Expresión del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC)

Transcripción

Biología de la Reproducción
E x p resión del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) Clase I
y Clase II en gametos humanos
Expression of Major Histocompatibility Complex (MHC) Class I and Class II
on human gametes
García-Láez V1, De los Santos JM 1, Serra V 2, Pellicer A2, De los Santos MJ 1.
1
2
Lab o ratorio de Embri o l ogía Clínica. Instituto Unive rs i t a rio IVI. Valencia, España.
Departamento de Obstetricia y Ginecología, Instituto Unive rs i t a rio IVI. Valencia España.
Resumen
La expresión de las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad en los gametos humanos
ha sido y es tema de deb ate por las implicaciones clínicas que de ello se deducen. La ex p resión de los
genes del HLA clase I y II en ovocitos humanos permanece poco inve s t i gada. Por el contra rio, aunque la ex p resión en esperm at o zoides humanos y sus pre c u rs o res ha estado ampliamente estudiada,
aún no está cl a ro si el HLA está presente en los espermatozoides o es producto de contaminación con
otras células presentes en el semen.
El objetivo del presente trabajo es estudiar la ex p resión de las moléculas del complejo principal de
histocompatibilidad tipo I y tipo II en ovocitos no fecundados y esperm at o zoides utilizando rigurosos
métodos de purificación celular combinados con RT-PCR y métodos de detección de proteínas.
El análisis de nu e s t ros resultados indican que el ARNm de los genes del HLA clase I y II, incluso de
las moléculas no clásicas como el HLA-G, está ausente en ovocitos maduros e inmaduros así como en
espermatozoides, sin embargo en las células ge rminales inmaduras masculinas obtenidas desde el
eyaculado sí que ex p resan los productos de los genes del HLA. A pesar de ello los antígenos HLA cl ase I y clase II no están normalmente presentes en la superficie de estas células ga m e t ogénicas y esto
sugi e re la existencia de dife rentes caminos en la regulación de la expresión de las moléculas del
MHC en las células ge rminales inmaduras masculinas. La ausencia de las moléculas del HLA puede
ser importante en el mantenimiento de la fi s i o l ogía normal del gameto y posiblemente de su estat u s
como célula inmu n o p riv i l egi a d a .
Palab ras cl ave : HLA clase I. HLA clase II. Ovocito. Espermatozoide. Células ge rminales.
Correspondencia: Dra. Mª José de los Santos Molina
IVI-Valencia
Plaza de la Policía Local, 3
46015 Valencia, España.
[email protected]
Vol. 25- nº 5 - Septiembre-Octubre 2008
E x p resión del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) - 3 3 3
Summary
The expression of histocompatibility leuko cyte antigen (HLA) class I and class II antigens on human
o o cytes and sperm cells has been under deb ate due to the immune connotation of this issue. The study of
the HLA expression on human oocytes has not been deep ly studied; however this is not the case on the
s p e rm cells. Sperm cells HLA expression is not clear since the presence of other cells such asep i t h e l i a l
cells of white blood cells or sperm germ cells can be a source for HLA expression contaminat i o n .
The aim of the study was to inve s t i gate whether both human oocytes and sperm cells express HLA
class I and class II combining highly methods of cell puri fi c ation with indirect immu n o fluorescence
assay and RT-PCR. Our results demonstrated that both human oocytes and sperm cells lacked these
a n t i gens, however granulosa cells and immature sperm cells are able to ex p ress HLA class I and cl a s s
II molecules at mRNA level.
Key words: HLA class I. HLA class II. Oocy t e. Spermatozoa. Germ cells.
INTRODUCCIÓN
El complejo principal de histocompat i b i l i d a d
(MHC) comprende genes localizados en el cromosoma
6, 6p21,3 y está dividido en tres regiones diferentes
llamadas clase I, II y III.
La región MHC clase I codifica al menos siete
moléculas funcionales (HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G y J) y la región clase II, tres grupos de antígenos (HLADR, -DP y -DQ), los cuáles tienen la distribución tisular más re s t ri n gida que las moléculas de clase I.
Los genes de la región clase III tienen dife rentes funciones, algunos relacionados con funciones inmunes
como las moléculas del sistema del complemento
C4B, C4A, BF y C2, y las citoquinas como el fa c t o r
de necrosis tumoral (TNF) α y ß (1).
Las moléculas HLA clase I y clase II son críticas
para la presentación de antígenos de fo rma que puedan ser reconocidas por los linfocitos T citotóxicos
(CD8+) y ayudantes (CD4+), re s p e c t iva m e n t e. Las
moléculas del HLA clase I también pueden afectar a
la función celular de las Nat u ral Killer (NK) (2, 3). Su
contri bución a la respuesta alogénica está bien documentada. Las moléculas del MHC ex t rañas se dife rencian de las moléculas del MHC propias en múltiples
residuos de aminoácidos; y se cree que este polimorfismo es importante para la dive rsidad de respuestas
inmunológicas, y constituye la mayor barre ra para el
transplante de tejidos. Se cree que la ausencia de exp resión de las moléculas del HLA-A, -B, -DR, -DP y DQ es una de la estrategias mediante la cual ciertos tejidos como por ejemplo el sincitotro fo blasto, mantiene
el carácter de inmu n o p riv i l egio que le permita ev i t a r
el rech a zo por el sistema inmune mat e rno (4).
Debido a la importancia de este posible mecanismo para evitar un ataque potencial de las células NK
y linfocitos T maternos HLA-re s t ri n gidos durante la
implantación, se han realizado otros estudios con el
fin de identificar la presencia de HLA en estadios de
desarrollo embri o n a rio tempranos, así como en ga m etos (esperm atozoides y ovocitos). Los estudios re a l izados hasta el momento usan anticuerpos monocl o n ales contra las moléculas del HLA clase I y clase II
con ciertas discrepancias. Mientras que algunos han
revelado ausencia (5, 6) de ex p resión del HLA, otro s
han encontrado una discreta presencia de estas moléculas en ovocitos humanos (7). Otros autores han desc rito la expresión de los genes del HLA y las pro t e ínas tanto en ovocitos como en blastocistos humanos
(8); llegándola a relacionar incluso con la capacidad
implantatoria (9).
