Fundamentos de Microscopía Óptica

Técnicas de Microscopía aplicada a las Ciencias Forenses
Adaptación Open Course Ware (OCW)
Máster Ciencias Forenses
Universidad de Murcia
Sesión 2:
Fundamentos de Microscopía Óptica
Nicolás Ubero Pascal
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Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2
Máster en Ciencias Forenses
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The title of that slide is:
Pictures Copyright
Nicolás Ubero Pascal
2
Microscopía óptica:
instrumentación y
principios
Autor:
David R. Caprette,
Ph.D.
Adaptación:
Nicolás Ubero
Compound Microscope, circa 1751
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Microscopio óptico compuesto
Cabezal
Estativo
Ocular
(adaptador para
los ojos)
Revolver
Objetivo
Platina móvil
Macrométrico
condensador
Micrométrico
Lente de campo
(fuente luminosa)
Control de
iluminación
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Máster en Ciencias Forenses
Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2
Fundamentos técnicos de la microscopía óptica
Óptica (lentes)
Aumentos
Campo visual
Iluminación
Resolución
Contraste
Profundidad de
campo
Enfoque
Nicolás Ubero Pascal
5
Refracción
La luz se dobla en ángulo cuando incide
en una superficie
Aire
Al igual que un vehículo cambia su
dirección cuando entra en un terreno de
gravilla
Pavimento
suelto
Cristal
Esta primera
rueda frena
Onda
incidente
La
componente
que incide
primero
se ralentiza
primero
Pavimento
consolidado
Eje
perpendicular
La onda se comprime y se
dobla en el límite del medio
que produce la desaceleración
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Aumentos y Orientación I
Las líneas de puntos son
perpendiculares a la
superficie de la lente
Dirección de
la luz
rápido
lento
Posición
actual
Una lente biconvexa
curva la luz en la misma
dirección cuando entra
y cuando sale
Frog gastrula, saggital section; arrow indicates
yolk plug
rápido
Dirección del
movimiento
Imagen
proyectada
arriba
izquierda
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Dirección
aparente
abajo
Punto focal
Objeto
real
Imagen
aparente
derecha
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Aumentos y Orientación II
¿Por qué una lente de aumento simple
no produce una imagen invertida?
Con el objeto más cerca de la lente que del punto focal,
los rayos de luz divergen dando al observador la ilusión
de que está viendo un objeto más grande, más alejado,
pero en la misma orientación..
object
focal
point
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Aumentos
Aumentos finales
usando una lente
simple (por ejemplo un
estereomicroscopio)
40x
100x
400x
40x
100x
400x
La misma imágen:
usando un
microscopio óptico
compuesto
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Resolución
Resolución (d) =
0.61λ
n sin α
λ = Longitud de onda de la luz; n = índice de refracción
Escala de
resolución
teórica
0.2 µm
5 µm
2 µm
1 µm
0.4 µm
Escala de
resolución
de una 1
µm
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Campo visual y profundidad de campo
Volumen tridimensional
Teniendo en cuenta los cambios del aumento
escala = 5 mm
Volumen de espacio observado
40x
Profundidad de campo
a diferentes aumentos
cubreobjeto (#1) 0.15
mm thick
Profundidad de una
típica muestra
montada en humedat
0.1 mm
100x
400x
Grosor del portaobjeto
normal
1 mm
40x
100x
400x
1000x
1000x
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Campo visual e intensidad de la luz
Aumento final
Campo aparente:
(izquierda) Sin ajustar el brillo
(derecha) Después de compensar
con el control de intensidad
100x
Demasiado
brillante
Aumento del objetivo
400x
Correcto
1,000x
correcto
Demasido
oscuro
10x
Correcto
Demasido
oscuro
40x
100x
Quantity of
light
Diámetro de
campo real 2 mm
Área
0.5 mm
3 mm2
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0.2 mm
0.2 mm2
0.03 mm2
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El contraste y el condensador
Vista superior de un condensador con
selector de filtros
Apertura del condensador: tres posiciones
Totalmente
cerrado
Vista lateral del condensador
Resolucióny
contraste
optimizados
Totalmente
abierto
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Contraste y variación en el condensador
Tres imágenes de Paramecium caudatum (vacuolas alimentarias con células de levadura)
Contraste bajo
A
Contraste óptimo
(Izquierda) Bacillus thuringinensis con
endosporas: (A) campo claro; (B)
Contraste de fases (400x)
(derecha) Pseudopodo de Chaos
(Pelomyxa) carolinensis: (C) campo
claro; (D) campo oscuro (100x)
B
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Alto contraste
C
D
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Enfocando multiples surperficies
objetivo
Esquema no a
escala
Foco inicial por
encima de la
preparación
Preparación
Condensador
abierto para una
mayor claridad
Dirección del
enfoque
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Observando a través del especimen
Enfocando a través de un filamento de Spirogyra (400x)
Siguiente
paso
Células superiores enfocadas
Siguiente
paso
Siguiente
paso
Cloroplastos enfocados justo
debajo de la pared celular
Siguiente
paso
Enfoque en el centro de la
célula
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Aproximadamente a la
mitad de la célula
Siguiente
paso
Alcanzando el fondo
Cloroplastos enfocados justo
encima de la pared celular
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Microscopía con aceite de inmersión
Aumentos en seco
Aceite de inmersión
Diffracción
severa que
compromete una
buena
resolución
A
A: Bacteria at 400x
Aumentos en seco
mostrando una imagen
borrosa (Resolución
pobre)
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La difracción es
minimizada con el
uso de aceite de
inmersión
B
B: Bacteria at 1000x Con
un objetivo de inmersión
(Porción central del
campo de visión de A)
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Uso del objetivo de inmersión
1
2
Enfocar en seco con el
objetivo de mayor
aumento.
