Clase biblio genomica 2009

16/04/2009
Bibliotecas Genómicas
Colección de fragmentos de DNA que representan todas las secuencias
de un genoma los cuales son clonados en un vector que puede ser
usado y mantenido establemente.
Aplicaciones:
* Secuenciar un gen entero o una región de un cromosoma
* Secuenciación de genomas
* Identificar promotores
Construcción y screening de una biblioteca genómica
Extracción de DNA genómico
Vector de alta
capacidad
Digestión con ER
Digestión con ER
Fraccionamiento del DNA genómico
Ligación y transformación de célula huesped
Selección de transformantes – clones independientes
Screening de la biblioteca genómica
Obtención de los clones conteniendo la/s secuencia/s de interés
Secuenciación
1
16/04/2009
Requerimientos de una buena biblio genómica:
* Fácil de analizar, almacenar, amplificar y estable.
* Representación completa.
* Representación superpuesta del genoma (overlapping clones).
 digestión con ER en posiciones al azar: digestión parcial: fragmentos
al azar del DNA completo.
Vectores de alta capacidad empleados
Vector
Cósmidos/Fósmidos
Capacidad (Kb)
30 - 45
Vectores basados en fago P1
PAC (cromosoma artificial derivado del
fago P1)
BAC (cromosomas artificiales bacterianos)
YAC (cromosomas artificiales de
levaduras)
80 - 100
50 - 150
100 - 300
200 - 1000
Vectores de “baja” capacidad: fago lambda (9-23 kb)
-Lambda DASH II
-Lambda EMBL3
-Lambda Fix II
2
16/04/2009
Caracterización de las bibliotecas genómicas
Representación completa del genoma
Pocos clones independientes: muy poca
probabilidad de encontrar el fragmento
de interés.
Más clones: más sitios del genoma
representados. Clones son al azar y
superpuestos: algunas partes del
genoma están sobrerrepresentadas
mientras que otras no aparecen.
Número suficientemente grande de
clones: certeza de que todo el genoma
está representado y poder encontrar el
fragmento de interés con una P: 99%
Caracterización de las bibliotecas genómicas
N: Número de clones necesarios para encontrar un determinado
fragmento con una probabilidad P (99%)
N=ln(1-P)/ln(1-f)
P: probabilidad deseada de aislar el
fragmento de interés: 0,99 (probabilidad del
99%)
f: fracción del genoma representado por el
tamaño promedio del inserto = tamaño del
inserto/tamaño genoma
Para genoma humano: 3x109 pares de bases:
vector
cósmido
YAC
Tamaño inserto
30000
1000000
N
500000
14000
3
16/04/2009
Caracterización de las bibliotecas genómicas
equivalente genómico (EG): número mínimo de clones
independientes para lograr una cobertura completa del genoma si
fueran clones adyacentes
1 EG: tamaño genoma/tamaño promedio del inserto
Ejemplo
Tamaño promedio inserto
(bases)
genoma haploide
humano: 3x109 bases
Cósmidos
30000
1EG=1x105
BAC
200000
1EG=15.000
N (cósmido)= ln(1-0,99)/ln (1-(30.000/3x109))= 5x105
Screenear 5 veces el EG para encontrar el
fragmento de interés con una
probabilidad del 99%
4
16/04/2009
Preparación de DNA genómico de alto peso molecular
Objetivo: Purificar DNA genómico (eliminar proteínas y
contaminantes) empleando métodos que eviten su fragmentación
mecánica.
En promedio se utiliza 2-4x mas largo según la aplicación:
Aplicación
Southern blot
Cosmidos
YACs
Tamaño
50 kb
200 kb
1000 - 4000 kb
Métodos para extracción de DNA genómico
200 kb < (Cos, P1)
Proteinasa K/SDS
Extracción solventes
orgánicos
Precipitación etOH –
resuspensión
Estimación de la calidad: 0,30,4% agarosa
Digestión parcial con ER
>200 kb (BACs-YACs)
Células embebidas en
plugs de agarosa
Infusión para lisar las
células / remover las
proteínas
Digestión parcial con ER en el
plug de agarosa
5
16/04/2009
Digestión parcial con Enzima de Restricción
-Fragmentos cortos
-No hay clones
superpuestos y no se
puede reconstruir la
seq del DNA
-Fragmentos largos
-Representación
superpuesta del
genoma
Sau3AI o MboI : ↓GATC↑ (4 cutter):   freq de corte: 1/4n : 1/256
bases: colección de fragmentos más “randomizados”. Además: generan
extremos cohesivos compatibles con BamHI (6 cutter-menor
frecuencia de corte): ligar en vectores cortados con BamHI
Digestión parcial: Variar la cc de enzima o tiempo de incubación.
