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FENOTIPADO SELECTIVO COMO ESTRATEGIA PARA REDUCIR COSTOS Y TIEMPO
OPERATIVO EN LA LOCALIZACION DE QTL´s
Giomi G.M., Presello D.A., Rodriguez M.A., Fauguel C., Fernandez M.
Estación Experimental INTA Pergamino. CC 31. 2700 – Pergamino. Provincia de Buenos Aires. Argentina.
[email protected]
Techniques of selective phenotyping allow to choose a reduced subset of progenies in mapping
populations, minimizing the loss of information and sensitivity for localization of QTLs. These
techniques are used for characters that have high operating costs in labor and supplies. In previous
studies were mapped QTLs for resistance to Fusariumverticillioides in a population of 298 lines (F4:F5)
derived from L4637 × L4673. These parental lines differ in resistance to Fusarium spp. and at least in
two of its components, thickness and content of ferulic acid in the pericarp. This work was carried out
with the aim of choosing a subset of lines able to detect the same QTLs for disease resistance
minimizing loss of information for mapping both components. We develop a software that provided the
matrix analysis of the genetic composition of individuals, following Jannink (2005), method called
uniRec, to select a subgroup of 120 lines. For each group of lines, the genetic map was built with the
MapDisto program v1.7.5.1, performed statistical analysis with the SAS software v5.1 and carry out an
analysis of QTLs with the multi-character mapping by composite interval procedure of winQTLcart v2.5
program. The loss of information in relation to molecular data was relatively low considering that we
only use about 2/5 of the initial population. Mapping of the subset of 120 lines identified the same 5
QTLs for resistance to disease, located on chromosomes 1, 2, 3 and 5, that had been identified by
using data from the whole population. These results indicate that, while there was a loss in precision,
the major QTLs were identified in both populations and therefore this subset of lines is appropriate to
map QTLs for both disease resistance components.
Key words: ear rot, Fusarium, resistance components, selective phenotyping, quantitative trait loci
Palabras clave: podredumbre de espiga, Fusarium, componentes de resistencia, fenotipado selectivo,
loci de carácter cuantitavo (QTL)
INTRODUCCION
Existen varias especies de hongos pertenecientes a los géneros Fusarium, Diplodia,
Aspergillus y Penicillium que afectan al maíz (Zea mays L.) produciendo enfermedades
conocidas como podredumbres de espiga.Se identificaron fuentes de resistencia a la invasión
de F. verticillioides y la subsecuente acumulación de fumonisinas en el germoplasma local
(Iglesias et. al., 2007). La expresión de esta resistencia es estable en una amplia diversidad
de ambientes (Presello et. al., 2006) depende de varios genes, siendo un carácter con
distribución del tipo cuantitativa (Chunguet. al., 1996) y presenta una herencia compleja.
Una posible forma de facilitar el desarrollo de híbridos resistentes, es la redefinición de la
resistencia a la enfermedad en los componentes que la constituyen.
Nuestro grupo de trabajo, obtuvo una población de mapeo conformada por 298 RILs
F5 derivadas de la generación F2 de una cruza entre una línea resistente (L4637) y otra
susceptible (L4674) a Fusarium spp, con la que fueron mapeados QTLs de resistencia a
Fusarium verticillioides. Estudios previos que involucran a estas líneas parentales, sugieren
que el espesor de pericarpio y un alto contenido de ácidos fenólicos son componentes de
resistencia al ataque de F. verticillioides en grano (Fauguel, avance de Tesis: Sampietroet al,
2010).La complejidad en la cuantificación de estos caracteres dificulta la fenotipificación de
ellos en toda la población de mapeo.
Existen diferentes técnicas de fenotipado selectivo (selectivephenotyping) para
realizar la selección de un subgrupo de líneas que minimice la pérdida de información y
sensibilidad del mapeo (Jinet al, 2004; Jannink, 2005).Este trabajo se realizó con el objetivo
de elegir un subgrupo de líneas que nos permita seguir detectando los QTLs de resistencia
previamente identificados, para luego mapear los componentes de resistencia mencionados.
