Memoria Científica - Severo Ochoa

Transcripción

Biología del desarrollo
Developmental Biology
Biología celular
Cell Biology
Inmunología y virología
Immunology and virology
Neurobiología
Neurobiology
Regulación de la expresión génica
Regulation of gene expresion
Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)
y Universidad Autónoma de Madrid (UAM)
Universidad Autónoma de Madrid
Cantoblanco
28049 MADRID
Tel.: (+34) 91 397 5070
Fax: (+34) 91 397 4799
http: //www.cbm.uam.es
Memoria Científica Scientific Report
01
02
Coordinadores de esta Memoria /
Report Coordinators
José Manuel Cuezva
Crisanto Gutierrez
Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)
y Universidad Autónoma de Madrid (UAM)
Universidad Autónoma de Madrid
Cantoblanco
28049 MADRID
Tel.: (+34) 91 397 5070
Fax: (+34) 91 397 4799
http: //www.cbm.uam.es
Comentarios del director
Introductory remarks .......4
Personal
Personnel
Índice
Index
.......8
A
Biología del Desarrollo
B. 6 Tráfico regulado de proteínas de
membrana
A. 1 Análisis Genético de mecanismos
morfogenéticos en Drosophila
Regulated membrane protein
trafficking
Genetic Analysis of morphogenetic
mechanisms in Drosophila
Antonio García-Bellido
.......14
Ignacio V. Sandoval
B. 7 Terapia génica experimental
A. 2 Mecanismos de señalización en el
desarrollo
Experimental gene therapy
Signalling mechanisms in development
Isabel Guerrero
.......36
Antonio Talavera
.......38
.......16
B. 8 Química de proteínas y proteómica
A. 3 Comunicación intercelular en el
desarrollo del Drosophila
Protein chemistry and proteomics
Jesús Vázquez
Cell-cell signalling in Drosophila
development
Fernando Jiménez Díaz-Benjumea
.......18
A. 4 Biología molecular del desarrollo
Molecular biology of development
Juan Modolell
.......20
C
Inmunología y Virología
Immunology and Virology
C. 1 Transmisión de señales a través del
receptor para el antígeno de células T
A. 5 Control genético de la morfogénesis
Genetic control of morphogenesis
Ginés Morata
.......40
.......22
Signal transduction through the T cell
antigen receptor
Balbino Alarcón
B
.......44
C. 2 Bases moleculares de la patogenia y
del potencial anti-tumoral de los
parvovirus
Biología Celular
Cell Biology
Molecular bases of parvovirus
pathogenesis and anti-tumour potential
José M. Almendral
.......46
B. 1 Citoesqueleto y nucleoesqueleto
Cytoskeleton and nucleoskeleton
Isabel Correas
.......26
C. 3 Bases moleculares de la citopatología
viral
Molecular bases of viral cytopathology
Luis Carrasco
B. 2 Mecanismos de regulación de la
biogénesis mitocondrial y alteración
mitocondrial en cáncer
C. 4 Variabilidad genética de virus RNA
Mechanisms that regulate the
biogenesis of mitochondria and
mitochondrial alterations in cancer
José M. Cuezva
.......48
Genetic variability of RNA viruses
Esteban Domingo
.......50
.......28
C. 5 Activación del sistema inmune
B. 3 Terapia génica experimental
Activation of the immune system
Marta Izquierdo
Manuel Fresno
C. 6 Estabilidad e ingeniería de proteínas
víricas
B. 4 Desarrollo neuronal y
neurodegeneración
Stability and engineering of viral
proteins
Neuronal development and
neurodegeneration
Francisco Moreno
.......52
.......30
Mauricio García Mateu
.......54
.......32
C. 7 Replicación del DNA y ciclo celular
B. 5 Señalización celular por PKC atípicas
en inmunidad y cáncer
DNA replication and cell cycle
Crisanto Gutierrez
Cell signaling through the atypical PKC
pathways in immunity and cancer
Jorge Moscat
.......34
.......56
C. 8 Inmunología de los antígenos de
histocompatibilidad
D. 5 Regulación de la expresión génica en
enfermedades neurodegenerativas
Immunology of histocompatibility
antigens
Regulation of the gene expression in
neurodegenerative diseases
José A. López de Castro
.......58
Cecilio Giménez
E. 6 Mantenimiento y variabilidad del
genoma: enzimología de la reparacion
del DNA
.......86
Genome maintenance and variability:
enzymology of DNA repair
Luis Blanco
D. 6 Bases moleculares de la adaptación
al ejercicio y de la plasticidad muscular
C. 9 Enzimas retrovirales: análisis estructural
y funcional de la retrotranscriptasa del
virus de la inmunodeficiencia humana
Luis Menéndez Arias
Rafael Manso
.......60
C.10 Regulación de la expresión génica en
endotelio vascular
Alberto Martínez Serrano
Miguel Angel Rodríguez Marcos
Federico Mayor, jr.
C.12 Virus de la peste porcina africana
.......92
.......94
.......68
Jorgina Satrústegui.
E.12 Estructura cromatínica y transcripción
Chromatin structure and transcription
Enrique Palacián
.......124
.......96
Cell envelopes
Miguel Angel de Pedro Montalban
.......126
Molecular neuropathology of
Alzheimer's disease
.......70
Fernando Valdivieso.
.......98
E.14 Bases moleculares de las
enfermedades metabólicas
Molecular basis of metabolic diseases
Replication and transcription of
bacteriophage ø29
Magdalena Ugarte
.......72
Neurobiología
Neurobiology
.......128
E
Regulation of gene expression
D
Responsables de Laboratorio
Persons in charge of laboratories ....132
E. 1 Parasitología molecular
Molecular parasitology
Carlos Alonso
D. 1 Bases moleculares de la
neurotransmisión glicinérgica
.......102
E. 2 Expresión génica en linfocitos T
Molecular basis of glycinergic
neurotransmission
Seminarios
Seminars
....136
Seminarios “Severo Ochoa”.
Avances en Biología Molecular
Seminars “Severo Ochoa”.
Advances in Molecular Biology
.....138
Servicios Técnicos
de Apoyo a la Investigación
Research and Support Facilities
.....140
Lecciones conmemorativas
Memorial Lectures
.....142
Gene expression in T lymphocytes
.......78
D. 2 Función de las proteínas
microtubulares en neuronas
Miguel A. Alonso
.......104
E. 3 Biología molecular de extremófilos
(microbiología aplicada)
Function of microtubular proteins in
neurons
Molecular biology of extremophylic
microorganisms
.......80
D. 3 Transducción de señales. Mecanismos
de acción de neuromoduladores e
implicaciones farmacológicas
Ricardo Amils
.......106
E. 4 División celular bacteriana y resistencia
a antibióticos
Bacterial cell division and antibiotics
resistance
Signal transduction. Mechanisms of
action of neuromodulators and
pharmacological implications
Juan Alfonso Ayala Serrano
.......108
.......82
E. 5 Biotecnología y genética de bacterias
termófilas extremas
D. 4 Bases moleculares de la plasticidad
neuronal
Biotechnology and genetics of extreme
thermophilic bacteria
Molecular basis of neuronal plasticity
F. Javier Díez Guerra
.......122
E.13 Envolturas celulares
C.15 Replicación y transcripción del DNA
del bacteriófago ø29
Edgardo Catalán
.......120
E.11 Iniciación interna de la traducción en
mRNAs eucarióticos
Encarnación Martínez-Salas
D.11 Neuropatología molecular de la
enfermedad de Alzheimer
Development of the human
lymphohematopoietic system
Jesús Avila de Grado
Gene expression in yeast and
Streptomyces
Internal initiation of translation in
eukaryotic mRNAs
Neurodegeneration and ageing:
calcium signalling in mitochondria and
insulin/leptin signalling during ageing
C.14 Desarrollo del sistema
linfohematopoyético humano
Carmen Aragón
.......118
E.10 Expresión génica en levaduras y
Streptomyces
D.10 Neurodegeneración y envejecimiento:
señalización mitocondrial del calcio y
señalización de insulina/leptina en
envejecimiento
Development of new strategies to
control and prevent viral diseases: the
foot-and-mouth virus as a model
Margarita Salas
Protein synthesis and its regulation in
eukaryotes
César de Haro, José M. Sierra
Neurotransmission and development
Galo Ramírez.
María Luisa Toribio
.......90
D. 9 Neurotransmisión y desarrollo
.......66
C.13 Desarrollo de nuevas estrategias para
el control y prevención de
enfermedades virales: el virus de la
fiebre aftosa como modelo
Francisco Sobrino
.......116
E. 9 Síntesis de proteínas y su regulación
en eucariontes
Antonio Jiménez
African swine fever virus
María Luisa Salas
Juan Pedro García Ballesta
G protein-coupled receptors signaling
and regulatory mechanisms
.......64
.......114
Ribosome structure and function
D. 8 Mecanismos de señalización y
regulación de receptores acoplados a
proteínas G
Embryonic development of the
José Luis Castrillo Díez
E. 8 Estructura y función del ribosoma
Biology of human neural stem cells.
Potential for gene therapy in
neurodegeneration
.......62
linfohematopoiético embrionario
Regulation of the tissue-specific gene
expression
.......88
D. 7 Biología de células troncales neurales
humanas. Potencial para reposición
celular y terapia génica en
neurodegeneración
Regulation of gene expression in
vascular endothelium
Juan Miguel Redondo
E. 7 Regulación de la expresión génica
específica de tejido
Molecular bases of the adaptation to
exercise and of skeletal muscle
plasticity
Retroviral enzymes: structural and
functional analysis of human
immunodeficiency virus reverse
transcriptase
.......112
José Berenguer
.......84
.......110
C O M E N TA R I O S D E L D I R E C T O R
W O R D S
F R O M
T H E
D I R E C T O R
Próximos a celebrar el 50 aniversario del
El esfuerzo de nuestros investigadores
descubrimiento de la doble hélice, podemos
y personal de apoyo ha sido y es modélico
observar lo mucho y bueno que se ha
y es la razón fundamental por la que nuestro
realizado en estos años en el campo de la
Centro tiene un cierto reconocimiento a nivel
Biología Molecular. En este último bienio,
Internacional. El aumento de recursos es
tras haberse determinado la secuencia del
muy mejorable. Afortunadamente, tenemos
DNA de muchos organismos, incluyendo el
la ayuda de nuestros patronos, el CSIC y la
ser humano, se han comenzado los estudios
UAM, así como el apoyo esencial y
de genómica funcional en muchos de esos
constante de la Fundación Ramón Areces
organismos. Nuevos descubrimientos como
(a través de una ayuda institucional a la
las moléculas de RNA que pueden prevenir
Ciencia que se realiza en nuestro Centro).
la expresión génica pueden ser valiosas
Igualmente, la valía de nuestros
herramientas para estos estudios. Pero no
investigadores nos ha permitido obtener
solo se han conseguido avances en el área
ayudas competitivas de organismos públicos
de la expresión génica, sino también en las
(fundamentalmente del Ministerio de Ciencia
otras áreas de la investigación: Biología del
y Tecnología, y del Ministerio de Sanidad y
Desarrollo, Virología, Inmunología,
Consumo), y también de instituciones
Microbiología, Biología Celular, Señalización
privadas. Sin embargo, requerimos de más
Celular o Neurobiología; todas estas
recursos.
disciplinas se desarrollan en nuestro Centro.
Un problema fundamental del CBMSO
Existe pues una gran rapidez de
es la carencia de espacio. Por ello las
acontecimientos científicos en el campo de
Direcciones anteriores (Federico Mayor
la Biología Molecular que requiere de
Menéndez y Miguel Angel de Pedro)
nosotros un gran esfuerzo para ser
gestionaron la posible construcción de un
competitivos a nivel internacional.
nuevo edificio. Gracias a su gestión, hoy en
Adicionalmente, cada día aparecen nuevas
día tenemos un proyecto para construir una
técnicas y equipamientos, lo cual nos hace
nueva sede en el Campus de Cantoblanco,
depender de recursos materiales para los
dentro del Parque Científico de Madrid.
que necesitamos cada vez una mayor
Tenemos cedida por la UAM una parcela, y
subvención, para estar en las mismas (o por
actualmente existe un proyecto de
lo menos no muy diferentes) condiciones
construcción de este nuevo edificio que está
que nuestros colegas extranjeros.
llevando a cabo la empresa Euroespacios.
Con este nuevo edificio se pretende
reorganizar el CBMSO. En este reorganizado
Centro se piensa aunar las diferentes líneas
de trabajo, junto con algún otro nuevo grupo
externo, en cuatro áreas de trabajo que
hagan más eficiente su funcionamiento.
4
En el bienio 2001-2002 la
mundial. En recuerdo a Eladio
producción de las diferentes líneas
Viñuela, el Instituto de Biología
fundamentales para el buen
del Centro ha dado lugar a 338
Molecular (CSIC) ha pasado a
funcionamiento del CBMSO es su
artículos de investigación con un
denominarse Instituto de Biología
Departamento Técnico. Muchos
índice de impacto medio de
Molecular “Eladio Viñuela”. Otra
de los servicios de este
alrededor de 6. El número de
novedad relacionada con el
Departamento se han consolidado
proyectos de investigación
personal científico en formación
durante este bienio y se ha
financiados ha sido de 316
no en plantilla, ha sido la
procedido a la instauración de uno
incluyendo aquellos
instauración de dos premios para
nuevo, el Servicio de Citometría
subvencionados por instituciones
una buena Tesis leída en el Dpto.
de Flujo.
públicas (del Gobierno Central o
de Biología Molecular de nuestra
de Comunidades Autónomas,
Facultad, y para un buen trabajo
De cara al futuro, la mayor
fundamentalmente la Comunidad
publicado de investigación. Cuidar
preocupación es la de tener a las
de Madrid, que adicionalmente ha
la formación de nuestros
personas adecuadas y los medios
indicado que hará una valiosa
investigadores más jóvenes y
necesarios para llevar a cabo una
inversión en el desarrollo del nuevo
mejorar su modo de trabajar es
excelente labor investigadora; para
edificio), privadas, y de la Unión
de vital importancia. En este
ello necesitaremos más
Europea.
sentido se debe de buscar para
subvenciones para plazas y
ellos unas mejores condiciones
contratos de trabajo, y para
contractuales que faciliten su labor.
infraestructuras.
El CBMSO es un centro
Uno de los pilares
universitario y por lo tanto cuida
la formación científica de sus
No menos importante es la
Cerca del X aniversario de la
miembros más jóvenes de
formación de personal técnico
muerte de D. Severo Ochoa,
acuerdo con las normas
altamente capacitado. En este
debemos de buscar que nuestro
académicas. Desde este punto de
sentido, el CBMSO ha mantenido
Centro sea un lugar de excelencia
vista, y en colaboración con el
su colaboración con el INEM, a
científica como él deseaba.
Dpto. de Biología Molecular, ha
través de la Fundación Severo
Tenemos un personal creativo y
colaborado en algunos aspectos
Ochoa, para favorecer la
con gran capacidad de trabajo.
docentes y se han leído tesis
formación de técnicos en la
Por ello debemos de encontrar
doctorales. Adicionalmente, se ha
Escuela-Taller.
más recursos para poder realizar
el trabajo que deseamos. Estoy
mantenido el Master de
Biotecnología. Además, se han
Otra actividad novedosa ha
convencido que con unas buenas
llevado a cabo 81 Seminarios, de
sido la iniciación de una Escuela
condiciones el CBMSO podrá
ellos 20 dentro del Ciclo Severo
de Periodismo Científico,
realizar un trabajo excelente y
Ochoa. Se han celebrado también
subvencionada por la Fundación
competitivo que pueda dar frutos
las Lecciones 8ª y 9ª en honor a
Española para la Ciencia y la
a nuestra sociedad.
Severo Ochoa, y la 2ª y 3ª en
Tecnología (FECYT), y que ha
memoria de Eladio Viñuela,
buscado mejorar la capacidad de
nuestro pionero de la Biología
comunicación de nuestros
Molecular, en las que han
científicos más jóvenes.
participado investigadores de talla
5
Jesús Avila
Director
WORDS FROM THE DIRECTOR
C O M E N T A R I O S
D E L
Close to the celebration of
the 50th anniversary of the
discovery of the double helix,
we can look back on the
breakthroughs in the field of
Molecular Biology. In the last
two year period, after the
determination of the DNA
sequence of numerous
organisms — including that of
the human — functional
genomics research has been
carried out with many of these
organisms. New discoveries
such as RNA molecules that
can prevent gene expression
may become valuable
instruments for use in this area
of research. Advances have
not been restricted to the area
of gene expression but include
other research areas, such as:
Developmental Biology,
Virology, Immunology,
Microbiology, Cell Biology,
Cellular Signalling and
Neurobiology; all these
disciplines are followed at our
Centre.
There is rapid progress
and change within the field of
Molecular Biology; in order to
remain competitive
internationally we will have to
work hard. Additionally, new
techniques and systems are
developed daily, putting new
D I R E C T O R
burdens on our resources. If
we do not keep up we will lag
behind our competitors
abroad.
The effort of our
researchers and support
personnel has been and is
exemplary. They are the
fundamental reason why our
Centre has achieved a strong
international recognition. But
more resources are needed.
Fortunately, we are backed by
our sponsors — the CSIC
(Spanish Board of Scientific
Research) and the UAM
(Autonomous University of
Madrid) — and we enjoy the
constant and essential support
from the Ramón Areces
Foundation. Likewise, the
precious skills of our
researchers have allowed us
to obtain competitive grants
from public organisations —
mainly from the Department
of Science and Technology
and the Department of Health
and Consumer Affairs — as
well as from private institutions
(acknowledged in the Lines of
Work section of the
Memorandum Report).
However, in spite of this, we
still require more resources.
6
A fundamental problem
faced by the CBMSO is the
lack of space. Therefore, the
formers Directors, Federico
Mayor and Miguel Angel de
Pedro, have planned the
construction of a new building.
Thanks to his work, today we
have a project for the
construction of our new central
premises at the Cantoblanco
Campus, located in the
Scientific Park of of Madrid .
We have been given a plot of
land by the UAM, and currently
there is a project for the
construction of this new
building carried out by the firm
Euroespacios. The aim of this
development is to reorganise
the CBMSO and gather in this
new Centre groups in four
areas and to join them with
some groups from outside.
This will make the running of
the Centre much more
efficient.
In the 2001-2002 period,
the production of the Centre’s
different teams has led to 338
research papers, with an
average impact value of
around 6. Financed research
projects amounted to 316,
including all those projects
subsidised by public
institutions such as Central or
Another new activity was the
establishment of a Scientific Journalism
School, subsidised by the FECYT (Spanish
Science and Technology Foundation) which
seeks to improve the capacity for
communication of our youngest scientists.
Autonomous Governments — mainly the
Community of Madrid, which have expressed
their interest in investing in the new building
development — private institutions and the
European Union.
The CBMSO is a university centre and,
therefore takes care of the scientific training
of its youngest members in accordance with
academic ordinances. From this point of
view, and in collaboration with the Department
of Molecular Biology, it has trained many
graduate students to PhD level. In addition,
we have supported the Masters of
Biotechnology studies. Eighty-one seminars
have been given, of which twenty were part
of the Severo Ochoa Cycle. The 8th and 9th
lectures celebrated Severo Ochoa’s, and the
2nd and 3rd were a tribute to Eladio Viñuela,
our pioneer in the field of Molecular
Biology.These lectures were given by
internationally well-known researchers. Also,
as a tribute to Eladio Viñuela, the CSIC
(Institute of Molecular Biology) has been
renamed Institute of Molecular Biology “Eladio
Viñuela”. Other news in connection with
scientific trainees has been the creation of
two awards, one for the best Thesis read at
our Faculty’s Department of Molecular
Biology, and another for the best peerreviewed piece of research. It is our policy
to provide training and support to our
youngest researchers, so we must achieve
the best contractual terms for them and their
work.
One of the foundations of the smooth
operation of the CBMSO is its Technical
Department. Many of the services offered
by this Department have been consolidated
during this two-year period. Furthermore, a
new service, the Flux Cytometry Service has
also been set up.
As for the future, our main concern is to
gather the appropriate people and the
necessary means to carry out excellent
research work. To achieve this, we will need
more subsidies for labour positions and
contracts, as well as for infrastructures. Close
to the X anniversary of Severo Ochoa’s
passing, we must build a Centre that is the
place of scientific excellence he envisaged.
We have creative and hard working
personnel. Therefore, we must find more
resources so we can reach the goals set in
our work. I am convinced that, under good
conditions, the CBMSO will be able to carry
out outstanding and competitive work for the
benefit of our society.
Jesús Avila
The training of highly qualified technical
personnel is equally important. The CBMSO
is continuously collaborating with the INEM
(Spanish Employment Office) through the
Severo Ochoa Foundation in order to
promote the training of technicians at the
Workshop School.
Director
7
Personal Personnel
CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR
"SEVERO OCHOA"·
A
B
Dirección /
Management Board
Personal Científico /
Scientific Staff
Director / Director
CONSEJO SUPERIOR DE
INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (CSIC)
PROFESORES DE INVESTIGACIÓN /
RESEARCH PROFESSORS
Vicedirector / Vicedirector
José Berenguer Carlos
Director del Instituto de Biología
Molecular "Eladio Viñuela" del CSIC /
Director of the Instituto de Biología
Molecular "Eladio Viñuela" CSIC
Crisanto Gutiérrez Armenta
Director del Instituto Universitario de
Biología Molecular de la UAM /
Director of the Instituto Universitario
de Biología Molecular UAM
José Manuel Cuezva Marcos
Alarcón Sánchez, Balbino
Alonso Bedate, Carlos
Avila de Grado, Jesús
Domingo Soláns, Esteban
García Ballesta, Juan Pedro
García-Bellido y Gª de Diego, Antonio
Gutiérrez Armenta, Crisanto
Jimenez Martínez, Antonio
López de Castro, José Antonio
Modolell Mainou, Juan
Morata Pérez, Ginés
Moscat Guillén, Jorge
Palacián Gil, Enrique
Ramírez Ortiz, Galo
Ripoll Quintas, Pedro M.
Salas Falgueras, Margarita
Vicente-Sandoval Rodríguez, Ignacio
Gerente / Administrative Director
Salvador Fortes Alba
Oficina de Relaciones Institucionales
/ External Relations and
Communication Department
Rosario Martín Rodríguez
INVESTIGADORES CIENTÍFICOS /
RESEARCH SCIENTISTS
Alonso Lebrero, Miguel Angel
Blanco Dávila, Luis
Campuzano Corrales, Sonsoles
Guerrero Vega, Isabel
Haro Castella, César Jesús, de
Martínez Salas, Encarnación
Nieto López, Antonio
Pedro Montalbán, Miguel Angel, de
Ramírez Ortiz, Angel
Redondo Moya, Juan Miguel
Salas Falgueras, José
Salas Falgueras, María Luisa
Sánchez-Herrero Arbide, Ernesto
Sobrino Castello, Francisco
Toribio García, María Luisa
CIENTÍFICOS TITULARES /
TENURED SCIENTISTS
Alcamí Pertejo, Antonio Javier
Antón Canto, Luis Carlos
Ayala Serrano, Juan Alfonso
Busturia Jimeno, Ana María
Castrillo Díez, José Luis
Celis Ibeas, José Felix de
Díaz-Meco Conde, Mª Teresa
Escarmís Homs, Cristina
Gómez Skarmeta, José Luis
Jiménez Díaz-Benjumea, Fernando
López Carrascosa, Angel L.
Lucas Lozano, José Javier
Menéndez Arias, Luis
Pulido Vega, Diego
Revilla Novella, Yolanda
Rodríguez Marcos, Miguel A.
Ruiz Gómez, Mar
Talavera Díaz, Antonio
Vázquez Cobos, Jesús
Villasante Atienza, Alfredo
Wandosell Jurado, Francisco
8
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE
MADRID (UAM)
CATEDRÁTICOS / PROFESSORS
Amils Pibernat, Ricardo
Aragón Rueda, Carmen
Carrasco Llamas, Luis
Cuezva Marcos, José Manuel
Fresno Escudero, Manuel
Giménez Martín, Cecilio
Hermoso Nuñez, José Miguel
Mayor Menéndez, Federico
Mayor Zaragoza, Federico
Moreno Muñoz, Francisco
Satrústegui Gil-Delgado, Jorgina
Sierra Pérez, José Manuel
Ugarte Pérez, Magdalena
Valdivieso Amate, Fernando
PROFESORES TITULARES /
ASSOCIATE PROFESSORS
Abad Lorenzo, José Pascual
Almendral del Río, José Mª
Armas Portela, Rosario
Berenguer Carlos, José
Bogónez Pelaez, Elena
Bonay Miarons, Pedro
Carrascosa Baeza, Jose Mª
Catalán Tobar, Edgardo
Correas Hornero, Isabel
Díaz Nido, Javier
Díez-Guerra, Fco. Javier
Fernández Lobato, María
Fernández Santarén, Juan Antonio
García Mateu, Mauricio
García Ruiz, Predestinación
Hernández Sánchez, Francisco
Izquierdo Rojo, Marta
Jiménez Martínez, Juan Salvador
López Corcuera, Beatriz
López Guerrero, José Antonio
Manso Martinez, Rafael
Marín Palma, Irma
Martínez Serrano, Alberto
Montejo de Garcini Guedas, Esteban
Remacha Moreno, Miguel
Requena Rolania, José Mª
Ruiz Gómez, Ana
Santamaría Pérez, Francisco
Sanz Martín, José Luis
Zafra Gómez, Francisco
PERSONAL CIENTÍFICO
CONTRATADO /
Airaksinen, Antero
Azpiazu Torres, Natalia
Barrio Olano, María Rosa
Bravo García, Alicia
Bullido Gómez-Heras, Mª Jesús
Calleja Requena, Manuel
Camacho Pedrero, Ana
Campillos González, Mónica
Cano López, Eva Mª
Castellano Moreno, Mª del Mar
Del Pozo Benito, Juan Carlos
Desvoyes, Irene Benedicte
Fernández Malavé, Edgar
García García, Miguel Angel
García Muñoz, Mª José
Gironés Pujol, Nuria
Gorfinkiel Haim, Nicole
Hernández López de Munain, Cristina
Hernández Pérez, Félix
Giménez Mateo, Oscar
Giménez Sanz, Carmen
Giovinazzo, Giovanna
Giovizazo, Giovanna
Glavic Mure, ALvaro
Gómez -Casero Esteban, Elena
Gómez Gómez, Felipe
González Barrera, Sergio
González Huici, Victor
González López, Claudia
Guerra García, Susana
Gutierrez Rivas, Mónica
Haro Castuera, Amparo
Herranz Muñoz, Héctor
Lamas López, José Ramón
Lim, Filip
Liste Noya, Isabel
Llorca Blanco, Oscar Antonio
Lomas López, Rodrigo
Lombardia Uria, Manuel
López Bueno, Alberto
López de Quinto, Sonia
López Matas , Mª. Angeles
Lorite Arana, Mª. José
MadridPérez, Olga
Marco Recuenco, Mª Carmen de
Maroto López, Beatriz
Martín Aparicio, Mª Ester
Martín Gordillo, Fernando
Martín Ruíz-Jarabo, Carmen
Más López, Antonio
Molina Balsa, Isabel
Morato López, Esperanza
Paradela Elizalde, Alberto
Perales Viejo, Celia
Pérez Martínez, Mª del Mar
Quijada Arteaga, Luis
Ramírez Parra, Elena
Recuero Vicente, María
Resino de Castro, Jaime
Rodríguez Martínez, Javier Mª
Ruiz León, Yolanda
Ruiz Olivar, Emilio
Sabariegos Jareño, Rosario
Sánchez Martínez, Cristina
Sánchez Ramón, Silvia
Saugar Gómez, Irene
Sayas Casanova, Carmen Laura
Solorzano Blanco, Karla
Speicher, Stephan
Truniger, Verónica
Vázquez García, Miriam Noemí
Villa Díaz, Ana
Yunta González, Mónica
Iñiguez Peña, Miguel Angel
Izquierdo Juárez, José María
Lafuente Monasterio, Mª José
Lalioti, Vassiliki
Lozano Salvatella, Juan José
Martín Belmonte, Fernando
Martín Fernández, Pilar
Martínez Martínez, Sara
Meijer, Wilfried
Mendieta Gómez, Jesús
Merinero Cortés, Begoña
Moreno Flores, Mª Teresa
Murga Montesinos, Cristina
Navarrete López de Soria, Rosa María
Núñez garrote, José Ignacio
Nusspaumer da Costa, Gretel
Pardo Merino, Beatriz
Penela Márquez, Petronila
Pérez González, Belén
Pérez Martín, José Manuel
Pérez Martínez, Mª. del Mar
Pérez-Cerdá, Celia
Ribas Núñez, Catalina
Richartd Rodríguez, Eva María
Rodríguez Márquez, Antonio
Rodríguez Martínez, Javier María
Rojo Gozalo, Susana
Ruiz Desviat, Lourdes
San José Martínez, Esther
Santos Tejedor, Cruz
Sanz Alonso Laura
Schamel, Wolfgang
Sevilla Hidalgo, Noemí
Soto Alvarez, Manuel
Suzanne, Magali
POSTDOCTORALES /
POSTDOCTORAL FELLOWS
Agudo Barriuso, Marta
Aldudo Soto, Jesús
Alejo Herberg, Ali
Alfranca González , Arantzazu
Alonso Martínez, María
Alvarez Nieto, Gema
Andrés Hernández, Germán
Baranowski, Eric
Barrios Bardavio, Beatriz
Beneyto Santonja, Mónica
Bonniotti, Beatrice
Boskovic, Yasminka
Burgos Muñoz, Javier
Callejo de Prado, Ainhoa
Canellada, Andrea
Cañas Montalvo, Benito
Carrillo Rosales, Graciela
Cavodeassi, Florencia
Cebria Gómez, Antonio
del Arco Martínez, Araceli
Díaz Gallardo, Martha Yadira
Díaz Hernández, Miguel
Dufour, Emmanuel
Durán Cascales, Consuelo
Eisembrand, Ralf
Excavour, Casandra
Frünt, Corinne
Frutos de Diego, Sonia
Garagorri Ganchegui, Nerea
García Escudero, Ramón
García García, Miguel Angel
García Muñoz, Fernando
García Palomero, Esther
García Peydró, Marina
Garrido Jurado, Juan José
Gascón Escobar, Irene
Gil Pagés, Diana
BECARIOS PREDOCTORALES /
GRADUATE STUDENTS
Acosta, Federico
Adan Padrón, Alexander
Alcaide Alonso, Pilar
Alcorlo Pagés, Martín
Aldaz Casanova, Silvia
Alonso Martínez, María
Alonso Torres, Pablo
Altmutter, Christina
Alvarez Gómez, Enrique
Aranda Gómez, Juan Francisco
Argoñórez, Martín Eduardo
Arias Esteban, Armando
Arroyo Becerra, Analilia
Avila Flores, Juana
Avila Flores, Silvia
Baena López, Luis Alberto
Barrado Guerrero, Patricia
Bassy Alvarez, Olga
9
Batista Barcón, Alicia
Bejarano León, Fernando
Blanco Fuentes, Raquel
Blas Galindo, Emilio
Bourahi, Redouane
Briceño, Verónica
Bueno López, Carlos
Caballero Mateo, Nuria
Cacheiro Llaguno, Cristina
Calandria Pérez, Carlos
Calles Arenales, Belén
Cantó, Carmen
Carmona, Pedro
Caro Azoy, Eddy
Carrasco Rando, Marta
Carreira Moreno, Aura
Carrillo Terán , Wilman
Carrión Herrero, Fco. Javier
Cases González, Clara Elisa
Castán García, Pablo
Castro Reguera, Margarita
Cava Valenciano, Luis Felipe
Cavero Martínez, Santiago
Clavero Villarrubia, Sonia
Cobas Pupo, Guillermo
Contreras Balsa, Laura
Costa, Katyssulla
Crespo Alonso, Miguel
Cruz Rubio, Cristina
Cubelos Alvarez, Beatriz
Chattopadhyay, Sharmila
Chichón García, Francisco Javier
Del Alamo Camuñas, Marta
Del Molnar-Darkos Muro, Cristina Ana
Delgado Cañaveras, Mª del Pilar
Díaz Muñoz, Laura
Díaz Portuondo, Emiliano
Diaz Triviño, Sara
Dominguez Hernández, Francisco
Duque Muñoz, Javier
Durán Molina, Mª.Angeles
Ecay Crespo, Mª. Jesús
Elías García, Mónica
Engel, Tobias
Epifano García, Carolina
Escudero Cuadrado, Luis María
Fernández Miragal, Olga
Ferrer López, Isaac
Fornes Chaves, Amparo
Foronda Alvaro, David
Gandi, Giuditta
García Arriaza, Juan Francisco
García Briones, Mercedes
García de Yébenes Mena, Virginia
García Díaz, Miguel
García Escudero, Vega
García Lievana, Job
García Marcos, Alberto
Giménez Sáinz, Carmen
Gómez Martín, Silvia
Gómez Molina, Carmen Patricia
Gómez Ramos, Alberto
Gómez Sintes, Raquel
Gómez Vicente , Violeta
González Alonso, Beatriz
González García, Inmaculada
González Granja, Aitor
González Ruiz, Domingo
González Santamaría, Patricia
González Toril, Elena
Grajal Cuervo, Henar
Grau Simón, Raquel
Grueso Hierro, Mª. Esther
Gurzov Amarelo, Esteban
Gutiérrez Berzal, Javier
Hernández Tiedra, Sonia
Herrera Quintana, Mónica
Hidalgo Estévez, Alicia María
Hurtado Marcos, Carolina
Iborra Martín, Salvador
Imbaud, Juan Ignacio
Isidoro Pacheco, Antonio
Izcue Castellvi, Ana Maria
Jiménez Mateos, Eva Mª.
Juanas Melero, David
Juarez Santos, Raquel
Köchling, Thorsten
Larreta López, Ruth
Latorre Muñoz, Eduardo
Leo Macías, Alejandra
Letizia, Annalisa
Longas Torne, Elisa
Lopez Ferrer, Daniel
Madam Renes, Vanesa
Maganto García, Elena
Manjón Castro, Cristina
Marcilla Goldaracena, Miguel
Marín Alberdi, Dolores
Martín Aparicio, Esther
Marín Palma, Enrique
Martín Castro, Francisco
Martín Cofreces, Noa
Martínez Díez, Marta
Martínez Fernández-Yáñez, Laura
Martínez García, Ana
Martínez García, Angeles
Matamoros Grande, Tania
Mateo Fernández, Roberto
Mena, Marcela
Minguet García, Susana
Molina Arranz, Susana
Molina Polo, Nicolás Segundo
Monjas Serrano, Alicia
Montserrat Pérez, Verónica
Morales García, Mª. Dolores
Moreno Albiger, Renata
Moustafa, Malki
Muñoz Espín, Daniel
Muñoz Risueño, Ruth
Navarro Galve, Beatriz
Navarro Lobato, Mª. de las Nieves
Navas Fernández, Luis Fernando de
Navascués Melero, Joaquín de
Ortega López, Paula
Ortega Pérez, Inmaculada
Pacheco García, Almudena
Pacheco Santos, María
Palacios Airado, Lucía
Pariente Peñamaría , Nonia
Parody de la Fuente, Nuria
Pastor Pareja, José Carlos
Pastrana Izquierdo, Erika
Peregrín Pedrique, Sandra
Pérez Fernández, Coralia
Pérez Fernández, Jorge
Pérez Ferreiro, Carmen Mª
Pérez García, Laura
Pérez Garijo, Ainhoa
Pérez Lorenzo, Mª Jesús
Pey Rodríguez, Angel Luis
Picher Serantes, Angel Joaquín
Pomar Ballestero, Natalia
Poyatos Belio, Irene
Pozueta Larios, Julio
Prado Delgado, Amaya
Pulgar Montoro, Manuel
Quesada Navidad, Antonio Jesús
Qui, Deyi
Ramírez Moreno, Carlos
Ramos Álvarez-Buylla, Manuel
Ramos Martín, Mª del Carmen
Rey Martín, Marta
Riolobos Santamaría, Laura
Rivera Gorrín, Henry
Rivero Guedez, Damaríz
Rodenstein, Lara María
Rodríguez Benito, María José
Rodríguez Carrasco, Yolanda
Rodríguez García, Irene
Rodríguez González, Irene
Rodríguez González, Nuria
Rodríguez Torres, Angelina
Romero Prado, Marina
Rubio Muñoz, Daniel
Ruiz Pérez, José
Salcedo de Haro, Marta
Salero Coca, Enrique
San Antonio Felipe, Belén
Sánchez Díaz, Raquel
Sánchez Martínez, Blanca
Sánchez Santos, Miguel Angel
Sánchez-Valdepeñas , Carmen Mª
Santa María Pérez, Ismael
Santamaría Núñez, Gema
Sarnago Cebada, Susana
Serna Rico, Alejandro
Serrano, Miguel Angel
Serrano Carballal, Elena
Serrano de las Heras, Gema
Serrano Saiz, Esther
Sesma Aguirre, Laura
Sierra Aragón, Saleta
Sierra Istúniz, Javier
Simón Sanz, Diana
Tenorio Vela, Raquel
Terrados Aguado, Gloria María
Valle Benitez, Noelia
Vázquez Alvarez, Blanca
Vega Mendoza, Daniel Edgar
Velasco Ortiz, Lara
Vergara Jaúregui, Silvia
Vicente Cenzano, Mª. Carmen
Vila del Sol, Virginia
Villa Cuesta, María Eugenia
Villajos Barja, Jesús
Zafra Amorós, Olga
Zaldivar Notario, Irene
Cuadros Catalán, Raquel
Dávila Cerrato, Mª Mercedes
de Chorro y de Villa-Ceballos, Mª de los
Angeles
De la Calle Mustianes, Elisa
Estella Sagrado, Carlos
Fernández Algar, María
Fernández Moyano, Mª Carmen
Fuertes Villadangos, Miguel A.
Fuertes Yebra, Esther
García García, Carlos
García García, Esther
García Mira, José Luis
Garriga Fuentes, César
Garuti Rodríguez, Helena Mª.
Gómez Buendía, Teresa
Gómez Mariano, Gema
Gómez Medina, Sergio
González Herrera, Rosa María
González Páramo, Cristina
Granda Vega, Carmen
Gutierrez Aranda, Julia
Gutierrez Luque, Ruth
Hermoso Crispín, Carmen
Hernández Baeza, María del Rosario
Hernández Carrasquilla, Miguel
Hernando Bellido, Almudena
Ibáñez Pérez, Carmen
Jiménez Gallego, Ana
Langa Gabriel, Elena
Lázaro Bolos, José Mª
Lazcano Duque, Juan José
Llorens Berzosa, Sergio
López Varea, Ana
Martín Bermejo, Mª. Jesús
Martín Fernández, Mª Paloma
Martín Redondo, Mª Asunción
Martínez Villarraso, Angeles
Mora-Gil Cobo, Mª Victoria
Muñoz Fernández, Consuelo
Muñoz Sánchez, Angel Luis
Navarrete López, Rosa María
Nogal Paris, María Luisa
Núñez Balbuena, Enrique
Ortega Pérez, Inmaculada
Pablos Pérez, Beatriz de
Parrón Muñoz, Ángela
Peñate Santajuana, Silvia
Punzón Gálvez, Carmen
Reguerra Vidaechea, Juan Javier
Reina Alba, Isabel
Rodríguez Enríquez, Isabel
Saiz Delgado, Eva María
Sánchez de la Chica, Ascensión
Sánchez Marujo, Vanessa
Sánchez Moreno, Antonio
Sanz Fernández, Miguel Angel
Sanz Rebollo, Paloma
Sastre Merlín, Isabel
Sesé Cobos, Bárbara
Sobrado de Vicente Tutor, Antonio
Soto-Largo Dimitrigeff, Santiago
Torre Tante, Mª. del Mar, de la
Torroja Fungairiño, Carlos
Villar García, Laurentino
Zamarreño Fernández, Noelia
C
Personal de apoyo en
líneas de Investigación
/ Technical
Assistance
Alcalde García, José
Alonso Barba, Carmen
Álvarez Pérez, Iñaqui
Arenas Martínez, Santiago
Barat Cascante, Ana
Barrero Hervás, Lorena
Blanca Benito, Vanesa
Bustos Sánchez, Mª José
Cabornero Catalá, Ana Isabel
Caminero Jiménez, Eva Mª.
Campos Trujillo, Ramón
Cano Cabezas, Emilio
Cantarero Mateo, Angélica
Casado García, Mª. del Mar
Cava Valenciano, Felipe
Cazorla Plaza, María
Cerrato Gómez, Antonia
Chamorro Bello, Margarita
Cisneros González, Nerea
D
Departamento Técnico
/ Technical Department
GERENTE / ADMINISTRATIVE
DIRECTOR:
Fortes Alba, Salvador
ADMINISTRACIÓN /
ADMINISTRATION
Jefe/Head:
García Martín-Delgado, Jaime
Belda San Mateo, Eloy
Berciano Ledesma, Juan
Del Castillo Tamayo, Milagros
Escribano Sánchez, Gloria
García Arias, Ramón
Gutiérrez García, Natividad
Pallarés Vargas, Regina
Plaza Diago, Loreto
Rueda Cubero, Esteban
Villar Pérez, Belén
ANIMALARIO / ANIMAL FACILITY
Jefe/Head:
Palacín Urquijo, Javier
Bordallo Martín-Fontecha, Miguel A.
Cobeña Chivato, Miguel A.
Díaz Riffo, Felipe Andrés
García Martínez, Verónica
Garuti Rodríguez, Helena Mª
González Mella, Marta
Méndez Río, Isabel
Muñoz Fuentes, Jaime Alberto
Pinel Ballesteros, Gema
Quintana Fernández, Juan Antonio
Revuelta Mayo, Patricia
Rodríguez Fernández, Elena
Rosco Pulido, Pilar
Salgado Muñoz, Hugo
Vera Meneses, Mª. Eugenia
BIBLIOTECA / LIBRARY
Jefe/Head:
Gutiérrez García, Rosario
Sanz Frías, Angeles
COMPRAS Y ALMACÉN / PURCHASE
DEPARTMENT
Jefe/Head:
Blanco Martín, José Luis
Celestén Martín, Jose Miguel
Corral Díaz, Margarita
Fernández Martín, Mª Jose
Hernández Sánchez, Lorenzo
Madrid del Alamo, Remedios
Pedraza Caro, Teodoro
Pedraza Fernández, Teodoro
CULTIVOS CELULARES / CELL
CULTURE
Alonso Hernández, Pilar
Bustos Sánchez, Juana
Gutiérrez García, Alfonso
Rebelles Vicente, Juan Antonio
10
DISEÑO / DESIGN
Aganzo Mateo, Pedro
Belio López, José Ignacio
Díaz Dorado, Carmen
Galán González, José Mª
FERMENTACIÓN / FERMENTATION
INFORMÁTICA / COMPUTING
Jefe/Head:
Pemau Alonso, Pedro
E
Programa CSIC-INEM Tercera Escuela Taller
“Severo Ochoa” de
2001
Técnicos de
Antón González, Rocio
Ayuela Butragueño, Belén
Laboratorio /
Cillan Capilla, José Luis
Third Workshop
Dávila de León , David
Hevia Hernández, Elena
“Severo Ochoa” for
León Fernández, Gabriela
López de la Fuente, Clemente Ramón
Laboratory
Martos Pérez, Carmen
Technicians
Muñoz Villalba, Pilar
Bodas Gómez, Oscar
Díaz Rodilla, Diego
Díaz Rodríguez, Fidel
Pérez García, María Peña
Santos Martín, Tomas
Ureña Rodríguez, Dionisio
FOTOGRAFÍA / PHOTOGRAPHY
Jefe/Head:
Bautista Torres, Mariano
QUÍMICA DE PROTEÍNAS Y
PROTEOMICA / PROTEIN
CHEMISTRY
Jefe/Head:
Vázquez Cobos, Jesús
Pérez Gracia, José Antonio
INSTRUMENTACIÓN /
INSTRUMENTS AND EQUIPMENT
Jefe/Head:
Seguido de la Fuente, Lorenzo
Calvo Romero, Manuel
González Galán, Jesús
González García, Julio
Gutiérrez de la Cruz, Francisco
Mejías Pozuelo, José Luis
Muñoz Maqueda, Fernando
Palomo Fernández, Marcos
Pozuelo Torrijos, Jesús
Zazo Chapinal, Antonio
LAVADO Y ESTERILIZACIÓN /
WASHING AND STERILIZATION
Blanco Ferreras, Angeles
Blanco Ferreras, Valentina
Carrascal Blanco, Isabel
Cobeña Chivato, Concepción
Escribano Molina, Josefina
Gil Pinto, Africa
Martín Bermejo, María Nieves
Sánchez Ramos, Montserrat
Barahona Nieto, Fernando
González-Nicolás Garrido, Josefa
Jorge García, Alberto
Marina Ramírez, Ana Isabel
Ogueta Villarreal, Samuel
Rogado Manzanares, Rosana
SECUENCIACIÓN DE DNA / DNA
SEQUENCING
Jefe/Head:
Modolell Mainou, Juan / Escarmís
Homs, Cristina
Cordón Polanco, Pedro Pablo
Fernández Arias, Alfonso
García Alarcón, Juan Luis
González Díaz, Miguel
Martín Izquierdo, Tomás
Martos Valladares, César
Montero Minguez, Emilio
Romero Celada, Juan Miguel
Zúñiga Parra, Ceferino
SEGURIDAD BIOLÓGICA /
BIOLOGICAL SAFETY
Jefe/Head:
Sánchez Sánchez, Angeles
Guerra Rodríguez, Milagros
Ocaña Romero, Francisca
MICROSCOPIA ÓPTICA Y
CONFOCAL / OPTICAL AND
CONFOCAL MICROSCOPY
Jefe/Head:
Díez Guerra, Javier
2002
Cañete Parras, Antonia Mª
Contreras López, Nieves
Garrido, Gema Emilia
Guindal Calleja, Susana
Hernández Sierra, Rosana
Méndez Río, Isabel
Pérez Poza, Ludivina
Rodera Pérez, Nelly
Rodríguez Navas, Mª del Carmen
Ruiz Orejón, Mª. Belén
Tuero Gil-Delgado, Myriam
Valeri Lozano, Paola
Valladares Bartolomé, Mª.Cruz
Vallejo Zabulegui, Jorge
SECRETARIAS / SECRETARIAL
Dirección / Management Board
Morales Pájaro, Adelaida
Gerencia / Administrative Director
Condes Cano, Antonia
Llaguno Pérez, Reyes
General / Pool
Horrillo Muñoz, Lucía
Navarro Martínez, Carmen
Ayuso Moreno, Mª. Luisa
Carrasco Ramiro, Fernando
Madueño Amor, Encarna
MICROSCOPIA ELECTRÓNICA /
ELECTRON MICROSCOPY
Jefe/Head:
Rejas Marco, Mª Teresa
Ruiz Bouley, Rosa Mª.
Ruiz Ibáñez, Jorge Antonio
Sierra Filardi, Elena
Urendez Morillas, Francisco
RECEPCIÓN / RECEPTION
Cabrerizo Las Heras, Luis
Gil Marinas, Mª Jesús
Ramiro Sánchez, Juan
MANTENIMIENTO / MAINTENANCE
Jefe/Head:
Muñoz Diez, José Antonio
F
Arribas Arcones, Marisol
Caparrós de la Jara, Gema
Del Valle Sanz, Aurora
Martínez García, Victor M.
Ortega Molina, Isabel
VIGILANCIA / SECURITY
Barajas Marín, Manuel
Delgado Rodríguez, Juan Antonio
García García, Francisco
Hidalgo Checa, Francisco
Mirasol Burgos, Francisco Borja
Parra García, Joaquín
Tirado Morón, Antonio
Muñoz Alcalá, Mª Angeles
Sánchez Martín, Carlos
Villalba Villacorta, Teresa
11
Profesores/Teachers
Gutiérrez Erlandsson, Sylvia
Ramos Ruiz, Ricardo
Valle Sanz, Mercedes del
Secretaria/Secretary
Herrador Morales, Mercedes
Alumnos/Students
Alcaín Sánchez, Juan
Alcaraz Iglesias, Gema
Martínez Villacorta, Angel Manuel
Castro Nieto, Jorge
Cuesta Mejías, José Manuel
Gosalbez López, Altea
Gutiérrez Aldea, Modesta
Martín-Francés Trigos, Enrique
Palmeiro Cuesta, Gema
Peralta Cañadas Nuria
Pérez Carrero, Oscar
Pérez Pulido, Miguel
Postigo Haro, Fernando
Prieto López, Rubén
Ramajo Alonso, Jorge
Ruíz García, Desiré
Clones de células doble mutantes para patched 14 y dispatched en el
disco imaginal de ala teñidos con GFP y con anticuerpos contra las
proteinas Patched (azul) y beta-Gal (rojo). Las células mutantes para
patched se marcan por la falta de color rojo. Las células mutantes para
dispatched por la falta de color verde. Las células doble mutantes tienen
una falta completa de color. Las distintas intensidades de verde y rojo
corresponden a células silvestres y heterocigóticas para cada una de las
mutaciones.
12
A
Antonio
García-Bellido
Isabel Guerrero
Fernando Jiménez
Díaz-Benjumea
A.1 Análisis genético de mecanismos
A.1 Genetic analysis of morphogenetic
A.2 Mecanismos de señalización en el desarrollo
A.2 Signalling mechanisms in development
A.3 Comunicación intercelular en el desarrollo
del Drosophila
A.3 Cell-cell signalling in Drosophila
development
Juan Modolell
A.4 Biología molecular del desarrollo
A.4 Molecular biology of development
Ginés Morata
A.5. Control genético de la morfogénesis
A.5 Genetic control of morphogenesis
A.1
Análisis genético de mecanismos
Resumen de Investigación
Jefe de Línea / Group Leader:
Antonio García-Bellido
Control del tamaño del ala. Alelos letales
e-mail: [email protected]
en cinco loci producen autónomamente, en
mosaicos genéticos, células más pequeñas
y menos células por territorio (l(3)Me10),
células más grandes y menos células (gig
y cdc2) asi como células más pequeñas y
El gen vestigial. Clones de sobreexpresión
de vg causan transformaciones hacia tejido
ala y expresión génica típica de ala si
ocurren en territorios que ya expresan Wg.
Los efectos morfogenéticos complejos
(responsable de laboratorio)
más células (EP(3)622 y ft). Otros fenotipos
reflejan que vg está implicado, en
combinación con otros genes, en el
crecimiento distalizante del primordio de la
región de ala propia.
José Félix de Celis
asociados revelan fallos en comunicación
celular y de ahí en la generación local de
valores posicionales.
Regulación del gen spalt en el ala. Hemos
identificado la región reguladora de spalt y
Postdoctoral Fellows:
Control de la forma del ala. Un análisis
caracterizado los sitios de unión de
diferentes factores de transcripción.
Cassandra Extavour
de clones gemelos permite definir donde
Alvaro Glavic
estaban las células madre del clon. La
proliferación de las células del ala es
intercalar y las células postmitóticas se
Scientific Staff:
Juan Fenández Santarén
Enrique Martín-Blanco
Rosa Barrio Olano
Postdoctorales /
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Jaime Resino de Castro
Luis Alberto Baena López
alocan preferentemente en el eje próximodistal o anterior-posterior dependiendo de
la región del disco.
Proteoma. Se están caracterizando los
Eversión del disco. Lo que va a ser el
péptidos de geles bidimensionales del disco
imaginal de ala como referencia para
José Carlos Pastor Pareja
Cristina Molnar-Darkos
Mª Dolores Morales García
Cristina Cruz Rubio
borde de contacto entre discos
contralaterales e ipsolaterales está
Jana Alonso Lorenzo
predefinido por células que expresan puc
Técnicos de Investigación /
(de la ruta de la Jun K) en los discos
imaginales. Esta ruta está relacionada con
David Juanas Melero
Technical Assistance:
Almudena Hernando Bellido
la relajación del citoesqueleto y la
separación de células. La eversión tiene
Mª Paloma Martín Fernández
lugar por la apertura de agujeros alrededor
Ana López Varea
del tallo que luego coaslecen y desplazan
a las células epidérmicas larvarias.
Rosario Hernández Baeza
Carmen Alonso Barba
Mutagénesis de exceso de función.
Hemos mapeado 500 inserciones PUAS
cuya sobreexpresión afecta la diferenciación
de las venas.
Mar Casado García
Clones gemelos (rojo y amarillo) en las regiones dorsal (A) y ventral (B)
de ala ilustrando que su forma y tamaño depende de cada territorio del
disco.
14
detectar cambios mutacionales.
Genetic analysis of morphogenetic
Research summary
Publicaciones/Publications:
The gene vestigial. Clones of cells over
expressing vg lead to ectopic
Size control. Lethal alleles in 5 loci
transformations to wing blade in territories
autonomously cause, in genetic mosaics
in the wing, smaller cells and clones
that already express wg. The
morphogenetic effects are complex,
(l(3)Me10), larger cells but small clones
(gig y cdc2) and smaller cells but larger
territories (EP(3)622 y ft). Other
other genes in the distalization of the
wing.
associated phenotypes reveal failures in
cell communication what suggests that
growth is determined by the local
generation of positional values.
Shape control. Twin-clon analysis
indicates the position of mother cells and
subsequent daughter cell allocation. Cell
proliferation in the wing is intercalary and
daughter cells allocate preferentially either
the proximo-distal or antero-posterior axis
depending on the region of the wing.
Disc eversion. The prospective border
of contact between discs is predefined
by the expression of puc (Jun K pathway)
a pathway related to the relaxation of the
cytoskeleton and loosening of cells. The
actual eversion takes place by
indicating that vg acts in combination with
Regulation of spalt expression in the
wing disc. We have identified the DNAregulatory region driving spalt expression
in the wing disc, and characterised the
binding sites of several transcription
factors.
Gain of function screening. We have
mapped 500 insertions of a PUAS
element affecting vein differentiation and
wing growth.
Proteome. We continue the catalogation
and characterization of wing proteins in
two-dimensional gels for comparisons
between wildtype and mutants.
coalescence of holes in the stalk of the
Extavour, C., García-Bellido, A. (2001) Germ cell selection
in genetic mosaics in Drosophila melanogaster. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 98, 11341-11346
Mollerau B., Dominguez, M., Webel, R., Colley, N.J.,
Keung, B., de Celis, J.F., Desplan, C. (2001) Two-step
process of photoreceptor formation in the Drosophila
eye. Nature 412, 911-913
Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Techanu, G.,
Kafatos, F. C., Barrio, R. (2001) Spalt restricts EGFR
mediated induction of chordotonal precursors in the
embryonic PNS of Drosophila. Development 128, 711722
López, P.P., Santarén, J.F., Ruiz, M.F., Esponda, P.,
Sanchez, L. (2001) The Drosophila melanogaster Xlinked mfs(1)6E locus is required for production of normal
seminal fulid by the male accessory glands. Exp. Cell
Res. 267, 1-12
Rodríguez, J.M., Salas, M.L., Santarén, J.F. (2001)
African swine fever virus-induced polypeptides in porcine
macrophages and in Vero cells: A high resolution two
dimensional analysis. Proteomics 1, 1447-1456
Resino, J., Salama-Cohen, P., García-Bellido, A. (2002)
Determining the role of patterned cell proliferation in the
shape and size of the Drosophila wing. PNAS 99, 75027507
Rusten, T.E., Cantera, R., Kafatos, F.C., Barrio, R. (2002)
The role of TGF- signaling in the formation of the dorsal
nervous system is conserved between Drosophila and
chordates. Development 129, 3575-3584
Cantera, R. Lüer, K., Rusten, T.E., Barrio, S., Kafatos,
F.C., Technau, G.M. (2002) spalt mutations cause a
severe but reversible neurodegenerative phenotype in
the embryonic central nervous system of Drosophila
melanogaster. Development 129, 5577-5586
disc and subsequent elimination of larval
epidermal cells.
Premios / Awards
- Doctor Honoris Causa por la Universidad Miguel
Hernández de Alicante, 2001.
- Miembro Electo del Neuroscience Institute. USA, 2001.
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Jaime Resino de Castro. 2002. “Tamaño y Proliferación
en el Disco Imaginal de Drosophila melanogaster”.
Universidad Autónoma de Madrid.
Twins clones (red-yellow pairs) in the dorsal (A) and ventral (B) wing imaginal disc. The size
and shape of the clones characteristically varies with the different regions.
15
A.2
Mecanismos de señalización en el desarrollo
Isabel Guerrero
Personal Científico / Scientific Staff:
Nicole Gorfinkiel
Isabel Rodríguez
Postdoctorales / Postdoctoral
Fellows:
Ainhoa Callejo
Graciela Carrillo
Verónica Martín
Graduate Students:
Carlos Torroja
Javier Sierra
Elvira Benitez
Estudiantes /
Undergraduate Students:
Ruth Muñoz
Mario Torrado
Usue Martínez
Técnico de Investigación / Technical
Assistance:
Carmen Ibañez
El desarrollo de las estructuras adultas de
de Hh por Ptc no se requiere para la
señalización de Hh siendo necesaria esta
endocitosis de Hh solo para controlar su
Drosophila melanogaster se ha utilizado
como sistema modelo para el estudio de la
inducción de patrones morfogenéticos. En
degradación. Por otra parte, existen varias
líneas de evidencia que indican una relación
del colesterol y los lípidos con la vía de Hh.
cada estructura adulta de la mosca, la
proteína Hedgehog (Hh) induce la activación
Se ha demostrado que el colesterol se
requiere para la respuesta a la vía de Hh.