La ex p resión de los genes del HLA clase I y II en
ovocitos humanos permanece poco investigada. Por el
c o n t ra rio, aunque la ex p resión en esperm at o zo i d e s
humanos y sus pre c u rs o res ha estado ampliamente estudiada, aún no está cl a ro si los tra n s c ritos de los genes del HLA están presentes en los espermat o zo i d e s
humanos y si hay ex p resión como proteínas superficiales (6, 10).
En este estudio, combinamos dos estrat egias de
detección, por un lado re a l i z a remos RT-PCR (del inglés; Reve rse Tra n s c riptase - Po l i m e rase Chain
Reaction) y por otro utilizaremos los métodos de detección de proteínas combinadas con ri g u rosos pro t ocolos de puri ficación celular para inve s t i gar la ex p resión de las moléculas del HLA clase I, incluidos los
a n t í genos no clásicos HLA-G, y las moléculas del
HLA clase II y en ovocitos y esperm at o zoides humanos. Nuestros resultados ap o rtan una evidencia de la
existencia de dife rentes fo rmas de regulación de la
ex p resión del MHC, entre la ovogénesis y esperm at ogénesis humanas.
334 - E x p resión del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC)
MATERIALES Y MÉTO D O S
Gametos humanos
Se analizaron un total de 155 ovocitos humanos
no viables de mujeres que part i c i p aban en las técnicas
de la rep roducción asistida (TRA) en el hospital
Brigham and Women´s, Boston, MA.
Las mu e s t ras de semen (n=11) fueron re c ogi d a s
de seis donantes sanos para el análisis de la presencia
de ex p resión genética del HLA clase I y II en espermatozoides puri ficados (n=7) y en células ge rminales
puri ficadas (n=4). La ex p resión superficial del HLA
clase I y II fue analizada por citometría de flujo, en
otras 21 mu e s t ras de semen adicionales re c ogidas de
10 hombres con fe rtilidad probada y 11 hombres que
e s t aban participando en las TRA en el hospital
Brigham and Women´s, Boston. Otras 5 mu e s t ras de
semen de 5 va rones VIH-1 seropositivos (3 con SIDA) obtenidos desde el Fenway Community Health
Center, fueron también testadas para ver la posible influencia de la infección en la ex p resión superficial del
HLA en las células ga m e t ogénicas masculinas. El
consentimiento informado fue obtenido de todos los
i n d ividuos. El semen fue recogido por masturbación
en contenedores estériles y licuado a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de pro c e s a rl o .
Métodos de puri ficación de esperm at o zoides
A) Puri ficación de espermatozoides móviles por gradientes discontinuos Percoll.
El esperma puro se obtuvo mediante el uso de dos
protocolos dife rentes: bien con gradiente discontinuo
Percoll de 90%, 70% y 45% (Pharmacia LKB, Nucl e a r
Inc Gaithersbu rg, Mary l a n d, USA) o un gradiente de
95% de Isolate (Irving Scientific, Santa Ana, CA, USA)
combinado con un paso adicional de purificación usando inmunobeads para eliminar las células positivas para
los antígenos CD45+ y CD14+. Brevemente, el semen
fue depositado suavemente sobre gradientes de Percoll
45% o Isolate 95% y centri f u gado a 600 g durante 2030 minutos. Las células del pellet fueron usadas para
RT-PCR o citometría de fl u j o .
B) Selección negat iva de células ge rminales del
plasma seminal y células blancas sanguíneas mediante inmunobeads para CD45+ y CD14+.
Las células redondas presentes en el plasma seminal (células blancas sanguíneas (CBS), células ge rm inales y células epiteliales) se aislaron por una técnica
de centri f u gación estándar de gradientes de densidad
(Ficoll-Hypaque; Pharmacia Biotech, AB, Uppsala,
Sweden). Breve m e n t e, las células redondas fueron resuspendidas en 1 mL de tampón de lavado, 0,1% de
BSA en PBS, e incubadas con inmunobeads re c u b i e rtos con un anticuerpo monoclonal contra CD45
(Dynal, Lake Success, NY) a 4ºC durante 2 horas. Las
células CD45+ del sobrenadante fueron tra n s fe ridas a
un segundo tubo, y el sedimento resuspendido en otro
mL de tampón de lavado e incubado de nu evo con in munobeads cubiertas con un anticuerpo monoclonal
contra CD14 (Dynal) a 4ºC durante 1 hora. El anticuerpo monoclonal usado contra CD45 fue el cl o n
TT29/33, el cual se une a la membrana celular de todos
los leucocitos ex c epto los macrófagos, y el cl o n
RMO52 usado contra CD14, el cual se une a los monocitos (>95%) incluyendo macrófagos y granulocitos.
Aislamiento de ARN de ovocitos humanos, espermatozoides y células germinales
Pa ra tal fin utilizamos ovocitos no fecundados de
FIV que se lava ron cuidadosamente en medio Ham´s
F-10 tamponado con Hepes y colocados en una solución de ácido Ty rode´s, pH 2,1 (ambos de Gibco BRL
L i fe Te ch n o l ogies, Grand Island, NY, USA) para
romper la zona pelúcida y eliminar las células de la
corona-cúmulus asociadas a ella. Los ovocitos fuero n
guardados a -80ºC en 19 µl de la mezcla para realizar
la tra s c ripción reve rsa conteniendo 0,5% de Nonidet
P40 hasta pro c e s a rl a s .
Las células ge rminales, esperm at o zoides maduro s
y CBS seminales fueron disueltas en 6 M de la solución tiocianato de guanidinio consistente en 0,5% de
s a rc o s i n ato de lauril sulfato sódico y 0,1% de mercaptoetanol (Sigma Co; St Louis MO, USA). Las células lisadas se pasaron sobre una capa de CsCl y
centri f u gadas a 15ºC durante 26 horas a 94.000 g. El
R NA fue mezclado con 3 M de acetato de sodio y
100% de etanol y guardado toda la noche a -20ºC
hasta pre c i p i t a r. El RNA del ra n go de 300.000 a
5.000.000 de esperm at o zoides puros y un ra n go de
300.000 a 500.000 de células germinales fue posteri o rmente analizado. El RNA del sedimento fue lavado con 70% de etanol y disuelto en agua destilada. La
concentración de RNA se midió por espectro fo t o m etría a 260 nm.
