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ANCA
Test System
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Per Uso Professionale
Para El Uso Profesional
Für Professionellen Gebrauch
För yrkesmässigt bruk
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Français
7
Italiano
12
Español
17
Deutsch
22
Svensk
27
Bibliography
32
Bibliographie/Riferimenti
Bibliografici/Bibliographie/Bibliografi
ANCA TEST SYSTEM
FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE
SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST
Intended Use: This is an indirect fluorescent antibody
test for the semi-quantitative detection of antineutrophil
cytoplasmic autoantibodies (ANCA) in human serum.
The test system is to be used as an aid in the detection
of antibodies associated with autoimmune vasculitis.
Antineutrophil cytoplasmic autoantibodies (ANCA) are
a group of antibodies that react with cytoplasmic antigens in human neutrophils. Although these antibodies
were originally reported in 1964 (1), the first report linking
these antibodies to disease was in 1982, when Davies
et al reported the antibodies in eight patients with
segmental necrotizing glomerulonephritis (2). In 1984,
four more patients with vasculitis and glomerulonephritis
were reported. In 1985, van der Woude et al showed
that ANCA had a high association with Wegener’s
granulomatosis, and that antibody titer correlated with
disease activity (3). In 1988, Falk and Jennette reported
that ANCA have more than one antigen specificity
(4). A subsequent report showed that the specificity
of ANCA correlated with the pathologic features of
vasculitides (5).
In the immunofluorescent test for ANCA, several
patterns of cellular staining may be seen. Two major
patterns of staining have been described and well
characterized when ethanol-fixed neutrophils are used
in the immunofluorescent ANCA test. Autoantibodies
that show a fine granular cytoplasmic pattern, called
cANCA, are usually directed against a serine protease,
Proteinase 3 (PR-3). These autoantibodies have been
shown to have a high association with Wegener’s
granulomatosis. The other major pattern of staining,
the perinuclear, or pANCA pattern, which is usually
due to antibodies directed against myeloperoxidase
(MPO), has been associated with systemic vasculitis
and idiopathic necrotizing and crescentic glomerulonephritis (4). The pANCA pattern is an artifact induced
by the use of ethanol as a fixative (4). If the neutrophils
are fixed in formalin, myeloperoxidase (the major
antigen responsible for the pANCA pattern in ethanol
fixed cells) remains associated with the primary (alpha)
granules, and shows a granular cytoplasmic distribution.
Proteinase-3 (PR-3) remains associated with the primary
(alpha) granules in either ethanol or formalin fixatives.
PRINCIPLE OF THE TEST
The Immuno Concepts antineutrophil cytoplasmic
autoantibodies (ANCA) test uses the indirect fluorescent
antibody (IFA) technique first described by Weller and
Coons (6). Diluted patient samples are incubated with
human neutrophils, which are fixed on glass microscope
slides, to allow specific binding of ANCA. If ANCA
are present, the autoantibodies bind to neutrophilic
antigens. After washing to remove non-specific antibodies, the substrate is incubated with anti-human IgG
conjugated to fluorescein. When results are positive
there is the formation of a stable three-part complex
consisting of fluorescent anti-human antibody bound
to human ANCA which are bound to antigen located
in the cells. This complex can be visualized with the aid
of a fluorescent microscope. Samples that are positive
for cANCA will show a distinctive granular cytoplasmic
staining of the neutrophils on both ethanol and formalin
fixed slides. In samples that are positive for pANCA, a
diffuse or peripheral nuclear staining of the neutrophils
will be seen on ethanol fixed cells, and a granular staining of the cytoplasm will be seen on formalin fixed cells.
If the sample is negative for ANCA, specific staining of
the neutrophils will not be seen.
SYSTEM COMPONENTS (MATERIALS PROVIDEd)
ANCA Substrate Slides:* Catalog No. 10010-11 (Ethanol
fixed) or 10010-12 (Formalin fixed). Ten well slides containing human neutrophils stabilized and fixed directly
on the test wells. Unique moat slide design minimizes
cross contamination of wells during testing. Slides
include four control wells designated pANCA, cANCA,
negative, and blank, to aid in proper interpretation of
results.
ANCA Sample Diluent: Catalog number 10100 (100
ml) Proprietary buffered sample diluent used to dilute
patient samples.
cANCA Positive Control: Catalog number 10021-12.
Ready to use dropper vial containing 1.0 ml of cANCA
positive human control serum. This serum demonstrates
granular staining of the cytoplasm between the nuclear
segments of the neutrophils on both ethanol and
formalin fixed slides. This reagent contains 0.1% sodium
azide as a preservative.
pANCA Positive Control: Catalog number 10021-11.
Ready to use dropper vial containing 1.0 ml of pANCA
positive human control serum. This serum demonstrates
diffuse or peripheral nuclear staining of the neutrophils
on ethanol fixed slides and granular cytoplasmic fluorescence on formalin fixed slides. This reagent contains
0.1% sodium azide as a preservative.
cANCA Titratable Control: Catalog number 10026-12.
Ready to use vial containing 0.25 ml of liquid stable
cANCA positive human control serum. This reagent
contains 0.1% sodium azide as a preservative. This control should be treated as an undiluted patient sample.
See label for mean titer information.
pANCA Titratable Control: Catalog number 10026-11.
Ready to use vial containing 0.25 ml of liquid stable
pANCA positive human control serum. This reagent
contains 0.1% sodium azide as a preservative. This control should be treated as an undiluted patient sample.
See label for mean titer information.
Negative Control: Catalog number 10031. Ready to
use dropper vial containing 1.0 ml of ANCA negative
human control serum. This serum demonstrates low
intensity, nonspecific dull green fluorescence of the
neutrophils. This reagent contains 0.1% sodium azide as
a preservative.
Fluorescent Antibody Reagent-IgG Specific: Catalog
number 10009 (9ml). Goat anti-human IgG conjugated
to fluorescein isothiocyanate (FITC). This reagent
contains Evans Blue as a counterstain. Reagent comes
ready to use in precision dropper bottles. This reagent
contains 0.1% sodium azide as a preservative.
*This slide is protected by one or more of the following
U.S. and foreign patents: 4387972, D-274261, D-273261,
Canadian patent 1171302, and other patents pending.
NON-REACTIVE REAGENTS
PBS Buffer: Catalog number 1011. Phosphate-buffered
saline powder (0.01 M, pH 7.4 ± 0.2). Each package
contains sufficient buffer powder to make 1 liter. (One
package of buffer powder is supplied for each five
slides in complete test kits).
Preparation: Dissolve one package of buffer powder in
1 liter of deionized or distilled water and store refrigerated between 2-10° C for up to 4 weeks or until signs of
contamination or other visible changes occur.
Semi-Permanent Mounting Medium: Catalog number
1111. Ready to use dropper vial containing 5 ml of glycerol-based mounting medium, pH 9.1 ± 0.2. This reagent
contains 0.1% sodium azide as a preservative.
Coverslips: Catalog number 1041. Each packet contains 10 24 x 60 mm No. 1 glass coverslips.
Use: All components come ready to use with no
aliquoting or reconstitution required (except the PBS
buffer which must be dissolved in deionized or distilled
water before use).
ADDITIONAL MATERIALS REQUIRED (BUT NOT
PROVIDED)
Storage: All components can be stored under refrigeration at 2-10°C. After reconstitution, PBS buffer should be
stored in screw-cap containers under refrigeration at
2-10°C for up to four weeks or until signs of contamination or other visible changes occur.
Stability: All components remain stable at least 12
months from date of manufacture. Do not use any
component beyond its expiration date.
REACTIVE REAGENTS
2
Volumetric pipettes to deliver 20-25 µl volumes
Coplin jars or staining dishes
Squeeze bottle or Pasteur pipettes
Serological pipettes
One liter containers (for PBS buffer)
Deionized or distilled water
Test tubes to prepare optional serial dilutions
Bibulous paper or paper towels
Chamber for incubation
Disposable latex gloves
Lab timer
Fluorescent microscope equipped with 495 nm
exciter filter and 515 nm barrier filter
cANCA positive control should show bright applegreen fluorescent granular cytoplasmic staining of the
neutrophils, between the nuclear segments on either
ethanol or formalin fixed slides. The pANCA positive
control should show bright apple-green diffuse or
peripheral nuclear staining of the neutrophils on ethanol
fixed slides, and granular cytoplasmic fluorescence on
formalin fixed slides. The negative control should not
exhibit any bright green fluorescence. Low intensity,
nonspecific dull green fluorescence may be observed
in the negative control. The blank control is used to
observe nonspecific fluorescence of the antibody
reagent, and should not exhibit any green fluorescent
staining. The counterstain provided in the conjugate
may stain the cells a dull red color. If the controls do
not appear as described, the test is invalid and should
be repeated.
PRECAUTIONS
1. All human source material used in the preparation
of controls for this product has been tested and
found to be negative (not repeatedly reactive) for
antibody to human immunodeficiency virus-1 and
human immunodeficiency virus-2 (HIV-1 & HIV-2),
antibody to hepatitis C virus (HCV), and for hepatitis
B surface antigen (HBsAg) by an FDA approved
method. No test method can offer complete assurance that HIV-1, HIV-2, hepatitis C virus, hepatitis B
virus, or other infectious agents are absent. Thus, all
control sera should be handled in the same manner
as potentially infectious materials.
2. All patient samples should be handled at the Biosafety Level 2 as recommended for any potentially
infectious human serum or blood specimen in the
Centers for Disease Control/National Institutes of
Health Manual: Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories, 1984 Edition.
3. Dilution of the components or substitution of components other than those provided in this system
may yield inconsistent results.
4. Sodium azide (0.1%) is used as a preservative. Sodium azide may react with lead or copper plumbing and form explosive metal azide salts. When
disposing of reagents, flush with ample volumes of
tap water to prevent potential residues in plumbing. Sodium azide is a poison and may be toxic if
ingested.
5. This kit is for in vitro diagnostic use.
6. The titratable control serum is intended for use in
monitoring lot to lot and run to run reproducibility.
It is not intended as a measurement of overall
sensitivity or specificity of the assay.
7. Do not smoke, eat, or drink in areas where specimens or kit reagents are handled.
8. Avoid splashing or generation of aerosols at all
times.
9. Incubation times and temperatures other than
those specified may give erroneous results.
10. Cross contamination of reagents or samples may
give false results.
11. Reusable glassware must be washed and thoroughly rinsed free of detergents prior to use. All
glassware must be clean and dry before use.
12. Bring all reagents, slides, and specimens to room
tempera-ture (18-24°C) prior to use.
13. Wear disposable latex gloves when handling specimens and reagents, and wash hands thoroughly
afterwards.
14. Microbial contamination of reagents or samples
may give false results.
15. Never pipette by mouth and avoid contact of
reagents and specimens with skin and mucous
membranes. If contact occurs, wash with a germicidal soap and copious amounts of water.
OPTIONAL TITRATABLE CONTROL
When reading titers, many laboratories begin reading
with the well that contains the most dilute sample and
read “backwards” to the 1:20 dilution. The first well in
which clearly discernible cytoplasmic staining is visible is
the titer end-point. We recommend this technique for
determining titer end-points.
The mean titer and titer range (± one dilution on either
side of the mean) determined for each lot number
were established in our laboratory and are stated as a
guide. This control is provided to allow each laboratory
to assess the reproducibility (precision) of its ANCA testing. Since this control is not intended to be an indicator
of titer accuracy, each laboratory should establish its
own mean titer end-point for this sample, and should
use this information to assess run-to-run reproducibility
(precision).
Through multiple testing of this titratable control, using
the Immuno Concepts Fluorescent ANCA Test Systems,
a mean titer value has been established for each lot
number. The lot number, mean titer and titer range (±
one twofold dilution on either side of the mean) are
stated on the vial label and should be used as a guide
for the test system performance.
The values obtained in our laboratory may differ from
your values. Some of the many factors that can affect
your results may include, but are not limited to:
1. Type of light source: Mercury light sources will
produce greater excitation energy at 495 nm than
Quartz/Halogen. The 50-watt, 100-watt, and 200watt Mercury light sources differ little in excitiation
energy at 495 nm. The 100-watt Quartz/Halogen
light sources will produce greater excitation energy
at 495 nm than 50-watt Quartz/Halogen.
2. Condition and age of the light source: This is
particularly true for Mercury light sources which
generally exhibit a gradual reduction in excitation
energy at 495 nm prior to burning out. This gradual
reduction in excitation energy can result in a
significant loss in sensitivity over several weeks. This
problem can be avoided by keeping a time log.
For best results, replace 50-watt mercury bulbs at
100 hours, and 100 or 200-watt mercury bulbs at 200
hours. Quartz/Halogen light sources generally do
not exhibit a gradual reduction in excitation energy
prior to burning out.
3. Type of exciter filter used: Interference exciter filters
provide greater sensitivity over a much narrower
wavelength than absorption exciter filters. Refer
to your fluorescent micro-scope manual or sales
representative for more information.
4. Proper alignment of the microscope light path:
Refer to your fluorescent microscope manual for
instructions.
5. Numerical aperture of the objective: With incident
light fluorescence (Epi), fluorescence is increased
exponentially as the numerical aperture (NA) of the
objective is increased additively. This may cause
a 40X objective with a NA of 0.65 to read one or
more dilutions lower than a 40X objective with a NA
of 0.85. The numerical aperture is printed on the
side of the objective. Sensitivity of transmitted light
fluorescent microscopy is not affected by NA.
6. Supression filters: Supression filters reduce specific
wavelengths of excitation and may be used in
reducing sensitivity. Refer to your fluorescent microscope manual or sales representative for more
information.
7. Precision and accuracy of dilution technique,
equipment, and performance of the test procedures.
SPECIMEN COLLECTION
Collection: Serum is the preferred specimen. Approximately 5 ml of whole blood should be collected aseptically by venipuncture using a sterile vacuum collection
tube or other suitable collection system. Allow blood to
clot at room temperature (18-24°C). Serum should be
separated from the clot as soon as possible to minimize
hemolysis.
Interfering Substances: Sera exhibiting a high degree
of hemolysis, icterus, lipemia, or microbial growth should
not be used because a decrease in antibody titer may
occur on positive samples. Specimens with very high
levels of lipid may cause a non-specific fluorescent film
to form over the cell substrate. Use of fasting specimens
or clearing specimens by ultracentrifugation may
eliminate this problem. Specimens containing visible
particulate matter should be clarified by centrifugation
before testing.
Storage: Sera may be stored at 2-10°C up to one week.
If testing is further delayed, sera should be stored frozen
at -20°C or lower. Serum should not be stored in a selfdefrosting freezer.
CAUTION: Repeated freeze/thawing of patient samples
may yield false positive or false negative results.
INTERPRETATION OF RESULTS
QUALITY CONTROL
Positive, negative and blank controls should be run in
the wells provided for quality control on each slide. The
INTERPRETATION OF PATIENT RESULTS
3
400X total magnification is recommended for viewing
the neutrophils.
Among the normal samples there were 22 samples that
were positive for ANA, and were considered uninterpretable for ANCA. The remaining discrepant samples
were tested for antibodies to MPO and PR3 using ELISA
tests to determine the true antibody status.
Negative: A serum is considered negative for ANCA if,
at a dilution of 1:20, green fluorescent staining of the
cells is less than or equal to the negative control well.
Non-specific background staining due to heterophile
antibodies or autoantibodies may be observed in the
neutrophils.
SERA PREVIOUSLY DETERMINED TO BE POSITIVE FOR
ANCA BY INDIRECT IMMUNOFLUORESCENCE
Serum samples which had been judged to be positive
for ANCA using in-house IFA assays were obtained from
reference laboratories in the USA, the United Kingdom,
and Australia. A total of 383 sera, which we expected
to be positive for ANCA, were examined in this part of
the study. These samples were tested in parallel using
the Immuno Concepts ANCA kit and another kit in commercial distribution. Discrepant samples were tested for
ANA using Immuno Concepts HEp-2 ANA Test System,
and for antibodies to MPO and PR3 using ELISA tests.
Positive: A serum is considered positive for ANCA if, at
a dilution of 1:20, the cells in each field demonstrate
granular cytoplasmic fluorescence similiar to that seen
with the cANCA control on either ethanol or formalin
fixed slides. Alternatively, a serum is considered positive
for ANCA if, at a dilution of 1:20, the cells demonstrate
diffuse or peripheral nuclear fluorescence similar to that
seen with the pANCA control on ethanol fixed slides.
REPORTING OF RESULTS
Screening: Results should be reported as positive or
negative at the 1:20 dilution.
Combining the results of the normal population and
the abnormal population, we obtained the following
data in the initial comparison for the Immuno Concepts
ANCA Test System with Ethanol Fixed Human Neutrophils
(Table 1):
Staining Patterns: Many autoantibodies can cause
staining of the cytoplasm and/or nucleus of the neutrophils. There are two major patterns of specific staining:
Comparison Method
cANCA (classical or cytoplasmic staining): Staining of
the alpha (primary) granules in the cytoplasm shows a
consistent speckled cytoplasmic staining pattern, often
with a concentration of staining between the lobes of
the nucleus. The cytoplasmic speckling will be seen
with either ethanol fixed or formalin fixed neutrophils.
IC
Posititve
Negative
Posititve
324
94
Negative
124
316
Ethanol
ANCA
These data yield the followingMéthode
comparative
statistics:
de comparaison
Relative sensitivity : 72.3%
Négatif
Relative specificity: 77.1% Positif
Overall agreement: 74.6%
pANCA (perinuclear staining): Smooth or homogeneous staining of the multi-lobed nucleus, often with
marked peripheral staining of the nuclear lobes on
ethanol fixed neutrophils. On formalin fixed neutrophils,
these antibodies show a granular cytoplasmic staining.
Éthanol IC
Positif
324
94
In
the initial comparison for the Immuno Concepts
ANCA
Négatif
124
316
ANCA Test System with Formalin Fixed Human Neutrophils we obtained the following data (Table 2):
Antinuclear and other autoantibodies can react with
the neutrophils, so all positive samples should be tested
for ANA using a HEp-2 cell substrate before reporting
the presence of ANCA.
Optional titering: Results should be reported as the
IC
reciprocal of the dilution of the last well in which a posiFormalin
tive reaction is seen.
Etanolo IC
ANCA
ANCA
LIMITATIONS OF THE TEST
Posititve
Posititvo
Negative
Negativo
Comparison Method
Metodo di confronto
Negative
Posititve
Posititvo
Negativo
255
52
324
94
45
124
528
316
1. Diagnosis cannot be made on the basis of antineuThese data yield the following comparative statistics:
trophil cytoplasmic antibody detection alone. The
decomparación
comparaison
Método de
Relative sensitivity : 85.0% Méthode
physician must interpret these results in conjunction
Relative specificity: 91.0%
with the patient’s history and symptoms, the physiPositif
Négatif
Negativo
Overall agreement: 89.0%Posititvo
cal findings, and other diagnostic procedures.
Positif
255
52
2. Treatment should not be initiated on the sole basis
Posititvo
324
94
Formol IC
Etanol
ManyICautoantibodies, other than those associated
of a positive test for antineutrophil cytoplasmic
ANCA
with
vasculitis, can45react with human
ANCAautoimmune
Négatif
528
antibodies. Clinical indications, other laboratory
124
316
Negativo
findings, and the physician’s clinical impression must neutrophils (8). In order to confirm that the antibodies detected by any immunofluorescent ANCA test
be considered before any treatment is initiated.
are clinically significant, confirmatory
tests using ELISA
Vergleichsmethode
3. Antinuclear antibodies present in patient samples
assays for myeloperoxidase (MPO)
and di
proteinase-3
Metodo
confronto
may react with the cell substrate. If antinuclear
Negativ
Posititv(9).
(PR-3) are strongly recommended
antibodies are present, the ANCA results can often
Posititvo
Negativo
All of the discrepant samples in the above tables
were
be interpreted because of the different character
Posititv
324 and for antibodies
94
tested
for
antinuclear
antibodies
IC
Äthanol
of the specific ANCA staining, differing titers, and/or
Posititvo
255
52
Formalina
to
MPO and PR-3. Taking the results of these tests into
intensity of reactions. If the fluorescent antinuclear
ANCA
124 for the Immuno
316
account,
see the overall results
IC ANCA weNegativ
antibody reaction is strong enough to obscure
Negativo
45
528
Concepts ANCA Test System with Ethanol Fixed Human
the ANCA staining, the test should be reported as
Neutrophils
in
Table
3:
“uninterpretable”, and an alternative method must
Método deMethod
comparación
Comparison
be used for determination of the patient’s ANCA
Jämförelsemetod
status.
Posititvo
Negativo
Posititve
Negative
Negativt
Positivt
4. Because of the many options available in fluoresPosititvo
cent microscopes, it is recommended that light
255
52
IC
IC
Formol
Posititve
380
32
Positivt
324
94
IC etanol
sources, filters, and optics be standardized when
Ethanol
ANCA
45
528
Negativo
comparing patient titers between laboratories.
ANCA
434
6
ANCA
Negative
124
316
Negativt
5. The results of this test should be used in conjunction
with information available from the clinical evaluaVergleichsmethode
tion and other diagnostic procedures to determine
These data yield the following comparative statistics:
the patient’s clinical status.
Negativ
Posititv
Relative sensitivity : 98.4% Méthode de comparaison
Posititv
EXPECTED VALUES
Positif
Négatif
255
52
IC Formalin
The expected value in the normal population is
ANCA
Positif
380
32
Negativ
45
528
negative at a 1:20 screening dilution. In patients
Éthanol
IC
The overall
results for the Immuno Concepts ANCA
with disease, titer values as high as 1:640 have been
ANCA
Test System with
Formalin Fixed6Human Neutrophils
are
Négatif
434
reported (7).
shown in Table 4:
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
NORMAL SAMPLES
Serum samples from 497 blood donors (247 males and
250 females) were tested in parallel using the Immuno
IC formalin
IC
Concepts ANCA kit and another kit in commercial
ANCA
distribution. All of the samples that were positive on eth- Formalin
Etanolo
IC
ANCA
anol fixed slides in this population were also tested for
ANCA
Antinuclear Antibodies (ANA) using Immuno Concepts
HEp-2 ANA Test System.
4
Positivt
Posititve
Negativt
Posititvo
Negative
Negativo
Jämförelsemetod
Comparison Method
Positivt
Negativt
Negative
Posititve
Metodo di confronto
255
52
Posititvo
Negativo
292
13
45
380
5
528
32
548
6
434
Méthode
dede
comparaison
Método
comparación
ANA test. This sample was judged to be a non-specific
reaction. All other sera in this population were negative
on both the ethanol fixed and formalin fixed neutrophils.
Since many autoantibodies can react non-specifically
with human neutrophils (8), positive immunofluorescent
tests should always be confirmed using specific assays
for the ANCA-associated antibodies.
These data yield the following comparative statistics:
Relative sensitivity : 98.3%
SERUM SAMPLES FROM PATIENTS WITH KNOWN VASCULITIDES
Samples obtained from 102 patients with clinically characterized vasculitides were tested using the Immuno
Concepts ethanol fixed neutrophils and the Immuno
Concepts formalin fixed neu-trophils. The results of this
comparison are shown in Table 5:
REPRODUCIBILITY
Intra-run, inter-day and inter-lot studies were performed
to demonstrate the reproducibility of the Immuno
Concepts ANCA Test System with Ethanol Fixed Human
Neutrophils and the Immuno Concepts ANCA Test
System with Formalin Fixed Human Neutrophils. The
sera used in this study included three pANCA positive
samples (one that exhibited strong staining, one that
exhibited moderate staining and one that exhibited
weak staining), and three cANCA positve samples (one
each that showed strong, moderate or weak staining).
Six samples which were negative for ANCA were also
used. In the intra-run study these 12 sera were tested in
replicates of six wells each. For inter-day and inter-lot
reproducibility, these 12 sera were each run on three
lot numbers of kits on three separate occasions. The
six negative samples were negative on all slides tested,
and the positive samples were positive, with consistent
fluorescent intensities, on all slides tested.
CROSS REACTIVITY
Sera from 57 patients with various autoimmune disorders
were tested on both the Immuno Concepts ANCA
Test System with Ethanol Fixed Human Neutrophils
and the Immuno Concepts ANCA Test System with
Formalin Fixed Human Neutrophils. Three of these
samples showed an atypical type of nuclear staining,
which resembled the pANCA pattern, on the ethanol
fixed neutrophils. All three of these samples were from
patients with SLE, were positive for anti-DNA antibodies and showed a positive ANA with a homogeneous
pattern. One additional sample showed cytoplasmic
speckling on the ethanol fixed neutrophils, but was
negative on the formalin fixed neutrophils and on the
TABLE 5
Clinical
Diagnosis
Staining Pattern
(Ethanol Fixed)
Number
Positive
Wegener's granulomatosus
30
26 (86.7%)
all cANCA
Polyarteritis nodosa
12
8 (66.7%)
all pANCA
Microscopic polyarteritis
20
18 (90.0%)
all pANCA
Churg-Strauss Syndrome
3
2 (66.7%)
one pANCA; one both pANCA and cANCA
Immune Complex Crescentic
15
10 (66.7%)
all pANCA
22
17 (77.3%)
all atypical pANCA
Glomerulonephritis
Inflammatory Bowel Disease
Diagnostic clinique
Image fluorescente
(fixation à l’éthanol)
Nombre
Positiif
Granulomatose de Wegener
30
26 (86,7%)
tous cANCA
Périartérite noueuse
12
8 (66,7%)
tous pANCA
Périartérite microscopique
20
18 (90,0%)
tous pANCA
Syndrome de Churg et Strauss
3
2 (66,7%)
un pANCA; un à la fois pANCA et cANCA
Glomérulonéphrite à croissants
15
10 (66,7%)
tous pANCA
22
17 (77,3%)
tous pANCA atypiques
Numero
Positivo
Pattern della colorazione
(fissaggio in etanolo)
Granulomatosi di Wegener
30
26 (86,7%)
tutti cANCA
Poliarterite nodosa
12
8 (66,7%)
tutti pANCA
Poliarterite microscopica
20
18 (90,0%)
tutti pANCA
Sindrome Churg-Strauss
3
2 (66,7%)
un pANCA; uno sia pANCA che cANCA
Immunocomplesso semilunare
15
10 (66,7%)
tutti pANCA
22
17 (77,3%)
tutti pANCA atipici
épithéliaux du complexe immun
Maladie intestinale inflammatoire
Diagnosi clinica
Glomerulonefrite
Malattia infiammatoria dell'intestino
Diagnóstico clínico
Número
Granulomatosis de Wegener
30
Positivo
Patrón de tinción
(fijados con etanol)
26 (86,7%)
todo cANCA
Poliarteritis nudosa
12
8 (66,7%)
todo pANCA
Poliarteritis microscópica
20
18 (90,0%)
todo pANCA
Síndrome de Churg-Strauss
3
2 (66,7%)
un pANCA; otro pANCA y cANCA
Glomerulonefritis por
15
10 (66,7%)
todo pANCA con semilunas
22
17 (77,3%)
todo pANCA atípicos
inmunocomplejos
Enfermedad inflamatoria intestinal
5
ANCA TEST PROCEDURE
1.
RECONSTITUTE BUFFER (PBS)
Dissolve contents of one buffer package in
1 liter of deionized or distilled water. Cover
and store at 2-10° C for up to four weeks or
until signs of contamination or other visible
changes occur.
2.
DILUTE PATIENT SAMPLES
Screening: Dilute patient samples to 1:20
by adding 0.05 ml (50 µl) of serum to 0.95 ml
(950 µl) of Sample Diluent.
Semi-Quantitative Titering: To make twofold serial dilutions of screening samples
(e.g. 1:40, 1:80, 1:160...1:640), remove 0.5
ml of the 1:20 dilution and mix with 0.5 ml of
sample diluent to achieve a 1:40 dilution,
and continue serial dilutions in this fashion.
3.
4.
5.
DILUTE OPTIONAL TITRATABLE CONTROL
Treat the optional titratable control as an
undiluted patient sample. Dilute the control
1:20 by adding 0.05 ml (50 µl) of the control
serum to 0.95 ml of Sample Diluent. Make
two-fold serial dilutions of the titratable
control as outlined above.
PREPARE SUBSTRATE SLIDES (20-25 µl/well)
Remove slide(s) from pouch(es) and place
control sera on control wells as follows:
Invert control dropper bottle and squeeze
gently until drop is visible at the tip. Gently
touch the drop to appropriate control well
while avoiding direct contact of dropper tip with slide surface. Place pANCA
positive control on well marked “pANCA”,
cANCA positive control on well marked
“cANCA”, negative control on well marked
“Neg”, and one drop of Sample Diluent on
well marked “Blank”. Add 1 drop (20-25
µl) of diluted patient sample to numbered
wells.
CAUTION: DIRECT CONTACT OF DROPPER
TIP WITH SLIDE SURFACE MAY RESULT IN DAMAGE TO THE ANTIGEN SUBSTRATE.
INCUBATE SLIDES (30 ± 5 minutes at room
temperature, i.e. 18-24°C)
Place slide(s) into a moist covered chamber (a petri dish with moistened paper
toweling will be adequate). Incubate, with
lid in place, for 30 minutes (± 5 minutes) at
room temperature (18-24°C).
6.
PBS RINSE
Remove slide(s) from incubator tray and
rinse briefly with PBS using a squirt bottle,
Pasteur, or serological pipette. Do not squirt
buffer directly on the wells.
NOTE: To avoid cross contamination on 10well slides, direct PBS stream along midline
of slide, tilting first toward wells 1-3 followed
by tilting toward wells 4-6.
7.
PBS WASH (10 minutes)
Wash slide(s) 10 minutes with PBS in a slide
staining dish or Coplin jar. Gentle agitation is recommended at slide immersion,
midpoint, and removal. This wash may be
extended up to 30 minutes with no variability in final test results. Discard PBS wash solution after use. For optimal results, change
PBS at midpoint and use a magnetic stirrer.
8.
FLUORESCENT ANTIBODY REAGENT (Cover
the wells with 10-12 drops)
Remove one slide at a time from PBS and
dip 3-5 times in deionized or distilled water.
Tap slide on its side against bibulous paper
or paper toweling to remove excess water.
Immediately return slide to the incubation
chamber and cover the wells completely
using fluorescent antibody reagent; begin
by placing a drop over each well. Repeat
for each slide. Fluorescent antibody reagent has been titered to compensate for
residual deionized or distilled water remaining on the slide after rinsing.
6
NOTE: It is important that slide wells do not
dry during this procedure or damage to the
substrate may occur.