De acuerdo con este requerimiento, en Ptc
se ha identificado unas secuencias (dominio
de nuevas señales morfogenéticas desde
el centro organizador anterior / posterior,
tales como los factores de secreción
Wingless (WG) y Decapentablegic (DPP),
sensible a esterol (SSD)), que presentan
homología con las proteínas que controlan
pertenecientes a las familias proteicas Wnt
and TGF-` respectivamente. Esta cascada
de inducción de señales es clave para el
desarrollo de todos los apéndices de la
mosca. Uno de los problemas mas
la homeostasis de colesterol. Nosotros
hemos encontrado que mutaciones en el
fascinantes actualmente en biología es
la proteína mutante de Ptc.
entender como este tipo de señales
morfogenéticas se secretan y difunden, y
como las células las reciben e interpretan.
Paralelamente, estamos estudiando la
En los últimos años nos hemos centrado
en el estudio de los mecanismos de
señalización de Hh debido a su importancia
en enfermedades humanas
(holoprosencefalia, polidactilia, carcinomas
de células básales, meduloblastomas, etc.).
dominio SSD de Ptc abren constitutivamente
la vía de Hh y sin embargo, no impiden el
reconocimiento e internalización de Hh por
morfogénesis de la genitalia en Drosophila.
El disco genital, del cual deriva la terminalia,
es desde el punto de vista morfogenético
muy interesante ya que para su desarrollo
es necesaria la interacción entre los genes
de formación de patrón y los genes de
determinación sexual. Hasta ahora, hemos
establecido los parámetros que intervienen
Estudiando el receptor de Hh, Patched
(Ptc), hemos identificado dos dominios
funcionales en su proteína ya que ciertas
en la organización del disco genital y como
mutaciones afectan solo a la difusión de
Hh y otras solo a la interacción con
diferencialmente en el macho y en la
hembra por los genes de determinación
segundos mensajeros.
sexual.
Hemos demostrado que la internalización
Clones de células doble mutantes para patched 14 y dispatched en el disco imaginal de ala teñidos
con GFP y con anticuerpos contra las proteinas Patched (azul) y beta-Gal (rojo). Las células
mutantes para patched se marcan por la falta de color rojo. Las células mutantes para dispatched
por la falta de color verde. Las células doble mutantes tienen una falta completa de color. Las
distintas intensidades de verde y rojo corresponden a células silvestres y heterocigóticas para
cada una de las mutaciones.
16
las respuestas a las vías de señalización
de Hh, Wg y Dpp están controladas
Signalling mechanisms in development
Research summary
The development of the adult structures
of Drosophila melanogaster has been
used as a model system to study the
induction of the morphogenetic processes.
In each fly structure, extra-cellular
signaling molecules from specialized
the internalization of Hh by Ptc is not
Mullor, J.L., Guerrero, I. (2000) A gain-of-function mutant
required for Hh signaling. However, this
Hh internalization is required for Hh
degradation to control the Hh
morphogenetic gradient. Besides, there
are several evidences that indicate a
of patched dissects different responses to the Hedgehog
relationship of cholesterol and lipids with
groups of cells, termed organizers, supply
the information for these morphogenetic
processes. Thus, Hedgehog protein (Hh)
induces from the anterior/ posterior
the Hh pathway. It has been demonstrated
that cholesterol is required for Hh
response in the receiving cells. In this
context, a sterol sensing domain (SSD)
has been identified in Ptc. Other proteins
organizer the activation of new
morphogenetic signals, such as Wingless
(Wg) and Decapentaplegic (Dpp) that
with this SSD domain are involved in the
control of cholesterol homeostasis. We
have found that mutations in the SSD
belong to the super-families Wnt and
TGF-` respectively. This signaling
cascade is fundamental for the
domain constitutively open the Hh
gradient. Dev. Biol. 228, 211-224
Sánchez, L., Gorfinkiel, N., Guerrero, I. (2001) Sex
determination genes control the development of the
Drosophila genital disc modulating the response to
Hedgehog, Wingless and Decapentaplegic signals.
Development 128, 1033-1043
Martín, V., Carrillo, G., Torroja, C., Guerrero, I. (2001)
The sterol-sensing domain of Patched protein seems to
control Smoothened activity through Patched vesicular
trafficking. Curr. Biol. 11, 1-7
pathway but do not avoid the
internalization of Hh by Ptc.
Sánchez, L., Guerrero, I. (2001) The development of
development of all the fly appendages.
One of the most fascinating problems in
Simultaneously, we are studying the
Gorfinkiel, N., Sánchez, L., Guerrero, I. (2003)
biology is to understand how these
development of the genitalia in Drosophila.
Development of the Drosophila genital disc requires
morphogenetic signals are secreted and
interactions between its segmental primordia.
diffuse and how the receiving cells
The development of the genital disc, which
gives rise to the genitalia and analia of
interpret them.
the adult fly, requires the activity of both
Due to the importance of Hh signaling
patterning and sex determination genes.
We have first established the segmental
pathway in human diseases
organization of the genital disc as well as
(holoprosencephaly, polidactily, basalcell-carcinomas, medullablastomas, etc)
the expression and requirement of several
we are studying the mechanism of Hh
signaling. For the last few years, we have
patterning genes for the development of
the genitalia. Next, we have found that
the sex determination genes control the
analyzed the function of Patched (Ptc),
development of the genital discs
the Hh receptor molecular and genetically.
We have identified two Ptc functional
modulating the responses to Hh, Wg, and
Dpp signals. This modulation of the
domains because some ptc mutations
affect only the Hh diffusion and others
signaling pathways by the sex genes is
the key mechanism in the development
only the interaction of Ptc with second
messengers. We have demonstrated that
of either male or female structures.
17
the Drosophila genital disc. Bioessays 23, 698-707
Development 130, 295-305
Patente / Patent
Application Number PCT/GB01/04891
Method for detecting inhibitors of tumor growth.
A.3
Comunicación intercelular en el desarrollo
del Drosophila
Fernando Jiménez Díaz-Benjumea
El ala de Drosophila se desarrolla por la
La especificación de la articulación
del ala
El suceso más temprano en la organización
del eje PD del disco de ala es la
acción combinada de dos diferentes
organizadores: el anterior-posterior (AP) y
Estudiantes /
el dorsal-ventral (DV). Estos dos
organizadores se sitúan en el disco en los
bordes de expresión de los genes selectores
engrailed y apterous, los cuales determinan
determinación del destino ala por el gen
vestigial (vg) en el desarrollo larvario
temprano. Más tarde en el desarrollo,
interacciones celulares en el borde del
dominio de expresión de vg activan la
los compartimentos posterior y dorsal del
expresión de una serie de genes que
ala respectivamente. Interacciones celulares
median la activación de los genes
decapentaplegic (dpp) y wingless (wg) en
los organizadores AP y DV respectivamente.
promueven el desarrollo de la articulación
del ala. Nuestro objetivo es identificar los
genes involucrados en el desarrollo de la
articulación y los componentes de esta ruta
de señalización intercelular.
David del Álamo Rodríguez
Javier Terriente Félix
dpp y wg codifican moléculas difusibles que
promueven el desarrollo del ala mediante
la activación de diferentes genes diana.
El eje próximo-distal (PD) del disco no se
desarrolla por la acción de un tercer
organizador, sino que es la acción
combinada de Dpp y Wg la que activa la
expresión de una serie de genes que se
considera que definen el eje PD.
Nuestro trabajo está dirigido al análisis de
diferentes aspectos del desarrollo del ala
en el eje PD.
Patrones de expresión de wingless (rojo) y engrailed (verde) en un disco
de ala silvestre (izquierda) y mutante para omb (derecha). En mutantes
omb, wingless se expresa ectópicamente en las células anteriores del borde
de compartimento AP del ala.
18
La función del gen optomotor-blind
(omb) en el desarrollo del ala
El gen omb codifica una proteína nuclear
con un dominio T-box. Su expresión en el
disco de ala es activada por la acción
combinada de las rutas de Dpp y Wg. El
fenotipo mutante sugiere que omb tiene un
papel primordial en el desarrollo del ala,
aunque su función real no se conoce.
Nuestro objetivo es estudiar la función de
omb y de otros genes involucrados en el
desarrollo del eje PD del ala.
Cell-cell signalling in Drosophila development
Research Summary
The Drosophila wing is patterned by the
combined action of two different
organizers: the anterior-posterior (AP)
and the dorsal-ventral (DV). These two
organizers are placed in the disc at the
borders of expression of the selector
genes engrailed and apterous, which
specify the P and the D compartments of
the wing respectively. Cell interactions
mediate the activation of the genes
decapentaplegic (dpp) and wingless (wg)
at the AP and DV organizers respectively.
The specification of the wing hinge
The earliest event in PD patterning in the
wing disc is the specification of the wing
fate by the gene vestigial (vg) in early
larval development. Later in development
cell interactions at the border of the vgexpression domain drive the expression
of a set of genes that promotes the growth
of the wing hinge. Our goal is to identify
and to characterize both the genes
involved in the development of the wing
hinge and the components of this cellsignalling pathway.
dpp and wg encode diffusible molecules
The function of the gene optomotor-
that pattern the disc through the activation
of different target genes.
blind (omb) in wing development
The gene omb encodes a T-box protein.
omb expression in the wing disc is
The proximal-distal (PD) axis of the disc
otherwise the combined action of Dpp
activated by the combined action of Dpp
and Wg. The omb mutant phenotype
suggests that it plays an important role
and Wg is required to activated a set of
in wing development but its real function
genes that, it is considered, defines the
PD axis. Our work is focused in different
aspects of PD wing patterning:
is not known. Our goal is to study the
function of omb and of other genes
involved in the development of the PD
axis of the wing.
is not patterned by a third organizer,
Wingless (red) and engrailed (green) patterns of expression in wild-type (left) and omb mutant
(right) wing discs. In omb wingless is ectopically expressed in the anterior side of the AP compartment
boundary of the wing blade.
19
del Alamo Rodríguez, D., Terriente, J., Díaz-Benjumea,
F. J. (2002) Spitz-EGFr signalling via the Ras/MAPK
pathway mediates the induction of bract cells in
Drosophila legs. Development 129, 1975-19822
del Alamo Rodríguez, D., Terriente, J., Galindo, M. I.,
Couso, J. P., Díaz-Benjumea, F. J. (2002) Different
mechanisms initiate and maintain wingless expression
in the Drosophila wing hinge. Development 129, 39954004
A.4
Biología molecular del desarrollo
Resumen de investigación
Juan Modolell
Scientific Staff:
Sonsoles Campuzano
José-Luis Gómez-Skarmeta
Isabel Rodríguez
Mar Ruiz-Gómez
Postdoctorales /
Florencia Cavodeassi
Sol Sotillos
Graduate Students:
Marta Carrasco
Especificación territorial. Un proceso
importante durante el desarrollo es la
subdivisión de un epitelio en distintos
territorios. La subdivisión que separa el ala
(apéndice) del mesotórax (tronco) de
Drosophila depende de los genes iroquois
Annalisa Letizia
María Eugenia Villa
Eva Caminero
Elisa de la Calle
Paloma Martín
caracterizando varias de las secuencias
reguladoras (enhancers) responsables de
la expresión espacial y temporalmente
regulada de los genes Iro-C.
(Iro-C) puesto que su ausencia del
mesotórax dorsal transforma a éste en ala.
Miogénesis. Los músculos de Drosophila
son sincitios formados por fusión de
mioblastos. Previamente a la fusión, los
Hemos demostrado que la señalización del
mioblastos se subdivid en subtipos, siendo
morfógeno Decapentaplegic, que proviene
del territorio de ala, confina la expresión
del Iro-C al territorio del tronco, y define por
esta segregación fundamental para que
progrese la miogénesis. Esto se debe a la
tanto la subdivisión entre estos territorios.
Se está investigando en la actualidad la
función de genes adicionales (msh y
islet=tail-up) en estas especificaciones y/o
subdivisiones.
Joaquín de Navascués
Luis María Escudero
Control de la expresión de los genes Iro.
Hemos identificado y estamos
Inhibición lateral. La señalización entre
las células de un grupo proneural mediada
por el receptor Notch limita el número de
células que pueden devenir precursores
naturaleza asimétrica de la fusión, que
implica dos poblaciones de mioblastos:
fundadores y competentes en fusión.
Estamos utilizando una combinación de
técnicas genéticas, celulares y moleculares
para estudiar el control de la miogénesis,
centrándonos en el proceso de la
diversificación de los mioblastos. Para ello,
estamos caracterizando funcionalmente
genes específicos de las distintas
subpoblaciones.
nerviosos (inhibición lateral). En
colaboración con el grupo de Jui-Chou Hsu
en Taiwan, hemos demostrado la función
Función de los genes iro en vertebrados.
Hemos comprobado que los genes iro en
Xenopus (Xiro) participan en múltiples
de la proteína de membrana Echinoid de
potenciar la señalización de Notch.
procesos del desarrollo. Así, los genes Xiro
Función de DaPKC. Los complejos
se requieren para la formación del
organizador de Spemman y el
multiproteicos Par-3/Par-6/aPKC y
Crumbs/Discs lost/Stardust se requieren
para el establecimiento de la polaridad
apicobasal de las células epiteliales en
vertebrados e invertebrados. Hemos
demostrado que, en Drosophila, ambos
complejos interaccionan físicamente, que
aPKC fosforila in vitro a Crumbs y que esta
fosforilación se require para la actvidad in
vivo de Crumbs. En colaboración con el
grupo de J. Moscat.
La expresión forzada de chn provoca la activación del gen proneural scute
(rojo) y la aparición de numerosos órganos sensoriales extra (amarillo).
20
establecimiento del neuroectodermo. Estos
procesos tienen lugar a través de la
represión de Bmp4 por las proteínas Xiro.
Por otro lado, en estadios más tardios, los
genes Xiro se requieren para el
establecimiento y mantenimiento del
organizador secundario localizado entre el
cerebro medio y el cerebro posterior, y para
coordinar la salida del ciclo celular y la
diferenciación de las neuronas primarias.
Molecular biology of development
Research Summary
Control of Iro genes expression. We
have identified and are in the process of
Territorial specification. The subdivision
of an epithelium in distinct territories is an
important process during development.
characterizing several regulatory
sequences (enhancers) that govern the
spatially and temporally restricted
The subdivision that separates a
Drosophila appendage (wing) of the trunk
(mesothorax) depends on the iroquois
expression of the Iro-C genes.
(iro) genes, since their removal transforms
the dorsal mesothorax into wing hinge.
syncytial fibres formed by cell fusion. In
Drosophila the subdivision of the
We have shown that signaling by the
mesoderm into different populations is
essential for normal myogenesis and
muscle patterning. This is so because
Decapentaplegic morphogen, which
emanates from the wing territory, confines
iro expression to the trunk territory and
Myogenesis. Muscles in Drosophila are
thereby defines the subdivision between
these territories. The function of msh and
myoblast fusion is a polar process that
involves two kinds of myoblasts: founders
and fusion-competent myoblasts. We use
islet=tail-up in these specifications and
subdivisions is being examined.
a combined genetic, cellular and molecular
approach to study how myogenesis is
regulated and the role of myoblast
Lateral inhibition. Notch signaling
between cells of a proneural cluster limits
the number of its cells that can become
diversification in this control. To this
purpose, we are functionally characterizing
neural precursors (lateral inhibition). In
collaboration with Jui-Chou Hsu (Taiwan),
populations of myoblasts.
we have shown that the trans-membrane
Function of vertebrate iro genes. We
have found that Xenopus iro genes (Xiro)
protein Echinoid potentiates Notch
signaling.
Function of DaPKC. The multiprotein
complexes Par-3/Par-6/aPKC and
Crumbs/Discs lost/Stardust are requiered
genes specific of the different sub-
participate in multiple processes during
development. Thus, Xiro genes are
required to form the Spemman organizer
and the prospective neuroectoderm.
These processes take place through Xiro-
to stablish apicobasal polarity in epithelial
mediated Bmp4 downregulation. In
cells, both in vertebrates and in
invertebrates. We have shown that both
addition, at later stages, Xiro genes are
required for the formation and
maintenance of the midbrain-hindbrain
secondary organizer and for coordinating
cell cycle exit and differentiation of primary
complexes physically interact, that aPKC
phosphorylates Crumbs in vitro and that
this phosphorylation is required for the in
vivo activity of Crumbs. In collaboration
with J. Moscat group.
neurons.
Benos, P.V., Modolell, J., et al. (2001) From first base:
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Martin, B.S., Ruiz-Gomez, M., Landgraf, M., Bate, M.
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Claveria, C., Caminero, E., Martinez-A , C., Campuzano,
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finger transcription factor required to specify fusioncompetent myoblasts in Drosophila. Development 129,
133-141
Forced expression of chn promotes activation of the proneural gene scute
(red) and the emergence of many extra sensory organs (yellow).
Premios / Awards / Other Activities
Juan Modolell, Premio Rey Jaime I de Investigación,
2002
Workshop on Neural Prepatterning and Specification.
Fundación Juan March. Junio 2001
21
A.5
Control genético de la morfogénesis
Jefes de Linea / Group Leaders:
Ginés Morata
Ernesto Sánchez-Herrero*
e-mail: ,
En nuestro laboratorio co-existen dos grupos
de trabajo, dirigidos por G. Morata y por E.
Sánchez-Herrero respectivamente, que
desarrollan líneas de investigación
independientes dentro del área del control
genético del desarrollo de Drosophila..
Natalia Azpiazu
Manuel Calleja,
Fellows:
Hector Herranz
Eduardo Moreno
Magali Suzanne
Graduate Students:
Silvia Aldaz
Carlos Estella
Beatriz Estrada
David Foronda
Francisco Martín
Luis de Navas
Ainhoa Perez
Angelica Cantarero
Rosa González
* Jefe de Línea asociado / Associate
Group Leader
Durante el periodo 2001-2002 el grupo
dirigido por G. Morata ha desarrollado tres
líneas de trabajo principales: 1) Identificación
y estudio de las subdivisiones genéticas en
los discos imaginales, 2) Estudio de los
genes que delimitan el eje dorsoventral del
embrión, y 3) Análisis de los mecanismos
de control de tamaño en el ala.
Con respecto al primer apartado se están
estudiando dos genes que codifican para
factores de transcripción con homeodominio
y que muestran expresión restringida en el
tórax adulto. El gen muscle specific
homeobox (msh) funciona en la región
torácica lateral, mientras que eyegone (eyg)
está activo en la región mas anterior y
central del tórax. El estudio de ambos
genes se está realizando mediante la
inducción de mutaciones y experimentos
de expresión dirigida por el método
Gal4/UAS. Los resultados demuestran que
juegan un papel crítico en el proceso de
subdivisión genética del notum. En el caso
de eyg se ha demostrado que está activado
por los genes iroquois and pannier (pnr) y
que media la función torácica de estos.
El análisis de la especificación dorsoventral
(D/V) del embrión se ha centrado en la
función de pnr, buttonhead (btd) y LP1 tres
genes que se expresan en regiones
específicas a lo largo del eje D/V. Los
resultados con pnr indican que este gen
tiene una función selectora en el embrión
similar a la que ejerce en el adulto,
especificando el desarrollo de la región
mediodorsal y regulando la actividad de los
genes que especifican el desarrollo de
zonas dorsales adyacentes. La función de
btd en la región ventral está restringida a
la formación del Sistema Nervioso y de los
primordios de los discos imaginales
ventrales, de antena, pata y genital. En
ausencia de la función de btd y su gen
gemelo D-Sp1 no se forman las estructuras
ventrales del adulto. LP1 se expresa en la
amnioserosa, la región mas dorsal del
embrión y su papel parece estar relacionado
con la respuesta a la señal Dpp.
22
El estudio de los mecanismos de control
de tamaño es un tema reciente en el
laboratorio, pero relacionado con
experimentos realizados hace mas de 25
años, cuando se encontró que en los discos
imaginales las células de crecimiento lento
son eliminadas si co-existen con células
que se dividen mas rápidamente. Este
fenómeno se denominó “competición
celular” e implicaba la existencia de
mecanismos de comunicación entre células
que distinguen ritmos diferentes de
proliferación. Recientemente se ha
encontrado en el laboratorio que la
eliminación por competición celular se debe
a apoptosis originada por niveles diferentes
de función de la vía Dpp. En la actualidad
se está estudiando la relación funcional
entre la actividad de la vía Dpp, el
crecimiento del ala y la aparición de
apoptosis. Los resultados indican que la
función principal de Dpp es activar
crecimiento, pero esta función está
antagonizada por dos genes que a su vez
son regulados por la vía Dpp, daughters
against dpp (dad) y brinker (brk). El tamaño
del ala de Drosophila parece ser el resultado
del compromiso de estas dos funciones
antagónicas.
El grupo dirigido por E. Sánchez-Herrero
estudia los mecanismos por los que los
genes Hox confieren especificidad en el eje
antero-posterior de Drosophila
melanogaster. El gen Hox Abdominal-B es
necesario para formar la genitalia y, en su
ausencia ésta se transforma en una pata
o una antena. Estos dos apéndices
comparten con la genitalia una información
posicional común, que es modificada por
Abdominal-B para la formación de esta
estructura. Para ello, Abdominal-B reprime
genes característicos de la pata o la
antenna. Si bien éstos apéndices son
similares en varios aspectos de su
desarrollo, hemos caracterizado dos genes
adyacentes y con gran similitud de
secuencia que no se expresan en la pata
pero sí en la antena, además de en el ojo.
La expresión ectópica de cualquiera de
estos dos genes, que hemos llamado
Hernández y Fernández, produce antenas
u ojos ectópicos. El que se desarrolle una
u otra estructura depende, al menos en
parte, de la vía de señalización del gen
Notch. Nuestros resultados desarrollan
estudios previos sobre la relación de genes
Hox y vías de señalización, determinan
algunos de los mecanismos por los que se
especifican diferentes estructuras en la
mosca e identifican dos genes que median
la función de genes Hox para la formación
de distintos apéndices.
Genetic control of morphogenesis
Research Summary
In the laboratory there two research
groups, led by G. Morata and E. SanchezHerrero respectively, centered on the
genetic control of Drosophila
development.
During the 2001-2002 period the research
work by the Morata group has been
focussed in three major lines 1)
Identification and study of new genetic
subdivisions in the imaginal discs, 2)
Study of the genes that establish the
dorsal-ventral body axis in the embryo
and 3) Analysis of the mechanisms
controlling the size of the wing.
Regarding the first issue, there are two
genes encoding homeodomain
transcription factors and that are
expressed in restricted domains of the
thorax. The muscle specific homeobox
(msh) gene functions in the lateral region
whereas eyegone (eyg) is active in the
anterior central region. The function of
the two genes is being studied by inducing
mutations and by misexpression
experiments with the Gal4/UAS method.
The results so far indicate that the two
genes play critical roles in the subdivision
of the thorax. For eyg it has been shown
that it functions downstream the thoracic
genes iroquois and pannier (pnr) and
mediates their patterning function.
In the analysis of the embryonic dorsalventral (D/V) specification, the work
focused on three genes, pnr, buttonhead
(btd) and LP1, which are expressed in
distinct zones along the D/V axis. In the
case of pnr the evidence is that it has a
selector-like function similar to that
reported for the adult structures; it
specifies the development of the
mediodorsal region and interacts with
other genes like iro and spalt responsible
for the development of other dorsal
regions. In contrast, btd function is
restricted to the Nervous System and the
ventral discs primordia, antennal, leg and
genital. The loss of btd function and of
the related gene Dsp-1 the ventral adult
structures do not form. The LP1 gene is
expressed in the most dorsal zone of the
embryo, the amnioserosa, and its function
appears to be related with the diffusion
and response to the Dpp signal, which in
the embryonic development has a
dorsalising function.
The analysis of the size control
mechanisms is a new research topic in
the group but related to experiments
originated in the laboratory about 27 years
ago (Morata and Ripoll, Dev. Biol. 1975).
It was found that in the wing disc cells
that divide slowly are eliminated if they
co-exists in the same polyclone with faster
dividing cells. This phenomenon was
called “cell competition” and implied the
existence of a cell communication process
that discriminates cells with different
proliferation rates. Recent work in the
laboratory has shown that the elimination
of slow dividing cells is due to apoptosis
triggered by low levels of activity of the
Dpp signalling pathway. Experiments
under way try to establish a functional
connection between Dpp activity, growth
of the wing and apoptosis. Preliminary
results indicate that the Dpp pathway
promotes growth but this activity is
antagonised by those of two genes,
daughters against dpp (dad) and brinker
(brk), which in turn are regulated by Dpp.
The final size of the Drosophila wing
appears to be the result of these two
antagonistic forces.
The group headed by E. Sanchez-Herrero
is studying the mechanisms responsible
for the Hox genes specificity in the
determination of the anteroposterior axis
in Drosophila. The Hox gene AbdominalB (Abd-B) is required to determine the
genitalia and, in its absence, this is
transformed into leg or antenna. These
two appendages share with the genitalia
a common positional information that is
modified by Abd-B to form this structure.
This is achieved by Abd-B repressing
genes characteristic of legs or antennae.
These two appendages are similar in
many respects, however, we have
identified two adjacent genes with a similar
sequence that are expressed in the
antenna (and the eye) but not in the leg.
Ectopic expression of either of these two
genes, that we have called Hernández
and Fernández, makes ectopic eyes or
antenna. Whether one or another structure
is made depends in part on the activity
of the Notch gene. We have extended
previous results as to the relationship of
Hox genes and signalling pathways,
determined some of the mechanisms to
specify fly structures and characterised
two genes that mediate Hox information
to make different appendages.
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Ginés Morata. Miembro del Comité Científico del Centro
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Fundación Juan March, desde 2001.
Ginés Morata. Miembro del Comité Evaluador del
Instituto de Investigaciones Bioquímicas de la Fundación
Campomar. Buenos Aires (Argentina) Abril, 2001.
Ginés Morata. Premio Nacional Santiago Ramón y Cajal
de Investigación en Biología 2002.
Ginés Morata. Miembro del Scientific Advisory Committee
of the European Molecular Biology Laboratory (EMBO),
desde 2002.
23
Proliferación (A) y muerte (B) de una célula tumoral. A, Anafase:
mitocondrias, verde; cromátidas, azul; microtúbulos del huso
acromático, rojo. B, Apoptosis: DNA fragmentado (azul) y mitocondrias
hinchadas (verde).
Proliferation (A) and death (B) of a tumour cell. A, Anaphase:
mitochondria, green; chromatids, blue; microtubules of the mitotic
spindle, red. B, Apoptosis: fragmented DNA (blue) and swollen
mitochondria (green).
24
B
Biología Celular
Cell Biology
Isabel Correas
B.1 Citoesqueleto y nucleoesqueleto
B.1 Cytoskeleton and nucleoskeleton
José M. Cuezva
B.2 Mecanismos de regulación de la biogénesis
mitocondrial y alteración mitocondrial en
cáncer
B.2 Mechanisms that regulate the biogenesis of
mitochondria and mitochondrial alterations
in cancer
Marta Izquierdo
B.3 Terapia génica experimental
B.3 Experimental gene therapy
Francisco Moreno
B.4 Desarrollo neuronal y neurodegeneración
B.4 Neuronal development and
neurodegeneration
B.5 Señalización celular por PKC atípicas en
inmunidad y cáncer
Jorge Moscat
Ignacio V. Sandoval
Antonio
Talavera Díaz
Jesús Vázquez
B.5 Cell signaling through the atypical PKC
B.6 Tráfico regulado de proteínas de membrana
B.6 Regulated membrane protein trafficking
B.7 Terapia génica experimental
B.7 Experimental gene therapy
B.8 Química de proteínas y proteómica
B.8 Protein chemistry and proteomics
Biología Celular
Cell Biology
B.1
Citoesqueleto y nucleoesqueleto
Isabel Correas
Postdoctoral / Postdoctoral Fellow:
Carmen María Pérez-Ferreiro
Estudiantes / Undergraduate
Students:
Altea Gosálbez, Desiderio Ordoño,
Elimelec Sendino
La proteína 4.1 fue originalmente
identificada en el eritrocito humano como
un componente de 80 kDa cuya función es
el anclaje del citoesqueleto de actina a la
membrana plasmática. En células
nucleadas de mamífero la situación es más
Los objetivos principales que nuestro grupo
viene abordando en los últimos años son
la caracterización de las señales
responsables de la distribución subcelular
diferencial de las isoformas de 4.1R y el
estudio de las funciones que 4.1R
desempeña en las células de mamífero no
eritroides.
compleja puesto que hay una gran
diversidad de isoformas, originadas
Los resultados más destacables del bienio
mediante splicing alternativo del RNA
2001-2002 han sido, por un lado, la
identificación de nuevos dominios
precursor, distribuidas en múltiples
compartimentos subcelulares y cuya función
comienza a caracterizarse. En este sentido,
nuestro grupo ha demostrado que 4.1 es
un componente nuclear y que juega un
papel estructural formando parte del
nucleoesqueleto celular al que se anclan
componentes de la maquinaria de ‘splicing’.
Actualmente a la proteína 4.1 eritroide se
la designa 4.1R (red blood cells) para
diferenciarla de otras proteínas 4.1
recientemente descritas y codificadas por
tres genes diferentes: 4.1N (neuronal), 4.1B
(brain) y 4.1G (general). Hay que señalar
que la 4.1B es una proteína supresora de
tumores específicos.
involucrados en la localización núcleocitoplasmática de 4.1R y el establecimiento
del orden jerárquico en que éstos actúan.
Los datos obtenidos sugieren que las
isoformas de 4.1R se distribuyen entre el
núcleo y el citoplasma siguiendo, al menos,
cuatro mecanismos de transporte diferentes.
Además, hemos demostrado que 4.1R
participa en el mantenimiento de la
arquitectura de los microtúbulos interfásicos
mediante su asociación con la tubulina a
través de un dominio común a todas las
isoformas. Estos resultados están
contribuyendo a esclarecer las múltiples
funciones que la diversidad de isoformas
de 4.1R desempeña en la célula no eritroide
así como los mecanismos que regulan su
transporte y distribución intracelular.
La proteína 4.1R posee una secuencia rica en leucinas capaz de regular su localización núcleocitoplasmática. A. La secuencia rica en leucinas presente en 4.1R se parece a las señales de
exportación nuclear ya caracterizadas en otras proteínas. B. Estructura tridimensional de la
NES de 4.1R. C. Estructura tridimensional del dominio FERM de 4.1R donde se muestra la
señal de exportación nuclear presente en una _-hélice expuesta. Los dos residuos más
conservados, Leu34 y Leu36 están indicados en la figura.
26
Cytoskeleton and nucleoskeleton
Research summary
Protein 4.1 was originally identified as an
80 kDa component of the membrane
skeleton of human red blood cells. In
The main current goals of our group
comprise the characterization of the
sequence motifs involved in differential
targeting of proteins 4.1R and the
Perez-Ferreiro, C.M., Luque, C.M., Correas, I. (2001)
4.1R proteins associate with interphase microtubules in
human T cells: a 4.1R constitutive region is involved in
tubulin binding. J. Biol. Chem. 276, 44785-44791
these cells, 4.1 acts as an stabilizing
elucidation of the roles that 4.1 plays in
nucleated cells.
protein of the spectrin-actin network, linked
to the plasma membrane via interactions
During the 2001-2002 period, our main
with transmembrane proteins. The picture
is more complex in nucleated cells, in
findings on signals involved in nucleocytoplasmic distribution of 4.1R isoforms
which many 4.1R isoforms varying in size
suggest that 4.1 is differentially distributed
between these two compartments at least
de Marco, M.C., Martin-Belmonte, F., Kremer, L., Albar,
by four different mechanisms. Our results
J.P., Correas, I., Vaerman, J.P., Marazuela, M., Byrne,
also indicate that all 4.1R isoforms bind
to interphase microtubules in human T
cells through a conserved region. All these
J.A., Alonso, M.A. (2002) MAL2, a novel raft protein of
and intracellular location, have been
identified. Little is known about the
functional roles that proteins 4.1 are
playing in nonerythroid cells. Studies
carried out by our group have shown that
a specific 4.1 isoform is a component of
the nucleoskeleton to which proteins of
the splicing machinery attach. Red blood
cell protein 4.1 has recently been referred
to as 4.1R to distinguish it from three
newly described 4.1 proteins which are
Perez-Ferreiro, C.M., Luque, C.M., Pérez-González, A.,
data will contribute to the understanding
of the multiple 4.1R functions played in
non-erythroid cells as well as to elucidate
the mechanisms involved in 4.1R
intracellular distribution.
Sendino, E., Correas, I. (2001) Nuclear and cytoplasmic
localization signals in protein 4.1R. Cell Mol. Biol. Lett.
6,195
the MAL family, is an essential component of the
machinery for transcytosis in hepatoma HepG2 cells. J.
Cell Biol. 159, 37-44
Tesis doctorales/Doctoral Theses
Carmen María Pérez-Ferreiro. 2001. "Secuencias que
modulan la distribución subcelular y las interacciones
encoded by three other genes. These
proteins are named 4.1B (abundant in
brain), 4. 1N (abundant in neurons), and
de la proteína 4.1R en células no eritroides”. Universidad
Autónoma de Madrid.
4.1G (generally distributed). Protein 4.1B
functions as a tumor suppressor and its
loss is observed in a variety of tumors,
including breast and lung cancers as well
as meningiomas.
A leucine-rich sequence regulates nuclear cytoplasmic
localization of protein 4.1R. A. The leucine-rich sequence
of 4.1R resembles nuclear export signals (NESs)
characterized in a variety of proteins. B. Threedimensional structure of the NES present in protein
4.1R. C. Three-dimensional structure of the FERM
domain of 4.1R showing the position of the NES in an
exposed _-helix. Two essential residues, Leu34 and
Leu36, are shown.
27
Biología Celular
Cell Biology
B.2
Mecanismos de regulación de la biogénesis
mitocondrial y alteración mitocondrial en cáncer
Trabajos anteriores de nuestro laboratorio
han demostrado que la expresión del gen
que codifica la subunidad catalítica del
El objetivo fundamental que persigue esta
línea de investigación es la caracterización
de los mecanismos celulares y moleculares
que regulan la biogénesis de las
desarrollo y en células tumorales por control
de la traducción del mRNA correspondiente.
José M. Izquierdo
mitocondrias en células de mamífero, esto
es, el conjunto de procesos que tienen
En este periodo hemos caracterizado los
dos elementos de la secuencia del mRNA
como finalidad el aumento de la dotación
y/o de la actividad mitocondrial en la célula.
que participan en el control de su traducción,
así como las proteínas del hígado que
Por la implicación evidente que la
mitocondria tiene en múltiples
manifestaciones de la patología humana
interaccionan con dichos elementos. Por
Antonio Isidoro
(cáncer, enfermedades neurodegenerativas,
envejecimiento, diabetes,…) hacemos
colon se produce una alteración de la
biogénesis mitocondrial que hemos definido
Alvaro Ortega
especial hincapié en el estudio de aquellos
como “la huella bioenergética del cáncer”.
Técnico de Investigación /
mecanismos que conducen a la expresión
de un fenotipo mitocondrial aberrante. La
finalidad de estos estudios es la
Esta alteración está íntimamente ligada a
la progresión tumoral, de tal forma que la
subunidad catalítica de la H+-ATP sintasa
constituye un excelente marcador de la
supervivencia de pacientes con cáncer de
José M. Cuezva
Fernando Martín
Graduate Students:
Gema Santamaría
Marta Martínez
Margarita Chamorro
caracterización de las moléculas que
participan en la manifestación de la
complejo H+-ATP sintasa está regulada en
otro lado, hemos demostrado que en
pacientes con cáncer de hígado, riñón y
patología y, eventualmente, el desarrollo
de estrategias encaminadas a prevenir la
progresión de la enfermedad. En este
colon.
contexto, nuestros estudios se centran en
el complejo de la H+-ATP sintasa, sistema
centran a cuatro niveles: (i) el desarrollo de
un kit para el análisis de la huella
enzimático cuello de botella de la generación
de energía biológica, de la generación y
organización de la membrana interna
bioenergética del cáncer, (ii) el estudio de
la huella bioenergética en otros tumores y
mitocondrial que, además, está implicada
en la ejecución del programa de apoptosis.
del mecanismo por el que la H+-ATP sintasa
En la actualidad nuestros objetivos se
líneas tumorales humanas, (iii) el estudio
está implicada en muerte celular y (iv) el
análisis del control de la traducción del
mRNA de la subunidad catalítica de la H+ATP sintasa en desarrollo y en cáncer.
Grupo / Group members:
(de izquierda a derecha/from left to right)
Gema, Álvaro, Pepe, Marta, Fernando,
Margarita, Antonio.
Estudiando la dinámica mitocondrial (“gusanitos” verdes en la pantalla del ordenador)
en células vivas.
Studying mitochondrial (green worm-like structures in the PC screen) dynamics in living
cells.
28
Mechanisms that regulate the biogenesis of mitochondria
and mitochondrial alterations in cancer
Research summary
Our group is interested in the
characterisation of the cellular and
molecular mechanisms that regulate the
biogenesis of mitochondria in cells of
mammals, that is, the set of processes
that result in an increase of the number
and/or activity of mitochondria within the
cell. Because mitochondria is implicated
in many manifestations of human
pathology (cancer, neurodegenerative
diseases, ageing, diabetes,…..) we pay
special emphasis to the study of those
mechanisms that promote the expression
of an aberrant mitochondrial phenotype
in the cell. The aim of these studies is
the characterisation of the molecules that
gene encoding the catalytic subunit of
the H+-ATP synthase is regulated at the
level of mRNA translation. We have
recently characterised the two elements
of the mRNA sequence that participate
in the control of its translation, as well as
the liver proteins that interact with the two
RNA elements. On the other hand, we
have demonstrated that the alteration of
the biogenesis of mitochondria is a cellular
hallmark of liver, kidney and colon cancer
patients. We have defined this feature as
The bioenergetic signature of cancer is
intimately related with cancer progression,
providing the catalytic subunit of the H+ATP synthase an excellent marker of the
survival of the patients with early-stage
colorectal carcinomas.
development of new strategies aimed at
At present time our objectives are focused
at four main levels: (i) the development
Within this context, our studies are centred
on the H+-ATP synthase complex, the
enzyme system that is bottle-neck for the
generation of biological energy, for the
generation and organisation of the inner
mitochondrial membrane and that is also
implicated in the execution of apoptosis.
Previous works from our laboratory have
demonstrated that during development
Cristobal, S., Rejas, M., Cuezva, J.M., Ochoa, B. (2001)
Immunolocalization of erCEH: a novel cholesteryl ester
hydrolase localized in the endoplasmic reticulum of murine
and human hepatocytes. Hepatology 33, 662-667
Ricart, J., Izquierdo, J.M., Di Liegro, C.M., Cuezva, J.M.
(2002) The assembly of the ribonucleoprotein complex
containing -F1-ATPase mRNA requires the participation of
two distal cis-acting elements and a complex set of cellular
trans-acting proteins. Biochem. J. 365, 417-418
“the bioenergetic signature of cancer”.
participate in the development of
pathology and, eventually, the
the prevention of disease progression.
Fresnedo, O., López de Heredia, M., Martínez, M.J.,
of a kit assay for the analysis of the
bioenergetic signature of cancer, (ii) the
study of the bioenergetic signature in
other tumours and tumoral human cells,
(iii) the study of the mechanism that
implicate the H+-ATP synthase in cell
death and (iv) the analysis of the control
of the translation of the mRNA encoding
the catalytic subunit of the H+-ATP
synthase in development and in cancer.
and in tumour cells the expression of the
Proliferación (A) y muerte (B) de una célula tumoral. A,
Anafase: mitocondrias, verde; cromátidas, azul; microtúbulos
del huso acromático, rojo. B, Apoptosis: DNA fragmentado
(azul) y mitocondrias hinchadas (verde).
Proliferation (A) and death (B) of a tumour cell. A, Anaphase:
mitochondria, green; chromatids, blue; microtubules of the
mitotic spindle, red. B, Apoptosis: fragmented DNA (blue)
and swollen mitochondria (green).
29
Cuezva, J.M., Krajewska, M., López de Heredia, M.,
Krajewski, S., Santamaría, G., Kim, H., Zapata, J.M.,
Marusawa, H., Chamorro, M., Reed, J.C. (2002) The
bioenergetic signature of cancer: a marker of tumor
progresión. Cancer Res. 62, 6674-6681
Patentes / Patents
Cuezva, J.M. (2002) “Procedimiento para el diagnóstico,
análisis de la progresión y prognosis de tumores malignos
basado en el estudio de marcadores metabólicos de la
célula” Universidad Autónoma de Madrid, OEPM
200201190. PCT (Europe, Canada, USA, Japan)
ESO3/00228
Biología Celular
Cell Biology
B.3
Terapia génica experimental
Marta Izquierdo
Terapia génica de tumores cerebrales
e-mails:
malignos. Los glioblastomas son tumores
primarios cerebrales, poseen una
mortandad superior al 90 % considerándose
Graduate Students:
prácticamente incurables. Los avances y
descubrimientos recientes en biología
molecular permiten la utilización de nuevas
Vega García-Escudero
Daniel Muñoz
Esteban Gurzov
Nuria Peralta
estrategias contra este mal. Una de ellas
está basada en un gen vegetal (linamarasa)
que transforma el sustrato inocuo linamarina
(2-HO isobutyronitrile--D-glucopyranoside)
en glucosa y cianuro. Con este sistema
hemos logrado erradicar tumores de hasta
1000 mm3 de volumen en la rata Wistar.
El efecto colateral debido al cianuro puede
Si bien tradicionalmente nuestro grupo ha
utilizado la rata Wistar y la línea celular C6
de glioblastoma de rata, en los últimos años
hemos constatado repetidamente que un
10% de los animales son capaces de
sobrevivir al tumor sin medicación o terapia
alguna. Estas curaciones, que enmascaran
el éxito de la terapia génica que pudo
aplicarse, podrían explicarse como un
rechazo no inmediato a un transplante
alogénico.
Otra nueva estrategia se basa en la
utilización de ARN de interferencia (ARNi)
compensar los bajos porcentajes de
basado en un ARN de doble hebra y dirigido
contra algunas proteínas imprescindibles
para la progresión del ciclo celular. Se han
construido vectores retrovirales portadores
infección viral que se estiman en tumores
sólidos. Estamos asimismo utilizando el
perro, (Beagle) cuyo tamaño de cerebro es
intermedio entre la rata y el hombre, como
de un ADN que se transcribirá en ARNis
pequeños de interferencia y que actuarán
contra los ARNs correspondientes al genes
potencialmente letales del ciclo celular.
modelo experimental. Se pretende
caracterizar en profundidad este sistema
para su eventual utilización en humanos.
30
Research Summary
Gene therapy in malignant brain
tumors. Glioblatomas are primary brain
tumors, having over 90% mortality and
being considered virtually incurable. The
current new advances in molecular
biology, allow the use of new strategies.
One of those is based on the plant gene
(linamarase) that will hydrolyze the
innocuous substrate linamarin (2-HO
isobutyronitrile--D-glucopyranoside) into
cyanide and glucose. We have
successfully used this approach to
eradicate tumors up to a volume of 1000
mm3 in the Wistar rat. The bystander
effect due to cyanide can compensate
the low viral percentages of infection
estimated in solid tumors. We are also
using the dog (Beagle) as a model system
because its brain size is intermediate
between that of the rat and humans.
Although we have used traditionally the
de Felipe, P., Izquierdo, M., Wandosell, F., Lim, F. (2001)
Wistar rat and the C6 rat glioblastoma
cell line as model systems, in the last few
years we found that about 10% of the
Integrating retroviral cassette extends gene delivery of
HSV-1 expression vectors to dividing cells BioTechniques
31, 394-405
animals were consistently able to eliminate
the tumor spontaneously with no help
from gene therapy. The spontaneous
Izquierdo, M (2001) Ingeniería Genética y Transferencia
tumor remision, that would mask the gene
Ciafré, S.A., Barillari, G., Bongiorno Borbone, L.,
therapy treatment applied, might be the
result of a graft-host allogenic rejection.
Wannenes, F., Izquierdo M., Farace, M.A. (2002) A
Génica. Ediciones Pirámide. Madrid 2001
tricistronic retroviral vector expressing natural
antiangiogenic factors inhibits angiogenesis in vitro but
A second strategy is base in RNA
is not able to block tumor progression in vivo Gene
interference (RNAi) by double-stranded
RNA against targeted cell cycle genes.
Therapy 9 297-302
We have constructed constructed vectors
based on retroviruses bearing transgenes
whose transcription gives rise to small
interfering RNAs (siRNAs) specific for the
Cortés, M.L., García-Escudero, V., Hughes, M., Izquierdo,
mRNAs corresponding to the cell cyclecontroller genes.
We are characterizing several aspects of
the system in order to be able to apply it
in the future to humans.
31
M. (2002) The cyanide bystander effect of the
linamarase/linamarin killer-suicide gene therapy system
The Journal of Gene Medicine 4 1-8
Biología Celular
Cell Biology
B.4
Desarrollo neuronal y neurodegeneración
Resumen de investigación
Francisco Moreno
Francisco Wandosell
Juan S. Jiménez
María José Benitez
Concepción Pérez Martín
María Teresa Moreno
Postdoctorales /
Silvia Sánchez
Marta Agudo
La morfogénesis neuronal depende de la
organización de los diferentes componentes
del citoesqueleto, en donde los microtúbulos
desempeñan un papel central. Se ha podido
demostrar que el grado de fosforilación de
ciertas proteínas, por ejemplo, tau puede
controlar una serie de procesos tales como
el desarrollo neuronal, algunos procesos
neurodegenerativos e incluso procesos
interaccionan entre si para formar un
complejo muy estable. Con el objetivo de
contribuir a la elucidación de la forma de
interacción de ambos tipos de subunidades,
hemos usado un equipo de Resonancia
de Plasmón Superficial, desarrollado en
nuestro laboratorio, para estudiar la
interacción entre las subunidades para
formar la holoenzima, así como la forma
de interaccionar de cada subunidad con
proteínas substrato.
oncogénicos.
Se tiene un gran interés en conocer como
Se han descrito diferentes modificaciones
químicas anormales en la proteína tau en
enfermos de Alzheimer. Parece ser que
afectan los cambios en la actividad de la
GSK 3 sobre distintos aspectos del
metabolismo en el sistema nervioso. Por
esta razón se han usado células de
Marta Salcedo
fosforilaciones aberrantes son los
principales cambios que afectan a su
capacidad de unión a microtúbulos,
Diana Simon
disminuyéndola aunque no afecta a su
neuroblastoma y cultivos primarios de
neuronas de regiones específicas del
cerebro, como modelos experimentales,
Olga Varea
ensamblaje. Se han implicado varias
quinasas en la hiperfosforilación anómala
para examinar la expresión de ésta enzima
durante la diferenciación neuronal y las
de tau entre las que cabe destacar a la
GSK3 y CK2, desempeñando importantes
posibles implicaciones en la patología
Graduate Students:
Personal Técnico /
Beatriz García
Mª Jesús Martín-Bermejo
funciones. La actividad de la GSK3 puede
ser regulada a través de interacción con
otras proteínas, tales como las proteínas
que se unen a la GSK3 (GBPs).
Recientemente hemos descrito una nueva
GBP que además puede actuar como
competidor de tau.
La Proteína quinasa CK2 es una quinasa
ubiqua, capaz de actuar en mecanismos
de señalización, proliferación celular, y
expresión génica. Cataliza la fosforilación
de restos de serina y treonina en un gran
número de proteínas relacionadas con la
síntesis de ácidos nucleicos, productos de
oncogenes, y las proteínas del citosqueleto.
El hecho de que la enzima sea más
abundante en cerebro que en otros tejidos,
y el gran número de substratos implicados
neuronal que se ha descrito en la
enfermedad de Alzheimer. Nuestros
resultados indican que la GSK 3 desempeña
una función destacada en la regulación de
la dinámica de los microtúbulos y que la
existencia de una mayor expresión del
enzima puede ser decisiva en la patología
observada en neuronas con esta
enfermedad.
Estamos interesados también en analizar
la respuesta neuronal ante situaciones de
estress y/o lesiones del sistema nervioso
central. En este sentido , hemos podido
comprobar que la proteína de matriz
extracelular fibronectina a es parte de la
respuesta de estres inducida por el péptido
amiloide.
en desarrollo, neuritogénesis, transmisión
Hemos podido comprobar que la proteína
quinasa GSK3/Shaggy se activa tras la
sináptica, y supervivencia indican que la
enzima tiene un papel importante en
inducción de la retracción de axones.
Además la inhibición farmacológica de PI3K
funciones neuronales. Muchos datos
sugieren también su implicación en
produce activación de GSK3 y retracción
desórdenes debidos a la enfermedad de
Alzheimer. La Protein Kinasa CK2 se
compone de dos tipos de subunidades
catalíticas y de dos subunidades
reguladoras. Ambas subunidades
32
neurítica. Esta activación aumenta la
expresión de fosfo-epítopos de tau que son
característicos de AD, como PHF-1. Además
hemos localizado los elementos de la ruta
de LPA-Rho responsables del sistema de
activación de GSK3/Shaggy.
Neuronal development and neurodegeneration
Research Summary
Research Summary
Neuronal morphogenesis depends on the
organization of cytoskeletal elements
among which microtubules play a very
important role. Regulation of tau
phosphorylation might be one of the key
mechanism modulating neuronal
development, neurodegenerative process
and oncogenic processes.
Several abnormal modifications have
been described for tau proteins present
in the brain of AD patients. Aberrant tau
phosphorylation appears to be mainly
involved in the regulation of its binding to
microtubules, decreasing it but not in
facilitating tau assembly. Several kinases
mode of interaction of both type of
subunits we have used a Surface
Plasmon Resonance equipment
developed in our laboratory to study the
intersubunit interactions to form the whole
holoenzyme, as well as the mode of
interaction of each subunit with protein
substrates.
There is a great interest in elucidating
how different aspect of neuronal
metabolism is altered upon changes in
GSK 3 activity. Thus we have used the
human neuroblastoma cell and primary
cultures of rat cerebellar granule neurons
as model systems to study the expression
of GSK 3 during neuronal differentiation
and the possible implications for neurite
pathology in Alzheimer’s disease.
have been involved in the anomalous
hyperphosphorylation of tau protein and
GSK3 and CK2 appear to play important
Our results are consistent with an
important role for GSK 3 in the regulation
roles. The activity of GSK 3 can be
regulated through its interaction with
of cytoskeletal dynamics during neurite
proteins such as GSK 3 binding protein
growth and that upregulation of GSK 3
may contribute to cytoskeletal pathology
(GBPs). We have described a novel GBP
that can act as a competitor with tau.
within neurites in AD. We are interested
too, in the analysis of brain response after
some stress situations of after some
Protein Kinase CK2 is a ubiquitous kinase,
acting on signaling, cell proliferation, and
insults. We reported that fibronectin is
gene expression mechanisms. It catalyses
the phosphorylation of serine and
part of an astroglilal response to betaAmiloide peptide.
threonine residues of a large number of
proteins related to nucleic acid synthesis,
We have further studied the role of
GSK3/Shaggy, after the induction of
oncogenes products, and cytoskeleton
proteins. The enzyme has an important
growth cone collapse and neurite
retraction. The pharmacological inhibition
role in neural functions as indicated by
of PI3K produces a growth cone collapse
the facts that it is more abundant in brain
than in other tissues; and the large amount
of enzyme substrates involved in
and GSK3 activation. This activation
enhanced the phosphorylation of Tau
development, neuritogenesis, synaptic
transmission, and survival. Many data
epitope characteristics of AD brains, such
as PHF-1. And more significant, we
suggests also its implication in disorders
described the elements from LPA-Rho
pathway that responsible of GSK3/Shaggy
due to Alzheimer’s disease. Protein
activation.
Kinase CK2 is composed of two types of
catalytic subunits and two regulatory
We initiated a new study of molecular
subunits. It is well known that both catalytic
and regulatory subunits bind each other
to form a very stable complex. In order
to contribute to the elucidation of the
mechanism of regeneration based on the
capacity of ensheathing glia to promote
or redirect neuronal regeneration
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of GSK3/Shaggy. BBA-Mol. and Cell Biol. Of Lipids 15821/3, 144-153
Sayas, CL., Avila, J., Wandosell, F (2002) GSK-3 is
activated by Galfa-12 and Galfa-13 by Rho-independent
and Rho, dependent mechanism. J. Neurosci. 22, 6863687
Silvia Sánchez. 2001. “Análisis de los mecanismos
moleculares que controlan la elongación y retracción
axonal: Papel de la PI3-Quinasa”. Univ. Autónoma de
Madrid.
33
Biología Celular
Cell Biology
B.5
Señalización celular por PKC atípicas en
inmunidad y cáncer
Jorge Moscat
Las quinasas son elementos esenciales en
los mecanismos de comunicación celular.
En particular, numerosos estudios han
María Teresa Díaz-Meco
María José Lafuente
Pilar Martín
Postdoctorales /
Antonia Avila
Carlos Guillén
María José Lorite
implicado a las PKC atípicas (aPKC), cPKC
y h/f PKC, en la activación de NF-gB, que
es un factor de transcripción crítico en el
crecimiento celular y la respuesta inmune.
La alteración de los mecanismos normales
que regulan la señalización celular da lugar
a la aparición de enfermedades humanas
tales como el cáncer, la inflamación o
desordenes autoinmunes como el lupus o
la artritis reumatoide. En nuestro laboratorio
Graduate Students:
Angeles Durán
Raquel Sánchez
hemos caracterizado recientemente el ratón
“knock out” (KO) de cPKC, lo que nos ha
permitido concluir que esta quinasa
Esther Fuertes
Juan José Lazcano
Desireé Ruiz
de NF-gB, debido al hecho de que cPKC
fosforila directamente su subunidad
transactivadora, RelA. Por lo tanto, durante
estos dos años hemos generado resultados
que prueban genéticamente que cPKC es
esencial en la activación de NF-gB y en el
control de la respuesta inmune.
Esto hace de esta quinasa una diana muy
atractiva para el descubrimiento de nuevas
medicinas anti-inflamatorias y anticancerosas. Las aPKC interaccionan con
dos proteínas reguladoras: Par-4 y p62. La
primera es pro-apoptótica e inhibidora de
las aPKC, y sus niveles se reprimen en
efectivamente juega un importante papel
en el sistema inmune y especialmente en
la función de células B.
células tumorales.
Así, la falta de cPKC en este tipo celular
información de gran interés sobre el papel
que esta proteína juega in vivo. Por otra
Esther Garcia
de Peyer. Mecanísticamente, las células
de ratones cPKC KO muestran una fuerte
inhibición en la activación transcripcional
inhibe la proliferación y la supervivencia
celulares en respuesta a estímulos del
Hemos empezado a caracterizar los ratones
KO de Par-4 cuyo fenotipo está revelando
parte, p62 es una proteína de andamiaje
receptor antigénico, lo que correlaciona con
que organiza el complejo de señalización
Científicos Visitantes /
un defecto en la inducción de varios genes
Visiting Scientists:
de aPKC en la ruta de NF-gB. La reciente
generación, en nuestro laboratorio, de
(Auburn University, Alabama)
dependientes de NF-gB, como Bcl-xL. Como
consecuencia de estos defectos
moleculares, los ratones KO para cPKC
Nancy Laurin
son incapaces de montar una respuesta
(L’Université Laval, Quebec)
inmune óptima y manifiestan un retraso en
el desarrollo de órganos linfoides
Marie W. Wooten
ratones KO para p62 ayudará a la
comprensión de los mecanismos por los
que el complejo aPKC/p62 participa en la
transducción específica de señales en
modelos in vivo.
secundarios, especialmente de las placas
Microfotografías de marcajes representativos de hematoxilina-eosina de placas de
Peyer (arriba) y bazo (abajo) de ratones wild type y KO para cPKC de 2 semanas de
edad. Las características estructurales de las Placas de Peyer están alteradas en los
ratones KO, mostrando reducción en el número y tamaño de los folículos. La estructura
global del bazo de los ratones KO está preservada pero son aparentes los defectos en
la zona marginal así como la existencia de folículos B menores en pulpa blanca.
34
Spleen
Peyer’s Patches
cPKZ +/+
cPKZ -/-
Cell signaling through the atypical PKC
Research Summary
Kinases are essential players in the
mechanisms of cell communication. In
particular, numerous studies have
implicated the atypical PKC isoforms
(aPKC), cPKC and h/fPKC, in the
activation of NF-gB which is critical in the
control of cell proliferation and the immune
response. The subversion of the normal
mechanisms that regulate cell signaling
Of great interest, cPKC-deficient cells
Diaz-Meco, M.T., Moscat, J. (2001) MEK5, a New Target
have a severe defect in NF-gB
transcriptional activity which is due to the
fact that cPKC phosphorylates the NFgB transactivating subunit, RelA.
of the Atypical PKCs in Mitogenic Signalling. Mol. Cell.
