u - Inmetro

Measurement Uncertainty in Microbiology,
still a secret ..... ??? (Part 1)
Proyecto: Metrologia Química
1
Normas
Legales
Referencias
bibliográficas
aceptadas
Resultado de
ensayos de aptitud
Gráficos de control y
datos de validación
Cuantificación de
acuerdo a la
Niemela et al., Finland
Experiencia
de expertos
2
Incertidumbre
Incertidumbre de
de las
las mediciones
mediciones en
en Microbiología
Microbiología
EA
EAGuide
Guide04
04/10
/10
Acreditación
Acreditaciónde
delaboratorios
laboratoriosmicrobiológicos
microbiológicos
Información
Informaciónvaliosa
valiosa
adicional
adicional
ISO
ISO7218
7218
Microbiología
Microbiologíade
dealimentos
alimentosyyalimentos
alimentospara
paraanimales
animales-Reglas
Reglasgenerales
generalespara
paraexámenes
exámenesmicrobiológicos
microbiológicos
3
4
Incertidumbre
Incertidumbre de
de las
las mediciones
mediciones en
en Microbiología
Microbiología
EA
EAGuide
Guide4/10
4/10
5.2 Incertidumbre de las mediciones
Los ensayos microbiológicos generalmente están en la
categoría que no requieren cálculos rigurosos,
metrológicamente y estadísticamente válidos de la
Incertidumbre de las mediciones. Generalmente es mas
apropiado estmar la Incertidumbre basándose solamente
en los datos de repetibilidad y reproducibilidad, pero en
forma ideal, incluyendo los sesgos (p.e. de resultados de
ensayos de aptitud). Las componentes individuales de la
Incertidumbre deben identificarse y debe demostrarse que
están bajo control y evaluada su contribución a la
variabilidad …..
5
and
and in
in addition
addition ISO/PDTS
ISO/PDTS 19036
19036 …..
…..
Draft
DraftTechnical
TechnicalSpecification/
Specification/
Technical
TechnicalReport
Report
No.
No.19036,
19036,released
released11th
11thMay
May2005
2005
Microbiology
Microbiologyof
offood
foodand
andanimal
animalfeeding
feedingstuffs
stuffs-Guide
Guideon
onestimation
estimationof
ofmeasurement
measurementuncertainty
uncertainty
for
forquantitative
quantitativedeterminations
determinations
6
Philosophy
Philosophy of
of ISO/PDTS
ISO/PDTS 19036
19036
Global
Globalapproach
approachfor
forthe
theestimation
estimationof
ofmeasurement
measurementuncertainty
uncertainty
5.1
5.1 Combined
Combined
standard
standarduncertainty
uncertainty
5.2
5.2 SD
SDof
ofreproducibility
reproducibility
5.3
5.3 Expanded
Expanded
uncertainty
uncertainty
5.4
5.4 General
Generalrules
rulesfor
forthe
theestimation
estimation
of
ofSD
SDof
ofreproducibility
reproducibility
66 Intra-laboratory
Intra-laboratorySD
SD
of
ofreproducibility
reproducibility
77 Reproducibility
ReproducibilitySD
SDof
ofmethod
method
derived
derivedfrom
froman
anILC
ILCstudy
study
Expression of measurement uncertainty in test reports
7
Oncewoke
wokeup,
up,
Once
nowalso
also
now
mikrobiologists
mikrobiologists
haveideas
ideas...
...
have
about
about
measurement
measurement
uncertainties
uncertainties
…
…
8
MU
- and
MU –– Normal
Normaland Poisson
Poisson distribution
distribution
In
Inchemical
chemicaltestings
testingsquite
quiteoften
oftenthe
the
normal
normaldistribution
distribution isisused
usedto
toquantify
quantify
measurement
measurementuncertainties
uncertainties…
…
Normalverteilung
Pay
Payattention:
attention:
Microorganisms
Microorganisms
hate
hatestatistics
statistics…
…
9
In
In big
big groups
groups we
we are
are more
moreor
orless
lessnomally
nomallydistributed
distributed ....
35 - 5.9
25 - 5.4
5 - 4.9
x
4.4
5 - 3.9
25 - 3.4
35 - 2.9
10
But as singles we are behaving as ....
Poissoins.
11
12
Nobody can
escape the
mathematicans
So let us try to
calculate
measurement
uncertainties
…...
13
Incertidumbre de las mediciones in Microbiología
Cálculo de
cfu‘s,
Distribución
de Poisson
Coeficiente de
confirmación
Lecturas
(personal)
Muestreo
Uniformidad de la distribución
de los microbios
Fuentes de
incertidumbre en
Microbiología
Condiciones
de incubación
Efectos
de la muestra
Pesas usadas
+ volumenes
+ diluciones
Mezclado
adecuado
Desempeño del
medio
Tiempo hasta
la inoculación
Equipos, e.g.
spiral plater, exactitud
14
Cálculo de la Incertidumbre de las mediciones en Microbiology
La incertidumbre estándar
puede ser calculada también en Microbiología
ucombinada =
u12 + u22 + ... + un2
ucombinada =
sw2 + sv2 + ... + sn2
15
The
Thecommon
commonbasic
basicequation
equationfor
forcomputing
computingthe
the
test
testresult
resultin
inall
allquantitative
quantitativecultural
culturalmethod
methodis:
is:
z
c = F x
v
cc ==estimated
estimatedcfu
cfuconcentration
concentrationof
ofthe
thesample
sample
4
-4
FF ==dilution
dilutionfactor,
factor,e.g.
e.g.10
104,,the
thereciprocal
reciprocalof
ofdilution
dilution10
10-4
zz ==colony
colony count
countin
inthe
thefinal
finalsuspension
suspension
(when
(whendilution
dilutionisisunnecessary
unnecessary FF==1)
1)
vv ==volume
volumeof
ofthe
thefinal
finalsuspension
suspensionused
usedfor
forquantifying
quantifying
16
One-plate
One-plate instrument
instrument
The
Theestimate
estimateof
ofmicrobiological
microbiologicalconcentration
concentrationis:
is:
z
c=
v
zz
vv
==colony
colony number
number
==test
testportion
portionvolume
volumeof
ofthe
thefinal
finalsuspension
suspensionused
used
for
forquantifying
quantifying
17
One-plate
One-plate instrument
instrument
SAMPLE
= dilution flask or tube
= final suspension
= petri plate
= the result is only read
in one plate
= transfer of liquid
18
One-plate
One-plate instrument
instrument -- Report
Report sheet
sheet (part
(part I)I)
Sample:
Date:
Basics:
Relative uncertainty of the test result:
uy = up2 + uK2 H + uK2 S + uK2 A + uK2 M + uK2 L + uF2 + u2t + u2z + u2v
pp ==confirmation
confirmationcoefficient
coefficient
KKH ==personal
personalyield
yieldcoefficient
coefficient
H
KKS ==sample
samplestability
stabilitycoefficient
coefficient
S
KKA ==yield
yieldof
ofmedium
mediumcoefficient
coefficient
A
KKM ==material
material//environment
environmentcoefficient
coefficient
M
KKL ==overlap
overlapcorrection
correctionfactor
factor
L
FF ==dilution
dilutionfactor
factor
tt ==reading
reading
zz ==colony
colonynumber
number
vv ==test
testportion
portionvolume
volume
19
One-plate
One-plate instrument
instrument -- Report
Report sheet
sheet (part
(part II)
II)
Dilution factor F of final suspension:
Test portion volume:
Number of colonies:
Systematic correction coefficients applied:
Coefficient
u
u2
confirmation p
personal yield KH
sample stability KS
medium yield KA
overlap KL
dilution factor F
(When a coefficient is unknown or unused its value is taken as 1 and the uncertainty as 0.)
20
One-plate
One-plate instrument
instrument -- Report
Report sheet
sheet (part
(part III)
III)
z
Test result: y = p × K H × K S × K A × K L × K M × F ×
v
Untertainty components of the „particle detection instrument“:
u
u2
reading t
primary count z
test portion v
Final report:
Microbiological content of the sample y:
Relative uncertainty, 100wy:
%
21
Confirmation
Confirmation rate
rate (true
(true positive
positive rate)
rate) pp
IfIfthe
thecount
counthas
hasto
tobe
beconfirmed
confirmedby
bydifferent
differentmedia
mediaor
or
biochemical
biochemicalreactions,
reactions,ititis
isthe
thebest
bestto
toconfirm
confirm every
every
colony
colonybecause
becauseof
ofthe
theconfirmation
confirmationof
ofthe
thetotal
totalcount
countz.
z.