Tra s c ripción reve rs a - reacción en cadena de la polimerasa (RT- PCR)
La RT-PCR se realizó con el ARN de las fracciones
c e l u l a res de semen (espermat o zoides, células ge rm i n a-
les y células blancas), en células del cúmulus, en 50 células de la línea celular de coriocarcinoma JEG-3, así
como en ovocitos individuales. La tra s c ripción reve rs a
se realizó en 20 µl de tampón consistente en 5,2 mM
MgCl2, 10,5 mM Tris-HCl, 52,6 mM KCl, 20 U de inhibidor de la RNAasa, 0,05 nmol de hexámeros aleat orios, 50 Ul del tra n s c riptasa reve rsa (MuLV) (Pe rk i n E l m e r, Bra n ch bu rg, New Je rs ey, USA) y 5,3 nm de
m e z cla de cada desox i ri b o nu cleótido tri fo s fato (dNTP).
La reacción estuvo 10 minutos a 22ºC y 42 minutos a 42ºC seguidos de un paso final de incubación de
5 minutos a 95ºC para inactivar a la MuLV.
El cDNA de los esperm at o zoides maduros, células
ge rminales seminales, CBS, células del cúmulus y
ovocitos, se utilizó para amplificar los productos de
los genes del HLA clase I, incluido el HLA-G y el
HLA clase II (DPα y DRα) por medio de la Amplitaq
Gold Polimerasa (Perkin-Elmer) en 30 µl de una re a cción mezcla que contiene 1,67 mM MgCl 2 , 10mM
tris-HCl, 50 Mm KCl, y 200 µM de mezcla de dNTP.
Se usó como control positivo células JEG-3 de cori ocarcinoma. El perfil de los 42 ciclos consistió en desn at u ralización a 95ºC durante 30 segundos, anillamiento a 55-60ºC durante 30-90 segundos, y 72ºC
durante 30 segundos, con un paso final de extensión a
72ºC durante 7 minutos. Los pri m e ros fueron escogi-
dos en intrones diferentes para evitar la contaminación con de DNA genómico. Los pri m e ros de ß-actina eran de Continental Laborat o ry Products Inc (San
Diego, CA) y se usaron para asegurar el éxito de la
síntesis del cDNA. Además, la PCR para CD45 fue
usada como control de la presencia de células bl a n c a s
sanguíneas mientras que la Keratina-18 se utilizó como control de la presencia de células epiteliales. En
la tabla 1 se mu e s t ran las secuencias de los pri m e ro s
y la longitud esperada de los productos de la PCR
después de la heminested PCR. Los productos fuero n
visualizados por tinción con bro mu ro de etidio en un
gel de aga rosa al 1,5%.
Heminested PCR
En la h e m i n e s t e d PCR usamos el mismo pri m e r
upstream y un primer dow n s t ream interno diferente
( Tabla 1) para ve ri ficar la especificidad de los productos obtenidos y mejorar la detección de los productos de la PCR cuando se analiza una pequeña cantidad de DNA. En la heminested PCR se empleó entre
0,6 µl y 1 µl de los productos amplificados para la segunda amplificación de la PCR. Las condiciones del
tampón y los volúmenes de reacción usados en la segunda PCR fueron idénticos a los de la pri m e ra PCR.
Tabla 1
Secuencias de primer usados para detectar la expresión del mRNA del MHC en ovocitos y células espermáticas
5´a 3´
pb
Tª
HLA I
A cgcttacga c gg c a aggattac
B tctgctcttctccaga aggca
C tgctgcacat g c agg t g t at c
419
60ºC
HLA-G
A ttgtccttgcag c t g t ag t c a c
B ctggtctctgcacaagagagg
C tgaga c agaga c ggaga c at c
238
60 ºC
HLA-DP
A gccctctccttggctttcctgctg
B aagaacttgtcaatgtggcagat g
C acgtga c g t t gag c a c t gg t ggg
382
60 ºC
HLA-DR
A ctgat gag c g c t c agga at c at gg
B agg t a c at t gg t gat c ggag t at a
C gttcgtgagcacagttacctctgg
285
60 ºC
CD45
A ggaattccaaagcccaacacc
B acttgtgtaaatcatgtaa
340
55 ºC
K-18
A cgaga aggaga c c at g c a a ag c
B ctgg c a at c t ggg c t t g t agg
453
55 ºC
A y B rep resentan los primer upstream y downstream. C es el primer interno downstream usado en la heminested PCR. La secuencia de primer para HLA de clase II y CD45 fueron obtenidas de Meye rs et al 1991 (36) y Fo rsyth et al 1993 (37) respect ivamente.
Análisis por Citometría de fl u j o
Para los análisis de citometría de flujo se utilizó
un método de inmunofl u o rescencia directa con los siguientes anticuerpos monoclonales: W6/32 conjugado con fi c o e ri t rina (FE) (Dako, Carpintería, CA,
USA) el cual reconoce al epítopo monomórfico del
producto polipéptido de 45 KDa de los loci HLA-A, B y -C (también reconoce al HLA-G), el y el anticuerpo CR3/43 conjugado con isocianato fl u o rescein
(FITC) que reconoce todos los productos de las subregiones de los genes de DP, DQ y DR. Como cont rol positivo se utilizó anticuerpo CD55 conjuga d o
con FE y FITC (Pharm i n gen, San Diego, CA) ex p resado en la superficie de las células ge rminales y esperm at o zoides. Un re a c t ivo doble color para el CD45
clon T29/33 y para CD14 clon TUK3 (Dako) fue usado como control para ver la presencia de CBS. Los
c o n t roles negat ivos fueron anticuerpos de isótopos
irre l evantes conjugados con FE y FITC. Como control positivo para los anticuerpos HLA clase I y HLA
clase II se utilizaron células sanguíneas mononu cl e ares peri f é ricas (PBMC).
El procedimiento fue el siguiente: fracciones enriquecidas con células germinales y espermatozoides
maduros fueron divididas, si era posibl e, en 5 alícuotas conteniendo entre 6x104 y 106 células dep e n d i e ndo de la calidad de las mu e s t ras de semen. Cada alícuota fue incubada con una combinación de antic u e rp o s
de isótopos irre l evante conjugados con PE y FITC,
con anticuerpos CD55 FITC conjugado y CD55 PE
conjugado, o con una combinación de W6/32 RPE y
CR3/43 FITC conjugados, y finalmente el doble color
reactivo como control de la contaminación con CBS.
