manual de técnicas de laboratorio para el

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ASSISTANCE FOOD
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Convenio de transferencia de conocimientos con
Consultores en Producción, Comercialización & HACCP para Industrias y Servicios de Alimentación y Pesca
ASSISTANCE FOOD ARGENTINA S.A. Member of the Association of Food and Drug Officials of USA
1.13
MANUAL
DE TÉCNICAS
DE LABORATORIO
PARA EL ANÁLISIS DE
ALIMENTOS
Dr. César Augusto Lerena
Dr. Joaquín I. Lerena
Dra. Adriana Pereyra
Assistance Food Argentina S.A.
Copyright © 1998
Rev. 15.9.07
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En el presente Manual de Técnicas de Laboratorio para el análisis de Alimentos se describen las prácticas y
metodologías más habituales de uso en las actividades alimentarias, sin que por ello sean excluyentes, ya que
existen numerosas opiniones y criterios y los laboratoristas utilizan métodos en los que se encuentran más seguros
o que consideran más adecuadas e internacionalmente aceptadas.
En especial nos ocuparemos de:
1. Instrucciones para la preparación del material de vidrio.
2. Instrucciones para el manejo del autoclave.
3. Instrucciones para el fraccionamiento de medios de cultivo en placas de petri (plaqueado).
4. Instructivo para la preparación de medios de cultivo.
5. Instructivo para la siembra de muestras.
6. Instructivo para el recuento de colonias.
7. Análisis microbiológico de agua.
8. Análisis microbiológico de productos pre-elaborados.
9. Formulación, técnica e interpretación de hisopados en superficies de contacto y personal.
10. Interpretación de resultados.
1. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL MATERIAL DE VIDRIO
1.1. Limpieza y acondicionamiento de material que no requiere esterilización
• Esterilizar todo material “sucio” (placas y tubos sembrados, etc.) en autoclave a 1,5 atmósferas, durante 15
minutos.
• Lavar el material de vidrio con agua tibia (45-50º C), detergentes y cepillos.
• Enjuagar con agua tibia.
• Secar por escurrido.
• Almacenar protegido contra el polvo del medio ambiente.
• Previo a su utilización enjuagar el interior con agua destilada.
1.2. Limpieza y acondicionamiento de material que requiere esterilización
1.2.1. En general
• Esterilizar todo material “sucio” (placas y tubos sembrados, etc.) en autoclave a 1.5 atmósferas, durante 15
minutos.
• Lavar el material de vidrio con agua tibia (45-50º C),detergentes y cepillos.
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• Enjuagar con agua tibia.
• Secar por escurrido.
1.2.2. Placas de Petri y tubos de ensayo, hemólisis, etc.
• Envolver en papel, de manera que no quede ninguna parte del material en contacto con el aire.
• Esterilizar en estufa a 160º C durante 1 hora.
1.2.3. Pipetas
• Envolver en papel, de manera que no quede ninguna parte del material en contacto con el aire.
• Esterilizar en autoclave en un Pipetero de Acero Inoxidable a 1 atmósfera, durante 15 minutos.
Nota: Si las pipetas van a estar siempre contenidas en el pipetero, no es necesario envolver en papel.
2. INSTRUCCIONES PARA EL MANEJO DEL AUTOCLAVE
• Comprobar el nivel de agua que debe cubrir el fondo del autoclave sin inundar el piso del mismo.
• Cargar el autoclave con el material a esterilizar evitando que toque en forma directa el piso y las paredes del
mismo.
• Verificar que el nivel de carga no obstruya el cierre del autoclave.
• Colocar y atornillar la tapa, ajustando por parejas diametralmente opuestas, de forma tal que la tapa encaje
perfectamente sobre la arandela (muy importante para evitar pérdidas de vapor por cierre incorrecto).
• Abrir la válvula de vapor y encender el gas en posición máximo.
• Esperar a que salga vapor de la válvula en forma de columna durante 5 minutos.
• Cerrar la válvula de vapor.
• Cuando el manómetro llegue a la presión deseada, bajar la llama de gas a posición mínimo, y dejar el tiempo
indicado para la esterilización.
• Cerrar la llama de gas.
• Esperar a que el manómetro llegue a cero.
• Abrir la válvula de vapor, hasta eliminar todo el vapor sobrante.
• Abrir la tapa.
3. INSTRUCCIONES PARA EL FRACCIONAMIENTO DE MEDIOS DE CULTIVO EN PLACAS DE PETRI (PLAQUEADO)
• Debe realizarse en el área de sembrado, con mesadas y azulejos desinfectados, elementos de laboratorio estériles
y sin corrientes de aire, con mecheros de Bunsen encendidos.
• Fundir el medio a Baño María. Tener en cuenta que los medios, por su fracción proteica son sensibles a la
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desnaturalización por calor, por lo tanto debe evitarse que el tiempo de exposición sea superior al necesario para la
fundición.
• La temperatura del medio al momento de fraccionar no debe ser superior a los 50º C, para evitar condensación
de vapores en las Placas de Petri.
• Fraccionar al lado del mechero de Bunsen encendido, abriendo la placa hacia el lado de la llama, vertiendo el
contenido del tubo de ensayo y/o Erlen Meyer.
