control biológico - Entomología mexicana
Transcripción
control biológico - Entomología mexicana
CONTROL BIOLÓGICO EXTRACTOS ENZIMÁTICOS DE Beauveria bassiana, UNA ALTERNATIVA PARA EL CONTROL DE Metamasius spinolae (GYLLENHAL BUSK), BAJO CONDICIONES DE LABORATORIO Lluvia de Carolina Sánchez-Pérez1; Silvia Rodríguez-Navarro1; Juan Esteban Barranco-Florido2; Erika ChávezIbañez1; Miguel Ángel Ramos-López2. 1Departamento de Producción Agrícola y Animal. 2Departamento de Sistemas Biológicos. Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco. Calzada del Hueso #1100, Colonia Villa Quietud, Delegación Coyoacán. México 04960. [email protected]; [email protected]; [email protected]. mx. RESUMEN. Se evaluó la acción de conidios y extractos enzimáticos de Beauveria bassiana individualmente y en conjunto con el fin de acelerar el proceso infectivo del B. bassiana sobre Metamasius spinolae obtenidos de Milpa Alta, D. F., bajo condiciones de laboratorio, planteándose como alternativa para el control de esta plaga en el cultivo del nopal. Se montó un bioensayo con 6 tratamientos obteniendo un 100% de mortalidad en todos los tratamientos sin existir diferencia significativa; pero al evaluar el tiempo de muerte existió diferencia significativa que muestra una aceleración de mortalidad. La propuesta de utilizar simultáneamente conidios + extractos enzimáticos se propuso debido a que probablemente acelera y facilita la degradación y penetración del tegumento del insecto. Palabras clave: extractos enzimáticos, Beauveria bassiana, Metamasius spinolae, degradación, fermentación sólida. Enzymatic extracts of Beauveria bassiana, an alternative to control Metamasius spinolae (Gyllenhal Busk) under laboratory conditions ABSTRACT. We evaluated the action of enzymatic extracts of conidia and Beauveria bassiana individually and together in order to accelerate the infective process of B. bassiana on Metamasius spinolae from Milpa Alta, D. F., under laboratory conditions, as v f h f h p ¨ p ”. A b w w h6 m 100% m in all treatments without significant differences. However to assess the time of death, there were significant differences showing significant difference in mortality acceleration. The proposal to use simultaneously conidia + enzyme extracts was proposed because it probably accelerates and facilitates the degradation and penetration of the insect integument. Key words: enzymatic extracts, Beauveria bassiana, Metamasius spinolae, degradation, solid fermentation Introducción E “p ” (Metamasius spinolae Gyllenhal Busk) (Coleoptera: Curculionidae) se distribuye por todo el país (Mann, 1969). El daño lo causan las larvas que se alimentan del tejido interno del nopal; viven dentro de las pencas favoreciendo la entrada de patógenos a la planta y al alimentarse forman galerías en el interior de las pencas restándole estructura de soporte ocasionando su acame; adultos se alimentan de pencas tiernas (Orduño, 2009); la presencia de esta plaga disminuye la producción y reduce la calidad del cultivo (Mann, 1969; Muñiz, 1998; Mena-Covarrubias, 2004). El control biológico es una alternativa para el manejo de plagas, ya que no deja residuos en el medio ni en los cultivos (Sánchez et al., 2012); los hongos entomopatógenos (HE) son utilizados por su capacidad insecticida, pues producen la muerte en insectos por contacto (Assaf, 2007). Como es el caso de Beauveria bassiana, patógeno de distribución cosmopolita y de amplio espectro, capaz de causar epizootias (Alves et al., 2002). El proceso bajo el cual los HE infectan a su hospedero es mediante dos mecanismos uno físico, presión que ejerce el tubo germinativo hacia el interior del insecto y uno bioquímico donde segrega enzimas hidrolíticas como subtilisina Pr1 y Tripsina Pr2, quitinasas y un complejo enzimático del citocromo P450s, 273 que degradan la cutícula y proporcionar a su vez nutrientes al hongo (Monzón, 2001; Huang et al., 2004; Yang et al., 2007). Una de las ventajas de los extractos enzimáticos es la reducción del tiempo en el proceso infeccioso del hongo sobre el insecto y además de alterar la capacidad de alimentación de M. spinolae y por lo tanto la disminución de daños en el nopal (Sánchez et al., 2012). Los síntomas de los insectos infectados por HE son la pérdida de coordinación en sus movimientos, falta de movimiento y dejar de alimentarse para posteriormente ocasionar la muerte. La fermentación sólida es útil para producir enzimas con gran estabilidad; tiene como ventajas: uso de sustratos insolubles como fuentes de carbono y nitrógeno (Goettel et al., 1997); es un sistema simple; similar al ambiente natural de los hongos entomopatógenos; facilita la recuperación del extracto enzimático y la viabilidad de los conidios se incrementa al ser resistentes a los rayos UV (Rangel et al., 2008). El objetivo de presente trabajo fue evaluar la aplicación de conidios junto con extractos enzimáticos del cultivo sólido para acelerar el proceso infectivo de B. bassiana b “p ” (Metamasius spinolae) en el nopal verdura (Opuntia ficus indica Mill) provenientes de Milpa Alta, D.F. en condiciones de laboratorio. Materiales y Método Hongos entomopatógenos. Se utilizó la cepa de Beauveria bassiana donada por la Dra. Raquel Alatorre Rosas; se creció en agar dextrosa sabouraud a 25° C durante 7 días. Se colectaron las esporas con una solución de Tween 80 al 0.05 % y se conservaron a 4 ºC. La fermentación sólida se realizó en matraces Erlenmeyer de 250 ml usando como soporte bagazo de caña, un medio mineral de acuerdo con Barranco y cols. (2009) y como fuente de carbono cutícula de camarón (60 g l -1); los matraces contenían 35 g de materia húmeda, con una humedad inicial 75 %, pH 5.4 y temperatura de 25°C. Se inocularon con 1 x 107 esporas (g Peso húmedo)-1. Los extractos enzimáticos se obtuvieron después de 5 días de fermentación, pesando el contenido de cada matraz y se adicionó agua destilada en una proporción (1:1) se homogeneizó y se comprimió, se centrifugó a 10, 000 rpm durante 10 minutos, se almacenaron a 4ºC (Polanczyk et al, 2000). La obtención de conidios fue de una fermentación de 12 días con una solución de Tween 80 % ajustando a una cantidad de 1x108 conidios por mL (Barranco et al, 2009). Insectos. S “p ” b p q m b p parcelas de San Juan Tepenahuac, Milpa alta, D.F., posteriormente se llevaron al Insectario de la UAM-X, donde se pesaron, midieron y sexaron; se colocaron individualmente en vasos de plástico transparente de 265 ml de capacidad, se les alimentó con 20 g de nopal tierno, el cual se cambió cada dos días. Se aclimataron a 25°C y 65% HR durante 30 días. Bioensayo. Los insectos fueron inoculados mediante el método de inmersión durante 10 seg, para eliminar el exceso de humedad se dejaron sobre papel absorbente, cuando se secaron se metieron en vaso estéril y rotulado, con el nombre del tratamiento, repetición y fecha de inoculación (Fig. 2). Se usó un diseño completamente al azar, de 6 tratamientos con 5 repeticiones, los cuales fueron: Control negativo, extractos enzimáticos, conidios + extracto enzimático, conidios 1x108, control positivo (Bea Tron ®) y control positivo + extractos enzimático. Cada tratamiento se suspendió en una solución acuosa de 100 mL de Tween 80 al 0.05%. Manteniéndose en condiciones controladas de 25 ± 2° C, 65% ± 5% HR y fotoperiodo de 16 h luz. Análisis estadístico: Los datos obtenidos fueron analizados con un análisis de varianza de una vía y una prueba de ajuste de medias de Tukey, con el paquete estadístico SYSTAT9. 274 Resultados En el bioensayo realizado para evaluar la acción de conidios y extractos enzimáticos de B. bassiana producidos por fermentación sólida sobre M. spinolae, se tuvieron los siguientes resultados: en todos los tratamientos se obtuvo el 100% de mortalidad, excepto en el control negativo donde solo se produjo la muerte de uno de los individuos por causas no determinadas, no existiendo diferencia significativa en la mortalidad (Cuadro 1). Sin embargo al evaluar el tiempo que corresponde a la CL50 existen diferencias significativas que evidencian una aceleración de mortalidad 6.89 ± 1.69 con el tratamiento de extractos enzimáticos + conidios obtenidos de fermentación sólida, seguido por el control positivo + extractos de acuerdo con la prueba de Tukey. Los insectos muertos mostraron crecimiento del micelio posterior a ser inoculados vistos a través de un microscopio estereoscópico, en donde se observó el crecimiento del micelio en los espacios inter segmentales del insecto que facilitan la emergencia del hongo del interior del insecto muerto (Fig. 3). Cuadro 1. Porcentaje de mortalidad de insectos y valores de mortalidad evaluados en días. Tukey Tratamiento (A) Control negativo (Tween 80 al .05%) (B) Extracto enzimático (C) Extracto enzimático + Conidios 1x108 (D) Conidios 1x108 (E) Control positivo ( Bea Tron ® (F) Control positivo + Extracto enzimático 120 Mortalidad (Prom) 20 (ND) 80±20 100±0 100±0 100±0 100±0 20 1a 100 AyB Grupos de acuerdo a Mortalidad (días) 10±1.35B 6.8±1.69A 12.8±4.44B 13±0.41B 8.5±0.5A 1b 15 80 60 10 40 5 20 0 0 A B C D E F B C D E F Figura 1a y 1b. Graficas de las desviaciones estándar de mortalidad (Prom) y mortalidad en días del efecto de B. bassiana sobre M. spinolae en el cultivo del nopal Discusión Existe escasa literatura sobre la utilización de extractos enzimáticos que se obtienen en el cultivo sólido junto cuando se producen conidios a través de este sistema. La propuesta en que se utilizan simultáneamente conidios (cultivo sólido y producto comercial) + extractos enzimáticos acelera el proceso infectivo debido probablemente a que facilita la penetración de la superficie de la cutícula porque sufre un proceso de degradación que permite al conidio, el apresorio y el tubo germinativo del hongo encuentren sitios receptores específicos y la penetración mecánica y 275 enzimática. Recientemente se ha buscado estrategias que conjunten el uso de hongos entomopatógenos junto con extractos vegetales, feromonas y atrayentes (Nana et al, 2012), sin embargo cuando se utilizan extractos de Neem se ha demostrado que reducen el crecimiento de B. bassiana afectando su virulencia (Depieriet al., 2005). La ventaja de esta propuesta es que no se presenta ese problema porque son extractos enzimáticos que el mismo hongo sintetiza y de manera efectiva disminuyó el tiempo de infección, aun utilizando los extractos enzimáticos junto con un producto comercial. Figura 2. M. spinolae micosado por B. bassiana Agradecimientos Este trabajo fue apoyado por el CONACYT como becaria de la Maestría de Ciencias Agropecuarias y por la Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco con los proyectos divisionales: Insectos y ácaros de importancia Agrícola en México y Evaluación de conidios y quitinasas de hongos filamentosos producidos en cultivo sólido para su uso potencial en el control biológico y en la industria farmacéutica. A la M. C. Rosaura Luna Reyes por la revisión y sugerencias al trabajo y al Dr. Francisco Cervantes Mayagoitia, Profesor investigador del Dpto.de Producción Agrícola y Animal de la UAM-X por la revisión y comentarios al trabajo. Literatura Citada Assaf, L. H. A. 2007. Ecological study and evaluation of activity of Beauveria bassiana (Bals)Vuill and Paecilomycesfarinosus (Dicks ex Fr.) Against the poplar leaf beetle Melasoma populi L. (Ph.D thesis).University of Mosul, College of Agriculture and Forestry. Iraq. 231 pp. Barranco-Florido, J. E., P. Bustamante-Camilo., L. Mayorga-Reyes., R. González-Cervantes., P. Martínez-Cruz., A. Azaola-Espinosa. 2009. Β-N-acetylglucosaminidase production by Lecanicillium (Verticillium) lecanii ATCC 26854 by solid-state fermentation utilizing shrimp Shell. Interciencia 34:356-360. 276 Charnley, A. K. y S. A. Collins. 2007. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. In: Kubicek, C. P. and Druzhinina, I. S. Eds. The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships (2nd edition). Springer-Verlag, Berlin. 159-187 pp. Depieri, R. A., S. S. Martinez., Jr O. A. Menezes. 2005. Compatibility of the fungus Beauveria bassiana (Bals.) Vuill (Deuteromycetes) with extracts of Neem sedes and leaves and the emulsifiable oil.Neotropical Entomology 34:601-606. Goettel, M. S. y G. D. Eanglis. 1997. Fungi: Hyphomycetes, In: Lacey (Ed.) Manual of Techniques in insect Pathology. Academic Press, San Diego. 213 – 249 pp. Huang, X.W., N.H. Zhao., K.Q. Zhang, 2004. Extracellular enzymes serving as virulence factors in nematophagous fungi involved in infection of the host. Reserch in Microbiology 155: 811-816. Mann, J. 1969. Cactus-feeding insects and mites. Bulletin of the United States National Museum.256: 1-158. Mena, C. J. 2009. Bases Para Desarrollar Un Programa De Manejo Integrado Contra Las Plagas y las Enfermedades Del Nopal. En: VII Simposium-T “P oducción y Aprovechamiento del Nopal en el Noreste de México”. F A mí , UANL. N v L ó México. Revista salud pública y Nutrición. Edición especial No. 2: 18 p. Mena-Covarrubias, J. 2004. Manejo integrado de plagas del nopal: Una propuesta para tomar mejores decisiones de control. El nopal. Tópicos de Actualidad. Universidad Autónoma Chapingo. Colegio de Postgraduados.125-140 pp. Muñiz, R. 1998. Cactophagus spinolae (Glyllenhall, 1838), Picudo del nopal. Duguesiana 5: 4554. Nana, P., N. K. Maniania., R. O. Maranga., H. I. Boga., H. L. Kutima., J. N. Eloff, J.N. 2012. Compatibility between Calpurnia aurea leaf extract, attraction aggregation, and attachment pheromone and entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae on viability, growht, and virulence of the pathogen. Journal Pest Sciences. 85:109-115. Orduño, C. N. 2009. Virulencia de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae sobre Picudo barrenador del nopal Metamasius spinolae. Tesis de maestría. Colegio de Postgraduados. Campus Montecillos. Postgrado en Fitosanidad Entomología y Acarología. Edo de México. 93 p. Polanczyk, R., A. Pires ., S. R. Fiuza., L. M. 2000. Effectiveness of Bacillus thuringiensis strains against Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae). Brazilian J. Microbiology 31: 165-167 Rangel, D. E., D. G., Alston., R. D. W. 2008. Effects of physical and nutritional stress conditions during mycelial growth on conidial germination speed, adhesion to host cuticle, and virulence of Metarhizium anisopliae, an entomopathogenic fungus. Mycology Reserch 11:1355-1361. SEDEREC (Secretaría de Desarrollo Rural y Equidad para las Comunidades). Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación. 2009. Geoestadística del nopal-verdura en el Distrito Federal. Oficina Estatal de Información para el Desarrollo Rural Sustentable del Distrito Federal (OEIDRUS D.F.). México. 162 p. Villarroel Agustín, comunicación personal. 18/05/2012. Yang, J., B. Tian., L. Liang., K.Q. Zhang, 2007. Extracellular enzymes and the pathogenesis of nematophagous fungi. Applied Microbiology and Biotechnology 75: 21-31. 277 Chrysoperla carnea (STEPHEN), Chrysoperla comanche (BANKS) Y Ceraeochrysa valida (BANKS) (NEUROPTERA: CHRYSOPIDAE) COMO DEPREDADORES DE Diaphorina citri KUWAYAMA (HEMIPTERA: PSYLIDAE) Juan José Pacheco-Covarrubias y Martiniano Perales-Amador. Campo Experimental Norman E. Borlaug. Centro de Investigación Regional del Noroeste. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Calle Norman E. Borlaug km. 12. C. P. 85000 Cd. Obregón, Sonora. México. [email protected], [email protected]. RESUMEN. La capacidad de depredación de Chrysoperla comanche, Chrysoperla carnea y Ceraeochrysa valida sobre adultos y ninfas N4-5 del Psílido Asiático de los Cítricos (PAC) fue evaluada con el fin de contribuir a determinar la especie de depredador más idónea a criar con fines de liberación en campo. Los resultados indican diferencias biológicas y estadísticas entre los estados larvarios L3 y L2 en la depredación de adultos del PAC, independientemente de las especies de crisopas evaluadas. Para larvas L3, el mayor consumo de adultos correspondió a Chrysoperla comanche, seguido de Ceraeochrysa valida. En larvas L2, Chrysoperla carnea registró la menor depredación de adultos. Diferencias importantes fueron documentadas en la depredación de ninfas N4-5 del PAC por larvas L3, donde Ceraeochrysa valida registró más del doble de ninfas depredadas que Chrysoperla comanche. Para larvas L2 la especie menos eficiente fue Chrysoperla carnea. Palabras clave: Depredación, chrysopa, psílido asiático de los cítricos. Chrysoperla carnea (Stephen), Chrysoperla comanche (Banks) and Ceraeochrysa valida (Banks) (Neuroptera: Chrysopidae) as predators of adults and nymphs of Asian Citrus Psyllid ABSTRACT. Depredation of adults and nynphs N4-5 of Asian Citrus Psyllid (ACP) by Chrysoperla comanche, Chrysoperla carnea and Ceraeochrysa valida was evaluated in order to determine the best predator for field release. The data indicated biological and statistical differences between L2 and L3 larvae of lacewings as ACP adult predators; regardless of the species of lacewing evaluated. For L3 larvae, Chrysoperla comanche was the lacewing that registered the highesr adult ACP predation, followed by Ceraeochrysa valida. In L2 larvae, Chrysoperla carnea registered the lowest adult predation. Significant differences were documented for the predation of nymphs N4-5 ACP by L3 larvae, where Ceraeochrysa valida consumed more than twice nymphs than Chrysoperla comanche. Finally, for L2 larvae Chrysoperla carnea was the specie lest efficient as nymphal predator. Key words: Predation, lacewing, Asian Citrus Psyllid. Introducción El psílido asiático de los cítricos (PAC), vector de la bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus es el responsable de la enfermedad Huanglongbing o enverdecimiento de los cítricos (Mead, 2007). El Huanglongbing tiene en crisis la citricultura nacional y mundial por ser responsable de la muerte gradual de árboles de cítricos, primeramente afectando la calidad de la fruta, su producción y posteriormente la muerte del árbol (Rogers et al, 2009). La bacteria es altamente fastidiosa y se encuentra en el floema de las plantas, misma que está restringida a los cítricos y otros hospedantes cercanos como limonaria, por lo que se afirma que Candidatus Liberibacter spp. tiene un rango estrecho de hospedantes (Halbert and Keremane, 2004). A nivel mundial, las áreas citrícolas afectadas por este patógeno han resentido este problema a través de la historia de la enfermedad; mientras que en México se empiezan a documentar rápidamente los primeros daños en el cultivo de limón, ya que en abril de 2010 se encontraron los primeros árboles con síntomas de la enfermedad en una huerta comercial en la zona productora de limón mexicano de Colima; actualmente en dicha zona ya se han encontrado varias centenas de árboles enfermos en ese predio, así como plantas que muestran los síntomas 278 característicos de la enfermedad en más de 100 predios en cuatro municipios de Colima. (Flores et al, 2010). En el estado de Colima, los arboles presentan reducción de hasta el 50% en la producción de fruta. A consecuencia de falta de acciones oportunas, aunado al comportamiento fenológico del cultivo, en tan solo dos años se alcanzó una incidencia superior al 60% en la región. (Manzanilla-Ramírez et al., 2012). Desde 2002, el psílido asiático de los cítricos en México fue reportado y actualmente ya se encuentra presente en todas las zonas productoras de cítricos. El combate integrado del PAC, hace necesario explotar al máximo todas las tácticas de control dentro del Manejo Integrado de Plagas, que entre otras incluyen medidas de carácter biológico como la liberación de insectos depredadores. Chrysoperla carnea es el depredador que sobresale dentro del control biológico inducido por ser la especie más reproducida por las diferentes Juntas Locales de Sanidad Vegetal en el ámbito nacional; sin embargo, existen otras especies de crisopidos que pueden apoyar esta función y cuyo potencial en México está siendo estudiado. En este sentido, Pacheco y Perales (2012) encontraron diferencias en el número de días en el consumo de adultos del PCA, demostrando que Chrysoperla carnea es la especie que presentó el menor número de días alimentándose de adultos del PAC con siete días; seguido de Chrysoperla comanche con nueve días y finalmente Ceraeochrysa valida con diez días. Este trabajo tuvo como finalidad continuar con los estudios para documentar la capacidad de depredación de especies de crisopa sobre el PAC, con el objetivo de impulsar la cría artificial de estos depredadores de acuerdo a su capacidad de impacto en la pendiente de crecimiento poblacional del PAC. Materiales y Método El estudio se realizó en el Campo Experimental Norman E. Borlaug, del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, ubicado en el Valle del Yaqui, en Cd. Obregón, Sonora, durante el 2012. Se evaluó la capacidad de depredación de tres especies de crisopa: Chrysoperla carnea, Chrysoperla comanche y Ceraeochrysa valida, en adultos y ninfas del PAC. Para obtener el material biológico de evaluación se procedió a levantar un pie de cría de cada una de las especies de crisopa. Para tal fin, se usaron huevecillos de crisopa obtenidos en el Centro de Reproducción de Organismos Benéficos de la Junta Local de Sanidad Vegetal del Valle del Yaqui. Los huevecillos de las tres especies de crisopa, ya próximos a eclosionar, se colocaron por separado en cajas de PVC aplanadas y con cavidades individuales en cuyo fondo se agregó previamente vermiculita. Una vez que los huevecillos eclosionaron se seleccionaron las larvas recién emergidas y se cambiaron a una caja nueva a la que se le colocó una malla con pegamento en las orillas y por encima de la malla se deposito huevecillos de palomilla de los cereales (Sitotroga cerealella) para su alimentación. Las cajas con el material biológico se mantuvieron a la temperatura ambiente de laboratorio y se revisaron hasta que los depredadores alcanzaron el estado biológico de larva L2 ó L3, según el caso, para proceder a la evaluación. Los tratamientos evaluados se presentan en el Cuadro 1. La metodología de evaluación se basó en la técnica de confinamiento e infestación inducida, tanto para el caso de las tres especies de depredadores como para el psílido. 279 Cuadro 1.Tratamientos evaluados para la depredación de adultos y ninfas del Psílido Asiático de los Cítricos. INIFAP-CIRNO-CENEB. Depredador Ceraeochrysa valida Ceraeochrysa valida Ceraeochrysa valida Ceraeochrysa valida Ceraeochrysa valida Chrysoperla carnea Edo. Biol. L2 L3 L2 L2 L3 L2 Cond. AY AY AY SA AY AY Rep. 4 20 12 4 4 8 PCA Adultos Adultos N4-5 N4-5 N4-5 Adultos Chrysoperla carnea Chrysoperla carnea L3 L2 AY AY 12 12 Adultos N4-5 Chrysoperla carnea Chrysoperla comanche L2 L2 SA AY 4 4 N4-5 Adultos Chrysoperla comanche Chrysoperla comanche Chrysoperla comanche Chrysoperla comanche L3 L2 L2 L3 AY AY SA AY 20 12 4 4 Adultos N4-5 N4-5 N4-5 AY= ayuno; SA= sin ayuno Para la recolección de los adultos del PAC se usó un aspirador adaptado para su captura los cuales se obtuvieron de una colonia criada ex-profeso en plantas de cítricos dentro de las instalaciones del Campo Experimental Norman E. Borlaug. Grupos de diez adultos del PAC sin sexar (de 1 a 3 días de emergidos) fueron recolectados, entre 8:00 y 9:00 am y separados en frascos individuales, para realizar las infestaciones requeridas en la prueba de depredación de adultos. Para la prueba de depredación de adultos del PAC, en cada uno de los brotes preparados para la evaluación se introdujeron diez adultos. Las bolsas se cerraron perfectamente para evitar que se escaparan los insectos. Posteriormente, se introdujo en cada uno de los brotes una larva de crisopa recién ingresada al estado biológico L2 ó L3, según el caso, y se mantuvo en confinamiento en dicho brote por un periodo de 24 horas. Para determinar la capacidad de consumo de las larvas L2 y L3 de las tres especies de crisopa usadas en esta evaluación, sobre ninfas N4-5 del PAC, en un periodo de 24 horas, se procedió a localizar en campo infestaciones con estados inmaduros del PAC. Una vez localizados brotes con infestaciones de inmaduros, estos se depuraron para conservar solamente ninfas correspondientes a los estadios N4-5, mediante la eliminación manual de ninfas que no correspondieran a dichos estadios. El número de ninfas sometidos a depredación fue variable para cada uno de los ensayos, pero en todos los casos se aseguró que el total consumido por las larvas de crisopas fuera menor que la disponibilidad de ninfas objetivo a ser depredadas, es decir se eliminaron los tratamientos donde el consumo de ninfas fue del 100%; lo anterior, permitió que se pudiera cuantificar la capacidad de consumo por 24 horas. En todos los casos, se contabilizó bajo microscopio el total de ninfas N4-5 y las ninfas N4-5 depredadas por las larvas de crisopas. 280 El criterio tanto para adulto o ninfa N4-5 del PAC depredado por larvas de crisopa fue insecto con al menos una perforación hecha con las mandíbulas y maxilas de las especies de crisopa evaluadas. El número de repeticiones por tratamiento siendo el mínimo cuatro repeticiones, lo anterior, debido a la disposición de material biológico de evaluación. Se usó un diseño completamente al azar. Los datos se sometieron a un análisis de varianza mediante el paquete estadístico MINITAB® Release 14.13, y cuando se encontró diferencia significativa entre tratamientos se aplicó la separación de medias basada en desviación standard de Pooled a una probabilidad del 95%. Resultados y Discusión Depredación de adultos del PCA. El promedio de depredación (por un periodo de 24 h) sobre adultos del PCA por las tres especies de crisopas se presenta en el Cuadro 2. Dicha información muestra diferencias biológicas y estadísticas entre los estados larvarios L3 y L2, para los casos de Chrysoperla comanche y Ceraeochrysa valida. Cuadro 2. Promedio de adultos del psílido asiático de los cítricos depredados (24 h) por dos estadios larvarios de tres especies de crisopa, bajo condiciones de ayuno por 24 h y confinamiento. Depredador Chrysoperla comanche Ceraeochrysa valida Chrysoperla carnea Chrysoperla carnea Chrysoperla comanche Pooled desv standard = 1.972 Estadío Rep L3 L3 L3 L2 L2 L2 20 20 12 4 8 4 Adultos PAC depredados 7.50 5.90 4.41 3.75 3.50 2.75 Desv. Standard 2.83 1.80 0.99 0.85 1.30 0.50 Pooled 0.05 a b c c c c Dentro del estado biológico L3, el mayor consumo de adultos correspondió a Chrysoperla comanche, seguido de Ceraeochrysa valida y finalmente Chrysoperla carnea. Mientras que dentro del estado biológico L2 no se detectaron diferencias ni biológicas ni estadísticas entre las tres especies de crisopidos evaluados. Los anteriores resultados muestran una diferencia en consumo por estadío biológico a favor de Ceraeochrysa valida debido al ciclo de vida más largo, es decir, los días que la larva vive es mayor en el caso de Ceraechrysa valida lo que implicará un mayor consumo de presas a través de sus estados biológicos (Pacheco y Perales, 2012). Depredación de ninfas N4-5 del PCA. Por otra parte, el promedio de depredación (por un periodo de 24 h) sobre ninfas N4-5 del PCA por crisopas se presenta en el Cuadro 3. Dicha información muestra diferencias biológicas y estadísticas entre las condiciones de ayuno y no ayuno previo a la depredación por parte de las tres especies de crisopa. Bajo las condiciones de no ayuno las larvas L2 de Chrysoperla comanche registraron la menor cantidad de ninfas N4-5 depredadas; mientras que los valores obtenidos para fueron muy similares. Diferencias fueron documentadas entre los estadíos larvarios L2 y L3 en las especies de crisopidos evaluados. Las larvas L2 de Chrysoperla comanche como de Ceraeochrysa valida 281 registraron un comportamiento similar, mientras que las larvas de Chrysoperla carnea registraron la menor depredación. Cuadro 3. Promedio de ninfas N4-5 del psílido asiático de los cítricos depredados (24 h) por dos estadios larvarios de tres especies de crisopa, bajo condiciones de ayuno y sin ayuno, ambas en confinamiento. Depredador Ceraeochrysa valida Chrysoperla comanche Chrysoperla comanche Ceraeochrysa valida Chrysoperla carnea Chrysoperla carnea Ceraeochrysa valida Chrysoperla comanche *AY= ayuno 24 h; SA= sin ayuno Pooled desv standard = 4.293 Estadío Cond* Rep L3 L3 L2 L2 L2 L2 L2 L2 AY AY AY AY AY SA SA SA 4 4 12 12 12 4 4 4 N4-5 PAC depredadas 27.75 12.50 12.16 12.08 9.83 9.75 8.50 6.50 Desv. Standard 10.04 6.40 3.66 3.39 3.40 0.5 1.29 4.12 Pooled 0.05 a b b b bc bc bc c También se determinaron diferencias en el estadío L3 en las especies de crisopidos. Ceraeochrysa valida registró más del doble de ninfas depredadas que Chrysoperla comanche. Las diferencias de depredación encontradas entre las especies de crisopas estudiadas no concuerdan con lo indicadopor Pacheco-Rueda et al. (2012) quienes, no encontraron diferencia en la capacidad de depredación del PAC entre Chrysoperla comanche, C. rufilabris, C. externa y Ceraeochrysa valida. Por otra parte, Cortez et al. (2011) registran en el estado de Sinaloa la capacidad de consumo de Chrysoperla comanche, Chrysoperla rufilabris y Ceraeocrysa valida en ninfas N4-5 del PAC; sin embargo. no detectaron diferencias importantes en el consumo de ninfas grades del PAC entre las especies de crisopa evaluadas, a diferencia de este estudio donde sobresale Ceraeochrysa valida seguido de Chrysoperla comanche como especies de crisopa más activas en la depredación del PAC. Por otra parte, el registro de depredación de los diferentes estados biológicos del PAC por las diferentes especies de crisopas reportado por Cortez et al. (2011) fue muy superior al registrado en este estudio, lo anterior, probablemente debido al método entre los estudios realizados. Conclusiones Ceraeochrysa valida y Chrysoperla comanche presentan resultados interesantes como para ser considerados como opciones dentro del control biológico inducido para regular poblaciones del PAC. Agradecimientos Agradecemos a la Junta Local de Sanidad Vegetal del Valle del Yaqui, al Patronato para la Investigación y Experimentación Agrícola en el Estado de Sonora y a la Fundación Produce Sonora, A.C. el apoyo para la realización de este trabajo. 282 Literatura Citada Cortez-Mondaca E., J I López-Arroyo, L Rodríguez-Ruíz, M P Partida-Valenzuela, J PérezMárquez, V M. González-Calderón. 2011. Capacidad de depredación de especies de chrysopidae asociadas a Diaphorina citri Kuwayama en los cítricos de Sinaloa, México. 2° Simposio Nacional sobre investigación para el manejo del Psílido Asiático de los Cítricos y el Huanglongbing en México. p. 323-333. Flores, R., Robles, M. M., Velásquez, J.J. y Manzanilla, M. A. 2010. Situación Actual del Huanglongbing (HLB) en Limón Mexicano bajo las condiciones Agroecológicas de Colima. VI Simposio Internacional Citrícola. Tecomán, Colima, México. 20p. Halbert, S. E. and Manjunath Keremane L. 2004. Asian Citrus Psyllids (Sternorrhyncha: Psyllidas) and Greening Disease of Citrus. A literature Review and assessment of Risk in Florida. Florida Entomologist 87(3) 330-353. Manzanilla-Ramírez M.A., M. M. Robles-González, J. J. Velázquez-Monreal, M. Orozco-Santos y S. H. Carrillo-Medrano. 2012. Experiencias y perspectivas del Huanglongbing en limón mexicano. pp. 406-414. In: López-Arroyo, J. I., Rocha-Peña, M.A., (Ed.). Memoria: 3er Simposio Nacional sobre Investigación para el Manejo del Psílido Asiático de los Cítricos y el Huanglongbing en México, Veracruz, Veracruz, México, 10 - 12 de diciembre, 2012. Centro Regional de Investigación del Noreste (CIRNE), Campo Experimental General Terán. CD-ROM. Memoria Científica. ISBN en trámite. 450 p. Mead, F.W. 2007. Asian Citrus Psyllid, Diaphorina citri Kuwayama (Insecta: Hemiptera: Psyllidae). University of Florida. IFAS Extensión. EENY-033. Pacheco-Rueda I., J. R. Lomeli-Flores y J. I. López-Arroyo. 