DETERMINACION DE LA DOSIS LETAL 50 (DL50

Transcripción

DETERMINACIÓN DE LA DOSIS LETAL MEDIA (DL50) DE CINCO ESPECIES
DEL GÉNERO MICRURUS EN ESTADO DE CAUTIVERIO EN NILO –
CUNDINAMARCA (COLOMBIA)
SINDY MONJE BELMONTE
UNIVERSIDAD DE LA AMAZONIA
FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
PROGRAMA DE BIOLOGIA CON ENFASIS EN BIORECURSOS
FLORENCIA – CAQUETÁ
2.007
1
DETERMINACIÓN DE LA DOSIS LETAL MEDIA (DL50) DE CINCO ESPECIES
DEL GÉNERO MICRURUS EN ESTADO DE CAUTIVERIO EN NILO –
CUNDINAMARCA (COLOMBIA)
SINDY MONJE BELMONTE
Trabajo de grado presentado como Requisito
parcial para optar al Título de
Biólogo con Énfasis en Biorecursos
DIRECTORA
Marta Gómez Cabal
Bióloga MSC Biología Vegetal
Directora de Investigación y
Desarrollo Laboratorios Probiol
ASESORA
Claudia Martínez Cárdenas
Bióloga, Bacterióloga, Microbióloga, Esp.Epidemiología
Directora de Aseguramiento de Calidad
Laboratorios Probiol S.A.
UNIVERSIDAD DE LA AMAZONIA
FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
PROGRAMA DE BIOLOGIA CON ENFASIS EN BIORECURSOS
FLORENCIA - CAQUETA
2.007
2
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 18 del Acuerdo No 026 de Diciembre de 2.001: “El director y los
jurados del trabajo de grado no son responsables de las ideas y
conclusiones expuestas en el trabajo, ellas son exclusividad de su autor”
3
Nota de aceptación
______________________________
______________________________
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Presidente del Jurado
______________________________
Jurado
______________________________
Jurado
Florencia, Mayo de 2007
4
DEDICATORIA
Dedico en especial este trabajo a la memoria de mi Abuela Nazarea Quimbay de
Belmonte, a mis Padres Stella Belmonte de Monje, Felix Eney Monje Pena; mi
Hermano Osman Monje Belmonte, las personas que más amo, porque sin su
apoyo espiritual constante no habría alcanzado mis logros.
A Juan Manuel Suarez Tezna, la persona con la que he compartido este corto
tiempo mi corazón y me ha brindado su amor incondicional en buenos y malos
momentos.
A los doctores Marta Gómez Cabal, Clemencia Gómez Cabal, Alberto Gómez
Cabal, Claudia Martínez Cárdenas, Jairo Maldonado y Héctor Charry por su
amistad desinteresada y su asesoría en el área de la Biología y Toxinología de las
serpientes presentes en Colombia.
A todo el equipo de trabajo del Laboratorios Probiol S.A., en especial a Blanca
Grajales, Marisol Giraldo, Nelson Díaz, y Sonia Lancheros, por brindarme una
estadía cálida y servicio.
A mis profesores de la Universidad de la Amazonia y mis mejores compañeros de
carrera y amigos, por incentivar mi espíritu de investigación y acompañarme
durante todo el transcurso de la misma.
5
AGRADECIMIENTOS
•
A Marta Gómez Cabal, directora de esta investigación, quien siempre estuvo
presente y atenta al progreso de mi trabajo para guiarme en mi aprendizaje
como una gran maestra y mostrarme las maravillas de la Biología.
•
A Claudia Martínez Cárdenas, asesora de esta investigación, quien me
acompañó en la fase final de muestreo y en el análisis estadísitico de las
pruebas de seroneutralización.
•
A Clemencia Gómez, Alberto Gómez Cabal y Maria Clara Gómez Cabal, por su
amistad incondicional y hospitalidad.
•
A Jairo Maldonado, por su invaluable apoyo en la fase de campo realizada en
el Serpentario del Parque Recreacional y Zoológico Piscilago, su enseñanza en
el área de Biología, Manipulación y Taxonomía de las serpientes del género
Micrurus lo cual permitió que se llevara a cabo parte de el proyecto.
•
A Héctor Charry, por sus asesorías en el desarrollo del proyecto, en el área de
Biología y Toxinología experimental de las serpientes del género Micrurus.
•
A Fernando Ortíz y Gloria Elena Estrada, jurados de esta investigación, por sus
correcciones y sugerencias en el desarrollo y presentación final de la
investigación.
6
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
RESUMEN .............................................................................................................17
ABSTRACT ...........................................................................................................18
1. INTRODUCCIÒN ...............................................................................................19
2. PROBLEMA ......................................................................................................21
3. JUSTIFICACIÒN ...............................................................................................23
4. OBJETIVOS ......................................................................................................24
4.1 OBJETIVO GENERAL:.................................................................................24
4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS: .......................................................................24
5. REVISION DE LITERATURA ............................................................................25
5.1 Clasificación Taxonómica.............................................................................25
5.2 Características generales de la especie Micrurus sp. ..................................25
5.2.1 Morfología y Fisiología general .................................................................26
5.2.2 Hábitat y comportamientos ....................................................................26
5.2.3 Tipo de alimentación y reproducción .....................................................27
5.3 Distribución Geográfica de las Micrurus en estudio .....................................27
5.3.1 Micrurus surinamensis surinamensis, (Cuvier, 1.817) ..........................27
5.3.2 Micrurus mipartitus, (Duméril, Bibron y Duméril, 1.854)........................28
5.3.3 Micrurus isozonus, Cope, 1.860 ...........................................................28
5.3.4 Micrurus dumerilii, (Griffin, 1.916) ..........................................................29
5.3.5 Micrurus medemi, (Roze, 1.967)............................................................29
5.4 Venenos Ofídicos .........................................................................................30
5.4.1 Venenos micrúricos ...............................................................................30
5.4.2 Dosis Letal Media de los venenos Elapídicos en Colombia...................31
5.5 Accidente Ofídico por corales en Colombia..................................................32
5.5.1 Clasificación del Accidente Ofídico ........................................................33
5.6 Seroterapia en Accidentes ofídicos por Micrurus .........................................33
5.6.1 Dosis Efectiva Media del Suero Antielapídico Probiol frente a los
venenos Micrúricos.........................................................................................34
5.6.2 Producción de Suero Antiofídico Antielapídico en Colombia .................36
6. METODOLOGIA................................................................................................39
6.1 Fase de Campo............................................................................................39
6.1.1 Área de Estudio .....................................................................................39
6.1.2 Obtención de los Venenos Micrúricos....................................................40
6.1.3 Extracción de Veneno............................................................................40
6.1.5. Preparación de las Muestras de los Venenos Micrúricos .....................41
6.2 Fase Experimental .......................................................................................41
6.2.1 Animales Experimentales ......................................................................41
6.2.2 Ensayos Preliminares ............................................................................42
7
6.2.3 Dosis Letal Media DL50 (OMS, 1981) ....................................................42
6.2.3.1 Validez de la Prueba ......................................................................43
6.2.4 Dosis Efectiva Media DE50 .....................................................................44
6.2.4.1 Validez de la Prueba .......................................................................46
6.3. Condiciones Experimentales .......................................................................46
6.3.1 Condiciones de Mantenimiento..............................................................46
6.3.2 Grupo Control Positivo...........................................................................46
6.3.3 Grupo Control Negativo .........................................................................47
7. RESULTADOS ..................................................................................................48
7.1 Aspectos Biológicos .....................................................................................48
7.1.1 Micrurus surinamensis surinamensis, Cuvier (1.817) ............................48
7.1.2 Micrurus mipartitus, Duméril y Bibrón (1.854).......................................49
7.1.3 Micrurus isozonus , Cope (1.860) ..........................................................51
7.1.4 Micrurus dumerilii , Griffin (1.916) .........................................................52
7.1.5 Micrurus medemi, Roze (1.967).............................................................53
7.2 Dosis Letal Media (DL50 )..............................................................................55
7.2.1 DL50 para Micrurus surinamensis surinamensis.....................................55
7.2.2 DL50 para Micrurus mipartitus ................................................................58
7.2.3 DL50 para Micrurus isozonus..................................................................61
7.2.4 DL50 para Micrurus dumerilii ..................................................................64
7.2.5 DL50 para Micrurus medemi ...................................................................67
7.3 Dosis efectiva Media (DE50) .........................................................................70
7.3.1 DE50 para el Veneno de Micrurus surinamensis neutralizado por un Lote
Piloto de Suero Anticoral AC-OO5..................................................................70
7.3.2 DE50 para el Veneno de Micrurus mipartitus neutralizado por un Lote
7.3.3. DE50 para el Veneno de Micrurus isozonus neutralizado por un el Lote
7.3.4. DE50 para el Veneno de Micrurus dumerilii neutralizado por un el Lote
7.3.5 DE50 para el Veneno de Micrurus medemi neutralizado por un el Lote
8. ANALISIS DE RESULTADOS...........................................................................76
8.1 Aspectos Biològicos .....................................................................................76
8.1.1 Micrurus surinamensis surinamensis .....................................................76
8.1.2 Micrurus mipartitus.................................................................................76
8.1.3 Micrurus isozonus ..................................................................................77
8.1.4 Micrurus dumerilii...................................................................................78
8.1.5 Micrurus medemi ...................................................................................79
8.2 Dosis Letal Media (DL50) ..............................................................................79
8.2.1 (DL50) para Micrurus surinamensis surinamensis ..................................79
8.2.2 (DL50) para Micrurus mipartitus..............................................................80
8.2.3 (DL50) para Micrurus isozonus ...............................................................80
8.2.4 (DL50) para Micrurus dumerilii ................................................................80
8.2.5 (DL50) para Micrurus medemi.................................................................81
8
8.3 Dosis Efectiva Media (DE50) ........................................................................81
8.3.1 DE50 del Suero Antiofidico Anticoral Polivalente Liofilizado frente al
veneno de la especie Micrurus surinamensis .................................................81
veneno de la especie Micrurus mipartitus.......................................................82
veneno de la especie Micrurus isozonus. .......................................................82
veneno de la especie Micrurus dumerilii. ........................................................82
veneno de la especie Micrurus medemi. ........................................................82
9. CONCLUSIONES ..............................................................................................83
10. RECOMENDACIONES....................................................................................85
BIBLIOGRAFIA .....................................................................................................86
ANEXOS................................................................................................................93
9
LISTA DE CUADROS
Pág.
Cuadro 1. Dosis Letal Media DL50 Comparativas de los venenos Micrúricos
de algunas especies de la Amazonia ColombianaCuadro 2. Dosis Efectiva
Media (Otero, 1.994)
32
Cuadro 2. Dosis Efectiva Media (Otero, 1.994)
34
Cuadro 3. Dosis Efectiva Media de los venenos micrùricos (Charry, 2.006)
35
Cuadro 4. Dosificación con veneno Micrúrico
36
Cuadro 5. Casos Atendidos conSuero Anticoral Figura 2. Área de Estudio
(Nilo – Cundinamarca) Mapa Aéreo
38
Cuadro 6. Distribucion de los Venenos en Tubos Plásticos de Colores
41
Cuadro 7.Características morfométricas de los ejemplares de la especie M.
surinamensis
49
Cuadro 8. Cantidad de veneno obtenida durante el tiempo de estudio en
miligramos para la especie M. s.surinamensis
49
Cuadro 9. Características morfométricas de los ejemplares de la especie
Micrurus mipartitus
50
miligramos para la especie M. mipartitus
50
M.isozonus
52
miligramos para la especie M.isozonus
52
M. dumerilii
53
miligramos para la especie M.dumerilii.
53
10
M. mipartitus
54
miligramos para la especie M. medemi
55
Cuadro 17. Ensayos preliminares para la determinación de la Dosis letal
Media para el Veneno Micrurus surinamensis
55
Cuadro 18. Pruebas finales para la determinación de la dosis letal media
para el Veneno Micrurus surinamensis
56
Cuadro 19. Ensayos preliminares para la determinación de la dosis letal
media para el Veneno Micrurus mipartitus
58
para el Veneno Micrurus mipartitus
59
media para el Veneno Micrurus isozonus
61
para el Veneno Micrurus isozonus
62
media para el veneno Micrurus dumerilii
64
para el veneno Micrurus dumerilii
65
media para el veneno Micrurus medemi
67
para el veneno Micrurus medemi
68
Cuadro 27. Determinación de la DE50 del Suero Antimoral frente al veneno
Micrurus surinamensis
70
Cuadro 28. Determinación de la dosis efectiva media (DE50) para el veneno
Micrurus mipartitus probando la efectividad del el suero antiofidico anticoral
polivalente liofilizado Lote piloto AC-005 producido por Laboratorios Probiol
S.A. (Técnica utilizada por el Instituto Clodomiro Picado)
71
11
Cuadro 29. Determinación de la dosis efectiva media (DE50) para el Veneno
Micrurus isozonus frente al suero antiofidico anticoral polivalente liofilizado
Lote piloto AC-005 de producido por Laboratorios Probiol S.A. (Técnica
utilizada por el Instituto Clodomiro Picado)
72
Micrurus dumerilii frente al suero antiofidico anticoral polivalente liofilizado
Lote piloto AC-005 producido por Laboratorios Probiol S.A. (Técnica
73
Micrurus medemi frente al Suero Antiofidico Anticoral Polivalente Liofilizado
Lote piloto AC-005 producido por Laboratorios Probiol S.A. (Técnica
74
Cuadro 32. Efectividad del Suero Antiofídico Antimoral Lote Piloto: AC – 005
frente a cinco Lotes de veneno del género Micrurus sp.
75
12
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Análisis de la Producción de Suero Anticoral
37
Figura 2. Área de Estudio (Nilo – Cundinamarca) Mapa Aéreo
39
Figura 3. Método de Extracción del veneno Micrúrico
40
Figura 4. Dosis Letal Media (DL50)
43
Figura 5. Dosis Efectiva Media (DE50)
45
Figura 6. Micrurus surinamensis surinamensis, Cuvier (1.817)
48
Figura 7.Micrurus mipartitus, Duméril y Bibrón (1.854)
50
Figura 8. Micrurus isozonus, Cope (1.860)
51
Figura 9. Micrurus dumerilii, Griffin (1.9169)
53
Figura 10. Micrurus medemi, Roze 81.967)
54
13
LISTA DE GRÁFICAS
Pág.
Gráfica 1. Curva de la dosis letal media del veneno Micrurus surinamensis
en estado de cautiverio en Nilo - Cundinamarca
57
Gráfica 2. Curva de la dosis letal media del veneno Micrurus mipartitus en
estado de cautiverio en Nilo - Cundinamarca
60
Gráfica 3. Curva de la dosis letal media del veneno Micrurus isozonus en
63
Gráfica 4. Curva de la dosis letal media del veneno Micrurus dumerilii en
66
Gráfica 5. Curva de la dosis letal media del veneno Micrurus medemi en
69
Gráfica 6. Curva de la dosis efectiva medio (DE50) para el veneno Micrurus
surinamensis frente al suero antiofidico anticoral polivalente liofilizado Lote
piloto AC-005 producido por Laboratorios Probiol S.A. (Técnica utilizada
por el Instituto Clodomiro Picado)
70
Gráfica 7. Curva de la dosis efectiva media (DE50) para el veneno Micrurus
mipartitus frente al suero antiofidico anticoral polivalente liofilizado Lote
piloto AC-005 producido por Laboratorios Probiol S.A.
71
isozonus frente al suero antiofidico anticoral polivalente Liofilizado Lote
piloto AC-005 producido por Laboratorios Probiol S.A.
72
dumerilii frente al Suero antiofidico Anticoral Polivalente Liofilizado Lote
piloto AC-005 de Laboratorios Probiol S.A.
73
Gráfica 10. Curva de la dosis efectiva media (DE50) para el veneno
Micrurus medemi frente al Suero Antiofidico Anticoral Polivalente
Liofilizado Lote piloto AC-005 de Laboratorios Probiol S.A.
74
14
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Clasificación Taxonómica de las Micrurus en estudio
25
Tabla 2. Dentición de la familia Elapidae, (Soerensen, 1.990)
26
Tabla 3. Dosis Letal Media de venenos de serpientes Colombianas
30
Tabla 4. Clasificación Taxonómica Micrurus surinamensis
48
Tabla 5. Clasificación Taxonómica Micrurus mipartitus
49
Tabla 6. Clasificación Taxonómica Micrurus isozonus
51
Tabla 7. Clasificación Taxonómica Micrurus dumerilii
52
Tabla 8. Clasificación Taxonómica Micrurus medemi
54
15
LISTA DE ANEXOS
Pág.
ANEXO A. FICHA DE ASPECTOS BIOLOGICOS DE LAS ESPECIES EN
ESTUDIO
94
ANEXO B. UTILIZACIÓN DE ANIMALES DE LABORATORIO EN LA
EXPERIMENTACIÓN BIOLÓGICA
107
ANEXO C. CARACTERISTICAS GENERALES DE LOS BIOMODELOS
118
ANEXO D. FORMATO PRUEBA DOSIS LETAL MEDIA
119
ANEXO E. FORMATO PRUEBA DOSIS EFECTIVA (DE50)
121
ANEXO F. MATERIALES
122
ANEXO G ANÁLISIS ESTADÍSTICOS PARA DETERMINAR LA DL50 Y
DE50
124
16
RESUMEN
Se calculó la dosis letal media (DL50) del veneno de las serpientes anteriormente
mencionadas en estado de cautiverio en Nilo – Cundinamarca (Colombia),
inoculando ratones albinos de la especie Mus musculus por vía intraperitoneal de
17 – 19 gramos. Se evaluaron dosis ascendentes de veneno desde 100 hasta 600
µg/ por ratón, sometiéndoles a un periodo de observación 24 – 48 horas postinoculación. La (DL50) obtenida para las especies de Micrurus sp. de forma
ascendente de mayor a menor toxicidad: Micrurus mipartitus de 5.53 µg/ratón <
Micrurus dumerilii de 8.83 µg/ratón < Micrurus surinamensis de 13.50 µg/ratón <
Micrurus isozonus de 28.92 µg/ratón < Micrurus medemi de 47.1 µg/ratón.
Posteriormente se evaluó la efectividad de un Lote Piloto: AC-005 de suero
antiofídico antielapídico liofilizado producido por Laboratorios Probiol S.A. de
Colombia frente a la toxicidad de cinco lotes de venenos utilizados, demostrando
que el suero anticoral es polivalente y neutraliza de la misma forma los diferentes
venenos en estudio sin importar la especie, estando en una relación de 0.3 mg/ml.
La (DE50) del suero valorado en relación con los venenenos de la especie Micrurus
surinamensis es de 1.021 mg/ml, Micrurus mipartitus es de 0.8 mg/ml, Micrurus
isozonus es de 1.28 mg/ml, Micrurus dumerilii es de 1.16 mg/ml y Micrurus
medemi es de 1.55 mg/ml., utilizando ratones albinos de la especie Mus musculus
con pesos de 20 -22 gramos, inoculándolos por vía intraperitoneal.
Se determinó que existe intima relación entre la dosis de veneno, la dosis efectiva
de suero antiofídico y su efecto, siendo notable la sensibilidad de los animales y la
reproducibilidad de los experimentos, para las pruebas de letalidad y potencia.
17
ABSTRACT
There was calculated the lethal average dose (DL50) of the poison of the serpents
previously mentioned in condition of captivity in Nilo - Cundinamarca (Colombia),
inoculating albino mouse of the species Mus musculus for route intraperitoneal with
17 - 19 grams. Ascending doses of poison were evaluated from 100 - 600 µg/by
mouse, submitting to a period of observation 24 - 48 hours post-inoculation. The
(DL50) obtained for the species of Micrurus sp. of ascending form of bigger than
minor toxicity: Micrurus mipartitus of 5.53 µg/mouse <Micrurus dumerilii of 8.83
µg/mouse <Micrurus surinamensis of 13.50 µg/mouse <Micrurus isozonus of 28.92
µg/mouse <Micrurus medemi of 47.1 µg/mouse.
Later there was evaluated the efficiency of a Pilot Lot: AC-005 of whey antiofídico
antielapídico lyophilized produced by Laboratories Probiol S.A. of Colombia
opposite to the toxicity of five lots of used poisons, demonstrating that the whey
anticoral is polyvalent and neutralizes of the same form the different poisons in
study without importing the species, being in a relation of 0.3 mg/ml. The (DE50) of
the whey valued for relation with the venenenos of the species Micrurus
surinamensis is of 1.021 mg/ml, Micrurus mipartitus is of 0.8 mg/ml, Micrurus
isozonus is of 1.28 mg/ml, Micrurus dumerilii is of 1.16 mg/ml and Micrurus
medemi is of 1.55 mg/ml., using albino mouse of the species Mus musculus with
weight of 20-22 grams, inoculating them for route intrperitoneal.
One determined that intimate relation exists between the dose of poison, the
effective dose of whey antiofídico and his effect, being notable the sensibility of the
animals and the reproducibilidad of the experiments, for the tests of lethal and
promoting.
18
1. INTRODUCCIÒN
Colombia debido a sus propiedades geográficas, es uno de los diez países con
mayor diversidad de vertebrados, con 2.890 especies de las cuales 520 son
reptiles. Representan el 6% del total de las especies del mundo, que lo posicionan
en el tercer lugar del planeta, con 97 especies de reptiles endémicas y 20
especies de reptiles en peligro de extinción, datos reportados por la Asociación
Colombiana de Parques Zoológicos, Acuarios en el 2.003 y el Fondo para la
Acción Ambiental, quienes afirman que así como Colombia posee una gran
biodiversidad, también presenta una enorme vulnerabilidad en sus 99
ecosistemas.
Dentro de la clase Reptilia (reptiles), orden Squamata (escamosos), suborden
Serpentes (serpientes), se distribuyen en 9 familias las serpientes en Colombia, de
las cuales solo tres familias son venenosas: Viperidae (Víboras); Elapidae (Rabo
de ají, Corales) y Colubridae (Cazadoras, culebras comunes) pero solo las dos
primeras son de gran importancia médica debido a la toxicidad de sus venenos;
una de ellas es la familia Elapidae (serpientes corales o de anillos).
Taxonómicamente se han propuesto varias teorías para clasificar las corales, pero
debido a que la taxonomía es una ciencia inexacta, que se encuentra en
constantes reevaluaciones y cambios, el número de especies para Colombia varía
según el autor. Para Colombia la familia Elapidae, con el género Micrurus (Wagler,
1.824), Roze señala 13 especies en 1.966; Peters registra 14 en 1.986; 20
especies según Campbell y Lamar en 1.989; Juan Jose Silva en 1.994 reporta
para la Amazonia Colombiana 10 taxones del género Micrurus, subfamilia
Elapinae, entre especies y subespecies válidas; Orlando Chaparro en el 2.000
afirma que el país representa uno de los centros de dispersión más importantes
del grupo con más de 28 especies del género Micrurus y una del género
Leptomicrurus (Schmidt,1.937), distribuidas en todo el territorio colombiano, desde
el nivel del mar hasta los 2.400 m.s.n.m.; Daniel Pineda en el 2.002 publicó en el
libro “Accidentes por animales venenosos” que la familia Elapidae tiene dos
géneros para Colombia, Micrurus, conformado por 22 especies y Pelamis con una
sola especie; 28 especies en el 2.006 por Jairo Maldonado distribuidas en 3
géneros Pelamis, Leptomicrurus y Micrurus; y considerando que algunos
herpetólogos como Héctor Charry en el 2.006 incluyen el género Leptomicrurus
como parte del género Micrurus, subfamilia Elapinae, con 22 especies. Esta
extraordinaria diversidad hace que Colombia ocupe el tercer puesto en número de
especies de coral después de México y Brasil.