Biol. 21, 1218-1227
Moscat, J., Sanz, L., Sanchez, P., Diaz-Meco, M.T., (2001)
Regulation and role of the atypical PKC isoforms in cell
Therefore, our results during these two
years have genetically established the
role of cPKC in NF-gB signaling and in
the immune response which makes this
kinase an attractive therapeutic target for
survival during tumor transformation. Adv. Enzyme Regul.
41, 99-120
Wooten, M., Seibenhener, M.L., Mamidapudi, V., DiazMeco, M.T., Moscat, J. (2001) The Atypical PKC-
drug discovery in the areas of
inflammation and cancer.
Interacting Protein p62 is a Scaffold for NF-B Activation
rheumatoid arthritis. We have recently
characterized the cPKC knock out (KO)
The atypical PKCs interact with two
regulatory proteins: Par-4 and p62. The
Wooten, M.W., Vandenplas, M.L., Seibenhener, M.L.,
mice which reveals that this kinase plays
an essential role within the immune
former is a pro-apoptotic inhibitor of the
aPKCs that is down-regulated in tumortransformed cells. We have now started
Stimulates multisite tgrosine phosphorglation and
leads to various forms of human diseases
such as cancer, inflammation or
by Nerve Growth Factor. J. Biol. Chem. 276, 7709-7712
autoimmune disorders like lupus or
system and specifically in B-cell function.
Geetha, T., Díaz-Meco, M.T. (2001) Nerve Growth factor
activation of the atgpical Protein kinase C’s via a SRC
kinase pahtwag. Mol. Cell. Biol. 21, 8414-8427
to characterize the Par-4 KO mice whose
Thus, the loss of cPKC in B-cells impairs
survival and proliferation in response to
phenotype is revealing extremely
interesting information on the role of this
Leitges, M., Sanz, L., Martin, P., Duran, A., Braum, U.,
antigen receptor stimulation which
correlates with a defective induction of
protein in vivo.
P.D., Moscat, J. (2001) Targeted disruption of the PKC
several NF-gB-dependent genes,
including Bcl-xL. Consistent with these
On the other hand, p62 is a scaffold
Mol.Cell. 8, 771-780
Ponting, C.P., Ito, T., Moscat, J., Diaz-Meco, M.T., Inagaki,
Garcia, J.F., Camacho, F., Diaz-Meco, M.T., Rennert,
gene results in the impairment of the NF-B pathway.
molecular defects, the cPKC KO mice
protein that serves to organize the aPKCs
signaling complex in the NF-gB pathway.
are unable to mount an optimal immune
response and display a delay in the
The recent generation, in our laboratory,
of the p62 KO will help to understand how
development of secondary lymphoid
organs, specially the Peyer’s patches.
the aPKC/p62 complexes participate in
the control of specific signaling events in
in vivo models of human diseases.
F., Suminoto, H. (2002) OPR, PC and AID: all in the PB1
family. TIBS 27, 10
Moscat, J., Diaz-Meco, M.T. (2002) Specificity in atypical
Protein kinase C signaling: the NF-B paradigm. In Protein
nd
Kinase C, 2 Edition. Lodewijk Dekker ed. (eirekah.com)
Martin, P., Duran, A., Minguet, S., Gaspar, M.L., DiazMeco, M.T., Rennert, P., Leitges, M., Moscat, J. (2002)
Role of PKC in B-cell signaling and function. EMBO J.
21, 4049-4057
Avila, A., Silverman, N., Diaz-Meco, M.T., Moscat, J.
(2002) The Drosophila atypical PKC-Ref(2)P complex
constitutes a conserved module for signalling in the Toll
Pathway. Mol. Cell. Biol. 22, 8787-8795
J. Moscat. Premio de la Fundación Carmen y Severo
Ochoa
J. Moscat. II Ayuda de la Fundación Juan March a la
Investigación Básica
J. Moscat. Co-organizador Workshop de la Fundación
Photomicrographs of representative hematoxilin-eosin stainings of Peyer’s patches (upper panels)
and spleen (lower panels) of 2-weeks old cPKC KO and wild type mice. The structural features of
individual Peyer’s patches were altered in the KO mice, showing a reduction in the number and size
of follicles. The overall structure of the spleens from the cPKC-deficient mice was preserved but a
defect in the marginal zone was detected together with smaller B cell follicles in the white pulp.
35
Juan March “Control of NF-gB Signal Transduction in
Inflammation and Innate Immunity” (7-9 Octubre, 2002)
Biología Celular
Cell Biology
B.6
Tráfico regulado de proteínas de membrana
Ignacio V. Sandoval
El principal interés de nuestro grupo consiste
en entender los mecanismos moleculares
que regulan el secuestro intracelular de
Diego Pulido, Vassiliki Lalioti
Beatriz Barrios
Becarios Predoctorales / Graduate
Students:
proteínas de membrana en las proximidades
del aparato de Golgi y su translocación a
la membrana plasmática en respuesta a
estímulos que demandan su funcionamiento
en ésta.
Trabajamos con el transportador de glucosa
Sonia Hernández
sensible a insulina, GLUT4, y los
transportadores de cobre, ATP7A y ATP7B,
Sharmila Chatopadhyay
centrándose nuestros estudios en la
Eduardo Silles
caracterización morfológica y molecular de
los compartimentos de la red trans del Golgi
en donde son almacenados y desde donde
son transportados a la membrana
Silvia Vergarajauregui
plasmática.
36
Doscientos millones de personas padecen
diabetes de tipo II, enfermedad en la que
la función transportadora de GLUT4 está
impedida, y doscientas cincuenta mil sufren
las graves toxicosis provocadas por la
disfunción de ATP7A y ATP7B.
Perseguimos identificar los sensores que
responden a insulina y cobre activando la
translocación de GLUT4 y de ATP7A y
ATP7B, respectivamente, así como
caracterizar las correspondientes
maquinarias de retención y transporte que
operan sobre ellos.
Regulated membrane protein trafficking
Research Summary
toxicosis produced by the dysfunction of
Palacios, S. Lalioti, V., Martínez-Arca, S., Chattopadhyay,
S., Sandoval, I.V. (2001) Recycling of the insulin-sensitive
The aim of our research is to advance
ATP7A and ATP7B are suffered by two
hundred and fifty thousand people.
the knowledge of the Golgi-based
mechanisms that operate in the
Significant contributions of our studies to
is mediated by the Phe5-Gln7-Ile8 motif. J. Biol. Chem.
the understanding of the cellular trafficking
276, 3371-3383
of GLUT4 were the characterization of
four distinct signals of transport: one,
RXXXLL490 implicated in its transport from
Leber, R., Silles, E., Sandoval, I.V., Mazon, M.J. (2001)
the Golgi cisternae to its storage
targeting of aminopeptidase I to the yeast vacuole. J.
compartment (GSC); two, Y502 y
PDEND509, involved in its retention and
Biol. Chem. 276, 29210-29217
release from the GSC; and, a forth one,
FQQI8 , which operates in its recycling
from endosomes to the GSC, upon the
fall in the insulin levels. More recently we
Holman, G.H., Sandoval, I.V. (2001) Moving the insulin-
respond to increases in the levels of insulin
and copper by promoting their
translocation to the cell surface, as well
have characterized the physical
Lalioti, V., Vergarajauregui, S., Sandoval, I.V. (2001)
interaction between Daxx and JNK1 with
the N and C-cytoplasmic domains of
Targeting motifs in GLUT4. Mol. Membrane Biol. 18, 257-
as to characterize the machineries of
retention and transport that act upon them.
GLUT4, and cloned using the yeast two
hybrid system and the thirty terminal
Lalioti, V., Vergarajauregui, S., Sandoval, I.V. (2002) The
amino acids of GLUT4 as bait, KIS, a
insulin-sensitive glucose transporter GLUT4, interacts
Two hundred million people suffer type II
diabetes, a disease produced by the
new membrane protein lodged in the Golgi
that appears to have the capacity to signal
physically with Daxx: two proteins with capacity to bind
peripheral resistance to insulin and the
ill-functioning GLUT4. The often lethal
both intra and extracellularly.
264
intracellular sequestering and
translocation to the plama membrane of
proteins that modify its functioning in a
regulated fashion.
Subjects of our studies are: the insulin
regulated glucose transporter, GLUT4,
and the copper transporters, ATP7A and
ATP7B.
We seek to identify the sensors that
glucose transporter GLUT4. Access of surface internalised
GLUT4 molecules to the perinuclear storage compartment
Yol082p, a novel CVT protein involved in the selective
regulated glucose transporter GLUT4 into and out of
storage. Trends in Cell Biology 11, 173-179
264
Ubc9 and conjugated to SUMO1. J. Biol. Chem. 18, 257-
Eduardo Martínez Díaz. 2002. “Transport of pAPI from
the cytoplasm to the vacuole of yeast”. Universidad de
la Habana, Cuba.
37
Biología Celular
Cell Biology
B.7
Terapia génica experimental
Antonio Talavera Díaz
La utilidad de los vectores retrovirales en
la terapia génica radica en la estabilidad
del gen terapéutico transducido, inserto en
Humberto Sánchez González
el genoma celular mediante el proceso de
integración proviral. No obstante, y como
ha quedado en evidencia recientemente,
Laura Fuentes Sánchez
los éxitos de esta técnica pueden quedar
Leticia Alda Herrán Villalaín
ensombrecidos por la aparición de efectos
secundarios debidos a integraciones
Becarios Predoctorales / Graduate
Students:
inadecuadas de los vectores.
Con los vectores así obtenidos hemos
logrado corregir, en un modelo celular, un
gen testigo a niveles compatibles con su
uso clínico. La segunda modificación
consistió en la adición, en el esqueleto del
vector retroviral, de dos elementos que
permitiesen su establecimiento como
episoma replicativo extracromosómico: el
origen de replicación del virus SV40 y la
región de unión a la matriz nuclear (región
MAR) del gen del interferón ` humano.
Hemos confirmado que estos elementos
contribuyen al mantenimiento
En el caso de la terapia génica sustitutiva
la integración no es, sin embargo, necesaria,
ya que el efecto perseguido no es la
expresión del gen transducido, sino la
extracromosómico del DNA proviral en las
células transducidas, ya que el gen selector
transducido no aparecía en el DNA de alto
peso molecular, pudiendo, en cambio, ser
reparación de un gen endógeno mediante
su recombinación homóloga con una
rescatado de la fracción extracromosómica.
secuencia del DNA transducido. Con el fin
Hemos observado, sin embargo,
reorganizaciones inesperadas en los DNAs
de adaptar los vectores retrovirales a la
terapia génica sustitutiva, hemos introducido
dos modificaciones en el sistema.
transducidos que, aunque en principio no
La primera consistió en abolir su capacidad
deberían interferir con el proceso de
reparación génica, consideramos
conveniente minimizar o abolir, para lo cual
integrativa, bien delecionando secuencias
hemos abordado su caracterización.
del provirus necesarias para su
reconocimiento y procesamiento por la
integrasa, o bien utilizando un sistema
empaquetador desprovisto de integrasa
funcional.
Modelo celular de reparación génica. El gen tk contiene una mutación de
cambio de fase, y está unido en fase con el gen egfp. El conjunto es
seleccionable con higromicina, ya que el gen de resistencia a dicho antibiótico
esta separado del gen de fusión por una secuencia de entrada ribosomica
interna (IRES). La reparación del gen de fusión recupera tanto la actividad
timidina kinasa como la sintesis de proteina verde fluorescente. Las celulas
curadas pueden ser seleccionadas tanto por fluorometria como por su
resistencia en medio HAT.
38
Research Summary
The modified vectors have allowed us to
Fuentes, L., Sánchez, H (2001) Comentario "La
repair, in a model system, a reporter gene
importación al núcleo del genoma del VIH-1 está mediada
The usefulness of retroviral vectors in
at levels compatible with their clinical use.
por una solapa central del DNA" al artículo homónimo
gene therapy is related to the stability of
the transduced therapeutic gene, that
remains linked to the cell genome by
The second modification was the addition,
in the retroviral backbone, of two elements
Virología 8, 37-38
virtue of the process of proviral
that lead to its establishment as a
Fuentes, L. (2001) Comentario "La transducción estable
integration.
replicative episome: the SV40 replication
origin and a matrix attachment region
(MAR) of the human `<interferon gene.
de células proliferativas puede ser mediada por un nuevo
However, as evidenced by recent reports,
the success of gene therapy may be
obscured by unwanted results caused by
de V. Zennou y col. [Cell 101, 173-185].
vector adenoepisomal" al artículo homónimo de H. Lebois
y col. [Mol. Ther. 1, 314-321] Virología 8, 73-74
We have proved that these elements
contribute to the extrachromosomal
permanence of the proviral DNA in the
Talavera, A., Sánchez, H. (2001) El virus del SIDA:
inadequate integration of the vectors used.
Nevertheless, substitutive gene therapy
does not require integration as, in this
transduced cell, as in most instances the
transduced reporter gene was absent
Biopress, nº 1.
instance, the action sought for is the rapair
of a defective endogenous gene by
from the high molecular weight DNA
fraction, being readily rescued from the
extrachromosomal fraction.
Laura Fuentes Sánchez. 2001. "Nuevas adaptaciones
homologous recombination between this
and a sequence in the transduced DNA,
rather than the expression of the incoming
gene. In order to adapt retroviral vectors
to substitutive gene therapy, we have
introduced two modifications in the vector
system.
First, we abolished integration by deleting
proviral sequences recognised, bound,
un retrovirus patógeno como agente terapéutico.
de vectores retrovirales para terapia génica". Universidad
We have observed, however, unexpected
rearrangements in the transduced DNAs
which, although should not, in principle,
Humberto Sánchez González. 2001. “Modelos celulares
interfere with the process of gene repair,
their origin and mechanism of formation
para el estudio de la sustitución génica mediada por
should be characterised, in order to
minimise or altogether prevent their
occurrence.
and processed by the integrase or,
alternatively, by using a packaging system
devoid of the enzyme.
Esquema de las
interacciones de las
secuencias MAR con la
matriz nuclear. Los lazos de
DNA constituyen dominios
del genoma
transcripcionalmente
independientes.
39
vectores retrovirales defectivos en integración".
Biología Celular
Cell Biology
B.8
Química de proteínas y proteómica
Nuestro grupo está actualmente estudiando
la regulación del promotor del gen APOE
en el contexto de la patogénesis de la
fisiológica mediante purificación por afinidad
Enfermedad de Alzheimer (EA). Hemos
buscado nuevos factores que regulen la
en tándem (“TAP”). La mayoría de estos
desarrollos han sido aplicados con éxito en
actividad del promotor mediante técnicas
de espectrometría de masas y Proteómica.
varios trabajos biomédicos y
biotecnológicos.
Jesús Vázquez
Postdoctorales /
José Ramón Lamas
Miguel Angel García
Mónica Campillos
Benito Cañas
nuevas técnicas. Estamos trabajando en
métodos para la caracterización de
modificaciones posttraduccionales y la
identificación de factores de relevancia
Estos factores podrían generar nuevas
pistas para entender los mecanismos de la
EA y para identificar nuevas dianas
terapéuticas. Hemos demostrado que el
Una de las técnicas emergentes más
prometedoras (“shotgun Proteomics”) se
basa en el análisis a gran escala de las
Daniel López
oncogen DEK modula el efecto de AP-2,
un activador del promotor específico de
cerebro. También hemos encontrado que
complejas mezclas de péptidos generadas
a partir de proteomas no sometidos a
separación previa. Las herramientas
Graduate Students:
Alberto Monteagudo
la proteína hnRNPA1 modula
específicamente la actividad de la forma
–219T del promotor de APOE. Nuestros
bioinformáticas actuales sólo permiten
descifrar de forma parcial la enorme
cantidad de información sobre
resultados demuestran que hnRNPA1 juega
un papel fisiológico en la actividad diferencial
de las dos isoformas –219 del promotor, y
fragmentación de péptidos que se genera
desarrollado en nuestro laboratorio
Silvia Lorenzo
permiten proponer un mecanismo molecular
para explicar la asociación existente entre
la isoforma –219T y el aumento en el riesgo
(Universidad de Santiago Compostela)
de desarrollar la enfermedad.
secuenciación automática de péptidos.
Estamos probando y tratando de mejorar
Nuestro laboratorio también está trabajando
las prestaciones de este algoritmo para
en el emergente campo de la Proteómica.
Esta tecnología se basa principalmente en
técnicas de espectrometría de masas y de
mejorar la fiabilidad de la identificación de
péptidos a gran escala, y para el análisis
automático de mutaciones, modificaciones
bioinformática, que todavía no se han
posttraduccionales, y proteomas de
desarrollado plenamente. Estamos por ello
concentrando nuestros esfuerzos en la
especies poco representadas en las bases
de datos.
Fernando Martín
(ThermoFinnigan, CA, USA)
Carmen Piñeiro
(Instituto Investigaciones Marinas Vigo)
implementación y desarrollo de estas
Caracterización de sitios de fosforilación mediante espectrometría de
masas en tándem de trampa iónica.
Characterization of phosphorylation sites by ion trap tandem mass
spectrometry.
40
mediante estas técnicas. Estamos
trabajando en un nuevo algoritmo
(comercializado por Thermo Finnigan bajo
el nombre de “DeNovoX”), para la
Protein chemistry and proteomics
Research Summary
Our group is currently studying the
regulation of APOE gene promoter in the
context of the pathogenesis of Alzheimer’s
Disease (AD). Using mass spectrometry
and Proteomics, we have searched for
novel factors which regulate promoter
activity. These factors may provide new
clues to understand the mechanisms
underlying AD, as well as for the
identification of novel therapeutic targets.
We have demonstrated that the oncogene
DEK modulates the effect of AP-2, a brainspecific activator of the promoter. We have
also found that the protein hnRNPA1
specifically modulates the activity of –219T
isoform of APOE promoter. Our results
demonstrate that hnRNPA1 plays a
physiological role in the differential activity
of the two –219 APOE promoter isoforms,
and provide a molecular mechanism to
explain the association of the –219T form
with an increased risk for AD.
Our laboratory is also working in the
emerging field of Proteomics. This
technology relies mainly in mass
spectrometry and bioinformatic
efforts in the implementation and
development of novel techniques. We are
working in methods for characterization
of postranslational modifications and
identification of interacting factors of
physiological relevance by tandem affinity
purification (TAP). Most of these
approaches have been successfully
applied in several works in the fields of
biomedicine and biotechnology.
One of the most promising techniques is
the so-called “shotgun Proteomics”, which
is based in the large-scale analysis of the
peptide pools generated from unseparated
proteomes. The vast amounts of peptidefragmentation information generated by
these approaches are only partially
deciphered by current bioinformatic tools.
We are working with a novel algorithm
developed in our laboratory (marketed by
Thermo Finnigan under the name of
“DeNovoX”) for automated “de novo”
sequencing of peptides. We are testing
and improving the performance of this
algorithm for increasing the confidence
of large-scale peptide identification, and
for the automated analysis of mutations,
postranslational modifications and
approaches, which are not fully developed
proteomes from species poorly
yet. We are therefore concentrating our
represented in databases.
Piñeiro, C., Vázquez, J., Marina, A., Barros-Velázquez, J.,
Gallardo, J.M. (2001) Characterization and partial sequencing
of species-specific sarcoplasmic polypeptides from
commercial hake species by mass spectrometry following
two dimensional electrophoresis. Electrophoresis 22, 15451552
López, J.L., Mosquera, E., Fuentes, J., Marina, A., Vázquez,
J., Alvarez, G. (2001) Two-dimensional gel electrophoresis
of Mytilus galloprovincialis. Differences in protein expression
between intertidal and cultured mussels. Marine Ecology
Progress Series 224, 149-156
Yagüe, J., Marina, A., Vázquez, J., López de Castro, J.A.
(2001) Major histocompability complex class I molecules
bind natural peptide ligands lacking the amino-terminal
binding residue in vivo. J.Biol.Chem. 276, 43699-43707
Alvarez, I., Martí, M., Vázquez, J., Camafeita, E., Ogueta,
S., López de Castro, J.A. (2001) The Cys67 residue of HLAB27 influences cell surface stability, peptide specificity and
T-cell antigen presentation. J. Biol. Chem. 276, 48740-48747
Pérez Martín, C., Vázquez, J. Avila, J., Moreno, F.J. (2002)
P24, a glycogen synthase kinase 3 (GSK 3) inhibitor. Biochim.
Biophys. Acta 1586, 113-122
Pineda-Molina, E., Klatt, P., Vázquez, J., Marina, A., García
de Lacoba, M., Pérez-Sala, D., Lamas, S. (2002)
Glutathionylation of the p50 subunit of NF-B: a mechanism
for redox-induced inhibition of DNA-binding. Biochemistry
40, 14134-14142
Sesma, L., Montserrat, V., Lamas, J.R., Marina, A., Vázquez,
J., López de Castro, J.A. (2002) The peptide repertoires of
HLA-B27 subtypes differentially associated to
spondyloarthropathy (B*2704 and B*2706) differ by specific
changes at three anchor positions. J. Biol. Chem. 277,
16744-16749
López, J.L., Marina, A., Vázquez, J. and Alvarez, J. (2002)
A proteomic approach to the study of the marine mussels,
Mytilus edulis and Mytilus galloprovincialis Marine Biology
141, 217-223
García, M.A., Koonrugsa, N., Toda, T. (2002) Spindlekinetochore attachment requires the combined action of Kin
I-like Klp5/6 and Alp14/Dis1-MAPs in fission yeast. EMBO
J. 21, 6015-6024
Montes, C., Zuñiga, E.I., Vázquez, J., Arce, C., Gruppi, A.
(2002) Trypanosoma cruzi mitochondrial malate
dehydrogenase triggers polyclonal B-cell activation. Clin.
Exp. Immunol. 127, 27-36
Ramos, M., Paradela, A., Vázquez, M., Marina, A., Vázquez,
J. López de Castro, J.A. (2002) Differential association of
HLA-B*2705 and B*2709 to ankylosing spondylitis correlates
with limited peptide subsets but not with altered cell surface
stability. J. Biol. Chem. 277, 28749-28756
Fuentes, J., López, J.L., Mosquera, E., Vázquez, J., Villalba,
A. Alvarez, G. (2002) Growth, mortality, pathological
conditions and protein expresion of Mytilus edulis and Mytilus
galloprovincialis crosses cultured in the Ría de Arousa (NW
of Spain). Aquaculture 213, 233-251
Enseñat, R., Martín, F., Barahona, F., Vázquez, J., Soria,
B., Reig, J.A. (2002) Direct visualization by confocal
fluorescent microscopy of the permeation of mirystoilated
peptides through the cellular membrane. IUBMB Life 54,
33-36
López, J.L., Marina, A., Alvarez, G., Vázquez, J. (2002)
Application of proteomics for fast identification of speciesspecific peptides from marine species. Proteomics 2, 16581665
Alexa, A., Schmidt, G., Tompa, P., Ogueta, S., Vázquez, J.,
Kulcsar, P., Kovacs, J., Dombradi, V., Friedrich, P. (2002)
The phosphorylation state of threonine-220, a uniquely
phosphatase-sensitive protein kinase A site in microtubuleassociated protein MAP2c, regulates microtubule binding
and stability. Biochemistry 41, 12427-12435
Esquema de la identificación de péptidos a gran escala mediante los motores actuales de búsqueda
en las bases de datos (Sequest), o mediante interpretación automática de secuencia utilizando el
programa DeNovoX. Este último permite la identificación de mutaciones y de modificaciones
posttraduccionales.
Urzainqui, A., Serrador, J.M., Viedma, F., Yáñez-Mó, M.,
Corbí, A.L., Alonso-Lebrero, J.L., Luque, A., Vázquez, J.,
Sánchez-Madrid, F. (2002) ITAM-based interaction of ERM
proteins with Syk mediates signaling by the leukocyte
adhesion receptor PSGL-1. Immunity 17, 401-412
Scheme of large-scale peptide identification using current database searching engines (Sequest), or
by automated sequence intepretation using DeNovoX software. The latter allows the identification of
mutations and posttranslational modifications.
Rey, M., Vicente-Manzanares, M., Viedma, F., Yáñez-Mó,
M., Urzainqui, A., Barreiro, O., Vázquez, J., Sánchez-Madrid,
F. (2002) Association of the Motor Protein Nonmuscle Myosin
Heavy Chain-IIA with the C-terminus of the chemokine receptor
CXCR4 in T Lymphocytes. J. Immunol. 169, 5410-5414
41
Microscopía electrónica del VPPA. (A) Viriones maduros intracelulares. (B) Cápsidas vacías
generadas en células infectadas con el virus recombinante v220i inducible en la poliproteína
pp220, en condiciones restrictivas. c, cápsida; ie, envuelta interna; cs, dominio intermedio; n,
nucleoide.
Electron microscopy of ASFV. (A) Intracellular mature virions. (B) Empty capsids generated in cells
infected with the recombinant virus v220i inducible in polyprotein pp220, under restrictive conditions.
c, capsid; ie, inner envelope; cs, core shell; n, nucleoid.
42
C.1 Transmisión de señales a través del
receptor para el antígeno de células T
Balbino Alarcón
José M.
Almendral
Luis Carrasco
Esteban Domingo
Manuel Fresno
C
Inmunología
y Virología
Mauricio
García Mateu
Crisanto
Gutierrez
José A.
López de Castro
C.1 Signal transduction through the T cell
antigen receptor
C.2 Bases moleculares de la patogenia y del
potencial anti-tumoral de los parvovirus
C.2 Molecular bases of parvovirus pathogenesis
and anti-tumour potential
C.3 Bases moleculares de la citopatologia viral
C.3 Molecular bases of viral cytopathology
C.4 Variabilidad genética de virus RNA
C.4 Genetic variability of RNA viruses
C.5 Activación del sistema inmune
C.5 Activation of the immune system
C.6 Estabilidad e ingeniería de proteínas víricas
C.6 Stability and engineering of viral proteins
C.7 Replicación del DNA y ciclo celular
C.7 Dna replication and cell cycle
C.8 Inmunología de los antígenos de
histocompatibilidad
C.8 Immunology of histocompatibility antigens
Immunology
and Virology
Luis Menéndez
Arias
Juan Miguel
Redondo
Miguel Angel
Rodríguez Marcos
María Luisa Salas
Francisco Sobrino
María Luisa
Toribio
C.9 Enzimas retrovirales: análisis estructural y
funcional de la retrotranscriptasa del virus
de la inmunodeficiencia humana
C.9 Retroviral enzymes: structural and functional
analysis of human immunodeficiency virus
reverse transcriptase
C.10 Regulación de la expresión génica en
endotelio vascular
C.10 Regulation of gene expression in vascular
endothelium
C.11 Embryonic development of the
C.12 Virus de la peste porcina africana
C.12 African swine fever virus
C.13 Desarrollo de nuevas estrategias para el
control y prevención de enfermedades
virales: el virus de la fiebre aftosa como
modelo
C.13 Development of new strategies to control
and prevent viral diseases: the foot-andmouth virus as a model
C.14 Development of the human
C.15 Replicación y transcripción del dna del
bacteriófago ø29
Margarita Salas
C.15 Replication and transcription of
bacteriophage ø29
C.1
Transmisión de señales a través del receptor para el
antígeno de células T
Balbino Alarcón
Edgar Fernández
Ester San José
Wolfgang Schamel
Graduate Students:
Diana Gil
Pilar Delgado
Alicia Monjas
Irene Zaldívar
Manuel Pulgar
Ruth M Risueño
realizado una contribución más significativa
El receptor para el antígeno de los linfocitos
T (TCR) está compuesto de 6 subunidades:
TCR_, TCR`, CD3a, CD3b, CD3¡ y CD3c.
Mientras que las dos primeras son
en el pasado bienio. Hicimos una búsqueda
de ligandos intracelulares de CD3¡ por un
responsables del reconocimiento del
antígeno, las demás están encargadas de
la transmisión de señales al interior celular.
por tirosinas fosforiladas, ya conocidos. Uno
El TCR no actúa como un simple interruptor
sino que es capaz de dar distintas
respuestas dependiendo de ligeras
modificaciones en el antígeno. En nuestro
laboratorio, estamos dedicados al estudio
de los mecanismos que regulan la formación
de este complejo multiproteíco y de cómo
se transmiten las señales de activación al
interior de la célula. En líneas generales,
los objetivos de nuestra línea de
investigación son los siguientes:
Personal Técnico /
Maite Gómez
Toñi Cerrato
Es en este último objetivo dónde hemos
método de dos híbridos con el fin de
encontrar efectores distintos a los reclutados
de los ligandos encontrados fue Nck, un
adaptador implicado en la reorganización
del citoesqueleto de actina. Descubrimos
que la interacción Nck-CD3¡ es importante
para la polimerización de actina inducida
por el TCR y así, un mutante dominantenegativo de Nck la bloquea (figura 1). Pero
lo que es más importante, Nck es reclutado
al TCR de forma inducible en lo que
constituye una prueba de que en este
receptor se produce un cambio
conformacional como mecanismo de
señalización. En el momento presente seguimos investigando sobre el mecanismo de
- Dilucidar la estequiometría del TCR.
- Estudiar los mecanismos de ensamblaje
y retención intracelular.
- Discernir entre los papeles específicos y
redundantes de cada una de las
subunidades del TCR.
Inducción de "spreading" en linfocitos T transfectados con una
construcción dominante negativa para Nck (DN-Nck) o con el vector
vacío (control) y estimulados sobre cubreobjetos recubiertos de
anti-CD3. Las células están teñidas con Texas Red-faloidina que
permite la visualización de F-actina.
44
regulación de la interacción TCR-Nck y en
la caracterización de nuevos ligandos de
CD3¡ y de las demás subunidades.
Signal transduction through the T cell
antigen receptor
Research summary
It is in this last objective where we have
made the most significant progress in the
Gil, D, Gutiérrez, D., Alarcón, B. (2001) Intracellular
The T cell antigen receptor (TCR) is
composed of 6 subunits: TCR_, TCR`,
last two-year period. We made a twohybrid-based screening for intracellular
chain of the T cell receptor complex. J. Biol. Chem. 276,
CD3a, CD3b, CD3¡ and CD3c. While the
first two subunits are responsible for
antigen recognition, the others are
ligands of CD3¡, aiming to find cytoplasmic
¡
redistribution of nucleolin upon interaction with the CD3
11174-11179
effectors different to the well-characterized
tyrosine phosphorylation-dependent
ligands. One of the new ligands was Nck,
Borroto, A., San José, E., Monjas, A., Roumier, A.,
an adapter protein involved in
reorganization of the actin cytoskeleton.
receptor. Inmunologia 20, 119-129
We found that the Nck-CD3¡ interaction
is important for the TCR-induced actin
Teixeiro, E., Fuentes, P., Galocha, B., Alarcón, B.,
to the study of the mechanisms that
polymerization and, thus, a dominant-
transduction controlled by the beta chain transmembrane
regulate the formation of this multiproteic
complex as well as the signal transduction
negative Nck mutant blocked it (figure 1).
But, more important, Nck is recluted to
the TCR in an inducible manner in what
domain: apoptosis-deficient cells display unbalanced
responsible for signal transduction. The
TCR does not act as a simple switch but
is able to produce different responses
depending on slight modifications of the
antigen. In our laboratory we are dedicated
mechanisms. Our general research
objectives are the following:
- To elucidate the stoichiometry of the
TCR.
- To study the mechanisms of assembly
and intracellular retention.
- To investigate the existence of redundant
Gutiérrez, D., Martí, M., Terhorst, C., Alcover, A., Alarcón,
B. (2001) All-or-none downregulation of the T cell antigen
Bragado, R. (2002) T cell receptor-mediated signal
mitogen-activated protein kinases activities upon T cell
receptor engagement. J. Biol. Chem. 277, 3993-4002
constitutes a hallmark of an undergoing
conformational change in the TCR as a
signaling mechanism. We are at present
studying the mechanisms that regulate
the TCR-Nck interaction as well as trying
Sancho D., Montoya M.C., Monjas A., Gordon-Alonso
to characterize further ligands of CD3¡
and other CD3 subunitis.
APC Interface Independently of Pyk2 Activity and in an
and specialized roles in signal
transduction for each TCR subunit.
M., Katagiri T., Gil D., Tejedor R., Alarcon B. SanchezMadrid F.(2002) TCR Engagement Induces Proline-Rich
Tyrosine Kinase-2 (Pyk2) Translocation to the T Cell-
Immunoreceptor Tyrosine-Based Activation MotifMediated Fashion. J. Immunol. 169, 292-300
Gil, D., Schamel, W., Montoya, M., Sánchez-Madrid, F.,
¡
Alarcón, B. (2002) Recruitment of Nck by CD3 reveals
a ligand-induced conformational change essential for T
cell receptor signaling and synapse formation. Cell 109,
901-912
Premios / Awards
Balbino Alarcón fue galardonado con el IX Premio
Carmen y Severo Ochoa en 2002. Balbino Alarcón was
awarded with the IX Carmen and Severo Ochoa Prize
in 2002.
Diana Gil Pagés. 2002. "Caracterización de ligandos
¡
citoplásmicos para la cadena CD3 del TCR implicados
en la activación de linfocitos T". Universidad Autónoma
de Madrid.
Induction of cell spreading in T cells transfected with a dominant negative Nck construct (DN-Nck) or with
empty vector (control) and stimulated on anti-CD3-coated coverslips. Cells were stained with Texas Redphalloidin to visualize F-actin.
45
C.2
Bases moleculares de la patogenia y del
potencial anti-tumoral de los parvovirus
Jefe de Línea/ Group Leader:
José M. Almendral
Juan Carlos Ramírez
Postdoctorales /
Cristina Sánchez
La dependencia de la replicación de los
parvovirus por funciones moduladas por la
proliferación, diferenciación y transformación
celular, confiere a estos virus icosaédricos
de ADN de banda sencilla unas propiedades
biológicas de especial interés. Aspectos
recientes de nuestra investigación con la
especie prototipo del género, el virus
diminuto del ratón (MVM), son los siguientes.
Alberto López-Bueno
Noelia Valle
Patogenia y evolución. La cepa MVMi
induce en ratones inmunodeficientes una
leucopenia severa consecuencia de su
Laura Riolobos
capacidad de infectar precursores
Esther Grueso
Macarena Sierra
hematopoyéticos comprometidos y
primitivos, incluyendo células madre con
potencial de reconstitución hematopoyética
Estudiantes /
de larga duración. El MVM muestra en su
hospedador natural una alta frecuencia de
Elena Merino
mutación sorprendente para un virus ADN,
que permite la selección en un sólo individuo
de variantes virulentos con alteración en la
Graduate Students:
Vanesa Sánchez
Silvia Peñate
José M. Cuesta
Transporte nuclear y morfogénesis. Las
subunidades de proteínas de la cápsida del
MVM forman complejos citoplasmáticos
que se traslocan al núcleo mediante señales
de localización nuclear, localizadas en la
secuencia N-terminal de VP1 y en una
lámina beta de la región común de VP1/VP2.
Mutaciones sencillas en VP1 que alteran el
transporte determinan que estos complejos
formen estructuras anulares subvirales
asociadas a ubiquitina (Figura 2), un
fenómeno que puede participar en la
regulación de la permisividad celular a los
parvovirus. La cápsida de las partículas
virales que maduran en el núcleo está
fosforilada fundamentalmente en tres
serinas del extremo N-terminal de VP2, que
conforman una señal de transporte a través
de la membrana nuclear en células
transformadas.
Oncotropismo. El tropismo del MVM hacia
células de glioblastomas humano lo
unión al receptor primario, y la emergencia
de mutantes patogénicos resistentes a
encontramos regulado a nivel de la
replicación del genoma, y en funciones
desconocidas requeridas para la transmisión
anticuerpos monoclonales en respuesta a
una inmunoterapia pasiva. Los virus
entre células que mapean en la región de
las proteínas no-estructurales. Estamos
resistentes a la neutralización poseen
cambios puntuales de amino ácidos situados
construyendo virus oncotrópicos por
manipulación de estas funciones y de ciertos
dominios expuestos en la superficie de la
en la espícula de la cápsida (Figura 1).
cápsida, para conferir a estos virus una
mayor especificidad por receptores de
células transformadas que pudiera permitir
su uso como vectores selectivos en terapias
anti-cáncer.
Localización de los cambios de amino ácido en la superficie de la cápsida de MVM (en rojo),
que permiten al virus evadir una terapia con anticuerpos neutralizantes en ratones
inmunodeficientes.
Localization of the amino acid changes on MVM capsid surface in red allowing viral evasion
of a neutralizing antibody therapy in immunodeficient mice.
46
Molecular bases of parvovirus pathogenesis
and anti-tumour potential
Research summary
The dependence of parvovirus replication
on functions modulated by proliferation,
differentiation and cellular transformation
confers to these icosahedral singlestranded DNA viruses some biological
properties of special interest. Recent
issues of our research on the type species
of the genus, the minute virus of mice
Nuclear transport and morphogenesis.
Rubio, M.P., Guerra, S., Almendral, J.M. (2001) Genome
The MVM capsid protein subunits form
replication and post-encapsidation functions mapping to
cytoplasmic complexes that are
translocated to the nucleus by nuclear
the non-structural gene restrict the host range of a murine
localization signals placed at the VP1 Nterminal sequence and in a beta strand
of the VP1/VP2 common region. Single
parvovirus in human cells. J. Virol. 75, 11573-11582
Rommelaere, J., Almendral, J.M., Cornelis, J., Nuesbch,
J. (2001) Parvovirus (Parvoviridae, Parvovirinae). En:
mutations disrupting VP1 transport
determine that these complexes form ring-
The Springer Index of Viruses. A. Tidona, G. Darai (ed.)
shaped subviral structures associated to
ubiquitine (Figure 2), a phenomenon that
may participate in the regulation of cell
Lombardo, E., Ramírez, J.C., García, J., Almendral, J.M.
(MVM), are the followings.
Pathogenesis and evolution. The MVMi
strain induces in immunodeficient mice a
severe leukopenia as a consequence of
permissiveness to parvoviruses. The
capsid of the viral particles maturing within
the nucleus is phosphorylated mainly in
virus of mice during assembly and onset of infection. J.
its capacity to infect committed and
three serine residues of VP2 N-terminus,
that conform a signal for the transport of
the virions across the nuclear membrane
of transformed cells.
Alberto López-Bueno. 2002. “Cambios de aminoácidos
primitive hemopoietic precursors, including
stem cells with long-term hemopoietic
reconstitution potential. The MVMi shows
in the natural host a striking high mutant
(2002) Complementary roles of multiple nuclear targeting
signals in the capsid proteins of the parvovirus minute
Virol. 76, 7049-7059
en la superficie de la cápsida del parvovirus MVM
determinan la adaptación, el tropismo y el escape a
frequency for a DNA virus, that allows the
Oncotropism. The MVM tropism toward
anticuerpos neutralizantes, en un hospedador
selection in a single individual of virulent
variants with alteration in the binding to
the primary receptor, and the emergence
human glioblastoma cells was found to
inmunodeficiente”. Universidad Autónoma de Madrid.
be regulated at the level of genome
replication, and by unknown functions
required for intercellular spreading
Noelia Valle Benítez. 2002. “Mecanismos de salida
mapping to the non-structural proteins
por la kinasa Raf-1 en células transformadas humanas”.
passive immunotherapy. The neutralization
resistant viruses harbor punctual changes
region. We are constructing oncotropic
viruses by the manipulation of these
in amino acids placed at the spike of the
capsid (figure 1).
functions as well as certain domains
exposed at the capsid surface, to endow
of pathogenic mutants resistant to
monoclonal antibodies in response to a
these viruses with a higher specificity for
transformed cells receptors that could
allow their use as selective vectors for
anti-cancer therapies.
Conjugación de ubiquitina con proteínas de la cápsida de MVM. El genoma de MVM mutado en la
región N-terminal de VP1 fue transfectado en células permisivas y analizado por microscopía confocal
con (A) un suero anti-cápsida de MVM, y (B) un anticuerpo monoclonal que reconoce ubiquitina
conjugada.
Ubiquitine conjugation to MVM capsid proteins. MVM genome mutated in the VP1 N-terminal region
was transfected in permissive cells and analyzed by confocal microscopy with a (A) MVM capsid
antiserum and (B) a monoclonal antibody recognizing conjugated ubiquitine.
47
nuclear del parvovirus MVM: fosforilación de la cápsida
C.3
Bases moleculares de la citopatología viral
Luis Carrasco
La infección de células animales por virus
produce toda una serie de alteraciones en
numerosas funciones celulares. A lo largo
genómico retroviral es capaz de traducirse
en estas condiciones, debido a la presencia
de una estructura tipo IRES. Se está
analizando si esta capacidad para reconocer
e hidrolizar el eIF4G ocurre también con
las proteasas de otras especies de
Ivan Ventoso
de los años se han descrito numerosas
modificaciones tanto morfológicas como
funcionales en las células infectadas por
virus. Nuestra investigación en estos últimos
de la traducción en células humanas
Graduate Students:
años se ha enfocado hacia el análisis de
los cambios inducidos por la infección viral
de la maquinaria de traducción de los
mRNAs, poniendo especial atención en el
infectadas por miembros de la familia
retroviridae. La estrategia descrita basada
en la modificación del complejo de iniciación
factor de iniciación eIF4G. Por otro lado,
hemos continuado con el estudio de las
proteínas virales conocidas como
del virus más eficaz.
Celia Perales
Carlos Calandria
Raquel Blanco
Enrique Alvarez
Susana Molina
Maria Vanesa Madam
Vanesa Rojas
Alfredo Castelló
Marta Ramos
Patricia García.
viroporinas, que están implicadas en el
aumento de la permeabilidad de la
membrana plasmática que tiene lugar
después de la replicación del genoma viral.
Miguel Angel Sanz
Rebeca Galisteo
Carmen Hermoso
eIF4F conduce a una expresión genética
Las viroporinas. Nuestro grupo propuso
hace años la existencia de esta nueva familia
de proteínas virales, capaces de formar
poros en las membranas de las células
Modificación del factor de iniciación de
la traducción eIF4G. Existen algunas
infectadas. Estas proteínas son de pequeño
tamaño, muy hidrofóbicas, que oligomerizan
e interaccionan con membranas. La función
principal de las viroporinas, aunque no
especies de virus dentro del grupo de los
única, es la de facilitar la salida de las
picornavirus que contienen una proteasa
capaz de hidrolizar el eIF4G en dos mitades,
inactivando a este factor para la traducción
partículas virales de las células infectadas,
aumentando la gemación de los virus que
poseen cubiertas lipídicas. En estos dos
de mRNAs celulares sintetizados de novo.
Se ha pensado que esta hidrólisis era
últimos años hemos asistido a un
retrovirus. Estos estudios abren nuevas
perspectivas en el campo de la regulación
específica de estas especies de
picornavirus. Notablemente hemos
encontrado que el virus VIH, responsable
de causar el SIDA en humanos, utiliza un
mecanismo análogo. La proteasa del VIH
es capaz de hidrolizar el eIF4G en dos
posiciones, dividiéndolo en los tres dominios
funcionales descritos para este factor. Esta
hidrólisis inactiva el eIF4G para traducir los
mRNAs celulares, mientras que el RNA
Dominios y sitios de corte de diversas proteasas sobre el factor de iniciación
de la traducción eIF4G.
Domains and cleavage sites of several virus proteases on the initiation factor
of translation eIF4G.
48
incremento notable en el conocimiento de
este grupo de proteínas por parte de varios
grupos de investigación. Un descubrimiento
de interés ha sido la constatación de la
formación de poros en membranas modelo
por las viroporinas de picornavirus y de
togavirus. Futuros estudios sobre las
viroporinas darán lugar a un mayor
conocimiento de la estructura y función de
esta familia de proteínas virales.
Molecular bases of viral cytopathology
Research summary
Viral infection of animal cells provokes a
variety of alterations in several cell
functions. Throughout the years a number
of morphological and biochemical
modifications have been described in
virus infected cells. Our research in the
last few years has focused in the analysis
of the changes of the translational
machinery that takes place after viral
infection, with particular interest in the
initiation factor of translation eIF4G. On
the other hand, we have continued the
study of viral proteins known as viroporins,
that are involved in the enhancement of
plasma membrane permeability that
occurs after virus genome replication.
Modification of the initiation factor of
translation eIF4G. Some species of
picornaviruses encode a protease able
to bisect eIF4G, inactivating this factor to
This hydrolysis inactivates eIF4G to
translate cellular mRNAs, while the
González, M.E., Carrasco, L. (2001) Human
genomic retroviral RNA is translated due
virus glycoprotein processing and enhances membrane
to the presence of an IRES structure. The
capability of other retroviral PRs to cleave
eIF4G is being tested. These studies open
new perspectives in the field of the
permeabilization. Virology 279, 201-209
regulation of translation in human cells
infected by members of the retroviridae
family. The strategy based in the
modification of the eIF4F complex leads
to a more efficient viral gene expression.
Biochemistry 40, 3589-3600
immunodeficiency virus type 1 Vpu protein affects Sindbis
Irurzun, A., Carrasco, L (2001) Entry of poliovirus into
cells is blocked by valinomycin and concanamycin A.
Sanz, M.A., Carrasco, L. (2001) A Sindibis virus variant
with a deletion in the 6K gene shows defects in
glycoprotein processing and trafficking. Lack of
complementation by a wild-type 6K gene in trans. J. Virol.
The viroporins. Several years ago we
advanced the idea of the existence of this
group of viral proteins, which are able to
form pores at membranes of the infected
75, 7778-7784
cells. These virus- encoded proteins are
cap-dependent translation. Proc. Nat. Acad. Sci. USA
of small size, very hydrophobic, that
oligomerize and interact with membranes.
The main function of viroporins, amongst
98, 12966-12971
others, is to facilitate viral exit, increasing
L. (2002) Antipoliovirus flavonoids from Psiadia dentata.
budding in enveloped viruses. In the last
Antiviral Chemistry and Chemotherapy 12, 283-291
Ventoso, I., Blanco, R., Perales, C., Carrasco, L. (2001)
HIV-protease cleaves eukaryotic factor 4G and inhibits
Robin, V., Irurzun, A., Amoros, M., Boustie, J., Carrasco,
translate de novo synthesized cellular
two years we have witnessed a
mRNAs. It has been thought that this
mechanism only occurred with some
picornavirus species. Notably, we have
significative increase in our knowledge
of this group of proteins carried out by
Agirre, A., Barco, A., Carrasco, L., Nieva, J.L. (2002)
several groups. A notable finding has
formation by non-structural poliovirus 2B protein. J. Biol.
found that the HIV, that causes AIDS in
humans, uses an analogous strategy. The
been to analyze pore formation by
picornavirus and togavirus viroporins in
Chem. 277, 40434-40441
HIV PR has the ability to hydrolyze eIF4G
model membranes. Future work about
viroporins will add further insights in our
understanding of this protein family.
Carrasco, L., Guinea, R., Irurzun, A., Barco, A. (2002)
at two positions, rendering the three
domains described for this factor.
Viroporin-mediated membrana permeabilization: pore
Effects of viral replication on cellular membrane
metabolism and function. In: Molecular Biology of
Picornaviruses. B.L. Semler y E. Wimmer (eds.) ASM
Press, Washington pp. 337 354
Celia Perales Viejo. 2002. "Regulación de la traducción
de los ARNm de gag y env del virus de la
inmunodeficiencia humana”. Universidad Autónoma de
Madrid. Calificación: Apto cum laude.
Carlos Calandria Pérez. “Citotoxicidad de las proteasas
2A y 3C del virus de la polio”. Universidad Autónoma de
Madrid.
Representación esquemática
de las estructuras formadas
por las viroporinas en
membranas biológicas.
Schematic representation of
the structures formed by
viroporins in biological
membranes.
49
C.4
Variabilidad genética de virus RNA
Esteban Domingo
Cristina Escarmís
Postdoctorales /
Antero Airaksinen
Eric Baranowski
Claudia González
El objetivo del grupo es entender la dinámica
de cuasiespecies virales para definir
mecanismos de adaptación de los virus y
diseñar nuevas estrategias para controlar
enfermedades víricas. Empleamos como
modelo el virus de la fiebre aftosa (VFA),
el virus de la coriomeningitis linfocítica del
ratón (VCML), el prototipo de los arenavirus,
y el virus de la inmunodeficiencia humana
tipo-1 (VIH-1).
Antonio Mas
Noemí Sevilla
Eloisa Yuste
Los principales resultados han sido: (i)
Caracterización de la memoria molecular
en cuasiespecies víricas. (ii) Medidas de la
extinción a pesar de una acumulación lineal
de mutaciones. Se ha desarrollado un
modelo teórico que es coherente con los
resultados experimentales obtenidos. En
cambio, mediante mutagenesis
incrementada se obtiene una extinción
eficiente del virus que va acompañada de
aumentos de complejidad de los espectros
de mutantes. La extinción es tanto más
efectiva cuanto menores son la carga viral
y la eficacia biológica del virus. Resultados
sobre extinción de VCML en cultivos
celulares fueron coherentes con los
obtenidos con VFA. (iii) Hemos participado
en un proyecto de colaboración para
seguimiento de cuasiespecies de VIH-1 en
pacientes sometidos a tratamiento
antiretroviral altamente agresivo (HAART).
Armando Arias
frecuencia de extinción de variantes del
VFA al someter el virus bien a acumulación
de mutaciones asociadas a cuellos de
Juan Francisco García Arriaza
botella poblacionales o a mutagenesis
Estos trabajos se han realizado con el apoyo
Mónica Herrera
incrementada mediante análogos de base
mutagénicos, empleados aisladamente o
del Ministerio de Ciencia y Tecnología, la
Graduate Students:
Nicolás Molina
Nonia Pariente
Carmen Martín Ruíz-Jarabo
Saleta Sierra
en combinación con inhibidores antivíricos.
Al someter virus a cuellos de botella
sucesivos se ha documentado un descenso
Estudiantes /
bifásico de valores de eficacia biológica y
una considerable resistencia del VFA a la
Comunidad Autónoma de Madrid, la Unión
Europea y la Fundación FIPSE. El grupo
ha colaborado con varios grupos de
investigación tanto españoles como
extranjeros, cuyas contribuciones se
recogen en la lista de publicaciones.
Yvonne Avalos
Eric Louis Miller
Allyson Norman
Samuel Ojosnegros
Jorge Castro
Mercedes Dávila
Gema Gómez-Mariano
Científicos Visitantes / Visiting
Scientists:
Ana Grande
Saleta Sierra Aragón. 2001. "Caracterización de la respuesta del virus de la
fiebre aftosa a mutagénesis química". Universidad Autónoma de Madrid.
Carmen Martín Ruíz-Jarabo. 2002. "Coevolución de antigenicidad y tropismo
celular del virus de la fiebre aftosa y descripción de memoria genética en
cuasiespecies víricas". Universidad Autónoma de Madrid.
Otras Actividades / Other Activities
Esteban Domingo, Director del CISA-INIA.
Miembro del Consejo Editorial de Virology.
Vocal del Consejo Rector del Instituto Nacional de Investigación y Tecnología
Agraria y Alimentaria (INIA).
Colaborador Honorífico del Departamento de Patología Animal I (Sanidad Animal)
de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid.
50
Genetic variability of RNA viruses
Research summary
The objective of the group is to understand
quasispecies dynamics to define
mechanisms of virus adaptation and to
design new strategies to control viral
disease. As model systems we use footand-mouth disease virus (FMDV),
lymphocytic choriomeningitis virus
(LCMV) and human immunodeficiency
virus type 1 (HIV-1).
The main results have been: (i)
Characterization of quasispecies memory.
(ii) Measurements of frequency of FMDV
extinction associated either with
accumulation of mutations upon serial
bottleneck transfers or to enhanced
mutagenesis by base analogues, used
alone or in combination with antiviral
inhibitors. A bifasic fitness decrease and
a remarkable resistance to extinction have
been observed upon subjecting FMDV to
repeated bottlenecks, despite a linear
accumulation of mutations. A theoretical
model coherent with experimental results
has been developed. In contrast,
enhanced mutagenesis led to efficient
viral extinction, associated with increases
in mutant spectrum complexity. Low viral
load and low fitness favour virus extinction.
Results of extinction of LCMV in cell
culture were in agreement with the results
using FMDV. (iii) We have been involved
in a collaborative project on quasispecies
analyses of HIV-1 samples of patients
Arias, A., Lázaro, E., Escarmís, C., Domingo, E. (2001)
Molecular intermediates of fitness gain of an RNA virus:
characterization of a mutant spectrum by biological and
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These studies have been supported by
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Tecnología, Comunidad Autónoma de
Madrid, Unión Europea and Fundación
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several Spanish and foreign groups, as
reflected in several joint publications.
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amenaza oculta. Equipo Sirius, S. A.
51
C.5
Activación del sistema inmune
Manuel Fresno
Pedro Bonay Miarons
Miguel Angel Iñiguez Peña
La activación del linfocito T induce la
expresión de ciclooxigenasa-2 (COX-2),
implicada en la síntesis de prostaglandinas,
cuya expresión y función en linfocitos T no
habían sido descritas. La inducción de COX2 tiene lugar mediante la activación del
factor de transcripción NFAT. Además, COX-
Postdoctorales /
Iñigo Angulo Barturen
Núria Gironès Pujol
Belén San Antonio de Felipe
Elena Gómez Casero
2 juega un papel importante en la activación
del linfocito T, y está inducida por Cot kinasa
y PCKc que regula la activación
transcripcional de NF-B via PI3K y de NFAT
(Fig1). COX-2 via NFAT juega también un
papel fundamental en angiogénesis y en
metástasis tumoral.
Graduate Students:
Pilar Alcaide Alonso
La infección de linfocitos T por HIV-1 induce
Javier Duque Muñoz
la expresión de iNOS, que sintetiza NO cual
Raquel Grau Simón
activa NF-B y la replicación viral. Además,
la proteína tat de HIV afecta la activación
del linfocito T, uniéndose a los factores de
Carmen Punzón Galvez
Carmen Mª Sánchez Valdepeñas
Virginia Vila del Sol
Elena Maganto García
Camino Menéndez García de la Infanta
Alicia Hidalgo Estévez
transcripción, c-rel y AP-1 impidiendo su
El protozoo Trypanosoma cruzi causa de
la enfermedad de Chagas que cursa con
una inmunosupresión en la fase aguda y
autoinmunidad en la fase crónica. Hemos
caracterizado una mucina, AgC10 de T.
cruzi, responsable de la inhibición de la
transcripción de IL-2 en la fase aguda.
Además, hemos descrito la existencia de
2 mecanismos de inmunosupresión en la
fase aguda, uno mediado por AgC10, y otro
por inducción de células inmunosupresoras
mieloides inmaduras Gr1+Mac1+ que
secretan NO que inhibe la activación T.
Estas se inducen también en infeciones por
Candida. Además, hemos demostrado
claramente que la autoinmunidad juega un
papel importante en la patología de la fase
crónica. Hemos identificado un nuevo
autoantígeno, Cha, que presenta reacción
cruzada con 2 proteínas de T. cruzi. Un
epítopo es reconocido por linfocitos T y otro
por linfocitos B. Además, la transferencia
asociación, conduciendo a una inhibición
de células T autoreactivas es capaz de
inducir patología similar a la causada por
de la transcripción de IL-2.
la infección (Fig2).
Cristina Cacheiro Llaguno
Henar Cuervo Grajal
María Cazorla Plaza
Mª de los Angeles de Chorro y de VillaCeballos
Gema Alcaraz Iglesias
Regulation of NF-kB and NFAT transactivation. Several signals: T cell receptor (TCR)
activation, tumor promoters (TPA), TNF. VEGF, etc, stimulate NF-kB or NFAT nuclear
translocation viaI KK or calcineurin activation respectively. We have found that full
activation of these factors requires the induction of a path way that involves the
Cot/PKCç axis leading to the phosphorylation of the transactivation domains.
Antinflammatory compounds as glucocorticoids and PGJ2 inhibit this path way.
52
Activation of the immune system
Research summary
T cell activation induces cyclooxygenase2 (COX-2) expression, involved in
protaglandin synthesis. COX-2 expression
and function had not been previously
described in T cells. Besides, COX-2 plays
a very important role in T cell activation.
COX-2 induction takes place through
activation of NFAT transcription factor
which in turn is activated by Cot kinase
and PCKc which also regulates
transcriptional activation of NF-B and TNF
via PI3K (Fig1). COX-2 induction via NFAT
also plays an essential role in
angiogenesis and tumor metastasis.
HIV-1 infection of T lymphocytes induce
iNOS expression which synthesize NO
that activates NF-B and viral replication.