MATERIALES Y METODOS
Desarrollo de la Población. Las líneas L4674, parental susceptible de la población de
mapeo, fue derivada del compuesto R4993 y L4637, parental resistente, fue derivada del
híbrido LP561×LP611, ambas provenientes de germoplasma flint argentino y evaluadas con
anterioridad en múltiples años y localidades (Presello et al, 2006). A partir de la línea F2
derivada de los parentales mencionados se generaron 298 RILs hasta la generación F4:F5.
Las líneas F4 fueron utilizadas para la genotipificación y las líneas F5 para obtener los datos
fenotípicos.
Evaluación a campo. La población de mapeo y ambos parentales fueron evaluados
en las campañas 2009/10 y 2010/11 en la Estación Experimental INTA Pergamino. Se utilizó
un diseño de bloques completos aleatorizados de dos repeticiones, con parcelas de dos
surcos de 5 metros cada uno, separados 90cm entre sí y a una densidad de 5 plantas por
metro. Se inocularon15 plantas por parcela mediante la inyección de 2 ml de suspensión
conidial a una concentración de 1×106 esporas por ml de F. verticillioidesP364, aislamiento
agresivo y toxicogénico obtenido de maíz en Pergamino(Iglesias et al, 2007). Las líneas
seleccionadas y ambos parentales se evaluaron por severidad de síntomas visibles de
acuerdo a la escala propuesta por Reidand Hamilton (1996), donde: 1 = sin síntomas; 2 =
1- 3%; 3 = 4-10%; 4 = 11-25%; 5 = 26-50%; 6 = 51-75%; y, 7 = 76-100% del área de la
espiga visiblemente afectada por podredumbre de espiga.
Fenotipado Selectivo.Se definió arbitrariamente un tamaño muestral de 120 líneas
para realizar el fenotipado selectivo. Se aplicaron tres procedimientos:
1) Siguiendo las pautas de Jinet. al. (2004): el criterio se basa en la comparación de
los datos de marcadores moleculares para cada línea,contrastados con los datos de toda la
población de mapeo, y selecciona aquel grupo de líneas que presentan la mayor disimilitud
genotípica entre ellas.
2) maxRec: el procedimiento consiste en analizar pares consecutivos de marcadores
moleculares. Selecciona el grupo de líneas que presentan la mayor cantidad de
recombinaciones entre estos pares de marcadores (Jannink, 2005).
3) uniRec: sigue el mismo criterio de Maxrec, pero además considera la uniformidad
de las recombinaciones en todo el genoma, es decir, selecciona el grupo de líneas que
presentan la mayor cantidad de recombinaciones distribuidas en todo el genoma (Jannink,
2005).
Para cada procedimiento desarrollamos un software con la colaboración del Lic. en
Informática Ariel Giomi (CPCIBA MP:367),que nos facilitó el análisis matricial de la
composición genética de los individuos.
Análisis estadístico.El análisis de los datos fenotípicos para la población de mapeo y
para los subgrupos de 120 líneas, se basó en un modelo lineal mixto considerando a los
efectos de ambiente como fijos y a los efectos de genotipo y de repetición (bloque) dentro
de ambiente como aleatorios. Para este análisis univariado se utilizó el procedimiento MIXED
del programa estadístico SAS(SAS Institute, 1999). Los componentes de variancia se
estimaron mediante el método de Máxima Verosimilitud Restringida (Patterson, 1997).
Datos genotípicos y construcción del mapa genético. El juego de datos
genotípicos para toda la población de mapeo consta de 256 marcadores SNP´s polimórficos.
Para la población de mapeo y cada subgrupo de líneas, fueron estimados el orden de los
marcadores y las frecuencias de recombinación con el software MapDisto 1.7.5 (Lorieuxet al,
2007) y se realizó el test χ2 para analizar las posibles segregaciones distorsionadas de los
marcadores. Las frecuencias de recombinación fueron transformadas a centimorgan (cM)
con la función Kosambi.