19
Los venenos de las serpientes corales de la familia Elapidae, tienen acción
predominantemente neurotóxica y algunos cardiotóxicos. La mayoría de estos
venenos tienen actividad de bloqueo postsináptico y en minoría una actividad de
bloqueo presináptico, producto de la acción de fosfolipasas A2 que afectan esta
terminal (Charry, 2.006). La actividad de las neurotoxinas actúan bloqueando la
transmisión del impulso nervioso sobre los diferentes órganos, lo cual juega un
papel importante en la acción letal de los venenos de estas serpientes, que han
sido estudiados no sólo con el objetivo de mejorar la calidad y eficacia de los
antivenenos (sueros monovalentes y polivalentes) en el diagnóstico y tratamiento
de las mordeduras, sino también en estudios comparativos de los componentes de
esos venenos, sus reacciones inmunológicas, evolutivas haciendo una gran
contribución científica a la biología y estimulando el interés científico en
posteriores estudios (Chaparro, 2.000).
En el estudio toxinológico desde el punto de vista farmacológico, la dosis letal
media de los venenos micrúricos (serpientes coral) y la dosis efectiva media de los
antivenenos frente a los venenos, es primordial en el estudio de la neutralización
del poder tóxico de los mismos por un suero antiofídico antielapídico específico o
polivalente dependiendo de el método que se utilice. Uno de los métodos para
analizar la toxicidad de un veneno es la dosis letal media (DL50), definiéndose
como aquella sustancia tóxica (veneno elapídico) expresada en miligramos por
kilogramos de peso corporal (animales inoculados de la especie Mus musculus)
capaz de matar el 50% de los animales inoculados, en un periodo de tiempo
determinado, que usualmente es de 24 a 48 horas postinoculación (Martínez,
2.004).
Por lo anterior y considerando que para Colombia existen datos deficientes de la
biología y toxinología experimental de los venenos de las serpientes Micrurus sp.,
el objetivo de este proyecto de investigación fue determinar la dosis letal media
(DL50) de cinco especies de corales a saber: Micrurus surinamensis surinamensis,
(Cuvier, 1.817); Micrurus mipartitus, (Duméril Bibron y Duméril, 1.854); Micrurus
isozonus, (Cope, 1.860); Micrurus dumerilii, (Griffin, 1.916) y Micrurus medemi,
(Roze, 1.967); en estado de cautiverio en el Parque Recreacional y Zoológico
Piscilago ubicado en el Municipio de Nilo, Departamento de Cundinamarca,
Colombia.
Con la determinación de la dosis letal media de las cinco especies de corales en
estudio, se realizó posteriormente la prueba de seroneutralización para determinar
la dosis efectiva media (DL50), es decir la capacidad o potencia neutralizante
efectiva media del Suero Antiofídico AntiElapídico (Lote Piloto Número AC – 005)
fabricado por Laboratorios Probiol S.A. para neutralizar un Pool de venenos de las
cinco especies de Micrurus sp en estudio.
20
2. PROBLEMA
Las serpientes son reptiles que han sido culturalmente el grupo de vertebrados
que más rechazo causa a las personas. A su alrededor existen mitos y leyendas
perpetuadas por la humanidad, como la creencia de que las serpientes corales
(Micrurus) muerden por la cola. Estas son fantasías que se construyen en
respuesta al desconocimiento acerca de su verdadera naturaleza, sin rescatar el
importante papel que juegan en los ecosistemas, regulando poblaciones de
insectos, mamíferos, aves, anfibios y hasta reptiles incluyendo serpientes (Galvis,
2.005).
Taxonómicamente se han propuesto varias teorías para clasificar las corales, pero
debido a que la taxonomía es una ciencia inexacta, que se encuentra en
constantes reevaluaciones y cambios, el número de especies para Colombia varía
según el autor.
En la serie de libros rojos de especies amenazadas de Colombia no se están
teniendo en cuenta las serpientes y se presenta solo una de las especies
Eunectes marinus comúnmente conocida como anaconda con datos deficientes,
corroborando el gran desconocimiento de la biología de los ofidios.
Otras amenazas que ponen en riesgo la perpetuidad de las serpientes es el
deterioro del hábitat, la persecución y muerte indiscriminada por el hombre a
causa del miedo irracional que hace que dificulten los estudios de estos taxones.
Es claro que no podrán sobrevivir sin nuestra ayuda, y su extinción es la pérdida
de un eslabón en la cadena trófica que puede llevar a un desequilibrio ecológico.
Las corales causan el 2.9% (Martínez, 2.006) del total de los accidentes ofídicos
en Colombia y debido a la falta de información epidemiológica confiable, según el
Ministerio de Protección Social, en Colombia se producen 4.000 accidentes al año
por mordedura de serpiente, 40 son por corales, donde las principales víctimas
son los niños.
A pesar de que la incidencia de mordedura de serpientes de coral sea baja,
considerando el gran número de especies y su gran distribución en Colombia,
cuando ocurre, se considera grave, ya que el accidente ofídico por Micrurus se
maneja clínicamente como una intoxicación y los principales efectos del veneno de
estas serpientes son la parálisis flácida en la víctima, por lo cual ocasiona un paro
cardiorrespiratorio y finalmente la muerte, sino es tratado clínicamente en las
primeras horas con un Suero Antiofídico Anticoral (Gómez, 2.006)
21
El estudio toxinológico de los venenos de las serpientes presentes en Colombia,
especialmente de la familia Elapidae (corales), se desconoce total o parcialmente,
ya que solo se han determinado las dosis letales medias para las Micrurus
presentes en la Amazonia Colombiana y no existe reporte de las dosis letales de
las Micrurus del centro del país como la especie Micrurus mipartitus, de
importancia médica, causante de una gran cantidad de accidentes en la región
Andina del país.
22
3. JUSTIFICACIÒN
Este trabajo es importante para hacer un aporte de tipo científico a la biología y
toxinología de las serpientes corales (Micrurus), haciendo especial énfasis en la
importancia de su conservación y la caracterización de los venenos de cinco
especies a saber: Micrurus surinamensis surinamensis, (Cuvier, 1.817); Micrurus
mipartitus, (Duméril Bibron y Duméril, 1.854); Micrurus isozonus, (Cope, 1.860);
Micrurus dumerilii, (Griffin, 1.916) y Micrurus medemi, (Roze, 1.967), presentes en
Colombia. Teniendo en cuenta que es el tercer país con mayor especies de coral
de Latinoamérica, después de Brasil y México; actualmente están reportadas 29
especies de serpientes del género Micrurus (corales, rabo de ají, rabo de candela)
según Campbell y Lamar (2.004) con una amplia distribución geográfica en el
territorio nacional.
En el presente estudio se determinó la dosis letal media (DL50), que se utilizaron
para encontrar los umbrales de toxicidad, para cada uno de los cinco venenos en
estudio. Así mismo la verificación de que el suero antiofídico anticoral polivalente
liofilizado producido por Laboratorios Probiol S.A. posee una adecuada capacidad
de neutralización frente a cada uno de los venenos de las especies Micrurus sp.
mencionadas anteriormente como objeto de estudio.
En el desarrollo de los sueros antiofídicos, es muy importante establecer las dosis
letales medias de las diferentes especies de serpientes, para luego conocer la
eficiencia de los sueros antiofídicos. Por eso la Organización Mundial de la Salud
(OMS) recomienda que es necesario establecer en cada país sus propios
parámetros para la producción y regulación de los antivenenos, aceptando que es
necesario un procedimiento donde se compruebe el estado letal de cada lote de
veneno utilizado (DL50) y posteriormente se confirme la potencia neutralizante de
cada lote de antivenenos con la dosis efectiva media (DE50). (UPS, 2.000).
La dosis letal media de los venenos ofídicos y la dosis efectiva media, prueba de
potencia, prueba de seroneutralización o titulación de un suero antiofídico, están
definidas por la OMS como uno de los principales procedimientos que se tienen en
cuenta al momento de evaluar la calidad de los antivenenos, gracias a que con
estas pruebas se determina la cantidad de veneno en mililitros capaz de matar al
50% de la población inoculada, indispensable a su vez para determinar la cantidad
de veneno en miligramos que son neutralizados por un mililitro de suero. Esta
razón convierte a la dosis efectiva media en la herramienta médica más práctica
para la dosificación más acertada del antiveneno (BP, 1.973).
23
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL:
Determinar la dosis letal media (DL50) de cinco especies de la familia Elapidae,
género Micrurus sp., mantenidas en cautiverio en el Parque Recreacional y
Zoológico de Piscilago en el Municipio de Nilo, Departamento de Cundinamarca
(Colombia).
4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS:
•
Identificar algunos aspectos biológicos del manejo de las cinco especies de
Micrurus sp. en estado de cautiverio, como la identificación taxonómica,
categoría de amenaza (UICN, Apéndice Cites), sexo, edad aproximada,
condiciones físicas, morfometría (longitud total, longitu cola), distribución
geográfica, hábitat, comportamiento de la especie en cautiverio,
manipulación y transporte.
•
Determinación de la Dosis Letal Media (DL50) de los venenos de las cinco
especies de Micrurus sp. presentes en Colombia:
1.
2.
3.
4.
5.
Micrurus surinamensis surinamensis, Cuvier, 1.817
Micrurus mipartitus, Duméril, Bibrón y Duméril, 1.854
Micrurus isozonus, Cope, 1.860
Micrurus dumerilii, Griffin, 1.916
Micrurus medemi, Roze, 1.967
•
Identificar las diferencias que presentan los resultados de la dosis letal
media (DL50) de los venenos de las cinco especies de Micrurus sp.
anteriormente nombradas.
•
Realizar una prueba de efectividad del suero antiofídico antielapídico
polivalente liofilizado (Lote pioto: AC – 005) fabricado por Laboratorios
Probiol S.A. frente a cada uno de los venenos de las cinco especies de
Micrurus sp. en estudio.
24
5. REVISION DE LITERATURA
5.1 Clasificación Taxonómica
Tabla 1. Clasificación Taxonómica de las Micrurus en estudio
CLASIFICACIÓN
Reino: Animalia
Phylum: Cordata
Subphylum: Vertebrata
Clase: Reptilia
Orden: Squamata (escamosos)
Suborden: Ofidios, Serpentes
Familia: Elapidae
Subfamilia: Micrurinae
Género: Micrurus
Especie: Micrurus surinamensis surinamensis, Cuvier, 1.817
Micrurus mipartitus, Duméril, Bibron y Duméril, 1.854
Micrurus isozonus, Cope, 1.860
5.2 Características generales de la especie Micrurus sp.
Las serpientes del género Micrurus son reptiles que carecen de extremidades; en
términos generales son de tamaño mediano y pequeño, la mayoría de las
especies muestra proporciones con tendencia a ser muy delgadas; su cuerpo está
cubierto por escamas lisas (Charry, 2.006); son conocidas popularmente con el
nombre de corales, serpientes de anillos, rabo de ají, rabo de candela, cabeza de
chocho, entre otros nombres vulgares dependiendo de la ubicación geográfica.
Se caracterizan en general por su diseño (cuerpo adornado con anillos que lo
circundan completamente, que se disponen según la especie en tríadas o pares) y
su patrón de coloración (rojo, negro, blanco, amarillo) a excepción de algunas
especies (M.scutiventris y M.karlschmidti), incluídas para algunos autores en el
género Leptomicrurus (Schmidt, 1.937), que tienen el dorso de color negro
uniforme, sin anillos visibles; en la cabeza presentan un anillo completo de color
amarillo o blanco y en la cola dos o tres anillos pequeños de color rojo (Silva,
1.994).
25
5.2.1 Morfología y Fisiología general
Desde el punto de vista taxonómico es quizás el aparato venenífero la
característica más importante para diferenciar un ofidio del género Micrurus de
cualquier serpiente de la familia Colubridae, Anilidae, con las cuales presentan
similitudes que corresponde a formas diferentes de mimetismo (Silva, 1.994).
El aparato venenífero de los Micrurus, al igual que el de todos los demás
tanatofidios, está compuesto por un par de glándulas situadas a cada lado de la
cabeza, en la región temporal, por detrás y debajo de los ojos. Tiene además un
par de pequeñas glándulas accesorias, localizadas por delante de las glándulas
principales y el conducto excretor de veneno, además de un par de dientes
inyectores cortos no mayores a 3mm. de largo, ligeramente incursados, situados
en la parte inferior del maxilar superior y en el extremo anterior de éste. Estos
últimos están surcados por un canal central para la conducción del veneno
cubierto por una membrana mucosa. Constituye una característica importante de
las corales verdaderas el tener el diente inyector siempre eréctil y con poca
movilidad anteroposterior (Silva, 1.994).
El tipo de dentición para las serpientes corales es llamado Proteroglifa (Tabla 2),
según Mejía (1.987) el maxilar superior es alargado (belfas); la cabeza suele ser
pequeña, con cuello no diferenciado, ojos muy pequeños y puntiformes.
Tabla 2. Dentición de la familia Elapidae, (Soerensen, 1.990)
FAMILIA
DENTINCIÓN
Elapidae
Proteroglifa
EPISTEMOLOGÍA
protero = anterior; gliphé = surco
5.2.2 Hábitat y comportamientos
Habitan en zonas de clima medio y cálido, algunas especies viven en estrecha
cercanía con los seres humanos, como las que prefieren los jardines o cultivos
como el café y cacao. Muchas especies llevan vida semisubterránea, hábitos
nocturnos y crepusculares, prefieren permanecer ocultas bajo la hojarasca,
piedras o troncos, son serpientes de carácter manso, tímidas. Cuando se sienten
en peligro, algunas levantan la cola y la enrollan para dar la impresión de que se
trata de la cabeza (Otero, 1.994). Cuando muerden lo hacen con mucha fuerza y
con frecuencia se quedan firmemente aferradas a la piel por un largo período de
tiempo (Charry, 2.006), debido a que su boca es pequeña y sus colmillos son
cortos con baja o nula movilidad anteroposterior.
26
5.2.3 Tipo de alimentación y reproducción
El 90% de las especies de Micrurus sp. se alimentan de otras serpientes, son
ofidiófagas. Además comen anfibios, peces y otros reptiles (Pineda, 2.002).
La reproducción es interna; los machos han desarrollado órganos copuladores
bifurcados a partir de la pared de la cloaca llamados hemipenes, a través del
surco, a lo largo de cada uno de los hemipenes es transportado el esperma hacia
el aparato reproductor de la hembra (Young, 1.980). Sólo uno de los dos
hemipenes entra en la cloaca de la hembra, nunca ambos a la vez. Se reproducen
por medio de huevos (Ovípara).
5.3
Distribución Geográfica de las Micrurus en estudio
Las Micrurus son las representantes de la familia Elapidae de América, en donde
tienen una amplia distribución geográfica. Se les encuentra desde la región
nororiental de los Estados Unidos, pasando por México, América Central y Sur
América, hasta la Argentina. En Colombia se distribuyen desde el nivel del mar
hasta los 2.000 metros de altitud (Silva, 1.994). Las corales ocupan varios tipos de
ambientes disponibles, desde los terrestres (hojarasca, raíces de los árboles),
subterráneos y ambientes acuáticos.
5.3.1 Micrurus surinamensis surinamensis, (Cuvier, 1.817)
Se encuentra en la Amazonía y Orinoquía colombiana; presentando una alta
ocurrencia poblacional en las regiones limítrofes de Brasil y Perú con Colombia.
Las poblaciones de esta especie presentan mayor densidad en las áreas de
trapecio amazónico colombiano y en países vecinos como Brasil, Ecuador, Perú y
Bolivia. Se aprecia una disminución de la incidencia poblacional hacia el norte y el
centro de la Amazonia colombiana, en los territorios de Guaviare, Guainía,
Vaupés y Orinoquía. Micrurus s. surinamensis, M. l. lemniscatus y M. spixii
obscurus son las tres formas codominantes del género Micrurus en la región
amazónica. (Silva, 1.994).
M. s. surinamensis alcanza un gran desarrollo corporal; los individuos hembras
adultos pueden tener hasta 1.400 mm de largo y el cuerpo robusto con un grosor
de 100 a 120 mm medido en la parte media del cuerpo. Los especímenes
hembras de máximo desarrollo tienen entre 450 a 600 gr. de peso; cabeza robusta
de 40 mm de largo y 40 mm de ancho, deprimida anteroposteriormente; boca
ancha, con hocico redondo, ojos pequeños, ligeramente sobresalientes y situados
por encima; pupilas cilíndricas; internasales más pequeñas que las prefrontales;
frontal pequeña más delgada que ancha, lo cual constituye un elemento
característico de esta especie. Su cuerpo consta de tres colores los cuales forman
anillos amarillos, negros y rojos. Cabeza característicamente roja, con las
escamas cefálicas bordeadas con líneas negras; las escamas supracefálicas y las
27
labiales (supra e infralabiales) enrojecidas, es típico de esta especie, lo cual
constituye uno de los caracteres taxonómicos más sobresalientes, fácil de
reconocer y útil para la identificación de esta especie. Tienen dimorfismo sexual,
las hembras poseen en forma constante un mayor desarrollo corporal que los
machos (Silva, 1.994).
5.3.2 Micrurus mipartitus, (Duméril, Bibron y Duméril, 1.854)
En Antioquia y Chocó la especie es conocida popularmente como rabo de ají,
coral, cabeza de chocho o rabo de candela, posee anillos negros y blancos, o
negros y amarillos en el cuerpo; una banda roja encima de la cabeza y entre dos y
cuatro rojas en la cola; talla máxima 124 cm. (Otero, 1.994). Es Ovípara. Tiene
costumbres nocturnas y subterráneas, pero también se le encuentra oculta entre
grietas, troncos podridos y hojarasca. Se encuentra en todo el territorio nacional,
principalmente en zonas húmedas y selváticas. Se alimenta de lagartijas, ranas y
otras serpientes. Mide entre 50 a 90 centímetros de longitud, pero puede alcanzar
un poco más de un metro. Algunos estudios sugieren que es la serpiente terrestre
más venenosa del mundo. Por su comportamiento poco agresivo, los accidentes
son raros, aunque sin tratamiento casi siempre son mortales (Vásquez, 1.995).
El ojo es pequeño, puntiforme y la pupila vertical semielíptica. Tiene anillos negros
separados por blancos o amarillos más delgados, pero el segundo de la cabeza y
los tres o cinco últimos, son rojos brillantes. Posee 15 hileras de escamas dorsales
y carece de escama loreal, en general son de vida nocturna y subterránea, se
alimentan de caecilidos, lagartos y otras serpientes. Son ovíparas, se hallan
distribuídas en Centro América y Norte de Suramérica. En Colombia es
probablemente la más abundante en la cordillera de los andes encontrándose
ampliamente distribuida a una altura aproximada de 1.800 metros sobre el nivel
del mar. Es común en zonas productoras de café (Ángel, 1.983).
5.3.3 Micrurus isozonus, Cope, 1.860
Según Campbell y Lamar (2.004) esta especie mide en promedio 50 y 70 cm
aunque no son raros los ejemplares de un metro de longitud, existe un registro de
un ejemplar que midió 150 cm. Presenta una coloración dorsal conformada por
triadas, series de tres anillos negros alternados con dos blancos y un anillo rojo
brillante que separa cada triada entre si. Normalmente los anillos rojos son más
largos que los anillos individuales de las triadas. Posee entre 10 y 14 triadas en el
cuerpo además de 1 – 2/3 en la cola. El hocico es blanco ynegro, este patrón
puede extenderse hasta la parte trasera de los ojos y al mismo nivel en el dordo
de la cabeza. Después puede observarse una banda gris o blancuzca que tiene
manchas irregulares que atraviesa de lado a lado la cabeza transversalmente. En
otros ejemplares el hocico es gris con manchas negras y una banda esta
bordeada posteriormente por un anillo rojo ancho que puede incluir algunas
escamas en el frente y dorso de la cabeza, posterior a este se encuentra el anillo
28
negro de la primer triada. El vientre de la cabeza usualmente es rojo, blanco con
pigmento negro hacia las escamas que bordean la boca.
Es una especie que se encuentra en Colombia distribuída hasta los 1.400
m.s.n.m. en la región de la Orinoquía y puede llegar a medir unos 70 centímetros.
El patrón de coloración son anillos rojos, negros, y amarillos. Los anillos negros
en grupos de tres intercalados por dos anillos amarillos y los anillos negros
extremos tocando los anillos rojos. En estado de cautiverio se han logrado
conservar varios ejemplares de esta especie por más de dos años (Maldonado,
2.006). De su biología se conoce muy poco.
5.3.4 Micrurus dumerilii, (Griffin, 1.916)
Esta especie algunos la clasifican como Micrurus carinicaudus antioquensis (Pérez
et al, 1.993), la indican como sinónimo de M.dumerilii antioquensis. M. dumerilii ha
sido reportada para Colombia (en El Cedro, Río Juradó, Chocó) cerca de la
frontera con Panamá según Campbell y Lamar (1.989), sin embargo no se ha
registrado en territorio panameño.
Esta especie es endémica para Colombia, se encuentra en tierras del oeste del
país, la zona Andina y la Sierra Nevada de Santa Martha hasta los 2.133
m.s.n.m.; se han reportado cinco subespecies en todo el territorio colombiano M.
d. antioquiensis, M. d. carinicaudus, M. d. colombianus, M. d. dumerilli, y M. d.
transandinus. El patrón de coloración para las subespecies M. d .dumerilli y M. d.
colombianus tienen los anillos negros en grupos de tres. Se han logrado mantener
las subespecies M. d. antioquiensis y M. d. transandinus más de un año vivas con
la misma dieta que para la especie Micrurus medemi en estado de cautividad
(Maldonado, 2.006).
5.3.5 Micrurus medemi, (Roze, 1.967)
Es una especie endémica de Colombia. Esta serpiente ha llegado a medir 60
centímetros en estado de cautiverio. Tiene un patrón de coloración diferente de
otras corales; a lo largo de su cuerpo posee anillos negros intercalados con anillos
amarillos, blancos o rojos (pero no todos al tiempo); habita en el bosque húmedo
tropical y seco entre 250 – 600 m.s.n.m. Se ha reportado una satisfactoria
reproducción en cautiverio de especies provenientes de áreas cercanas a Nilo
(Cundinamarca) como Villavicencio (Meta) en el Parque Recreacional y
Serpentario Piscilago, con una dieta que incluye cecilias, varias serpientes
pequeñas y alimentación artificial a base de mezclas de harinas y carne
(Maldonado, 2.006).