Besides, HIV-1 tat protein alters T cell
activation, being able to bind to c-rel and
AP-1 transcription factors, preventing their
association, leading to IL-2 transcription
The protozoan parasite, Trypanosoma
cruzi, causes Chagas’ disease
characterized by immunosupression in
the acute phase and autoimmunity in the
chronic phase. We have characterized
AgC10, a mucin, responsible for the
inhibition of IL-2 transcription in the acute
phase. Besides, we have identified 2
mechanism of immunosuppression: one
mediated by AgC10 and another that
involves the induction of Gr1+Mac1+
immature myeloid cells that secrete NO
that in turns inhibits T cell activation. Those
cells are also induced in other infections,
as Candida. Besides, we have clearly
demostrated the role of autoimmunity in
the pathology of the chronic phase. Thus,
we have identified a new autoantigen,
named Cha, that has crossreactivity with
2 T. cruzi proteins. One crossreactive
epitope is recognized by T cells and the
other by B cells. Adoptive transfer of T
cells to naive recipients causes a disease
similar to infected mice (Fig2).
inhibition.
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91-101
Adoptive transfer of purified T cells from chronically
infected mice triggers myocarditis in syngeneic recipient
naive mice. Key: black arrow, subendocardial
lymphocytic cumulus; black star, limited myocarditis
zone; white star, general edema. Scale bar 1/4 25 mm.
Lara-Pezzi, E., Gómez-Gaviro, Mª V., Gálvez, B.G., Mira,
E., Iniguez, M.A., Fresno, M., Martínez-A, C., Arroyo,
A.G., López-Cabrera, M. (2002) The hepatitis B virus X
protein promotes tumor cell invasion by inducing
membrane-type matrix metalloproteinase-1 and
cyclooxygenase-2 expression. J. Clin. Invest. 110, 18311838
53
C.6
Estabilidad e ingeniería de proteínas víricas
Mauricio García Mateu
Graduate Students:
Roberto Mateo Fernández
Marta del Álamo Camuñas
Aura Carreira Moreno
Nuestra investigación se centra en el estudio
de los determinantes moleculares del
ensamblaje y estabilidad de cápsidas
víricas, utilizando técnicas de ingeniería de
proteínas, y de sus aplicaciones para el
diseño de vacunas y antivirales. Actualmente
llevamos a cabo tres proyectos relacionados,
utilizando como modelos el virus de la fiebre
preparación) han facilitado una estrategia
para intentar la construcción de una cápsida
termoestable de VFA con potencial como
vacuna mejorada.
2) Efecto de inserciones de epítopos
sobre la estabilidad de una cápsida.
Hemos construido cápsidas de MVM que
contienen inserciones peptídicas en los
aftosa (VFA), el virus diminuto del ratón
(MVM) y el virus de la inmunodeficiencia
bucles presumiblemente más tolerantes.
Los resultados (Carreira y col., para ser
enviado) sugieren un papel crítico de incluso
humana (HIV), en colaboración con diversos
grupos, incluyendo los de J.M. Almendral
(CBMSO), J.L. Neira (CBMC) y M.
los bucles más expuestos en el ensamblaje
y estabilidad, que deberá tenerse en cuenta
en el diseño de vacunas quiméricas.
José Luis Neira
Menéndez (IQFR).
Juan Reguera Vidaechea
3) Disección termodinámica de una
(Centro de Biología Molecular y Celular,
Universidad Miguel Hernández)
1) Disección del papel estructural y
funcional de residuos e interacciones
en las interfases entre subunidades de
interfase entre subunidades de la
cápsida. Hemos realizado la primera
disección termodinámica de una interfase
una cápsida. Hemos truncado las cadenas
laterales implicadas en todas o la mayoría
de interacciones entre subunidades de las
proteína-proteína en una cápsida vírica, la
implicada en dimerización de la proteína
cápsidas de VFA o MVM, y analizado los
efectos sobre infectividad y/o ensamblaje
(Del Álamo y col., en preparación) han
revelado la contribución energética de cada
y estabilidad. Los resultados (Mateo y col.,
para ser enviado; Reguera y col., en
residuo y nos ayudan en la construcción
de un inhibidor del ensamblaje de HIV.
Estructura de uno de 12 pentámeros en la cápsida de VFA. Se indican los
residuos interfásicos más críticos para la infectividad (violeta) o tolerantes
a mutación a alanina (verde).
Structure of one of 12 pentamers in the FMDV capsid. Interfacial residues
most critical for infectivity (violet) or tolerant to ala mutation (green) are
indicated.
54
de la cápsida (CA) de HIV. Los resultados
Stability and engineering of viral proteins
Research summary
Research in our group is focused on the
molecular determinants of assembly and
stability of viral capsids using protein
engineering, and on possible applications
for the design of vaccines and antiviral
agents. We are currently undertaking three
related projects using foot-and-mouth
disease virus (FMDV), minute virus of
mice (MVM) and human
immunodeficiency virus (HIV) as models,
of a thermostable FMDV capsid,
potentially useful in the development of
an improved vaccine.
Neira, J.L., Mateu, M.G. (2001) Hydrogen exchange of
the tetramerization domain of the human tumour
suppressor p53 probed by denaturants and temperature.
Eur. J. Biochem. 268, 4868-4877
2) Effect on capsid stability of epitope
insertions. We have engineered MVM
capsids with peptide insertions at the
presumably most tolerant surface loops.
The results (Carreira et al., to be
submitted) suggest a critical role of even
the most exposed loops on assembly and
stability, and the need to compensate for
in collaboration with several groups
including those of J.M.Almendral
(CBMSO), J.L.Neira (CBMC) and
such effects in the design of chimeric
vaccines.
M.Menéndez (IQFR).
3) Thermodynamic dissection of an
interface between capsid subunits.
1) Dissection of the structural and
We have carried out the first
functional role of residues and
interactions at the interfaces between
thermodynamic dissection of a proteinprotein interface involved in assembly of
capsid subunits. We have truncated the
side chains involved in all or most
interactions between subunits in the FMDV
a viral capsid. Analyses of the dimerization
interface of the capsid protein (CA) of HIV
or MVM capsids and assessed their
individual relevance for viral infectivity
the energetic contribution of each residue
to CA stability and dimerization and are
and/or capsid assembly and stability. The
results (Mateo et al., to be submitted;
Reguera et al., in preparation) has led us
of help in the engineering of a modified
(Del Álamo et al., in preparation) revealed
CA domain with strong inhibitory activity
on HIV assembly.
to a strategy to attempt the engineering
Estructura del dominio C-terminal de la proteína CA de HIV. Los residuos en la interfase de dimerización
se indican en colores de acuerdo a su contribución energética a la asociación, de mayor a menor: rojo,
naranja, amarillo, verde. Los residuos en violeta dificultan la dimerización.
Structure of the C-terminal domain of protein CA from HIV. Residues at the dimerization interface are
indicated in colours according to their energetic contribution to association, from highest to lowest.
Residues in violet actuallly impair dimerization.
55
Mateu, M.G. (2002) Equilibrium unfolding of dimeric and
monomeric forms of the C-terminal domain of the HIV1 capsid protein. J.Mol. Biol. 318, 519-531
C.7
Replicación del DNA y ciclo celular
Crisanto Gutierrez
Juan Carlos del Pozo Benito
M. Beatrice Boniotti
María del Mar Castellano Moreno
Bénédicte Desvoyes
Corinne Fründt
María de los Angeles López-Matas
Elena Ramírez-Parra
Graduate Students:
María del Mar Castellano Moreno
Sara Díaz Triviño
La salida y entrada del ciclo celular junto
con la duplicación del material genético y
su coordinación con el ciclo celular son
procesos cruciales para la proliferación
celular y con implicaciones en diferenciación
celular y desarrollo. La estrategia general
de control de las transiciones del ciclo celular
parece estar mecanísticamente conservada
en eucariontes. Sin embargo, existen
diferencias fundamentales en los elementos
reguladores, en especial en organismos
multicelulares. En plantas, que poseen
características únicas de crecimiento y
desarrollo, un balance correcto entre división
celular, diferenciación y desarrollo es
fundamental, ya que la organogénesis es
un proceso post-embrionario.
Sergio Llorens Berzosa
del ciclo celular para producir una variedad
de patrones de crecimiento y desarrollo
(Fig. 2). Trabajamos con la planta modelo
Arabidopsis thaliana que nos permite
realizar abordajes de tipo bioquímico,
molecular, celular, genético y de genómica
funcional, y con los geminivirus.
Recientemente hemos identificado los
complejos CDK/ciclina responsables de la
fosforilación de RBR en G1/S, estudiado la
regulación de los factores E2F a nivel
transcripcional y post-traduccional por el
proteasoma, identificado una serie de genes
regulados por E2F, dilucidado el mecanismo
de reclutamiento del complejo RFC al origen
de replicación de geminivirus por la proteína
de iniciación Rep, y analizado el papel de
proteínas de los complejos pre-replicativos
(CDC6 y ORC) en endoreplicación y durante
el desarrollo.
La reactivación de la división celular
(transición G0/G1) y la iniciación del período
Uno de nuestros mayores retos futuros es
S (transición G1/S) son puntos de control
críticos que integran señales intra- y
entender cómo la regulación de la
proliferación celular se integra con los
Manuela Nájera
extracelulares. Nuestro grupo está
estudiando dos de las principales rutas de
procesos de diferenciación celular,
crecimiento y desarrollo así como cuál es
(UNAM, Mexico)
control a este nivel: la de retinoblastoma
el papel de la ruta de retinoblastoma/E2F/DP
Analilia Arroyo
(RBR)/E2F/DP y las fases iniciales de la
replicación del DNA (Fig. 1), que transducen
señales hormonales y ambientales a través
en diferenciación y en la biología de las
células progenitoras (stem cells).
Nerea Cisneros González
(IB, Cuernavaca, México)
Leyre Agreda
(Universidad de Navarra)
Expresión del gen CDC6 en células proliferantes del meristemo radicular (A; flecha) y endoreplicantes (B; tricomas,
flechas) de Arabidopsis. La división celular y el desarrollo de las hojas de plantas de tipo salvaje (C; flecha) se inhibe
por la expresión ectópica de E2Fc (D; flecha).
Expression of CDC6 gene in proliferating root meristem (A; arrow) and endoreplicating (B; trichomes, arrows)
Arabidopsis cells. Cell division and leaf development in wild type plants (C; arrow) is inhibited by ectopic expression
of E2Fc (D; arrow).
56
DNA replication and cell cycle
Research summary
Cell cycle entry and exit together with
duplication of the genetic material and its
coordination with cell cycle progression
are crucial processes for cell proliferation
with enormous implications in cell
differentiation and development. The
general strategy for controlling cell cycle
transitions seems to be mechanistically
well conserved among eukaryotes.
However, fundamental differences exist
in the regulatory networks, in particular
in multicellular organisms. In plants, with
unique growth and developmental
properties, a correct balance between
cell division, differentiation and
development is crucial since
organogenesis is a continuous post-
environmental signals, through the cell
cycle machinery, to produce a variety of
Castellano, M. M., del Pozo, J. C., Ramirez-Parra, E.,
growth and developmental patterns (Fig.
2). We use the model plant Arabidopsis
of Arabidopsis CDC6 is associated with endoreplication.
thaliana that allows us to combine
biochemical, molecular, cellular, genetic
and functional genomic approaches.
Recently, we have identified the
CDK/cyclin complexes that phosphorylate
RBR at G1/S, studied the regulation of
E2F transcription factors at the
transcriptional and post-translational level
through the proteasome, identified a
collection of E2F-regulated genes,
Brown, S., Gutierrez, C. (2001) Expression and stability
Plant Cell 13, 2671-2686
Boniotti, M. B., Gutierrez, C. (2001) A cell cycle-regulated
kinase activity phosphorylates plant retinoblastoma
protein and contains, in Arabidopsis, a CDKA/cyclin D
complex. Plant J. 28, 341-350
Blanchard, F., Rusiniak, M. E., Sharma, K., Sun, X.-L.,
Todorov, I., Castellano, M. M., Gutierrez, C., Heintz, N.
H., Baumann, H., Burhans, W. C. (2002) Targeting of
initiation of DNA replication by cell death pathways in
mammals and yeast. Mol. Biol. Cell 13, 1536-1549
dilucidated the mechanism to recruit the
RFC complex to the origin of geminivirus
Boniotti, M. B., Griffith, M. E. (2002) Cross-talk between
DNA replication by the initiator protein
Rep, and analyzed the role of components
14, 11-17
cell division cycle and development in plants. Plant Cell
of pre-replication complexes (pre-RC),
such as CDC6 and ORC, in
endoreplication and during plant growth
Sánchez, M. P., Torres, A., Boniotti, M. B., Gutierrez, C.,
embryonic process.
Reactivation of cell division (G0/G1
and development.
Plant. Mol. Biol. 50, 167-175
transition) and initiation of S-phase (G1/S)
are checkpoints that integrate intra-and
One of our major challenges ahead is to
extracellular signals. Our laboratory is
studying two of the main control pathways
at this level: the retinoblastoma
(RBR)/E2F/DP pathway and the initial
stages of DNA replication (Fig. 1), both
of which transduce hormonal and
understand how cell proliferation is
integrated with cell differentiation, cell
Vázquez-Ramos, J. M. (2002) PCNA protein associates
to Cdk-A type protein kinases in germinating maize.
Gutierrez, C. (2002) Strategies for geminivirus DNA
replication and cell cycle interference. Physiol. Plant Mol.
Biol. 60, 219-230
growth and development, as well as what
is the relevance of the RBR/E2F/DP
Gutierrez, C., Martínez-Salas, E. (2002) DNA plant and
pathway for stem cell biology.
London, Nature Publishing Group, pp. 555-564
animal virus replication. Encyclopedia of Life Sciences,
Luque, A., Sanz-Burgos, A., Ramirez-Parra, E.,
Castellano, M. M., Gutierrez, C. (2002) Interaction of
geminivirus Rep protein with replication factor C and its
potential role during geminivirus DNA replication. Virology
302, 83-94
Gutierrez, C., Ramirez-Parra, E., Castellano, M. M., del
Pozo, J. C. (2002) G1 to S transition: more than a cell
cycle engine switch. Curr. Opin. Plant Biol. 5, 480-486
del Pozo, J. C., Boniotti, M. B.., Gutierrez, C. (2002)
Arabidopsis E2Fc functions in cell division and is degraded
by the ubiquitin-SCFAtSKP2 – pathway in response to
light. Plant Cell 14, 3057-3071
María del Mar Castellano Moreno: 2002. “Iniciación de
la replicación del DNA en Arabidopsis: regulación de los
componen tes CDC6, CDT1 y ORC1 del complejo prereplicativo". Universidad Autónoma de Madrid.
Rutas implicadas en la transición
G1/S en Arabidopsis y su
integración con la salida del ciclo
celular.
- Miembro del EMBO Fellowship Committee
- Miembro del Advisory Board de Plant Journal
Pathways involved in the G1/S
transition and their integration with
cell cycle exit.
Simposios organizados /
Symposia organized
- C. Gutierrez, Co-organizer "Cross talk between cell
division and development in plants". Fundación Juan
March, 2001.
57
C.8
Inmunología de los antígenos de histocompatibilidad
Base molecular de la asociación de HLA-
de HLA-B27 que es presentado
selectivamente por los subtipos de este
antígeno asociados a enfermedad. Dicho
B27 con espondiloartritis. Los antígenos
HLA de clase I presentan péptidos derivados
ligando presenta alta homología con una
secuencia de Chlamydia trachomatis, una
del procesamiento proteasómico del
proteoma celular a los linfocitos T citotóxicos.
La supresión de la tolerancia inmunológica
bacteria artritogénica. El correspondiente
José A. López de Castro
Luis Antón
Postdoctorales /
Mercè Martí
Alberto Paradela
Miriam Vázquez
Jesús Yagüe
Graduate Students:
Iñaki Alvarez
Patricia Gómez
Violeta Gómez
Miguel Marcilla
Verónica Montserrat
Manuel Ramos
Laura Sesma
María del Mar de la Torre
hacia péptidos propios, por ejemplo como
consecuencia de una estimulación
antigénica externa, puede desembocar en
autoinmunidad. En nuestro laboratorio se
estudia el posible papel de la presentación
peptídica por HLA-B27 en la patogenia de
la espondilitis anquilosante (EA) y otras
espondiloartropatías. Se han desarrollado
métodos, basados en el análisis estructural
por espectrometría de masas, para el
análisis comparativo de los repertorios
péptido bacteriano se une in vitro a HLAB27 con la misma eficiencia que el ligando
endógeno homólogo y es generado por el
proteasoma 20S a partir de un precursor
sintético con la secuencia de la proteína
bacteriana parental. Estos resultados
demuestran que es posible, a través del
análisis de repertorios peptídicos
endógenos, identificar ligandos naturales
de HLA-B27 que posean las características
esperables de posibles péptidos
artritogénicos.
peptídicos presentados constitutivamente
por subtipos de HLA-B27 asociados
diferencialmente a enfermedad. Estos
Mecanismos de procesamiento
estudios permiten correlacionar la
se inicia la vía de procesamiento de
asociación a EA con subconjuntos de
antígeno. Es entonces cuando tiene lugar
péptidos y definir algunas características
comunes a estos subconjuntos, entre ellas
la presencia de tyrosina C-terminal.
la selección de substratos de esta vía,
siendo el proteasoma la principal proteasa
implicada en este proceso. Nuestro trabajo
Complementariamente a esta aproximación,
se centra en los mecanismos de esta
que persigue la identificación de péptidos
con potencial artritogénico, hemos utilizado
antigénico. La degradación proteolítica en
núcleo y citosol marca el punto en el que
la digestión in vitro de substratos sintéticos
selección, planteándonos el estudio del
papel potencial de estructuras celulares
relacionadas con degradación proteolítica,
con el proteasoma 20S para la predicción
e identificación de ligandos naturales de
así como la identificación de diferentes
proteínas, ya sean chaperonas,
HLA-B27. En el curso de estos estudios se
ha identificado un ligando natural endógeno
cochaperonas u otras proteasas, que
Vista lateral, desde la hélice 2 hacia la hélice 1, del modelo molecular de B*2705
(superficie blanca) en complejo con los péptidos B27 (309-320), en color azul, y
DNA primasa (211-222) de Chlamydia trachomatis, en color amarillo. Se muestran
los residuos de los péptidos que sobresalen de la superficie de B*2705 (Ramos
et al. 2002. J. Biol. Chem. 277: 37573-37581).
Side view, from the 2- towards the 1-helix, of a molecular model of B*2705 (white
in complex with peptides B27 (309-320), blue, and DNA primase (211-222) from
Chlamydia trachomatis, yellow. Protruding peptide residues are indicated (Ramos
et al. 2002. J. Biol. Chem. 277: 37573-37581).
58
regulen este proceso.
Immunology of histocompatibility antigens
Research summary
Molecular basis of the association of
HLA-B27 with spondyloarthritis. HLA
class I molecules present peptides derived
from the proteasomal processing of the
cell proteome to cytolytic T lymphocytes.
Abrogation of immune tolerance towards
selectively presented by diseaseassociated subtypes. This peptide had
high homology with a protein sequence
from Chlamydia trachomatis, an
arthritogenic bacteria. The chlamydial
peptide bound HLA-B27 in vitro with the
same efficiency as its homologous natural
ligand, and was generated by the 20S
self-peptides, for instance as a
consequence of external antigenic
proteasome from a synthetic precursor
with the sequence of the parental bacterial
challenge, may lead to autoimmunity. In
protein. These results show that it is
possible, through the analysis of
endogenous peptide repertoires, to
our laboratory we are addressing the
possible role of HLA-B27-mediated
peptide presentation in the pathogenesis
of ankylosing spondylitis (AS) and other
spondyloarthropathies. We have
developed mass spectrometry-based
methods for the comparative analysis of
peptide repertoires constitutively
identify natural HLA-B27 ligands with
features expected from putative
arthritogenic peptides.
Mechanisms of antigen processing.
Proteolytic degradation in both cytosol
presented for HLA-B27 subtypes
differentially associated to disease. These
studies allowed us to correlate association
and nucleus lies at the core of substrate
selection in the MHC class I antigen
to AS with limited peptide subsets, and
with structural features of these peptides,
constitutes the main source of peptide
substrates supplied to the pathway. Our
such as the presence of C-terminal Tyr.
research is focused on the mechanisms
behind this selection, aiming at both the
Besides this approach, which aims at
identifying putative arthritogenic peptides,
processing pathway. The proteasome
cellular structures involved and the
in vitro digestion of synthetic substrates
with 20S proteasome was used to predict
identification of proteins, such as
molecular chaperones and cochaperones
and identify novel natural ligands of HLA-
or additional proteases, which may
B27. Within these studies, we identified
an endogenous HLA-B27 ligand that was
regulate this process.
Purcell, A.W., Gorman, J. J., García-Peydró, M., Paradela,
A., Burrows, S. R., Talbo, G. H., Laham, N., Peh, C.A.,
Reynolds, E.C., López de Castro, J.A., McCluskey, J.
(2001) Quantitative and qualitative influence of tapasin
on the class I peptide repertoire. J. Immunol. 166, 10161027
Ramos, M., Alvarez, I., García-del-Portillo, F., López de
Castro, J.A. (2001) Minimal alterations in the HLA-B27bound peptide repertoire induced upon infection of
lymphoid cells with Salmonella typhimurium. Arthritis
Rheum. 44, 1677-1688
Reinelt, S., Martí, M., Dédier, S., Reitinger, T., Folkers,
G., López de Castro, J.A., Rognan D. (2001) -amino acid
scan of a class I MHC-restricted alloreactive T-cell epitope.
J. Biol. Chem. 276, 24525-24530
Alvarez, I., Sesma, L., Marcilla, M., Ramos, M., Martí,
M., Camafeita, E., López de Castro, J.A. (2001)
Identification of novel HLA-B27 ligands derived from
polymorphic regions of its own or other class I molecules
based on direct generation by 20S proteasome. J. Biol.
Chem. 276, 32729-32737
Yagüe, J., Marina, A., Vázquez, J., López de Castro, J.A.
(2001) Major Histocompatibility Complex class I molecules
bind natural peptide ligands lacking the amino-terminal
binding residue in vivo. J. Biol. Chem. 276, 43699-43707
Alvarez, I., Martí, M., Vázquez, J., Camafeita, E., Ogueta,
S., López de Castro, J.A. (2001) The Cys-67 residue of
HLA-B27 influences cell surface stability, peptide
specificity, and T-cell antigen presentation. J. Biol. Chem.
276, 48740-48747
Martí, M., Alvarez, I., Montserrat, V., and López de Castro,
J.A. (2001). Large sharing of T-cell epitopes and natural
ligands between HLA-B27 subtypes (B*2702 and B*2705)
associated with spondyloarthitis. Tissue Antigens 58,
351-362
Antón L. C., Bennink J. R., Yewdell J. W. (2001) Use of
proteasome inhibitors to examine processing of antigen
for MHC class I presentation. In: Antigen Processing and
Presentation Protocols, (Methods in Molecular Biology,
v. 156). Ed. J.C.Solheim. Humana Press, Totowa, NJ,
USA. pp. 17-31
Iñaki Alvarez Pérez. 2001. "Generación proteasómica
de ligandos naturales de HLA-B27 y modulación del
repertorio peptídico por posibles factores patogenéticos".
Sesma, L, Montserrat, V., Lamas, J. R., Marina, A.,
Vázquez, J., López de Castro, J.A. (2002) The peptide
repertoires of HLA-B27 subtypes differentially associated
to spondyloarthropathy (B*2704 and B*2706) differ by
specific changes at three anchor positions. J. Biol. Chem.
277, 16744-16749
Ramos, M., Paradela, A., Vázquez, M., Marina, A.,
Vázquez, J., López de Castro, J.A. (2002) Differential
association of HLA-B*2705 and B*2709 to ankylosing
spondylitis correlates with limited peptide subsets but
not with altered cell surface stability. J. Biol. Chem. 277,
28749-28756
Ramos, M., López de Castro, J.A. (2002) HLA-B27 and
the pathogenesis of spondyloarthritis. Tissue Antigens
60, 191-205
Microscopía electrónica de transmisión (x15000) de
células linfoides C1R-B*2705 infectadas con
Salmonella typhimurium. Las bacterias se observan
como cuerpos oscuros, rodeados de membranas
vacuolares (Ramos et al. 2001. Arthritis Rheum. 44:
1677-1688).
May, E., Dulphy, N., Frauendorf, E., Duchmann, R.,
Bowness, P., López de Castro, J. A., Toubert, A., MärkerHermann, E. (2002) Conserved TCR chain usage in
reactive arthritis. Evidence for selection by a putative
HLA-B27-associated autoantigen. Tissue Antigens 60,
299-308
Transmission electron microscopy (x 15000) of the
lymphoid C1R-B*2705 cells infected with Salmonella
typhimurium. The bacteria are observed as dark
bodies surrounded by vacuolar membranes (Ramos
et al. 2001. Arthritis Rheum. 44: 1677-1688).
Ramos, M., Alvarez, I., Sesma, L., Logean, A., Rognan,
D., López de Castro, J.A. (2002) Molecular mimicry of
an HLA-B27-derived ligand of arthritis-linked subtypes
with chlamydial proteins. J. Biol. Chem. 277, 3757337581
59
C.9
Enzimas retrovirales: análisis estructural y
funcional de la retrotranscriptasa del virus de
la inmunodeficiencia humana
podido demostrar el papel que juega la Tyr-
El virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH) es un retrovirus que infecta
115 en la discriminación entre
ribonucleótidos (rNTPs) y dNTPs, y también
su influencia sobre la fidelidad de copia de
preferentemente a células del sistema
la enzima. Nuestros trabajos han puesto
Graduate Students:
inmune, y provoca el síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA).
de manifiesto el papel de otros residuos,
como la Met-230, situados fuera del sitio
Actualmente, el tratamiento de la infección
por el VIH en países desarrollados implica
la utilización de inhibidores de enzimas
de unión del dNTP y que también
contribuyen de forma importante a la
virales como la retrotranscriptasa (RT) y la
proteasa. Estos fármacos han mostrado
una gran eficacia clínica pero la aparición
de virus resistentes, la existencia de
potencialmente útiles para el diseño de
nuevas estrategias y fármacos
antirretrovirales.
reacciones cruzadas entre ellos y los efectos
secundarios que producen son factores que
hipotecan su utilidad a largo plazo.
Otros proyectos en curso tienen como
objetivo la caracterización bioquímica de
Luis Menéndez Arias
Clara E. Cases González
Tania Matamoros Grande
Blanca Mª Vázquez Álvarez
César Garriga Fuentes
La retrotranscriptasa del VIH es una enzima
clave en la replicación del RNA que
fidelidad de la enzima. Estos estudios son
variantes de la RT de relevancia clínica.
Por ejemplo, RTs portadoras de inserciones
que exhiben resistencia a múltiples
constituye el material genético del virus.
Se trata de una enzima heterodimérica, que
fármacos antirretrovirales, y cuyo
mecanismo de resistencia demostramos
en estudios previos; o RTs resistentes a
posee actividad DNA polimerasa
nevirapina y otros inhibidores no
dependiente de RNA y de DNA, además
nucleosídicos, que aparecen en aislados
del VIH-1 de grupo O y que se encuentran
de actividad endonucleasa (ribonucleasa
H). Nuestro trabajo se ha centrado en el
análisis del papel que juegan distintos
aminoácidos del sitio de unión de
alejadas filogéneticamente de las variantes
predominantes en Europa y Norteamérica.
desoxirribonucleótido (dNTP) en la reacción
Junto a estos estudios, nuestro grupo está
de síntesis de DNA, con particular énfasis
en el estudio de los determinantes
implicado en la puesta a punto de una Base
de Datos de secuencias de virus de
moleculares de la especificidad de
nucleótido. Fruto de estos estudios hemos
pacientes infectados por el VIH y tratados
en hospitales españoles.
Estructura cristalográfica de la retrotranscriptasa del VIH-1.
Crystal structure of HIV-1 reverse transcriptase.
60
Retroviral enzymes: structural and functional
analysis of human immunodeficiency virus
reverse transcriptase
Research summary
have shown that Tyr-115 plays a critical
role in discrimination between
The human immunodeficiency virus (HIV)
is a retrovirus that infects cells of the
immune system, and causes the acquired
ribonucleotides (rNTPs) and dNTPs, and
also influences the copying fidelity of the
RT. In addition, the role of residues
immunodeficiency syndrome (AIDS).
Nowadays, treatment of HIV-infection in
developed countries involves the use of
outside of the dNTP-binding pocket (e.g.
Met-230) in fidelity of DNA synthesis has
also been demonstrated. These studies
inhibitors of retroviral enzymes such as
are potentially useful for the design of
novel therapeutic strategies and
the reverse transcriptase (RT) and the
protease. These drugs have been rather
successful in the clinic, but the emergence
of resistant viruses, the observed crossreactivity between the inhibitors, and
unwanted secondary effects are major
antiretroviral drugs.
Other current projects include the
biochemical characterization of clinicallyrelevant variant RTs. For example,
hurdles towards their long-term efficacy.
multidrug-resistant RTs carrying a twoamino acid insertion in their “fingers”
The HIV reverse transcriptase plays a
subdomain, whose resistance mechanism
was elucidated in our laboratory; or
pivotal role in the replication of the viral
genomic RNA. It is a heterodimeric
enzyme that possesses RNA- and DNA-
nevirapine-resistant RTs found in group
dependent DNA polymerase activity as
well as endonuclease (ribonuclease H)
O HIV-1 variants, which are viruses
phylogenetically distant from those
predominant in Europe and North
activity. Our recent work has been
America.
devoted to the analysis of the role of
different residues that form the
Together with those studies, our group is
deoxynucleotide (dNTP)-binding site in
the DNA synthesis reaction, with particular
emphasis on their role in determining the
also involved in the establishment of a
Database collecting nucleotide sequences
of HIV clinical isolates from patients
nucleotide specificity of the enzyme. We
treated in Spanish hospitals.
Menéndez-Arias, L., Abraha, A., Quiñones-Mateu, M.E.,
Mas, A., Camarasa, M.-J., Arts, E.J. (2001) Functional
characterization of chimeric reverse transcriptases with
polypeptide subunits of highly divergent HIV-1 group M
and O strains. J. Biol. Chem. 276, 27470-27479
Zakharenko, A.L., Kolpashchikov, D.M., Khodyreva, S.N.,
Lavrik, O.I., Menéndez-Arias, L. (2001) Investigation of
the dNTP-binding site of HIV-1 reverse transcriptase
using photoreactive analogs of dNTP. Biochemistry
(Moscow) 66, 999-1007
Gutiérrez-Rivas, M., Menéndez-Arias, L. (2001) A
mutation in the primer grip region of HIV-1 reverse
transcriptase that confers reduced fidelity of DNA
synthesis. Nucleic Acids Res. 29, 4963-4972
Quiñones-Mateu, M.E., Tadele, M., Parera, M., Mas, A.,
Weber, J., Rangel, H.R., Chakraborty, B., Clotet, B.,
Domingo, E., Menéndez-Arias, L., Martínez, M.A. (2002)
Insertions in the reverse transcriptase increase both
drug resistance and viral fitness in a human
immunodeficiency virus type 1 isolate harboring the
multi-nucleoside reverse transcriptase inhibitor resistance
69 insertion complex mutation. J. Virol. 76, 10546-10552
Mas, A., Vázquez-Álvarez, B. M., Domingo, E., MenéndezArias, L. (2002) Multidrug-resistant HIV-1 reverse
transcriptase: Involvement of ribonucleotide-dependent
phosphorolysis in cross-resistance to nucleoside analogue
inhibitors. J. Mol. Biol. 323, 181-197
Domingo, E., Mas, A., Yuste, E., Pariente, N., Sierra, S.,
Gutiérrez-Rivas, M., Menéndez-Arias, L. (2001) Virus
population dynamics, fitness variations and the control
of viral disease: an update. En: Jucker, E. (ed.) Progress
in Drug Research., vol. 57. Birkhäuser-Verlag, Basilea
(Suiza), págs. 77-115
Menéndez-Arias, L., Domingo, E. (2002) Amino acid
substitutions associated with resistance to HIV-1 reverse
transcriptase, protease inhibitors, and other antiretroviral
drugs. En: Clotet, B., Menéndez-Arias, L., Ruiz, L., Tural,
C., Brun-Vezinet, F., Loveday, C., Burger, D., Schapiro,
J., Boucher, C., D’Aquila, R., Richman, D.D. (eds.) Guide
pharmacokinetics of antiretroviral therapy, 2ª Edición.
Editorial Taisa, S.L., Barcelona, España, págs. 37-112
Menéndez-Arias, L. (2002) Sensitivity to reverse
transcriptase and protease inhibitors of recombinant HIV
clones harboring resistance mutations: In vitro studies.
En: Clotet, B., Menéndez-Arias, L., Ruiz, L., Tural, C.,
Brun-Vezinet, F., Loveday, C., Burger, D., Schapiro, J.,
Boucher, C., D’Aquila, R., Richman, D.D. (eds.) Guide
pharmacokinetics of antiretroviral therapy, 2ª Edición.
Editorial Taisa, S.L., Barcelona, España, págs. 113-202
Menéndez-Arias, L., Martínez-Picado, J., Domingo, E.
(2002) Drug resistance-associated mutations and their
effects in viral fitness. En: Clotet, B., Menéndez-Arias,
L., Ruiz, L., Tural, C., Brun-Vezinet, F., Loveday, C.,
Burger, D., Schapiro, J., Boucher, C., D’Aquila, R.,
Richman, D.D. (eds.) Guide to management of HIV drug
resistance and pharmacokinetics of antiretroviral therapy,
2ª Edición. Editorial Taisa, S.L., Barcelona, España,
págs. 203-222.
Localización estructural de la Tyr-115 y la Met-230 en relación al sitio de unión del dNTP, en el complejo
ternario formado por la retrotranscriptasa, el dNTP entrante y un molde-iniciador DNA/DNA.
Structural location of Tyr-115 and Met-230 within the dNTP-binding pocket of HIV-1 reverse transcriptase
in the ternary complex containing a DNA/DNA template-primer.
Menéndez-Arias, L. (2002) Molecular basis of fidelity of
DNA synthesis and nucleotide specificity of retroviral
reverse transcriptases. Prog. Nucleic Acids Res. Mol.
Biol. 71, 91-147
Menéndez-Arias, L. (2002) Targeting HIV: Antiretroviral
therapy and development of drug resistance. Trends
Pharmacol. Sci. 23, 381-388
61
C.10
Regulación de la expresión génica en
endotelio vascular
Juan Miguel Redondo
Nuestro interés científico se centra en el
estudio de la regulación de la expresión
génica en la activación de células
Eva Cano
endoteliales.
Antonio Rodríguez
exportación al citoplasma. La efectividad
de algunas drogas inmunosupresoras que
inhiben la actividad de calcineurina proviene
de su acción inhibitoria de NFAT. La
disección de los mecanismos de regulación
de NFAT permitirían desarrollar estrategias
para reemplazar estos inmunosupresores
En estos modelos celulares estamos
analizando los mecanismos que integran
la transducción de señales extracelulares
por drogas con menores efectos
secundarios.
con la activación de factores de
transcripción, a su vez encargados de
regular programas específicos de inducción
En células endoteliales estamos analizando
Inmaculada Ortega
génica. Parte de nuestros objetivos están
dirigidos al estudio de la regulación de la
Antonio J Quesada.
familia de factores de transcripción NFAT.
respuesta a VEGF (factor de crecimiento
del endotelio vascular), un potente factor
mitogénico y angiogénico. Recientemente
Esta familia está implicada en procesos de
importancia biológica tales como activación
hemos determinado que la respuesta
endotelial a VEGF conduce a la activación
de NFAT, lo que se requiere para la
Postdoctorales /
Arantzazu Alfranca
Sara Martínez
Graduate Students:
Dolores López
Felipe Were
las rutas de señalización y el papel de
distintos factores de transcripción en la
linfocitaria, morfogénesis de válvulas
cardiacas y en el desarrollo de sinapsis. Al
menos 4 miembros de la familia residen en
expresión de Ciclooxigenasa-2 y que la
inhibición de NFAT por Ciclosporina A
el citoplasma en células en reposo y se
por VEGF. Estos resultados nos han
conducido a investigar el efecto de
eicosanoides y NFAT en modelos in vitro e
translocan al núcleo en respuesta a
aumentos intracelulares de calcio, en un
proceso que conlleva la desfosforilación de
produce inhibición selectiva de angiogénesis
NFAT mediada por calcineurina. Al cesar
las señales de calcio, quinasas nucleares
in vivo de patologías que cursan con
neovascularización mediada por VEGF,
actualmente en estudio en nuestro
poco caracterizadas median su re-
laboratorio.
62
Regulation of gene expression in vascular
endothelium
Research summary
substituted. These mutants are now being
Hernández, G. L., Volpert, O. V., Iñiguez, M. A., Lorenzo,
E., Martínez-Martínez, S., Grau, R., Fresno, M., Redondo,
We are investigating the mechanisms that
couple extra-cellular signals to the
used in transient transfection experiments
to define the influence of individual
phosphorylated residues on the
activation of the transcription factors that
transactivating activity and subcellular
roles of the nuclear factor of activated T cells and
regulate specific programmes of gene
induction during endothelial cell activation.
localization of NFAT family members. The
effectiveness of immunosuppressive
cyclooxygenase 2. J. Exp. Med. 193, 607-620
drugs that inhibit calcineurin arises from
their blockade of NFAT. This research
programme is allowing us to dissect the
Lorenzo, E., Ruiz-Ruiz, C., Quesada, A.J., Hernández,
Our efforts are directed towards the study
of NFAT (nuclear factor of activated Tcells). NFAT is implicated in such important
biological processes as lymphocyte
activation, heart valve morphogenesis,
mechanisms of NFAT regulation, and
carries with it the potential for developing
strategies to replace drugs in current use
expression in human primary endothelial cells through
and the development of synaptic
connections. Members of this large family
that have unwanted side effects.
of transcription factors are activated by
We are also investigating signalling
Rodríguez, A. (2002) Transcription initiation sites and
the calcium-sensitive phosphatase
calcineurin, Deactivation is effected by
poorly-defined nuclear kinases that
pathways and transcription factors
activated by VEGF (vascular endothelial
growth factor), potent mitogenic and
promoter structure of the human TRAIL-R3 gene. FEBS
rephosphorylate NFAT and initiate its
return to the cytosol. There is strong
evidence to support a role for MAP
angiogenic agent. We recently
Carretero, M., Gómez-Gonzalo, M., Lara-Pezzi, E.,
demonstrated that activation of NFAT is
required for VEGF–induced expression
Benedicto, I., Aramburu, J., Martínez-Martínez, S.,
kinases in these processes, including our
of Cyclooxygenase-2. As COX-2 activity
Hepatits B virus X protein binds to and activates the
previous work that demonstrated a
plays an important role in angiogenesis,
we are studying the actions of eicosanoids
NH2-termial transactivation domain of nuclear factor of
physical association of p38 MAPK with
NFAT. We are using mass spectrometry
and phospho-peptide mapping to identify
NFAT residues phosphorylated by kinases
such as p38 and JNK. We have generated
J. M. (2001) Selective inhibition of vascular endothelial
growth factor-mediated angiogenesis by cyclosporin A:
G., Rodríguez, A., López-Rivas, A., Redondo, J.M. (2002)
Doxorubicin induces apoptosis and CD95 gene
a p53-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 17,1088310892
Ruiz de Almodóvar, C., López-Rivas, A., Redondo, J.M.,
Lett. 531, 304-308
Redondo, J.M., and López-Cabrera, M. (2002) The
activated T-cells-1. Virology 299, 288-300
and NFAT in in vitro and in vivo models
of angiogenesis and pathologies
Urzainqui, A., Serrador, J.M., Viedma, F., Yáñez-Mó, M.,
characterised by neovascularisation
Rodríguez, A., Corbí, A.L., Alonso-Lebrero, J.L., Luque,
mediated by VEGF.
A., Deckert, M., Vázquez, J., Sánchez-Madrid, F. (2002)
mutants in which these residues are
ITAM-based interaction of ERM proteins with Syk
mediates signaling by the leucocyte adhesion receptor
PSGL-1. Immunity 17, 1-20
Elisa Lorenzo Álvarez. 2002. “Estudio de la regulación
transcripcional de genes en respuesta a VEGF y
Doxorrubicina en células endoteliales. Efecto apoptótico
de Doxorrubicina”. Universidad Autónoma de Madrid.
Premios / Awards
Juan Miguel Redondo: Premio Iñigo Alvarez de Toledo
2002 a la Investigación Básica.
63
C.11
Desarrollo del sistema
Miguel Angel Rodríguez Marcos
El sistema hematopoiético adulto se
Postdoctorales /
Gracia Morales Kucharski
Ana Izcue Castellví
Becario Predoctoral /
Graduate Student:
Susana Minguet García
mantiene en un equilibrio dinámico entre
la diferenciación de células tronco
inician la diferenciación linfoide B, y una
población de precursores B-específicos es
detectable. Dichos precursores son
fácilmente establecidos in vitro en cultivos
multipotenciales y el recambio celular de
los estadios maduros. En el embrión
estromales + IL7 a largo plazo, donde
maduran a linfocitos B maduros y secretores
de Igs y, lo que es más interesante, pueden
reconstituir el sistema adulto B funcional.
postgastrulación, los progenitores
hematopoiéticos emergen de novo de
hemangioblastos y/o endotelios
(B) En el SV inicial, además de los eritrocitos
nucleados y células mieloides, existen
hemogénicos, y experimentan altas tasas
de proliferación/expansión en nichos
primarios (saco vitelino –SV- y
pequeñas poblaciones de eritrocitos adultos,
megacariocitos, mastocitos y progenitores
de microglia. Estamos caracterizando una
esplanchnopleura paraaórtica –P/Sp-) y
nueva población de precursores T/NK que
emerge in situ a día 9 de la gestación del
ratón,, y que podría ser relevante en el
secundarios (hígado, bazo, sangre).
Investigaciones recientes, incluidas de
nuestro grupo, han establecido un escenario
con dos compartimientos autónomos (SV,
establecimiento de la tolerancia madre-feto.
P/Sp) que dan lugar a una onda transitoria
(C) El hígado es la estación central de la
de mieloeritropoiesis embrionaria y a la
linfohematopoiesis definitiva,
respectivamente. En condiciones
hematopoiesis fetal, donde conviven
precursores hepatoepiteliales que generarán
experimentales, sin embargo, ambos tipos
en respuesta a señales del microambiente.
Estamos interesados en los mecanismos
progenitores linfohematopoiéticos de origen
extrínseco. Hemos caracterizado una nueva
población de progenitores hepatoepiteliales
bipotenciales (c-KitdullCD45-TER119-),
capaces de diferenciarse in vitro en sistemas
genéticos y celulares que condicionan los
específicos. Co-cultivos de progenitores de
destinos celulares de progenitores
embrionarios, así como en evaluar sus
potenciales de regeneración in vivo.
ambos sistemas revelan la existencia de
de progenitores pueden expresar un amplio
espectro de potenciales de diferenciación,
hepatocitos y células biliares, con
influencias mutuas, a través de interacciones
celulares directas y factores solubles
(A) Los primeros tres días del desarrollo
específicos (SCL, OSM, HGF, etc.). Estamos
explorando el posible papel de estos
linfoide B. Un día después de su
progenitores embrionarios en modelos de
especificación, las células tronco de la P/Sp
regeneración hepática in vivo.
Organización celular del desarrollo de novo, recambio celular
y regeneración tras daño tisular.
64
Embryonic development of the
Research summary
of B-restricted precursors is detected.
These cells are easily established in vitro
Izcue, A., Morales, G., Minguet, S., Sánchez-Movilla, A.,
In the adult steady state, the
hematopoietic complex is balanced
between the differentiation of
on long-term stromal cell cultures + IL7,
Both B and TCR ab+ lymphocytes regulate superantigen-
where they mature to functional, Igsecreting B lymphocytes and, more
dependent selection of TCR _`+ lymphocytes in an
hematopoietic stem cells and the mature
cell turnover. In the postgastrulation
embryo, hematopoietic progenitors
interestingly, they are able to reconstitute
an efficient B-cell compartment in the
adult.
31, 2811- 2817
emerge de novo from hemangioblasts
Martínez, J.A., Gaspar, M.L., Marcos, M.A.R. (2001)
opposite and complementary manner. Eur. J. Immunol.
Martínez, J.A., Minguet, S., Gonzalo, P., Soro, P.G., De
Andrés, B., Ízcue, A., Marcos, M.A.R., Gaspar, M.L.
and/or hemogenic endothelia, and show
high rates of proliferation/expansion in
2) Besides the nucleated erythroid and
myeloid cells, other subsets of adult
(2001) Long-lived polyclonal B-cell lines derived from
primary (yolk sac –YS- and paraaortic
splanchnopleura –P/Sp-) and secondary
niches (liver, spleen, blood). Recent
findings from our and other groups have
erthrocytes, megakaryocytes, mast cells
progenitors reconstitute adult immunodeficient mice.
and microglial precursors are present in
the starting YS. We are characterizing a
Blood 98, 1862-1871
novel population of T/NK precursors
emerging in situ at day 9 of gestation that
De Andrés, B., Gonzalo, P., Minguet, S., Gómez Soro,
could be relevant for the establishment
The first three days of B cell development in the mouse
of the mother/fetus tolerance.
embryo. Blood 100, 4073- 4081
3) The liver becomes the central organ
Tesis Doctoral / Doctoral Theses
defined a scenario with two autonomous
compartments (YS, P/Sp) giving rise to
both the transient wave of embryonic
myeloerythropoiesis and definitive
lymphohematopoiesis, respectively. In
experimental conditions, however, both
midgestation mouse embryo lymphohematopoietic
P., Martínez, J.A, Marcos, M.A.R., Gaspar, M.L. (2002)
of fetal hematopoiesis. There,
types of progenitors can express a wider
spectrum of differentiation potentials in
hepatoepithelial precursors for both
Susana Minguet García. 2002. “Una población de células
hepatocytes and biliary cells are intimately
tronco-hepáticas en los estadios iniciales de la
response to microenvironment-derived
linked to extrinsic hematopoietic
progenitors. We have characterized a
novel population of hepatoepithelial
bipotential progenitors (c-KitdullCD45TER119-) that differentiate in vitro. Co-
morfogénesis del hígado embrionario de ratón”.
signalings. We are interested in the
dissection of the genetic and cellular
mechanisms constraining the cell fates
of embryonic progenitors, as well as in
elucidating their in vivo regeneration
potentials.
1) The first three days of B cell
development. One day after the
specification of P/Sp hematopoietic
progenitors, their differentiation to B-cell
lineages begins, and a small population
cultures of both types of liver progenitors
have revealed processes of
hematopoietic/hepatoepithelial cross-talk
through direct cell interactions and soluble
factors (SCL, OSM, HGF, etc.). We are
exploring the putative role of these
embryonic hepatoepithelial progenitors
in in vivo hepatic regeneration.
Hepatocitos y células biliares en la
diferenciación in vitro de progenitores
embrionarios. (A) Hepatocitos secretores de
glucógeno (tinciones de PAS); (B) Expresión
de citoqueratinas (8, 18, 19) y albúmina en
precursores comunes (CK19+ALB*,
amarillos), hepatocitos (CK19-ALB+, verdes)
y colangiocitos (CK19+ALB-, rojos).
65
Universidad Autónoma de Madrid, Fac. de Ciencias.
C.12
Virus de la peste porcina africana
María Luisa Salas
formación del dominio central del virus
(“core”), constituido por el nucleoide que
Uno de los objetivos de nuestra línea es el
estudio del sistema de reparación del DNA
del virus de la peste porcina africana
contiene el DNA y el dominio intermedio
Yolanda Revilla
(VPPA), que puede ser esencial para el
mantenimiento de la integridad del genoma
viral en el ambiente oxidativo y
en la poliproteína pp220, uno de los
componentes mayoritarios del dominio
intermedio. La represión de la síntesis de
Javier M. Rodríguez
potencialmente genotóxico del macrófago.
Postdoctorales /
El sistema de reparación por excisión de
bases (BER) del VPPA está constituido por
la pp220 en este sistema tiene un efecto
dramático sobre la morfogénesis del virus,
generándose cápsidas vacías, que carecen
José Salas
Ángel L. Carrascosa
Alí Alejo
Germán Andrés
Ramón García
Graduate Students:
Carolina Epifano
Aitor González
Javier Gutiérrez
Carolina Hurtado
Irene Rodríguez
una AP endonucleasa, una DNA polimerasa
reparativa, designada pol X, y una DNA
ligasa. La fidelidad de inserción de la pol X
es comparable a la de la DNA polimerasa
beta reparativa humana, lo que apoya su
participación en la reparación de un daño
en el DNA viral debido a alteraciones en
María Luisa Nogal
del “core” central. Estas estructuras, que
no son infectivas y que contienen los
determinantes antigénicos presentes en la
capa externa de la partícula viral, podrían
constituir una herramienta útil para el
desarrollo de una vacuna eficaz contra la
peste porcina africana, así como para el
las bases. Por otra parte, la actividad liasa
que posee la pol X sobre intermedios
reparativos que contienen un sitio abásico
diagnóstico de la enfermedad.
sugiere la existencia de una ruta alternativa
para el BER viral.
los mecanismos que utiliza el virus para
controlar la apoptosis y la respuesta inmune
Nuestros estudios tienen también como
finalidad comprender los procesos de
del huésped. Nuestros estudios indican que
la apoptosis se induce durante la
desencapsidación del virus y que no se
ensamblaje de la partícula viral y los
mecanismos implicados en la diseminación
requiere la replicación de éste para activar
el proceso apoptótico. Hemos demostrado,
del virus. Utilizando un recombinante del
por otra parte, que el gen viral homólogo
VPPA que expresa induciblemente la
proteína de la cápsida p14.5, hemos
demostrado que esta proteína es necesaria
al IAP celular, además de bloquear la
activación de la caspasa-3, activa al NFkB
para la diseminación del virus, estando
implicada en el transporte mediado por
microtúbulos del VPPA desde las factorías
kinasa (IKK). Esto representa una nueva
estrategia para evadir la respuesta del
huésped, no descrita previamente para
virales hasta la membrana plasmática. La
otros virus animales.
Technical Assistance
María José Bustos
que rodea a éste, se investigó
caracterizando un recombinante inducible
Microscopía electrónica del VPPA. (A) Viriones maduros intracelulares. (B) Cápsidas vacías generadas en
células infectadas con el virus recombinante v220i inducible en la poliproteína pp220, en condiciones restrictivas.
c, cápsida; ie, envuelta interna; cs, dominio intermedio; n, nucleoide.
Electron microscopy of ASFV. (A) Intracellular mature virions. (B) Empty capsids generated in cells infected with
the recombinant virus v220i inducible in polyprotein pp220, under restrictive conditions. c, capsid; ie, inner
envelope; cs, core shell; n, nucleoid.
66
Otro objetivo de nuestro trabajo es investigar
mediante la inducción de actividad IkB
African swine fever virus
Research summary
constituted by the DNA-containing
Andrés, G., Alejo, A., Simón-Mateo, C., Salas, M. L.
nucleoid and the core shell that surrounds
(2001) African swine fever virus protease: A new viral
One objective of our research line is the
study of the African swine fever virus
(ASFV) DNA repair system, which may
it, was investigated by characterizing a
recombinant inducible in polyprotein
pp220, one of the main components of
member of SUMO-1-specific protease family. J. Biol.
be essential to maintain the integrity of
the viral genome in the oxidative and
potentially genotoxic environment of the
the core shell. Repression of pp220
synthesis using this system causes a
dramatic effect on virus morphogenesis,
Nogal, M. L., González de Buitrago, G., Rodríguez, C.,
macrophage. The ASFV base excision
with the generation of “empty capsids”
lacking the virus core. These structures,
caspase activation and promotes cell survival in
repair (BER) system is constituted by an
AP endonuclease, a reparative DNA
Chem. 276, 780-787
Cubelos, B., Carrascosa, A. L., Salas, M. L., Revilla, Y.
(2001) African swine fever virus IAP homologue inhibits
mammalian cells. J. Virol. 75, 2535-2543
which are non-infectious and contain the
polymerase, designated pol X, and a DNA
ligase. The insertion fidelity of pol X is
comparable to that of the human
reparative DNA polymerase beta,
antigenic determinants of the particle
external layer, may provide a useful tool
for the investigation of effective vaccines
Andrés, G., García-Escudero, R., Viñuela, E., Salas, M.
against ASFV infection and for the
from the assembly sites to the plasma membrane but
supporting its participation in the repair
of a viral DNA damage due to alterations
in the bases. On the other hand, pol X
development of ASF diagnostic tests.
not for infectivity. J. Virol. 75, 6758-6768
Another objective of our work is to
Rodríguez, J. M., Salas, M. L., Santarén, J. F. (2001)
possesses a lyase activity on reparative
intermediates containing an abasic site,
suggesting the existence of an alternative
investigate the mechanisms used by the
African swine fever virus-induced polypeptides in porcine
virus to control the apoptosis and the
alveolar macrophages and in Vero cells: Two-dimensional
gel analysis. Proteomics 1, 1447-1456
viral BER pathway.
immune response. Our studies indicate
that apoptosis is induced during virus
uncoating and that virus replication is not
Our studies are also directed to
required to activate the apoptotic process.
J. M. (2002) Repression of African swine fever virus
understand the assembly processes of
the viral particle and the mechanisms
involved in virus dissemination. Using an
On the other hand, we have demonstrated
that the viral gene homologous to cellular
polyprotein pp220-encoding gene leads to the assembly
L., Rodríguez, J. M. (2001) African swine fever virus
structural protein pE120R is essential for virus transport
Andrés, G., García-Escudero, R., Salas, M. L., Rodríguez,
of icosahedral core-less particles. J. Virol. 76, 2654-2666
IAP, in addition to its effect in preventing
caspase-3 activation, is able to activate
NFkB through a mechanism that involves
Rodríguez, C. I., Nogal, M. L., Carrascosa, A. L., Salas,
demonstrated that this protein is
necessary for virus dissemination, being
involved in the microtubule-mediated
the induction of IkB kinase (IKK) activity.
virus IAP-like protein induces the activation of nuclear
This represents a new strategy to evade
the host’s immune response, not
factor kappa B. J. Virol., 76, 3936-3942
transport of ASFV from the viral factories
described previously for mammalian
Carrascosa, A. L., Bustos, M. J., Nogal, M. L., González
to the plasma membrane. The formation
of the virus central “core” domain,
viruses.
de Buitrago, G., Revilla, Y. (2002) Apoptosis induced by
ASFV recombinant inducibly expressing
the capsid protein p14.5, we have
M. L., Fresno, M., Revilla, Y. (2002) African swine fever
an early step of African swine fever virus (ASFV) entry
into Vero cells does not require virus replication. Virology,
294, 372-382
Bustos, M. J., Nogal, M. L., Revilla, Y., Carrascosa, A. L.
(2002) Plaque assay of African swine fever virus on
swine macrophages. Arch. Virol., 147, 1453-1459
Andrés, G., Alejo, A., Salas, J., Salas, M. L. (2002) African
swine fever virus polyproteins pp220 and pp62 assemble
into the core shell. J. Virol. 76, 12473-12482
Modulación de NFkB por genes del VPPA homólogos
a IkB (gen A238L) e IAP (gen A224L). El IkB viral es
un inhibidor del NFkB, mientras que el homólogo del
IAP activa a este factor de transcripción por un
mecanismo que implica la activación de las IKKs.
Modulation of NFkB by ASFV genes homologous to
IkB (gene A238L) and IAP (gene A224L). The viral
IkB is an inhibitor of NFkB, while the IAP homologue
activates this transcription factor by a mechanism
involving IKKs activation.
67
Investigador responsable /
Scientist in charge:
Francisco Sobrino
Becarios Postdoctorales /
Postdoctoral fellows:
José Ignacio Núñez
Becarios Predoctorales
Nicolás Molina
Diana Belén de la Morena
Científicos Visitantes
Lliliane Ganges (CENSA, Cuba)
Judith Villén (U. Pompeu Fabra,
Barcelona)
C.13
Desarrollo de nuevas estrategias para el control y
prevención de enfermedades virales: el virus de la
fiebre aftosa como modelo
esencial para la replicación del virus en
cultivos celulares y en modelos animales.
El virus de la fiebre aftosa (VFA) constituye
un interesante modelo, de gran importancia
económica, para entender como las
Así mismo, se ha demostrado la implicación
de la NSP 3A en el rango de hospedador
interacciones entre un virus con gran
capacidad de variación y sus diferentes
hospedadores naturales, condicionan el
única sustitución de aminoácido en esta
proteína confiere al VFA la capacidad de
producir lesiones vesiculares en cobaya.
del virus, habiéndose identificado que una
control de la enfermedad que produce.
Se está caracterizando la respuesta inmune
Finalmente, se ha trabajado en el desarrollo
de nuevas estrategias de diagnóstico
celular que induce el VFA y sus vacunas
convencionales en un importante
hospedador natural, el cerdo. Se participa,
serológico y en la optimización de la
secuenciación y análisis filogenético del
VFA y otros virus RNA.
también, en el diseño de nuevas vacunas
y en el análisis de su inmogenicidad en
modelos animales. Se han identificado
epítopos T cooperadores en proteínas no
estructurales (NSP) del VFA que son
eficientemente reconocidos por linfocitos
de cerdos domésticos. Estos epítopos están
Parte de este trabajo ha sido desarrollado
en el laboratorio BSL3 del que se dispone
en el CISA-INIA. Se ha colaborado
activamente con: D. Andreu (U. Pompeu
Fabra), E. Domingo (CBMSO), E. Giralt (U.
siendo empleados en la formulación de
vacunas peptídicas, cuya inmunogenicidad
Barcelona), V. Ley (INIA), E. Martínez-Salas
(CBMSO), E.L Palma (INTA, Argentina), M.
