HCV
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HCV
PORQUE BUSCAMOS LA HEPATITIS C? ESTE INDIVIDUO TIENE HCV? ESTA PERSONA (POTENCIAL DONANTE DE SANGRE) PUEDE ESTAR EXPUESTO A HCV ? QUE EFECTOS TIENE LA INFECCION POR HCV EN EL HIGADO? CUAL ES LA PROBABILIDAD QUE EL TRATAMIENTO SEA EFECTIVO EN ESTE PACIENTE? EXISTEN TRATAMIENTOS EFECTIVOS? QUIENES SON LOS CANDIDATOS A ESTUDIAR EL HCV ? 1- AQUELLOS QUE TIENEN FACTORES DE RIESGO PARA LA INFECCION POR HCV 2- AQUELLOS CON RESULTADOS DE SU FUNCION HEPATICA ANORMAL 3- LOS DONANTES DE SANGRE 4- PACIENTES INFECTADOS CON TERAPIA ANTIVIRAL IMPACTO DE LA INFECCION HISTORIA NATURAL DE LA HEPATITIS C GRAN COHORTE DE PACIENTES AMBOS SEXOS Y DE DIFERENTES ETNICIDAD FECHA DE INFECCION: HEPATITIS C AGUDA SIN TRATAMIENTO CONOCIMIENTO DE COFACTORES ESTRATEGIAS PARA EL ESTUDIO DE LA HISTORIA NATURAL DE HCV INFECCION INICIAL FASE TEMPRANA HEPATITIS CRONICA FASE TARDIA HEPATITIS CRONICA (CIRROSIS) 20 A 40 AÑOS ESTUDIOS RETROSPECTIVOS ESTUDIOS PROSPECTIVOS ESTUDIOS RETROSPECTIVOS - PROSPECTIVOS Leonard Seeff 2002; Hepatology DINAMICA DE LA INFECCION TEMPRANA POR HCV INFECCION POR HCV CLEARANCE VIRAL TRANSMISSION PATOGENESIS PERSISTENCIA VIRAL HCV RNA 4-7 log Doubling Time Viral :10,8 a 17 horas SCREENING SEROLÓ SEROLÓGICO Concentración Relativa Ag/Ac 4ª Período de Ventana Serológica Anti-HCV 3ra Infección Anti-HCV 2da Anti-HCV 1ra 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Eclipse Días ALGORITMO DIAGNÓSTICO Relación S/CO - EIA para Anti HCV NEGATIVO + Alto S/CO RIBA Anti HCV Bajo S/CO POSITIVO NEGATIVO IND INDETERMINADO + POSITIVO Evaluación adicional (PCR, ALT, etc) Alter et al, Recommendations and Reports, CDC,2003 RT-PCR HCV + SCREENING SEROLÓ SEROLÓGICO ELISA CORE E1 E2 NS1 NS2 NS3 NS4 NS5 80% c100-3 1º 2º C22-3 3º C22-3 c200 c200 S 95% NS5 97% La Pregunta Inicial ¿Falso positivo? Pacientes sanos No antecedentes parenterales ALT normal Anti--HCV (+) Anti Pruebas Suplementarias: RIBA-LIA HCV RNA Transfusiones o drogas IV Incremento de ALT Enfermedad hepática ¿Verdadero positivo? Limitaciones del Anti-HCV No mide la presencia de virus circulante No distingue entre infección aguda, crónica o resuelta Es negativo en alrededor del 10% de los pacientes con infección crónica C No es útil para el diagnóstico de infección aguda (seroconversión en semanas) En poblaciones de bajo riesgo la tasa de resultados falsos positivos es alta EN LOS INMUNOENSAYOS MUESTRAS QUE PERMANECEN POSITIVAS Y QUE SON NEGATIVAS POR UN TEST CONFIRMATORIO INESPECIFICA O FALSA REACTIVIDAD FALSOS POSITIVOS O BFR 2- LAS CAUSAS INMUNOENSAYOS La causa primaria de BFR es la reactividad de anticuerpos No específicos ya sea contra epitopes virales o no virales contaminantes Vacunación contra FLU o Rabia Infecciones agudas recientes o Alergias Agentes relacionados inmunologicamente CARACTERISTICAS DE LOS BFR 1- RELACIONADOS AL ENSAYO 2- CAMBIOS DE LA TASA DE BFR CON LOS LOTES 3- VARIACIONES DE BFR DEBIDO A LAS MODIFICA CIONES DEL ENSAYO 4- RESULTADOS DE BFR TRANSITORIO 5- LA SEÑAL S/CO CARACTERISTICAS DE LOS BFR 5- LA SEÑAL S/CO ENSAYOS DE MICROPLACAS HCV BFR S/CO : 1.524 ANTI HCV (+)/ RNA (-) S/CO: 4.546 ANTI HCV (+) RNA(+) S/CO: 6.467 ENSAYOS EN TUBOS MÉTODOS SUPLEMENTARIOS RIBA O LIA Mayor Especificidad