DO NOT BLOT OR DRY THE SLIDE IN ANY
MANNER OR ALLOW SLIDE TO SIT WITHOUT
FLUORESCENT ANTIBODY REAGENT FOR
LONGER THAN 15 SECONDS.
9.
INCUBATE SLIDES (30 ± 5 minutes at room
temperature, i.e. 18-24°C)
Place lid on incubation chamber and cover with a paper towel to prevent exposure
to light if the chamber is not opaque. Allow
slide(s) to incubate 30 minutes (± 5 minutes)
at room temperature (18-24°C).
10.
PBS RINSE
Remove slide(s) from incubator tray and
rinse briefly with PBS. Do not squirt buffer
directly on the wells.
11.
PBS WASH (10 minutes)
Wash slide(s) 10 minutes with PBS in a slide
staining dish or Coplin jar. Gentle agitation is recommended at slide immersion,
midpoint, and removal. This wash may be
extended up to 30 minutes with no variability in final test results.
12.
MOUNT COVERSLIP
Remove one slide at a time from PBS and
dip 3-5 times in deionized or distilled water.
Tap slide on its side against bibulous paper
or paper toweling to remove excess water.
DO NOT BLOT OR DRY THE SLIDE IN ANY
MANNER OR ALLOW TO SIT WITHOUT COVERSLIP FOR LONGER THAN 15 SECONDS.
Add 4-5 drops of semi-permanent mounting
medium along midline of each slide. Carefully place coverslip in position, avoiding air
pockets, by gently lowering coverslip from
one end of the slide to the other.
NOTE: Excess mounting medium on the
slide may result in high background fluorescence due to light scattering, or lack
of clear resolution of cells (blurred image).
Excess mounting medium may be removed
from slide by gently blotting coverslip with
bibulous or lens paper while avoiding any
direct movement of the coverslip.
For Technical Assistance:
1-800-251-5115 (Toll Free) or e-mail:
[email protected]
SYSTÈME DE TEST ANCA
un récipient à bouchon à vis au réfrigérateur entre 2
et 10 °C pendant 4 semaines maximum ou jusqu’à ce
que des signes de contamination ou de modifications
visibles apparaissent.
POUR UTILISATION DIAGNOSTIQUE IN VITRO
RÉSUMÉ ET EXPLICATION DU TEST
Stabilité : Tous les composants sont stables pendant
12 mois à partir de la date de fabrication. Ne pas utiliser
les composants au-delà de leur date de péremption.
UTILISATION PRÉVUE : Il s’agit d’un test
d’immunofluorescence indirecte pour la détection
semi-quantitative des auto-anticorps anti-neutrophiles
cytoplasmiques (ANCA) dans le sérum humain. Le
système doit être utilisé comme une aide à la détection
des anticorps associés à la vascularite auto-immune.
RÉACTIFS
Lames de substrat ANCA : * Réf. catalogue 10010-11
(fixées à l’éthanol) ou 10010-12 (fixées au formol).
Lames à dix puits contenant des neutrophiles humains
stabilisés et fixés directement sur les puits de test. Le
concept unique de la lame recouverte de téflon
(Moat™) évite toute contamination croisée entre les
puits pendant le test. Les lames comprennent quatre
puits de contrôle désignés pANCA, cANCA, négatif et
blanc pour faciliter l’interprétation des résultats.
Les auto-anticorps anti-neutrophiles cytoplasmiques
(ANCA) sont un groupe d’anticorps qui réagissent avec
les antigènes cytoplasmiques dans les neutrophiles
humains. Bien que ces anticorps aient été initialement
signalés en 1964 (1), le premier rapport associant ces
anticorps à la maladie date de 1982, lorsque Davies
et al les ont observés chez huit patients atteints de
glomérulonéphrite nécrosante segmentaire (2). En 1984,
quatre autres patients souffrant de vascularite et de
glomérulonéphrite ont été signalés. En 1985, van der
Woude et al ont montré que l’ANCA était fortement
associé à la granulomatose de Wegener et que le titre
de l’anticorps était corrélé à l’activité de la maladie
(3). En 1988, Falk et Jennette ont rapporté que l’ANCA
avait plusieurs spécificités antigéniques (4). Une étude
ultérieure a démontré que la spécificité de l’ANCA
était corrélée aux caractéristiques pathologiques des
vascularites (5).
Diluant pour échantillon ANCA : Référence catalogue
10100 (100 ml) Diluant tamponné propriétaire, utilisé
pour diluer les échantillons de patient.
Contrôle positif cANCA : Référence catalogue 1002112. Flacon compte-gouttes prêt à l’emploi contenant
1,0 ml de sérum de contrôle humain positif cANCA. Ce
sérum présente une fluorescence granulaire du cytoplasme entre les segments nucléaires des neutrophiles
sur les lames fixées à l’éthanol et au formol. Ce réactif
contient 0,1 % d’azide de sodium (conservateur).
Dans le test d’immunofluorescence pour l’ANCA,
plusieurs images de fluorescence cellulaire peuvent
être observées. Deux images majeures ont été décrites
et bien caractérisées lorsque les neutrophiles fixés à
l’éthanol sont utilisés dans le test ANCA immunofluorescent. Les auto-anticorps qui présentent une image
cytoplasmique granulaire fine, appelés cANCA, sont
généralement dirigés contre une sérine protéase, la
protéinase 3 (PR-3). Il a été démontré que ces auto-anticorps sont fortement corrélés à la granulomatose de
Wegener. L’autre image majeure, l’image périnucléaire
ou pANCA, généralement attribuée à des anticorps dirigés contre la myéloperoxydase (MPO), a été associée
à la vascularite systémique et à la glomérulonéphrite
nécrosante idiopathique et à croissants épithéliaux (4).
L’image pANCA est un artéfact induit par l’utilisation
de l’éthanol comme fixateur (4). Si les neutrophiles sont
fixés dans le formol, la myéloperoxydase (principal
antigène responsable de l’image pANCA dans les
cellules fixées à l’éthanol) reste associée aux granules
(alpha) primaires et présente une répartition cytoplasmique granulaire. La protéinase-3 (PR-3) reste associée
aux granules (alpha) primaires dans les fixateurs éthanol
ou formol.
Contrôle positif pANCA : Référence catalogue 1002111. Flacon compte-gouttes prêt à l’emploi contenant
1,0 ml de sérum de contrôle humain positif pANCA.
Ce sérum présente une fluorescence nucléaire diffuse
ou périphérique des neutrophiles sur les lames fixées à
l’éthanol et une fluorescence cytoplasmique granulaire
sur les lames fixées au formol. Ce réactif contient 0,1 %
d’azide de sodium (conservateur).
Contrôle titrable cANCA : Référence catalogue 1002612. Flacon prêt à l’emploi contenant 0,25 ml de sérum
de contrôle humain positif cANCA stable liquide. Ce
réactif contient 0,1 % d’azide de sodium (conservateur). Ce contrôle doit être traité comme un échantillon
de patient non dilué. Voir l’étiquette du flacon pour
connaître le titre moyen.
Contrôle titrable pANCA: Référence catalogue 1002611. Flacon prêt à l’emploi contenant 0,25 ml de sérum
de contrôle humain positif pANCA stable liquide. Ce
réactif contient 0,1 % d’azide de sodium (conservateur). Ce contrôle doit être traité comme un échantillon
de patient non dilué. Voir l’étiquette du flacon pour
connaître le titre moyen.
PRINCIPE DU TEST
Contrôle négatif : Référence catalogue 10031. Flacon
compte-gouttes prêt à l’emploi contenant 1,0 ml de
sérum de contrôle humain négatif ANCA. Ce sérum
présente une fluorescence vert sombre non spécifique
peu intense des neutrophiles. Ce réactif contient 0,1 %
d’azide de sodium (conservateur).
Le test des auto-anticorps anti-neutrophiles cytoplasmiques (ANCA) d’Immuno Concepts utilise la technique
d’immunofluorescence indirecte (IFA) initialement
décrite par Weller et Coons (6). Les échantillons de
patient dilués sont mis à incuber avec des neutrophiles
humains qui sont fixés sur des lames de microscope en
verre pour permettre la liaison spécifique des ANCA.
En présence d’ANCA, les auto-anticorps se lient aux
antigènes neutrophiles. Après le rinçage destiné à
éliminer les anticorps non spécifiques, le substrat est mis
à incuber avec de l’IgG anti-humaine conjuguée à de
la fluorescéine. Lorsque les résultats sont positifs, on observe la formation d’un complexe tripartite stable composé d’un anticorps anti-humain fluorescent lié à un
auto-anticorps anti-neutrophile cytoplasmique humain,
lui-même lié à un antigène situé dans les cellules. Ce
complexe peut être visualisé à l’aide d’un microscope
à fluorescence. Les échantillons positifs au cANCA
présentent une fluorescence cytoplasmique granulaire
caractéristique des neutrophiles sur les lames fixées à
l’éthanol et au formol. Dans les échantillons positifs au
pANCA, on observe une fluorescence nucléaire diffuse
ou périphérique des neutrophiles sur les cellules fixées à
l’éthanol et on note une fluorescence granulaire du cytoplasme sur les cellules fixées au formol. Si l’échantillon
est négatif à l’ANCA, aucune fluorescence spécifique
des neutrophiles n’est observée.
Réactif immunofluorescent - Spécifique à l’IgG :
Référence catalogue 10009 (9 ml). Globuline de chèvre
anti-IgG humaine conjuguée à de l’isothiocyanate de
fluorescéine (FITC). Ce réactif contient du bleu d’Evans
comme contre-colorant. Le réactif est fourni dans des
flacons compte-gouttes de précision prêts à l’emploi.
Ce réactif contient 0,1 % d’azide de sodium (conservateur).
* Cette lame est protégée par un ou plusieurs des
brevets suivants déposés aux États-Unis et à l’étranger :
4387972, D-274261, D-273261, brevet canadien 1171302
et autres brevets en attente.
RÉACTIFS NÉGATIFS
Tampon PBS : Référence catalogue 1011. Solution saline
en poudre tamponnée au phosphate (0,01 M, pH 7,4
± 0,2). Chaque sachet contient une quantité suffisante
de poudre tampon pour préparer 1 litre de solution.
Chaque kit de test complet contient un sachet de
poudre tampon pour cinq lames.
COMPOSITION DES SYSTÈMES (MATÉRIELS FOURNIS)
Préparation : Dissoudre un sachet de poudre tampon
dans 1 litre d’eau désionisée ou distillée et conserver
au réfrigérateur entre 2 et 10 °C pendant 4 semaines
maximum ou jusqu’à ce que des signes de contamination ou de modifications visibles apparaissent.
Utilisation : Tous les composants sont prêts à l’emploi
et ne requièrent ni aliquotage ni reconstitution (sauf
pour le tampon PBS qui doit être dissous dans une eau
désionisée ou distillée avant utilisation).
Conservation : Tous les composants peuvent être
conservés au réfrigérateur entre 2 et 10°C. Après
reconstitution, le tampon PBS doit être conservé dans
Milieu de montage semi-permanent : Référence
catalogue 1111. Flacon compte-gouttes prêt à l’emploi
7
PRÉLÈVEMENT D’ÉCHANTILLONS
contenant 5 ml de milieu de montage à base de
glycérol, pH 9,1 ± 0,2. Ce réactif contient 0,1 % d’azide
de sodium (conservateur).
Prélèvement : Le sérum est l’échantillon préférentiel.
Environ
5 ml de sang entier doivent être prélevés de manière
aseptique par ponction veineuse à l’aide d’un tube à
prélèvement sous vide stérile ou tout autre système de
prélèvement adapté. Laisser le sang coaguler à température ambiante (18-24°C). Le sérum doit être séparé
du caillot aussi rapidement que possible, de façon à
limiter l’hémolyse.
Lamelles couvre-objet : Référence catalogue 1041.
Chaque paquet contient 10 lamelles
couvre-objet en verre n°1 de 24 x 60 mm.
MATÉRIEL SUPPLÉMENTAIRE REQUIS (MAIS NON FOURNI)
Pipettes volumétriques permettant de prélever 20 à
25 µl
Jarres Coplin ou cuves à coloration
Pissette en plastique ou pipettes Pasteur
Pipettes sérologiques
Récipients d’un litre (pour tampon PBS)
Eau désionisée ou distillée
Tubes à essai pour préparer les dilutions successives
facultatives
Papier absorbant ou serviettes en papier
Chambre d’incubation
Gants en latex jetables
Chronomètre de laboratoire
Microscope à fluorescence équipé d’un filtre
d’excitation de 495 nm et d’un filtre d’émission
de 515 nm.
Substances interférentes : Les sérums présentant un
degré élevé d’hémolyse, d’ictère, de lipémie ou de
prolifération microbienne doivent être écartés car une
réduction du titre de l’anticorps peut survenir sur les
échantillons positifs. Les échantillons dont les niveaux
de lipide sont très élevés peuvent entraîner la formation d’un film fluorescent non spécifique sur le substrat
cellulaire. L’utilisation d’échantillons prélevés à jeun
ou d’échantillons clarifiés par ultracentrifugation peut
éliminer ce problème. Les échantillons contenant des
particules visibles doivent être clarifiés par centrifugation avant de procéder au test.
PRÉCAUTIONS
1. Tous les matériels d’origine humaine utilisés dans
la préparation des contrôles pour ce produit ont
été testés et se sont révélés négatifs (non-réactivité répétée) vis-à-vis des anticorps des virus de
l’immunodéficience humaine 1 et 2 (vih 1 et 2),
de l’anticorps du virus de l’hépatite C (hcv) et
de l’antigène de surface de l’hépatite B (hbsag),
selon les méthodes approuvées par la fda. Aucune
méthode de test ne peut assurer totalement
l’absence de vih-1, vih-2, virus de l’hépatite C, virus
de l’hépatite C ou d’autres agents infectieux. Par
conséquent, tous les sérums de contrôle doivent
être manipulés de la même manière que des matériels considérés comme potentiellement infectieux.
2. Tous les échantillons de patient doivent être manipulés conformément aux recommandations du
niveau de biosécurité 2, comme pour tout échantillon de sérum ou de sang humain potentiellement
infectieux, telles qu’indiquées dans le manuel du
Centers for Disease Control/National Institutes of
Health : Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 1984 Edition.
3. La dilution des composants ou l’utilisation de composants autres que ceux fournis dans ce système
peut donner lieu à des résultats incohérents.
4. L’azide de sodium (0,1 %) est utilisé comme
conservateur. Il est possible que l’azide de sodium
réagisse au contact des canalisations en plomb
ou en cuivre et forme des sels d’azides métalliques
explosifs. Lors de l’élimination des réactifs, rincer
abondamment les canalisations avec de l’eau afin
d’éviter toute accumulation de résidus. L’azide de
sodium est un poison et peut être toxique en cas
d’ingestion.
5. Ce kit est destiné à une utilisation diagnostique in
vitro.
6. Le sérum de contrôle titrable est destiné à être
utilisé pour surveiller la reproductibilité inter-lot
et inter-analyse. Il n’est pas destiné à mesurer la
sensibilité ou la spécificité globale de l’essai.
7. Ne pas fumer, manger ni boire dans les zones où
des échantillons ou des réactifs du kit sont manipulés.
8. Éviter toute éclaboussure ou pulvérisation
d’aérosols à tout moment.
9. Les durées et températures d’incubation autres
que celles spécifiées peuvent donner des résultats
erronés.
10. La contamination croisée des réactifs ou des
échantillons peut donner de faux résultats.
11. Avant utilisation, la verrerie réutilisable doit être
lavée et rincée soigneusement afin d’éliminer tout
détergent. Toute la verrerie doit être propre et
sèche avant utilisation.
12. Avant utilisation, porter les réactifs, lames et échantillons à température ambiante (18-24 °C).
13. Porter des gants en latex jetables pour manipuler
les échantillons et réactifs puis se laver soigneusement les mains par la suite.
14. La contamination microbienne des réactifs ou des
échantillons peut donner de faux résultats.
15. Ne pas pipeter avec la bouche et éviter tout
contact de la peau et des muqueuses avec les
réactifs et les échantillons. En cas de contact, laver
abondamment avec un savon germicide et de
l’eau.
Conservation : Les sérums peuvent être conservés entre
2 et 10 °C pendant une semaine maximum. Si le test est
reporté, ils doivent être congelés à -20 °C minimum. Le
sérum ne doit pas être conservé dans un congélateur à
dégivrage automatique.
ATTENTION : Les congélations et décongélations successives des échantillons de patient peuvent induire des
résultats faussement positifs ou faussement négatifs.
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
CONTRÔLE DE QUALITÉ
Les contrôles positif, négatif et blanc doivent être
effectués dans les puits dédiés au contrôle qualité sur
chaque lame. Le contrôle positif cANCA doit présenter
une fluorescence cytoplasmique granulaire vert
pomme intense des neutrophiles, entre les segments nucléaires sur les lames fixées à l’éthanol ou au formol. Le
contrôle positif pANCA présente une fluorescence nucléaire diffuse ou périphérique vert pomme intense des
neutrophiles sur les lames fixées à l’éthanol et une fluorescence cytoplasmique granulaire sur les lames fixées
au formol. Le contrôle négatif ne doit pas présenter
de fluorescence vert intense. Une fluorescence vert
sombre non spécifique peu intense peut être observée
dans le contrôle négatif. Le contrôle à blanc est utilisé
pour observer la fluorescence non spécifique du réactif
anticorps et ne doit pas présenter d’image fluorescente
verte. Le contre-colorant fourni dans le conjugué peut
donner aux cellules une couleur rouge sombre. Si les
contrôles n’apparaissent pas tel que décrit, le test n’est
pas valable et doit être recommencé.
CONTRÔLE TITRABLE OPTIONNEL
Lors de la lecture des titres, de nombreux laboratoires
commencent par lire le puits qui contient l’échantillon
le plus dilué puis poursuivent « à rebours » jusqu’à la dilution 1:20. Le premier puits dans lequel une fluorescence
cytoplasmique clairement perceptible est visible, est
le résultat du titrage. Nous recommandons cette technique pour la détermination des résultats de titrage.
Le titre moyen et la plage de titrage (± une dilution
de part et d’autre de la moyenne) déterminés pour
chaque numéro de lot ont été établis dans notre
laboratoire et sont communiqués à titre indicatif. Ce
contrôle est fourni pour permettre à chaque laboratoire
d’évaluer la reproductibilité (précision) de son test
ANCA. Étant donné que ce contrôle n’est pas destiné
à être un indicateur de la précision du titrage, chaque
laboratoire doit établir sa propre référence de titrage
moyen pour cet échantillon et utiliser cette information
pour évaluer la reproductibilité inter-analyse (précision).
Par de multiples dosages de ce contrôle titrable
réalisés à l’aide du système de test ANCA fluorescent
d’Immuno Concepts, une valeur de titre moyen a été
établie pour chaque numéro de lot. Le numéro de lot,
le titre moyen et la plage de titrage (± une double dilution de part et d’autre de la moyenne) sont indiqués
sur l’étiquette du flacon et doivent être utilisés à titre
indicatif pour la performance du système.
Les valeurs obtenues dans notre laboratoire peuvent
différer de vos propres valeurs. De nombreux facteurs
peuvent affecter vos résultats, notamment :
1. Type de source lumineuse : Les sources de lumière
8
2.
3.
4.
5.
6.
7.
au mercure génèreront une plus grande énergie
d’excitation à 495 nm que le quartz/l’halogène. Les
sources de lumière au mercure 50 watts, 100 watts
et 200 watts diffèrent peu en matière d’énergie
d’excitation à 495 nm. Les sources de lumière
au quart/à l’halogène 100 watts produiront une
plus grande énergie d’excitation à 495 nm que le
quartz/l’halogène 50 watts.
État et durée de vie de la source lumineuse : Cela
est particulièrement vrai pour les sources de lumière
au mercure qui affichent généralement une réduction progressive de l’énergie d’excitation à 495 nm
avant de griller. Cette réduction progressive peut
entraîner une perte de sensibilité significative au fil
des semaines. Ce problème peut être résolu par la
tenue d’un journal. Pour de meilleurs résultats, remplacer les ampoules au mercure de 50 watts toutes
les 100 heures et les ampoules au mercure de 100
ou 200 watts toutes les 200 heures. Les sources de
lumière au quartz/halogène n’affichent généralement pas de réduction progressive de l’énergie
d’excitation avant de griller.
Type de filtre d’excitation utilisé : Les filtres
d’excitation interférentiels offrent une plus grande
sensibilité sur une longueur d’onde beaucoup plus
étroite que les filtres d’excitation absorbants. Se reporter au manuel du microscope à fluorescence ou
contacter le représentant pour plus d’informations.
Alignement correct de l’axe optique du microscope : Pour les instructions, se reporter au manuel
du microscope à fluorescence.
Ouverture numérique de l’objectif : Grâce à la
lumière incidente (Epi), la fluorescence augmente
de manière exponentielle à mesure que l’ouverture
numérique (ON) de l’objectif augmente. Cela peut
conduire un objectif 40X avec une NA de 0,65 à lire
une ou plusieurs dilutions inférieures à un objectif
40X avec une ON de 0,85. L’ouverture numérique
est indiquée sur le côté de l’objectif. La sensibilité
de la microscopie à fluorescence à lumière transmise n’est pas affectée par l’ON.
Filtres de suppression : Les filtres de suppression
réduisent les longueurs d’onde d’excitation
spécifiques et peuvent être utilisés pour réduire la
sensibilité. Se reporter au manuel du microscope
à fluorescence ou contacter le représentant pour
plus d’informations.
Précision et exactitude de la technique de dilution,
de l’équipement et de la réalisation des procédures de test.
nucléaires sur les neutrophiles fixés à l’éthanol. Sur les
neutrophiles fixés au formol, ces anticorps présentent
une fluorescence cytoplasmique granulaire.
Les auto-anticorps antinucléaires et autres peuvent
réagir avec les neutrophiles, tous les échantillons positifs
doivent donc être testés pour l’ANA à l’aide d’un
substrat de cellules HEp-2 afin de confirmer la présence
d’ANCA.
Titrage optionnel : Les résultats doivent être communiqués comme étant l’inverse de dilution du dernier puits
dans lequel une réaction positive a été observée.
LIMITES DU TEST
1. Le diagnostic ne peut pas être réalisé sur la base
de la détection des anticorps anti-neutrophiles
cytoplasmiques seuls. Le médecin doit interpréter
ces résultats au regard des antécédents et des
symptômes du patient, des observations physiques
et d’autres procédures de diagnostic.
2. Le traitement ne doit pas débuter sur la seule base
d’un test positif aux anticorps anti-neutrophiles
cytoplasmiques. Les indications cliniques, les autres
analyses de laboratoire et le diagnostic clinique
du médecin doivent être pris en compte avant de
commencer tout traitement.
3. Les anticorps anti-nucléaires présents dans les
échantillons de patient peuvent réagir avec le
substrat cellulaire. Si des anticorps anti-nucléaires
sont présents, les résultats ANCA peuvent souvent
être interprétés en raison du caractère différent
de la fluorescence ANCA spécifique, des titres
divergents et/ou de l’intensité des réactions. Si la
réaction fluorescente des anticorps anti-nucléaires
est suffisamment forte pour masquer la fluorescence ANCA, le test doit être rapporté comme
étant « non interprétable » et une autre méthode
doit être utilisée pour la détermination des ANCA
du patient.
4. En raison des nombreuses options disponibles sur
les microscopes à fluorescence, il est recommandé
que les sources de lumière, les filtres et les optiques
soient normalisés lors de la comparaison des titres
de patient entre plusieurs laboratoires.
5. Les résultats de ce test doivent être utilisés conjointement aux informations disponibles provenant
de l’évaluation clinique et d’autres procédures de
diagnostic afin de déterminer l’état clinique du
patient.
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS DU PATIENT
VALEURS ESCOMPTÉES
Un grossissement total de 400X est recommandé pour la
visualisation des neutrophiles.
La valeur escomptée dans la population saine est
négative à une dilution de test de 01:20:00. Chez les patients présentant une maladie, on a relevé des valeurs
de titre élevées, pouvant atteindre 1:640 (7).
Négatifs : Un sérum est considéré comme négatif aux
ANCA si, à une dilution à 1:20, la fluorescence verte
des cellules est inférieure ou égale à celle observée
pour le puits du contrôle négatif. Une fluorescence de
fond non spécifique due à des anticorps hétérophiles
ou à des auto-anticorps peut être observée dans les
neutrophiles.
PERFORMANCES
ÉCHANTILLONS NORMAUX
Les échantillons de sérum de 497 donneurs de sang
(247 hommes et 250 femmes) ont été testés en parallèle
à l’aide du kit ANCA d’Immuno Concepts et d’un autre
kit disponible sur le marché. Tous les échantillons positifs
sur les lames fixées à l’éthanol de cette population ont
également été testés pour les anticorps anti-nucléaires
(ANA) à l’aide du système de test ANA HEp-2 d’Immuno
Concepts.
Positifs : Un sérum est considéré comme positif aux
ANCA si, à une dilution à 1:20, les cellules dans chaque
champ présentent une fluorescence cytoplasmique
granulaire similaire à celle observée avec le contrôle
cANCA sur les lames fixées à l’éthanol ou au formol.
Sinon, un échantillon de sérum est considéré comme
positif aux ANCA si, à une dilution à 1:20, les cellules
présentent une fluorescence nucléaire diffuse ou
périphérique similaire à celle observée avec le contrôle
pANCA sur les lames fixées à l’éthanol.
Parmi les échantillons normaux, 22 étaient positifs à
l’ANA et ont été considérés comme non interprétables
pour l’ANCA. Les échantillons discordants restants
ont été testés pour les anticorps anti-MPO et PR3 à
l’aide des tests ELISA afin de déterminer le niveau des
anticorps.
COMMUNICATION DES RÉSULTATS
Test : Les résultats doivent être notés comme étant
positifs ou négatifs à la dilution 1:20.
SÉRUMS PRÉCÉDEMMENT DÉTERMINÉS COMME POSITIFS À
L’ANCA PAR IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE
Images fluorescentes : De nombreux auto-anticorps
peuvent entraîner une fluorescence du cytoplasme
et/ou du noyau des neutrophiles. Il existe deux images
principales de fluorescence spécifique :
On s’est procuré auprès de laboratoires de référence
aux États-Unis, au Royaume-Uni et en Australie des
échantillons de sérum jugés positifs à l’ANCA à l’aide
de dosages IFA internes. Un total de 383 sérums, dont
on suspectait la positivité à l’ANCA, ont été examinés
dans le cadre de cette étude. Ces échantillons ont
été testés en parallèle à l’aide du kit ANCA d’Immuno
Concepts et d’un autre kit disponible sur le marché.
Les échantillons discordants ont été testés pour l’ANA
à l’aide du système de test ANA HEp-2 d’Immuno
Concepts et pour les anticorps anti-MPO et PR3 à l’aide
des tests ELISA.
cANCA (fluorescence classique ou cytoplasmique) : La
fluorescence des granules alpha (primaires) dans le cytoplasme présente une image cytoplasmique mouchetée uniforme, souvent avec une concentration de la
fluorescence entre les lobes du noyau. La moucheture
cytoplasmique sera observée avec les neutrophiles fixés
à l’éthanol ou au formol.
pANCA (fluorescence périnucléaire) : Fluorescence
lisse ou homogène de plusieurs lobes du noyau, souvent
marquée par une fluorescence périphérique des lobes
En combinant les résultats de la population saine et de
9
Posititve
ANCA
Negative
IC
Posititve
324 obtenu les données
94
la population
malade, nous avons
Ethanol dans la comparaison initiale du système de
suivantes
124
316
ANCA
Negative Concepts
test
ANCA d’Immuno
avec neutrophiles
humains fixés à l’éthanol (tableau 1) :
Éthanol IC
ANCA
Négatif
Positif
324
94
Négatif
124
316
Méthode de comparaison
Formol IC
ANCA
Posititve
255
Formalina
ANCA IC
Formol
ANCA
Négatif
94
Positif
Negativo
255
124
52
316
Négatif
45
528
548
Posititvo
292
13
Vergleichsmethode
Negativ
Posititv
Les échantillons de sérum de 57
patients souffrant
de
divers troubles auto-immuns ont été testés sur le système
Posititv
292 avec neutrophiles
13
de
test ANCA d’Immuno
Concepts
IC Formalin
humains
fixés
à
l’éthanol
et
sur
le
système
de
test
ANCA
ANCA
Negativ avec neutrophiles
5
d’Immuno Concepts
humains548
fixés
au formol. Trois de ces échantillons ont présenté une
fluorescence nucléaire atypique, qui ressemblait à
l’aspect pANCA, sur les neutrophiles fixés à l’éthanol.
Jämförelsemetod
L’ensemble de ces trois échantillons provenait de
patients atteints de LED, étaient
positifs
Positivt aux anticorps
Negativt
anti-ADN et ANA avec un aspect homogène. Un
échantillon supplémentaire
présentait
une moucheture
Positivt
292
13
IC formalin
cytoplasmique sur les neutrophiles fixés à l’éthanol mais
ANCA
5
était négatif sur Negativt
les neutrophiles fixés
au formol et548
sur le
test ANA. Cet échantillon a été jugé comme n’étant
pas une réaction spécifique. Tous les autres sérums de
cette population étaient négatifs sur les neutrophiles
fixés à la fois à l’éthanol et au formol. Étant donné
que beaucoup d’auto-anticorps peuvent réagir de
manière non spécifique avec les neutrophiles humains
(8), les tests positifs par immunofluorescence doivent
systématiquement être confirmés à l’aide de dosages
spécifiques pour les anticorps associés aux ANCA.
Formalina
IC ANCA
De
nombreux auto-anticorps,
autres
que ceux associés
Negativo
45
528
à la vascularite auto-immune, peuvent réagir avec
Jämförelsemetod
des neutrophiles humains (8). Afin de confirmer que les
Método de comparación
anticorps détectés par un test
ANCA
immunofluoresNegativt
Positivt
cent sont significatifs d’un point
de
il est
Posititvovue clinique,
Negativo
Positivtde réaliser324
fortement conseillé
des tests de confirmation
94
IC etanol
Posititvo
255et la protéinase-3
52 (PRpour
la myéloperoxydase
(MPO)
Formol IC
ANCA
124Comparison Method
316
3) à l’aide deNegativt
dosages ELISA (9).