Usually
Usuallyonly
onlypartial
partialconfirmation
confirmationis
ispracticed.
practiced.
AAconfirmation
confirmationcoefficient
coefficientdetermined
determinedfrom
from
aasmall
smallsample
sampleof
ofpresumptive
presumptivepositive
positivecolonies
colonies
is
isoccasionally
occasionallythe
theonly
onlyavailable
availablemeans
meansof
of
converting
convertingpresumptive
presumptivecounts
countsto
toconfirmed
confirmedcounts.
counts.
uy = u
2
p
22
Personal
Personal yield
yield coefficient
coefficient K
KHH
Every
Everyperson
personreading
readingcolony
colonynumbers
numbershas
hasaa „personal
„personal style“
style“
of
ofenumeration.
enumeration.This
Thisoften
oftenleads
leadsinto
intodetectable
detectablesystematic
systematic
differences
persons
differencesbetween
between the
theresults
resultsof
ofdifferent
differentpersons.
persons.
To
Tobe
beproved
provedby
bypresenting
presentingthe
thesample
sample
plates
platesto
to22or
ormore
morepersons
personsfor
forreading.
reading.
The
Themost
mostsignificant
significantproblem
problemin
inthis
thisconnection
connectionis
isthat
thatthe
the
true
trueresult
resultis
isnot
notknown.
known.There
Thereare
areno
noabsolute
absolutereference
reference
points
pointsand
andan
anarbitrary
arbitraryone
onemust
mustbe
bechosen.
chosen.
∑ zE
KH =
∑ zX
uKH
uy =
sd
=
n
u +u
2
p
EE==Expert
Expert
2
KH
23
Common
Common reading
reading uncertainty
uncertainty of
of aa lab
lab
K
KHH == 11
ififaalaboratory
laboratorymight
mightnot
notwish
wishto
topay
pay
attention
attentionto
tothe
thepossibility
possibilityof
ofdifferent
different
counting
countingstyles
stylesof
ofindividuals
individuals
The
Theuncertainty
uncertaintyof
ofthe
thegeneral
generalcounting
countingpractice
practice
of
ofaalaboratory
laboratoryas
aswhole
wholecan
canbe
beestimated
estimated
with
withexperiments
experimentswhere
whereall
alltechnicians
techniciansread
readthe
the
numbers
numbersof
ofcolonies
coloniesof
ofthe
thesame
sameplates.
plates.
24
Stability
Stability coefficient
coefficient K
KSS
Stability
Stabilityof
ofthe
thesample
sampleduring
duringstorage
storage
Stability
Stabilitycoefficient
coefficientKKSS
and
andits
itsuncertainty
uncertainty
very
very
difficult
:
difficult:
Expert
Expertknowledge
knowledge
rectangular
rectangularor
ortriangular
triangulardistribution
distribution
IfIfdeath
deathand
andenumeration
enumerationare
areconsidered
consideredto
tobe
be
equally
equallypossible
possiblethe
thecoefficient
coefficientgets
getsthe
thevalue
value
K
KSS == 1.0
1.0..
IfIfonly
onlyone
onedirection
directionof
ofchange
changeis
isconsidered
considered
possible,
possible,the
thecoefficient
coefficientwill
willdiffer
differ from
from1.0.
1.0.
uy = u + u
2
p
2
KH
+u
2
KS
25
Yield
Yield coefficient
coefficient of
of the
the nutrient
nutrient medium
medium K
KAA
Every
Everybatch
batchof
ofnutrient
nutrientmedia
mediashould
shouldbe
betested
tested
for
forrecovery
recoveryas
aspart
partof
ofthe
thequality
qualityassurance
assurancesystem.
system.
reference
referencesamples
samples
The
Thesamples
samplesare
areof
ofnecessity
necessityartificial
artificial(spiking)
(spiking)
and
andthere
thereis
isno
noperfect
perfecttraceability
traceabilityto
toaatrue
truevalue.
value.
uK A
xR
=
xA
gives the correction factor
Relative
Relativeuncertainty
uncertainty(variance)
(variance)of
ofthe
thecorrection
correctionfactor:
factor:
uK A = u
2
xR
1
+
ZA
ZA = total number of colonies on
which the test result xA is based
uy = u + u
2
p
2
KH
+u
2
KS
+u
2
KA
26
Material
Material // environment
environment coefficient
coefficient K
KMM
ItItis
isentirely
entirelypossible
possiblethat
thatsolids
solidsof
ofaasample
sampleare
aredirectly
directly
or
orindirectly
indirectlythe
thecause
causeof
oflowered
loweredrecovery
recoveryof
ofthe
thetarget
target
organisms
organismsfrom
fromthe
thetest
testportion.
portion.
The
Thereasons
reasonsmight
mightbe
beanything
anythingfrom
fromadsorption
adsorptionto
to
particles
particlesto
todeath
deathbecause
becauseof
ofdestruction
destructionof
ofcells
cells
during
duringmaceration
macerationof
ofthe
thesample.
sample.
loss
lossof
ofviable
viablecells
cells
Spiking of cells of pure cultures
and testing recoveries seems to
be the only approach.
uy = u + u
2
p
2
KH
+u
2
KS
+u
2
KA
+u
2
KM
27
Overlap
Overlap correction
correction factor
factor K
KLL
The
Thenumber
numberof
ofcolonies
coloniesobserved
observedon
onaaplate
plateis,
is,at
atthe
the
most,
most,equal
equalto
tothe
thenumber
numberof
ofso-called
so-calledcolony
colonyforming
forming
units
units(cfu,
(cfu,cfp),
cfp),present
presentin
inthe
thetest
testportion.
portion.
Sometimes
Sometimescolonies
colonies„disappear“
„disappear“by
bymerging
merging
indistinguishly
indistinguishlywith
withother
other similar
similar colonies.
colonies.
Special
Specialproblem
problemin
inmembrane
membrane
filtration
filtrationtechnology!!!
technology!!!
28
Overlap
Overlap correction
correction factor
factor K
KLL
Usually
Usuallyexpected
expectedvalues
valuesof
ofthe
theoverlapping
overlappingby
bymeans
meansof
ofthe
the
correcting
correctingfactor
factor KKLLis
isaafunction
functionof
ofthe
thecoverage
coverage
(proportion
(proportionof
ofgrowth
growtharea
areacovered
coveredby
bytarget
targetcolonies):
colonies):
Coverage %
KL
5
10
15
20
25
30
35
40
1.02
1.04
1.06
1.08
1.11
1.14
1.18
1.24
At
At30
30%
%and
andhigher
highercoverage
coverage
usually
most technicians
“ are
usually„„most
technicians“
are
unhappy
unhappyabout
abouttheir
theirjob!!!
job!!!
Little
Littledata
dataavailable!!!
available!!!
uy = u + u
2
p
2
KH
+u
2
KS
+u
2
KA
+u
2
KM
+u
2
KL
29
Dilution
Dilution factor
factor FF
FF
==nominal
nominalor
oractual
actualdilution
dilutionfactor,
factor,
44, the reciprocal of dilution 10-4
e.g.