Digestión parcial de DNA
genómico con Sau3AI en agarosa
0,9%
6
16/04/2009
Métodos para extracción de DNA genómico
200< (Cos, P1)
>200 kb (BACs-YACs)
Proteinasa K/SDS
Células embebidas en
plugs de agarosa
Extracción solventes
orgánicos
Precipitación etOH –
resuspensión
Infusión para lisar las
células / remover las
proteínas
Estimación de la calidad: 0,30,4% agarosa
Digestión parcial con ER
Digestión parcial con ER
Fraccionamiento:
Electroforesis de campo pulsátil (PFGE)
Electroforesis de campo pulsátil (PFGE)
Electroforesis común: fragmentos >50 kb
migran juntos.
Si el DNA cambia la dirección durante la
corrida se pueden separar: PFGE
Con cada reorientación del campo
eléctrico los fragmentos menores
reaccionan más rápido en la nueva
dirección (las más grandes tardan más en
arrancar): hay una diferencia de velocidad
en los primeros milisegundos luego de
aplicado el campo eléctrico.
Fw: 0.5 seg – Rv: 0.25 seg
7
16/04/2009
Fraccionamiento DNA digerido: PFGE
Seleccionar el tamaño de fragmento adecuado
Cosmidos y vectores basados en P1: no es tan
crítico: durante el empaquetamiento el fago
selecciona por tamaño
PAC, BAC, YAC: hay que fraccionar el DNA
Electreoelución: slice a tubo de
diálisis  electroforesis  colectar
buffer del tubo  precipitar
DNA
Tb: disolver el gel y precipitar el
DNA
Cósmidos: 30 – 45 kb
Cósmido: híbrido fago-plásmido
se empaquetan en cápsides (más
capacidad y más eficiencia de
transformación que los plásmidos) replican como plásmidos en
bacterias:
no da playas de lisis sino colonias!!!
(no tiene proteínas del fago : no
forma partículas virales)
Cos de fago: empaquetar en fagos e infectar
XbaI para linealizar
Ampr/ori: replicación en E coli (ori: alto número de copias)
Sitio de Clonado: BamHI para clonar el DNAg (BamHI o compatibles)
prom RNApol T7 y T3: generar ribo-sondas a partir de los extremos del
inserto (caminado cromosómico)
8
16/04/2009
Terminasa del fago :
empaqueta cósmidos
entre el 75% y 105% del
largo del fago normal:
selección por tamaño
Corta en sitios cos. Deja
extremos cos cohesivos
5-overhang
selección LB-Amp
(Colonias!!)
Infectar E coli
COS cohesivos se
ligan en coli:
circulariza
Screening….
9
16/04/2009
Fósmidos: 30 – 45 kb
Similares a cósmidos (sitios cos) pero
mantiene 1 copia por célula: mayor
estabilidad
Tienen elementos del plásmido F (como los
BAC): par A, B y C, ori/repE: 1 copia por
célula, controlan la partición durante la
división
Vectores basados en bacteriófago P1: 80 – 100 kb
Ventajas:
* alta eficiencia de transformación
(por que se empaqueta en fagos)
* alta capacidad (más que cósmido)
* mayor estabilidad (1copia/cell)
30 kb
-ScaI: linalizar el vector
-Sitio Clonado: BamHI
-Sitio de empaquetamiento del P1
(Pac): empaquetar en fagos
- Sitios de recombinación del P1 (loxP): circularizar el DNA una vez
inyectado por el fago en E coli (cepa P1 Cre recombinasa +)
- Kanr: selección bacterias que incorporaron y recircularizaron el vector
- replicón plasmídico del P1: 1 copia/bacteria: > estabilidad
- replicón lítico del P1: inducible por IPTG – 20 copias/bacteria
- SacBII: levansucrasa: selección de bacterias con vector+inserto
(levansucrasa en medio con 5% sacarosa: levan : letal para E. coli)
10
16/04/2009
digerir y deP DNAg
Cortar con ScaI
y deP. Cortar
con BamHI
Ligación
30 kb
Pac
PacA y PacB
Selección: Kan (vector) + sacarosa (con
inserto)
Replicón plasmídico (1 copia/cell)
Replicón lítico: IPTG (20 copias/cell): para
aislar el plásmido luego del screening (tb
para amplificar vector)
Selección por tamaño:
muy chico: no empaqueta
muy grande: corta y elimina loxP
distal: no circulariza: no crece
stuffer: flexibilidad – corta ahí
PAC (P1 derived artificial cromosome): 50 – 150 kb
PAC: cromosoma artificial derivado de vectores basados en
bacteriófago P1 (pAD10 modificado):
 Remoción de una región que contiene el sitio pac, el fragmento
stuffer y un sitio lox (acá no hay fagos!!!).