45
Posititve
5
RÉACTIVITÉ CROISÉE
Negativ
Posititv de comparaison
Ces données induisent les statistiques
Metodo di confronto
suivantes :
Posititv : 85,0 % 324
94
Sensibilité relative
IC Äthanol
Posititvo
Negativo
Spécificité relative : 91,0 %
ANCA
124
316
Agrément Negativ
total
: 89,0 %
Posititvo
255
52
Negativo
Négatif
Vergleichsmethode
ANCA
13
Les échantillons de 102 patients souffrant de vascularite caractérisée d’un pointPosititvo
de vue clinique Negativo
ont été
testés à l’aide des neutrophiles fixés à l’éthanol et des
Posititvo
292
neutrophiles
fixés
au formol d’Immuno
Concepts.13Les
Formol IC
résultats de cette comparaison sont présentés dans le
ANCA
548
5
Negativo
tableau 5 :
Posititvo
Negativo
Positif
324
292
IC ANCA
52
Posititvo
Négatif
5
548
ÉCHANTILLONSNegativo
DE SÉRUM DE PATIENTS
AYANT UNE
VASCULARITE CONNUE
ANCA
Formalin
Dans
la comparaison
ANCA
Negativo initiale du
124système de test316
45
528
d’Immuno
Concepts
humains
fixés
ANCA
Negativeavec neutrophiles
au formol, nous avons obtenu les données suivantes
(tableau 2) :
Etanol IC
Positif
Positif
Ces données induisent les statistiques de comparaison
suivantes :
Metodo di confronto
Sensibilité relative : 98,3 %
Spécificité relative : 97,7 %Posititvo
Negativo
Agrément total : 98,6 %
Ces données induisent les statistiques de comparaison
Metodo di confronto
suivantes :
Comparison Method
Sensibilité relative : 72,3 %
Posititvo
Negativo
Spécificité relative : 77,1 % Posititve
Negative
Agrément total
: 74,6 %
Posititvo
324
94
Etanolo
IC IC
548
au formol sont présentés dans le tableau 4 :
Positif
5
Negative
528
Negative
L’ensemble des échantillons discordants des tableaux
ci-dessus
ont été testés pour les anticorps anti-nucléIC
Posititve
380
Vergleichsmethode32
aires
et les anticorps anti-MPO et PR-3. Si l’on prend les
Ethanol
résultats de ces tests en compte,
les résultats globaux
Negativ
Posititv
434
6
ANCA
Negative
pour le système de test ANCA d’Immuno Concepts
Posititv
avec neutrophiles
humains fixés255
à l’éthanol sont 52
présenIC Formalin
tés dans le tableau 3 :
REPRODUCTIBILITÉ
Des études intra-analyse, d’un jour sur l’autre et inter-lot
ont été menées pour démontrer la reproductibilité
des systèmes de test ANCA d’Immuno Concepts avec
Positif
Négatif
neutrophiles humains fixés à l’éthanol et neutrophiles
Jämförelsemetod
humains fixés au formol. Les sérums utilisés dans cette
Positif
380
32
Éthanol IC
étude comprenaient trois échantillons positifs pANCA
Negativt
Clinical Positivt
Staining Pattern
ANCA
(respectivement à forte fluorescence, fluorescence moNégatif
434 Positive
(Ethanol Fixed)
Diagnosis 6 Number
dérée
et
faible
fluorescence)
et trois échantillons positifs
Positivt
255
52
IC formalin
cANCA (présentant respectivement une fluorescence
ANCA
30
26 (86.7%)
alléchantillons
cANCA
forte, modérée ou faible). Six
négatifs à
45
528
Negativt les statistiques
Ces données induisent
de comparaison
l’ANCA étaient également all
utilisés.
Dans l’étude intra12
pANCA
Polyarteritis
nodosa
8
(66.7%)
Metodo di confronto
suivantes :
analyse, ces 12 sérums ont été testés en double sur
Sensibilité
relative
: 98,4 %
all pANCA
Microscopic
polyarteritis
18 (90.0%)
Posititvo 20
Negativo
six puits chacun. Pour la reproductibilité
d’un jour sur
Spécificité relative : 93,1 %
l’autre et inter-lot,
ces 12one
sérums
été chacun
traités
one pANCA;
bothont
pANCA
and cANCA
3
2 (66.7%)
Agrément total
: 95,5 %
Posititvo
380
32
sur trois numéros de lot de kits à trois occasions différenEtanolo IC
15
all
pANCA
10 (66.7%)
tes. Les six échantillons négatifs se sont révélés négatifs
LesANCA
résultats globaux
pour le système
de test ANCA
Negativo
6
434
sur toutes les lames testées et les échantillons positifs
Glomerulonephritis
d’Immuno Concepts avec neutrophiles humains fixés
étaient positifs, avec des intensités de fluorescence
all atypical pANCA
Inflammatory Bowel Disease
22
17 (77.3%)
uniformes, sur toutes les lames testées.
ANCA
Negativ
Etanol
IC
TABLEAU
ANCA
5
45
528
Posititvo
Negativo
Posititvo
380
32
Negativo
6
434
Diagnostic clinique
Nombre
Positiif
Vergleichsmethode
Posititv
IC Äthanol
30
12
Posititv microscopique
Périartérite
380
20
ANCA Syndrome de Churg et Strauss
Negativ
6
3
Negativ
32
434
15
Image fluorescente
26 (86,7%)
tous cANCA
8 (66,7%)
tous pANCA
18 (90,0%)
tous pANCA
2 (66,7%)
10 (66,7%)
tous pANCA
17 (77,3%)
Positivo
Jämförelsemetod
22
Maladie intestinale inflammatoire
Positivt
IC etanol
ANCA
Positivt
380
Diagnosi clinica
6
Negativt
Negativt
32
Numero
434
10
D
PROCÉDURE DE TEST ANCA
1.
RECONSTITUTION DU TAMPON (PBS)
Dissoudre le contenu d’un sachet de tampon dans un litre d’eau désionisée ou distillée. Couvrir et conserver entre 2 et 10 °C
pendant 4 semaines maximum ou jusqu’à
ce que des signes de contamination ou de
modifications visibles apparaissent.
2.
DILUTION DES ÉCHANTILLONS DES PATIENTS
Test : Diluer les échantillons des patients à
1:20 en ajoutant 0,05 ml (50 µl) de sérum à
0,95 ml (950 µl) de diluant pour échantillon.
Titrage semi-quantitatif : Pour procéder
à des dilutions doubles successives des
échantillons de dépistage (ex. : 1:40, 1:80,
1:160...1:640), retirer 0,5 ml de la dilution à 1:
20 et la mélanger à 0,5 ml de diluant pour
échantillon afin d’obtenir une dilution à 1:
40 puis poursuivre de la même manière.
3.
DILUTION DU CONTRÔLE TITRABLE OPTIONNEL
Traiter le contrôle titrable optionnel comme
un échantillon de patient non dilué. Diluer
le contrôle à 1:20 en ajoutant 0,05 ml (50 µl)
de sérum de contrôle à 0,95 ml de diluant
pour échantillon. Procéder aux dilutions
doubles successives du contrôle titrable
comme décrit ci-dessus.
4.
PRÉPARATION DES LAMES DE SUBSTRAT
(20-25 µl/puits)
Sortir les lames des sachets et placer les
sérums de contrôle sur les puits de contrôle
comme suit : Retourner le flacon comptegouttes du contrôle et le presser légèrement jusqu’à ce qu’une goutte apparaisse
à l’extrémité de l’embout. Mettre soigneusement la goutte en contact avec le puits
de contrôle approprié en évitant tout
contact direct de l’embout du comptegouttes avec la surface de la lame. Placer
le contrôle positif pANCA sur le puits marqué « pANCA », le contrôle positif cANCA
sur le puits marqué « cANCA » et le contrôle
négatif sur le puits marqué « Nég » puis une
goutte de diluant pour échantillon sur le
puits marqué « Blanc ». Ajouter 1 goutte (2025 µl) d’échantillon du patient dilué dans
les puits numérotés.
ATTENTION : LE CONTACT DIRECT DE
L’EMBOUT DU COMPTE-GOUTTES AVEC
LA SURFACE DE LA LAME PEUT ALTÉRER LE
SUBSTRAT ANTIGÉNIQUE.
5.
INCUBATION DES LAMES (30 minutes ±5 minutes à température ambiante, soit 18-24 °C)
Placer les lames dans une chambre humide
couverte (une boîte de Pétri avec des serviettes en papier humidifiées conviendra).
Mettre à incuber, couvercle fermé, pendant 30 minutes (±5 minutes) à température
ambiante (18-24 °C).
6.
RINÇAGE EN TAMPON PBS
Sortir les lames du plateau de l’incubateur
et les rincer rapidement avec le tampon
PBS à l’aide d’un flacon gicleur ou d’une
pipette Pasteur ou sérologique. Ne pas asperger le tampon directement sur les puits.
REMARQUE : Afin d’éviter toute contamination croisée sur les lames à 10 puits, diriger
le jet du tampon PBS le long de la ligne
médiane de la lame, en l’inclinant d’abord
vers les puits 1 à 3 puis vers les puits 4 à 6.
7.
LAVAGE EN TAMPON PBS (10 minutes)
Laver la ou les lames pendant 10 minutes
avec du PBS dans une cuve à coloration
ou une jarre Coplin. Il est recommandé
d’agiter légèrement la cuve au moment
de l’immersion et du retrait de la lame ainsi
qu’à mi-parcours. Ce lavage peut être
prolongé jusqu’à 30 minutes sans que les résultats des tests finaux n’en soient affectés.
Jeter la solution de lavage PBS après utilisation. Pour obtenir des résultats optimums,
changer le tampon PBS à mi-parcours et
utiliser un agitateur magnétique.
8.
RÉACTIF IMMUNOFLUORESCENT (couvrir les
puits avec 10 à 12 gouttes)
Retirer les lames une à une du tampon PBS
et les immerger 3 à 5 fois dans de l’eau
désionisée ou distillée. Tapoter la tranche
de la lame sur du papier absorbant ou des
serviettes en papier pour éliminer l’excès
d’eau. Remettre immédiatement la lame
dans la chambre d’incubation et recouvrir
complètement les puits de réactif immunofluorescent. Commencer par placer une
goutte sur chaque puits. Recommencer
l’opération pour chaque lame. Le réactif
immunofluorescent a été titré de façon à
compenser l’eau désionisée ou distillée résiduelle restant sur la lame après le rinçage.
REMARQUE : Il est important que les puits
de la lame ne se dessèchent pas pendant
cette procédure sous peine d’altérer le
substrat.
NE PAS SÉCHER LA LAME OU OUBLIER DE LA
RECOUVRIR DE RÉACTIF IMMUNOfluorescent
PENDANT PLUS DE 15 SECONDES.
9.
INCUBATION DES LAMES (30 minutes ±5 minutes à température ambiante, soit 18-24 °C)
Placer le couvercle sur la chambre
d’incubation puis, si la chambre n’est
pas opaque, la couvrir d’une serviette en
papier pour l’abriter de la lumière. Laisser
la ou les lames incuber pendant 30 minutes
(±5 minutes) à température ambiante (1824 °C).
10.
RINÇAGE EN TAMPON PBS
Sortir les lames du plateau d’incubation et
les rincer rapidement avec du PBS. Ne pas
asperger le tampon directement sur les
puits.
11.
LAVAGE EN TAMPON PBS (10 minutes)
Laver les lames pendant 10 minutes avec
du PBS dans une cuve à coloration ou une
jarre Coplin. Il est recommandé d’agiter
légèrement la cuve au moment de
l’immersion et du retrait de la lame ainsi
qu’à mi-parcours. Ce lavage peut être
prolongé jusqu’à 30 minutes sans que les résultats des tests finaux n’en soient affectés.
12.
MONTAGE DE LA LAMELLE COUVRE-OBJET
Retirer les lames une à une du tampon PBS
et les immerger 3 à 5 fois dans de l’eau
désionisée ou distillée. Tapoter la tranche
de la lame sur du papier absorbant ou des
serviettes en papier pour éliminer l’excès
d’eau.
NE PAS SÉCHER LA LAME OU OUBLIER DE
LA RECOUVRIR DE LA LAMELLE COUVREOBJET PENDANT PLUS DE 15 SECONDES.
Ajouter 4 à 5 gouttes de milieu de montage
semi-permanent sur la ligne médiane de
chaque lame. Mettre soigneusement la
lamelle couvre-objet en place en évitant
la formation de bulles d’air ; pour cela,
abaisser doucement la lamelle d’un côté
de la lame vers l’autre.
REMARQUE : Un excès de milieu de
montage sur la lame peut entraîner une
forte fluorescence de fond en raison
de l’accumulation de lumière ou d’un
manque de résolution nette des cellules
(image floue). Afin d’éliminer l’excès de
milieu de montage sur la lame, essuyer
soigneusement la lamelle couvre-objet
avec du papier absorbant ou un nettoyant optique tout en évitant de déplacer la
lamelle.
POUR L’Assistance technique : +1 916-363-2649
ou messagerie électronique :
[email protected]
11
SISTEMA DI ANALISI DEGLI ANCA
Stabilità: tutti i componenti restano stabili per almeno
12 mesi dalla data di produzione. Non usare alcun
componente oltre la data di scadenza.
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO
RIEPILOGO E INFORMAZIONI DI BASE
REAGENTI REATTIVI
Uso previsto: analisi in fluorescenza indiretta degli
anticorpi per la determinazione semiquantitativa degli
anticorpi anti-citoplasma dei neutrofili (ANCA) nel siero
umano. Questo sistema di analisi deve essere usato
come ausilio nella determinazione di anticorpi associati
alla vasculite autoimmune.
Gli anticorpi anticitoplasma dei neutrofili (ANCA) sono
un gruppo di anticorpi reagenti con gli antigeni citoplasmatici nei neutrofili umani. Sebbene questi anticorpi
furono riportati per la prima volta nel 1964,(1) la prima
volta che fu riportato un collegamento degli stessi con
la patologia fu nel 1982, quando Davies et al. riportarono gli anticorpi in otto pazienti con glomerulonefrite
segmentale necrotizzante.(2) Nel 1984, furono riportati
altri quattro pazienti con vasculite e glomerulonefrite.
Nel 1985, van der Woude et al. dimostrarono che gli
ANCA avevano un’alta associazione con la granulomatosi di Wegener, e che il titolo anticorporale era in
correlazione con l’attività della patologia.(3) Nel 1988,
Falk e Jennette riportarono che gli ANCA hanno più di
una specificità antigenica.(4) Un successivo rapporto
dimostrò che la specificità di ANCA era in correlazione
con le caratteristiche patologiche delle vasculiti.(5)
Nell’analisi ad immunofluorescenza per ANCA sono
osservabili svariati pattern di colorazione cellulare. Due
importanti pattern di colorazione sono stati descritti e
ben caratterizzati quando nell’analisi ad immunofluorescenza ANCA si usano neutrofili fissati in etanolo. Gli
autoanticorpi che mostrano un pattern citoplasmatico
granulare sottile, denominati cANCA, in genere sono
diretti contro una proteasi di serina, Proteinasi 3 (PR-3).
È stato dimostrato che questi anticorpi hanno una forte
associazione con la granulomatosi di Wegener. L’altro
importante pattern della colorazione, quello perinucleare, o pattern pANCA, che è in genere dovuto agli anticorpi diretti contro la mieloperossidasi (MPO), è stata
associato alla vasculite sistemica e alla glomerulonefrite
idiopatica necrotizzante e semilunare.(4) Il pattern
pANCA è un artefatto indotto dall’uso di etanolo
come fissativo.(4) Se i neutrofili sono fissati in formalina,
la mieloperossidasi (il maggior antigene responsabile
del pattern pANCA nelle cellule fissate con etanolo)
resta associata ai granuli primari (alfa), e mostra una
distribuzione citoplasmatica granulare. La proteinasi-3
(PR-3) resta associata ai granuli primari (alfa) sia nei
fissativi con etanolo che in quelli con formalina.
PRINCIPIO DEL TEST
Il sistema di analisi degli anticorpi anticitoplasma
dei neutrofili (ANCA) della IC utilizza la tecnica
dell’immunofluorescenza indiretta, descritta per la
prima volta da Weller e Coons.(6) I campioni dei
pazienti, diluiti, sono incubati con neutrofili umani che
sono fissati sui vetrini del microscopio per consentire lo
specifico legame degli ANCA. Se sono presenti ANCA,
gli anticorpi si legano agli antigeni neutrofili. Dopo il lavaggio per rimuovere anticorpi non specifici, il substrato
viene incubato con anti-IgG umane coniugate con
fluoresceina. Quando i risultati sono positivi, avviene
la formazione di un complesso stabile in tre parti composto dall’anticorpo fluorescente antiumano legato
agli ANCA umani che sono legati all’antigene presente
nelle cellule. Tale complesso può essere visualizzato con
l’ausilio di un microscopio a fluorescenza. I campioni
positivi per cANCA avranno una particolare colorazione citoplasmatica granulare dei neutrofili sia sui vetrini fissati in etanolo che su quelli fissati in formalina. Nei
campioni positivi per pANCA, si noterà una colorazione
diffusa o periferica dei neutrofili sulle cellule fissate con
etanolo ed una colorazione granulare del citoplasma in
quelle fissate con formalina. Se il campione è negativo
per gli ANCA, non si vedrà alcuna colorazione specifica
dei neutrofili.
COMPONENTI DEL SISTEMA (MATERIALI FORNITI)
Uso: tutti i componenti sono pronti per l’uso senza che
siano necessarie la suddivisione in aliquote o la ricostituzione (tranne il tampone PBS che deve essere sciolto
in acqua deionizzata o distillata prima dell’uso).
Conservazione: tutti i componenti possono essere
conservati alla temperatura di 2-10°C. Dopo la ricostituzione, il tampone PBS deve essere conservato in contenitori con tappo a vite alla temperatura di 2-10°C per
massimo quattro settimane o fino a che si presentano
segni di contaminazione o altri cambiamenti visibili.
12
Vetrini per substrato ANCA:* numero di catalogo
10010-11 (fissati in etanolo) o 10010-12 (fissati in formalina). Dieci vetrini a pozzetto contenenti neutrofili umani
stabilizzati e fissati direttamente sui pozzetti per il test.
L’esclusivo design a fossa del vetrino minimizza la contaminazione incrociata dei pozzetti durante l’analisi. I
vetrini comprendono quattro pozzetti definiti pANCA,
cANCA, negativo e bianco per favorire l’esatta interpretazione dei risultati.
Diluente per campione ANCA: numero di catalogo
10100 (100 ml). Esclusivo diluente tamponato per
campioni utilizzato per la diluizione dei campioni dei
pazienti.
Controllo positivo cANCA: numero di catalogo 1002112. Fiala contagocce pronta per l’uso contenente
1,0 ml di siero di controllo umano positivo cANCA.
Questo siero mostra una colorazione granulare del
citoplasma tra i segmenti nucleari dei neutrofili sia su
vetrini fissati in etanolo che su quelli fissati in formalina.
Questo reagente contiene sodio azide allo 0,1% come
conservante.
Controllo positivo pANCA: numero di catalogo 1002111. Fiala contagocce pronta per l’uso contenente 1,0
ml di siero di controllo umano positivo pANCA. Questo
siero mostra una colorazione nucleare dei neutrofili
diffusa o periferica, sui vetrini fissati in etanolo e a
fluorescenza citoplasmatica granulare sui vetrini fissati
in formalina. Questo reagente contiene sodio azide allo
0,1% come conservante.
Controllo titolabile cANCA: numero di catalogo
10026-12. Fiala pronta per l’uso contenente 0,25 ml di
siero liquido stabile di controllo umano positivo cANCA.
conservante. Questo controllo va trattato come un
campione del paziente non diluito. Per informazioni sul
titolo medio vedere l’etichetta.
Controllo titolabile pANCA: numero di catalogo
10026-11. Fiala pronta per l’uso contenente 0,25 ml di
siero liquido stabile di controllo umano positivo pANCA.
conservante. Questo controllo va trattato come un
campione del paziente non diluito. Per informazioni sul
titolo medio vedere l’etichetta.
Controllo negativo: numero di catalogo 10031. Fiala
contagocce pronta per l’uso contenente 1,0 ml di
siero di controllo umano negativo ANCA. Questo siero
mostra una fluorescenza dei neutrofili a bassa intensità,
non specifica, verde spento. Questo reagente contiene
sodio azide allo 0,1% come conservante.
Reagente anticorpo fluorescente, specifico per IgG:
numero di catalogo 10009 (9ml). Anti-IgG umane di
capra coniugate con FITC (fluorescein isothiocyanate,
fluoresceina isotiocianato). Questo reagente contiene
blu di Evans come colorante di contrasto. Il reagente
si presenta pronto all’uso in flaconi contagocce di
precisione. Questo reagente contiene sodio azide allo
* Questo vetrino è protetto da uno o più dei seguenti
brevetti statunitensi e stranieri: 4387972; D-274261; D273261; brevetto canadese 1171302 ed altri brevetti in
corso di registrazione.
REAGENTI NON REATTIVI
Tampone PBS: numero di catalogo 1011. Polvere salina
tamponata al fosfato (0,01 M, pH 7,4 ± 0,2). Ciascuna
confezione contiene polvere tamponata sufficiente a
fare 1 litro. (Nei kit di analisi completi, viene fornita una
confezione di polvere tamponata per cinque vetrini).
Preparazione: sciogliere una confezione di polvere
tamponata in un (1) litro di acqua deionizzata o distillata e conservare in frigorifero ad una temperatura
di 2-10° per massimo 4 settimane o fino a che non
compaiono segni di contaminazione o altri cambiamenti visibili.
Mezzo di fissaggio semipermanente: numero di
catalogo 1111. Fiala contagocce pronta per l’uso contenente 5 ml di mezzo di fissaggio a base di glicerolo,
pH 9,1 ± 0,2. Questo reagente contiene sodio azide allo
Vetrini coprioggetto: numero di catalogo 1041. Ciascuna confezione contiene dieci vetrini coprioggetto
24 x 60 mm N. 1.
ALTRI MATERIALI NECESSARI (MA NON FORNITI)
Pipette volumetriche per l’erogazione di volumi da
20-25 µl.
Vaschette Coplin o capsule di colorazione.
Flacone morbido o pipette di Pasteur.
Pipette sierologiche.
Contenitori da un litro (per tampone PBS).
Acqua deionizzata o distillata.
Provette per preparare le diluizioni seriali opzionali.
Carta bibula o assorbente.
Camera per incubazione.
Guanti a perdere in lattice.
Timer da laboratorio.
Microscopio a fluorescenza dotato di filtro eccitatore
da 495 nm e filtro di sbarramento da 515 nm.
PRECAUZIONI
1. Tutti i materiali di origine umana usati per la
preparazione dei controlli per questo prodotto
sono stati analizzati e trovati negativi (non
ripetutamente reattivi) per gli anticorpi del virus
dell’immunodeficienza umana tipo 1 (HIV-1), del
virus della immunodeficienza umana tipo 2 (HIV-2),
del virus dell’epatite C (HCV) e per l’antigene di
superficie dell’epatite B (HBsAg) con un metodo
approvato dalla FDA. Nessun metodo di analisi è
in grado di garantire con completa sicurezza che
siano assenti HIV-1, HIV-2, virus dell’epatite C, virus
dell’epatite B o altri agenti infettivi. Quindi, tutti i sieri
di controllo vanno maneggiati secondo le stesse
modalità utilizzate per i materiali potenzialmente
infettivi.
2. Tutti i campioni dei pazienti devono essere maneggiati osservando le precauzioni di sicurezza biologica di livello 2, come raccomandato per ogni siero
umano potenzialmente infettivo o per campioni di
sangue nel manuale pubblicato per i CDC/NIHM
(Centers for Disease Control/National Institutes of
Health Manual, Centri per il Controllo delle Infezioni/
Istituti Nazionali per la Sanità): Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, Edizione 1984.
3. La diluizione di componenti o la sostituzione di componenti diversi da quelli forniti in questo sistema può
dare risultati non coerenti.
4. Il sodio azide (0,1%) viene usato come conservante.
Il sodio azide può reagire nelle tubature di piombo
o rame formando sali metallici di azide esplosivi.
Quando si eliminano i reagenti, far scorrere grandi
quantità di acqua del rubinetto per evitare la
formazione di potenziali residui nelle tubature. Il
sodio azide è un veleno e può essere tossico se
ingerito.
5. Questo kit è per uso diagnostico in vitro.
6. Il siero di controllo titolabile è destinato ad essere
usato nel monitoraggio da lotto a lotto e nella
riproducibilità interfase. Non è destinato alla misurazione della sensibilità complessiva o della specificità
del dosaggio.
7. Non fumare, non mangiare o non bere nelle aree in
cui sono maneggiati i campioni o i reagenti del kit.
8. Evitare sempre gli spruzzi e la formazione di aerosol.
9. Tempi e temperature di incubazione diversi da
quelli specificati possono dare risultati errati.
10. La contaminazione incrociata dei reagenti o dei
campioni può dare origine a risultati falsi.
11. Prima dell’uso, la vetreria di laboratorio riutilizzabile
deve essere lavata e sciacquata a fondo e completamente liberata da ogni residuo di detergente.
Prima dell’uso, tutta la vetreria di laboratorio deve
essere pulita e asciutta.
12. Prima dell’uso, portare tutti i reagenti, i vetrini e i
campioni a temperatura ambiente (18-24°C).
13. Indossare guanti a perdere in lattice quando si
maneggiano campioni e reagenti e dopo lavare
accuratamente le mani.
14. La contaminazione microbica dei reagenti o dei
campioni può dare origine a risultati falsi.
15. Non pipettare mai con la bocca ed evitare il
contatto dei reagenti e dei campioni con la cute e
le mucose. In caso di contatto, lavare abbondantemente con un sapone germicida e acqua.
ambiente (18-24°C). Non appena possibile, il siero deve
essere separato dal coagulo in modo da ridurre al
minimo l’emolisi.
Sostanze interferenti: non vanno usati sieri che mostrano un alto grado di emolisi, ittero, lipemia o crescita
microbica, perché può verificarsi una diminuzione del
titolo anticorporale nei campioni positivi. Campioni con
livelli di lipidi molto alti possono causare la formazione
di una pellicola fluorescente non specifica sul substrato
cellulare. L’uso di campioni a digiuno o diafanizzanti
per ultracentrifugazione può eliminare questo problema. Campioni contenenti sostanze particellari visibili
vanno chiariti per centrifugazione prima dell’analisi.
Conservazione: i sieri possono essere conservati a
2-10°C fino ad una settimana. Se l’analisi viene ulteriormente rimandata, i sieri devono essere conservati
congelati a -20°C o a una temperatura inferiore. Il siero
non deve essere conservato in freezer autosbrinanti.
ATTENZIONE: il ripetuto congelamento e scongelamento dei campioni dei pazienti può dare origine a
falsi risultati positivi o a falsi risultati negativi.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
CONTROLLO DELLA QUALITÀ
I controlli positivo, negativo e del bianco devono essere
analizzati nei pozzetti previsti per il controllo qualità su
ciascun vetrino. Il controllo positivo cANCA dovrebbe
mostrare una colorazione citoplasmatica granulare dei
neutrofili verde mela brillante tra i segmenti nucleari, sia
sui vetrini fissati in etanolo che su quelli fissati in formalina. Il controllo positivo pANCA dovrebbe mostrare una
colorazione nucleare dei neutrofili diffusa o periferica,
sui vetrini fissati in etanolo e a fluorescenza citoplasmatica granulare sui vetrini fissati in formalina. Il controllo
negativo non dovrebbe mostrare alcuna fluorescenza
verde brillante. Nel controllo negativo può essere osservata una fluorescenza verde spento, non specifica. Il
controllo del bianco si usa per osservare la fluorescenza
non specifica da parte del reagente anticorpo, e non
dovrebbe mostrare alcuna colorazione fluorescente
verde. Il colorante di contrasto fornito nel coniugato
può dare alle cellule una sbiadita colorazione rossa. Se
i controlli non appaiono come descritto, il test non è
valido e deve essere ripetuto.
CONTROLLO TITOLABILE OPZIONALE
Nel leggere i titoli, molti laboratori iniziano a leggere
dal pozzetto contenente il campione più diluito e
leggono “all’indietro” fino alla diluizione 01:20. Il primo
pozzetto in cui è visibile una colorazione citoplasmatica
chiaramente distinguibile è il punto di equivalenza della
reazione. Raccomandiamo questa tecnica per determinare i punti di equivalenza della reazione.
Il titolo medio e la gamma del titolo (± una diluizione
su ciascun lato della media) determinati per ciascun
numero di lotto sono stati stabiliti nel nostro laboratorio
e sono indicati come guida. Questo controllo è fornito
per consentire a ciascun laboratorio di valutare la
riproducibilità (di precisione) del proprio test ANCA.
Dal momento che questo controllo non è destinato
ad essere un indicatore dell’accuratezza del titolo,
ciascun laboratorio deve stabilire il proprio punto medio
di equivalenza della reazione per questo campione e
deve usare tali informazioni per valutare la riproducibilità interfase (di precisione).
Attraverso analisi multiple di questo controllo titolabile,
usando il sistema di analisi in fluorescenza degli ANCA
della Immuno Concepts, è stato stabilito un valore
medio del titolo per ciascun numero di lotto. Il numero
di lotto, il titolo medio e la gamma del titolo (± una
duplice diluizione su ciascun lato della media) sono
indicati sull’etichetta della fiala e vanno usati come
guida della performance del sistema di analisi.
I valori ottenuti nel nostro laboratorio possono essere
diversi dai vostri. Di seguito sono indicati alcuni tra i fattori che possono influenzare i risultati.
1. Il tipo di fonte luminosa. Fonti luminose al mercurio
producono una maggiore energia di eccitazione a
495 nm rispetto a quelle al quarzo/alogene. Le fonti
luminose al mercurio da 50 watt, 100 watt e 200
watt differiscono poco nell’energia di eccitazione
a 495 nm. Fonti luminose al quarzo/alogene da 100
watt generano una maggiore energia di eccitazione a 495 nm rispetto a quelle al quarzo/alogene
da 50 watt.
2. La condizione e l’età della fonte di luce. Questo
in particolare per le fonti luminose al mercurio
RACCOLTA DI CAMPIONI
Raccolta: il siero è il campione preferito. Devono
essere prelevati con tecnica asettica circa 5 ml di
sangue intero per venopuntura usando una provetta
di raccolta sterile a vuoto o un altro sistema di raccolta
adatto. Lasciare che il sangue si coaguli a temperatura
13
3.
4.
5.
6.