• Antes de cerrar la placa dejar unos minutos semidestapada, para facilitar la salida de vapor excedente; el lado
abierto de la placa debe estar orientado hacia la llama del mechero.
• Cerrar las placas y dejar solidificar a temperatura ambiente.
4. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
4.1. MEDIO:
DE PRE-ENRIQUECIMIENTO
Aplicación: Dilución y pre-enriquecimiento no selectivo para la preparación de muestras.
Incubación en: varía según el tiempo y temperatura de pre-enriquecimiento de cada marcha.
Marcha: Se entiende como la serie de procesos a los que se somete una muestra (enriquecimiento, cultivo,
incubación, etc.). Para la determinación y/o identificación de microorganismos indicadores o patógenos.
Modo de Preparación:
COMPONENTES SÓLIDOS
Fosfato anhidro disódico
8.66 g
Fosfato anhidro monosódico
4.66 g
Peptona de Carne
10.00 g
AGUA DESTILADA
HOMOGENEIZAR
ESTERILIZAR
1000 ml.
10’ a Baño María
15’ a 1 atm.
(autoclave)
• Pesar en balanza digital la cantidad indicada de reactivos y agregar el agua destilada en jarra de precipitado,
previamente enjuagada con agua destilada.
•Homogeneizar con cuchara espátula y colocar a Baño María el tiempo indicado (continuar el mezclado con
cuchara), hasta completar el proceso.
• Fraccionar según su utilización en:
a) Frascos para dilución de muestras:
a1) Preparar frascos limpios (del tipo mermeladas) con trozos de vidrio, que harán las veces de homogeneizador y
en estos envases así acondicionados verter la cantidad indicada según la marcha de diluyente medido con probeta.
a2) Tapar con la tapa propia del frasco y luego sellar esta con una tapa papel aluminio y otra de papel común y
cerrar todo con banda elástica.
a3) Esterilizar en autoclave el tiempo indicado.
a4) Mantener en heladera (4-8º C).
b) Tubos de ensayo para preparación de Hisopos (ver Anexo de instructivo para formulación y técnicas de Hisopos).
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4.2. MEDIO: PLATE COUNT
Aplicación: recuento de BACTERIAS AEROBIAS MESÓFILAS.
Incubación en: Estufa a 36.5º C durante 72 horas.
MEDIO
DESHIDRATADO
4.6 g
AGUA DESTILADA
HOMOGENEIZAR
ESTERILIZAR
200 ml.
15’ a 1 atm.
• Pesar en balanza digital la cantidad indicada de medio deshidratado y agregar el agua destilada en jarra de
precipitado, previamente enjuagada con agua destilada.
• Homogeneizar con cuchara espátula y colocar a Baño María el tiempo indicado (continuar el mezclado con
• Fraccionar con pipeta, en tubos de ensayo 10 ml de medio.
• Tapar con tapón de algodón y aluminio y/o tapón plástico que resista la esterilización.
• Esterilizar en autoclave 15 minutos a 1 atmósfera de presión.
• Colocar los tubos en gradillas, envolver en polietileno, e identificar con tinta indeleble con la sigla “PC”.
• Mantener en heladera (4-8º C).
• Para sembrar fundir tantos tubos, como placas sean necesarias, a baño María.
• Verter en placas de Petri estériles (siguiendo las instrucciones del fraccionamiento en placas).
4.3. MEDIO: VIOLETA ROJO BILIS DEXTROSA (VRBD)
Aplicación: recuento de ENTEROBACTERIAS.
Incubación en: Estufa a 36.5º C durante 24 horas.
MEDIO DESHIDRATADO
8.3 g
AGUA DESTILADA
200 ml.
HOMOGENEIZAR
10’ Baño María
ESTERILIZAR
30’ a vapor fluente
Nota: en este medio, la homogeneización es un paso crítico, por la tendencia del agar a sedimentar.
• Fraccionar con pipeta, en tubos de ensayo 10 ml de medio. (debe hacerse en forma rápida de modo de evitar que
comience a solidificar).
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• Esterilizar en Vapor fluente (en autoclave sin presión) durante 30 minutos.
• Colocar los tubos en gradillas, envolver en polietileno, e identificar con tinta indeleble con la sigla “VRBD”.
• Para sembrar fundir tantos tubos como placas sean necesarias, a baño María .
• Verter en placas de Petri estériles (siguiendo las instrucciones del fraccionamiento en placas).
4.4. MEDIO: CALDO BRILA
Aplicación: determinación de COLIFORMES.
Incubación en:
Estufa a 36.5º C durante 48 horas (COLIFORMES TOTALES).
Baño Termostático a 45º C durante: 48hs. (COLIFORMES FECALES).
MEDIO DESHIDRATADO
8g
AGUA DESTILADA
200 ml
HOMOGENIZAR
ESTERILIZAR
15’ a 1 atm.
cuchara),hasta completar el proceso.
• Colocar en cada tubo de ensayo una Campanita de Durham, el extremo abierto de la campanita debe quedar en
contacto con el fondo del tubo.
• Fraccionar con pipeta, en tubos de ensayo 9ml de medio, luego invertir el tubo tapando con el pulgar la boca del
mismo, para sacar el aire de la campanita (no debe quedar ninguna burbuja en el interior de la misma).