10
e.g. 10 , the reciprocal of dilution 10-4
w
wFF ==relative
relativestandard
standarduncertainty
uncertaintyof
ofthe
thenominal
nominal
or
oractual
actualdilution
dilutionfactor
factor
uy =
u K2 H + u K2 S + u K2 A + u K2 M + u K2 L + u F2
30
Confirmed
Confirmed counts
counts
The
Theconfirmed
confirmedtest
testresult
resultis
iscalculated
calculatedfrom
from
X
y =F
V
uX =
uy =
1 1 1
+ −
Z K N
XX ==sum
sumof
ofconfirmed
confirmedcounts
counts
ZZ ==total
totalpresumptive
presumptivecount
count
KK ==total
totalnumber
numberof
ofcolonies
coloniesconfirmed
confirmed
NN ==total
totalnumber
numberof
ofcolonies
coloniestested
tested
u K2 H + u K2 S + u K2 A + u K2 M + u K2 L + u F2 + u 2X
31
Confirmed
Confirmed counts
counts
The
Theconfirmed
confirmedtest
testresult
resultis
iscalculated
calculatedfrom
from
X
y =F
V
uX =
uy =
XX ==sum
sumof
ofconfirmed
confirmedcounts
counts
ZZ ==total
totalpresumptive
presumptivecount
count
KK ==total
totalnumber
numberof
ofcolonies
coloniesconfirmed
confirmed
NN ==total
totalnumber
numberof
ofcolonies
coloniestested
tested
1 1 1
+ −
Z K N
u
2
KH
+u
2
KS
+u
2
KA
+u
2
KM
+u
2
KL
+u +u
2
F
2
X
32
Test
Test portion
portion volume
volume
VV ==total
totaltest
testportion
portionvolume
volume
w
relativestandard
standarduncertainty
uncertaintyof
ofthe
the
wVV ==relative
total
totaltest
testportion
portionvolume
volume
uy = u + u
2
p
2
KH
+u
2
KS
+u
2
KA
+u
2
KM
+u
2
KL
+u +u +u
2
F
2
X
2
V
33
One-plate
One-plate instrument
instrument
AAmicrobial
microbialtest
test
result
resultuncertainty
uncertainty
calculation
calculationmight
might
be
beconcidered
concidered
„completely
„completely
corrected“
corrected“ififthe
the
following
followingfactors
factors
have
havebeen
beenapplied
applied
(of
(ofcourse,
course,ififrelevant)
relevant)
pp ==confirmation
confirmationcoefficient
coefficient
KKH ==personal
personalyield
yieldcoefficient
coefficient
H
KKS ==sample
samplestability
stabilitycoefficient
coefficient
S
KKA ==yield
yieldof
ofmedium
mediumcoefficient
coefficient
A
KKM ==material
material//environment
environmentcoefficient
coefficient
M
KKL ==overlap
overlapcorrection
correctionfactor
factor
L
FF ==dilution
dilutionfactor
factor
tt ==time
time
zz ==colony
colonynumber
number
vv ==test
testportion
portionvolume
volume
u y = up2 + uK2 H + uK2 S + uK2 A + uK2 M + uK2 L + uF2 + u2t + u2z + u2v
AAsystematic
systematiccomponent
componenthas
hasno
noeffect
effectififthe
thecoefficient
coefficient
is
is1.0
1.0and
andits
itsuncertainty
uncertaintyis
isgetting
getting0.
0.
34
Multiple-plate
Multiple-plate instrument
instrument
SAMPLE
= dilution flask or tube
= final suspension
= petri plate
= a sub-set is selected
for reading the result
= transfer of liquid
35
Multiple-plate
Multiple-plate instrument
instrument
IfIfmore
morethan
thanone
onecountable
countableplate
plateis
isavailable
availablethe
thetest
test
result,
result,with
withthe
thedilution
dilutiontaken
takeninto
intoaccount,
account,is
is
∑ zi
Z
y =F
=F
V
∑vi
FF
zzi
i
vvi
i
==dilution
dilutionfactor
factor
==count
countin
inplate
plateii
==test
testportion
portionvolume
volumeof
ofplate
plateii
(ml
(mlof
offinal
finalsuspension)
suspension)
Z,
Z,VV ==capital
capitalletters
lettersare
areused
usedfor
for
denoting
denotingsums
sums
36
Multiple-plate
Multiple-plate instrument
instrument -- Report
Report sheet
sheet (part
(part I)I)
Sample:
Date:
Basics:
Relative uncertainty of the test result:
uy =
u K2 H + u K2 S + u K2 A + u K2 M + u K2 L + u F2 + u 2T + u 2X + u 2V
KKH ==personal
personalyield
yieldcoefficient
coefficient
H
KKS ==sample
samplestability
stabilitycoefficient
coefficient
S
KKA ==yield
yieldof
ofmedium
mediumcoefficient
coefficient
A
KKL ==material
material//environment
environmentcoefficient
coefficient
L
KKM ==overlap
overlapcorrection
correctionfactor
factor
M
FF ==dilution
dilutionfactor
factor
TT ==time
time
XX ==sum
sumof
ofconfirmed
confirmedcounts
counts
VV ==test
testportion
portionvolume
volume
37
Multiple-plate
Multiple-plate instrument
instrument -- Report
Report sheet
sheet (part
(part II)
II)
Plate Presumptive
count
1
2
3
4
5
Sum
Colonies
tested
Colonies
confirmed
Dilution factor F of final suspension:
Test portion volume:
Sum of confirmed counts (if relevant):
Systematic correction coefficients applied:
Coefficient
u
Confirmed
count
Sum V=:
X=:
u2
confirmation p
personal yield KH
sample stability KS
medium yield KA
overlap KL
dilution factor F
(When a coefficient is unknown or unused its value is taken as 1 and the uncertainty as 0.)
38
Multiple-plate
Multiple-plate instrument
instrument -- Report
Report sheet
sheet (part
(part III)
III)
X
Test result: y = K H × K S × K A × K L × K M × F ×
V
Untertainty components of the „particle detection instrument“:
w
w2
reading T
confirmed count X
test portion V
Final report:
Microbiological content of the sample y:
Relative uncertainty, 100wy:
%
39
Multiple-plate
Multiple-plate instrument
instrument
AAmicrobial
microbialtest
test
result
resultuncertainty
uncertainty
calculation
calculationmight
might
be
beconcidered
concidered
„completely
„completely
corrected“
corrected“ififthe
the
following
followingfactors
factors
have
havebeen
beenapplied
applied
(of
(ofcourse,
course,ififrelevant)
relevant)
uy =
KKH ==personal
personalyield
yieldcoefficient
coefficient
H
KKS ==sample
samplestability
stabilitycoefficient
coefficient
S
KKA ==yield
yieldof
ofmedium
mediumcoefficient
coefficient
A
KKM ==material
material//environment
environmentcoefficient
coefficient
M
KKL ==overlap
overlapcorrection
correctionfactor
factor
L
FF ==dilution
dilutionfactor
factor
TT ==total
totalreading
reading
XX ==sum
sumof
ofconfirmed
confirmedcounts
counts
VV ==total
totaltest
testportion
portionvolume
volume
u K2 H + u K2 S + u K2 A + u K2 M + u K2 L + u F2 + u 2T + u 2X + u 2V
AAsystematic
systematiccomponent
componenthas
hasno
noeffect
effectififthe
thecoefficient
coefficient
is
is1.0
1.0and
andits
itsuncertainty
uncertaintyis
isgetting
getting0.
0.
40
1 Incertidumbre de pesada de la muestra
∆1
0 . 01 g
=
= 0 . 001
10 g
2 Incertidumbre del volumen
0 . 5 ml
∆2 =
= 0 . 0056
90 ml
3 Incertidumbre del volumen de la muestra
0 . 01 ml
∆3 =
= 0 . 01
1ml
4
Incertidumbre total combinada
Sum = ∆ = 0.001 + 0.0056 + 0.01 = 0.01
2
2
2
==11%
%
41
Cálculo de la Incertidumbre de las mediciones en Microbiología
Cálculo
Cálculode
decoeficiente
coeficientede
deconfirmación
confirmación
p
k
n
=
k=
k=número
númerode
decolonias
coloniasconfirmadas
confirmadas
nn==número
númerode
deposibles
posiblescolonias
coloniaspositivas
positivas
(número
(númerode
decolonias
coloniastomadas
tomadaspara
paraconfirmación).
confirmación).
Cálculo
Cálculodel
delnúmero
númerode
decolonias
colonias
x =
pz
=
kz
n
zz==número
númerode
decuentas
cuentas(colonias
(coloniassospechadas)
sospechadas)
pp==coeficiente
coeficientede
decoordinación
coordinación
42
Cálculo de la Incertidumbre de las mediciones en Microbiología
Cálculo
Cálculode
dela
ladesviación
desviaciónestándar,
estándar,
incertidumbre
incertidumbreestándard
estándardu(x)
u(x)
z²k(n − k) + nk² z
u²(x) =
n³
zz==número
númerode
decolonias
coloniascontadas
contadas(sospechosas)
(sospechosas)
kk==número
númerode
decolonias
coloniasconfirmadas
confirmadas
nn==número
númeroposible
posiblede
decolonias
coloniaspositivas,
positivas,
(número
(númerode
decolonias
coloniastomadas
tomadaspara
paraconfirmación).
confirmación).
