.F., Bontrop, R.E.,
Charron, D., Dupont, B., Erlich, H.A., Fauchet, R., Mach, B., Mayr, W.R.,
Parham, P., Sasazuki, T., Schreuder, G.M.Th., Strominger, J.L.,
Svejgaard, A., Terasaki, P.I.: Nomenclature for factors of the HLA system,
1996. Tissue Antigens 49: 297-321, 1997
7. DIN EN ISO 980 Graphic symbols for use in the labelling of medical
devices.
B
Biotest
M Biotest,
Industriestr. 1, D-63303 Dreieich,
Germany Tel.: +49-6103-801-0, Fax: +49-6103-801-140
www.biotest.de, [email protected]
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[DE]
823360/05 – 04/2008
Verwendungszweck
Die [MZP] Lymphoscreen ABC 60 wird zum Screening und zur Differenzierung
von komplementabhängigen, zytotoxischen HLA-ABC-Antikörpern eingesetzt
(1,5). Jede [MZP] enthält ein Panel tiefgefrorener, HLA-ABC-typisierter Lymphozyten (6).
Einleitung
Zytotoxische HLA-Antikörper können nach Bluttransfusionen, nach
Organtransplantationen und während einer Schwangerschaft entstehen
(2,3,4). Mit Hilfe von Lymphoscreen ABC 60 ist ein schnelles Screening von
Seren schwangerer Frauen, von transfundierten oder transplantierten Patienten möglich. Die Bestimmung von zytotoxischen HLA-ABC-Antikörpern
gegen ein Panel HLA-typisierter Lymphozyten ist eine Methode, die in jedem
HLA-Labor durchgeführt werden kann.
Prinzip des Mikrolymphozytotoxizitätstests
Lymphozyten mit bekannten HLA-Antigenen werden mit einem Serum
unbekannter HLA-Spezifität und Komplement vom Kaninchen inkubiert. Im Falle
der Anwesenheit des korrespondierenden Antigens führt die Zugabe des Serums
in Gegenwart von Komplement zur Lyse der Lymphozyten. Diese wird mit einem
Farbstoff (z.B.Eosin Y) sichtbar gemacht. Die Beurteilung der lysierten und
vitalen Lymphozyten erfolgt mit einem inversen Phasenkontrastmikroskop.
Waschvorgang
1. Waschvorgang unter Verwendung von saugfähigem Zellstoff
- Lymphoscreen ABC 60 bei Raumtemperatur (18...22°C) kurz antauen lassen.
Achtung: Eis sollte in den Kavitäten noch zu sehen sein!
Nicht mehr als 2 [MZP] auf einmal auftauen!
- 20 μl Waschmedium mit dem Terasaki-Dispenser zügig in jede Kavität
pipettieren.
- Die [MZP] 15 Minuten bei Raumtemperatur (18...22°C) stehen lassen.
- Mit saugfähigem Zellstoff das Waschmedium von einer Ecke der [MZP]
absaugen. Mit einem zweiten Tupfer das restliche Waschmedium Reihe für
Reihe durch Abtupfen entfernen.
Achtung: Falls das Waschmedium nicht komplett entfernt wird, können abgeschwächte Reaktionen durch Verdünnung der zu testenden Seren auftreten.
- Lymphoscreen ABC 60 mit Decköl beschichten (ca. 5 µl pro Kavität).
oder alternativ
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Produktbeschreibung
In Lymphoscreen ABC 60 sind periphere Lymphozyten von verschiedenen, gesunden Blutspendern mit definierten HLA-Antigenen in einer [MZP] tiefgefroren.
Die Membran der gefrorenen Lymphozyten ist mit DMSO (Dimethylsulfoxid)
stabilisiert. Für die Durchführung des Mikrolymphozytotoxizitätstests wird
Lymphoscreen ABC 60 bei Raumtemperatur aufgetaut. DMSO wird mit einem
Waschmedium entfernt, da es bei Raumtemperatur stark zytotoxisch wirkt.
Eine Packung Lymphoscreen ABC 60 beinhaltet 6 [MZP]. Jede [MZP] enthält
ein Panel von 56 tiefgefrorenen, HLA-typisierten Lymphozyten für das Screening
eines Probanden und 2 Lymphozytenpools ( je 2 Kavitäten), die für positive und
negative Doppelkontrollen vorgesehen sind. Die Positionen der Kontrollen sind
auf jeder [MTP] farblich markiert. Jede Kavität enthält 2 μl Lymphozytensuspension in 13 µl Einfriermedium. Die Zellzahl beträgt ca. 7000 Lymphozyten pro
Kavität.
Vorbereitung der Reagenzien
Waschmedium herstellen: 10% (V/V) FCS in Lymphostabil.
Kontroll-HLA (pos.) in dem auf dem Etikett angegebenen Volumen
destillierten Wassers rekonstituieren = Positivkontrolle.
Kontroll-HLA (neg.) in dem auf dem Etikett angegebenen Volumen
destillierten Wassers rekonstituieren = Negativkontrolle.
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[COMP] Komplement
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[MZP] Mikrotest-Zellplatte
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[REF] 7 823 300
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Zum Nachweis von HLA-ABC-Antikörpern
Zusätzlich erforderliches Material
1. * Lymphostabil (McCoy's Medium 5A, modifiziert nach Park und Terasaki,
Ca++- und Mg++-frei)
2. Fetales Kälberserum (FCS), hitzeinaktiviert, z.B. Fa. Sigma
3. * Kontroll-HLA (pos.)
4. * Kontroll-HLA (neg.)
5. Eosin Y (5%ig in Aqua dest. lösen und filtrieren), z.B. Fa. Merck
6. Formaldehyd für die Histologie, 37%ig, säurefrei (filtrieren und pH 7,2 ± 0,2
mit 0,1 N Natronlauge einstellen), z.B. Fa. Merck
7. * Decköl
8. Saugfähiger Zellstoff
9. * Deckgläser 50 x 75 mm
10. Mikroliterspritzen, z.B. Fa. Hamilton Nr. 710 (0,100 ml Spritze)
11. Dosiervorrichtung, z.B. Fa. Hamilton PB 600-1
12. Terasaki-Dispenser, z.B. Fa. Hamilton Nr. 1725 (6 x 0,250 ml Spritzen)
13. Mikrodispenser für Mikrotestplatten, z.B. Fa. Greiner
14. Inverses Phasenkontrastmikroskop
nur für alternativen Waschvorgang mit Plattenzentrifuge
15. Mikrotestplattenzentrifuge
16. 6-fach Absaugkopf, z.B. Fa. Greiner
17. Wasserstrahlpumpe
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Vorsichtsmaßnahmen
Reagenz nur zur in-vitro-Diagnostik [IVD]
Der Test ist nur von geschultem und autorisiertem Fachpersonal durchzuführen.
Alle für dieses Produkt verwendeten Materialien humanen Ursprungs wurden mit
FDA-lizenzierten Testkits auf HBsAg, Anti-HCV und Anti-HIV-1/-2 geprüft und
erwiesen sich als nicht reaktiv. Jedoch sollten alle Produkte humanen Ursprungs
als potentielle Überträger von Hepatitis, HIV oder anderen infektiösen
Krankheitserregern betrachtet werden. Angemessene Sicherheitsvorkehrungen
werden empfohlen.
Lagerung
Lymphoscreen ABC 60 ist bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Datum
haltbar.
Lymphoscreen ABC 60 muß bei -70°C oder kälter gelagert werden. Die in
Trockeneis angelieferten Packungen sollten unmittelbar in die -70°C Lagerung
überführt werden. Geöffnete Lymphoscreen ABC 60 Packungen dürfen nicht
zusammen mit Trockeneis gelagert werden.