 Inserción de una región derivada del pUC19 en el sitio de clonado
BamHI (dentro del SacBII) para anular la toxicidad de SacBII y
aumentar la cant del vector (tiene ori de replicación de alto número de
copias):
PAC (vacío) replica mejor:
se puede amplificar
bien en bacterias para digerir y
hacer la library
Replicón lítico (IPTG), replicón
plasmídico, kan… idem pAD10
11
16/04/2009
fosfatasa
deP
Genomic DNA
Partial digestion Sau3I or MboI.
Select fragment by size
NO fosfatasear
Selección y screening de
library: rep plasmídico.
Para amplificar clon de
interés: rep lítico.
Ligate vector to a genomic DNA fragments
Transform E. coli by electroporation
•Select recombinants on media containing Kan and 5% sucrose
Kan: selecciona bacterias que incorporaron vector
SacBII: selección de clones con inserto (levansucrasa en E. coli es letal
en medio con 5% sacarosa)…sin fragm DNAg (religación): expresan
levansucrasa y mueren
Cromosomas artificiales bacterianos (BAC): 100 – 300 kb
Contienen elementos del
plásmido F (solo 1 copia por
célula que se divide y particiona
en las 2 células hijas):
-par A, B y C, oriS/repE:
mantienen 1 copia por célula
(muchas copias: inestabilidad),
controlan la partición durante la
división
-Cm(r): resist cloranfenicol: selección de bacteria transformantes
-MCS: HindIII-BamH
-LacZ: identificación de recombinantes
-prom T7 y SP6: para generar ribosondas (pegado primers para seq los
extremos del inserto)
12
16/04/2009
O digerir vector con
BamHI y DNA con
Sau3AI-MboI
loxP y cosN: puntos
para clivaje (prot
P1cre y terminasa del
fago)
Transformar E. coli x electroporación
Selección en CAM/IPTG/X-gal
Transformar E. coli x
electroporación
Selección en CAM/IPTG/Xgal
Cromosomas artificiales de levaduras (YAC): 200-1000 kb
YACs se propagan en levaduras como
cromosoma lineal.
Elementos de cromosoma de
levaduras:
TEL: secuencias teloméricas
CEN4: seq del centrómero
ARS: seq de replicación autónoma
Cloning site: EcoRI dentro del SUP4: selección de recombinates con
inserto.
URA3/TRP1: selección levaduras transformantes (ura-, trp-)
Ori/Amp: amplificación del vector en Ecoli
13
16/04/2009
ade2 ochre: rosado x
acumulación de
intermediario biosíntesis
de adenina
SUP4: suprime los efectos
de ade2ochre
No rec: expresa SUP4:
suprime ade2ochre colonia
blanca
Rec: no expresa SUP4, no
suprime ade2ochre colonia
rosada
Selección en medio trpura- y baja cc de ade:
colonias rosadas!