• Colocar los tubos en gradillas, envolver en polietileno, e identificar con tinta indeleble con la sigla “BRILA”.
4.5. MEDIO: AGAR EOSINA AZUL DE METILENO (EMB)
Aplicación: visualización de colonias sospechosas de E. COLI.
Incubación en: Estufa a 36.5ºC durante 24 horas.
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MEDIO DESHIDRATADO
7.2 g
AGUA DESTILADA
200 ml
HOMOGENEIZAR
ESTERILIZAR
15’ a 1 atm.
• Fraccionar todo el volumen en Erlen Meyer.
• Fraccionar en placas de Petri (siguiendo las recomendaciones del fraccionamiento en placas).
• Identificar con tinta indeleble, con la sigla EMB en la base de la placa.
• Envolver de a cuatro placas en papel aluminio.
4.6. MEDIO: AGAR BAIRD PARKER
Aplicación: visualización de colonias sospechosas de STAPHYLOCOCCUS AUREUS.
MEDIO DESHIDRATADO
11.6
AGUA DESTILADA
200 ml
HOMOGENEIZAR
ESTERILIZAR
15’ a 1 atm.
• Homogeneizar con cuchara espátula y colocar a Baño María el tiempo indicado(continuar el mezclado con
cuchara),hasta completar el proceso.
• Al retirar el medio del autoclave enfriar hasta 50º C (en baño termostático a 45º C)
(*)
• Agregar cada 200 ml de medio 10 ml de yema de huevo Telurito, agitando en forma constante el Erlen Meyer,
(*)
para lograr una solución homogénea
• Fraccionar en placas de Petri (siguiendo recomendación del fraccionamiento en placas).
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• Identificar con tinta indeleble, con la sigla “BP” en la base de la placa.
(*) Importante: La temperatura del medio al agregar la yema de Huevo Telurito, no debe superar los 50º C, porque
el huevo se desnaturaliza visualizándose como “hilos“; ni ser inferior a 45ºC, para evitar la solidificación del agar,
ya que una vez agregada la yema de huevo el medio no puede ser recalentado. En ambos casos el medio queda
inutilizado.
4.7. MEDIO: AGAR MANITOL
Aplicación: identificación de colonias sospechosas de STAPHYLOCOCCUS AUREUS.
MEDIO DESHIDRATADO
21.6
AGUA DESTILADA
200 ml
HOMOGENEIZAR
ESTERILIZAR
15’ a 1 atm.
• Fraccionar en placas de Petri (siguiendo las recomendaciones del fraccionamiento en placas).
• Identificar con tinta indeleble, con la sigla “MAN” en la base de la placa.
4.8. MEDIO: CALDO INFUSION CEREBRO CORAZON (CICC)
Aplicación: caldo de enriquecimiento de colonias sospechosas de STAPHYLOCOCCUS AUREUS.
MEDIO DESHIDRATADO
7.4 g
AGUA DESTILADA
200 ml
HOMOGENEIZAR
ESTERILIZAR
15’ a 1 atm.
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• Fraccionar con pipeta, en tubos de ensayo 10ml de medio.
• Colocar los tubos en gradillas, envolver en polietileno, e identificar con tinta indeleble con la sigla “CICC”.
4.9. MEDIO: PLASMA DE CONEJO CON EDTA LIOFILIZADO
Aplicación: test de coagulasa para identificación de STAPHYLOCOCCUS AUREUS COAGULASA POSITIVO.
Incubación en: estufa de cultivo a 37ºC e ir observando a partir de los 30 minutos a 4 horas si coagula el plasma. Si
no se produce coagulación del plasma dejar hasta 24 horas.
MEDIO LIOFILIZADO
AGUA DESTILADA ESTÉRIL
Según presentación comercial (*)
HOMOGENEIZAR
Por agitación
ESTERILIZAR
No
(*) Las presentaciones contienen un volumen de liofilizado para hidratar en 2 ml.
• La hidratación del Plasma debe realizarse en el área de sembrado, con mesadas y azulejos desinfectadas,
elementos de laboratorio estériles y sin corrientes de aire, con mecheros de Bunsen encendidos.
• Luego, en las mismas condiciones ambientales de la hidratación, fraccionar con pipeta estéril, en tubos de
hemólisis, 0.5 ml. de plasma.
• Tapar con tapón de algodón y aluminio ó plásticos estériles.
• Mantener a –20º C.
• Descongelar a Temperatura ambiente para la inoculación.
4.10. MEDIO: HONGOS Y LEVADURAS
Aplicación: recuento de HONGOS Y LEVADURAS
Incubación en: Estufa a 37º C durante 5 días.
MEDIO DESHIDRATADO
AGUA DESTILADA
Según presentación comercial
HOMOGENEIZAR
ESTERILIZAR
15’ a 1 atm.
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Preparación del Antibiótico Clortetraciclina
Diluir 0.01 g de antibiótico en 5ml de agua destilada estéril.
(*)
• Al retirar el medio del autoclave dejar enfriar hasta 50ºC (en baño termostático a 45ºC) .
• Agregar cada 200 ml de medio 0.5 ml de antibiótico clortetraciclina agitando en forma constante el Erlen Meyer,
(*)
para lograr una solución homogénea .