Warnhinweis
Zeigt die Negativkontrolle mehr als 10 % lysierte Lymphozyten und ist die
Grundtoxizität >10 % sollte die Testung wiederholt werden.
Zeigt die Positivkontrolle weniger als 80 % lysierte Lymphozyten muß der Test
wiederholt werden.
Probenvorbereitung
Gewinnung des Probandenserums aus:
- ca. 3 ml Nativblut oder
- ca. 3 ml Heparinblut (Plasma durch Thrombinzugabe in Serum überführen) oder
- ca. 3 ml EDTA- oder ACD-Blut (Plasma durch Zugabe von Calciumchlorid
in Serum überführen)
Das Probandenserum sollte entweder frisch eingesetzt oder bei mindestens
-20°C gelagert werden.
Methode
vorhandenes Material
Lymphoscreen ABC 60 (1 [MZP] für 1 Probe)
Lyophilisiertes [COMP] vom Kaninchen (3x1 ml sind je Packung beigelegt)
Worksheets (6 Stück sind je Packung beigelegt)
2. Waschvorgang mit einer Plattenzentrifuge
- Lymphoscreen ABC 60 bei Raumtemperatur (18...22°C) kurz antauen lassen.
Achtung: Eis sollte in den Kavitäten noch zu sehen sein!
Nicht mehr als 2 [MZP] auf einmal auftauen!
- 20 μl Waschmedium mit dem Terasaki-Dispenser zügig in jede Kavität
pipettieren.
- [MZP] sofort bei 1000 x g für 30 Sekunden zentrifugieren (ohne Bremse).
- Waschmedium mit 6fach Absaugkopf über Wasserstrahlpumpe vorsichtig
absaugen.
Achtung: Absaugkopf am Rand der Vertiefung ansetzen, damit nur das
Medium und nicht die sedimentierten Zellen abgesaugt werden.
- Lymphoscreen ABC 60 mit Decköl beschichten (ca. 5 µl pro Kavität).
Lymphoscreen ABC 60 ist jetzt für den Mikrolymphozytotoxizitätstest
gebrauchsfertig.
Mikrolymphozytotoxizitätstest
- Je 2 μl der Negativkontrolle in die Kavitäten 1A und 1B pipettieren.
- Je 2 μl der Positivkontrolle in die Kavitäten 10A und 10B pipettieren. Die Kontrollpositionen sind auf der [MZP] markiert.
- Je 2 μl des Probandenserums in die restlichen Kavitäten (1C bis 10C) pipettieren.
- 30 Minuten bei Raumtemperatur (18...22°C) inkubieren.
- [COMP] 15 Minuten vor Ablauf der Inkubationszeit mit dem auf dem Etikett angegebenen Volumen destillierten Wassers unter leichtem Schwenken rekonstituieren. NICHT WIEDER EINFRIEREN! KOMPLEMENTREST VERWERFEN!
- 5-6 μl [COMP] je Kavität zugeben und 60 Minuten bei Raumtemperatur
(18...22°C) inkubieren.
- Mit 3-4 μl 5%iges Eosin Y je Kavität die Zellen ca. 3 Minuten anfärben.
- Mit 6-7 μl gepufferter Formaldehydlösung je Kavität die Reaktionen fixieren.
- Bei Bedarf die Platten zusätzlich ölen.
- Die fertige Platte mit einem Deckglas abdecken und frühestens 30 Minuten
nach Beendigung des Tests ablesen. Bei Aufbewahrung bei 2..8°C ist eine
Beurteilung noch bis zu 3 Tagen möglich. Das Ablesen erfolgt entsprechend
der beigelegten Worksheets mäanderförmig; von 1A nach 1F, von 2F nach
2A, von 3A nach 3F usw.
Qualitätskontrolle
Die Negativkontrolle befindet sich in den Positionen 1A und 1B und überprüft die
Vitalität der Lymphozyten. Die Vitalität sollte mehr als 90 % betragen.
Die Positivkontrolle befindet sich in den Positionen 10A und 10B und überprüft die
Komplementaktivität. Die Positivkontrolle sollte mehr als 80 % lysierte
Lymphozyten enthalten.
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von Biotest lieferbar
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Fehlerquellen
Zeigt die Negativkontrolle mehr als 10 % lysierte Lymphozyten und ist die
Grundtoxizität >10 % sollte die Testung wiederholt werden. Mögliche Ursachen
können sein:
1. Lymphoscreen ABC 60 wurde beim Umpacken zu lange der
Raumtemperatur ausgesetzt.
2. Lymphoscreen ABC 60 wurde wärmer als bei -70°C gelagert.
3. Lymphscreen ABC 60 war völlig aufgetaut, bevor das Waschmedium
zugegeben wurde.
Zeigt die Positivkontrolle weniger als 80 % lysierte Lymphozyten muß der Test
wiederholt werden.
Mögliche Ursachen können sein:
1. Komplementaktivität nicht ausreichend.
2. Verdünnung des nachzuweisenden Antikörpers durch unzureichende
Entfernung des Waschmediums.
3. Geöffnete Packungen oder einzelne [MZP] wurden gemeinsam mit
Trockeneis gelagert.
Weder in den ASHI (American Society for Histocompatibility and Immunogenetics)- noch in den EFI (European Federation of Immunogenetics)Richtlinien werden die HLA-Antigene benannt, die in einem Panel zur Differenzierung von HLA-ABC-Antikörpern vorhanden sein sollten. Deshalb werden
die vorhandenen Spender so ausgewählt, dass möglichst alle bekannten HLAABC-Antigene vorhanden sind.
Die Phenotyp-Frequenzen variieren zwischen den verschiedenen Populationen.
Deshalb können die in Lymphoscreen ABC 60 repräsentierten Antigene unterschiedlich zur Antigenhäufigkeit der Population sein, aus der die getestete Probe
stammt.
In Lymphoscreen ABC 60 werden vorwiegend Zellen caucasoiden Ursprungs
eingesetzt.
se
Ist keine Spezifitätsangabe möglich, wird die Summe der positiven Reaktionen
als prozentualer Anteil des Panelumfanges angegeben (% PRA = % Panel
Reactive Antibodies).
Anzahl der positiven Reaktionen
% Panelreaktivität =
------------------------------------------------------------- x 100
Gesamtzahl der Lymphozytensuspensionen
Literatur
1992.
6. Marsh, S.G.E., Bodmer, J.G., Albert, E.D., Bodmer, W.F., Bontrop, R.E.;
Dupont, B.; Erlich, H.A.; Hansen, J.A., Mach, B.; Mayr, W.R., Parham,
P., Petersdorf, E.W., Sasazuki, T., Schreuder, G.M.Th., Strominger, J.L.,
Svejgaard, A., & Terasaki, P.J. Nomenclature for factors of the HLA
system, 2000. Tissue Antigens 57: 236-283, 2001.
devices.
U
Bewertung der Reaktionen
Die Ablesung erfolgt mit einem inversen Phasenkontrastmikroskop. Vitale
Lymphozyten sind hell und leuchtend (=negative Reaktion), lysierte
Lymphozyten sind dunkel und größer (=positive Reaktion). Der Anteil der
lysierten Lymphozyten an der Gesamtlymphozytenzahl wird als Scorewert
angegeben.
% lysierte Zellen
Bewertung
0 10%
=
Score 1
negativ
11 20%
=
Score 2
fraglich negativ
21 50%
=
Score 4
schwach positiv
51 80%
=
Score 6
positiv
81 100%
=
Score 8
stark positiv
Score 0
nicht ablesbar
Die abgelesenen Reaktionen sind in die entsprechende Spalte des Worksheets
einzutragen. Mit einem Farbmarkierstift können die Antigene der positiv
reagierenden Zellen in der Antigentabelle markiert werden. Durch Selektion der
Antigene, die komplett markiert sind, wird die HLA-Spezifität des Antikörpers
definiert.