Sáiz (CISA-INIA), A. Villaverde (U.A.
está siendo estudiada.
Barcelona), y dentro de los proyectos de la
UE: FAIR CT97-3665 y CT96 1317.
Se trabaja, también, en el análisis funcional
de elementos reguladores del RNA y en el
papel de NSP en la patogenia producida
por el VFA. La 3’NCR del RNA viral es
Representación esquemática de la respuesta inmune específica inducida por el VFA.
Reconocimiento de epítopos virales por linfocitos B y T CD4 (cooperadores) y CD8
(citotóxicos, CTL). La inducción de anticuerpos neutralizantes frente al VFA se asocia
con protección frente a la infección viral. El papel de la respuesta CTL en la protección
frente al VFA es poco conocido, lo que se indica con un interrogante.
Schematic representation of the specific immune response induced by FMDV. Recognition
of viral epitopes by B and T CD4 (helper) and T CD8 (CTL) lymphocytes. Induction of
viral neutralizing antibodies correlates with protection to viral infection. The role of the
CTL response in FMD protection is not well established and this is indicated by a question
mark.
68
New strategies for prevention and control of viral
diseases: foot-and-mouth disease virus as a
model.
Research summary
essential for virus replication in cell culture
and in animal models. We have also
Sáiz, M., Gómez, S., Martínez-Salas, E., Sobrino, F.
Foot-and-mouth disease virus (FMDV) is
one of the major concerns for animal
health. It is also an interesting model
demonstrated the implication of NSP 3A
in viral host range. A single amino acid
abrogates infectivity and viral replication. J. Gen. Virol.
system for understanding the interactions
of a highly variable virus and its natural
hosts and the implications of these
adaptation of foot-and-mouth disease
virus to guinea-pig.
interactions on disease control.
We are involved in the characterization
Finally, we have worked on the
development of methods for serological
diagnosis and for optimization of
of the cellular immune response to FMDV
and its conventional vaccines in pigs. We
are also participating in the design of new
nucelotide sequencing and phylogenetic
analyses of FMDV and other RNA viruses.
Part of these activities has been carried
vaccines and the analysis of their
immunogenicity in animal models. T cell
epitopes that are efficiently recognized
by porcine lymphocytes have been
out in the BSL3 laboratory that F. Sobrino
utilizes at CISA-INIA. An important part
of the results have been obtained in
collaboration with D. Andreu (U. Pompeu
identified on FMDV non-structural proteins
Fabra), E. Domingo (CBMSO), E. Giralt
(NSP). These epitopes are being included
in the formulation of peptide vaccines
(U. Barcelona), V. Ley (INIA), E. Martínez-
Núñez, J.I., Baranowski, E., Molina, N., Ruiz-Jarabo, C.,
Salas (CBMSO), E.L Palma (INTA,
Argentina), M. Sáiz (CISA-INIA) y A.
Domingo, E., Sobrino, F. (2001) A single amino acid
Villaverde (U.A. Barcelona), and as a
adaptation of foot-and-mouth disease virus to guinea-
result of the participation in the EU
projects: FAIR CT97-3665 y CT96 1317.
Highlights Section of ASM News, como uno de los seis
whose immunogenicity is under study.
We are also analyzing the functional role
of RNA regulatory elements and FMDV
NSP. The 3’NCR of FMDV RNA is
(2001) Deletion or substitution of the aphthovirus 3'NCR
82, 93-101
substitution in this protein can mediate
Sobrino, F., Sáiz, M., Jiménez-Clavero, M.A., Núñez, J.I.,
Rosas, M.F., Baranowski, E., Ley, V. (2001) Foot-andmouth disease virus: a long known virus, but a current
threat. Vet. Res. 32, 1-30
Núñez, J.I., Martín, M.J., Piccone. M.E., Carrillo, E.,
Palma, E.L., Dopazo, J., Sobrino, F. (2001) Identification
of optimal regions for phylogenetic studies on VP1 gene
of foot-and-mouth disease virus: analysis of types A and
O Argentinean viruses. Vet. Res. 32, 31-45
Blanco, E., García-Briones, M., Sanz-Parra, A., Chiva,
C., Andreu, D., Ley, V., Sobrino, F. (2001) Identification
of T cell epitopes in non-structural proteins of foot-andmouth disease virus. J. Virol. 75, 3164-3174
substitution in non-structural polypeptide 3A can mediate
pig. J. Virol. 75, 3977-3983 Seleccionado por la Journal
mejores artículos del mes.
Sobrino, F., Domingo, E. (2001) Foot-and-mouth disease
Otras actividades y reconocimientos científicos /
Other scientific activities and awards
in Europe. EMBO reports 2, 459-461
F. Sobrino:
J.I. Núñez:
Miembro del Comité de Redacción y del Consejo
Seleccionado como Experto internacional en
Editorial de la Revista Oficial de la Sociedad
Diagnóstico y Epidemiología Molecular cuantitativa
Española de Virología. (1999- ).
por la FAO en el proyecto TCP/CUB/8926(A)
Feliu, J.X, Ferrer-Miralles, N., Blanco, E., Sobrino, F.,
“Epidemiología molecular del virus de la peste
Villaverde, A. (2002) Enhanced response to antibody
porcina clásica”. 2000-2001.
binding in engineered -galactosidase enzymatic sensors.
Miembro del Editorial Board de Veterinary
Reserach (Elsevier). (1998- ).
Miembro del Scientific Panel of the Action Access
to Research Infrastructures, HPRI-CT2001-00131,
of the EU Improving Human Potential Programme.
CISA-INIA. (2002 -
).
Sobrino, F. (2001) La fiebre aftosa y su control. Pequeños
Seleccionado como Experto por la Oficina de
Rumiantes. Publicación de la Sociedad Española de
Ovinotecnia y Caprinotecnia. 2, 8-15
Biochem. Biophys. Acta. 36605, 1-13
Alimentación y Veterinaria de la Comunidad
Sobrino, F., Blanco, E., Núñez, J.I., Jiménez-Clavero,
Europea (UE) en la Comisión de seguimiento y
M.A., Ley, V. (2002) Cellular immune response to foot-
evaluación de la fiebre aftosa en Brasil y Uruguay
and-mouth disease virus. Mod. Asp. Immunobiol. 2, 166-
. Enero-febrero 2001.
168
Distinción a la labor científica durante los años
Sáiz, M., Jiménez-Clavero, M.A., Núñez, J.I., Baranowski,
académicos 98-99 y 99-00 por el Instituto de
E., Sobrino, F. (2002) Foot-and-mouth disease virus:
Miembro del Comité Científico Técnico del Centro
de Investigación en Sanidad Animal (CISA) del
INIA, MCYT. ( Feb 2002 - Mayo 2002).
Investigaciones Agrarias y Alimentarias INIA, 23
prospective for disease control. Microb. Infect. 4, 183-
de marzo de 2001.
1192
Coordinador del Curso Internacional de
Domingo, E., Baranowski, E., Escarmís, C., Sobrino, F.
Epidemiología molecular y enfermedades
(2002) Foot-and-mouth disease virus. Comp. Immunol.
Director del XI Curso Internacional sobre
transfronterizas de los animales domésticos,
Microbiol. 25, 297-308
enfermedades Exóticas Animales (AECI-INIA).
organizado por la FAO. CENSA- San José de las
CISA-INIA, Valdeolmos, Madrid. Noviembre 2002.
Lajas, Cuba, mayo de 2001
Miembro de Comité Asesor a la Dirección del
Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA)
del INIA, MCYT.(Junio 2002 -
).
López de Quinto, S., Sáiz, M., de la Morena, D., Sobrino,
F., Martínez-Salas, E. (2002) FMDV IRES-driven
translation is stimulated separately by the viral 3’NCR
Colaboraciones con la industria /
Collaborations with Industry
and poly (A) sequences. Nucleic Acids Res. 30, 4398-
Colaboración con la empresa Tecnología para el
Domingo, E., Baranowski, E., Escarmís, C., Sobrino, F.,
Diagnóstico e Investigación (TDI, SA), para el
Holland, J.J. (2002) Error frequencies of picornavirus
desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico y
RNA polymerases-evolutionary implications for virus
caracterización de virus.
populations. In: Wimmer, E., Semler, B. (eds.) ASM Press.
4405
pp. 285-298
69
C.14
Desarrollo del sistema
2) Regulación de la expresión del preTCR durante el desarrollo linfoide T.
María Luisa Toribio
Nuestro trabajo se centra en el estudio de
Gretel Nusspaumer
los programas madurativos que determinan
la especificación de diferentes linajes
celulares a partir de un precursor
Susana Rojo
hematopoyético multipotencial. En concreto,
TCR se regula a nivel transcripcional,
existiendo una expresión diferencial de las
formas pT_a y pT_b de procesamiento
Postdoctorales /
hemos identificado las rutas madurativas
que determinan la generación in vivo de
alternativo del mRNA de pT_ durante el
desarrollo intratímico. Además, sólo pT_a
linajes hematolinfoides alternativos (linfocitos
T, células dendríticas -DC-, o células NK),
a partir de los progenitores que colonizan
es capaz de expresarse en la membrana
formando parte del complejo CD3-pre-TCR,
mientras que pT_b se asocia con la cadena
TCR` y la retiene intracelularmente, lo que
Marina García Peydró
Almudena Rodríguez Ramiro
Graduate Students:
Virginia García de Yébenes
María de las Nieves Navarro
Yolanda Rodríguez Carrasco
el timo humano. Nuestro objetivo final es
definir la contribución de genes concretos
en la especificación celular para identificar
los mecanismos implicados en la generación
de patologías asociadas al desarrollo
linfohematopoyético.
Angel Manuel Martínez
Durante el bienio 2001-2002, nuestros
estudios han incidido en tres aspectos:
1) Ontogenia de las DCs intratímicas.
La expresión estadio-específica del pre-
sugiere que pT_b también participa en la
regulación de la expresión en superficie del
pre-TCR.
3) Mecanismos moleculares de control
de los niveles de expresión del pre-TCR.
Hemos demostrado que la limitada
expresión del pre-TCR en la superficie
celular está regulada por la cadena pT_ y
es independiente de la composición
La identificación en el timo humano de una
bioquímica del módulo CD3/c. La cadena
nueva población de DCs, generadas in vivo
a través de un progenitor intermediario
pT_ induce la internalización y degradación
mieloide, cuestiona la idea aceptada de
que las DCs intratímicas tienen origen
linfoide y demuestra que el timo se coloniza
por progenitores inmaduros que retienen
ambas potencialidades, linfoide y mieloide.
Acumulación intracelular y colocalización de las subunidades pT_ y TCR` del pre-TCR
humano con la proteína PDI residente en el retículo endoplásmico (ER).
Intracellular accumulation and colocalization of pT_ and TCR` subunits of the human
pre-TCR with the ER-resident PDI protein.
70
constitutiva del pre-TCR y su región
citoplásmica posee una función de retención
en el retículo endoplásmico. Ambos
mecanismos contribuyen a la regulación de
los niveles de expresión en superficie del
pre-TCR.
Development of the human
Research summary
2) Regulation of pre-TCR gene
Carrasco, Y.R., Ramiro, A.R., Trigueros, C., de Yébenes,
V.G., García-Peydró, M., Toribio, M.L. (2001) Identification
Our work aims at understanding the
expression and function during T cell
development.
maturation programs that lead to lineage
specification from hematopoietic stem
cells. Particularly, we have contributed to
Expression of pT_a and pT_b mRNA
spliced products is differentially regulated
the identification of the developmental
along intrathymic development,
pathways that specify the generation of
alternative hematolymphoid lineages (T,
suggesting that stage-specific expression
of the pre-TCR is regulated at the
Ramiro, A.R., Navarro, M.N., Carreira, A., Carrasco, Y.R.,
dendritic –DCs-, and NK cell lineages)
from the earliest thymic precursors. Our
final aim is to determine the contribution
transcriptional level. In addition, we found
that only pT_a is capable of inducing
surface expression of a CD3-associated
pre-TCR, while pT_b pairs with and
B., Toribio, M.L. (2001) Differential developmental
of particular genes to critical cell-fate
choices, in order to identify pathogenetic
events linked to lymphohematopoietic
development.
of an endoplasmic reticulum retention function for the
cytoplasmic tail of the human pre-T cell receptor (TCR)
retains TCR` intracellularly. Thus, pT_b
may also contribute to the regulation of
surface pre-TCR
_ chain: A possible role in the regulation of cell-surface
pre-TCR expression levels. J. Exp. Med. 193, 1045-1057
de Yébenes, V.G., Carrillo, G., San Millán, J.L., Rubin,
regulation and functional effects on pre-TCR surface
expression of human pT_a and pT_ b spliced isoforms.
J. Immunol. 167, 5106-5114
Rubin B., Alibaud L., Huchenq-Champagne, A., Arnaud,
J., Toribio, M.L., Constans, J. (2002) Some hints
concerning the shape of T-cell receptor structures. Scand
has focused on three main topics:
3) Molecular mechanisms that control
surface pre-TCR expression levels.
1) Developmental origin of intrathymic
Our studies showed that low surface
DCs.
expression of the human pre-TCR is
The identification in our lab of a novel
independent of the biochemical
composition of the CD3/c modules, but
population of intrathymic DCs that develop
depends on the pT_ chain itself. We found
in vivo through an intermediate myeloidrestricted progenitor challenges the
that the pT_ cytoplasmic tail serves an
endoplasmic reticulum retention function,
current view that all intrathymic DCs are
lymphoid-derived, and provide evidence
and propose that pT_ plays a direct role
in promoting constitutive internalization
and degradation of the pre-TCR. Both
During the years 2001-2002 , our work
J Immunol. 55, 111-118
Ichimiya S., Kojima, T., Momota, H., Kondo, N., Ozaki,
that precursors seeding the human
thymus are actually uncommitted
progenitors that retain the potential to
develop into both lymphoid- and
T., Nakagawara, A., Toribio, M.L., Imamura, M., Sato, N.
(2002) p73 is expressed in human thymic epithelial cells.
J. Histochem. Cytochem. 50, 455-462
de Yébenes, V.G., Carrasco, Y.R., Ramiro, A.R., Toribio,
M.L. (2002) Identification of a myeloid intrathymic pathway
of dendritic cell development marked by expression of
the GM-CSF receptor. Blood 99, 2948-2956
Carrasco, Y.R., Navarro, M.N., Ramiro, A.R., Toribio, M.L.
(2002) Regulation of surface expression of the human
mechanisms may thus contribute to the
pre-TCR. Semin. Immunol. 14, 325-334
regulation of surface pre-TCR expression
levels.
de Yébenes, V.G., García-Peydró, M., Toribio, M.L. (2002)
myelomonocytic-lineage cells.
Lymphoid developmental potential of human
hematopoietic progenitors transduced with retroviral
vectors. Inmunología 21, 121-128
Patentes / Patents
Toribio, M.L., Carrillo, G., Ramiro, A.R., de Yébenes,
V.G., Carrasco, Y.R.(2001). “Pre-receptor de las células
T (pre-TCR): Caracterización y regulación de su expresión
durante el desarrollo de las células T en humanos”.
CSIC. PCT/ ES02/ 00387 (España, Europa, USA,
Canadá, Japón).
Yolanda Rodríguez Carrasco. 2001. “Mecanismos
moleculares que regulan la expresión del complejo preTCR en la membrana: implicación del dominio
intracitoplásmico de la proteína pT_. Universidad
Localización subcelular de las isoformas pT_a y pT_b. Patrón de expresión intracelular (A) y de
superficie (B) de proteínas quiméricas pT_a-GFP y pT_b-GFP en transfectantes estables de células
pre-T.
Virginia García de Yébenes Mena. 2002. “Plasticidad de
Subcellular localization of pT_a and pT_b isoforms. Intracellular (A) and surface (B) expression patterns
of chimeric pT_a-GFP and pT_b-GFP proteins in pre-T cell stable transfectants.
desarrollo de sistemas de modificación genética para el
los progenitores hematopoyéticos del timo humano:
estudio de la diversificación de linajes celulares”.
71
C.15
Replicación y transcripción del DNA
del bacteriófago ø29
a 26, son esenciales para la oligomerización
de la proteína y para su funcionalidad.
Margarita Salas
Replicación del DNA de ø29
Hemos continuado el estudio del
Alicia Bravo
mecanismo de iniciación de la replicación
del DNA de ø29 mediante proteína terminal
Por mutagénesis dirigida hemos
Ana Camacho
José Miguel Hermoso
Wilfried J.J. Meijer
Postdoctorales /
Ana Abril
Belén Calles
Emmanuelle Dufour
Ralf Eisenbrandt
Irene Gascón
Víctor González-Huici
José A. Horcajadas
Alejandro Serna-Rico
Verónica Truniger
Predoctoral Students:
Martín Alcorlo
Elisa Longás
determinado que el motivo “coiled-coil” de
la proteína p1 de ø29 está implicado en la
formación de láminas bidimensionales in
(TP), así como el de otras proteínas
implicadas en replicación.
vitro. La proteína p1 también forma
estructuras multiméricas in vivo asociadas
a la membrana bacteriana, lo que sugiere
Los residuos Tyr59, His61 y Phe69 de la
DNA polimerasa de ø29, localizados en el
dominio N-terminal, son esenciales para la
que la p1 suministra un sitio de anclaje para
interacción con la TP. En el dominio C-
La p16.7 de ø29 es una proteína dimérica
integral de membrana que se une al DNA
de cadena simple, forma multímeros e
interacciona con la TP. Hemos propuesto
terminal, la Lys392, conservada en DNA
polimerasas que inician con TP, localizada
a continuación del motivo Kx3NSxYG, es
importante para la unión correcta del
nucleótido en la iniciación de la replicación.
Por otra parte, la Lys371, que precede al
motivo Kx3NSxYG, conservada en las DNA
polimerasas de tipo eucariótico, está
implicada en la unión del nucleótido entrante
la replicación del DNA de ø29.
que la función de p16.7 es la unión de los
intermedios replicativos a la membrana
bacteriana mediante la interacción con la
TP y con el DNA de cadena simple.
Transcripción del DNA de ø29
en las reacciones de iniciación y
polimerización.
Hemos completado la secuencia del DNA
Irene Rodríguez
La función de la proteína p6 de ø29 in vivo
del fago GA-1, y se ha realizado un análisis
de los promotores tempranos del mismo.
Gemma Serrano
requiere la formación de dímeros. Por otra
Daniel Muñoz
Laura Pérez
parte, la p6 se une in vivo preferentemente
Estudiantes / Undergraduate
Students:
Blanca Manzano
a los extremos del DNA de ø29, lo que
confirma resultados obtenidos in vitro.
Se ha demostrado que la represión del
promotor C2 temprano de ø29 por la
proteína p6 se debe a un defecto en la
Además, la unión de la p6 al DNA in vivo
aumenta ~30 veces en presencia de
formación del complejo cerrado.
novobiocina, que disminuye el
La proteína p6 coopera con la proteína
José Mª. Lázaro
superenrollamiento negativo del DNA. Estos
resultados sugieren que el DNA de ø29,
reguladora p4 de ø29 en el control del
cambio de la transcripción temprana a
Ángeles Martínez
aunque no está cerrado covalentemente,
tardía. La formación de un complejo
Laurentino Villar
tiene restricción topológica in vivo.
nucleoprotéico de ambas proteínas con el
DNA de ø29 da lugar a represión de los
promotores tempranos A2b y A2c y
Patricia Pérez
La proteína p17, en forma dimérica,
interacciona con la p6 in vitro y favorece la
unión de ésta a los extremos del DNA de
ø29.
activación del promotor tardío A3. La
represión del promotor A2c se debe a la
inhibición de la formación del complejo de
demostrado que la región N-terminal de la
transcripción abierto. La formación estable
del complejo nucleoprotéico requiere la
interacción entre la p6 y la región C-terminal
proteína SSB del fago GA-1, relacionado
de la p4.
Mediante mutagénesis de deleción hemos
con ø29, en concreto los aminoácidos 19
Análisis mutacional en la proteína p1 del fago ø29
Mutational analysis in the phage ø29 protein p1
72
Replication and transcription of
bacteriophage ø29 DNA
Research summary
essential for the oligomerization and
Meijer, W.J.J. Serna-Rico, A., Salas, M. (2001)
functionality of the protein.
Characterization of the bacteriophage ø29-encoded
Replication of ø29 DNA
protein p16.7: a membrane protein involved in phage
By site-directed mutagenesis we have
DNA replication. Mol. Microbiol. 39, 731-746
We have continued with the studies of
shown that the coiled-coil motif of ø29
the mechanism of ø29 DNA initiation of
replication primed by the TP, as well as
of others proteins involved in replication.
Residues Ty59, His61 and Phe69 of ø29
protein p1, is involved in the in vitro
formation of bidimensional sheets. Protein
p1 also forms multimeric structures in
vivo associated to the bacterial
the phage ø29 late A3 promoter. J.Mol.Biol. 307, 487-
DNA polymerase located at the N-terminal
membrane, suggesting that p1 provides
an anchoring site for ø29 DNA replication.
497
domain are essential for the interaction
with the TP. At the C-terminal domain,
Lys392, conserved in DNA polymerases
that use TP as primer, located adjacent
to motif Kx3NSxYG, is important for
correct binding of the templating
nucleotide during initiation of ø29 DNA
replication. On the other hand, Lys371,
that precedes motif Kx3NSxYG,
conserved in eukaryotic-type DNA
C-terminal domain of the RNA polymerase alpha subunit
plays a role in the stability of open complexes formed at
Meijer, W.J.J., Horcajadas, J.A., Salas, M. (2001) The
The ø29 dimeric protein p16.7 is an
integral membrane protein that binds to
ø29-family of phages. Microb.Mol.Biol.Rev. 65, 261-287
single-stranded DNA (ssDNA), forms
multimers and interacts with the TP. We
have proposed that p16.7 function is the
Bravo, A., Serrano-Heras, G., Salas, M. (2001) A single
attachment of the replicative intermediates
to the bacterial membrane through the
dimensional sheets to filamentous structures.
amino acid substitution within a coiled-coil motif changes
the assembly of a 53-amino-acid protein from two-
J.Biol.Chem. 276, 21250-21256
interaction with the TP and with ssDNA.
polymerases, is involved in the binding of
the incoming nucleotide in initiation and
Calles, B., Monsalve, M., Rojo, F. , Salas, M. (2001) The
Brenkman, A.B. Heideman, M.R., Truniger, V., Salas, M.,
Transcription of ø29 DNA
polymerisation reactions.
van der Vliet, P.C. (2001) The "YXGG/A" motif of
adenovirus DNA polymerase affects template DNA
We have completed the sequence of GA-
binding and the transition from initiation to elongation.
1 DNA and analysed its early promoters.
J.Biol.Chem. 276, 29846-29853
On the other hand, p6 interacts in vivo
We have shown that the repression of the
Camacho, A., Salas, M. (2001) Repression of
preferentially with the ø29 DNA ends,
confirming in vitro results. In addition, p6
ø29 early promoter C2 by protein p6 is
due to impairment of closed complex
bacteriophage ø29 early promoter C2 by the viral protein
binding to DNA in vivo increases ~30 fold
formation.
J.Biol.Chem. 276, 28927-28932
decreases the negative supercoiling of
Ø29 protein p6 cooperates with the
Camacho, A., Salas, M. (2001) Mechanism for the switch
DNA. These results suggest that ø29
DNA, although it is not covalently closed,
regulatory protein p4 in the switch from
early to late transcription. The formation
of ø29 DNA early to late transcription by regulatory
is topologically constrained in vivo.
of a multiprotein complex of both proteins
6060-6070
with ø29 DNA leads to repression of the
early promoters A2b and A2c and
Horcajadas, J.A., Meijer, W.J.J., Rojo, F., Salas, M.
activation of the late promoter A3.
(2001) Analysis of early promoters of the Bacillus
Repression of promoter A2c results from
inhibition of open complex formation. The
stable formation of the nucleoprotein
bacteriophage GA-1 J.Bacteriol. 183, 6965-6970
Salas, M. (2002) Genus ø29-like viruses (Podoviridae).
complex requires interaction between p6
The Springer Index of Viruses. Springer-Verlag. pp. 798-
and the C-terminal region of p4.
803
In vivo studies have shown that formation
of p6 dimers are required for its function.
p6 is due to the impairment of the closed complex.
in the presence of novobiocin, that
Protein p17 dimers interact with p6 in vitro
and favor p6 binding to the ø29 DNA
ends.
By deletion mutagenesis we have shown
that the N-terminal region of the SSB
protein of the ø29-related phage GA-1,
protein p4 and histone-like portein p6. EMBO J. 20,
specifically amino acids 19 to 26, are
Serna-Rico, A., Salas, M., Meijer, W.J.J. (2002) The
Bacillus subtilis phage ø29 protein p16.7, involved in
ø29 DNA replication, is a membrane-localizaed singlestranded DNA-binding protein. J.Biol.Chem. 277, 67336742
Truniger, V., Lázaro, J.M., Blanco, L., Salas, M. (2002)
A highly conserved lysine residue in ø29 DNA polymerase
is important for correct binding of the template strand
during initiation of ø29 DNA replication. J.Mol.Biol. 318,
83-96
73
Replicación y transcripción del DNA del bacteriófago ø29
Publicaciones cont./Publications cont.:
Truniger, V., Lázaro, J.M., Esteban, F.J., Blanco, L.,
Irene Gascón Escobar. 2001. “Caracterización
Salas, M. (2002) A positively charged residue in DNA
estructural y funcional de las SSBs de los fagos Nf y
polymerases from families A and B, is involved in binding
GA-1. Estudio comparativo con la SSB de ø29”.
Nombrada Asturiana del Siglo XX por El Comercio.
the incoming nucleotide. Nucl.Acids.Res. 30, 1483-
Diario de Información (2001).
Margarita Salas
1492
Víctor González-Huíci. 2001. “Reconocimiento del origen
Elegida entre las 100 Mujeres del Siglo XX que abrieron
Eisenbrandt, R., Salas, M., de Vega, M. (2002) ø29
de replicación del DNA del bacteriófago ø29”.
el camino a la igualdad en el Siglo XXI por el Consejo
DNA polymerase residues Tyr59, His61 and Phe69 of
de la Mujer de la Comunidad de Madrid (2001).
interaction with the terminal protein. Nucl.Acids.Res.
Belén Calles Arenales. 2002. “Regulación de la
Nombrada Patrona de la Fundación Foro Jovellanos
30,1379-1386
transcripción de los promotores A3 y A2c del
del Principado de Asturias (2001- ).
the highly conserved ExoII motif, are essential for
bacteriófago ø29 de Bacillus subtilis. Función de las
Gascón, I., Carrascosa, J.L., Villar, L., Lázaro, J.M.,
proteínas p4 y p6”. Universidad Autónoma de Madrid.
Miembro del Colegio Libre de Eméritos (2001–
).
Salas, M. (2002) Importance of the N-terminal region
of the phage GA-1 SSB for its self-interaction ability
Miembro Electo de la Real Academia de la Lengua
and functionality. J.Biol.Chem. 277, 22534-22540
(2001-
Abril, A.M., Salas, M., Hermoso, J.M. (2002) The in vivo
Miembro del Patronato de la Fundación ICO (2001-
).
).
function of phage ø29 nucleoid-associated protein p6
requires formation of dimers. Gene 296, 187-194
Co-dirigió el curso: "Procesos moleculares básicos de
los organismos y su patología" de la Escuela de Biología
Calles, B., Salas, M., Rojo, F. (2002) The ø29
Molecular "Eladio Viñuela". Universidad Internacional
transcriptional regulator contacts the nucleoid protein
Menéndez Pelayo (2001).
p6 to organize a repression complex. EMBO J. 21,
6185-6194
Member of The Novartis Foundation Scientific Advisory
Panel (2002–
).
Premio Isabel Ferrer de la Generalitat Valenciana (2002).
Medalla de Oro de la Comunidad de Madrid (2002).
Doctora Honoris Causa por la Universidad de
Extremadura (2002).
Co-dirigió el curso “Nuevas perspectivas en Biomedicina
y Biotecnología“ de la Escuela de Biología Molecular
“Eladio Viñuela”. Universidad Internacional Menéndez
Pelayo (2002).
74
Distribución regional de los transportadores GLYT1 (verde)
y v-GLUT (rojo) en el área CA3 en hipocampo de cerebro
de rata.
76
Carmen Aragón
D.1 Bases moleculares de la neurotransmisión
glicinérgica
D.1 Molecular basis of glycinergic
neurotransmission
Jesús Avila
de Grado
D.2 Función de las proteínas microtubulares en
neuronas
D.2 Function of microtubular proteins in neurons
D
Neurobiología
Neurobiology
Edgardo Catalán
F. Javier
Díez Guerra
Cecilio Giménez
D.3 Transducción de señales. Mecanismos de
acción de neuromoduladores e implicaciones
farmacológicas
D.3 Signal transduction. Mechanisms of action
of neuromodulators and pharmacological
implications
D.4 Bases moleculares de la plasticidad neuronal
D.4 Molecular basis of neuronal plasticity
D.5 Regulación de la expresión génica en
enfermedades neurogegenerativas
D.5 Regulation of the gene expression in
Rafael Manso
D.6 Bases moleculares de la adaptación al
ejercicio y de la plasticidad muscular
D.6 Molecular bases of the adaptation to exercise
and of skeletal muscle plasticity
Alberto
Martínez Serrano
Federico Mayor, jr.
D.7 Biología de células troncales neurales
humanas. Potencial para reposición celular
y terapia génica en neurodegeneración
D.7 Biology of human neural stem cells. Potential
for gene therapy in neurodegeneration
D.8 Mecanismos de señalización y regulación de
receptores acoplados a proteínas G
D.8 G protein-coupled receptors signaling and
regulatory mechanisms
Galo Ramírez
Jorgina
Satrústegui
Fernando
Valdivieso
D.9 Neurotransmisión y desarrollo
D.9 Neurotransmission and development
D.10 Neurodegeneración y envejecimiento:
señalización mitocondrial del calcio y
señalización de insulina/leptina en
envejecimiento
D.10 Neurodegeneration and ageing: calcium
signalling in mitochondria and insulin/leptin
signalling during ageing
D.11 Neuropatología molecular de la enfermedad
de alzheimer
D.11 Molecular neuropathology of alzheimer's
disease
Neurobiología
Neurobiology
D.1
Bases moleculares de la neurotransmisión
glicinérgica
Hemos eliminado los cuatro sitios de
glicosilación del segundo bucle extracelular
de GLYT2 mediante mutagénesis dirigida,
Carmen Aragón*
La glicina es un neurotransmisor inhibidor
en la médula espinal y en el tallo cerebral
de vertebrados que interviene en el
procesamiento de la información sensorial
lo que nos ha permitido demostrar que las
cadenas de oligosacáridos constituyen
señales de inserción y distribución
Beatriz López-Corcuera
y motora de actividades como el
movimiento, visión y audición. Así mismo,
asimétrica del transportador en la
membrana apical de células polarizadas.
la glicina tiene un papel excitador como coagonista del glutamato sobre receptores
Las propiedades dinámicas del bucle
Arjan Geerlings
Graduate Students:
Amparo Fornés
Lara Rodenstein
Pablo Alonso
Enrique Núñez
*Jefe de línea asociado
NMDA en corteza e hipocampo. Los
transportadores específicos de glicina de
la membrana plasmática de las terminales
presinápticas y de los procesos gliales,
denominados GLYT1 y GLYT2,
desempeñan un papel importante en la
finalización de la transmisión glicinérgica,
manteniendo concentraciones
extracelulares de glicina bajas y elevados
niveles en el interior celular. Las alteraciones
en la actividad de GLYT1 y GLYT2 podrían
estar implicadas en patologías relacionadas
con la actividad muscular esquelética y con
un tipo de esquizofrenia asociada a una
extracelular 1(EL1) de GLYT1 y GLYT2 han
sido estudiadas mediante técnicas
bioquímicas y electrofisiológicas utilizando
mutaciones puntuales y transportadores
quiméricos. Nuestros resultados sugieren
que EL1 es una fuente de heterogeneidad
estructural entre la familia de
transportadores de neurotransmisores y
que funciona a modo de una visagra que
fluctúa entre diferentes conformaciones
secuenciales durante el ciclo de transporte.
En cuanto a la regulación de estas
hipofunción de los receptores NMDA. Los
proteínas, hemos demostrado la existencia
de un mecanismo regulador mediado por
transportadores de glicina son, por tanto,
proteínas del complejo SNARE que
considerados actualmente como dianas
de futuros compuestos con acción
terapéutica.
aumenta la expresión en membrana de
GLYT2 durante la neurosecreción de glicina.
Mediante la aplicación de técnicas de
El objetivo de nuestro grupo es el estudio
microscopía electrónica y detección
inmunológica con oro coloidal a una
a nivel molecular de la estructura,
mecanismo funcional y regulación de GLYT1
preparación de vesículas sinápticas
purificadas hemos localizado GLYT2 en
y GLYT2, con el objeto de profundizar en
la fisiología y patología de la
estos orgánulos, lo que sugiere que a través
neurotransmisión glicinérgica.
del tráfico intracelular del transportador
existe una estrecha coordinación entre la
liberación de neurotransmisor y su recaptura
por los transportadores en la sinapsis.
78
Molecular basis of glycinergic neurotransmission
Research summary
Glycine is an inhibitory neurotransmitter
in the spinal cord and the brain stem of
vertebrates that participates in the
processing of motor and sensory
information and is involved in several
functions like movement, vision, and
audition. In addition, glycine acts as an
necessary coagonist of glutamate, the
main excitatory neurotransmitter in the
brain, on NMDA receptors. Two specific
glycine transporters, GLYT1 and GLYT2,
located at the plasma membrane of presynaptic nerve terminals or surrounding
glial processes, play a major role in the
final step of synaptic transmission
maintaining a low extracellular and high
intracellular concentration of glycine.
Dysfunctions of GLYT1 or GLYT2 could
be involved in pathologies dealing with
disturbed musculoskeletic activity, and a
kind of schizophrenia related to NMDA
hypofunction. Therefore, glycine
transporters are now considered as
targets of future therapeutic drugs.
López-Corcuera, B., Geerlings, A., Aragón, C. (2001)
By site-directed mutagenesis of the four
N-glycosylation sites located in the second
extracellular loop of GLYT2, we have
Glycine neurotransmitter transporters: an update. Mol.
identified the carbohydrate moiety as
Martínez-Maza, R., Poyatos, I., López-Corcuera, B.,
signals for targeting and sorting to apical
membrane when this neuronal transporter
Núñez, E., Giménez, C. Zafra, F., Aragón, C. (2001)
is expressed in polarized cells.
membrane and sorting of the neuronal glycine transporter
Membr. Biol. 18, 13-20
The role of N-glycosylation in transport to the plasma
GLYT2. J. Biol. Chem. 276, 2168-2173
The dynamic properties of the extracellular
loop1 (EL1) domain of glycine transporters
have been studied by biochemical and
Geerlings, A., Núñez, E., López-Corcuera, B., Aragón,
electrophysiological methods with
chimeric and point mutant transporters.
Our results suggest that EL1 is a source
the neuronal glycine transporter GLYT2. J. Biol. Chem.
of structural heterogeneity among the
family of neurotransmitter transporters
and acts as a fluctuating hinge undergoing
Roux, M. J., Martínez-Maza, R., Le Goff, A., López-
sequential conformational changes during
the transport cycle.
reactivity to sulfhydryl reagents. J. Biol. Chem. 276,
We have reported the existence of a
SNARE-mediated regulatory mechanism
López-Corcuera, B., Aragón, C. and Geerlings, A. (2001).
that controls the surface expression of
GLYT2 in a brain-derived preparation.
Under conditions that stimulate vesicular
. 29, 742-745
C. (2001) Calcium and syntaxin1 mediated trafficking of
276, 17548-17590
Corcuera, B., Aragón, C., Supplisson, S. (2001) The glial
and the neuronal glycine transporters differ in their
17699-17705
Regulation of Glycine Transporters. Biochem. Soc. Trans
López-Corcuera, B., Núñez, E., Martínez-Maza, R.,
glycine release, GLYT2 is rapidly traffics
first toward the plasma membrane and
Geerlings, A., Aragón, C.(2001)
loop one in the glycine transporter GLYT2. J. Biol. Chem.
regulation characteristics, with the aim to
then internalized. This coordinated
regulation of glycine neurosecretion and
glycine reuptake has been also supported
understand the physiology and pathology
of glycine-mediated neurotransmission.
by GLYT2 localization on synaptic vesicles
by immunogold electron microscopy.
Geerlings, A., Núñez, E., Rodenstein, L., López-Corcuera,
Our group is studying the molecular
properties of GLYT1 and GLYT2, mainly
structure-function relationship and
Substrate-induced conformational changes of extracellular
276, 43463- 43470
B., Aragón, C. (2002) Glycine transporter isoforms show
differential subcellular localization in PC12 cells. J.
Neurochem. 82, 58-65
79
Neurobiología
Neurobiology
D.2
Función de las proteínas microtubulares
en neuronas
Jefe de línea / Group Leader:
Nuestro trabajo ha continuado en el estudio
de la función de las proteínas
microtubulares, fundamentalmente la
En experimentos en cultivos celulares se
ha logrado observar la formación de
agregados de tau hiperfosforilado,
habiéndose encontrado que la fosforilación
de tau por la proteína GSK3 puede facilitar
dicho ensamblaje.
Javier Díaz-Nido
proteína asociada a los microtúbulos
MAP1B, en el desarrollo de la forma
neuronal; la implicación de la proteína
María Teresa Moreno-Flores
asociada a los microtúbulos, tau, en
Félix Hernández
procesos de degeneración neuronal que
cursan con la aparición de agregados
un ratón transgénico condicional que
sobreexpresa GSK3. En este ratón, tau está
hiperfosforilado, su asociación a los
José Javier Lucas
Filip Lim
Mar Pérez
En base a los resultados anteriores se aisló
aberrantes de dicha proteína, y el análisis
de la regeneración neuronal.
microtúbulos está disminuida, pero no forma
agregados aberrantes. Sin embargo, el
estudio de su comportamiento sugiere
Sobre la implicación de la proteína MAP1B
Miguel Díaz
en el desarrollo de la forma neuronal hemos
encontrado que MAP1B juega un importante
defectos en su memoria. También, el ratón
presentaba unas características patológicas
similares a las encontradas en enfermos
papel en el proceso de elongación axonal
y que puede complementar a otras proteínas
de Alzheimer. Adicionalmente, se aisló un
ratón transgénico que sobreexpresa tau
Graduate Students:
como MAP2 y tau para la determinación
Alberto Gómez
de la forma neuronal. Para estos análisis
se ha utilizado un ratón deficiente en
humano conteniendo alguna de las
mutaciones que se encuentran en la
demencia frontotemporal asociada al
MAP1B, y en estudios de cultivos de
neuronas se han utilizado oligonucleótidos
cromosoma 17 (FTDP-17). La
caracterización de este ratón indicó la
antisentido para inhibir la expresión de
presencia en su cerebro de agregados
aberrantes de tau. Tanto en este ratón como
Postdoctorales /
Christian González-Billault
Ester Martín
Eva-María Jiménez
Erika Pastrana
Tobías Engel
Raquel Gómez
Alfredo Giménez
Olga Abbad
MAP2 y tau.
La agregación aberrante de tau ha sido
Technical Assitance:
Raquel Cuadros
estudiada a tres niveles; in vitro, en cultivos
celulares, y en ratones transgénicos.
utilizados como modelos para estudiar
alguna de las características patológicas
que tienen lugar en la enfermedad de
Elena Langa
Experimentos in vitro han determinado la
Alzheimer.
Chus Martín
región de la molécula de tau,
fundamentalmente implicada en el proceso
de autoasociación. También, mediante
Sobre la regeneración axonal hemos
continuado estudiando las células de glía
experimentos in vitro, se ha observado que
envolvente y hemos observado que en
la proteína tau cambia su conformación
durante el proceso de su polimerización.
procesos de regeneración axonal hay un
aumento en la expresión de la proteína
MAP1B fosforilada.
en el que sobreexpresa GSK3 podrían ser
Santiago Soto-Largo
Ester Martín Aparicio. 2002. “Caracterización del modelo
transgénico condicional de la enfermedad de Huntington:
estudios in vivo y en cultivos primarios”.
Premios / Awards
Premio de la Comunidad de Madrid, 2001. / Prize from
the Comunidad de Madrid, 2001.
Premio de la Fundación Pfizer, Envejecimiento y Calidad
de Vida, 2001. / Prize of Fundación Pfizer, 2001.
Premio de la Fundación Pfizer, Envejecimiento y Calidad
de Vida, 2002. / Prize of Fundación Pfizer, 2002.
Premio de la Fundación Lilly en Investigación Biomédica,
2002. / Prize of Fundación Lilly on Biomedical Research,
2002.
80
Function of microtubular proteins in neurons
Research summary
transgenic mouse overexpressing human
We have continued in our analysis of the
function of a microtubule associated
protein, MAP1B, in the development of
tau containing those mutations that are
found in some patients with frontotemporal
dementia linked to chromosome 17
(FTDP-17).
neuron morphology; in the study of the
role of other microtubule associated
protein, tau, in neurological disorders
The characterization of this mouse
showed the presence, in its brain, of
(tauopathies) characterized by the
appearance of aberrant aggregates of
aberrant aggregates of tau. Thus, this
mouse and that one overexpressing GSK3
that protein; and in the analysis of axonal
may be used as models for some
regeneration in damaged neurons.
pathological features that take place in
Alzheimer´s disease.
About the function of MAP1B in neuron
morphogenesis we have found that this
protein plays an important role on the
process of axonal elongation. Together
About axonal regeneration we have
with other microtubule associated proteins
like MAP2 and tau, MAP1B could
during nerve regeneration is an increase
of MAP1B in phosphorylated form.
continued the characterization of
ensheating glia cells and we found that
determine the neuron shape. For these
oligonucleotides.
We have studied the aberrant tau
aggregation at three different levels; in
vitro, in cell culture and by using transgenic
mice. In vitro analysis has indicated the
region, in tau molecule, involved in selfassociation. Additional in vitro experiments
indicated that tau protein modifies its
conformation when it polymerizes into
filaments.
By using cellular cultures, some conditions
were developed to allow the formation of
hyperphosphorylated tau aggregates.
Moreover, it was shown that the
Perry, G., Taddeo, M. A., Nunomura, A., Zhu, X., ZentenoSavin, T., Drew, K. L., Shimohama, S., Avila, J., Castellani,
R. J., Smith, M. A. (2002) Comparative biology and
pathology of oxidative stress in Alzheimer and other
neurodegenerative diseases: beyond damage and
response. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol.
133, 507-513
Gonzalez-Billault, C., Owen, R., Gordon-Weeks, P. R.,
Avila, J. (2002) Microtubule-associated protein 1B is
involved in the initial stages of axonogenesis in peripheral
nervous system cultured neurons. Brain Res. 943, 56-67
Perry, G., Nunomura, A., Cash, A. D., Taddeo, M. A.,
Hirai, K., Aliev, G., Avila, J., Wataya, T., Shimohama, S.,
Atwood, C. S., Smith, M. A. (2002) Reactive oxygen: its
sources and significance in Alzheimer disease. J. Neural.
Transm. Suppl. 69-75
Perry, G., Nunomura, A., Hirai, K., Zhu, X., Prez, M.,
Avila, J., Castellani, R. J., Atwood, C. S., Aliev, G., Sayre,
L. M., Takeda, A., Smith, M. A. (2002) Is oxidative damage
the fundamental pathogenic mechanism of Alzheimer's
and other neurodegenerative diseases? Free Radic. Biol.
Med. 33, 1475-1479
Based in the previous results, a transgenic
mouse overexpressing GSK3, in a
Perez, M., Hernandez, F., Gomez-Ramos, A., Smith, M.,
Perry, G., Avila, J. (2002) Formation of aberrant
phosphotau fibrillar polymers in neural cultured cells.
Eur. J. Biochem. 269, 1484-1489
mouse, tau is in hyperphosphorylated
form, this modified tau shows a lower
microtubule binding capacity, but it does
Sanchez, M. P., Gonzalo, I., Avila, J., De Yebenes, J. G.
(2002) Progressive supranuclear palsy and tau
hyperphosphorylation in a patient with a C212Y parkin
mutation. J. Alzheimers Dis. 4, 399-404
not form aberrant aggregates. However,
some memory deficits were observed by
Sayas, C. L., Avila, J., Wandosell, F. (2002) Glycogen
synthase kinase-3 is activated in neuronal cells by
Galpha12 and Galpha13 by Rho-independent and Rhodependent mechanisms. J. Neurosci. 22, 6863-6875
found in Alzheimer´s disease patients.
Additionally, we isolated another
Alvarez, G., Munoz-Montano, J. R., Satrustegui, J., Avila,
J., Bogonez, E., Diaz-Nido, J. (2002) Regulation of tau
phosphorylation and protection against beta-amyloidinduced neurodegeneration by lithium. Possible
implications for Alzheimer's disease. Bipolar Disord. 4,
153-165
Glycosaminoglycans and beta-amyloid, prion and tau
peptides in neurodegenerative diseases. Peptides 23,
1323-1332
Sadqi, M., Hernandez, F., Pan, U., Perez, M., Schaeberle,
M. D., Avila, J., Munoz, V. (2002) Alpha-helix structure
in Alzheimer's disease aggregates of tau-protein.
doing behavioural tests, and it presents
some pathological features similar to those
Agudo, M., Trejo, J. L., Lim, F., Avila, J., Torres-Aleman,
I., Diaz-Nido, J., Wandosell, F. (2002) Highly efficient
and specific gene transfer to Purkinje cells in vivo using
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665-674
Moreno-Flores, M. T., Martin-Aparicio, E., Avila, J., DiazNido, J., Wandosell, F. (2002) Ephrin-B1 promotes
dendrite outgrowth on cerebellar granule neurons. Mol.
Cell. Neurosci. 20, 429-446
modifications of tau protein by GSK3
could facilitate its aggregation.
conditional way, was isolated. In this
Avila, J., Lucas, J. J., Lim, F., Pérez, M., Hernández, F.,
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analyses we have used a mouse lacking
MAP1B and neuron cultures where the
expression of MAP2 and tau has been
prevented by addition of antisense
Perry, G., Nunomura, A., Avila, J., Pérez, Rottkamp, C.
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Neurobiology
D.3
Transducción de señales. Mecanismos de acción de
neuromoduladores e implicaciones farmacológicas
Edgardo Catalán
Graduate Student:
Eduardo Latorre
probablemente tiene lugar por mediación
El objetivo principal del proyecto de
investigación lo constituye el estudio de los
de la activación de fosfolipasa C. Estos
resultados confirman la modulación por
PAF de sistemas de transducción
mecanismos de transducción implicados
intranuclear y la existencia de receptores
en la acción de neuromoduladores, en
particular endotelina (ET) y factor activante
de plaquetas (PAF), así como la implicación
de agentes farmacológicos específicos. Los
nucleares específicos. Por otra parte, se ha
demostrado que el PAF aumenta la
fosforilación en tirosina de las proteínas
p125FAK y p130Cas mediante la producción
objetivos particulares de este proyecto han
de NO en hipocampo, hecho que valida del
todo su papel en la funcionalidad del sistema
sido:
María Victoria Mora-Gil
nervioso.
a) Estudio del mecanismo de acción de la
ET. Los estudios llevados a cabo han
confirmado que el mecanismo de acción
de la ET implica la fosforilación de proteínas
y la participación de mediadores lipídicos;
en este sentido, se ha establecido la relación
entre el neuropéptido y el sistema de
esfingolípidos como otro posible mecanismo
de transducción. Por otra parte, el análisis
c) Estudio de la participación de mediadores
lipídicos. El estudio en particular del sistema
de esfingolípidos como vía de transducción
implicada en la acción de
neuromoduladores, ha señalado el papel
de la PI3-quinasa en la translocación nuclear
de la PKC c por acción de la ceramida, así
como el papel de derivados como
del papel de la ET en estados fisiológicos
relacionados con alteraciones patológicas
ha sido analizado, demostrándose cambios
esfingosina-1-P en el metabolismo nuclear.
en los perfiles lipídicos en vasos y cerebelo,
así como un descenso en la sensibilidad a
a nivel de sistemas de transducción. Se
la acción de ET.
acción de la ET modulando el sistema de
b) Estudio del mecanismo de acción del
esfingolípidos, en particular de
esfingosina-1-P.
d) Estudio de la barrera hematoencefálica
han obtenido nuevos datos acerca de la
PAF. Nuestros estudios han demostrado
que el PAF, a través de sitios de unión
específicos, produce un incremento de
diacilglicerol en el núcleo, lo que
82
e) Estudio de sistemas de transducción
mediante agentes farmacológicos.
Signal transduction. Mechanisms of action of neuromodulators
and pharmacological implications
Research summary
The main goal of this project is to study
the biochemical mechanisms at the
transduction level involved in the action
of neuromodulators, in particular
endothelin (ET) and platelet activating
factor (PAF) and the involvement of new
pharmacological agents. In this regard,
the particular objectives are:
The changes are due to the activation of
the phospholipase C. These data confirm
a modulation by PAF of intranuclear signal
Miguel, B.G., Calcerrada, M.C., Martín, L., Catalán, R.E.,
transduction and the existence of specific
nuclear PAF receptors. On the other hand,
rat liver nuclei. Prostag. Other Lipid Mediat. 65, 159-166
PAF causes an increase on the tyrosine
phosphorylation of two phosphoproteins
which were identified as the focal adhesion
Miguel, B.G., Calcerrada, M.C., Catalán, R.E., Martínez,
Martínez , A.M. (2001) Increase of phosphoinositide
hydrolysis and diacylglycerol production by PAF in isolated
A.M. (2001) Sphingolipid derivatives modulate intracellular
Ca2+ in rat synaptosomes. Acta Neurobiol. Exp. 61, 113-
kinase p125FAK and p130Cas. PAF
117
increased the tyrosine phosphorylation
by the production of NO in hippocampus,
Calcerrada, M.C., Catalán, R.E., Martínez, A.M. (2002)
a) Study of the mechanism of action of
ET. Our studies have confirmed that the
mechanism of action of ET involves the
protein phosphorylation and some lipid
mediators; in this regard, the relationship
suggesting that PAF may play role in the
functioning of the nervous system.
between the neuropeptide and the
sphingolipid system has been established.
On the other hand, the role of ET in some
transduction system has indicated the
involvement of PI3-kinase in the nuclear
PKC c translocation after ceramide
Fernández, I., Delgado, J., Catalán, R.E., Megías, A.
physiological conditions related to
physiopathological states has been
treatment as well as a role of sphingosine-
rats. Lipids 37, 43-52
PAF-stimulated protein tyrosine phosphorylation in
hippocampus: involvement of NO synthase. Neurochem.
Res. 27, 313-318
c) Study of the involvement of lipid
mediators. The study of the sphingolipid
Latorre, E., Morán, M., Aragonés, M.D., Saborido, A.,
(2002) Exercise training-induced changes in sensitivity
to endothelin-1 and aortic and cerebellum lipid profile in
1-P on the nuclear metabolism.
analyzed and changes in both vascular
Calcerrada, M.C., Miguel, B.G., Martín, L., Catalán, R.E.,
and cerebellar lipid profiles and a
decrease sensitivity to ET action have
d) Functioning of the blood-brain barrier
mainly at the transduction level. New data
Martínez, A.M. (2002) Involvement of phosphatidylinositol-
been observed.
about the modulation of sphingolipids, in
induced by C2-ceramide in rat hetapocytes. FEBS Letters
particular sphingosine-1-P, by ET have
514, 361-365
b) Study of the mechanism of action of
been observed.
PAF. We have demonstrated that PAF
increases diacylglycerol in the nuclei
e) Modulation of the transduction systems
through specific nuclear PAF-binding sites.
by pharmacological agents
83
3-kinase in nuclear translocation of protein kinase C c_
Neurobiología
Neurobiology
D.4
Bases moleculares de la plasticidad neuronal
F. Javier Díez Guerra
en el contexto de la señalización intracelular
Las proteínas de la familia GMC (GAP-43,
Neurogranina, MARCKS, MacMARCKS y
CAP-23) comparten, entre otras
Noa Martín Cófreces
Graduate Students:
Carmen Granda Vega
relacionada con el dinamismo del
citoesqueleto de actina, la aparición de
lamelipodios y filopodios, la polarización,
características, una estructura filamentosa,
su interacción con calmodulina y fosfolípidos
la adhesión y la motilidad celular.
y una expresión elevada en tejido nervioso
de mamíferos, especialmente en las
primeras etapas del desarrollo.
Utilizamos técnicas convencionales de
mutagénesis dirigida y fusión con proteínas
fluorescentes que nos permiten analizar la
Su funcionalidad se relaciona con el
dinamismo morfológico y la motilidad
neuronal, ambos procesos fundamentales
en el marco de la plasticidad neuronal y
relevancia funcional de dominios
estructurales y sitios de fosforilación o
acilación en proteínas GMC, realizar
seguimientos “in vivo” de su traslocación
entre compartimentos subcelulares y
Patricia Molina Ortiz
Irene Domínguez González
proteínas y/o lípidos. Este estudio se realiza
reorganización sináptica típicas del
desarrollo. El trabajo de nuestro grupo de
investigación se orienta hacia el
esclarecimiento de los mecanismos de
acción de estas proteínas en el ámbito
molecular y celular, y su estudio como
“dianas moleculares” en el desarrollo de
agentes activos para la regeneración
neuronal y la prevención de
neurodegeneración.
analizar “in situ” su interacción con otras
proteínas mediante técnicas de microscopía
de transferencia resonante de fluorescencia
(FRET). Nuestro interés en conocer el modo
de acción de las proteínas GMC se
fundamenta en su potencial como “dianas
moleculares” para modular localmente la
plasticidad neuronal.
Este conocimiento contribuirá al diseño de
nuevos agentes farmacológicos con acción
Para ello, estudiamos la expresión,
localización subcelular y modificaciones
post-traduccionales de las proteínas GMC,
así como sus interacciones con otras
Célula Swiss-3T3 tratada (90 min) con el péptido Ant-IQ(Nrg) biotinilado y visualizado con
estreptavidina-TxRed. Observar la afinidad del péptido por vesículas endocíticas.
84
sobre la regeneración neuronal post-lesión
acoplada a recuperación funcional y la
prevención de neurodegeneración masiva
asociada con episodios epilépticos.
Molecular basis of neuronal plasticity
Research summary
GMC proteins (GAP-43, Neurogranin,
MARCKS, MacMARCKS and CAP-23)
signal transduction and actin cytoskeleton
dynamics, lamelipodia and filopodia
Sánchez, C., Arellano, J.I., Rodríguez-Sánchez, P., Avila,
formation, and cellular polarity, adhesion
and motility.
associated protein 2 phosphorylation is decreased in
share, among other features, an elongated
structure, their ability to interact with
calmodulin and phospholipids and their
high expression in mammalian nervous
tissue, particularly during the earlier
stages of development.
Their functionality is associated with
cellular morphology dynamics and also
cellular motility, both of them fundamental
processes central to neuronal plasticity
and synaptic reorganization during
potential sites for phosphorylation or
acylation, carry out time-lapsed “in vivo”
imaging demonstrating their translocation
among subcellular compartments and “in
situ” analyze their interaction with other
proteins using fluorescence resonance
energy transfer (FRET) microscopy.
and cellular level, and their potential use
mode of action of GMC proteins is backed
by their potential as appropriate “molecular
treatments designed to enhance neuronal
regeneration and prevent
neurodegeneration.
the human epileptic temporal lobe cortex. Neuroscience
107, 25-33
We use conventional site-directed
mutagenesis and generation of fusion
quimeras with fluorescent proteins to
study the functional relevance of structural
domains of GMC proteins and their
development. Our research group focuses
its work on the understanding of the GMC
proteins mode of action at the molecular
as “molecular targets” of new agents and
J., DeFelipe, J., Díez-Guerra, F:J. (2001) Microtubule-
Our interest in disclosing the molecular
targets” to modulate neuronal plasticity
locally. This would help to design new
pharmacological agents with specific
Thus, we currently study GMC proteins
expression, subcellular localization, post-
action on post-lesion neuronal
regeneration and functional recovery and
the prevention of massive
translational modifications and interactions
neurodegeneration associated to epileptic
with other proteins or lipids. This study is
carried out in the context of intracellular
episodes.
Experimento de seguimiento “in vivo” de
la adhesión y extensión sobre sustrato
de células Swiss-3T3 transfectadas con
GAP-43-GFP. Se observan dos células
una transfectada y otra no. La primera
ralentiza su extensión sobre el sustrato
al tiempo que extiende gran cantidad de
filopodios.