• Fraccionar en placas de Petri (siguiendo las recomendación del fraccionamiento en placas).
• Identificar con tinta indeleble, con la sigla “HL” en la base de la placa.
(*) Importante: La temperatura del medio al agregar el Antibiótico no debe superar los 50º C; ni ser inferior a 45º
C, para evitar la solidificación del agar, ya que una vez agregada el antibiótico el medio no puede ser recalentado.
En ambos casos el medio queda inutilizado.
5. INSTRUCTIVO PARA LA SIEMBRA DE MUESTRAS
5.1. EN GENERAL
a) El área de sembrado, debe ser un sector aislado y cerrado, sin corrientes de aire.
b) Las mesadas y azulejos deben estar desinfectadas, (lavar con detergentes, enjuagar y tratar con desinfectantes
c) Los elementos de laboratorio limpios y/o estériles (ver instrucciones de preparación de material de laboratorio).
d) Los mecheros de Bunsen encendidos.
e) Antes de comenzar la siembra el técnico debe constatar que tiene todos los elementos necesarios preparados,
(para esto se recomienda leer los instructivos de la marcha que va a realizar).
Elementos básicos para todas las marchas:
• Pipetas estériles de distintos calibres.
• Pipetas Pasteur acondicionadas en un recipiente con alcohol.
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• Tijeras, pinzas y cucharas espátulas acondicionadas en un recipiente con alcohol.
• Frasco con agua destilada estéril.
• Cucharas espátulas estériles.
• Ansas de punta y punta redonda.
• Algodón.
• Alcohol.
• Placas de Petri estériles, desenvueltas e identificadas con la sigla del medio en que se va a sembrar y con el
número de muestra correspondiente.
• Gradillas con los medios en tubos identificados con el número de muestra y la dilución correspondiente.
• Recipientes vacíos para ir colocando las pipetas o utensilios de laboratorio que ya han sido utilizados.
5.2. TRATAMIENTO DE LA MUESTRA
a) Si el envase de la muestra tiene tapa, destapar y quitar con una cuchara espátula estéril la capa superficial.
b) Si la muestra se encuentra en bolsas de polietileno desinfectar con alcohol, la superficie, luego flamear pinza y
tijera (que se encontraban en el frasco con alcohol), enfriar en agua destilada estéril y abrir la bolsa sosteniendo
con la pinza y cortando con la tijera.
c) Una vez abierta la muestra quitar con una cuchara espátula estéril la capa superficial.
d) Tarar una placa de Petri estéril en una balanza digital, y colocar en ésta los gramos necesarios de la muestra,
según la marcha:
• Realizar la operación con cuchara espátula estéril, abriendo y cerrando la placa al ir incorporando la muestra
hasta conseguir el peso deseado, siempre al lado del Mechero de Bunsen encendido (la placa de Petri debe
permanecer cerrada y la parte interna de la tapa no debe contactar con el exterior).
• Esta maniobra debe realizarse sin que los utensilios toquen ningún elemento ajeno a la muestra y al lado del
Mechero de Bunsen encendido
e) Luego colocar la muestra en el frasco con diluyente:
• Primero se debe aflojar la tapa del frasco, sin quitarla.
• Luego se quita la tapa de la placa de Petri, sin apartarla del Mechero.
• Tomar la muestra con cuchara estéril con una mano y destapar el frasco de manera que la parte interna de la
tapa no contacte con el exterior con la otra mano.
• Cerrar el frasco y homogeneizar agitando suavemente de manera que el líquido no contacte con la tapa del
mismo
5.3. TÉCNICAS DE SEMBRADO
A efectos de este instructivo se describirán sólo alguna de las técnicas a aplicarse:
a) Sembrado en Superficie
Se denomina a la siembra realizada con Ansa de punta redonda o pipeta Pasteur donde la solución a sembrar se
esparce sobre el medio ya solidificado, cubriendo la superficie del mismo sin perforarlo.
b) Sembrado en Profundidad
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En este caso se vierte en placa de Petri vacía y estéril una determinada cantidad de solución a sembrar y luego se
agrega el medio fundido (plaqueado). A continuación se realiza la homogeneización del medio y la solución a
sembrar con movimientos en forma de ocho sobre la mesada de trabajo con la placa de Petri perfectamente
cerrada. Luego se deja solidificar, para incubar en estufa.
c) Sembrado en Estrías
Se denomina a la siembra realizada con Ansa de punta, donde la solución a sembrar se esparce sobre el medio ya
solidificado, cubriendo la superficie del mismo, introduciendo la punta del Ansa de manera que perfora el medio
sin atravesarlo (Se dibuja una víbora o una onda).
6. INSTRUCTIVO PARA EL RECUENTO DE COLONIAS EN PLACAS DE PETRI
a) Las colonias bacterianas pueden tener distintas formas, a efectos de este instructivo, haremos referencia a las
frecuentemente observadas en los medios de recuentos totales (Por ej.: Plate Count, VRBD), aquí se observan
colonias de forma circular y del tamaño de la cabeza de un alfiler (pueden ser más pequeñas).
b) Las colonias características de un determinado género se describen en la marcha correspondiente (véase Staph.