Todos los anticuerpos fueron diluidos 1:50 en PBS
con 0,1% de BSA e incubados durante 30 minutos a
4ºC. Después de ser lavadas dos veces, las muestras
fueron fijadas en 1% de para folmaldehido y guard adas en oscuridad a 4ºC durante no más de 48 hora s ;
10.000 células/mu e s t ra fueron analizadas con un
FACScan (Beckton Dickinson).
Inmunocitoquímica
La inmunocitoquímica fue realizada sobre 40 ovocitos no fecundados con el mismo anticuerpo monoclonal usado para el análisis por citometría de flujo.
Un total de 26 ovocitos se utilizó para localizar el
HLA clase I y II; 14 ovocitos adicionales fueron usados como control negat ivo del experimento. Brevemente, los ovocitos no fijados se tra n s firieron a go t a s
de 200 µl de 0,1% de BSA en solución de lavado PBS,
tras tres rondas de lavado se incubaron durante 30 m iVol. 25- nº 5 - Septiembre-Octubre 2008
nutos a 4ºC en gotas de 100 µl de una solución de
ambos anticuerpos monoclonales W6/32-PE y
CR3/43-FITC a una dilución 1:50.
Después de tres ciclos más de lavado, los ovocitos
finalmente fueron fijados en 2% de para folmaldehido
d u rante 30 minutos y montados para ser eva l u a d o s
s o b re el microscopio de fl u o rescencia (Olympus BH2), donde fueron fo t ogra fiados con una unidad de
c o n t rol de exposición (Olympus). Los controles negativos fueron procesados con los anticuerpos de isótopos irre l evantes conjugados con PE y FITC.
Análisis estadístico
Se utilizó el test no para m é t rico de Wi l c oxon para
a comparación de la ex p resión superficial del HLA I
y HLA II en todas las células ge rminales y fra c c i o n e s
celulares de esperma. Valores de p<0,05 fueron cons i d e rados estadísticamente signifi c at ivos.
RESULTADOS
Detección de los productos de los genes HLA clase
I y clase II en ovocitos humanos.
Pa ra veri ficar la síntesis sat i s fa c t o ria de cDNA utilizamos 1 µl de cDNA de ovocitos y células del cúmulus y se sometieron a una PCR usando pri m e rs de
ß-actina. Ningún producto fue detectado en el cultivo
s o b renadante ex t raído de los ovocitos y sometido a
RT-PCR, el cual fue usado como control negat ivo .
Ap roximadamente la mitad del total del cDNA obtenido de los ovocitos individuales fue usado para amp l i ficar dos antígenos HLA. Independientemente del
estado meiótico analizado (pro fase I (PI), metafase I
(MI), o metafase II (MII)) no se pudo detectar ningún
determinante HLA clase I o II en ovocitos humanos.
Sin embargo, las células del cúmulus ex p re s a ro n
tra n s c ritos para HLA-DPα y DRα (Fi g u ra 1A).
La ex p resión para el gen HLA-G fue evaluado en
un total de 42 ovocitos (9PI, 16 MI, 15 MII y 2 part enogenotas). Las 50 células de cori o c a rcinoma JEG-3
usadas como control positivo reve l a ron una banda de
292 pb junto con otra banda no específica a 200 pb,
como previamente describió Juri s i c ova et al., 1996a
(8). La falta de las 200 pb cuando CBSs fueron usadas
sugi e re que este art e facto fue debido al RNAm de las
células JEG-3. La amplificación del HLA-G reve l ó
que no había tra n s c ritos en los ovocitos no fecundados
m a d u ros o inmaduros (Fi g u ra 1B). La sensibilidad para el primer HLA-G fue de un equivalente de 0,3 células de cori o c a rcinoma JEG-3. Altern at ivamente se
u s a ron otros sets dife rentes de pri m e rs, G.526, G. 1 2 2 5
y G.1200 (11), que daba un producto de 710 pb, pero
la amplificación del RNAm del HLA-G seguía siendo
no satisfactoria. Las células del cúmulus no ex p re s aron tra n s c ritos del HLA-G (Fi g u ra 1B).
H e m i n e s t e d PCR fue realizada con los pri m e r
d ow n s t ream internos (Tabla 1) con el fin de ve ri fi c a r
la autenticidad de los productos de la PCR para JEG3 y células del cúmulus. Los ovocitos seguían careciendo de tra s c ripción del HLA.
Fi g u ra1
Expresión mediante RT-heminested PCR de las moléculas
de los genes MHC, HLA clase I, HLA-DP, HLA-DR y
HLA-G en ovocitos (O) y células del cúmulus (CC).
Los ovocitos no mostra ron ninguna actividad
transcripcional para ninguna de las moléculas del MHC
estudiadas. Sin embargo las células del cúmulus tenían
RNAm para el HLA de clase I y clase II pero fue negat ivo
para la expresión genética de HLA-G.
Detección de los productos de los genes HLA clase
I y clase II en espermat o zoides, células germinales
inmaduras y CBS seminales
El análisis RT-PCR revela que las moléculas del
HLA clase I (incluidas las moléculas de HLA-G) y
clase II (DPα y DRα) estaban tra n s c ritas en las células germinales obtenidas del semen. Los esperm at ozoides maduros puros no contenían ningún mRNA de
HLA clase I, clase II o HLA-G, aunque los tra n s c ritos de ß-actina fueron detectados (Fi g u ra 2). Las CBS
obtenidas del semen usado como control positivo para la ex p resión de los genes del HLA clásico clase I y
clase II también reveló la presencia de tra n s c ritos de
HLA-G. La especificidad de los productos fue confi rmada en la heminested PCR.
E x p resión superficial de los antígenos del HLA
clase I y clase II en ovocitos humanos.
El análisis inmunocitoquímico del HLA cl á s i c o
clase I y clase II reveló un patrón de tinción atípico
Fi g u ra2
La expresión de los genes MHC en esperm at o zoides (Sp),
células blancas sanguíneas (CBS) y células ge rminales
i n m a d u ras (G) obtenida desde el eyaculado. Se escogi ó
como control positivo la expresión de ß-actina. El RNA m
de la moléculas HLA clase I, HLA-DPa, HLA-DRa
y HLA-G fue positivo en las células ge rminales inmadura s
y también en las células blancas sanguíneas. Sin embargo ,
los esperm at o zoides, a pesar de ser positivos para la
ß-actina, no se encontra ron tra n s c ritos para ninguna
molécula del MHC estudiada. La ausencia de
contaminación con CBS en la fracción enriquecida
de células germinales fue determinada por deficiencia
de expresión de CD45.
en los ovocitos. La mayoría de los ovocitos no mostró
inmunoreactividad para ningún HLA clásico clase I y
clase II, pero, 3 de 26 (11,5%) ovocitos analizados,
mostra ron una fuerte tinción positiva para ambos tipos de antígenos, clase I y II. Sin embargo, 2 de 14
ovocitos usados como control negativo también re a cc i o n a ron positivamente para ambos tipos del HLA.