Fo
Spezifische Charakteristika
In Lymphoscreen ABC 60 werden zum Screening und zur Differenzierung
komplementabhängiger, zytotoxischer HLA-ABC-Antikörper Lymphozyten von
Spendern eingesetzt, die mit den entsprechenden HLA-Antiseren getestet
wurden. Das Vorhandensein der Antigene ist im beigelegten Worksheet
aufgelistet.
Jede Charge wird mit mindestens 10 ausgewählten Anti-HLA-ABC-Testseren
überprüft. Dabei darf der Anteil 10% falsch positiver und 5% falsch negativer
Reaktionen nicht überschritten werden. Bei Testung mit einem negativen
Kontrollserum muß sich eine Vitalität der Lymphozyten von mindestens 90%
ergeben. Bei Testung mit einem positiven Kontrollserum müssen mindestens
90% der Zellen je Kavität lysiert sein.
Vergleichsdaten von Lymphoscreen ABC 60 und einem Zellpanel, dass
entsprechend den ASHI-Richtlinien hergestellt wurde:
78/ 101 Seren waren negativ in beiden Tests
22/ 101 Seren waren positiv in beiden Tests
1/ 101 Serum war positiv nur in Lymphoscreen ABC 60
B
Biotest
M Biotest,
Germany Tel.: +49-6103-801-0, Fax: +49-6103-801-140
|
[FR]
823360/05 – 04/2008
[COMP] Complément
Remarque concernant l’utilisation
La microplaque de cellules [MZP] Lymphoscreen ABC 60 est utilisé pour la
recherche et la différentiation des anticorps anti-HLA-ABC lymphocytotoxiques,
dépendants du complément (1,5). Lymphoscreen ABC 60 contient un panel de
lymphocytes congelés dont les groupes HLA-ABC ont été typés (6).
Introduction
On peut observer l’apparition d’anticorps HLA cytotoxiques après une
transfusion sanguine, une greffe d’organe et pendant la grossesse (2,3,4).
L’utilisation de Lymphoscreen ABC 60 permet un dépistage rapide dans les
sérums, prélevés chez des femmes enceintes et chez des patients transfusés
ou transplantés. La détermination des anticorps cytotoxiques par un panel de
lymphocytes dont les groupes HLA-ABC ont été typés est une méthode qui peut
être mise en oeuvre dans chaque laboratoire HLA.
Principe du test de microlymphocytotoxicité
On incube des lymphocytes, portant des antigènes HLA connus, avec un
sérum de spécificité HLA non connu et du complément de lapin. Si l’antigène
correspondant est présent, l’ajout du sérum en présence de complément
provoque une lyse des lymphocytes. Cette lyse est révélée par un colorant (par
exemple éosine Y). Les lymphocytes lysés et intacts sont évalués à l'aide d'un
microscope à contraste de phase inverse.
Processus de lavage
1. Processus de lavage à l’aide de papier absorbant
- Laisser brièvement décongeler Lymphoscreen ABC 60 à température
ambiante (18…22°C ).
Mise en garde : Des cristaux de glace devront rester visibles dans les
puits !
Ne pas décongeler plus de deux plaques [MZP] à
la fois.
- Distribuer sans délai 20 µl de milieu de lavage dans chaque puits à l’aide du
distributeur de Terasaki .
- Laisser la plaque [MZP] pendant 15 minutes à température ambiante
(18…22°C).
- Aspirer le milieu de lavage à partir d’un coin de la plaque [MZP] à l’aide de
papier absorbant. Enlever à l’aide d’un deuxième papier absorbant le milieu de
lavage restant rangée par rangée.
Mise en garde : Si le milieu de lavage n’est pas complètement enlevé, on
peut observer des réactions atténuées par dilution des sérums à tester.
- Répartir de l’huile dans chaque puits (environ 5 µl par puits).
autre possibilité
en
ce
Description du produit
Lymphoscreen ABC 60 contient des lymphocytes congelés de différents
donneurs ayant des antigènes HLA définis congelés sur microplaque [MZP]. La
membrane des lymphocytes congelés est stabilisée à l'aide de DMSO
(diméthylsulfoxyde). Pour la réalisation du test de microlymphocytotoxicité, on
décongèle Lymphoscreen ABC 60 à température ambiante. On élimine le DMSO
à l'aide d'un milieu de lavage, car ce produit est fortement toxique pour les
cellules à température ambiante.
Un conditionnement Lymphoscreen ABC 60 contient 6 plaques [MZP].
Chaque plaque [MZP] contient un panel de 56 lymphocytes congelés dont le
groupe HLA a été determiné pour le dépistage du sérum d’un sujet et de deux
pools lymphocytaires (chaque fois deux puits), prévus pour les témoins positifs
et négatifs en double. La position des témoins est indiquée sur chaque plaque
par un code couleur. Chaque puits contient 2 µl de suspension de lymphocyte
dans 13 µl de milieu de congélation. Le nombre de lymphocytes est de l’ordre
de 7000 lymphocytes par puits.
Préparation des réactifs
Préparer le milieu de lavage : SVF à 10 % (V/V) dans Lymphostabil
Reconstituer le témoin HLA (positif) dans le volume d'eau distillée indiqué
sur l'étiquette = témoin positif. Le témoin positif est un sérum antilymphocytaire de cheval qui réagit sur le plan cytotoxique avec tous les
lymphocytes d'origine humaine.
Reconstituer le témoin HLA (négatif) dans le volume d'eau distillée indiqué
sur l'étiquette = témoin négatif. Le témoin négatif est un sérum d'un donneur
masculin en bonne santé de groupe sanguin AB et ne présentant pas de
réactions cytotoxiques au cours du test de lymphocytotoxicité utilisant des
lymphocytes non sélectionnés de donneurs.
y
[MZP] La microplaque de cellules
nl
823 300
O
[REF] 7
se
Pour la détermination des anticorps anti-HLA-ABC
Matériel complémentaire nécessaire
1. * Lymphostabil (milieu SA de McCoy's, modifié selon Park et Terasaki,
dépourvu de Ca++ et de Mg++)
2. Sérum de veau foetal (SVF) inactivé par la chaleur, par exemple Société
Sigma
3. * Témoin HLA (positif)
*
4. Témoin HLA (négatif)
5. Eosine Y (dissoudre à 5 % dans de l'eau distillée et filtrer), par exemple
Société Merck
6. Formaldéhyde pour examens histologiques à 37 %, sans acide (filtrer et
ajuster à un pH de 7,2 ± 0,2 à l'aide de soude 0,1 N), par exemple Société
Merck
*
7. Huile de couverture
8. Cellulose absorbante
9. * Lamelles de 50 x 75 mm
10. Seringue graduée en ml, par exemple Société Hamilton N° 710 (0.100 ml
seringue)
11. Dispositif de dosage, par exemple Société Hamilton PB 600-1
12. Distributeur de Terasaki, par exemple Société Hamilton N° 1725 (6 x 0.250
ml seringue)
13. Distributeur pour microplaques, par exemple Société Greiner
14. Microscope à contraste de phase inverse
Uniquement si l'on utilise un certain procédé de lavage pour d’une centrifugeuse
15. Centrifugeuse pour microplaque
16. Tête d'aspiration à 6 canaux, par exemple Société Greiner
17. Pompe à eau
U
Fo
r
R
ef
er
Précaution
[IVD] Ce réactif est à utiliser seulement pour le diagnostic in vitro
Le test doit être réalisé par des techniciens autorisés à faire la technique et
bien formés.