Aureus Coagulasa (+), ó E. Coli, por ej.)
c) Se toma la placa de Petri, sin destaparla y se coloca en el contador de colonias (aparato dotado de luz y aumento
que permite visualizar con mayor nitidez las colonias). Si no se contara con un contador se toma la placa de Petri a
trasluz, de manera que se visualicen claramente las colonias.
d) Con una fibra de tinta indeleble, se marcan y se cuentan mentalmente todas las colonias separadas entre sí por
lo menos por una distancia equivalente al radio de una colonia, considerando cada una de éstas como una unidad.
e) Luego se multiplica el número absoluto de colonias contadas por la dilución de la siembra, obteniéndose así, la
cantidad de unidades formadoras de colonias por gramo. (Por Ej.: si se contaron 20 colonias de una dilución –1, se
multiplica por 10, es decir: 200 ufc/g).
7. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUA
a) Recuento de Bacterias Aerobias Mesófilas:
• Sembrar 1 ml de agua de la muestra en Plate Count, en Profundidad.
• Incubar en estufa 48 horas a 37ºC.
• Contar todas las colonias (ver instructivo para Recuento de colonias )
b) Determinación de Coliformes Totales:
• Sembrar en 3 tubos de caldo Mc Conkey doble concentración, 10 ml de agua.
• Sembrar en 3 tubos de caldo Mc Conkey simple concentración, 1 ml de agua.
• Sembrar en 3 tubos de caldo Mc Conkey simple concentración, 0,1 ml de agua.
• Incubar los tubos sembrados en estufa a 37º C durante 48 horas, luego observar en los tubos la formación de gas
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en campana de Durham (se observa una burbuja que ocupa un tercio de la campana) este resultado se interpreta
como positivo; en los que no se observa formación de gas se interpreta como negativo.
• Con los resultados, se lee en tabla de Hoskins el Numero más Probable (NMP) de Coliformes Totales.
c) Determinación de Coliformes Fecales:
• Los tubos que resultaron positivos para Coliformes Totales son repicados en caldo Mc Conkey de simple
concentración e incubados en Baño Termostático a 45º C durante 48 horas, luego observar en los tubos la
formación de gas en campana de Durham (se observa una burbuja que ocupa un tercio de la campana) este
resultado se interpreta como positivo; en los que no se observa formación de gas se interpreta como negativo.
• Con los resultados, se lee en tabla de Hoskins el Numero más Probable (NMP) de Coliformes Fecales.
d) Determinación de Escherichia Coli:
• Los tubos que resultaron positivos para Coliformes Fecales son sembrados en superficie en Agar Eosina Azul de
Metileno (E.M.B.), tomando una gota del tubo con Ansa de Punta redonda y siguiendo las instrucciones para
siembra .
• Incubar en estufa a 37º C durante 24 horas y observar en las Placas el crecimiento de colonias puntiformes con
brillo metálico, este resultado se interpreta como bacterias del Género de E. Coli. El diagnóstico debe confirmarse
con pruebas Bioquímicas.
e) Determinación de Pseudomona Auriginosa:
• Sembrar 1 ml de agua en 10 ml de Caldo Cerebro Corazón e incubar en estufa 24 hs. A 37 ºC, la formación de
turbidez en el medio se considera positivo, si el medio permanece límpido se considera negativo.
• El tubo positivo es sembrado en medio Plate Count en profundidad, y se incuba 24 horas a temperatura
ambiente, la presencia de Colonias verdosas se considera positivo.
8. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS PRE-ELABORADOS
• Se toman 20 g de la muestra, (ver instructivo de Siembra) y se colocan en un frasco con 180 ml. de Diluyente para
Salmonella.
• Homogeneizar agitando suavemente sin que el líquido contacte con la tapa.
• Incubar en estufa 10 minutos a 37º C.
NOTA: A efectos de este instructivo, de aquí en adelante, llamaremos “solución” a la muestra diluida,
homogeneizada e incubada en Medio de Pre-enriquecimiento.
a) Recuento de Bacterias Aerobias Mesófilos:
• Colocar 1ml de la solución en Placa estéril rotulada con la sigla “PC” en la base, y sembrar en profundidad.
• Incubar en estufa 48 horas a 37º C.
• Contar todas las colonias (ver instructivo para recuento de colonias )
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b) Recuento de Enterobacterias:
• Colocar 1ml de la solución en Placa estéril rotulada con la sigla “VRBD” en la base, y sembrar en profundidad.
• Contar todas las colonias (ver instructivo para recuento de colonias )
c) Determinación de Coliformes Totales:
• Colocar 1 ml. de solución en Caldo Brila.
• Incubar los tubos sembrados en estufa a 37º C durante 48 horas, luego observar en los tubos la formación de gas
en campana de Durham (se observa una burbuja que ocupa un tercio de la campana) este resultado se interpreta
como positivo; en los que no se observa formación de gas se interpreta como negativo.
• Con los resultados, se lee en tabla de Hoskins el Numero más Probable (NMP) de Coliformes Totales.
d) Determinación de Coliformes Fecales:
• Los tubos que resultaron positivos para Coliformes Totales son repicados en caldo Brila e incubados en Baño
Termostático a 45º C durante 48 horas, luego observar en los tubos la formación de gas en campana de Durham
(se observa una burbuja que ocupa un tercio de la campana) este resultado se interpreta como positivo; en los que
no se observa formación de gas se interpreta como negativo.