29
5.4 Venenos Ofídicos
El veneno de las serpientes es una mezcla de diferentes compuestos sólidos de
los cuales 70 a 90% son polipéptidos y proteínas, 10 a 30% compuestos y
elementos de bajo peso molecular. Los compuestos del veneno han sido
clasificados según Daniel Pineda en 2.002 en proteicos y no proteicos. La dosis
letal media de los venenos de serpientes colombianas se presenta en la Tabla 3.
(Pineda, 2.002).
Tabla 3. Dosis Letal Media de venenos de serpientes Colombianas
Especie
Micrurus mipartitus
Crotalus durissus terrificus
Bothrops atrox
Botriechis shlegelii
Botricpsis punctat
DL50 (mg/ratón)*‫(ײ‬Sic)‫ײ‬
9, 0
130, 0
58, 0 – 69, 0
206, 0
47, 0
* Inoculación intraperitoneal de 5 ratones de 18 – 20 g/nivel. (Sic): [No es mg/ratón sino es
μg/ratón], la medida de Dl50 se da en microgramos por ratón o por peso de ratón.
5.4.1 Venenos micrúricos
Los venenos de las corales son muy potentes, su acción es predominantemente
neurotóxica, si bien algunos también cardiotóxicos. Nunca debe subestimarse el
tamaño de la serpiente, ni la ausencia inicial de síntomas generales y locales. La
mordedura es indolora de una pequeña serpiente coral “rabo de ají” de 10 a 15 cm
de longitud y tan delgada como un cordón de zapato, es potencialmente mortal
para un hombre adulto. Estos venenos poseen neurotoxinas de bajo peso
molecular, que se unen frecuentemente a los receptores colinérgicos de la placa
neuromotora de las fibras musculares, actuando como un ·”aislante” que bloquea
el paso del impulso nervioso al músculo, lo que ocasiona una parálisis flácida que
puede conducir a disnea y paro respiratorio (Charry, 2.006).
El veneno de las corales induce efectos típicamente neurotóxicos, produciendo por
lo general un bloqueo postsináptico de los receptores colinérgicos de la placa
motora. Este veneno se esparce rápidamente por los tejidos y bloquea los
receptores de acetilcolina en los músculos, observándose entre los síntomas por
mordedura de coral una parálisis muscular (Galvis, 2.005); sin embargo, algunos
venenos micrúricos poseen también actividad de bloqueo presináptico, producto
de la acción de fosfolipasas A2 que afectan esta terminal. Es importante recordar
que los venenos de las corales no producen efectos hemorrágicos, coagulaciones,
ni daños locales a piel o tejidos (Charry, 2.006).
30
5.4.2 Dosis Letal Media de los venenos Elapídicos en Colombia
En Colombia existe una fuente de información deficiente acerca de la acción letal
de los venenos de las serpientes en general, especialmente las pertenecientes a
la familia Elapidae. Sólo hay un reporte desde 1.994 publicado por el Médico de la
Universidad Nacional de Colombia Juan José Silva Haad quien fue el primer
científico que publicó un artículo llamado “Los micrurus de la Amazonia
Colombiana. Biología y toxicología experimental de sus venenos” donde determinó
la dosis letal media DL50 para el veneno de 15 tanatofídios pertenecientes al
género Micrurus que viven en la región amazónica.
En este experimento se investigó la producción máxima y media de veneno en las
diferentes especies de Micrurus. Las diferentes cantidades obtenidas se
relacionaron con los tamaños de los Micrurus comúnmente observados en la
Amazonía. Los datos obtenidos acerca de los tamaños y de la producción de
veneno de cada grupo – muestra, fueron sometidos a cálculos y análisis
estadísticos para determinar los diferentes valores de los intervalos de clase.
En los ensayos de investigación Silva (1.994) empleo ratones blancos machos y
hembras no preñadas, de 25 a 35 gramos, utilizando grupos de seis ratones con
pesos iguales para cada dosis letal de ensayo y por cada vía orgánica de
inoculación experimentada. Se hizo uso de palomas domésticas (Columbia livia),
con pesos de 200 a 300 gramos; cobayos machos (Cavia cobaya) con pesos de
200 a 300 gramos y primates de la especie Aotus nancymai con pesos de 600 a
800 gramos.
La dosis letal media, está definida en farmacología y se utiliza para obtener la
dosis media capaz de matar el 50% de la población inoculada por el veneno en
este caso ofídico de especies del género Micrurus; esta dosis letal media (DL50) se
expresó en microgramos por gramo de peso corporal, para los animales cuyo peso
era menos a un kilogramo y en miligramos por kilo de peso corporal para aquellos
cuyo peso era mayor de un kilogramo. Los estudios de venenos de las diferentes
especies de Micrurus, permitieron demostrar que la especie M.s.surinamensis es
el mayor productor de veneno entre todas las especies de coral que viven en la
región Amazónica.
Los resultados obtenidos indicaron que las palomas, los primates y los cobayos
son los animales más susceptibles al veneno de M. s. surinamensis, administrado
bien sea por la vía Intramuscular (I.M.) o Intraperitoneal (I.P). La sensibilidad de
estas tres especies al veneno micrúrico es similar, como se aprecia en el Cuadro
1. El ratón blanco de acuerdo con los resultados observados, exhibe
comparativamente con los cobayos, palomas y micos, la mayor resistencia a los
venenos de M. l. lemniscatus, M. spixii obscurus y M. s. surinamensis.
31
Cuadro 1. Dosis Letal Media DL50 Comparativas de los venenos Micrúricos de
algunas especies de la Amazonia Colombiana
Especie
M.hemprichii ortoni
M.lemniscatus l.
M.spixii obscurus
M. s. surinamensis
M. s. surinamensis
M. s. surinamensis
Dosis Letal 50
Vía de Administración
Animal Empleado
1.41 µg/gr peso
I.P
Mus musculus
3.4 µg/gr
I.M
Mus musculus
0.44 µg/gr
I.P
Mus musculus
0.50 µg/gr
I.M
Mus musculus
2.2 µg/gr
I.P
Mus musculus
4.25 µg/gr
I.M
Mus musculus
0.41 µg/gr
I.P
0.55 µg/gr
I.M
Mus musculus
Mus musculus
DL50
0.18 µg/gr
I.M
Aotus nancymai
0.068 µg/gr
I.V
Aotus nancymai
0.2 µg/gr
I.M
Cavia cobaya
0.065 µg/gr
I.V
Cavia cobaya
0.18 µg/gr
I.M
Columbia livia
0.068 µg/gr
I.V
Columbia livia
*(Tomado del Artículo “Los Micrurus de la Amazonía Colombiana. Biología y toxicología
experimental de sus venenos” Silva, 1.994.)
5.5 Accidente Ofídico por corales en Colombia
Los accidentes ofidicos por corales representan el 2.9% (Martínez, 2.006) de las
mordeduras por serpientes. Su diagnóstico se puede realizar mediante la
identificación de la serpiente, ya sea porque el paciente la describa o porque la
capture y la lleve al centro de salud para que sea identificada; si se desconoce el
agente agresor, se hace fundamental hacer un diagnóstico clínico o cuadro clínico
en donde se tiene que tener en cuenta los siguientes aspectos:
a) las manifestaciones neurológicas que son típicas de este envenenamiento y
b) las manifestaciones hemorrágicas que están completamente ausentes en este
tipo de accidentes. El diagnóstico diferencial de un accidente ofídico por
serpientes de la familia Elapidae y Viperidae es fundamental ya que ambos
tratamientos deben realizarse con un suero antiofídico específico diferente, por lo
tanto es importante descartar otro tipo de envenenamiento por serpientes (Pineda,
2.002).
Las manifestaciones clínicas del envenenamiento por serpientes de coral en el
accidentado es exclusivamente neurológico, en los casos moderados y graves, el
paciente puede presentar un compromiso con los músculos de las extremidades
que le puede dificultar el mantenerse de pie y de los músculos respiratorios que lo
llevan a presentar disnea; los efectos locales son escasos con dolor leve, mínimo
32
y transitorio (Pineda, 2.002); el edema es escaso ó solamente alrededor de la
mordedura, no hay hemorragias en la piel, excepto a través de los orificios dejados
por los colmillos. No se presentan ampollas, ni necrosis y después de unos
minutos aparecen parestesias en el sitio de la mordedura, pero por el contrario la
mordedura es mortal en cuestión de horas dependiendo de la región afectada
(Otero, 1.994).
El accidente ofídico por coral no es frecuente pero cuando ocurre se considera
grave (Gómez, 2.003), ya que el envenenamiento ocurre a nivel sistémico, lo cual
puede ser severo, siendo entonces una intoxicación esencialmente neurotóxica y
experimentalmente se demostró su efecto miotóxico (Vital, et al, 1.983/84); el
veneno se difunde rápidamente por los tejidos y si el paciente Animal o Humano
no es atendido de inmediato con Suero Antiofídico AntiElapídico en el transcurso
de unas pocas horas ocasiona parálisis de todos los músculos del cuerpo
incluyendo los músculos respiratorios provocando que la víctima tenga dificultad al
respirar sin que el afectado pierda el conocimiento, generando paro cardiaco
respiratorio y finalmente la muerte (Gómez, 2.003).
5.5.1 Clasificación del Accidente Ofídico
Este tipo de accidente ofídico se clasifica teniendo en cuenta fundamentalmente el
grado de compromiso de la función respiratoria; si no está comprometida,
hablamos de un accidente moderado; si hay compromiso de los músculos
respiratorios, hablamos de un accidente severo. Es importante tener en cuenta
que la clasificación de este accidente puede cambiar con la evolución y que un
paciente que ingresó con un accidente moderado puede evolucionar hacia uno
severo. Se habla de un accidente leve cuando el paciente no presenta ningún tipo
de alteración motora, clasificación que puede variar según la evolución del estado
neurológico, por tanto la víctima que ha entrado como un accidente leve,
permanezca en observación, por lo menos de 6 horas antes de darle de alta, ya
que así como existe la probabilidad de que sea una mordedura seca o sin
inoculación de veneno, podría ocurrir lo contrario (Pineda, 2.002).
5.6 Seroterapia en Accidentes ofídicos por Micrurus
En el accidente elapídico (corales), en las regiones de Antioquia y Chocó, se
tienen dos especies importantes: Micrurus mipartitus y Micrurus dumerilii. Para la
primera se produce en Costa Rica un antiveneno específico anticoral gargantilla o
rabo de ají. La evaluación de este antiveneno y su comparación con el suero
anticoral producido por Probiol (Bogotá), con veneno de otras especies de la
Amazonía, realizado por el Doctor Rafael Otero Patiño. Cuadro 2.
33
Cuadro 2. Dosis Efectiva Media (Otero, 1.994)
DE50 Neutralizante del efecto letal del veneno de Micrurus mipartitus
(4 DE50 = 36 µg)
Suero anti – M.mipartitus Instituto
0.5 mg veneno/ml antiveneno
Clodomiro Picado ICP (Costa Rica)
Suero Anticoral (Laboratorios Probiol)
0.13 mg veneno/ml antiveneno
(Colombia)
*Tomado del Artículo “Seroterapia y Tratamiento del Accidente Ofídico en Antioquia y Chocó” por el
Doctor Rafael Otero Patiño.
Para M.dumerilii no se produce antiveneno específico en ninguno de los países de
América Latina. Sin embargo, este veneno antigénicamente es muy parecido al de
M.nigrocinctus, especie que se encuentra en el Urabá Antioqueño, Chocó y
Centroamérica; en Costa Rica, el (ICP) Instituto Clodomiro Picado produce un
antiveneno específico anti-M.nigrocinctus. La evalucación experimental contra el
efecto letal (4DL50 = 30 µg veneno de M.dumerilii antiquensis), según reportes del
Doctor Rafael Otero fue:
DE50 = 0.8 mg veneno/ml antiveneno (anticoral ICP)
El antiveneno habría que aplicarlo antes que el paciente tenga parálisis, es decir
en las primeras 2 horas; sin embargo el 50% de los pacientes llegan al hospital en
insuficiencia respiratoria y por lo tanto, el antiveneno no logra revertir los síntomas
paralíticos y estos persisten durante 3 a 6 días. En consecuencia, el soporte
ventilatorio adecuado se constituye en la parte importante del tratamiento (Otero,
1.994).
5.6.1 Dosis Efectiva Media del Suero Antielapídico Probiol frente a los
venenos Micrúricos
El suero antiofídico antielapídico liofilizado producido por Laboratorios Probiol S.A.
posee una adecuada potencia neutralizante contra los venenos de serpientes de
las especies Micrurus mipartitus, Micrurus s.surinamensis, Micrurus dumerilii,
Micrurus spyches medemi y Micrurus spixii (Charry, 2.006).
La dosis efectiva media (DE50) del suero antiofídico antielapídico de Laboratorios
Probiol S.A. frente al veneno de cada una de las especies de serpientes Micrurus
sp. mencionadas anteriormente, según pruebas y experimentos realizados por el
Doctor Héctor Charry en el Centro de Investigación y Asesoría Ofidiológica
OPHIDIA en Manizales, se muestran en el Cuadro 3.
34
Cuadro 3. Dosis Efectiva Media de los venenos micrùricos (Charry, 2.006)
Especie
Dosis Efectiva Media
(DE50)
1,37*
1,12*
1,25*
1,37*
2.37*
1,20*
Micrurus mipartitus
Micrurus s. surinamensis
Micrurus dumerilii
Micrurus spyches medemi
Micrurus spixii
Micrurus s.p.p. Mezcla Homogénea
*DE50 expresada en miligramos de veneno neutralizados por cada 10 ml de antiveneno
La demostrada capacidad neutralizante (DE50) del suero antiofídico anticoral de
Laboratorios Probiol S.A. frente a los venenos micrúricos, guarda una coherente
relación proporción con la cantidad promedio de veneno inoculada en la mordida
de la mayoría de las especies de corales estudiadas y que está entre los 5 a 25
mg de veneno, esto significa que una dosis inicial de entre 5 y 10 frascos viales de
10 ml del antiveneno permiten tratar adecuadamente un accidente micrúrico
promedio, siempre y cuando su aplicación sea precoz y por la vía de
administración más adecuada (intravenosa)(Charry, 2.006).
No existe ningún método para la dosificación de antivenenos que pueda ser
recomendado internacionalmente. Las variaciones existentes en cuanto a
composición y acción de los venenos es tan grande que difícilmente pueden
concebirse una prueba única general. Cada país o región debe establecer sus
propios parámetros para la dosificación de sus sueros.
La Organización Mundial de la Salud ha considerado que métodos más sencillos,
como la simple demostración del número de miligramos que una unidad de
volumen de antiveneno neutraliza, es tan precisa y más económica que cualquier
otro método más elaborado. Se concluyó, además, que para el clínico la cantidad
de miligramos de veneno que una dosis de antiveneno neutraliza, es más fácil de
comprender y relacionar con el tratamiento a seguir.
Por facilidad de mantenimiento y costo, el ratón blanco es el animal
preferiblemente para la dosificación de potencia. La ruta de inoculación es
importante y debe utilizarse aquella que muestre un resultado más acorde con la
realidad; teóricamente, es la intramuscular o subcutánea. Sin embrago, su uso no
es práctico en el ratón blanco, ya que este es muy resistente a los venenos por
esta vía.
El veneno que recibe cada ratón en la prueba no debe ser inferior a 3DL50. El
veneno de referencia debe ser una mezcla de venenos individuales
representantes de las diferentes zonas geográficas de la región, desecado por
35
liofilización, escrupulosamente dosificado y conservado en frío y en la oscuridad.
Según la OMS, se aconseja incluir paralelamente con el suero a probar una
antitoxina previamente dosificada como suero de referencia. Además, conviene
repetir la DL50 cada vez que un nuevo lote de antiveneno va a ser dosificado.
El método que sugiere la OMS consiste en la mezcla de una cantidad fija de
veneno en presencia de cantidades variables del antiveneno, las que se ajustan a
un volumen igual, se incuban 30 minutos a 37º C y se inoculan por vía
intraperitoneal en grupos de cinco ratones por mezcla, de forma que cada uno
reciba una dosis no inferior a 3Dl50.
El título de neutralización en microgramos de veneno neutralizado por mililitro se
calcula con base en la menor cantidad de antiveneno que protege al menos cuatro
de los cinco animales.
Ejemplo de protocolos utilizados en la determinación de potencia:
Cuadro 4. Dosificación con veneno Micrúrico
Experimento
No.
1
2
3
4
5
6
Ml de
Veneno
(1mg/ml)
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
Ml de
Solución
Salina
1,2
2,7
3,2
3,45
3.60
4.2
Ml de
Antiveneno
3,0
1,5
1,0
0,75
0,6
-
Relación µg
Veneno/1 ml
de Antiveneno
100
200
300
400
500
Control
No. de
Ratones
Cantidad a
Inocular
5
5
5
5
5
5
0,75
0,75
0,75
0,75
0,75
0,75
*Dosis Prueba por Ratón 50 µg (Observación por 72 horas) por el Instituto Clodomiro Picado en
Costa Rica.
5.6.2 Producción de Suero Antiofídico Antielapídico en Colombia
Hace 40 años el único productor de suero antiofídico para la familia Viperidae fue
el Instituto Nacional de Salud, es importante aclarar que el Instituto durante todos
esos años sólo produjo Suero para las mordeduras de serpientes de esta familia
conocida con los siguientes nombres vulgares: talla x, veinticuatro, patoco,
patoquilla, cascabel, verrugoso y nunca produjo suero para las mordeduras de
serpientes de la familia Elapidae, es decir las corales (rabo de ají, coral, coralilla)
(Gómez, 2.006).
Pero a partir de los 80, se contó con un productor de carácter privado en el país
llamado Laboratorios Probiol. Este laboratorio fundado en 1956 por el Doctor
Cesar Gómez Villegas, inició la producción y comercialización de sueros
antiofídicos en 1.988 y además de producir el suero antiofídico para las
mordeduras de la familia Viperidae incursionó en el suero para la mordedura de
36
corales convirtiéndose en el único productor de suero antimoral en el país
(Gómez, 2.006).
Colombia hasta el año 1.997 contó con dos productores nacionales de sueros
antiofídicos; entre los dos suplían las necesidades en cuanto a accidentes ofidicos
por mordedura de serpientes de la familia Viperidae y Elapidae, abasteciendo las
necesidades no solo de Colombia como productor sino también como exportador
de este importante biológico en países vecinos como Panamá, Ecuador y Perú,
aportando al desarrollo científico, económico y social (Monje, 2.006).
El Laboratorio Probiol realizó un análisis estadístico de la “Producción de suero
anticoral desde 1.988 hasta el 2.006 en Colombia” que se presenta a continuación
en la Figura 1 en donde se muestra que desde el año 1.998 no hay producción de
este biológico vital en el país. En cuanto a las especies que causan el accidente
ofidico elapídico, los datos que se muestran en el Cuadro 5 son los casos
atendidos con suero antielapídico producido por Laboratorios Probiol. se
presentan como una información, debido a su bajo número, no pueden ser
analizados estadísticamente.
Figura 1. Análisis de la Producción de Suero Anticoral
10.000
9.000
8.000
7.000
6.000
5.000
4.000
3.000
2.000
1.000
0
PRODUCCIÓN LABORATORIOS PROBIOL
COMPORTAMIENTO DE LA PRODUCCIÓN
1992 - 2006
19
8
19 8
8
19 9
90
19
9
19 1
9
19 2
9
19 3
9
19 4
9
19 5
96
19
9
19 7
9
19 8
99
20
0
20 0
0
20 1
0
20 2
0
20 3
0
20 4
0
20 5
06
C A N T ID A D D E F R A S C O S
ANÁLISIS DE LA PRODUCCIÓN DE SUERO ANTIOFÍDICO
PARA LA FAMILIA ELAPIDAE EN COLOMBIA
1988 - 2006
AÑOS
*(Tomado del Archivo de Laboratorios Probiol S.A 50 años de Historia por Clemencia Gómez
Cabal, 2.006)
37
Cuadro 5. Casos Atendidos conSuero Anticoral
Nombre
Edad
años
Lugar y
Fecha del
Accidente
Fecha
Andrea Lobo de la Hoz
2
Santa Marta
(Magdalena)
Brayan Alexis
Arciniegas
7
Bucaramanga
(Santander)
Clínica Materno Infantil
Juan Carlos Otalvaro
27
Cartago
(Valle del Cauca)
Hospital
Universitario
del Valle “Evaristo García”
23 VII 1994
Steven Román Pérez
2
Mesitas del
Colegio
(Cundinamarca)
Hospital de
Kennedy
(Bogotá D.C.)
23 VIII 1.994
Nerlsy Janet Panado
22
Villavicencio
(Meta)
Hospital Departamental
de Villavicencio
22 VI 1.992
Efraín Jiménez Bueno
40
Caicedonia
(Valle del Cauca)
Hospital
Universitario
San Juan de Dios (Armenia)
Institución
Clínica
Marcaribe
Diagnóstico
23 VII 2003
1. Accidente ofídico por
coral en mano
28 VII 2003
1. Accidente Ofídico por
coral en el pie
1.
2 II 1.992
Neurotoxicidad por
mordedura de
coral.
2.
Intoxicación por
hidrocarburos
1. Mordedura por coral
M.mipartitus en el dedo
de la mano izquierda
1. Mordedura en el cuello
por la especie
M.psyches
1. Mordedura por ofidio
tipo coral en arco interno
del pie izquierdo
*(Tomado del Archivo de Laboratorios Probiol S.A. 50 años de Historia por Clemencia Gómez
Cabal, 2.006).
Actualmente el país cuenta con la producción de suero antiofídico polivalente para
vipéridos producido por el Laboratorio Probiol S.A., pero no para coral. Aunque es
doloroso decirlo, las razones de haber terminado la producción de suero anticoral
en el país se debió al cierre que tuvo el Laboratorio en el año 1.997 por parte del
INVIMA por no cumplir con las Buenas Prácticas de Manufactura. La razón del
cierre fue real, sin embargo como ocurrió en muchos de los cierres de
Laboratorios (especialmente nacionales) que hizo el INVIMA, no se evaluó ni el
impacto social, ni el económico, no se buscaron alternativas para evitar el
desabastecimiento de algunos biológicos y medicamentos, como fue el caso del
suero contra las mordeduras de serpientes del género Micrurus (Corales). Por ello,
desde el año 1.997 el país no contó con suero antiofídico anticoral. Sin embargo,
el Laboratorio Probiol siempre mantiene un stock y en más de una oportunidad ha
suministrado en calidad de donación el suero antiofidico antielapídico a víctimas
de mordeduras de corales, salvándoles la vida (Gómez, 2.006).
La situación actual se puede comparar con el año 1.987, retomando el escrito que
hizo el Dr. Cesar Gómez Villegas al Ministerio de Salud, el 27 de Julio del mismo
año, para solicitar el Registro Sanitario del suero anticoral: “En la actualidad y a
causa de que este antiveneno no se consigue en el país, es frecuente escuchar
por radio y televisión el llamado angustioso y muchas veces inútil en busca de este
medicamento indispensable para salvar vidas humanas”.