2012. Preferencia de presa de Chrysoperla y Ceraeochrysa (Neuroptera: Chrysopidae) sobre inmaduros del psílido asiático de los cítricos. pp. 302-309. In: López-Arroyo, J. I., Rocha-Peña, M.A. (Ed.). Memoria: 3er Simposio Nacional sobre Investigación para el Manejo del Psílido Asiático de los Cítricos y el Huanglongbing en México, Veracruz, Veracruz, México, 10 - 12 de diciembre, 2012. Centro Regional de Investigación del Noreste (CIRNE), Campo Experimental General Terán. CD-ROM. Memoria Científica. ISBN en trámite. 450 p. Pacheco-Covarrubias J.J. y M. Perales-Amador. 2012. Capacidad de Chrysoperla carnea (Stephen), Chrysoperla comanche (Banks) y Ceraeochrysa valida (Banks) (Neuroptera: Chrysopidae) como agentes de control biológico de adultos de Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). pp. 287-291. In: López-Arroyo, J.I., Rocha-Peña, M.A., (Ed.). Memoria: 3er Simposio Nacional sobre Investigación para el Manejo del Psílido Asiático de los Cítricos y el Huanglongbing en México, Veracruz, Veracruz, México, 10 - 12 de diciembre, 2012. Centro Regional de Investigación del Noreste (CIRNE), Campo Experimental General Terán. CD-ROM. Memoria Científica. ISBN en trámite. 450 p. Rogers, M.E., P.A. Stansly and L.L. Stelinski. 2009. Florida Citrus Pest Management Guide: Asian Citrus Psyllid and Citrus Leafminer. University of Florida. IFAS Extensión. ENY734. 283 AISLAMIENTO DE NEMATODOS ENTOMOPATÓGENOS NATIVOS EN CAMPOS CULTIVADOS CON MAGUEY MEZCALERO EN OAXACA Juan Reyes Delgado-Gamboa1, Jaime Ruíz-Vega1, Jorge Eugenio Ibarra-Rendón2, Teodulfo Aquino-Bolaños1, Federico Gaytán-Zárate3. 1Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional Unidad Oaxaca. IPN. Calle Hornos 1003. Santa Cruz Xoxocotlán. C.P. 71230. Oaxaca. México. [email protected]; [email protected]; [email protected]. 2Departamento de Biotecnología y Bioquímica, Centro de Investigación y Estudios Avanzados, Unidad Irapuato, 36500, Irapuato, Guanajuato, México. [email protected]. 3Instituto Tecnológico del Valle de Oaxaca. Ex-Hda de Nazareno, Xoxocotlan, Oaxaca. [email protected]. RESUMEN. Los nematodos entomopatógenos (NEP) se consideran como agentes potenciales para el control de plagas en ambientes crípticos, encontrándose en diversidad de hábitats a través del mundo. Este estudio se realizó con la finalidad de aislar juveniles infectivos (JI) de NEP nativos en campos cultivados con Agave angustifolia Haw, para su posterior utilización en el control del picudo del agave Sciphophorus acupunctatus. Se colectaron 60 muestras de suelo (1000 g de suelo c/u) en 13 comunidades en el período de marzo a junio y de septiembre a noviembre de 2012. Se utilizó la técnica de insecto-trampa con larvas de Galleria mellonella (L.). Después que se comprobó la entomopatogenicidad de los aislados utilizando los postulados de Koch, se multiplicaron en larvas de G. mellonella y almacenaron en frascos a 10°C a concentraciones de 1000 JI/ml. Se detectaron NEP en 33.3% de las muestras y de acuerdo a su coloración todas estuvieron aparentemente infectadas por especies del género Steinernema. Palabras clave: Steinernema, Galleria mellonella, juveniles infectivos, control biológico, Sciphophorus acupunctatus. Isolation of native entomopathogenic nematodes in fields planted to maguey mescal in Oaxaca ABSTRACT. Entomopathogenic nematodes (EPN) are considered a potential control agents for insects pests in cryptic habitat and are found in many habitats worldwide. This study was aimed to isolate infective juveniles (IJ) of native entomopathogenic nematodes (EPN) in fields planted to Agave angustifolia Haw in the Central Valleys of Oaxaca for control of the agave weevil Sciphophorus acupunctatus. Sixty (60) soil samples (1000 g of soil each) were collected in 13 communities in the time periods from March to june and from september to november of 2012. The technique of baiting with larvae of Galleria mellonella (L.) was used. After verifying the entomopathogenicity of the samples by Koch postulates, we multiplied in G. mellonella larvae, and stored in tissue culture flasks (1000 JI/ml ) at 10 °C. Entomopathogenic nematodes were detected in 33.3% of samples and according to the color of the dead larvae only the genus Steinernema was found. Keys words. Steinernema, Galleria mellonella, infective juvenils, biological control, Sciphophorus acupunctatus. Introducción Los nematodos entomopatógenos que habitan en el suelo se encuentran ampliamente distribuidos en diferentes ecosistemas terrestres en todos los continentes, excepto en la Antártica (Ngo-Kanga, et al., 2012). Estos son reconocidos como agentes de control biológico, particularmente contra insectos barrenadores y algunas plagas edafícolas o que presentan una fase de desarrollo en el suelo (Gaugler, 2002; Alatorre, 2010). Los nematodos entomopatógenos de las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae, son alternativas biológicas al uso de insecticidas químicos, considerando su nulo impacto sobre invertebrados, plantas, y otros organismos no plaga (Mekete et al., 2005). Pueden ser almacenados por largos períodos y mantener su viabilidad y patogenicidad hasta por 6-12 meses a temperaturas de 4-10°C. El único estadio de vida libre en el suelo es el infectivo juvenil (JI), el cual busca, infecta y mata a los insectos hospederos. El control de plagas por los steinernematidos y heterorhabditidos se debe a la asociación simbiótica con bacterias específicas del género Xenorhabdus y Photorhabdus respectivamente, ubicadas en 284 el intestino de los infectivos juveniles. Después de localizar a su hospedero susceptible el JI invade a través de las aberturas naturales (boca, ano, espiráculos, membranas intersegmentales) y penetra al hemocele (Lewis et al. 2006). Los JI liberan la bacteria, la cual causa una septicemia letal, usualmente dentro de 24-48 horas (Mekete et al., 2005). Los nematodos se alimentan de la bacteria y del cadáver en descomposición del insecto, se reproducen por 2-3 generaciones dentro del cadáver completando su desarrollo y emergen como juveniles de tercer estadio o JI, dispersándose dentro del suelo en búsqueda de nuevos hospederos (Alatorre, 2010). En México, es poca la información con respecto al potencial, identificación y distribución de nematodos entomopatógenos nativos, que puedan permitir la selección de aislamientos o especies eficaces (Salas-Luévano et al., 2001). Uno de los trabajos pioneros data de 2003, cuando en un muestreo de suelos realizado a nivel estado de Oaxaca se identificaron solo dos nematodos entomopatógenos, Heterorhabditis sp. y Steinernema feltiae (Ruiz et al., 2003). El objetivo del presente estudio fue aislar nematodos entomopatógenos nativos en zonas cultivadas con agave mezcalero de la región de Valles Centrales de Oaxaca, con el propósito de avanzar en el conocimiento de la biodiversidad existente e identificar especies con potencial biocontrolador. Materiales y Método Los Valles Centrales de Oaxaca, se localizan a una altitud de 1000-1600 msnm. Predomina el Clima semicálido-semiseco con lluvias entre abril-octubre y presenta un verano cálido con una temperatura media mensual que oscila entre 20 y 24 °C, y una precipitación media de 1000 mm (García, 1988). Muestreo de Suelos. Dentro del cultivo de agave se seleccionaron 3-5 sitios, y en cada uno de ellos se recolectaron tres muestras compuestas de suelo de 1 kg con una pala de mano; después de retirar los 5 cm superficiales, se muestreó a una profundidad de 15-20 cm, cubriendo un área de aproximadamente 20 m2, dejando al menos 100 m de separación entre cada sitio (Stock et al., 1999). Los muestreos se llevaron a cabo de marzo a junio y de septiembre a noviembre de 2012. Las muestras obtenidas de cada sitio, se mezclaron uniformemente en una cubeta y posteriormente se tomó 1 kg en una bolsa de polietileno, para evitar la pérdida de humedad, se etiquetó y colocó en una hielera (10 °C) para mantenerlas en condiciones de frío durante su traslado al laboratorio, donde se almacenaron a 5°C hasta su procesamiento y análisis en el laboratorio al día siguiente. Insecto Cebo. Para la captura de los nematodos entomopatógenos se utilizaron larvas del último instar de Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae), insecto muy susceptible al ataque de estos organismos (Bedding y Arkhust 1975). La cría de G. mellonella mantenida en una cámara (67% de humedad relativa y 29°C de temperatura), se alimentó con una dieta constituida con 40 g de salvado de trigo, 75 g de levadura de cerveza, 300 g de cereal de arroz, 120 ml de glicerina, 100 ml de miel de abeja. Los adultos se mantuvieron en frascos grandes de vidrio para la oviposición y, los huevos y larvas en recipientes de plástico rectangulares de uso doméstico (24 x 32 x 11 cm). El tiempo de obtención de estas larvas fue aproximadamente 40 días. Aislamiento de NEP. Se colocó una cantidad de 300 g de suelo en un recipiente de plástico de 500 ml, humedeciendo las muestras muy secas con agua destilada (10 %). Enseguida a cada contenedor se le agregaron cinco larvas del último estadio de G. mellonella, los cuales se 285 taparon e invirtieron, permaneciendo a temperatura ambiente (25±3°C) durante siete días (Stock et al., 1999). Después del período de incubación los cadáveres de las larvas se recolectaron, se lavaron con agua destilada estéril, y se desinfectaron superficialmente por inmersión en hipoclorito de sodio al 0.1% durante 30 segundos, después se enjuagaron tres veces en recipientes con agua destilada estéril (Woodring y Kaya, 1988). Para recolectar los juveniles infectivos que emergieron de los cadáveres, se transfirieron e incubaron en trampas de White (1927) modificada (Kaya y Stock, 1997). Los cadáveres que mostraron signos y síntomas característicos de infecciones por nematodos entomopatógenos se examinaron bajo un microscopio estereoscópico. Los cadáveres permanecieron en la trampa por una semana, esperando a que los juveniles infectivos salieran y migraran al agua. Patogenicidad y almacenamiento de NEP. Se colocaron cinco larvas del último estadio de G. mellonella sobre un papel filtro húmedo con suspensión de JI dentro de una caja Petri (100 x 15 mm), para verificar si había reinfección de acuerdo a los postulados de Koch. Los juveniles infectivos que emergieron en la trampa de White, se conservaron en matraces de 250 ml en agua destilada estéril, manteniéndolos en refrigeración a 10°C (Woodring y Kaya, 1988). Resultados y Discusión De 60 muestras analizadas se encontraron 20 con nematodos entomopatógenos (33.3%). El porcentaje de muestras positivas localizadas para cada una de las regiones en función al número de muestras recogidas se encontró 35% para Tlacolula, 30% para Ocotlán-Ejutla y 35% para Zimatlán-Zaachila (Cuadro 1). Cuadro 1. Porcentaje de localidades positivas con nematodos entomopatógenos en cinco distritos de Oaxaca. Región Tlacolula Ocotlán-Ejutla Zimatlán-Zaachila TOTALES No. de muestras No. de muestras positivas 20 20 20 60 7 6 7 20 Muestras positivas para NEP (%) 35 30 35 100 Actualmente no existe referencia de estudio en plantas de agave en el estado de Oaxaca, que sirva de comparación o referencia de caso. La presencia de nematodos entomopatógenos con 33.3% es mayor a lo reportado por Stock (1995) en la región de las pampas de Argentina (13.2%), García del Pino (1996) en la región de Cataluña España (23.3%), Stock et al., (1999) en California (26.3%), Steiner (1996) en los Alpes Suizos (27%), Mekete et al., (2005) en Etipía (6.9%), Melo et al., (2009) en Colombia (6%), González, (2006) en el Pacífico centro mexicano (23.8%). Sin embargo, esta proporción está por debajo de lo reportado por otros autores; Méndez et al., (2011) en Valle del Cauca, Colombia (36.84%) y Girón et al., (2012) en Valles centrales de Oaxaca, México (49.1%). Los nematodos aislados en las diferentes localidades se identificaron a nivel de género con base en la sintomatología que mostraron los cadáveres, de acuerdo a la coloración de los 286 insectos infectados, que a menudo son flácidos y de color crema. Kaya y Stock (1997) mencionan que larvas de G. Mellonella infectadas con nematodos entomopatogenos del género Steinernema spp., muestran una coloración creomosa a gris pardo. Para este estudio la prevalencia de 100% de nematodos entomopatógenos del género Steinernema en las muestras de suelo indican una alta incidencia de estos organismos, lo cual concuerda con Stock et al., (1999), quienes reportan 80% de Steinernema, así mismo, Ruiz-Vega et al., (2003) reportan 67% de prevalencia del género Steinernema en muestras de suelo y Girón et al., (2012) reportaron a su vez 81% de Steinernema. Posteriormente se realizará la caracterización molecular de los NEPs aislados, así como la determinación de su potencial biocontrolador mediante bioensayos. Conclusiones Los nematodos entomopatogenos fueron detectados en 33.3% de las muestras, con base en la coloración de las larvas muertas, solo se identificó el género Steinernema. Literatura Citada Alatorre, R. R. 2010. Nematodos entomopatógenos. XXI Curso Nacional de Control Biológico. Sociedad Mexicana de Control Biológico. 8 al 10 de Noviembre de 2010. Uruapan Michoacán, México. Bedding, R. A.; Akhurst, R. J. 1975. A simple technique for the detection of insect rhabditid nematodes in soil. Nematologica 21: 109-110. García, E. 1998. Modificaciones al sistema de clasificación climática de Koppen. (Para adaptar a las condiciones climáticas de la República Mexicana). UNAM. México. p. 246. García del Pino F. y Palomo, F. A. 1996. Natural occurrence of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinermatidae and Heterorhabditidae) in Spanish soils. J. Invertebr. Pathol. 68:84-90. Gaugler, R. 2002. Entomopathogenic Nematology. CABI Publishing, Wallingford, UK. González, R. M. 2006. Presencia, identificación y patogenicidad de nematodos entomopatógenos (Rhabditidae: Heterorhabditidae, Steinermatidae) aislados de suelos del Pacífico Centro Mexicano. Tesis de Doctorado en Biotecnología. Universidad de Colima, Tecomán Mexico, 2006. 121-122 p. Girón, P.S., Ruiz, V.J., Pérez, P.R., Sánchez, G.J.A. y Aquino, B.T. 2012. Isolation of entomopathogenic nematodes and control of Phyllophaga vetula Horn in Oaxaca, Mexico. African Journal of Biotechnology. 11(99), pp. 16525-16531. Kaya, H. K.; Stock, S. P. 1997. Techniques of insect nematology. pp. 281-324. En: Lacey, L. (Eds.). Manual of techniques in insect pathology. Biological Techniques Series. Capítulo VI. Academic Press, San Diego, California. 409 p. Mekete, T., Gaugler, R., Nguyen, K. B., Mandefro, W., y Tessera, M. 2005. Biogeography of entomopathogenic nematodes in Ethiopia. Nematropic 35:31-36. Melo, M., Ortega, O., Susurluk, A., Gaigl, A., y Bellotti, A. 2009. Poblaciones nativas de nematodos entomopatógenos (Rhabditida) en cuatro departamentos de Colombia. Revista Colombiana de Entomología 35 (1): 28-33 (2009). Méndez, B. A., Olaya, R. G., y Caicedo. V. A. 2011. Aislamiento de nematodos entomopatógenos en áreas de buenaventura, valle del cauca, Colombia. Fitosanidad. 153157. 287 Ngo- Kanga, F., Waeyenberge, L., Hauser, S. y Moens, M. 2012. Distribution of entomopathogenic nematodes in Southern Cameroon. Journal of Invertebrate Pathology 109:41–51. Ruiz-Vega, J., Aquino, B. T., Kaya, H. K. y Stock, P. 2003. Colecta y evaluación de nemátodos entomopatógenos para el control de gallinas ciegas Phyllophaga vetula (Horn) en Oaxaca, México. Folia Entomol. Mex. 42: 169-175. Salas-Luévano, M. A., González, R. M., Lezama, R., Rebolledo, D. O. y Molina, O. J. 2001. Existencia de Nematodos entomopatógenos (Steinernematidae y Heterorhabditidae) en agrosistemas del cañon de Juchipila Zacatecas, México. 5as. Jornadas de Investigación. Universidad de Zacatecas. 25 al 29 de Junio de 2001. Steiner, W. A. 1996. Distribution of entomopathogenic nematodes in the Swiss Alps. Rev. Suisse Zool. 103 (2): 439.452. Stock, S. P. 1995. Natural populations of entomopathogenic nematodes in the pampean region of Argentina. Nematropica. 25: 143-148. Stock, S.P., Pryor, B.M. y Kaya, H.K. 1999. Distribution of entomopathogenic nematode (Steinernematidae and Heterorhabditidae) in natural habitats in California, USA. Biodiversity Conservation 8: 535-549. White, G. F. 1927. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science 66:302-303. Woodring, J. L. y Kaya, H. K.1988. Steinernematid and Heterorhabditid nematodos. A handbook of biology and techniques. Soutern Cooperative Series Bulletin 331, Arkansas Agricultural Experiment Station, Fayetteville, AK. 30pp. 288 ENTOMOTOXICIDAD DE EXTRACTOS DE LIRIO ACUÁTICO Eichhornia crassipes SOBRE EL GUSANO FALSO MEDIDOR Trichoplusia ni (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) Antonio Flores-Macías1, Miguel Angel Ramos-López2, Silvia Rodríguez-Navarro1, María Guadalupe RamosEspinosa1, Juan Esteban Barranco-Florido3. 1Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco, Departamento de Producción Agrícola y Animal, Calzada del Hueso 1100, Col. Villa Quietud, C.P. 04960, México D.F., 2Universidad Autónoma de Querétaro, Facultad de Química, Cerro de las Campanas s/n, Santiago de Querétaro, Querétaro, C.P. 76010., 3Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco, Departamento de Sistemas Biológicos. [email protected] RESUMEN. La investigación tuvo la finalidad principal de evaluar la toxicidad de cinco extractos (metanol, hexano, acetato de etilo, diclorometano y agua) de la planta E. crassipes (lirio acuático) sobre el insecto plaga T. ni (gusano falso medidor). Los datos obtenidos de los bioensayos mostraron que los extractos obtenidos con solventes de polaridad media (acetato de etilo y diclorometano) mostraron una toxicidad significativamente superior que los demás tratamientos. Ello pudiera significar que estos extractos tienen un alto potencial para ser utilizados como insecticidas botánicos en el combate del insecto plaga mencionado. Estudios de campo complementarios son necesarios para determinar si la insecticida se mantiene en condiciones de campo no controladas Palabras clave. Lirio acuático, entomotoxicidad, insecto plaga, falso medidor de lechuga. Entomotoxicity of extracts from water hyacinth Eichhornia crassipes on cabbage looper Trichoplusia ni (Lepidoptera: Noctuidae) ABSTRACT. The aim of this research was to assess the toxicity of five extracts (methanol, hexane, ethyl acetate, dichloromethane and water) from the plant E. crassipes (water hyacinth) on the insect pest T. ni (cabbage looper). Data from the bioassays showed that extracts obtained with medium polarity solvent (ethyl acetate and dichloromethane) showed a significantly higher toxicity than the other treatments. This could mean that these extracts have a high potential for use as botanical insecticides in controlling the mentioned insect pests. Complementary field studies are needed to determine if the insecticide effect remains under uncontrolled field conditions. Key words. Water Lily, entomotoxicity, insect pest, cabbage looper. Introducción Hoy en día la necesidad no sólo es producir alimentos para una población creciente, sino asegurar que estos sean saludables y sostenibles. Uno de los componentes que forman parte del sistema agrícola, que merma su producción, es la presencia de plagas. Si bien los insecticidas químicos han permitido un control eficaz de estas (Gelman et al., 2001), se ha establecido que estos compuestos son altamente perjudiciales para la salud humana y los ecosistemas, por su persistencia en el ambiente, favorecen que los insectos plaga sean resistentes a ellos, lo que ha motivado el uso de dosis cada vez mayores o de productos cada vez más tóxicos. Esto ha generado una gran preocupación en el ámbito mundial, por lo que ahora los científicos se enfrentan a la necesidad de buscar alternativas efectivas y ecológicamente menos nocivas al entorno para el control de plagas. Una de las alternativas a este problema, es la utilización de insecticidas botánicos, que son extractos naturales obtenidos a partir de plantas que causen la muerte de los insectos (acción insecticida) o que interfieran con su desarrollo (acción insectistática). El objetivo de éstos, es reducir la dependencia de químicos sintéticos, sin que ello este asociado a una disminución de la productividad en campo (Gelman et al., 2001; Tamez et al., 2001). Se ha mencionado que los insecticidas botánicos tienen un mayor potencial de 289 aplicación en los países en desarrollo debido a que en éstos existe un conocimiento ancestral y práctica tradicional sobre la utilización de plantas (Isman, 2008). La práctica de usar aceites esenciales de plantas, por sus cualidades medicinales y sus propiedades insecticidas, obtenidos a través de destilación mediante vapor, se remonta al menos a dos milenios entre las culturas china, egipcia, griega e india (Isman, 2006). En este sentido, México tiene una cultura y experiencia ancestral en la utilización de plantas para ambos fines. La investigación y tecnología moderna han demostrado que ciertos aceites esenciales de plantas y/o sus constituyentes tienen un amplio espectro de actividad contra insectos y ácaros plaga, patógenos de plantas, hongos y nematodos (Isman, 2000; Miresmailli, 2006). Sin embargo, la investigación a realizar con plantas con capacidad insecticida tiene un enorme potencial por desarrollar, especialmente en países con una gran biodiversidad como es el caso de México. Los avances tecnológicos han permitido un gran adelanto en el estudio de los metabolitos secundarios obtenidos a partir de plantas, que son constituyentes primarios de los insecticidas botánicos, los que se perfilan para ser un componente principal en el logro de una producción de alimentos sostenible. La planta E. crassipes ha sido un problema en los ecosistemas acuáticos, de donde al ser extraída se convierte en desperdicio costoso de manejar. Por ello, se han realizado trabajos orientados a utilizarla como materia prima; éste es el caso de su empleo como material de investigación en el área de los insecticidas botánicos (Jayanthi et al., 2012). Lo anteriormente expuesto es la razón principal por la cual se desarrolló la presente investigación, en la que el objetivo principal fue evaluar la actividad insecticida de los extractos obtenidos a partir de la planta E. crassipes (lirio acuático) sobre el insecto plaga T. ni (gusano falso medidor). Materiales y Método Obtención de extractos.Para la obtención de los extractos se utilizaron disolventes, que se constituyeron en los tratamientos evaluados en la investigación (agua, metanol, hexano, cloruro de metileno y acetato de etileno). El trabajo se inició con la recolección de material vegetal obtenido de los canales de Xochimilco, el cual se secó a la sombra. Se pesó 1 Kg de tejido foliar, el que se molió manualmente en un mortero de ágata; posteriormente se mezcló con 500 ml de metanol, se dejó reposar 24h y se procedió a realizar la separación mediante ebullición durante 4 h, se filtró y el disolvente se eliminó a presión reducida en un evaporador rotatorio. El disolvente terminó de evaporarse utilizando una corriente de nitrógeno inyectado mediante una terminal tipo aguja. El extracto de guardó dentro de un frasco color ámbar y se refrigeró a 4oC hasta su utilización. Un gramo del extracto obtenido fue separado mediante la técnica del embudo de separación, para lo cual se le mezcló con 45 mL de metanol, 5 mL de agua y 50 mL de hexano, se agitó manualmente durante un minuto y se dejó reposar dentro del embudo. Este procedimiento y el de los disolventes descritos a continuación se repitieron tres veces. Las primeras soluciones obtenidas fueron una con hexano y la otra con metanol. A esta última se le agregaron 60 mL de agua y 50 mL de cloruro de metileno (diclorometano), se volvió a agitar durante un minuto y se dejó reposar nuevamente durante el mismo tiempo. La solución de cloruro de metileno se guardó en un frasco ámbar, mientras que la solución restante se colocó en el rotovapor para eliminar el metanol existente. La solución restante se mezcló con 50 mL de acetato de etileno y se dejó 290 reposar durante el tiempo antes mencionado, para posteriormente obtener por diferencia de densidad en el embudo otras dos soluciones; la de acetato de etileno y la de agua. Todas las soluciones fueron evaporadas utilizando el rotovapor para obtener un sólido de cada una, el cual fue pesado al final del proceso. Bioensayos. La especie Trichoplusia ni (Lepidoptera: Noctuidae fue obtenida de colonias establecidas por más 50 generaciones, las que estuvieron en una cámara bioclimática a 24 0C y periodo de 16:8 horas luz:oscuridad. Para determinar la toxicidad de los extractos, se realizaron aplicaciones tópicas sobre larvas del tercer instar. Diez larvas fueron colocadas en una caja de Petri de 10 cm de diámetro que tenía un papel filtro en su fondo. Mediante una microjeringa se aplicó 1 µL de solución metanólica al 1%, previamente preparada para cada uno de los cinco extractos. Cada larva por separado fue introducida en una caja de Petri con papel filtro en el fondo, colocando 5 g de dieta artificial (No. 9795, Bio-Serve Inc., Frenchtown, NJ. USA). Para el tratamiento control se utilizó sólo metanol. Los tratamientos fueron distribuidos al azar dentro de una cámara bioclimática en las mismas condiciones a las anteriormente indicadas. Después de un periodo de 24 h se realizó un conteo de larvas vivas y muertas, con las que se determinó la mortalidad. Análisis estadísticos. Los datos obtenidos fueron sometidos a pruebas de normalidad (prueba de Shapiro-Wilk W) y homosedasticidad (prueba de Welch), análisis de varianza (p≤0.05) p b f m (T k ≤0.05): E á ó programa de análisis estadístico (SAS, 2001). Resultados y Discusión La toxicidad ocasionada por los seis tratamiento varío desde un porcentaje bajo (17.6%) hasta uno alto (90.9%). El extracto con hexano como solvente fue el tratamiento que ocasionó la menor mortalidad, seguido por el control (metanol), mientras que el extracto crudo y el de agua presentaron el mismo porcentaje. El extracto obtenido con acetato de etilo y el de cloruro de metileno fueron los que lograron un mayor porcentaje de mortalidad (Fig. 1). El análisis de varianza indicó que se rechaza la hipótesis nula y se acepta la alterna, lo que indica que existe una diferencia entre los tratamientos. La prueba de diferencia de medias muestra q f í (T k ≤0.05). m ad ocasionada por el tratamiento diclorometano y acetato de etileno, pero si entre estos dos respecto a los demás extractos y control. El mismo tipo de análisis muestra que no hay diferencia significativa entre el control y los extractos obtenidos con el disolvente hexano, agua y extracto crudo. El trabajo de Jayanthi (2012) evaluó extractos de éter de petróleo, acetona, acetato de etilo, metanol y etanol, encontrando que la fracción de etanol mostró la más alta actividad larvicida y pupicida contra Culex. quinquefasciatus. En comparación con los resultados obtenidos en el presente trabajo, los tratamientos que ocasionaron mayor mortalidad fueron obtenidos con disolventes que ocupan posiciones intermedias en cuanto a su polaridad, esto es, no son poco polares (como el hexano) ni muy polares (como el agua, metanol y el etanol). Ello hace suponer que los metabolitos presentes en las soluciones de diclorometano y acetato de etilo fueron removidos cuando se utilizaron los otros disolventes estudiados. Se ha encontrado que E. crassipes es una planta que absorbe elementos contaminantes (Chatterjee, 2011) que pudieron influir en el efecto tóxico evaluado en el presente trabajo. Sin embargo, esto no fue investigado y más trabajos serán necesarios para determinar esta variable que pudiera afectar la capacidad insecticida de los extractos estudiados. 291 Mortalidad (%) 100.0 90.9 80.0 * * 60.0 40.0 20.0 73.7 29.2 17.6 29.2 10.7 0.0 Tratamiento Figura 1. Mortalidad larval promedio de T. ni ocasionada por los diferentes extractos obtenidos a partir de E. crassipes (* indica igualdad entre tratam T k ≤0.05). Conclusiones Se requiere de la realización de más trabajos para determinar con mayor precisión el potencial insecticida de los extractos de E. crassipes, principalmente, realizando bioensayos de toxicidad sobre otras especies de insectos plaga. Sin embargo, los resultados de la presente investigación muestran que la planta tiene capacidad para producir metabolitos que pueden ser utilizados como un insecticida botánico, cuando sus compuestos son extraídos empleando los disolventes de polaridad media como el acetato de etilo y el diclorometano. Posteriores pruebas de campo son indispensables para determinar si la toxicidad permanece constante bajo condiciones diferentes a las estudiadas en condiciones de laboratorio. Agradecimientos Expresamos nuestro reconocimiento y agradecimiento al Dr. Martín López Hernández del ICMyL de la Universidad Nacional Autónoma de México por su colaboración en el manejo de datos y sus valiosas sugerencia que mejoraron el presente manuscrito. Literatura Citada Gelman, D. B., Blackburn, M. B., Hu, J. S. 2001. Timing and ecdysteroid regulation of the molt in last instar greenhouse whiteflies (Trialeurodes vaporariorum). J. Insect Physiol. 48:6373. Isman, M. 2000. Plant essential oils for pest and disease management. Crop Prot. 19 (2000) 603608 Isman, M. 2008. Perspective Botanical insecticides for richer, for poorer. Pest Manag. Sci. 64: 811 Isman, M. B. 2006. Botanical insecticides, deterrents, and repellents in modern agriculture and an increasingly regulated world. Annu. Rev. Entomol. 2006. 51:45–66 Jayanthi P, Lalitha P, Aarthi N. 2012. Larvicidal and pupicidal activity of extracts and fractionates of Eichhornia crassipes (Mart.) Solms against the filarial vector Culex quinquefasciatus Say. Parasitol Res. 111(5):2129-35. doi: 10.1007/s00436-012-3061-0 292 Miresmailli, S., Bradbury, R., Murray, I. 2006. Comparative toxicity of Rosemarinus officinalis L. essential oil blends of its major constituents against Tetranychus urticae Koch (Acari: Tetranychidae) on two different host plants. Pest Manag. Sci. 62:366-371. Chatterjee S., Chetia M., Singh L, Chattopadhyay B., Datta S., Mukhopadhyay SK. 2011. A study on the phytoaccumulation of waste elements in wetland plants of a Ramsar site in India. Environ Monit Assess. 178(1-4):361-71. doi: 10.1007/s10661-010-1695-x. SAS. 2001. SAS User´s Guide: Statistics. SAS Institute Inc. 8th Edition, North Carolina, Cary. Tamez, G.P., W.L.J. Galán, R.H. Medrano, G.C. García, P.C. Rodríguez, F.R.A. Gómez, G.R. 2001. Bioinsecticidas: su empleo, producción y comercialización en México. Ciencia UANL Vol, 2:143-152. 293 EVALUACIÓN DEL EXTRACTO CLOROFÓRMICO DE Salvia keerlii (LAMIACEAE) CONTRA EL GUSANO COGOLLERO DEL MAIZ Spodoptera frugiperda (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) Miguel Angel Ramos-López1, Antonio Flores-Macías2, Diana Romo-Asunción3, Cesáreo Rodríguez-Hernández4, Juan Ramiro Pacheco-Aguilar1, Ramón Álvar Martínez-Peniche1. 