Cálculo
Cálculode
dela
ladesviación
desviaciónestándar
estándarrelativa
relativa
u(x)
w(x) =
x
kk==número
númerode
decolonias
coloniasconfirmadas
confirmadas
u(x)
u(x)==incertidumbre
incertidumbreestándar
estándar
43
Measurement Uncertainty in Microbiology,
still a secret ..... ??? (Part 2)
Proyecto: Metrologia Química
1
Incertidumbre
Incertidumbre de
de las
las mediciones
mediciones en
en Microbiología
Microbiología
EA
EAGuide
Guide04
04/10
/10
Acreditación
Acreditaciónde
delaboratorios
laboratoriosmicrobiológicos
microbiológicos
Información
Informaciónvaliosa
valiosa
adicional
adicional
ISO
ISO7218
7218
Microbiología
Microbiologíade
dealimentos
alimentosyyalimentos
alimentospara
paraanimales
animales-Reglas
Reglasgenerales
generalespara
paraexámenes
exámenesmicrobiológicos
microbiológicos
2
3
Incertidumbre
Incertidumbre de
de las
las mediciones
mediciones en
en Microbiología
Microbiología
EA
EAGuide
Guide4/10
4/10
5.2 Incertidumbre de las mediciones
Los ensayos microbiológicos generalmente están en la
categoría que no requieren cálculos rigurosos,
metrológicamente y estadísticamente válidos de la
Incertidumbre de las mediciones. Generalmente es mas
apropiado estmar la Incertidumbre basándose solamente
en los datos de repetibilidad y reproducibilidad, pero en
forma ideal, incluyendo los sesgos (p.e. de resultados de
ensayos de aptitud). Las componentes individuales de la
Incertidumbre deben identificarse y debe demostrarse que
están bajo control y evaluada su contribución a la
variabilidad …..
4
and
and in
in addition
addition ISO/PDTS
ISO/PDTS 19036
19036 …..
…..
Draft
DraftTechnical
TechnicalSpecification/
Specification/
Technical
TechnicalReport
Report
No.
No.19036,
19036,released
released11th
11thMay
May2005
2005
Microbiology
Microbiologyof
offood
foodand
andanimal
animalfeeding
feedingstuffs
stuffs-Guide
Guideon
onestimation
estimationof
ofmeasurement
measurementuncertainty
uncertainty
for
forquantitative
quantitativedeterminations
determinations
5
But as singles we are behaving as ....
Poissoins.
6
7
Uncertainties for colony counts for
single plate measurements
according to ISO 7218
cfu per plate
Confidence level 95%
1
< 1 bis 6 (-97% bis +457%)
2
< 1 bis 7 (-88% bis +261%)
3
< 1 bis 9 (-79% bis +192%)
4
1 bis 10 (-73% bis +156%)
5
2 bis 12 (-68% bis +133%)
10
5 bis 18 (-52% bis +84%)
15
8 bis 25 (-44% bis +65%)
8
Normas
Legales
Referencias
bibliográficas
aceptadas
Resultado de
ensayos de aptitud
Gráficos de control y
datos de validación
Cuantificación de
acuerdo a la
Niemela et al., Finland
Experiencia
de expertos
9
Límite
superior
El
Elnivel
nivellímite
límitesuperior
superiorestá
estáexcedido
excedidocon
conuna
unaprobabilidad
probabilidad
de
de 95
95%
%si
sila
ladiferencia
diferenciaentre
entreel
elvalor
valormedido
medidoyylímite
límite
superior
superiores
esmayor
mayorque
quela
ladiferencia
diferenciacrítica.
crítica.
10
Diferencia Crítica
(Directiva 213/2001 EC del 09.01.2001)
Uso
Uso
Evaluación
Evaluaciónde
deresultados
resultadosde
deensayos,
ensayos,
detección
detecciónde
devalores
valores
que
queexcedan
excedanel
ellímite
límitesuperior
superior
Punto
Puntode
de
partida
partida
La
LaIncertidumbre
Incertidumbrede
delas
lasmediciones
medicionesse
se
expresa
expresacomo
comoDiferencia
DiferenciaCrítica
CríticaCrD
CrD
Condiciones
Condiciones
Conocimiento
Conocimientode
dela
larepeatibilidad
repeatibilidadyy
reproducibilidad,
reproducibilidad,desviación
desviaciónestándar,
estándar,
nivel
nivelde
deconfianza
confianza95
95%
%para
pararryyRR
11
La
Ladiferencia
diferenciacrítica
crítica(nivel
(nivelde
deconfianza
confianzade
de95
95%)
%)
puede
puedeser
ser calculada:
calculada:
(n − 1)
u ( y ) = s y = s R − sr
n
2
2
(n − 1)
CrD95 ( y − m ) = 0,59 R − r
n
2
2
12
Incertidumbre
Incertidumbre en
en Microbiología
Microbiología
Ejemplo: Leche en polvo
descremada
Max.
Max.40,000
40,000cfu‘s/g
cfu‘s/g
Incertidumbres
Incertidumbrespropuestas
propuestas
Repeatibilidad
Repeatibilidad
rr==0.43
0.43(log-units)
(log-units)
Reproducibilidad
Reproducibilidad
RR==0.85
0.85(log-units)
(log-units)
Diferencia
Diferenciacrítica
crítica
CrD
CrD==0.47
0.47(log-units)
(log-units)
78,000
78,000cfu/g
cfu/g(determinación
(determinacióndoble)
doble)
13
Incertidumbre
Incertidumbre de
de las
las mediciones
mediciones en
en microbiología
microbiología
Ejemplo: Resultado de EAs, cuentas totales a 36 °C
No.
Fecha
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
31.12.93
22.02.94
30.05.94
17.01.95
02.06.95
28.06.96
18.12.96
21.05.97
29.04.98
11.12.98
01.03.99
07.06.99
Operador Valor asignado Resultado Lab Valor medio de
(cfu/ml)
(cfu/ml)
recuperación en %
J
J
J
J
J
J
J
J
J
J
J
J
132
136
66
149
30
33
273
49
83
299
80
256
140
149
78
120
26
26
230
48
74
301
98
260
106
110
118
81
87
79
84
98
89
101
123
102
14
Incertidumbre
Incertidumbre de
de las
las mediciones
mediciones en
en microbiología
microbiología
Ejemplo: Resultado de EAs, cuentas totales a 36 °C
No.
Fecha
Operador
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
07.12.99
21.02.00
19.05.00
29.08.00
02.03.01
20.06.01
21.09.01
30.11.01
13.03.02
27.05.02
J
J
J
J
J
J
J
J
J
J
Rec.:
SD:
98 %
± 15 %
Valor asignadoResultados Lab Valor medio de
(cfu/ml)
(cfu/ml)
recuperación en %
118
15
18
22
139
172
15
52
51
39
132
12
20
22
150
174
18
55
45
46
Incertidumbre combinada:
Incertidumbre expandida :
112
80
111
100
108
101
120
106
88
118
± 15 %
± 30 %
15
16
17
Incertidumbre
Incertidumbre en
en Microbiología
Microbiología
20
20medidas
medidasde
dela
la
misma
mismamuestra
muestra
Resultados Log10
1.1 x 104
1.1 x 104
1.1 x 104
1.1 x 104
1.1 x 104
3.0 x 105
4.8 x 104
2.7 x 105
7.8 x 103
6.7 x 104
1.9 x 104
8.0 x 103
2.2 x 104
1.2 x 105
1.2 x 104
1.5 x 105
1.7 x 104
3.0 x 104
0.5 x 104
2.0 x 104
4.04
4.04
4.04
4.04
4.04
4.47
4.68
5.43
3.89
4.83
4.28
3.90
4.34
5.10
4.10
5.18
4.23
4.48
3.70
4.30
Ejemplo: Conteo total de bacterias
en hamburguesas
Media
Media
SD
SD
SD
SDRelativa
Relativa
Incertidumbre
Incertidumbre
Expandida
Expandida
Resultado
Resultado
4
4.4
cfu/g
4.4xx10
104cfu/g
4
0.52
cfu/g
0.52xx10
104cfu/g
0 .52 × 10 4
× 100 % = 12 %
4
4 .4 × 10
UUexpanded ==±±24%
24%
expanded
44cfu/g
4.4
±
1.1
x
10
4.4 ± 1.1 x 10 cfu/g
4
4.4
4.4xx10
104±±24%
24%cfu/g
cfu/g
18
In
In big
big groups
groups we
we are
are more
moreor
orless
lessnomally
nomallydistributed
distributed ....