Tous les matériaux d'origine humaine, utilisés pour ce produit, ont été contrôlés à
l'aide de trousses, brevetées par la FDA, pour l'AgHBs, les anticorps anti-HCV et
anti-HIV-1/-2 et ont donné des réactions négatives. Tous ces produits d'origine
humaine devront toutefois être considérés comme transmetteurs potentiels des
virus de l'hépatite, du HIV et d'autres agents pathogènes infectieux. Des
mesures de précaution appropriées sont recommandées.
Stockage
Lymphoscreen ABC 60 est utilisable jusqu’à la date de péremption indiquée sur
les étiquettes.
Lymphoscreen ABC 60 doit être stocké à une température inférieure ou égale à 70°C. Les emballages livrés sur carboglace doivent être congelés immédiatement à -70°C. Les emballages de Lymphoscreen ABC 60 entamés ne
doivent pas être stockés dans de la carboglace.
Problèmes qualités
Si le témoin négatif présente plus de 10 % de lymphocytes lysés et si la toxicité
de fond est supérieure à 10 %, le test devra être répété.
Si le témoin positif présente moins de 80 % de lymphocytes lysés, le test devra
être répété.
Préparation des prélèvements
Prélèvement du sérum à partir de:
- environ 3 ml de sang complet ou bien
- environ 3 ml de sang hépariné (transformer le plasma en sérum paraddition de thrombine) ou bien
- environ 3 ml de sang sur EDTA ou ACD (transformer le plasma en sérum
par addition de chlorure de calcium)
Utiliser un sérum fraîchement prélevé ou après stockage congelé à une
température inférieure ou égale à -20°C.
Méthode
Matériel contenu dans le conditionnement
Lymphoscreen ABC 60 (1 microplaque [MZP] pour un prélèvement)
Complément [COMP] lyophilisé de lapin (3 x 1 ml sont joints à chaque
conditionnement)
Formulaires de travail (6 formulaires sont joints dans chaque conditionnement)
2. Processus de lavage à l’aide d’une centrifugeuse à plaques
- Laisser brièvement décongeler Lymphoscreen ABC 60 à température
ambiante (18...22°C ).
Mise en garde : Des cristaux de glace devront rester visibles dans
les puits !
Ne pas décongeler plus de deux plaques [MZP] à
la fois !
- Distribuer sans délai 20 µl de milieu de lavage à l'aide du distributeur de
Terasaki dans chaque puits.
- Centrifuger les plaques [MZP] immédiatement à 1000 x g pendant 30
secondes (sans freinage).
- Aspirer avec précautions le milieu de lavage par la tête d'aspiration à 6 canaux
à l'aide de la pompe à eau.
Mise en garde : Appliquer la tête d'aspiration sur le bord du puits pour que
seul le milieu et non pas les cellules sédimentées soient aspirées.
- Répartir de l’huile dans chaque puits (environ 5 µl par puits).
Lymphoscreen ABC 60 est maintenant prêt à l'emploi pour le test de microlymphocytotoxicité.
Test de microlymphocytotoxicité
- Distribuer 2 µl du témoin négatif dans les puits 1A et 1B
- Distribuer 2 µl du témoin positif dans les puits 10A et 10B. Les positions des
témoins sont marquées sur la plaque [MZP].
- Distribuer 2 µl du sérum prélevé dans les puits restants (1C à 10C).
- Incuber pendant 30 minutes à température ambiante (18...22°C).
- Reconstituer le complément [COMP] 15 minutes avant la fin de la durée
d'incubation à l'aide du volume d'eau distillée, indiqué sur l'étiquette, en agitant
légèrement. NE PAS RECONGELER! JETER LE COMPLEMENT RESTANT!
- Ajouter 5 à 6 µl de complément [COMP] dans chaque puits.
- Incuber pendant 60 minutes à température ambiante (18...22°C).
- Colorer les cellules pendant environ 3 minutes à l'aide de 3 à 4 µl d'éosine Y
5% par puits.
*
pouvant être livrés par Biotest
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ce
Sources d'erreur
Si le témoin négatif présente plus de 10 % de lymphocytes lysés et si la toxicité
de fond est supérieure à 10 %, le test devra être répété.
Les causes peuvent en être les suivantes:
1. Lymphoscreen ABC 60 a été exposé trop longtemps à la température
ambiante lors de la livraison.
2. Lymphoscreen ABC 60 a été stocké à une température supérieure à -70°C
3. Décongélation complète de Lymphoscreen ABC 60 avant l’ajout du milieu
de lavage.
Si le témoin positif présente moins de 80 % de lymphocytes lysés, le test devra
être répété.
Les causes peuvent en être les suivantes:
1. Réactivité insuffisante du complément
2. Dilution de l'anticorps à déceler du fait d'une élimination non satisfaisante du
milieu de lavage.
3. Emballages entamés ou stockage des plaques [MZP] dans de la
carboglace;
Les antigènes HLA qui devront faire partie d’un panel visant à différencier les
anticorps HLA-ABC ne sont cités ni dans les directives de l’ASHI (American
Society for Histocompatibility and Immunogenetics) ni dans celles de l’EFI
(European Federation of Immunogenetics). C’est pourquoi on choisit les
donneurs de façon à comprendre si possible tous les antigènes HLA-ABC
connus.
Les fréquences des phénotypes varient entre les différentes populations. Les
antigènes représentés dans Lymphoscreen ABC peuvent ainsi être différents
de la fréquence des antigènes de la population à partir de laquelle provient le
prélèvement à étudier.
Lymphoscreen ABC 60 utilise principalement des lymphocytes prélevés chez
des sujets de race blanche.
O
Interprétation des réactions
Les plaques sont lues au microscope à contraste de phase inverse. Les
lymphocytes vivants ont une couleur claire et sont brillants (= réaction négative),
les lymphocytes lysés sont foncés et de plus grande dimension (= réaction
positive). La part des lymphocytes lysés sur le nombre total de lymphocytes est
% de cellules lysées
Interprétation
0
-10%
=
Score 1
négatif
11
-20%
=
Score 2
négativité discutable
21
-50%
=
Score 4
faiblement positif
51
-80%
=
Score 6
positif
81
-100%
=
Score 8
fortement positif
=
Score 0
non interprétable
Les réactions lues devront être inscrites dans la colonne correspondante du
formulaire de travail. Les antigènes des cellules présentant une réaction positive
peuvent être marqués sur le tableau des antigènes à l'aide d'un stylo de couleur.
La spécificité anti-HLA de l'anticorps est définie par la sélection des antigènes
présentant un marquage complet.
S'il n'est pas possible d'indiquer une spécificité, la somme des réactions positives
est indiquée sous forme de pourcentage par rapport à la totalité du panel (%
PRA = pourcentage des anticorps réactionnels vis à vis du panel).
Nombre de réactions positives
% PRA = --------------------------------------------------------------- x 100
Nombre total de suspensions lymphocytaires
se
Contrôle de qualité
Le témoin négatif se trouve en position 1A et 1B et permet le contrôle de la
vitalité des lymphocytes.
La vitalité devra être supérieure à 90 %.
Le témoin positif se trouve en position 10A et 10B et permet de contrôler
l’activité du complément.
Le témoin positif devra comporter plus de 80 % de lymphocytes lysés.
Références bibliographiques
1992.
1996. Tissue Antigens 49: 297-321, 1997
devices.
U
- Fixer les réactions à l'aide de 6 à 7 µl de formaldéhyde par puits.