1Universidad Autónoma de Querétaro, Facultad de Química, Cerro de las Campanas s/n, Santiago de Querétaro, Querétaro, C.P. 76010., 2Universidad Autónoma Metropolitana unidad Xochimilco, Departamento de Producción Agrícola y Animal, Calzada del Hueso 1100, Col. Villa Quietud, C.P. 04960, México D.F., 3Exalumna de la licenciatura de Agronomía, Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco, Calzada del Hueso 1100, Col. Villa Quietud, C.P. 04960, México D.F., 4Colegio de Postgraduados en Ciencias Agrícolas, Campus Montecillos Km 36.5 Carretera México-Texcoco, Texcoco, Estado de México, C.P. 56230. RESUMEN. Se evaluaron las actividades insectistática e insecticida del extracto clorofórmico de las partes aéreas de Salvia keerlii (Lamiaceae), desde larva de primer instar hasta la emergencia de adultos del gusano cogollero del maíz Spodopterafrugiperda (Lepidoptera: Noctuidae). El extracto mostró ambas actividades. La viabilidad larval media fue (VL50) de 1527 ppm. A 1000 ppm la actividad insectistática aumento las fases larval/pupal en 4.9/3.1 d respectivamente, y el peso pupal disminuyó 16.4%. Estos resultados indican que este extracto puede ser usado para controlar S. frugiperda, por presentar actividad insecticida e insectistática contra este insecto plaga. Sin embargo, deberán hacerse evaluaciones extras para determinar si el comportamiento insecticida e insectistático se conservan bajo condiciones de campo. Palabras clave: insectistático, insecticida, gusano cogollero de maíz, Salvia keerlii. Chloroformic extract evaluation of Salvia keerlii (Lamiaceae) against fall armyworm Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) ABSTRACT. Insectistatic and insecticidal activities of aerial parts of chloroform extract from Salvia keerlii (Lamiaceae) were evaluated from first larval instar to adult emergence of fall armyworm Spodopterafrugiperda (Lepidoptera: Noctuidae). The extract showed both activities. Its larvae viability fifty was VL50 1527 ppm. At 1000 ppm the insectistatic activity augmented the larval/pupal phase 4.9/3.1 d respectively, and the pupal weight was diminished 16.4%. These results indicate that this extract may be used to control S. frugiperda due to their insecticide and insectistatic activities against this insect pest. However, further research must be done in order to determine if this activity remains under field conditions. Key words: insectistatic, insecticide, fall armyworm, Salvia keerlii. Introducción El gusano cogollero del maíz Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) es la principal plaga que afecta al maíz, pero también ataca a otras 50 especies de plantas (Arana, 1996; Molina et al., 2003); el abuso en el uso de insecticidas químico sintéticos para su control ocasiona contaminación y resistencia por lo que se deben implementar medidas biorracionales (Mareggiani, 2001). Muchas sustancias químicas vegetales tienen actividad insectistática y/o insecticida (Rodríguez-Hernández y Vendramim, 1996). De la familia Lamiaceae ya se han reportado varios géneros y especies con actividad insectistática y/o insecticida (Khalfiet al., 2006; Sanon et al., 2006; Kotan et al., 2008). Con el uso de sustancias vegetales para el control de insectos que son plaga como S. frugiperda se reduce la probabilidad de generar resistencia ya que ejercen menor presión selectiva (Saxena, 1986). Por lo que la finalidad de la presente investigación fue la de determinar la actividad insectistática e insecticida del extracto clorofórmico de Salvia keerlii (Lamiaceae) en larvas de primer instar de S. frugiperda. 294 Materiales y Método Se colectaron partes aéreas de S. keerlii en el municipio de Guadalcazar, San Luis Potosí, se dejaron secar a la sombra a temperatura ambiente por 15 días y posteriormente se molieron en una licuadora casera de la marca Osterizer (Modelo 4127). Para la preparación del extracto se realizó un matraz balón de 2 L, donde se colocaron 200 g de partes aéreas (hojas y tallos) de la planta seca y molida, luego se agregaron 4 L de cloroformo, la extracción se puso en posición de reflujo durante 4 horas a temperatura de ebullición, posteriormente el disolvente se filtro y se eliminó a presión reducida en un evaporador rotatorio y finalmente se colocó en una estufa de vacío por 4 h de acuerdo con (Pérez-Gutiérrez et al., 2012). Al extracto clorofórmico de S. keerlii se le realizaron las siguientes pruebas fitoquímicas: 1] alcaloides (ácido Silicotungstico y reactivo de Meyer), 2] cumarinas (fluorescencia con H2SO4), 3] flavonoides (H2SO4 concentrado y reactivo Dimroth), 4] lignanos (FeCl3 y H2SO4), 5] q (N OH/HC α f /M OH/HC ), 6] m (N OH H2SO4), 7] esteroles (reactivo Salkoscky y reactivo Liebermann/Burchard) y 8] terpenos (reactivo Noller). Para la prueba de la actividad biológica se utilizaron larvas de primer instar de S. frugiperda realizando pruebas preliminares para determinar las concentraciones a utilizar en el experimento final. Las variables a evaluar fueron la viabilidad larval y pupal, en (%), el peso de pupa (mg), y la duración larval y pupal en (días), así como la viabilidad larval media (VL50) (Ramos-López et al., 2010). Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con 24 repeticiones por tratamiento; realizando un análisis de varianza y la comparación entre medias de los tratamientos (T k ≤ 0.05) pq í S YSTAT 9. Resultados Al realizarle a este extracto las pruebas fitoquímicas, dieron positivo para flavonoides, lignanos, y esteroles. Actividad insectistática. El extracto clorofórmico de S. keerlii retardo la formación de pupas o sea, incrementó la fase larval 10.8, 9.5, 5.9, 4.9 y 2.6 días con respecto al control a 5000, 4000, 2000, 1000 y 500 ppm; la fase pupal también se vio afectada al aumentarse el periodo de tiempo en emerger los adultos en 4.4, 3.4, 3.2, 3.1 y 2.3 días con las concentraciones anteriores. Las pupas formadas después de 24 horas alcanzaron menor peso que las pupas del control, reduciéndose su peso 40.9, 38.7, 29.8 y 16.4% con las concentraciones mencionadas (Cuadro 1). Actividad insecticida. El bioensayo de la actividad insecticida del extracto clorofórmico de S. keerlii mostró a las concentraciones de 5000, 4000, 2000 y 1000 ppm 12.5, 16.7, 37.5 y 58.3% de pupas formadas o sea de viabilidad larval y con las cinco concentraciones evaluadas 5000, 4000, 2000, 1000 y 500 ppm se afectó la viabilidad pupal alcanzando solo el 4.2, 4.2, 25, 37.5 y 62.5% de adultos emergidos, la VL50 fue de 1527 ppm (Cuadro 2). Discusión Nuestros resultados mostraron que el extracto clorofórmico de S. keerlii presentó actividad insectistática e insecticida contra larvas de S. frugiperda. Otros autores han reportado que el extracto realizado con diclorometano a las partes aéreas de la especie Salvia cabulica (Lamiaceae) mostró 80% de mortalidad de adultos de Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae), al evaluarse 200 mg de extracto disueltos en 3 mL de acetona, sobre 10 insectos 295 adultos (Rashid et al., 2009), por otro lado el extracto acuoso al 5% de las partes aéreas de Salvia karwinskiiy y de Salvia polystachya (Lamiaceae) mostró poca actividad insectistática e insecticida en larvas de Leptophobia aripa elodia (Lepidoptera: Pieridae) al reportarse 7% de repelencia y 13% de mortalidad con ambas especies(Ramírez-Moreno et al., 2001). Cuadro 1. Duración larval y pupal y peso de pupa de S. frugiperda con el extracto clorofórmico de las partes aéreas de S. keerlii. Concentración Duración (días) Peso Pupa ppm larva pupa (mg) 5000 32.0±0.6* 14.0±ND* 126.0±24.1* 4000 31.3±1.3* 13.0±ND* 141.8±16.8* 2000 27.7±0.6* 12.8±0.3* 162.3±18.1* 1000 26.7±0.6* 12.7±0.2* 193.3±7.2* 500 24.4±0.6* 11.9±0.2* 217.2±4.0 0 21.8±0.6 9.6±0.2 231.2±4.2 *=diferencia significativa respecto al control. Cuadro 2. Viabilidad larval y pupal de S. frugiperda con el extracto clorofórmico de las partes aéreas de S. keerlii. Concentración Viabilidad (%) ppm larva pupa 5000 12.5±6.9* 4.2±ND* 4000 16.7±7.7* 4.2±ND* 2000 37.5±10.1* 25.0±9.0* 1000 58.3±10.3* 37.5±10.1* 500 79.2±8.5 62.5±10.1* 0 91.7±5.8 87.5±6.9 VL50 1527 ppm VL50= Viabilidad Larval Media; *=diferencia significativa respecto al control. Este trabajo muestra que el extracto clorofórmico de S. keerlii puede ser un prometedor insecticida contra S. frugiperda. El género Salvia contiene algunos compuestos bioactivos como flavonoides, aceites esenciales, diterpenos y triterpenos, que pueden presentar actividad antialimentaria en insectos (Tomás-Barberan y Wollenweber, 1990). Conclusiones Es necesario continuar con este trabajo con la finalidad de encontrar al menos un principio activo que sea el responsable de la actividad insectistática y/o insecticida del extracto 296 clorofórmico de S. keerlii contra larvas de S. frugiperda, así como seguir explorando si este extracto tiene alguna actividad en otros insectos plaga. Literatura Citada Arana E, Sánchez J, Peferoen M, Güereca L, Bravo A. 1996.Interactions of Bacillus thuringiensis crystal proteins with the midgut epithelial cells of S. frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae). J. Invertebr. Pathol. 68: 203-212. Khalfi O, Benyoussef E, Yahiaoui N. 2006. Extraction, analysis and insecticidal activity of spearmint essential oil from Algeria against Rhyzopertha dominica (F.).J. Ess. Oil-Bearing Plants. 9(1): 17-21. Kotan R, Kordall S, Cakir A, Kesdek M, Kaya Y, Kilic H. 2008. Antimicrobial and insecticidal activitues of essential oil isolated from Turkish Salvia hydrangea D.C. Benth. Biochem.Systemat. Ecol. 36: 360-369. Mareggiani G. 2001.Manejo de insectos plaga mediante sustancias semioquímicas de origen vegetal. Man. Inte. Plag. 60: 22-30. Molina J, Carpenter J, Heinrichs E, Foster J. 2003. Parasitoids and parasites of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas and Caribbean Basin: an inventory. Flor. Entomol. 86: 254-89. Pérez-Gutiérrez S, Zavala-Sánchez MA, González-Chávez MM, Cárdenas-Ortega NC, RamosLópez MA. (2011). Bioactivity of Carica papaya (Caricaceae) against Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae). Molecules 16(9): 7502-7509. Ramírez-Moreno LA, García-Barrios LE, Rodríguez-Hernández C, Morales HE, Castro RAE (2001). Evaluación del efecto insecticida de extractos de plantas sobre Leptophobia aripa elodia. Man. Integr. Plagas, 60: 50-56. Ramos-López MA, S. Pérez G, Rodríguez-Hernández C, Guevara-Fefer G, Zavala-Sánchez MA. 2010. Activity of Ricinus communis (Euphorbiaceae) against Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae). Afr. J. Biotech. 9(9): 1359-1365. Rashid R, Mukhtar F, Mohammad MN (2009). Biological screening of Salvia cabulica. Pak. J. Bot., 41(3): 1453-1462. Rodríguez-Hernández C, y Vendramim JD. 1996. Toxicidad de extractos de Meliaceae en Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae). Man. Integ. Plag. 42: 14-22. Sanon A, Iboudo Z, Dabire CLB, Nebie RCH, Dicko IO, Monge JP. 2006. Effect of Hyptisspicigera Lam (Labiatae) on the behaviour and development of Callosobruchus maculatus F. (Coleoptera: Bruchidae), a pest of stored cowpeas. Int. J. Pest Manag. 52(2): 117-123. Saxena RC. 1986. Antifeedants in Tropical Pest Managament. Insect Sci. Applic. 8: 731-6. Tomás-Barberán FA, Wollenweber E (1990). Flavonoid aglycones from the leaf surfaces of some Labiatae species. Plant Syst. Evol., 173: 109-118. 297 DETERMINACIÓN DE LA VIRULENCIA DE LA CEPA 148 DE Bacillus thuringiensis Y Ma-156 DE Metarhizium anisopliae SOBRE Diatraea magnifactella DYAR Alejandra Isabel Buenosaires-Álvarez1; Guadalupe Peña-Chora2; Luis Ángel Rodríguez-Del Bosque3. 1Faciltad de Ciencias Agropecuarias 2Centro de Investigaciones Biológicas 3Centro de Investigaciones en Biotecnología. Universidad Autónoma del Estado de Morelos. Av. Universidad 1001. Col. Chamilpa. Cuernavaca, Morelos. CP. 62209.3 Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Progreso5, Barrio de Santa Catarina, Delegación Coyoacán México, D.F. C.P. 04010. [email protected]. RESUMEN. La caña de azúcar Saccharum officinarum (Poaceae) es uno de los cultivos más importantes en México; sin embargo, su producción se ve disminuida por las plagas que la atacan, principalmente Diatraea magnifactella. En busca de métodos alternativos para el control de barrenadores se han encontrado bacterias y hongos entomopatógenos, por lo cual se buscó determinar la CL50 de la cepa B-148 de B. thuringiensis y la cepa Ma156 de M. anisopliae sobre D. magnifactella, por medio de bioensayos en laboratorio y su posterior análisis PROBIT. Se obtuvo una CL50 de 2322.612 ng/cm2 la cepa B-148 de B thuringiensis evaluada en hojas de caña y de 4381.394 ng/cm sobre hojas de maíz. Para la cepa Ma156 de M. anisopliae se obtuvo una CL50 de 1.8359x10 7 conidios/ml en caña y de 2.0518 x10 8 conidios/ml en maíz. Palabras clave: Virulencia, Bacillus thuringiensis, Metarhizium anisopliae y Diatraea magnifactella. Virulence of Bacillus thuringiensis 148 and ma-156 of Metarhizium anisopliae ON Diatraea magnifactella ABSTRACT. Sugarcane Saccharum officinarum (Poaceae) is one of the most important crops in Mexico, however, its production is diminished by insect pests that attack, mainly Diatraea magnifactella. In search of alternative methods to control borers there are entomopathogenic bacteria and fungi, thus In this study we determine the LC50 of the B-148 strain of B. thuringiensis and Ma156 strain of M. anisopliae on D. magnifactella through laboratory bioassays and probit analysis. The on LC50 of 2322,612 ng/cm2 the strain B-148 in sugarcane leaves and 4381,394 ng / cm in maize leaves. For strain of Ma156 was obtained LC50 1.8359x10 7 conidia / ml in sugarcane and 2.0518 × 10 8 conidia / ml in maize. Key words: Virulence, Bacillus thuringiensis, Metarhizium anisopliae and Diatraea magnifactella. Introducción La caña de azúcar Saccharum officinarum (Poaceae) es uno de los cultivos más importantes en México con cerca de 700 mil hectáreas cultivadas y con 58 ingenios azucareros; sin embargo, su producción se ve disminuida por las plagas que la atacan, siendo el complejo de barrenadores los que más daño ocasionan. Las principales especies pertenecen al orden Lepidóptera, particularmente a la familia Crambidae, subfamilia Crambinae, que incluye los géneros Eoreuma y Diatraea; su presencia provoca grandes pérdidas económicas al año. En Morelos se reportan 21 municipios donde se cultiva S. officinarum con presencia de gusanos barrenadores, principalmente Diatraea magnifactella (Campos y Lugo; 2012).Los daños directos que causa D. magnifactella son: muerte del punto de crecimiento del tallo y perforación del tallo formando galerías longitudinales, las cuales pueden atravesar varios nudos del tallo; de manera indirecta causan la muerte de la planta y el acame de los tallos, la reducción del tamaño del tallo y del rendimiento, así mismo facilita la entrada de otros organismos a la galería, reduciendo el contenido de sacarosa del tallo (Rodríguez del Bosque y Vejar; 2008. Campos y Lugo; 2012). Se han buscado métodos alternativos para el control de barrenadores que no afecten el ambiente, como bacterias y hongos entomopatógenos, Fonseca (2011) indica que la cepa B-148 de B. thuringiensis, nativa del estado de Morelos, produce una mortalidad mayor al 50%, sobre D. magnifactella., así mismo realizó bioensayos de la cepa Ma 156 de Metarhizium anisopliae 298 sobre D. magnifactella (Silva; 2010), por lo anterior el objetivo del presente trabajo fue determinar la CL50 de la cepa B-148 de B. thuringiensis y de la cepa Ma156 de M. anisopliae sobre D. magnifactella. Materiales y Método Material Biológico. Se utilizaron larvas neonatas D. magnifactella de la cría establecida en el Centro de Estudios e Investigaciones en Biotecnología de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos. Se utilizó la cepa Ma156 de M. anisopliae proveniente de la colección del Centro Nacional de Referencia de Control Biológico (SAGARPA-DGSV) y la cepa B-148 de B. thuringiensis proveniente de la colección del CIB de la UAEM. Bioensayos. Se utilizaron hojas de maíz y hojas de caña de 1cm 2, previamente desinfectadas, los trozos de hojas se inocularon por el método de inmersión en la suspensión correspondiente, durante 1 minuto, posteriormente se colocaron en un vaso de 10 ml de plástico con 2 ml de agar estéril y papel filtro estéril, se colocó una larva neonata de D. magnifactella por vaso, finalmente los vasos fueron tapados e incubados a temperatura ambiente (27°7C). Para la determinación de la CL50 de la cepa Ma156 de M. anisopliae y la cepa B-148 de B thuringiensis se tuvieron 12 tratamientos por cada cepa; en hojas de maíz y caña (104, 105, 106,107 y 108 conidios/ml para la cepa Ma156 y 1 000 ng/cm2, 2 000 ng/cm2, 3 000 ng/cm2, 4 000, y 5 000 ng/cm2 para la cepa B-148). Como control se utilizó H2O con Tween 20 al 5%, cada tratamiento con tres repeticiones y como unidad experimental tomamos 15 larvas neonatas de D. magnifactella. Análisis estadísticos. Para la determinación de la CL50, después de la realización de bioensayos, obteniendo el número de larvas de D. magnifactella, muertas por unidad experimental se realizó un análisis PROBIT con el programa estadístico POLO PLUS. Resultados y Discusión De acuerdo con el análisis PROBIT la CL50 de la cepa B-148 de B thuringiensis en hojas de caña fue de 2322.612 ng/cm2 (Fig. 1) y en hojas de maíz fue de 4381.394 ng/cm (Fig. 2). Para la cepa Ma156 de M. anisopliae la CL50 en hojas de caña fue de 1.8359x10 7 conidios/ml (Fig. 3) y de 2.0518 x10 8 conidios/ml en hojas de maíz (Fig. 4). Las concentraciones de ambas cepas es menor sobre hojas de caña, esto puede deberse a que el alimento natural de D. magnifactella es la caña y de manera visible la larva se alimentó en mayor cantidad de estas que de las hojas de maíz, indicando que aun en condiciones de laboratorio el insecto, se alimenta mejor con un alimento natural lo cual es importante en la realización de bioensayos pues los resultados se acercan a lo que podría suceder en condiciones naturales. Fonseca (2011) registró una mortalidad del 74% para la cepa B-148 de a una concentración de 1,000 ng/cm2 sobre D. magnifactella; sin embargo, las condiciones en las que se realizó el bioensayo fueron diferentes, al utilizar una dieta meridica como alimento. Las condiciones en el presente estudio son similares a las que se encuentra la larva en forma natural, al ser alimentadas con hojas de caña y maíz por lo que, las concentraciones aumentan. Silva (2010) reporta la patogenecidad de la cepa Ma 156 de M. anisopliae sobre D. magnifactella con una CL50 de 1.9 x 106 conidios/ml similar a la que se obtuvo sobre hojas de caña, por lo que probablemente en condiciones de campo la concentración de M. anisopliae tenga una menor variación que la que presente B. thuringiensis. 299 Figura 1. CL50 de la cepa B-148 de B thuringiensis en hojas de caña Figura 2. CL50 de la cepa B-148 de B thuringiensis en hojas de maíz Figura 4. CL50 de la cepa Ma156 de M. anisopliae en hojas de maíz Figura 3. CL50 de la cepa Ma156 de M. anisopliae en hojas de Caña Literatura Citada Campos, H. A. y Lugo, A. A. 2012. Manual de plagas y enfermedades de caña de azúcar para el estado de Morelos. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales. Primera edición. 3-7. Fonseca, G. A. 2011. Aislamiento y virulencia de Bacillus thuringiensis sobre Diatraea magnifactella. Tesis de Maestría en Biotecnología. Centro de Investigación en Biotecnología. Facultad de Ciencias Biológicas. UAEM.45 p. Rodríguez Del Bosque. L y Vejar, G. C. 2008. Barrenadores del Tallo (Lepidóptera: Crambidae) del Maíz y Caña de Azúcar. En Casos de Control biológico en México. Editorial MundiPrensa. pp. 9-22. Silva T., I. 2010. Virulencia de los hongos entomopatógenos Metarhizium anisopliae y Cordyceps bassiana (Ascomycetes) en larvas de Diatraea magnifactella (Lepidóptera: Pyralidae) en laboratorio. Tesis de Licenciatura. Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias. Universidad de Colima. 300 EVALUACIÓN DE DOS DISEÑOS DE TRAMPAS RÚSTICAS Y ATRAYENTES BASADOS EN ACEITES ESENCIALES Y ALCOHOLES PARA EL MONITOREO Y CAPTURA DE BROCA DEL CAFÉ Hypothenemus hampei (FERRARI) (COLEOPTERA: CURCULIONIDAE) EN FINCAS DE LA REGIÓN CENTRAL DEL ESTADO DE VERACRUZ Maribel Díaz, Alejandra Cruz, Gabriel Mercado y Trevor Williams. Instituto de Ecología, A.C. Xalapa, Veracruz, [email protected]. RESUMEN. Se realizó un estudio en tres fincas cafetaleras veracruzanas a diferentes altitudes. Se probó el desempeño para la atracción-captura de adultos de la broca de café utilizando dos diseños de trampa: Ecoiapar y Etotrap. Asimismo, se realizó una evaluación de seis atrayentes comparando aceites esenciales, alcoholes y agua (testigo), así como la infestación en frutos obteniéndose el grado de madurez y estimándose el período de mayor riesgo de infestación. La trampa Ecoiapar superó a la Etotrap en broca capturada, pero también en variación de capturas. La mezcla de metanol-etanol presentó una mejor eficiencia de captura respecto al testigo y al resto de los tratamientos. Los meses de abril y mayo fueron los que se presentaron los picos de mayor emergencia de la plaga. Concluimos que la trampa Ecoiapar merece una detallada evaluación como un posible reemplazo a la trampa Etotrap actualmente recomendada por parte de la Campaña Nacional Contra la Broca del Café (SAGARPA). Palabras clave: Hypothenemus hampei Ferrari, Trampeo, atrayente, infestación. Evaluation of two designs of rustic traps and attractants based on essential oils and alcohols the for monitoring and capture of the Coffee berry borer Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Curculionidae) in coffee plantations in the centre of Veracruz State ABSTRACT. We performed a comparative study in three coffee plantations in the centre of Veracruz State at different altitudes. Two designs of trap: Ecoiapar and Etotrap were tested for their attraction-capture characteristics against the Coffee berry borer. The Ecoiapar trap outperformed the Etotrap but also generated higher variation in adult captures. Were also evaluated In a separate experiment six types of attractant were evaluated using essential oils, alcohols and a water control. The standard ethanol/methanol mixture resulted in the highest total capture of adult berry borers during the experiment. The infestation of fruits and the level of ripening were significantly associated with pest emergence from fallen fruits at the beginning of the rainy season. We conclude that the Ecoiapar trap deserves detailed evaluation as a possible replacement for the standard Etotrap in Veracruz State. Key words: Hypothenemus hampei Ferrari, Trapping, attractive, infestation Introducción El café es un cultivo de gran importancia económica para muchas regiones en países tropicales del mundo incluyendo México. Esta agroindustria ocupa un lugar preponderante como generador de divisas y empleos a nivel rural para el desarrollo de actividades de manejo agronómico, de cosecha y de beneficiado. De igual forma, el cultivo de café contribuye a una variedad de servicios en los agro-ecosistemas cafetaleros, incluyendo el control de Plagas (Williams et al., 2013). Actualmente, México ocupa el quinto lugar en producción de café a nivel mundial, después de Brasil, Colombia, Indonesia y Vietnam y es el principal país exportador del café orgánico. Se estima que México tiene una superficie sembrada con este cultivo de aproximadamente 759,134 ha, de las cuales son cosechadas alrededor de 688,376 ha. El café se cultiva en doce estados y del producto final, 96% corresponde a café arábiga y 4% a café robusta. En el ámbito cafetalero nacional, Veracruz ocupa el segundo lugar en producción, con una superficie sembrada de 155,605 ha, distribuidas en 82 municipios (SIAP, 2012). 301 La broca del café es la principal plaga de este cultivo y su presencia se extiende por todas las regiones cafetaleras del mundo. El lugar de origen de este insecto es aún desconocido, pero probablemente es endémica del África central (Jaramillo et al., 20011). Esta plaga entró a territorio mexicano por Guatemala en 1978 (Barrera y López-Arroyo, 2007), y a pesar de las medidas implementadas para su control desde su ingreso a México, actualmente se encuentra prácticamente en todas las regiones productoras de café de nuestro país. Dentro de los principales tipos de control de esta plaga, destacan los relacionados con el uso de productos químicos, los biológicos y los que tienen un componente cultural en cuanto al manejo de las fincas. El Manejo Integrado de la Broca (MIB) se presenta como una herramienta que liga de manera estratégica varios métodos de monitoreo y control, incluyendo al trampeo como parte de estos métodos y que privilegian el control biológico para reducir los impactos económicos asociados con esta plaga. Durante los últimos años se han diseñado y probado diferentes tipos de trampas artesanales hechas a partir de diversos tipos de contenedores plásticos, particularmente envases de refrescos embotellados reciclados, con la finalidad de abatir costos y de esta manera promover el trampeo de la broca entre los productores (Ramírez del Ángel et al., 2007). El presente estudio estuvo orientado por un lado, a evaluar dos tipos de trampas rústicas, Ecoiapar y Etotrap asi como diferentes atrayentes basados en aceites esenciales y alcoholes para el monitoreo y trampeo de adultos de broca del café. Por otro lado, se planteó la importancia de estudiar el desarrollo de infestación en frutos de tres fincas de diferentes altitudes para determinar los períodos de mayor riesgo de infestación. Estos estudios incluyeron actividades de campo para realizar colectas de granos de café en planta y colectas de lechos de agua con insectos en trampas. Asimismo se realizaron estudios de laboratorio basados en la disección de granos de café para la identificación y conteo de broca, así como la identificación y conteo de adultos en los lechos de agua provenientes de las trampas. Materiales y Método Trabajo de campo. Con el objeto de estudiar la dinámica de la broca de café y con el apoyo de personal técnico de campo del Comité Estatal de Sanidad Vegetal del Estado de Veracruz (CESVVER), en junio de 2011, se iniciaron trabajos de identificación y selección de tres fincas en la región de Coatepec, Veracruz, con niveles de elevación diferente y con sistemas de manejo en campo similares con cultivos de café arábica. Las fincas seleccionadas fueron: Arcos (624 msnm), Vegas (768 msnm) y Costa Rica (901 msnm). Estas fincas fueron sujetas a un estudio con el fin de comparar la eficiencia de dos tipos de trampa (Etotrap y Ecoiapar) para la captura de adultos de broca del café (Fig. 1). Tanto la trampa Etotrap como el atrayente usado en ambos diseños, están indicados por la norma NOM-037-FITO1995 y empleados en la Campaña Nacional contra la broca del café. Por otro lado, la trampa Ecoiapar, ha sido desarrollada y probada con éxito por investigadores de El Colegio de la Frontera Sur (ECOSUR) en las regiones cafetaleras de Chiapas y Guatemala (Barrera et al., 2008; Campos, 2007). El diseño de estas trampas está basado en el aprovechamiento de envases de plástico reciclados de 2 y 2.5 l y fueron habilitadas con un gotero plástico conteniendo un atrayente (mezcla etanol-metanol en proporción 3:1). Es importante señalar que cada una de las trampas, lleva acondicionado en el fondo del envase lechos de agua, donde caen los insectos atraídos por el cebo. Para llevar a cabo el estudio, se seleccionó una planta centinela (mata de café robusta) por cada finca. En estas matas se colocaron en pares las trampas. Cada trampa se colocó sobre la planta centinela, a una altura aproximada de 1.30 m a partir del suelo. 302 Figura 1. Trampas Ecoiapar (izquierda) y Etotrap (derecha) utilizadas en el estudio para evaluar su eficiencia en tres fincas de café de la región central de Veracruz Considerando por un lado que el uso de diferentes atrayentes tiene implicaciones comerciales en términos de costos, tomando en cuenta la pronta volatilización de los alcoholes empleados como cebos, se llevó a cabo un estudio tendiente a evaluar diferentes atrayentes basados en aceites esenciales en comparación con alcoholes. Estas actividades se llevaron a cabo en la región de Tuzamapan en el Municipio de C p ,V f “V ” m í f presencia de la broca. El estudio se basó en un ensayo realizado completamente al azar con seis repeticiones evaluando los siguientes siete tratamientos: TI: Mezcla de metanol-etanol 3:1; T2: Alcohol de caña; T3: Mezcla de metanol + sándalo; T4: Mezcal de metanol + esencia de romero; T5: Mezcla de metanol + esencia de naranja; T6: Mezcla de metanol + esencia de clavo; T7: Testigo (agua purificada). Se utilizaron como unidades experimentales, trampas del tipo Ecoiapar, considerando su eficiencia ya mostrada, para capturar y monitorear broca en cafetales de sombra. Se usaron como difusores del atrayente, viales de vidrio de 15 ml de capacidad, con una tapa de hule perforada. De esta manera, se llevaron a cabo diluciones compuestas de 200 µl de aceite esencial en 100 ml de metanol. Se colocaron dos trampas, ubicadas aleatoriamente sobre ramas (a 1.30 m de altura sobre el suelo) en plantas de café arábiga. La recolección de muestras y de datos se realizó mediante visitas a las fincas cada 15 días. Para la recuperación de los adultos en campo, se utilizó un colador convencional (10 cm de diámetro) y sobre éste se acondicionó un pedazo de tela-malla con la finalidad de filtrar el líquido y retener a las brocas contenidas en los lechos de agua. Las muestras fueron acondicionadas en contenedores plásticos y etiquetadas adecuadamente para su posterior traslado al laboratorio. Esta actividad de recuperación de broca en campo, permitió facilitar el conteo de organismos realizado posteriormente a nivel laboratorio. Por otro lado y partiendo de un estudio previo de laboratorio con muestras de granos de café (100 granos por muestra) procedentes de 51 fincas incluidas en el observatorio del café y localizadas en diferentes regiones cafetaleras de la región central veracruzana (Huatusco, Córdoba, Misantla, Coatepec, Atzalan y Zongolica), se seleccionaron tres de estas fincas, en las cuales se obtuvo el mayor porcentaje de infestación por broca. Estas fincas correspondieron a las regiones de Huatusco (Localidad El Mirador: 1053 msnm); Córdoba (Cañada Blanca, Mpio. De Amatlán: 868 msnm) y Misantla (Localidad La Victoria, Mío. de Yecuatla: 320 msnm). Toda vez ubicadas geográficamente, las fincas fueron sujetas a una visita para llevar a cabo un recorrido por cada una de ellas e identificar sitios para posteriores muestreos de granos en matas de café. 303 En cada visita mensual realizada, además de realizar una colecta de frutos, se tomaron datos de temperatura e intensidad luminosa para utilizarlos como posibles variables en el proceso de infestación de broca. Los muestreos de granos se llevaron a cabo bajo un esquema de colecta lineal y de manera alterna, donde se seleccionaron 100 granos de café al azar en cada una de las fincas. Los granos colectados se acondicionaron en recipientes de plástico para su traslado al laboratorio del Instituto de Ecología, A.C. en Xalapa, Veracruz para someterlos a revisión y posterior cálculo del porcentaje de infestación presentada en cada finca. Trabajo de Laboratorio Tanto los granos obtenidos del acopio en las 51 fincas de las regiones de Huatusco, Córdoba, Misantla, Coatepec, Atzalan y Zongolica, como las de las fincas de la región de Coatepec, Veracruz fueron llevadas a laboratorio para su procesamiento siendo separadas y clasificadas por región cafetalera. Se revisaron y contabilizaron los números de granos perforados y no perforados por broca. De estas muestras (100 granos por muestra), se tomaron 10 granos de café al azar por cada finca para determinar tamaño, peso, largo y ancho del fruto con el apoyo de un vernier y una balanza analítica. Asimismo, se determinó el grado de madurez de los granos, empleando un refractómetro manual para medir los grados Brix de los frutos. Posteriormente, se seleccionaron 20 cerezas que presentaran perforaciones causadas por la broca para realizar una disección y observar si la broca se encontraba dentro del grano y obtener el número de huevos, larvas, pupas y adultos. Para comparar la dinámica poblacional que presentó la broca después de un año, se realizó este ejercicio nuevamente, realizando un acopio en el mes de octubre de 2012, de muestras de granos de café de las diferentes regiones cafetaleras. Los resultados fueron sujetos a análisis de varianza con tipo de trampa o tipo de cebo como factores experimentales. Resultados y Discusión Como parte de los resultados de este estudio y específicamente a lo relacionado con la evaluación de la eficiencia entre los dos tipos de trampa, se observó que para el caso de las fincas de la región de Coatepec; Arcos (624 msnm), Vegas (768 msnm) y Costa Rica (901 msnm), el mes de abril, fue el que presentó mayor captura de broca en las tres fincas, en un período de muestreos que duró cinco meses (de febrero a junio del 2012). Esto se debió a que durante este periodo, denominado de intercosecha y que ocurre en esta época del ciclo, se presentó el f óm “ m m v ” ( mí Á et al., 2007), en el cual las hembras abandonaron los frutos viejos para salir en busca de nuevos frutos. En la finca Arcos, la trampa Ecoiapar (1 ventana), capturó el mayor número de broca: 1420 adultos, comparado con el modelo Etotrap (3 ventanas), cuyo número de brocas capturadas fue de 594, sin embargo la diferencia no fue significativa (P>0.05). En la finca Vegas, se observó que a pesar de que se obtuvo un menor número de capturas en los dos modelos de trampa, comparado con la finca Arcos, la trampa Ecoiapar tuvo un significativamente mejor desempeño, ya que capturó aproximadamente 40% más brocas que la trampa Etotrap (P<0.05). En este sentido, la trampa Ecoiapar tuvo una mayor captura (61 brocas) que la Etotrap (26 brocas). Finalmente la finca Costa Rica, se obtuvo menor captura. Para este caso, la mayor captura fue de 12 adultos capturados en la trampa Ecoiapar y 11 para la Etotrap. Por otro lado y a lo relacionado con el estudio para evaluar atrayentes basados en aceites esenciales y alcoholes, se observaron diferentes significativas entre tratamientos (P<0.05) ya que el tratamiento T1 (mezcla de metanol-etanol 3:1) fue el más atractivo para atraer a la broca de 304 café en relación a los otros con un total de 154 brocas capturadas, seguido del tratamiento T2 correspondiente a alcohol de caña de azúcar con 123 brocas capturadas y que el menor fue el testigo T7( agua purificada) con 38 adultos capturadas durante el experimento. Los tratamientos T3 (sándalo) T4 (romero) y T5 (naranja) tuvieron una respuesta intermedia mientras que el tratamiento de aceite de clavo fue intermedio entre el control y el alcohol de caña. El mes de julio fue donde se obtuvo el mayor número de broca capturada ya que el fruto de café estaba en formación y se presentaron lluvias marcadas en el cual las brocas emergieron de frutos residuales para ir en busca de nuevos hospederos. Finalmente y referente a los estudios para determinar los niveles de infestación en tres fincas de café en las regiones de Huatusco (1053 msnm); Córdoba (868 msnm) y Misantla (320 msnm), en el cuadro 1 se presentan los datos obtenidos para determinar los niveles de infestación de la broca del café presentes en los meses de marzo, mayo, julio, septiembre. Como se puede observar, el mes de mayo fue el que presentó el mayor porcentaje de infestación en la región de Córdoba con el 98% de frutos perforados. Asimismo, esta región también fue la que presentó el menor porcentaje obtenido, correspondiendo al mes de julio con un 9% de infestación. Cuadro 1. Porcentaje de infestación presentes en las fincas de las regiones de Yecuatla, Córdoba y Huatusco durante muestreos de 2012. MES Marzo Mayo Julio Septiembre FINCA POR REGIÓN YECUATLA CÓRDOBA HUATUSCO N/A 55 41 56 98 47 49 9 11 80 13 N/A Conclusiones Podemos concluir que la plaga de la broca del café se encuentra presente en las principales regiones cafetaleras del centro del estado de Veracruz. No obstante, su biología y la altitud de las fincas intervienen como factores que influyen en su reproducción dentro de los granos de café. Por otro lado, la trampa Ecoiapar resultó tener una mayor eficiencia en el trampeo, comparada con la trampa Etotrap. Asimismo, la mezcla de etanol-metanol 3:1 fue el atrayente más efectivo para H. hampei bajo condiciones de campo y que los cebos de sándalo, romero y naranja presentaron una respuesta similar a la mezcla de metanol-etanol. En este sentido, estos aceites esenciales pueden considerarse como posibles atrayentes que puedan sustituir al compuesto por los alcoholes usados convencionalmente. Agradecimientos Al CONACYT por el financiamiento a través del Fondo Institucional de Fomento Regional para el Desarrollo Científico, Tecnológico y de Innovación (FORDECYT) para el p úm : 139378 “C ó ó v ó p f b V ” 305 Literatura Citada Barrera, J. F. y J. I. Lopez-Arroyo. 