Cerebral metabolic rate of oxygen and amplitude-integrated
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Cerebral metabolic rate of oxygen and amplitude-integrated
Modelo de asfixia perinatal en cerdos recién nacidos Curso CHEA “Animal de experimentación como reactivo biológico en investigación, diagnóstico y control de fármacos” Depto de Neonatología, Hospital de Clínicas, Facultad de Medicina Dra. Fernanda Blasina, [email protected] Causas de mortalidad neonatal Birth Asphyxia 29% Source: WHO 2001 estimates (based on data collected around 1999) Infection Complications of Prematurity 32% 24% Other 5% Congenital Anomalies 10% Asfixia perinatal en países desarrollados: -10% de los recién nacidos sufren asfixia leve a moderada -1% sufre asfixia severa Incidencia de 2 -4 por 1000 RN de término. Mortalidad de 20 – 50% en el periodo neonatal 25% de los que sobreviven presentan secuelas neurológicas (retardo mental, parálisis cerebral, epilepsia, trastornos del aprendizaje). Review Hypoxia-ischemia in the inmature brain. Susan J. Vannucci and Henrik Hagberg. April 2004 CHPR, 2005 la prevalencia fue de 14,5%. En ese año fue la cuarta causa de mortalidad infantil y neonatal. Daño hipóxico isquémico del recién nacido Incidencia de muerte o daño neurológico severo: 2-3/1000 nac. vivos en países desarrollados. Aumenta en países en vías de desarrollo ENCEFALOPATÍA MUERTE Retraso del desarrollo Parálisis cerebral TERAPIAS INEFICACES Gunn and Gluckman, CLINICAL OBSTETRICS AND GYNECOLOGY 2005,Volume 50, Number 3, 636–651 Robertson et al, 2012 Susceptibilidad cerebro inmaduro • Aumento sensibilidad a excitotoxicidad. • Expresión máxima de receptores. • Incompleta maduración de mecanismos inhibidores. • Disminución de proteínas de unión al Ca+. • Aumento sensibilidad radicales libres Susceptibilidad cerebro inmaduro • Susceptibilidad oligodendrocitos en desarrollo. • Estado hiperexcitable e hipermetabólico. • Pobre capacidad vasodilatadora en tejido nervioso. Asfixia perinatal Redistribución FSC Aumneto PA Hipoxia Hipercpnia Acidosis Aumento de FSC Pérdida Autorregulación Cae PA Hemorragia FSC Cae Lesión neuronal primaria Ventana terapéutica (horas) Lesión neuronal secundaria Animal models Acute studies n (%) Chronic studies n (%) Total reviwed Non-human primate 14 (48) 15 (52) 29 Piglet 61(90) 7(10) 68 Fetal sheep and newborn lamb 54(87) 8(13) 62 Rodent 31(38) 51(62) 82 Dog 30 (100) 0 30 Others 17(81) 4(19) 21 TOTAL Roohey et al, 1997 ACUTE STUDIES Models (n) Metabolic n(%) Clinical n (%) Pathology n(%) Non-H Primate (14) 10 (34) 4(14) 6(20) Piglet (61) 61(100) 2(3) 1(2) Sheep (54) 51(94) 11(20) 4(7) Rodent (31) 28(90) 4(13) 4(13) Roohey et al, 1997 Anestésicos? Sistémicos: Ketamina, Propofol Inhalatorios:isofluorano, halotano, enfluorano Considerar farmaconcinetica en cada especie y el efecto sobre parámetros que se vayan a evaluar a nivel del sistema nervioso central (ej: electroencefalograma). Método de hipoxia-isquemia asfixia Primates 14 10 Cerditos 61 31 Oveja 54 42 Roedores 31 15 Perros 17 isquemia 2 17 0 1 Duración? Tracey et al, 2006 EDAD??? Neonatal Piglet: 3 de mediana (0-30) Fetal Roohey et al, 1997 TERM HUMAN newborn GRADO de DESARROLLO ENCEFÄLICO???? Clancy et al, 2001 Predicen 95 eventos neurogenéticos en 9 especies diferentes Factores que modulan severidad del daño Glicemia Temperatura Ginsberg et al, 1989 DIFERENCIAS ENTRE GÉNERO MASCULINO O FERMENINO?? Dev Med Child Neurol. 