35 - 5.9
25 - 5.4
5 - 4.9
x
4.4
5 - 3.9
25 - 3.4
35 - 2.9
19
Analytical Laboratory Ltd.
[Company Logo]
Management Form
Control Card Monitoring
Code: …
Revision: 01
Date: …
Page: 1 of 2
Control Card Monitoring No. 1
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Sample
15/
304
81/
401
22/
227
04/
101
97/
449
13/
448
37/
892
50/
221
66/
197
82/
902
83/
902
47/
111
92/
309
27/
338
72/
398
07/
018
08/
015
32/
558
19/
734
88/
206
Date
06.
05.
06
08.
06.
06
08.
06.
06
08.
06.
06
09.
06.
06
09.
06.
06
10.
06.
06
11.
06.
06
11.
06.
06
14.
06.
06
14.
06.
06
14.
06.
06
16.
06.
06
16.
06.
06
17.
06.
06
18.
06.
06
18.
06.
06
18.
06.
06
20.
06.
06
20.
06.
06
Measure 1
50
83
100
55
40
62
122
55
38
440
30
175
26
140
13
94
32
64
7,8x
107
31
7,7x
103
Measure 2
64
90
124
75
24
66
142
65
40
480
00
197
22
122
7
82
20
-
6,9x
107
28
6,9x
103
log 1
1,6
98
1,9
19
2,0
0
1,7
40
1,6
02
1,7
92
2,0
86
1,7
40
1,5
79
4,6
43
2,2
43
1,4
14
2,1
46
1,1
13
1,9
73
1,5
05
1,8
06
7,8
92
1,4
91
3,8
86
log 2
1,8
06
1,9
54
2,0
93
1,8
75
1,3
80
1,8
19
2.1
52
1,8
12
1,6
02
4,6
81
2,2
94
1,3
42
2,0
86
0,8
45
1,9
13
1,3
01
-
7,8
38
1,4
47
3,8
38
r
0,1
08
0,0
35
0,0
93
0,1
35
0,2
22
0,0
27
0,0
66
0,0
72
0,0
23
0,0
38
0,0
51
0,0
72
0,0
60
0,2
68
0,0
60
0,2
04
-
0,0
54
0,0
17
0,0
48
Signature
XY
XY
XY
XY
XY
XY
XY
XY
XY
XY
XY
XY
XY
XY
XY
XY
XY
XY
XY
XY
Compiled [Date]
[Signature]
Checked [Date]
[Signature]
Valid from [Date]
[Signature]
20
Analytical Laboratory Ltd.
[Company Logo]
Management Procedure
Complaint Management
Code: …
Revision: 01
Date: …
Page: 2 of 2
Maximum r = 0,27
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
Avarage r = 0,087
0,05
0,00
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Avarage r = 0,087
Compiled [Date]
[Signature]
Checked [Date]
[Signature]
Valid from [Date]
[Signature]
21
Incertidumbre
Incertidumbre de
de medición
medición estimadas
estimadas en
en la
la
industria
industria alimentaria
alimentaria
••Listeria
Listeriamonocytogenes:
monocytogenes:
••Aerobic
Aerobicmesophilic
mesophiliccounts:
counts:
••Bacillus
Bacilluscereus:
cereus:
••Coliforms:
Coliforms:
••Enterobacteriacea:
Enterobacteriacea:
••Staphylococcus
Staphylococcusaureus:
aureus:
••Levadura:
Levadura:
±±0.20
0.20log
logCFU/ml
CFU/ml
±±0.15
0.15log
logCFU/ml
CFU/ml
±±0.20
0.20log
logCFU/ml
CFU/ml
±±0.25
0.25log
logCFU/ml
CFU/ml
±±0.25
0.25log
logCFU/ml
CFU/ml
±±0.20
0.20log
logCFU/ml
CFU/ml
±±0.20
0.20log
logCFU/ml
CFU/ml
••Esporas
EsporasAeróbicas
Aeróbicasmesofilas:±
mesofilas:±0.25
0.25log
logCFU/ml
CFU/ml
••Clostridium
Clostridiumperfringens:
perfringens:
±±0.20
0.20log
logCFU/ml
CFU/ml
22
Muchas gracias
por su atención !!!
23
Calculation of Measurement
Uncertainty in Chemistry
1
Referencia
Referencia
EURACHEM
EURACHEM//CITAC
CITACGuide
GuideCG
CG44
Quantifying
Quantifyingincertidumbre
incertidumbrein
inAnalytical
AnalyticalMeasurement
Measurement(2000)
(2000)
www.eurachem.com
www.eurachem.com
NORDTEST
NORDTESTTR
TR537
537
Handbook
Handbookfor
forCalculation
Calculationof
ofMeasurement
MeasurementUncertainty
Uncertainty
www.nordicinnovation.net/nordtest.cfm
www.nordicinnovation.net/nordtest.cfm
under
underlink
link„Rapporter“
„Rapporter“
2
Normas
Legales
Referencias
bibliográficas
aceptadas
Resultado de
ensayos de aptitud
Gráficos de control y
datos de validación.
Cuantificación de
acuerdo a la
EURACHEM GUIDE or NORDTEST
Experiencia
de expertos
3
CONCEPTOS
CONCEPTOS GENERALES
GENERALES
Evaluación
Evaluación “tipo
“tipo A”
A” de
de la
la incertidumbre
incertidumbre
usando
usando análisis
análisis estadístico
estadístico de
de una
una
serie
serie de
de medidas
medidas
Medidas
Medidas
Evaluación
Evaluación “tipo
“tipo B”
B” de
de la
la incertidumbre
incertidumbre
usando
usando otros
otros métodos
métodos no
no estadísticos
estadísticos
Creer
Creer
4
CONCEPTOS
CONCEPTOS GENERALES
GENERALES
Evaluación
Evaluación “tipo
“tipo A”
A” de
de la
la incertidumbre
incertidumbre
usando
usando análisis
análisis estadístico
estadístico de
de una
una
serie
serie de
de datos
datos
Es aquella que se evalúa por métodos estadísticos.
– Calcular desviación estándar del promedio.
– Método de mínimos cuadrados para ajustar una
curva a una serie de datos: desviación estándar de
pendiente y ordenada.
– Análisis de varianza para identificar y cuantificar
efectos aleatorios.
5
Cuantificación de las componentes individuales de
la incertidumbre. Typo A
x1 + x 2 + x3 + ... + x n
1 n
x = ∑ i =1 xi =
n
n
s ( xi ) =
1
n
2
(
x
−
x
)
∑
i
i =1
( n − 1)
s(xi )
1
n
2
=
(x − x)
s(x) =
∑
i=1 i
n(n−1)
n
Media aritmética de n
observaciones
Desviación estándar experimental
Desviación estándar experimental
de las medias
u ( xi ) = s ( x )
para varias series de medidas
u ( xi ) = s ( x)
para una serie de medidas
u(xi): incertidumbre estándar
6
Concepto de la Incertidumbre de las mediciones
Incertidumbre combinada
u
 ∂f
( y ) = ∑ 
i =1  ∂ x i
u
2
combinada
 ∂f
( y ) = ∑ ∑ 
i =1 j =1  ∂ x i
n
para componentes de
incertidumbre no
correlacionadas
2
2
combinada
n
 2
 u ( x i )

n
 ∂ f

 ∂x
 j

u ( xi x j )


para componentes de
incertidumbre
correlacionadas
Para ecuaciones simples
y = x1 + x2 + x3 − x4
...ucombined ( y) =
y = x1 ⋅ x2 ⋅ x3 / x4 ...
ucombined ( y )
=
y
2
u
∑i =1 ( xi ) = u1 + u2 + ... + un
n
2
2
2
2
2
2
u 2 ( xi )
un
u1 u2
=
+
+
+
...