38
6. METODOLOGIA
6.1 Fase de Campo
6.1.1 Área de Estudio
La Fase de Campo se realizó en el Parque Recreacional y Zoológico Piscilago
ubicado en el Municipio de Nilo, Departamento de Cundinamarca (Colombia), a los
4º12’50.24” de latitud Norte y 74º40’51.25” de latitud Oeste aproximadamente, en
el Kilómetro 105 vía Bogotá – Girardot, privilegiadamente sentado sobre el cálido
Valle de Sumapaz, kilómetro 5 vía Melgar – Girardot y a 70 kilómetros de Ibagué.
Con una extensión de 83 hectáreas y una temperatura promedio entre 27º y 30º
(grados centígrados).
Figura 2. Área de Estudio (Nilo – Cundinamarca) Mapa Aéreo
39
6.1.2 Obtención de los Venenos Micrúricos
Los venenos se obtuvieron de las serpientes del genero Micrurus sp. las especies:
Micrurus surinamensis (4 ejemplares); Micrurus mipartitus (1 ejemplar); Micrurus
isozonus (2 ejemplares); Micrurus dumerilii (2 ejemplares) y Micrurus medemi (4
ejemplares) en estado de cautiverio que forman parte del inventario oficial del
serpentario del Parque Recreacional y Zoológico de Piscilago en Nilo
(Cundinamarca).
Cada quince días se recolectaron muestras de veneno de cada uno de los
ejemplares, para un total de 20 muestreos a lo largo de diez meses.
Al iniciar el estudio se tomaron algunos datos morfométricos como longitud total,
longitud cola y algunos aspectos biológicos como la identificación taxonómica,
categoría de amenaza (UICN, apéndice CITES), sexo, edad aproximada,
condiciones físicas, distribución geográfica, hábitat, comportamiento del individuo
en cautiverio, manipulación y transporte de cada uno de los ejemplares de las
cinco especies de Micrurus sp. Anexo A.
6.1.3 Extracción de Veneno
Las serpientes del género Micrurus son de tamaño pequeño por tanto no se
recomienda el método de inmovilización con gancho, ya que se perdería veneno o
se expondría seriamente al manipulador de la serpiente a ser mordido. Para este
experimento se utilizaron frascos para toma de muestra nuevos y limpios, con la
superficie cubierta por un guante desechable asimilando un tambor, lo que induce
a la serpiente a morder e inocular el veneno. Figura 3.
Figura 3. Método de Extracción del veneno Micrúrico
40
6.1.4. Conservación y Transporte de los Venenos
Las muestras de los venenos una vez obtenidos, fueron conservados en tubos
plásticos individuales por especie, cerradas y debidamente etiquetadas con un
rótulo que contenía: fecha de recolección de la muestra, el número de lote del
veneno y la especie de la cual se extrajo el veneno. Las muestras de los venenos
fueron mantenidas a una temperatura de 2ºC con hielo seco en una nevera de
icopor, mientras fueron transportadas a las instalaciones del laboratorio.
6.1.5. Preparación de las Muestras de los Venenos Micrúricos
Una vez ingresadas las muestras de veneno al laboratorio, fueron secadas en una
estufa a 37º centígrados por 48 horas, posteriormente se pesaron, se etiquetaron
nuevamente con la cantidad de miligramos de veneno que contiene cada tubo
plástico. A cada especie se le asignó un color. Cuadro 6. Se mantuvieron a
temperatura ambiente en la oscuridad hasta el momento de preparar la solución
de trabajo.
Cuadro 6. Distribucion de los Venenos en Tubos Plásticos de Colores
Especie
Micrurus surinamensis surinamensis,
Micrurus mipartitus,
Micrurus isozonus
Micrurus dumerilii
Micrurus medemi
6.2
Color del Tubo Plástico
Rojo
Amarillo
Azul
Verde
Blanco
Fase Experimental
6.2.1 Animales Experimentales
Dentro del proyecto de investigación “Determinación de la Dosis Letal Media
(DL50) de cinco especies del género Micrurus en estado de cautiverio en NiloCundinamarca (Colombia)” que tuvo asiento en el Laboratorio Probiol S.A, se
estableció como prioridad la utilización y el manejo ético de animales de
laboratorio en esta experimentación biológica. Anexo B.
Se utilizaron como biomodelos ratones de la especie Mus musculus con pesos
que oscilaron entre 17 y 22 gramos sin importar el sexo adquiridos en el bioterio
de la Universidad Nacional en la Facultad de Veterinaria. Los biomodelos
utilizados no tuvieron ningún tipo de privación en las condiciones ambientales
experimentales; los principales factores ambientales que puedan afectar a los
41
animales serán constantes, ya que los cambios en el ambiente experimental
producirán cambios en el modelo animal, lo que conlleva al aumento de la
variabilidad de los resultados, de lo contrario las pruebas se invalidan. Se tuvo en
cuenta el cuadro de caracteristicas generales para los biomodelos utilizados.
Anexo C.
6.2.2 Ensayos Preliminares
Se preparó una solución madre de veneno Micrúrico para cada especie en una
concentración (1:1) mg/ml en solución de Cloruro de Sodio al 0.9%. Se realizaron
seis diluciones siguiendo una progresión geométrica sin espaciamiento constante
(d). Cada dosis fue ensayada en lotes de 5 animales inoculando 0,5 ml por la vía
intraperitoneal.
La prueba a la que se llamo “Prueba gruesa” se repitio varias veces hasta
encontrar una dosis de trabajo. Anexo D.
Para la determinación estadistica de la DL50 ( ensayos preliminares) se utilizo la
prueba de probit’s la cual no requiere de un espaciamiento constante (d) entre los
niveles de dosis. Se utilizó el programa Simfit 5.0 para realizar los cálculos
automáticamente. Anexo E.
6.2.3 Dosis Letal Media DL50 (OMS, 1981)
La dosis letal media (DL50) se determinó mediante el método de Spearman &
Karber, es un método aproximado, no paramétrico, propuesto por la OMS en
1981, inyectando por la vía intraperitoneal (I.P) un volumen de 0,5 ml de diluciones
seriadas de veneno cercanas a la dilución de trabajo encontrada en los ensayos
preliminares. Se utilizaron ratones albinos de la especie Mus musculus, con pesos
entre 17 y 19 gramos. Se emplearon cinco ratones por dosis para un total de seis
dosis a ensayar. Los animales fueron mantenidos en observación durante un
periodo de 48 horas. Los animales del grupo control se inyectaron con solución
salina isotónica. Anexo D.
Las dosis letales se repitieron cinco veces con cada veneno, para obtener una
muestra estadísticamente significativa. Figura 4.
42
Figura 4. Dosis Letal Media (DL50)
Se tomo una bala del veneno Micrurus sp. de la especie a
evaluar y se diluyó en Solución Salina al 0.9%, con una
concentración (1:1) µg/ml.
Se determinaron seis diluciones de veneno cercanas a la
dosis de trabajo hallada en los ensayos preliminares,
utilizando un espaciamiento constante entre cada dilución
(d).
Se midió la cantidad necesaria de veneno para inocular 10 ratones en cada dilución y se
siguió el siguiente protocolo:
Dilución
µl
24 Horas
48 Horas
1
10
0/5
0/5
2
20
1/5
1/5
3
30
2/5
2/5
4
40
3/5
3/5
5
50
4/5
4/5
6
60
5/5
5/5
Se completo hasta un volumen final de 5 mililitros con solución
salina estéril 0.9% cada dilución
Se tomaron cinco ratones de 17 - 19 gramos por cada dilución
y se inyectaron con 0.5 mililitros de la solución.
Se observaron los ratones inoculados a las 24 y 48 horas y
se registró el número de muertes para cada dosis. Los
resultados se anotaron en un número fraccionario, donde el
numerador es el número de ratones muertos y el
denominador es el número de ratones inoculados por dilución
6.2.3.1
Validez de la Prueba
•
Los ratones debian tener durante toda la prueba las condiciones
experimentales constantes de temperatura y alimentación. Si las condiciones no
son constantes la prueba se invalidaba.
•
Si en el grupo control negativo se producia una o más muertes, la prueba se
invalidaba.
43
•
Si el grupo control positivo sobrevivian uno o más ratones, la prueba se
invalidaba.
•
Si en los resultados de la prueban existian dos diluciones que separaban la
menor dilución en la cual mueren el 100% de los ratones de la mayor dilución en
donde mueren el 0% de los ratones la prueba se invalidaba.
6.2.4 Dosis Efectiva Media DE50
En la determinación de la dosis efectiva media (DE50). Figura 5. se utilizó la
técnica utilizada por el Instituto Clodomiro Picado de Costarica, que consiste en
una mezcla de una cantidad fija de veneno en presencia de cantidades variables
de antiveneno, las que se ajustan a un volumen igual, se incuban por espacio de
30 minutos a 37°C y se inocula por vía intraperitoneal en grupos de cinco ratones
por mezcla, de modo que cada uno reciba una dosis no inferior a 3DL50. Anexo F.
El cálculo de la dosis letal media (Dl50) se realizó con el programa Simfit 5.6
edición 7, al cual se ingresan las distintas dosis y los niveles de respuesta, en este
caso sobrevivencia, para cada una. El programa realiza la regresión lineal dada
por la relación probit-log de la dosis según el método gráfico numérico modificado
para computadores de Lichfield y Wilcoxon, que entrega la DE50 y el intervalo de
confianza al 95% (Tallarida y Murray, 1987; Jurado, 1989). La determinación de
diferencias significativas entre las DL50 se realizó mediante W Shapiro Wilks de
tendencia.
44
Figura 5. Dosis Efectiva Media (DE50)
Se tomo una bala del veneno Micrurus sp. de la especie a
evaluar y se diluyó en Solución Salina al 0.9%, con una
concentración (1:1) µg/ml.
Se reconstituyó el Lote Piloto: AC-005 de Suero Antiofidico
Anticoral Polivalente Liofilizado producido por Laboratorios
Probiol S.A. con 10 ml de agua destilada.
Se siguió el siguiente protocolo utilizado por el Instituto Clodomiro Picado de Costarica:
Experimento
No.
1
2
3
4
5
CONTROL
(+)
mL
veneno
(1mg/ml)
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
mL
Solución
Salina
mL
Antiveneno
Relación µg
Veneno/1ml
Antiveneno
1.2
2.7
3.2
3.45
3.60
4.2
3.0
1.5
1.0
0.75
0.6
----
100
200
300
400
500
Control
24
Horas
48
Horas
5/5
4/5
3/5
2/5
1/5
0/5
5/5
4/5
3/5
2/5
1/5
0/5
Se incubó la solución final durante 30 minutos a 37º
Centígrados
Se tomaron cinco ratones de 20 – 22 gramos por cada
dilución y se inyectaron con 0.75 mililitros de la solución final.
Se observaron los ratones inoculados a las 24 y 48 horas y
se registró el número de sobrevivientes para cada dosis. Los
resultados se anotaron en número fraccionario, donde el
numerador es el número de ratones que sobreviven y el
denominador es el número de ratones inoculados por
dilución.
45
Se utilizó el Método de transformación en Probit’s para la dosis efectiva media,
usando el programa Simfit 5.6 edición 7. Este Método está aceptado por la
Organización Mundial de la Salud.
6.2.4.1 Validez de la Prueba
•
Un mililitro de suero antiofidico anticoral liofilizado producido por Laboratorios
Probiol (DE100) debe titular como mínimo 0.1 miligramos de veneno Micrurus sp.
•
Si el Lote Piloto AC – 005 a probar no neutraliza, se desecha el suero
antiofidico del lote correspondiente debido a la baja potencia del producto.
•
Los ratones deben tener durante toda la prueba las condiciones
experimentales constantes de temperatura y alimentación. Si las condiciones no
son constantes la prueba se invalidaba.
•
Si en el grupo control positivo sobreviven uno o más ratones, la prueba se
invalida.
6.3. Condiciones Experimentales
Durante las pruebas de letalidad y Potencia se tuvo en cuenta las condiciones de
mantenimiento y los grupos control positivo y negativo.
6.3.1 Condiciones de Mantenimiento
Durante las pruebas de letalidad y potencia en el tiempo de observación y
postinoculación 24 – 48 horas, los ratones fueron mantenidos en cajas de acero
inoxidable de las mismas que se utilizan en el bioterio de la Universidad Nacional.
Los ratones se mantuvieron en el transcurso del tratamiento de la dosis letal media
y la dosis efectiva media en condiciones experimentales constantes de peso,
temperatura y alimentación. Si las condiciones no eran constantes la prueba se
invalidaba.
6.3.2 Grupo Control Positivo
•
Dosis letal media (DL50) para cada lote de veneno de las cinco especies de
Micrurus sp. se inocularon 5 ratones con 0.75 ml de la dosis madre concentrada
(1:1) del veneno. Si en el grupo control positivo sobrevivían uno o más ratones, la
prueba se invalidaba.
•
Dosis efectiva media (DE50) para cada lote de veneno de las cinco especies
de Micrurus sp. se hizo una dilución de la dosis madre concentrada (1:1) de
46
veneno y se inyectó 0.75 ml a 5 ratones. Si en el grupo control positivo sobrevivían
uno o más ratones se invalidaba la prueba.
6.3.3 Grupo Control Negativo
Dosis letal media (DL50) para cada lote de veneno de las cinco especies de
Micrurus sp. se inocularon 5 ratones con 0.75 ml de solución salina estéril al 0.9%.
Si en el grupo control negativo se producía una o más muertes, la prueba se
invalidaba.
•
Dosis efectiva media (DE50) para el lote piloto de suero antiofidico anticoral
AC -:005: se preparó una dilución madre (1:1) de suero antiofidico y solución
salina estéril al 0.9% y se inyectaron 5 ratones con 0.75 ml de esta solución. Si en
el grupo control negativo se producía una o más muertes, la prueba se invalidaba.
47
7. RESULTADOS
7.1 Aspectos Biológicos
Durante el tiempo de estudio se realizó un registro inicial de los Aspectos
Biológicos de 13 individuos de la familia Elapidae, género Micrurus, los cuales se
determinaron taxonómicamente con claves y reportes de Cuvier (1.817), Duméril y
Bribón (1.854), Cope (1.860), Griffin (1.916), Roze (1.967), Silva (1.994), Campbell
y Lamar (1.989 - 2.004), además se contó con la colaboración y asesoría del
Biólogo Herpetólogo Jairo Maldonado.
7.1.1
Micrurus surinamensis surinamensis, Cuvier (1.817)
Tabla 4. Clasificación Taxonómica Micrurus surinamensis
TAXONOMIA
Reino
Phylum
Sub. phylum
Clase
Orden
Suborden
Familia
Subfamilia
Genero
Especie
Nombre común
Animalia
Chordata
Vertebrata
Reptilia
Squamata
Serpentes
Elapidae
Micrurinae.
Micrurus
Micrurus surinamensis surinamensis. Figura 6.
Coral
Figura 6. Micrurus surinamensis surinamensis, Cuvier (1.817)
48
Cuadro 7.Características morfométricas de los ejemplares de la especie M.
surinamensis
Identificación del
individuo
Mss-001
Mss-002
Mss-003
Mss-004
Edad
Sexo
Adulto
Adulto
Juvenil
Adulto
Hembra
Hembra
Macho
Hembra
Longitud total
(cm)
89,5
92,0
64,5
73,5
Longitud cola (cm)
8,0
11,0
8,5
6,5
miligramos para la especie M. s.surinamensis
Especie
Promedio por muestreo para
los cuatro ejemplares
( mg )
Cantidad en miligramos (mg)
Total
0,8
16
7.1.2 Micrurus mipartitus, Duméril y Bibrón (1.854)
Tabla 5. Clasificación Taxonómica Micrurus mipartitus
TAXONOMIA
Reino
Phylum
Sub phylum
Clase
Orden
Suborden
Familia
Subfamilia
Genero
Especie
Nombre común
Animalia
Chordata
Vertebrata
Reptilia
Squamata
Serpentes
Elapidae
Micrurinae.
Micrurus
Micrurus mipartitus. Figura 7.
Rabo de candela, rabo de ají, cabeza de chocho.
49
Figura 7.Micrurus mipartitus, Duméril y Bibrón (1.854)
Cuadro 9. Características morfométricas de los ejemplares de la especie Micrurus
mipartitus
Identificación del
individuo
Mmp-001
Edad
Sexo
Adulto
Macho
Longitud total
(cm)
90,0
Longitud cola (cm)
9,5
miligramos para la especie M. mipartitus
Especie
Micrurus mipartitus
Promedio por
muestreo para
ejemplar
( mg )
0,1
50
Cantidad en miligramos
(mg) Total
2,5
7.1.3 Micrurus isozonus , Cope (1.860)
Tabla 6. Clasificación Taxonómica Micrurus isozonus
TAXONOMIA
Reino
Phylum
Sub phylum
Clase
Orden
Suborden
Familia
Subfamilia
Genero
Especie
Nombre común
Animalia
Chordata
Vertebrata
Reptilia
Squamata
Serpentes
Elapidae
Micrurinae.
Micrurus
Micrurus isozonus. Figura 8.
Coral
Figura 8. Micrurus isozonus, Cope (1.860)
51
M.isozonus
Identificación del
individuo
Mis-001
Mis-002
Edad
Sexo
Juvenil
Adulto
Macho
Macho
Longitud total
(cm)
53,0
90,0
Longitud cola (cm)
3,0
4,5
miligramos para la especie M.isozonus
Especie
los dos ejemplares
( mg )
Total
Micrurus isozonus
0,2
6,0
7.1.4 Micrurus dumerilii , Griffin (1.916)
Tabla 7. Clasificación Taxonómica Micrurus dumerilii
TAXONOMIA
Reino
Phylum
Sub phylum
Clase
Orden
Suborden
Familia
Subfamilia
Genero
Especie
Nombre común
Animalia
Chordata
Vertebrata
Reptilia
Squamata
Serpentes
Elapidae
Micrurinae.
Micrurus
Micrurus dumerilii. Figura 9.
Coral
52
Figura 9. Micrurus dumerilii, Griffin (1.9169)
Cuadro 13. Características morfométricas de los ejemplares de la especie M.
dumerilii
Identificación del
individuo
Mdm-001
Mdm-002
Edad
Sexo
Adulto
Adulto
Macho
Hembra
Longitud total
(cm)
40,0
59,0
Longitud cola (cm)
7,0
5,5
miligramos para la especie M.dumerilii.
Especie
los dos ejemplares
( mg )
Total
Micrurus dumerilii
0,05
3
7.1.5 Micrurus medemi, Roze (1.967)
53
Tabla 8. Clasificación Taxonómica Micrurus medemi
TAXONOMIA
Reino
Phylum
Sub phylum
Clase
Orden
Suborden
Familia
Subfamilia
Genero
Especie
Nombre común
Animalia
Chordata
Vertebrata
Reptilia
Squamata
Serpentes
Elapidae
Micrurinae.
Micrurus
Micrurus medemi. Figura
Coral
Figura 10. Micrurus medemi, Roze 81.967)
Cuadro 15. Características morfométricas de los ejemplares de la especie M.
mipartitus
Identificación del
individuo
Mmd-001
Mmd-002
Mmd-003
Mmd-004
Edad
Sexo
Adulto
Adulto
Adulto
Adulto
Macho
Macho
Hembra
Macho
Longitud total
(cm)
67,0
51,0
59,0
50,0
54
Longitud cola (cm)
9,5
7,0
5,5
7,0
miligramos para la especie M. medemi
Especie
los cuatro ejemplares
( mg )
Total
Micrurus medemi
0,1
4
7.2 Dosis Letal Media (DL50 )
Para determinar la dosis letal media se realizaron varios ensayos preliminares los
cuales sirvieron para establecer una dosis letal media de trabajo, para cada uno
de los venenos de las especies estudiadas. Luego de determinar la dosis letal de
trabajo, se elaboraron varias pruebas finales y de ellas se realizó un muestreo al
azar de cinco pruebas las cuales sirvieron para dar soporte estadístico a la
determinación de la dosis letal media (DL50) de los ejemplares estudiados del
genero Micrurus sp.
7.2.1 DL50 para Micrurus surinamensis surinamensis
Cuadro 17. Ensayos preliminares para la determinación de la Dosis letal Media para
el Veneno Micrurus surinamensis
Ensayo
(Dl50)
(mg) Veneno/
Peso ratón (g)
Intervalo de Confianza del 95%
1
15.4
13.4 - 17.4
2
10.6
8.2 - 13.1
3
12.3
9.6 - 15
4
19.4
11.1 - 27.6
5
10.3
8.1 - 12.9
Promedio:
Media
(Dosis letal 50 de trabajo)
:
12.3
13.6
Desviación estándar :
3.8
Limite de confianza 95% inferior
8.8
Limite de confianza 95% superior
18.3
55
Cuadro 18. Pruebas finales para la determinación de la dosis letal media para el
Veneno Micrurus surinamensis
Ensayo
(Dl50)
(mg) Veneno/
Peso ratón (g)
Intervalo de confianza del 95%
1
13,762
13,13- 14.420
2
13,365
12.818-13,935
3
13,867
13,263- 14,561
4
13,365
12,818-13.935
13,496
5
12,957-14,957
13.50
Promedio:
Media
:
13.56
0.21
13.28
13.84
Valor mínimo
13.337
Valor máximo
13.90
Estadístico W Shapiro Wilks
0,886
Probabilidad P
< 0,34
Método estadístico Spearman Karber (OMS 1981)
56
Gráfica 1. Curva de la dosis letal media del veneno Micrurus surinamensis en estado
de cautiverio en Nilo - Cundinamarca
La DL50 del veneno Micrurus surinamensis es de 13,56 µg /peso de ratón de 17 y
19 g
57
7.2.2 DL50 para Micrurus mipartitus
Cuadro 19. Ensayos preliminares para la determinación de la dosis letal media para el
Veneno Micrurus mipartitus
Ensayo
(Dl50)
(mg) Veneno/
Peso ratón (g)
1
7.06
5.02 - 9.10
2
5.77
3.1 - 8.4
3
3.7
2.6 - 4.8
4
7.42
5.33 - 9.52
5
4.16
2.8 – 5.51
Promedio:
5,77
Media
5,62
:
1,67
3,54
7,69
58
Cuadro 20. Pruebas finales para la determinación de la dosis letal media para el Veneno
Micrurus mipartitus
Ensayo
(Dl50)
(mg) Veneno/
Peso ratón (g)
1
5,53
5,50 - 5,98
2
5,32
5,28 - 5,81
3
5,62
5,28 - 5,81
4
5,53
5.39 - 5,91
5,53
5
5,28 - 5,81
5,53
Promedio:
Media
:
5,51
0,16
5,37
Valor mínimo
5,66
Valor máximo
5,64
0,832
5,32
Probabilidad P
< 0,144
59
Gráfica 2. Curva de la dosis letal media del veneno Micrurus mipartitus en estado de
cautiverio en Nilo - Cundinamarca
La DL50 del veneno Micrurus Mipartitus es de 5,53 µg /peso de ratón de 17 y 19
gramos.