• Con los resultados, se lee en tabla de Hoskins el Numero más Probable (NMP) de Coliformes Fecales.
e) Determinación de Escherichia Coli:
• Los tubos que resultaron positivos para Coliformes Fecales son sembrados en superficie en Agar Eosina Azul de
Metileno (E.M.B.), tomando una gota del tubo con Ansa de Punta redonda y siguiendo las instrucciones para
siembra.
• Incubar en estufa a 37º C durante 24 horas y observar en las Placas el crecimiento de colonias puntiformes con
brillo metálico, este resultado se interpreta como bacterias del Género de E. Coli. El diagnóstico debe confirmarse
con pruebas Bioquímicas.
f) Determinación de Staphilococcus Aureus Coagulasa Positivo:
• Sembrar 0.1 ml de solución en Medio Baird Parker y esparcir en superficie con Pipeta Pasteur, hasta que el medio
absorba la solución.
• Observar la formación de colonias características puntiformes con un halo transparente que la rodea.
• Contar las colonias con estas características, y registrar el Nº como: Staphilococcus Aureus sp.
• Luego a estas colonias se les realiza la PRUEBA DE LA CATALASA:
a) Colocar en un portaobjetos una gota de Peróxido de hidrógeno (agua oxigenada),
b) Tomar con una ansa de punta una muestra de una colonia, también puede picarse de varias colonias pequeñas,
testeando un pool.
c) Luego colocar la punta del ansa sobre el portaobjeto de manera que contacte con la gota de peróxido de
Hidrógeno y observar la formación de Burbujas, si esto se observa se registra como Catalasa positivo (+). Si no se
forman burbujas se considera Catalasa negativo (-).
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Las colonias Catalasa (+) se siembran por método de estrías en agar manitol salado y se incuban en estufa 24 horas
a 37º C.
Se observa el viraje de color del área sembrada de rojo a amarillo (esta reacción se registra como manitol positivo
(+), si no vira de color se registra como manito negativo (-).
Las colonias Manitol (+), se toman de la placa de Agar Manitol, con ansa de punta redonda y se siembran en caldo
infusión cerebro corazón (CICC), incubándose en estufa 24 horas a 37º C.
Luego de la incubación se toman 0.2 ml de CICC sembrado y se colocan en 0.3 ml de plasma de conejo.
Se mantiene a temperatura ambiente y se observa a la media hora (30’) si el plasma coaguló, inclinando
suavemente el tubo; el coágulo debe permanecer inmóvil. (Importante: el movimiento del tubo debe ser suave
para no romper la fibrina que puede estar en formación).
Si no hubiera coagulado en los primeros 30’, dejar 4 horas (observando cada 30’) y si aún no hubiera coagulado
dejar 24 horas en estufa a 37º C.
Si el plasma permanece inmóvil se registra como coagulasa positivo (+) y se anota el tiempo que demoró en
coagular (30’, 60’ o 24 horas, etc.).
Si el plasma no coaguló se registra como coagulasa negativo (-).
f) Determinación de Presencia de Salmonella:
• La muestra con diluyente de Salmonella se incuba en estufa 24 horas a 37º C.
• Luego de la incubación se siembra 1 ml en Caldo Tetrationato, al que previamente a sembrar se le agregó 0.2 ml
de Ioduro de Potasio (KI).
• Incubar en Caldo Tetrationato , durante 24 hs. en Baño termostático a 44.5º C.
• Tomar una gota del caldo incubado con ansa de punta redonda y sembrar en Rambach Agar en superficie.
• Incubar en estufa durante 24 horas a 37º C.
• Observar la formación de colonias puntiformes Fucsias, este resultado se interpreta como bacterias del Género
de Salmonella. El diagnóstico debe confirmarse con pruebas Bioquímicas.
g) Recuento de Hongos y levaduras:
• Colocar 1ml de la solución en Placa estéril rotulada con la sigla “HL” en la base, y sembrar en profundidad.
• Incubar en estufa 5 días a 37º C.
• Contar todas las colonias (ver instructivo para recuento de colonias ).
9. FORMULACIÓN, TÉCNICA E INTERPRETACIÓN DE HISOPADOS EN SUPERFICIES DE CONTACTO Y PERSONAL
9.1. formulación y preparación del medio de pre-enriquecimiento
Se utilizará como medio de preenriquecimiento el siguiente:
Na2 HPO4
Na H2PO4
Peptona de carne
1,73g
0,93g
2,00g
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Agua destilada
200 ml
Calentar el agua destilada a baño María durante dos (2) minutos, luego agregar 1 x 1 los componentes sólidos de la
fórmula agitando con cuchara espátula constantemente. Dejar homogeneizar a baño María diez (10) minutos
agitando de vez en cuando.
9.2. Fraccionamiento del medio de pre-enriquecimiento
Colocar cinco (5) ml de la solución en tubos de ensayo sin rosca.
9.3. Preparación del hisopo
Al hisopo se le agrega en su nivel medio una porción de algodón formando un tapón, colocando el tapón-hisopo en
el tubo el que se cierra herméticamente (se sella) con papel aluminio.