Detección y estimación de QTLs combinados. Las medias fenotípicas (BLUPs)
calculadas fueron usadas para el mapeo de QTLs utilizando un modelo mixturado
(JiangandZeng, 1995) basándonos en que los modelos mixturados tienen mejor precisión
que los mixtos cuando se quieren localizar QTLs en mapas no saturados. En el mapeo
multicarácterpor intervalo compuesto (MT-CIM)se utilizó el análisis de regresión “stepwise”
Modelo 6 del WinQTLCartographer V2.5 (Wang et al., 2011). Se estableció un umbral de
0.05 para seleccionar los QTLs putativos que fueron usados como cofactores y un tamaño de
ventana de 10cM. El umbral para declarar significativo un QTL combinado fue LOD=2,5, con
intervalos de escaneo de 2cM entre marcadores y un QTL putativo. Las posiciones de los
QTLs fueron asignadas en las regiones relevantes al punto máximo del LOD.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
Fenotipado Selectivo y mapas genéticos. El mapa genético de la población de
mapeo ubicó 256 marcadores SNP polimórficos en 10 grupos de ligamiento que cubrieron
1178cM del genoma total.Los tres procedimientos fueron aplicados en forma separada y se
obtuvieron tres subgrupos de 120 líneas cada uno, con muchas líneas en común entre ellos.
En la tabla 1 se muestra el resultado de la construcción del mapa genético para la población
de mapeo y para cada subgrupo de líneas obtenido con los tres procedimientos.
Población de
Mapeo
Procedimiento
Jin et al, 2004
Procedimiento
maxRec
Procedimiento
uniRec
10
10
10
10
1178 cM
1025 cM
987 cM
1158 cM
256
198
208
231
g.l.
distancia total
SNP polimórficos
Tabla 1. Resultados de la construcción de los mapas genéticos de los subgrupos de líneas
seleccionados con los distintos procedimientos y el de la población de mapeo.
En base a los resultados de la Tabla 1, decidimos realizar el análisis de QTLs para
severidad de síntoma con el subgrupo de líneas seleccionado por el procedimiento uniRec,
ya que la pérdida de información en relación a datos moleculares fue relativamente baja
considerando que sólo utilizamos aproximadamente 2/5 de la población inicial.
Detección de QTLs. En la población de mapeo se detectaron 6 QTLs en los
cromosomas 1, 2, 3 y 5 (Figura 1, a). En el subgrupo de líneas seleccionado, se detectaron 6
QTLs en los cromosomas 1, 2, 3, 5 y 10 (Figura 1, b).
2
(a)
3a 3b
1
(b)
1
5a
5b
2
3b
5a
5b 10
Figura 1. Salidas del programa winQTLcart v2.5, en el análisis de QTLs asociados a severidad de
síntoma para la población de mapeo (a) y el subgrupo de líneas seleccionado por el método uniRec(b).
Los círculos de color claro indican aquellos QTLs que coincidieron en ambos grupos de líneas, aquellos
de color oscuro son: en (a) un QTL no identificado en el subgrupo de líneas y en (b) un QTL espúreo.
En ambos grupos de líneas se identificaron los QTL 1, 2, 3b, 5a y 5b para resistencia
a la enfermedad ubicados en los cromosomas 1, 2, 3 y 5, mientras que para el subgrupo de
120 líneas apareció 1 QTLadicional en el cromosoma 10, el cualconsideramosespúreo.En el
subgrupo de líneas no se pudo identificar el QTL 3a. Estos resultados indican que, si bien
existió una pérdida en la precisión, los QTLs más importantes fueron identificados en ambas
poblaciones.
CONCLUSIONES
La técnica de fenotipado selectivo propuesta por Jannink, denominada uniRec, fue de
utilidad para seleccionar una fracción (2/5) de líneas de la población de mapeo inicial con la
cual detectar QTLs de resistencia a Fusarium verticillioides.Lógicamente, trabajar con una
mayor fracción de líneas, hubiese mejorado la calidad y cantidad de información, pero la
elección del número de líneas (120) fue considerado teniendo en cuenta las posibilidades
económicas y el tiempo disponibles.
Consideramosadecuado este subgrupo de 120 líneas para continuar con el fenotipado
de los componentes de resistencia, espesor de pericarpio y concentración de ácido t-ferúlico.
Fuentes de financiamiento
* INTA, Proyecto 52-021321 Desarrollo de germoplasma de maíz resistente a estrés biótico y abiótico (Inicio 2009,
finalización y reformulación 2011) comprendido en el Proyecto Integrado PNCER 1 (inicio 2006 finalización 2014)
* Beca CONICET tipo II, convocatoria 2012
CITAS BIBLIOGRAFICAS
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