Microscopía de fluorescencia

Microscopía de fluorescencia
Biología Celular 2011
La microscopía de fluorescencia
Utilidades
• Visualizar partes de la célula: membrana plasmática, núcleo,
vacuolas, retículo endoplásmico, etc.
• Estudiar procesos celulares: división celular, muerte celular,
cambios en el potencial de membrana, endocitosis y exocitosis.
• Observar determinados iones, cambios de pH, etc.
• Diferenciar partículas muy pequeñas que por contraste de fases no
se resolverían.
• Localizar moléculas específicas: proteínas, lípidos, etc
• Estudiar la interacción entre moléculas in vivo.
Principio de la microscopía de
fluorescencia
Las moléculas fluorescentes (fluoróforos) absorben luz de una dada longitud de
onda y emiten luz de otra longitud de onda, más larga.
Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y
visualizado a través de un filtro que sólo permita pasar la luz de longitud de
onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre un
fondo oscuro.
La intensidad y el color de la luz es una propiedad característica de la molécula
fluorescente utilizada.
Microscopio de Fluorescencia
Diagrama de Jablonski
Fenómeno de Fluorescencia
jk
S1
S1
Ea
S1
Ea
S0
Ea
S0
1
Ee
S0
2
3
E=h.υ=h.c/λ
1 – Absorción: Excitación electrónica
2 – Relajación vibracional no radiativa: calor
3 – Relajación radiativa: emisión (λ emisión > λ absorción)
Los espectros de absorción y emisión
Corrimiento de Stokes
Los fluoróforos tienen espectros de
emisión y absorción bien definidos.
Existe una diferencia entre los picos de
absorción y emisión de un fluoróforo
(corrimiento de Stokes) que depende
de la estructura electrónica del
fluoróforo.
E=h.υ=h.c/λ
Los espectros de absorción y emisión
Los espectros de absorción y emisión
La intensidad de fluorescencia
emitida varía con la longitud
(λ) de excitación.
La excitación a la λmax (A),
produce la fluorescencia más
intensa (A).
El perfil o aspecto del espectro
no depende de la λ de
excitación.
http://www.mcb.arizona.edu/IPC/spectra_page.htm
Fluoróforos
Fluoróforos más utilizados: moléculas orgánicas simples y proteínas
fluorescentes.
Muchas sondas fluorescentes son construidas en torno a de sustancias
químicas sintéticas aromáticas orgánicas diseñadas para unirse a una
macromolécula biológica (por ejemplo, una proteína o el ácido nucleico)
o localizar dentro de una región específica estructural, como el
citoesqueleto, mitocondrias, aparato de Golgi, retículo endoplasmático, y
el núcleo.
Otras sondas son empleadas para supervisar procesos dinámicos y
seguimiento de variables ambientales, incluyendo las concentraciones de
iones inorgánicos metálicos, pH, ROS, y el potencial de membrana.
Indicadores fluorescentes se utilizan además para comprobar la
integridad celular (vivos contra muertos y apoptosis), endocitosis,
exocitosis, fluidez de la membrana, el tráfico de una proteína, y la
actividad enzimática.
Fluoróforos Orgánicos
Alexa – Molecular Probes
Derivados sulfonados de otros fluoróforos
Emiten fluorescencia a una mayor
intensidad
Barren todo el espectro
Más estables
Solubles en agua
Núcleo-DAPI
Schizosaccharomyces
pombe
Agardhiella subulata
Célula multinucleada
BRC-230
línea celular
4',6-diamidino-2-phenylindole DAPI
Especies reactivas de oxígeno (ROS)
DHR123 + H2O2
Dihydrorhodamine 123 (DHR123)
R123 + H2O
Anexina-Apoptosis
Ensayo Anexina V
fluorescein isothiocyanate (FITC)
Ensayo Anexina V
Anexina-Apoptosis
Fluoróforos proteicos
Ser65Thr
238 aa
Fluoróforos proteicos
Espectros de excitación y de emisión
Quenching – Atenuación de la fluorescencia
-Procesos de colisión de los estados excitados que reducen la intensidad
de fluorescencia
-Mecanismos:
-Transferencia energética (entre moléculas distintas)
- Reacción química (transferencia de energía como energía de
activación)
Photobleaching
Photobleaching (fading): es la destrucción, usualmente irreversible, del fluoróforo
en el estado excitado. Se pueden producir modificaciones químicas (de uniones
covalentes, por ejemplo).