85
Paglini, G., Peris, L., Díez-Guerra, F.J., Quiroga, S.
Cáceres, A. (2001) The cdk5-p35 kinase associates with
the Golgi apparatus and regulates membrane traffic.
EMBO Rep. 2, 1139-1144
Noa Beatriz Martín Cófreces. 2002. “Fisiología Molecular
de GAP-43: una proteína implicada en guía y extensión
axonal”. Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de
Ciencias.
Neurobiología
Neurobiology
D.5
Regulación de la expresión génica en
enfermedades neurogegenerativas
no-canónica del tipo E-box.
El interés del grupo se centra, en primer
lugar, en el estudio de los mecanismos que
regulan la expresión de la apolipoproteína
E en células nerviosas.
Cecilio Giménez
promotor, la cual contiene una secuencia
Francisco Zafra
El segundo objetivo del grupo sigue siendo
el estudio de la sinápsis glicinérgica,
centrado en la relación estructura función
y regulación de los transportadores de
ApoE, además de jugar un papel importante
en el metabolismo de las lipoproteínas
plasmáticas, está involucrada en procesos
glicina GLYT1 y GLYT2 de células nerviosas.
mantener bajos niveles de glicina en el
espacio sináptico regulando así la actividad
de la neurotransmisión glicinérgica.
Estudiantes /
de mantenimiento y reparación de células
nerviosas. ApoE4, una de las isoformas de
la proteína, es un factor de riesgo importante
para la enfermedad de Alzheimer tardía.
Aunque es conocido el hecho de que se
producen cambios en la producción de
Vanesa de Mingo
desórdenes neuromusculares y en algún
tipo de esquizofrenia.
ApoE en respuesta a lesiones degenerativas
en zonas como el hipocampo, o en
respuesta a mediadores inflamatorios, los
mecanismos de regulación del gen que
Enrique Núñez
codifica esta proteína son bastante
En este periodo hemos estudiado la
distribución subcelular de las isoformas de
GLYT1 y de GLYT2 en células polarizadas
desconocidos.
MDCK y en neuronas de hipocampo.
Graduate Students:
Irene Poyatos
Enrique Salero
Beatríz Cubelos
Inma González
Estas proteínas son las responsables de
Alteraciones en la actividad de GLYT1 y de
GLYT2 pueden estar involucradas en
Mediante mutagénesis dirigida hemos
Nuestro grupo ha demostrado que los
factores de transcripción AP-2, Zic1 y Zic2
se unen y transactivan al promotor del gen
de ApoE en células de glia. Más
recientemente hemos demostrado que el
factor de transcripción USF 1, perteneciente
a la familia de proteínas bHLH con
cremallera de leucina, activa al promotor
de ApoE uniéndose a la región URE3 del
Distribución regional de los transportadores GLYT1 (verde) y v-GLUT (rojo) en el área
CA3 en hipocampo de cerebro de rata.
Regional distribution of GLYT1 (green) and v-GLUT (red) transporters in the CA3
of rat brain hippocampus.
86
identificado señales de localización
basolateral y/o apical en los extremos amino
y carboxilo de GLYT1.
Por otro lado, hemos demostrado que los
sitios de glicosilación de GLYT2 son
responsables de su localización apical en
células polarizadas.
Regulation of the gene expression in
Research summary
The main interest of the group is, firstly,
focussed in the study of the regulatory
mechanisms involved in the expression
of the apolipoprotein E by nerve cells.
ApoE, apart of playing a key role in the
metabolism of plasma lipoproteins, has
been demonstrated to be involved in
neuronal maintenance and repair.
ApoE4, one of the four existing isoforms
of the protein, is an important risk factor
for late-onset Alzheimer´s disease.
Although has been demonstrated changes
into the regulatory element URE3 to a
Salero, E., Pérez-Sen, R., Aruga, J., Giménez, C., Zafra,
region which contains a functional noncanonical E-box motif.
F. (2001) Transcription factors Zic1 and Zic2 bind and
transactivate the apolipoprotein E gene promoter. J. Biol.
Chem. 276, 1881-1888
The second objective of the group is the
study of the glycinergic synapse, focused
on the structure-function and the
Martínez-Maza, R., Poyatos, I., López-Corcuera, B.,
Núñez, E., Giménez, C., Zafra, F., Aragón, C. (2001) The
regulation of the glycine transporters
GLYT1 and GLYT2 from nerve cells. These
role of N-glycosylation in transport to the plasma
proteins are responsible to maintain low
levels of glycine in the synaptic cleft during
glycine-mediated neurotransmission.
Dysfunctions of the activity of GLYT1 or
GLYT2 could underlay to some
GLYT2. J. Biol. Chem. 276, 2168-2173
musculoskeletical disorders or to some
746-750
membrane and sorting of the neuronal glycine transporter
Zafra, F., Giménez, C. (2001) Molecular determinants
involved in the asymmetrical distribution of glycine
transporters in polarised cells. Biochem. Soc. Trans. 29,
in ApoE production in response to
types or schizophrenia.
neurodegenerative insults in the
hippocampus, or in responds to
inflammatory mediators, the regulation of
the gene encoding for this protein remains
During this period we have studied the
asymmetrical subcellular distribution of
of a non-canonical E-box motif as a regulatory element
the GLYT1 isoforms, and of GLYT2 in
gene. Biochem. J. 20021142
polarised MDCK cells and in neurons
from the hippocampus.
Tesis Doctorales / Doctoral Thesis
largely unknown.
Salero, E., Giménez, C., Zafra, F. (2002) Identification
Previous studies of our group
By using site directed mutagenesis we
demonstrated that transcription factors
AP-2, Zic1 and Zic2 bind and transactivate
have been able to identify signals for
basolateral/somatodendritic localisation
the apolipoprotein E gene promoter in
in the amino and carboxyl tail of GLYT1.
glioblastoma cells. More recently, we have
identified transcription factor USF 1, a
protein that belongs to the bHLH family
Moreover, we have shown the N-
which also contains a leucine zipper,
activates the apoE promoter by binding
glycosylation sites of GLYT2 are involved
in the apical localisation of this protein in
polarised cells.
87
in the proximal promoter region of the apolipoprotein E
Enrique Salero. 2001. “Identificación de los factores Zic1,
Zic2 y USF como reguladores transcripcionales del gen
de la apolipoproteína E”. Universidad Autónoma de
Madrid.
Neurobiología
Neurobiology
D.6
Bases moleculares de la adaptación al ejercicio
y de la plasticidad muscular
Rafael Manso
Fellows:
Beatriz González Alonso
Pilar Negredo Madrigal
María Jesús Pérez Lorenzo
El interés científico general del laboratorio
se ha dirigido a la caracterización de señales
y rutas de transducción que median cambios
adaptativos inducidos por el ejercicio. Se
ha estudiado la implicación de las HSPs en
la respuesta hepática al ejercicio ya que su
expresión incrementada permite entender
como se puede conseguir tolerancia a
ejercicio más intenso y a otras situaciones
de estrés celular, al mismo tiempo. Utilizando
como modelo la rata ejercitada en tapiz
rodante se puso de manifiesto una
peso molecular HSP25 en la respuesta
hepática al ejercicio. Se han cubierto
aspectos relativos a las cinéticas de
inducción de la proteína y del mRNA, así
como a la modificación post-traduccional
asociada a la respuesta en diversas etapas
del post-ejercicio
Un segundo aspecto de interés investigador
se refirió a la caracterización de la diversidad
molecular de las cadenas ligeras
reguladoras de la miosina (rMLCs) en el
músculo estriado de mamífero. Se han
analizando los patrones de variantes en
respuesta compleja tras un golpe agudo de
ejercicio que se inició con la inducción
temprana, bajo control transcripcional, de
diversas HSPs. A ésta siguió una
acumulación transitoria de HSP72, que es
músculo esquelético rápido y lento y en
aurícula y ventrículo de diversas especies,
el antecedente de al menos otras dos ondas
contracción-relajación muscular
de acumulación en el post-ejercicio tardío
estableciendo una posible correlación entre
que tuvieron lugar en ausencia de niveles
detectables del mensajero. Se ha estudiado
el papel del estrés oxidativo como señal
ellas y las isoformas conocidas de las
cadenas pesadas de miosina. Se han
utilizado aproximaciones de proteómica
inductora de la respuesta hepática de las
para caracterizar los mecanismos
HSPs tras el ejercicio. La correlación directa
entre los niveles de HSP72 acumulada
durante el post-ejercicio temprano y los de
moleculares responsables de la generación
de variantes y se han analizado las
TBARS conjugadas, puso de manifiesto la
existencia de un mecanismo muy sensible
para ajustar la amplitud de esta respuesta
para entender el papel que las diferentes
isoformas de las rMLCs y sus estados
fosforilados pueden tener en el ciclo de
transiciones que tienen lugar durante la
remodelación de fibras rápidas a lentas que
se induce por estimulación eléctrica de baja
frecuencia.
en función del estrés oxidativo.
Un tercer aspecto de interés investigador
Se han identificado variantes de carga de
las HSP70 citosólicas en el hígado. Para
entender su relevancia para la actividad
biológica o estabilización de niveles
incrementados, se ha estudiado su
presencia y abundancia relativa durante el
periodo temprano y en los picos de las
se refiere a la influencia de factores neurales
y hormonales en la expresión de proteínas
contráctiles y de estrés en músculo
esquelético. Para ello se han utilizado
modelos animales de ratas ejercitadas,
ondas de acumulación de HSP72 en el
post-ejercicio tardío. Se ha realizado también
cordotomizadas y estimuladas
eléctricamente a través del nervio y, en
colaboración con el Departamento de
Cirugía Ortopédica, modelos de lesión del
un estudio paralelo para caracterizar la
ligamento cruzado anterior en gato.
implicación de la proteína de estrés de bajo
Diversidad molecular de las cadenas ligeras reguladoras de miosina en músculo esquelético
de rata y cambios en su expresión durante el remodelado del músculo rápido EDL inducido
por estimulación eléctrica crónica de baja frecuencia (s, f, isoformas lenta y rápida; E1, 7,
21, 30, días de estimulación eléctrica del EDL)
88
Molecular bases of the adaptation to exercise and
of skeletal muscle plasticity
Research summary
The overall research interest of the
laboratory concerned the characterization
of signals and transduction pathways
involved in adaptive changes in response
to exercise. The increased expression of
heat-shock proteins (HSPs) provides a
conceptual framework to understand how
exercise could increase tolerance to
physical activity of growing intensity and
to a variety of other stressors at the same
time. To get a better understanding of
whole organism adaptation to chronic
exercise one of the research aims was to
characterize the involvement of HSPs in
understand the role of the small heatshock protein HSP25 in the hepatic
exercise response. This study covered
induction kinetics of synthesis and
González, B., Negredo, P., Hernando, R., Manso, R.
accumulation of protein and mRNA during
Eur. J. Physiol. 443, 377-386
early and late post-exercise, as well as
post-translational modifications associated
with the exercise response.
A second area of interest was the
characterization of the molecular diversity
of the regulatory myosin light chains
(rMLCs) in mammalian striated muscle.
A comparative study of two-dimensional
patterns of rMLCs in fast and slow skeletal
single exercise bout was observed. It was
muscle types an in atrium and ventricle
of different mammals was performed to
understand the role of the different rMLCs
and of their phosphorylated products in
the contraction-relaxation cycle of skeletal
initiated by an early, transcriptionally-
muscle and to establish a possible
controlled induction of the synthesis and
accumulation of HSP70s and other HSPs,
followed by at least two further waves of
correlation between them and the known
isoforms of the myosin heavy chains. The
molecular mechanism involved in
HSP72 accumulation that took place over
generating the diversity of variants of
the next 48 h in the absence of detectable
levels of mRNA. The role of oxidative
stress as the initiating signal of this
rMLCs, considering the possibility of
multiple phosphorylation, was investigated
the hepatic exercise response. Using
treadmill-exercised rats as a model a
complex hepatic response of HSPs to a
response was also investigated. The
positive correlation between levels or
protein-bound TBARS and accumulated
HSP72 during the early post-exercise
period (in the absence of statistically
significant increases in either free or
using a proteomic approach. The
relevance of rMLC variants in defining
muscle contractile properties was
investigated following their transitions
during fast-twitch muscle remodelling
induced by low-frequency electrical
stimulation.
protein-bound TBARS), indicated the
existence a sensitive mechanism capable
of adjusting the amplitude of the stressresponse to exercise according to
perceived oxidative stress.
Cytosolic HSP70s displayed isoelectric
point variants in the liver. The relevance
of these variants for biological activity or
stabilization of increased HSP70-levels
was studied by analysing their presence
and relative abundance in the liver in the
A third research interest was aimed at
understanding the implication of neural
and hormonal activity in defining the
expression of contractile and stress
proteins in skeletal muscle. Models of
exercise, spinal cord transection and
electrical stimulation in rats and a model
of lesions of the anterior cruciate ligament
(in collaboration with the Department of
Orthopaedic Surgery) have been used.
peaks of the HSP72 accumulation waves
during early and late post-exercise. A
parallel study was performed to
Molecular diversity of myosin regulatory light chains in
rat skeletal muscle and changes in their expression
levels during remodelling of the fast-twitch EDL muscle
induced by low-frequency electrical stimulation (s, f,
slow and fast isoforms; E1, 7, 21, 30, days of electrical
stimulation of EDL muscle)
89
(2002) Protein variants of skeletal muscle regulatory
myosin light chains: prevalence in mammals, generation
and transitions during muscle remodelling. Pflügers Arch-
Beatriz González Alonso. 2002. “Inducción y estabilización
de los niveles de expresión de proteínas de estrés en
el hígado en respuesta al ejercicio agudo y crónico”.
Neurobiología
Neurobiology
D.7
Biología de células troncales neurales humanas.
Potencial para reposición celular y terapia génica
en neurodegeneración
Alberto Martínez Serrano
Postdoctorales /
Ana Villa
2. Potencial para reposición celular en
el cerebro dañado.
La actividad de nuestro grupo se centra en:
i) el estudio de la biología básica de células
neurales troncales (preferentemente de
origen humano), y ii) el estudio de su
potencial para el desarrollo de estrategias
En esta línea de trabajo estamos
caracterizando cuál es el potencial de
supervivencia, integración, migración y
diferenciación de lineas de células neurales
de reposición celular (neuronal y glial) y de
transferencia génica en situaciones de
neurodegeneración.
troncales humanas, una vez transplantadas
al cerebro adulto, principalmente en estriado
1. Biología básica de células troncales
neurales de origen humano.
3. Desarrollo de nuevas estrategias de
Utilizando células neurales troncales
Florian Mayrhofer
Nuestro trabajo se centra en parte en el
desarrollo de métodos de expansión y
perpetuación de estas células, cuyo
crecimiento en cultivo es muy lento y está
limitado, de forma similar a lo que ocurre
con otras células humanas mortales. En
cabo knock-in, y así, mediante
recombinación homóloga, modificar
genéticamente estas células de la mejor
Inmaculada Ocaña
años anteriores hemos desarrollado
Isabel Liste
Milagros Ramos
Graduate Students:
Francisco Javier Rubio
y sustancia negra.
transferencia génica.
Carlos Bueno
Beatriz Navarro
Matthew Sledenbroek
herramientas genéticas para la perpetuación
de estas células. En previsión de la
necesidad de retirar los genes
humanas, estamos desarrollando los
procedimientos necesarios para llevar a
manera hoy en día posible. En teoría, esta
estrategia nos permitirá llevar a cabo
transferencia génica al cerebro adulto de
inmortalizadores de las células, para su
forma controlada, eficiente y completamente
segura, por un tiempo ilimitado, y también
potencial uso en el ser humano, estamos
ya utilizando construcciones donde éstos
ofrece la posibilidad de regulación fisiológica
de los transgenes.
están flanqueados por sitios loxP.
Además, tenemos interés en determinar el
potencial de diferenciación a linajes neurales
de estas líneas celulares, in vitro e in vivo,
y los factores epigenéticos y genéticos que
controlan estas decisiones.
Neuronas dopaminérgicas humanas (aquéllas que degeneran en la
enfermedad de Parkinson), generadas a partir de una línea establecida
de progenitores humanos de mesencéfalo ventral.
Human dopaminergic neurons (those that degenerate in Parkinson’s
disease), generated from a established cell line of neuronal progenitors
of ventral mesencephalic origin.
90
Biology of human neural stem cells. Potential for
gene therapy in neurodegeneration
Research summary
Our research is focused in the study of:
i) the basic biology of neural stem cells
(preferably of human origin), and ii) their
potential for therapeutic intervention in
human neurodegenerative conditions, in
cell replacement or gene therapy
2. Cell replacement potential in the
damaged brain.
Villa, A., Rubio, J.F., Navarrro B, Bueno, C., MartínezSerrano, A. (2001) Human neural stem cells in vitro. A
focus on their isolation and perpetuation. Biomed.
In this line of work we are characterizing
Pharmacother. 55, 1-5
the survival, integration, migration and
differentiation properties of human neural
stem cell lines, once grafted to the adult
Martínez-Serrano, A., Rubio, F.J., Navarro, B., Bueno,
Cells: In vitro and in vivo properties, and potential for
modalities.
mammalian brain, mainly in the striatum
and substantia nigra.
1. Basic biology of human neural stem
cells.
3. Development of new gene therapy
strategies.
Our work is focused on the development
Using human neural stem cell lines, we
Lenzlinger, P.M., Sinson, G., Grady, M.S., McIntosh, T.K.
of expansion and perpetuation procedures
for these cells, which normally grow very
are developing knock-in procedures
(based on homologous recombination),
on the assumption that this is the best
available way of genetically modifying
(2001) Neuroprotective and behavioral efficacy of nerve
C., Villa, A. (2001) Human Neural Stem and Progenitor
gene therapy and cell replacement in the CNS. Curr.
Gene Ther. 1, 279-299
Philips, M.F., Mattiasson, G., Wieloch, T., Bjorklund, A.,
Johansson, B.B., Tomasevic, G., Martinez-Serrano, A.,
slowly and for a limited time, since we
are dealing with cells with mortal
properties. As a result of previous work,
we have developed genetic tools for the
perpetuation of these cells. Since the
presence of an oncogene or protooncogene in the cells might hamper or
limit their use in the clinical setting (even
when the cells are not transformed, just
cells nowadays. In principle, this strategy
will allow for ex vivo gene transfer to the
adult mammalian brain in a controlled,
efficient and safe manner, and for
unlimited time. It will also provide means
growth factor-transfected hippocampal progenitor cell
transplants after experimental traumatic brain injury. J
Neurosurg. 94, 765-774
Martínez-Serrano, A. (2002) Células troncales neurales
de origen humano: Investigación básica, aplicada, y
perspectivas terapéuticas para el tratamiento de la
enfermedad de Parkinson. En “Etica y clonación:
for the physiological control of transgene
Realidades y exageraciones”. Fundación Valenciana de
expression.
Estudios Avanzados
established), we have already developed
lines in which the perpetuating gene is
floxed (flanked by loxP sites for site
Villa, A., Navarro, B., Martinez-Serrano, A. (2002) Genetic
specific recombination), to allow for its
cells (HNSCs): cellular properties and therapeutic
removal before transplantation of the cells.
potential. Brain Res. Bull. 57, 789-794
In addition, we have the interest to
determine the differentiation potential of
Villa, A., Martinez-Serrano, A. (2002) Strategies for the
these immortal neural stem cells towards
different neural lineages, both in vitro and
be used in the clinics: Scientific and bio-ethic implications.
perpetuation of in vitro expanded human neural stem
generation of human dopaminergic neurons that could
J. Int. Soc. Bioethics (SIBI) 8, 71-82
in vivo, as well as to explore the role of
epigenetic and genetic factors influencing
cell fate decisions.
Rueda, D., Navarro, B., Martínez-Serrano, A., Guzmán,
M., Galve-Roperh, I. (2002) The endocannabinoid
anandamide inhibits neuronal development through
attenuation of the Erk pathway. J. Biol. Chem. 277, 4664546650
Astroglia (GFAP, verde) y neuronas (-III-tubulina,
rojo) humanas diferenciadas a partir de una línea
de células troncales neurales humanas.
Human astroglia (GFAP stain, green) and neurons
(-III-tubulin stain, red) differentiated from a cell line
of human neural stem cells.
91
Neurobiología
Neurobiology
D.8
Mecanismos de señalización y regulación de
receptores acoplados a proteínas G
Los receptores acoplados a proteínas G
inflamatorios como la artritis reumatoide.
Sin embargo, no se conoce en detalle cómo
esos cambios alteran la señalización por
(GPCR) median las acciones de diversos
mensajeros que desempeñan un papel
esencial en la función del sistema
GPCRs y contribuyen al
desencadenamiento y/o progresión de estas
patologías, lo que podría ser de gran interés
para identificar nuevas estrategias
Catalina Ribas
cardiovascular o del sistema inmune.
Además de con proteínas G
heterotriméricas, los GPCR activados
Petronila Penela
interaccionan con quinasas de receptores
Federico Mayor, jr.
Ana Ruiz-Gómez
Cristina Murga
Postdoctorales /
Esperanza Morato
Graduate Students:
diagnósticas y terapéuticas. En este
contexto, nuestro grupo se plantea los
siguientes objetivos generales: a)
acoplados a proteínas G (GRKs) y con las
proteínas moduladoras denominadas
arrestinas. Estas dos familias de proteínas
profundizar en los mecanismos de control
desempeñan un papel clave en la rápida
descritos en situaciones patológicas; b)
contribuir a definir el conjunto de
modulación de la funcionalidad y la dinámica
intracelular de receptores tras la activación
de la función, expresión y estabilidad de
GRKs y su relación con los cambios
interacciones e interconexiones funcionales
Ana Elorza
por ligandos, así como permiten el
reclutamiento y regulación de otras
M. Carmen Jiménez
proteínas celulares, iniciando nuevas vías
Sandra Peregrín
de señalización, por lo que son tanto
moduladores como componentes
esenciales de la transducción de señales
arrestinas sobre vías de señalización y
mediada por GPCR. Los niveles y
de quimioquinas. Finalmente, nuestro grupo
funcionalidad de algunas GRKs están
colabora con otros laboratorios del Centro
alteradas en situaciones patológicas como
en el estudio de la relación entre sistemas
el fallo cardiaco congestivo, la hipertrofia
cardiaca, la hipertensión o procesos
de señalización y la enfermedad de
Susana Sarnago
Antonio Sobrado
Alicia Salcedo
Carlota García-Hoz
Estudiantes /
Undergraduate Students
Helena Holguín
Ana Molina
Consecuencias funcionales de la fosforilación de GRK2 por
la tirosina quinasa c-Src
Functional consequences of GRK2 phosphorylation by c-Src
92
(“interactoma”) de las GRKs y c) estudiar
el efecto de cambios en la
expresión/funcionalidad de GRKs y
procesos celulares modulados por GPCR
del sistema cardiovascular o por receptores
Alzheimer.
G protein-coupled receptors signaling and
regulatory mechanisms
Research summary
known in detail how these changes alter
GPCR signal transduction and contribute
to the ethiology and/or progression of
Penela, P., Elorza, A., Sarnago, S., Mayor, jr., F. (2001)
these diseases. This would be relevant
for the identification of new diagnostic
and therapeutic strategies. In this context,
Penela, P., Barradas, M., Alvarez-Dolado, M., Muñoz,
functions. Activation of GPCR leads to its
interaction with at least two kinds of
proteins: heterotrimeric G proteins and
the main objectives of our group are: a)
levels in rat liver, lung and heart. Endocrinology 142,
GRKs (G protein-coupled receptor
degradation of GRKs and their relevance
in promoting changes in their levels in
different pathological conditions; b) to
investigación biomédica. En: Investigación y Siglo XXI.
contribute to identify the network of
functional conexions and interactions of
GRKs with other cellular proteins (the
Mayor, F., (2001) Genética molecular de la enfermedad
GRKs “interactome”); and c) to investigate
editores). Masson, Barcelona, pp. 105-110
proteins, thus triggering new signaling
pathways. Therefore, GRKs and arrestins
the effect of changes in the
expression/functionality of GRKs and
Ribas, C., Takesono, A., Sato, M., Hildebrandt, J.D,
can be considered as both regulators and
arrestins on key signal transduction
of the heterotrimeric G-proteins Gi/Go by the NG108-15
key components of GPCR signal
transduction pathways. Alterations in the
levels and functionality of GRKs have
pathways and cellular functions mediated
by cardiac GPCR or chemokine receptors.
G-protein activator. J Biol Chem. 277, 50223-50225
Murga, C., Zohar, M., Teramoto, H., Gutkind, J.S.. (2002)
Finally, our group collaborates with other
Rac1 and RhoG promote cell survival by the activation
been related to congestive heart failure,
cardiac hypertrophy or hypertension, and
to inflammatory processes such as
laboratories of this Center in the study of
relationships between signalling cascades
of PI3K and Akt, independently of their ability to stimulate
and Alzheimer’s disease.
Ribas, C., Sato, M., Hildebrandt, J.D., Lanier, S.M. (2002)
G protein-coupled receptors (GPCR)
mediate the actions of a variety of
messengers that are key regulators of
cardiovascular or immune system
kinases), which in turn promote the
binding of arrestins. GRKs and arrestins
play different important roles: they
uncouple GPCR from G proteins, promote
GPCR internalization and recycling; and
allow the recruitment of other cellular
to better understand the mechanisms
governing function, expression and
rheumatoid arthritis. However, it is not
ß-arrestin and c-Src-dependent degradation of G-proteincoupled receptor kinase 2. EMBO J. 20, 5129-5138
A., Mayor, jr., F. (2001) Effect of hypothyroidism on G
protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) expression
987-991
Mayor, F., (2001) La Biología Molecular y los retos de la
Fundación José Casares Gil. Real Academia de
Farmacia, pp. 95-118
de Alzheimer. En: Alzheimer XXI: Ciencia y Sociedad
(J.M. Martínez-Lage, Z.S. Khachaturian, J.J. Artells, F.
Guillén, J.J. López-Ibor, F. Mayor, jr y J.M. Segovia,
Lanier, S.M. (2002) Pertussis toxin-insensitive activation
JNK and NF-kappaB" Oncogene. 21, 207-216
Analysis of signal transfer from receptor to Go/Gi in
different membrane environments and receptorindependent activators of brain G protein. Methods
Enzymol. 344, 140-152
Murga, C., Barber, D.F. (2002) Molecular mechanisms
of pre-T cell receptor-induced survival J Biol Chem 277,
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Mayor, F., Rodes, J., (2002) La investigación biomedica
básica y clínica en España. En: Reflexiones sobre la
Ciencia en España. El caso particular de la Biomedicina
(J.A. Gutiérrez-Fuentes y J.L. Puerta López-Cózar, eds)
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Lombardi, M.S., Kavelaars, A., Penela, P., Scholtens,
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Jr., F. & Heijnen, C.J. (2002) Oxidative stress decreases
G protein-coupled receptor kinase 2 in lymphocytes via
a calpain-dependent mechanism” Mol. Pharmacol. 62,
379-388
Susana Sarnago Cebada. 2001. “Mecanismos de
regulación de la quinasa de receptores acoplados a
proteínas G GRK2”.
Ana Elorza Moreno. 2001. “Degradación de la quinasa
de receptores acoplados a proteínas G, GRK2: un nuevo
Modelo para la activación y translocación a la membrana de GRK2
mecanismo de la regulación de su función”.
Proposed model for GRK2 activation and membrane translocation. In the absence of modulators, an
equilibrium would exist between the active “open” (B) and inactive “closed” (A) conformation. It would be
displaced towards the inactive conformation through stabilization by intramolecular interactions involving
N- and C-terminal domains of GRK2. C.- In vitro, the substitution of such interactions by the addition of
kinase fragments would allow the disruption of the constrained conformation and favor a more active state
of GRK2. A similar mechanism would explain the in vitro effects on GRK2 activity of modulators (G `a
subunits, phospholipids, receptor domains) able to bind to N- and C-terminal domains of GRK2. D.- In
vivo the concerted interaction of such intracellular ligands with different GRK2 domains would simultaneously
lead to the disruption of the inhibitory intramolecular associations and to the targeting of GRK2 to the
plasma membrane, where the RGS domain would also be free to interact with G_q subunits. PIP2,
Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate; ßa, G protein ßa subunits; circled P, putative GRK2 phosphorylation
sites in the receptor.
Maria del Carmen Jiménez Sainz. 2001. “Mecanismos
de señalización y regulación de receptores de
quimioquinas”.
Federico Mayor:
Miembro del Consejo Asesor de Sanidad / Member of
the Advisory Board of the Minister of Health (2001- ).
Miembro del Consejo de Dirección de la Fundación
Española para la Ciencia y la Tecnología (FECYT) /
Member of the Executive Board of the Spanish Foundation
93
for Science and Technology (2001- ).
Neurobiología
Neurobiology
D.9
Neurotransmisión y desarrollo
Galo Ramírez
Interacción de los nucleótidos de
una hipótesis sobre los cambios
conformacionales que acompañan a la
interacción agonista/receptor y la
guanina con los receptores ionotrópicos
de glutamato
consiguiente generación de un poro/canal
iónico asociada a una perturbación
específica del residuo Glu209 (1). A
Los objetivos de esta nueva etapa del
proyecto se centran en el diseño, mediante
modelización molecular, la síntesis y el
continuación, hemos analizado, con la
Jesús Mendieta
Científicos Visitantes/
ensayo biológico de una nueva línea de
convencionales, como el DNQX, y el propio
GMP. A diferencia del primero, que impide
el cambio conformacional que tiende a
Ana Barat
Marcos Frizzo
Cintia Roehrig
Universidad Federal de Río Grande del
antagonistas de glutamato que
interaccionarían con los iGluRs de la misma
forma que lo hace el GMP.
Sur, Brasil.
La primera etapa, el diseño, necesitaba
José Luis García-Mira
previamente de la validación de un modelo
estructural de receptor ionotrópico de
glutamato basado en datos cristalográficos,
en lugar de los modelos derivados de las
conocidas analogías entre estos receptores
y las proteínas periplásmicas bacterianas
(implicadas en el transporte de
aminoácidos) y de los datos de mutagénesis
dirigida. Partiendo del modelo reducido de
Gouaux y colaboradores, hemos estudiado,
mediante técnicas de dinámica molecular
misma metodología, la interacción con el
receptor de antagonistas competitivos
cerrar los segmentos S1 y S2 del receptor
sobre los agonistas, el GMP permite ese
cierre pero no activa el receptor (no se
genera el canal iónico) al no interaccionar
el GMP con el residuo Glu209, actuando
pues como un falso agonista, lo que explica
su antagonismo funcional y su carácter
neuroprotector/antiexcitotóxico (enviado
para publicación).
Finalmente hemos continuado nuestra
exploración de los efectos moduladores de
otros derivados purínicos de la guanina
en ordenador, la interacción del glutamato
sobre la captación neuronal y glial del
glutamato (2), y los estudios sobre la
y del kainato con el sitio activo del receptor
GluR2 de AMPA/kainato y hemos propuesto
presencia de elementos purinérgicos y sus
metabolitos en el LCR (3).
94
Neurotransmission and development
Research summary
receptor, and we have furthermore
Mendieta, J., Ramírez, G., Gago, F. (2001) Molecular
proposed a new hypothesis to explain the
conformational changes associated to
dynamics simulations of the conformational changes of
of glutamate and kainate. Proteins (Structure, Function
The molecular design, organic synthesis
the agonist-receptor interaction, including
the opening of a ionic channel specifically
triggered by contact with Glu209 (1). Next,
and biological assay of a new line of
compounds, interacting with the iGluRs
in the same way as GMP, were among
we have analyzed, with the same
methods, the interaction of the receptor
model with conventional competitive
Lara, D.R., Schmidt, A.P., Frizzo, M.E.S., Burgos, J.S.,
the tasks defined for future work at the
beginning of this last two-year period.
Concerning design, we first needed to
establish a structural/functional model of
antagonists (e.g., DNQX) and GMP.
Whereas DNQX sterically blocks the
by glutamatergic agents. Brain Res. 912, 176-180
closing movement of the S1 and S2
Portela, L.V.C., Oses, J.P., Silveira, A.L., Schmidt, A.P.,
Lara, D.R., Battastini, A.M.O., Ramírez, G., Vinadé, L.,
the iGluRs on the basis of crystallographic
data, rather than early models based on
segments, GMP allows such closure
without interacting with Glu209 so that
pore opening does not take place: GMP
analogies among the receptors and
then behaves as a false agonist, a
Res. 950, 74-78
bacterial periplasmic proteins (amino acid
transporters), and on the results of
directed mutagenesis of selected
functional competitive antagonist and an
efficient neuroprotector/antiexcitotoxic
Interaction of guanine nucleotides with
ionotropic glutamate receptors
molecular dynamics simulations to
analyze the interaction of glutamate and
kainate with the GluR2 AMPA/kainate
Ramírez, G., Souza, D.O. (2001) Effect of orally
administered guanosine on seizures and death induced
Sarkis, J.J.F., Souza, D.O. (2002) Guanine and adenine
nucleotidase activities in rat cerebrospinal fluid. Brain
Javier S. Burgos. 2000. “Interacción de los nucleótidos
Finally, we have continued our studies on
of Gouaux and coworkers we have used
and Genetics) 44, 460-469
agent (submitted).
residues.
Starting with the compact receptor model
the glutamate receptor ligand-binding core in the presence
the modulatory effects of other purine
derivatives of guanine on neuronal and
glial glutamate uptake (2), and on the
presence of purinergic compounds and
their metabolites in the CSF (3).
95
de guanina con los receptores ionotrópicos de glutamato”.
Neurobiología
Neurobiology
D.10
Neurodegeneración y envejecimiento: señalización
mitocondrial del calcio y señalización de
insulina/leptina en envejecimiento
Jorgina Satrústegui
Elena Bogónez
Jose M. Carrascosa
dominios de unión de Ca2+ de aralar1, la
Nuestro laboratorio está interesado en el
estudio de los mecanismos moleculares de
señalización por calcio en mitocondrias y
su implicación en envejecimiento y
neurogengeneración, y en el estudio de la
señalización por insulina y leptina en la
vejez.
Postdoctorales /
Milagros Ramos
Beatriz Pardo
Graduate Students:
Yasmin Fermín
Santiago Cavero
transducción de energía en la célula y
también controla la fase de ejecución de
la muerte apoptótica. En células neurales,
la entrada de Ca2+ en mitocondrias es
importante para la señalización por Ca2+,
ya que activa a deshidrogenasas de la
Patricia Mármol
asocia con disfunción mitocondrial y muerte
Carmen Galián
Javier Traba
Arancha Delgado
toxicidad del glutamato o de la proteína
beta-amiloide, el péptido de las placas
seniles características de la enfermedad
de Alzheimer.
matriz mitocondrial; sin embargo, la
persistencia de Ca2+ en la mitocondria se
Estudiantes / Students:
isoforma de AGC de células neurales, en
la activación del AGC. También, el papel
de aralar1 en la maduración neuronal y en
la supervivencia a situaciones como la
La mitocondria se encarga de la
Laura Contreras
Coralia Perez
Estamos estudiando la función de los
celular. Por ello, estamos interesados en el
estudio de sistemas de señalización
mitocondrial de Ca2+ que no requieran la
entrada de Ca2+ en la mitocondria. Hemos
El envejecimiento en roedores y humanos
está asociado a la presencia de resistencia
a la insulina. El interés de nuestro grupo se
centra en desentrañar los mecanismos
responsables de dicha resistencia, habiendo
identificado algunas alteraciones en la
cascada de señalización de la hormona en
adipocitos. Recientemente describimos la
presencia de hiperleptinemia en ratas viejas
y estamos investigando actualmente la
posible relación entre hiperleptinemia y
desarrollo de la resistencia a la insulina.
Dado que las ratas viejas presentan
identificado a aralar1 y citrina, los primeros
transportadores mitocondriales regulados
por Ca2+ conocidos, como isoformas del
resistencia central a la leptina, postulamos
Bárbara Sesé
transportador de aspartato-glutamato
mitocondrial (AGC), un transportador
podría jugar un papel en la aparición de la
importante en la lanzadera de NADH
malato-aspartato. Los AGCs se activan por
Ca2+ en la cara externa de la membrana
Araceli del Arco
(Universidad de Castilla-la-Mancha)
mitocondrial interna, lo que permite su
estimulación por Ca2+ sin necesidad de la
entrada de calcio en la mitocondria.
96
que una interacción directa de la leptina
con sus receptores en tejidos periféricos
resistencia global a la insulina en animales
viejos. Estamos interesados también en
explorar la reversibilidad de la resistencia
a leptina y a insulina por medio de la
restricción calórica.
Neurodegeneration and ageing: calcium signalling
in mitochondria and insulin/leptin signalling
during ageing
Research summary
Our laboratory is interested in the study
of the molecular mechanisms of calcium
signal transduction in mitochondra in
ageing and neurodegeneration, and in
the study of insulin and leptin signaling
in ageing.
Mitochondria are the main sites for energy
transduction and the controllers of the
execution phase of apoptotic cell death.
In neural cells, Ca2+ entry in mitochondria
is important in cell Ca2+ signaling, as it
calcium entry in mitochondria. We are
Carrascosa, J.M., Molero, J.C. Fermín, Y. Martínez, C.
currently studying the function of the Ca2+-
Andrés A., Satrústegui, J. (2001) Effects of chronic treatment
binding motifs of aralar1, the main AGC
isoform in neural cells, in AGC activation.
with acarbose on glucose and lipid metabolism in obese
We are also studying the role of aralar1
in neuronal maturation and survival to
insults such as glutamate excitotoxicity
and exposure to beta-amyloid, the peptide
from senile plaques characteristic of
Alzheimer's disease.
Insulin resistance is associated with aging
in rodents and humans. We are interested
in elucidating the mechanisms responsible
activates dehydrogenases in the
mitochondrial matrix; however, its
for this resistance after having identified
a number of alterations in the insulin signal
persistence in mitochondria is also
associated with mitochondrial dysfunction
and neuronal death. Thus, we are
cascade of adipose cells. Recently we
reported the presence of hyperleptinemia
in aged rats and we are currently
interested in the study of systems for Ca2+
signaling in mitochondria that don't require
Ca2+ entry in the organelle. We have
investigating the possible association
between elevated levels of leptin and the
development of insulin resistance. As
identified aralar1 and citrin, the first known
calcium regulated mitochondrial carriers,
aged rats manifest central leptin resistance
as two isoforms of the aspartateglutamate transporter (AGC) in
mitochondria, a carrier important within
the malate-aspartate NADH shuttle. The
AGCs are activated by Ca2+ at the outer
face of the inner mitochondrial membrane,
allowing for Ca2+-stimulation without
we postulate that direct interaction of
leptin with its receptors in peripheral
diabetic wistar rats. Diabetes, Obesity & Metabolism 3,
240-248
Palmieri, L., Pardo, B., Lasorsa, F.M., Del Arco, A.,
Kobayashi, K., Iijima, M., Runswick, M.J., Walker, J.E.,
Saheki, T., Satrústegui, J., Palmieri, F. (2001) Citrin and
2+
aralar1 are Ca stimulated aspartate/glutamate
transporters in mitochondria. EMBO J. 20, 5060-5069
Cruz, F., Villalba, M., García-Espinosa, M.A., Bogónez, E.,
Satrústegui, J., Cerdán, S. (2001) Intracellular
compartmentation of pyruvate in primary cultures of cortical
13
neurons as detected by C NMR spectroscopy with
13
multiple C labels. J. Neurosci. Res. 66, 771-781
Satrústegui, J. Alvarez, G., Ramos, M., Bogónez, E. (2001)
Calcio y muerte neuronal. En Alzheimer XXI: Ciencia y
Sociedad. Editores J.M. Martínez Lage & Z.S. Khachaturian.
Masson Barcelona. 187-192
Fernández-Galaz C., Fernández-Agulló T., Campoy, F.,
Arribas, C., Gallardo, N., Andrés, A., Ros, M., Carrascosa,
J.M. (2001) Decreased leptin uptake in hypothalamic nuclei
with ageing in Wistar rats. J. Endrocinol. 171, 23-32
Alvarez, G., Muñoz-Montaño, J.R., Satrústegui, J., Avila,
tissues could play a role in the overall
insulin resistance of aged animals. We
J., Bogónez, E., Diaz-Nido, J. (2002) Regulation of tau
are also interested in exploring the
neurodegeneration by lithium. Possible implications for
possible reversion of leptin and insulin
resistance by means of caloric restriction.
phosphorylation and protection against -amyloid-induced
Alzheimer's disease. Bipolar Disorders 4, 1-13
Begum, L., Abdul Jalil, Md., Kobayashi, K., Iijima, M., Li,
MX, Yasuda, T., Horiuchi, M., Del Arco, A., Satrústegui, J.,
Saheki, T. (2002) Expression of three mitochondrial solute
carriers, citrin, aralar1 and ornithine transporter in relation
to urea cycle in mice. Biochim. Biophys. Acta 1574, 283292
del Arco, A., Morcillo, J., Martínez-Morales JR, Galián C.,
Martos V., Bovolenta P., Satrústegui J. (2002) Expression
of the aspartate-glutamate mitochondrial carriers aralar1
and citrin during development and in adult rat tissues. Eur.
J. Biochem. 269, 3313-3320
Fernández-Galaz, C., Fernández-Agulló, T., Pérez, C.,
Peralta, S., Arribas, C., Andrés, A., Carrascosa, J.M., Ros,
M. (2002) Long-term food restriction prevents ageingassociated central leptin resistance in wistar rats.
Diabetologia 45, 997-1003
Molero, J.C., Pérez, C., Martínez, C., Villar, M., Andrés, A.,
Fermín, Y., Carrascosa, J.M. (2002) Activation of MAP
kinase by insulin and vanadate in adipocytes from young
and old rats. Mol. Cell. Endocrinol. 189, 77-84
Peralta, S., Carrascosa ,J.M., Gallardo, N., Ros, M., Arribas,
C. (2002) Ageing increases SOCS-3 expression in rat
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Res. Commun. 296, 425-428
Yasmín Fermín: 2002. “Cambios en la sensibilidad a la
insulina durante el envejecimiento de la rata Wistar.
Alteraciones de las vías lipogénicas y lipolíticas en el tejido
adiposo perirrenal” Universidad Autónoma de Madrid.
97
Neurobiología
Neurobiology
D.11
Neuropatología molecular de la enfermedad
de alzheimer
genes silenciados o sobreexpresados, para
La enfermedad de Alzheimer (EA) es un
analizar los mecanismos responsables de
su participación en la muerte celular.
proceso neurodegenerativo resultado de la
interacción entre genes y factores
Mediante esta estrategia hemos identificado
polimorfismos en dos genes implicados en
ambientales. Mutaciones en los genes de
señalización adrenérgica, que modifican la
Maria Jesús Bullido
la proteína precursora del péptido amiloide
(APP) y las presenilinas causan la EA
monogénica. El alelo 4 de la apolipoproteína
susceptibilidad para la EA y los niveles de
cAMP en neuronas, sugiriendo que el estrés
adrenérgico participa en el desarrollo de la
E (APOE4) es el factor de susceptibilidad
genética más relevante para la EA
esporádica. Además, el riesgo de
EA.
neurodegeneración asociado a factores
ambientales como el traumatismo craneal
o ciertos procesos infecciosos aumenta en
implicación del virus herpes simplex tipo 1
(HSV-1) en procesos neurodegenerativos
utilizando modelos celulares y animales de
presencia de factores genéticos como
infección. Estudios en células sugieren que
Graduate Students:
APOE4.
HSV-1 puede modificar la fosforilación de
tau e iniciar un proceso de apoptosis
Ana Martínez García
Para estudiar los mecanismos patogénicos
neuronal. En un modelo murino de infección
Julio Pozueta Larios
de la EA, hemos desarrollado una estrategia
basada en la identificación y análisis
hematógena, hemos encontrado que la
funcional de genes utilizando modelos
celulares y animales. Los genes candidatos
neuroinvasividad del HSV-1, estableciendo
un posible vínculo funcional entre estos dos
factores, uno genético y otro ambiental, de
Fernando Valdivieso
José A. López Guerrero
Postdoctorales /
Jesús Aldudo Soto
Gema Alvarez Nieto
María Recuero Vicente
Javier Burgos Muñoz
María Alonso Martínez
Carlos Ramírez Moreno
María del Carmen Ramos Martín
Marta Rey Martín
Elena Serrano Carballal
Esther Serrano Saiz
se detectan en "microarrays" de expresión
Por otra parte, estamos estudiando la
dosis alélica de APOE modula la
de modelos neuronales sometidos a
estímulos inductores de estrés; sobre estos
riesgo para EA.
candidatos: a) realizamos estudios de
Nuestros resultados inciden en la idea del
asociación genética como indicador de su
implicación real en la patogénesis, y b)
carácter multifactorial de la EA, a la que
contribuyen genes de susceptibilidad y
Isabel Sastre Merlín
generamos modelos neuronales con dichos
agresiones de índole no genética.
Raquel Tenorio Vela
María del Carmen Vicente Cenzano
98
Molecular neuropathology of alzheimer's disease
Research summary
models by silencing or overexpressing
the candidate, to analyze the mechanisms
Martín, D., Salinas, M., López-Valparaiso, R., Serrano,
Alzheimer's disease (AD) is a
mediating its participation in the proccess
(2001) Effect of the Alzheimer amyloid fragment
neurodegenerative disorder produced by
the interactions among genes and
of cell degeneration. Using this strategy
we have identified polymorphisms in two
genes involved in adrenergic signaling;
Abeta(25-35) on Akt/PKB kinase and survival of PC12
gene coding for the amyloid precursor
protein (APP) and in the presenilins cause
monogenic AD. The allele 4 of
these polymorphisms change the
Alonso, M., Dimitrijevic, A., Recuero, M., Serrano, E.
susceptibility for AD and the cAMP levels
in cultured neurons, suggesting that
Valdivieso, F., López-Guerrero, J.A. (2001) Interaction
apolipoprotein E (APOE4) is the main
genetic susceptibility factor for sporadic
AD. Moreover, the risk for
adrenergic stress participates in AD
pathogenesis.
neuronal cells. J. Neurovirol. 7, 556-563
neurodegeneration associated to
enviromental factors such as major trauma
or certain infectious processes increase
in the presence of genetic factors as
On the other hand, we are studying the
Wang, J.C., Bullido, M.J., Harris, J.M., Artiga, M.J.,
involvement of herpes simplex virus type
1 (HSV-1) in neurodegenerative
processes. Our studies in cell models
Hernandez, D., Kwon, J.M., Frigard, B., Petersen, R.C.,
APOE4.
suggest that HSV-1 modifies tau
phosphorylation and initiates a neuronal
apoptosis process. In a murine model of
D.M., Wavrant DeVrieze, F., Ezquerra-Trabalon, M.,
hematogenous infection we have found
(2002) Contribution of APOE promoter polymorphisms
based on the identification and functional
that the allelic dose of APOE modulates
to Alzheimer’s disease risk. Neurology 59, 59-66
analysis of candidate genes using cell
and animal models. The candidate genes
the neuroinvasivity of HSV-1, pointing to
enviromental factors. Mutations in the
To study the pathogenic mechanisms of
the AD, we have developed a strategy
E., Recuero, M., Cuadrado, A.
cells. J. Neurochem. 78,1000-1008
of alpha-2-macroglobulin and HSV-1 during infection of
Lambert, J-C., Goumidi, L., Myllykangas, L., Ellis, C.,
Cumming, A.M., Pasquier, F., Sastre, I., Tienari, P.J.,
Frank, A., Sulkava, R., Morris, J. C., Clair, D. St, Mann,
Amouyel, P., Hardy, J., Haltia, M., Valdivieso, F., Goate,
A.M., Pérez-Tur, J., Lendon, C.L., Chartier-Harlin, M-C.
the existence of a functional link between
these two factors, one genetic and the
Burgos, J.S., Ramírez, C., Tenorio, R., Sastre, I., Bullido,
analysis of cultured neuronal cells
subjected to different treatments inducing
stress; with each candidate: a) we perform
other enviromental, of risk for AD. Thus,
time PCR parameters. Mol. Cel. Probes
all our results are in agreement with the
idea that AD is a multifactorial process,
16, 257-260
genetic association case-control studies,
with contribution of genes and non-genetic
Frank García, A., Ramos, M.C., Bullido, M.J. Genética
as indicators of its actual implication in
pathogenesis, and b) we generate cell
injuries.
y deterioro cognitivo severo.
are detected by expression microarray
M.J. (2002) Influence of reagents formulation on real-
(2002) Neurología 17 (supl.7) 56-62
Bullido, M.J., Fariñas, F., Sastre, I., Gil, P. (2002) Deterioro
cognitivo y funcional asociado a polimorfismos de ApoE
y A2M. Revista Española de Geriatría y Gerontología
37, 111-119
Martínez García, A., Bullido, M.J. (2002) Enfermedad
de Alzheimer. Genes y mecanismos moleculares.
BioPress.net 5
Burgos, J.S., Ramírez, C., Sastre, I., Bullido, M.J.,
Valdivieso, F. (2002) Involvement of Apoliprotein E in the
Hematogenous Route of Herpes Simplex Virus Type 1
to the Central Nervious Systems. J. Virol. 76, No.23,
12394-12398
Frank, A., Díez-Tejedor, E., Bullido, M.J., Valdivieso, F.,
Barreiro, P. (2002) APOE genotype in cerebrovascular
disease and vascular dementia. J. Neurol. Sci. 203-204,
173-176
99
Representación del sitio activo de polimerización de la Pol ß humana, en la que se indican una serie
de residuos implicados en la catálisis y fidelidad de inserción del nucleótido entrante (en amarillo),
en base a la complementariedad con un nucleótido molde (en verde). Los residuos coloreados en
marrón son invariantes entre Pol ß y Pol l. La falta de conservación de Lys280, Asp276 y Ala185
sugiere importantes diferencias entre la Pol ß y la Pol l. La figura ha sido realizada con los programas
GRASP, MOLSCRIPT y RASTER3D, utilizando el fichero 1BPY del banco de datos PDB.
The active polymerization site of human Pol ß, indicating the sites involved in catalysis and incoming
nucleotide insertion fidelity (yellow), based on the complementarity with a template nucleotide (green).
Brown-colored residues are invariant in Pol ß and Pol l. The lack of conservation in Lys280, Asp276
and Ala185 suggests important differences between Pol ß and Pol l. The figure has been prepared
using GRASP, MOLSCRIPT and RASTER3D software, using the 1BPY file and the PDB database.
100
Carlos Alonso
Miguel A. Alonso
E.1 Parasitología molecular
E.1 Molecular parasitology
E.2 Expresión génica en linfocitos T
E.2 Gene expression in T lymphocytes
E.3 Biología molecular de extremófilos
(microbiología aplicada)
Ricardo Amils
E
Juan Alfonso
Ayala Serrano
Regulación de
la expresión
génica
E.3 Molecular biology of extremophylic
microorganisms
E.4 División celular bacteriana y resistencia a
antibióticos
E.4 Bacterial cell division and antibiotics
resistance
E.5 Biotecnología y genética de bacterias
José Berenguer
E.5 Biotechnology and genetics of extreme
E.6 Mantenimiento y variabilidad del genoma:
enzimología de la reparacion del DNA
Luis Blanco
José Luis
Castrillo Díez
Regulation
of gene
expresion
Juan Pedro
García Ballesta
César de Haro,
José M. Sierra
E.6 Genome maintenance and variability:
E.7 Regulación de la expresión génica
E.7 Regulation of the tissue-specific gene
expression
E.8 Estructura y función del ribosoma
E.8 Ribosome structure and function
E.9 Síntesis de proteínas y su regulación en
eucariontes
E.9 Protein synthesis and its regulation in
eukaryotes
E.10 Expresión génica en levaduras y
streptomyces
Antonio Jiménez
Encarnación
Martínez-Salas
E.10 Gene expression in yeast and
streptomyces
E.11 Iniciación interna de la traducción en
mRNAs eucarióticos
E.11 Internal initiation of translation in
eukaryotic mRNAs
Enrique Palacián
E.12 Estructura cromatínica y transcripción
E.12 Chromatin structure and transcription
Miguel Angel de
Pedro Montalban
E.13 Envolturas celulares
E.13 Cell envelopes
Magdalena
Ugarte
E.14 Bases Moleculares de las
Enfermedades Metabólicas
E.14 Molecular basis of metabolic diseas
101
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.1
Parasitología molecular
Las especies de Leishmania son protozoos
parásitos, agentes etiológicos de las
Leishmaniosis, un grupo de enfermedades
que afectan a la población de 88 países.
Jose Mª Requena, Manuel Soto
Se estima que se producen 2 millones de
casos nuevos cada año, existiendo unos
400 millones de personas en riesgo de
Carlos Alonso
Luis Quijada
Graduate Students:
Ana Isabel Rico
Ruth Larreta
Nuria Parody
Salvador Iborra
Javier Carrión
Miguel A. Fuertes
se están realizando en tres sistemas
animales: el ratón, el hámster dorado y el
perro (este último en colaboración con el
Dr. Luis Carlos Gómez-Nieto (Facultad de
Veterinaria, Universidad de Extremadura,
Cáceres).
contraer la enfermedad. La leishmaniosis
visceral causada por Leishmania infantum
Otra parte de nuestra actividad investigadora
es una enfermedad severa, fatal si no es
tratada, que es común en la región
Mediterránea y en Latinoamérica. Los perros
son el principal reservorio y la
molecular de L. infantum. Este parásito
presenta características muy peculiares de
seroprevalencia entre la población canina
oscila entre el 10 y el 30%.
Cristina Folgueira
proteínas son mitógenos de linfocitos B de
ratón. Los estudios de inmunoprotección
La principal actividad investigadora de
nuestro grupo se dirige hacia la
caracterización de las propiedades
inmunoprofilácticas de una serie de
se desarrolla en el campo de la biología
regulación de la expresión génica, forzado
por la carencia de secuencias promotoras
en sus genes. En particular, estamos
estudiando los mecanismos de regulación
post-transcripcional, utilizando como modelo
los genes de histonas y de las proteínas
de choque térmico. Información adicional
sobre la actividad investigadora de nuestro
antígenos de L. infantum. Hemos identificado
grupo se puede obtener en la dirección:
http://www2.cbm.uam.es/cx-
a proteínas evolutivamente conservadas
203/PAGINA1.htm
como antígenos prominentes de Leishmania
que son específicamente reconocidos por
los sueros de humanos y perros con
Nuestro grupo está colaborando con los
leishmaniasis visceral (LV). Algunas de
estas proteínas (p. ej., las proteínas de
choque térmico HSP70 y HSP83) tienen
características inmunoestimuladoras. En
particular, hemos demostrado que estas
Leishmania tiene dos formas morfológicas, el promastigote móvil
(izquierda) y el amastigote no móvil (derecha).
102
Drs. Carmen Navarro-Ranninger y Jose
Manuel Pérez (Departamento de Química
Orgánica, UAM) en la identificación de las
vías bioquímicas por las que algunos
compuestos metálicos ejercen su actividad
antitumoral.
Molecular parasitology
Research summary
properties. In particular, we have
demonstrated that these proteins are
mitogens for mouse B lymphocytes. The
Fuertes, M.A., Perez, J.M., Soto, M., Lopez, M.C., Alonso,
J. Biol. Inorg. Chem. 6, 107-117
by a group of diseases that affects the
experiments directed to analyse the
potential protection provided by these
antigens is carried out in three model
population in 88 countries. It has been
estimated that there are about 2 million
systems: mouse, hamster and dog. The
protection experiments with dogs are
new cases every year and that there are
about 400 million people at risk of getting
done in collaboration with Dr. Luis Carlos
Gómez-Nieto (Facultad de Veterinaria,
Universidad de Extremadura, Cáceres).
Leishmaniae are protozoan parasites that
are the etiological agents of
Leishmaniosis. Leishmaniosis is formed
the disease which is very severe and fatal
when not treated. This form of the disease
is common in the Mediterranean area and
in Latinoamérica. Dogs are the main
reservoir of the parasite. The prevalence
is the canine population varies form 10
to 30%.
The research activity of our group is aimed
to the characterisation of a series of L.
infantum antigens and to the
determination of the immune-prophylactic
properties of these antigens. We have
identified several L. infantum proteins that
panantigens in Leishmania. Trends Parasitol. 17, 64
Gonzalez, V.M., Fuertes, M.A., Alonso, C., Perez, J.M.
(2001) Is cisplatin-induced cell death always produced
by apoptosis? Mol. Pharmacol. 59, 657-663
Echeverria, P., Dran, G., Pereda, G., Rico, A.I., Requena,
J.M., Alonso, C., Guarnera, E., Angel, S.O. (2001)
Analysis of the adjuvant effect of recombinant Leishmania
analyse the regulation of the expression
Lett. 76, 107-110
of several genes of L. infantum since it
presents several characteristics due to
the absence of promoter sequences. In
Thomas, M.C., Longobardo, M.V., Carmelo, E., Marañon,
particular we are studying mechanisms
of post-tanscriptional regulation using as
models the histone and heat shock genes.
Further information on the activity of the
group may be found in:
http://www2.cbm.uam.es/cx203/PAGINA1.htm.