60
7.2.3 DL50 para Micrurus isozonus
Veneno Micrurus isozonus
Ensayo
(Dl50)
(mg) Veneno/
Peso ratón (g)
1
29.4
19.1-37.6
2
28.2
23.1-39.2
3
23.1
14.1-32
4
26.4
20.2-32.6
5
35.4
33.4-47.5
Promedio:
28.2
Media
28.5
:
4.53
22.8
34.1
61
Cuadro 22. Pruebas finales para la determinación de la dosis letal media para el Veneno
Micrurus isozonus
Ensayo
(Dl50)
(mg) Veneno/
Peso ratón (g)
1
28,91
27,83 - 30,04
2
29,20
28,10 - 30,33
3
28,63
27,49 - 29,82
4
28,91
27,83 - 30,04
5
28,91
27,83 - 30,04
28,92
Promedio:
Media
:
28,92
0.383
28,67
Valor mínimo
29,17
Valor máximo
29,20
0.835
26,4
Probabilidad P
< 0.3254
62
Gráfica 3. Curva de la dosis letal media del veneno Micrurus isozonus en estado de
La DL50 del veneno Micrurus Isozonus es de 28,92 µg /peso de ratón de 17 y 19 g
63
7.2.4 DL50 para Micrurus dumerilii
veneno Micrurus dumerilii
Ensayo
(Dl50)
(mg) Veneno/
Peso ratón (g)
1
9,16
7,73-10,87
2
8,84
7,39-10,57
3
8,52
7,25-10,02
4
9,50
8,01-11,27
5
8,84
7,58-10,58
Promedio:
8,84
Media
8,97
:
0,37
8,51
9,44
64
Cuadro 24. Pruebas finales para la determinación de la dosis letal media para el veneno
Micrurus dumerilii
Ensayo
(Dl50)
(mg) Veneno/
Peso ratón (g)
1
9,18
8,77 – 9,61
2
9,01
8,62 – 9,40
3
8,83
8,48 – 9,20
4
9,01
8,62 – 9,40
5
8,83
8,48 – 9,20
Promedio:
8,83
Media
8,99
:
0.130
8,33
9,15
Valor mínimo
8,83
Valor máximo
9,18
0.953
Probabilidad P
< 0.76
65
Gráfica 4. Curva de la dosis letal media del veneno Micrurus dumerilii en estado de
La DL50 del veneno Micrurus dumerilii es de 8,83 µg /peso de ratón de 17 y 19 g
66
7.2.5 DL50 para Micrurus medemi
veneno Micrurus medemi
Ensayo
(Dl50)
(mg) Veneno/
Peso ratón (g)
1
41.6
39.6-49.6
2
47.1
40.1-50.1
3
43.61
35.0-52.2
4
49.3
36.9-56.6
48.4
5
38.4-53.5
Promedio:
Media
47,1
:
46
3,27
41,9
50
67
Cuadro 26. Pruebas finales para la determinación de la dosis letal media para el veneno
Micrurus medemi
Ensayo
(Dl50)
(mg) Veneno/
Peso ratón (g)
1
46,56
44,94-48,24
2
47.48
45,26-49,80
3
47,02
44,92-49,21
4
47,02
44,92-49,21
5
46,56
44,94-48,24
Promedio:
47,2
Media
46,93
:
0.383
46.45
47.41
46.56
47.48
0.809
< 0.31
Valor mínimo
Valor máximo
Probabilidad P
68
Gráfica 5. Curva de la dosis letal media del veneno Micrurus medemi en estado de
La DL50 del veneno Micrurus Medemi es de 47,2 µg /peso de ratón de 17 y 19 g
69
7.3 Dosis efectiva Media (DE50)
En la determinación de la dosis efectiva media (DE50) se implementó la técnica
utilizada por el Instituto Clodomiro Picado de Costarica según la metodología
explicada anteriormente 6.2.5. Se realizó una prueba retando el suero antiofidico
Anticoral polivalente liofilizado Lote Piloto AC - 005 producido por Laboratorios
Probiol S.A. frente a cada uno de los venenos de las especies en estudio.
7.3.1 DE50 para el Veneno de Micrurus surinamensis neutralizado por un Lote
Piloto de Suero Anticoral AC-OO5
Cuadro 27. Determinación de la DE50 del Suero Antimoral frente al veneno
Especie
(DE50)
Desviación
Estándar
Limite de
Confianza
95%
Probabilidad
(p)
1.021
0,1395
0.577- 1,46
0.0053
Gráfica 6. Curva de la dosis efectiva medio (DE50) para el veneno Micrurus surinamensis
frente al suero antiofidico anticoral polivalente liofilizado Lote piloto AC-005 producido
por Laboratorios Probiol S.A. (Técnica utilizada por el Instituto Clodomiro Picado)
Concentración [mg veneno / ml antiveneno]
70
7.3.2 DE50 para el Veneno de Micrurus mipartitus neutralizado por un Lote
Cuadro 28. Determinación de la dosis efectiva media (DE50) para el veneno Micrurus
mipartitus probando la efectividad del el suero antiofidico anticoral polivalente liofilizado
Lote piloto AC-005 producido por Laboratorios Probiol S.A. (Técnica utilizada por el
Instituto Clodomiro Picado)
Especie
(DE50)
Desviación
Estándar
Limite de
confianza
95%
Probabilidad
(p)
Micrurus mipartitus
0,862
0,196
0,235-1,48
0.022
Gráfica 7. Curva de la dosis efectiva media (DE50) para el veneno Micrurus mipartitus
frente al suero antiofidico anticoral polivalente liofilizado Lote piloto AC-005 producido
por Laboratorios Probiol S.A.
71
7.3.3. DE50 para el Veneno de Micrurus isozonus neutralizado por un el Lote
Cuadro 29. Determinación de la dosis efectiva media (DE50) para el Veneno Micrurus
isozonus frente al suero antiofidico anticoral polivalente liofilizado Lote piloto AC-005 de
producido por Laboratorios Probiol S.A. (Técnica utilizada por el Instituto Clodomiro
Picado)
Especie
(DE50)
Desviación
Estándar
Limite de
confianza
95%
Probabilidad
(p)
Micrurus isozonus
1,28
0,2
0,64 - 1,92
0,0077
Gráfica 8. Curva de la dosis efectiva media (DE50) para el veneno Micrurus isozonus frente
al suero antiofidico anticoral polivalente Liofilizado Lote piloto AC-005 producido por
Concentración [mg veneno/ ml antiveneno]
72
7.3.4. DE50 para el Veneno de Micrurus dumerilii neutralizado por un el Lote
dumerilii frente al suero antiofidico anticoral polivalente liofilizado Lote piloto AC-005
Picado)
Especie
(DE50)
Desviación
Estándar
Limite de
Confianza
95%
Probabilidad
(p)
Micrurus dumerilii
1,16
0,239
0,40-1,93
0,077
Gráfica 9. Curva de la dosis efectiva media (DE50) para el veneno Micrurus dumerilii
frente al Suero antiofidico Anticoral Polivalente Liofilizado Lote piloto AC-005 de
73
7.3.5 DE50 para el Veneno de Micrurus medemi neutralizado por un el Lote
medemi frente al Suero Antiofidico Anticoral Polivalente Liofilizado Lote piloto AC-005
Picado)
Especie
(DE50)
Desviación
Estándar
Limite de
Confianza
95%
Probabilidad
(p)
Micrurus medemi
1,55
0,222
0,8452,261
0,0060
Gráfica 10. Curva de la dosis efectiva media (DE50) para el veneno Micrurus medemi
frente al Suero Antiofidico Anticoral Polivalente Liofilizado Lote piloto AC-005 de
74
7.3.6 Relación Efectividad del Suero Anticoral Probiol respecto a los
Venenos del género Micrurus sp. Utilizados
Cuadro 32. Efectividad del Suero Antiofídico Antimoral Lote Piloto: AC – 005
frente a cinco Lotes de veneno del género Micrurus sp.
Especie
(DE50) del suero
Antiofidico anticoral
Lote Piloto: AC -005
(ml)
Cantidad de
Veneno utilizado
por Lote
(mg)
Relación de
Efectividad
(mg/ml)
1.02
0.30
0.29
0.86
0.25
0.30
1.28
0.38
0.29
1.16
0.34
0.30
1.55
0.46
0.30
Micrurus mipartitus
Micrurus isozonus
Micrurus dumerilii
Micrurus medemi
75
8. ANALISIS DE RESULTADOS
8.1 Aspectos Biològicos
8.1.1 Micrurus surinamensis surinamensis
De los trece ejemplares estudiados del género micrurus, cuatro pertenecen a la
especie Micrurus surinamensis surinamensis tres Hembras y un Macho. Anexo A.
Esta especie presenta un gran desarrollo corporal aproximadamente de 90 cm,
Silva (1994) describe ejemplares hasta de 140 cm ademas, muestran un marcado
dimorfismo sexual en cuanto al tamaño. las hembras tienen mayor longitud total y
menor longitud cola con respecto a las medidas observadas en el individuo macho
de la especie que se puede apreciar De acuerdo a lo planteado por Silva (1.994),
en donde existe un dimorfismo sexual diferenciado, en el Cuadro 7.
Los patrones de coloración en estos individuos coinciden con los reportados por
Cuvier (1.817), Campbell y Lamar (1.989) y Silva (1.994), que consta de tres
colores aposemáticos, los cuales forman anillos negros, amarillos y rojos. Los
anillos negros forman triadas bien definidas, que en un número de 6 a 9 se
extienden desde la parte posterior de la región temporal hasta la cola como se
puede apreciar en la Figura 6.
Existen datos deficientes del comportamiento de esta especie en estado de
cautiverio. Según Maldonado (2.006), se ha logrado mantener estos individuos
vivos en cautiverio de seis meses a un año, proporcionandoles un hábitat e
implementando una dieta similar a la observada en su hábitat natural.
Mantener estas serpientes vivas en cautiverio en un periodo largo es una tarea
difícil para el investigador, ya que cuando entran en un nivel alto de Stres, pierden
el apetito y no se alimentan voluntariamente, para ello Maldonado (2.006) les
implementó una dieta a base de harinas y carnes por medio de la alimentación
inducida.
8.1.2 Micrurus mipartitus
En el presente estudio se trabajó con un ejemplar Macho en total de esta especie.
Anexo A. Según Otero (1.994) esta especie puede alcanzar una talla máxima de
1,24 metros, esta especie tiene al igual que M.s.surinamensis, M.isozonus un
gran tamaño corporal. Cuadro 9. Debido a que solo se tuvo en observación un
individuo no se logró hacer una comparación entre individuos de diferente sexo.
76
El patrón de coloración del individuo observado coincide con el reportado por
Duméril y Bibron (1.854), Ángel (1.983) y Otero (1.994), que consta de tres colores
aposemáticos los cuales forman anillos blancos, negros y rojos; posee un anillo
rojo de mayor grosor encima de la cabeza y entre dos y cuatro anillos rojos en la
cola como se puede observar en la Figura 7.
Según Maldonado (2.006) en esta especie existe un tipo de coloración atípica
presente en Colombia en la que se remplazan los anillos blancos por anillos
amarillos, los cuales separan los anillos negros a lo largo de el cuerpo y poseen
una banda roja encima de la cabeza y entre dos o cuatro anillos rojos en la cola.
Existen datos deficientes acerca del comportamiento de esta especie en estado de
cautiverio. Maldonado (2.006) ha logrado mantener estos individuos vivos en
cautiverio de seis meses a un año, proporcionandoles un hábitat e implementando
una dieta similar a la observada en su hábitat natural.
inducida.
8.1.3 Micrurus isozonus
En esta investigación se trabajó con dos ejemplares Machos. Anexo A. Según
Cope (1.860), Campbell y Lamar (1.989), Maldonado (2.006) esta especie es
endémica para Colombia. Debido a que el número de individuos es bajo y poseen
el mismo sexo, no se logró hacer una comparación entre individuos Hembras y
Machos de la misma especie. Los individuos observados en cautiverio presentan
tamaño corporal entre 53 – 90 y una longitud de la cola inferior a las medidas
observadas en otras especies del género Micrurus sp.Cuadro 11.
El patrón de coloración de los individuos observados en esta especie es similar al
reportado por Silva (1.994) para la especie Micrurus spixii obscurus, formado
por anillos de colores negro, amarillo y rojo, los cuales se agrupan en triadas
amplias, bien definidas, que en número de 5 a 7 se extienden desde la nuca hasta
la cola del ofídio. Las triadas de anillos negros están separadas una de la otra por
dos anillos amarillos en medio de dos anillos rojos.Figura 8.
Al comparar el patrón cromático de estas dos especies M.isozonus y M.spixii
obscurus difieren en que los individuos de la especie M.spixii poseen abundante
pigmento melánico en las escamas dorso laterales del cuerpo del ofídio, por lo
cual adquiere una coloración negra brillante, mientras que en los individuos de la
especie M.isozonus la presencia de melanina es inferior, solo se encuentran
bordeando las escamas, los colores amarillo y rojo son nítidos y brillantes, el
77
hocico es amarillo y negro con una banda rojo en la cabeza, el vientre de la
cabeza usualmente rojo y amarillo con pigmento negro hacia las escamas que
bordean la boca. De aceurdo con lo planteado por Campbell y Lamar (2.004) el
patrón de coloración reportado para esta especie difiere con las especies
evaluadas en Piscilago en que se cambian los anillos blancos por anillos amarillos.
De su biología, toxinología y comportamiento en el medio ambiente natutal y
artificial se conoce muy poco; Maldonado (2.006) ha logrado mantener estos
individuos vivos en cautiverio alrededor de dos años, proporcionandoles un hábitat
e implementando una dieta similar a la observada en su hábitat natural.
inducida.
8.1.4 Micrurus dumerilii
En esta investigación se trabajó con dos ejemplares, una Hembra, un Macho.
Anexo A. Según los reportes de Griffin (1.916), Maldonado (2.006), esta especie
es endémica para Colombia. Alcanza una talla máxima de 65 cm. posee un
tamaño corporal pequeño con respecto a otras especies del género Micrurus como
M.s.surinamensis, M.mipartitus, M.isozonus. Los individuos observados presentan
un dimorfismo sexual pronunciado, la Hembra posee mayor longitud total y menor
longitud cola. Cuadro 13.
El patrón de coloración de los individuos observados en esta especie coinciden
con los reportados por Griffin (1.916) el cual consta de tres colores aposemáticos
los cuales forman aproximadamente 18 repeticiones de un anillo negro en medio
de dos anillos blancos que a su vez se encuentran en medio de dos anillos rojos.
La cabeza es negra con un anillo blanco encima. La cola posee de 5 a 6
repeticiones un anillo negro y uno blanco. Figura 9.
De su biología, comportamiento en el medio ambiente natutal y artificial se conoce
muy poco; Maldonado (2.006) ha logrado mantener estos individuos vivos en
cautiverio alrededor de dos años, proporcionandoles un hábitat e implementando
una dieta similar a la observada en su hábitat natural.
inducida.
78
8.1.5 Micrurus medemi
En el presente trabajo se estudiaron cuatro ejemplares en total, una Hembra que
se logró reproducir satisfactoriamente en cauiverio y tres Machos. Anexo A. De
acuerdo a lo planteado por Roze (1.967), Maldonado (2.006), esta es una especie
endémica de Colombia, que puede llegar a medir alrededor de 60 a 67 cm en
estado de cutiverio. Cuadro 15.
Estas serpientes tienen una coloración atípica a otras corales ya que por lo
general las corales poseen tres colores, mientras que en esta especie posee dos
patrones cromáticos de dos colores, anillos negros anchos y anillos amarillos
delgados o anillos negros anchos y anillos rojos delgados en repeticiones de 42 –
45. Figura 10.
Existen datos deficientes de la biología y comportamiento de esta especie en
estado tanto en su hábitat natural como en cautiverio; Maldonado (2.006) ha
logrado mantener estos individuos vivos en cautiverio alrededor de dos años,
proporcionandoles un hábitat e implementando una dieta similar a la observada en
su hábitat natural.
inducida.
8.2 Dosis Letal Media (DL50)
Para este estudio se realizaron cinco pruebas finales a cada veneno para cada
especie en estudio. El número de pruebas realizadas siguiendo siempre la misma
metodología garantizó que los parámetros que influían de forma directa en los
resultados estuvieran siempre bajo control y permitió normalizar el ensayo de
determinación de la DL50 del veneno de las Serpientes del genero Micrurus,
especies Micrurus surinamensis surinamensis, Micrurus mipartitus, Micrurus
isozonus, Micrurus dumerilii y Micrurus medemi ya que se demostró que en las
diferentes pruebas finales los límites de los valores estimados de las respectivas
DL50 para un intervalo de confianza de 95 %, se encontraban ampliamente dentro
dicho intervalo.
8.2.1 (DL50) para Micrurus surinamensis surinamensis
El cuadro 17 muestra en el promedio la dosis letal de 12,3 g/ratón para Micrurus
surinamensis, esta dosis fue utilizada para deteminar la dosis letal de las pruebas
79
finales, Los resultados obtenidos Cuadro 18, permiten definir la DL50 del veneno
M.surinamensis utilizado como de 13,50 g que al ser inoculado
intraperitonealmente en ratones albinos de peso entre 17 y 19 gramos provoca la
muerte al 50% de los animales inoculados. Gráfica 1.
Al comparar la DL50 de 13,50 g/raton, para el Veneno de la Micrurus surinamensis
utilizado, con la dosis letal reportada para la misma especie, por Silva (1994) de
10,25 µg/peso del ratón, se observa una marcada diferencia que se puede explicar
por muchas razones: Primero: la zona geografica donde se realizo el estudio, Silva
trabajo en el amazonas, mientras que el presente estudio fue realizado en Nilo
Cundimarca; Segundo: Las serpientes utilizadas por Silva fueron serpientes en su
habitat natural mientras, el presente estudio son ejemplares en cautiverio
sometidas a alimentacion artificial y aun alto grado de stress. Estas razones
pueden con llevar variaciones en las dosis letales para esta especie.
8.2.2 (DL50) para Micrurus mipartitus
En los ensayos preliminares la dosis letal media promedio es de 5.77 g/ratón para
Micrurus mipartitus Cuadro 19, esta dosis fue utilizada para deteminar la dosis
letal de las pruebas finales. En las pruebas finales el veneno de la especie
Micrurus mipartitus utilizada presentó una DL50 de 5,53 g/ratón, Gráfica 2,
mostrándose altamente tóxico, comparado con los venenos de las otras especies
estudiadas y con la DL50 para M.mipartitus reportada por Pineda(2002) de (9
µg/ratón). Estas diferencias se deben como se explico anteriormente a que las
caracteristicas del veneno pueden variar significativamente de una region a otra y
de igual manera las condiciones del habitat en cautiverio o natural. Cuadro 20.
8.2.3 (DL50) para Micrurus isozonus
Se realizó un ensayo preliminar para determinar la dosis letal media inicial de
trabajo de 28.2 µg/ratón. Cuadro 21. En el Cuadro 22 se observan los resultados
para la DL50 obtenida para el veneno Micrurus isozonus que fue de 28,92 µg/ por
ratón, equivalente a la cantidad de veneno de Micrurus isozonus que causo la
muerte del 50% de los animales en 48 horas. Gráfica 3. No se encuentra ningún
reporte de dosis letal media en la literatura científica para esta especie en
Colombia lo que dificulta su comparación.
En relación con las otras especies estudiadas los resultados de la dosis letal
media es menor que las obtenidas para las especies M.surinamensis, M.mipartitus
y M.dumerilii.
8.2.4 (DL50) para Micrurus dumerilii
Cuadro 23. En los ensayos preliminares para la determinación de la dosis letal
media inicial de estudio fue 8.84 µg/ratón. Los resultados para el estudio de la
80
dosis letal media final observados en el Cuadro 24, de M.dumerilii utilizado se
pueden definir como 8.83 µg de veneno que al ser inoculado a ratones albinos de
17 a 19 gramos ocasionan la muerte al 50% del total de la poblacion inoculada. No
se encuentra ningún reporte de dosis letal media en la literatura científica para
esta especie en Colombia lo que dificulta su comparación.Gráfica 4.
De acuerdo con Bolivar(2.006) la especie Micrurus dumerilii, presenta junto a la
Micrurus mipartitus la mayor accidentalidad por la familia Elapidae en Colombia.
Es importante recalcar que de acuerdo a los resultados obtenidos Micrurus
dumerilli presenta el veneno más tóxico despues de M.mipartitus.
8.2.5 (DL50) para Micrurus medemi
En el Cuadro 25 se observa una dosis letal media inicial de trabajo de 47.1
µg/ratón. Se calculó la dosis letal media para la especie Micrurus medemi de 47.2
µg por peso de ratón. Cuadro 26. Se inocularon ratones albinos de la especie Mus
musculus vía intraperitoneal con pesos de 17 a 19 gramos y se definio la dosis
letal media como la cantidad en microgramos de veneno capaz de matar al
cincuenta por ciento de la población inoculada.Gráfica 5.
Es importante recordar que esta especie es endemica para Colombia y hasta
ahora no se ha reportado la dosis letal media lo que dificulta su comparación.
8.3 Dosis Efectiva Media (DE50)
Utilizando la metodología del Instituto Clodomiro Picado de Costa Rica, la dosis
efectiva media de un suero antiofídico polivalente ó específico en la evaluación
experimental frente al efecto letal medio del veneno de las serpientes debe
neutralizar al menos tres dosis letales medias de veneno utilizado en la
experimentación. El suero antiofídico anticoral lote piloto AC-005 neutraliza de la
misma forma los diferentes venenos de las especies Micrurus sp. estudiadas,
estando en una relación de aproximadamente 0.3 mg/ml de efectividad del suero
antiofídico antielapídico producido por Laboratorios Probiol. Cuadro 32.
veneno de la especie Micrurus surinamensis
La dosis efectiva media del suero anticoral producido por Laboratorios Probiol es
de 1,021 mg/ml capaz de salvar el 50% de la población inoculada utilizando
ratones albinos de la especie Mus musculus con pesos entre 20 -22 gramos.
Gráfica 6. Donde 1,021 ml de suero antiofidico anticoral polivalente liofilizado
producido por Laboratorios Probiol S.A. Lote AC-005 neutraliza 0.304 mg de
veneno Micrurus surinamensis con un limite de confianza del 95% entre 0.5771,46 y con una probabilidad de p = 0.0053.Cuadro 27.
81
veneno de la especie Micrurus mipartitus.
En el Cuadro 28 se observa la dosis efectiva media del suero anticoral producido por
Laboratorios Probiol Lote AC-005 que es de 0.862 ml que neutraliza 0.25 mg de veneno
Micrurus mipartitus con un limite de confianza del 95% entre 0,235-1,48 y con una
probabilidad de p = 0.022. Esta dosis efectiva media es capaz de salvar el 50% de la
población inoculada utilizando ratones albinos de la especie Mus musculus con pesos entre
20 – 22 gramos. Figura 7.
veneno de la especie Micrurus isozonus.
La (DE50) es de 1,28 ml de suero antiofidico anticoral polivalente liofilizado
producido por Laboratorios Probiol Lote AC-005 que neutraliza 0.384 mg de
veneno Micrurus isozonus con un limite de confianza del 95% entre 0,64 - 1,92 y
con una probabilidad de p = 0.0077.Cuadro 29. Esta dosis es capaz de salvar el
50% de la población inoculada utilizando ratones de la especie Mus musculus con
pesos de 20 – 22 gramos. Figura 8.
veneno de la especie Micrurus dumerilii.