7.
che in genere mostrano una graduale riduzione
nell’energia di eccitazione a 495 nm prima di
esaurirsi. Questa riduzione graduale dell’energia
di eccitazione può comportare una significativa
perdita di sensibilità dopo diverse settimane.
Questo problema può essere evitato tenendo una
registrazione dei tempi. Per risultati ottimali, sostituire
le lampadine a mercurio da 50 watt dopo 100 ore
e quelle da 100 o 200 watt dopo 200 ore. Le fonti luminose al quarzo/alogene in genere non mostrano
una graduale riduzione dell’energia di eccitazione
prima di esaurirsi.
Il tipo di filtro di eccitazione usato. I filtri eccitatori
ad interferenza danno maggiore sensibilità in una
lunghezza d’onda molto più ridotta rispetto ai filtri
eccitatori ad assorbimento. Per maggiori informazioni, consultare il manuale del proprio microscopio
a fluorescenza o contattare il rappresentante.
Il giusto allineamento del percorso ottico del
microscopio. Per istruzioni, consultare il manuale del
proprio microscopio a fluorescenza.
L’apertura numerica dell’obiettivo. Con fluorescenza a luce incidente (Epi), la fluorescenza cresce in
modo esponenziale man mano che aumenta anche l’apertura numerica (NA) dell’obiettivo. Questo
può far sì che un obiettivo da 40X con una NA di
0,65 legga una o più diluizioni più basse rispetto ad
un obiettivo da 40X con un NA di 0,85. L’apertura
numerica è stampata sul lato dell’obiettivo. La
sensibilità del microscopio a luce fluorescente
trasmessa non è influenzata da NA.
I filtri a soppressione. I filtri a soppressione riducono
le specifiche lunghezze d’onda dell’eccitazione
e possono essere usati per ridurre la sensibilità.
Per maggiori informazioni, vedere il manuale del
proprio microscopio a fluorescenza o contattare il
rappresentante.
La precisione e l’accuratezza della tecnica di diluizione, dell’apparecchiatura e della performance
delle procedure di analisi.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI DEL PAZIENTE
LIMITI DEL TEST
1. Le diagnosi non possono essere fatte solo sulla base
del rilevamento dell’anticorpo anti-citoplasma dei
neutrofili. Il medico deve interpretare questi risultati
confrontandoli con l’anamnesi e i sintomi del paziente, i dati fisici e altre procedure diagnostiche.
2. La cura non va iniziata sulla sola base di un test
positivo per gli anticorpi anti-citoplasma dei neutrofili. Prima di iniziare qualunque trattamento devono
essere considerate indicazioni cliniche, altri risultati
di laboratorio e l’impressione clinica del medico.
3. Gli anticorpi antinucleari presenti nei campioni dei
pazienti possono reagire con il substrato cellulare.
Se sono presenti anticorpi antinucleari, i risultati
ANCA possono spesso essere interpretati per il diverso carattere della specifica colorazione ANCA,
per i titoli diversi e/o per la diversa intensità delle
reazioni. Se la reazione dell’anticorpo antinucleare
fluorescente è abbastanza forte da oscurare la
colorazione ANCA, l’analisi va riportata come “non
interpretabile”, e va usato un metodo alternativo
per stabilire lo status degli ANCA del paziente.
4. A causa delle numerose opzioni disponibili nei
microscopi a fluorescenza, si raccomanda di
standardizzare le fonti luminose, i filtri e gli strumenti
ottici in caso di confronto dei titoli dei pazienti tra i
vari laboratori.
5. Per stabilire lo status clinico del paziente, i risultati
di questa analisi vanno usati in connessione alle
informazioni disponibili a partire da valutazioni
cliniche ed altre procedure diagnostiche.
VALORI ATTESI
Il valore atteso nella popolazione normale è negativo
in una diluizione di screening di 01:20. In pazienti con
patologie, sono stati riportati titoli alti fino 1:640.(7)
CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI
CAMPIONI NORMALI
Per visualizzare i neutrofili si raccomanda un ingrandimento totale di 400X.
Negativo: un siero è considerato negativo per ANCA
se, ad una diluizione di 1:20, la colorazione verde fluorescente delle cellule è inferiore o uguale al pozzetto
provetta di controllo negativo. Nei neutrofili si può
osservare colorazione non specifica di fondo dovuta ad
anticorpi eterofili o autoanticorpi.
Positivo: un siero si considera positivo per gli ANCA se,
ad una diluizione di 1:20, le cellule in ciascun campo
mostrano una fluorescenza citoplasmatica granulare
simile a quella osservata con il controllo cANCA su
vetrini fissati in etanolo o in formalina. Alternativamente,
un siero si considera positivo per gli ANCA se, ad una
diluizione di 1:20, le cellule mostrano una fluorescenza
diffusa o periferica simile a quella osservata con il
controllo pANCA su vetrini fissati in etanolo.
RIPORTO DEI RISULTATI
Screening: i risultati devono essere riportati come
positivi o negativi alla diluizione di 01:20.
Pattern della colorazione: molti anticorpi possono causare la colorazione del citoplasma e/o del nucleo dei
neutrofili. Esistono due importanti pattern di colorazione
specifica.
Furono testati in parallelo, usando il kit ANCA della Immuno Concepts e un altro kit disponibile in commercio,
campioni di siero di 497 donatori di sangue (247 maschi
e 250 femmine). Tutti i campioni che erano positivi su
vetrini fissati in etanolo in questo gruppo furono testati
anche per gli anticorpi antinucleari (ANA) usando
il sistema di analisi degli ANA HEp-2 della Immuno
Concepts.
Tra i campioni normali ce n’erano 22 positivi per ANA
e vennero considerati non interpretabili per ANCA. I
rimanenti campioni discrepanti furono testati per gli anticorpi a MPO e PR3 usando le analisi ELISA per definire il
vero status degli anticorpo.
SIERI PRECEDENTEMENTE DEFINITI COME POSITIVI PER
ANCA ATTRAVERSO IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA
Comparison Method
Da laboratori di riferimento negli Stati Uniti, nel Regno
Unito e in Australia, si ottennero
campioni diNegative
siero che
Posititve
erano stati giudicati positivi per ANCA usando analisi IFA
IC
in-house.
In questa
studio furono esaminati
Posititveparte dello
324
94
Ethanol
un totale di 383 sieri che si prevedeva fossero positivi
per
ANCA. Questi
campioni furono
124 testati in parallelo
316
ANCA
Negative
usando il kit ANCA della Immuno Concepts ed un altro
kit reperibile in commercio. I campioni discrepanti
furono testati per ANA usandoMéthode
il sistema
di analisi degli
de comparaison
ANA HEp-2 della Immuno Concepts e per gli anticorpi a
Négatif
MPO e PR3 usando le analisi Positif
ELISA.
cANCA (colorazione classica o citoplasmatica): la
Positif
324 popolazione normale
94
colorazione dei granuli alfa (primari) nel citoplasma
Mettendo
assieme i risultati della
Éthanol
IC
mostra un pattern costante di colorazione citoplase
di quella anormale, nel confronto iniziale per il sistema
ANCA
Négatif
124
matica a chiazze, spesso con una concentrazione
di analisi degli ANCA della Immuno
Concepts 316
con neudella colorazione tra i lobi del nucleo. La chiazzatura
trofili umani fissati in etanolo, si ottennero i dati riportati
citoplasmatica sarà osservabile sia con neutrofili fissati in di seguito (Tabella 1).
etanolo che con neutrofili fissati in formalina.
Metodo di confronto
pANCA (colorazione perinucleare): colorazione
uniforme o omogenea del nucleo multilobo, spesso con
marcata colorazione periferica dei lobi nucleari su neu- Etanolo IC
trofili fissati in etanolo. Su neutrofili fissati in formalina,
ANCA
questi anticorpi mostrano una colorazione citoplasmatica granulare.
Posititvo
Negativo
Posititvo
324
94
Negativo
124
316
Métodostatistica
de comparación
Questi dati producono la seguente
comparativa.
Negativo
Sensibilità relativa: 72,3% Posititvo
Specificità relativa: 77,1%
Posititvo
324
94
Etanol
IC
Concordanza
complessiva: 74,6%
Gli antinucleari ed altri autoanticorpi possono reagire
con i neutrofili, quindi, prima di riportare la presenza di
ANCA, tutti i campioni positivi vanno rianalizzati per gli
ANA usando un substrato cellulare HEp-2.
Titolazione opzionale: i risultati vanno riportati come il
reciproco della diluizione dell’ultimo pozzetto in cui è
stata osservata una reazione positiva.
ANCA
Negativo
124
316
Nel confronto iniziale per il sistema di analisi degli ANCA
della Immuno Concepts con neutrofili umani fissati in
14
Vergleichsmethode
ANCA
Négatif
45
528
formalina, si ottennero i dati riportati di seguito
(Tabella 2).
CAMPIONI DI SIERO DI PAZIENTI CON VASCULITI NOTE
Metodo di confronto
Formalina
IC ANCA
Posititvo
Negativo
Posititvo
255
52
Negativo
45
528
Furono testati campioni ottenuti da 102 pazienti con
vasculite clinicamente caratterizzata usando i neutrofili
della Immuno Concepts fissati in etanolo e fissati in
formalina. Nel tabella 5 vengono mostrati i risultati di
questo confronto.
REATTIVITÀ CROCIATA
Questi dati producono la seguente statistica
Comparison Method
comparativa.
Posititvo
Negativo
Sensibilità relativa: 85,0%
Negative
Posititvo91,0% Posititve
255
52
Specificità
relativa:
IC
Formol
Concordanza
complessiva: 89,0%
IC
ANCA
Posititve
Negativo
Ethanol
380
45
32
528
Molti autoanticorpi, diversi da quelli associati con
434
6
ANCA
Negative
vasculite autoimmune, possono reagire con i neutrofili
Vergleichsmethode
umani.(8) Per confermare che gli anticorpi rilevati con
Negativ
Posititv
qualunque analisi ad immunofluorescenza
degli
ANCA
siano clinicamente significativi, si raccomandano analisi
Méthode
comparaison
Posititv saggi ELISA
255
52
diFormalin
conferma usando
per la de
mieloperossidasi
IC
(MPO) e la proteinasi-3 (PR-3).(9)
Positif
Négatif
ANCA
528
Tutti i campioniNegativ
discrepanti nelle45tabelle che precePositifper anticorpi
dono,
furono testati
380antinucleari e per
32
Éthanol IC
anticorpi a MPO e PR-3. Tenendo conto dei risultati
ANCA
Négatif
di queste analisi,
nella tabella 3 vediamo
i risultati
6 Jämförelsemetod
434
complessivi del sistema di analisi degli ANCA della Immuno Concepts con neutrofiliPositivt
umani fissati in etanolo.
Negativt
Comparison
255Metodo diMethod
52
confronto
Positivt
IC formalin
ANCA
Posititve
45
Posititvo
Negativt Clinical
Diagnosis
IC
Posititve
Posititvo
Etanolo
FormalinIC
292
380
Negative
528
Negativo
Number
13
Furono testati sieri di 57 pazienti con vari disturbi autoimmuni, sia con il sistema di analisi degli ANCA della
Immuno Concepts con neutrofili umani fissati in etanolo
che con il sistema di analisi degli ANCA della Immuno
Concepts con neutrofili umani fissati in formalina. Tre
di questi campioni mostravano, sui neutrofili fissati in
etanolo, un colorazione nucleare atipica che somigliava al pattern pANCA. Tutti e tre questi campioni
provenivano da pazienti con SLE, erano positivi per gli
anticorpi anti-DNA e mostravano un ANA positivo con
un pattern omogeneo. Un altro campione mostrava
una chiazzatura citoplasmatica sui neutrofili fissati in
etanolo, ma era negativo sui neutrofili fissati in formalina
e sull’analisi ANA. Questo campione fu giudicato come
una reazione non specifica. Tutti gli altri sieri in questo
gruppo erano negativi sia sui neutrofili fissati in etanolo
che su quelli fissati in formalina. Dal momento che molti
autoanticorpi possono reagire in modo non specifico
con i neutrofili umani,(8) le analisi ad immunofluorescenza positive devono sempre essere confermate usando
analisi specifiche per gli anticorpi associati a ANCA.
RIPRODUCIBILITÀ
Positive
Staining Pattern
(Ethanol Fixed)
32
Furono compiuti studi intrasaggio, intragiorni e intralotti
all cANCA
la riproducibilità
del sistema di analisi
degli ANCA della Immuno Concepts
12
all pANCAcon neutrofili
8 (66.7%)
umani fissati in etanolo e con neutrofili umani fissati in
all pANCA
Microscopic polyarteritis Método20
18 (90.0%)
de comparación
formalina. I sieri usati in questi
studi comprendevano tre
Questi dati producono la seguente statistica
Méthode
de
comparaison
campioni
pANCA
positivi
(uno
chepANCA
mostrava
one pANCA; one both
and coloracANCA
3
comparativa.
Posititvo
Negativo2 (66.7%)
zione forte, uno che mostrava colorazione moderata e
Sensibilità
relativa:
98,4%
Positif
Négatif 10 (66.7%)
15
all pANCA
uno che mostrava colorazione debole), e tre campioni
Posititvo
380
32
Specificità
relativa:
93,1%
Etanol
IC
cANCA positivi (che mostravano ciascuno una coloraGlomerulonephritis
Positif
13
Concordanza
complessiva:292
95,5%
Formol
IC
ANCA
zione forte, moderata o debole). Furono anche usati sei
6
434 17 (77.3%)
Negativo
all atypical pANCA
Inflammatory
Bowel
Disease
22
ANCA
campioni negativi per ANCA. Nello studio intrasaggio,
5 i risultati complessivi
548
Nella tabella 4Négatif
vengono mostrati
questi sieri furono analizzati in replicati di sei pozzetti
del sistema di analisi degli ANCA della Immuno Conciascuno. Per la riproducibilità intragiorni e intralotti,
cepts con neutrofili umani fissati inVergleichsmethode
formalina.
questi 12 sieri furono analizzati ciascuno su tre numeri
Negativ
Posititv
di lotto di kit in tre occasioni separate. I sei campioni
Metodo di confronto
negativi erano negativi su tutti i vetrini testati e i camPosititv
380
32
Posititvo
Negativo
Image
IC Äthanol
pioni positivi erano positivi,
con fluorescente
intensità di fluorescenza
Diagnostic clinique
Nombre
Positiif
costante, su tutti i vetrini testati.
ANCA
Wegener's
granulomatosus 5
ANCA
ANCA
Negative
Negativo
Posititvo
Negativ
Formalina
IC ANCA
30
26 (86.7%)
548
per dimostrare
434
6
292
6
13
434
30
12
Negativo
5
548
Jämförelsemetod
Périartérite microscopique
20
Método
de comparación
Questi dati producono la seguente
statistica
Positivt
Negativt
comparativa.
Syndrome de Churg et
Strauss
3Negativo
Posititvo
Sensibilità relativa: 98,3%
15 32
Glomérulonéphrite
à croissants
Positivt
380
IC etanol
Specificità relativa:
Posititvo97,7%
292
13
Formol IC
épithéliaux ducomplessiva:
complexe immun
Concordanza
98,6%
ANCA
Negativt
ANCA
6
5
Negativo inflammatoire
Maladie intestinale
22
Posititv
Diagnosi clinica
292
18 (90,0%)
tous pANCA
2 (66,7%)
10 (66,7%)
tous pANCA
17 (77,3%)
Numero
13
Positivo
30 548
26 (86,7%)
tutti cANCA
Poliarterite nodosa
12
8 (66,7%)
tutti pANCA
Poliarterite microscopica
20
Granulomatosi
di Wegener
Negativ
5
18 (90,0%)
tutti pANCA
3
2 (66,7%)
15 Negativt
10 (66,7%)
tutti pANCA
17 (77,3%)
tutti pANCA atipici
Jämförelsemetod
Positivt
Immunocomplesso semilunare
IC formalin
tous pANCA
Negativ
Posititv
ANCA
tous cANCA
8 (66,7%)
Vergleichsmethode
TABELLA 5
IC Formalin
434
548
26 (86,7%)
Glomerulonefrite
Positivt
292
Malattia infiammatoria dell'intestino
ANCA
5
Negativt
13
22
Número
30
548
Positivo
Patrón de tinción
26 (86,7%)
todo cANCA
12
8 (66,7%)
todo pANCA
20
18 (90,0%)
todo pANCA
3
2 (66,7%)
15
10 (66,7%)
22
17
15(77,3%)
inmunocomplejos
PROCEDURA DEL TEST ANCA
1.
RICOSTITUZIONE DEL TAMPONE (PBS)
Sciogliere il contenuto di una confezione
di tampone in un litro di acqua deionizzata
o distillata. Coprire e conservare alla temperatura di 2-10° fino a quattro settimane
o fino a che non si presentino segni di
contaminazione o altri cambiamenti visibili.
2.
DILUIZIONE DEI CAMPIONI DEI PAZIENTI
Screening: diluire i campioni del paziente a
01:20 aggiungendo 0,05 ml (50 µl) di siero a
0,95 ml (950 µl) di diluente per campioni.
Titolo semi-quantitativo: per preparare diluizioni seriali duplici di campioni di screening
(ad es. 1:40, 1:80, 1:160...1:640), rimuovere
0,5 ml della diluizione 1:20 e mescolarla
con 0,5 ml di diluente per campioni per ottenere una diluizione a 01:40, e continuare
le diluizioni seriali in tal modo.
3.
DILUIZIONE OPZIONALE DEL CONTROLLO
TITOLABILE
Trattare il controllo opzionale titolabile
come un campione del paziente non diluito. Diluire il controllo a 01:20 aggiungendo
0,05 ml (50 µl) di siero di controllo a 0,95 ml
diluente per campioni. Preparare diluizioni
seriali duplici del controllo titolabile, come
sopra descritto.
4.
PREPARAZIONE DEI VETRINI DEL SUBSTRATO
(20-25 µl/pozzetto)
Rimuovere il/i vetrino/i dal contenitore/i e
porre i sieri di controllo sui pozzetti di controllo come descritto di seguito. Capovolgere il flacone contagocce di controllo e
premere delicatamente fino a che in punta
è visibile la goccia. Appoggiare delicatamente la goccia sul pozzetto di controllo
appropriato evitando il contatto diretto
della punta del contagocce con la superficie del vetrino. Mettere il controllo pANCA
positivo sul pozzetto contrassegnato come
“pANCA”, il controllo cANCA positivo
sul pozzetto indicato come “cANCA”, il
controllo negativo sul pozzetto indicato
come “neg” e una goccia di diluente per
campione sul pozzetto indicato come
“bianco”. Aggiungere 1 goccia (20-25 µl)
di campione diluito del paziente ai pozzetti
numerati.
ATTENZIONE: IL CONTATTO DIRETTO DELLA
PUNTA DEL CONTAGOCCE CON LA SUPERFICIE DEL VETRINO PUÒ DANNEGGIARE IL
SUBSTRATO ANTIGENE.
5.
INCUBAZIONE DEI VETRINI (30±5 minuti a
temperatura ambiente, ovvero 18-24°C)
Mettere il/i vetrino/i in una camera umida,
coperta (una capsula di Petri con carta assorbente inumidita andrà bene). Incubare,
col coperchio, per 30 minuti (±5 minuti) a
temperatura ambiente (18-24°C).
6.
RISCIACQUO COL PBS
Rimuovere il/i vetrino/i dal piatto
dell’incubatore e sciacquare brevemente
con PBS usando una bottiglia a zampillo,
una pipetta di Pasteur o una pipetta
sierologica. Non far zampillare il tampone
direttamente sui pozzetti.
NOTA: per evitare la contaminazione incrociata sui vetrini con 10 pozzetti, orientare
il flusso di PBS lungo la linea mediana del
vetrino, inclinando prima verso le provette
1-3 e poi verso quelle 4-6.
7.
LAVAGGIO COL PBS (10 minuti)
Lavare il/i vetrino/i per 10 minuti con PBS in
un piatto per la colorazione del vetrino o
una vaschetta Coplin. Si raccomanda di
agitare con delicatezza all’immersione del
vetrino, al punto mediano e alla rimozione.
Questo lavaggio può durare fino a 30 minuti senza che i risultati finali dell’analisi varino.
Eliminare la soluzione di lavaggio PBS dopo
l’uso. Per risultati ottimali, cambiare il PBS
al punto mediano e usare un agitatore
magnetico.
16
8.
REAGENTE ANTICORPO FLUORESCENTE
(coprire i pozzetti con 10-12 gocce)
Rimuovere uno alla volta i vetrini dal PBS
e immergerli 3-5 volte in acqua deionizzata o distillata. Tamponare il vetrino
sul lato con carta bibula o con carta
assorbente in modo da eliminare l’acqua
in eccesso. Riportare immediatamente
il vetrino nella camera di incubazione e
coprire completamente i pozzetti usando
il reagente anticorpo fluorescente; iniziare
mettendo una goccia su ogni pozzetto.
Ripetere l’operazione per ciascun vetrino.
Il reagente anticorpo fluorescente è stato
titolato al fine di compensare l’acqua
deionizzata o distillata residua che resta sul
vetrino dopo il risciacquo.
NOTA: è importante che i pozzetti dei
vetrini non si asciughino durante questa
procedura onde evitare il danneggiamento del substrato.
TAMPONARE O ASCIUGARE IL VETRINO IN
MANIERA CHE LO STESSO NON RESTI SENZA
REAGENTE ANTICORPO FLUORESCENTE PER
PIÙ DI 15 SECONDI.
9.
INCUBAZIONE DEI VETRINI (30±5 minuti a
temperatura ambiente, ovvero 18-24°C)
Mettere il coperchio sulla camera di incubazione e coprire con carta assorbente
per impedire l’esposizione alla luce se la
cella non è opaca. Lasciare incubare il/i
vetrino/i per 30 minuti (±5 minuti) a temperatura ambiente (18-24°C).
10.
RISCIACQUO COL PBS
Rimuovere il/i vetrino/i dal piatto
dell’incubatore e sciacquare brevemente
con PBS. Non far zampillare il tampone
direttamente sui pozzetti.
11.
LAVAGGIO COL PBS (10 minuti)
Lavare il/i vetrino/i per 10 minuti con PBS in
un piatto per la colorazione del vetrino o
una vaschetta Coplin. Si raccomanda di
agitare con delicatezza all’immersione del
vetrino, al punto mediano e alla rimozione.
Questo lavaggio può durare fino a 30
minuti senza che i risultati finali dell’analisi
varino.
12.
MONTAGGIO DEL VETRINO COPRIOGGETTI
Rimuovere uno alla volta i vetrini dal PBS e
immergerli 3-5 volte in acqua deionizzata
o distillata. Tamponare il vetrino sul lato
con carta bibula o con carta assorbente in
modo da eliminare l’acqua in eccesso.
TAMPONARE O ASCIUGARE IL VETRINO
IN MANIERA CHE NON RIMANGA SENZA
COPRIVETRINO PER PIÙ DI 15 SECONDI.
Aggiungere 4-5 gocce di mezzo di fissaggio
semipermanente lungo la linea mediana
di ciascun vetrino. Posizionare con attenzione il vetrino coprioggetto, evitando
vuoti d’aria, abbassando delicatamente il
vetrino coprioggetto da un estremo all’altro
del vetrino.
NOTA: una quantità eccessiva di mezzo
di fissaggio sul vetrino può causare
un’alta fluorescenza di fondo, dovuta alla
dispersione della luce o alla mancanza di
risoluzione chiara delle cellule (immagine
sfocata). L’eccesso del mezzo di fissaggio
può essere eliminato dal vetrino tamponando delicatamente il vetrino coprioggetto
con carta assorbente o carta per pulire
lenti evitando qualsiasi movimento diretto
del vetrino coprioggetto.
PER ASSISTENZA TECNICA: +1 916-363-2649
oppure a mezzo e-mail:
[email protected]
SISTEMA DE DETECCIÓN DE ANCA
PARA USO DIAGNÓSTICO IN VITRO
RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA
Uso previsto: Se trata de una determinación indirecta
por inmunofluorescencia para la detección semicuantitativa de autoanticuerpos citoplásmicos antineutrófilos
(ANCA) en suero humano. Este sistema de análisis ha
de emplearse como ayuda en la detección de anticuerpos asociados a las vasculitis autoinmunitarias.
Los autoanticuerpos citoplásmicos antineutrófilos
(ANCA) son un grupo de anticuerpos que reaccionan
con los antígenos citoplásmicos de los neutrófilos
humanos. Aunque aparecieron por primera vez en un
informe de 1964 (1), su primera vinculación con enfermedades apareció en 1982, cuando Davies y cols.
informaron de su presencia en ocho pacientes con
glomerulonefritis necrotizante segmentaria (2). En 1984,
se informó de otros cuatro pacientes con vasculitis y
glomerulonefritis. En 1985 van der Woude y cols. demostraron que los ANCA tenían una elevada asociación
a la granulomatosis de Wegener, y que el título de
anticuerpos se correlacionaba con la actividad de la
enfermedad (3). En 1988, Falk y Jenette publicaron que
los ANCA tenían más de una especificidad antigénica
(4). En un informe ulterior se comunicó que la especificidad de los ANCA se correlacionaba con las características anatomopatológicas de las vasculitis (5).
En el análisis de ANCA por inmunofluorescencia se
pueden observar varios patrones de tinción celular. Se
han descrito dos principales; han sido bien caracterizados con neutrófilos fijados en etanol, y se emplean en
la detección de ANCA por inmunofluorescencia. Los
autoanticuerpos que muestran un patrón citoplásmico
granular fino, denominados cANCA, suele ir dirigidos
contra una serina proteasa, la proteinasa 3 (PR-3). Se
ha demostrado que estos autoanticuerpos presentan
un elevado grado de asociación a la granulomatosis
de Wegener. El otro patrón de tinción importante, el
perinuclear o pANCA, que se suele deber a autoanticuerpos dirigidos con la mieloperoxidasa (MPO), se
ha asociado a las vasculitis sistémicas y a la glomerulonefritis necrotizante idiopática y con semilunas (4).
El patrón pANCA es un artefacto inducido por el uso
de etanol como fijador (4). Si los neutrófilos se fijan
con formol la mieloperoxidasa (el principal antígeno
responsable del patrón pANCA en células fijadas con
etanol) sigue asociado a los gránulos primarios (alfa), y
muestra una distribución citoplásmica granular. La proteinasa 3 (PR-3) sigue asociada a los gránulos primarios
(alfa) tanto si se emplea etanol como fijador como si se
emplea formol.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
El análisis de autoanticuerpos citoplásmicos antineutrófilos (ANCA) de Immuno Concepts emplea la
técnica indirecta de detección de anticuerpos por
inmunofluorescencia (IFA) descrita por primera vez por
Weller y Coons (6). Se incuban muestras de pacientes diluidas con neutrófilos humanos, que se fijan en
portaobjetos de vidrio para permitir la unión específica
de los ANCA. Si hay ANCA, los autoanticuerpos se unen
a los antígenos de los neutrófilos. Tras el lavado para
retirar los anticuerpos unidos de forma inespecífica, se
incuba el sustrato con IgG antihumana conjugada con
fluoresceína. Si los resultados son positivos se forma un
complejo estable con tres partes: el anticuerpo antihumano fluorescente unido al ANCA humano, unido a su
vez al antígeno localizado en las células. Este complejo
se puede visualizar con la ayuda de un microscopio
de fluorescencia. Las muestras positivas para ANCA
mostrarán una tinción citoplásmica granular de los
neutrófilos característica, tanto en los portaobjetos
fijados con etanol como en los fijados con formol. En
las muestras positivas para pANCA se observará un
patrón de tinción difusa o periférica de los neutrófilos
en las células fijadas con etanol, y una tinción granular
del citoplasma en las fijadas con formol. Si la muestra
es negativa para ANCA, los neutrófilos no se teñirán de
forma específica.
COMPONENTES DEL SISTEMA (MATERIALES SUMINISTRADOS)
Utilización: Todos los componentes se entregan listos
para su empleo, sin necesidad de fragmentarlos ni prepararlos (excepto el tampón PBS, que debe ser disuelto
en agua desionizada o destilada antes de utilizarlo).
Conservación: Todos los componentes deben conservarse en refrigerador a 2-10 ºC. Una vez preparado, el
tampón PBS debe conservarse en envases con tapón
de rosca, en refrigerador a 2-10 ºC durante cuatro
semanas como máximo, hasta que aparezcan signos
de contaminación u otros cambios visibles.
Estabilidad: Todos los componentes son estables al
menos durante 12 meses a partir de la fecha de fabricación. No utilice los componentes pasada la fecha
de caducidad.
REACTIVOS
Portaobjetos con sustrato ANCA:* Nº de catálogo
10010-11 (etanol como fijador) o 10010-12 (formol
como fijador). Portaobjetos con diez pocillos que
contienen neutrófilos humanos estabilizados y fijados
directamente en los pocillos de análisis. El exclusivo
diseño de los fosos del portaobjetos reduce al mínimo
la contaminación cruzada de los pocillos durante la
prueba. Los portaobjetos llevan cuatro pocillos de
control designados como pANCA, cANCA, negativo y
vacío, que ayudan a interpretar adecuadamente los
resultados.
Disolvente para muestras ANCA: Número de catálogo
10100 (100 ml) Disolvente para muestras tamponado
patentado, para disolver las muestras de los pacientes.
Control positivo cANCA: Nº de catálogo 10021-12. Vial
con cuentagotas listo para usar, que contiene 1,0 ml de
suero de control humano positivo cANCA. Este suero
muestra una tinción granular del citoplasma entre los
segmentos nucleares de los neutrófilos, tanto en los
portaobjetos fijados con etanol como en los fijados
con formol. Este reactivo contiene azida sódica al 0,1%
como conservante.
Control positivo pANCA: Nº de catálogo 10021-11. Vial
con cuentagotas listo para usar, que contiene 1,0 ml de
suero de control humano positivo pANCA. Este suero
muestra una tinción nuclear difusa o periférica de los
neutrófilos en los portaobjetos fijados con etanol, y una
fluorescencia citoplásmica granular en los fijados con
formol. Este reactivo contiene azida sódica al 0,1%
como conservante.
Control titulable cANCA: Nº de catálogo 10026-12. Vial
con cuentagotas listo para usar, que contiene 0,25 ml
de suero de control humano positivo cANCA estable
líquido. Este reactivo contiene azida sódica al 0,1%
como conservante. Este control debe ser tratado como
muestra de paciente no diluida. Véase la información
sobre títulos medios en la ficha técnica.