Al colocar el tapón hisopo debe tenerse la precaución de no contar con el mismo el medio de pre-enriquecimiento
(el hisopo debe permanecer seco).
9.4. Esterilización en autoclave
Una vez finalizada la operación anterior se introduce en el autoclave para su esterilización adecuada (15 minutos a
1 atmósfera).
9.5. Preparación de la muestra (dilución, homogeneización, e incubación)
En el caso de los hisopos la dilución se realiza en el momento de la toma de la muestra.
•Sumergir sucesivamente el hisopo (4 veces, sin sacarlo del tubo), generando una agitación del diluyente para
obtener una distribución homogénea de la muestra.
•Incubar en estufa a 37 ºC durante 10 minutos.
•Sumergir el hisopo en el medio de preenriquecimiento antes de sembrar en los distintos medios de cultivo.
9.6. Siembra de la muestra:
9.6.1. Recuento de Bacterias Aerobias Mesófilos:
•Sembrar en superficie en Plate Count(PC)(ver instrucciones de siembra)
•Incubar en estufa 48 hs. A 37 ºC.
•Contar todas las colonias (ver instructivo para Recuento de colonias)
9.6.2. Recuento de Enterobacterias:
•Sembrar en superficie en Violeta Rojo Bilis Dextrosa (VRBD)(ver instrucciones de siembra)
•Incubar en estufa 24 hs. a 37 ºC.
•Contar todas las colonias (ver instructivo para Recuento de colonias)
9.6.3. Determinación de Coliformes Totales:
•Colocar 1 ml del caldo de Pre-enriquecimiento sembrado, en Caldo Brila.
•Incubar los tubos sembrados en estufa a 37 ºC durante 48 hs., luego observar en los tubos la formación de gas en
campana de Durham (se observa una burbuja que ocupa un tercio de la campana) este resultado se interpreta
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como positivo; en los que no se observa formación de gas se interpreta como negativo .
•Con los resultados, se lee en tabla de Hoskins el Numero más Probable (NMP) de Coliformes Totales.
9.6.4. Determinación de Coliformes Fecales:
•Los tubos que resultaron positivos para Coliformes Totales son repicados en caldo Brila e incubados en Baño
Termostático a 45 º C durante 48 hs., luego observar en los tubos la formación de gas en campana de Durham (se
observa una burbuja que ocupa un tercio de la campana) este resultado se interpreta como positivo; en los que no
se observa formación de gas se interpreta como negativo .
•Con los resultados, se lee en tabla de Hoskins el Numero más Probable (N.M.P.) de Coliformes Fecales.
9.6.5. Determinación de Escherichia Coli:
•Los tubos que resultaron positivos para Coliformes Fecales son sembrados en superficie en Agar Eosina Azul de
metileno (E.M.B.), tomando una gota del tubo con Ansa de Punta redonda y siguiendo las instrucciones para
siembra.
•Incubar en estufa a 37 º C durante 24 hs. y observar en las Placas el crecimiento de colonias puntiformes con brillo
metálico ,este resultado se interpreta como bacterias del Género de E. Coli el diagnóstico debe confirmarse con
pruebas Bioquímicas.
9.6.6. Determinación de Staphilococcus Aureus Coagulasa Positivo:
a) Sembrar en superficie en Medio Baird Parker.
b) Incubar en estufa 48 hs. a 37 º C.
c) Observar la formación de colonias características puntiformes con un halo transparente que la rodea.
d) Contar las colonias con estas características, y registrar el Nº como: Staphilococcus Aureus sp.
e) Luego a estas colonias se las somete a:
e1) Prueba de la Catalasa:
-Colocar en un portaobjetos una gota de Peróxido de hidrógeno (agua oxigenada).
-Tomar con una ansa de punta una muestra de una colonia, también puede picarse de varias colonias pequeñas,
evaluando un pool.
-Luego colocar la punta del ansa sobre el portaobjeto de manera que contacte con la gota de peróxido de
Hidrógeno y observar la formación de Burbujas, si esto se observa se registra como Catalasa positivo (+). Si no se
forman burbujas se considera Catalasa negativo (-).
e2) Identificación de Manitol Positivo (+):
Las colonias Catalasa (+) se siembran por método de estrías en Agar manitol salado y se incuban en estufa 24 hs. a
37 º C. Se observa el viraje de color del área sembrada de rojo a amarillo esta reacción se registra como manitol
positivo (+), si no vira de color se registra como manitol negativo (-).
e3) Enriquecimiento selectivo:
Las colonias Manitol (+) se toman de la placa de Agar Manitol, con ansa de punta redonda y se siembran en caldo
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infusión cerebro corazón (CICC), incubándose en estufa 24 Hs. a 37ºC.
e4) Prueba de la Coagulasa:
-Luego de la incubación se toman 0.2 ml de CICC sembrado y se colocan en 0.3 ml de plasma de conejo.
-Se mantiene a temperatura ambiente y se observa a la media hora (30`) si el plasma coaguló, inclinando
suavemente el tubo; el coágulo debe permanecer inmóvil, IMPORTANTE: el movimiento del tubo debe ser suave
para no romper la fibrina que puede estar en formación.
-Si no hubiera coagulado en los primeros 30`, dejar 4 horas (observando cada 30’), y si aún no hubiera coagulado
dejar 24 horas en estufa a 37º C.