Los antígenos del HLA estaban ausentes en la zona
pelúcida, incluso para los ovocitos positivos para ambos tipos del HLA.
Las células de la corona radiada fueron positivas
para el HLA clase I, pero no para las moléculas del
HLA clase II (Fi g u ra 3).
E x p resión superficial de los antígenos del HLA
clase I y clase II en esperm at o zoides humanos y
células ge rminales inmaduras
La citometría de flujo para el semen de ambos varones, fértiles e infértiles, reveló un porcentaje muy
bajo (1%) de células positivas para el HLA clase I en
Fi g u ra3
I d e n t i ficación inmunocitoquímica del HLA clase I y HLA clase II en ovocitos humanos no fecundados y en las células
de la corona radiada. Las fi g u ras a y b mu e s t ran microscopia de contraste de fase en uno de los ovocitos humanos y células
del cúmulus; c y d mu e s t ran un patrón de tinción negat iva para HLA de clase I y II. Las células del cúmulus mostraron
expresión positiva para el HLA clase I (e) pero negat iva para los antígenos del HLA clase II (f). (x100).
fracciones enriquecidas con células ge rminales y células espermáticas, comparadas con sus respectivo s
c o n t roles negat ivos (Fi g u ra 4 A, B). Este re s u l t a d o
probablemente fue debido a la presencia de un porcentaje muy bajo de células CD45+ asociadas (1,15 ±
1,31%). La ex p resión del HLA clase II no fue encontrada en ningún esperm at o zoide o célula ge rminal inmadura de ninguno de los varones, fértiles y subfért iles, o en los controles negat ivos. No se encontraron
diferencias en la ex p resión de los antígenos HLA cl ase I y clase II entre las células ge rminales y las células espermáticas dentro un grupo dado (Fi g u ra 4).
Tampoco había dife rencia en el nivel de ex p resión de
HLA en esperm at o zoides y células ge rminales de varones fértiles comparados con los va rones infért i l e s .
No se encontró dife rencia en la ex p resión de HLA
clase I y clase II entre células ge rminales y células
espermáticas dentro de un grupo dado. De forma similar, el análisis FACS de varones seropositivos VIH1 reveló que no había ex p resión de los antígenos del
HLA clase I o clase II en las células ge rminales y esp e rm at o zoides (Tabla 2). Solo una de 11 mu e s t ras de
semen de varones infértiles mostró un alto porc e n t a j e
de células positivas para el HLA clase I, en las fra cciones enriquecidas con en células ge rminales (8%) y
en células espermáticas (10%) re s p e c t iva m e n t e.
Tabla 2
Expresión del HLA clase I y clase II en esperm at o zoides y células ge rminales de hombres VIH-1 seropositivo s
Ruido de
fo n d o
HLA clase I
Ruido de
fo n d o
HLA clase II
p
n=5
Esperm at o zo i d e s
0,42 ± 0,41*
1,68 ± 0,81
1,00 ± 0,74
0,48 ± 0,64
NS
Células ge rminales
0,81 ± 0,54
1,64 ± 0,86
0,68 ± 0,64
0,68 ± 0,82
NS
*Va l o res que son signifi c at ivos ± Desviación Estándar obtenida de análisis FACS.
NS: No signifi c at ivo
Fi g u ra 4
Análisis mediante FACS de esperm at o zoides y células ge rminales. Las células fueron teñidas directamente con W6/32 PE
c o n j u gado y CR3/43 FITC conjugado para el HLA clase I y clase II, respectiva m e n t e.Los controles negat ivos fueron
esperm at o zoides y células ge rminales inmaduras teñidas con anticuerpos de isótopos irre l evantes conjugados con PE y
FITC. Un pequeño porcentaje presentó marcaje positivo para HLA clase I, que fue siempre similar al porcentaje de células
p o s i t ivas CD45 que quedaron después de nu e s t ro procedimiento de puri ficación. El HLA clase II no fue encontrado en
esperm at o zoides y células ge rminales inmadura s .
340 - Expresión del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC)
DISCUSIÓN
E x p resión del MHC en ovocitos humanos y
células del cúmulus
La ex p resión de los antígenos MHC en los ga m etos humanos ha representado desde siempre un tema
de interés debido a su posible implicación en la fe rt ilidad humana. Este es uno de los pri m e ros trab a j o s
que inve s t i ga la presencia de ARNm de los genes cl ásicos del HLA en ovocitos humanos.
En este estudio no detectamos los productos de los
genes HLA clásicos clase I y clase II (DPα y DRα) en
ovocitos humanos no fecundados, independientemente del estado de maduración nu clear (PI, MI, MII) en
el que se encontra ran. El significado funcional que de
estos resultados se desprende es que la ausencia de
expresión de HLA se origina tanto a nivel de tra n scripción como de traducción a proteína y que la expresión de HLA puede empezar a darse cuando comienza la tra n s c ripción propiamente embri o n a ria y
no antes.
De hecho, se piensa que procesos de regulación de
ex p resión génica como son la metilación del ADN
pueden estar evitando la ex p resión de dichos loci (12).
El hecho de que ni ovocitos ni esperm at o zo i d e s
ex p resen en su superficie los antígenos HLA clásicos,
los haría suscep t i bles al ataque inmunológico mediado por células NK (2), fue por este motivo por el cual
se decidió averiguar si por ellos mismos existía expresión de los determinantes no clásicos, esto es expresión de HLA-G. La búsqueda de este antígeno era
importante en tanto en cuanto su presencia podría representar protección frente a los NK deciduales maternos tal como se pensaba ocurría con el tro fo bl a s t o
extravellositario que invade la decidua materna (3).