Control titulable pANCA: Nº de catálogo 10026-11. Vial
con cuentagotas listo para usar, que contiene 0,25 ml
de suero de control humano positivo pANCA estable
líquido. Este reactivo contiene azida sódica al 0,1%
como conservante. Este control debe ser tratado como
muestra de paciente no diluida. Véase la información
sobre títulos medios en la ficha técnica.
Control negativo: Nº de catálogo 10031. Vial con cuentagotas listo para usar, que contiene 1,0 ml de suero
de control humano negativo ANCA. Este suero muestra
una fluorescencia de color verde mate inespecífico
de baja intensidad de los neutrófilos. Este reactivo
contiene azida sódica al 0,1% como conservante.
Reactivo fluorescente para anticuerpos específico de
la IgG: Número de catálogo 10009 (9ml). IgG antihumana de cabra, conjugada con fluoresceína isotiocianato
(FITC). Este reactivo contiene azul de Evans como
contratinción. El reactivo se presenta en frascos con
cuentagotas de precisión listos para usar. Este reactivo
contiene azida sódica al 0,1% como conservante.
*Este portaobjetos está protegido por una o más de las
siguientes patentes estadounidenses y de otros países:
4387972, D-274261, D-273261, patente canadiense
1171302, y otras patentes en trámite.
ELEMENTOS NO REACTIVOS
Tampón PBS: Nº de catálogo 1011. Polvo tampón salino
con fosfato (0,01 M, pH 7,4 ± 0,2). Cada bolsa contiene
polvo tampón suficiente para formar 1 litro. (Los kits de
análisis completos llevan una bolsa de polvo tampón
por cada cinco portaobjetos).
Preparación: Disuelva una bolsa de polvo tampón en
1 litro de agua desionizada o destilada y consérvelo
en refrigerador a 2-10 ºC durante 4 semanas como
máximo, o hasta que aparezcan signos de contaminación u otros cambios visibles.
17
Medio de montaje semipermanentes: Nº de catálogo
1111. Vial con cuentagotas listo para usar, que contiene 5 ml de medio para preparaciones microscópicas
a base de glicerol, pH 9,1 ± 0,2. Este reactivo contiene
azida sódica al 0,1% como conservante.
Cubreobjetos: Número de catálogo 1041. Cada envase
contiene diez cubreobjetos de vidrio nº 1 de 24x60 mm.
OTROS MATERIALES NECESARIOS (PERO QUE NO SE
SUMINISTRAN)
OBTENCIÓN DE MUESTRAS
Obtención: La muestra ideal es suero. Se obtendrán
aproximadamente 5 ml de sangre por venipunción
aséptica, con un tubo de vacío estéril u otro sistema de
obtención adecuado. Deje que la sangre coagule a
temperatura ambiente (18-24 ºC). Se separará el suero
del coágulo cuanto antes, para que no se produzca
hemólisis.
Sustancias que interfieren: No se utilizarán sueros que
muestren grados elevados de hemólisis, ictericia,
lipemia o crecimiento microbiano, pues en todas esas
circunstancias se pueden producir una reducción el
título de anticuerpos en muestras positivas. Las muestras
con niveles de lípidos muy elevados pueden presentar
una película fluorescente inespecífica sobre el sustrato
celular. Este problema se puede eliminar utilizando
muestras tomadas en ayunas o aclarándolas por ultracentrifugado. Si la muestra presenta partículas visibles,
éstas deben ser eliminadas por centrifugado antes de
la prueba.
Pipetas volumétricas para dispensar volúmenes de
20-25 µl
Jarras Coplin o platillos de tinción
Frasco para exprimir o pipetas de Pasteur
Pipetas serológicas
Envases de un litro (para el tampón PBS)
Agua desionizada o destilada
Probetas para preparar series de diluciones opcionales
Papel secante o toallas de papel
Cámara de incubación
Guantes de látex desechables
Cronómetro
Microscopio de fluorescencia equipado con un filtro
excitador de 495 mm y un filtro de barrera de
515 mm
Conservación: Los sueros se pueden conservar a 2-10
ºC durante una semana como máximo. Si el análisis se
posterga, los sueros deben conservarse congelados a
una temperatura de –20 ºC o inferior. No se utilizarán
refrigeradores ni congeladores con sistema “auto-frost”
(eliminación automática de la escarcha).
PRECAUCIONES
1. Todos los materiales de procedencia humana
utilizados en este producto han sido analizados en
busca de anticuerpos con el virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1), el virus de la inmunodeficiencia humana-2 (VIH-2), el virus de la hepatitis
C (VHC) y el antígeno de superficie de la hepatitis
B (HBsAG) con métodos aprobados por la FDA,
obteniendo resultados negativos (no reactivos en
varias ocasiones) en todos los casos. Pero no existe
ningún método de análisis que pueda garantizar
por completo la ausencia de VIH-1, VIH-2, hepatitis
C, hepatitis B u otros agentes infecciosos. Por eso,
todos los sueros de control deben ser manipulados
como si fueran infecciosos.
2. Todas las muestras de paciente deben ser manipuladas según el nivel 2 de bioseguridad, según
se recomienda en el manual de los Centers for
Disease Control/National Institutes of Health para
toda muestra de suero o sangre humana potencialmente infecciosa: Biosafety in Microbiological
and Biomedical Laboratories, 1984 Edition.
3. La disolución de los componentes o su sustitución
por otros distintos de los suministrados con el
sistema puede arrojar resultados incoherentes.
4. Se emplea azida sódica (0,1%) como conservante.
La azida sódica puede reaccionar con el plomo
o con las conducciones de cobre y formar sales
de azidas metálicas explosivas. Al eliminar los
reactivos, lavar con grandes volúmenes de agua
del grifo para evitar que queden residuos en las
tuberías. La azida sódica es venenosa y puede ser
tóxica en caso de ingestión.
5. Este kit es para uso diagnóstico in vitro.
6. El suero de control titulable debe utilizarse para
controlar la reproductibilidad entre lotes y entre ciclos. No está concebido para medir la sensibilidad
o la especificidad generales del ensayo.
7. Esta prohibido fumar, comer o beber en las zonas
de manipulación de las muestras o los reactivos del
kit.
8. Evite salpicaduras y la generación de aerosoles en
todo momento.
9. Si los tiempos de incubación y las temperaturas
no son los especificados, los resultados pueden ser
erróneos.
10. La contaminación cruzada de los reactivos o de las
muestras puede dar resultados falsos.
11. Los elementos de vidrio reutilizables deben ser
lavados y enjuagados a fondo para eliminar los
detergentes antes de su uso. Todos los elementos
de vidrio deben estar limpios y secos antes de su
uso.
12. Todos los reactivos, portaobjetos y muestras deben
estar a temperatura ambiente (18-24 ºC) antes de
su uso.
13. Para manipular las muestras y los reactivos debe
utilizar guantes de látex desechables, y cuando
acabe deberá lavarse bien las manos.
14. La contaminación microbiana de los reactivos o de
las muestras puede dar resultados falsos.
15. No pipetée nunca con la boca y evite el contacto
de los reactivos y las muestras con la piel y las mucosas. En caso de contacto, lávese con un jabón
germicida y agua abundante.
18
PRECAUCIÓN: Si las muestras son sucesivamente
congeladas y descongeladas, se pueden obtener
resultados falsos positivos y negativos.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
CONTROL DE CALIDAD
Para el control de calidad se dispondrán los controles
positivo, negativo y vacíos en los pocillos al efecto que
se encuentran en todos los portaobjetos. El control
positivo cANCA debe dar una tinción citoplásmica
granular fluorescente de color verde manzana brillante
entre los segmentos nucleares de los neutrófilos, tanto
en los portaobjetos fijados con etanol como en los
fijados con formol. El control positivo pANCA muestra
una tinción nuclear difusa o periférica de color verde
manzana brillante los neutrófilos en los portaobjetos
fijados con etanol, y una fluorescencia citoplásmica
granular en los fijados con formol. El control negativo
no debe mostrar fluorescencia verde brillante. En el
control negativo se puede observar una fluorescencia
de color verde mate inespecífica y baja intensidad.
El control vacío se emplea para observar la tinción
inespecífica del reactivo de anticuerpos, y no debe
dar fluorescencia verde. La contratinción que se facilita
con el conjugado puede teñir las células de color rojo
mate. Si los controles no se ven como se ha descrito, la
prueba no es válida y debe repetirse.
CONTROL TITULABLE OPCIONAL
Para interpretar los títulos, muchos laboratorio empiezan por el pocillo que contiene la muestra más diluida,
y van “hacia atrás” hasta la dilución 1:20. El primer
pocillo en el que se aprecie un patrón discernible de
tinción del citoplasma corresponde al título que se
considera como criterio de valoración. Recomendamos utilizar esta técnica para determinar los criterios de
valoración de los títulos.
El título medio y el rango de títulos (± una dilución a
cada lado de la media) determinados para cada
número de lote han sido establecidos en nuestro
laboratorio, y se consideran la norma. Este control se
facilita para que cada laboratorio pueda evaluar la
reproductibilidad (precisión) de sus análisis de ANCA.
Como quiera que este control no ha sido diseñado
como indicador de la exactitud de la titulación, cada
laboratorio deberá establecer su propio criterio de valoración del título medio para cada muestra, utilizando
esta información para evaluar la reproductibilidad
(precisión) de unos ciclos a otros.
Mediante la reiterada evaluación de este control
titulable utilizando el sistema de análisis de ANCA por
inmunofluorescencia de Immuno Concepts, se ha
establecido un título medio para cada número de lote.
El número de lote, el título medio y el rango de títulos (±
una dilución doble a cada lado de la media) figuran
en la etiqueta del vial y deben servir como guía para el
funcionamiento del sistema de análisis.
Puede que los valores obtenidos en nuestro laboratorio
difieran de los suyos. He aquí algunos de los muchos
factores que pueden afectar a sus resultados:
1. Tipo de fuente de luz: Las fuentes de luz de mercurio producen una energía de excitación a 495 nm
mayor que las de cuarzo/halógenas. Las fuentes
de luz de mercurio de 50, 100 y 200 vatios difieren
poco en la energía de excitación a 495 nm. Las
fuentes de luz de cuarzo/halógenas de 100 vatios
producen una energía de excitación a 495 nm
superior a la proporcionada por las de cuarzo/
halógenas de 50 vatios.
2. El estado de la fuente de luz y su edad: Esto es
especialmente cierto para las fuentes de luz de
mercurio, que suelen experimentar una reducción gradual de la energía de excitación a 495
nm antes de agotarse. Esta gradual reducción
de la energía de excitación puede producir una
pérdida significativa de la sensibilidad en un plazo
de semanas. El problema se puede evitar con un
registro cronológico. Para que los resultados sean
óptimos, cambie las bombillas de mercurio de 500
vatios cada 100 horas, y las de 100 ó 200 vatios
cada 200 horas. Por lo general, las fuentes de luz
de cuarzo/halógenas no experimentan una reducción gradual de la energía de excitación antes de
agotarse.
3. El tipo de filtro excitador utilizado: Los filtros excitadores por interferencia proporcionan mayor sensibilidad en una longitud de onda mucho menor que
los filtros excitadores por absorción. Si desea más
información, consulte el manual de su microscopio
de fluorescencia, o con su delegado de ventas.
4. Correcta alineación del haz de luz del microscopio.
Consulte las instrucciones del manual del microscopio de fluorescencia.
5. La apertura numérica del objetivo. Si se emplea
fluorescencia por luz incidente (Epi), la fluorescencia aumenta exponencialmente con la
apertura numérica (NA) del objetivo. Así, puede
que un objetivo de 40X con una apertura de 0,65
interprete una o más diluciones como inferiores a
las determinadas con un objetivo de 40X con una
apertura numérica de 0,85. La apertura numérica
va impresa a un lado del objetivo. La apertura numérica no afecta a la sensibilidad del microscopio
de luz fluorescente transmitida.
6. Filtros de supresión. Los filtros de supresión reducen
longitudes de onda de excitación concretas, y
se pueden utilizar para reducir la sensibilidad. Si
desea más información, consulte el manual de su
microscopio de fluorescencia, o con su delegado
de ventas.
7. Precisión y exactitud de la técnica de dilución, del
equipo y de la realización de los procedimientos
de análisis.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS DEL PACIENTE
Para ver los neutrófilos se recomienda un aumento total
de 400X.
Negativos: Se considera que un suero es negativo para
ANCA si a una dilución de 1:20 la tinción fluorescente
verde de las células es igual o inferior a la del pocillo de
control negativo. En los neutrófilos se puede observar
una tinción de fondo inespecífica, debida a los anticuerpos heterófilos o a los autoanticuerpos.
Positivos: Se considera que un suero es positivo para
ANCA si a una dilución de 1:20 las células de todos los
campos muestran fluorescencia citoplásmica granular
similar a la observada en el control cANCA, tanto en
los portaobjetos fijados con etanol como en los fijados
con formol. Por otro lado, se considera que un suero es
positivo para ANCA si a una dilución de 1:20 las células
muestran fluorescencia nuclear difusa o periférica
similar a la observada en el control pANCA en los
portaobjetos fijados con etanol.
NOTIFICACIÓN DE LOS RESULTADOS
Selección: Se indicará si el resultado es positivo o negativo a la dilución 1:20.
Patrones de tinción: Muchos autoanticuerpos puede
teñir el citoplasma y/o el núcleo de los neutrófilos. Hay
dos patrones principales de tinción específicos:
cANCA (tinción clásica o citoplásmica): La tinción de
los gránulos alfa (primarios) del citoplasma muestra un
patrón de tinción citoplásmica moteada homogéneo,
a menudo con una concentración de la tinción en los
lóbulos del núcleo. El moteado citoplásmico se observa
tanto en los neutrófilos fijados con etanol como en los
fijados con formol
pANCA (tinción perinuclear): Tinción lisa u homogénea
de los núcleos multilobulados, a menudo con una
notable tinción periférica de los lóbulos nucleares de
los neutrófilos fijados con etanol. En los neutrófilos fijados
con formol estos anticuerpos muestran una tinción
citoplásmica granular.
Los anticuerpos antinucleares y otros autoanticuerpos
pueden reaccionar con los neutrófilos, por lo que en
todas las muestras positivas se practicará un análisis de
ANA con sustrato del células HEp-2 antes de declarar la
presencia de ANCA.
Titulación opcional: Los resultados se notificarán como
la inversa de la dilución del último pocillo en el que se
observa reacción positiva.
LIMITACIONES DEL ANÁLISIS
1. No es posible hacer un diagnóstico basándose
sólo en la detección de anticuerpos citoplásmicos
antineutrófilos. El médico debe interpretar estos resultados en el contexto de la historia y los síntomas
del paciente, los hallazgos físicos y otros procedimientos diagnósticos.
2. No se debe iniciar un tratamiento basándose exclusivamente en un resultado positivo del análisis de
anticuerpos citoplásmicos antineutrófilos. Antes de
iniciar un tratamiento hay que tener en cuenta las
indicaciones clínicas, otros hallazgos de laboratorio
y la impresión clínica del médico.
3. Los anticuerpos antinucleares presentes en las
muestras de los pacientes pueden reaccionar con
el sustrato celular. Si hay anticuerpos antinucleares,
a menudo se pueden interpretar los resultados
ANCA debido al diferente carácter de la tinción
ANCA específica, a que los títulos son diferentes,
y/o a la intensidad de las reacciones. Si la reacción fluorescente de los anticuerpos antinucleares
es tan intensa que oscurece la tinción ANCA se
declarará la prueba como “no interpretable” y se
utilizará otro método para determinar el estado
ANCA del paciente.
4. Como quiera que existen muchas opciones en
los microscopios de fluorescencia, se recomienda
estandarizar las fuentes de luz, los filtros y los medios
ópticos para comparar los títulos de los pacientes
obtenidos en diferentes laboratorios.
5. Los resultados de esta prueba, junto con la
información obtenida de la evaluación clínica y
otros procedimientos diagnósticos, servirán para
determinar la situación clínica del paciente.
VALORES ESPERADOS
El valor previsto en la población normal es negativo a
la dilución 1:20 utilizada para la selección. En pacientes
con enfermedades, se han notificado valores de hasta
1:640 (7).
CARACTERÍSTICAS DEL RENDIMIENTO
MUESTRAS NORMALES
Se analizaron en paralelo muestras de suero de 497
donantes de sangre (247 varones y 250 mujeres) con
el kit ANCA de Immuno Concepts y otro kit comercializado. Todas las muestras que dieron positivo en
portaobjetos fijados con etanol en esta población también fueron sometidas a la detección de anticuerpos
antinucleares (ANA) mediante el sistema de análisis de
ANA HEp-2 de Immuno Concepts.
Entre las muestras normales, 22 dieron positivo para
ANA y fueron consideradas no interpretables para
ANCA. Las demás muestras discrepantes fueron
sometidas a la detección de anticuerpos anti MPO y
PRE mediante ELISA para determinar la situación real
de los anticuerpos.
SUEROS ANTERIORMENTE DETERMINADOS COMO
POSITIVO PARA ANCA POR INMUNOFLUORESCENCIA
INDIRECTA
Las muestras de suero que fueron consideradas
positivas para ANCA mediante prueba IFA locales
se obtuvieron de laboratorios de referencia de los
Estados Unidos, el Reino Unido y Australia. En esta parte
del estudio se examinó un total de 383 suero, que
esperábamos que dieran positivo para ANCA. Estas
muestras fueron evaluadas en paralelo con el kit ANCA
de Immuno Concepts y otro kit comercializado. Las
muestras discrepantes fueron sometidas a la detección ANA con el sistema de análisis de ANA HEp2 de
Immuno Concepts y de anticuerpos anti MPO y PRE
mediante ELISA.
19
Formalina
Metodo di confronto
IC ANCA
Negativo
5
548
neutrófilos humanos fijados con formol:
Posititvo
Negativo
Comparison Method
Combinando los resultados de la población normal
Negative
Posititve
Posititvo
324
94
Etanolo
con
losICde la anómala, obtuvimos los siguientes datos
enANCA
laICcomparación
inicial
para
el
sistema
de
análisis
de
Posititve
255
52
Negativo
124
316
ANCA
de Immuno Concepts con neutrófilos humanos
Formalin
fijados
(tabla 1):
45
528
ANCAcon etanol
Negative
Formol IC
ANCA
Posititvo
Negativo
Posititvo
292
13
Negativo
5
548
Posititvo
Negativo
Etanol IC
ANCA
Formol IC
ANCA
Posititvo
324
Positif
94
Négatif
Negativo
Positif
124
255
316
52
Négatif
45
Vergleichsmethode
Estos datos arrojan la siguiente estadística de
comparación:
Negativ
Posititv
Sensibilidad relativa: 98,3%
Posititv
Especificidad
relativa: 97,7% 292
13
IC Formalin
Concordancia general: 98,6%
528
Vergleichsmethode
ANCA
Estos datos arrojan la siguiente estadística de
comparación:
Negativ
Posititv
Posititv
Especificidad
relativa: 77,1% 324
94
Metodo di confronto
IC Äthanol
ANCA
Negativ
Posititvo
124
Negativ
5
548
MUESTRAS DE SUERO DE PACIENTES CON VASCULITIS
CONOCIDA
Jämförelsemetod
Se analizaron muestras de 102 pacientes
con vasculitis
clínicamente caracterizadas utilizando el sistema de
Positivt
Negativt
análisis de ANCA de Immuno Concepts con neutrófilos
humanos fijadosPositivt
con etanol y el292
de neutrófilos fijados
13
IC formalin
con formol. Los resultados de la comparación se recoANCA
gen en la tabla Negativt
5:
548
5
Negativo
316
En la comparación inicial para el sistema de análisis de
Posititvo
255
52
Formalina
ANCA
de Immuno Concepts con neutrófilos humanos
IC ANCA
fijados
con formol
obtuvimos los siguientes datos
Negativo
45 Jämförelsemetod
528
(tabla 2):
Clinical
Staining Pattern
Negativt
DiagnosisPositivt
Number
Método
de comparación Positive
REACTIVIDAD CRUZADA (Ethanol Fixed)
Positivt
IC etanol
324
Posititvo
ANCA
Formol IC
94
Negativo
30
26 (86.7%)
all cANCAcon diversos
Se evaluaron sueros de 57 pacientes
trastornos autoinmunitarios con el sistema de análisis de
all pANCA
ANCA de Immuno Concepts con neutrófilos humanos
ANCA Microscopic polyarteritis
20
all
pANCA
18
(90.0%)
fijados con etanol y con el sistema
de análisis de ANCA
45
528
Negativo
Posititve
Negative
de Immuno Concepts con neutrófilos humanos fijados
one pANCA; one both pANCA and cANCA
3
2 (66.7%)
con formol. Tres de las muestras dieron una tinción
IC
Posititve
380
32
Vergleichsmethode
Immune
Complex
15 de
all pANCA,
pANCA en los neutrófilos
10 (66.7%)
nuclear atípica, parecida a la
Estos
datos arrojan
laCrescentic
siguiente estadística
Ethanol
fijados con etanol. Las tres pertenecían a pacientes
comparación:
Negativ
Posititv
434
6
ANCA Glomerulonephritis
Negative
con LES, dieron positivo para anticuerpos anti-ADN y
all atypical
Inflammatoryrelativa:
Bowel Disease
22
17 (77.3%)
mostraron ANA positivo con
patrónpANCA
homogéneo. Otra
Especificidad
91,0% 255
Posititv
52
IC Formalin
muestra presentó un moteado citoplásmico en los
ANCA
neutrófilos fijados con etanol, pero dio negativo en los
Negativ
45
528
Méthode
de comparaison
neutrófilos fijados con formol y en la prueba de ANA.
Muchos autoanticuerpos pueden reaccionar con
Se consideró que en esta muestra se había producido
Positif
Négatif
los neutrófilos humanos, además
de los asociados
a
una reacción inespecífica. Todos los demás sueros de
las vasculitis autoinmunitarias (8). Para confirmar que
Jämförelsemetod32
Positif
esta población dieron negativo
tanto con los neutrófilos
Image fluorescente
los anticuerpos
detectados por380
cualquier prueba
de
Éthanol
IC
Diagnostic clinique
à l’éthanol)
(fixation
Nombre
Positiif
fijados con etanol como con
los fijados
con formol.
ANCA
son clínicamente
ANCA por inmunofluorescencia
Positivt
Negativt
6
434
Como quiera que muchos autoanticuerpos pueden
significativos, seNégatif
recomienda encarecidamente
realizar
de forma inespecífica
con los neutrófilos huanálisis de confirmación
con
ELISA
y la
Positivt
255 para la MPO
30 52
Granulomatose
de Wegener
tous cANCA
26reaccionar
(86,7%)
IC formalin
manos (8), las pruebas de inmunofluorescencia positiva
PR-3 (9).
ANCA
12
tous con
pANCA
8deben
(66,7%)ser confirmadas siempre
otras específicas
45
528
Negativt
los anticuerpos asociados
a los
ANCA.
Metodo
di confronto
Todas las muestras
discrepantes
de
las tablas
anteriores 18de
20
Périartérite
microscopique
tous
pANCA
(90,0%)
fueron sometidas a análisis de anticuerpos antinuclePosititvo
Syndrome de Churg et
Strauss
3Negativo
2 (66,7%)
REPRODUCTIBILIDAD
ares y de anticuerpos contra MPO y PR-3. Teniendo en
15
tous pANCA
à
croissants
10
(66,7%)
cuentaGlomérulonéphrite
los resultados
de
estas
pruebas,
en
la
tabla
3
Posititvo
380
32
Etanolo IC
Se realizaron estudios intra-ensayo, entre días y entre
se recogen los resultados generales para el sistema de
épithéliaux
du
complexe
immun
ANCA de ANCA de Immuno Concepts con neutrófilos
lotes para demostrar la reproductibilidad del sistema
análisis
Negativo
6
434
análisis de ANCA detous
Immuno
Concepts
Maladie
intestinale
inflammatoire
pANCA
atypiquescon
22
17de
(77,3%)
humanos
fijados
con etanol:
neutrófilos humanos fijados con etanol y del sistema de
análisis de ANCA de Immuno Concepts con neutrófilos
humanos fijados con formol. Los sueros utilizados en
Posititvo
Negativo
este estudio incluyeron
tres muestras
positivas pANCA
Pattern
della colorazione
(una con tinción intensa,(fissaggio
otra moderada
y otra débil) y
in etanolo)
Numero
Positivo
PosititvoDiagnosi clinica
380
32
Etanol IC
tres muestras positivas cANCA (una con tinción intensa,
ANCA
otra moderada y otra débil). También se utilizaron
6
Negativo
30 434
Granulomatosi
di Wegener
26 (86,7%)
tutti cANCA
seis muestras negativas para ANCA. En el estudio
12
pANCA
Poliarterite nodosa
8intra-ensayo
(66,7%)
se evaluaron 12tutti
sueros
en seis pocillos por
entre días y entre
Vergleichsmethode
Estos datos arrojan
la siguiente
estadística
de20
tutti pANCA
Poliarterite
microscopica
18duplicado.
(90,0%) Para la reproductibilidad
lotes estos 12 sueros se analizaron con tres kits con
comparación:
Posititv
pANCA; uno
pANCA
che cANCA
3Negativ
2números
(66,7%) de loteun
diferentes
y ensiatres
ocasiones
distintas.
Las
seis muestra negativas dieron
negativo en todos
Especificidad
relativa:
93,1%
Immunocomplesso
semilunare
15
tutti
pANCA
10
(66,7%)
Posititv
380
32
IC Äthanol
los portaobjetos analizados, y las muestras positivas
Glomerulonefrite
dieron positivo en todos, con intensidades similares de
ANCA
Negativ
6
434
En la
tabla 4infiammatoria
se recogen los
resultados generales
tutti pANCA atipici
Malattia
dell'intestino
22 del
17fluorescencia.
(77,3%)
Negativt
Posititvo nodosa 124
255
Polyarteritis
316
52
Comparison Method
12
8 (66.7%)
sistema de análisis de ANCA de Immuno Concepts con
TABLA 5
Jämförelsemetod
Positivt
IC etanol
ANCA
Positivt
380
Negativt
Número
Positivo
32
Patrón de tinción
30 434
26 (86,7%)
todo cANCA
12
8 (66,7%)
todo pANCA
6
Negativt
20
18 (90,0%)
todo pANCA
3
2 (66,7%)
15
10 (66,7%)
22
17 (77,3%)
inmunocomplejos
20
PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS DE ANCA
1.
PREPARACIÓN DEL TAMPÓN (PBS)
Disuelva el contenido de una bolsa de
tampón en un litro de agua desionizada
o destilada. Tape y conserve en refrigerador a 2-10 ºC durante 4 semanas como
máximo, o hasta que aparezcan signos de
contaminación u otras alteraciones visibles.
2.
DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS DE PACIENTE
Selección: Disuelva las muestras de pacientes a 1:20 añadiendo 0,05 ml (50 µl) de
suero a 0,95 ml (950 µl) de disolvente de
muestras.
Titulación semicuantitativa: Para preparar
series de diluciones dobles de las muestras
de selección (p. ej., 1:20, 1:40, 1:80...1:640),
saque 0,5 ml de la dilución 1:20 y mézclelos
con 0,5 ml de disolvente de muestras para
obtener una dilución 1:40, y así para las
sucesivas diluciones.
3.
DILUCIÓN DEL CONTROL TITULABLE OPCIONAL
Considere que el control titulable opcional
es una muestra de paciente no diluida.
Diluya el control a 1:20 añadiendo 0,05 ml
(50 µl) del suero de control a 0,95 ml de
disolvente de muestras. Prepare diluciones
dobles del control titulable como se ha
descrito.
4.
PREPARACIÓN DE LOS PORTAOBJETOS CON
SUSTRATO (20-25 µl/pocillo)
Saque los portaobjetos de las bolsas y
disponga los sueros de control en los pocillos de control, como se indica: Invierta el
frasco cuentagotas de control y apriete
hasta que se vea una gota en la punta.
Toque suavemente el pocillo de control
con la gota, evitando que la punta del
cuentagotas entre en contacto directo
con la superficie del portaobjetos. Coloque
el control positivo pANCA en el pocillo
designado “pANCA”, el control positivo
cANCA en el pocillo designado “cANCA”,
el control negativo en el pocillo designado “Neg” y una gota de disolvente de
muestras en el pocillo designado “Blank”.
Añada una gota (20-25 µl) de muestra de
paciente diluida a los pocillos numerados.
PRECAUCIÓN: SI LA PUNTA DEL CUENTAGOTAS TOCA DIRECTAMENTE LA SUPERFICIE
DEL PORTAOBJETOS, SE PUEDE DAÑAR EL
SUSTRATO DE ANTÍGENO.
5.
INCUBACIÓN DE LOS PORTAOBJETOS (30±5
minutos a temperatura ambiente, es decir,
entre 18 y 24 °C)
Ponga los portaobjetos en una cámara cubierta y húmeda (bastará con una placa
de Petri con una toalla de papel humedecida). Incube con la tapa puesta durante
30 minutos (±5 minutos) a temperatura
ambiente (18-24 ºC).
6.
ENJUAGUE CON PBS
Saque los portaobjetos de la bandeja de
la incubadora y aclárelos un poco con
PBS utilizando una jeringa o una pipeta de
Pasteur o serológica. No utilice la jeringa
directamente sobre los pocillos.
NOTA: Para evitar la contaminación cruzada de los portaobjetos con 10 pocillos,
dirija el chorro de PBS a la línea media del
portaobjetos, inclinándolo primero hacia
los pocillos 1-3 y luego hacia los pocillos 4-6.
LAVADO CON PBS (10 minutos)
Lave los portaobjetos con PBS durante
10 minutos, en una placa de tinción de
portaobjetos o en una jarra Coplin. Se
recomienda agitar suavemente al sumergir
el portaobjetos, cuando haya pasado la
mitad del tiempo y al sacarlo. Este lavado
puede durar hasta 30 minutos sin que
varíen los resultados finales. Una vez utilizada, tire la solución de lavado PBS. Para
que los resultados sean óptimos cambie
el PBS cuando haya pasado la mitad del
tiempo, y utilice un agitador magnético.
7.
8.