- Une fois les manipulations terminées, recouvrir la plaque d'une lamelle et
procéder à la lecture au plut tôt 30 minutes après la fin du test. Si la plaque
est conservée à des températures de 2 à 8°C, l’évaluation est encore
possible dans un délai de 3 jours. La lecture se fait en conformité avec les
formulaires joints selon la séquence suivante de 1A à 1F, de 2F à 2A, de 3A
à 3F, etc.
Caractéristiques spécifiques
Pour le dépistage et le diagnostic différentiel des anticorps HLA-ABC
cytotoxiques, dépendants du complément, Lymphoscreen ABC 60 contient
des lymphocytes provenant de donneurs testés à l’aide des antisérums HLA
correspondants. Les différents antigènes de Lymphoscreen ABC 60 sont
énumérés dans le formulaire de travail joint en annexe.
Chaque lot est contrôlé à l'aide d'au moins 10 sérums-tests anti-HLA-ABC
sélectionnés. Un pourcentage de 10 % de réaction à tort positives et de 5 % de
réactions à tort négatives ne devra pas être dépassé. Lors du contrôle à l'aide
d'un sérum témoin négatif, la viabilité des lymphocytes doit être au moins de 90
%. Lors du contrôle à l'aide d'un sérum témoin positif, au moins 90 % des
cellules par puits doivent être lysées.
Données comparatives de Lymphoscreen ABC 60 et d’un panel de cellules,
préparé en conformité avec les directives de l’ASHI:
78/101
sérums étaient négatifs dans les deux tests
22/101
sérums étaient positifs dans les deux tests
1/101
sérums n’était positif que pour Lymphoscreen ABC 60
B
Biotest
M Biotest,
Germany Tel.: +49-6103-801-0, Fax: +49-6103-801-140
|
[IT]
823360/05 – 04/2008
[COMP] Complemento
Usi
Il Lymphoscreen ABC 60 Biotest contiene un panel di linfociti congelati utilizzati
per lo screening e la differenziazione complemento-dipendente degli anticorpi
linfocitotossici HLA-ABC (1,5).
Ciascuna piastra [MZP] contiene un panel di linfociti congelati e tipizzati per HLAABC (6).
Introduzione
Dopo trasfusioni di sangue, trapianti di organi e durante una gravidanza possono
formarsi anticorpi-HLA citotossici(2,3,4). Con l’aiuto di Lymphoscreen ABC 60 è
possibile un rapido screening dei sieri di donne in gravidanza e di pazienti trasfusi o
trapiantati. La determinazione degli anticorpi HLA-ABC citotossici contro un panel
di linfociti HLA tipizzati è una metodica che può essere eseguita in ogni
laboratorio con esperienza nel settore del sistema HLA.
Principio del test di microlinfocitotossicità
I linfociti con antigeni-HLA noti sono incubati con un siero di specificità HLA
sconosciuta e complemento di coniglio. In caso di presenza dell’antigene
corrispondente, l’aggiunta di siero in presenza di complemento porta alla lisi
dei linfociti. Questa viene evidenziata mediante l’uso di una sostanza colorante
(es. eosina Y) che penetra all’interno dei linfociti. La valutazione dei linfociti lisati
e di quelli vitali viene effettuata con un microscopio a contrasto di fase invertito.
Procedimento di lavaggio
1. Procedimento di lavaggio con impiego di carta assorbente.
- Portare le piastre di Lymphoscreen ABC 60 a temperatura ambiente
(18...22°C).
Attenzione: Si deve ancora vedere ghiaccio nei pozzetti!
Non scongelare più di 2 piastre [MZP] per volta!
- Pipettare in ogni pozzetto, con la microsiringa Terasaki, 20 µl della soluzione di lavaggio.
- Lasciare le piastre [MZP] per 15 minuti a temperatura ambiente (18...22°C).
- Assorbire da un angolo della piastra [MZP], con la carta assorbente, la
soluzione di lavaggio. Tamponare, fila per fila, la rimanente soluzione di
lavaggio.
Attenzione: se la soluzione di lavaggio non viene rimossa completamente, è
possibile un indebolimento delle reazioni a causa della diluizione del siero in
esame.
- Ricoprire le piastre di Lymphoscreen ABC 60 con olio (ca. 5µl per ogni
pozzetto).
oppure, in alternativa
ce
Descrizione del prodotto
Nel Lymphoscreen ABC 60, i linfociti tipizzati del sangue periferico, proveniente
da diversi donatori, vengono congelati in micropiastre [MZP]. La membrana dei
linfociti congelati viene stabilizzata con DMSO (dimetilsulfossido), Tale composto
è tossico per le cellule, e pertanto deve essere rimosso immediatamente,
mediante opportuni lavaggi, non appena le micropiastre vengono portate a
temperatura ambiente per lo scongelamento.
Una confezione di Lymphoscreen ABC 60 contiene 6 piastre [MZP]. Ogni piastra
[MZP] contiene un panel di 56 linfociti congelati, a tipizzazione HLA nota, necessari
per lo screening di un campione e 2 pool di linfociti (ognuno in 2 pozzetti) previsti
per i doppi controlli positivo e negativo. Le posizioni dei controlli sono segnate su
ogni piastra. Ciascun pozzetto contiene 2 µl di sospensione di linfociti e 13 µl di
medium di congelamento. Il numero delle cellule è di circa 7000 linfociti per
pozzetto.
Preparazione dei reagenti
Soluzione di lavaggio: FCS al 10% (v/v) in Lymphostabil.
Controllo HLA positivo: ricostituire nel volume di acqua distillata indicato
sull’etichetta = Controllo positivo
Controllo HLA negativo : ricostituire nel volume di acqua distillata indicato
sull'etichetta = Controllo negativo
y
[MZP] Micropiastre per test cellulari
nl
823 300
O
[REF] 7
se
per la determinazione degli anticorpi HLA-ABC
Ulteriori materiali necessari
1. * Lymphostabil (terreno McCoy 5A, modificato sec. Park e Terasaki, privo di
Ca++ e Mg++)
2. Siero di vitello fetale (FCS), inattivato al calore, Sigma
3. * Controllo HLA positivo
4. * Controllo HLA negativo
5. Eosina Y(sciogliere al 5% in acqua distillata e filtrare), Merck
6. Formaldeide per istologia, al 37%, priva di acidi (filtrare e portare a pH 7,2 ±
0,2 con idrossido di sodio 0,1 N), Merck
7. * Olio minerale
8. Carta assorbente
9. * Vetrini coprioggetti 50 x 75 mm
10. Microsiringhe, Hamilton N.710 (0.100 ml siringhe)
11. Dispenser per microsiringhe, Hamilton PB 600-1
12. Microsiringhe Terasaki, Hamilton N.1725 (6 x 0.250 ml siringhe)
13. Microdispenser per micropiastre, Greiner
14. Microscopio a contrasto di fase invertito
solo per il procedimento alternativo di lavaggio con una centrifuga
15. Centrifuga per micropiastre
16. Pettine a 6 canali per lavaggi, Greiner
17. Pompa a getto d'acqua
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R
ef
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Precauzione
[IVD] Reagenti solo per diagnostica in vitro
Il test deve essere effettuato da tecnici di laboratori autorizzati e ben preparati.
Tutti i materiali di origine umana impiegati per questo prodotto sono stati testati
con kit approvati dalla FDA per rilevare l'eventuale presenza di :
HBsAg, anti-HCV ed anti-HIV-1/2 con esito negativo.
Tuttavia, tutti i prodotti di origine umana devono essere considerati
potenzialmente in grado di trasmettere epatiti, HIV o altre malattie infettive.
Si raccomanda di attenersi alle procedure di sicurezza opportune.
Conservazione
Le Lymphoscreen ABC 60 sono stabill fino alla data dichiarata sull' etichetta.