Sin embargo, nosotros no detectamos ARNm para el
HLA-G en ovocitos no fecundados. Nuestros re s u l t ados no ap oyan artículos previos (8) en los cuáles la
p resencia de mRNA del HLA-G fue detectado por
RT-PCR usando RNA de un pool de ovocitos con fallo de fecundación. En nu e s t ro estudio, el cDNA obtenido de los ovocitos se utilizó para realizar PCR
con el mismo set de primer capaces de amplificar una
terc e ra parte de una célula de cori o c a rcinoma JEG-3
en nu e s t ras condiciones ex p e rimentales. El uso de un
s egundo set de pri m e rs también específico para HLAG ve ri ficó la ausencia del HLA-G en los ovo c i t o s .
Tres de 26 (11,5%) ovocitos con fallo de fecundación
analizados para la ex p resión del HLA clase I y clase
II mostra ron una inmunotinción intensa para estos
dos antígenos. Sin embargo, como también se observa ron uniones no específicas de los anticuerpos, un
14% aproximadamente de los controles negativos resultaron positivos y pensamos que podría existir cierta afinidad del fl u o ro c romo por la membrana del ovocito o a la zona pelúcida, como ha sido mostrado en
ratón con FITC (13), o bien una podría existir una
unión no especifica a los re c eptores Fc, los cuáles se
conoce que se ex p resan en los ovocitos humanos
(14). Roberts et al., 1992 inve s t i ga ron sobre un patrón
atípico de la expresión de la proteína HLA en ovo c itos con fallo de fecundación que habían sido fijados
en acetona, donde 2 (18%) de 11 ovocitos eran teñidos positivamente con el mismo anticuerpo monoclonal W6/32, el cual también reconoce al HLA-G (7).
Otros estudios, sin embargo, no detectaron la ex p resión de ninguna molécula de HLA de clase I o clase
II en ovocitos no fecundados, ovocitos con fe c u n d ación anormal o embriones bloqueados (5, 6). Otra s
inve s t i gaciones han descrito una alta ex p resión superficial de HLA-G en ovocitos con fallo de fe c u n d ación; concretamente 6 de 13 ovocitos (46%) con el
anticuerpo monoclonal W6/32, y 15 de 25 (60%) con
el anticuerpo de ratón (8). La función del HLA-G en
ovocitos sigue estando poco cl a ra ya que, antes de la
implantación, los ovocitos no deberían estar en contacto con las células NK deciduales o con los linfo c itos citotóxicos que serían los únicos tipos celulares
capaces de atacarlos. En cualquier caso, tal vez otro
tipo de mecanismo de defensa como la presencia de
la zona pelúcida y las proteínas reg u l a d o ras del complemento ex p resadas en los ovocitos podrían ser muy
importantes para la defensa inmune de él mismo durante el período pre i m p l a n t at o rio (7, 15). Por otro lado, la ausencia de las moléculas de HLA en los ga m etos tiene cierto sentido ya que sería crucial para
p e rmitir la evolución evitando el re ch a zo si la ge n e ración de nu evos alelos ocurre bien por causas ge n é t icas o bien por conversión génica.
Otras de las células asociadas al ovocito que se estudiaron fueron las células del cúmulus, su análisis
mostró ex p resión positiva para HLA clase I, pero
también expresión para los determinantes de tipo II
como DPα y DRα. Nuestros resultados ap oyan datos
a n t e ri o res que demu e s t ran la reacción positiva de
ciertas subpoblaciones de células del cúmulus (ex c epto las células del cúmulus de la corona), para los antígenos DP y DR (6). Hill et al en 1990 también ap o rt ó
que las células de la gra nulosa de los ovarios estimulados con gonadotropinas expresaban antígenos del
HLA de clase II e interferón gamma (INF-γ) puede
inducir la expresión del HLA clase II en las células
de la gra nulosa (16). La mayoría de las células de los
m a m í fe ros son capaces de endocitar y procesar las
proteínas antigénicas. La expresión del HLA clase II
a nivel de proteínas y RNAm puede permitir a las células del cúmulus funcionar como células pre s e n t a d oras de antígenos. Además, la ex p resión del HLA clase
II no es un fenómeno aislado, otras células como las
células epiteliales de la trompa de Falopio son cap aces de ex p resar antígenos del HLA clase II en condiciones fi s i o l ó gicas normales (17).
E x p resión del MHC en espermatozoides humanos
y células germinales inmaduras
El análisis de los esperm at o zoides mostró que,
aunque son positivos para RNAm de ß-actina, no poseían tra n s c ritos para los genes clásicos del HLA cl ase I y clase II y para el HLA-G. Nuestros datos, aunque de acuerdo con algunas inve s t i gaciones (18, 19),
no concuerdan con otros estudios que describen la expresión de las moléculas clásicas del HLA clase I y
HLA-G en los esperm at o zoides maduros demostra d o
mediante RT-PCR (20, 21). Sin embargo, las células
ge rminales inmaduras del semen, ex p re s a ron HLA
clase I y clase II (DPα y DRα) incluso los determ inantes no clásicos como HLA-G; los cuáles, de
acuerdo con los resultados previos, mu e s t ran que tanto los espermatozoides como las espermátidas aisladas del testículo contienen bajos niveles de RNA m
del HLA clase Ia y Ib (22, 19). Además estos datos
indican que estos genes se tra n s c riben de fo rma continua o bien se presentan como RNAm estables en las
células ge rminales a lo largo de su viaje por el tra c t o
rep ro d u c t ivo. Los mecanismos postraducionales nec e s a rios para evitar la presencia de moléculas del
MHC en la membrana de las células ge rminales permanecen desconocidos. La presencia de rep re s o re s
traduccionales se ha suge rido para otros RNAm en el
testículo (23). Otra posibilidad es la pérdida de la
ß2m i c roglobulina cuya síntesis se encuentra detenida
en el estado de espermátida (22). Las proteínas de
HLA también se encontra ron ausentes en el esperm atozoide humano (24, 25).
El análisis FACS de los esperm atozoides y de las
células ge rminales, en hombres fértiles e infértiles reveló que incluso después de la eliminación de las poblaciones de células redondas y células germinales,
puede haber ra s t ros de contaminación con otros tipos
celulares, lo cual puede admitirse dentro del error de
la técnica o incluso de los procesos de puri fi c a c i ó n .