REACTIVO FLUORESCENTE PARA DETECTAR
ANTICUERPOS (cubra los pocillos con 10-12
gotas)
Saque los portaobjetos del PBS de uno
en uno y sumérjalos 3-5 veces en agua
desionizada o destilada. Pase un papel
secante o una toalla de papel por el
borde del portaobjetos para retirar el agua
sobrante. Vuelva a colocar de inmediato el
portaobjetos en la cámara de incubación
y cubra los pocillos por completo con el
reactivo fluorescente para detectar anticuerpos; empiece por poner una gota en
cada pocillo. Repita la operación en cada
portaobjetos. El reactivo fluorescente para
detectar anticuerpos ha sido titulado para
compensar el agua desionizada o destilada residual que queda en el portaobjetos
tras el enjuague.
NOTA: Es importante que los pocillos del
portaobjetos no se sequen durante este
procedimiento, pues se podría dañar el
sustrato.
NO SEQUE EL PORTAOBJETOS NI DEJE QUE
PASEN MÁS DE 15 SEGUNDOS SIN AÑADIR EL
REACTIVO.
9.
INCUBACIÓN DE LOS PORTAOBJETOS (30±5
minutos a temperatura ambiente, es decir,
entre 18 y 24 °C)
Ponga la tapa de la cámara de incubación y cúbrala con una toalla de papel
para impedir la exposición a la luz, si la
cámara no es opaca. Deje que los portaobjetos se incuben 30 minutos (±5 minutos) a
temperatura ambiente (18-24 ºC).
10.
ENJUAGUE CON PBS
Retire los portaobjetos de la bandeja de
la incubadora y enjuáguelos un poco con
PBS. No utilice la jeringa directamente
sobre los pocillos.
11.
LAVADO CON PBS (10 minutos)
Lave los portaobjetos con PBS durante
10 minutos, en una placa de tinción de
portaobjetos o en una jarra Coplin. Se
recomienda agitar suavemente al sumergir
el portaobjetos, cuando haya pasado la
mitad del tiempo y al sacarlo. Este lavado
puede durar hasta 30 minutos sin que
varíen los resultados finales.
12.
PREPARACIÓN DE LOS CUBREOBJETOS
Saque los portaobjetos del PBS de uno en
uno y sumérjalos 3-5 veces en agua desionizada o destilada. Pase un papel secante
o una toalla de papel por el borde del
portaobjetos para retirar el agua sobrante.
NO SEQUE EL PORTAOBJETOS NI DEJE QUE
PASEN MÁS DE 15 SEGUNDOS SIN PONER
EL CUBREOBJETOS. Añada 4-5 gotas de
medio de preparación semipermanente
en la línea media de cada portaobjetos.
Coloque el cubreobjetos con cuidado,
evitando que se formen bolsas de aire, haciendo bajar suavemente el cubreobjetos
de un lado del portaobjetos al otro.
NOTA: Si pone demasiado medio de preparación puede que la fluorescencia de
fondo sea elevada debido a la diseminación de la luz, o que la resolución de las
células no sea clara (imagen borrosa). Si ha
puesto demasiado medio de preparación,
puede retirarlo del portaobjetos secando
suavemente el cubreobjetos con papel
secante o para lentes, evitando cualquier
movimiento directo del cubreobjetos.
ASISTENCIA TÉCNICA: 916-363-2649
o correo electrónico:
[email protected]
21
ANCA TESTSYSTEM
NUR ZUR IN VITRO-DIAGNOSTIK
ZUSAMMENFASSENDE ERKLÄRUNG DES TESTS
Indikation: Dies ist ein indirekter Fluoreszenz-Antikörpertest für den semiquantitativen Nachweis von antineutrophilen Zytoplasma-Antikörpern (ANCA) in humanem
Serum. Der Test dient als Hilfestellung beim Nachweis
von Antikörpern, die mit Autoimmun-Vaskulitis in Zusammenhang gebracht werden.
Antineutrophile Zytoplasma-Autoantikörper (ANCA)
zählen zu einer Gruppe von Antikörpern, die mit Zytoplasma-Antigenen in Human-Neutrophilen reagieren.
Obwohl über diese Antikörper bereits 1964 berichtet
wurde (1), wurde eine Verbindung zu Krankheiten erst
1982 hergestellt, als Davies et al über die Antikörper
bei acht Patienten mit segmentaler nekrotisierender
Glomerulonephritis berichteten (2). 1984 wurde über
vier weitere Patienten mit Vaskulitis und Glomerulonephritis berichtet. 1985 wiesen van der Woude et al den
starken Zusammenhang zwischen ANCA und WegenerGranulomatose nach und zeigten die Korrelation der
Krankheitsaktivität mit der Antikörpertitrierung auf (3).
1988 berichteten Falk und Jennette, dass ANCA mehr
als eine Antigen-Spezifität aufweisen (4). Eine nachfolgende Untersuchung hat gezeigt, dass die Spezifität
von ANCA mit den pathologischen Ausprägungen von
Vaskulitiden korreliert (5).
Im Immunofluoreszenz-Test für ANCA sind verschiedene
Muster der Zellverfärbung zu sehen. Zwei wesentliche
Verfärbungsmuster und deren Eigenschaften wurden
beschrieben; dazu wurden im ImmunofluoreszenzANCA-Test Äthanol-fixierte Neutrophile verwendet.
Autoantikörper, die ein feines Granularmuster des Zytoplasma aufweisen, werden cANCA genannt und sind
im Allgemeinen gegen eine Serin-Protease, Proteinase
3 (PR-3), gerichtet. Diese Autoantikörper wiesen einen
starken Zusammenhang mit Wegener-Granulomatose
auf. Das andere wichtige Verfärbungsmuster, das
perinukleäre bzw. pANCA-Muster, das in der Regel auf
gegen Myeloperoxidase (MPO) gerichtete Antikörper
zurückzuführen ist, wurde mit systemischer Vaskulitis und
idiopathischer nekrotisierender und anwachsender
Glomerulonephritis in Zusammenhang gebracht (4). Bei
dem pANCA-Muster handelt es sich um einen Artifakt,
hervorgerufen durch die Verwendung von Äthanol
als Fixativ (4). Wenn die Neutrophile in Formalin fixiert
sind, bleibt die Verbindung zwischen Myeloperoxidase
(das für das pANCA-Muster in Äthanol-fixierten Zellen
hauptverantwortliche Antigen) und den primären
(alpha) Granularen, die durch eine Granularverteilung
des Zytoplasma gekennzeichnet ist. Proteinase-3 (PR-3)
bleibt mit den primären (alpha) Granularen in Äthanolund Formalin-Fixativen verbunden.
Aufbewahrung: Alle Komponenten können gekühlt bei
2-10 °C aufbewahrt werden. Nach Rekonstitution sollte
PBS-Puffer in Behältern mit Schraubverschluss bei 2-10 °C
bis zu vier Wochen aufbewahrt werden, bis Anzeichen
von Kontamination oder andere sichtbare Veränderungen auftreten.
Stabilität: Alle Komponenten sind bis mindestens
12 Monate nach Herstellungsdatum stabil. Keine
Komponenten nach Überschreiten des Verfallsdatums
verwenden.
REAKTIVE REAGENZIEN
ANCA Substratträger:* Katalognummer 10010-11
(Äthanol-fixiert) oder 10010-12 (Formalin-fixiert). Objektträger für zehn Vertiefungen, die Human-Neutrophile
enthalten, welche direkt auf den Testvertiefungen
fixiert sind. Durch eine spezielle Konstruktion wird die
Gefahr der Kreuzkontamination der Vertiefungen bei
den Tests minimiert. Die Objektträger beinhalten vier
Kontrollvertiefungen für pANCA, cANCA, negative und
Leerwerte zur Erleichterung der korrekten Interpretation
der Ergebnisse.
*Dieser Objektträger ist durch mindestens eines der folgenden US- und anderen Patente geschützt: 4387972,
D-274261, D-273261, Patent 1171302 in Kanada, andere
Patente angemeldet.
ANCA Probenverdünner: Katalognummer 10100 (100
ml). Spezieller gepufferter Probenverdünner zur Verdünnung der Patientenproben.
cANCA Positivkontrolle: Katalognummer 10021-12.
Gebrauchsfertiger Tropfer mit 1,0 ml positivem cANCA
Human-Kontrollserum. Dieses Serum weist eine Granularfärbung des Zytoplasma zwischen den Zellsegmenten
des Neutrophils auf Äthanol- und auf Formalin-fixierten
Objektträgern auf. Dieses Reagens enthält 0,1 % Natriumazid als Konservierungsmittel.
pANCA Positivkontrolle: Katalognummer 10021-11.
Gebrauchsfertiger Tropfer mit 1,0 ml positivem pANCA
Human-Kontrollserum. Dieses Serum weist eine diffuse
oder periphere Zellkernverfärbung des Neutrophils auf
Äthanol-fixierten Objektträgern auf und eine GranularFluoreszenz des Zytoplasma auf Formalin-fixierten Objektträgern. Dieses Reagens enthält 0,1 % Natriumazid als
Konservierungsmittel.
cANCA Titrierbare Kontrolle: Katalognummer 1002612. Gebrauchsfertiger Tropfer mit 0,25 ml positivem
cANCA Human-Kontrollserum in flüssiger stabiler
Form. Dieses Reagens enthält 0,1 % Natriumazid als
Konservierungsmittel. Diese Kontrolle ist als unverdünnte
Patientenprobe zu behandeln. Siehe Etikett für mittleren
Titrierungsbereich.
TESTPRINZIP
Das antineutrophile Zytoplasma-Autoantikörper Testsystem (ANCA) von Immuno Concepts arbeitet mit der
Methode der indirekten Fluoreszenz-Antikörper (IFA),
wie sie von Weller und Coons zuerst beschrieben wurde
(6). Verdünnte Patientenproben werden mit HumanNeutrophilen verdünnt, die auf Glas oder MikroskopObjektträgern fixiert sind, um spezifische Bindungen
von ANCA zu ermöglichen. Falls ANCA vorhanden sind,
werden die Autoantikörper an neutrophile Antigene
gebunden. Nach dem Waschen, bei dem nicht-spezifische Antikörper entfernt werden, wird das Substrat mit
einem anti-Human-IgG, das an Fluoreszein konjugiert ist,
inkubiert. Bei positivem Ergebnis bildet sich ein stabiler
dreiteiliger Komplex, bestehend aus an humane ANCA
gebundenen anti-Human-Fluoreszenz-Antikörpern,
welche ihrerseits an Antigen in den Zellen gebunden
sind. Dieser Komplex kann mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroskops sichtbar gemacht werden. Für cANCA positive
Proben weisen eine deutliche Granular-Zytoplasmaverfärbung der Neutrophile auf Äthanol- und Formalin-fixierten Objektträgern auf. In für pANCA positiven Proben
ist eine diffuse oder periphere Zellkernverfärbung des
Neutrophils auf Äthanol-fixierten Zellen zu sehen und auf
Formalin-fixierten Zellen ist eine Granularverfärbung des
Zytoplasma zu sehen. Wenn die Probe für ANCA negativ
ist, zeigen die Neutrophile keine spezifische Verfärbung.
pANCA Titrierbare Kontrolle: Katalognummer 1002611. Gebrauchsfertiger Tropfer mit 0,25 ml positivem
pANCA Human-Kontrollserum in flüssiger stabiler
Form. Dieses Reagens enthält 0,1 % Natriumazid als
Konservierungsmittel. Diese Kontrolle ist als unverdünnte
Patientenprobe zu behandeln. Siehe Etikett für mittleren
Titrierungsbereich.
Negativkontrolle: Katalognummer 10031. Gebrauchsfertiger Tropfer mit 1,0 ml negativem ANCA Human-Kontrollserum. Dieses Serum weist eine wenig ausgeprägte,
nichtspezifische mattgrüne Fluoreszenz der Neutrophile
auf. Dieses Reagens enthält 0,1 % Natriumazid als
Fluoreszenz-Antikörper-Reagens – spezifisch für IgG:
Katalognummer 10009 (9ml). Anti-Human-IgG (Ziege),
an Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC) konjugiert. Dieses
Reagens enthält Evans Blau als Gegenfärbung. Das Reagens wird gebrauchsfertig in Präzisionstropffläschchen
geliefert. Dieses Reagens enthält 0,1 % Natriumazid als
NICHT-REAKTIVE REAGENZIEN
THALTEN)
PBS-Puffer: Katalognummer 1011. Phosphat-gepuffertes
Kochsalzpulver (0,01 M, pH 7,4 ± 0,2). Jeder Beutelinhalt
reicht für 1 Liter gebrauchsfertigen Puffer. (Ein Beutel
Pufferpulver für je fünf Objektträger ist im Lieferumfang
des Testkits enthalten).
Verwendung: Sämtliche Komponenten werden
gebrauchsfertig geliefert, ohne dass Aliquotieren oder
eine Rekonstitution erforderlich sind (mit Ausnahme des
PBS-Puffers, der vor Gebrauch in deionisiertem oder
destilliertem Wasser aufgelöst werden muss).
Herstellung: Einen Beutel Pulver in 1 Liter deionisiertem
oder destilliertem Wasser auflösen und gekühlt bei 2-10
°C bis zu 4 Wochen aufbewahren, oder bis Anzeichen
von Kontamination oder andere sichtbare Veränderungen zu erkennen sind.
SYSTEMKOMPONENTEN (IM LIEFERUMFANG EN-
22
Semipermanentes Eindeckmedium: Katalognummer
1111. Gebrauchsfertiges Tropf-Fläschchen mit 5 ml
Glycerol-basiertem Montagemedium, pH 9,1 ± 0,2.
Dieses Reagens enthält 0,1 % Natriumazid als Konservierungsmittel.
Deckgläser: Katalognummer 1041.Jede Packung
enthält zehn Deckgläser 24x60 mm Nr. 1.
ZUSÄTZLICH ERFORDERLICHE MATERIALIEN (NICHT
IM LIEFERUMFANG ENTHALTEN)
Präzisionspipetten für Volumina von 20-25 µl.
Coplin-Glaszylinder oder Färbungsschalen
Spritzflasche oder Pasteur-Pipetten
Serologische Pipetten.
Mehrere 1-Liter-Behälter (für PBS-Waschpuffer).
Deionisiertes oder destilliertes Wasser.
Teströhrchen zur Herstellung von optionalen Reihenverdünnungen.
Saugpapier oder Papierhandtücher.
Inkubationskammer
Einmal-Latexhandschuhe.
Laborstoppuhr.
Fluoreszenz-Mikroskop mit 495 nm Erregerfilter und 515
nm Sperrfilter.
SICHERHEITSHINWEISE
1. Sämtliche zur Herstellung von Kontrollseren für
dieses Produkt verwendeten Materialien humanen
Ursprungs wurden nach von der FDA anerkannten
Methoden negativ (nicht wiederholt reaktiv) auf
Antikörper gegen HIV-1, HIV-2, Hepatitis-C (HCV)
und Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAG)
getestet. Keine Testmethode kann jedoch mit
absoluter Sicherheit nachweisen, dass keine HIV-1,
HIV-2, Hepatitis-C oder Hepatitis-B-Viren oder
andere infektiöse Agenten vorhanden sind. Daher
sollten alle Kontrollseren wie potenziell infektiöse
Materialien gehandhabt werden.
2. Alle Patientenproben sollten nach den Anforderungen für Biosafety Level 2 behandelt werden, wie für
potenziell infektiöses humanes Serum und andere
Blutbestandteile empfohlen in: Centers for Disease
Control / National Institutes of Health Manual:
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, Ausgabe 1984.
3. Ein Verdünnen der Bestandteile oder eine Zugabe
von nicht zum Kit gehörenden Reagenzien kann die
Qualität der Ergebnisse beeinträchtigen.
4. Einige Reagenzien enthalten Natriumazid (0,1 %) als
Konservierungmittel. Natriumazid kann mit Blei- oder
Kupferinstallationen reagieren und hochexplosive
Metallazidsalze bilden. Beim Entsorgen der Reagenzien mit reichlich Leitungswasser nachspülen, damit
im Abfluss keine Rückstände verbleiben. Natriumazid ist giftig und kann bei Verschlucken toxisch
wirken.
5. Der Kit ist ausschließlich zur In vitro-Diagnostik
bestimmt.
6. Das titrierbare Kontrollserum ist für die Überwachung der Chargen- und Testlauf-übergreifenden
Reproduzierbarkeit bestimmt. Es ist nicht zur Messung der Gesamtsensibilität oder Spezifität des Tests
bestimmt.
7. In Bereichen, in denen mit Patientenproben oder
Kitreagenzien gearbeitet wird, nicht rauchen, essen
oder trinken.
8. Verspritzen von Reagenzien und Erzeugung von
Aerosolen vermeiden.
9. Die angegebenen Inkubationszeiten und Temperaturwerte genau einhalten, andernfalls könnten die
Ergebnisse verfälscht werden.
10. Eine Kreuzkontamination der Reagenzien oder Proben kann ebenfalls zu falschen Ergebnissen führen.
11. Wiederverwendbare Glasartikel müssen vor
Gebrauch gewaschen und gründlich ausgespült
werden, um sämtliche Waschmittelrückstände zu
entfernen. Die Glasartikel müssen vor Gebrauch
sauber und trocken sein.
12. Vor der Testdurchführung müssen alle Reagenzien,
Objektträger und Proben auf Zimmertemperatur
(18-24 °C) gebracht werden.
13. Beim Arbeiten mit Proben und Reagenzien sind
grundsätzlich Einmal-Latexhandschuhe zu tragen.
Danach gründlich Hände waschen.
14. Eine mikrobielle Kontamination der Reagenzien
oder Proben kann das Ergebnis verfälschen.
15. Niemals mit dem Mund pipettieren und Kontakt der
Reagenzien und Proben mit Haut und Schleimhäuten vermeiden. Bei Kontakt mit viel Wasser und
desinfizierender Seife waschen.
PROBENGEWINNUNG
Probenentnahme: Nach Möglichkeit sollten Serumproben hergestellt werden. Dazu durch Venenpunktion in
ein steriles Vakuumröhrchen oder durch ein anderes
geeignetes Blutentnahmesystem aseptisch ca. 5 ml
Vollblut entnehmen. Das Blut bei Zimmertemperatur
(18-24 °C) gerinnen lassen. Das Serum muss so bald
wie möglich abgetrennt werden, um Hämolyse zu
vermeiden.
Störsubstanzen: Stark hämolytische, lipämische oder
durch Mikrobenwachstum verunreinigte Seren sowie
Seren von Ikteruspatienten dürfen nicht verwendet
werden, weil bei positiven Proben eine Abnahme der
Antikörper-Titrierungen auftreten könnte. Proben mit
hohen Lipidanteilen können einen nicht-spezifischen
fluoreszenten Film über dem Zellsubstrat bilden. Die
Verwendung von Fixierungs- oder Reinigungsproben
durch Ultrazentrifugieren kann dieses Problem beheben.
Proben mit sichtbaren Verunreinigungen müssen vor
Verwendung zentrifugiert werden.
Aufbewahrung: Serumproben können bei einer Temperatur von 2-10 °C maximal eine Woche lang aufbewahrt
werden. Sollen die Proben länger aufbewahrt werden,
müssen sie bei mindestens –20 °C eingefroren werden.
Serum darf nicht in einem Gefrierschrank mit Abtauautomatik gelagert werden.
ACHTUNG: Wiederholtes Einfrieren / Auftauen von
Patientenproben ist zu vermeiden. Andernfalls können falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse
auftreten.
INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
QUALITÄTSSICHERUNG
In den für die Qualitätssicherung vorgesehenen
Vertiefungen sollten für jeden Objektträger Positiv-,
Negativ- und Leer-Kontrollläufe durchgeführt werden.
Die cANCA Positivkontrolle sollte zwischen den Kernsegmenten auf Äthanol- oder Formalin-fixierten Objektträgern eine helle apfelgrüne fluoreszierende GranularZytoplasmaverfärbung im Neutrophil aufweisen. Die
pANCA Positivkontrolle sollte eine helle apfelgrüne diffuse oder periphere Zellkernverfärbung des Neutrophils
auf Äthanol-fixierten Objektträgern aufweisen und eine
Granular-Fluoreszenz des Zytoplasma auf Formalin-fixierten Objektträgern. Die Negativkontrolle sollte keine
hellgrüne Fluoreszenz aufweisen. In der Negativkontrolle
ist u.U. eine nicht-spezifische mattgrüne Fluoreszenz von
geringer Intensität festzustellen. Die leere Kontrollvertiefung wird zur Beobachtung nicht-spezifischer Verfärbungen durch das Antikörper-Reagens verwendet und
sollte keine grüne Fluoreszenz aufweisen. Die Gegenfärbung des Konjugats kann eine mattrote Verfärbung der
Zellen hervorrufen. Wenn die Kontrollvertiefungen nicht
die beschriebenen Merkmale aufweisen, ist der Test
ungültig und muss wiederholt werden.
OPTIONALE TITRIERBARE KONTROLLE
Beim Auswerten der Titrierungen beginnen viele Labore
mit der Vertiefung, die die Probe mit der größten
Verdünnung enthält, und fahren mit der Auswertung
„nach hinten” zur 1:20-Verdünnung fort. Die erste
Vertiefung, in der eine deutliche Verfärbung des
Zytoplasma sichtbar ist, ist der Titrierungsendpunkt. Wir
empfehlen diese Vorgehensweise zur Bestimmung des
Titrierungsendpunkts.
In unserem Labor wurde die mittlere Titrierung und der
mittlere Titrierungsbereich (± eine Verdünnung nach
oben oder unten, vom Mittel ausgehend) für diese
Chargennummer festgelegt; dieser gilt als Richtwert. Mit
Hilfe dieser Kontrolle kann jedes Labor die Reproduzierbarkeit (Präzision) seiner ANCA-Tests selbst einschätzen.
Da diese Kontrolle nicht als Indikator für die Titrierungsgenauigkeit vorgesehen ist, muss jedes Labor seinen
eigenen mittleren Titrierungsendpunkt für diese Probe
festlegen und sollte diese Informationen zur Bewertung der Reproduzierbarkeit (Präzision) ihrer Testläufe
heranziehen.
Für jede Chargennummer wurde durch mehrere
Testläufe mit dieser titrierbaren Kontrolle, unter
Verwendung des ANCA-Fluoreszenz-Testsystems von
Immuno Concepts, ein mittlerer Titrierungswert ermittelt.
Chargennummer, mittlere Titrierung und Titrierungsbereich (± eine Zweifach-Verdünnung nach oben oder
unten, ausgehend vom Mittel) sind auf dem Etikett des
Fläschchens verzeichnet und sollten zur Messung der
Systemleistung herangezogen werden.
Die in unserem Labor ermittelten Werte können von
Ihren eigenen Werten abweichen. Zahlreiche Faktoren
23
können Einfluss auf Ihre Ergebnisse nehmen; hier einige
Beispiele:
lin-fixierten Neutrophilen zu sehen.
1. Die Art der verwendeten Lichtquelle: Quecksilber-Lichtquellen produzieren bei 495 nm mehr
Erregerenergie als Quarz/Halogen. QuecksilberLichtquellen mit 50 Watt, 100 Watt und 200 Watt
weisen bei 495 nm nur geringe Unterschiede in der
Erregerenergie auf. Quarz/Halogen-Lichtquellen mit
100 Watt erzeugen bei 495 nm mehr Erregerenergie
als solche mit 50 Watt.
2. Zustand und Alter der Lichtquelle: Dies gilt besonders für Quecksilber-Lichtquellen, bei denen in
der Regel vor dem Durchbrennen eine allmähliche
Reduzierung der Erregerenergie bei 495 nm zu
beobachten ist. Dieser allmähliche Rückgang der
Erregerenergie kann im Verlauf mehrerer Wochen
zu einem deutlichen Sensibilitätsverlust führen. Das
Problem kann durch Führen eines Lampenprotokolls
vermieden werden. Für beste Ergebnisse empfiehlt
es sich, 50 Watt-Quecksilberbirnen nach 100 Stunden und 100 oder 200 Watt-Quecksilberbirnen nach
200 Stunden auszuwechseln. Bei Quarz/Halogen-Lichtquellen tritt in der Regel vor dem Durchbrennen
keine allmähliche Reduzierung der Erregerenergie
auf.
3. Die Art des verwendeten Erregerfilters: InterferenzErregerfilter bieten höhere Sensibilität über eine viel
schmalere Wellenlänge als Absorptions-Erregerfilter.
Ziehen Sie für weitere Informationen die Gebrauchsanweisung zu Ihrem Fluoreszenz-Mikroskop zu Rate
oder wenden Sie sich an den Verkäufer.
4. Korrekte Ausrichtung des Lichtwegs im Mikroskop:
Dazu die Anweisungen in der Gebrauchsanweisung
zu Ihrem Fluoreszenz-Mikroskop lesen.
5. Die Blendenöffnung des Objektivs: Bei Epi (AuflichtFluoreszenz) kann die Fluoreszenz exponential
erhöht werden, da die Blendenöffnung des
Objektivs additiv vergrößert wird. Auf diese Weise
kann ein Objektiv mit 40-facher Vergrößerung mit
einer Blendenöffnung von 0,65 unter Umständen ein
bis zwei Verdünnungen tiefer gehen als das gleiche
Objektiv mit einer Blendenöffnung von 0,85. Die
Blendenöffnung ist seitlich am Objektiv aufgedruckt. Die Blendenöffnung hat keine Auswirkung
auf die Sensitivität der übertragenen FluoreszenzLicht-Mikroskopie.
6. Unterdrückungsfilter: Mit Unterdrückungsfiltern können spezifische Erreger-Wellenlängen reduziert und
zur Reduzierung der Sensibilität verwendet werden.
Ziehen Sie für weitere Informationen die Gebrauchsanweisung zu Ihrem Fluoreszenz-Mikroskop zu Rate
oder wenden Sie sich an den Verkäufer.
7. Präzision und Genauigkeit der Verdünnungstechnik,
der Ausrüstung und der Ausführung der Testverfahren.
INTERPRETATION DER PATIENTENERGEBNISSE
pANCA (perinukleäre Verfärbung): Glatte oder homogene Verfärbung des mehrlappigen Nukleus, oft mit
deutlicher peripherer Verfärbung der Nukleus-Lappen
auf Äthanol-fixierten Neutrophilen. Auf Formalin-fixierten
Neutrophilen weisen diese Antikörper eine Granularfärbung des Zytoplasma auf.
Antinukleäre und andere Autoantikörper können mit
den Neutrophilen reagieren; es sollten deshalb alle
positiven Proben mit einem Hep-2 Zellsubstrat auf ANA
getestet werden, bevor das Ergebnis als Vorhandensein
von ANCA gewertet wird.
Optionale Titrierung: Die Ergebnisse sind als reziprok zur
Verdünnung der letzten Vertiefung, in der eine deutliche
positive Reaktion sichtbar ist, anzugeben.
EINSCHRÄNKUNGEN DES TESTS
1. Es ist nicht möglich, lediglich auf der Basis des
Nachweises antineutrophiler Zytoplasma-Antikörper
eine Diagnose zu stellen. Der Arzt muss die Ergebnisse im Zusammenhang mit Krankengeschichte
und Symptomen des Patienten, den Ergebnissen
der körperlichen Untersuchung und anderen diagnostischen Methoden interpretieren.
2. Lediglich auf Grund eines positiven Testergebnisses
für antineutrophile Zytoplasma-Antikörper mit diesem Test sollte keine Behandlung initiiert werden. Für
eine Behandlung müssen auch klinische Symptome,
andere Laborergebnisse und der Gesamteindruck des Patienten auf den behandelnden Arzt
herangezogen werden.
3. In Patientenproben vorhandene antinukleäre Antikörper können mit dem Zellsubstrat reagieren. Wenn
antinukleäre Antikörper vorhanden sind, können die
ANCA-Ergebnisse oft aufgrund unterschiedlicher
Eigenschaften der spezifischen ANCA-Verfärbung,
unterschiedlicher Titrierungen und/oder Reaktionsintensität interpretiert werden. Falls die FluoreszenzReaktion antinukleärer Antikörper so stark ist, dass
die ANCA-Verfärbung überdeckt wird, sollte der
Test als „nicht interpretierbar“ gewertet und eine
alternative Methode zur Bestimmung des ANCAStatus des Patienten gewählt werden.
4. Wegen der zahlreichen für Fluoreszenz-Mikroskope
verfügbaren Optionen empfehlen wir, bei Vergleichen von Patienten-Titrierungen zwischen verschiedenen Laboren mit standardisierten Lichtquellen,
Filtern und optischen Geräten zu arbeiten.
5. Um den klinischen Zustand des Patienten zu bestimmen, sollten die Ergebnisse des Tests im Zusammenhang mit den übrigen verfügbaren Informationen
zur klinischen Einschätzung und anderen diagnostischen Methoden interpretiert werden.
ZU ERWARTENDE WERTE
Zum Betrachten der Neutrophile wird eine 400-fache
Vergrößerung empfohlen.
Der zu erwartende Wert in der normalen Population ist
negativ bei einer Screening-Verdünnung von 1:20. Bei
Patienten mit vorhandenen Erkrankungen ergaben sich
Titrierungen von bis zu 1:640 (7).
Negative Reaktion: Ein Serum ist als negativ für
Antikörper gegen ANCA zu werten, wenn bei einer
Verdünnung von 1:20 die Zell-Fluoreszenz geringer als
oder gleich der negativen Kontrollvertiefung ist. In den
Neutrophilen ist u.U. eine nicht-spezifische Hintergrundverfärbung, bedingt durch heterophile Antikörper oder
Autoantikörper, zu beobachten.
LEISTUNGSFÄHIGKEIT DES TESTS
NORMALE PROBEN
Positive Reaktion: Ein Serum ist als positiv für ANCA zu
werten, wenn bei einer Verdünnung von 1:20 die Zellen
in jedem Feld eine Granular-Fluoreszenz des Zytoplasma
aufweisen, die der cANCA-Kontrolle auf Äthanol- oder
Formalin-fixierten Objektträgern ähnelt. Alternativ ist ein
Serum als positiv für ANCA zu werten, wenn bei einer
Verdünnung von 1:20 die Zellen eine diffuse oder periphere Zellkern-Fluoreszenz aufweisen, die der pANCAKontrolle auf Äthanol-fixierten Objektträgern ähnelt.
AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE
Screening: Die Ergebnisse des Tests sind als positiv oder
negativ bei 1:20-Verdünnung anzugeben.
Serumproben von 497 Blutspendern (247 Männer und
250 Frauen) wurden parallel mit dem Immuno Concepts
ANCA Kit und einem anderen im Handel erhältlichen
Kit getestet. Alle Proben dieser Population, die auf
Äthanol-fixierten Objektträgern positiv waren, wurden
außerdem mit dem HEp-2 ANA Testsystem von Immuno
Concepts auf antinukleäre Antikörper (ANA) getestet.