Il Lymphoscreen ABC 60 deve essere conservato ad almeno -70°C. Le
confezioni consegnate in ghiaccio secco devono essere immediatamente
trasferite in un congelatore a -80°C. Le confezioni di Lymphoscreen ABC 60,
una volta aperte, non devono essere conservate insieme al ghiaccio secco.
Segnali di deterioramento
Se il controllo negativo indica più del 10% di linfociti lisati e la tossicità di base è
>10%, è necessario ripetere il test.
Se il controllo positivo indica meno dell'80% di linfociti lisati, è necessario ripetere
il test.
Preparazione dei campioni
Il siero del paziente può essere ottenuto da:
circa 3 ml di sangue intero, oppure
circa 3 ml di sangue eparinato (trasformare il plasma in siero mediante
aggiunta di trombina), oppure
circa 3 ml di sangue trattato con EDTA o con ACD (trasformare il plasma in
siero mediante aggiunta di cloruro di calcio).
Il siero del paziente puo’ essere conservato ad almeno -20°C.
Metodica
Materiale disponibile
Lymphoscreen ABC 60 (1 piastra-microtest [MZP] per 1 campione)
Complemento [COMP] di coniglio liofilizzato (in ogni confezione sono acclusi 3 x 1
ml)
Worksheets (in ogni confezione sono acclusi 6 fogli).
2. Procedimento di lavaggio con una centrifuga per piastre.
- Portare le piastre di Lymphoscreen ABC 60 a temperatura ambiente
(18...22°C).
Attenzione: Si deve ancora vedere ghiaccio nei pozzetti!
Non scongelare più di 2 piastre [MZP] per volta!
- Pipettare in ogni pozzetto, con la microsiringa Terasaki, 20 µl della
soluzione di lavaggio.
- Centrifugare immediatamente le piastre [MZP] a 1000 x g per 30 secondi
(senza freno).
- Aspirare accuratamente la soluzione di lavaggio,con il pettine a 6 canali,
mediante la pompa a getto d'acqua.
Attenzione: aspirare attentamente la soluzione di lavaggio tenendosi sul
bordo del pozzetto, onde evitare di aspirare il sedimento cellulare.
- Ricoprire le piastre Lymphoscreen ABC 60 con l'olio (ca. 5µl per ogni
pozzetto).
Il Lymphoscreen ABC 60 è ora pronto per l'uso per il test di microlinfocitotossicità.
Test di microlinfocitotossicità
- Pipettare 2 µl di controllo negativo nei dei pozzetti 1 A e 1B.
- Pipettare 2 µl di controllo positivo nei pozzetti 10A e 10B. Le posizioni dei
controlli sono indicate sulla piastra [MZP].
- Pipettare 2 µl di siero del paziente in ognuno dei rimanenti pozzetti (da 1C
fino a 10C).
- Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (18...22°C).
- 15 minuti prima del termine del tempo di incubazione, ricostituire il complemento [COMP] con il volume di acqua distillata indicato sull'etichetta, agitando
leggermente. NON CONGELARE NUOVAMENTE! ELIMINARE IL COMPLEMENTO RESIDUO!
- Aggiungere in ogni pozzetto 5-6 µl di complemento [COMP].
- Incubare per 60 minuti a temperatura ambiente (18...22°C).
- Aggiungere in ogni pozzetto 3-4 µl di 5% eosina Y e lasciar colorare le cellule
per ca. 3 minuti.
- Bloccare la reazione con 6-7 µl di formaldeide per ogni pozzetto.
- Coprire con un vetrino coprioggetto la piastra ultimata e leggere non prima di
30 minuti. La valutazione è ancora possibile per un massimo di 3 giorni, se
le piastre vengono conservate a 2...8°C. La lettura avviene in modo conforme ai Worksheets di forma meandrica acclusi; dall’1 A all’1 F, dal 2 F al
2 A, dal 3 A al 3 F, ecc.
*
disponibile presso Biotest
Controllo di qualità
Il controllo negativo si trova nelle posizioni 1 A e 1 B e verifica la vitalità dei linfociti.
La vitalità dovrebbe essere superiore al 90%.
Il controllo positivo si trova nelle posizioni 10 A e 10 B e verifica l’attività del
complemento. Il controllo positivo dovrebbe contenere più dell’ 80% di linfociti lisati.
nl
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Possibilità di errori
Se il controllo negativo indica più del 10% di linfociti lisati e la tossicità di base è
>10%, è necessario ripetere il test. Possibili cause :
1. Il Lymphoscreen ABC 60 è stato lasciato troppo a lungo a temperatura
ambiente all’apertura dell’imballaggio
2. Il Lymphoscreen ABC 60 è stato conservato ad una temperatura inferiore a
-70°C.
3. Lymphoscreen ABC 60 era completamente scongelato, prima di essere
aggiunto il tampone di lavaggio.
Se il controllo positivo indica meno dell'80% di linfociti lisati, è necessario ripetere
il test. Possibili cause :
1. Insufficiente attività del complemento.
2. Diluizione degli anticorpi eventualmente rilevabili per insufficiente rimozione
della soluzione di lavaggio.
3. Le confezioni sono state conservate insieme al ghiaccio secco.
Né nelle direttive dell’ASHI (American Society for Histocompatibility and
Immunogenetics) né in quelle dell’EFI (European Federation of Immunogenetics)
sono nominati gli antigeni-HLA che dovrebbero essere presenti in un panel per la
differenziazione degli anticorpi-HLA-ABC. Perciò i donatori presenti vengono scelti
in modo tale che tutti gli antigeni-HLA-ABC conosciuti siano presenti il più possibile.
Le frequenze dei fenotipi variano da una popolazione all’altra. Per questo gli
antigeni rappresentati in Lymphoscreen ABC possono essere diversi dalla
frequenza antigenica della popolazione da cui deriva il campione esaminato.
In Lymphoscreen ABC 60 sono contenute prevalentemente cellule di origine
caucasica.
y
Valutazione delle reazioni
La lettura viene eseguita con un microscopio a contrasto di fase invertito. I
linfociti vitali sono chiari e luminosi (= reazione negativa), i linfociti lisati sono
scuri e più grandi (= reazione positiva). La percentuale dei linfociti lisati rispetto
alla conta totale dei linfociti viene espressa mediante score.
% cellule lisate
Valutazione
0 10%
=
Score 1
negativo
11 20%
=
Score 2
negativo dubbio
21 50%
=
Score 4
debolmente positivo
51 80%
=
Score 6
positivo
81 100%
=
Score 8
fortemente positivo
Score 0
non leggibile
Registrare le letture delle reazioni sui fogli di lavoro. Evidenziare gli antigeni
delle cellule con reazione positiva nella tabella degli antigeni. Mediante la
selezione degli antigeni segnati completamente si definisce la specificità HLA
degli anticorpi.
Se non è possibile riscontrare alcuna specificità, si indica la somma delle reazioni
positive come percentuale delle dimensioni del panel (% PRA = % Panel
Reactive Antibodies = % reattività del panel).
Numero delle reazioni positive
% PRA = ---------------------------------------------------------- x 100
Numero totale delle sospensioni di linfociti
Fo
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Caratteristiche specifiche
Lymphoscreen ABC 60 contiene linfociti (per lo screening e la differenziazione
dipendente dal complemento) di donatori esaminati con i corrispondenti antisieriHLA. La presenza degli antigeni è elencata nel Worksheet accluso.
Ogni lotto è stato controllato con almeno 10 sieri test anti-HLA-ABC selezionati.
Pertanto non è ammesso superare il 10% di reazioni false positive ed il 5% di
reazioni false negative.