En el Cuadro 30 se observa la (DE50) es de 1,16 mg/ml. Donde 1,16 ml de suero
antiofidico anticoral polivalente liofilizado producido por Laboratorios Probiol S.A.
Lote AC-005 neutraliza 0.348 mg de veneno Micrurus dumerilii en donde sobrevive
el 50% de la población inoculada utilizando ratones albinos de la especie Mus
musculus. Figura 9. Con un limite de confianza del 95% entre 0,40-1,93 y con una
probabilidad de p = 0.077.
veneno de la especie Micrurus medemi.
La (DE50) es de 1,55 mg/ml en donde sobrevive el 50% de la población inoculada
con el veneno de la especie Micrurus medemi como se observa en la Gráfica 10.
Donde 1,55 ml de Suero Antiofídico Anticoral Polivalente Liofilizado de Probiol S.A.
Lote AC-005 neutraliza 0.465 mg de veneno Micrurus medemi con un limite de
confianza del 95% entre 0,845-2,261 y con una probabilidad de p = 0.0060.
Cuadro 31.
82
9. CONCLUSIONES
En la literatura científica se evidencia una deficiente información acerca de la
categoría de amenaza, vulnerabilidad, extinción, estudios poblacionales,
toxinología y comportamiento de las serpientes del género Micrurus sp. presentes
en Colombia en estado de cautiverio.
Igualmente solo se reporta la Dl50 para dos de las cinco especies evaluadas; la
especie Micrurus surinamensis en la Amazonia Colombiana tiene una Dl50 de10,25
µg/ratón utilizando ratones de 25 a 35 gramos e inoculandolos
intraperitonealmente (Silva, 1.994) y una Dl50 para la especie Micrurus mipartitus
de 9 mg/ratón utilizando como biomodelo ratones albinos de 18 -20 gramos por
nivel (Pineda, 2.002).
Es de aclarar que existe error en las unidades de medida en la Dl50 teórica
planteada por Pineda (2.002) para la especie M.mipartirus ya que los resultados
de dosis letales se determinan en µg por gramos o peso del animal inoculado, lo
que dificulta una comparación de las dosis letales medias teóricas y las obtenidas
experimentalmente.
La DL50 del veneno de cada una de las cinco especies del género Micrurus sp.
puede ser determinada a través de inoculaciones por vía intraperitoneal en ratones
albinos de la especie Mus musculus con pesos entre 17 y 19 gramos sin distinción
de sexo. Se demostró resultados satisfactorios tanto en sensibilidad como en
reproducibilidad al utilizar un modelo estadístico Spearman Karber el cual nos
permitió calcular una Dl50 inicial de trabajo.
Se encontró que la toxinología de los venenos puede variar entre especies y aún
utilizando el veneno de un mismo ejemplar obteniendo como resultado este orden
de toxicidad en las cinco especies de Micrurus sp. evaluadas: Micrurus mipartitus
< Micrurus dumerilii< Micrurus surinamensis< Micrurus isozonus< Micrurus
medemi. Indicando que el que tiene una menor DL50 se caracteriza como el más
tóxico.
Estos cambios en la Dl50 puede atribuirse a los diferentes niveles de stress a los
que son sometidas las serpientes, que conllevan a la muerte por inanición y a los
cambios en la alimentación que se deben implementar para lograr mantenerlas
con vida por un largo periodo de tiempo.
En la evaluación del Lote Piloto: AC-005 de suero antiofidico antielapídico
producido por Laboratorios Probiol S.A., se demostró que posee una capacidad
83
neutralizante de los cinco lotes de veneno utilizados del género Micrurus sp. Es
muy importante lo anteriormente mencionado, ya que respalda el uso del suero
polivalente en accidentes causados por las especies: Micrurus surinamensis,
Micrurus mipartirus, Micrurus isozonus, Micrurus dumerilii y Micrurus medemi.
El suero antiofidico antielpídico neutraliza de la misma forma los diferentes
venenos mencionados anteriormente sin importar la especie que se refieran,
estando en una relación de efectividad de aproximadamente 0.3mg/ml del Lote
Piloto de suero anticoral frente a los cinco Lotes de veneno micrúrico analizados.
Es decir que 1 cm de suero anticoral polivalente está neutralizando 0.3 mg de
veneno micrúrico de las especies evaluadas.
Esto nos indica que no hay especificidad en la relación del suero anticoral y
tampoco se tendrían en cuanta las dosis letales medias de cada uno de los
venenos. En este sentido el suero antiofidico antielapídico analizado tiene el
mismo grado de efectividad independientemente de las especies evaluadas y
teniendo constante el volumen de veneno utilizado.
84
10. RECOMENDACIONES
Las serpientes del género Micrurus sp. en estado de cautiverio mueren por
inanición, por lo tanto se debe implementar diferentes dietas para suplir las
necesidades vitales de acuerdo con sus hábitos de alimentación en su hábitat
natural; el cual debe basarse en lo reportado por Silva (1.994) y lo recomendado
por Maldonado (2.006), una alimentación a base de celicilias, bachias, alevinos y
pequeñas serpientes.
La determinación de la dosis letal media se realizó utilizando 13 individuos del
género Micrurus sp., que sirven como base a posteriores estudios ampliando la
muestra experimental y así se aumentaría la cantidad en mg de cada uno de los
lotes de veneno a evaluar.
Se recomienda determinar la Dl50 del veneno de las serpientes de acuerdo a la
zona geográfica de su captura, ya que se han demostrado variaciones
significativas en su composición que podrían tener importancia médica,
filogenética y taxonómica.
Para calcular una Dl50 inicial de trabajo o reto en la fase experimental inicial se
debe utilizar un modelo estadístico que permita calcular la dosis letal media inicial
experimental sin tener en cuenta una d entre las diluciones. En la determinación
de la Dl50 de la fase experimental final se debe utilizar un modelo estadístico
utilizando una d aprobada por la OMS.
El grado de toxicidad de los venenos evaluados presenta variabilidades entre
especies e incluso utilizando el veneno de un mismo ejemplar, por lo tanto no se
recomienda un método para la dosificación del suero anticoral y difícilimente
puede concebirse una prueba única general.
En el cálculo de la DE50 planteada por el Instituto Clodomiro Picado de Costa Rica
no se tiene en cuenta la dosis letal media del lote de veneno, pero esta dosis
efectiva media del suero antiofidico debe cubrir mínimo 3DL50 del lote de veneno a
evaluar.
85
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90
INDICE ALAFABETICO
Acción Postsináptica: Actividad neurotóxica del veneno en un sitio
específico de acción dentro de la unión neuromuscular después de la
sinapsis.
20
Acción Presináptica: Actividad neurotóxica del veneno en un sitio
específico de acción dentro de la unión neuromuscular antes de la
sinapsis.
21
Dosis Letal Media (DL50): Es la dosis de preparación u organismo que
mata el 50% de los animales inoculados.
43
Dosis Efectiva Media (DE50): Es la dosis de preparación en la que
sobrevive el 50% de los animales inoculados.
45
Liofilizado: Deshidratar algo en vacío. El Suero antiofídico Liofilizado no
necesita refrigeración ya que es seco.
37
Miotóxico: Daños en el corazón por efectos de una intoxicación.
26
Monovalente: Se hace referencia al Suero antiofídico específico para una
sola especie de serpientes.
35
Neurotóxico: Daños en el sistema nervioso por efectos de una
intoxicación.
31
OMS: Organización Mundial de la Salud.
37
Polivalente: Se hace referencia al Suero antiofídico que tiene efectividad
sobre varias especies de una misma familia de serpientes.
36
Proteroglifas: Tipo de dentición de las Micrurus. Su aparato venenoso
consta de un diente acanalado a cada lado de la parte anterior de la
maxila y dos glándulas productoras de veneno. Dichos dientes son
profundamente acanalados y por medio de un conducto se comunican con
las glándulas, que son grandes y están colocadas en la región temporal,
una a cada lado de la cabeza. Los dientes inyectores de las serpientes
proteroglifas son fijos y relativamente cortos, pero esto se encuentra
compensado por un activo veneno neurotóxico.
27
91
Tanatofídios: Son las modificaciones osteológicas de los huesos de las
serpientes para inocular toxinas por medio del aparato venenoso. Las
serpientes Proteroglifas y Solenoglifas son conocidas como tanatofídios.
27
Toxinología: Estudio de las toxinas producidas por glándulas secretoras
de veneno.
21
Vía Intraperitoneal (I.P): Dícese de lo que está o se pone en el interior
del peritoneo. Inóculos intraperitoneales.
32
Vía Intramuscular (I.M): Dícese de lo que está o se pone en el interior de
los músculos. Inyección intramuscular.
32
Vía Intravenosa (I.V): Dícese de lo que está o se pone en el interior de las
venas. Inyección intravenosa.
33
92
ANEXOS
93
ANEXO A. FICHA DE ASPECTOS BIOLOGICOS DE LAS ESPECIES EN
ESTUDIO
1. IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA:
NOMBRE CIENTÍFICO:
Micrurus s.surinamensis
NOMBRE VULGAR:
Coral
CODIGO
Ms-001
2. CATEGORIA DE AMENAZA UICN: No aplica APÉNDICE CITES: No aplica
3. SEXO: Hembra EDAD: aprox. Neonato____Juvenil____Adulto__X__
4. CONDICIONES FISICA:
4.1 Tegumento: Piel cubierta de escamas.
4.2 Sistema Óseo: Constituido por vértebras que le permiten gran flexibilidad.
4.3 Dentición: El tipo de dentición presente es llamado Proteroglifa, el maxilar superior es alargado (belfas).
4.4 Estado.reproductivo: El ejemplar se encuentra apto para la reproducción.
4.5 Descripción: Dentro del género Micrurus es una especie de mayor tamaño en comparación con otras especies del mismo
género, posee colores aposemáticos rojo, amarillo, negro, que indican advertencia; su cabeza es pequeña de color rojo con líneas
negras en forma de red, con cuello no diferenciado y ojos muy pequeños.
4.6 Locomoción: Serpentino, la serpiente contrae sus músculos para generar una serie de movimientos ondulatorios, este es la
locomoción común en todas las serpientes de coral.
5. MOFORMETRIA:
Longitud total: 89,5 cm.
Longitud Cola: 8.0 cm.
6. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA: Geográficamente se encuentra en la Amazonía y Orinoquía Colombiana; presentando una alta
ocurrencia poblacional en las regiones limítrofes de Brasil y Perú con Colombia. Se aprecia una disminución de la incidencia
poblacional hacia el norte y el centro de la Amazonia Colombiana, en los territorios de Guaviare, Guainía, Vaupés y Orinoquía.
7. HÁBITAT: Habitan en zonas de clima medio y cálido. Algunas especies tienen vida semisubterránea, hábitos nocturnos y prefieren
permanecer ocultas bajo la hojarasca, piedras, troncos, son de carácter manso, tímidas de hábitos nocturnos. Su hábitat natural es el
bosque tropical siempre cerca de áreas acuáticas entre 0 y 600 msnm.
8. HISTORIA NATURAL DE LA ESPECIE EN CAUTIVERIO:
8.1 Patrón de actividad: Durante el día su actividad es mínima, en la noche tiene mayor actividad.
8.2 Locomoción y postura: Permanece enrollada en las cajas herpetológicas, cuando se le va ha extraer el veneno, se levanta la
cola y esconde la cabeza.
8.3 Dormideros: Se le acondicionó un recipiente plástico transparente, con tierra negra rica en humus, y un recipiente con agua.
8.4 Dieta: Alimentación artificial inducida con ratones pinck (recién nacidos) de la especie Mus musculus. El Doctor Jairo Maldonado
realiza una mezcla de harinas y carnes, y las ha mantenido por más de un año en el Serpentario del Parque Recreacional y Zoológico
Piscilago en Nilo – Cundinamarca.
9. COMPORTAMIENTO DEL INDIVIDUO:
9.1 Patrón de actividad: En general su patrón de actividad es mínimo. Mantener esta especie en cautiverio es una tarea difícil para
el investigador, ya que pierden el apetito y no se alimentan por si mismas.
9.2 Comportamiento Social: Cuando se les extrae veneno son agresivas, por lo general las serpientes se mantienen en cajas
individuales; solo se mantienen más de dos serpientes de la misma especie cuando son de la misma camada.
9.3 Interacción con otras especies: El comportamiento social con otras especies es agresivo.
10. MANIPULACIÓN: La inmovilización de la serpiente se hace directamente con la mano, debido a su tamaño, ya que las pinzas
herpetológicas lastimarían la serpiente o expondrían al investigador a una mordedura letal; para ello se toman medidas preventivas, y
la manipulación solo lo realiza una persona experta.
11. TRANSPORTE: Se transportan por medio de cajas herpetológicas.
94
NOMBRE CIENTÍFICO:
NOMBRE VULGAR:
Coral
CODIGO
Ms-002
5. MOFORMETRIA:
Longitud Cola: 11,0 cm.
95
NOMBRE CIENTÍFICO:
NOMBRE VULGAR:
Coral
CODIGO
Ms-003
3. SEXO: Macho EDAD: aprox. Neonato____Juvenil__ X___Adulto______
5. MOFORMETRIA:
Longitud total: 64.5 cm.
96
NOMBRE CIENTÍFICO:
NOMBRE VULGAR:
Coral
CODIGO
Ms-004
5. MOFORMETRIA:
97
1. IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA: 1
NOMBRE CIENTÍFICO:
Micrurus mipartitus
NOMBRE VULGAR:
Rabo de ají , cabeza de chocho, rabo de candela.
CODIGO
Mp-001
3. SEXO: Macho EDAD: aprox. Neonato____Juvenil____Adulto__X__
4.1 Tegumento: Piel cubierta de escamas. Posee 15 hileras de escamas dorsales y carecen de escama loreal.
4.5 Descripción: Presenta colores aposemáticos: negros, rojos y blancos, esta serpiente presenta un anillo rojo en la cabeza, y
cinco anillos rojos en la cola intercalados de anillos negros, el resto de su cuerpo posee un anillo negro, seguido de un anillo
blanco. Su cabeza es pequeña, sin diferenciación de cuello, el ojo es pequeño.
5. MOFORMETRIA:
Longitud total: 90 cm.
Longitud Cola: 9,5cm.
6.DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA: Geográficamente se encuentra principalmente en la Cordillera de los Andes, Antioquia y Chocó,
encontrándose ampliamente distribuida en todo el territorio Colombiano, a una altura aproximada de 1.800 metros sobre el nivel
del mar.
7. HÁBITAT: Habitan en principalmente en zonas húmedas, zonas productoras de café y selváticas, esta especie vive en cercanía
estrecha con los seres humanos, ya que prefieren los cultivos de café. Tiene hábitos nocturnos y subterráneos, pero también se
encuentra oculta entre la hojarasca, grietas, y troncos podridos.
8.1 Patrón de actividad: Tiene mayor actividad nocturna.
8.2 Locomoción y postura: Permanece buscando la manera de ocultarse en la tierra cuando se va a manipular para extraer su
veneno.
8.3 Dormideros: Se le acondicionó un recipiente plástico transparente, con tierra negra, con hojarasca y un recipiente con agua.
8.4 Dieta: Alimentación artificial inducida con ratones pinck (recién nacidos) de la especie Mus musculus. El Doctor Jairo
Maldonado realiza una mezcla de harinas y carnes, y las ha mantenido por más de un año en el Serpentario del Parque
Recreacional y Zoológico Piscilago en Nilo – Cundinamarca.
9.1 Patrón de actividad: En general su patrón de actividad es mínimo. Mantener esta especie en cautiverio es una tarea difícil
para el investigador, ya que pierden el apetito y no se alimentan por si mismas.
9.2 Comportamiento Social: Cuando se les extrae veneno no tiene conducta agresiva.
herpetológicas lastimarían la serpiente o expondrían al investigador a una mordedura letal; para ello se toman medidas
preventivas, y la manipulación solo lo realiza una persona experta.
11. TRANSPORTE: Se transportan por medio de cajas herpetológicas
98
NOMBRE CIENTÍFICO:
Micrurus isozonus
NOMBRE VULGAR:
Coral
Mis-001
3. SEXO: Macho EDAD: aprox. Neonato____Juvenil__ X__ Adulto ____
4. CONDICIONES FISICAS:
4.5 Descripción: Dentro del género Micrurus es una especie de tamaño grande, posee colores aposemáticos negro, amarillo,
rojo; el patrón de coloración del cuerpo es tres anillos negros intercalados de dos anillos amarillos, en medio de dos anillos rojos.
Existe pocos reportes acerca de su biología.
5. MOFORMETRIA:
Longitud Cola: 3 cm.
6. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA: Geográficamente esta especie se encuentra en la Región de la Orinoquía. De su Ubicación
geográfica se conoce muy poco.
7. HÁBITAT: Habitan la región de la Orinoquía, se distribuye aproximadamente en Colombia hasta los 1.400 metros sobre el nivel
del mar.
8.1 Patrón de actividad: Mayor actividad nocturna.
8.2 Locomoción y postura: En el día permanece enrollada, locomoción serpentina, en el momento de manipularla para la
extracción del veneno, la serpiente se torna agresiva, se enrolla escondiendo la cabeza debajo de su cuerpo y levanta la cola a
manera de señuelo.
8.3 Dormideros: Se le acondicionó un recipiente plástico transparente, con tierra negra, con hojarasca, y un recipiente con agua.
8.4 Dieta: El Doctor Jairo Maldonado implementó una dieta que incluye cecilias, bachias, serpientes pequeñas y alimentación
artificial inducida con una mezcla de harinas y carnes.
9. COMPORTAMIENTO DE LA ESPECIE:
9.1 Patrón de actividad: Nocturno.
9.2 Comportamiento Social: Se ha logrado satisfactoriamente mantener viva dos años en cautiverio.
9.3 Interacción con otras especies: Es agresivo, esta serpiente es ofidiófaga.
herpetológicas lastimarían la serpiente o expondrían al investigador a una mordedura letal; para ello se toman medidas preventivas
y la manipulación solo lo realiza una persona experta.
99
NOMBRE CIENTÍFICO:
Micrurus isozonus
NOMBRE VULGAR:
Coral
CODIGO
Miso-002
3. SEXO: Macho EDAD: aprox. Neonato____Juvenil ____Adulto __ X__
4.5 Descripción: Dentro del género Micrurus es una especie de tamaño grande, posee colores aposemáticos negro, amarillo,
rojo; el patrón de coloración del cuerpo es tres anillos negros intercalados de dos anillos amarillos, en medio de dos anillos
rojos. Existen pocos reportes acerca de su biología.
5. MOFORMETRIA:
Longitud Cola: 4,5cm.
6. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA: Geográficamente esta especie se encuentra en la Región de la Orinoquía. De su Ubicación
geográfica se conoce muy poco.
7. HÁBITAT: Habitan la región de la Orinoquía, se distribuye aproximadamente en Colombia hasta los 1.400 metros sobre el
nivel del mar.
8.2 Locomoción y postura: En el día permanece enrollada, locomoción serpentina, en el momento de manipularla para la
extracción del veneno, la serpiente se torna agresiva, se enrolla escondiendo la cabeza debajo de su cuerpo y levanta la cola a
manera de señuelo.
8.3 Dormideros: Se le acondicionó un recipiente plástico transparente, con tierra negra, con hojarasca, y un recipiente con
agua.
10. MANIPULACIÓN: La inmovilización de la serpiente se hace directamente con la mano, debido a su tamaño, ya que las
pinzas herpetológicas lastimarían la serpiente o expondrían al investigador a una mordedura letal; para ello se toman medidas
preventivas y la manipulación solo lo realiza una persona experta.
100
2
NOMBRE CIENTÍFICO:
Micrurus dumerilli
NOMBRE VULGAR:
Coral
CODIGO
Mdm- 001
3. SEXO: Macho EDAD: aprox. Neonato____Juvenil _____ Adulto__X__
4.5 Descripción: Dentro del género Micrurus es una especie de tamaño pequeño, posee colores aposemáticos, anillos negros
intercalados con anillos blancos en cabeza y cola, sin cuello diferenciado del resto del cuerpo, su cola tiene un adelgazamiento
brusco, el patrón de coloración del cuerpo es distinto de la cola, a lo largo del cuerpo posee en medio de dos anillos rojos un anillo
blanco seguido de un anillo negro, la cola tiene un anillo negros en medio dos anillos blancos en seis repeticiones.
5. MOFORMETRIA:
Longitud Cola: 7 cm.
6. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA: Geográficamente esta especie se encuentra en la Región Andina, Antioquia, Sierra Nevada de
Santa Martha. En Colombia esta especie se encuentra en tierras del oeste del país.
7. HÁBITAT: Habitan en el bosque seco aproximadamente 2.133 metros sobre el nivel del mar.
8.2 Locomoción y postura: En el día permanece enrollada, locomoción serpentina.
101
1. IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA: 1
NOMBRE CIENTÍFICO:
Micrurus dumerilli
NOMBRE VULGAR:
Coral
CODIGO
Mdm -002
3. SEXO: Hembra EDAD: aprox. Neonato____Juvenil ______Adulto__ X__
4.5 Descripción: Dentro del género Micrurus es una especie de tamaño pequeño, posee colores aposemáticos, anillos negros
intercalados con anillos blancos en cabeza y cola, sin cuello diferenciado del resto del cuerpo, su cola tiene un adelgazamiento
brusco, el patrón de coloración del cuerpo es distinto de la cola, a lo largo del cuerpo posee en medio de dos anillos rojos un anillo
blanco seguido de un anillo negro, la cola tiene un anillo negros en medio dos anillos blancos en seis repeticiones.
5. MOFORMETRIA:
6. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA: Geográficamente esta especie se encuentra en la Región Andina, Antioquia, Sierra Nevada de
Santa Martha. En Colombia esta especie se encuentra en tierras del oeste del país.
7. HÁBITAT: Habitan en el bosque seco aproximadamente 2.133 metros sobre el nivel del mar.
8.2 Locomoción y postura: En el día permanece buscando la oscuridad.
102
NOMBRE CIENTÍFICO:
Micrurus medemi
1
NOMBRE VULGAR:
Coral
CODIGO
Mmd-001
4.5 Descripción: Dentro del género Micrurus es una especie que posee un patrón de coloración diferente a otras
corales, posee colores aposemáticos, anillos negros intercalados con anillos rojos, su cabeza es pequeña, sin cuello
diferenciado del resto del cuerpo, su cola tiene un adelgazamiento brusco.
4.6 Locomoción: Serpentino, la serpiente contrae sus músculos para generar una serie de movimientos ondulatorios,
este es la locomoción común en todas las serpientes de coral.
5. MOFORMETRIA:
6. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA: Este ejemplar proviene de Villavicencio (Meta), de su distribución geográfica se sabe
muy poco. Es una especie endémica de Colombia.
7. HÁBITAT: Habitan en el bosque húmedo tropical y seco entre 250 – 600 metros sobre el nivel del mar, del territorio
Colombiano.