∑i =1 x 2
2
2
x
x
x
2
i
n
1
2
n
7
CONCEPTOS
CONCEPTOS GENERALES
GENERALES
Evaluación
Evaluación “tipo
“tipo B”
B” de
de la
la incertidumbre
incertidumbre
utiliza
utiliza métodos
métodos no
no estadísticos
estadísticos
• Es aquella que se evalúa por medios diferentes a un
análisis estadístico, esta basada en el juicio científico
usando toda la información disponible relevante, como:
- Datos de experimentos previos.
– Experiencia y/o conocimiento general del
comportamiento de la propiedad, substancia o
instrumento.
– Especificaciones del fabricante.
– Datos de calibración, reportes, informes.
– Incertidumbre asignada tomada de manuales de
referencia.
8
Distribuciones
Distribuciones de
de probabilidad
probabilidad
Distribución
Distribución rectangular
rectangular
Forma
2a ( = ±a )
1/2a
Emplear cuando:
UUn certificado u otra
especificación proporciona
límites sin especificar el
nivel de confianza
((Ejem. 25 ml ± 0.05 ml)
Incertidumbre
a
u ( x) =
3
·
x
9
Incertidumbre estándar de Calibración
Certificado del proveedor. Tolerancia =1000 ± 5 mg/l
u
(C
)
stock
u (C stock
)
5 mg
=
3 l
= 2.89 mg/l
10
Pureza de un estándar
Se considera el dato del proveedor < 99%
Por lo que se supone una distribución rectangular
u ( PChemical ) = 0.1% / 3 = 0,06%
11
Distribuciones
de
Emplear cuando:
Distribuciones
de probabilidad
probabilidad
Distribución
Distribución triangular
triangular
2a ( =±a )
1/a
x
eLa información disponible
relacionada la variable x
menos limitada que la
correspondiente
a
la
distribución rectangular. Los
valores de x son más
probables se situen al centro
que en los extremos. A La
estimación se realiza de la
forma de un intervalo
máximo (±a) descrito por
una distribución simétrica.
a
u ( x)=
6
12
Distribuciones de Probabilidad
13
Proceso de estimación de la incertidumbre, modelo EURACHEM
Especificar el mensurando
Identificar las fuentes
de incertidumbre
Paso 1
Paso 2
Agrupar la fuentes
Cuantificar las componentes
agrupadas
Cuantificar las componentes
restantes
Paso 3
Convertir a “desviaciones
standard”
Calcular la incertidumbre
combinada
Revisar y re-evaluar las
componentes mayores si es
necesario
Calcular la incertidumbre
expandida
Paso 4
Paso 5
14
Determinación de Cadmio en Alimentos
1 Introducción
Luego de la homogenización y mineralización el contenido
de Cadmio se determina por medio de EAA
(Absorción Atómica).
2 Principios y rango de trabajo del método
Este método permite medir Cadmio en concentraciones de
0.5 – 5 mg / kg en alimentos. Luego de homogeneizar y
mineralizar con ácido nítrico, la muestra se analiza por
EAA utilizando un horno de grafito.
15
3 Descripción del método
Se toman 0.5 g ± 0.1 mg de muesta para mineralizar usando
2.5 ml de ácido nítrico. Luego de mineralizar, la solución se
transfiere cuantitativamente a un matráz de 100 ml y se
analiza por EAA utilizando horno de grafito y calibrando con
soluciones estándar comerciales.
16
Cálculo de la Incertidumbre de las mediciones
de acuerdo a la GUM
Preparación
Preparaciónde
dela
lamuestra
muestra
Pesada
Pesada
Mineralisación
Mineralisación
Preparación
Preparaciónde
delos
los
estándares
estándaresde
decalibración
calibración
EAA
EAA
Calibración
Calibracióndel
delEAA
EAA
Resultado
Resultado
17
Identificación de las fuentes de incertidumbre
” diagramas causa efecto”
cCd
Volume
Purity
m⋅P
=
V
Temperature
Calibration
Repeatability
Concentration
cCd
Repeatability
Repeatability
m (gross)
Linearity
Repeatability
Repeatability
Sensitivity
Linearity
Sensitivity
Calibration
Calibration
Mass
18
5 Identificación y análisis de las fuentes de
incertidumbre
• incertidumbre de pesada de la muestra (uW)
• incertidumbre del volumen (uV)
• incertidumbre de la solución de calibración de stock
(uCstock)
• incertidumbre de la función de calibración
Otras: repetibilidad, recuperación, etc.
19
5.1 Incertidumbre de la pesada de la muestra (uW)
El certificado de calibración de la balanza indica
± 0.15 mg para la linealidad.
u (W)
0.15 mg
=
= 0.09 mg
3
Esta contribución debe ser contada dos veces, una para la tara
y una para el peso total, ya que cada una es una determinación
independiente y los efectos de linealidad no están
correlacionados.
Esto da una incertidumbre estándar de
u (W) = 2 × (0.09)
2
u (W) = 0.13 mg
20
5.2 Incertidumbre del volumen (uV)
Luego de la digestión se transfieren 0.5 g a un matraz de 100ml.
• Volumen: El certificado del proveedor indica que para el
matráz de 100 ml la tolerancia es de ± 0.1 ml.
u (V)
0.1 ml
=
3
u (V) = 0.06 ml
21
• Efectos de la temperatura:
temperatura ambiente 20 °C ± 3 °C
Coeficiente de expansión volumétrica del agua 2.1 x 10-4 / °C
−4
u (T)
100 ml × 2.1× 10 × 3 °C
=
3°C
u (T) = 0.035 ml
22
• Efectos de paralaje: Se enraza 10 veces,
desviación estandard: 0.05 ml
100.2
100.0
100.0
99.9
:
:
100.0
u(P)
0.05
=
ml
10
u(P) = 0.02 ml
s = 0.05
n = 10
23
Incertidumbre estándar de un matraz de 100 ml
2
2
s (V100ml ) = u (V) + u (P) + u (T)
2
s (V100ml ) = 0.06 + 0.02 + 0.035
2
2
2
s (V100ml ) = 0.07 ml
24
5.3 Incertidumbre del estándar de Calibración (uCstock)
Certificado del proveedor 1000 ± 5 mg/l
u (Cstock )
5 mg
=
3 l
u (Cstock ) = 2.89 mg/l
25
Incertidumbre debida a la función de calibración
Función lineal de calibración
60,0
y(aj.)
Muestra Î
50,0
y(aj.) + u
Fuerza/N y
40,0
y(aj.) - u
30,0
20,0
10,0
0,0
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
Lectura/N x
© D r. Scheutwinkel 09 -2001
26
Coeficiente de correlación r = 0.9997
Desviación estándar de la calibración: 0.0040
a = 0.00017
b = 0.0865 pendiente
S 1 1 (c0 − c) 2
u(c0 ) =
+ +
B1 p n
Sxx
S
B1
p
n
c0
c
Sxx
i
j
n
Sxx = ∑ (ci − c)
2
i =1
: desviación estándar de los residuos
: pendiente
: número de medidas para determinar c0
: numero de medidas para la calibración
: concentración de cadmio en la muestra
: valor medio de las concentraciones de los estándares
:
: índice para el número de estándares de calibración
: índice para el número de medidas para obtener
la curva de calibración
27
5.4 Incertidumbre resultante de la calibración
estándar
(ppb)
1
2
3
0.5
0.058
0.057
0.061
1
0.104
0.104
0.104
2
0.197
0.194
0.194
3
0.284
0.279
0.285
4
0.363
0.349
0.367
Muestra
0.07
0.068
0.069
28
Standard
(ppb)
y
x(ci)
(ci-cort)
(ci-cort)2
0.5
0.058
0.47
-1.83
3.33
0.5
0.057
0.46
-1.84
3.38
0.5
0.061
0.51
-1.79
3.21
1.0
0.104
1.01
-1.29
1.67
1.0
0.104
1.01
-1.29
1.67
1.0
0.104
1.01
-1.29
1.67
2.0
0.197
2.08
-0.22
0.05
2.0
0.194
2.05
-0.25
0.06
2.0
0.194
2.05
-0.25
0.06
3.0
0.284
3.09
0.79
0.62
3.0
0.279
0.03
0.73
0.53
3.0
0.285
3.10
0.80
0.64
4.0
0.363
4.00
1.70
2.89
4.0
0.349
3.84
1.54
2.37
4.0
0.367
4.05
1.75
3.05
Sxx
25.22
2.30
Resultado de la muestra: 0.6 µg/l
29
n
Sxx = ∑ (ci − c) = 25.22
2
i =1
2
0.0040 1 1 (0.60 − 2.3)
+ +
= 0.033 µg/l
u(c0 ) =
0.0865 3 15
25.22
30
6 Incertidumbre combinada
2
2
 u W   u V   u Cstock
u C (Cd)
 + 
 + 
= 
c(Cd)
 C W   C V   C Cstock
2
2
2
  u C 0
 +
  C C 0
2

 + others ...