y menor Sensibilidad que EIA de 3º Generación LUDWIG VAN BEETHOVEN – 1770-1827 El término música clásica es un amplio, a veces impreciso, término que se refiere a la música producida o arraigada en la tradición INTERPRETACION La Biología Molecular es una ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensión de todos aquellos procesos celulares, que contribuyen a que la información genética se transmita eficientemente de unos seres a otros, y se exprese en los nuevos individuos. INTERPRETACION MUSICA CLASICA ORQUESTA VIOLINES, VIOLAS, FLAUTAS, VIOLONCELOS CONTRABAJO, OBOE, FAGOT, CLARINETE OBRA MUSICAL (SINFONIA) LA BIOLOGIA MOLECULAR ENSAYOS HIBRIDACION, CLONACION PLASMIDOS, TRANSFECCION AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS, SATELITISMO HEPATITIS C SINFONIA HEPATITIS C 1º Allegro Replicación y Persistencia 2º Adagio o Andante Interacción con el SI 3º Minuetto o Scherzo Mutaciones 4º Allegro Finale o Rondó Carga Viral CARGA VIRAL HCV EL MOVIMIENTO DE ESTA SINFONIA : NAT LOS INSTRUMENTOS : PCR CUANTITATIVA TMA REAL TIME PCR bDNA ARMONIA : LOS ACORDES LIMITE DE DETECCION Y CUANTIFICACION Utilidad Clínica del HCV RNA Marcador directo de replicación viral Diagnóstico de infección aguda Diagnóstico de infección oculta Transmisión vertical Transmisión por órganos sólidos Recurrencia de HCV post-trasplante Confiabilidad de los productos sanguíneos Accidentes de trabajo Monitoreo del tratamiento antiviral ¿Para qué sirve la carga viral de HCV? Para estimar la respuesta al tratamiento antiviral Para evaluar la respuesta virológica precoz (12 semanas de tratamiento): HCV RNA negativo o ↓ >2 log ¿Qué valor tienen la carga viral para evaluar la severidad o el pronóstico de una hepatitis crónica C? Ninguno fehacientemente comprobado Tecnología Real time Taqman Syber Green Easy Q (Molecular Beacon) A. Martinez-Lab Virología-CEMIC REAL TIME PCR Sondas de hibridización Molecular beacons Syber Green HCV RNA Tecnología Taqman Journal of Molecular Endocrinology (2000) 25,169-193 HEPATITIS VIRALES-CARGA VIRAL REAL TIME PCR : BAJA CONTAMINACION AUMENTO DEL RANGO DINAMICO : LOG DE 8 O 9 BAJO LIMITE DE DETECCION RESULTADOS EN UI/mL REPRODUCIBILIDAD – HIT RATE 95% “Workflow” 48 muestras DIA 2 DIA 1 9:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 9:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 PCR Extracción, automatizada Amplificación RT Extracción, automatizada Amplificación Detección Detección SCOTT JD, GRETCH DR. JAMA 2007; 21:724-732 ENSAYOS MOLECULARES PARA HCV •NASBA HCV QT (BIOMERIEUX) 278 UI/mL •Procleix HIV 1/ HCV (Gene Probe ) 5 UI/mL •AmpliScreen HCV (Roche) 50 UI/mL HCV RNA CUANTITATIVO MONITOREO TRATAMIENTO SCOTT JD, GRETCH DR. JAMA 2007; 21:724-732 * LOS ENSAYOS MOLECULARES DEBEN ESTAR VALIDADOS * LOS ENSAYOS MOLECULARES: ESTANDARIZADOS * LOS ENSAYOS MOLECULARES: CONTROLES DE CALIDAD * ENSAYOS MOLECULARES COMERCIALES : TRAZABILIDAD PERO CUIDADO!! CAP/ CTM SOBREESTIMACION DE LA CARGA VIRAL SUBESTIMACION DE LA CARGA VIRAL GENOTIPO 2 (15%) GENOTIPO 4 (30%) PAWLOTSKY JM, 2007 Hepatology ;46: 22-31 LOS ENSAYOS DE BIOLOGIA MOLECULAR CONSTITUYEN EL NUEVO PARADIGMA EN LAS HEPATITIS VIRALES NUEVAS TECNOLOGÍAS : ARRAY LÍQUIDO (LUMINEX) NUEVOS MARCADORES : cccDNA (HBV) INTERPRETACION