Il test eseguito con un siero di controllo negativo deve dare almeno il 90% di
linfociti vitali. Nell'esame di un siero di controllo positivo, almeno il 90% delle
cellule di ogni pozzetto deve essere lisato.
Dati derivanti dal confronto di Lymphoscreen ABC 60 e di un panel cellulare creato
in accordo con le direttive ASHI:
78/101
Sieri negativi in entrambi i test
22/101
Sieri posiitivi in entrambi i test
1/101
Sieri positivi solo nel Lymphoscreen ABC 60
Bibliografia
Schirmer, R.: Donorreaktive und panelreaktive Antikörper bei
Nierentransplantatempfängern - Ursachen und Einfluß auf das
Transplantatschicksal. Transplantationsmedizin 7:80-86, 1995.
1992.
1996. Tissue Antigens 49: 297-321, 1997
devices.
B
Biotest
M Biotest,
Germany Tel.: +49-6103-801-0, Fax: +49-6103-801-140
|
[ES]
823360/05 – 04/2008
[COMP] Complemento
Modo de aplicación
La placa [MZP] de microensayo Lymphoscreen ABC 60 se utiliza para la
detección selectiva y diferenciación de los anticuerpos anti-HLA-ABC citotóxicos,
dependientes del complemento (1,5). Se contiene un grupo ultracongelado de
linfocitos tipificados según HLA (6).
Introducciòn
Los anticuerpos HLA citotóxicos se pueden originar después de transfusiones
de sangre, trasplantes de órganos o durante el embarazo (2,3,4).
Lymphoscreen ABC 60 hace posible una rápida exploración de los sueros de
mujeres embarazadas o de pacientes a los que se les ha transfundido sangre
o trasplantado un órgano. La determinación de los anticuerpos citotóxicos
contra un grupo de linfocitos tipificados según HLA representa un método que
puede aplicarse en cualquier laboratorio de HLA.
Principio del la prueba de microlinfocitotoxicidad
Los linfocitos con antígenos HLA conocidos son incubados con un suero de
especificidad HLA desconocida y con un complemento procedente del conejo.
Si el antígeno correspondiente está presente, la adición del suero en
presencia del complemento conduce a la lisis de los linfocitos.
Esta se visualiza con un colorante (p. ej., eosina Y). La valoración de los
linfocitos lisados y vitales tiene lugar con un microscopio inverso de contraste de
fases.
Procedimiento de lavado
1. Lavado con celulosa absorbente
- Se descongela brevemente Lymphoscreen ABC 60 a temperatura ambiente
(18...22°C).
Atención:
¡debe apreciarse hielo en los pocillos!
¡No se deben descongelar más de dos placas [MZP] a la
vez!
- Se pipetean de inmediato 20 µl del medio de lavado con el dispensador de
Terasaki en cada pocillo.
- Se deja en reposo la placa [MZP] durante 15 minutos a la temperatura
ambiente (18...22°C).
- Se aspira el medio de lavado de los bordes de la placa [MZP] con celulosa
absorbente. Se retira el resto del medio con un segundo paño, pasándolo por
cada fila.
Atención: si no se elimina completamente el medio de lavado, puede
reducirse la reacción, por dilución de los sueros analizados.
- Se recubre Lymphoscreen ABC 60 con aceite (approx. 5µl a cada pocillo).
o bien
er
en
ce
Descripción del producto
Los linfocitos periféricos de los diferentes donantes con antígenos HLA definidos
se encuentran ultracongelados en las placas [MZP] de microensayo de Lymphoscreen ABC 60. La membrana de los linfocitos congelados se estabiliza con
DMSO (dimetilsulfóxido). Para realizar el ensayo de microtoxicidad linfocítica se
descongela Lymphoscreen ABC 60 a la temperatura ambiente. DMSO se
elimina con una solución de lavado, ya que posee un efecto tóxico celular muy
intenso a la temperatura ambiente.
Un envase de Lymphoscreen ABC 60 contiene 6 placas [MZP]. Cada placa
[MZP] contiene un panel de 56 linfocitos ultracongelados y tipificados en HLA
para la exploración de una muestra, así como 2 bandejas de linfocitos (de 2
cavidades cada una), previstas para controles dobles positivos y negativos.
Las posiciones de los controles se hallan marcados con colores en cada
placa. Cada cavidad contiene 2 μl de suspensión linfocítica en 13 μl de medio
congelante. El número de células asciende a aproximadamente 7.000
linfocitos por cavidad.
Preparación de los reactivos
Preparación del medio de lavado: SBF al 10% (v/v) en Lymphostabil.
Control HLA (positivo) reconstituido con el volumen de agua destilada
indicado en la etiqueta = control positivo.
Control HLA (negativo) reconstituido con el volumen de agua destilada
indicado en la etiqueta = control negativo.
y
[MZP] Placa di microlinfocitotoxicidad
nl
823 300
O
[REF] 7
se
Para la determinación de los anticuerpos anti-HLA-ABC
Material adicional necesario
1. * Lymphostabil (medio 5A de McCoy, modificado par Park y Terasaki, exento
de Ca++ y Mg++)
2. Suero bovino fetal (SBF), inactivado con calor, p. ej. de la compañia Sigma
3. * Control HLA (positivo)
4. * Control HLA (negativo)
5. Eosina Y(disolver al 5% en agua destilada y filtrar), p. ej. de la compañia
Merck
6. Formaldehído para el examen histológico, al 37%, sin ácido (filtrar y ajustar
a pH 7,2 + 0,2 con hidróxido sódico 0,1 N), p. ej. de la compañia Merck
7. * Aceite de recubrimiento
8. Celulosa absorbente
9. * Cubreobjetos de 50 x 75 mm
10. Jeringas de microlitros, p. ej. de la compañia Hamilton n° 710 (0.100 ml
jeringa)
11. Dosificador, p. ej. de la compañia Hamilton PB 600-1
12. Dispensador Terasaki, p. ej. de la compañia Hamilton n° 1725 (6 x 0.250 ml
jeringas)
13. Microdispensador para placas de microensayo, p. ej. de la compañia
Greiner
14. Microscopio invertido de contraste de fases
Exclusivamente para el procedimiento alternativo de lavado con una centrífuga
15. Centrifuga de placas de microensayo
16. Cabezal aspirador de 6 tomas, p. ej. de la compañia Greiner
17. Bomba de aire de chorro de agua
U
Fo
r
R
ef
Medidas de precaución
[IVD] El reactivo sólo debe utilizarse para el diagnóstico in vitro.
El ensayo debe ser realizado por técnicos de laboratorio bien preparados y
autorizados.
Todo material de origen humano utilizado para este producto ha sido sometido a
análisis de HBsAg, anti-HCV y anti-VIH-1/2, con lotes aprobados por la FDA,
obteniendo un resultado negativo. De todas maneras, todo producto de origen
humano puede, en teoría, transmitir la hepatitis, VIH y otras enfermedades
infecciosas. Por eso, se recomiendan las medidas generales de seguridad.
Conservación
El producto es estable hasta la fecha indicada en la etiqueta.
Lymphoscreen ABC 60 se debe conservar, como mínimo, a -70°C. Los envases,
suministrados en hielo seco, se trasladarán inmediatamente al congelador de 70°C. Los envases abiertos de Lymphoscreen ABC 60 no se pueden conservar
con hielo seco.
Indicaciones de deterioración
Si el control negativo contiene más de 10% de linfocitos lisados y la toxicidad de
fondo es >10%, se repetirá el ensayo.
Si el control positivo contiene menos de 80% de linfocitos lisados, se repetirá el
ensayo.