2007. Control biológico de insectos plaga en el sureste de México. En: Teoría y Aplicación del Control Biológico, Ed. LA Rodríguez-del-Bosque, HC Arredondo-Bernal, pp. 201–33. México DF, Soc. Mexicana Control Biol. Barrera, J. F., J. Herrera, M. Chiu, J. Gómez y J. Valle Mora. 2008. La trampa de una ventana (ECOIAPAR) captura más broca del café Hypothenemus hampei que la trampa de tres ventanas (ETOTRAP). Entomología Mexicana 7: 619-624. Campos, O. 2007. 35 Años de experiencias sobre la Broca del café en Guatemala. En: J.F. Barrera, A. García, V. Domínguez y C. Luna (Eds.). Sociedad Mexicana de Entomología y El Colegio de la Frontera Sur. México, p. 7-16. Jaramillo J., Muchugu E, Vega F E, Davis A, Borgemeister, C. and Chabi-Olaye, A. 2011. Some like it hot: The influence and implications of climate change on Coffee berry borer (Hypothenemus hampei) and coffee production in East Africa. PLos ONE 6: e24528. Ramírez Del Ángel, M., M. González C., A. Bello R. & S. Romero B. 2007. Campaña nacional contra la broca del café en México: Operación y perspectivas. En: J.F. Barrera, A. García, V. Domínguez y C. Luna (Eds.), La Boca del Café en América Tropical: Hallazgos y Enfoques. Sociedad Mexicana de Entomología y El Colegio de la Frontera Sur. México DF, p. 73-81. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA).2012. Anuarios estadísticos de la producción agrícola. Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera (SIAP). México, D.F. http://www.siap.sagarpa.gob.mx. Williams, T., Arredondo-Bernal, HC, and Rodríguez-del-Bosque, L. 2013. Biological pest control in Mexico. Annu. Rev. Entomol. 58:119–40 306 SELECCIÓN IN VITRO DE CEPAS DE Bacillus thuringiensis BERLINER, PATÓGENAS A Bactericera cockerelli SULC (HEMIPTERA: TRIOZIDAE) Daniela Isabel Tapia-Avelar1, Guadalupe Peña-Chora2, Víctor Manuel Hernández-Velázquez3, Iván Arenas-Sosa2, Rosalío Lehninger Estrada-Urbina4 y Andrés Alvear-Garcia4. 1Facultad de Biología, 2Centro de Investigaciones Biológicas, 3Centro de Investigación en Biotecnología y 4Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Autónoma del Estado de Morelos, Campus Norte, Av. Universidad 1001, Colonia Chamilpa C.P 62209, Cuernavaca, Morelos, México. [email protected]. RESUMEN. El psílido de la papa (Bactericera cockerelli Sulc.) es plaga importante de solanáceas en México, ocasiona daños por succión de nutrientes y transmisión de fitoplasmas. Para su control se han utilizado insecticidas químicos, esto ha originado poblaciones de insectos resistentes. En la búsqueda de agentes biológicos para su control se observa que la bacteria Bacillus thuringiensis produce proteínas insecticidas altamente especificas. En el presente estudio se evaluaron 12 cepas de B. thuringiensis en ninfas de quinto estadio de B. cockerelli. Se observó a las 48 horas que las cepas GP139, GP280 y GP132 causaron mortalidad significativa, siendo de 82.2% para la primera, un 60% y 55% para la segunda y un 59.9% y 51.1% para la tercer cepa a concentraciones de 10 y 100 ng/µl. Se reportan las primeras cepas de B. thuringiensis patógenas a ninfas de B. cockerelli con efecto promisorio para su posterior evaluación en condiciones de campo. Palabras clave: Bactericera cockerelli, paratrioza, control microbiano, psílido del tomate. In vitro selection of Bacillus thuringiensis Beerliner, with pathogenic activity to Bactericera cockerelli Sulc (Hemiptera: Triozidae) ABSTRACT. The potato psyllid (Bactericera cockerelli Sulc.) is an important solanaceous pest in Mexico, it causes direct and indirect damage due to the suction of nutrients and phytoplasm transmission. Its control has been based on chemical insecticides which have resulted in resistant insect populations. Therefore it is necessary to find biological agents for its control; the entomopathogenic bacterium Bacillus thuringiensis produces highly specific insecticidal proteins. In the present study were evaluated 12 strains of B. thuringiensis in fifth instar nymphs of B. cockerelli. Was observed that GP139, GP280 and GP132 strains at 48 hours caused significant mortality, it was 82.2% for the first, 60% and 55% for the second and 59.9% and 51.1% for the third strain at concetrations of 10 and 100 ng/µl. We report the first B. thuringiensis strains with pathogenic activity to nymphs of B. cockerelli with promising effect for evaluation under field conditions. Key words: Bactericera cockerelli, paratrioza, microbial control, tomato psyllid. Introducción L “p ” [Bactericera cockerelli (Hemiptera: Triozidae)] en México es considerada una plaga importante del cultivo de papa (Solanum tuberosum L.), chile (Capsicum spp.) y jitomate (Lycopersicum esculentum). Ocasiona daños directos al succionar la savia (Munyaneza et al., 2007) e indirectos al transmitir fitoplasmas (Garzón et al., 1992). Los fitoplasmas ocasionan las enfermedades: punta morada de la papa y el permanente del tomate, razón principal de la importancia de realizar un buen manejo de B. cockerelli (Garzón et al., 2005; Munyaneza et al., 2007). Ante el incremento de los daños por paratrioza se recurre a la aplicación de insecticidas químicos (Liu y Trumble, 2005). Sin embargo el uso irracional de estos productos causa efectos adversos al ambiente, organismo no blanco y la salud humana. De esta manera, a pesar de los avances en el manejo integrado del salerillo, el combate químico sigue siendo una herramienta muy importante para mantener la densidad de población por debajo del umbral económico (Nava, 2002). Debido a lo anterior se ha desarrollado un interés en la búsqueda de agentes para el control biológico de plagas, siendo el uso de bacterias entomopatógenas una alternativa viable. Entre estas bacterias la más importante es Bacillus 307 thuringiensis que produce proteínas insecticidas (Cyt, Cry, S-layer) durante la esporulación. Estas proteínas insecticidas (delta-endotoxinas) son altamente específicas al insecto blanco e inocuas a los humanos, vertebrados y plantas (Nester et al., 2002). Por lo tanto B. thuringiensis es una alternativa para el control de insectos plaga en la agricultura y vectores de importancia en la salud humana. El objetivo de este trabajo fue: seleccionar cepas de B. thuringiensis aisladas de psílidos con actividad patogénica a ninfas de B. cockerelli. Materiales y Método El presente trabajo se realizó en el laboratorio de Parasitología Vegetal del Centro de Investigaciones Biológicas de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos. La cría de B. cockerelli se llevó a cabo en jaulas de 1x1x1 m con malla antiáfidos. Como planta huésped se utilizó el hibrido Toro F1, las plántulas de jitomate de 30 días de crecimiento se trasplantaron en bolsas de plástico de 10 litros con sustrato de tezontle negro. A los 10 días de transplante se infestó con adultos de B. cockerelli hasta la obtención de ninfas del quinto estadio. Se evaluaron un total de doce cepas (GP280, GP 850, GP855, GP308, GP322, GP336, GP847, GP202, GP132, GP139 y HD1), éstas fueron aisladas de organismos de la familia Psillidae y una de Bemisia tabaci (GP139), pertenecen a la colección de B. thuringiensis del laboratorio antes mencionado. Las cepas se activaron en medio sólido HCT. Una vez esporuladas se recuperó la proteína total, consecutivamente se cuantificó mediante la técnica de Bradford (1976). Para los bioensayos se empleó un sistema de alimentación que consiste en dos vasos de plástico del número unidos por la parte superior (Torres-Quintero et al., 2012). Al sistema se le colocó dieta líquida a base de extracto de levadura al 5% y sacarosa al 15% con un pH de 7. Cada sistema se recubrió con una delgada membrana de parafilm sobre la cual se colocaron 15 ninfas de B. cockerelli del quinto estadio. El segundo vaso (recortado por el fondo) se unió con el vaso de la membrana de parafilm y se cubrió con malla para evitar la salida de las ninfas. Se probaron dos dosis: 10 y 100 ng/µl de cada cepa. En cada tratamiento se utilizó un volumen total de 3ml de dieta líquida mezclada con esporas-cristales a excepción del testigo, donde solo se colocó dieta. Los sistemas se colocaron en un recipiente de plástico de 20 x 45 cm, en la parte inferior se colocó algodón humedecido con agua destilada estéril para conservar la humedad. Se contabilizó el número de ninfas muertas a las 24 y 48 horas de haberse sometido a los tratamientos correspondientes. Se tomó como muerta la ninfa que: no respondía estímulos por el pincel, aquella con desecación de color ámbar y ninfas fracturadas. Los sistemas de alimentación se dispusieron en un diseño completamente al azar, con tres repeticiones. Se realizó una comparación múltiple de medias mediante Tukey, con un nivel f α 0.05. Resultados A las 24 horas de haberse aplicado los tratamientos, se observa un efecto altamente significativo en la mortalidad de ninfas de B. cockerelli (P 0.0017). No obstante, de acuerdo a la comparación múltiple de medias los tratamientos con mayor mortandad generan un porcentaje no mayor al 20% en concentración de 10 ng/µl (Cuadro 1). Cabe señalar que las cepas que originaron la mayor mortandad (20%) son: GP855 y HD1 a 10 ng/µl. El Testigo no presentó ninfas muertas, sin embargo se agrupó con el resto de los tratamientos. 308 Cuadro 1. Patogenicidad de cepas de B. thuringiensis sobre ninfas de B. cockerelli a concentraciones de 10 y 100 ng/µl. Cepas de Bt. GP855 HD1 GP139 GP132 GP280 GP847 GP202 GP322 GP865 GP336 GP850 GP308 Testigo 24 horas Mortalidad Mortalidad 10 ng/µl 100 ng/µl 20.0a ± 1.7* 8.8 ab ± 0.9 20.0a ± 2.9 6.6 ab ± 1.7 ab 15.5 ± 1.9 6.6 ab ± 0.0 ab 15.5 ± 2.6 15.5 ab ± 2.6 ab 15.5 ± 2.6 6.6 ab ± 0.0 ab 11.1 ± 0.9 8.8 ab ± 1.9 6.6ab ± 0.0 8.8 ab ± 0.9 ab 6.6 ± 0.0 15.5 ab ± 0.9 ab 4.4 ± 0.9 4.4 ab ± 1.9 ab 4.4 ± 1.9 4.4 ab ± 1.9 ab 2.2 ± 0.9 11.1 ab ± 2.6 ab 2.2 ± 0.9 15.5 ab ± 0.9 0.0b ± 0.0 48 horas Mortalidad Mortalidad 100 10 ng/µl ng/µl 40.0bc ± 0.0 40.0bc ± 2.9 20.0dc ± 0.0 20.0dc ± 0.0 a 82.2 ± 4.3 44.4bc ± 3.9 ab 59.9 ± 2.9 51.1ab ± 4.3 ab 60.0 ± 0.0 55.5ab ± 1.9 bc 28.8 ± 3.5 37.7bc ± 4.9 37.7bc ± 1.9 35.5bc ± 6.0 bc 40.0 ± 1.7 31.1bc ± 0.9 bc 37.7 ± 2.6 24.4bc ± 1.9 bc 31.1 ± 2.6 37.7bc ± 3.5 bc 51.1 ± 1.9 40.0bc ± 4.5 bc 28.8 ± 0.9 26.6bc ± 0.0 2.2d ± 0.9 Nota: Letras diferentes indican diferencias estadísticas (p<0.05), *= error estándar de la media, Bt: B. thuringirnsis A las 48 horas se observó diferencia altamente significativa en la mortandad de las ninfas de B. cockerelli, en los diferentes tratamientos (P < 0.0001). En la comparación de medias (Cuadro 1), se obtuvo que la cepa GP139 a concentración de 10 ng/µl, logró causar el 82.2% de mortalidad. Así mismo, las cepas GP280 y GP132 a 10 y 100 ng/µl propiciaron un 60 y 55.5% y 59.9 y 51.1%% de mortalidad, respectivamente. Las cepas antes mencionadas formaron el grupo de los tratamientos que causaron alta mortandad. El testigo formó un grupo separado del resto de los tratamientos, en éste se presentó una mortalidad del 2.2%. Los tratamientos con las concentraciones de 100 ng/µl no propiciaron mortandad mayor al 50%. Como se aprecia en el Cuadro 1, las cepas a concentraciones de 10 ng/µl generan un mayor porcentaje de mortalidad, en comparación con la concentración de 100 ng/µl. Discusión. La mortalidad en el testigo está relacionada con factores externos y al ciclo biológico del insecto (Mora et al., 2007). En relación a la mayor mortandad observada en los tratamientos a concentraciones de 10 ng/µl, se menciona que la mortalidad observada con la menor dosis de B. thuringiensis se debe al efecto de la densidad bacteriana, encontrándose moderada mortandad con elevadas dosis del patógeno en comparación a bajas dosis (Raymond et al., 2009). Existen muy pocos trabajos relacionados con la actividad insecticida de Bt contra Hemípteros. En bioensayos con Lygus hesperus se empleó delta-endotoxinas de Bt mezclada en dieta artificial, se encontró que estas toxinas son responsables de la mortalidad ninfal. No obstante es necesario atender la activación proteolítica para optimizar la actividad insecticida de las proteínas (Wellman-Desbiens y Jean-Charles, 2005). Las cepas de B. thuringiensis aisladas del insecto blanco es posible que presenten proteínas toxicas altamente específicas (Peña-Chora y Bravo, 2002). De igual manera, es posible que la mortandad se encuentre relacionada con las inclusiones proteicas de Bt. Se conoce que la cepa GP139 presenta toxinas Cry 1Aa, 1Ac, 2Aa y S-layer, existen investigaciones que señalan que las proteínas Cry1Aa y Cry2Aa son tóxicas contra hemípteros (van 309 Frankenhuyzen., 2009), así como las proteínas S-layer (Peña-Chora et al., 2006). Debido a que estas proteínas se encuentran presentes en la cepa GP139, es posible que la mortalidad sea debido a dichas proteínas, siendo probable que dicho efecto ocurra con las cepas GP280 y GP132, las cuales originaron la mayor mortalidad en B. cockrelli. Por otro lado, el incremento de la mortalidad en el tiempo está relacionada con la interacción de las delta-endotoxinas en el intestino de hemípteros, las formas activas de estas toxinas propician mortandad después de 12 horas (Brandt et al., 2003). En los tratamientos de la presente investigación no se solubilizó el complejo espora-cristal, lo cual pudo haber prolongado el tiempo para observar los efectos en la mortalidad de ninfas. Conclusión Con una confiabilidad de 95% se concluye que las cepas GP139, GP280 y GP132 causan mortandad significativa en ninfas del quinto estadio de B. cockerelli. De esta manera, a las 48 horas de aplicados los tratamientos se observa que estos producen mayor mortalidad que a las 24 horas. Consecutivamente, de las tres cepas con mayor actividad insecticida la GP139 produce la mayor mortalidad siendo de 82.2% a 10 ng/µl. Seguidamente las cepas GP280 y GP132 propiciaron mortalidades mayores al 50% en concentraciones de 10 y 100 ng/µl. No obstante, las cepas ya mencionadas se seleccionaron como las más patógenas para ninfas de quinto estadio de B. cockerelli. Es importante señalar que el mayor porcentaje de mortandad en ninfas del “ ” f b m 10 /µ . F m , mortalidad del testigo se ve claramente asociada a factores externos antes mencionados. A pesar de no encontrar literatura que mencione la utilización de B. thuringiensis contra B. cockerelli, en el presente trabajo se observó que Bt causa mortandad en paratrioza, lo que sugiere que dicha batería entomopatógena logra penetrar por diversas aperturas naturales y causar la muerte del insecto. De acuerdo a los resultados obtenidos, las cepas GP139, GP280 y GP132 generan mortalidades con efecto promisorio para su posterior evaluación en condiciones de campo. Agradecimientos A la Universidad Autónoma del Estado de Morelos, al laboratorio de Parasitología Vegetal por el apoyo brindado en el trabajo, a mi director de tesis Dr, Guadalupe Peña, a mi comité tutoral, mis compañeros de laboratorio y especial agradecimiento al M. C. Lehninger Estrada por la guía y apoyo brindado. Literatura Citada Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (12): 248-254. Brand, S. L., Coudron, T. A., Habibi, J., Brown, G. R., Llagan, O. M. y Wagner, R. M. 2003. Interaction of Two Bacillus thuringiensis -Endotoxins with the Digestive System of Lygus Hesperus, Biological Control of Insects Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, University of Missouri. 48: 1-9. Garzón, T. J., Becerra, F. A., Marín, A., Mejía, A. y Byerly, M. 1992. Manejo integrado de la f m “P m m ” (Lycopersicon lycopersicum Karst ex Fawll Mill.), en el Bajío. En: Urías, C., R. Rodríguez, y T. Alejandre (eds). Afidos como vectores de virus en México. Colegio de Postgraduados, Centro de Fitopatología. 1: 116-129. 310 Garzón, T. J. A., Garzón-Ceballos, J.A., Velarde-Félix, S., Marín-Jarillo, A. y CárdenasV , O.G. 2005. E m ó f p m “P m m ” p pí Bactericera cockerelli Sulc., en México. Entomología Mexicana. 4: 672-675. Liu, D. y Trumble, T. 2005. Interactions of plant resistance and insecticides on the development and survival of Bactericera cockerelli (Sulc) (Hemiptera: Psyllidae). Crop Potection. 24: 111-117. Mora, R., Ibarra, E. y Espinoza, M. 2007. A reliable bioassay procedure to evaluate per os toxicity of Bacillus thuringiensis strains against the rice delphacid, Tagosodes orizicolus (Homoptera: Delphacidae). Revista de Biologia Tropical. 55: 373-383. Munyaneza, J.E., Crosslin, J.M. y Upton, J.E. 2007. Association of Bactericera cockerelli (Homoptera: Psyllidae) w h “Z b Ch p,” wp S hw U States and México. Journal of Economical Entomolology. 100: 656-663. Nava C.U.2002. Muestreo, monitoreo y umbrales económicos del psílido del tomate Paratrioza cockerelli (Sulc). Pág. 55-77. En: Avilés C. M., Gálvez R. J., Garzón T. J. Memoria del Taller sobre Paratrioza cockerelli Sulc., como plaga y vector de fitoplasmas en hortalizas. Culiacán, Sinaloa. 25 y 26 de julio del 2002. 100 p. Nester E. W., Matthew, M. T. y Gordon, M. 2002. 100 years of Bacillus thuringiensis: A critical scientific Assessment [Online]. American Academy of Microbiology. Washingtong DC. Peña-Chora, G. y Bravo, A. 2002. Discovery of new Bacillus thuringiensis toxins. En: Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its Environmental Impact. Proceedings of the 4th Pacific Rim Conference. R. J. Akhurst, C. E. Beard y P. Hughes (EDS.). CSRO. 106111 pp. Peña, G., Miranda-Ríos J., De la Riva, G., Pardo-López, L., Soberón, M. y Bravo, A. 2006. A Bacillus thuringiensis S-layer protein involved in toxicity against Epilachna varivestis (Coleoptera: Coccinellidae). Applied and Environmental Microbiology. 72 (1): 353-60. Raymond, B., Richard, J.E. y Bonsall, M. 2009. Moderation of pathogen-induced mortality: the role of density in Bacillus thuringiensis virulence. Biology Letters, 218-219. Torres-Quintero, Mary Carmen, Iván Arenas-Sosa, Guadalupe Peña-Chora y Víctor HernándezVelázquez. 2012. Caracterización de cepas de Bacillus thuringiensis patógenas a Myzus persicae (Insecta: Hemiptera). XXIX Congreso Nacional de Bioquímica. 11 – 17 de noviembre. Oaxaca, Oax. 991. Van Frankenhuyzen, Kees. 2009. Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis crystal proteins. Journal of invertebrate pathology. Vol. 101(1): 1-16. Wellman-Desbiens, E. y Jean-Charles, C. 2005. Development of a Bacillus thuringiensis-based assay on Lygus hesperus. Journal of Economic Entomology. 98 (5): 1469-1479. 311 AGENTES POTENCIALES DE CONTROL BIOLÓGICO DE LA MOSQUITA BLANCA Bemisia tabaci GENNADIUS (HEMÍPTERA: ALEYRODIDAE) EN EL SUR DE TAMAULIPAS Daniel Alfonso García-Guerrero1; Svetlana Nikolaevna-Myartseva2; Gerardo Arcos-Cavazos3; Eduardo VázquezSegura4. 1Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Departamento de Parasitología. Calzada Antonio Narro # 1923, Buenavista, Saltillo; Coahuila, México. C.P. 25315. 2 División de Estudios de Postgrado e Investigación, UAM Agronomía y Ciencias, Universidad Autónoma de Tamaulipas, Cd. Victoria, C.P. 87149, Tamaulipas, México. Tel. (834) 3181 800 ext. 2125. 3Campo Experimental Las Huastecas, CIRNE-INIFAP, Carretera Tampico-Mante Km 55, C.P. 89610, Cuauhtémoc, Tamaulipas, México. 4Instituto Tecnológico de Altamira. Altamira, Tamaulipas, México. Tel. (833) 264 0545. [email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]. RESUMEN. La mosquita blanca es la principal plaga que provoca pérdidas a los cultivos del sur de Tamaulipas, ya que transmiten más de 40 agentes causales de enfermedades, por ser eficientes vectores de virus. Por lo que la conservación de enemigos naturales de este grupo es de gran importancia, ya que el uso de insecticidas es la principal razón de la perdida de los mismos. En atención a lo anterior se determinó identificar las especies de parasitoides de esta plaga presentes en la zona de manera natural. Las recolectas se realizaron durante el año 2011 en la región sur de Tamaulipas, obteniéndose especies de la familia Aphelinidae dentro de los géneros Encarsia (E. sophia y E. inaron) y Eretmocerus (E. mundus). Las tres especies estuvieron presentes en las diferentes zonas y fechas de recolecta. Palabras Clave: Mosquita blanca, Control biológico, Eretmocerus mundus, Encarsia sophia, Encarsia inaron. Potential agents of biological control of whitefly Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae) in Southern Tamaulipas. ABSTRACT. The whitefly is a major pest that causes crop losses in southern Tamaulipas, because they transmit more than 40 disease-causing agents, being efficient virus vectors and that is for the conservation of natural enemies of this group is of great importance, being the use of insecticides the main reason for their loss. In consideration of the above mentioned, the objective of this research was to determine the species of parasitoids of this pest in the area. Collections were made during 2011 year in the southern region of Tamaulipas, obtaining Aphelinidae species within the genus Encarsia (E. sophia and E. inaron) and Eretmocerus (E. mundus). The three species were present in the different areas and dates of collection. Key words: Whitefly, Biological Control, Eretmocerus mundus, Encarsia sophia, Encarsia inaron. Introducción El manejo de cultivos en la Huasteca Tamaulipeca requiere de prácticas sustentables que no afecten o dañen directa e irremediablemente el ecosistema; para esto se requiere el establecimiento de explotaciones agrícolas en las que el manejo de plagas y enfermedades considere la sustentabilidad del agroecosistema. Debido a esto existe la necesidad de tomar conciencia del daño que se causa al utilizar productos de origen químico-sintético con alto poder residual, que contaminan al suelo, mantos acuíferos y aire, provocando además la desaparición de enemigos naturales de plagas; para este panorama es conveniente optar por el uso de productos formulados a base de sustancias orgánicas que disminuyen el efecto negativo al ambiente, así como el uso y preservación de fauna benéfica ya sean estos depredadores o parasitoides que regulen la densidad poblacional de las plagas en cuestión. Actualmente una plaga de gran recurrencia e importancia económica es la mosquita blanca Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera:Aleyrodidae), causante de pérdidas cuantiosas en cultivos hortícolas de la región, ya que es vector de los Virus del Mosaico Dorado del Chile (PepGMV) y el Virus Huasteco del 312 Chile (PHV) (Medina et al., 2004), con síntomas como amarillamientos severos, moteados, mosaicos cloróticos, achaparramientos, rizados, deformaciones, arrugas o pliegues en hojas, incluso inducir el aborto de flores y deformaciones de frutos (Rivas, 1994). El control biológico como método de regulación de plagas, permite que una especie distinta al problema, mantenga el nivel de población por debajo del que causa daño; el complejo mosquita blanca cuenta con una importante gama de enemigos naturales, entre los cuales destacan las avispas parasitoides de la familia Aphelinidae, dentro de los géneros Encarsia y Eretmocerus que incluyen especies importantes de control biológico (García, 2012). Debido a los problemas provocados por B. tabaci, el objetivo del presente estudio fue identificar las especies de parasitoides afelinidos nativos del sur de Tamaulipas para su posterior incorporación a un programa de manejo integrado de plagas. Materiales y Método Las recolectas semanales se efectuaron de marzo a noviembre del 2011, en tres predios ubicados en los municipios de Altamira y González del estado de Tamaulipas, en hospederas silvestres comunes de la región, así como cultivos hortícolas, de donde se recolectaron hojas del estrato inferior de las plantas, con ninfas de mosca blanca con síntomas de parasitismo que se depositaron en cajas de Petri, se sellaron por medio de una película plástica para su traslado al laboratorio de control biológico del Campo Experimental Las Huastecas (INIFAP), donde se etiquetaron y registraron para dar seguimiento a la emergencia de parasitoides apoyándose en el uso de estereoscopio compuesto para su observación, los parasitoides se recolectaban con un pincel fino previamente humedecido en alcohol etílico al 75 % y se depositaban en frascos de cierre hermético de 2 mm para su preservación debidamente etiquetados y se colocaron en cajas plásticas especiales para evitar su fractura. La identificación de las especies colectadas estuvo a cargo de la Dra. Svetlana Nikolaevna Myartseva profesora e investigadora de la UAT Agronomía y Ciencias Campus Ciudad Victoria Tamaulipas. Los especímenes se montaron en portaobjetos utilizando Bálsamo de Canadá, se etiquetaron y dejaron reposar por 72 horas para su secado, posteriormente se observó al microscopio compuesto las características y estructuras principales para su identificación, utilizando las claves de Mercet (1931); Girault y Dodd, (1915); Walker, (1839). Resultados y Discusión Se identificaron tres especies de parasitoides presentes en el Sur de Tamaulipas, las cuales fueron ubicadas en la familia Aphelinidae, en los géneros Eretmocerus y Encarsia: E. mundus para el primer caso; E. sophia y E. inaron para el segundo. Eretmocerus mundus Mercet. La hembra tiene cinco segmentos antenales: escapo cilíndrico, pedicelo, dos segmentos funiculares cortos, club o maza larga; vena marginal usualmente con 3-4 setas; fórmula tarsal 4-4-4; tibia media usualmente con una espina aproximadamente a 0.5x del tarsómero medio; antena del macho compuesta por tres segmentos; escapo, pedicelo y club (Fig. 1). Encarsia sophia Girault y Dodd. Fórmula tarsal 5-5-5; primer par de alas hialinas y uniformemente setosas, vena marginal con 6-9 setas a lo largo del margen anterior, grupo de setas 313 basales 7-11 con un área conspicua de setas largas cerca del margen posterior, club antenal trisegmentado; ovipositor largo o ligeramente más largo que la tibia media (Fig. 2). Encarsia inaron Walker. Fórmula tarsal 5-5-5, primer par de alas hialinas y uniformemente setosas, vena marginal con 6-7 setas a lo largo del margen anterior, grupo de setas basales 4-5; club antenal bisegmentado; espina en la tibia media; ovipositor más largo que la tibia media; cabeza, mesosoma y peciolo marrón obscuro a negro; gaster variable; patas amarillas excepto las coxas en algunos especímenes son oscuras (Fig. 3). Figura 1. Eretmocerus mundus Figura 2. Encarsia sophia Figura 3. Encarsia inaron Conclusiones De las especies E. sophia y E. inaron se obtuvo un total de 456 avispas emergidas representando el 60 % de las recolectas; de E. mundus se obtuvo un total de 304 avispas conformando el 40 % restante, por lo que E. sophia y E. inaron fueron más predominantes en la zona que E.mundus. Las tres especies se ubicaron en los diferentes sitios de muestreo, teniendo presencia en todas las fechas de recolecta. Estos parasitoides se encuentran de manera natural en los 314 agroecosistemas de la región, por lo que es importante conservarlos y aprovecharlos con fines económicos. Agradecimientos A la Dra. Svetlana Nikolaevna Myartseva, por la identificación de las especies encontradas en esta investigación. Al campo experimental las Huastecas del Sur de Tamaulipas por el apoyo y las facilidades prestadas para la realización del mismo. Literatura Citada García, G. D. A. 2012. Colecta e Identificación de Parasitoides de Mosquita Blanca Bemisia tabaci Gennadius en el Sur de Tamaulipas. Tesis de licenciatura. 74 p. Girault, A. A. and Dodd, A. P. 1915. The cane grubs of Australia. Bulletin Bureau Suagarcane Experimental Stations, Queensland Division of Entomology, 2: 1-60. Medina, R. G y Torres, P. I., Bujanos, M. R., de la Torre, R., Guevara, G. R. C y González, C. M. M. 2004. Reproducción y limpieza de mosquita blanca (Bemisia tabaci Gen.) utilizada como vector en pruebas de transmisión de geminivirus en chile (Capsicum annuum L.) Primera Convención Mundial del Chile. pp: 106-114. Mercet, G. R. 1931. Notas sobre afelinidos (Hym: Chalc.) 4° nota. pp: 395-410. Rivas, P. G.1994. Geminivirus virus transmitidos por las moscas blancas. Hoja técnica. Boletín informativo MIP. No 33. Costa Rica. Walker, F. 1839. Monographia Chalciditum, I. London, Hyppolitus Bailliere. 