8.3 Dormideros: Se le acondicionó un recipiente plástico transparente, con tierra negra, con hojarasca, y un recipiente
con agua.
8.4 Dieta: El Doctor Jairo Maldonado les implementó una dieta que incluye cecilias, bachias, serpientes pequeñas y
alimentación artificial inducida con una mezcla de harinas y carnes.
9.2 Comportamiento Social: Se ha logrado satisfactoriamente la reproducción en cautiverio de esta especie; se han
mantenido vivas por más de dos años con la implementación de la dieta artificial inducida, ya que la mayoría de las
corales no se alimentan voluntariamente en cautiverio.
10. MANIPULACIÓN: La inmovilización de la serpiente se hace directamente con la mano, debido a su tamaño, ya que
las pinzas herpetológicas lastimarían la serpiente o expondrían al investigador a una mordedura letal; para ello se toman
medidas preventivas, y la manipulación solo lo realiza una persona experta.
103
1.
IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA:
NOMBRE CIENTÍFICO:
Micrurus medemi
NOMBRE VULGAR:
Coral
CODIGO
Mmd-002
4.5 Descripción: Dentro del género Micrurus es una especie que posee un patrón de coloración diferente a otras corales, posee
colores aposemáticos, anillos negros intercalados con anillos blancos, su cabeza es pequeña, sin cuello diferenciado del resto del
cuerpo, su cola tiene un adelgazamiento brusco.
5. MOFORMETRIA:
6. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA: Este ejemplar proviene de Villavicencio (Meta), de su distribución geográfica se sabe muy
poco. Es una especie endémica de Colombia.
7. HÁBITAT: Habitan en el bosque húmedo tropical y seco entre 250 – 600 metros sobre el nivel del mar, del territorio Colombiano.
8.4 Dieta: El Doctor Jairo Maldonado les implementó una dieta que incluye cecilias, bachias, serpientes pequeñas y alimentación
9.2 Comportamiento Social: Se ha logrado satisfactoriamente la reproducción en cautiverio de esta especie; se han mantenido
vivas por más de dos años con la implementación de la dieta artificial inducida, ya que la mayoría de las corales no se alimentan
voluntariamente en cautiverio.
herpetológicas lastimarían la serpiente o expondrían al investigador a una mordedura letal; para ello se toman medidas
preventivas, y la manipulación solo lo realiza una persona experta.
104
NOMBRE CIENTÍFICO:
Micrurus medemi
NOMBRE VULGAR:
Coral
CODIGO
Mmd-003
4.5 Descripción: Dentro del género Micrurus es una especie que posee un patrón de coloración diferente a otras corales,
posee colores aposemáticos, anillos negros intercalados con anillos amarillos, su cabeza es pequeña, sin cuello diferenciado
del resto del cuerpo, su cola tiene un adelgazamiento brusco.
5. MOFORMETRIA:
6. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA: Este ejemplar proviene de Villavicencio (Meta), de su distribución geográfica se sabe muy
poco. Es una especie endémica de Colombia.
Colombiano.
8.3 Dormideros: Se le acondicionó un recipiente plástico transparente, con tierra negra, con hojarasca, y un recipiente con
agua.
9.2 Comportamiento Social: Se ha logrado satisfactoriamente la reproducción en cautiverio de esta especie; se han mantenido
vivas por más de dos años con la implementación de la dieta artificial inducida, ya que la mayoría de las corales no se
alimentan voluntariamente en cautiverio. No son agresivas con individuos de la misma especie.
10. MANIPULACIÓN: La inmovilización de la serpiente se hace directamente con la mano, debido a su tamaño, ya que las
pinzas herpetológicas lastimarían la serpiente o expondrían al investigador a una mordedura letal; para ello se toman medidas
preventivas y la manipulación solo lo realiza una persona experta.
105
1.
IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA:
NOMBRE CIENTÍFICO:
Micrurus medemi
NOMBRE VULGAR:
Coral
CODIGO
Mmd-004
4.5 Descripción: Dentro del género Micrurus es una especie que posee un patrón de coloración diferente a otras
corales, posee colores aposemáticos, anillos negros intercalados con anillos amarillos, su cabeza es pequeña, sin
cuello diferenciado del resto del cuerpo, su cola tiene un adelgazamiento brusco.
4.6 Locomoción: Serpentino, la serpiente contrae sus músculos para generar una serie de movimientos ondulatorios,
este es la locomoción común en todas las serpientes de coral.
5. MOFORMETRIA:
6. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA: Este ejemplar proviene de Villavicencio (Meta), de su distribución geográfica se
sabe muy poco. Es una especie endémica de Colombia.
Colombiano.
8.3 Dormideros: Se le acondicionó un recipiente plástico transparente, con tierra negra, con hojarasca, y un recipiente
con agua.
8.4 Dieta: El Doctor Jairo Maldonado implementó una dieta que incluye cecilias, bachias, serpientes pequeñas y
alimentación artificial inducida con una mezcla de harinas y carnes.
9.2 Comportamiento Social: Se ha logrado satisfactoriamente la reproducción en cautiverio de esta especie; se han
mantenido vivas por más de dos años con la implementación de una dieta artificial inducida, ya que la mayoría de las
corales no se alimentan voluntariamente en cautiverio.
10. MANIPULACIÓN: La inmovilización de la serpiente se hace directamente con la mano, debido a su tamaño, ya que
las pinzas herpetológicas lastimarían la serpiente o expondrían al investigador a una mordedura letal; para ello se
toman medidas preventivas y la manipulación solo lo realiza una persona experta.
106
ANEXO B. UTILIZACIÓN DE ANIMALES DE LABORATORIO EN LA
EXPERIMENTACIÓN BIOLÓGICA
I. PROGRAMA GLOBAL PARA LA INFRAESTRUCTURA DE LA INVESTIGACIÓN BIOLOGICA
Y BIOMEDICA EN MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO – INSTITUTO DE
BIOTECNOLOGIA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA, MAYO DE 2.000.
(Osorio, et al 2.000)
1.
PRINCIPIOS ÉTICOS EN EL MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO
1.1.Ética
Este tema compete a todos los individuos pero, con mayor razón a los involucrados en la
investigación biológica; desde el técnico auxiliar que está a cargo del cuidado de los animales,
hasta el más alto directivo de la institución productora o usuaria de los mismos. La primera
condición del investigador que trabaja con animales de laboratorio es el respeto por la vida,
por el dolor o el sufrimiento a que éstos pueden ser sometidos en los trabajos bajo su
responsabilidad.
Siempre que se utilizan animales en investigación habremos de considerar que un objetivo, tan
importante como el de obtener resultados experimentales, será el de minimizar cualquier dolor o
angustia que éstos puedan sufrir. El refinamiento de los procedimientos para conseguir que sean
más humanos debe ser parte integrante de toda investigación científica.
Esto es importante tanto desde el punto de vista de la preocupación humanitaria como para cumplir
los requisitos de la legislación sobre animales de investigación.
2.
ÉTICOS INTERNACIONALES PARA INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA CON ANIMALES CIOM (CONSEJO INTERNACIONAL DE ORGANIZACIONES MÉDICAS)
2.1 El avance del conocimiento, la protección de la salud y/o el bienestar de los hombres y los
animales requiere la experimentación con animales vivos.
2.2. Siempre que sea apropiado usar métodos alternativos.
2.3 Realizar experimentación en animales después de estudiar su importancia para la salud
humana y animal y para el avance del conocimiento biológico.
2.4 Seleccionar animales de especie y calidad apropiadas y usar el mínimo número requerido
para obtener resultados científicamente válidos.
2.5 Tratar a los animales como seres sensibles y considerar imperativo ético el cuidado y uso
adecuado, evitando o minimizando las molestias, la angustia y el dolor.
2.5 Presumir siempre que los procedimientos dolorosos para el hombre también causarán dolor
en otras especies vertebradas.
2.6
Procedimientos que pueden causar dolor o angustia momentánea o mínima deben ser
realizados con sedación, analgesia o anestesia. No realizar procedimientos quirúrgicos o dolorosos
en animales no anestesiados o paralizados con agentes químicos.
2.7
Cuando se requiere apartarse del principio anterior la decisión debe ser tomada por un
Comité Revisor convenientemente constituido. Estas excepciones no deben ser hechas solo para
demostración o enseñanza.
107
2.8
Al final de la experiencia, o en el momento apropiado, los animales que puedan sufrir dolor
crónico o severo, angustia, disconfort o invalidez, que no puedan ser aliviados, deben ser
sacrificados sin dolor.
2.9 Los animales mantenidos con fines biomédicos, deben tener las mejores condiciones de vida
posibles, de preferencia con supervisión de veterinarios con experiencia en ciencia de animales de
laboratorio.
2.10 El director del establecimiento es responsable por la calificación de los investigadores y
demás personal, para realizar los trabajos requeridos, debiendo otorgar adecuadas oportunidades
de entrenamiento.
3.
ALTERNATIVAS AL USO DE ANIMALES DE LABORATORIO
Desde que el concepto de Alternativas fue introducido recibió nombres variados según quienes lo
emplearon. Algunos lo interpretan como un programa para eliminar totalmente al animal
experimental. El concepto más generalizado en la actualidad parte de la publicación de Russel y de
Burch que definieron Alternativas como: Cualquier técnica que Reemplace el uso de animales, que
Reduzca su número en n trabajo particular o que Refine un método existente para disminuir el
dolor o el malestar de los animales. Esto de conoce como el princio de las tres R’s (Reemplazo,
Reducción y Refinamiento).
Como resultado de esta definición existe una gran gama de técnicas o abordajes (Biológicos y no
Biológicos) que pueden considerarse apropiados como Alternativas.
4. CARACTERÍSTICAS DE LOS ANIMALES DE LABORATORIO
4.1
Genética y Reproducción
Es esencial conocer las características genéticas para seleccionar los animales, a fin de elegir los
portadores de caracteres consistentes con los objetivos experimentales. Debe considerarse las
diferencias conocidas entre especies, colonias o cepas que incluyen: expectativas de vida,
anatomía, tamaño corporal, sistemas fisiológicos y metabólicos, características comportamentales,
susceptibilidad a xenobióticos, etc. Es muy importante conocer la historia genética completa de los
animales antes de comenzar a trabajar.
Con relación a tipos genéticos los animales se clasifican en colonias exocriadas (outbred stocks),
cepas endocriadas, (inbreb strains), los híbridos, las colonias parcialmente endocriadas, etc. Las
colonias exocriadas son colonias mantenidas de manera que se evite el cruzamiento de familiares
cercanos. Las cepas endocriadas son las obtenidas a partir de una pareja única, por continuo
cruzamiento entre hermanos o entre padres e hijos. Después de veinte o más generaciones con
este método se obtiene un coeficiente de endocría del 98%. Este es el mínimo nivel aceptado
internacionalmente para que una cepa sea designada endocriada. Los híbridos son de dos tipos, el
F1 y el F2. El F1 resulta del cruzamiento de dos cepas endocriadas. Los F2 son los animales
resultantes del cruzamiento entre dos híbridos F1. Colonias parcialmente endocriadas son aquellas
que no han alcanzado por cruzamiento entre hermanos las veinte generaciones.
4.2
Ambiente
Existe abundante evidencia de que las condiciones ambientales en que se crían y experimentan
los animales influye decisivamente en las respuestas a los diferentes tratamientos. Si se requieren
respuestas estandarizadas, las condiciones en que se mantienen los animales deben ser fijas y
comparables en todos los laboratorios del mundo.
108
En general, los cambios en el ambiente externo son registrados por los receptores externos de los
animales que envían la información al sistema nervioso central el que, a su vez, informará al
sistema neuroendocrino para restaurar cualquier desbalance homeostático. Esto producirá
cambios en el modelo del animal y con ello cambios, reconocibles o no, en las respuestas
ocasionadas por el tratamiento experimental. Estas alteraciones pueden traducirse en una
modificación del tipo de respuesta o en un aumento de la variabilidad de los resultados entre o
dentro de los laboratorios.
Los principales factores ambientales que afectan a los animales pueden clasificarse en:
4.2.1. Climáticos (temperatura, humedad, ventilación, etc.)
4.2.2. Fisicoquímicos (iluminación; ruido; presencia de contaminantes, anestésicos y sanitizantes;
composición del aire y cama, etc.)
4.2.3. Habitaciones (forma, tamaño, tipo y población de las jaulas, etc)
4.2.4 Nutricionales (dietas, agua y esquema de administración).
4.2.5. Microorganismos y parásitos (con especial referencia a los patógenos de cada especie).
4.2.6. Situación experimental.
5. ASPECTOS A CONSIDERAR EN EL MANEJOS DE ANIMALES DE LABORATORIO EN
PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN
5.1 Recomendaciones para el tratamiento de los Animales
En la práctica el cuidado de los animales de laboratorio recae en varias personas, pero legalmente
y dependiendo de las leyes del país donde se adelante el estudio, la responsabilidad final con
frecuencia recae en el Investigador principal que esté realizando el procedimiento científico.
Las recomendaciones básicas que debe tener en cuenta son:
•
Acoger los términos de la legislación pertinente.
•
Elegir la especie más apropiada o la alternativa no animal, si existiere, que responda a las
necesidades del proyecto. Requiere conocimiento previo de la historia natural de dicha especie.
Debe tener en cuenta el estado de conservación de la especie.
•
Utilizar el menor número posible de individuos (estudio piloto, buen diseño experimental y
uso de pruebas estadísticas apropiadas)
•
Discutir previamente con colegas el valor científico de la investigación así como los
aspectos éticos de la misma durante todos los procedimientos.
•
Obtener animales de proveedores serios. En caso de tratarse de animales silvestres, su
captura debe hacerse minimizando el dolor y acogiendo la legislación vigente.
5.2 Categorización de las Molestias
Categorización de las molestias o el malestar inducido durante la Fase de Experimentación:
109
5.2.1 Molestias menores: Se consideran como molestias menores los siguientes procedimientos:
•
•
•
•
•
•
•
Toma de muestra de sangre
Examen rectal
Toma de muestra de flujo vaginal
Administración forzada de sustancias inocuas
Experimentos terminales bajo anestesia
Vacunas sin coadyuvante
Toma de radiografías en animales no anestesiados
5.2.2 Molestias moderadas: se consideran como molestias moderadas la utilización de cualquiera
de los siguientes procedimientos:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Toma frecuente de muestras de sangre
Pruebas de pirógenos
Cateterización y canulación
Uso de Yesos
Inmovilización
Cesárea
Recuperación de anestesia general
Inmunización sin adyuvantes completos
Transplantes de piel
5.2.3 Molestias severas: se consideran como molestias severas la utilización de cualquiera de los
siguientes procedimientos:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Extracción del fluído ascítico
Sangría total sin anestesia previa
Inducción de defectos genéticos
Deprivación prolongada de comida, agua o sueño
Pruebas de dosis letal 50 y concentración letal 50
Inmovilización con relajantes sin sedación
Inducción de infecciones experimentales
Pruebas de carcinogenicidad con producción de tumores
Inducción de convulsiones
6.
Categorización de la Invasividad producida durante la experimentación:
CATEGORÍA
A
B
C
D
E
PROCEDIMIENTOS
Experimentos realizados en invertebrados o células/ tejidos aislados
Experimentos que causan nulo o mínimo estrés o malestar
Experimentos que causan leve estrés o dolor de corta duración.
Experimentos que causan de moderado a severo estrés o malestar.
Procedimientos que causan dolor severo o al límite de tolerancia de animales conscientes.
110
II. FORMULARIO PARA LA EVALUACIÓN DE PROYECTOS QUE INVOLUCRAN ANIMALES
DE LABORATORIO
Formulario de evaluación de proyectos de investigación/docencia en lo referente a manejo de
animales de laboratorio
INSTITUCIÓN: LABORATORIOS PROBIOL S.A., UNIVERSIDAD DE LA AMAZONIA, TECMOL
FARMACÉUTICA.
PRIMERA PARTE
1.
INVESTIGADOR PRINCIPAL (TITULAR DEL PROYECTO O ACTIVIDAD):
SINDY MONJE BELMONTE.
2.
TÍTULO DEL PROYECTO O PROTOCOLO: DETERMINACIÓN DE LA
DOSIS LETAL MEDIA (DL50) DE CINCO ESPECIES DEL GENERO MICRURUS EN ESTADO DE
CAUTIVERIO EN NILO – CUNDINAMARCA (COLOMBIA).
3.
EQUIPO DE DOCENCIA O INVESTIGACIÓN (Personas que manipularán
los animales de este proyecto)
Nombre
Institución
SINDY MONJE
BELMONTE
CONVENIO
UNIAMAZONIA Y
PROBIOL
MARTA GÓMEZ
C.
LABORATORIOS
PROBIOL S.A.
Estudiante
Posg.
Investigador
X
Estudiante de
Preg.
X
Cargo
Investigador
principal
Director
Proyecto de
Investigación
X
3.1 EXPERIANCIA EN USO DE ANIMALES DEL GRUPO QUE TRABAJARÁ EL PROYECTO:
3.1.1 EXPERIENCIA PREVIA
Si: __X__No: _____
3.1.2 RECIBIRÁ ENTRENAMIENTO
Si: __X__No: _____
4. ORGANISMO FINANCIADOR: LABORATORIOS PROBIOL S.A.
5
NATURALEZA DEL TRABAJO
Investigación
X
Trabajo de Grado
X
Pregrado
X
5.1 SUPERVISADO POR:
5.1.1 NOMBRE: MARTA LUCIA GÓMEZ CABAL
5.1.2 CARGO: DIRECTORA PROYECTO, DIRECTORA DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO,
LABORATORIOS PROBIOL S.A.
5.2.1 NOMBRE: FERNANDO IGNACIO ORTÍZ SUÁREZ
5.2.2 CARGO: JURADO CALIFICADOR, PROFESOR ASOCIADO, UNIVERSIDAD DE LA
AMAZONIA.
111
5.3.1 NOMBRE: GLORIA ELENA ESTRADA
5.3.2 CARGO: JURADO CALIFICADOR, PROFESORA ASOCIADA, UNIVERSIDAD DE LA
AMAZONIA.
6
DURACIÓN ESTIMADA
LABORATORIO: UN MES.
7
DEL
TIEMPO
DE
TRABAJO
CON
ANIMALES
DE
ANIMALES REQUERIDOS:
Especie
Mus
Musculus
Procedencia
Bioterio de la
Universidad
Nacional
Exocriada
30 – 40
H* – M*
20 – 22
Bioterio de la
Mus
(días)
(gramos)
Universidad
Musculus
Nacional
H: Hembras M: Machos *Las pruebas de Dosis Letal Media y Dosis Efectiva Media se realizaron
con biomodelos de la especia Mus musculus sin diferenciación de sexo.
8
Cepa
Exocriada
Edad
20 - 30
(días)
Sexo
H* – M*
Peso
17 – 19
(gramos)
Cantidad
PROCEDIMIENTO DE TIPO : TERMINAL:_X__ AGUDO:____ CRÓNICO:____
9
CATEGORÍA DE LAS MOLESTIAS*
Menores:_____ Moderadas:______ Severas:__X__
10
CATEGORIA DE INVASIVIDAD*
A:____ B:____ C:____ D:____ E:__X_
*Ver categorización correspondiente en ASPECTOS A CONSIDERAR EN EL MANEJOS DE
ANIMALES DE LABORATORIO EN PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN
SEGUNDA PARTE
1.
SINTESIS DE LOS OBJETIVOS DEL PROYECTO O DE LA PRÁCTICA:
1.1
OBJETIVO GENERAL
Determinar la dosis letal media (DL50) de cinco especies de la familia Elapidae, género Micrurus,
mantenidas en cautiverio en el Parque Recreacional y Zoológico de Piscilago en el Municipio de
Nilo, Departamento de Cundinamarca (Colombia).
Evaluar la efectividad por medio de la (DE50) del Lote Piloto AC-005 de suero antiofídico
antielapídico producido por Laboratorios Probiol frente a los venenos de las cinco especies de
Micrurus sp.a evaluar:
1.Micrurus surinamensis surinamensis, Cuvier, 1.817
2.Micrurus dumerilii, Duméril, Bibron y Duméril, 1.854
3.Micrurus dumerilii, Cope, 1.860
4.Micrurus dumerilii, Griffin, 1.916
5.Micrurus medemi, Roze, 1.967
112
2.
LA SIGUIENTE INFORMACIÓN SERA DE UTILIDAD PARA FACILITAR EL
DESARROLLO DE LAS TAREAS QUE UD HA PROPUESTO REALIZAR, POR ELLO LE
SOLICITAMOS DILIGENCIARLA EN SU TOTALIDAD Y DAR A CONTINUACIÓN LOS
DETALLES PERTINENTES:
¿Para la realización de las pruebas requiere inmovilizar a su animal?
Si:__X__ No:_____
¿Si su respuesta es afirmativa, que tipo de inmovilización hará? ¿Qué método usará y que
duración tendrá?
La inmovilización que se le dió a los Biomodelos de la especie Mus musculus, es manual para
proceder a inocular las diluciones de veneno Micrúrico ó el Lote Piloto de Suero Antiofídico
Anticoral AC – 005. La duración de la inmovilización es de 1 minuto aproximadamente.
¿Realizará procedimientos invasivos?
Si:__X__ No:_____
¿Si su respuesta es afirmativa, de que tipo, frecuencia y duración serán estos
procedimientos? ¿Cuáles son los efectos clínicos esperados durante ellos? Igual si su
respuesta es negativa.
El procedimiento de invasión es la Inoculación Vía Intraperitoneal de Dosis Letal 50 de Veneno
Micrúrico y Dosis Efectiva 50 del Lote Piloto AC -005 de Suero Antiofídico Anticoral; una vez
inoculados los Biomodelos se dejan en observación por 24 – 48 horas post-inoculación. Los
efectos clínicos esperados en la Dosis Letal Media es que muera el 50% de la población inoculada
con Veneno Micrúrico, utilizando la Metodología de Laboratorios Probiol S.A de Colombia. Los
efectos clínicos esperados en la Dosis Efectiva Media es que sobreviva el 50% de la población
inoculada con Veneno Micrúrico neutralizado con el Suero Antiofídico AntiElapídico Lote Piloto AC
– 005 producido por Laboratorios Probiol S.A., utilizando la Metodología del Instituto Clodomiro
Picado de Costa Rica.
¿El animal será sometido a algún tipo de privación?
Si:_____ No:__X___
¿Si esto es previsible, de que tipo, duración, frecuencia y demás serán y que se espera
como efecto clínico?
Los biomodelos utilizados no tendrán ningún tipo de privación en las condiciones ambientales
experimentales; los principales factores ambientales que puedan afectar a los animales serán
constantes, ya que los cambios en el ambiente experimental producirán cambios en el modelo
animal, lo que conlleva al aumento de la variabilidad de los resultados, de lo contrario las pruebas
se invalidan.
¿Le serán administrados al animal algún tipo de agentes químicos o biológicos?
Si:__X__ No:_____
¿En caso de que su respuesta sea positiva, qué tipo de agentes usará, qué dosis
suministrará, que vías y frecuencias empleará y que efectos clínicos espera?