Aproximadamente el 50% de nu e s t ras mu e s t ras contenían un 1% de células blancas determinadas por anticuerpos CD45-CD14, y estas mu e s t ras son positivas
cuando se analiza la expresión de los antígenos del
HLA. Ninguna de las mu e s t ras negativas para CD45CD14 expresó antígenos del HLA. Nuestros re s u l t a-
dos, de acuerdo con previos estudios, describen la ausencia de moléculas de HLA clase I y II en células
germinales inmaduras obtenidas del tejido testicular
(26, 22) o del semen (27). La ex p resión de los antígenos del HLA en las fracciones enriquecidas del esperma y células ge rminales de va rones fértiles e infért iles fue similar a la encontrada en va rones fért i l e s ,
como ha sido previamente descrito (28). En este estudio el 14% de los pacientes infértiles expresó HLA
clase I y II y los dos antígenos fueron siempre asociados con unos y otros en todos los casos con pre s e n c i a
de células blancas. Dado que la leucocitospermia está
asociada en mu chos casos con la pobre calidad espermática (29), es posible que estas mu e s t ras tengan más
contaminación con células blancas que cuando solo
se usa la técnica del swim-up. Se ha demostrado que
los linfocitos T CD4, los cuáles producen IFN-γ, son
numerosos en el testículo de los hombres que padecen una obstrucción testicular unilat e ral, pacientes
postvasectomía con anticuerpos antiespermatozoide
(30) y hombres infectados con VIH-1 (31). La concentración local de IFN-γ en el tejido testicular podría
inducir la ex p resión del HLA en las células dentro de
un área esperm at ogénica específica. Sin embargo, ha
sido demostrado que las células ge rminales son negativas para la ex p resión superficial de HLA clase I, en
hombres con anticuerpos en el esperma (32), así como en varones positivos para VIH.
Dada la discrepancia en los resultados de expresión de HLA en los esperm at o zoides, algunos autore s
han propuesto un mecanismo dependiente del ciclo de
la inhibina para explicar la discrepancia en la ex p resión superficial del HLA entre los distintos grupos de
inve s t i gación (21); nosotros analizamos un total de 26
muestras pero ninguna de ellas tenía un incremento
en la expresión del HLA que no pudiera haber sido
explicado por la presencia de CBS.
La ausencia de antígenos HLA en la mayoría de esp e rm at o zoides, puede ser importante para evitar posibles reacciones inmunes contra antígenos HLA pat e rn o s
ex p resados en la membrana de los zigotos, los cuáles
pueden afectar a la rep roducción normal (33, 34).
Además de la importancia inmu n e, la ausencia de
antígenos del HLA en esperm at o zoides y ovocitos sugi e re que el HLA no juega el mismo papel en la interacción ovo c i t o / e s p e rma humano como se ha suge rido que ocurre en ratón, o cual podría explicar por qué
no hay ex p resión a estos niveles en humanos (35).
En resumen, nu e s t ros datos indican que el RNAm
de los genes de HLA clase I y II y las moléculas del
HLA-G están ausentes en ovocitos maduros e inmaduros y en esperm atozoides maduros, sin embargo en las
células germinales inmaduras masculinas obtenidas
desde el eyaculado sí que se ex p resan los productos de
los genes del HLA. A pesar de ello los antígenos HLA
clase I y clase II no están normalmente presentes en la
s u p e r ficie de estas células ga m e t ogénicas y esto sugi ere la existencia de dife rentes caminos en la ex p re s i ó n
de las moléculas del MHC en las células ge rminales
inmaduras masculinas. La ausencia de las moléculas
del HLA puede ser importante en el mantenimiento de
la fi s i o l ogía normal del gameto y posiblemente de su
e s t atus como célula inmu n o p riv i l egiada.
AGRADECIMIENTOS
A gradecer a Je n n i fer Nelly, Aida Nure dd i n ,
Shehua Shen, Caroline Balint and Kat hy Ja ckson del
l ab o rat o rio de Fecundación In Vi t ro del Hospital
Brigham and Women´s por su colaboración en la recolección de los ga m e t o s .
BIBLIOGRAFÍA
1. Trowsdale J. : Both man & bird & beast: comparat ive
o rga n i z ation of MHC genes. Immu n ogenetics 1995;
41(1): 1-17.
2. Lanier LL and Phillips JH.: I n h i b i t o ry MHC class I
re c ep t o rs on NK cells and T cells. Immunol To d ay
1996; 17(2): 86-91.
3. Rouas-Freiss NRE, Marchal et al.: The alpha1 domain of HLA-G1 and HLA-G2 inhibits cy t o t ox i c i t y
induced by nat u ral killer cells: is HLA-G the public ligand for natural killer cell inhibitory re c eptors?. Proc
Natl Acad Sci USA 1997; 94(10): 5249-54.
4. Ellis SA, Palmer MS, et al.: Human trophoblast and
the ch o ri o c a rcinoma cell line BeWo express a truncated HLA Class I molecule. J Immunol 1990; 144(2):
731-5.
5. Desoye G, Dohr GA, et al.: E x p ression of human major histocompatibility antigens on ge rm cells and early
p re i m p l a n t ation embryos. Lab Invest 1991; 64(3):
306-12.
6. Dohr GA, Motter W, et al.: L a ck of ex p ression of
HLA [corrected] class I and class II molecules on the
human oocy t e. J Immunol 1987; 138(11): 3766-70.
7. R o b e rts JM, Taylor CT, et al.: E x p ression of the
CD46 antigen, and absence of class I MHC antige n ,
on the human oocyte and preimplantation blastocyst.”
Immu n o l ogy 1992; 75(1): 202-5.
8. Ju ri s i c ova A, Casper RF, et al.: HLA-G ex p ression
during preimplantation human embryo deve l o p m e n t .
Proc Natl Acad Sci USA 1996a; 93(1): 161-5.
9. Ju ri s i c ova A, Casper RF, et al.: E m b ryonic human
leuko cyte antigen-G ex p ression: possible implicat i o n s
for human preimplantation development. Fe rtil Steril
1996b; 65(5): 997-1002.
10. Hutter H and Dohr G.: HLA expression on immat u re
and mat u re human ge rm cells. J Rep rod Immu n o l
1998; 38(2): 101-22.
11. Kirszenbaum M, Moreau P, et al.: An alternat ive ly
spliced fo rm of HLA-G mRNA in human trophoblasts
and evidence for the presence of HLA-G tra n s c ript in
adult ly m p h o cytes. Proc Natl Acad Sci USA 1994;
91(10): 4209-13.