2
2
u C (Cd)
 0.00013   0.07   2.89   0.033 
= 
 +
 +
 +
 + others
c(Cd)
 0.5   100   1000   0.6 
u C (Cd)
= 0.026 2 + 0.0007 2 + 0.00289 2 + 0.0552
c(Cd)
u C (Cd)
= 0.06
c(Cd)
31
c0 × V
m=
W
0.6 × 0.1
m=
= 0.12 mg/kg
0.5
uc (Cd)= 0.06× 0.12= 0.007≈ 0.01
Cd = 0.12 ± 0.01 mg/kg
32
7 Incertidumbre expandida
k = factor de cobertura
k = 2 (95 % intervalo de confianza)
8 Informe del resultado
Cd = 0.12 ± 0.02 mg/kg
(± incertidumbre expandida, factor de cobertura = 2)
33
Oh, I need a break!
34
Incertidumbre
de la
Medición
Generales
by
Dr. Miguel Scheutwinkel
1
Referencia
Referencia
ILAC
ILACGuide
Guide17
17
Introducing
Introducingthe
theConcept
Conceptof
ofIncertidumbre
Incertidumbrein
inTesting
Testingin
in
Association
Associationwith
withthe
theApplication
Application
of
ofthe
theStandard
StandardISO/IEC
ISO/IEC17025
17025(2002)
(2002)
www.ilac.org
www.ilac.org
EA
EAGuide
Guide4/16
4/16
EA
EAguidelines
guidelineson
onthe
theexpression
expressionof
ofincertidumbre
incertidumbrein
in
quantitative
quantitativetesting
testing(12/2003)
(12/2003)
www.european-accreditation.com
www.european-accreditation.com
EURACHEM
EURACHEM//CITAC
CITACGuide
GuideCG
CG44
Quantifying
QuantifyingIncertidumbre
Incertidumbrein
inAnalytical
AnalyticalMeasurement
Measurement(2000)
(2000)
www.eurachem.com
www.eurachem.com
2
3
4
5
6
Expresión de la Incertidumbre
Una medida es sólo
una estimación porque todas
las medidas tienen
limitaciones de precisión
respecto al
" Valor verdadero".
" Valor
Aun con calibraciones
y haciendo nuestro
mejor trabajo profesional
tenemos incertidumbre
en nuestras medidas respecto
al "Valor verdadero".
verdadero" es algo teórico
7
Principios de la incertidumbre de
medición
8
Definición
Incertidumbre de medición (VIM* 1993)
Un
Un parámetro
parámetro asociado
asociado con
con el
el resultado
resultado
de
de una
una medida
medida que
que caracteriza
caracteriza la
la dispersión
dispersión
de
de los
los valores
valores que
que se
se puede
puede atribuir
atribuir
razonablemente
razonablemente al
al mesurando
mesurando
**==International
Internationalvocabulary
vocabularyof
ofbasic
basicand
andgeneral
generalterms
termsininmetrology
metrology
9
Incertidumbre y límites de aceptación:
1.
Límite
Superior de
Control
2.
?
3.
?
4.
10
Incertidumbre de las mediciones
Objetivos de la ISO/IEC 17025
Estimación razonable de la incertidumbre
identificando todas las componentes de la incertidumbre
Asegurar que los resultados en un informe de ensayos
no den una impresión errónea de la incertidumbre.
Requerido por
el método
de ensayo
Requerido por
el cliente
Requerido cuando existen
límites estrechos sobre los cuales
se basan las decisiones de
conformidad con especificaciones.
11
Principios de la incertidumbre de medida
Informe del resultado
Cd = 0.12 ± 0.02 mg/kg
(± incertidumbre expandida,
factor de cobertura = 2;
intervalo de confianza de 95%)
12
Informe de un resultado y su incertidumbre
Valor = ( x ± U )( units )
Como el uso de la incertidumbre expandida estándar
aún no es universal, siempre es conveniente acompañar
el resultado de una frase similar a:
“El valor de incertidumbre informado corresponde al
valor de la incertidumbre expandida estándard
calculada según la Guía ISO para la expresión de la
incertidumbre de las mediciones, con un factor de
cobertura correspondiente a una probabilidad de
aproximadamente 95 % (k=2)”
13
Incertidumbre de las mediciones
Error
Es
Es importante
importante distinguir
distinguir entre
entre
error
error ee incertidumbre.
incertidumbre. Error
Error está
está definido
definido como
como la
la
diferencia
diferencia entre
entre un
un resultado
resultado individual
individual yy el
el
valor
valor verdadero
verdadero del
del mesurando.
mesurando. Como
Como tal,
tal, el
el error
error es
es
un
un valor
valor individual.
individual. En
En principio,
principio, el
el valor
valor de
de un
un error
error
conocido
conocido puede
puede ser
ser aplicado
aplicado como
como corrección
corrección
de
de una
una medición.
medición.
14
Desviaciones aleatorias y sistemáticas
preciso
y
exacto
impreciso
pero
exacto
preciso
pero
inexact
impreciso
e
inexacto
15
Mean
20
19
18
17
16
15
14
13
12
11
305
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
Ref.
315
310
Incertidumbre
Error
300
295
290
16
Incertidumbre de las mediciones
3.5%
3.0%
Preciso, pero inexacto
Inexacto e impreciso
2.5%
Error %
Error > incertidumbre
2.0%
1.5%
incertidumbre > Error
1.0%
0.5%
Exacto pero impreciso
Exacto y preciso
Incertidumbre %
0.0%
0.0%
0.5%
1.0%
1.5%
2.0%
2.5%
3.0%
3.5%
17
Normas
Legales
Referencias
bibliográficas
aceptadas
Resultado de
ensayos de aptitud
Gráficos de control y
datos de validación.
Cuantificación de
acuerdo a la
EURACHEM GUIDE or NORDTEST
Experiencia
de expertos
18
Incertidumbre de las mediciones
Estimación
Cálculo
Satisfacción de los
requerimientos del cliente
19
20
21
22
23
24
25
Normas
Legales
Referencias
bibliográficas
aceptadas
Resultado de
ensayos de aptitud
Gráficos de control y
datos de validación.
Cuantificación de
acuerdo a la
EURACHEM GUIDE
Experiencia de expertos
26
Incertidumbre de las mediciones
Efectos
aleatorios
Muestreo
Condiciones de
almacenamiento
Efectos del
Operador
Fuentes de
incertidumbre
Corrección
de blancos
Pureza de
reactivos
Efectos
computacionales
Efectos de
la muestra
Efectos
instrumentales
Condiciones
de medición
Estequiometría
supuesta
27
Expresión de la incertidumbre
U2
U1
U3
Medida
U8
U7
U4
U5
U6
No se pueden
corregir todas las
fuentes de incertidumbre .
Esta es la razón para la
dispersión de posibles resultados.
Incertidumbre
de la medición
28
Expresión de la incertidumbre
Como
Como el
el signo
signo yy valor
valor de
de la
la
"Incertidumbre
"Incertidumbre de
de la
la medida"
medida"
son
son desconocidos
desconocidos
debemos
debemos intentar
intentar cuantificar
cuantificar el
el
valor
valor de
de incertidumbre.
incertidumbre.
Afortunadamente,
Afortunadamente, la
la "Incertidumbre
"Incertidumbre
de
de la
la medición“
medición“ es
es una
una variable
variable
estadística
estadística que
que sigue
sigue una
una
distribución
distribución de
de probabilidad.
probabilidad.
29
Incertidumbre
Incertidumbre de
de medición
medición yy distribución
distribución normal
normal
En
Enanálisis
análisisquímicos
químicosla
la
repetibilidad
repetibilidadgeneralmente
generalmentesigue
sigue
una
unadistribución
distribuciónnormal.
normal.