-Si el plasma permanece inmóvil se registra como Coagulasa positivo (+) y se anota el tiempo que demoró en
coagular (30’,60’ o 24 hs., etc.).
-Si el plasma no coaguló se registra como coagulasa negativo (-).
(1)
10. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
La presencia de microorganismos en los alimentos no significa necesariamente un peligro para el consumidor o una
calidad inferior de estos productos. En realidad si se exceptúa el reducido número de alimentos esterilizados, cada
bocado de alimento contiene levaduras inocuas, hongos, bacterias y otros microorganismos.
Si los alimentos han estado sometidos a condiciones que pudiesen haber permitido la llegada y/o multiplicación de
agentes infecciosos o toxigénicos, pueden constituirse en vehículos de transmisión de Enfermedades de
Transmisión alimentaria (E.T.A.).
La puesta en evidencia de estos riesgos se basa en examen de muestras de alimentos, en busca de los propios
agentes causales o de indicadores de contaminaciones de distinto origen.
Debido a la complejidad para realizar la identificación de la numerosa serie de Microorganismos patógenos y sus
toxinas, se ha determinado la utilización de grupos o especies de microorganismos, cuya enumeración o recuento
es de mayor practicidad y facilidad, de manera que a concentraciones “X” en los alimentos, indican que los
productos estuvieron en condiciones de haber introducido organismos peligrosos y/o favorecido la multiplicación
de especies infecciosas o toxigénicas. A tales grupos se los denomina “MICROORGANISMOS INDICADORES”, y
sirven para evaluar tanto la seguridad que ofrecen los alimentos, como su calidad microbiológica.
10.1. recuento en placa de bacterias aerobias mesófilas
La mayoría de los alimentos industrializados (excepto los fermentados) deben considerarse como inadecuados
cuando contienen un gran número de microorganismos, aún cuando éstos no sean conocidos como patógenos o no
hayan alterado los caracteres organolépticos de los alimentos; debido a:
a) Recuentos altos en alimentos estables indican materias primas contaminadas o tratamiento sanitario
inadecuado, mientras que en los productos perecederos pueden indicar, además, condiciones inadecuadas de
almacenamiento (tiempo/temperatura).
b) Todas las bacterias patógenas transmitidas por los alimentos son mesófilas.
Interpretación: El fabricante de alimentos puede utilizar tales recuentos para evaluar la eficacia de la sanitización a
lo largo del proceso de industrialización.
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10.2. bacterias entéricas indicadoras
Familia Enterobacteriaceae (Enterobacterias)
En los alimentos que han recibido un tratamiento para garantizar su sanidad, la presencia de niveles considerables
de Enterobacteriaceae o de coliformes indica:
a) Tratamiento inadecuado y/o contaminación posterior al tratamiento, a través de materias primas, equipos
sucios o manejo no higiénico.
b) Multiplicación bacteriana que pudo haber permitido el crecimiento de toda la serie de microorganismos
patógenos y toxigénicos.
La presencia de E. Coli en un alimento no constituye una connotación directa de la presencia de un patógeno, sino
que implica únicamente un cierto riesgo de que pudiera estar presente. En otras palabras la presencia de E. Coli en
los alimentos no guarda siempre una estrecha correlación con la presencia de salmonelas o de otros
microorganismos patógenos.
Una práctica común es utilizar las pruebas para coliformes, que incluyen E. Coli, en los ensayos “screenig” o
preliminares. Si de estas pruebas iniciales se deduce la posibilidad de contaminación fecal, los coliformes u otras
Enterobacteriaceae se someten a posteriores estudios para determinar si entre ellos está presente E. Coli.
El término habitual de “coliformes” comprende E. Coli y diversas especies pertenecientes a otros géneros de la
familia Enterobacteriaceae. En la práctica los coliformes son los microorganismos que se detectan en las pruebas
para coliformes.
El término coliformes fecales ha surgido como un intento de encontrar métodos rápidos y confiables para
establecer la presencia de E. Coli y variantes estrechamente relacionados, sin necesidad de purificar los cultivos
obtenidos en las pruebas para coliformes o de aplicar las relativamente costosas pruebas confirmatorias (APHA y
col., 1976). Los “coliformes fecales” comprenden un grupo de microorganismos seleccionados por incubación de
los inóculos procedentes de un caldo de enriquecimiento de coliformes a temperaturas superiores a las normales
(44/45,5ºC dependiendo del método).
(1) ICMSF “Microorganismos de los alimentos I Técnicas de Análisis Microbiológicos”, Ed. Acribia – Segunda Edición.
Dr. César Augusto Lerena
Dr. Joaquín I. Lerena
Dra. Adriana Pereyra
Assistance Food Argentina S.A.
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Rev. 15.9.07
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E-mail: [email protected]
Dr. César Augusto Lerena, Dr. Joaquín Ignacio Lerena
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Reservados todos los derechos.
PERMITIDA LA REPRODUCCIÓN SIN MODIFICAR LOS FORMATOS, CONTENIDOS NI AUTORES.
Hecho el depósito que previene la Ley 11.723.
Registro de la Dirección Nacional del Autor. I.S.B.N. Nº 987-43-9749-7

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