333 p. 315 AVANCE EN TERRITORIO MEXICANO DEL ESCARABAJO DEFOLIADOR Diorhabda spp. LIBERADO EN LOS MÁRGENES DEL RÍO BRAVO COMO CONTROL BIOLÓGICO DEL PINO SALADO (Tamarix spp.) Pablo Zamorano1, Alberto Lafón-Terrazas2, Carlos Sifuentes-Lugo3 y Sergio Sánchez-Peña4. 1Instituto Nacional de Ecología, Periférico 5000, Col. Insurgentes Cuicuilco, Coyoacán, D.F. 04530, México [email protected]. 2 Protección de la Fauna Mexicana, A.C., Calle Ramírez 1602, Col. Pacífico, Chihuahua. Chih. 31030, México [email protected]. 3Comisión Nacional de Áreas Naturales Protegidas, Juan Antonio de la Fuente 1141, Zona Centro, Saltillo, Coah. 25000, México [email protected]. 4Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Calzada Antonio Narro 1923, Saltillo, Coah. 25313, México [email protected]. RESUMEN. Se reporta el avance del escarabajo Diorhabda spp., usado como control biológico del pino salado en territorio mexicano sobre los márgenes de los ríos Bravo y Conchos, resaltando la velocidad de dispersión y el consumo no selectivo del pino salado (Tamarix ramossisima) y del sabino (Tamarix aphylla) con importantes repercusiones entre los habitantes de la región que reclaman el daño a sus árboles de ornato, sombra y cortina rompevientos. Palabras clave: Coleoptera, especies invasoras, control biológico, desierto chihuahuense. Progress in Mexican territory of leaf beetle Diorhabda spp. released on the margins of the Rio Grande as biological control of salt cedar (Tamarix spp.) ABSTRACT. We report the progress of the beetle Diorhabda spp. used as biological control of saltcedar in Mexico on the margins of the Rio Grande and Conchos, highlighting the velocity dispersal and consumption nonselective tamarisk (Tamarix ramossisima) and the sabino (Tamarix aphylla) with important implications among the inhabitants of the region which indicate damages on their ornamental, shade and windbreak trees. Key words: Coleoptera, invasive species, biological control, chihuahuense desert. Introducción Diferentes especies de pino salado Tamarix spp. (T. ramosissima, Tamarix aphylla, T. parviflora, T. chinensis, T. gallica), fueron introducidas como plantas ornamentales para el control de la erosión del suelo en los Estados Unidos hace aproximadamente 200 años (DiTomaso, 1998), utilizando ejemplares de Euroasia y el Norte de África; sin embargo, debido a sus características intrínsecas desplazó a las especies nativas como el álamo (Populus spp.) y el sauce (Salix spp.), convirtiéndose en una especie invasora de las zonas áridas y semiáridas del oeste de los Estados Unidos y del norte de México (Dudley y Kazmer, 2005; Shafroth et al., 2005; Wood, 2005). Frente a esta problemática, en el año 2001, un grupo de investigadores estadounidenses del USDA introdujeron en Nevada, Utah, Colorado y Wyoing al escarabajo Diorhabda spp. (D. carinulata, D. carinata, D. elongata, D. e. deserticola y D. sublineata; De Loach et al., 2009), defoliador natural del pino salado, como control biológico para reducir la expansión y población de esta planta invasora observando un enorme éxito del agente, por ello en 2006 el grupo de investigadores iniciaron una campaña para liberar a D. elongata en Texas y en 2008, pese a las opiniones del sector ambiental en México, se decidió liberar al escarabajo en los márgenes del Río Grande (Río Bravo en México), sin embargo la liberación de D. elongata no resultó exitosa debido a las condiciones ambientales que prevalecen en el sur de Texas, por lo que en 2009 se probó con D. sublineata proveniente de Túnez adaptada a condiciones de calor y sequía más extremos (Tracy y Robbins, 2009) y en 2010 se registró la presencia del escarabajo en 316 territorio mexicano con un éxito sin precedentes (Obs. Pers.). La liberación del escarabajo en el Río Bravo consistió en 15 sitios (siete para D. sublineata y ocho para D. elongata). Dada la complejidad de interacciones que existen en el ambiente natural y la capacidad de respuesta del escarabajo introducido, así como la preocupación de la población local y autoridades mexicanas sobre la posibilidad de que el escarabajo pudiera afectar a otras especies nativas del desierto Chihuahuense, se hace necesario realizar el monitoreo sobre su avance y comportamiento, así como, evaluar el riesgo del impacto sobre especies no objetivo y su posible propagación en la frontera norte de México. Materiales y Método Con el fin de observar la distribución y avance del escarabajo en los márgenes del Río Bravo se establecieron transectos perpendiculares al cauce a la altura de los sitios de liberación de escarabajo con una longitud de 200 m y segmentados en sitios de muestreo cada 20 m y transectos secundarios a una distancia de 1000 m, a cada lado de cada transecto principal, con una longitud de 100 m (Fig. 1). Figura 1. Diseño experimental para el monitoreo del control biológico en los márgenes del río Bravo Por su parte, para el Río Conchos se seleccionaron de manera arbitraria sitios donde se observó impacto del escarabajo sobre Tamarix, específicamente en zonas urbanas e individuos aislados. Para el monitoreo del impacto del escarabajo sobre especies no objetivo, se optó por utilizar la técnica del vecino más cercano basado en cuadrantes alrededor de cada sitio de muestreo, para lo cual se localiza el individuo de Tamarix que haya sido consumido por el escarabajo, posteriormente se localizan tres individuos de especies nativas presentes en tres tipos de estratos vegetativos, una especie arbustiva, una herbácea y una gramínea, a fin de determinar si han sido consumidos por el insecto y estimar en todo caso el daño ocasionado. 317 El grado de herbivoría y la mortalidad de Tamarix por el control biológico, se determinó con base en un índice de cinco categorías de acuerdo al grado de defoliación observado al momento del monitoreo (Cuadro 1). El grado de defoliación es una interpretación visual de la ausencia de follaje debido al consumo por parte del escarabajo. Para obtener dicha información, se establecieron 41 localidades de monitoreo, distribuidas de la siguiente manera: 16 en el municipio de Manuel Benavides, 14 en el municipio de Manuel Ojinaga, 7 en el municipio de Coyame del Sotol, 3 en el municipio de Aldama y 1 en el municipio de Julimes, siendo este último el máximo avance reportado en 2011. Cuadro 1. Índice de categorías del grado de herbivoría y porcentaje de defoliación causado por Diorhabda spp. CATEGORÍA 1 2 3 4 5 % DE DEFOLIACIÓN 80 – 100 60 – 79 40 – 59 20 – 39 0 - 19 GRADO DE HERBIVORÍA Excelente Bueno Regular Malo Muy malo Resultados La distribución del escarabajo sobre el río Bravo hasta 2011 abarcó una longitud de 122 km, mientras que sobre el río Conchos desde la confluencia con el Bravo abarcó una longitud aproximada de 200 km (Fig. 2). En general el grado de herbivoría sobre los tamariscos evaluados fue de alto a excelente (60-100% de defoliación), encontrando al escarabajo principalmente en sitios donde la distribución de Tamarix es continua, mientras que en organismos aislados, la presencia del escarabajo es mínima y en algunos casos solo se observaron restos de mudas o larvas secas. El grado de herbivoría en las inmediaciones de Ojinaga es excelente; en Manuel Benavides se muestran todas las categorías; en Coyame va de muy malo a regular; en Aldama de regular a excelente, y el único registro en Julimes registró una categoría 3. La relación herbivoría/mortalidad guarda cierta proporción, sin embargo la mortalidad real, en el pino salado, ocurre sólo en las ramas terminales y es total cuando la planta agota sus reservas, normalmente después de tres años con dos defoliaciones por año (DeLoach et al., 2009). El sistema de muestreo del vecino más cercano utilizado para detectar posibles impactos sobre la flora nativa del desierto chihuahuense, permitió tener la evidencia del hábito de consumo del escarabajo indicando que a pesar de la abundancia con que se presenta el escarabajo en algunos sitios en cualquiera de sus fases de desarrollo (Fig. 3), no se han observado daños a la flora nativa, entre las que destacan Bacharis salicifolia, Echinocloa crusgali, Nicotiana glauca, Prosopis sp., Celtis pallida y Parkinsonia aculeata. Discusión La liberación del Escarabajo del pino salado en el sur de Texas realizada en el año 2009, se llevó a cabo bajo las condiciones normales del área (i.e. veranos calurosos e inviernos benignos con temperaturas mínimas de 6 a 8 °C bajo cero). 318 319 Figura 2. Avance del escarabajo Diorhabda spp., en territorio mexicano indicando el grado de defoliación de los individuos de Tamarix spp. analizados. 319 Figura 3. Diorhabda sublineata Lucas, 1849 en su fase larvaria estadio 2 (4 mm) y en su fase adulto macho (5.06 mm de longitud por 2.2 mm de ancho). Fotografías de Protección de la Fauna Mexicana, A.C. El insecto ya adaptado durante las pruebas de laboratorio tuvo un gran éxito reproductivo y expansivo y en el primer año logró invadir casi 200 km de río y áreas marginales, teniendo un impacto social en México por la defoliación intensiva tanto sobre la especie objetivo (pino salado), como en el pinabete o sabino (Tamarix aphylla), árbol ornamental y de sombra común en la zona urbana del área, que no estaba contemplada para control, al menos con esa magnitud, lo que indica una necesidad de realizar programas de protección de sabinos y programas de restauración del entorno afectado El desconocimiento acerca del control biológico y su forma de actuar, inclinó al ciudadano común a podar sus árboles (sabinos) para evitar que estos murieran (muerte aparente) debido a la defoliación por el escarabajo cuando la realidad es que se necesita más de una defoliación para que el árbol muera por completo. Lo anterior indica la necesidad apremiante de establecer un programa de difusión e información sobre el control biológico y su impacto ambiental. No se detectó presencia del escarabajo sobre los individuos de Tamarix que se localizaron alejados del río o esta consistía de restos de mudas o larvas secas, lo que puede interpretarse como la necesidad de la presencia de un medio arbolado húmedo (río) para el éxito en el desplazamiento del control biológico y como la denso-dependencia poblacional del insecto, ya que individuos aislados o grupos pequeños mueren al separarse de una población establecida. Es decir, el control biológico actúa con éxito solo en poblaciones grandes. Lo anterior sugiere que el escarabajo se desplazará en grandes grupos por el Río Conchos consumiendo el Tamarix ramossisima hasta alcanzar también a las poblaciones de sabino (T. aphylla) en el corredor agrícola de Meoqui-Delicias-Saucillo-Camargo, lo que tendrá una importante repercusión social por el uso que se le da al sabino como cortina rompe viento en las zonas agrícolas, así como se observó en las poblaciones aledañas al río Bravo y la parte baja del Conchos, donde el árbol es la única sombra en una región sumamente soleada, además de ser fuente de ingresos por la producción de miel a partir de su flor por algunas familias chihuahuenses. Estos impactos sociales son los que deben atenderse y compensarse por el o los responsable(s) técnico, intelectual y diplomático que liberaron al escarabajo defoliador como agente de control biológico del pino salado sin tomar en consideración lo antes señalado, además de remediar los impactos económicos que pudiesen percibirse. Desde el punto de vista ambiental, el control biológico ha resultado un éxito y hasta el momento no se ha observado daño a la flora nativa a pesar de la abundancia con que se presenta 320 en algunas áreas. Pese a lo anterior, es necesario continuar con el monitoreo del avance del escarabajo en territorio mexicano y detectar tempranamente cualquier cambio en sus hábitos, además de contar con información probada y comprobada en campo para mantener informados a los diversos sectores de la sociedad preocupados por el control biológico, para lo que se requiere el apoyo técnico y financiero del gobierno estadounidense para continuar y ahondar en la investigación. Agradecimientos Los autores del presente son sólo los responsables del proyecto en sus respectivas instituciones, sin embargo una gran cantidad de personal de campo y de escritorio han estado involucrados en el proyecto, por lo que se hace extensivo este agradecimiento y a María del Rosario Castillo Rendón por la elaboración del mapa. Literatura Citada DeLoach, C. J., A. E. Knutson, P. J. Moran, J. H. Everitt, J. Michels, M. Muegge, C. Randal, T. Fain, M. Donet y C. Ritzi. 2009. Progress on biological control of saltcedar in Texas 20042008. Report of Information for the Public, USDA, 57 pp. DiTomaso, J. 1998. Impact, Biology, and Ecology of Saltcedar (Tamarix spp.) in the Southwestern United States. Weed Technology 12: 326-336. Dudley, T. L. y D. J. Kazmer. 2005. Field assessment of the risk posed by Diorhabda elongata, a biocontrol agent for control of saltcedar (Tamarix spp.), to a non-target plant, Frankenia salina. Biological Control 35:265-275. Shafroth, P. B., J. R. Cleverly, T. L. Dudley, J. P. Taylor, C. Van Riper, E. P. Weeks y J. N. Stuart. 2005. Control of Tamarix in the Western United States: implications for wáter salvage, wildlife use, and riparian restoration. Environmental Management 35(3): 231-246. Tracy, J. L. y T. O. Robbins. 2009. Taxonomic revisión and biogeography of the Tamarixfeeding Diorhabda elongata (Brullé, 1832) species group (Coleoptera: Chrysomelidae: Galerucinae: Galerucini) and analysis of their potencial in biological control of tamarisk. Zootaxa 2101: 1-152. Wood, M. 2005. Escarabajos beneficiosos controlan la maleza pino salado. On line: www.ars.usda.gov/is/espanol/pr/2005/050401.es.htm 321 PARÁMETROS DE CRÍA PARA EL MANTENIMIENTO DEL DEPREDADOR Delphastus pusillus COMO AGENTE DE CONTROL DE LA MOSCA BLANCA DE LOS INVERNADEROS Trialeurodes vaporariorum BAJO CONDICIONES DE CASA DE MALLA Sonia Cristina Acero-Sotelo. Programa manejo integrado de plagas Corpoica-Tibaitata. Facultad de Ciencias y Educación. Licenciatura en Biología, Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Cra 3 No.26 A-40, Bogotá, Colombia. [email protected] RESUMEN. Se realizó un estudio para la cría del depredador Delphastus pusillus en plantas hospederas de frijol Phaseolus vulgaris variedad ICA cerinza, determinando la edad vegetativa tolerante de la planta, la infestación inicial adecuada de la plaga, la producción óptima de adultos del depredador y su efecto de consumo sobre los estados de la plaga. La edad V3 fue tolerante al fitófago y presentó un desarrollo adecuado con respecto al testigo. La infestación de 250 adultos de mosca blanca generó menor impacto en la planta y alimento necesario para el depredador. La producción de adultos óptima para iniciar una cría fue de 3 parejas de parentales por planta produciendo un promedio de 8,95 adultos hembras y una sobrevivencia del 73,25%. Se consideró la cohorte 2 óptima para cría en casa de malla al obtener una sobrevivencia del 61,99%. Las dos parejas del depredador tuvieron un mayor consumo de inmaduros de mosca blanca. Palabras clave: Edad vegetativa, infestación inicial, producción óptima, efecto depredador. Bredding parameters for maintenance of predator Delphastus pusillus as controller of the whitefly greenhouses Trialeurodes vaporariorum in conditions of house mesh ABSTRACT. A study for the predator breeding host plants Delphastus pusillus in Phaseolus vulgaris bean variety ICA cerinza, determining the plant tolerant vegetative age, adequate initial infestation of the pest, the optimal production of adults of the predator and its effect consumption on the stages of the pest. The V3 tolerant age was phytophagous and presented a proper development compared to the control. The infestation of whitefly adults 250 generated less impact on the plant and food necessary for the predator. Optimal production to initiate breeding was 3 parental adults pairs by plant producing an average of 8.95 adult females and 73.25% of survival. Cohort 2 was considered optimal for breeding in house mesh to obtain a survival of 61.99%. Two pairs of predator produced high consumption of stages of whitefly. Key words: Age vegetative, initial infestation, optimal production, predator effect. Introducción En Colombia la mosca blanca de los invernaderos puede llegar a causar pérdidas del 50% en los rendimientos de cultivos de hortalizas y leguminosas, dependiendo de los factores de cultivo, ambientales y de manejo específico de la plaga (Ashby et al., 1992). Siendo el control químico la principal estrategia de manejo contra la plaga por parte de los agricultores, como consecuencia es frecuente encontrar que diferentes estados de desarrollo de T. vaporariorum hayan desarrollado niveles de resistencia y tolerancia a insecticidas, debido a su uso prolongado y a sus dosis excesivas. Para dar alternativas al control químico realizado contra la plaga, García et al. (2000) adelantaron un estudio de diagnóstico e identificación de los enemigos naturales de las especies de mosca blanca de mayor importancia. Uno de los entomófagos reconocidos en dicho estudio como potencial biocontrolador fue el insecto depredador Delphastus pusillus (Le Conte) (Coleoptera: Coccinelidae). De los estudios realizados en campo, se encontró que D. pusillus dentro de su dieta alimenticia prefiere los estados inmaduros de especies de mosca blanca como T. vaporariorum, B. tabaci y Aleurotrachelus socialis; además de su amplia distribución geográfica en diferentes regiones de Colombia y su eficiencia depredadora que logra mantener su longevidad y fecundidad en función a la densidad de moscas blancas (García y López-Ávila, 322 2000). El propósito de este trabajo es obtener parámetros de cría para el mantenimiento del depredador D. pusillus, que integren las interacciones biológicas tri-tróficas entre la planta hospedera, fitófago y depredador v p “ m ” específicamente para la zona de Mosquera-Cundinamarca. Materiales y Método E ó C Iv ó “T b á ” p ó Colombiana de Investigación Agropecuaria- Corpoica-, ubicado en Mosquera-Cundinamarca a 2640 m. . .m. E v p “ m ” mp p m 0 0 de 26 C+ 11 C y humedad relativa del 76%+ 7%. El invernadero tiene un área total de 289 m2 dividido en tres módulos destinados para: Siembra de material vegetal limpio (frijol ICA cerinza y cargamanto rojo), establecimiento de mosca blanca en plantas de frijol cargamanto rojo y área para ensayo. Se recolectaron individuos adultos de D. pusillus en dos fincas del municipio del Espinal, las dos cohortes se establecieron en laboratorio por sexos en jaulas entomológicas a una temperatura promedio de 25+ 2 0C y una humedad relativa de 58+ 5 %, durante 24 horas sin alimento y luego fueron llevados a casa de malla para iniciar la experimentación (Fig. 1a, b y c). a c b Figura 1. Establecimiento del depredador D. pusillus: a) Jaula entomológica para establecer los adultos por 24 horas, b) Separación por sexos de las cohortes, c) Unidades experimentales para la liberación. Para determinar la edad vegetativa tolerante y la infestación inicial óptima, se realizó un diseño factorial de 3x3, los factores fueron correspondientes a las edades vegetativas V2, V3 y V4 (según escala CIAT, 1987) y a las densidades de infestación de 500, 250 y 0 adultos de mosca blanca. Con este diseño se obtuvieron datos sobre morfología de la planta y daños foliares, además de realizar registro de los estados de huevo, ninfa 1 y ninfa 2 a 3 producidos por T.vaporariorum. Para determinar la producción óptima del depredador se realizó un diseño completamente al azar, los tratamientos correspondieron al número de 2, 3 y 4 parejas del depredador, se realizó un registro del número de los individuos obtenidos durante los estados de huevo, estados de larva y adulto del depredador. Para estimar el efecto depredador se tomó el mismo diseño y se registró el consumo del número de huevos, ninfas 1, ninfas 2- 3 y ninfas 4 de mosca blanca. Resultados y Discusión Desarrollo de la planta y daño foliar. Los resultados obtenidos sobre el desarrollo morfológico de la planta la edad V3 correspondiente al desarrollo del primer trifolio demuestra ser la edad tolerante a infestaciones entre 250 y 500 adultos de mosca blanca, al presentar un promedio de 84,8% de características favorables respecto al testigo con: 99,28% de hojas mantenidas en planta, 95,36% de longitud apical alcanzada, 96,73% de entrenudos alcanzados y 323 55,67% de hojas infestadas (Fig. 2a). Mientras las edades V2 y V4 presentaron enanismo, enroscamiento foliar y aumento en la caída de hojas durante su desarrollo vegetativo. En cuanto al daño foliar total causado por la mosca blanca T. vaporariorum, para edades el mayor porcentaje de daño es para la edad V2 con 45,62% y con un menor porcentaje para la edad V4 con 40,73% y la edad V3 con 39,59%. Siendo la edad V3 la que presentó un menor daño con 14,53% de marchitez, 16,24% de clorosis, 3,49% de mildeo polvoso y 2,34% de daño por fumagina (Fig. 2b). Como lo anota Bernal (2008) los adultos de mosca blanca tienden a ovipositar en plantas de frijol que se encuentran finalizando la etapa vegetativa debido a que ofrecen hojas jóvenes, tienen mayor tolerancia a infestaciones moderadas y ofrecen una mayor área de forrajeo para el fitófago. 50 100 longitud apical 80 N. entrenudos 60 Hojas en planta 40 N. hojas infestadas 20 V2 V3 V4 marchitez 40 30 clorosis 20 mildeo polvoso 10 fumagina 0 Crecimiento foliar 0 a % daño foliar % alcanzado 120 V2 V3 V4 % Total alcanzado daño total Edades Vegetativas Edades Vegetativas b Figura 2. Daños causados por infestación de mosca blanca T. vaporariorum en las edades vegetativas frijol ICA cerinza. a) Desarrollo alcanzado de las edades respecto al testigo, b).Daños foliares. Establecimiento de mosca blanca. Respecto a los individuos encontrados de los estados inmaduros de mosca blanca, se mostró que la edad V3 tuvo una mayor sobrevivencia durante los estados de huevo a ninfas 1 con un 84,01% y una producción promedio de 467,64 huevos y 392,14 ninfas 1 en 4cm2 del área foliar, considerándose la edad óptima para el suministro de alimento en la cría del depredador (Fig. 3a). 400 500 400 300 N. de 300 individuos 200 huevo N. de individuos 200 huevo ninfa 1 100 ninfa 1 100 ninfas 2-3 V2 V3 ninfa 2-3 0 0 500 V4 250 Niveles de infestación Edades Vegetativas a b Figura 3. Establecimiento de mosca blanca. a) Por edades vegetativas, b) Por niveles de infestación. Respecto a los niveles de infestación para el estado de huevo a ninfas 1 se mostró que el nivel de 500 adultos de mosca blanca tuvo una mayor sobrevivencia con 78,1%, de igual manera para el estado de ninfas 1 a ninfas 2-3 con una sobrevivencia de 63,94%, mientras para el nivel de 324 250 adultos de mosca blanca tuvo una mayor sobrevivencia de estados de huevo a ninfa 1 con 75,35% y para el estado de ninfa 1 a ninfas 2-3 con una sobrevivencia del 54,15% (Fig. 3b). Infestación inicial. De acuerdo a los daños en el desarrollo de la planta, los daños foliares y los individuos de mosca blanca establecidos; la infestación inicial de 250 adultos es la adecuada ya que mantiene el 88,62% de las hojas en planta, evita la aglomeración de inmaduros en los foliolos con 55,88% de hojas infestadas en planta, genera un daño foliar lento en las plantas desde su etapa vegetativa hasta su etapa reproductiva y una producción del 38% de inmaduros. Características de las etapas intermedias del frijol que según Bernal (2008) favorecen el establecimiento de los estados inmaduros de la mosca blanca de los invernaderos y su culminación hasta el estado adulto, al tener asegurado su suministro de alimento. Además de afirmar que las infestaciones menores a 500 adultos de mosca blanca generan un daño moderado y evitan la aglutinación de estados inmaduros por foliolo. Producción óptima del depredador. Teniendo en cuenta la selección de la edad V3 como planta hospedera y de la densidad inicial de infestación de 250 adultos de mosca blanca, se comparó la producción de cada uno de los estados del depredador respecto al número de parejas parentales y las dos cohortes recolectadas en el Espinal. La producción de adultos óptima para iniciar una cría fue de 3 parejas de parentales por planta con un promedio de 8,95 adultos hijos hembras y una sobrevivencia del 73,25% de individuos durante el ciclo de vida del depredador. Mientras las 2 y 4 parejas parentales del depredador a pesar de mostrar una tasa de fecundidad alta de 8,9 y 10,23, durante el ciclo de vida del depredador se mostró una menor sobrevivencia de 49,8% y 38,24% respectivamente (Fig. 4a). Lo cual evidencia que la producción de adultos hijos respecto al número de parentales puede estar influenciada por la tasa de crecimiento de la población del depredador, que se reduce por una baja sobrevivencia de los estadios inmaduros aunque la tasa de fecundidad de los adultos sea elevada (Hassell, 1988). Lo cual explica la poca eficiencia de producción de adultos hijos en las parejas parentales 2 y 4 parejas del depredador, presentando el menor porcentaje de sobrevivencia durante todo el ciclo de vida. 50 30 40 N. de individuos 30 25 huevo larva 1 20 larva 2 10 0 2 3 4 larva 3 5 larva 4 0 larva 1 larva 2 larva 3 larva 4 1 parejas depredador D. pusillus adulto a huevo N. de 20 individuo 15 s 10 b 2 adulto cohortes Figura 4. Producción de estados del depredador D. pusillus de acuerdo al: a) número de adultos parentales y b) cohortes. Se consideró la cohorte 2 óptima para cría en casa de malla al obtener una sobrevivencia del 61,99%, de individuos durante el ciclo de vida del depredador y una producción promedio de 15,3 adultos del depredador; mientras la cohorte 1 presentó un 45,55% de sobrevivencia y una 325 producción promedio de 11,86 adultos del depredador (Fig. 4b). Por lo cual el desconocimiento de la edad de los adultos parentales puede ser un factor limitante que genera endocría, afectando negativamente la fecundidad (Clercq et al., 1998, citado por García, 2005). Efecto de consumo del depredador. El mayor consumo fue por parte de las 2 parejas parentales del depredador con un promedio de 91,8 huevos y de 46,5 ninfas 1, mientras las 3 y 4 parejas parentales del depredador presentaron un consumo promedio de 84,5 y 57,05 huevos; 46 y 30,8 ninfas 1 respectivamente. Respecto al consumo total de estados de mosca blanca, las 2 y 3 parejas de parentales y sus individuos producidos presentaron un mayor consumo con 44,15 y 42,04 estados de mosca blanca. Se evidenció un mayor consumo de los estados de huevo y ninfas 1 de la mosca blanca T. vaporariorum por parte de los adultos parentales y de las larvas 1 hijas del depredador (Fig. 5a). Según García (2006) este comportamiento de consumo se debe al efecto negativo en el consumo de presas por el incremento en la cantidad de adultos del depredador, los cuales aprovechan la mayor parte de su tiempo en la reproducción y encuentro con coespecíficos. Respecto a las cohortes del depredador, la cohorte 2 presentó el mayor consumo total de estados de mosca blanca con un promedio de 42,92 estados consumidos, mientras la cohorte 1 presentó 37,14 estados consumidos (Fig. 5b). En las dos cohortes se observó que los adultos parentales del depredador presentan un mayor porcentaje de consumo, lo cual asegura su oviposición. Debido a que existe una relación lineal entre presas ingeridas y tasa de crecimiento (Beddington et al., 1976, citado por García, 2005). 100 estados consumid os 100 80 estados 60 consumid 40 os huevo 50 ninfa 1 ninfas 2-3 0 2 3 4 parejas del depredador huevo ninfa1 ninfa 2-3 20 ninfa 4 ninfa 4 0 1 total consumido 2 consumo total cohortes a b Figura 5. Promedio de consumo de estados de mosca blanca T. vaporariorum en relación a: a) las parejas parentales del depredador b) y las cohortes recolectados. Conclusiones Los parámetros para establecer la cría del depredador en condiciones en casa de malla fueron los siguientes: Las plantas hospederas de edad V3 tuvieron mayor tolerancia al fitófago al presentar características morfológicas óptimas de desarrollo como mayor longitud apical y número de entrenudos, menor pérdida de hojas en planta, mayor número de hojas infestadas, un menor daño foliar y un establecimiento adecuado de los estados de mosca blanca. La infestación inicial de 250 adultos de mosca blanca fue considerada la adecuada al causar menor impacto en el desarrollo de la planta, lo cual asegura una mayor disponibilidad de alimento para los estados inmaduros de la mosca blanca. La muestra poblacional óptima para iniciar una cría fue de tres parejas parentales por planta, debido a su mayor producción de adultos hijos hembras que asegura la oviposición en la 326 siguiente generación, además de presentar una mayor sobrevivencia de los estados durante el ciclo de vida del depredador. El cohorte 2 se considera óptimo para la cría del depredador ya que presentó una mayor sobrevivencia durante todo el ciclo de vida y mayor producción de adultos hijos. Los adultos parentales presentaron un mayor consumo de huevos y ninfas de I ínstar de mosca blanca lo cual aseguró su oviposición y sobrevivencia en la transición de sus estados larvales. Agradecimientos Al centro de investigaciones de Corpoica Tibaitatá Mosquera –Cundinamarca por darme la oportunidad de aportar a su macroproyecto “D mp m ó í p el control de la mosca blanca Trialeurodes vaporariorum en cultivos de tomate bajo cubierta, con base en la utilización del depredador Delphastus pusillus”. Literatura Citada Ashby, J. A. 1992. Manual para la evaluación de tecnologías con productores. IPRA/ Centro Internacional de Agricultura Tropical CIAT, Cali. 127 p. Bernal, L; Pesca, L. 2008. Plan de muestreo directo para Trialeurodes vaporariorum (Westwood) (Hemiptera: Aleyrodidae) en cultivos comerciales de tomate. Revista de Agronomía Colombiana 26(2), 266-276. CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical). 1987. Sistema estándar para la evaluación de germoplasma de fríjol. Efecto de métodos de control y rotaciones. Tesis Maestría. Chapingo, México, Colegio de Posgraduados. 192 p. En: Resúmenes sobre Fríjol, Vol. XVI, No 2. 1991. García, J.; López-Avila, A. 2000. Manejo integrado sostenible de las moscas blancas como plagas y vectores de virus en los trópicos. Reconocimiento, diagnóstico y caracterización de moscas blancas en el trópico alto de América Latina. Informe técnico final. Corpoica. Bogotá. García, J.; Benítez, E.; López-Ávila, A. 2005.Tabla de vida de Delphastus pusillus (Coleoptera: Coccinellidae) en la mosca blanca Trialeurodes vaporariorum (Hemiptera: Aleyrodidae). Revista Colombiana de Entomología 31 (2): 155-160. García, J.; Benítez, E.; López-Ávila, A. 2006. Efecto de la densidad del depredador de moscas blancas D. pusillus (Le Conte) (Coleoptera: coccinellidae) sobre su eficiencia de búsqueda. Revista Colombiana de entomología 32 (1): 10-17. Hassel, P. 1988. Dinámica de la competencia y la depredación. Oikos-tau S.A. BarcelonaEspaña. pp. 73-89. 