113
A los Biomodelos les serán administrados un agente de tipo Biológico; en la prueba de Dosis Letal
Media se inocula una dosis por nivel, cada nivel utiliza cinco ratones de Veneno Micrúrico por Vía
Intraperitoneal esperando que muera el 50% de la población inoculada y en la Prueba de Dosis
Efectiva Media se inocula una dosis por nivel, cada nivel utiliza cinco ratones de Veneno Micrúrico
neutralizado con Suero Antiofídico Anticoral (Medicamento de tipo Biológico a base de
inmunoglobulinas equinas, producido por Laboratorios Probiol S.A. Las dosis son administradas
por Vía Intraperitoneal, esperando que sobreviva el 50% de la población inoculada. Ambas pruebas
se mantienen en observación por 24 – 48 Horas post-inoculación.
¿Para la realización del experimento o práctica recurrirá al empleo de agentes anestésicos?
Si:__X__ No:_____
En caso de que su respuesta sea positiva, ¿Qué tipo de agentes usará, qué dosis
suministrará, qué vías y frecuencia empleará y qué efectos clínicos espera?
Luego de realizar los registros pertinentes en cada una de las pruebas de potencia y
seroneutralización realizadas, los ratones que sobrevivieron se les aplicó el método de eutanasia
con Enflurano por Vía Respiratoria (Anestesia general), los efectos clínicos esperados son la
muerte por hipoxia de los ratones sobrevivientes.
Describa a continuación el tipo de manejo que requerirá su animal o grupo de animales en
cuanto a dietas, antibióticos, cuidados especiales, etc.
Los Biomodelos fueron mantenidos en Cajas de acero inoxidable tipo Bioterio, en condiciones
ambientales constantes, controlando los principales factores ambientales durante toda la
experimentación, Climáticos (temperatura, humedad, ventilación), Fisicoquímicos (iluminación;
ruido, presencia de contaminantes, cama), Habitaciones (Jaulas de tipo Bioterio), Nutricionales
(dietas, agua y esquema de administración).
Enumere el nombre o nombres de las personas que se encargarán de éstos cuidados
especiales en los animales durante el desarrollo del proyecto o práctica:
1. Sindy Monje Belmonte.
2. Marta Gómez Cabal.
¿En caso de presentarse dolor durante los procedimientos, qué medidas se utilizarán para
aliviarlo?
El Veneno Micrúrico utilizado induce efectos típicamente neurotóxicos, produciendo un bloqueo
postsináptico de los receptores colinérgicos de la placa motora. Este veneno se esparce
rápidamente por los tejidos y bloquea los receptores de acetilcolina en los músculos, observándose
a las 24 – 48 horas postinoculación una parálisis muscular o la muerte. Los modelos que
sobreviven se les aplicó el Método de Eutanasia por Hipoxia.
¿Qué método de eutanasia se llevará a cabo al final del procedimiento? Quién lo realizará?
Al final del procedimiento a los biomodelos sobrevivientes se les aplicó el Método de Eutanasia por
Hipoxia; finalmente todos los biomodelos se incineran.
114
TERCERA PARTE
ALTERNATIVAS
¿Existe algún método alternativo o de reemplazo que no involucre el uso de animales en
trabajos como el que usted propone?
Si:_____ No:__X___
No, porque solo la Prueba Dosis Letal Media es aceptada por la Organización Mundial de la Salud,
y es la prueba empleada rutinariamente en laboratorios dedicados a la evaluación de la toxicidad
aguda en diferentes países; así como la Prueba de Dosis Efectiva Media en la evaluación de la
potencia neutralizante de los sueros antiofídicos comerciales.
CUARTA PARTE
Riesgos para el personal o para la población del Bioterio
_____Sin Riesgo
_____Radiactivos
_____Químicos
_____Cancerígenos
__X__Biológicos: El personal manipulador de los biomodelos en el bioterio tiene riesgo
biológico al auto inocularse con el veneno Micrúrico empleado en las Pruebas de Dosis
Letal Media y Dosis Efectiva Media.
__X__Riesgo Potencial: La auto inoculación del Biológico en evaluación puede acarrear la
muerte del personal manipulador de los Biomodelos, sino es tratado a tiempo con Suero
Antiofídico Anticoral Polivalente producido por Probiol S.A.
QUINTA PARTE
IDENTIFICACIÓN DE LAS PERSONAS QUE SE PUEDEN CONTACTAR EN CASO DE
EMERGENCIA:
Suministre los datos de una persona a quien se pueda recurrir en caso de algún imprevisto durante
el experimento o práctica y de un nombre alternativo con el mismo fin:
CLEMENCIA GÓMEZ CABAL, Médica Cirujana, Gerente Laboratorios Probiol S.A.. Teléfono:
(091) 671 – 1023, Celular: 310 – 777 0476.
MARTA GÓMEZ CABAL, Bióloga, Directora de Investigación y Desarrollo, Laboratorios Probiol
S.A. Teléfono: (091) 677 – 3057, Celular: 310 – 777 0441.
CLAUDIA MARTÍNEZ, Bióloga, Bacterióloga, Microbióloga, Directora de Aseguramiento y Calidad,
Laboratorios Probiol. Teléfonos: (091) 671 – 1023, 2954832, Celular: 316 – 671 6632
PARA USO DEL COMITÉ INSITITUCIONAL DE CUIDADO Y USO DE ANIMALES DE
LABORATORIO
_________________________________________
Firma del Investigador Principal y Responsable
115
III. LEY No. 84 DE 1.989. “POR EL CUAL SE ADOPTA EL ESTATUTO NACIONAL DE
PROTECCIÓN DE LOS ANIMALES”
CAPÍTULO SEXTO
DEL USO DE ANIMALES VIVOS EN EXPERIMENTOS E INVESTIGACIÓN
ARTICULO 23: Los experimentos que se llevan a cabo con animales vivos, se realizarán
únicamente con autorización previa del Ministerio de Salud Pública y sólo cuando tales actos sean
imprescindibles para el estudio y avance de la ciencia, siempre esté demostrado:
a) Que los resultados experimentales no puedan obtenerse por otros procedimientos o alternativas.
b) Que las experiencias son necesarias para el control, prevención, el diagnóstico o el tratamiento
de enfermedades que afectan al hombre o al animal.
c) Que los experimentos no puedan ser sustituidos por cultivo de tejidos, nodos computarizados,
dibujos, películas, fotografías, video u otros procedimientos análogos.
ARTICULO 24: El animal usado en cualquier experimento deberá ser puesto bajo los efectos de
anestesia lo suficientemente fuerte para evitar que sufra dolor.
Si sus heridas son de consideración o implican mutilación grave, serán sacrificados
inmediatamente al término del experimento.
ARTICULO 25: Se prohíbe realizar experimentos con animales vivos, como medio de ilustración de
conferencias en facultades de medicina, veterinaria, zootecnia, hospitales o laboratorios o en
cualquier otro sitio dedicado al aprendizaje, y con el propósito de obtener destreza manual.
Los experimentos de investigación se llevarán a cabo únicamente en los laboratorios autorizados
previamente por las autoridades del Ministerios de Salud Pública y el Decreto 16080 de 1.978 en lo
pertinente.
También se prohíbe el uso de animales vivos en los siguientes casos expresamente:
a) Cuando los resultados del experimento son conocidos con anterioridad.
b) Cuando el experimento no tiene un fin científico y especialmente cuando está orientado hacia
una actividad comercial.
c) Realizar experimentos con animales vivos de grado superior en la escala zoológica la
indispensable, según la naturaleza de la experiencia.
ARTICULO 26: Para todo experimento con animales vivos deberá conformarse un comité de ética.
El Ministerio de Salud Pública no autorizará la realización de experimentos con animales vivos sino
cuando esté conformado el mismo, que está integrado por no menos de tres (3) miembros, uno de
los cuales deberá ser veterinario del Instituto Colombiano Agropecuario, el segundo deberá
pertenecer a la autoridad administradora de los recursos naturales; el tercero deberá ser
representante de las sociedades protectoras de animales. Los miembros del comité de ética serán
designados por sus respectivas entidades a solicitud del experimentador. El gobierno nacional
reglamentará la forma de proveer las representaciones de las sociedades protectoras de animales
y su junta coordinadora nacional, que tendrá tres miembros por un periodo de dos años. Las
116
representaciones de las sociedades protectoras de animales en los comités de ética serán adhonorem. Todo comité de ética será responsable de coordinar y supervisar:
a) Las actividades y procedimientos encaminados al cuidado de los animales.
b) Las condiciones físicas para el cuidado y bienestar de los animales.
c) El entrenamiento y las capacidades del personal encargado del cuidado de los animales.
d) Los procedimientos para la prevención del dolor innecesario incluyendo el uso de anestesia y
analgésicos.
e) el cumplimiento de los prescrito en los Artículos 24 y 25 de esta Ley.
El director de un experimento en el que se vayan a utilizar animales vivos, queda obligado a
comunicar al comité de ética, la naturaleza de los procedimientos que vayan a emplearse con los
animales, el número y tipo de los mismos, las alternativas al uso de animales y las fuentes y
naturaleza de los fondos de investigación.
En el sitio en el cual un comité de ética tenga razones para creer que se está violando esta Ley o
que se violará, o que se está violando, ordenará lo siguiente, según sea pertinente:
a) Suspensión del experimento.
b) Sacrificio del animal cuando se le haya causado enfermedad o lesión incurable.
PARAGRAFO: Son deberes de los comités de ética:
a) Reunirse trimestralmente.
b) Hacer inspecciones por lo menos cuatro (4) veces al año a las áreas de estudio de animales de
cada laboratorio y a los centros de experimentales, de las cuales rendirán un informe a las
autoridades competentes y a la entidad administradora de los recursos naturales.
c) Revisar durante las inspecciones a los centros experimentales o de estudio las condiciones de
manejo y el control del dolor en los animales, para establecer si se cumplen los requisitos
señalados en la presente Ley.
De todas las actuaciones el Comité de Ética se rendirá informe a las entidades empleadoras del
funcionario.
La violación de lo dispuesto en cualquiera de los artículos del capítulo quinto de esta Ley acarreará
al experimentador pena de multa de cincuenta mil ($50.000,oo) a quinientos mil ($500.000,oo)
pesos.
117
ANEXO C. CARACTERISTICAS GENERALES DE LOS BIOMODELOS
1. ESPECIE: Mus musculus
Nombre
Vulgar
Peso
Al Nacer
(g)
Ratón
Blanco
1-2
2.
Edad al
Desmame
(días)
Peso al
Desmame
(g)
Edad a la
Pubertad
(días)
Peso
Adulto
(g)
Longevidad
promedio
(años)
Productividad
Crías/Madre/Año
Número
Cromosomas
(2n)
19 - 21
10 - 12
35
25 - 30
1-2
50 - 100
40
DATOS DE CRIA Y REPRODUCCIÓN *
Nombre
Vulgar
Ratón
Blanco
* h = Horas
Edad
Reproductiva
Rango
Hembra-Macho
6s
s = Semanas
Ciclo
Sexual
Duración
(días)
Receptividad
Sexual
Duración
Gestación
Media y Rango
(días)
4-5
10 – 20 h
a = Años
d = Días
Tamaño
de la Camada
Periodo
Reproductivo
Óptimo
20
19 - 21
6 - 12
7–8m
Agua
Requerida
(Diaria)
(ml)
Orina
Excretada
(Diaria)
(ml)
Comida
Requrida
(Diaria)
(g)
m = Meses
3 PARAMETROS FISIOLÓGICOS Y NUTRICIONALES *
Nombre
Vulgar
Temperatura
Rectal
(º C±0.5)
Rata
Respiratoria
Mínima
(x y Rango)
Rata
Cardiaca
Mínima
(x y Rango)
Ratón
37.5
138
470
3-7
1-3
Blanco
90 - 180
300 - 650
*VALORES PROMEDIO Y RANGOS EXTRAIDOS DE LA LITERATURA PARA ANIMALES ADULTOS JOVENES
4 PRUEBAS DE SERONEUTRALIZACIÓN
4.1 PESOS DE LOS BIOMODELOS
Prueba de Potencia
Dosis Letal Media (DL50)
Dosis Efectiva Media (DE50)
* El peso de los Biomodelos en gramos por ratón blanco.
Peso*
17 – 19 g / ratón (Mus musculus)
118
3–6
ANEXO D. FORMATO PRUEBA DOSIS LETAL MEDIA
1. ENSAYO PRELIMINAR “PRUEBA GRUESA”
EXPERIMENTO No._____
1. DATOS ENSAYO EXPERIMENTAL PRELIMINAR:
1.1 Fecha:________________________1.2 Lugar:________________________
1.3 Lote Veneno: __________________1.4 Especie: _Micrurus_____________
1.5 Biomodelo: Mus músculus_______1.6 Cantidad Inoculada: ____0,5ml____
1.7 Elaborado por: Sindy Monje B.____1.8 No. Ratones Inoculados: ___30___
2. PRUEBA GRUESA DILUCIONES
Dilución
µl
24 Horas
/5
/5
/5
/5
/5
/5
48 Horas
/5
/5
/5
/5
/5
/5
*Los resultados se anotan en un número fraccionario, donde el numerador es el número de ratones
muertos y el denominador es el número de ratones inoculados por dilución.
3. PESOS DE LOS BIOMODELOS
Prueba de Potencia
Peso*
4. GRUPO CONTROL
4.1. No. Ratones inoculados
24 Horas
48 Horas
CONTROL POSITIVO
Solucion madre (1:1)
0/5
0/5
CONTROL NEGATIVO
Solucion salina0,9%
0/5
0/5
* Los resultados se anotan en un numero fraccionario donde , el numerador es el número de ratones muestros y el denominador es el numero
de ratones inoculados. Si el control positivo sobreviven uno o mas ratones la prueba se invalida. Si el control negativo se produce una o mas
ratones la prueba se invalida
119
2. ENSAYO FINAL DOSIS LETAL 50 (DL50)
1. DATOS ENSAYO EXPERIMENTAL FINAL
1.1 Fecha:________________________1.2 Lugar:________________________
1.7 Elaborado por: Sindy Monje B.____1.8 No. Ratones Inoculados: _________
1.9 Solucion Madre (1:1): ____________
2. PRUEBA FINAL (d) = 1,05
Dilución
µl
24 Horas
/5
/5
/5
/5
/5
/5
48 Horas
/5
/5
/5
/5
/5
/5
*Los resultados se anotan en un número fraccionario, donde el numerador es el número de ratones
muertos y el denominador es el número de ratones inoculados por dilución.
Prueba de Potencia
Peso*
4. GRUPO CONTROL
4.1. No. Ratones inoculados
24 Horas
48 Horas
CONTROL POSITIVO
Solucion madre (1:1)
0/5
0/5
CONTROL NEGATIVO
Solucion salina0,9%
0/5
0/5
* Los resultados se anotan en un numero fraccionario donde , el numerador es el número de ratones muestros y el denominador es el numero
de ratones inoculados. Si el control positivo sobreviven uno o mas ratones la prueba se invalida. Si el control negativo se produce una o mas
ratones la prueba se invalida
120
ANEXO E. FORMATO PRUEBA DOSIS EFECTIVA
(DE50)
PRUEBA DE POTENCIA
1. DATOS ENSAYO FINAL:
1.1 Fecha:________________________1.2 Lugar:________________________
1.7 Elaborado por: Sindy Monje B.____1.8 No. Ratones Inoculados: ___30___
1.9 Suero Antiofidico Anticoral Polivalente Lote piloto AC005
2. PROTOCOLO DE DOSIFICACION PARA LA DETERMINACION DE LA (DE50)
Experimento
No.
1
2
3
4
5
CONTROL
(+)
mL veneno
(1mg/ml)
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
mL Solución
Salina
1.2
2.7
3.2
3.45
3.60
4.2
mL
Antiveneno
Relación µg
Veneno/1ml
Antiveneno
24 Horas
48 Horas
3.0
1.5
1.0
0.75
0.6
----
100
200
300
400
500
Control
/5
/5
/5
/5
/5
/5
/5
/5
/5
/5
/5
/5
*Los resultados se anotan en un número fraccionario, donde el numerador es el número de ratones vivos y el denominador es el número de
ratones inoculados por dilución.
Prueba de Potencia
Peso*
121
ANEXO F. MATERIALES
1. Recursos Biológicos:
1.1. Agua de Cicloproceso
Agua destilada, grado inyectable, libre de pirógenos, empaquetada en ampollas de 10 mililitros,
utilizada para diluir el Suero Antiofídico.
1.2. Suero Antiofídico
Se utilizó el Lote Piloto AC – 005 de Suero Antiofídico Antielapídico Polivalente Liofilizado
producido por Laboratorios Probiol S.A.
1.3. Solución Salina Estéril
Se utilizó Solución Salina Estéril al 0.9%, en la preparación de las diferentes diluciones que se
inocularon en los biomodelos, debido a que es una solución isotónica (es decir que tiene la misma
concentración molecular que el plasma sanguíneo, manteniendo la misma presión osmótica sin
alterar los resultados obtenidos en las diferentes pruebas realizadas), distribuidas en frascos de
500 ml.
1.4. Veneno Elapídico
Se utilizaron venenos de serpientes corales de las siguientes cinco especies* en estudio:
•
•
•
•
•
Micrurus surinamensis surinamensis, Cuvier, 1.817
Micrurus dumerilii, Duméril, Bibron y Duméril, 1.854
Micrurus dumerilii, Cope, 1.860
* Lotes de veneno suministrados por el Doctor Jairo Maldonado, Biólogo del Serpentario del Parque Recreacional y Zoológico de Piscilago en
Nilo (Cundinamarca).
2. Recursos no Biológicos:
•
Balas con tapa MICOTAINER Brand Tubes. Lote: 4285895 (5). Exp. 2008.
•
Cinta de enmascarar tesa® Belersdort S.A Colombia. Bajo Tecnología de BDF.
•
Cámara Fotográfica HP Photosmart M407, 4.1 MP, 18 zoom (3x optical, 6x digital).
•
Frascos nuevos para muestra de orina.
•
Incubadora 37º C E & Q EQUIPOS. Ref: IAA-9. Serial: 1027. WATT 100. V.A.C:
110. A.A Bogotá, Col. 075954.
122
•
Incubadora EDEL STAHL Rost frei memert No. 854. Schwabach W. Germany. Typ. U10.
F – Nr 880 – 994. V: 110. Hz: 50160. W: 1400. DIN 12880 – K1.0. Nenntemp: 220º
C. Schutzart DIN 40050 – IP20.
•
Jeringas de 1ml RYMCO Estéril para insulina U – 100 276 x ½” – 12 x
0.4mm. REG. MINSALUD: COLOMBIA V – 000438 – R1. Lote: 2003472. VAL: DIC /
2.008.
•
Jeringas de 10 ml RYMCO Estéril de 216 x 11/2” – 40 x 0.8 mm. REG. MINSALUD:
COLOMBIA V – 0000438. Lote: 2003103. VAL: ABR / 2.008.
•
Micropipeta de 500 µl BIOH´T PRO y puntas amarillas.
•
Micropipeta de 100 µl BRAND Transferpette® y puntas azules.
•
Pipetas de 1 ml SUPE◊RIOR W. GERMANY DIN. Tol. ± 0.01. 1ml: 0.01. Ex. 20º C.
•
Pipetas de 2 ml. 2IN 1/10. CORNING ® USA Reusable No. 97085. TD. 20º C.
•
Pipetas de 5 ml. 5IN 1/10. PIREX. USA Reusable No. 7065. TD. 20º C.
•
Pinzas de Material Quirúrgico. Germany Sfainless.
•
Sofware SPEARMAN KARBER, Método Estadístico No Paramétrico.
•
Viales limpios con tapón de caucho.
123
ANEXO G ANÁLISIS ESTADÍSTICOS PARA DETERMINAR LA DL50 Y DE50
Análisis de regresión y análisis Probit
Para el cálculo de los DE50 y DL50 generalmente se usa el análisis Probit. En un experimento típico
de pruebas de toxicidad aguda se tiene la siguiente situación:
• Concentración de la sustancia o dosis (d).
• Número de individuos (n).
• Número de organismos muertos o afectados (r).
• Porcentaje de efecto (p).
La representación gráfica de p vs. d, o relación dosis-respuesta, genera una curva parabólica que
muchas veces presenta dificultades en la construcción de un modelo lineal. Una forma de abordar
este problema es transformando d a una escala logarítmica (X = log10(d), lo cual mostrará una
relación dosis-respuesta de forma S o sigmoidea normal,de esta manera la distribución de p vs. X
será de tipo normal.
Posteriormente, mediante las tablas de Probit se transforma p (porcentaje de efecto) a unidades
probit (buscando en una tabla de distribución normal el valor de z correspondiente a una
probabilidad acumulada igual a p y sumándole a continuación cinco unidades), se obtiene una
distribución de puntos en un sistema bivariado de tipo lineal, los cuales se procesan según un
análisis de regresión típico. Vale la pena enfatizar que el Probit es una transformación sobre la tasa
de efecto (p), y la ecuación generada es de la forma:
Donde:
124
Para facilitar los cálculos, simplemente se puede usar un software como el Simfit Versión 5,6
edición 7 El procedimiento Probit permite encontrar estimadores m-verosímiles de parámetros de
regresión y de tasas naturales (por ejemplo, tasas de mortalidad) de respuesta para ensayos
biológicos cuantales, analizando porcentajes de efecto vs. dosis dentro del marco de la regresión.
Prueba Estadística Spearman Karber : Aspecto Teórico y Explicación
El método de Spearman-Kärber es un método aproximado, no paramétrico, que proporciona una
buena estimación de la media y la desviación estándar. Si la distribución es simétrica, se obtiene
una estimación de la concentración total mediana (CL50/CE50/CI50).
Se utilizó la prueba de distribución t student y el método de Spearman Karber, aceptado por la
Organización Mundial de la Salud para determinar la validez de los experimentos realizados en la
determinación de la dosis letal media de cinco especies del género Micrurus, técnica estandarizada
por Laboratorios Probiol S.A.
Cálculo de la dosis letal Media por el método Spearman Karber
m = X100 +/- d/n (∑r – n / 2)
m
= logaritmo DL50
X100 = logaritmo del nivel donde la dosis más débil de veneno causa el 100% de
mortalidad.
n
= número de ratones utilizados en cada dilución
r
= número de ratones que mueren en cada dosis
d
= valor constante (logaritmo de intervalo de clase)
∑
= sumatoria de ratones muertos por nivel desde X0 a X100 incluyendo los
dos valores extremos (X0 representa el logaritmo de la dosis más alta
que no produce ninguna muerte).
Cálculo de los límites de confianza DL50
El cálculo de los límites de confianza para la dosis letal media se utilizó la siguiente fórmula:
V(m) = D2 / n2 (n – 1). ∑ [r (n – r)]
Se tomaron valores aproximados de intervalos de confianza al 95%, los siguientes valores: m +/- t
0.05 √ V(m), t. 0.05, teniendo un valor apropiado para E (n – 1) grados de libertad, donde los
grados de libertad se evalúan como la suma de los niveles que provocan la muerte de los ratones
entre el 0 – 100%, estando estos dos valores extremos excluidos.
125

DETERMINACION DE LA DOSIS LETAL 50 (DL50

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