Our group is also collaborating with Drs.
affected by visceral leishmaniosis (LV)
that are evolutionary conserved. Some of
Carmen Navarro-Ranninger and José
Manuel Pérez (Departamento de Química
Orgánica, UAM) on the identification of
proteins have also immuno-stimulatory
Requena, J.M., Alonso, C., Soto, M. (2001) More
infantum Hsp83 protein as a tool for vaccination. Immunol.
confronted with human and dog sera
mention the HSP70 and HSP83). These
Leishmania infantum kinetoplastid membrane protein-11.
Our research efforts are also directed to
behave as prominent antigens when
these proteins belong to the group of heat
shock proteins (as an example we can
C. (2001) Calcium-induced conformational changes in
metabolic pathways which can be
manipulated to enhance the anti tumour
activity of certain metallic compounds.
C., Planelles, L., Patarroyo, M.E., Alonso, C., Lopez,
M.C. (2001) Mapping of the antigenic determinants of
the T. cruzi kinetoplastid membrane protein-11.
Identification of a linear epitope specifically recognized
by human Chagasic sera. Clin. Exp. Immunol. 123, 465-471
Jansen, B.A., Perez, J.M., Pizarro, A., Alonso, C., Reedijk,
J., Navarro-Ranninger C. (2001) Sterically hindered
cisplatin derivatives with multiple carboxylate auxiliary
arms: synthesis and reactions with guanosine-5'monophosphate and plasmid DNA. J. Inorg. Biochem.
85, 229-235
Planelles, L., Thomas, M.C., Alonso, C., Lopez, M.C.
(2001) DNA immunization with Trypanosoma cruzi HSP70
fused to the KMP11 protein elicits a cytotoxic and humoral
immune response against the antigen and leads to
protection. Infect. Immun. 69, 6558-6563
Viñuelas, J., Garcia-Alonso, M., Ferrando, L., Navarrete,
I., Molano. I., Miron, C., Carcelen, J., Alonso, C., Nieto,
C.G. (2001) Meningeal leishmaniosis induced by
Leishmania infantum in naturally infected dogs. Vet.
Parasitol. 31, 23-27
Fuertes, M.A., Perez, J.M., Gonzalez, V.M., Alonso, C.
(2001) A kinetic model for the B-Z transition of poly[d(GC)].poly[d(G-C)] and poly[d(G-m5C)].poly[d(G-m5C)]. J.
Biol. Inorg. Chem. 6, 675-682
Ana Isabel Rico Errazquin. 2002. “Propiedades
inmunoestimuladoras de las proteínas de choque
Perez-Alvarez, M.J., Larreta, R., Alonso, C., Requena,
J.M. (2001) Characterisation of a monoclonal antibody
recognising specifically the HSP70 from Leishmania.
Parasitol. Res. 87, 907-910
térmico HSP70 y HSP83 de Leishmania infantum”.
Larreta, R., Guzman, F., Patarroyo, M.E., Alonso, C.,
Requena, J.M. (2002) Antigenic properties of the
Leishmania infantum GRP94 and mapping of linear Bcell epitopes. Immunol. Lett. 80, 199-205
Perez, J.M., Cerrillo, V., Matesanz, A.I., Millan, J.M.,
Navarro, P., Alonso, C., Souza, P. (2001) DNA interstrand
cross-linking efficiency and cytotoxic activity of novel
cadmium(II)-thiocarbodiazone complexes. Chembiochem.
2, 119-123
Iniesta, V., Gomez-Nieto, L.C., Molano, I., Mohedano,
A., Carcelen, J., Miron, C., Alonso, C., Corraliza, I. (2002)
Arginase I induction in macrophages, triggered by Th2-
There are two developmental forms of Leishmania, the motile promastigote (left) and the
amotile amastigote (right).
type cytokines, supports the growth of intracellular
Leishmania parasites. Parasite Immunol. 24, 113-118
Rico, A.I., Girones, N., Fresno, M., Alonso, C., Requena,
J.M. (2002) The heat shock proteins, Hsp70 and Hsp83,
of Leishmania infantum are mitogens for mouse B cells.
Cell Stress & Chaperones 7, 339-346
103
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.2
Expresión génica en linfocitos T
Las membranas celulares parecen estar
Con la hipótesis de que la familia MAL de
proteínas podría desempeñar funciones
importantes en procesos de transporte,
compartimentalizadas en microdominios o
balsas lipídicas implicados en procesos de
nuestro grupo ha caracterizado BENE y
MAL2, dos miembros inéditos de la familia
transporte intracelular y señalización. Para
Cristina Hernández-Munain
que las balsas sean operativas necesitan
una maquinaria proteica especializada que
las organice y las dote de las funciones
MAL presentes también en las balsas
lipídicas. Nuestros resultados recientes
indican que BENE participa en el transporte
Miguel A. Alonso
Alicia Llorente
Fernando Martín-Belmonte
de colesterol en células endoteliales,
requeridas. El principal objetivo de nuestro
laboratorio ha sido la identificación la
mientras que MAL2 es un componente
esencial de la maquinaria para la ruta
maquinaria de transporte que interviene en
las balsas lipídicas, investigar las rutas en
las que esta maquinaria está implicada, y
indirecta o transcitótica que transporta
proteínas desde la membrana basolateral
a la membrana apical en hepatocitos y en
caracterizar su mecanismo de actuación.
células epiteliales. Nuestros resultados
sitúan a la familia MAL de proteínas en un
Sergio Gómez
La proteína MAL ha sido caracterizada
Noelia Zamarreño
como el primer componente integral de
membrana de la maquinaria necesaria para
lugar central en la regulación del tráfico
intracelular de proteínas.
el transporte directo de proteínas mediado
Graduate Students:
por balsas lipídicas a la superficie apical
en células epiteliales MDCK. El hecho de
Una línea de trabajo adicional en el
laboratorio consiste en el estudio de las
bases moleculares para la regulación de la
que MAL se exprese también en linfocitos
expresión de los genes de los receptores
T nos ha llevado a demostrar la existencia
para antígeno en linfocitos T por enhancers
mediante el estudio de la localización
Postdoctorales /
Jaime Millán
Mª del Carmen de Marco
Alicia Batista
Juan Francisco Aranda
de una ruta semejante que transportaría
proteínas al urópodo, un subdominio de
membrana presente en los linfocitos T
polarizados.
nuclear de estos genes y la caracterización
de los complejos multiprotéicos
ensamblados en los enhancers durante el
desarrollo.
La ruta directa de transporte de proteínas a la superficie apical
está controlada por la proteína MAL en células epiteliales
polarizadas, mientras la proteína MAL2 dirige la ruta indirecta
o transcitótica tanto en células epiteliales como en hepatocitos.
104
Gene expression in T lymphocytes
Research summary
Cellular membranes appear to be
comparmentalized in glycolipid and
cholesterol-enriched microdomains,
referred as to lipid rafts, involved in
membrane trafficking and signaling. Rafts
require specialized protein machinery to
be functional. The main goal of our lab is
the identification of protein elements of
the machinery involved in raft-mediated
membrane trafficking processes.
The MAL protein was characterized has
the first integral membrane component
of the machinery for the raft-mediated
route of direct transport to the apical
surface in epithelial MDCK cells. The fact
that MAL is also expressed in T
lymphocytes prompt us to demonstrate
the existence of a similar route involved
in the trafficking of proteins to the uropod
protrusion, a membrane subdomain found
at the rear of migrating T lymphocytes.
of proteins might play a general role in
de Marco, M. C., Kremer, L., Albar, J. P., Martínez-
membrane trafficking we have
characterized BENE and MAL2, two
Menárguez, J. A., Ballesta, J., García-López, M.A.,
unedited members of the MAL family also
present in rafts. Our studies indicate that
BENE is involved in cholesterol transport
in endothelial cells, whereas MAL2 plays
an essential role as a component of the
machinery for the indirect of transcytotic
Marazuela, M., Puertollano, R., Alonso, M. A. (2001)
BENE, a novel raft-associated protein of the MAL
proteolipid family, interacts with caveolin-1 in human
endothelial-like ECV304 cells. J. Biol. Chem. 276, 2300923017
Martín-Belmonte, F., Arvan, P., Alonso M. A. (2001) MAL
mediates apical transport of secretory proteins in polarized
epithelial Madin-Darby canine kidney cells. J. Biol. Chem.
route that transport proteins from the
basolateral to the apical surface in
hepatocytes and polarized epithelial cells.
276, 49337-49342
The MAL family plays, therefore, a central
place in the regulation of the intracellular
traffic.
motif in the carboxyl terminus of MAL is required for
In addition, we are also interested in the
molecular basis for regulation of gene
Alonso, M. A., Millán, J. (2001) The role of lipid rafts in
expression at the T-cell receptor genes
by enhancers through the study of nuclear
localization of these genes and
characterization of the multiprotein
complexes assembled on their enhancers
during cell development.
With the hypothesis that the MAL family
Puertollano, R., Martínez-Menárguez, J. A., Batista, A.
Ballesta, J., Alonso, M. A. (2001) An intact dilysine-like
normal apical transport of the influenza virus
hemagglutinin cargo protein in epithelial Madin-Darby
canine kidney cells. Mol. Biol. Cell 12, 1869-1883
signalling and membrane trafficking in T lymphocytes.
J. Cell Sci. 114, 3957-3965
Bouchon, A., Hernandez-Munain, C., Cella, M., Colonna,
M. (2001) A DAP12-mediated pathway regulates
expression of CC chemokine receptor 7 and maturation
of human dendritic cells. J. Exp. Med. 194, 1111-1122
Millán, J., Qaidi, M., Alonso, M.A. (2001) Segregation of
costimulatory components into specific T-cell surface
lipid rafts. Eur. J. Immunol. 31, 467-473
Martín-Belmonte, F., Millán, J. (2001) Estructura y función
de las balsas lipídicas (“rafts”), dominios de membrana
ricos en esfingolípidos y colesterol. Inmunología 20, 216224
Copie-Bergman, C., Plonquet, A., Alonso, M. A., Boulland,
M.-L., Marquet, J., Divine, M., Möller, P., Leroy, K.,
Gaulard, P. (2002) MAL expression in lymphoid cells:
further evidence for MAL as a distinct molecular marker
of primary mediastinal large B-cell lymphomas. Mod.
Fernando Martín-Belmonte. 2001. “Función del
proteolípido MAL en el transporte polarizado de
proteínas en células epiteliales”. Universidad Autónoma
de Madrid.
Pathol. 15, 1172-1180
Tracey, L., Villuendas, R., Ortiz, P., Dopazo, A., Spiteri,
I., Rodríguez-Peralto, J.L., Fernández-Herrera, J.,
Hernández, A., Fraga, J., Lombardia, L., Dominguez,
.
O., Herrero, J., Alonso, M.A , Dopazo, J., Piris, M. A.
(2002) Identification of genes involved in resistance to
María del Carmen de Marco. 2002. “Caracterización
_-interferon in cutaneous T-cell lymphoma. Am. J. Pathol.
de BENE y MAL2, dos nuevos miembros de la familia
161, 1825-1837
MAL de proteínas, como elementos de la maquinaria
de tráfico de membranas”. Universidad Autónoma de
Madrid.
Hernández-Munain C., Krangel, M. S. (2002) Distinct
roles for c-Myb and core binding factor/polyoma enhancerbinding protein 2 in the assembly and function of a
multiprotein complex on the TCR b enhancer in vivo. J.
Immunol. 169, 4362-4369
Sánchez-Pulido, L., Martín-Belmonte, F., Valencia, A.,
Alonso, M. A. (2002) MARVEL: a conserved domain
involved in membrana apposition events. Trends Biochem.
Sci. 27, 599-601
Millán, J., Montoya, M. C., Sancho, D., Sánchez-Madrid,
F., Alonso, M. A. (2002) Lipid rafts mediate biosynthetic
transport to the T cell uropod subdomain and are
necessary for uropod integrity and function. Blood 99,
MAL mediates the direct pathway to the apical surface in polarized epithelial cells,
whereas MAL2 directs the indirect transcytotic route both in epithelial cells and
hepatocytes.
978-984
de Marco, M. C., Martín-Belmonte, F., Kremer, L., Albar,
P. J., Correas, I., Vaerman, J. P., Marazuela, M., Byrne,
J. A., Alonso, M. A. (2002) MAL2, a novel raft protein of
the MAL family, is an essential component of the
machinery for transcytosis in hepatoma HepG2 cells. J.
Cell Biol. 159, 37-44
105
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.3
Biología molecular de extremófilos (microbiología
aplicada)
Ricardo Amils
El grupo de Biología Molecular de
Microorganismos Extremófilos posee
distintas líneas de investigación cuyos
objetivos principales se resumen a
Irma Marín
continuación:
Francisco Santamaría
José Luis Sanz
Biohidrometalurgia, ecología, biología
Francisco Hernández
molecular y biotecnología de
microorganismos que se desarrollan en
Postdoctorales /
Elena González Toril
Angeles Aguilera
Felipe Gómez
ambientes ácidos, con especial énfasis
en los aspectos aplicados de los
mismos: biominería, biodesulfuración de
carbones, secuestro específico de metales
pesados, fitorremediación.
Graduate Students:
Enrique Marín
Javier Chichón
Eva Lospitao
Emiliano Díaz
Moustafa Malki
Eva Mejía
Antonio García
Ecología microbiana de ambientes
extremos terrestres como modelos de
vida de interés astrobiológico:
geomicrobiología del Río Tinto y de las
lagunas hipersalinas de la Mancha (Tirez).
Este trabajo se hace en colaboración con
el laboratorio de Extremofilia del Centro de
Metanogénesis: i) caracterización
microbiana de las formas de desarrollo
de la biomasa anaerobia (lodo granular
y biopelículas): identificación,
cuantificación, formación y estudio de la
estructura del gránulo y distribución espacial
de las diferentes poblaciones; ii) toxicidad
y biodegradación de alquilbenceno
sulfonatos (LAS) en sistemas anaerobios:
caracterización microbiológica de
sedimentos marinos, rutas degradativas,
etc.; iii) biorremediación de compuestos
azufrados en efluentes industriales; iv)
ecología molecular microbiana de
ambientes extremos anaerobios (ácidos e
hipersalinos). En todos los casos se aplican
técnicas moleculares: hibridación in situ
con sondas fluorescentes (FISH),
electroforesis en gel con gradiente
desnaturalizante (DGGE) y clonación.
Dinoflagelados marinos: i) desarrollo de
métodos inmunológicos y moleculares para
la detección de toxinas DSP y los
Astrobiología (INTA-CSIC).
organismos productores y ii) identificación
y clonación de proteínas relacionadas con
Thorsten Köchling
Caracterización estructural y funcional
la producción de toxinas PSP por diferentes
Alberto Fernández Fairen
Erik Zettler
de chaperonas de haloarqueas:
purificación, identificación de los genes
especies del género Alexandrium
comparando: a) cepas tóxicas y no tóxicas,
codificantes y clonación, estudios
estructurales al microscopio electrónico, su
b) a lo largo del ciclo celular, c) sus bacterias
simbiontes. Actualmente se está iniciando
papel en la reconstitución de ribosomas,
un proyecto relacionado con la
sus aplicaciones en nanotecnología.
secuenciación del genoma de Dinophysis
acuminata.
Lucía Palacios
Nuria Fernández
Nuria Rodríguez
Juan Francisco Morales
Modesta Gutierrez
Antonio Lazcano (U. Nacional de
México)
Ana Mª Amaro (U. de Chile)
Linda Amaral (MBL Woods Hole)
Erik Zettler (MBL Woods Hole)
Modelo de la geomicrobiología del río Tinto.
106
Molecular biology of extremophylic microorganisms
Research summary
The objectives of the Extremophiles group
are the following:
Biohydrometallurgy: ecology,
molecular biology, and biotechnology
of acidophilic microorganisms, with
special emphasis in their potential
application: biomining, bioremediation,
specific metal sequestering,
fitoremediation.
Microbial ecology of terrestrial extreme
environments as models of
astrobiological interest:
geomicrobiology of the Tinto River and
hypersaline ponds from la Mancha (Tirez).
In colaboration with the Centro de
Metanogenesis: I) microbial
López-Archilla, A.I., Marín, I., Amils, R. (2001) Microbial
characterization of the biomass present
in an anaerobic reactor (granular sludge,
Community Composition and Ecology of an Acidic Aquatic
biofilms): identification, quantification,
formation, structural studies of the
granules and space distribution of the
microbial populations; ii) toxicity and
biodegradation of alkylbencen sulfonates
(LAS) in anaerobic systems: microbial
characterization of marine sediments,
degradative pathways, etc.; iii)
bioremediation of sulfur compounds from
industrial effluents, iv) molecular ecology
of anaerobic extreme environments (acidic
and hypersaline). Molecular ecology
techniques are used in all the projects:
fluorescence in situ hybridization (FISH),
denaturating gradient gel electrophoresis
(DGGE) and cloning.
González-Toril, E., Gómez, F., Rodríguez, N., FernándezRemolar, D., Zuluaga, J., Marín, I., Amils, R. (2001)
Geomicrobiology of the Tinto River, a model of interest
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fundamentals, technology and sustainable development”,
Vol. B, Ciminelli, V.S.T. y García, O. (eds.), Elsevier,
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Durán, C., Sargeant, C., Rodríguez, N., Amils, R. (2001)
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Culubret, E. N,, Luz, M., Rojas, P., Amils, R., Sanz, J.L.
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methanogenic conditions. Water Science and Technology
44, 117-122
Marín, I., Aguilera, A., Reguera, B., Abad, J.P. (2001)
Preparation of DNA suitable for PCR amplification from
Astrobiología (INTA-CSIC)
characterization of haloarchaeal
chaperons: purification, gen identification,
Marine dinoflagellates: i) development
of inmunological and molecular
methodologies for the detection of DSP
toxins and producing microorganisms and
cloning, structural studies at the electron
ii) identification and cloning of proteins
microscope, role in the reconstitution of
ribosomes, application in nanotechnology
related with the production of PSP toxins
by different species of the genus
Structural and functional
Environment: The Tinto River, Spain. Microb. Ecol. 41,
20-35
Alexandrium comparing: a) toxic and non
toxic strains, b) cellular cycle, c) symbiotic
fresh or fixed single dinoflagellate cells. BioTechniques
30: 88-93
Amaral-Zettler, L., Gómez, F., Zettler, E., Keenan, B.G.,
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352
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Modificados Genéticamente. Cultura Biotec. 2, 5.
107
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.4
División celular bacteriana y resistencia a
antibióticos
Juan Alfonso Ayala Serrano
Graduate Students:
Guillermo Cobas Pupo
Daniel Edgar Vega Mendoza
Estudiantes /
Ana Rosa Villaroya Moreno
Rachel Ruíz
Fernando López Gallego
Amelie Borges
Ingrid Dunn-Stanley
Susana Dominguez Santos
Carmen Panadero Alvarez
Nuria Salas
Visiting Scientist:
Vanina Romanello, Universidad de
Rosario, Argentina
Juan Francisco Almenares, Universidad
de Oriente, CEBI, Cuba
Prof. Jean van Heijenoort, Universite
de Paris-Sud, Francia
Dr. Gabriel Guntkind, Universidad
Buenos Aires, Argentina
Dr. Kuvat T. Momynaliev, Institute of
Physico-Chemical Medicine, Moscow,
Russia
Los objetivos de nuestro grupo son el
estudio desde un punto de vista molecular
del proceso de crecimiento y división
bacteriana y de los diversos mecanismos
de resistencia a los antibióticos `-lactámicos,
que se han desarrollado por los
microorganismos patógenos de origen
clínico.
La mayor parte de los enzimas implicados
en el proceso de división bacteria se
encuentran agrupados en el cluster dcw
(division and cell wall), muy conservado en
la evolución y donde se incluyen, entre
otros, los genes pbpB, ftsW y ftsZ. El estudio
de la funcionalidad de FtsW en Escherichia
coli ha sido uno de los aspectos que hemos
desarrollado en este periodo.
Los mecanismos de resistencia a los
antibióticos desarrollados por las bacterias
patógenas son muy complejos y incluyen
entre otros, transmisión horizontal de
determinantes de resistencia, modificación
de la permeabilidad de la membrana y
expresión de bombas de eflujo. En este
periodo hemos caracterizado una nueva
`-lactamasa (CTX-M-2) transmisible en un
nuevo integrón, así como la influencia de
la longitud de cadena del antígeno-O en la
invasividad de Shigella flexneri. Además,
estamos caracterizando las proteínas de
membrana externa de Pseudomonas
aeruginosa de origen clínico.
Tras la publicación de la secuencia completa
del genoma de Salmonella Typhi se ha
hecho patente la presencia de genes
parálogos para las PBPs no previamente
identificados por estudios bioquímicos. Dos
de estos genes codifican para parálogos
cromosomales de pbpA y pbpB, que no
están presente en Escherichia coli. Estamos
analizando estas proteínas desde el punto
de vista genético, enzimático y fisiológico,
y encontrando evidencias de su implicación
en los procesos de invasión y proliferación
intracelular.
El peptidoglicano lateral durante la
elongación bacteriana se sintetiza
esencialmente por la proteína PBP1b. Esta
proteína presenta una actividad
transpeptidasa (crosslinking) asociada al
dominio C-terminal, y una actividad
transglicosilasa (elongación de cadena) en
el dominio N-terminal. A pesar de los
esfuerzos de varios grupos para la
cristalización y determinación de la
estructura de esta proteína, aun no se han
conseguido resultados positivos. No
obstante hemos avanzado en el
conocimiento de la interacción con el
antibiótico inhibidor de la transglicosilación,
moenomicina A, y en la funcionalidad de
cada dominio de la proteína.
La proteína FtsZ es un componente esencial
del anillo septal para la división bacteriana.
Este anillo, con estructura que presenta
analogías al citoesqueleto eucariota, parece
ser un componente universal para el
mecanismo de división. Dado que
Mycoplasma hominis tiene todas las
características de la célula procariota
mínima y algunos de los procesos de las
bacterias con envoltura, es un modelo
prometedor para el estudio de los principios
básicos del proceso de división. En este
periodo hemos iniciado el estudio de esta
proteína en este microorganismo y en
mutantes de origen clínico.
Los logros esenciales en los dos últimos
años han sido: 1.-Estudio de la distribución
de cadenas de antígeno O durante el
crecimiento exponencial e intracelular de
Shigella flexneri, 2.- La caraterización
topológica en la membrana para la proteína
esencial FtsW implicada en división celular
en Escherichia coli, 3.- Descripción de un
nuevo integrón de Clase 1 (InS21) portador
del gen de resistencia blaCTX-M-2 en
Salmonella enterica Serovar Infantis. 4.Análisis por Resonancia de Plasma
Superficial (SPR) de la interacción entre el
antibiótico Moenomicina A con la PenicillinBinding Protein 1b de Escherichia coli, 5.Caracterización del gen ftsZ de Mycoplasma
hominis y la variabilidad de secuencia en
mutantes clínicos de Mycoplasma.
Topología de FtsW en la membrana interna de Escherichia coli, derivada de la actividad AP y la resistencia a `-lactámicos de fusiones génicas. La secuencia aminoacídica se
muestra con el código de una letra y rodeadas por círculos, cuadrados o rombos. Se muestran las posiciones conservadas en al menos 60% (cuadrados) o en mas de 90%
(rombos) de los homólogos a FtsW. Las posiciones de las fusiones PhoA y Bla están colocadas en el modelo (caracteres blancos) de acuerdo con la actividad AP o resistencia
a Bla, con fondo oscuro (activas o resistentes) o fondo gris (inactivas o sensibles). Los residuos conservados entre las secuencias de FtsW de E. coli y S. pneumonia están
resaltados por una línea gruesa y fondo blanco. PER, periplasma. CM, membrana citoplásmica, CYT, citoplasma.
Membrane topology model of FtsW from Escherichia coli derived from AP activity and `-lactam resistance of fusion proteins. The primary amino acid sequence is given in the
single-letter code and in black characters surrounded by a circle, a square or a diamond. Conserved position in at least 60% (squares) or in more than 90% (diamonds) of the
FtsW homologues are indicated. The positions of the PhoA and BlaM fusions are superimposed to the model (in white characters) according to the AP activity or Bla resistance
as black (active or resistant) or grey (inactive or sensitive) background. Conserved residues among the sequence of FtsW from E. coli and S. pneumonia are highlighted by a
bold line and white background. PER, periplasm. CM, cytoplasmic membrane, CYT, cytoplasm.
108
Bacterial cell division and antibiotics resistance
Research summary
The objectives of our group is the analysis
under diverse molecular approaches of
the bacterial growth and cell division, and
to study the mechanisms of resistance to
the `-lactam antibiotics, that have been
developed by pathogens of clinical origin.
Most of the gene coding for the enzymes
involved on cell division processes are
grouped in the dcw cluster (division and
Lateral peptidoglycan during cell
elongation is synthesized mainly by the
Varela, G., Schelotto, F., diConza, J., Ayala, J. A. (2001)
Analysis of the O-antigen chain length distribution during
penicillin-binding protein PBP1b. This
protein holds the transpeptidase activity
(crosslinking) in the C-terminal domain,
and the transglycosylase activity (chain
elongation) in the N-terminal domain. In
exponential and intracellular growth of Shigella flexneri.
spite of the big effort of several groups to
crystallize and to determine the 3D
structure of this protein, there are no
FtsW. FEMS Microbiology Letters 216, 23-32
Microbial Pathogenesis 31, 21-27
Lara, B., Ayala, J.A. (2002) Topological characterization
of the essential Escherichia coli cell division protein
Stembera, K., Buchynskyy, A., Vogel, S., Knoll, D., Osman,
positive results. However, we have
advanced on the knowledge of the
A. A., Ayala, J.A., Welzel, P. (2002) Moenomycin-mediated
interaction with the transglycosylase-
the genes pbpB, ftsW and ftsZ. The study
of functional characterization of the FtsW
protein has been developed during this
ChemBioChem. 3, 332-340
inhibitor antibiotic moenomycin and the
functionality of each domain of the protein.
Di Conza, J., Ayala, J.A., Power, P., Mollerach, M.,
period.
The FtsZ protein is an essential
component of the bacterial cell division
Gutkind, G. (2002) Novel Class 1 integron (InS21) carrying
ring. This cytoskeleton-like ring is believed
to be the universal way of bacterial
Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46, 2257-2261
cell wall), highly conserved during
evolution and including, among others,
The molecular mechanisms that have
been developed by pathogens are very
complex, including, horizontal
affinity purification of penicillin-binding protein 1b.
the blaCTX-M-2 in Salmonella enterica Serovar Infantis.
division. Mycoplasma hominis possesses
Stembera, K., Vogel, S., Buchynskyy, A., Ayala, J.A.,
transmission of resistance determinants,
all features of the minimal cell and some
Welzel, P. (2002) A Surface Plasmon Resonance Analysis
change of membrane permeability and
traits of cell-wall bacteria and seems to
of the Interaction between the Antibiotic Moenomycin A
expression of efflux pumps. In this period
we have characterize a new `-lactamase
(CTX-M-2) transmissible by a new
be a promising object for study of basic
principles of the bacterial division process.
559-565
integron InS21, and also the influence of
O-antigen length on virulence of Shigella
flexneri. We are also characterizing the
outer membrane proteins in clinical isolate
of Pseudomonas aeruginosa.
After the complexion of the Salmonella
Typhi genome sequence, it has become
apparent that some paralogous PBP
genes have not been identified previously
by the biochemical methods. Two of these
genes code for chromosomal pbpA and
pbpB paralogues, which are not present
in Escherichia coli. We are analyzing these
proteins from the genetic, enzymatic and
physiological point of view, and we have
found evidence for involvement on the
cellular invasion and proliferation
processes.
In this period we have started the analysis
of this protein in this model microorganism,
and variant forms of clinical origin.
Our main achievements in the last two
years were: 1.- O-antigen chain length
distribution during exponential and
intracellular growth of Shigella flexneri,
2.- Topological characterization of the
essential Escherichia coli cell division
protein FtsW, 3.- Description of a novel
Class 1 integron (InS21) carrying the
blaCTX-M-2 in Salmonella enterica
Serovar Infantis, 4.- Surface Plasmon
Resonance analysis of the interaction
between the antibiotic moenomycin A with
Penicillin-Binding Protein 1b of
Escherichia coli, and 5.- Characterization
of the Mycoplasma hominis ftsZ gene and
its sequence variability in the Mycoplasma
clinical isolates.
109
with Penicillin-Binding Protein 1b. ChemBioChem. 3,
Momynaliev, K. T., Smirnova, O. V., Lazyrev, V. N., Akopian,
T. A., Chelysheva, V. V., Ayala, J.A., Simankova, A. N.,
Borchsenius, S. N., Govorun, V. M. (2002) Characterization
of the Mycoplasma hominis ftsZ Gene and Its Sequence
Variability in the Mycoplasma Clinical Isolates..Biochem.
Biophys. Research Comm. 293, 155-162
Di Conza, J., Mollerach, M., Ayala, J.A., Gutkind, G.
(2002) Estudio de integrones clase 1 en Salmonella
aisladas en Santa Fe, Argentina. Revista FABICIB 6,
163-169
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.5
Biotecnología y genética de bacterias
José Berenguer
Postdoctorales /
Jasminka Boskovic
Celia Perales
Graduate Students:
Cristina Vallés
Pablo Castán
Renata Moreno
Felipe Cava
Olga Zafra
Eddy Caro
Emilio Blas
Margarita Sánchez
pesar de ser exportada al periplasma (C.
Nuestro grupo utiliza aislados del género
Vallés, Tesis Doctoral). En el segundo
aspecto, hemos demostrado que la
Thermus como organismo termófilo modelo,
tanto para estudios de carácter básico
acerca de su biología, como en su vertiente
maduración y unión a la membrana de las
subunidades mayores de la nitrato reductasa
respiratoria requiere la presencia de un
más aplicada para su utilización como
"factoría celular" para la producción de
enzimas termoestables. A nivel básico, los
citocromo C periplásmico en T. thermophilus.
objetivos fundamentales en los dos últimos
años han sido el análisis de la regulación
empleado por primera vez en termófilos
extremos dos genes trazadores, codificantes
transcripcional y traduccional del
componente mayoritario de la capa proteica
cristalina (capaS) que envuelve a esta
de una `-galactosidasa y una fosfatasa
bacteria, y la caracterización de las enzimas
implicadas en la respiración anaeróbica de
nitrato. En el primer aspecto, hemos
una enzima periplásmica que utiliza el
recientemente descrito sistema de
demostrado la existencia de un espacio
periplásmico en Thermus a través del
aislamiento de mutantes de deleción de la
región 5'UTR (transcrita pero no traducida)
del gen de la capa S(slpA), y hemos
para su secreción en E. coli.
Adicionalmente, hemos empleado el
promotor de la nitrato reductasa respiratoria
para la construcción de los primeros
analizado in vivo la función de SlrA, una
proteína que ejerce una fuerte actividad
Thermus, utilizándolos para demostrar in
vivo la termoestabilidad de una ribozima
del parásito Schistosoma mansoni.
represora sobre la transcripción de slpA, a
A nivel aplicado, hemos descrito y
alcalina (AP), ambas con óptimos de
actividad en torno a los 80 ºC. La AP es
transporte Tat (Twin Arginine Transporter)
vectores de expresión controlada en
Termoestabilidad in vivo de la ribozima SM_1 de Schistosoma mansoni. En regiones repetitivas del genoma de S. mansoni (A) se encuentra codificada una ribozima
(SM_1) capaz de producir la ruptura (en trans) de un RNA blanco (Syn) y la suya propia (en cis) (B). Ambos genes fueron clonados en T. thermophilus en direcciones
opuestas, bajo el control de un promotor inducible (Pnar) y otro constitutivo (Ps), respectivamente (C). Tras la inducción de Pnar se analizó la actividad en cis y
en trans de la ribozima a distintas temperaturas (50-80 ºC) mediante Northern blot (D) con sondas contra el RNA blanco (Osyn) y la ribozima (Orib1 y Orib2).
Nótese como ambas actividades máximas tienen lugar a 70 ºC.
In vivo thermostability of the ribozyme SM_1 from Schistosoma mansoni. Within the repetitive DNA sequences of Schistosoma mansoni (A) a ribozyme (SM_1) is
encoded, which is able to catalyze its self-cleavage (in cis) and the cleavage (in trans) of a target RNA (Syn) (B). Both genes were cloned divergently in T. thermophilus
HB8 under the control of inducible (Pnar) and constitutive (Ps) promoters, respectively (C). After induction of Pnar, cis and trans activities were analyzed by Northern
blot at different temperatures (50-80 ºC), with specific probes against the target RNA (Osyn) and the ribozyme (Orib1 y Orib2). Note how both activities reached
their maximum at 70 ºC.
110
Biotechnology and genetics of extreme
Research summary
Our research group uses isolates
belonging to the genus Thermus as
models of thermophilic microorganisms,
both for basic research on their biology
, and, from an applied point of view, for
their use as "cell factories" to produce
thermostable enzymes.
At the basic research level, the main
objectives during the last two years have
been the analysis of the transcriptional
and traductional regulation of the main
component of the crystalline protein layer
(S-layer) that surrounds this bacteria, and
the characterization of the enzymes
implicated on the anaerobic respiration
of nitrate. On the first topic, we have
demonstrated the existence of a
periplasmic space in Thermus through
the isolation of mutants in which the 5'UTR
(untranslated region) region of the S-layer
gene (slpA) was deleted. We also have
analyzed in vivo the function of SlrA, a
transcription of slpA, despite being
Sanchez, M., Vicente, M. F., Cercenado, E., de Pedro,
secreted to the periplasm (C. Vallés, PhD.
Thesis). On the nitrate respiration topic,
we have demonstrated that the maturation
M. A., Gomez, P,, Moreno, R., Morón, R., Berenguer, J.
and membrane binding of the major
dependent way to reach high levels of penicillin resistance.
subunit of the respiratory nitrate reductase
requires the presence of a periplasmic
Int. Microbiol. 4, 217-222
cytochrome C in T. thermophilus.
Castán, P., de Pedro, M. A., Risco, C., Vallés, C.,
(2001) Diversity among clinical isolates of penicillinresistant Streptococcus mitis: indication for a PBP1-
Fernández-Herrero, L. A., Schwarz, H., Berenguer, J.
At the applied level, we have described
and used for the first time in extreme
thermophiles two gene reporters, coding
for a `-galactosidase and a alkaline
phosphatase (AP), both with optimum
activities around 80 ºC. Interestingly, the
(2001) Multiple Regulatory Mechanisms Act on the 5’
periplasmic AP uses the recently
described Tat (twin arginine transporter)
system for its secretion in E. coli. In
addition, we have used the promoter of
the respiratory nitrate reductase to
Thermus thermophilus alkaline phosphatase via the twin-
construct the firsts vectors for the
controlled expression in Thermus, using
them to demonstrate in vivo the
thermostability of a ribozyme from the
parasite Schistosoma mansoni.
protein which strongly repress the
Untranslated Region of the S-layer Gene from Thermus
thermophilus HB8. J. Bacteriol. 183, 1491-1494
Angelini, S., Moreno, R., Gouffi, K., Santini, C-L.,
Yamagishi, A., Berenguer, J., Wu, L-F. (2001) Export of
arginine translocation pathway in Escherichia coli. FEBS
Letters 506, 103-107
Vázquez-Tello A., Castán, P., Moreno, R., Smith, J. M.,
Berenguer, J., Cedergren, R. (2002) Efficient transcleavage by the Schistosoma mansoni SM_1 hammerhed
ribozyme in the extreme thermophile Thermus
thermophilus. Nucleic Acid Research 30, 1606-1612
Castán, P., Zafra, O., Moreno, R., de Pedro, M. A., Vallés,
C., Cava, F., Caro, E. A., Schwarz, H., Berenguer, J.
(2002) The periplasmic space in Thermus thermophilus:
evidences from a regulation-defective S-layer mutant
overexpressing an alkaline phosphatase. Extremophiles
6, 225-232
Zafra, O., Ramírez, S., Castán, P., Moreno, R., Cava, F.,
Vallés, C., Caro, E., Berenguer, J. (2002) A cytochrome
c encoded by the nar operon is required for the synthesis
of active respiratory nitrate reductase in Thermus
thermophilus FEBS Letters 523,99-102
Vallés, C., Castán, P., Berenguer, J. (2002)
Microorganismos termófilos y sus aplicaciones. Colección
"Becas de Investigación" . Ed: Obra Social y Cultural
de Caja Segovia. I.S.B.N.: 84-89711-91-7
Patentes / Patents
Zafra, O., Moreno, R., Berenguer, J. (2001) Proceso de
obtención y purificación de una fosfatasa alcalina
recombinante altamente termoestable. OEPM:
200100725
Corte fino de células del mutante 6UTRslpA
de Thermus thermophilus HB8. Obsérvese la
existencia de una envoltura externa común a
un grupo de 14 células. La barra corresponde
a 0,5 µm.
Moreno, R., Zafra, O., Berenguer, J. (2001) Vector
Thin section of cells from the 6UTRslpA mutant
of Thermus thermophilus HB8. Note the
presence of a common external envelope
surrounding a group of 14 cells. Bar
corresponds to 0,5 µm.
plasmídico para la expresión controlada de proteínas
en bacterias termófilas extremas genéticamente
modificadas. OEPM: 200101224.
Cristina Vallés. 2002. “Caracterización funcional de la
proteína SlrA de Thermus thermophilus HB8”. Universidad
111
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.6
Mantenimiento y variabilidad del genoma:
enzimología de la reparacion del DNA
Estamos llevando a cabo un análisis
Hemos identificado dos nuevas DNA
estructura-función de la fidelidad de síntesis
y de la capacidad de dislocación de ambos
polimerasas eucarióticas, denominadas
Pol h (32% de identidad de aminoácidos
enzimas. En el caso de la Pol h humana,
se intentará correlacionar diferencias de
con la Pol ß) y Pol µ (42% de identidad de
fidelidad con la expresión preferencial de
Antonio Rodríguez Fernández de
aminoácidos con TdT). En una primera fase
hemos determinado sus principales
actividades enzimáticas: polimerización de
una variante alélica en muestras de tumores.
Varias isoformas de Pol h, expresadas
específicamente o más abundantemente
DNA y actividad dRP liasa (Pol h);
polimerización de DNA y actividad
transferasa terminal (Pol µ). Nuestros datos
muestran el potencial enzimático de Pol h
para participar en la reparación de daño
en muestras de tumores podrían
reparación de DNA, estudiando la respuesta
Miguel García Díaz
oxidativo en el DNA por un mecanismo de
excisión de base (“base excision repair”, ó
BER), uno de los procesos más frecuentes
de reparación, que elimina bases
modificadas y sitios abásicos. Por otro lado,
Raquel Juárez Santos
las propiedades de la Pol µ son idóneas
dominio BRCT presente en ambos enzimas
para ser el enzima implicado en la
reparación de dobles roturas de cadena de
DNA que son procesadas por un
mediante análisis de dos híbridos de
levadura. Finalmente, se analizarán los
modelos murinos (knock-out) deficientes
mecanismo de reunión de extremos no
en Pol h y Pol µ que hemos generado en
colaboración con otros grupos de
Luis Blanco
Henestrosa
Postdoctorales /
Tomas Kirchhoff
Rosario Sabariegos Jareño
Esther García Palomero
Sergio González Barrera
Graduate Students:
José Ruiz Pérez
Estudiantes /
Angel Picher Serantes
Gloria Terrados Aguado
homólogos (NHEJ).
representan variantes “mutadoras” del
enzima que pudieran contribuir al proceso
de tumorogénesis. Se intentará demostrar
la participación de Pol h y Pol µ en
a diversos tipos de daño en el DNA de
líneas celulares sobreproductoras de Pol h
(ambos alelos) o de Pol µ. Se buscarán
interacciones específicas a través del
investigación nacionales e internacionales.
Funciones propuestas para la Pol µ, en base a los datos de expresión (hipermutación
somática y recombinación VDJ) y en la capacidad del enzima para alinear cadenas
de DNA parcialmente complementarias (reparación de dobles roturas de cadena de
DNA vía NHEJ).
Functions proposed for Pol µ, based on data derived from expression (somatic
hypermutation and VDJ recombination) and the ability of the enzyme to align partially
complementary DNA strands (double-stranded DNA repair through NHEJ).
112
Genome maintenance and variability:
Research summary
We have identified two novel eukaryotic
DNA polymerases, named Pol h, (32%
amino acid identity with Pol ß) and Pol µ
(42% amino acid identity with TdT). In a
preliminar characterization, we described
their main enzymatic activities: DNA
polymerization and dRP lyase (Pol h);
DNA polymerization and terminal
transferase (Pol µ). Our data demonstrate
the enzimatic potential of Pol h to
participate in the repair of oxidative
damage by a mechanism named base
excision repair (BER), a very active
pathway that deals with modified bases
and abasic sites. On the other hand, the
peculiar properties of Pol µ make this
enzyme the most suitable candidate to
repair double strand breaks (DSBs) by a
mechanism referred to as nonhomologous end-joining (NHEJ).
We are carrying out a structure-function
Ruiz, J.F., Dominguez, O., Lain de Lera, T., García-Diaz,
analysis of the intrinsic fidelity and
dislocation capacity of both enzymes. For
M., Bernad, A., Blanco, L.(2001) DNA polymerase mu,
human Pol h, fidelity differences that could
B. Biol. Sci. 356, 99-109
imply a mutator phenotype will be
correlated with allelic variants preferentially
expressed in tumoral samples. Various
García, M., Bebenek, K., Kunkel, T., Blanco, L. (2001)
a candidate hypermutase? Philos. Trans. R. Soc. Lond.
Identification of an intrinsic dRP lyase activity in human
Pol h isoforms, specifically and/or
abundantly expressed in tumoral samples
could be “mutator variants” with an
implication in tumorogenesis. The
involvement of Pol h in a base excission
DNA polymerase lambda: a possible role in base excision
repair (BER) mechanism to relieve
oxidative damage in DNA, and the
nomenclature. J. Biol. Chem. 276, 43487-43490
involvement of Pol µ in double-strand
break repair via NHEJ will be studied by
testing damage responsiveness of cell
lines overproducing Pol h (each of both
Taladriz, S., Hanke, T., Ramiro, M.J., García-Diaz, M.,
allelic variants) or Pol µ. Specific
Nucleic Acids Res. 29, 3822-34
interactions, proposed to occur through
the BRCT domain present in both
García-Díaz, M., Bebenek, K., Sabariegos, R.,
repair. J. Biol. Chem. 276, 34659-34663
Burgers, P.M.J., Koonin, E. V., Blanco, L. et al. (2001)
Eukaryotic DNA polymerases: proposal for a revised
García De Lacoba, M., Blanco, L., Larraga, V.. (2001)
Nuclear DNA polymerase beta from Leishmania infantum.
Cloning, molecular analysis and developmental regulation.
enzymes, will be studied by yeast twohybrid analysis. Finally, murine KO models
Domínguez, O., Rodríguez, J., Kirchhoff, T., García-
of Pol h and Pol µ deficiency, generated
T.A., Blanco, L. (2002) DNA Polymerase Lambda, a
in collaboration with other research
laboratories, will be studied.
Novel DNA Repair Enzyme in Human Cells. J. Biol.
Palomero, E., Picher, A.J., Juárez, R., Ruiz, J.F., Kunkel,
Chem. 277, 13184-13191
Truniger, V., Lázaro, J.M., Blanco, L., Salas, M. (2002)
A highly conserved lysine residue in phi29 DNA
polymerase is important for correct binding of the
templating nucleotide during initiation of phi29 DNA
replication. J. Mol. Biol. 318, 83-96
Duvauchelle, J.-B., Blanco, L., Fuchs, R. P. P., Cordonnier,
A. M. (2002) Human DNA polymerase mu (Pol µ) exhibits
an unusual replication slippage ability at AAF lesion.
Nucleic Acids Res. 30, 2061-2067
Truniger, V., Lázaro, J.M., Esteban, F.J., Blanco, L., Salas,
M. (2002) A positively charged residue of phi29 DNA
polymerase, highly conserved in DNA polymerases from
families A and B, is involved in binding the incoming
nucleotide. Nucleic Acids Res. 30, 1483-1492
Maga, G., Villani, G., Ramadan, K., Shevelev, I., Tanguy
Le Gac, N., Blanco, L., Blanca, G., Spadari, S., Hübscher,
U. (2002) Human DNA polymerase lambda functionally
and physically interacts with proliferating cell nuclear
antigen in normal and translesion DNA synthesis. J. Biol.
Chem. 277, 48434-48440
Representación del sitio activo de polimerización de la Pol ß humana, en la que se indican una serie de
residuos implicados en la catálisis y fidelidad de inserción del nucleótido entrante (en amarillo), en base
a la complementariedad con un nucleótido molde (en verde). Los residuos coloreados en marrón son
invariantes entre Pol ß y Pol h. La falta de conservación de Lys280, Asp276 y Ala185 sugiere importantes
diferencias entre la Pol ß y la Pol h. La figura ha sido realizada con los programas GRASP, MOLSCRIPT
y RASTER3D, utilizando el fichero 1BPY del banco de datos PDB.
The active polymerization site of human Pol ß, indicating the sites involved in catalysis and incoming
nucleotide insertion fidelity (yellow), based on the complementarity with a template nucleotide (green).
Brown-colored residues are invariant in Pol ß and Pol h. The lack of conservation in Lys280, Asp276 and
Ala185 suggests important differences between Pol ß and Pol h. The figure has been prepared using
GRASP, MOLSCRIPT and RASTER3D software, using the 1BPY file and the PDB database.
113
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.7
José Luis Castrillo Díez
Graduate Students:
Silvia Avila Flores
Olga Bassy Alvarez
Job García Liévana
Juan Ignacio Imbaud
Angelina Rodríguez Torres
restricción de expresión específica de tejido,
así como la purificación de los factores de
El objetivo general de nuestra línea de
investigación es el estudio a nivel molecular
de la expresión génica específica de tejido
transcripción que las regulan.
en células humanas. Nuestro sistema
modelo principal lo constituye el gen
línea de investigación, es la puesta a punto
de técnicas de análisis de expresión
humano HGH-N que se transcribe
específicamente en la hipófisis anterior y
que se localiza en el cromosoma 17q23.3
diferencial de mRNAs: "Differential Display
RT-PCR" y DNA Microarrays" que nos ha
permitido establecer dos nuevos objetivos:
dentro del locus "HGH-HPL". A este locus
pertenecen genes que comparten una gran
homología de secuencia pero que se
(1) Identificación y clonaje de genes
específicamente expresados en tumores
transcriben en tejido placentario: HGH-V,
Otra área de desarrollo dentro de nuestra
hipofisarios humanos, que nos permitirán
profundizar en los mecanismos moleculares
de expresión génica hipofisaria, así como
en el desarrollo de nuevos marcadores de
progresión tumoral hipofisaria.
Estela Bastos
HPL-3 y HPL-4. Asimismo, hemos iniciado
el estudio de los mecanismos de restricción
especifica de tejido de otro locus génico
humano: "HLH-HCG", localizado en el
cromosoma 19q13.3 y que también
(ICETA-UTAD, Portugal)
presenta un patrón de expresión tisular
(2) Identificación y caracterización de genes
Ivan Delgado
semejante: hipófisis vs placenta. Para ello
se están analizando las regiones
promotoras y enhancers de estos genes,
específicamente expresados en tejido
endometrial humano durante la "ventana"
de implantación, para clonar nuevos genes
marcadores de implantación embrionaria.
Enrique Martín-Francés
(UANL, México)
identificando los elementos que confieren
Microscopía Confocal del Factor de Transcripción GHF1/Pit1 (verde) y de la
Hormona de Crecimiento hGH (rojo), en células hipofisarias.
Confocal Microscopy of GHF1/Pit1 transcripción factor (green) and growth
hormone GH (red), in pituitary cells.
114
Regulation of the tissue-specific gene expression
Research summary
The overall goal of this project is to study
at molecular level the tissue-specific gene
expression in human cells. Our working
model is the human growth hormone
gene (HGH-N) specifically transcribed in
the anterior pituitary and mapped at
A new area of research and development
Martin, J., Avila, S., Jiménez, O., Pellicer, A., Castrillo,
in our laboratory, is to set-up new
approaches to study differential
expression of mRNAs: DD-RTPCR and
J.L., Simon, C. (2001) Detection of novel genes
DNA Microarrays techniques. We are
involved in two new goals:
associated to high versus low endometrial receptivity
status. J. Soc. Gynecol. Invest. 8,115-118
Avila, S., Castrillo, J.L. (2002) Terapia Génica.
In: Hernandez, E., Simon, C. (ed.) Biología Molecular
(1) Identification and cloning of genes
specifically expressed in human pituitary
tumours. This approach can lead us to
improve our understanding of pituitary
gene-expression control, and use this
en Medicina Reproductiva. FIVIER Press, España,
knowledge to develop new therapeutic
agents.
Receptivity: Gene Regulation. J. Rep. Immunol. 55,
HCG" locus, located at chromosome
19q13.3, and also expressed in pituitary
(2) Identification of genes diferentially
expressed in receptive versus non-
or placenta tissues. We are analyzing
the promotor and enhancer regions,
receptive human endometrium. Using
two cell lines with extreme receptive
phenotype and screening genome-wide
Marina Romero Prado. 2002. “Mecanismos de regulación
gene expression using DNA Microarrays
and DD-RTPCR, we are finding new
genes involved in the receptive or non-
V): efectos de la glucosa y estados de metilación del
chromosome 17q23.3 in the "HGH-HPL"
locus. This is a gene-cluster with other
four closely related genes (HGH-V, HPL3 y HPL-4), but specifically transcribed
in placenta tissue. In addition, we started
the study of the tissue-specific
transcriptional control of the human "HLH-
identifying the cis-DNA elements, and
cloning the transcription factors involved
in the tissue-specific transcriptional
control.
pp 200-210
Martín, J., Domínguez, F., Avila, S., Castrillo, J.L., Remohí,
J., Pellicer, A. Simon, C. (2002) Human Endometrial
131-139
transcripcional de los genes humanos de las hormonas
de crecimiento hipofisaria (hGH-N) y placentaria (hGH-
DNA sobre su expresión”. Universidad Autónoma de
Madrid.
receptive status. This approach can lead
us to improve our understanding of
endometrial receptivity and use this
knowledge to optimize it in infertility
Martha Y. Díaz Gallardo. 2002. “Identificación de proteínas
coactivadoras del factor transcripcional PIT1/GHF1”.
patients or to alter it as an interceptive
procedure.
ORGANIZACIÓN CURSOS ESPECIALIZACIÓN CSIC:
"Cursos Prácticos de Regulación Transcripcional y
Expresión Génica": Septiembre-2001 y 2002.
Differential Display (DD-RTPCR) gel.
Differential Display (DD-RTPCR) gel.
115
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.8
Estructura y función del ribosoma
Juan Pedro García Ballesta
Scientific Staff:
Miguel Remacha
Antonio Jiménez Díaz
Postdoctorales /
Cruz Santos
Gretel Nusspaumer
Sonia Zúñiga
Graduate Students:
Pilar Parada
Patricia González Santamaría
Jorge Pérez Fernández
De-yi Qiu
Alberto García Marcos
Verónica Briceño
Estudiantes /
Arancha Sánchez
Ruben Hervás
Mari Carmen Fernández Moyano,
Rebeca Galisteo
Juan Luis Alberruche
Prof. David Jameson,
Dept. Biología Molecular, Universidad
de Hawaii, USA
Dra. Sophia Kouyanou,
Dept. Biología, Universidad de Atenas,
Grecia
Prof. Wanxiang Xu,
Fudan University, Shanghai, R.P. China
B) Síntesis y ensamblaje del tallo
Regulación de la traducción en células
eucarióticas. Papel del tallo ribosómico
ribosómico. La acumulación de los
componentes del tallo está regulada por
degradación por un sistema diferente al
Nuestros estudios previos indican que el
tallo ribosómico puede regular la traducción
proteasoma y la vacuola. Se está
abordando el estudio de este desconocido
sistema degradativo caracterizando las
eucariótica. Este nuevo mecanismo de
control de la expresión génica puede jugar
un papel clave en la traducción de proteínas
señales de degradación e intentando
identificar las proteasas implicadas.
relacionadas con determinadas condiciones
de estrés. El objetivo último de nuestro
trabajo es aclarar este mecanismo de
C) Identificación de mRNAs cuya traducción
responde a alteraciones del tallo ribosómico.
Se obtendrá información de la comparación
regulación usando como modelo
del “transcriptoma” y del “traductoma”
Saccharomyces cerevisiae, cuyo tallo
ribosómico esta constituido por las proteínas
P0, P1_, P1`, P2_, P2` y L12. Como
objetivos inmediatos nos proponemos:
(mRNas en polisomas) de mutantes con
alteraciones en el tallo ribosómico.
Igualmente se identificarán mediante
microarrays los mRNAs asociados a
A) Caracterizar las interacciones entre los
distintos componentes del tallo y de éste
polisomas en ensayos de traducción in vitro
derivados de los mismos mutantes. Se
caracterizarán elementos en cis y en trans
con los factores solubles de la síntesis de
proteínas, en especial del factor EF-2. Se
aplican técnicas de “doble híbrido”, puenteo
que afecta su traducción preferente.
químico, etiquetado de proteínas con
la sordarina afectan directamente la función
del tallo ribosómico. Se están identificando
genes que afectan a la actividad inhibidora
diferentes marcadores, incluyendo la GFP.
La técnica “Fluorescence Correlation
Spectroscopy” (FCS) utilizando un
microscopio de fluorescencia de dos fotones
nos permite estudiar estas interacciones
en el interior de la célula (Colaboración con
Dr. E. Gratton).
Aumento de la fluorescencia intrinseca de
S. cerevisiae en un microscopio de fluorescencia
de dos fotones
116
D) Compuestos antifúngicos derivados de
y que pueden relacionarse con la función
ribosómica.
Ribosome structure and function
Research summary
Regulation of translation in eukaryotic
cells. Role of the ribosomal stalk
Our previous studies have indicated that
the ribosomal stalk may regulate
translation in eukaryotes. This new genetic
expression control mechanism can play
B) Synthesis and assembly of the
ribosomal stalk. The cellular accumulation
of stalk components is regulated by
proteolysis through a system that is
different from the proteasome and the
vacuole. We are studying this unknown
degradation pathway by characterizing
the protein degradation signals and trying
to identify the proteases involved in the
Gómez, E. B., Medina, G., Ballesta, J. P. G., Levin, M.J.,
Téllez-Iñón, M.T. (2001) Acidic ribosomal P proteins are
phosphorylated in Trypanosoma cruzi. Int. J. Parasitol.
31, 1032-1039
Guarinos, E., Remacha, M., Ballesta, J.P.G. (2001)
Asymmetric interactions between the acidic P1 and P2
proteins in the Saccharomyces cerevisiae ribosomal
stalk. J. Biol. Chem. 276, 32474-32479
a key role in the translation of proteins
related to some stress conditions. The
process.
final objective of our project is to
understand this regulatory mechanism
using as a model Saccharomyces
cerevisiae, whose stalk is formed by
C) Identification of mRNAs whose
stalk components in the resistance of Aspergillus
translation is affected by ribosomal stalk
alterations. Information will be gathered
fumigatus to the sordarin antifungals. Mol. Microbiol.
Santos, C., Ballesta, J.P.G. (2002) Role of the ribosomal
L12. As short term objectives we intend:
from comparison of the “transcriptome”
and the “translatome” (mRNAs in
polysomes) from mutants having stalk
A) Characterizing the interactions between
alterations. Similarly, mRNAs in polysomes
from in vitro translation systems derived
the different stalk components as well as
from the same mutants are being identified
between the stalk and the translation
soluble factors, especially EF2. The two-
using microarrays. Cis and trans acting
factors, which affect these mRNAs
hybrid method, chemical cross-linking,
translation will be characterized.
proteins P0, P1_, P1`, P2_, P2` and
protein tagging using different tags, like
GFP, are being used for in vitro studies.
Fluorescence correlation spectroscopy
(FCS) and two-photon fluorescence
microscopy are allowing us to study these
interactions inside the cell (collaboration
with Dr. E. Gratton).
43, 227-237
Lalioti, V.S., Pérez-Fernández, J., Remacha, M., Ballesta,
J.p.g. (2002) Characterization of interaction sites in the
Saccharomyces cerevisiae ribosomal stalk components.
Mol. Microbiol. 46, 719-729
Lázaro, E., Sanz, E., Remacha, M., Ballesta, J.P.G.
(2002) Characterization of sparsomycin resistance in
Streptomyces sparsogenes. Antimicrob. Agents
Chemother. 46, 2914-2919
D) Antifungal sordarin derivatives directly
affect the stalk function. New genes that
affect the sordarin inhibitory activity, and
consequently can be related to the stalk
function, are being identified.
Pilar Parada Valdecantos. 2001. “Estudios bioquímicos,
biofísicos y celulares de la estructura del tallo ribosómico
se Saccharomyces cerevisiae”.
Patricia González Santamaría. 2002. “Rpn6 es una
proteína esencial para mantener la estructura y actividad
del proteasoma 26S de Saccharomyces cerevisiae”.