327 NUEVOS REGISTROS Y HABITOS DE CONSUMO DE DEPREDADORES DE CHAPULINES EN EL ESTADO DE GUANAJUATO, MEXICO Manuel Darío Salas-Araiza, Dulce Daniela López-Pérez, Oscar Alejandro Martínez-Jaime, Luis Felipe RamírezSantoyo y Eduardo Salazar-Solís. Departamento de Agronomía. Universidad de Guanajuato. ExHacienda El Copal km 5 carr. Irapuato-Silao Cp 36500 [email protected]. RESUMEN. Se reporta a Stagmomantis limbata (Hahn) (Mantodea: Mantidae) y a Misumena vatia Clerck (Araneae: Thomisidae) como nuevos registros para Guanajuato como depredadores de chapulines. Se evaluó la capacidad de consumo de el mántido a las 24, 48 y 72, para la araña sólo se evaluó el consumo en un solo evento. S. limbata consume más chapulines a las 48 h consumiendo el 50% de las presas. M. vatia consumió un chapulín cada 24 h. Palabras Clave. Stagmomantis limbata, Misumena vatia, consumo. New record and consumption of grasshopper predators in Guanajuato state, Mexico ABSTRACT. A new species of grasshopper predator Stagmomantis limbata (Hahn) (Mantodea: Mantidae) and Misumena vatia Clerck (Aranea: Thomisidae) is reported here in the state of Guanajuato. The consumption of S. limbata at 24, 48, and 72 hours for one spider was assessed in only one event. S. limbata consumed more grasshoppers at 48 h, consuming 50% of the grasshoppers. In comparison, M. vatia consumed one grasshopper every 24 h. Key words. Stagmomantis limbata, Misumena vatia, consumption. Introducción La composición de las especies, distribución, preferencias de hábitat y alimenticios de los artrópodos depredadores en cultivos y en reductos de vegetación, son fundamentales para entender el papel que juegan estos organismos en el control biológico mediante la manipulación del hábitat en los agroecosistemas (Queiroz et al., 2012). Conocer los enemigos naturales de los insectos es importante para valorar su impacto en las poblaciones, sobre todo si son de importancia económica para los cultivos y es una alternativa al uso de insecticidas. Los mantidos (Mantodea) son poco conocidos como depredadores debido a que sus poblaciones son escasas y dispersas, pero son parte del complejo de enemigos naturales de muchos insectos plaga; en el área agrícola su presencia nunca ha sido valorada (Hill, 1994). Pocos trabajos se han realizado sobre mantis en México, Núñez-Vásquez et al. (2006) complementaron los únicos trabajos realizados para México por Saussure et al. (1899), los primeros indican que para México se incluyen 15 géneros y 34 especies, pero indican que el número de taxa reportados es probable que se incremente, su trabajo estuvo relacionado al estado de Yucatán. Una hembra de Stagmomantis limbata (Hahn) (Mantodea: Mantidae) bien alimentada, presenta mayor masa corporal, dureza en el exoesqueleto, alta fecundidad comparadas con hembra cuya dieta fue limitada, la dureza del abdomen correlacionó positivamente con la fecundidad y a su vez atrajeron más machos; las hembras con una dieta pobre es más probable que canibalicen al macho, la cópula ocurre en septiembre (Maxwell et al. 2010a). Las hembras de esta especie son depredadoras muy voraces después de algunas semanas de alimentación pueden medir más de 50 mm de longitud y pesar hasta 3 g, es de origen Neártico, habita pastizales y regiones áridas (Maxwell et al. 2010b). 328 El impacto de las arañas en lepidópteros defoliadores es mayor, cuanto más altas sean las poblaciones de éstas, las cuales son más abundantes en pastos (Demolin-Leite et al. 2012). La araña cangrejo Misumena vatia Clerck (Araneae: Thomisidae) no produce telaraña, ésta sólo la fabrica para proteger a los huevos, su distribución incluye Norteamérica y Europa. Se camuflajea con la vegetación circundante para atrapar a sus presas de las cuales se alimenta paralizándolas al inyectarles veneno (Comstock 1965), es atraída por el polen de las flores y permanece en ellas para atrapar insectos que allí llegan (Morse, 1981). En el estado de Querétaro, Uribe-González y Santiago-Basilio (2012) mencionan que la araña Neoscona spp (Araneae: Araneidae) se alimenta de ninfas de chapulín cuando son capturadas en la telaraña; Salas-Araiza y Salazar-Solís (2009) señalaron a Argiope spp (Araneidae) depredando ninfas y adultos del chapulín Syrbula admirabilis (Uhler) en Irapuato, Gto. En el Bolsón de Mapimí, Rivera (2004) indica que Araneus diadematus Clerck (Araneae: Araneidae), Argiope aurentia Lucas (Araneae: Argiopidae) y Aphonopelma spp (Araneae: Theraphosidae) depredan a Bootethix argentatus Bruner Orthoptera: Acrididae). Con el fin de contribuir a incrementar el conocimiento de los enemigos naturales de chapulines, el presente trabajo tuvo como objetivo dar a conocer nuevos registros de depredadores de acrididos y contribuir al conocimiento de sus hábitos de consumo en el estado de Guanajuato. Materiales y Método El trabajo se realizó en el Laboratorio de Entomología y en el campo experimental de la División Ciencias de la Vida de la Universidad de Guanajuato (20° 44´ 22´´ N, 101° 20´ 10´´ O; 1750 msnm; 650 mm anuales/promedio). La colecta de las mantis Stagmomantis limbata (Hahn) (Mantodea: Mantidae) se realizaron en Thuja occidentalis (Cupresassea); la araña Misumena vatia fue recolectada en zacate cortador Chloris galleana Kunth (Poaceae) del mismo campus. El trabajo se hizo a partir del 25/octubre/2012. Para la evaluación de depredación por S. limbata se emplearon seis jaulas entomológicas de 50x35x35 cm con malla de plástico, en cada una se colocó una mantis y 10 chapulines Sphenarium purpurascens (Charpentier) (Orthoptera: Acrididae) de tercer estadio, cada caja incluyó un frasco con pasto cortador para alimentación del chapulín, se tuvo un fotoperiodo de 12:12 (L:O), las lecturas se hicieron a las 24, 48 y 72 horas contando el número de chapulines consumidos; la misma prueba se realizó posteriormente empleando como presa a Melanoplus femurrubrum (De Geer) (Orthoptera: Acrididae), en este caso se usaron 5 individuos/jaula. El análisis del consumo de S. limbata para las dos especies de chapulines se hizo mediante la prueba H no paramétrica de Kruskal-Wallis para comparar el consumo a las 24, 48 y 72 h. Para determinar si hubo diferencias en el consumo entre las dos especies de chapulines, se uso un análisis de medidas repetidas (no paramétrica); la prueba DMS al 10% se aplicó para contrastar las medianas del porcentaje de consumo. Para la evaluación de depredación por Misumena vatia solamente se mantuvo un individuo en jaula entomológica de 25x20x35 cm con un recipiente con Chloris gayana en agua. Se le adicionaron cinco individuos de S. purpurascens y se registró el consumo diario por una semana. El mantido tuvo un peso promedio de 1.84 g, en tanto que S. purpurascens pesó en promedio 0.54 g y M. femurrubrum 0.64 g. 329 Resultados y Discusión Consumo de chapulines por S. limbata. No hubo diferencias en los periodos de consumo para Sphenarium purpurascens (Sp) (H=0.9572; p=0.6196), pero al depredar Melanoplus femurrubrum (Mf) hubo diferencias significativas (H=4.5208; p=0.1043) en los periodos de alimentación; en el cuadro 1, se observa que a las 48 h se presentó la depredación más alta con un 50% de Mf consumidos. Es posible que cuando la mantis se alimentó de Sp el movimiento más lento y la consistencia suculenta del chapulín favorezcan la alimentación, ya que fue uniforme durante los tres periodos (Cuadro 2); Mf aparentemente se activa a las 48 h de estar confinada y es capturada más fácilmente, ya que la mantis responde a los estímulos de movimiento de la presa para capturarla aun cuando este comiendo otra (Salas-Araiza, sin publicar), Sánchez-Cornejo et al. (2012) mencionan que la capacidad depredadora de un entomófago esta influida por diversos factores, ellos destacan el estado fisiológico del depredador y la presa, la densidad de la presa y los antecedentes alimenticios del depredador, entre otros; en este trabajo se utilizaron mantis de la misma edad de desarrollo, pero no se determinó los antecedentes alimenticios de éstas. Se observó que S. limbata permanece inmóvil esperando a su presa y en cuestión de segundos con sus patas delanteras captura al chapulín sujetándolo por la cabeza y patas traseras, en seguida desprende las patas anteriores para evitar que se libere y comienza a comer el abdomen; una vez que termina, come las patas mesotorásicas, después procede a comer la cabeza dejando las antenas al final, consume luego el tórax y finalmente retira una por una las patas traseras para consumirlas. En todos los casos el único residuo que dejó fue el proctodeo y la zona de los pretarsos. Este proceso se hizo en 33.5 m. No hubo diferencias significativas entre consumir alguna especie en particular (Sp o Mf) en los tres periodos de tiempo 24 h (U=24.0; p=0.3593), 48 h (U=9.5; p=0.1873) y 72 h (U=19.0; p=0.9350) por S. limbata, lo cual concuerda con sus hábitos alimenticios generalistas. Se ha observado que en confinamiento (Salas-Araiza sin publicar) depreda chinche del sorgo, adultos de sírfidos, abejas, crisomélidos, arañas cangrejo y tetigónidos. El consumo diario promedio de Sp y Mf por S. limbata fue de 3.3 chapulines, por lo que en un día consume 1.78 g cuando come de la primera especies de acrídido y de 2.11 g cuando lo hace del segundo, lo que equivale a consumir el equivalente a su propio peso o un poco más, diariamente. Cuadro 1. Contraste de medianas (promedios de rangos asignados) del porcentaje de consumo de dos especies de chapulines por S. limbata en diferentes periodos de tiempo. % Consumo Hora DMS, p=0.1. Sp 30 a 35 a 35 a 24 48 72 Mf 20 b 50 a 30 ab Cuadro 2. Contraste de medianas del porcentaje de consumo de Sp y Mf por S. limbata. FACTOR Especie de chapulín 24 h Sp 30.0 a Mf 20.0 a % Consumo 48 h Sp 35.0 a Mf 50.0 a Mann-Whitney, p=0.05 330 72 h Sp 35.0 a Mf 30.0 a Consumo de chapulines por Misumena vatia. Esta especie de Thomsidae no forma telarañada para atrapar a su presa (Comstock, 1965), se observó que la araña sujeta las patas traseras de Sp con un hilo de seda, inmovilizándolo de manera que lo pueda sujetar de la parte medial del tórax y la cabeza, dando lugar a que la araña logre liberar sustancias degradadoras para posteriormente comenzar a succionar los órganos internos del chapulín. Una vez que ha terminado de succionar los órganos internos y que el chapulín ya no tiene movimiento, continua succionando la parte externa del tórax , abdomen, patas traseras, patas intermedias y las patas delanteras, concluyendo con la cabeza, dejando solamente la parte del proctodeo. A las 48 h consumió dos chapulines con un peso de 0.54 g. Junto con el reporte de la araña Argiope spp que forma telaraña, este primer reporte de M. vatia aumenta el conocimiento de los enemigos naturales de chapulines, sobre todo del chapulín de la milpa Sphenarium purpurascens que ha incrementado su presencia y daño en maíz (CESAVEG, 2003). Conclusiones Se reportaron dos nuevos depredadores de chapulines en el estado de Guanajuato el mántido Stagmomantis limbata y el tomisido Misumena vatia; el primero consumió la misma cantidad de S. purpurascens en los tres periodos de tiempo, cuando comió M. femurrubrum lo hace en mayor cantidad a las 48 h y come diariamente un poco más de su propio peso. El tomisido consumió un chapulín en 24 h. El registro de ambas especies para el estado de Guanajuato aumentará la lista de artrópodos benéficos como herramientas en el manejo de chapulines plaga de los cultivos en el Estado. Agradecimientos A Martin B. D. Stiewe del Natural History Museum of London por la identificación de Stagmomantis limbata. Literatura Citada CESAVEG. (Comité Estatal de Sanidad Vegetal de Guanajuato). 2003. Sphenarium purpurascens. Ficha Técnica CH01. Programa de Sanidad Vegetal de Guanajuato SAGARPA-SDA-CESAVEG. Celaya, Gto. Comstock, J. 1965. The spider books. C. Brown Co. Ithaca, New York. Demolin-Leite, G., R. V., Dos Santos, V, J., Cola, Z. C. I. M. E., Almeida, P. S., Fiúza, F., G. Wilson, F. y M. Alvarenga, S. 2012. Habitat complexity and Caryocar brasiliense herbivores (Insecta: Arachnidae: Araneae). Florida Entomologist. 95(4): 819-830. Hill, J. D. 1994. Agricultural Entomology. Timber Press Portland Oregon. 635 pp. Maxwell, M. R., K. L. Barry. y J. Philip M. 2010a. Examinations of female pheromone use in two praying mantids, Stagmomantis limbata and Tenodera aridifolia sinensis (Mantodea: Mantidae). Annals of the Entomological Society of America. 103 (1): 120-127. Maxwell, M. R., K. M. Gallego, y K. L. Barry. 2010b. Effects of female feeding regime in a sexually cannibalistic mantid: fecundity, cannibalism, and male response in Stagmomantis limbata (Mantodea). Ecological Entomology. 35(6): 775-787. Morse, D. H. 1981. Prey captura by the crab spider Misunema vatia (Clerck) (Thomisidae) on three common nativa flowers. American Midland Naturalist. 105(2): 358-367. Núñez-Vázquez, C., F. J. Nava-Guizar. y J. A. Trejo- v . 2006. L “m ” Y á, México (Athropoda: Insecta: Mantodea). Entomología Mexicana 5(2): 1045-1049. 331 Queiroz, G. H., F. J. Cividanes, I. C. Fernandez, M. y L. R. Batista. C. 2012. Population fluctuations of Formicidae (Hymenopetra) and Araneae (Arachnida) in two tillage systems in the region of Guaíra-SP. Florida Entomologist. 95(4):1011-1018. Rivera, G. E. 2004. Records of predators and parasites (vertebrates and invertebrates) of creosote bush grasshopper Bootetix argentatus Bruner, 1889 (Orthoptera: Acrididae: Gomphocerinae) from the Bolsón de Mapimí, Ggo. (Chihuahuan Desert), Mexico. Acta Zoológica Mexicana (n.s.) 20:287-290. Salas-Araiza, M. D. y E. Salazar-Solís. 2009. Enemigos naturales de plaga de chapulín (Orthoptera: Acrididae) con énfasis en Guanajuato, México: Una breve revisión. Vedalia 13(2):57-64. Sánchez-Cornejo, R. A., G. J. Flores-Hernández, A. A. Adame-Fernández, G. Cordoba-Merino, M. S. Flores-Gutiérrez. y M. Flores. 2012. Capacidad depredadora de Ranatra fusca (Hemiptera: Nepidae) sobre larvas de Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) en condiciones de laboratorio. Entomología Mexicana 11(1): 282-286. Saussure, H., L. Zehntner y A. Pictet. 1899. Biología Centralli Americana. Insecta, Orthoptera. Vol. 11. Pp. 123-197. Uribe-González, E. y M. A. Santiago-Basilio. 2012. Contribución al conocimiento de enemigos naturales del chapulín (Orthoptera: Acridoidea) en el estado de Querétaro, Méx. Acta Zoológica Mexicana 28(1):133-144. 332 CAPACIDAD DE CONSUMO DE Chrysoperla carnea STEPHENS (NEUROPTERA: CHRYSOPIDAE) SOBRE Bactericera cockerelli SULCER (HEMIPTERA: PSYLLIDAE) Manuel Darío Salas-Araiza, Oscar Alejandro Martínez-Jaime, Luis Gerardo Lara-Alvarez, Eduardo Salazar-Solís, Fidel René Días-Serrano. Universidad de Guanajuato. División Ciencias de la Vida. Departamento de Agronomía. Exhacienda El Copal- Km. 5 carr. Irapuato- Silao. CP. 36500. [email protected]. RESUMEN. Se evaluó la capacidad de consumo de larvas de Chrysoperla carnea (Cc) sobre huevos y ninfas de Bactericera cockerelli (Bc) en condiciones de laboratorio, el análisis estadístico se realizó mediante la prueba H de Kruskal-Wallis para contrastar las medianas de las cuatro muestras independientes, para la separación de los rangos asignados se aplicó una prueba DMS al 5%. A las 48 h, las larvas de tercer ínstar de Cc consumieron el 70% de los huevos de Bc. A las 24 h las larvas de segundo ínstar de Cc depredaron un 85% de ninfas de primer ínstar de Bc y 90% a las 48 h. Las larvas de todos los estadios de Cc consumen mayor cantidad de huevo y ninfas de primer ínstar de Bc. Estos resultados contribuirán al manejo eficiente de crisopas en el control de Bc en solanáceas, principalmente para determinar las etapas de desarrollo de Bc preferidas por Cc. Palabras clave: Bactericera cockerelli, Chrysoperla carnea, consumo. Consumption of Chrysoperla carnea Stephens (Neuroptera: Chrysopidae) on Bactericera cockerelli Sulcer (Hemiptera: Psyllidae) ABSTRACT. The consumption of larvae of Chrysoperla carnea (Cc) was evaluated on eggs and nymphs of Bactericera cockerelli (Bc) in laboratory conditions. The statistical analysis was made by the H test of Kruskal-Wallis in order to contrast the medium of the four independent samples, for the separation of assigned ranges a MSD test at 5 % was applied. At 48 hours the larvae of the third stage of Cc consumed 70 % of the eggs of Bc. At 24 hours the larvae of the second stage of Cc depredated 85 % of nymphs of first stage of Bc and 90 % at 48 hours. The larvae of all stages de Cc consumed the major amount of eggs and nymphs of the first stage of Bc. These results will contribute to the efficient management of lacewings for the control of Bc, also for knowledge of the developmental stage in which the Bc is more susceptible to be controlled by the larvae of lacewings. Key words: Bactericera occkerelli, Chrysoperla carnea, consumed. Introducción Bactericera cockerelli (Bc) se alimenta de alrededor de 20 familias de plantas, pero prefiere papa y jitomate; además de extraer la savia e inocular toxinas, transmite enfermedades (Tran et al, 2012); una de las principales formas de control de este insecto es el uso de insecticidas, lo que incrementa los costos y contamina el ambiente. Chrysoperla carnea (Cc) es un depredador que se ha usado de manera amplia y eficiente en el control de araña roja en fresa (Salas-Araiza y Salazar-Solís 2003). Juan-Blasco et al. (2012) indican que el uso de crisopas junto con otros enemigos naturales pueden controlar hasta un 90% las poblaciones del psilido de los cítricos, Diaphorina citri. En pruebas de laboratorio, Cc consume hasta 790 pulgones de la fresa Chaetosiphon fragaefolii durante su ciclo de desarrollo, y en invernadero Cc redujo significativamente las poblaciones de este áfido; en tanto que en campo, las poblaciones de este pulgón se redujeron notablemente cuando se liberaron 8 larvas de Cc por planta (Easterbrook et al, 2006). El uso de C. carnea para el control de insectos plaga de los cultivos ha sido recomendado por Salas-Araiza y Salazar-Solís (2008) con el fin de reducir el uso de plaguicidas y buscar alternativas de control contra Bc, este neuróptero ayuda a reducir los costos de control y disminuir el impacto ambiental, Figueira y Lara (2004) señalaron que Chrysoperla puede controlar hasta en un 80% la poblaciones de Schizaphis graminum en sorgo, con una relación depredador-presa de 1:5; El-Sahn y Nevien (2012) al evaluar la capacidad de consumo de Cc sobre el piojo harinosos Planococcus citri recomiendan emplear para su liberación en campo, 333 larvas de crisopa de segundo y tercer ínstar, ya que las de primero son débiles y frágiles. Hay pocos reportes del uso de este depredador en el control de Bc ni la capacidad de consumo; por ello, el objetivo de este trabajo fue conocer el potencial de alimentación de larvas de C. sobre diferentes etapas de desarrollo de B. cockerelli bajo condiciones de laboratorio. Materiales y Método El trabajo se realizó en el Laboratorio de Entomología del Departamento de AgronomíaUGto. Se utilizó una cámara de cría con condiciones controladas 12:12 (L:O), 27±2 °C, 75% HR. Las larvas de Cc y las ninfas de Bc. fueron obtenidas de una cría artificial mantenidas en condiciones controladas. Las larvas de Cc previo al experimento se alimentaron con huevo de Sitotroga cerealella y los inmaduros de Bc en plantas de jitomate en invernadero. Se evaluó la capacidad de consumo de cuatro ínstares de Cc sobre huevos y cuatro estadios ninfales de Bc. Se usaron 10 cajas Petri de 9x1.5 cm. en cada una de ellas se colocó una larva de Cc de diferente ínstar, cada caja se tomó como una repetición de cada tratamiento. Para la manipulación se usaron agujas de disección y pincel de pelo de camello. El psílido se mantuvo en trozos de hoja del jitomate donde originalmente se desarrolló. Para distinguir cada uno de los ínstares de Bc., se uso la descripción de Marín-Jarillo et al. (1995). Para comparar el consumo en porcentaje que los cuatro ínstares larvarios de Cc tuvieron sobre los huevos y los cuatro estadios ninfales de Bc, a las 24 horas y luego a las 48 horas, se aplicó la prueba H de Kruskal-Wallis para el contraste de medianas de las cuatro muestras independientes, correspondientes a los instares de Cc. Se aplicó mb é p b DMS (α= 0.05) p p ó p m , reportándose las medianas en cada caso. Para saber si hay diferencias en el consumo entre las 24 y 48 horas, en cada instar de Cc, se ejecutó la prueba W de Mann-Whitney para comparar las medianas de las dos muestras independientes (24 y 48 h). Los análisis se ejecutaron con el paquete estadístico SAS (SAS, 2001). Resultados y Discusión Consumo de ninfas de Bc por los diferentes ínstares de Cc. En el cuadro 1 se observa que a las 24 horas, las larvas de cuarto ínstar de Cc se alimentan de mayor número de ninfas de segundo ínstar de Bc (H=15.10; p=0.0017) con un 50% de larvas consumidas; las ninfas de tercer ínstar de Bc fueron consumidas en casi un 43% por el tercer ínstar de Cc (H=10.29; p=0.016), también se observa que hay diferencias significativas (H=21.83; p=0.0001) en la capacidad de consumo del cuarto ínstar de Cc comparado con los otros ínstares cuando se alimentan de las ninfas de último estadio de desarrollo de Bc. Cuadro 1 Medianas del porcentaje de consumo de los diferentes ínstares de Cc sobre huevos y ninfas de 2 4h (m m m f v m f DMS; α=0.05). Instares larvarios de Cc 1 2 3 4 Huevo 35.0 a 65.0 a 55.0 a 35.0 a Huevos e ínstares ninfales de Bc 1 2 3 55.0 a 42.5 ab 20.0 ab 85.0 a 12.5 b 15.0 ab 60.0 a 27.5 b 42.5 ab 50.0 a 50.0 ab 12.5 b 334 4 5.0 abc 2.5 abc 12.5 abc 40.0 abc A las 48 h, las larvas de Cc de cuarto ínstar consumieron más ninfas de primer ínstar que el resto de los ínstares de Cc (H= 10.846; p= 0.012) con un 50% de ninfas consumidas. Las larvas de Cc de primer ínstar se alimentaron del 52.5% de ninfas de segundo estadio de Bc (H=10.2082; p=0.0169), igualmente fueron las que mayor número de ninfas de tercer ínstar de Bc depredaron en comparación con el resto de los ínstares (H=22.8806; p=0.0001); las ninfas de cuarto ínstar fueron depredadas en mayor porcentaje (55%) por larvas de tercer estadio de Cc (H=13.7775; p=0.0032) tal como se ve en el cuadro 2. Cuadro 2. Medianas del porcentaje de consumo de los diferentes ínstares de Cc sobre ninfas de Bc a las 48 horas (medianas con la misma letra no son significativamente difere DM S; α=0.05). Instares larvarios de Cc 1 2 3 4 Huevo 25.0 a 0.0 a 15.0 a 32.5 a Huevos e ínstares ninfales de Bc 1 2 3 22.5 ab 52.5 ab 52.5 ab 5.0 ab 20.0 b 5.0 ab 0.0 ab 22.5 ab 30.0 ab 50.0 ab 50.0 ab 32.5 ab 4 5.0 abc 10.0 abc 55.0 abc 5.0 abc Consumo de ninfas de Bc por larvas de Cc a las 24 y 48 h. Las larvas del ínstar 1 de Cc consumen mayor cantidad (55%) de ninfas de primer estadio de Bc a las 24 h (W=16.0; p=0.011), esta misma etapa larvaria depredó más individuos del tercer ínstar de Bc a las 48 h con un 52.5% (W=84.5; p=0.0096). El segundo ínstar de Cc consumió el 65% de los huevos de Bc a las 24 h y ya no consumió huevos a las 48 h (W=16.5; p=0.0098), el mismo segundo ínstar de Cc consumió 85% de ninfas de primer ínstar a las 24 y sólo 5% a las 48 h (W=5.0; p=0.00069). Se encontró una diferencia significativa en el consumo de tercer ínstar de Bc por larvas de segundo ínstar de Cc, a las 24 h consumió 15% de las ninfas contra 5% a las 48 h (W=12.5; p=0.0039); lo contrario sucedió cuando la misma etapa de desarrollo comió ninfas de cuarto ínstar de Bc ya que a las 24 h consume 2.5% en tanto que a las 48 h consumieron sólo el 10% (W=78.5; p=0.02837). Las larvas de tercer ínstar de Cc consumen más huevos a las 24 h (55%) que a las 48 (15%) (W= 17.5; p=0.0151), de la misma manera depredan más ninfas de primer ínstar a las 24 h (60%) que las 48 h (0%) (W=4.0; p=0.000478), estas mismas larvas de tercer ínstar de Cc se alimentaron de mayor cantidad de ninfas de cuarto estadio a las 48 h (55%) que a las 24 (12.5%) (W=90.0; p=0.002674), finalmente hay diferencias en el consumo a las 24 (12.5%) que a las 48 h (32.5%) para larvas de cuarto ínstar de Cc cuando consumieron las ninfas de tercer ínstar de Bc (W=79.0; p=0.0302). Para el resto de los ínstares de Cc no hay diferencias significativas en el consumo a las 24 y las 48 horas. El-Sahn y Nevien (2012) señalaron que los ínstares segundo y tercero de C. carnea son los más efectivos, pero indicaron que no recomiendan el uso de crisopas de primera etapa de desarrollo larvario por su fragilidad; sin embargo, los resultados aquí obtenidos muestran que a las 48 h las larvas de primer ínstar de Cc pueden depredar un 52.5% a las ninfas de segundo ínstar de Bc. refutando los resultados de estos autores. La figura 1 muestra que en general las larvas de todos los ínstares de Cc consumen mayor porcentaje de ninfas de la primera etapa de desarrollo, esto es importante ya que las liberaciones de crisopas podrían enfocarse hacia poblaciones donde predomine esta etapa del ciclo de vida; igualmente se observó que los huevos de Bc son consumidos por todos los ínstares particularmente el segundo de Cc, tal como lo señala Tiscareño-Iracheta et al. (2002) de esta manera se puede concluir que estas etapas de Bc son las 335 más susceptibles a la depredación de este neuróptero; al respecto, Salas-Araiza y Vela-Coellar (2003) indicaron que cuando las larvas de Cc se alimentaron de huevo de Plutella xylostella y Sitotroga cerealella la longevidad de los adultos se prolongó y la producción de huevos fue mayor que cuando se alimentó de larvas y áfidos; por su parte, Legaspi et al. (1994) determinaron que se desarrollan más rápido y la tasa de sobrevivencia se prolongó, cuando las larvas de Chrysoperla se alimentaron de huevos de Helicoverpa zea y S. cerealella, lo mismo observaron Pappas et al. (2007) en otras especies de Chrysopidae como Dichochrysa prasina cuando sus larvas se alimentaron con huevos de Ephestia kuehniella Zeller el crisópido incrementó su desarrollo y reproducción, concluyeron que la alimentación con huevos les proporcionan mayor nutrimiento y gastan menos energía en manejar a la presa para comérsela, que cuando lo hacen con otras etapas de desarrollo como son las larvas de estos lepidópteros. Figura 1. Consumo de los diferentes ínstares de Cc sobre huevos y ninfas de Bc a las 24 horas. Conclusiones Aun cuando no hay diferencias estadísticas significativas en el consumo de huevo y ninfas 1 de B. cockerelli por larvas de los diferentes ínstares de C. carnea, las larvas de segundo ínstar de Cc depredan mayor porcentaje de huevos y ninfas 1 de Bc (65 y 85%, respectivamente) a las 24 h, posiblemente la movilidad y capacidad de búsqueda de las larvas en este estadio sea mayor, además a las 48 h estas larvas consumieron el 90% de las ninfas 1 disponibles. La cantidad de ninfas consumidas en este periodo de tiempo es importante en las liberaciones masivas en los cultivos, ya que se verán resultados de control en el corto plazo, además de que se podrá recomendar, que la etapa larvaria de Cc para liberar sea en segundo ínstar. En general, la etapa más consumida por los diferentes ínstares de Cc es la de huevo y primer ínstar de Bc, debido probablemente a que el gasto de energía para su captura sea menor y contenido nutricional se mayor. Los resultados obtenidos en esta investigación, sugieren que cuando se use Cc es importante saber previamente en que etapa de desarrollo se encuentra la población de Bc para liberar a los depredadores y tener mejor efectividad en el uso de controladores biológicos como son las crisopas. 336 Agradecimientos A la Universidad de Guanajuato por el apoyo recibido a través del proyecto interno No. 000037/10. Literatura Citada El-Sahn, Omnia, M. N. y Nevien, M. A. Gaber. 2012. Feeding potential of Chrysoperla carnea (Stepens) on different stages of Planococcus citri (Risso) under laboratory conditions. Egyptian Journal of Biological Pest Control 22(2): 217-221. Easterbrook, M. A., J. D. Fitzgerald. y M. G. Solomon. 2006. Suppression of aphids on strawberry by augmentative releases of larvae of the lacewing Chrysoperla carnea (Stephens). Biocontrol Science and Technology 16(9): 893.900. Figueira, L. K. y F. M. Lara. 2004. Relaçã predador:presa de Chrysoperla externa (Hagen) (Neuroptera:Chrysopidae) para o controle do pulgão-verde em genótipos de sorgo. Neotropical Entomology 33 (4): 447-450. Juan-Blasco, M., J. A. Qureshi, A. Urbaneja. y P. A. Stansly. 2012. Predatory mite, Amblyseius swirskii (Acari: Phytoseiidae), for biological control of asian citrus psyllid, Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae). Florida Entomologist 95(3): 543-551. Marín-Jarillo, A. J., A. Garzón-Tiznado, A. Becerra-Flora, C. Mejía-Avila, R. Bujanos-Muñiz y K. F. Byerly-Murphy. 1995. Ciclo biológico y morfología del salerillo Bactericera cockerelli (Sulc.) (Homoptera: Psyllidae) v f m “p m j m ” jí . M j I P (C ) 38: 25-32. Legaspi, J. C., R. I. Carruthers. y D. A. Nordlund. 1994. Life history of Chrysoperla rufilabris (Neuroptera: Chrysopidae) provided sweetpotato whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) and other food. Biological Control 4: 178-184. Pappas, M. L., G. D. Broufas y D. S. Koveos. 2007. Effects of various prey species on development, survival and reproduction of the predatory lacewing Dichochrysa prasina (Neuroptera: Chrysopidae). Biological Control 43:163-170. Salas-Araiza, M. D. y E. Salazar S. 2003. Permanencia de adultos de Chrysoperla carnea Stephens (Neuroptera: Chrysopidae) liberados en campos de fresa. Entomología Mexicana 1: 432-435. Salas-Araiza, M. D. y E. Vela-Coellar. 2003. Influencia de la dieta en la sobrevivencia y fertilidad de Chrysoperla carnea Stephens (Neuroptera: Chrysopidae). Entomología Mexicana 1: 399-401. Salas-Araiza, M. D. y E. Salazar-Solís (eds.). 2008. Entomófagos en el control de plagas agrícolas en México. Universidad de Guanajuato, Guanajuato. Gto. 90 pp. SAS. 2001. SAS User's Guide, Version 8, SAS Institute Inc. Cary, N.C. U.S.A. Tiscareño-Iracheta, M. A., A. B. Abad-Domínguez, C. Villar-Morales, J. L. Sánchez-Cruz y V. Maya-Hernández. 2002. Control biológico del pulgón saltador Paratrioza cockerelli (Sulc.) con Chrysoperla carnea Stephens. Entomología Mexicana 1:274-278. Tran, L. T., S. P. Worner, R. J. Hale y D. A. J. Teulon. 2012. Estimating development rate and termal requirements of Bactericera cockerelli (Hemiptera: Triozidae) reared on potato and tomato by using linear nonlinear models. Environ. Entomol. 41(5): 1190-1198. 337 EVALUACIÓN DE LA ESPECIFICIDAD DE Bacillus thuringiensis OBTENIDOS DE Diatraea magnifactella SOBRE Trichoplusia ni Y Spodoptera frugiperda Alicia Fonseca-González1+, Guadalupe Peña-Chora2*, Víctor Manuel Hernández-Velázquez1*, Luis Ángel Rodríguez-Del Bosque3** 1Laboratorio de Control Biológico, Centro de Investigación en Biotecnología. 2Laboratorio de Parasitología vegetal, Centro de Investigaciones Biológicas. Universidad Autónoma del Estado de Morelos, Av. Universidad No. 1001, Col. Chamilpa, C.P. 62209. Cuernavaca Morelos. 3INIFAP Río Bravo. Carretera Matamoros Reynosa km. 61, Col. Zona Rural, Rio Bravo. C.P.88900, Rio Bravo, Tamaulipas. *CA de Entomología y Fitopatología, UAEMOR-CA-73. ** CA de Entomología. + [email protected] RESUMEN. La caña de azúcar es de los cultivos más importantes en México, para Morelos se reporta en 21 municipios. La producción cañera se ve mermada con el complejo de barrenadores, los cuales se encuentran distribuidos en nuestro país. Para Morelos se reporta la presencia de Diatraea magnifactella y Eoreuma loftini. Existen reportes del uso del Control Biológico para el control de Diatraea, dentro de los beneficios que éste ofrece, es que es seguro al ambiente y altamente específico. En este sentido se evaluaron nueve cepas de Bacillus thuringiensis aisladas de D. magnifactella las cuales fueron colectadas en cañaverales del estado de Morelos y evaluadas sobre el insecto blanco además de evaluar su especificidad al ser probadas sobre otros dos lepidópteros de importancia económica, Trichoplusia ni y Spodoptera frugiperda. Los resultados demuestran que los aislados son específicos para D. magnifactella, ya que los aislados ocasionaron mayores mortalidades sobre su insecto blanco. Palabras clave: Barrenadores, Control Biológico, Especificidad, Entomopatógeno Evaluatión of the specificiti of Bacillus thuringiensis obtaineds of Diatraea magnifactella in Trichoplusia ni and Spodoptera frugiperda ABSTRACT. Sugarcane is the major crop in Mexico, Morelos reported in 21 municipalities. The sugarcane production is crippled with complex borers, which are distributed in our country. To Morelos reported the presence of Diatraea magnifactella and Eoreuma loftini. There are reports of the use of biological control of Diatraea control within the benefits it offers, is that the environment is safe and highly specific. In this sense we evaluated nine strains of Bacillus thuringiensis isolated from D. magnifactella which were collected in the state of Morelos reeds and evaluated on the target insect in addition to evaluating their specificity when tested on two other economically important lepidopteran, Trichoplusia ni and Spodoptera frugiperda. The results demonstrate that the isolates are specific for D. magnifactella as isolates caused higher mortality on their target insect. Key words: Borers, Biological Control, Specificity, entomopathogenic Introducción La caña de azúcar representa uno de los cultivos industriales más importantes en nuestro país, con cerca de 700 mil hectáreas cultivadas y con 58 ingenios azucareros, distribuidos en las regiones del Pacífico, Centro Sur y las Huastecas. En el Estado de Morelos se reportan 21 municipios con actividad azucarera, generando empleos fijos y temporales. El reciente repunte del cultivo se debe al potencial que tiene como generador de biocombustible, actividad que se lleva a cabo en países como Brasil desde los años setenta .Los barrenadores reportados para México son integrantes del género Diatraea y Eoreuma, los cuales se encuentran ampliamente distribuidos en nuestro país (Rodríguez Del Bosque y Vejar, 2008). Para el estado de Morelos Rodríguez Del Bosque y colaboradores (2007), reportan la presencia de Diatraea magnifactella y Eoreuma loftini. Los daños que ocasionan estos insectos se debe a que cavan galerías dentro de los tallos, lo que reduce el crecimiento y debilita a la planta, al punto en el que algunas pueden quebrarse o incluso morir. Las características físicas de las plantas atacadas son, corazón muerto en plantas jóvenes puntas muertas en aquellas mas viejas, tallos rotos, perdida de peso en la producción de azúcar y daño a la caña que se utiliza para semilla. 