Preparación de muestras
Obtención del suero del probando a partir de:
aproximadamente 3 ml de sangre nativa o
aproximadamente 3 ml de sangre heparinizada (llevar el plasma al suero,
añadiendo trombina) o
aproximadamente 3 ml de sangre tratada con EDTA o ACD (pasar el
plasma al suero, añadiendo cloruro cálcico)
El suero del probando debe analizarse en fresco o conservarse a una
temperatura mínima de -20°C.
Método
Material que se suministra
Lymphoscreen ABC 60 (1 microplaca [MZP] de análisis para 1 muestra)
Complemento [COMP] liofilizado del conejo (3x1 ml en cada envase)
Hojas de trabajo (6 unidades en cada envase)
2. Lavado con una centrífuga de placas
- Se descongela brevemente Lymphoscreen ABC 60 a temperatura ambiente
(18...22°C).
Atención:
¡debe apreciarse hielo en los pocillos!
¡No se deben descongelar más de dos placas [MZP] a la
vez!
- Se pipetean de inmediato 20 µl del medio de lavado con el dispensador de
Terasaki en cada pocillo.
- Se centrifuga inmediatamente las placas [MZP] a 1000 x g durante 30
segundos (sin frenos).
- Se aspira cuidadosamente el medio de lavado con un cabezal aspirador de 6
tomas a través de una bomba de aire con chorro de agua.
Atención: el cabezal de aspiración debe colocarse en los bordes de la
concavidad, para que sólo se aspire el medio y no las células sedimentadas.
- Se recubre Lymphoscreen ABC 60 con aceite (approx. 5µl a cada pocillo).
Lymphoscreen ABC 60 está ya preparado para el ensayo de microcitotoxicidad linfocitaria.
Prueba de microlinfocitotoxicidad
- Se pipetean 2 µl de los controles negativos cada vez en los pocillos 1A y 1B.
- Se pipetean 2 µl de los controles positivos cada vez en los pocillos 10A y 10B.
Se marcan sobre la placa [MZP] los controles positivos.
- Se pipetean 2 µl del suero del probando en los demás pocillos (1C a 10C).
- Se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente (18...22°C).
- El complemento [COMP] se reconstituye 15 minutos antes de que termine el
periodo de incubación con el volumen de agua destilada señalada en la
etiqueta, balanceando ligeramente el recipiente. ¡NO VOLVER A CONGELAR!
¡DESECHAR LOS RESTOS DE COMPLEMENTO!
- Se añaden 5-6 µl del complemento [COMP] a cada pocillo.
- Se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente (18...22°C).
- Se tiñen las células de cada cavidad con 3-4 µl de 5% eosina Y durante aprox.
3 minutos.
- Se fijan los reactivos de cada cavidad con 6-7 µl de formaldehído.
- Se tapa la placa preparada con un cubreobjetos y la lectura se realiza, como
pronto, 30 minutos después de que concluya el ensayo. Si se conserva la
placa a 2...8°C, también se valora incluso durante tres días. La lectura se
realiza conforme a las hojas de trabajo que se adjuntan, en forma de
meandro: de 1A a 1F, de 2F a 2A, de 3A a 3F, etc.
*
Proveedor: Biotest
y
nl
O
Fo
r
R
ef
er
en
ce
Posibilidades de error
Si el control negativo contiene más de 10% de linfocitos lisados y la toxicidad de
fondo es >10%, se repetirá el ensayo.
Las posibles causas comprenden:
1. Lymphoscreen ABC 60 se mantuvo expuesto durante mucho tiempo a
temperatura ambiente después de desempaquetarlo.
2. Lymphoscreen ABC 60 se conservó a una temperatura menos fría que 70ºC.
3. Lymphoscreen ABC 60 estaba totalmente descongelado antes de añadir
el medio de lavado.
Si el control positivo contiene menos de 80% de linfocitos lisados, se repetirá el
ensayo. Entre las posibles causas se encuentran:
1. Actividad insuficiente del complemento.
2. Dilución del anticuerpo detector por eliminación inadecuada del medio de
lavado.
3. Los envases abiertos o algunas placas [MZP] se conservaron
conjuntamente con el hielo seco.
Ni en las directivas de la ASHI (American Society for Histocompatibility and
Immunogenetics) ni en las de la EFI (European Federation of
Immunogenetics) se nombran los antígenos HLA que deberían estar incluidos
en un panel de identificación de anticuerpos HLA-ABC. Por eso, los donantes
se escogen de tal modo que, en lo posible, estén presentes todos los
antígenos HLA-ABC conocidos.
Las frecuencias de fenotipos varían en función de las diferentes poblaciones.
Por eso, los antígenos representados en Lymphoscreen ABC 60 pueden
presentar diferencias con respecto a la frecuencia de antígenos de la
población de la que procede la muestra sometida a prueba.
En Lymphoscreen ABC 60 se han utilizado eminentemente células de origen
caucasoide.
se
Valoración de las reacciones
La lectura se realiza con un microscopio invertido de contraste de fases. Los
linfocitos vitales aparecen claros y brillantes (= reacción negativa) y los lisados,
oscuros y de mayor tamaño (= reacción positiva).
El porcentaje de linfocitos lisados, con respecto a la población total de linfocitos,
se indica como valor índice.
% de celulas lisadas
Valoración
0 - 10% =
Índice 1
negativo
11 - 20% =
Índice 2
dudosamente negativo
21 - 50% =
Índice 4
débilmente positivo
51 - 80% =
Índice 6
positivo
81 - 100% =
Índice 8
muy positivo
Índice 0
no valorable
Las reacciones valoradas se anotarán en la columna correspondiente de la hoja
de trabajo. Los antígenos de las células con reacción positiva se pueden marcar
con un rotulador en la tabla antigénica. La especificidad HLA del anticuerpo se
puede definir por la selección de los antígenos que están completamente
marcados.
Si no se puede valorar la especificidad, se indicará la suma de las reacciones
positivas como porcentaje de todo el grupo (% PRA = % Panel Reactive
Antibodies - % de anticuerpos reactivos del grupo).
Número de reaccionnes positivas
% PRA = ---------------------------------------------------------- x 100
Número total de suspensiones linfocíticas
Bibliografia
1992.
1996. Tissue Antigens 49: 297-321, 1997
devices.
U
Control de calidad
Las posiciones del control negativo son 1A y 1B, y permiten comprobar la
vitalidad de los linfocitos. La vitalidad debería ser superior al 90%.
Las posiciones del control positivo son 10A y 10B, y permiten comprobar la
actividad del complemento. El control positivo debería contener más de un
80% de linfocitos lisados.
Características específicas
Para la exploración e identificación de anticuerpos HLA-ABC citotóxicos y
dependientes del complemento, en Lymphoscreen ABC 60 se han utilizado
linfocitos de donantes que previamente se han sometido a pruebas con los
correspondientes antisueros HLA. La hoja de trabajo adjunta incluye una lista
de los antígenos incluidos.
Cada lote se debe examinar con un número mínimo de 10 sueros problema antiHLA-ABC escogidos. El porcentaje de resultados falsamente positivos no debe
exceder del 10% y el de falsamente negativos no debe hacerlo del 5%. Si se
examina un suero control negativo, la vitalidad de los linfocitos a de resultar,
como mínimo, del 90%. Si se examina un solo control positivo, deberán aparecer
como mínimo, un 90% de células lisadas en cada pocillo.
Datos de la comparación entre Lymphoscreen ABC 60 y un panel de células
fabricado conforme a las directivas de la ASHI:
78/101 Los sueros resultaron negativos en ambas pruebas
22/101 Los sueros resultaron positivos en ambas pruebas
1/101
El suero resultó positivo sólo en Lymphoscreen ABC 60
B
Biotest
M Biotest,
Germany Tel.: +49-6103-801-0, Fax: +49-6103-801-140
|

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