Unter den normalen Proben waren 22 Proben, die für
ANA positiv und als nicht interpretierbar für ANCA zu
werten waren. Die übrigen Proben mit Diskrepanzen
wurden auf Antikörper gegen MPO und PR3 mithilfe der
ELISA-Tests zur Bestimmung des tatsächlichen Antikörper-Status getestet.
SEREN, DIE ZUVOR DURCH INDIREKTE IMMUNOFLUORESZENZ ALS POSITIV FÜR ANCA BESTIMMT WURDEN
Verfärbungsmuster: Zahlreiche Autoantikörper können
eine Verfärbung des Zytoplasma und/oder des Neutrophil-Nukleus hervorrufen. Es treten hauptsächlich zwei
spezifische Verfärbungsmuster auf:
Serumproben, die mithilfe hauseigener IFA-Assays als
positiv für ANCA gewertet wurden, wurden von Referenzlabors in den USA, Großbritannien und Australien
bezogen. Insgesamt wurden 383 Seren, die als positiv
für ANCA eingeschätzt wurden, in diesem Teil der Studie
überprüft. Diese Serumproben wurden parallel mit dem
Immuno Concepts ANCA Kit und einem anderen im
Handel erhältlichen Kit getestet. Proben mit Diskrepanzen wurden mithilfe des HEp-2 ANA Testsystems von
cANCA (klassische oder Zytoplasma-Verfärbung): Die
Verfärbung der Alpha- (primären) Granulare im Zytoplasma weist ein konsistentes, fleckiges Verfärbungsmuster des Zytoplasma auf, oft mit einer Konzentration
der Verfärbung zwischen den Lappen des Nukleus. Die
Flecken des Zytoplasma sind auf Äthanol- oder Forma24
ANCA
Negative
45
Negativo
528
Immuno Concepts auf ANA undMétodo
mithilfe
ELISA-Tests
dedes
comparación
auf Antikörper gegen MPO und PR3 getestet.
548
5
Vergleichsmethode
Posititvo
Negativo
Posititv
Durch Kombination der Testergebnisse der normalen
Positif
Négatif
Posititvo
324
94
Etanol
IC anormalen Population erhielten wir im ersten
und
der
IC Formalin
Vergleich
für das
ANCA Testsystem
ConPositif
ANCA
255 von Immuno52
ANCA
316
Formol IC
Negativo Clinical124
cepts mit Äthanol-fixierten Human-Neutrophilen (Tabelle
Diagnosis
Number
Positive
ANCA
1) die folgenden
Daten:
Négatif
45
528
Posititv
292
Staining
5 Pattern
(Ethanol Fixed)
Negativ
Negativ
13
548
philen sind in Tabelle 4 enthalten:
all cANCA
Aus diesen Daten ergeben sich die Jämförelsemetod
folgenden
Negativ
Posititv
12
all
8 (66.7%)
statistischen Vergleichswerte: pANCA
Negativt
Metodo di confronto
Relative Sensitivität: 98,3 % Positivt
Posititvpolyarteritis324
20
all pANCA
Microscopic
18 (90.0%)
94
IC Äthanol
Relative Spezifität: 97,7 %
Posititvo
Negativo
Positivt
292 pANCA and cANCA
13
one
pANCA;
one both
3
2 (66.7%)
insgesamt:
98,6
%
ICÜbereinstimmung
formalin
ANCA Churg-Strauss Syndrome
Vergleichsmethode
30
Negativ
124
PosititvoCrescentic255
Immune Complex
Formalina
IC ANCA
316
52
15
26 (86.7%)
ANCA
10 (66.7%)
Negativt
all pANCA
5
548
Glomerulonephritis
Negativo
SERUMPROBEN VON PATIENTEN MIT BEKANNTER VASKU45
528
Aus diesen
Daten Bowel
ergeben
sich dieJämförelsemetod
folgenden
LITIS
all atypical pANCA
Inflammatory
Disease
22
17 (77.3%)
statistischen Vergleichswerte:
Proben von 102 Patienten mit klinisch erfassten VaskulitiMétodo de comparación
Negativt
Positivt
Relative Sensitivität: 72,3 %
den wurden mit den Äthanol-fixierten Neutrophilen von
Relative Spezifität: 77,1 % Posititvo
Immuno Concepts und den Formalin-fixierten NeutroNegativo
Comparison Method
Positivt
324
94
IC etanol
Übereinstimmung insgesamt: 74,6 %
philen von Immuno Concepts getestet. Die Ergebnisse
Posititvo
255
52
Posititve
Negative
dieses Vergleichs finden sich in Tabelle 5:
ANCA IC
Formol
124
316
Negativt
ImANCA
ersten Vergleich
für das ANCA Testsystem von ImImage fluorescente
IC
45
528
Posititve
380
32
Negativo
muno Concepts
mitDiagnostic
Formalin-fixierten
Human-NeutroKREUZREAKTIVITÄT
clinique
Nombre
Positiif
Ethanolerhielten wir die folgenden Daten (Tabelle
philen
2):
434
6
ANCA
Negative
Seren von 57 Patienten mit verschiedenen AutoimVergleichsmethode
30
tousANCA
cANCATestsystem
26
(86,7%)
munstörungen
wurden mit dem
Immuno Concepts mit Äthanol-fixierten
HumanNegativ
12
Périartérite Posititv
noueuse
tous pANCA
8von
(66,7%)
Neutrophilen und dem ANCA Testsystem von Immuno
20 52
Périartérite
microscopique
tousHuman-Neutrophilen
pANCA
18
(90,0%) mit Formalin-fixierten
Posititv
Méthode
de comparaison
255
Concepts
IC Formalin
getestet.
Drei dieser
Proben
wiesen
auf
den et
Äthanolun
pANCA;
un
à
la
fois
pANCA
cANCA
Syndrome
de
Churg
et
Strauss
3
2
(66,7%)
ANCA
Positif
Négatif
Negativ
45
528
fixierten Neutrophilen eine atypische Zellkernverfärbung
15
tous pANCA
10 (66,7%)
auf, die an das pANCA Muster erinnerte. Alle drei
Positif
380
32
Éthanol IC
Proben stammten von Patienten mit SLE, waren positiv
Aus
diesen Daten ergeben sich die folgenden
ANCA
für anti-DNA Antikörper und wiesen positive ANA mit
Négatif
6 Jämförelsemetod
434
Maladie
intestinale
inflammatoire
22
17
(77,3%)
einem homogenen Muster auf. Eine weitere Probe wies
Relative Sensitivität: 85,0 % Positivt
auf den Äthanol-fixierten Neutrophilen Flecken des ZytoNegativt
Relative Spezifität: 91,0 %
plasma auf, auf den Formalin-fixierten Neutrophilen und
Übereinstimmung
89,0 %
Positivtinsgesamt:255
52
im ANA-Test war sie jedoch negativ. Diese Probe wurde
IC formalin
Metodo di confronto
Patterngewertet.
della colorazione
als nicht-spezifische Reaktion
Alle anderen
ANCA
Diagnosi
clinica
Numero
Positivo
45
528
Im Gegensatz zu
den mit Autoimmun-Vaskulitis
in
Negativt
Seren
dieser Population waren
auf den Äthanol- und
Posititvo
Negativo
Verbindung gebrachten Antikörpern, können zahlreiche Formalin-fixierten Neutrophilen negativ. Da zahlreiche
Autoantikörper
mit Human-Neutrophilen
reagieren
Posititvo
380
26
(86,7%)
tutti cANCA nicht-spezifisch
30 32 (8).
Granulomatosi
di Wegener
Autoantikörper
mit Human-Neutrophilen
Etanolo IC
Zur Bestätigung, dass die durch einen ANCA Immureagieren
können (8), sollten tutti
positive
ImmunofluoANCA
12
pANCA
Poliarterite
nodosa
8
(66,7%)
Negativo
nofluoreszenztest
nachgewiesenen
Antikörper klinisch
6
434
reszenz-Tests stets mithilfe spezifischer Assays für ANCAsignifikant sind, Poliarterite
werden zusätzliche
Tests mit ELISA
20 Assays 18
tutti
pANCA
microscopica
(90,0%) Antikörper bestätigt
assoziierte
werden.
auf Myeloperoxidase (MPO) und Proteinase-3 (PR-3)
3
2 (66,7%)
dringend empfohlen (9).
REPRODUZIERBARKEIT
Immunocomplesso
semilunare
15
tutti pANCA
Alle Proben
in obigen Tabellen,
die Diskrepanzen
aufwi- 10 (66,7%)
Posititvo
Negativo
esen, wurden auf antinukleäre Antikörper und auf AntiStudien wurden in einem Durchlauf, an verschiedenen
Glomerulonefrite
Posititvo
380
32
körper
Tagen sowie chargenübergreifend durchgeführt, um
Etanol ICgegen MPO und PR-3 getestet. Tabelle 3 enthält
22
17
tutti
pANCA
atipici von
Malattia infiammatoria
dell'intestino von Immuno
die
Ergebnisse
für das ANCA-Testsystem
die(77,3%)
Reproduzierbarkeit des
ANCA
Testsystems
ANCA
6
434
Negativo
Concepts mit Äthanol-fixierten
Human-Neutrophilen,
Immuno Concepts mit Äthanol-fixierten Human-Neutrounter Einbeziehung der Ergebnisse aus diesen Tests:
philen und mit Formalin-fixierten Human-Neutrophilen zu
Vergleichsmethode
Posititv
IC Äthanol
ANCA
Posititv
380
Negativ
Negativ
Número
6
32
30
12
20
434
Aus diesen Daten
ergeben sich die folgenden3
Jämförelsemetod
Glomerulonefritis
por
15
Relative Sensitivität:
98,4 %
Positivt
Negativt
Relative Spezifität:inmunocomplejos
93,1 %
Übereinstimmung
insgesamt:
95,5
%
Positivt
380
32
IC etanol
22
ANCA
Die
Endergebnisse
für das ANCA
Im6 Testsystem von
434
Negativt
muno Concepts mit Formalin-fixierten Human-Neutro-
demonstrieren. Die in dieser Studie verwendeten Seren
beinhalteten drei pANCA-positive Proben (von denen
Patrón
de eine
tinción
eine Probe eine starke, eine
Probe
moderate
(fijados Verfärbung
con etanol) aufwies)
Positivo
und eine Probe eine schwache
sowie drei cANCA-positive Proben (mit jeweils starken,
26moderaten
(86,7%)
todo
cANCA
oder schwachen
Verfärbungen).
Außerdem
wurden sechs Proben verwendet, die für ANCA negativ
todo pANCA
8 (66,7%)
waren. In der Studie mit einem Durchlauf wurden diese
todo pANCA
1812
(90,0%)
Seren in Replikaten von jeweils
sechs Vertiefungen
an verschiedenen
un pANCA; otro pANCA
y cANCA
2 getestet.
(66,7%) Für die Reproduzierbarkeit
Tagen und mit verschiedenen Chargen wurden diese
todo
pANCA
con
semilunas
1012
(66,7%)
Seren jeweils an drei Chargennummern von Kits
bei drei verschiedenen Gelegenheiten getestet. Die
sechs negativen Proben waren auf allen getesteten
pANCA atípicos
17Objektträgern
(77,3%)
negativ; todo
die positiven
Proben waren mit
konsistenter Fluoreszenz-Intensität auf allen getesteten
Objektträgern positiv.
TABELLE 5
Verfärbungsmuster
(Äthanol-fixiert)
Klinische Diagnose
Zahl
Positiv
Wegener-Granulomatose
30
26 (86,7%)
alle cANCA
Kussmaul’sche Krankheit
12
8 (66,7%)
alle pANCA
Mikroskopische Polyarteriitis
20
18 (90,0%)
alle pANCA
Churg-Strauss Syndrom
3
2 (66,7%)
einmal pANCA; einmal pANCA und cANCA
Immunkomplex wachsende
15
10 (66,7%)
alle pANCA
22
17 (77,3%)
alle atypische pANCA
Glomerulonephritis
Entzündliche Darmerkrankung
25
ANCA TESTVERFAHREN
1.
PUFFER (PBS) REKONSTITUIEREN
Inhalt eines Beutels mit Pufferpulver in
einem Liter deionisiertem oder destilliertem
Wasser auflösen. Abdecken und bei 2-10 °C
bis zu vier Wochen aufbewahren, oder bis
Anzeichen von Kontamination oder andere
sichtbare Veränderungen zu erkennen sind.
2.
Patientenproben verdünnen
Screening: Patientenproben durch Zugabe
von 0,05 ml (50 µl) Patientenserum zu 0,95
ml (950 µl) Probenverdünner 1:20 verdünnen.
Semiquantitative Titrierung: Zur Herstellung
von zweifachen Reihenverdünnungen der
Screening-Proben (z.B. 1:40, 1:80, 1:160...1:
640), 0,5 ml von der 1:20 Verdünnung
trennen und mit 0,5 ml Probenverdünnung
mischen, um eine Verdünnung von 1:40
zu erzielen, anschließend auf diese Weise
weitere Reihenverdünnungen herstellen.
3.
VERDÜNNEN DES OPTIONALEN TITRIERBAREN
KONTROLLSERUMS
Die optionale titrierbare Kontrolle als
unverdünnte Patientenprobe behandeln.
Das Kontrollserum 1:20 verdünnen, indem
0,05 ml (50 µl) Kontrollserum zu 0,95 ml
Probenverdünnung zugegeben werden.
Zweifache Reihenverdünnungen des titrierbaren Kontrollserums wie oben beschrieben
herstellen.
4.
SUBSTRATTRÄGER VORBEREITEN (20-25
µl/Vertiefung)
Objektträger aus der Folie entnehmen
und Kontrollseren wie folgt in den Kontrollvertiefungen platzieren: Tropfflasche mit
Kontrollserum umdrehen und vorsichtig
drücken, bis an der Spitze ein Tropfen austritt. Den Tropfen vorsichtig in die entsprechende Kontrollvertiefung geben, dabei
direkten Kontakt der Tropferspitze mit der
Oberfläche des Objektträgers vermeiden. Die pANCA Positivkontrolle in die mit
„pANCA” markierte Vertiefung geben, die
cANCA Positivkontrolle in die mit „cANCA”
markierte Vertiefung, die Negativkontrolle in
die mit „Neg“ markierte Vertiefung geben
und einen Tropfen Probenverdünnung in
die mit „Blank” markierte Vertiefung geben.
1 Tropfen (20-25 µl) verdünnter Patientenprobe in die nummerierten Vertiefungen
geben.
ACHTUNG: DIREKTER KONTAKT DER TROPFERSPITZE MIT DEM OBJEKTTRÄGER KANN DAS
ANTIGEN-SUBSTRAT BESCHÄDIGEN.
5.
OBJEKTTRÄGER INKUBIEREN (30 ± 5 Minuten
bei Zimmertemperatur, 18-24 °C)
Objektträger in eine feuchte, bedeckte
Schale legen (z. B. Petrischale mit angefeuchtetem Papierhandtuch). 30 Minuten
(±5 Minuten) bei Zimmertemperatur (18-24
°C) abgedeckt inkubieren lassen.
6.
PBS-SPÜLUNG
Objektträger aus der Inkubationsschale
nehmen und mit Spritzflasche, Pasteur- oder
serologischer Pipette kurz mit PBS spülen.
Den Puffer nicht direkt in die Vertiefungen
einspritzen.
HINWEIS: Um bei Objektträgern mit 10
Vertiefungen eine Kreuzkontamination zu
vermeiden, den PBS auf die Mittellinie des
Objektträgers spritzen, dabei den Träger
zuerst in Richtung Vertiefungen 1-3 neigen,
anschließend in Richtung Vertiefungen 4-6.
7.
PBS-WASCHVORGANG (10 Minuten)
Objektträger in einem entsprechenden Gefäß 10 Minuten mit PBS waschen (Glaszylinder, Schale). Beim Eintauchen, in der Mitte
des Waschvorgangs und beim Herausnehmen leicht hin- und herbewegen. Dieser
Waschvorgang kann ohne Auswirkung auf
die Testergebnisse auf bis zu 30 Minuten
ausgedehnt werden. PBS-Waschlösung
nach Gebrauch entsorgen. Für optimale
Ergebnisse sollte nach Ablauf der halben
Waschzeit der PBS-Waschpuffer gewechselt
und ein magnetischer Rührer verwendet
werden.
26
8.
FLUORESZENZ-ANTIKÖRPERREAGENS (Vertiefungen mit 10-12 Tropfen befüllen)
Jeweils einen Objektträger aus dem PBSPuffer nehmen und 3-5 Mal in deionisiertes
oder destilliertes Wasser tauchen. Überschüssiges Wasser durch seitliches Ausklopfen auf Saugpapier oder Papierhandtuch
entfernen. Objektträger sofort wieder in
die Inkubationskammer geben und die
Vertiefungen vollständig mit FluoreszenzAntikörperreagens füllen; beginnend mit
einem Tropfen pro Vertiefung. Vorgang
für alle Objektträger wiederholen. Das
Fluoreszenz-Antikörperreagens wurde titriert,
um für auf dem Objektträger verbliebenes
deionisiertes oder destilliertes Wasser zu
kompensieren.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Vertiefungen auf dem Objektträger während dieses
Vorgangs nicht austrocknen, andernfalls
kann das Substrat beschädigt werden.
DEN OBJEKTTRÄGER NICHT TROCKEN
TUPFEN ODER WISCHEN, ODER LÄNGER ALS
15 SEKUNDEN OHNE FLUORESZENZ-ANTIKÖRPERREAGENS STEHEN LASSEN.
9.
OBJEKTTRÄGER INKUBIEREN (30±5 Minuten
bei Zimmertemperatur, 18-24 °C)
Deckel auf Inkubationskammer setzen und
mit Papierhandtuch abdecken, um das
Eindringen von Licht zu vermeiden, falls die
Kammer durchsichtig ist. Objektträger 30
Minuten (±5 Minuten) bei Zimmertemperatur (18-24 °C) inkubieren lassen.
10.
PBS-SPÜLUNG
Objektträger aus der Inkubationsschale
nehmen und kurz mit PBS spülen. Den Puffer
nicht direkt in die Vertiefungen einspritzen.
11.
PBS-WASCHVORGANG (10 Minuten)
Objektträger in einem entsprechenden Gefäß 10 Minuten mit PBS waschen (Glaszylinder, Schale). Beim Eintauchen, in der Mitte
des Waschvorgangs und beim Herausnehmen leicht hin- und herbewegen. Dieser
Waschvorgang kann ohne Auswirkung auf
die Testergebnisse auf bis zu 30 Minuten
ausgedehnt werden.
12.
DECKGLAS AUFSETZEN
Jeweils einen Objektträger aus dem PBSPuffer nehmen und 3-5 Mal in deionisiertes
oder destilliertes Wasser tauchen. Überschüssiges Wasser durch seitliches Ausklopfen auf Saugpapier oder Papierhandtuch
entfernen.
DEN OBJEKTTRÄGER NICHT TROCKEN
TUPFEN ODER WISCHEN, ODER LÄNGER ALS
15 SEKUNDEN OHNE DECKGLAS STEHEN
LASSEN. 4-5 Tropfen semipermanentes
Montagemedium entlang der Mittellinie
jedes Objektträgers hinzugeben. Deckglas
vorsichtig in Position bringen; dabei Lufteinschlüsse vermeiden; hierzu das Deckglas
vorsichtig an einem Ende des Objektträgers aufsetzen und auf das andere Ende
herablassen.
HINWEIS: Überschüssiges Montagemedium
auf dem Objektträger kann wegen der
Lichtstreuung oder wegen ungenügender
Auflösung der Zellen (verschwommenes
Bild) zu einem hohen Fluoreszenz-Hintergrund führen. Überschüssiges Montagemedium kann vom Objektträger entfernt
werden, indem das Deckglas mit Saugpapier abgetupft wird, ohne es dabei zu
bewegen.
TECHNISCHE UNTERSTÜTZUNG: +916-363-2649
oder via E-Mail:
[email protected]
ANCA-TESTSYSTEM
REAKTIVA REAGENSER
FÖR DIAGNOSTISK ANVÄNDNING IN VITRO
SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING AV TESTET
Avsedd användning: Detta är ett indirekt fluorescerande antikroppstest för halvkvantitativ detektion
av antineutrofila cytoplasmiska autoantikroppar
(ANCA) i humanserum. Testsystemet skall användas som
hjälpmedel för detektion av antikroppar associerade
med autoimmun vaskulit.
Antineutrofila cytoplasmiska autoantikroppar (ANCA)
är en grupp antikroppar som reagerar med cytoplasmiska antigener i humana neutrofiler. Även om dessa
antikroppar ursprungligen rapporterades 1964 (1),
associerades de med en sjukdom för första gången i en
rapport 1982 när Davis o.a. rapporterade att antikropparna förekom hos åtta patienter med segmental
nekrotiserande glomerulonefrit (2). 1984 rapporterades
ytterligare fyra patienter med vaskulit och glomerulonefrit. 1985 visade van der Woude o.a. att ANCA är
starkt förknippad med Wegeners granulomatos och att
antikroppnivåerna står i relation till sjukdomens aktivitet
(3) 1988 rapporterade Falk och Jennette att ANCA har
mer än en antigenspecificitet (4). En efterföljande rapport visade att ANCA-specificiteten står i relation till de
patologiska kännetecknen för vaskulitid (5).
I det immunfluorescerande ANCA-testet kan flera
cellformiga färgningsmönster noteras. Två betydande
färgningsmönster har beskrivits och blivit väl karaktäriserade med användande av etanolbeständiga
neutrofiler i det immunfluorescerande ANCA-testet. Autoantikroppar som uppvisar ett finkornigt cytoplasmiskt
mönster (cANCA) riktas vanligtvis mot en serinproteas,
proteinas 3 (PR-3). Dessa autoantikroppar har visat sig i
hög grad vara förknippade med Wegeners granulomatos. Det andra betydande färgningsmönstret - det
perinukleära mönstret, eller pANCA-mönstret - som vanligtvis beror på antikroppar mot myeloperoxidas (MPO)
har associerats med systemisk vaskulit och idiopatisk
nekrotiserande och halvmåneformad glomerulonefrit
(4). pANCA-mönstret är en artefakt som uppkommit
genom användning av etanol som fixeringsmedel (4).
Om neutrofilerna är beständiga i formalin, förblir myeloperoxidasen (den antigen som i huvudsak ansvarar för
pANCA-mönstret i etanolbeständiga celler) associerad
med de primära (alfa-) kornen och uppvisar en kornig
cytoplasmisk fördelning. Proteinas-3 (PR-3) förblir associerad med primära (alfa-) korn i antingen etanol- eller
formalinfixeringsmedel
TESTPRINCIP
Immuno Concepts antineutrofila cytoplasmiska autoantikroppanalys (ANCA) använder den indirekta fluorescerande antikroppteknik (IFA) som först beskrivits av
Weller och Coons (6). Spädda patientprover odlas med
humana neutrofiler som är fixerade på objektglas på
glasmikroskop för att tillåta specifik ANCA-bindning. Om
det förekommer ANCA binder autoantikropparna till de
neutrofila antigenerna. Efter tvättning för att avlägsna
ospecifika antikroppar odlas substratet med antihuman
IgG konjugerad med fluoroscein. Om resultatet är positivt bildas ett stabilt komplex i tre delar bestående av en
fluorescerande antikropp bunden till en human ANCA,
som i sin tur är bunden till en antigen belägen i cellerna.
Detta komplex kan studeras i fluorescerande mikroskop.
Prover som är cANCA-positiva uppvisar en särskiljande
kornig cytoplasmisk färgning av neutrofilerna på både
etanol- och formalinbeständiga objektglas. I prover som
är pANCA-positiva syns en diffus eller perifer nukleär
färgning av neutrofilerna på etanolbeständiga celler
och en kornig färgning av cytoplasman på formalinbeständiga celler. Om provet är ANCA-negativt syns
ingen specifik färgning av neutrofilerna.
SYSTEMKOMPONENTER (MATERIAL SOM MEDFÖLJER)
Användning: Alla komponenter levereras bruksfärdiga
utan krav på delning eller rekonstitution (förutom
PBS-bufferten som måste lösas upp i avjoniserat eller
destillerat vatten före användning).
Förvaring: Alla komponenter kan kylförvaras i 2-10 °C.
Efter rekonstitution skall PBS-bufferten förvaras i skruvlockbehållare under kylning i 2-10 °C upp till fyra veckor,
eller tills det syns tecken på kontamination eller andra
synliga förändringar.
ANCA substratobjektglas:* Katalognr 10010-11 (etanolbeständiga) eller 10010-12 (formalinbeständiga). Tio
brunnsobjektglas som innehåller humana neutrofiler
som stabiliserats och fixerats direkt på testbrunnarna. Ett
unikt vallgravsformat objektglas minimerar korskontamination mellan brunnarna under analysen. Objektglasen
innehåller fyra kontrollbrunnar med beteckningarna
„pANCA“, „cANCA“, „negativ“ och „färglös“ för att
underlätta korrekt tolkning av resultatet.
ANCA provspädningsvätska: Katalognummer 10100
(100 ml). Patentskyddad buffrad provspädningsvätska
som används för spädning av patientprover.
cANCA positiv kontroll: Katalognr 10021-12. Bruksfärdig pipettampull innehållande 1,0 ml cANCA positivt
humankontrollserum. Detta serum uppvisar kornig
färgning av cytoplasman mellan neutrofilernas nukleära
segment på såväl etanol- som formalinbeständiga
objektglas. Denna reagens innehåller 0,1 % natriumazid
som konserveringsmedel.
pANCA positiv kontroll: Katalognr 10021-11. Bruksfärdig
pipettampull innehållande 1,0 ml pANCA positivt humankontrollserum. Detta serum uppvisar diffus eller perifer nukleär färgning av neutrofilerna på etanolbeständiga objektglas och kornig cytoplasmisk fluorenscens
på formalinbeständiga objektglas. Denna reagens
innehåller 0,1 % natriumazid som konserveringsmedel.
cANCA titrerbar kontroll: Katalognr 10026-12. Bruksfärdig
ampull innehållande 0,25 ml vätskestabilt cANCA
positivt humant kontrollserum. Denna reagens innehåller
0,1 % natriumazid som konserveringsmedel. Denna
kontroll skall behandlas som ett outspätt patientprov. Se
etiketten för information om medelantikroppnivå.
pANCA titrerbar kontroll: Katalognr 10026-11. Bruksfärdig
ampull innehållande 0,25 ml vätskestabilt pANCA
positivt humant kontrollserum. Denna reagens innehåller
0,1 % natriumazid som konserveringsmedel. Denna
kontroll skall behandlas som ett outspätt patientprov. Se
etiketten för information om medelantikroppnivå.
Negativ kontroll: Katalognr 10031. Bruksfärdig pipettampull innehållande 1,0 ml ANCA negativt humant
kontrollserum. Detta serum uppvisar lågintensiv, ickespecifik matt grön fluorescens av neutrofilerna. Denna
reagens innehåller 0,1 % natriumazid som konserveringsmedel.
Fluorescerande antikroppreagens - IgG-specifik: Katalognummer 10009 (9 ml). Getantihuman IgG-konjugerad
till fluorescein isotiocyanat (FITC). Denna reagens
innehåller Evans blå som en motfärg. Reagensen levereras bruksfärdig i precisionspipettflaskor. Denna reagens
*Detta objektglas är skyddat genom ett eller flera av
följande amerikanska eller utländska patent: 4387972,
D-274261, D-273261, kanadensiskt patent 1171302 och
övriga inplanerade patent.
ICKE-REAKTIVA REAGENSER
PBS-buffert: Katalognummer 1011. Fosfatbuffrat saltlösningspulver (0,01 M, pH 7,4 ± 0.2). Varje förpackning
innehåller tillräckligt med buffertpulver för att ge 1 liter.
(En förpackning med buffertpulver levereras för vart
femte objektglas i kompletta testsatser).
Framställning: Lös upp en förpackning buffertpulver i 1
liter avjoniserat eller destillerat vatten och förvara avkylt
i 2-10 °C i upp till fyra veckor eller tills det syns tecken på
kontamination eller andra synliga förändringar.
Halvpermanent monteringsmedel: Katalognr 1111.
Bruksfärdig pipettampull innehållande 5 ml glycerolbaserat monteringsmedel, pH 9,1 ± 0,2. Denna reagens
Skyddsremsor: Katalognummer 1041. Varje paket innehåller 10 st 24 x 60 mm skyddsremsor nr 1 av glas.
ÖVRIGT MATERIAL SOM BEHÖVS (MEDFÖLJER EJ)
Volymetriska pipetter för pipettering av 20-25 µl
volymer
Coplin-kärl eller färgningsskålar
Klämflaska eller Pasteur-pipetter
Serologiska pipetter
Enlitersbehållare (för PBS-buffert)
Avjoniserat eller destillerat vatten
Provrör för framställning av serumspädningar
Stabilitet: Alla komponenter är stabila i minst tolv
månader från tillverkningsdatum. Använd inte någon
komponent efter dess utgångsdatum.
27
TOLKNING AV RESULTATET
Läskpapper eller pappershanddukar
Inkubationskammare
Engångshandskar av latex
Laboratorietidur
Fluorescerande mikroskop med 495 nm matarfilter
och 515 nm spärrfilter
KVALITETSKONTROLL
FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER
1. Allt material av humant ursprung som använts
för att förbereda kontroller för denna produkt
har testats med en FDA-godkänd metod och
visat sig vara negativt (inte upprepat reaktivt) för
antikroppar mot humant immunbristvirus-1, humant
immunbristvirus-2 (HIV-1 och HIV-2), antikroppar
mot hepatit C-virus (HCV) samt hepatit B ytantigen
(HBsAg) . Ingen testmetod kan helt garantera att
det inte förekommer HIV-1, HIV-2, hepatit-C-virus,
hepatit-B-virus eller andra smittämnen. Därför skall
allt kontrollsera hanteras som potentiellt smittsamt.
2. Alla patientprover på biosäkerhetsnivå 2 skall
hanteras enligt rekommendationerna för potentiellt
smittsamt humanserum eller blodprov i Centrum för
Sjukdomskontroll/Nationella hälsoinstitutets manual:
Biosäkerhet i mikrobiologiska och biomedicinska
laboratorier, 1984 års upplaga.
3. Spädning av komponenter eller byte till andra komponenter än de som medföljer detta system kan ge
motsägande resultat.