338 Dentro del control de D. magnifactella, se usa tradicionalmente el químico y el biológico con el uso de parasitoides, recientes trabajos como el realizado por Rosas y colaboradores (2003), donde el uso de Bacillus thuringiensis, representa una alternativa viable y amigable con el ambiente, además de su alta especificidad, característica importante al elegir un entomopatógeno Materiales y Método Para determinar la especificidad de los aislados bacterianos que se obtuvieron de los cadáveres de D. magnifactella, éstos fueron evaluados sobre D. magnifactella y dos lepidópteros más, los cuales son también de importancia económica. . Para la evaluación de los aislados; éstos fueron sembrados en cajas Petri con medio sólido HCT e incubados por 72 h a 27 °C. Una vez que se observó crecimiento, se recuperaron éstos en b pp f 1mL é 1μ PMSF, ó v m Fisher Scientific hasta obtener una mezcla homogénea. D h m m 2 μ 798 μ 200μL v f , p p óm 595 m de absorbancia. Una vez determinada la concentración de proteína, se realizaron los cálculos necesarios para obtener concentraciones de 1000 y 25000 ng/cm2 de la mezcla para las evaluaciones sobre D. magnifactella, S. frugiperda y T. ni. La suspensión de espora cristal fue colocada sobre dieta merídica, en cajas tipo Cell-Well 24 p , v m 35 μL p p f esparcida homogéneamente hasta cubrir la superficie de la dieta. Las placas se dejaron secar a temperatura ambiente y se colocó una larva neonata por pozo. Se permitió que las larvas se alimentaran durante siete días y se procedió a determinar el porcentaje de mortalidad en las tres especies. Como control positivo se usó la cepa comercial HD-1 (Rosas et al., 2003). Resultados y Conclusiones Se evaluaron los aislados de Bt sobre dos especies no blanco, para determinar la especificidad de los mismos. Así como en D. magnifactella. Los aislados que mostraron mayor actividad sobre S. frugiperda fueron el B-59, B-148 y B-165, con mortalidades superiores al 50% en la concentración de 25,000 ng/cm2. Los patrones proteicos son de 15 y 150 KDa, para el primero y último, el cual correspondería a una proteína tipo Cry, 25 KDa para el segundo. Para el aislado B-148 presentó un patrón proteico de una banda con un peso de 100 KDa este peso se asume como el de una proteína tipo S-layer (Peña et al., 2006). Por otra parte los aislados que mostraron una mortalidad mayor al 50% al ser evaluados en T. ni, fueron B-13, B-30, B-40, B-148 y B-150. Obteniendo una mortalidad del 100%, en ambas concentraciones, con el aislado B-148, al igual que con la cepa comercial HD-1. Dentro del trabajo que realizaron Bravo y colaboradores (1998), en la caracterización de los genes Cry para la colección de los suelos de México, realizaron bioensayos con S. frugiperda, S. exigua y T. ni, para evaluar las cepas obtenidas y calcular la CL5o, la IB87, mostró ser altamente efectiva para T. ni con una Concentración Letal de 6 ng/cm2, más no presentó la misma efectividad para las otras dos especies probadas, ya que las CL5o se elevaron a 72 y 177 ng/cm2. La Concentración Letal más baja obtenida para S. frugiperda y S. exigua, fue con la cepa IB126 con 22 ng/cm2 para ambas, sin embargo T. ni elevo su concentración hasta 121 ng/cm2. Los resultados antes mencionados coinciden con los obtenidos en el presente trabajo, ya que los aislados que mostraron una mortalidad mayor para 339 S. frugiperda no mostraron el mismo resultado para T. ni y viceversa. Es importante mencionar que los resultados obtenidos por Bravo y colaboradores (1998) reportan la actividad sólo de proteínas Cry sin que se haga mención de otro tipo de proteínas con capacidad insecticida, como las S-Layer. En el cuadro 1, se resume los aislados que presentaron mayor patogenicidad en las tres especies probadas. Cuadro 1. Aislados de B. thuringiensis que provocaron mortalidades mayores al 50% en las tres especies evaluadas. Spodoptera frugiperda Trichoplusia Diatraea ni magnifactella AISLADO 1,000 25,000 1,000 25,000 1,000 25,000 ng/cm2 ng/cm2 ng/cm2 ng/cm2 ng/cm2 ng/cm2 25.00 0.00 4.17 0.00 20.00 25.00 25.00 58.33 50.00 B-13 B-30 16.67 4.17 37.50 58.33 B-32 16.67 0.00 35.00 B-40 B-59 0.00 0.00 25.00 50.00 B-9 B-148 B-150 16.67 16.67 66.67 0.00 TAMAÑO DE LA PROTEINA LUGAR DE COLECTA 37.50 60, 45 y 25 Yautepec 33.33 4.17 25 y 37 Miacatlán 29.17 58.33 25.00 25.00 25 y 37 Yautepec 25.00 100,60,45 y 30 Yautepec 60.00 40.00 66.67 16.47 100 y 30 Yautepec 0.00 8.33 20.83 12.50 30 Yautepec 75.00 20.83 79.17 150 y 20 Yautepec 75.00 100,45 y 25 Ayala 100 45.00 100 60.00 B-165 16.67 66.67 90.00 100 20.83 75.00 150, 30 y 25 Puente de Ixtla HD-1 4.17 29.17 100 100 66.66 79.16 133.3 Comercial Como se puede observar en el cuadro 1, de las cepas que causaron mayor mortalidad a las tres especies, destaca la B-9 y la B-148, las cepas restantes causaron mortalidad a una o dos especies evaluadas. Dentro de las que mostraron mayor especificidad al insecto blanco resalta la B-32, para la que se recomienda realizar trabajos más extensivos. Literatura Citada Bravo, A., S. Sarabia, L. López, H. Ontiveros, C. Abarca, A. Ortiz, M. Ortiz, L. Lina, F. Villalobos, G. Peña, M. Núñez, M. Soberón y R. Quintero. 1998. Characterization of Cry genes in a Mexican Bacillus thuringiensis strain collection. Applied and Environmental Microbiology. 64: 4965-4972. Rodríguez Del Bosque, L., V. M. Hernández y J. Patricio. 2007. Invasión de Eoreuma loftini (Lepidoptera: Crambidae) en el centro de México y posibilidades sobre su control biológico. Entomología Mexicana. Pp 413-416. Rodríguez Del Bosque, L y G. C. Vejar. 2008. Barrenadores del Tallo (Lepidoptera: Crambidae) del Maíz y Caña de Azúcar. En Casos de Control biológico en México. Editorial Mundi-Prensa. Pp 9-22. Peña, G., J. R. Miranda, G. de la Riva, L. L. Pardo, M. Soberón, y A. Bravo. 2006. A Bacillus thuringiensis S-layer protein envolved in toxicity against Epilachna varivestis (Coleoptera: Coccinellidae). Applied and Environmental Microbiology. 72(1): 353-360. Rosas, G. N., K. Arévalo, B. Pereyra, H. Medrano, L. Galán J. Pérez y L. Morales. 2003. Elaboración de un bioinsecticida contra el gusano barrenador de la caña de azúcar. Ciencia UANL. Vol. VI: 491:496. 340 FAMILIAS DE PARASITOIDES DE LARVAS DE Monoctenus sanchezi SMITH (HYMENOPTERA: DIPRIONIDAE) EN LA SIERRA DE ÁLVAREZ, SAN LUIS POTOSÍ Salvador Ordaz-Silva, Gabriel Gallegos-Morales, Sergio René Sánchez-Peña, Mariano Flores-Dávila, Oswaldo García-Martínez y Ernesto Cerna-Chávez. Departamento de Parasitología Agrícola, Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Calzada Antonio Narro 1923, Colonia Buenavista, CP 25315, Saltillo, Coahuila, México. Correspondencia: [email protected] RESUMEN. Monoctenus sanchezi (SMITH) es una plaga de gran importancia en la Sierra de Álvarez, San Luis Potosí causando pérdidas considerables en (Juniperus flaccida), por lo antes mencionado el objetivo del presente trabajo fue ubicar taxonómicamente las familias de parasitoides que atacan las larvas de dicha plaga en campo. Se colectaron 500 larvas de mosca sierra en el periodo de agosto a diciembre de 2011. Se trasladaron al Departamento de Parasitología Agrícola en recipientes de plástico de 236 ml y se alimentaron con hojas y ramas de cedro blanco a 24±1º C y una humedad relativa de 40 %, se esperó a la emergencia de parasitoides o en su caso de adultos de mosca sierra, una vez obtenidos los mismos se colocaron en alcohol al 70 %, posteriormente se realizaron montajes y con ayuda de las claves taxonómicas de Triplehorn and Jhonson (2005) se realizó la identificación de los parasitoides. Se obtuvieron 21 ejemplares en total, de los cuales 2 familias pertenecieron al orden Hymenoptera (Ichneumonidae y Perilampidae) y una de Diptera (Tachinidae), lo cual representa un 4.2 % acumulativo de parasitismo natural. Palabras clave: Monoctenus sanchezi, taxonomía, Hymenoptera, Diptera, parasitismo natural Families of larval parasitoid of Monoctenus sanchezi Smith (Hymenoptera: Diprionidae) at Sierra de Álvarez, San Luis Potosi ABSTRACT. Monoctenus sanchezi (Smith) is an important pest at Sierra de Álvarez, San Luis Potosi causing considerable losses in drooping juniper (Juniperus flaccida), for the above the objective of this work was to find families of sawfly larvae parasitizing insects at field. 500 sawfly larvae were collected during August to December in 2011. They were moved to Department of Parasitology in 236 ml food containers and were provided whit drooping juniperus leaves and maintained in growth chamber at 24±1º C and 40 % of relative humidity; without stop feeding them we wait emergence of parasitoids or sawfly adult, which were placed in 70 % alcohol for their identification using Triplehorn and Johnson´s taxonomic keys (2005). 21 specimens were obtained, two hymenoptera families (Ichneumonidae and Perilampidae) and one Diptera family (Tachinidae). This represents a 4.2 % of natural parasitism. Key words: Monoctenus sanchezi, taxonomy, Hymenoptera, Diptera, natural parasitism Introducción Los ecosistemas forestales son el hábitat de una importante diversidad biológica debido a que desarrollan funciones ambientales como la regulación del ciclo hidrológico, captura y almacenamiento de agua, captura de carbono, conservación de suelos, entre muchos otros beneficios para el hombre y el medio ambiente en general (CONAFOR, 2009). Uno de los grandes desafíos para México es la conservación y/o recuperación de los extensos bosques, selvas, desiertos y otros tipos de vegetación que se han venido degradando por factores abióticos como el clima, cambio de uso del suelo, expansión de áreas urbanas, etcétera; así como por factores bióticos como la tala inmoderada, plagas, enfermedades, entre otros (CONAFOR, 2009). Los árboles forestales, incluyendo el cedro blanco (Juniperus flaccida) presentan diversos agentes patógenos que afectan una o más partes de los árboles, dando como resultado la reducción del crecimiento, o en casos cuando el daño es muy severo, la muerte misma del árbol. 341 La detección de plagas forestales se realiza mediante monitoreos continuos, lo cual implica la realización de recorridos de campo (CONAFOR, 2010). Las plagas forestales son insectos o patógenos que ocasionan daños de tipo mecánico o fisiológico a los árboles, tales como deformaciones, disminuciones en el crecimiento, debilitamiento o incluso la muerte, causando un impacto ecológico, económico y social importante (CONAFOR, 2003; SEMARNAT, 2003). Son consideradas como una de las principales causas de disturbio en los bosques templados del país, reconociéndose cerca de 250 especies de insectos y patógenos que pueden afectar al arbolado nacional (SEMARNAT, 2003). Dentro de los factores naturales que facilitan el ataque de plagas están los fenómenos meteorológicos como las sequías, huracanes y nevadas, así como otras conflagraciones naturales, como los incendios (Matthews et al., 2000, PNUMA, 2003). Sin embargo, las actividades humanas también facilitan el ataque. El aprovechamiento y pastoreo no regulados, el deficiente manejo silvícola, la introducción de especies de plagas y patógenos de otras regiones geográficas, así como los incendios inducidos, predisponen a las masas arboladas al ataque por insectos u otros patógenos (CONAFOR, 2010). Las plagas más importantes para el cedro blanco son del tipo de los descortezadores, barrenadores, plantas parásitas y defoliadores. En estos últimos tenemos especies dentro de los órdenes Orthoptera, Coleoptera, Lepidoptera e Hymenoptera. Entre las especies del orden Hymenoptera destacan algunas hormigas del género Atta spp y la mosca sierra Monoctenus sanchezi (Smith et al., 2010). La mosca sierra del cedro blanco fue detectada en La Sierra de Álvarez, San Luis Potosí en el año 2007. El daño por esta plaga se ha venido incrementando año con año; las larvas se alimentan tan pronto como emergen de los brotes de un año anterior, las larvas jóvenes comen sólo la superficie de la hoja pero pueden comerla completa conforme van creciendo, desde la base, hasta el ápice. Debido a la problemática e incremento de la superficie dañada por esta plaga se planteó realizar una ubicación taxonómica de las familias que parasitan a las larvas de Monoctenus sanchezi de forma natural en la Sierra de Álvarez, San Luis Potosí. Materiales y Método Ubicación del trabajo: Se realizaron colectas de material biológico de larvas de mosca sierra de diferentes instares en la zona dañada de la Sierra de Álvarez, San Luis Potosí ubicada a 22º 11’ 52’’ L N 100º 37’ 03’’ L O . L m Monoctenus sanchezi y/o parasitoides de la plaga se obtuvo en los laboratorios y cámaras bioclimáticas del Departamento de Parasitología Agrícola de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro ubicada en Saltillo, Coahuila. Colecta del material (larvas): Se colectaron 500 larvas de todos los estadios de Monoctenus sanchezi directamente de campo, de agosto a diciembre de 2011, que es cuando encontramos la mayor población de la plaga en esta etapa de su ciclo de vida. Las larvas se colocaron en recipientes de plástico de 236 mL proporcionándoles dieta natural a base de ramas de cedro blanco. El material colectado se trasladó al Departamento de Parasitología Agrícola de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro para su observación. Las condiciones de la cámara bioclimática en donde se colocó el material biológico fueron de 24±1 ºC de temperatura y una humedad relativa (HR) de 40 %. 342 Conservación del Material Biológico: Los insectos adultos (mosca sierra y parasitoides) que emergieron de las larvas de la plaga se colectaron y conservaron en alcohol al 70 % para su posterior identificación. Identificación de los parasitoides: Se tomaron algunos adultos del alcohol y se montaron con alfileres entomológicos para observarlos de diferentes formas (dorsal, lateral, ventral) para posteriormente hacer la ubicación taxonómica de acuerdo con las claves de Triplehorn and Jhonson (2005). Figura 1. Colecta de material biológico y traslado del mismo al laboratorio de Parasitología Agrícola para su observación e identificación de parasitoides. Resultados Se obtuvieron un total de 21 insectos de otras familias diferentes a la de la mosca sierra (Diprionidae), lo cual representa un 4.2 % acumulativo de parasitismo natural. Se obtuvieron dos familias de parasitoides de larvas de la mosca sierra Monoctenus sanchezi Smith y una familia que se caracteriza por ser hiperparasitoide de los órdenes Diptera e Hymenoptera. Las familias de parasitoides obtenidas correspondieron al orden Hymenoptera (Ichneumonidae) y Diptera (Tachinidae). De la familia Ichneumonidae se obtuvieron un total de 8 individuos, mientras que de los taquínidos se obtuvieron 6; además se obtuvieron 7 ejemplares 343 de la familia Perilampidae (Hymenoptera), familia que se caracteriza por ser hiperparasitoide de especies pertenecientes a los órdenes Diptera e Hymenoptera. Figura 2. Adultos de insectos obtenidos de las larvas de Monoctenus sanchezi. Izquierda (Hymenoptera: Ichneumonidae); al centro, Diptera: Tachinidae y derecha (Hymenoptera: Perilampidae). Conclusiones El parasitismos natural de Monoctenus sanchezi (SMITH) en la Sierra de Álvarez, San Luis Potosí es bueno considerando que esta plaga no tiene mucho tiempo causando daños y se ha incrementado considerablemente la población, de manera tal que se espera que la población de los enemigos naturales aumente conforme la plaga lo haga. Se espera posteriormente continuar con los trabajos y seguir encontrando más alternativas de control natural de esta plaga con más parasitoides, depredadores, o incluso con entomopatógenos. Literatura Citada Comisión Nacional Forestal. 2003. Costos de obras de conservación. Gerencia de Suelos Forestales-CONAFOR, México. Comisión Nacional Forestal. 2009. Restauración de ecosistemas forestales; Guía de conceptos básicos. Editado por la Comisión Nacional Forestal, Zapopan, Jalisco, México. 344 Comisión Nacional Forestal. 2010. Prácticas de reforestación; Manual básico. Editado por la CONAFOR, Zapopan, Jalisco, México. Matthews, J. A., Dahl, O., Nesje, A., Berrisford, M. S. and C. Andersson. 2000. Holocene glacier variations in central Jotunheimen, southern Norway based on distal glaciolacustrine sediment cores*1. Quaternary Science Reviews. 19(16): 1625-1647. Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente. 2003. GEO América Latina y el Caribe; Perspectivas del medio ambiente. SEMARNAT. 2003. Ley General de Desarrollo Forestal Sustentable. México. Smith R. D., G. Sánchez, M., and Ordaz, S. S. 2010. A new Monoctenus (Hymenoptera: Diprionidae) damaging Juniperus flaccida (Cupressaceae) in San Luis Potosí, México. Proceedins of the Entomological Society of Washington 112: 444 - 450. T p h , Ch. A. J h , N. F. 2005. D L Insects. Seventh edition. Thompson Learning, USA. 345 ’ I h S f PATOGENICIDAD DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS SOBRE HUEVOS DE DIFERENTE EDAD DE LA GARRAPATA Rhipicephalus microplus Rogelio Rivera-Oliver1, Angel-Sahagún César Andrés1, Cruz-Avalos Ana Martha2, Lezama-Gutiérrez Roberto3, Canchola-Ramírez Manuel4, Molina-Ochoa Jaime3. 1Programa Educativo de Medicina Veterinaria y Zootecnia, División Ciencias de la Vida, Campus Irapuato-Salamanca, Universidad de Guanajuato, Ex-Hacienda El Copal, Km. 7 Carretera Irapuato-Silao, Irapuato, Guanajuato. [email protected]. 2Instituto Tecnológico de Irapuato, Extensión Abasolo. Blvd. Cuitzeo de los naranjos N° 401. Colonia Peña de Guisa. C.P. 36970. Abasolo, Guanajuato. 3 Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima. Km. 40.5 Carretera ColimaManzanillo, Tecomán, Colima, México. 4Centro de Atención Canina del municipio de Irapuato, Guanajuato. RESUMEN. La garrapata Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) es un ectoparásito hematófago que ataca al ganado bovino por acción directa, le transmite enfermedades y ocasiona una disminución en la producción de leche y carne, retarda su crecimiento y hasta la muerte del animal. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la patogenicidad de seis cepas de los hongos entomopatógenos de Metarhizium anisopliae y tres de Cordyceps bassiana sobre huevos de R. microplus de tres, ocho y diecisiete días de edad. Se inoculó con 500 µL de la concentración 1x10 7 conidios/mL a cada grupo de 100 huevos. Se observó que el total de los hongos fueron patógenos sobre los huevos de la garrapata en las diferentes edades y el mayor porcentaje de micosis se obtuvo sobre huevos de tres días. El análisis de varianza (ANOVA) mostró que los factores edad de huevo y tratamiento tienen un efecto significativo sobre la micosis. Se concluye que los hongos de M. anisopliae y C. bassiana evaluados son patógenos para los huevos R. microplus de tres, ocho y diecisiete días de edad y esta mejora cuanto más joven es el huevo. Palabras clave: Control de calidad, selección, control biológico, enemigos naturales. Pathogenicity of fungi on egg in different old groups of the tick Rhipicephalus microplus ABSTRACT. The tick Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) is an ectoparasite hematophagous that attacks cattle by direct action, transmits disease and causes a losses in the production of milk and meat, which retards their growth and until the death of the animal. The goal of the present work was to evaluate the pathogenicity of six strains of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae and three of Cordyceps bassiana on eggs of R. microplus three, eight and seventeen days old. The eggs was inoculated with 500 µL of the concentration 1x107 conidia/ml to each group of 100 eggs. The results showed that the total of the pathogenic fungi evaluated were pathogenic on the eggs of the tick in the different old and the highest percentage of mycosis was obtained on eggs of three days old. The analysis of variance (ANOVA) showed that the factors age and egg treatment have a significant effect on the mycoses. It is concluded that the fungi of M. anisopliae and C. bassiana evaluated are pathogenic to eggs R. microplus three, eight and seventeen days old and this improves the younger is the egg. Key words: Quality control, selection, biological control, natural enemies Introducción Las garrapatas son ectoparásitos pertenecientes al grupo de los artrópodos, la especie Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) produce daños a la producción bovina por acción directa y por las enfermedades que transmite (Ojeda-Chi y Rodríguez-Vivas, 2011) como babesiosis y anaplasmosis. El control de las garrapatas de la familia Ixodidae se ha basado en el uso de ixodicidas entre los que se encuentran las familias químicas de los organofosforados, piretroides y amidinas (NOM-019-ZOO-1994). Una desventaja es que por su uso inadecuado se han generado poblaciones de R. microplus resistentes (Ojeda-Chi y Rodríguez-Vivas, 2011), actualmente se encuentra resistencia a todas las familias de ixodicidas (Olivares-Pérez et al., 2011), lo anterior impacta económicamente a los productores ya que implica más gastos para el control y tratamiento no solo de las garrapatas sino de las enfermedades transmitidas por estos ectoparásitos (Domínguez et al., 2010). 346 Un método de control no químico y que actualmente se está considerando es la utilización de hongos entomopatógenos, a éste se le denomina control biológico, en condiciones naturales se han aislado hongos entomopatógenos de garrapatas R. microplus (Da Costa et al., 2002). De los hongos entomopatógenos, Metarhizium anisopliae (Metschnickoff) Sorokin y Cordyceps (=Beauveria) bassiana (Balsamo-Crivelli) Vuillemin han mostrado capacidad de matar la garrapata R. microplus bajo condiciones de laboratorio y de campo, por lo que presentan potencial para el control biológico de esta especie (Angel-Sahagún et al., 2010) y algo sobresaliente que los hongos entomopatógenos presentan actividad acaricida e incluso en, cepas de garrapatas, resistentes (Fernández-Ruvalcaba et al., 2005). Aislados de M. anisopliae son capaces de parasitar al estado biológico de huevo de garrapatas R. annulatus, reportando que huevos de 15 y 16 días de edad son más susceptibles que huevos jóvenes de 2 y 3 (Gindin et al., 2009), cepas de M. anisopliae han demostrado parasitar al estado biológico de huevo de las garrapatas R. microplus (Kaaya et al., 1996), no obstante que se ha realizado investigación para seleccionar cepas que parasiten de manera sobresaliente a huevos de garrapatas R. microplus no se conoce si la edad del huevo tiene influencia en la susceptibilidad hacia hongos entomopatógenos. Materiales y Método El estudio se realizó en el Laboratorio de Parasitología y Control Biológico del Programa Educativo de Medicina Veterinaria y Zootecnia del Departamento de Agronomía, División Ciencias de la Vida de la Universidad de Guanajuato. Se colectaron garrapatas pletóricas de R. microplus en el municipio de Pénjamo Guanajuato, las hembras una vez en el laboratorio se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 0.1% y posteriormente se lavaron con agua destilada estéril en tres ocasiones. Posteriormente, se depositaron en cajas de Petri con doble papel filtro húmedo; se incubaron a 25±1°C hasta que se observó la ovoposición. Se recolectaron huevos de tres, ocho y diecisiete días de edad, fueron separados en cuatro grupos de 100 por tratamiento y se colocaron en cajas Petri con doble papel filtro húmedo, con ayuda de un pincel de cerda fina. Las cepas de hongos entomopatógenos de M. anisopliae y C. bassiana pertenecen a la colección de hongos entomopatógenos del laboratorio de Parasitología y Control Biológico; inicialmente los hongos fueron cultivados en Agar Dextrosa Sabouraud, con 1% de extracto de levadura y 500 ppm de cloranfenicol por 21 días a 25±1°C y 12 horas de luz-oscuridad (AguilarBarradas, 2010). Para evaluar la patogenicidad sobre huevo de R. microplus se colectaron los conidios con agua destilada estéril con 0.1% de Tween 80, una vez colectados fueron homogenizados con ayuda de un vortex y posteriormente cuantificados con una cámara de Neubauer. Por dilución se formó la concentración de 1x107 conidios/mL, misma que se utilizó para la evaluación, concentración que se estableció por observaciones de estudios previos. En total se evaluaron 10 tratamientos (Ma1, Ma2, Ma4, Ma5, Ma6, Ma7, Cb1, Cb2, Cb3 y un testigo) con 4 repeticiones cada uno; la inoculación se realizó aplicando 500 µL de la concentración 1x107 conidias/mL sobre cada grupo de huevos; para un grupo se utilizó agua destilada estéril con 0.1% de Tween 80 y se le consideró como testigo. Cada 48 horas fue registrado el número de huevos micosados hasta que se observó la emergencia de larvas en el tratamiento testigo (Prieto-Avella et al., 2012). Los porcentajes de micosis fueron analizados mediante un análisis de varianza, previa transformación angular al ArcSen-1 con un diseño factorial donde en el factor A se incluyeron los 347 tratamientos y el factor B la edad de huevo, cada tratamiento combinado tuvo 4 repeticiones, además se realizó una prueba de separación de medias por Tukey al 95% de confianza. Resultados De acuerdo a las condiciones en que se realizaron los experimentos se observó que el total de los hongos entomopatógenos evaluados de M. anisopliae y C. bassiana a la concentración de 1X107 conidias/mL son patógenos para los huevos de la garrapata R. microplus de tres, ocho y diecisiete días de edad. Los porcentajes de micosis, por las diferentes cepas de hongos entomopatógenos de M. anisopliae más sobresalientes, fueron los obtenidos en las evaluaciones con huevo de tres días de edad en un parámetro de 90.8 a 100% (Cuadro 1). La cepa Ma7 fue la que presentó porcentaje mayor de micosis en huevos de tres y ocho días con valores de 99.74 y 98.44 respectivamente; en huevos de diecisiete días el porcentaje de micosis fue 7.28%. La cepa de M. anisopliae que presentó un menor porcentaje de micosis fue Ma5 en huevos de ocho días con 54.27% y Ma4 para huevos de 17 días de edad con 2.04% (Cuadro 1). Los resultados más sobresalientes de micosis con cepas del hongo C. bassiana fue con la cepa Cb2 sobre huevos de tres días de edad con 89.63%. La cepa Cb3 presentó una micosis de 46.46% con huevos de tres días de edad; la cepa Cb1 fue la que presentó un menor porcentaje para huevos de tres y ocho días con 34.55 y 6.11% respectivamente. Las evaluaciones con huevos de 17 días. El análisis de varianza (ANOVA) de la variable micosis mostró que los factores edad de huevo y tratamiento tienen un efecto altamente significativo sobre la micosis (F calc.= 194.92 y 43.58 respectivamente y una p=0.0001 para los dos factores). La prueba de separación de medias de Tukey al 95% para el factor Edad de huevo formó 3 grupos, cada uno de ellos correspondió a una edad de huevo, con respecto al factor tratamiento formó tres grupos en el que las cepas Ma1, Ma2, Ma4, Ma5, Ma6, Ma7 y Cb2 formaron el grupo más sobresaliente, el grupo menos sobresaliente estuvo integrado solo por el tratamiento testigo y no compartió igualdad estadística con otro grupo (Cuadro 1). Con respecto a la eclosión, el huevo de tres días presentó un menor porcentaje, las cepas de M. anisopliae Ma1, Ma2, Ma5 y Ma7 presentaron 0%. Por el contrario el huevo de diecisiete días fue el que presentó un mayor porcentaje de eclosión para las cepas Ma1, Ma2, Ma4, Ma5, Ma6 y Ma7 con 76.80, 74.70, 92.72, 87.78, 88.13 y 91.88% (Cuadro 1). En cuanto a porcentaje de eclosión de las cepas de C. bassiana el más bajo fue la cepa Cb2 presentó 4.64% con huevos de tres días de edad, por el contrario la cepa que presentó el porcentaje más alto fue Cb3 presentó 92.63% con huevos de ocho días de edad (Cuadro 1). El análisis de varianza (ANOVA) de la variable eclosión mostró que los factores edad de huevo y tratamiento tienen un efecto altamente significativo sobre la eclosión (F calc.= 187.62 y 28.02 respectivamente y una p=0.0001 para los dos factores), la prueba de separación de medias de Tukey al 95% formó 3 grupos, cada uno de ellos correspondió a una edad de huevo, con respecto al factor eclosión formó tres grupos en el que en los tratamientos Ma1, Ma2, Ma4, Ma5, Ma6, Ma7 y el Cb2 formaron el grupo más sobresaliente por presentar menor porcentaje de eclosión; el grupo menos sobresaliente por presentar los porcentajes de eclosión mayores fue el testigo; las cepas Cb1, Cb2, Cb3, Ma1, Ma2, Ma4 y Ma5 formaron otro grupo donde las cepas Ma1, Ma2, Ma4, Ma5 y Cb2 compartieron igualdad estadística con el grupo más sobresaliente (Cuadro 1). 348 Cuadro 1. Porcentaje de micosis y eclosión en huevo de R. microplus de 3, 8 y 17 días de edad expuestos a hongos entomopatógenos de M. anisopliae y C. bassiana a la concentración de 1x107 conidias/ml y prueba de Tukey al 95%. Cepa/edad Ma1 3 días Micosis Eclosión 100 0 8 días 17 días Micosis Eclosión Micosis Eclosión 71.21 24.76 19.14 76.80 Prueba de Tukey Micosis Eclosión a bc Ma2 100 0 68.41 27.41 25.30 74.70 a bc Ma4 90.80 5.20 81.77 14.26 2.04 92.72 a bc Ma5 100 0 54.27 37.99 10.97 87.78 a bc Ma6 98.25 0.98 98.34 1.92 10.66 88.13 a c Ma7 99.74 0 98.44 1.56 7.28 91.88 a c Cb1 34.55 16.89 6.11 84.81 b b Cb2 89.63 4.64 27.28 72.97 a bc Cb3 46.46 12.95 5.93 92.63 b b testigo 0 98.48 0 98.48 d a 0 98.48 Discusión La patogenicidad de hongos entomopatógenos nativos del estado de Guanajuato sobre huevos de garrapata ya ha sido reportado en la especie Rhipicephalus sanguineus por PrietoAvella et al. (2012), en el presente estudio se demostró que también son patógenos para huevos de R. microplus de diferentes edades. En el presente estudio se puede observar que existe diferencia en la patogenicidad entre especies y aislados de hongos entomopatógenos sobre huevo de R. microplus, las cepas de M.anisopliae presentaron un mayor porcentaje de micosis que C. bassiana, para M. anisopliae el rango de micosis esta entre 90.80 y 100%, para C. bassiana 34.55 y 89.63% ambos en huevo de tres días de edad a una concentración de 1x107 conidios/mL, resultados que concuerdan con los reportados por Silva-Martínez (2001) quien menciona que M. anisopliae es más virulento que C. bassiana. Los huevos de hongos más jóvenes presentaron un mayor porcentaje de micosis respecto a los huevos con más edad, datos que difieren a lo reportado por Gindin et al. (2009) donde evaluaron el porcentaje de micosis de M. anisopliae sobre huevo de R. annulatus y concluyeron que los huevos más jóvenes fueron menos susceptibles a infecciones por hongos entomopatógenos de la especie M. anisopliae a las concentraciones de 2.5x105-2.5x106 conidios/cm2, la micosis de los huevos de mayor edad alcanzó 98-100%, mientras que en huevos jóvenes fue de 23-35%, probablemente la especie de garrapata influya sobre la susceptibilidad a hongos entomopatógenos o debido a que se utilizó una forma de inoculación diferente (impregnación de papel filtro con hongos entomopatógenos) se obtuvieron los resultados contrastantes en el presente estudio (baño de huevos con hongos entomopatógenos). Literatura Citada Aguilar-Barradas, J. A. 2010. Tesis: Termo tolerancia y eficacia in vitro del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae (Ma14) sobre el control de larvas de 349 Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Veracruzana. Veracruz. Angel-Sahagun, C. A., Lezama-Gutierrez, R; Molina-Ochoa, J; Pescador-Rubio, A; Skoda, SR; Cruz-Vazquez, C; Lorenzoni, AG; Galindo-Velasco, E; Fragoso-Sanchez, H; Foster, JE., 2010. Virulence of Mexican isolates of entomopathogenic fungi (Hypocreales: Clavicipitaceae) upon Rhipicephalus = Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) larvae and the efficacy of conidia formulations to reduce larval tick density under field conditions. Veterinary Parasitology.170: 278-286. Da costa, G. L., Sarquis, M. I. M., de Moraes, A. M. L., Bittencourt, V. R. E. P., 2002. Isolation of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae var. anisopliae from Boophilus microplus tick (Canestri, 1887), in Rio de Janeiro State, Brazil. Mycopathologia 154:207209. Domínguez-García, D. I., Rosario-Cruz, R., Almazán-García, C., Saltijeral-Oaxaca, J. A., De la Fuente, J., 2010. Boophilus microplus: Aspectos Biológicos y moleculares de la resistencia a los acaricidas y su impacto en la salud animal. Trop. Subtrop. Agrocosyt. 