Mover el revólver y
dejarlo en una posición
entre dos objetivos
5
3
Colocar una gota de
aceite de inmersión
sobre el espécimen
4
Colocar cuidadosamente el
objetivo de inmersión sobre el
espécimen
Disposición de aceite sobre el cubreobjetos
Colocación de aceite sobre un frotis (sin cubreobjetos)
Y ya se puede
observar
La punta del objetivo debe
estar completamente
embebida en el aceite.
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Enfoque con un objetivo de inmersión
Correcto – solo es
necesario un buen
enfoque
Demasiado lejos,
mover la platina hacia
arriba
Alto o bajo
Imagen no visible
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correcto
Demasiado cerca –
mover la platina hacia
abajo
Imagen no visible
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Ajuste de los oculares
Enfoque del ocular
Separación de los ojos
(girar para enfocar)
centro
Totalmente
abierto
Imagen doble
Totalmente
cerrado
Girar para extender el
tubo del ocular
Ajustar para una sola imagen
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Lentes sucias?
Si ve marcas contra un campo
vacío, mueva la muestra de
izquierda a derecha
... si se mueven,
las manchas
están en la
preparación
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Si las marcas no están en
la preparación, girar el
ocular
... si se mueven
indica que las
marcas están en
el ocular
Manchas fuera de foco pueden
aparecer en el condesador. Para
saberlo
...si alejamos el
condensador
estas estarán
mas fuera de foco
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Comparación de los
distintos tipos de
microscopía óptica
Autor:
David R. Caprette,
Ph.D.
Adaptación:
Nicolás Ubero
Dave Caprette
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Comparación de los tipos de microscopía óptica
Spirogyra
Bacillus
Amoeba proteus
Campo
claro
Campo
oscuro
(top) bright field
(bottom) D.I.C.
Contraste
fases
400x
“D.I.C.,”
(off axis
condenser)
100x except as noted
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400x
40x
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Microscopía de campo claro
Objetivo
Imagen de la
muestra*
Campo
claro
muestra
platina
Condensador
Control de diafragma
Diámetro del
campo visual
Filtro de luz de día
Fuente de
iluminación
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*Volvox (fixed and stained)
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Microscopía de campo oscuro
Objetivo
Luz
dispersat
Imagen de la
muestra*
Campo
oscuro
muestra
Platina
condensador
Filtro opaco
Diámetro del
campo visual
Filtro luz de día
Fuente
luminosa
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*yeast cells in suspension
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Microscopía de contraste de fase
Imagen
proyectada
Luz alterada
por la muestra
Luz no
obstaculizada
Objetivo
(no se
esquematizan
todos sus
componentes
Membrana
plasmática
halo
Placa de fase
muestra
Platina
plasmagel
Condensador
Vacuola
allimentaria
plasmasol con
gránulos
Diafragma
anular
(Fuente de luz no mostrada)
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Diafragma visto
desde arriba
Muestra: Chaos (pelomyxa) carolinensis
pseudopodium, 400x
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Microscopía Contraste Interdiferencial
(Nomarski)
Polarized light
a
Dirección de la vibración (luz que llega al
observador)
(a)
(b)
(c)
b
(a) luz blanca (no polarizada)
(b) Filtro polarizador
(c) Luz polarizada
Amoeba proteus (100x):
(a) imagen de campo claro; (b)
D.I.C. Efecto obtenido al ajustar el
condensador
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Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2
Máster en Ciencias Forenses
Otros ejemplos: Huevo de insecto con campo claro
© N. Ubero-Pascal
Nicolás Ubero Pascal
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Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2
Máster en Ciencias Forenses
Huevo de insecto con campo oscuro
A
© N. Ubero-Pascal
Nicolás Ubero Pascal
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Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2
Máster en Ciencias Forenses
Huevo de insecto con contraste de fases
B
© N. Ubero-Pascal
Nicolás Ubero Pascal
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Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2
Máster en Ciencias Forenses
Detalle de un huevo de insecto con contraste de fases
C
© N. Ubero-Pascal
Nicolás Ubero Pascal
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Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2
Máster en Ciencias Forenses
Huevo de insecto con contraste interdiferencial (DIC) Nomarski
D
© N. Ubero-Pascal
Nicolás Ubero Pascal
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Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2
Máster en Ciencias Forenses
Créditos de las Ilustraciones / Pictures copyright
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Logo Portada OCW-UM. Autor: Universidad de Murcia: Dirección web: http://ocw.um.es/
Logo encabezamiento. Autor: Musarumana: Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Microscopio_gif.jpg
Diapositivas 3-4 y 6-27 adaptadas de las presentaciones de D.R. Caprette: “Light Microscopy: Instrumentation and Principles” y “Light Microscopy: comparison of
optics”, publicadas on line en BioEd Online. Disponible en la página web: http://www.bioedonline.org/presentations/index.cfm#presentation32
Las figuras A, B, C y D de las páginas 29 a32 son de Nicolás Ubero
Nicolás Ubero Pascal
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