Normalverteilung
Cuidado
Cuidadoen
en
microbiología.
microbiología.
(las
(lasbacterias
bacteriasno
nosaben
sabenestadística)
estadística)
30
La desviación estándar permite
la cuantificación de todas las
incertidumbres
desconocidas
en un proceso
analítico.
Eso se
llama
"incertidumbre
estándar"
= Incertidumbre
de un resultado
de una medición
expresada como
desviación estándar
31
La incertidumbre estandar sobre todos los procesos,
cuantifica la dispersión posible alrededor de un
"Valor verdadero".
Análisis
Estadístico
Riesgos asociados
a las mediciones.
"Incertidumbre de
las mediciones"
Otras actividades
relacionadas
con mediciones
Frecuentemente
Incertidumbre estándar
se la llama
Incertidumbre
de medidas
32
Expresión
Expresión de
de la
la Incertidumbre
Incertidumbre
Incertidumbre
Incertidumbre
combinada
combinada
Nivel
Nivel de
de
confianza
confianza
68
68 %
%
Incertidumbre
Incertidumbre
expandida
expandida
Nivel de
confianza
mas de 68 %
33
Incertidumbre combinada
34
Incertidumbre de las mediciones
Incertidumbre combinada
Para el resultado de una medición y,
la incertidumbre total,
llamada incertidumbre combinada y
representada por uc(y), es una desviación estándar
estimada igual a la raiz cuadrada positiva de
la varianza total obtenida combinando todas las
componentes de la incertidumbre components, evaluada
usando la ley de propagación de incertidumbres.
ucombined =
u12 + u22 + ... + un2
35
Incertidumbre de las mediciones
Incertidumbre estándar
ucombinada =
u12 + u22 + ... + un2
ucombinada =
s12 + s22 + ... + sn2
Para fuentes de incertidumbre no correlacionadas
36
Incertidumbre de las mediciones
Incertidumbre expandida
Para
Parala
lamayoría
mayoríade
delos
lospropósitos
propósitosen
enquímica
químicaanalítica,
analítica,debe
debe
utilizarse
utilizarsela
laincertidumbre
incertidumbreexpandida
expandidaU.
U.
La
Laincertidumbre
incertidumbreexpandida
expandidada
daun
unintervalo
intervalodentro
dentrodel
delcual
cualse
se
espera
esperaque
queesté
estéelelvalor
valordel
delmesurando
mesurandocon
conun
unalto
altonivel
nivelde
deconfianza
confianza
La
LaUUse
seobtiene
obtienemultiplicando
multiplicandouucc(y),
(y),la
laincertidumbre
incertidumbre
combinada
combinadaestandar,
estandar, por
porun
unfactor
factorde
decobertura
coberturak.k.
La
Laelección
eleccióndel
delfactor
factork,
k,está
estábasado
basado
en
enelelnivel
nivelde
deconfianza
confianzadeseado.
deseado.
Para
Paraun
unnivel
nivelaproximado
aproximadode
de95
95%
%kkes
es2.2.
.. u
U
=
k
Uexpanded
ucombined
expanded = k
combined
37
38
39
CONCEPTOS
CONCEPTOS GENERALES
GENERALES
Evaluación
Evaluación “tipo
“tipo A”
A” de
de la
la incertidumbre
incertidumbre
usando
usando análisis
análisis estadístico
estadístico de
de una
una
serie
serie de
de medidas
medidas
Medidas
Medidas
Evaluación
Evaluación “tipo
“tipo B”
B” de
de la
la incertidumbre
incertidumbre
usando
usando otros
otros métodos
métodos no
no estadísticos
estadísticos
Creer
Creer
40
CONCEPTOS
CONCEPTOS GENERALES
GENERALES
Evaluación
Evaluación “tipo
“tipo A”
A” de
de la
la incertidumbre
incertidumbre
usando
usando análisis
análisis estadístico
estadístico de
de una
una
serie
serie de
de datos
datos
Es aquella que se evalúa por métodos estadísticos.
– Calcular desviación estándar del promedio.
– Método de mínimos cuadrados para ajustar una
curva a una serie de datos: desviación estándar de
pendiente y ordenada.
– Análisis de varianza para identificar y cuantificar
efectos aleatorios.
41
Cuantificación de las componentes individuales de
la incertidumbre. Typo A
x1 + x 2 + x3 + ... + x n
1 n
x = ∑ i =1 xi =
n
n
s ( xi ) =
1
n
2
(
x
−
x
)
∑
i
i =1
( n − 1)
s(xi )
1
n
2
=
(x − x)
s(x) =
∑
i=1 i
n(n−1)
n
Media aritmética de n
observaciones
Desviación estándar experimental
Desviación estándar experimental
de las medias
u ( xi ) = s ( x )
para varias series de medidas
u ( xi ) = s ( x)
para una serie de medidas
u(xi): incertidumbre estándar
42
Concepto de la Incertidumbre de las mediciones
Incertidumbre combinada
u
 ∂f
( y ) = ∑ 
i =1  ∂ x i
u
2
combinada
 ∂f
( y ) = ∑ ∑ 
i =1 j =1  ∂ x i
n
para componentes de
incertidumbre no
correlacionadas
2
2
combinada
n
 2
 u ( x i )

n
 ∂ f

 ∂x
 j

u ( xi x j )


para componentes de
incertidumbre
correlacionadas
Para ecuaciones simples
y = x1 + x2 + x3 − x4
...ucombined ( y) =
y = x1 ⋅ x2 ⋅ x3 / x4 ...
ucombined ( y )
=
y
2
u
∑i =1 ( xi ) = u1 + u2 + ... + un
n
2
2
2
2
2
2
u 2 ( xi )
un
u1 u2
=
+
+
+
...
∑i =1 x 2
2
2
x
x
x
2
i
n
1
2
n
43
CONCEPTOS
CONCEPTOS GENERALES
GENERALES
Evaluación
Evaluación “tipo
“tipo B”
B” de
de la
la incertidumbre
incertidumbre
utiliza
utiliza métodos
métodos no
no estadísticos
estadísticos
• Es aquella que se evalúa por medios diferentes a un
análisis estadístico, esta basada en el juicio científico
usando toda la información disponible relevante, como:
- Datos de experimentos previos.
– Experiencia y/o conocimiento general del
comportamiento de la propiedad, substancia o
instrumento.
– Especificaciones del fabricante.
– Datos de calibración, reportes, informes.
– Incertidumbre asignada tomada de manuales de
referencia.
44
Distribuciones
Distribuciones de
de probabilidad
probabilidad
Distribución
Distribución rectangular
rectangular
Forma
2a ( = ±a )
1/2a
Emplear cuando:
UUn certificado u otra
especificación proporciona
límites sin especificar el
nivel de confianza
((Ejem. 25 ml ± 0.05 ml)
Incertidumbre
a
u ( x) =
3
·
x
45
Incertidumbre estándar de Calibración
Certificado del proveedor. Tolerancia =1000 ± 5 mg/l
u
(C
)
stock
u (C stock
)
5 mg
=
3 l
= 2.89 mg/l
46
Pureza de un estándar
Se considera el dato del proveedor < 99.9 %
Por lo que se supone una distribución rectangular
u ( PChemical ) = 0.1% / 3 = 0,06%
47
Distribuciones
de
Emplear cuando:
Distribuciones
de probabilidad
probabilidad
Distribución
Distribución triangular
triangular
2a ( =±a )
1/a
x
eLa información disponible
relacionada la variable x
menos limitada que la
correspondiente
a
la
distribución rectangular. Los
valores de x son más
probables se situen al centro
que en los extremos. A La
estimación se realiza de la
forma de un intervalo
máximo (±a) descrito por
una distribución simétrica.
a
u ( x)=
6
48
Incertidumbre estándar de Calibración
Certificado del proveedor. Tolerancia =1000 ± 5 mg/l
u
(C
)
stock
u (C stock
)
5 mg
=
6 l
= 2.0 mg/l
49
Incertidumbre estándar de Calibración
Certificado del proveedor. Tolerancia =1000 ± 5 mg/l
u
(C
)
stock
u (C stock
)
5 mg
=
3 l
= 2.89 mg/l
50
Distribuciones de Probabilidad
51
So, keep in mind
there is not only
one approach for
the estimation of
measurement
uncertainty
52