Ocurre en condiciones de alta intensidad de iluminación, y de altos niveles de O2.
¿Cómo evitarlo?
Se minimiza el tiempo de exposición y la energía de excitación.
Se usan detectores altamente sensibles, objetivos y filtros ópticos optimizados.
Comercialmente se han desarrollado productos con menor labilidad ante la
estimulación lumínica (por ejemplo los fluoróforos Alexa).También se
desarrollaron sustancias “antifade” que reducen el bleaching (Slow Fade, Vecta
Shield, etc). Sin embargo estas sustancias no se pueden utilizar en células
vivas.
DAPI (núcleos) - MitoTracker Red (mitocondrias) - Alexa Fluor phalloidin (actina)
Fibroblastos de ciervo
Usos de Quenching y Photobleaching
Las propiedades de quenching y el photobleaching de un
fluoróforo pueden ser utilizadas para estudiar la dinámica y la
asociación de estructuras marcadas:
• FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)
• FLIP (Fluorescence Loss in Photobleaching)
• FRET (Föster Resonance Energy Transfer)
FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)
En FRAP se decolora un área específica por pulsos de láser de alta
intensidad. Posteriormente la cinética de recuperación de fluorescencia es
registrada por imágenes de muestreo en intervalos de tiempo regulares con
la iluminación de intensidad baja. Difusión y movilidad de macromoléculas.
Parámetros cinéticos
• La proporción entre fracción móvil e inmóvil.
• El coeficiente de difusión eficaz Deff
• El tiempo de unión (así como ensamble/desensamble) de proteínas a
estructuras macromoleculares.
• Formación de complejos proteicos (baja Deff)
FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)
tm
El área fluorescente es decolorada, ocurre un decrecimiento inicial de la
fluorescencia la cual es recuperada por difusión de los componentes del retículo
endoplasmático. Se calculan tiempos de difusión media y la fracción móvil.
FLIP (Fluorescence Loss in Photobleaching)
Estrechamente relacionado con FRAP es la pérdida de fluorescencia en el
fotoblanqueo. En experimentos de FLIP una región especificada de la célula
repetidamente es decolorada y se observa la pérdida de fluorescencia en las
partes no blanqueadas de la célula es medida. Se utiliza para observar
movimientos en membranas.
Disociación cinética de DDB2
La proteína DDB2 se une
al DNA cuando sufre un
daño por radiación UV,
comenzando el proceso
de
reparación.
Luego
DDB2 se disocia del DNA.
Se fusionó DDB2 a YGFP
para
ver
localización
subcelular.
Combinación de FRAP y FLIP
Determinar la dinámica de la
Histona H1 (puntos verdes) entre el
núcleo ( con ADN) y el espacio
intercromosomal (sin ADN)
Espacio NO
cromosomal
Espacio
cromosomal
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
TRANSFERENCIA DE ENERGIA ENTRE FLUOROCROMOS
La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), es una
interacción que ocurre solo a muy corta distancia entre dos estados de
excitación electrónica de dos moléculas fluorescentes en la que la longitud de
onda de emisión de una de ellas coincide con la de excitación de la otra.
Aceptor
Donante
1. Las moléculas de aceptor
y donante deben estar muy
próximas (10-100 Å).
2. El espectro de absorción
del aceptor debe solaparse con el espectro de
emisión de fluorescencia
del donor.
FRET
Intermolecular
FRET
Intramolecular
Controles FRET
Ventajas:
• Trabajar in vitro y con células vivas de mamíferos, no sólo levaduras.
• Alta resolución temporal (milisegundos) y espacial (submicrones).
• La interacción con otras proteínas puede darse en cualquier lugar de la
célula, no necesitan ser enviadas al núcleo.
Desventajas:
Deben expresarse proteínas de fusión, donde ambas partes deben
permanecer funcionales.
• Si las PFs están muy distantes unas de otras (a > 80 Aº) o mal orientadas,
FRET fallará.
• Incluso sin asociaciones, la superposición de espectros contribuye aporta
algo de señal en los λ de FRET.
• Se necesitan controles positivos y negativos.
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