117
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.9
Síntesis de proteínas y su regulación en
eucariontes
Jefes de Línea / Group Leaders:
César de Haro, José M. Sierra
Control de la traducción por las eIF-2_
quinasas (C. de Haro)
Regulación del crecimiento y
diferenciación celular durante el
desarrollo embrionario a nivel de la unión
del mRNA al ribosoma (J.M. Sierra)
Graduate Students:
Natalia Pomar
Damariz Rivero
Mónica Elías
Isabela Alonso
José Alcalde
Cuatro proteínas quinasas diferentes
regulan la síntesis de proteínas en respuesta
a varias situaciones de estrés. Estas son,
el inhibidor regulado por hemina (HRI), la
proteína kinasa inducible por interferón y
activada por dsRNA (PKR), la quinasa
asociada al retículo endoplásmico (PERK)
y el GCN2. Clonamos el primer miembro
de esta familia de embriones de Drosophila
(Santoyo et al. JBC, 272, 12544-50, 1997).
Ahora, hemos caracterizado la segunda
eIF2_ quinasa de Drosophila, un homólogo
de PERK (Pomar et al. EJB, 270, 293-306,
2003). La expresión de DPERK está
regulada durante el desarrollo embrionario.
También, hemos identificado el primer
homólogo de GCN2 en mamíferos
(MGCN2) (Berlanga et al. EJB, 265, 75462, 1999). Estudios recientes han
demostrado que ratones desprovistos del
gen Pkr, muestran una respuesta antiviral
casi normal; lo cual sugiere la existencia
de otra eIF2_ quinasa(s) que compense la
pérdida de función de la PKR. Existe la
posibilidad de que el MGCN2 juegue ese
papel, por ello, estudiaremos la función y
los mecanismos de control de MGCN2 en
las células de mamífero. Estos estudios nos
permitirán profundizar en la importancia de
las eIF2_ quinasas y su papel en el control
del crecimiento celular y la respuesta
antiviral.
118
Las proteínas eIF (eukaryotic initiation factor)
4E, eIF4G, eIF4A y eIF4B forman parte de
un complejo proteico implicado en el
reconocimiento y unión del mRNA al
ribosoma. Resultados previos de nuestro
laboratorio permitieron el aislamiento y
caracterización de estas proteínas a partir
de embriones de Drosophila melanogaster,
la clonación de los genes correspondientes,
y el estudio de su expresión durante el
desarrollo embrionario. Actualmente
estamos interesados en encontrar
evidencias que apoyen el papel de alguno
de estos genes en la regulación del
crecimiento y diferenciación celular durante
el desarrollo. Para ello, disponemos de
mutantes defectivos en alguno de estos
genes así como moscas transgénicas que
los sobreexpresan. También nos
proponemos identificar mRNAs cuya
traducción se active preferentemente en
respuesta a un aumento en los niveles
activos de estas proteínas. De esta manera
esperamos identificar genes importantes
en el crecimiento y proliferación celular cuya
expresión esta regulada a nivel de la
traducción.
Protein synthesis and its regulation in eukaryotes
Research Summary
Translational control by eIF-2_ kinases
Regulation of cell growth and
differentiation during embryonic
development at the level of mRNA
(C. de Haro)
binding to the ribosome (J.M. Sierra)
Four distinct eIF2_ kinases regulate
The proteins eIF (eukaryotic initiation
protein synthesis in response to various
environmental stresses. These are the
hemin-regulated inhibitor (HRI), the
factor) 4E, eIF4G, eIF4A y eIF4B are part
of a protein complex involved in the
recognition and binding of the mRNA to
interferon-inducible dsRNA-dependent
the ribosome. Previous results from our
laboratory led to the isolation and
characterization of these proteins from
Natalia Pomar Ballestero. 2001. “Regulación de la
iniciación de la traducción en Drosophila melanogaster:
Caracterización del factor eIF2B y de una nueva eIF2_
kinase (PKR), the endoplasmic reticulumresident kinase (PERK) and the GCN2
quinasa”. Universidad Autónoma de Madrid.
Simposios Organizados /
Organized Symposia
César de Haro
protein kinase. We found the first member
of this family, from Drosophila
melanogaster embryos (Santoyo et al.
Drosophila melanogaster embryos, the
Co-organizer: “Translational Control in Development and
cloning of the corresponding genes, and
the study of their expression during
Neurobiology”, a joint Serono Foundation- EMBO
JBC, 272, 12544-50. 1997). Recently, we
have characterized the second eIF2_
kinase found in Drosophila, a PERK
embryonic development. At present, we
are interested to find evidences supporting
the role of some of these genes in the
homologue (Pomar et al. EJB, 270, 293306, 2003). Expression of DPERK is
developmentally regulated. We also found
regulation of cell growth and differentiation
during development. To this end, we have
mutants lacking some of these genes as
the first mammalian GCN2 homologue
(MGCN2) (Berlanga et al. EJB, 265, 754-
well as transgenic flies overexpressing
62, 1999). Recent studies demonstrated
whose translation is preferentially
that mice lacking Pkr, show a nearly
normal antiviral response after interferon
treatment, suggesting the existence of
increased in response to a rise in the
them. We also intend to identify mRNAs
active levels of these proteins. In this way
we hope to identify critical genes in cell
another eIF2_ kinase(s) that must
growth and differentiation whose
compensate for loss of PKR function. It
is a possibility that the function of MGCN2
expression is regulated at the translational
level.
could explain some of the open questions
raised by these findings. Thus, we will try
to understand the function and the
mechanisms of control of MGCN2. These
studies would allow further elucidation of
the importance of eIF2_ kinases and their
role in control of cell growth and anti-viral
response.
119
Workshop, Palma de Mallorca, 2002.
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.10
Expresión génica en levaduras y streptomyces
Antonio Jiménez
Se han obtenido levaduras industriales
amilolíticas que contienen DNA derivado
exclusivamente de levaduras. La
transformación se realizó mediante una
estrategia integrativa dirigida a una región
María Fernández-Lobato
(responsable de laboratorio)
Investigador Visitante /
adyacente al locus ILV2, determinante de
resistencia a sulfometuron. El estudio llevado
a cabo sobre la regulación de la expresión
un polipéptido altamente hidrofóbico (SCR1)
con 14 dominios transmembrana, que
presenta una alta homología de secuencia
con proteínas de levaduras pertenecientes
a la familia MDR, que confieren resistencia
a diferentes antifúngicos. Sin embargo,
SCR1 confiere resistencia únicamente a
cyh y no a agentes como el benomilo o el
metotrexato. Se propone un nuevo
del gen SWA2 de Schwanniomyces
occidentalis en Saccharomyces cerevisiae
ha permitido localizar las secuencias
mecanismo de resistencia ribosomal donde
los ribosomas de las levaduras que
expresan SCR1 podrían sufrir un cambio
conformacional durante el transporte desde
promotoras de este gen, ubicadas entre las
posiciones -223 y +15, implicadas en
el núcleo al citoplasma que mermaría el
efecto del antibiótico.
Eloísa Sanz Martínez
repression catabólica, activación por etanol
Irene Saugar
y modulación por cAMP.
Se ha aislado y estudiado el repressor
Graduate Students:
catabólico SoMIG1 de la levadura
Schwanniomyces occidentalis. El gen
codificaría para una hipotética proteína de
caracterización de la ruta de biosíntesis del
antibiótico puromicina en el organismo
458 aminoácidos que muestra una alta
estudio del cluster ata de la ruta de
biosíntesis del antibiótico A201A. Éste es
un aminonucleósido similar a puromicina.
Visiting Researcher:
María Josefa
Elena Fernández-Fernández
Postdoctorales /
Dolores Marín Alberdi
María Blanca Sánchez Martínez
Patricia Barrado Guerrero
Laura Martínez Fernández Yáñez
María José Rodríguez Benito
Sara Mesa García.
homología de secuencia con los homólogos
a Mig1 y CreA descritos en distintos
organismos. El dominio de unión al DNA y
el efector de las proteínas de Schw.
En relación a Streptomycetes, se ha
continuado el análisis de varios pasos
enzimáticos para completar la
productor. También se ha continuado el
occidentalis y S. cerevisiae presentan
Su organismo productor (Streptomyces
capreolus) no pudo ser transformado, por
lo que no fue posible iniciar el análisis
Asunción Martín Redondo
identidades de un 71% y 15%,
respectivamente. El gen SoMIG1
genético y bioquímico de este cluster. Sin
embargo, se ha logrado integrar ata en
complementa la mutación mig1 de S.
cerevisiae.
Se ha estudiado el gen SCR1 de Schw
occidentalis que induce resistencia a
cicloheximida (cyh), a nivel ribosomal, en
S. cerevisiae. El gen dirigiría la síntesis de
120
Streptomyces lividans lo que se espera
permita el estudio de los genes y los
enzimas implicados en la biosíntesis de
A201A.
Gene expression in yeast and streptomyces
Research summary
to cyh but not to benomyl or metothrexate.
Marin, D., Jiménez A., Fernández Lobato. M. (2001)
Construction of an efficient amylolytic industrial yeast
Amylolytic industrial yeast strain of
So, these findings would disclose a novel
ribosomal resistance mechanism where
Saccharomyces cerevisiae contains DNA
derived exclusively from yeast were
the ribosomes of yeast cells expressing
SCR1, would undergo a conformational
FEMS Microbiol. Lett. 201, 249-253
obtained. Yeast transformation was carried
change during transport from the nucleus
Carmona, T. A., Barrado, P. Jiménez, A., Fernández
out by an integrative process targeted to
a dispensable upstream region of the
ILV2 locus, which determines
to the cytoplasm, which lowers their affinity
for cyh-binding.
Lobato, M. (2002) Molecular and functional analysis of
sulfometuron resistance. Expression in
S. cerevisiae of the SWA2 gene from
Schwanniomyces occidentalis was
Concerning Streptomycetes, the study of
studied. Deletion analyses (-223 to +15)
permitted the identification of different
fragments involved in glucose repression,
ethanol activation and cAMP regulation.
continued in order to end its
characterisation.
strain containing DNA exclusively derived from yeast.
a MIG1 homologue from the yeast Schwanniomyces
occidentalis. Yeast 19, 459-465
a number of enzymatic steps of the
puromycin biosynthetic pathway was
Carmona, T. A., Jiménez, A., Fernández Lobato. M.
(2002) Analysis of the Schwanniomyces occidentalis
SWA2 gene promoter in Saccharomyces cerevisiae.
FEMS Microbiol. Lett. 207, 69-73
The study of the A201A biosynthetic gene
(ata) cluster was also continued. This
antibiotic contains, in addition to an
Hoenicka, J., Fernández Lobato, M. Marín, D. Jiménez,
aminonucleoside moiety identical to that
which confers ribosomal resistance to cycloheximide.
putative protein of 458 amino acid that
of puromycin,.a polyketide and two
Yeast 19, 735-743
showed a high homology with Mig1 and
CreA analogues from different organisms.
monosaccharide moieties. This complexity
A glucose repressor MIG1-homologue
(SoMIG1) was isolated from the yeast
Schw. occidentalis. The gene encodes a
A. (2002) The SCR1 gene from Schwanniomyces
occidentalis encodes a highly hydrophobic polypeptide,
is a stimulus to dig into its biosynthetic
and genetic systems. However,
Saugar, I., Sanz, E., Jiménez, A. (2002) Identification of
The DNA binding and effector domains
of this protein showed an identity of 71%
transformation of Streptomyces capreolus,
aminonucleoside moiety of antibiotic A201A from
and 15%, respectively, to those of the
Mig1 protein from S. cerevisiae. The
SoMIG1 gene complemented a mig1
the producing organism, was not
achieved. This handicap did not permitted
to initiate a gene inactivation program in
5535
mutant of this yeast.
order to isolate intermediates an
characterise enzymatic steps.
The SCR1 gene from Schw occidentalis
Nevertheless, the whole ata cluster was
that induce ribosomal resistance to
isolated in the model Streptomyces
lividans, which will most probably permit
cycloheximide (cyh) in S. cerevisiae has
been studied. It would encode a highly
a straightforward study of these subjects.
hydrophobic polypeptide (SCR1) with 14
transmembrane domains, highly similar
to a variety of yeast proteins of the
multidrug-resistance (MDR) family.
However, SCR1 only conferred resistance
121
a set of genes involved in the biosynthesis of the
Streptomyces capreolus. Eur. J. Biochem. 169, 5527-
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.11
Iniciación interna de la traducción en mRNAs
eucarióticos
Encarnación Martínez-Salas
Postdoctorales /
Ricardo Ramos Ruiz
Sonia López de Quinto
Sandrine Reigadas
Graduate Students:
Olga Fernández Miragall
Almudena Pacheco García
Paula Serrano Pérez-Nievas
Personal Técnico /
Emilio Cano Cabezas
Jorge Ramajo Alonso
Jordi Gómez Castilla
H. Vall d´Hebrón, Barcelona
La iniciación de la traducción de mRNAs
para la actividad del IRES. La interacción
de eIF4B es más fuerte que la de eIF4G
aunque accesoria. Sin embargo, ni eIF4G
eucarióticos que codifican proteínas
necesarias en etapas en las que la iniciación
dependiente de cap está inhibida (apoptosis,
infecciones virales, etc.) está dirigida por
ni eIF4B interaccionan con el IRES de HCV.
La diversidad de interacciones RNA-proteína
observada en distintos IRES no permite
elementos IRES (sitios de entrada interna
del ribosoma). La comparación de IRES
muestra gran diversidad de secuencias y
todos ellos (Figura 1). El desciframiento de
la estructura terciaria del IRES, todavía
estructuras secundarias del RNA. Nuestro
grupo se ha centrado en el estudio de
regiones estructurales del IRES del virus
establecer un modo de acción común a
desconocida, es uno de los requisitos
necesarios para entender el mecanismo de
iniciación interna de la traducción. Con este
de la fiebre aftosa (FMDV) y hepatitis C
(HCV) esenciales para su actividad. La
fin, estamos estudiando motivos
estructurales GNRA y RAAA como
candidatos para organizar la estructura
relevancia funcional de estas regiones
tridimensional del IRES (Figura 2).
proviene de su participación en
interacciones RNA-proteína así como RNARNA estabilizadoras de la arquitectura del
La región 3´ no traducida del RNA de FMDV
IRES. Por otro lado, debido a su capacidad
de funcionar independientemente del
contexto genético que los rodea, los IRES
son herramientas para la construcción de
estimula la actividad IRES, aún en situación
de rotura de eIF4G e inactivación del puente
RNA-proteína con PABP. Estamos
interesados en identificar los factores
vectores de expresión policistrónicos en
implicados en esta estimulación, que podría
generar una pseudocircularización del RNA
células animales.
(Figura 1), además de la búsqueda de
Hemos identificado el sitio de interacción
proteínas de interacción con RNA que
contribuyan a la modulación de la actividad
de los factores de iniciación de la traducción
eIF4B, eIF4G y eIF3 en el IRES de FMDV,
siendo la interacción de eIF4G esencial
Diversidad de interacciones RNA-proteína implicadas en la
iniciación de la traducción.
Diversity of RNA-protein interactions involved in translation
initiation.
122
del IRES en función de su concentración o
su modificación postraduccional en distintas
líneas celulares.
Internal initiation of translation in eukaryotic mRNAs
Research summary
activity, that of eIF4B seems to be
López de Quinto, S., Lafuente, E., Martínez-Salas, E.
(2001) IRES interaction with translation initiation factors:
Initiation of translation in eukaryotic
mRNAs encoding proteins required at
dispensable. However neither eIF4G nor
eIF4B interacts with the HCV IRES. The
pattern of RNA-protein interaction
times when cap-dependent translation is
observed in different IRES suggests a
inhibited (apoptosis, viral infections, etc.)
occurs internally, under the control of a
region named IRES (internal ribosome
diversity of strategies to recruit the
ribosome internally (Figure 1). To date,
the tertiary structure of IRES elements is
Martínez-Salas, E., Ramos, R., Lafuente, E., López de
entry site). The primary sequence of the
growing list of IRES elements is not
conserved, neither their predicted
still unknown. Structural elements in the
FMDV IRES including GNRA and RAAA
J. Gen. Virol. 82, 973-984
motifs which are candidates to mediate
Schneider, R., Martínez-Salas, E. et al. (2001) New ways
secondary structure shows a significant
degree of homology. We have focused
our work to understand the relationship
in tertiary folding of the RNA structure,
have been shown to be essential for IRES
activity. Therefore, experimental analysis
of initiating translation in eukaryotes? Mol. Cell. Biol. 21,
between structural organization and
activity of the IRES of foot-and mouth
disease virus (FMDV) and hepatitis C
is in progress to investigate their structure
Sáiz, M., Gómez, S., Martínez-Salas, E., Sobrino, F.
(Figure 2).
(2001) Deletion or substitution of the aphthovirus 3´ NCR
(HCV). The relevance of these regions is
We have shown IRES-translation
stimulatory effect of FMDV 3´ noncoding
82, 93-101
likely related to their contribution in RNAprotein and RNA-RNA interactions,
functional characterization of novel RNA contacts with
eIF3, eIF4B, and eIF4GII. RNA 7, 1213-1226
Quinto, S. (2001) Functional interactions in internal
translation initiation directed by viral and cellular IRES"
8238-8246
abrogates infectivity and viral replication. J. Gen. Virol.
regions in cells where eIF4G was
Martínez-Salas, E. (2001) Los sitios de entrada interna
determinant of IRES spatial organization.
Moreover, IRES are unique tools to
construct policistronic biosafe expression
proteolyzed, thus, independent of the
PABP-eIF4G RNA circularization. We are
therefore interested in the identification
del ribosoma (IRES) y sus aplicaciones en vectores de
vectors. Because of their capacity to work
of factors responsible for such stimulation,
which may lead to the generation of a
Lafuente, E., Ramos, R., Martínez-Salas, E. (2002) Long-
functional bridge connecting the 5´ and
of the hepatitis C virus internal ribosome entry site
3´ ends of the mRNA (Figure 2). In
element. J. Gen. Virol. 83, 1113-1121
efficiently independently of the genetic
background, they are instrumental to
control gene expression in animal cells.
expresión. Virología 8, 1-11
range RNA-RNA interactions between distant regions
addition, we are interested in the study
During the last years we have
characterized the biological role of
initiation factors eIF4G, eIF4B and eIF3
in FMDV IRES activity. Whereas eIF4G-
of RNA-binding proteins likely contributing
to modulate IRES activity in different cells
as a function of their concentration or
Martínez-Salas, E., López de Quinto, S., Ramos, R.,
their posttranslational modification state.
84, 755-763
Fernández-Miragall, O. (2002) IRES elements: features
of the RNA structure contributing to their activity. Biochimie
binding is essential for FMDV IRES
López de Quinto, S, Sáiz, M; de la Morena, D, Sobrino,
F, Martínez-Salas, E. (2002) IRES-driven translation is
stimulated by the FMDV 3´NCR and poly(A) sequences.
Nuc. Acids Res. 30, 4398-4405
Gutiérrez, C., Martínez-Salas, E. (2002) DNA plant and
animal virus replication. Encyclopedia of Life Sciences
London, Nature Publishing Group pp. 556-564
Diferencias en la estructura secundaria
del RNA causadas por la substitución
del motivo GNRA por UNCG.
Secondary RNA structure changes
induced by UNCG substitution at the
GNRA motif.
123
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.12
Estructura cromatínica y transcripción
Enrique Palacián
Francisco Hernández
Graduate Student:
Lara Velasco
Santiago Arenas
Miguel Ángel Sánchez
Durante estos dos años hemos continuado
el estudio de las relaciones básicas entre
estructura y función en moldes
oligonucleosómicos definidos, empleando
como ensayo funcional la transcripción con
RNA polimerasa del bacteriófago T7. Se ha
completado la investigación de los tres
niveles en que la histona H5 podría afectar
a la síntesis de RNA : nucleosomas
a la fibra de 30 nm, producida al
incorporarse una molécula de histona H5
por cada unidad nucleosómica, no tiene
ningún efecto sobre la velocidad de
elongación de las cadenas de RNA. Sin
embargo, la unión de dos moléculas de
H5 por nucleosoma sí va acompañada por
inhibición de la elongación. Por último, la
asociación de oligonucleosomas que tiene
lugar en presencia de iones magnesio
produce agregados de alto peso molecular
individuales, fibra de 30 nm y agregados
de las cadenas oligonucleosómicas. Para
alcanzar este objetivo, se han determinado
que no permiten la síntesis de RNA.
paralelamente el grado de compactación,
plegamiento de la cromatina para formar la
fibra de 30 nm, estabilizado por la histona
H5, no ofrece ningún obstáculo al
la eficiencia transcripcional y la velocidad
de elongación de las cadenas de RNA. Los
resultados muestran que, a nivel de
nucleosomas individuales, la incorporación
de una molécula de H5 por cada elemento
nucleosómico no afecta la síntesis global
Nuestros resultados indican que el
funcionamiento de una maquinaria
biosintética sencilla como es la T7 RNA
polimerasa. Este comportamiento básico
contrasta con la explicación, generalmente
ni la elongación del RNA. En
oligonucleosomas con elementos
admitida, según la cual el efecto represor
de las histonas H1/H5 se produciría como
regularmente espaciados, la estabilización
consecuencia del plegamiento de la
cromatina al nivel de la fibra de 30 nm.
del nivel de compactación correspondiente
124
Chromatin structure and transcription
Research summary
In these two years we have continued the
study of the basic structure-function
relationships in well-defined
oligonucleosome templates using as a
molecule of histone H5 per nucleosome
element, does not affect the rate of
elongation of RNA chains. However,
binding of two molecules of H5 per
nucleosome causes significant inhibition
of elongation. In addition, the
functional probe transcription by RNA
polymerase from bacteriophage T7.
Research on the effects of histone H5 on
oligonucleosome self-association that
takes place in the presence of magnesium
RNA synthesis has been completed at
three different levels: individual
nucleosomes, 30-nm fiber, and
weight aggregates, is accompanied by
complete loss of RNA synthesis.
oligonucleosome aggregates. To
accomplish this goal, compaction level,
transcriptional efficiency, and rate of
elongation of RNA chains have been
Our results indicate that the stabilized
folding of chromatin by histone H5 to form
the 30-nm fiber is no obstacle whatsoever
ions, with formation of high-molecular-
determined in a parallel way. The results
show that, at the level of individual
to the function of a simple biosynthetic
machinery like T7 RNA polymerase. This
basic behavior is in contrast with the
nucleosomes, incorporation of one
generally admitted assumption according
molecule of histone H5 per nucleosome
has no effect on the overalll RNA synthesis
or chain elongation. In oligonucleosomes
to which the repressor role of histones
H1/H5 would be achieved by the induced
with regularly-spaced nucleosomes,
nm fiber.
chromatin folding to the level of the 30-
stabilization of the compaction level
corresponding to the 30-nm fiber, which
is produced by incorporation of one
125
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.13
Envolturas celulares
Miguel Angel de Pedro Montalban
Nuestro tema de estudio es la biología de
la envoltura celular bacteriana como
elemento morfogenético, de relación con el
Silvia Gutiérrez Erlandsson
Katysulla Costa
Miguel Angel Serrano Melgar
María Teresa Villalba Villacorta
estructurales radicales durante las primeras
etapas del proceso de colonización de
células eucarióticas, fenómeno base de la
medio y con otros organismos. Nuestro
trabajo se centra en dos aspectos
patogenia de dicho organismo. Estamos
estudiando la participación en dichos
procesos de enzimas relacionadas con el
principales:
metabolismo del sáculo. Recientemente
a) Morfogénesis de Escherichia coli ;
hemos obtenido información que indica que
las N-acetil-muramil-L-ala amilasas, de las
Continuamos nuestros estudios sobre la
generación y función de regiones
topológicamente diferenciadas en el sáculo
cuales existen al menos tres (amiA, amiB
y amiC), en S. typhimurium, afectan a la
capacidad de proliferación intracelular que
y en la membrana externa de la bacteria.
Durante este periodo hemos demostrado
es mayor en el caso de mutantes sencillos
y dobles. También hemos obtenido
información que indica que una infección
abortiva por mutantes autolíticos de S.
Graduate Students:
celular de S. typhimurium sufre cambios
la implicación de la penicillin binding protein
5 en la diferenciación de sitios de síntesis
activa y de regiones inertes. Estamos
estudiando las bases estructurales y
metabólicas de las heterogeneidades así
typhimurium induce una fuerte protección
en la célula huésped frente a una segunda
infección. En estos momento estamos
como su relevancia en la morfogénesis
bacteriana mediante métodos de marcaje
trabajando en caracterizar la influencia de
las proteínas morfogenéticas PBP1B, la
específico y microscopía de alta resolución.
principal actividad mureín sintasa, y BolA
b) Implicación de la pared celular en la
uno de los componentes de respuesta a
estrés que regula la expresión de las PBPs
colonización de células eucarióticas por
Salmonella typhimurium. La envoltura
5 y 6, en el proceso de colonización
intracelular en células cultivadas.
126
Cell envelopes
Research summary
investigating the influence of
macromolecular murein metabolism on
Castán, P., de Pedro, M.A., Risco, C., Valles, C.,
the ability of S. typhimurium to invade and
Multiple regulatory mechanisms act on the 5’ untranslated
replicate inside host eukaryotic cells.
Information indicating that the Nacetylmuramyl-L-alanine amidases (amiA,
Region of the S-layer gene from Thermus thermophilus
amiB, and amiC) modulate intracellular
replication of S. typhimurium has been
recently gathered. Single and double
de Pedro, M.A., Donachie, W.D., Höltje, J.-V., Schwarz,
a) Morphogenesis of Escherichia coli; we
continue our investigations on the
mutants do replicate to a higher extent
than wild type, indicating that amidase
morphogenetic proteins RodA and penicillin-Binding
generation and function of topologically
differentiated regions in the bacterial
sacculus and outer membrane. A direct
deficiencies interfere with cellular
Our research topic is the molecular biology
of the bacterial cell envelope as a
morphogenetic element, and as an
element mediating interaction with the
environment and other organisms. Our
work is focused on two main directions:
implication of PBP5 in the differentiation
of active synthesis and inert regions has
been demonstrated. At present we are
investigating the structural and metabolic
basis for the generation of heterogeneities
in the cell envelope s by means of specific
labeling and high resolution microscopy.
b) Involvement of the bacterial envelope
in eukaryotic cell colonization by
Salmonella typhimurium. The cell
envelope of the intracellular pathogen S.
Fernández, L.A., Schwarz, H., Berenguer, J. (2001)
HB8. J. Bacteriol. 183,149-1494
H. (2001) Constitutive septal murein synthesis in
Escherichia coli with impaired activity of the
protein 2. J. Bacteriol.183, 4115-4126
mechanisms restrictive for bacterial
proliferation. Evidence showing that an
abortive infection with S. typhimurium
Heidrich, C., Templin, M.F., Ursinus, A., Merdanovic,
autolytic mutants triggers a strong
amidases in cell separation and antibiotic induced
protective response in the host cells
against a second challenge with a fully
virulent strain has been obtained. The
autolysis of Escherichia coli. Mol. Microbiol. 41, 167-178
detailed molecular mechanisms
underlying this protective response are
Pedro,M.A., Gómez, P., Moreno, R., Morón, R.,
under investigation. At present we are
penicillin-resistant Streptococcus mitis: indication for a
also investigating the roles of the
morphogenetic proteins PBP 1B, the main
PBP-1-dependent way to reach high levels of penicillin
M., Berger, J., Schwarz, H., de Pedro, M.A., Höltje,
J.-V. (2001) Involvement of N-acetylmuramyl-L-alanine
Sánchez, M., Vicente, M.F., Cercenado, E., de
Berenguer, J. (2001) Diversity among clinical isolates of
resistance. Int. Microbiol. 4, 217-222
murein synthase activity, and BolA a
typhimurium is modified early in
member of the stress response system
controlling expression of PBPs 5 and 6,
eukaryotic cell colonization, a key process
for pathogenesis. We are currently
in S. typhimurium intracellular proliferation
and persistence in cultured cells.
Castán, P., Zafra, O., Moreno, R., de Pedro, M.A.,
Vallés, C., Cava, F., Schwarz, H., Berenguer, J. (2002)The
periplasmic space in Thermus thermophilus: Evidences
from a regulation-defective S-layer mutant overexpressing
an alkaline phosphatase. Extremophiles 6, 225-232
de Pedro, M.A., Höltje, J.-V., Schwarz, H. (2002) Fast
lysis of Escherichia coli filament cells requires
differentiation of potential division sites. Microbiology
148, 79- 86
Santos, J.M., Lobo, M., Matos,A.P.A., de Pedro, M.A.,
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dacC (PBP6) and ampC (AmpC), promoting normal
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Katysulla Costa. 2002. “The Peptidoglycan of Helicobacter
pylori”. Universidade do Porto, Portugal.
127
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.14
Bases Moleculares de las Enfermedades
Metabólicas
Magdalena Ugarte
El objetivo de nuestro trabajo es el
diagnóstico de enfermedades metabólicas
y la identificación y caracterización de los
enfermedades cardiovasculares y con el
riesgo de tener hijos afectados con
Síndrome de Down. Asimismo, se ha
iniciado el estudio del metabolismo
mitocondrial de cobalaminas mediante una
aproximación proteómica.
Mª José García Muñoz
genes implicados en algunas de ellas, así
como el análisis funcional y estructural de
Begoña Merinero
las diferentes proteínas mutantes.
En 3-metilcrotonilglicinuria, se han
En los dos últimos años, se ha ampliado el
caracterizado estructural y funcionalmente,
tanto a nivel genómico como de cDNA, los
Belén Pérez
Celia Pérez-Cerdá
Eva Mª Richard
Pilar Rodríguez-Pombo
Lourdes Ruiz Desviat
Pedro Ruiz Sala
número de técnicas diagnósticas para la
identificación de pacientes con defectos de
la ß-oxidación mitocondrial de ácidos
genes nucleares que codifican para las dos
subunidades de la proteína MCC, usando
grasos, enfermedades peroxisomales,
defectos congénitos de glicosilación,
de datos de EST y HTGS. Asimismo, se
han identificado mutaciones causantes de
enfermedad en ambos genes.
Sonia Clavero
defectos de la biosíntesis del colesterol y
defectos del metabolismo de purinas y
Mª Angeles Martínez
pirimidinas.
Graduate Students:
herramientas bioinformáticas y las bases
Para el análisis del efecto estructural y
Angel Luis Pey
funcional de las diferentes variantes alélicas
En los aspectos básicos, se han estudiado
las bases moleculares de la fenilcetonuria
causada por defectos en el gen de la
en las patologías en estudio, se han
desarrollado diferentes sistemas de
expresión, analizando el efecto de
fenilalanina hidroxilasa (PAH), así como las
mutaciones PKU, PCC y MCC sobre la
bases moleculares de la acidemia
propionica y la 3-metilcrotonilglicinuria
actividad, oligomerización y estabilidad de
la proteína en sus correspondientes
Rosa Navarrete
debidas a defectos en los genes nucleares
que codifican para las proteínas
compartimentos subcelulares. Los
resultados sugieren que, en general, la
Ascención Sánchez
heteroméricas mitocondriales propionil-CoA
mayoría de las mutaciones son estructurales
Paloma Sanz
y que su actividad puede ser modulada in
vivo por el sistema de control celular
Lorena Velazquez
carboxilasa (PCC) y metilcrotonil-CoA
carboxilasa (MCC), respectivamente.
Recientemente, se ha iniciado el análisis
Gema Palmeiro
de SNPs funcionales de genes del
terapias mas individualizadas.
Nuria Caballero
Margarita Castro
Mª Jesús Ecay
Isaac Ferrer
Silvia Pizarro
Fátima Leal
Científicos Visitantes / Visiting
metabolismo del folato y su relación con
Scientists:
Enna Gutierrez
Cezary Zekanowski
Estructura de la fenilalanina hidroxilasa humana, localización y conservación
de residuos implicados en mutaciones expresadas, causantes de fenilcetonuria.
El modelo ha sido generado mediante un cálculo de variabilidad tras el
alineamiento de proteínas ortólogas de diferentes organismos. El grado de
variabilidad se representa por un código de colores.
128
proteico, sentando las bases de nuevas
Molecular basis of metabolic diseases
Research summary
metabolism and cardiovascular disease
and with the risk of having a child with
The goal of our work is the diagnosis of
inborn errors of metabolism the
characterization and identification of the
Down syndrome. We have also started
a proteomic approach to study cobalamin
mitochondrial metabolism.
genes involved, as well as the functional
and structural analysis of the different
mutant proteins.
In 3-methylcrotonylglicinuria we
In the last two years, we have included
more diagnostic techniques aimed at the
characterized structurally and functionally,
at genomic and cDNA levels, the nuclear
genes encoding both MCC subunits, using
bioinformatic tools and the EST and HTGS
identification of patients with mitochondrial
ß-oxidation defects, peroxisomal diseases,
congenital glycosylation defects,
databases. We have also identified
disease-causing mutations in both genes.
cholesterol biosynthesis defects and
purine and pyrimidine metabolism
disorders ().
For the analysis of the structural and
functional effects of the different allelic
We have studied the molecular basis of
phenylketonuria caused by defects in the
variants of the disorders studied, we have
developed different expression systems,
analyzing the effect of PKU, PCC and
MCC mutations on activity, oligomerization
phenylalanine hydroxylase (PAH) gene
and of propionic acidemia and 3methylcrotonylglycinuria caused by
and stability of the protein in its cellular
defects in the propionyl-CoA carboxylase
structural properties of the enzyme, and
the activity can be modulated in vivo by
(PCC) and methylcrotonylCoA
carboxylase (MCC) genes, respectively.
compartment. The results reveal that the
majority of the mutations affect the
the quality control system, being the basis
Recently, we are analyzing the association
to apply new therapies tailored to each
between SNPs in genes involved in folate
patient.
Gallardo, M.E., Desviat, L.R., Rodriguez, J.M., EsparzaGordillo, J., Perez-Cerda, C., Perez, B., RodriguezPombo, P., Criado, O., Sanz, R., Morton, D.H., Gibson,
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130
Persons in charge of laboratories
131
Persons in charge of laboratories
Regulación del mantenimiento de la expresión de los
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Maintenance of homeotic gene expression in Drosophila
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Ana de Busturia,
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Estudio de la regeneración del sistema osteocondral a
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Bone and articular cartilage regeneration from human
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Predestinación García Ruiz,
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titania coatings for biocompatible applications. Biomaterials 23, 349-356
132
Unidad de Bioinformática
Bioinformatics Unit
Angel Ramírez Ortiz,
Fischer, D., Elofsson, A., Rychlewski, L., Pazos, F., Valencia, A., Rost, B., Ortiz, A.R.,
Dunbrack, R.L. Jr. (2001) CAFASP2: the second critical assessment of fully automated
structure prediction methods. Proteins Suppl 5, 171-183
Perez, C., Ortiz, A.R. (2001) Evaluation of docking functions for protein-ligand docking.
J. Med. Chem. 44, 3768-3785
Kmunicek, J., Luengo, S., Gago, F., Ortiz, A.R., Wade, R.C., Damborsky, J. (2001)
Comparative binding energy analysis of the substrate specificity of haloalkane
dehalogenase from Xanthobacter autotrophicus GJ10. Biochemistry 40, 8905-8917
Fabrega, C., Farrow, M.A., Mukhopadhyay, B., de Crecy-Lagard, V., Ortiz, A.R.,
Schimmel, P. (2001) An aminoacyl tRNA synthetase whose sequence fits into neither
of the two known classes. Nature 411, 110-114
Ortiz, A.R., Strauss, C.E., Olmea O. (2002) MAMMOTH (matching molecular models
obtained from theory): an automated method for model comparison. Protein Sci. 11,
2606-2621
De Las Rivas, J., Lozano, J.J., Ortiz, A.R. (2002) Comparative analysis of chloroplast
genomes: functional annotation, genome-based phylogeny, and deduced evolutionary
patterns. Genome Res. 4, 567-583
Regulación de la Miogénesis en Drosophila
Regulation of myogenesis in Drosophila
Mar Ruiz Gómez, [email protected]
San Martín, B., Ruiz-Gómez, M., Landgraf, M., Bate, M., (2001) A distinct set of
founders and fusion competent myoblasts make visceral muscles in the Drosophila
embryo. Development 128, 3331-3338
Ruiz-Gómez, M., Coutts, N., Suster, M.L., Landgraf M., Bate, M. (2002). Myoblasts
incompetent encodes a zinc finger transcription factor required to specify fusion
competent myoblasts in Drosophila. Development 129, 133-141
Dutta, D., Bloor, J.W., Ruiz-Gómez, M., VijayRaghavan K., Kiehart, D.P. (2002) Realtime imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS driven
expression of GPF fused to the actin binding domain of moesin. Genesis 34, 146-151
133
Seminarios
Seminars
Servicios
Apoyo a la investigación
Research and Support
Facilities
Lecciones Conmemorativas
Memorial Lectures
Seminarios Seminars
2001
2002
12 de Enero
11 de Enero
Dr. Eugenio Santos (Centro de
Investigación del Cáncer, Salamanca)
Juan Valcárcel (European Molecular
Biology Laboratory, Heidelberg)
“Activación de proteínas Ras por
intercambio de nucleótidos”
"Regulación del procesamiento alternativo
de ARN mensajeros"
25 de Enero
1 de Febrero
Dr. Francisco Sánchez - Madrid (Hospital
de la Princesa, Madrid)
Jorge Galán (Yale School of Medicine,
New Haven)
“Estudio dinámico de la polaridad celular
del linfocito durante la migración y las
interacciones inmunes”
"Mimetismo estructural y funcional durante
la patogénesis por Salmonella"
8 de Marzo
2 de Marzo
Dr. Jim Smith (National Institute for Medical
Research, Londres)
“Making mesoderm: upstream and
downstream of Brachyury”
José Ramón Naranjo (Centro Nacional
de Biotecnología, Madrid)
“Regulación transcripcional por DREAM:
vías, dianas y dominantes negativos”
22 de Marzo
Severo Ochoa
Avances en Biología
Molecular
16 de Marzo
Dr. Kim Nasmyth (Institute of Molecular
Pathology, Viena)
“Does a common mechanism trigger the
segregation of chromosomes during mitosis
and meiosis?”
Michael Rossmann (Department of
Biological Sciences, Purdue University,
West Lafayette, U.S.A.)
“Structure of Dengue Virus: Implications
for Flavivirus maturation and fusion”
5 de Abril
6 de Abril
Dr. Victor de Lorenzo (Centro Nacional
de Biotecnología, Madrid)
“Regulación transcripcional en
Pseudomonas: promotores en el tubo de
ensayo y en el medio ambiente”
Matthias Hentze (European Molecular
Biology Laboratory, Heidelberg)
“Principles of translational control, the
interface between ‘Genomics’ and
‘Proteomics’ ”
26 de Abril
20 de Abril
Dr. Richard Jackson (Department of
Biochemistry, University of Cambridge)
“Internal initiation of hepatitis C virus and
picornavirus RNA translation: contrasts with
capped mRNA translation”
John Diffley (ICRF Clare Hall Laboratories,
South Mimms, Inglaterra)
“DNA replication and cancer: lessons from
budding yeast”
10 de mayo
4 de Mayo
Michael Bate (Department of Zoology,
University of Cambridge)
Dr. Salvador Moncada (The Wolfson
Institute for Biomedical Research, Londres)
“Making sense of developing behaviour in
Drosophila”
“NO and the physiology and
pathophysiology of cell respiration”
24 de Mayo
25 de Mayo
Reinhard Jahn (Max Planck Institut fuer
Biophysikalische Chemie, Goettingen)
Dr. Tony Kouzarides (Wellcome/CRC
Institute and Department of Pathology,
Cambridge)
“Molecular mechanisms of membrane
fusion in the secretory pathway”
“Histone methylation in transcriptional
control”
24 de Octubre
21 de Junio
Dr. Alain Fischer (Hôpital Necker Enfants
malades, Paris)
“Severe combined immunodefiencies,
models for the studies of T lymphocyte
development and gene therapy”
27 de Noviembre
Dr. Hans Clevers (University Medical
Center, Utrecht)
“Wnt signaling establishes boundaries in
the gut”
136
Raúl Andino (University of California, San
Francisco, USA)
“The interactions of poliovirus with the host
cell during replication”
22 de Noviembre
Lisardo Boscá (Instituto de Bioquímica,
CSIC-Universidad Complutense, Madrid)
“Resolución de los procesos inflamatorios”
2001
Affolter, Markus (Zellbiologie,
Biozentrum der Universitat Basel, Suiza)
“Novel tools to study cell migration in
development”
Antón, Luis (Instituto de Salud Carlos
III, Madrid)
“Estructuras celulares implicadas en la
degradación de proteínas por el
proteasoma”
Bárcena Alicia (Department of Surgery,
University of California, San Francisco,
USA)
“Distribución de precursores de células NK
en hígado fetal humano”
Bustelo, Xosé R. (Centro de
Investigación del Cáncer, Salamanca)
“Mecanismos de activación y señalización
de las oncoproteínas VAV”
Castelli-Gair, James (Departamento de
Zoología, Universidad de Cambridge,
Reino Unido)
CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
"SEVERO OCHOA"
“Control de la morfogénesis de Drosophila
por genes ‘Downstream’ de abdominal-B”
Colaço, Camilo (Immunolobiology Dpt.,
Babraham Bioincubator, Cambridge. U.K.)
“CDs, HSPS and the integration of innate
and acquired immunity”
Desvoyes, Bénédicte (University of
Bordeaux 1, Francia and Texas A&M
University, College Station, USA)
“Translation regulation and movement of
Tombusviridae”
Diez del Corral, Ruth (Universidad de
Dundee, Escocia, RU)
“Regulación del inicio de la diferenciación
neural en la médula espinal por el
mesodermo paraxial y FGPs”
Elliot, David (The Victor Chang Cardiac
Research Institute, Darlinghurst,
Australia)
“Analysis of cardiac NK-2 proteins from
mice, men and octopuses”
Fain, Jhon N. (Department of
Biochemistry, Un of Tennesse, Memphis,
USA)
“Hormonal regulation of leptin release by
human adipose tissue”
Fasiolo, Franco (IBMC Estrasburgo,
Francia)
“A novel yeast EF-2 like GTPase is required
for ribosome export and a late cytoplasmic
step of ribosomal assembly”
137
Franze-Fernández, Mª Teresa (Centro de
Virología Animal, CONICET, Buenos
Aires, Argentina)
“Un sistema reconstituido de transcripción
y replicación basado en RNAs y proteínas
de virus tacaribe expresados por plásmidos”
Gómez, Jordi (Hospital Valle de Hebrón,
Barcelona)
“Corte específico del genoma del virus de
la hepatitis C por la ribonucleasa P humana”
González Reyes, Acaimo (Instituto de
Parasitología y Biomedicina López
Neyra, Granada)
“Diferenciación celular durante la oogénesis
de ‘Drosophila’”
Guzmán, Manuel (Departamento de
Bioquímica y Biología Molecular I,
Facultad de Biología, Universidad
complutense, Madrid)
“Cannabinoides como posibles agentes
antitumorales”
Knust, Elisabeth (Heinrich-Heine
Universitaet Duesseldorf, Institut fuer
Genetik, Germany)
“Protein scaffold and cell polarity in
drosophila”
Lever, Andrew M.L. (Addenbrooke’s
Hospital, University of Cambridge,
Departement of Medicine, Cambridge,
UK)
“Understanding how retroviruses package
their RNA genomes: Implications for
lentiviral (HIV) based vectors”
Paro, Renato (ZMBH, Universidad de
Heidelberg, Alemania)
“Chromosomal elements conferring
epigenetic inheritance”
Puertollano, Rosa (Cell Biology and
Metabolism Branch, National Institutes
of Health, Bethesda, USA)
“GGAs: una nueva familia de adaptadores
de clatrina implicada en el transporte de
los receptores de manosa-6-fosfato”
Rheinberger, Hans-Jörg (Director del
Instituto Max Planck de Historia de la
Ciencia, Berlin, Alemania)
“Gene concepts: perspectives from the
history of molecular biology”
Roch, Fernando (Centre de Biologie du
Developpement, Universite Paul
Sabatier, Toulouse, Francia)
“La señal de EGFR llega al núcleo: función
del represor CIC en el ala de Drosophila”
Seminarios Seminars
"SEVERO OCHOA"
Sevilla, Noemí (Dept. of
Neuropharmacology, Division of
Virology, The Scripps Research
Institute, La Jolla, California, USA)
Conway, Everly (Department of
Biomedical Sciences, School of
Public Health, University at Albany,
NY, USA)
“Mecanismos virales de
inmunosupresión y persistencia
mediante la infección de células
dendríticas”
"Transcription of stress genes in archaea:
prokaryotes with eukaryotic factors"
Simpson, Pat (Department of Zoology,
University of Cambridge, England)
"Visualizing T cell recognition"
“Gene duplication and the development
and evolution of bristle patterns in
diptera”
Viguera, Enrique (Centro de
Astrobiología (INTA), Torrejón, Madrid)
“Análisis del error de replicación por
deslizamiento de hebra”
Villarreal, Luis (Director, Center for
Virus Research, University of
California, Irvine, USA)
“The role of polyomavirus oncogenes in
differentiating tissue: evaluation in scid
mice”
Davis, Mark (Stanford University,
California, USA)
Finley, Daniel (Department of Cell
Biology, Harvard Medical School,
Boston, USA)
"The proteasome and its associated
proteins"
Franco, Rafael (Departamento de
Bioquímica y Biología Molecular,
Universidad de Barcelona, Barcelona)
"Interacciones proteína-proteína y
regulación de receptores acoplados a
proteínas G"
Galbiati, Laura (International Center
for Genetic, Engineering and
Biotechnology, Triestre, Italy)
"p300/CBP promotes acetylation and
ubiquitination of transcription factor
E2F-1"
García-García, María Jesús (Memorial
Sloan-Kettering Cancer Center, New
York, USA)
2002
2002
Borlongan, César V. (Department of
Neurology and Institute of Molecular
Medicine and Genetics, School of
Medicine, Medical College of Georgia,
Augusta, USA)
"Immunosuppression and neural
transplantation for Parkinson's disease"
Canelles, Matilde (Laboratory of
Molecular and Cellular Immunology,
National Institute of Immunology and
Infectious Diseases, National
Institutes of Health, Bethesda, USA)
"Señalización por TCR durante la
decisión CD4/CD8 en el timo"
Casal, José (Laboratory of Molecular
Biology, Cambridge, UK)
"Polaridad planar en Drosophila: una
aproximación"
Cohen, Philip (University of Dundee,
MRC Protein Phosphorylation Unit,
School of Live Sciencies, Scotland,
U.K.)
"How to cure diabetes without causing
cancer?: a signal transduction approach"
Coll, Miquel (Instituto de Biología
Molecular, CSIC, Barcelona)
"Procesamiento y transporte del ADN
en la conjugación bacteriana"
138
"Estudio de la gastrulación mediante
mutagénesis con ENU: caracterización
de la mutación Lazy Mesoderm, un
nuevo componente de la vía FGF"
Goldberg, Alfred L. (Professor of Cell
Biology, Harvard Medical School,
USA)
"The role of the proteasome in protein
degradation and antigen presentation"
Gotte, Matthias (McGill University
AIDs Centre Montreal, Canada)
"The translocation equilibrium of HIV-1
reverse transcripatse and implications
for enzymatic functions"
Gubb, David (Department of Genetics,
University of Cambridge)
"Drosophila Necrotic mutations activate
the innate immune response to fungal
infections and mirror human variants
associated with serpin polymer
diseases"
Ingham, Philip (MRC Intercellular
Signalling Group, Centre for
Developmental Genetics, School of
Medicine and Biomedical Sciencie,
University of Sheffield, U.K.)
"Mechanisms and roles of hedgehog
signalling in vertebrate development"
Inzé, Dirk (Department of Plant
Genetics, VIB, University of Ghent,
Belgium)
"How do plants coordinate cell division
and development"
Jiménez, Gerardo (Centro de
Investigación y Desarrollo, CSIC,
Barcelona)
Regan, John W. (Prof. of
Pharmacology and Toxicology,
University of Arizona, EEUU)
"Control materno del desarrollo de
Drosophila mediante señales
extracelulares y represión génica"
"Prostaglandin receptor signaling: novel
interactions of G protein-coupled
receptors with elements of the Wnt/betacatenin signaling pathway"
Kappes, Dietmar (Fox Chase Cancer
Center, Philadelphia, USA)
"Control of T cell development by
CD3delta and HD genes"
Reiner, Orly (Weizmann Institute,
Rehovot, Israel)
"Interaction of LIS-1 with microtubules"
Kavelaars, Annemieke (Wilhelmina
Children Hospital, Utrecht, Holanda)
Tercero, José Antonio (Imperial
Cancer Research Fund, UK)
"G protein coupled receptor kinases in
the inmune system: a role in
autoimmunity?"
"Regulación de la replicación
cromosómica en respuesta al daño en
el DNA"
Kokaia, Zaal (Section of Restorative
Neurology, Wallenberg Neuroscience
Center, Lund. Sweden)
Thome, Margot (Universidad de
Lausanne, Suiza)
"Neural stem cells and brain insults"
Lawrence, Peter FRS (MRC
Laboratory of Molecular Biology,
Cambridge, Inglaterra)
"Polarity and compartments in
Drosophila development"
Macario, Alberto (Wadsworth Center,
Department of Biomedical Sciences,
The University at Albany, NY, USA)
"Molecular biology of stress genes in
archaea: lessons from experimental data
and genome analysis"
Martín-Bermudo, Dolores (Instituto
de Parasitología y Biomedicina
"López Neyra", CSIC,
Granada)"Integrinas: moléculas clave
en morfogénesis"
Martínez Menárguez, José Angel
(Departamento de Biología Celular,
Histología y Embriología General,
Facultad de Medicina, Universidad de
Murcia)
"Tráfico de membranas en la vía
secretora temprana"
Medina, Miguel (Instituto Cavalieri
Ottolenghi Scientific, Universidad de
Turin, Italia)
"Análisis funcional de la interacción entre
presenilinas y cateninas"
Muñoz, Emilio (Instituto de Estudios
Sociales Avanzados, CSIC, Madrid)
"Nuevas estrategias para la formación
en Biotecnología"
Pedersen, Irene M. (The Burnham
Institute, La Jolla, USA)
"Induction of apoptosis in CLL (Chronic
Lymphocytic Leukemia) B-cells"
Prehn, Jochen H. M. (Westphalian
Wilhelms University, Faculty of
Medicine, Ctr Interdisciplinary Clinical
Res (IKF), Muenster, Germany)
"Mitochondrial function/dysfunction
during apoptosis"
139
"CARMA 1, a lipid-associated protein
involved in T-cell activation"
Van Den Heuvel, Marcel (MRC
Functional Genetics Unit, Department
of Human Anatomy and Genetics,
University of Oxford, U.K.)
"Hedgehog signalling and HDL receptor
proteins: a possible link"
Villarreal, Luis P. (Department of
Molecular Biology and Biochemistry,
Center for Virus Research 3232,
Biological Science 2, University of
California, Irvine, USA)
"Study of human papillomavirus in
human cervical tissues transplanted into
scid mice"
von Kobe, Cayetano (Laboratory of
Molecular Gerontology, National
Institutes on Aging, NIH, Baltimore,
USA)
"La proteína del síndrome de
envejecimiento prematuro deWerner:
localización, proteínas de interacción y
papel en respuesta a estrés oxidativo"
Yewdell, Jonathan W. (Laboratory of
Viral Diseases, NIAID, HIH, Bethesda,
MD, USA)
"Generation of MHC-Peptide complexes
in vitro and in vivo"
Servicios Técnicos
de Apoyo a la Investigación
Los servicios del CBMSO disponen de los siguientes equipamientos y técnicas
como apoyo directo a los grupos de investigación.
Animalario
Microscopía Electrónica
Producción y mantenimiento de rata
y ratón.
Preparación convencional de
muestras para microscopía
electrónica de transmisión: fijación
química e inclusión en Epon.
Producción y mantenimiento de
estirpes transgénicas y
genéticamente modificadas de ratón.
Manipulación animal con equipo de
anestesia y campanas de gases.
Laboratorio para infección
experimental con patógenos nivel
P-2.
Celdas para trabajo con diversas
especies animales.
Laboratorio de criopreservación de
embriones y semen.
Criofijación en propano o etano
líquidos.
Criosustitución e inclusión a baja
temperatura en Lowicryl (K4M,
HM20).
Ultramicrotomía convencional.
Crioultramicrotomía.
Inmunomarcado post-inclusión con
oro coloidal.
Hibridación “in situ” a nivel
ultraestructural.
Fermentación
Tinción negativa.
Equipo para cultivo y recolección de
microorganismos aerobiosanaerobios (fermentadores Chemup
de 20 1 y Braun de 30 1).
Microscopía de ácidos nucléicos.
Equipo para cultivo y recolección de
microorganismos extremófilos (Airlift
de 100 1 y un reactor agitado STR).
Criosecado y criofractura.
Microscopía óptica y confocal
Microscopía de Luz Transmitida.
Equipo para fraccionamiento celular
de microorganismos.
Microscopía de fluorescencia.
Microscopía confocal y espectral.
Microscopía de células vivas.
Química de Proteínas
FRET (Fluorescence Resonance
Energy Transfer).
Síntesis de péptidos.
Control de calidad de péptidos
sintéticos madiante HPLC y
espectrometría de masas.
Secuenciación de Edman de
péptidos y proteínas.
FRAP (Fluorescence Recovery After
Photobleaching).
Procesamiento y deconvolución de
imágenes.
Construcciones de proteínas
fluorescentes.
Digestión de proteínas y aislamiento
de péptidos mediante HPLC.
Análisis de péptidos y proteínas
mediante espectrometría de masas
tipo MALDI-TOF.
Análisis y secuenciación de péptidos
mediante espectrometría de masas
tipo nanospray-trampa iónica.
140
Secuenciación de DNA
Equipo para secuenciación (Applied
Biosystems), PCR y análisis de
secuencia.
Research and Support
Facilities
The following facilities and techniques are regularly provided by the Central Services
of the CBMSO in direct support of research teams.
Animal Facility
Electron Microscopy
Breeding and maintenance of rat
and mouse.
Conventional processing of samples
for “check spelling” of transmission
electron microscopy.
Breeding and maintenance of
transgenic and genetically modified
mice.
Plunge cryofixation in liquid propane
or ethane.
Animal surgery and manipulation
under anesthesia.
Freeze-substitution and
cryoembedding in Lowicryls.
Laboratory for experimental infection
with P-2 level pathogens.
Conventional ultramicrotomy.
Cryoultramicrotomy.
Embryo and sperm criopreservation
facility.
Postembedding immunogold
electron microscopy.
Ultrastructural “in situ” hybridization.
Fermentation
Negative staining.
Facilities for medium-scale growth
and harvesting of aerobic
microorganisms (Fermentors 20 1
Chemup and 30 1 Braun).
Electron microscopy of nucleic acids.
Freeze-drying and freeze fracture.
Facilities for large scale growth and
and harvesting of extremophiles (100
1 Airlift
Optical and Confocal Microscopy
and a STR stirred reactor)
Transmitted light microscopy.
Cellular fractionation of
microorganisms.
Fluorescence microscopy.
Confocal and spectral microscopy.
Microscopy with living cells.
Protein Chemistry
Peptide synthesis.
FRET (Fluorescence Resonance
energy Transfer).
Quality control of synthetic peptides
by HPLC and mass spectrometry.
FRAP (Fluorescence Recovery After
Photobleaching).
Peptide and protein Edman
sequencing.
Image processing and
deconvolution.
Protein digestion and HPLC peptide
purification.
Construction of fluorescent proteins
plasmids.
Peptide and protein analysis by
MALDI-TOF mass spectrometry.
DNA sequencing
Peptide and protein analysis and
sequencing by nano-spray ion trap
mass spectrometry.
141
Equipment for DNA sequencing
(Applied Biosystems) and PCR
analysis.
Lecciones
Conmemorativas
Memorial Lectures
2001-2002
"SEVERO OCHOA"
VIII Lección Conmemorativa Severo Ochoa
Dr. Bruce Stillman
(Director of Cold Spring Harbor Laboratory)
“Duplication of the genome: Cell cycle and control of genome
duplication”
30 de Noviembre de 2001
IX Lección Conmemorativa Severo Ochoa
Dr. Nahum Sonenberg
(Department of Biochemistry, McGill University, Montreal, Canada)
“Signaling to translation initiation factors: effects on cell growth
and proliferation”
8 de Noviembre de 2002
II Lección Conmemorativa Eladio Viñuela
Prof. Charles Weissmann
(Imperial College School of Medicine, London)
“Prions, mad cows and transgenic mice”
15 de Febrero de 2001
III Lección Conmemorativa Eladio Viñuela
Sir Aaron Klug
(MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK))
“The use of zinc finger peptides for the regulation of gene expression”
25 de Febrero de 2002
142

Memoria Científica - Severo Ochoa

Transcripción

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An Adventure into Cells and Their Parts

ENFERMEDADES GENETICAS