Transf levaduras trp1- ura3- ade2 ochre (mut en gen
ade2 -biosíntesis de adenina-: stop prematuro)
Placas de 96 wells
Elección del vector
Vector
Tamaño del
fragmento a
clonar
Cosmidos/
Fósmidos
< 50 kb
P1
> 50 kb
PAC
>50 kb
BAC
> 50 kb
YAC
>250 kb
Huésped/
Facilidad de
recuperación
del DNA
clonado
E. coli
Extracción
alcalina (EA)
E. coli
EA
E. coli
EA
E. coli
EA
levaduras
Difícil, requiere
PFGE
Inestabilidad
de la
secuencia
clonada
Cósmidos: alta
(rearreglos)
Fósmidos:
baja
Baja
Baja
Baja
Clones
quiméricos por
rec entre 2
YACs
Facilidad de
screening
Hibridización
convencional
arrays
arrays
arrays
arrays
14
16/04/2009
Screening por hibridación convencional (cósmidos/fósmidos)
SuperCos: se pueden “escrinear” 20 placas con 50000 ufc c/u:
1.0 × 106 cfu en total
Screening de bibliotecas ordenadas en “arrays” (PAC, BAC, YAC)
“Array”
Pins: c/u pica
una colonia
96 wells con medio de cultivo
* 1 well=1 clon : fácil de replicar
y almacenar.
•Robot
* Existen servicios que
construyen bibliotecas en
formato array
etOH 70%
Placas con
colonias
Cada clon identificado: #placafila-columna
Ej: 255A6: placa 255, fila A,
clomna 6
15
16/04/2009
Screening de bibliotecas ordenadas en “arrays” (PAC, BAC, YAC)
Métodos para screening
Hibridación
Sondas para hibridación
• gen vecino
• gen relacionado evolutivamente
• región correspondiente a un dominio
conservado
• exón conocido
PCR
Screening en forma
combinacional= los
clones se agrupan en
pooles y se analizan
muchos clones al
mismos tiempo
Sceening por hibridación
Screening de BAC library (algodón): 16896
clones (bacterias) spottados x2.
11 filtros de 8x12cm. c/u: grilla de 386 cuadros
(16x24: A-Px1-24). En cada cuadro: 4 colonias
por duplicado (8 spots): 1,536 clones BAC por
filtro (spottados por duplicado)
Se pueden pedir las membranas, hibridarlas y encargar los clones +
16
16/04/2009
Sceening por hibridación
grilla de 386 cuadros. En cada cuadro 8 colonias por duplicado (16
spots): 3072 clones BAC por filtro (spottados por duplicado)
Positivos: señal doble
Screening por PCR: pooles (sceening combinacional)
Cada fila de las 9
placas: 1 pool
(A-H): 8 pooles
9
master
pool 5
Cada columna de las 9 placas: 1
pool (1-12): 12 pooles
360 placas/9 =
40 master
pooles
Existen servicios de screening por
PCR
Cada placa: 1
pool: 9 pooles
A-I
Pooles de
placas
Placa G
Fila E
Pooles de filas
Col 5
Pooles de
columnas
17
16/04/2009
Secuenciación
Los insertos son muy largos!! - no se pueden secuenciar directamente
Clonado de la secuencia genómica y promotora de un gen
Screening (sonda correspondiente a una región conocida)
Clon que contiene la seq de interés:
digestión o fragmentación mecánica
en fragm pequeños (2-3kb)
superpuestos sub-library en otro
vector
Screening de la sub-library con la
misma sonda y secuenciar los +
A partir de las secuencias obtenidas se pueden generar
nuevas sondas para re-escrinear la sub-library (encontrar
clones adyacentes), secuenciar los +….repetir el proceso:
“caminado genómico”
Secuenciación
Sub-library Vectorette a partir de
un clon de la biblio genómica
seleccionado por screening
Seq
correspondiente
al primer
vectorette
Amplificar
secuencias
adyacentes a
cada lado de
una región
conocida para
secuenciar
De esa seq: primers
para hacer
“caminando
genómico”
18
16/04/2009
Secuenciación de genomas en BAC
DNA digerido: fragm de
150000 pb: library en
BAC
Fingerprinting: para localizar cada BAC a lo
largo del cromosoma (mapeos con ER de
cada BAC: comparan x software).
c/BAC: digestión parcial en fragm de 1500 pb 
library de c/BAC en otro vector
c/vector se seq:
PHRAP: junta los fragm por
superposición
19
16/04/2009
Caminado Cromosómico: mapeado de regiones genómicas largas
contenidas en distintos clones (por ej: clones de una biblioteca en
cósmidos)
Screening 1
Ribosondas con RNApol (T7, T3)
Screening 2
Screening n
20