4. Natriumazid (0,1 %) används som konserveringsmedel. Natriumazid kan reagera med ledningsrör
av bly eller koppar och bilda explosiva metallazidsalter. När reagenser kasseras skall man spola
med rikliga mängder kranvatten för att skölja bort
eventuella rester i avloppsledningarna. Natriumazid
är ett gift och kan vara toxiskt vid förtäring.
5. Denna sats är avsedd för diagnostisk användning in
vitro.
6. Det titrerbara kontrollserumet är avsett för användning vid övervakning av reproducerbarheten
mellan olika loter eller serier. Det är inte avsett för
mätning av den totala sensitiviteten eller analysens
specificitet.
7. Undvik att röka, äta eller dricka i områden där
prover eller satsreagenser hanteras.
8. Undvik alltid stänk och alstring av aerosoler.
9. Andra inkubationstider och temperaturer än de
angivna kan ge felaktiga resultat.
10. Korskontamination mellan reagenser och prover
kan ge felaktiga resultat.
11. Återanvändningsbart glas måste tvättas och
noggrant sköljas från rengöringsmedel innan det
används. Allt glas måste rengöras och torkas före
användning.
12. Placera alla reagenser, objektglas och prov i rumstemperatur (18-24 °C) före användning.
13. Använd engångshandskar av latex vid hantering
av prover och reagenser, och tvätta händerna
noggrant efteråt.
14. Mikrobisk kontamination av reagenser eller prover
kan ge felaktiga resultat.
15. Pipettera aldrig med munnen och undvik att
komma i kontakt med reagenser och prov med
hud eller slemhinnor. Tvätta med bakteriedödande
tvål och rikligt med vatten om sådan kontakt inträffat.
PROVTAGNING
Provtagning: Serum rekommenderas som prov.
Cirka 5 ml helblod skall tas aseptiskt genom venpunktion med hjälp av ett sterilt vakuumblodtagningsrör
eller annat lämpligt blodtagningssystem. Låt blodet
koagulera i rumstemperatur (18-24 °C). Serum skall så
snart som möjligt separeras från koagler för att minimera
hemolys.
Störande substanser: Sera som uppvisar en hög grad
av hemolys, ikterus, lipemi eller mikrobiell tillväxt skall
inte användas, eftersom antikroppnivån kan minska i
positiva prover. Prover med mycket höga lipidnivåer
kan leda till att en ospecifik fluorescerande film bildas
över cellsubstratet. Detta problem kan undvikas genom
användning av prover som får fast form eller klar färg
genom ultracentrifugering. Prover som innehåller
synliga partiklar bör klargöras genom centrifugering före
analysen.
Förvaring: Sera kan förvaras i 2-10 °C under högst en
vecka. Om analysen fördröjs ytterligare, skall sera frysas
i –20 °C eller lägre. Serum bör inte förvaras i självavfrostande fryslagerrum.
VARNING: Upprepad frysning/upptining av patientprover kan ge falskt positiva eller negativa resultat.
28
Positiva, negativa och färglösa kontroller bör köras i de
brunnar som tillhandahålls för kvalitetskontroll på varje
objektglas. Den cANCA-positiva kontrollen skall uppvisa
ljust äppelgrön fluorescerande kornig cytoplasmisk
färgning av neutrofilerna mellan de nukleära segmenten på antingen etanol- eller formalinbeständiga
objektglas. Den pANCA-positiva kontrollen skall uppvisa
ljust äppelgrön diffus eller perifer nukleär färgning av
neutrofilerna på etanolbeständiga objektglas och
kornig cytoplasmisk fluorescens på formalinbeständiga
objektglas. Den negativa kontrollen skall inte uppvisa
någon ljusgrön fluorescens. Den negativa kontrollen
kan uppvisa låg intensitet och en matt grön fluorescens.
Den färglösa kontrollen används för att observera
ospecifik fluorescens av antikroppreagensen och bör
inte uppvisa någon grön fluorescerande färgning. Den
motfärg som ingår i konjugatet kan färga brunnarna
i en matt röd färg. Om kontrollerna inte ser ut enligt
beskrivningarna är testet ogiltigt och bör göras om.
TILLHÖRANDE TITRERBAR KONTROLL
Vid läsning av antikroppnivåerna börjar många laboratorier med att läsa den brunn som innehåller det mest
spädda provet och läser „baklänges“ till spädningen 1:
20. Den första brunnen med klart urskiljbar cytoplasmisk
färgning är antikroppnivåns ändpunkt. Vi rekommenderar denna teknik för att fastställa antikroppnivåns
ändpunkter.
Det medelvärde och spridningsområde för antikroppnivån (± en spädning på var sin sida om medelvärdet) som bestämts för varje lotnummer har fastställts i
vårt laboratorium och uppges för vägledning. Denna
kontroll tillhandahålls för att varje laboratorium skall ha
tillgång till ANCA-testernas reproducerbarhet (precision). Eftersom kontrollen inte är avsedd att utgöra
en indikator på antikroppnivåns precision, bör varje
laboratorium etablera sitt eget medelvärde för antikroppnivåns ändpunkt för provet i fråga och använda
denna information för att bedöma reproducerbarheten
(precisionen) från serie till serie.
Genom upprepade analyser av denna titrerbara
kontroll med användande av Immuno Concepts
fluorescerande ANCA-testsystem har ett medelantikroppvärde fastställts för varje lotnummer. Lotnumret och
antikroppnivåns medelvärde och spridningsområde för
(± en dubbel spädning på vardera sidan om medelvärdet) står angivna på flaskans etikett och skall användas
som vägledning för testsystemets prestanda.
De värden som erhållits i vårt laboratorium kan skilja
sig från era. Några av de faktorer som kan påverka
resultaten kan vara, men är inte begränsat till:
1. Typ av ljuskälla: Ljuskällor av kvicksilver ger högre
exciteringsenergi vid 495 nm än kvarts/halogen.
Ljuskällor av kvicksilver på 50 watt, 100 watt och
200 watt skiljer sig något i exciteringsenergi vid
495 nm. Kvarts-/halogenljuskällor på 100 watt ger
högre exciteringsenergi vid 495 nm än kvarts-/
halogenljuskällor på 50 watt.
2. Ljuskällans skick och ålder: Detta gäller framför allt
ljuskällor av kvicksilver som i allmänhet uppvisar en
gradvis minskning i exciteringsenergi vid 495 nm,
innan de smälter ned. Denna gradvisa minskning
i exciteringsenergi kan leda till en avsevärd förlust
i känslighet över flera veckors tid. Detta problem
kan undvikas genom att föra en tidsloggbok.
För bästa resultat: Byt ut 50 watts glödlampor av
kvicksilver efter 100 timmar och 100 eller 200 watts
glödlampor av kvicksilver efter 200 timmar. Kvarts-/
halogenljuskällor uppvisar i allmänhet ingen gradvis
minskning i exciteringsenergi, innan de smälter ned.
3. Vilken typ av matarfilter som används: Störningsmatarfilter ger större känslighet över en mycket
smalare våglängd än absorptionsmatarfilter. Se
bruksanvisningen till det fluorescerande mikroskopet
eller kontakta säljaren för mer information.
4. Korrekt placering av mikroskopljusets bana: Se
bruksanvisningen till det fluorescerande mikroskopet
för mer information.
5. Objektivets numeriska bländaröppning: Med
infallande ljusfluorescens (Epi) ökar fluorescensen
exponentiellt, medan den numeriska bländaröppningen (NA) ökar additivt. Detta kan göra
att ett 40X-objektiv med en NA på 0,65 läser en eller
flera spädningar lägre än ett 40X-objektiv med en
NA på 0,85. Den numeriska bländaröppningen står
angiven på sidan av objektivet. Det fluorescerande
ljustransmissionsmikroskopets känslighet påverkas
inte av NA.
6. Spärrfilter: Spärrfilter minskar specifika exciteringsvåglängdernoch kan användas för att minska känsligheten. Se bruksanvisningen till det fluorescerande
mikroskopet eller kontakta säljaren för mer information.
7. Precision och exakthet i spädningsteknik, utrustning
och testmetodernas genomförande.
TOLKNING AV PATIENTRESULTAT
FÖRVÄNTADE VÄRDEN
Comparison Method
Det förväntade värdet i den normala populationen
Negative
Posititve
är negativt vid screeningspädning 1:20. Hos sjuka
patienter
har så höga antikroppnivåvärden som 1:640
IC
Posititve
324
94
rapporterats (7).
Ethanol
ANCA
Negative
PRESTANDA
NORMALA PROVER
400 gångers total förstoring rekommenderas för granskning av neutrofilerna.
124
316
Serumprover från 497 bloddonatorer
(247 män
och 250
Positif
Négatif
kvinnor) testades parallellt med hjälp av Immuno ConPositif
Negativt: Ett serum betraktas som ANCA-negativt om
cepts ANCA-sats
och ytterligare
324 en sats i kommersiell
94
Éthanol IC
den gröna fluorescerande färgningen av cellerna vid
distribution. Alla prover som uppvisade en positiv reakANCA
spädningen 1:20 är mindre eller lika med den negativa
tion på etanolbeständiga
objektglas
i denna populaNégatif
124
316
kontrollbrunnen. Ospecifik bakgrundsfärgning på grund
tion testades även för antinukleära antikroppar (ANA)
av heterofila antikroppar eller autoantikroppar kan
med hjälp av Immuno Concepts HEp-2 ANA-testsystem.
observeras i neutrofilerna.
Comparison
Method
Metodo
di confronto
Bland de normala proverna fanns
22 prover
som var
Positivt: Ett serum betraktas som ANCA-positivt om
ANA-positiva och dessa betraktades
som ejNegative
tolkningsPosititve
Posititvo
Negativo
cellerna i varje fält vid spädningen 1:20 uppvisar en
bara för ANCA. De återstående
avvikande proven
IC
kornig cytoplasmisk fluorescens liknande den som obtestades
för antikroppar
mot MPO
och PR3 med
Posititve
255
52 hjälp
Posititvo
324
94
IC för att fastställa den verkliga antikroppstatusen.
serveras med cANCA-kontrollen av endera etanol- eller Etanolo
av
ELISA
Formalin
ANCA
formalinbeständiga objektglas. Alternativt betraktas ett
45
528
ANCA
Negative
Negativo
124
316
serum som ANCA-positivt om cellerna vid spädningen
SERA SOM TIDIGARE FASTSTÄLLTS VARA ANCA-POSITIVA
1:20 uppvisar en diffus eller perifer nukleär fluorescens
GENOM INDIREKT IMMUNOFLUORESCENS
liknande den som observeras med pANCA-kontrollen
Méthode
de comparaison
på etanolbeständiga objektglas.
Serumprov som hade bedömts
som ANCA-positiva
med interna IFA-analyser erhölls
från referenslaboratoPosititvo
Negativo
Positif
Négatif
RESULTATRAPPORTERING
rier i USA, Storbritannien och Australien. Totalt 383 sera
Posititvo
324
94
som
förväntades
vara
ANCA-positiva
undersöktes
Positif
255
52 i
Etanol IC
Formol
Screening: Resultaten skall rapporteras som positiva
dennaIC del av studien. Dessa prover testades parallellt
ANCA
ANCAImmunoNegativo
124
316
eller negativa vid spädning 1:20.
med
Concepts ANCA-sats
och ytterligare
Négatif
45
528 en
sats som är kommersiellt tillgänglig. Avvikande prover
Färgningsmönster: Många antikroppar kan ge upphov
ANA-testades med hjälp av Immuno Concepts HEp-2
Vergleichsmethode
till färgning av cytoplasman och/eller neutrofilkärnan.
ANA-testsystem och även för antikroppar
mot MPO och
Det finns två betydande specifika färgningsmönster:
PR3 med hjälp av ELISA-tester.
Negativ
Posititv
Metodo di confronto
Posititvo
Negativo
cANCA (klassisk eller cytoplasmisk färgning): Färgning
Genom att kombinera
resultaten
Posititv
324 för den normala
94 och
IC Äthanol
av alfakorn (primära) i cytoplasman ger ett jämnt fläckden onormala populationen erhölls följande data
Posititvo
ANCA
255
52
Formalina
igt cytoplasmiskt färgningsmönster, ofta med en färg
vid den första
jämförelsen mellan
Negativ
124 Immuno Concepts
316
koncentration mellan kärnans lober. Den cytoplasmiska
ANCA-testsystem
och etanolbeständiga humana
IC ANCA
Negativo
45
528
färgningen förekommer med antingen etanolbestänneutrofiler (tabell 1):
diga eller formalinbeständiga neutrofiler.
Jämförelsemetod
pANCA (perinukleär färgning): Slät eller homogen
färgning av den kärna som är försedd med flera lober,
ofta med markerad perifer färgning av nukleärloberna
på etanolbeständiga neutrofiler. På formalinbeständiga neutrofiler uppvisar dessa antikroppar en kornig
cytoplasmisk färgning.
Antinukleära och andra autoantikroppar kan reagera
med neutrofiler. Därför skall alla positiva prover ANAtestas med HEp-2 cellsubstrat innan förekomsten av
ANCA rapporteras.
Tillhörande bestämning av antikroppnivå: Resultaten
skall rapporteras som en växelverkan av spädningen i
den sista brunn där en positiv reaktion noteras.
Positivt
Posititvo
ICFormol
etanol IC
ANCA
ANCA
Negativt
Negativo
Positivt
Posititvo
324
255
94
52
Negativt
Negativo
124
45
316
528
Vergleichsmethode
Dessa data ger följande jämförande statistik:
Relativ sensitivitet: 72,3 % Posititv
Negativ
Relativ specificitet: 77,1 %
Posititv
Total överensstämmelse:
74,6
%
255
52
IC Formalin
ANCA
Negativ
528
I den första jämförelsen
mellan45Immuno Concepts
ANCA-testsystem och formalinbeständiga humana
neutrofiler erhölls följande data (tabell 2):
TESTETS BEGRÄNSNINGAR
Jämförelsemetod
Positivt
Negativt
1. Diagnos kan inte ställas enbart på grundval av
detektion av antineutrofil cytoplasmisk antikropp.
Positivt
255
52
IC formalin
Läkaren måste tolka dessa resultat med hänsyn
ANCA
till patientens tidigare sjukdomar och symptom,
45
528
Negativt
de fysiska upptäckterna och andra diagnostiska
metoder.
2. Behandling bör inte påbörjas enbart på grundval
av ett positivt test för antineutrofila cytoplasmiska
Relativ sensitivitet: 85,0%
antikroppar. Kliniska indikationer, andra laboratoRelativ specificitet: 91,0%
rieupptäckter och läkarens kliniska intryck måste
Total överensstämmelse: 89,0%
beaktas innan behandling påbörjas.
3. Antinukleära antikroppar som förekommer i patientMånga autoantikroppar, andra än de som är asprovet kan reagera med cellsubstratet. Om det
förekommer antinukleära antikroppar kan ANCA-re- socierade med autoimmun vaskulit, kan reagera med
humana neutrofiler (8). För att bekräfta att de antikropsultaten ofta övertolkas på grund av den specifika
par som detekteras med något immunfluorescerande
ANCA-färgningens olikartade beskaffenhet, olika
ANCA-test är av klinisk betydelse rekommenderas
antikroppnivåer och/eller reaktionernas intensitet.
bekräftande tester med hjälp av ELISA-analyser av
Om den fluorescerande antinukleära antikropmyeloperoxidas (MPO) och proteinas-3 (PR-3) (9).
preaktionen är stark nog för att dölja ANCA-färgnAlla avvikande prover i ovanstående tabeller testades
ingen skall testet rapporteras som “ej möjligt att
för antinukleära antikroppar och antikroppar mot MPO
tolka”. En alternativ metod måste då användas för
och PR-3. Med dessa tester medtagna i beräkningen
att fastställa patientens ANCA-status.
4. Då det finns många olika alternativ att tillgå när det redovisas de totala resultaten för Immuno Concepts
etanolbeständiga humana neutrofiler i tabell 3:
gäller fluorescerande mikroskop, rekommenderas
��
att ljuskällor, filter och optik standardiseras när man
jämför patienters antikroppnivåer mellan laborato��
��
rier.
5. Resultaten av detta test skall användas tillsammans
��
��
��
��
med den information som finns från den kliniska
��
utvärderingen och andra diagnostiska metoder för
�
��
��
att fastställa patientens kliniska status.
29
IC ANCA
Malattia infiammatoria
dell'intestino
Negativo
5
Relativ specificitet: 93,1% Posititvo
Negativo
Posititvo
Formol IC
292
Número13
De totala resultaten för Immuno Concepts ANCA-testANCA
5 humana neutrofiler
system med
formalinbeständiga
Granulomatosis
de Wegener
30 548
Negativo
framgår av tabell 4:
12
Vergleichsmethode
20
Negativ
Posititv
IC Formalin
Posititv
Glomerulonefritis
292 por
3
15 13
inmunocomplejos
ANCA
Negativ
5
17 (77,3%)
22548
mönster. Ytterligare en analys uppvisade cytoplasmiska
fläckar på de etanolbeständiga neutrofilerna, men var
negativ på de formalinbeständiga neutrofilerna och
Patrón de tinción
ANA-testet. Detta prov bedömdes
vara en ospecifik
(fijadospopulation
con etanol)var negativa
Positivo
reaktion. All övrig sera i denna
på både de etanolbeständiga och formalinbeständiga
Eftersom många
kan
26neutrofilerna.
(86,7%)
todoautoantikroppar
cANCA
reagera ospecifikt med humana neutrofiler (8), skall
8 (66,7%)
todo pANCA
positiva immunfluorescerande tester alltid bekräftas
todo
pANCA
18med
(90,0%)
specifika analyser för de
ANCA-associerade
antikropparna.
2 (66,7%)
10REPRODUCERBARHET
(66,7%)
Studier av olika serier, dagar och lotnummer utfördes
548
22
tutti pANCA atipici
17för
(77,3%)
todo pANCA
atípicos
att påvisa Immuno Concepts
ANCA-testsystems
reproducerbarhet med etanolbeständiga humana
neutrofiler och Immuno Concepts ANCA-testsystem
med formalinbeständiga humana neutrofiler. De sera
som användes i denna studie bestod av tre pANCApositiva prover (ett som uppvisade stark färgning, ett
som uppvisade medelstark färgning samt ett som upPositivt
292
13
IC
formalin
SERUMPROVER
FRÅN PATIENTER MED KÄND VASKULITID
pvisade svag färgning) samt tre cANCA-positiva prover
ANCA
(som vardera uppvisade stark, medelstark och svag
548
5
Negativt
Prover som erhållits från 102 patienter med kliniskt karafärgning). Sex prover som var ANCA-negativa använktäriserad vaskulitid testades med Immuno Concepts
des också. I studien avVerfärbungsmuster
olika serier testades tolv sera två
etanolbeständigaKlinische
neutrofiler
och Immuno Concepts
gånger på sex brunnar vardera.
Vid undersökningen av
Diagnose
(Äthanol-fixiert)
Zahl
Positiv
formalinbeständiga neutrofiler. Resultaten av denna
reproducerbarheten mellan olika dagar och lotnummer
jämförelse visas i tabell 5:
analyserades dessa tolv sera vardera på tre satslotnumalle cANCA
26 (86,7%)
30
Wegener-Granulomatose
mer vid tre olika tillfällen. De sex negativa proverna var
KORSREAKTIVITET
8 (66,7%)
12
Kussmaul’sche Krankheit
negativa på alla objektglasalle
sompANCA
testades och de positiva proven var positiva och visade jämn fluorescerande
18 (90,0%)
20
Mikroskopische Polyarteriitis
alle pANCA
Sera från 57 patienter med olika autoimmuna
intensitet på alla objektglas som testades.
rubbningar testades
på både
Immuno Concepts
2 (66,7%)
einmal pANCA; einmal pANCA und cANCA
Churg-Strauss
Syndrom
3
ANCA-testsystem med etanolbeständiga humana
10 (66,7%)
Immunkomplex wachsende
15
alle pANCA
neutrofiler och Immuno Concepts ANCA-testsystem
med formalinbeständiga
humana neutrofiler. Tre av
Glomerulonephritis
dessa prover visade sig ha en atypisk form av nukleär
17 (77,3%)
22
alle atypische pANCA
Entzündliche Darmerkrankung
färgning liknande pANCA-mönstret på etanolbeständiga neutrofiler. Alla tre av dessa prover som kom från
SLE-patienter reagerade positivt på anti-DNA-antikroppar och uppvisade en positiv ANA med ett homogent
Jämförelsemetod
Relativ specificitet: 97,7%
Positivt
Negativt
TABELL 5
Klinisk diagnos
färgningsmönster
(etanolbeständigt)
Antal
Positivt
Wegeners granulomatos
30
26 (86,7%)
alla cANCA
12
8 (66,7%)
alla pANCA
Mikroskopisk polyarteritis
20
18 (90,0%)
alla pANCA
Churg-Strauss-syndrom
3
2 (66,7%)
ett pANCA; ett både pANCA och cANCA
Halvmånformat immunkomplex
15
10 (66,7%)
alla pANCA
22
17 (77,3%)
alla atypiska pANCA
Glomerulonefrit
Inflammatorisk tarmsjukdom
30
ANCA TESTPROCEDUR
1.
REKONSTITUTION AV BUFFERT (PBS)
Lös upp innehållet i en buffertförpackning
i 1 liter avjoniserat eller destillerat vatten.
Täck och förvara i 2-10 °C i upp till fyra
veckor eller tills det syns tecken på kontamination eller andra synliga förändringar.
2.
SPÄDNING AV PATIENTPROV
Screening: Späd patientprovet till 1:20
genom tillsättande av 0,05 ml (50 µl) serum
till 0,95 ml (950 µl) provspädningsvätska.
Semikvantitativ bestämning av antikroppnivå: För att framställa dubbla
seriespädningar av screeningprover (t ex
1:40, 1:80, 1:160…1:640, avlägsnas 0,5 ml
av spädningen 1:20 och blandas med
0,5 ml provspädningsvätska för att uppnå
spädningen 1:40. Fortsätt därefter med
seriespädningarna på detta sätt.
3.
SPÄDNING AV TILLHÖRANDE TITRERBAR
KONTROLL
Behandla den tillhörande titrerbara kontrollen som ett outspätt patientprov. Späd
kontrollen 1:20 genom att tillsätta 0,05 ml
(50 µl) kontrollserum till 0,95 ml provspädningsvätska. Framställ dubbla spädningar
av den titrerbara kontrollen (se skiss nedan).
4.
IORDNINGSTÄLLANDE AV OBJEKTGLAS FÖR
SUBSTRAT (20-25 µl/brunn)
Avlägsna objektglaset/objektglasen från
påsen/påsarna och placera kontrollsera på
kontrollserabrunnar enligt följande: Vänd
upp och ned på pipettflaskan och kläm
försiktigt tills det syns en droppe på spetsen.
För försiktigt droppen mot rätt kontrollbrunn,
men undvik direktkontakt mellan pipettspetsen och objektglasets yta. Placera
pANCA positiv kontroll i brunnen markerad
„pANCA“, cANCA positiv kontroll i brunnen
markerad „cANCA“, negativ kontroll i
brunnen markerad „Neg“ samt en droppe
provspädningsvätska i brunnen markerad
„färglös“. Tillsätt 1 droppe (20-25 µl) utspätt
patientprov i de numrerade brunnarna.
VARNING: DIREKTKONTAKT MELLAN
PIPETTSPETSEN OCH OBJEKTGLASETS YTA
KAN LEDA TILL ATT ANTIGENSUBSTRATET TAR
SKADA.
5.
ODLING AV OBJEKTGLAS (30 ± 5 minuter i
rumstemperatur, dvs 18-24 °C)
Placera objektglaset/-n i en fuktig täckt
kammare (en petriskål med fuktad pappershandduk duger). Odla, med locket på,
i 30 minuter (±5 minuter) i rumstemperatur
(18-24 °C).
6.
PBS-SKÖLJNING
Avlägsna objektglaset/-n från inkubatorbrickan och skölj hastigt med PBS genom
att använda en sprutflaska, Pasteur, eller
serologisk pipett. Spruta inte buffert direkt
på brunnarna.
OBSERVERA: Led PBS-flödet längs objektglasets mittlinje för att undvika korskontamination på tiobrunnars objektglas genom att
först luta glaset mot brunnarna 1-3 och
därefter mot brunnarna 4-6.
7.
PBS-TVÄTTNING (tio minuter)
Tvätta objektglaset/-n i tio minuter med PBS
i en objektglasfärgskål eller ett Coplin-kärl.
Försiktig omskakning rekommenderas vid
nedsänkning, mittpunkt och avlägsnande
av objektglaset. Denna tvättning kan
förlängas med upp till 30 minuter utan att
de slutliga testresultaten påverkas. Kassera
PBS-tvättlösningen efter användning.
För optimala resultat skall PBS ändras vid
mittpunkten och en magnetisk blandare
användas.
8.
FLUORESCERANDE ANTIKROPPREAGENS
(täck brunnarna med 10-12 droppar)
Avlägsna ett objektglas åt gången från PBS
och doppa det 3-5 gånger i avjoniserat
eller destillerat vatten. Knacka objektglasets
sida mot läskpapper eller pappershandduk
för att avlägsna överskottsvatten. Återför
genast objektglaset till inkubationskammaren och täck brunnarna helt med
fluorescerande antikroppreagens. Börja
med att placera en droppe över varje
brunn. Upprepa detta för varje objektglas.
Den fluorescerande antikroppreagensen
har titrerats för att kompensera för det
avjoniserade eller destillerade vatten som
är kvar på objektglaset efter sköljning.
OBSERVERA: Det är viktigt att objektglasbrunnarna inte torkar under detta förfarande, annars tar substratet skada.
TORKA ALDRIG OBJEKTGLASET MED LÄSKPAPPER ELLER ANNAT FÖREMÅL OCH LÅT
ALDRIG OBJEKTGLASET STÅ UTAN FLUORESCERANDE ANTIKROPPREAGENS LÄNGRE
ÄN FEMTON SEKUNDER.
9.
ODLING AV OBJEKTGLAS (30 ± 5 minuter i
rumstemperatur, dvs 18-24 °C)
Placera locket på inkubationskammaren
och täck med en pappershandduk för
att förhindra att det utsätts för ljus, om
kammaren inte är ogenomskinlig. Odla
objektglaset/-n i 30 minuter (±5 minuter) i
rumstemperatur (18-24 °C).
10.
PBS-SKÖLJNING
Avlägsna objektglaset/-n från inkubatorbrickan och skölj hastigt med PBS. Spruta
inte buffert direkt på brunnarna.
11.
PBS-TVÄTTNING (tio minuter)
Tvätta objektglaset/-n i tio minuter med PBS
i en objektglasfärgskål eller ett Coplin-kärl.
Försiktig omskakning rekommenderas vid
nedsänkning, mittpunkt och avlägsnande
av objektglaset. Denna tvättning kan förlängas med upp till 30 minuter utan att de
slutliga testresultaten påverkas.
12.
MONTERING AV SKYDDSREMSA
Avlägsna ett objektglas åt gången från PBS
och doppa det 3-5 gånger i avjoniserat
eller destillerat vatten. Knacka objektglasets
sida mot läskpapper eller pappershandduk
för att avlägsna överskottsvatten.
TORKA ALDRIG OBJEKTGLASET MED LÄSKPAPPER ELLER ANNAT FÖREMÅL OCH LÅT
ALDRIG OBJEKTGLASET STÅ UTAN SKYDDSREMSA LÄNGRE ÄN 15 SEKUNDER. Tillsätt 4-5
droppar halvpermanent monteringsmedium längs mittlinjen på varje objektglas. Sätt
försiktigt skyddsremsan på plats och undvik
luftfickor genom att försiktigt lägga ned
skyddsremsan från ena änden av objektglaset till den andra.
OBSERVERA: Överflödigt monteringsmedium
på objektglaset kan leda till hög bakgrundsfluorescens på grund av ljusspridning
eller brist på tydlig upplösning av cellerna
(suddig bild). Överflödigt monteringsmedium kan avlägsnas från objektglaset genom
att skyddsremsan försiktigt torkas med
läskpapper eller linspapper. Undvik att röra
direkt vid skyddsremsan.
TEKNISK HJÄLP: +1-916- 363-2649
eller e-mail: [email protected]
31
BIBLIOGRAPHY
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Lancet 2:344-345, 1964.
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Antineutrophil Antibody: Possible Arbovirus Aetiology? Br. Med. J. 285:606, 1982.
3. van der Woude, F.J., Rasmussen, N., Lobatto, S., et al. Autoantibodies Against Neutrophils and Monocytes: Tool for Diagnosis and Marker of Disease Activity in Wegener’s
Granulomatosis. Lancet 1:425-429, 1985.
4. Falk, R.J., Jennette, J.C. Antineutrophil Cytoplasmic Autoantibodies with Specificity for
Myeloperoxidase in Patients with Systemic Vasculitis and Idiopathic Necrotizing and
Crescentic Glomerulonephritis. N. Engl. J. Med. 318:1651-1657, 1988.
5. Jennette, J.C., Wilkman, A.S., Falk, R.J. Antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis and vasculitis. Am. J. Pathol. 135:921-930, 1989.
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Herpes Zoster Propagated in vitro. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86:789-794, 1954.
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Anticytoplasmic Autoantibodies: Their Immunodiagnostic Value in Wegener Granulomatosis. Ann. Int. Med. 111:28-40, 1989.
8. Stroncek, D.F., et al. Neutrophil alloantibodies react with cytoplasmic antigens: A
possible cause of false-positive indirect immunofluorescence assays for antibodies to
neutrophil cytoplasmic antigens. Am. J. Kidney Dis. 21:368-373, 1993.
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P/N 1119; Version 3.2 1/27/98
��
��
��
��
��
��
Manufacturer
Constructeur
Fornitore
Fabricante
Hersteller
Fabrikant
Authorized Representative in the European Community
Représentant autorisé dans le Communauté européen
Rappresentante autorizzato nella Comunità Europea
Representante autorizado en la Comunidad Europea
Autorisierter Repräsentant in der Europäischen Gemeinschaft
Auktoriserad Representant europeiska unionen
Temperature Limitation
Limitation de la Température
Limitazione Di Temperatura
Limitación De la Temperatura
Temperatur-Beschränkung
Temperatur begränsning
Contains Sufficient for <n> tests
Contient suffisamment pour <n> essais
Contiene sufficiente per <n> test
Contiene suficiente para <n> pruebas
Enthält genügendes für <n> Tests
Innehåller tillräckligt för <n> test
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