2007 Jan;49(1):74-8. Links Sex and the pathogenesis of cerebral palsy. Johnston MV, Hagberg H. Kennedy Krieger Institute and the Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, Maryland, USA. [email protected] Cerebral palsy (CP) and related developmental disorders are more common in males than in females, but the reasons for this disparity are uncertain. Males born very preterm also appear to be more vulnerable to white matter injury and intraventricular hemorrhage than females. Experimental studies in adult animals and data from adult patients with stroke indicate that sex hormones such as estrogens provide protection against hypoxic-ischemic injury, and the neonatal brain is also influenced by these hormones. However, hormonal influences on the fetus and neonates are substantially different from those on adults. Recent data from neonatal rodents subjected to hypoxia-ischemia also demonstrate differences between males and females. Knockout of the gene for poly (ADP-ribose) polymerase (PARP1), a major step in the cascade of injury, protected male but not female mouse pups from hypoxic-ischemic injury. Other reports demonstrated major differences between male and female neurons grown separately in cell culture, suggesting that sex differences in the fetal or neonatal period result from intrinsic differences in cell death pathways. This new information indicates that there are important neurobiological differences between males and females with respect to their response to brain injuries. This information is relevant to understanding the pathogenesis of CP as well as to the design of future clinical trials of Modelo de asfixia perinatal en cerdos recién nacidos Por qué cerdos? -Similitud anatómica, fisiológica y genética con seres humanos (K.N. Kuzmuk and L.B. Schook, 2011) -Tecnología utilizada a nivel clínico es útil en este modelo. IMPORTANCIA DE CONTAR CON ÁREA DE INVESTICACIÓN ADJUNTA AL ÁREA ASISTENCIAL CLÍNICA: oportunidad de medicina traslacional Reproducción de situaciones clínicas. Generación de situaciones que reproducen patologías en forma experimental. Desarrollo de modelos animales diversos. Entrenamiento y manejo de situaciones complejas Laboratorio METODOLOGÍA Cerdos recién nacidos, 1500 - 2000 g, menores de 2 días, proveniente de granja local. Ketamina 20 mg/k/dose I/M Termocuna y vía venosa periférica Aporte de fluídos con suero glucosado al 5% (70 ml/k/día) Anestesia intravenosa total con midazolam + ketamina + fentanyl Electrocardiografía, pulsioximetría, temperatura. Vía aérea por traqueostomía, tubo endotraqueal de tamaño adecuado. Cateterización de arteria femoral para medida de la presión arterial. Catetherización de la arteria pulmonar por medio de toracotomía para su monitorización invasiva. Estabilización hemodinámica y metabólica Tiempo de preparación total 1 hora. Monitor: * Electrocardiograma *Frecuencia cardiaca *Presión arterial sistémica *Presión arterial pulmonar *Saturación de oxígeno Data digitalization ECG SatO2 SAP PAP Monitoreo de Función Cerebrl (MFC) MFC o electroencefalograma de amplitud integrada Patrones de MFC Normal: Lim sup> 10 mcv. Lim inf > 5 mcv. Ciclos de actividad normal. Moderado: Lim sup> 10 mcv. Lim inf< 5 mcv. Severo: Lim sup < 10 mcv. Lim inf < 5 mcv. Pediatrics 1999;103;1263-1271 OBJETIVOS •Desarrollo de un modelo de asfixia perinatal controlado por la tolerancia fisiológica individual. •Estudiar la respuesta hemodinámica, electroencefálica, equilibrio ácido-base y variables hematimétricas durante las primeras horas. •Evaluar la actividad mitocondrial, anatomía patológica, integridad de proteínas, ADN y ARN encefálicas. Generación de hipoxia en modelo experimental: -Se mantiene FiO2 de 0,08 durante un período que permita al menos 17 minutos de MFC por debajo de 7uV, FC por encima de 80lpm y presión arterial media por encima de 20mmHg. -Al caer la hemodinamia hasta los umbrales indicados reanimación con FiO2 1 por 30 minutos, luego FiO2 0,21 según tolerancia -FC se eleva en respuesta a la hipoxia y desciende cuando la reserva miocárdica se limita, muestra estabilidad luego de la reanimación. -Posibilidad nanosomal de evaluar terapias neuroprotectoras: quercetina Modelo de Hipoxia Neonatal FiO2 8% Parámetros críticos para reanimación: MFC, PAM, FC Tiempo 0 Tiempo 1 Tiempo 2 Tiempo 3 M F C 10 uV Quercetina 7 uV 5 uV 0 1 2 Tiempo (horas) Gasometrías cada 30 minutos Gasometrías cada 10 minutos 09/12/10 21/12/10 23/12/10 30/12/10 26/10/10 11/11/10 ECG SatO2 Presión art. sistémica Monitorización de presión arterial pulmonar Presión arterial sistémica, frecuencia cardiaca, Presión art. pulmonar Gasto cardiaco, saturación, gasometría QUERCETIN 25mg/kg 1/10/08 Capacidad neuroprotectora in vivo en cerdos recién nacidos ante la hipoxia Evaluación •Hemodinamia sistémica y pulmonar •Equilibrio ácido base y metabolismo •Encefálico: monitoreo de función cerebral •Imagenología (Resonancia, PET) •FiO2 8% hasta descenso de MFC debajo de 7uV durante 40 min con ligadura carotídea •Presión arterial sistémica degajo de 20mmHg o •frecuencia cardiaca debajo de 80 cpm Evaluación del daño provocado por la hipoxia y uso de agentes neuroprotectores. A nivel sistémico Equilibrio ácido base y metabolismo en sangre Parámetros ventilatorios durante el experimento y variación de los mismos según estado del animal Estabilidad hemodinámica y necesidad de aporte inotrópico A nivel cerebral MFC durante todo el experimento. Se revierte daño? Eutanasia con KCl: Evaluación de perfil genético: ADN, ARN y proteínas Evaluación anatomopatológica (en cerdos de 3 días) Evaluación de actividad mitocondrial por reducción de sales de tetrazolio Se les realizará un primer estudio de imagenología funcional cerebral PET a través de la administración de [18F] FDG con el fin de determinar el grado de captación de glucosa de las distintas regiones del SNC y de realizar estudios comparativos entre los distintos grupos pre y post hipoxia. Luego de realizada la hipoxia en estos cerdos, se vigilará la recuperación anestésica y una vez extubados y con ventilación espontánea serán trasladados al bioterio de Facultad de Medicina o al HC según su condición. En este grupo de animales, tras 72 hs de sobrevida, se realizará evaluación metabólica (glicemia), comportamental y monitoreo de función cerebral diarios y a las 72 hs se realizará una resonancia nuclear magnética y un segundo estudio PET con [18F] FDG a los efectos de valorar la captación del glucosa por el tejido nervioso al cabo de tres días de la hipoxia, con o sin tratamiento. Duración hipoxia y posthipoxia HIPOXIA Y QUERCETINA 20 mgkg HIPOXIA Y QUERCETINA 10 mg/kg HIPOXIA 0:00:00 1:12:00 2:24:00 3:36:00 duración hipoxia 4:48:00 6:00:00 período posthipoxia 7:12:00 8:24:00 9:36:00 FiO2 durante Hipoxia y quercetina, 8 hs 1 0,8 Hipoxia Hipoxia y Quercetina 10 mgkg Hipoxia y Quercetina 20 mgkg 0,6 0,4 FiO2 0,2 Saturación de O2 de Hb (%) 0 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 500 400 300 200 100 pO2 0 Presión parcial de O2 durante Hipoxia y quercetina, 8 hs Hipoxia Hipoxia y Quercetina 10 mgkg Hipoxia y Quercetina 20 mgkg Hipoxia+Quercetina 10 mg/kg Hipoxia y Quercetina 20 mg/kg Hipoxia PAS sistólica (mmHg) 120 100 80 60 40 20 0 Presión Arterial Sistémica sistólica Hipoxia Hipoxia y Quercetina 10 mgkg Hipoxia y Quercetina 20 mg/kg Temperatura Hipoxia y Quercetina 10 mgkg Hipoxia Hipoxia y Quercetina 20 mg/kg temperatura (ºC) 40,5 40 39,5 39 38,5 38 180,000 160,000 140,000 120,000 100,000 80,000 60,000 40,000 20,000 0,000 Glicemia Hipoxia y Quercetina 10 mgkg Hipoxia Hipoxia y Quercetina 20 mg/kg 30 Amplitud integrated EEG (uV) 25 20 15 10 5 0 -5 Cerebral function monitor post reanimatio (superior margin) hypoxia -Se incuba un hemisferio cerebral por 30 minutos a 37ºC en solución conteniendo TTC - Luego de mantiene 12hs hasta pasaje a formol para fotografía y posterior medida del daño Brains after hypoxia 2hs survival 12 hs survival Controls Sham Absolute Muchas gracias por su atención!!