12. A l b e rti S and Herze n b e rg LA.: D NA methy l at i o n
p revents tra n s fection of genes for specific surface antigens. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85(22): 8391-4.
13. Kim H and Schuetz AW. : S t ru c t u ral and functional
d i fferentiation of follicular and oviductal mouse oocytes visualised with FITC-protein conjugates. Zygo t e
1993; 1(4): 297-307.
14. Bronson RA, Fusi FM, et al.: Monoclonal antibodies
identify Fc gamma re c ep t o rs on unfe rt i l i zed human
oocytes but not sperm at o zoa. J Rep rod Immunol 1992;
21(3): 293-307.
15. Fe n i chel P, Donzeau M, et al.: E x p ression of complement reg u l at o ry proteins on human eggs and pre i mp l a n t ation embryos. Am J Rep rod Immunol 1995;
33(2): 155-64.
16. Hill JA, Welch WR, et al.: Induction of class II major
histocompatibility complex antigen expression in human granulosa cells by interferon gamma: a potential
mechanism contributing to autoimmune ova rian fa i l ure. Am J Obstet Gynecol 1990 162(2): 534-40.
17. Bulmer JN, and Earl U.: The expression of class II
MHC gene products by fallopian tube epithelium in
p reg n a n cy a nd th roug hou t th e m enst rual cy cl e.
Immu n o l ogy 1987; 61(2): 207-13.
18. Bishara A, Oksenberg JR, et al.: Human leuko cyte
a n t i gens (HLA) class I and class II on sperm cells studied at the sero l ogical, cellular, and genomic leve l s .
Am J Rep rod Immunol Microbiol, 1987; 13(4): 97103.
19. Janitz M, Fi s zer D, et al.: A n a lysis of mRNA fo r
class I HLA on human ga m e t ogenic cells. Mol Rep rod
D ev 1994; 38(2): 231-7.
20. Chiang HM, Steuerwald N, Lambert H, Main EK
and Steinleitner A.: Detection of human leuko cy t e
antigen class I messenger ribonucleic acid transcripts
in human. Fertil Steril 1994; 61: 276-280.
21. Martín-Villa JM, Luque I, et al.: Diploid expression
of human leuko cyte antigen class I and class II molecules on spermat o zoa and their cy clic inve rse correlation with inhibin concentration. Biol Rep rod 1996;
55(3): 620-9.
22. Guilladeux T, Gómez E, Onno M, Dreno B, Segratain
D, Alberti S, Lejeune H, Fa u chet R, Jegou B, Le
Boutier P.: E x p ression of HLA class I genes in meio-
tic and postmeiotic human sperm at ogenic cells. Biol
Rep rod 1996; 55: 99-110.
23. Han JR, Yiu GK, et al.: Te s t i s / b rain RNA - b i n d i n g
protein at t a ches tra n s l at i o n a l ly rep ressed and transported mRNAs to micro t u bules. Proc Natl Acad Sci USA
1995; 92(21): 9550-4.
24. A n d e rson DJ, Bach DL, et al.: Major histocompat i b ility antigens are not ex p ressed on human ep i d i dymal
sperm. J Immunol 1982; 129(2): 452-4.
25. Kuhlman D, Dohr G, Pusch HH, Scherbaum W,
S ch i e fe rstein G, Uch a n s k a - Z i egler B, Ziegler A.:
Absence of HLA class I antigens as b-2 micro bu l i n
f rom normal and pat h o l ogical sperm at o zoa. Ti s s u e
Antigens 1986; 27: 179-184.
26. Anderson DJ, Narayan P, et al.: Major histocompat ibility antigens are not detectable on post-meiotic human
testicular ge rm cells. J Immunol 1984; 133(4): 1962-5.
27. Jassim A, Ollier W, Payne A, Biro A, Olivier RT,
Festenstein H.: Analysis of HLA on ge rm cells in human semen. Eur J Immunol 1989; 19: 1215-1220.
28. Ku rpisz M, Fernández N, et al.: HLA ex p ression on human ge rminal cells. J Immu n ogenet 1987; 14(1): 23-32.
29. Wo l ff H.: The biologic significance of white bl o o d
cells in semen. Fe rtil Steril 1995; 63(6): 1143-57.
30. El-Demery MI, Hargre ave TB, Bussuttil A, Elton R,
James K, Chisholm GD.: Immunocompetent cells in
human testis in health and disease. Fertil Steril 1987;
48: 470-479.
31. P u d n ey J and Anderson D. : Orchitis and human immu n o d e fi c i e n cy virus type 1 infected cells in repro d u ct ive tissues from men with the acquired immune defic i e n cysyndro m e. Am J Pathol 1991; 139(1): 149-60.
32. Castilla JA, Gil T, et al.: Lack of ex p ression of HLA
antigens on immat u re ge rm cells from ejaculates with
a n t i s p e rm antibodies. Am J Rep rod Immunol 1993;
30(1): 9-14.
33. O´Rand MG. : The presence of the sperm - s p e c i fic surface isoantigens on the eggs fo l l owing fertilization. J
Exp Zool, 1977; 202: 267-274.
34. Wi l ey LM, Obasaju MF, et al.: Detection of antisperm
antibodies: their localization to human sperm antigens
that are tra n s fered to the surface of zona-free hamster
o o cytes during the sperm penetration assay. Fe rt i l
S t e ril, 1987; 48(2): 292-8.
35. Mori T, Wu GM, et al.: Expression of class II major
h i s t o c o m p atibility complex antigen on mouse sperm
and its roles in fe rt i l i z ation. Am J Rep rod Immu n o l
1990; 24(1): 9-14.
36. Meyers FJ, Gumerlock PH, Kawasaki ES, Wang AM,
de Ve re White RW, Erl i ch HA.: B l a dder cancer. :
Human leuko cyte antigens II, inteleukin-6 and interleukin-5 re c eptor ex p ression determined by poly m e rase chain reaction. Cancer 1991; 67: 2087-95.
37. Forsyth KD, Chua KY, et al.: E x p ression of the leuko cyte common antigen CD45 by endothelium. J
Immunol 1993; 150 (8 Pt 1): 3471-7.

Expresión del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC)

Transcripción

Documentos relacionados

Diagnós@co, tratamiento e impacto de la pobre respuesta ovárica

Estimulación "ideal" en donantes de ovocitos. Dra. Mónica Álvarez

resumenes de tesis - dissertation abstracts