12: 181-192. Fernández-Ruvalcaba, M., Berlanga-Padilla, A. M., Cruz-Vázquez, C., Hernández-Velázquez, V. M., 2010. Evaluación de cepas de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae sobre la inhibición de ovoposición, eclosión y potencial reproductivo en una cepa triple resistente de garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini) (Acari: Ixodidae). Entomotropica. 25: 109-115. Fernández-Ruvalcaba, M., Zhioua, E., García-Vázquez, Z., 2005. Infectividad de Metarhizium anisopliae en contra de cepas de la garrapata Boophilus microplus sensible y resistente a los organofosforados. Téc Pecu Méx. 43: 433-440. Gindin-Galinda., Ment-Dana, Rot-Asael., Glazer-Itamar, Samish-Michael., 2009. Pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Hypocreales: Clavicipitaceae) to Tick Eggs and the Effect of Egg Cuticular Lipids on Conidia Development. Journal of Medical Entomology. 46(3): 531-538. Kaaya, G. P., E. N. Mwangi y E. A. Ouna, 1996. Prospects for biological control of livestock ticks, Rhipicephalus appendiculatus and Amblyomma variegatum using the entomogenous fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. J. Invertebr. Pathol. 67: 15-20. NOM-019-ZOO-1994 Campaña nacional contra la garrapata Boophilus spp. DIARIO OFICIAL. Viernes 19 de mayo de 1995. Ojeda-Chi, M. M. y Rodríguez-Vivas, R. I., 2011. Control de Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) mediante el uso del hongo entomopatógenos Metarhizium anisopliae (Hypocreales: Clavicipitaceae). Rev Mex Cienc Pecu. 2: 177-192. Prieto-Avella, E., Hernández-Ramírez, C., Angel-Sahagún C. A., Cruz-Avalos, A. M. GutiérrezChávez, A. J., Valencia-Posadas, M., 2012. Patogenicidad de hongos entomopatógenos nativos del Estado de Guanajuato sobre huevo de garrapata Rhipicephalus sanguineus (Acari-Ixodidae). Memorias del Primer Congreso Latinoamericano de Acarología. Puebla. Silva-Martínez, A. M., 2001. Virulencia de hongo Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, Paecilomyces fumosoroseus (Deuteromycotina: Hipomycetes) en huevo de Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). Seminario de Investigación II. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad de Colima. 350 EVALUACIÓN DE PORCENTAJE DE GERMINACIÓN Y CRECIMIENTO RADIAL DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS DE Metarhizium anisopliae y Cordyceps bassiana Jiménez-Lara Yadira1, Cruz-Avalos Ana Martha2, Lezama-Gutiérrez Roberto3, Angel-Sahagún César Andrés1, Martínez-Yáñez Alicia del Rosario1, Molina-Ochoa Jaime3. 1Programa Educativo de Medicina Veterinaria y Zootecnia, División Ciencias de la Vida, Campus Irapuato-Salamanca, Universidad de Guanajuato, Ex-Hacienda El Copal, Km. 7 Carretera Irapuato-Silao, Irapuato, Guanajuato. [email protected], [email protected]. 2 Instituto Tecnológico de Irapuato, Extensión Abasolo. Blvd. Cuitzeo de los naranjos N° 401. Colonia Peña de Guisa. C.P. 36970. Abasolo, Guanajuato. 3Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima. Km. 40.5 Carretera Colima-Manzanillo, Tecomán, Colima, México. RESUMEN. En el presente trabajo se evaluó porcentaje de germinación y crecimiento radial de ocho aislados de Metarhizium anisopliae y dos de Cordyceps bassiana en condiciones de laboratorio con la finalidad de determinar diferencias entre cepas y aislados. Los resultados de porcentaje de germinación demostraron diferencias entre cepas que varían de 83.5 a 98.5% incubadas a 25±1°C a 18 y 24 horas para Cb2 y Ma3 respectivamente, los resultados se homogenizan a las 24 horas de incubación. El crecimiento radial, a los 14 días de incubación a 25±1°C, variaron de 3.7 a 6.7cm para Cb2 y Ma1 respectivamente. Los resultados del presente trabajo permiten seleccionar a la cepa Ma6 por haber obtenido los valores más sobresalientes en la germinación a las 18 y 24 horas y en las evaluaciones de crecimiento radial. Palabras clave: Control de calidad, selección, control biológico, enemigos naturales. Evaluation of percentage of germination and radial growth of entomopathogenic fungi of Metarhizium anisopliae and Cordyceps bassiana ABSTRACT. In this study germination percentage and radial growth were evaluated in eight Metarhizium anisopliae isolates and two Cordyceps bassiana isolates in laboratory conditions in order to determine differences between strains and isolates. Germination percentage results demonstrate differences among strains that vary from 83.5 to 98.5% incubated at 25 ±1°C at 18 and 24 hours post incubation for Ma3 Cb2 respectively, the results are homogenized at 24 hours incubation without showing significant differences. Radial growth results at 14 days of incubation at 25 ±1°C, ranging from 3.7 to 6.7cm for Cb2 and Ma1 respectively. The results of the present work enable them to select the strain Ma6 by having obtained the most outstanding values in germination at 18 and 24 hours and in evaluations of radial growth Key words: Quality control, selection, biological control, natural enemies. Introducción En la actualidad existe un interés creciente para utilizar hongos en el control biológico de insectos, ácaros, malezas, patógenos de plantas, así como, nematodos parásitos de plantas y animales domésticos. Para ello, se tiene disponibilidad de un gran número de productos comerciales, y se formulan con la finalidad de procurarle al producto estabilidad y eficacia en el control de la plaga, para la cual es utilizado (Whipps y Lumsden, 2001). Los entomopatógenos incluyen a la mayoría de las especies conocidas como patógenos de insectos promisorios en el control microbiano (Samson, 1980). Este grupo incluye a Cordyceps bassiana (=Beauveria) (Balsamo-Crivelli) Vuillemin y Metarhizium anisopliae (Metschnickoff) Sorokin, con un grupo con un amplio rango de hospedadores. Veen, (1968) propuso que el éxito de un hongo entomopatógeno como bioinsecticida depende de la selección y el uso de una cepa altamente virulenta, además de conocer la manera de mejorarla o mantenerla por tiempos prolongados mediante procesos químicos o biológicos. Carreño (2003), afirma que para la comercialización de bioinsecticidas en base a hongos entomopatógenos se requiere de un conocimiento y control de las propiedades biológicas, físicas 351 y químicas, para lo cual existen pruebas microbiológicas que permiten discriminar cepas. Existe una amplia gama de pruebas que se pueden utilizar para seleccionar cepas sobresalientes para el control de plagas, dentro de las que se incluyen evaluaciones de patogenicidad, porcentaje de germinación y crecimiento radial como las más importantes (Dimbi et al., 2003). En el presente estudio se evaluó el porcentaje de germinación y crecimiento radial de dos cepas de hongos entomopatógenos de C. bassiana y ocho cepas de M. anisopliae, previamente evaluadas y seleccionadas por su elevado porcentaje de micosis sobre huevo y larvas de garrapata R. microplus (Canestrini), con la finalidad de determinar la cepa con mejores características biológicas que le proporcionen ventajas ante el desafío de plagas pecuarias y considerarla como posible agente de control biológico. Materiales y Método Los hongos que se utilizaron pertenecen a la colección de hongos entomopatógenos del Laboratorio de Parasitología y Control Biológico de la Universidad de Guanajuato (Cuadro 1) y previamente fueron evaluados y seleccionados por micosar huevos y larvas por arriba del 95% de la garrapata Rhipicephalus sanguineus. Primeramente los aislamientos se mantuvieron bajo condiciones de laboratorio y se reprodujeron en agar Dextrosa Sabouraud enriquecido con extracto de levadura al 1% (Watson et al., 1995) y con 500 ppm de cloranfenicol (Sneh, 1991) con 12 horas luz/oscuridad. Para la determinación de la viabilidad, los conidios de cada cepa se obtuvieron con ayuda de agua destilada con 0,1% (v/v) de Tween 80 (Samuels et al., 2002) y para homogenizar la suspensión se colocaron en un Vortex durante tres minutos (Lezama-Gutiérrez et al., 2000). Una vez que la suspensión se homogenizó se determinó la concentración con ayuda de una cámara hematimétrica de Neubauer (Reichert Scientific Instruments, Buffalo, Nueva York) y se ajustó, por dilución a 1x106 conidios/mL misma que sirvió para realizar la evaluación (García et al., 2005). Posteriormente se inocularon 100µL de la suspensión en cajas de Petri con Agar Dextrosa Sabouraud y Extracto de Levadura y el inóculo fue expandido en el Agar con ayuda de un dispersor celular y un asa de triangulo. La caja fue incubada a 25±1ºC y se tomaron registros de germinación a las 18 y 24 horas, se consideró un conidio como germinado cuando rebasó la longitud del mismo (Lacey et al., 1994). Para determinar el crecimiento radial de las diferentes cepas, primeramente fueron cultivadas en Agar Dextrosa Sabouraud. La caja fue incubada a 25±1ºC, entre tres y ocho días posterior a la inoculación, una vez que se observó un crecimiento uniforme sobre el Agar Dextrosa Sabouraud en la caja de Petri se extrajo un disco de 5 mm de diámetro de micelio no esporulado, con ayuda de un sacabocado, y fue colocado el micelio en contacto con el medio de cultivo, se incubó a 25±1°C y la superficie del crecimiento radial fue registrada diariamente usando los diámetros cardinales previamente dibujados en la parte inferior de cada caja (Fargues et al., 1997). Los resultados de porcentaje de germinación se analizaron con un análisis de varianza con arreglo completamente al azar, previa transformación angular de los porcentajes (ArcSeno-1) y para los que mostraron diferencias estadísticas entre tratamientos se realizó una prueba de separación de medias por Tukey al 95% de confianza con ayuda del programa estadístico SAS (SAS, 1997). A los datos obtenidos de crecimiento acumulativo de 14 días posterior a la inoculación se les realizó un análisis de varianza y una prueba de comparación de medias de Tukey al 95% de confianza con el paquete estadístico SAS (1997). 352 Resultados De acuerdo a las condiciones en que se desarrollaron las evaluaciones se observó que todos los aislamientos de M. anisopliae y C. bassiana mostraron germinación de las conidias. Se observaron germinaciones que variaron, de un 83.8 a 98.5% después de las 18 horas de inoculación, a las 24 horas el rango de los resultados fueron de 89.5 a un 100% de conidias germinadas (Cuadro 1). A las 18 horas de incubación las cepas de C. bassiana presentaron mayor porcentaje de germinación, sin embargo a las 24 horas de incubación dos aislados de M. anisopliae superaron los resultados de germinación de las cepas de C. bassiana (Cuadro 1). Cuadro 1. Resultados del porcentaje de germinación de hongos entomopatógenos de M. anisopliae y C. bassiana incubadas 18 y 24 horas a 25±1°C y de crecimiento radial después de 14 días de incubación a 25±1°C y pruebas de Tukey al 95% de confianza. Germinación (%) 18horas Aislado Ma1 Ma2 Ma3 Ma4 Ma5 Ma6 Ma7 Ma8 Cb2 Cb3 Germinación (%) 90 88.3 83.8 86.8 92.5 95.3 92.5 90.8 98.5 95.8 Crecimiento radial 24 horas Tukey* bcd e de cde abcd abc bcd bcd a ab Germinación (%) 97.8 94.7 89.5 98 96.8 98 100 98.5 99.8 99.5 Tukey* ab bc c ab abc ab a ab a a Crecimiento (cm) 6.7 6.7 6.4 4.1 4.9 6.1 6 5.3 3.7 3.9 Tukey* a a a de cd ab ab bc e e *Literales diferentes por columna denotan diferencia estadística significativa. El análisis de varianza a las 18 horas de incubación mostró diferencias significativas entre tratamientos (F=10.73; p<0.0001); la prueba de separación de medias por Tukey formó 5 grupos en donde los aislados Cb2, Cb3, Ma5 y Ma6 formaron el primer grupo y más sobresaliente, solo el aislado Cb2 no compartió igualdad estadística con otro grupo; el último grupo se formó por los aislados Ma2, Ma3 y Ma4, de los cuales solo el Ma2 no compartió igualdad estadística con otro grupo (Cuadro 1). El análisis de varianza con los datos registrados a las 24 horas, mostraron diferencias entre los tratamientos (F=8.77; p<0.0001); la prueba de comparación de medias formó 3 grupos, el primero y más sobresaliente estuvo formado por los aislados Ma1, Ma4, Ma5, Ma6, Ma7, Ma8, Cb2 y Cb3, el tercer grupo y menos sobresaliente se formó por los aislados Ma2, Ma3 y Ma5, el aislado Ma3 no compartió igualdad estadística con otro grupo (Cuadro 1). Con respecto al crecimiento radial se observó que las cepas de M. anisopliae presentaron mayor crecimiento que los de C. bassiana, donde las cepas más sobresalientes fueron Ma1, Ma2, Ma3, Ma6 y Ma7 con crecimientos de 6-6.7 cm, las cepas de Cb1 y Cb2 de C. bassiana presentaron crecimientos de 3.9 y 3.7 cm respectivamente (Cuadro 1). El análisis estadístico del crecimiento radial a los catorce días mostró que existen diferencias entre los tratamientos (F: 55.90; P> 0.0001) y la prueba de comparación múltiple de 353 medias de Tukey formó 5 grupos en donde Ma2, Ma1, Ma3 y Ma7 formaron el primer grupo más sobresaliente y el último grupo se formó por los aislados Ma4, Cb3 y Cb2 (Cuadro 3). Discusión En el presente estudio se observó que la germinación de los conidos de 21 días de edad fue de 83.8 a 98.5%, con un periodo de incubación de 18 horas a 25±1°C, valores semejantes a lo encontrado por Fargues et al. (1997) y Dimdi et al. (2003), quienes evaluaron la germinación de cepas de hongos entomopatógenos de distintos orígenes a diferentes temperaturas y encontraron que la temperatura óptima para la germinación fue de 25±1°C, en el presente estudio se observó que todos los hongos entomopatógenos germinaron y posiblemente las diferencias encontradas se debieron a las características particulares a cada hongo. En otros estudios se han reportado porcentajes de germinación de conidios similares a los obtenidos, tales como Ekesi et al. (2003) que reportan germinación de 85 a 90% de conidias de M. anisopliae incubados a 26±2°C, resultados que se encuentran, de manera general por debajo de lo encontrado en el presente estudio. En cuanto a los resultados del crecimiento radial obtenidos a los 14 días de incubación a 25±1°C comprueban que existen diferencias entre especies, pero también se presentan diferencias entre aislado de la misma especie. Lecuona y Díaz (2001) reportan un crecimiento radial en aislados de C. bassiana el cual va de 2.22-3.84 cm a los 9 días de ser incubados a 26±1°C, resultados que se asemejan a los observados en el presente estudio, donde el promedio mínimo de crecimiento fue de 3.9 y 3.7 cm para las cepas Cb3 y Cb2 respectivamente con 14 días de incubación a 25±1°C. Probablemente la especie de C. bassiana con respecto a M. anisopliae tiene menor velocidad de crecimiento lo cual se evidenció con los resultados del presente estudio. Magalhâes et al. (2003) observaron que existen diferencias entre aislados de M. anisopliae con respecto al crecimiento radial a los 14 días incubados a 25±1°C; ellos obtuvieron resultados que varían de 3.53 hasta 6.25 cm, los cuales son semejantes y por debajo a los que obtenidos en el presente estudio. De acuerdo a los estudios previos donde se observó que todas las cepas mataron por arriba del 95% de huevo y larvas de la garrapata R. sanguienus se puede evidenciar que una característica biológica no es suficiente para discriminar cepas de hongos entomopatógenos y se debe de considerar para estudios posteriores e incluso evaluaciones con otras plagas. Literatura Citada Carreño, I. A., 2003. Tesis: Evaluación de la Patogenicidad de diferentes hongos entomopatógenos para el control de la mosca blanca de la yuca Aleurotrachelus socialis Bondar (Homoptera: Aleyrodidae) bajo condiciones de invernadero. Bogotá D. C. Colombia. Dimbi, S., Maniania N. K, Lux S. A y Mueke J. M. 2003. Effect of constant temperature on germination, radial growth and virulence of Metarhizium anisopliae to three species of Agrican tephritid fruit flies. Biological Control 49:83-94. Ekesi, S., Maniania, N. K. y Lux, S. A. 2003. Effect of soil temperatura and moisture on survival and infectivity of Metarhizium anisopliae to four tephritid fruit fly puparia. Journal of Invertebrate Pathology. 83: 157-167. 354 Fargues, J., Goettel, M. S., Smits, N., Ouedraogo, A., y Rougier, M. 1997. Effects of temperature on vegerarive growth of Beauveria bassiana isolates from different origins. Mycologia, 89: 383-392 García, M. V., Monteiro, A. C., Szabo, M. J .P., Prette, N. y Bechara, G. H., 2005. Mechanism of infection and colonization of Rhiphicephalus sanguineus eggs by Metarhizium anisopliae as revealed by scanning electron microscopy and histopathology. Brazilian Journal of Microbiology. 36, 368–372. Lacey, L. A., Martins, A., y Ribeiro, C. 1994. The pathogenicity of Metarhizium anisopliae and Beauveria Bassiana for adults of the Japanese beetle, Popilia japonica (Coleoptera: Scarabaeidae). European Journal of Entomology. 91(3): 313-319. Lecuona, R. E. y Díaz, B. M. 2001. Susceptibilidad de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) a los hongos entomopatógenos Nomuraea rileyi, Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana. Revista de Investigación Agropecuaria. 30 (1): 25-42. Lezama-Gutiérrez, R., Trujillo-de La Luz, A., Molina-Ochoa, J., Rebolledo- Domínguez, O., Pescador, A. R., López-Edwards, M. y Aluja, M., 2000. Virulence of Metarhizium anisopliae (Deuteromycotina: Hyphomycetes) on Anastrepha ludens (Díptera: Tephritidae): laboratory and field trials. Journal of Economic Entomology. 93: 1080– 1084. Magalhâes, B. P., Silvana-Tigano, M., Martins, I., Frazâo, H. y Ramirez, H.G. 2003. Characterization of peruvian isolate of Metarhizium anisopliae var. Acridum, a pathogen of grasshoppers. Pesq. Agropec. Bras. 38(12): 1469-1475. SAS Institute, 1997. SAS/STAT software: change and hancements through relase 6.12. SAS Institute, Cary, NC. Samuels, R. I., Pereira, R. C. y Gava, C. A. T., 2002. Infection of the coffee berry borer Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae) by Brazilian isolates of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae (Deuteromycotina: Hyphomycetes). Biocontrol Science and Technology. 12: 631–635. Samson, R. A. 1980. Identification; Entomopathogenic deuteromicetes. En: Burges, H. D. Microbial control of pest and plant diseases 1970-1980. Sneh, B., 1991. Isolation of Metarhizium anisopliae from insects on an improved selective medium based on wheat germ. J. Invertebr. Pathol. 58: 269–273. Veen, K.H. 1968. Researches sur la maladie due Metarhizium anisopliae chez le croquet pelerine. Meded. Landbouwhogesch. Wagenengen. 68: 1-117. Watson, D. W., Geden, C. J., Long, S. J. y Rutz, D. A., 1995. Efficacy of Beauveria bassiana for controlling the house fly and stable fly (Diptera: Muscidae). Biological Control 5: 405– 411. Whipps, J. M. y Lumsden, R. D. 2001. Comercial use of fungi as disease biological control agents: Status and prospects, pp. 9-22. En Butt, T.M., Jackson, C. y Magan, N. (eds.), Fungí as Biocontrol Agents: Progress, Problems and Potential. CABI Publishing, Uk. 355 EVALUACIÓN DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS SOBRE PULGAS Ctenocephalides canis: RESULTADOS PRELIMINARES Laura Verónica Rivera-Ramírez1, César Andrés Angel-Sahagún1, Mauricio Valencia-Posadas1, Jonathan Emmanuel Ortega-Palomares1 y Manuel Canchola-Ramírez 3 1Departamento de Agronomía, División Ciencias de la Vida, Campus Irapuato-Salamanca, Universidad de Guanajuato. Ex Hacienda El Copal, km 7 carretera Irapuato-Silao, Apdo. Postal 311, Irapuato, Guanajuato, CP 36500 [email protected] 2Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima. Km. 40.5 Carretera Colima-Manzanillo, Tecomán, Colima, México. 3 Centro de Atención Canina del municipio de Irapuato, Guanajuato RESUMEN. El presente estudio evaluó la patogenicidad de hongos entomopatógenos de Metarhizium anisopliae y Cordyceps bassiana sobre la Ctenocephalides canis en condiciones de laboratorio. Las pulgas se obtuvieron de los cánidos infestados colectados por el personal del Centro de Atención Canina del Municipio de Irapuato, Guanajuato. Los tratamientos con los hongos M. anisopliae y C. bassiana consistieron de cuatro repeticiones cada uno y 10 individuos por repetición y la inoculación se realizó por inmersión a concentraciones de 1x108 conidios/mL. El aislado Ma2 resultó ser más patógeno en comparación con las cepas Cb2 y Ma5. Los resultados permiten concluir que los hongos evaluados son patógenos para pulgas C. canis en condiciones de laboratorio y se evidenció que la técnica de inoculación es eficaz para realizar las evaluaciones sobre pulgas. Palabras clave: Metarhizium anisopliae; Cordyceps bassiana; pulga; Ctenocephalides canis. Preliminary assessments of entomopathogenic fungi on fleas Ctenocephalides canis ABSTRACT. The present study evaluated the pathogenicity of entomopathogenic fungi of Metarhizium anisopliae and Cordyceps bassiana on the Ctenocephalides canis in laboratory conditions. The treatments with M. anisopliae and C. bassiana fungi consisted of four replicates each and 10 individuals by replicate and the inoculation was performed by immersion at concentrations of 1x108 conidia/mL. The isolated Ma2 resulted to be more pathogenic in comparison with the strains Cb2 and Ma5. The results allow to conclude that the entomopathogenic fungi assessment are pathogens for fleas C. canis in laboratory conditions and it was demonstrated that the technique of inoculation is effective to perform evaluations on fleas. Key words: Metarhizium anisopliae; Cordyceps bassiana; fleas; Ctenocephalides canis. Introducción La pulga del perro Ctenocephalides canis es un ectoparásito hematófago que se ha distribuido en todo el mundo (Hernández et al., 2011). La infestación por pulgas es un problema común en perros y son responsables de complicaciones de salud por sus hábitos alimenticios; el perro presentará prurito, irritación de la piel, y en ocasiones dermatitis alérgica. Además de los daños, las pulgas son hospederos intermediarios de parásitos internos y de otros microorganismos que causan enfermedades de importancia en salud pública y medicina veterinaria (Hernández et al., 2011). El control de pulgas se ha llevado a cabo mediante el uso de insecticidas y reguladores del crecimiento de insectos (RCI), los cuales han resultado ser muy efectivos para el control de infestaciones, aún en climas extremos, los cuales demuestran ser 100% eficaces en la eliminación de éstas sin necesidad de hacer tratamientos ambientales (Dryden y Broce, 2003). No obstante la eficacia de los insecticidas, existen daños al medio ambiente ya que los productos antes mencionados no discriminan entre pulgas y algunos otros insectos, como algunos benéficos. Además, se ha comprobado que los productos químicos repercuten en la salud de la población, especialmente la vulnerable como mujeres embarazadas y niños (Scholl, 1993). La comunidad científica busca métodos alternativos para mantener controladas plagas de interés veterinario y en salud pública, por lo anterior, actualmente se ha adoptado la idea de 356 utilizar el control biológico utilizando algunos de los enemigos naturales disponibles en la naturaleza. Dentro de los posibles enemigos naturales podemos encontrar bacterias, nematodos, virus, parasitoides y el más utilizado en los últimos años en el área veterinaria son los hongos entomopatógenos. Los hongos entomopatógenos se han usado con éxito para controlar plagas agrícolas y de pastoreo (Godwin y Shawgi, 2000). En Brasil, estos hongos se han rociado con aviones en los campos grandes para controlar las plagas de caña de azúcar, mientras que en Indonesia y Malasia, se utilizaron para controlar el escarabajo rinoceronte, plaga de la palma aceitera (Godwin y Shawgi, 2000). Actualmente no existen datos disponibles en la literatura sobre el control biológico de pulgas C. canis, sin embargo se cuenta con investigación de control biológico de pulgas utilizando hongos entomopatógenos de C. bassiana sobre C. felis (pulga del gato). Por lo antes expuesto el objetivo del presente trabajo fue evaluar hongos entomopatógenos para controlar la pulga del perro C. canis en condiciones de laboratorio. Materiales y Método La presente investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Parasitología y Control Biológico de la División Ciencias de la Vida (LPCB-DICIVA) del Campus Irapuato – Salamanca de la Universidad de Guanajuato, situado en el Km 7 de la carretera Irapuato – Silao, ExHacienda El Copal, Irapuato, Guanajuato. De Melo et al. (2008) realizaron una evaluación en la cual utilizó aislados de C. bassiana y M. anisopliae sobre C. felis felis (pulga del gato) en condiciones de laboratorio. En esta investigación se utilizó un protocolo similar con algunos ajustes a conveniencia. Se utilizaron cepas de C. bassiana y M. anisopliae pertenecientes al LPCB-DICIVA (Cuadro 1). Los hongos fueron multiplicados en agar dextrosa Sabouraud, con 1% de extracto de levadura y 500 ppm de cloranfenicol por 21 días a 25±1°C y 12 horas de luz/oscuridad. Los conidios fueron obtenidas con ayuda de agua destilada con 0.1% (v/v) de Tween 80 (Samuels et al., 2002) y para homogenizar la suspensión se colocaron en un Vortex durante tres minutos (Lezama-Gutiérrez et al., 2000). Una vez que la suspensión se homogenizó, se determinó la concentración con ayuda de una cámara hematimétrica de Neubauer (Reichert Scientific Instruments, Buffalo, Nueva York) y se ajustó, por dilución a 1x108 conidios/mL misma que sirvió para realizar la evaluación. Las pulgas que se utilizaron en el presente estudio, C. canis (pulga del perro), se obtuvieron de los cánidos infestados con pulgas recolectados por el personal técnico del Centro de Atención Canina del Municipio de Irapuato, Guanajuato. Las pulgas fueron extraídas con ayuda de un peine y se colocaron en una bolsa de polipropileno para su transporte al laboratorio. Una vez en el laboratorio fue necesaria una previa inmovilización de éstas introduciendo la bolsa de transporte al congelador con temperatura de 4°C por un lapso de 3 minutos para agruparlas con cinta masking a un total de 5 a 10 pulgas por cada repetición (se hicieron 4 repeticiones por cada tratamiento) y se colocaron dentro de cajas de petri 90x15 mm sobre una capa doble de papel filtro humedecido con agua destilada estéril. Los bioensayos consistieron en baños de inmersión por 5 segundos de suspensión conidial b ó 25± 1°C H ≥ 80%. L m m f as cada 12 horas durante tres días seguidos para observar la muerte y posterior presencia de micosis en cada tratamiento. Los resultados fueron analizados por análisis de varianza con arreglo completamente al azar de los porcentajes de micosis, previa transformación angular al ArcSen-1 y se realizó una 357 prueba de comparación de medias por Tukey al 95% de confianza con el programa estadístico SAS (SAS, 1997). Resultados y Discusión De acuerdo a las condiciones en que se realizaron los experimentos se logró observar que los hongos entomopatógenos de las especies de M. anisopliae y C. bassiana son patógenos para las pulgas C. canis en condiciones de laboratorio. Los porcentajes de micosis de las tres cepas de hongos entomopatógenos que resultaron patógenas para las pulgas de C. canis variaron de 11.25 a 38% donde la cepa más sobresaliente fue la Ma2 y la menos sobresaliente la Ma5 y la cepa Cb2 mostró un 20% de micosis (Cuadro 1). Los resultados del análisis de varianza mostró que existieron diferencias significativas entre los tratamientos (F=6.53; p= 0.0153) donde la prueba de Tukey formó dos grupos donde el primer grupo se formó por las cepas Ma2, Cb2 y Ma5 y el segundo grupo por el grupo testigo y compartiendo igualdad estadística con las cepas Cb2 y Ma5. Cuadro 1. Porcentaje de micosis de pulgas C. canis por hongos entomopatógenos de C. bassiana y M. anisopliae y prueba de separación de medias por Tukey. Especie/Cepa (Metarhizium anisopliae) Ma2 Ma5 Cordyceps bassiana Cb2 Testigo Micosis (%) 38.09 11.25 20.00 Tukey* 0 b a ab ab *Literales diferentes por columna denotan diferencia estadística significativa. En el presente estudio se demostró que las cepas Ma2, Ma5 y Cb2 resultaron ser poco patógenas sobre C. canis. a diferencia del estudio que realizó De Melo et al. (2008) donde se demostró que M. anisopliae y C. bassiana, tuvieron un gran potencial patógeno como control biológico, ya que a las 36 horas de que las pulgas fueron expuestas al hongo, éstas se mostraron micosadas. Debido a que solo existe un estudio previo al presentado acerca del control biológico sobre las pulgas, la discusión se limita solo a este trabajo y se recomienda se continúe evaluando hongos entomopatógenos con la técnica descrita ya que mostró ser eficaz. Conclusiones Se encontró que los hongos evaluados son patógenos para pulgas C. canis en condiciones de laboratorio. Se evidenció que la técnica de inoculación es eficaz para realizar las evaluaciones sobre C. canis. Literatura Citada De Melo, D. R., Fernandes, E. K. K., Da Costa, G. L., Scott, F. B., Bittencourt, V. R. E. P., (2008). Virulence of Metharhizium anisopliae and Beauveria bassiana to Ctenocephalides felis felis. Animal biodiversity and emerging diseases: Ann. N. Y. Acad. Sci. 1149:388-390. 358 Dryden, M. W., Broce, B. A., (2003). El control integral de las pulgas en el siglo 21 Vol. 24, No. 1(A). Consultado el 07 de febrero de 2012, Kansas State University. E.U.A. Disponible en: http://www.webveterinaria.com/merial/controlpulgas.html. Godwin, P. K., Shawgi, H. (2000). Entomogenous fungi as promising biopesticides for tick control. Experimental and Applied Acarology 24: 913–926 Hernández, V. E., Cruz, V. C., Ortíz, M. R., Valdivia, F. A., Quintero, M. M. T., (2011). Presence of Ctenocephalides canis (Curtis) and Ctenocephalides felis (Bouché) infesting dogs in the city of Aguascalientes, México. J. Parasitol 97 (6) 1017-1019. SAS Institute, 1997. SAS/STAT software: change and hancements through relase 6.12. SAS Institute, Cary, NC. Scholl, P. J., 1993. Biology and control of cattle grubs. Annu. Rev. Entomol. 38: 53-70. 359 FLUCTUACIÓN POBLACIONAL DE DOS ESPECIES DE PARASITOIDES DEL GUSANO COGOLLERO, Spodoptera frugiperda (SMITH) Laura Martínez-Martínez, Roselia Jarquín-López y José Antonio Sánchez-García. Instituto Politécnico Nacional, CIIDIR Unidad Oaxaca. Calle Hornos no. 1003. Sta. Cruz Xoxocotlán, Oaxaca, México. C. P. 71230. [email protected] RESUMEN. En Oaxaca se han encontrado 12 especies de parasitoides atacando al gusano cogollero del maíz, Spodoptera frugiperda, las más abundantes Chelonus insularis y Campoletis sonorensis. Para realizar un manejo biológico, es necesario conocer la fluctuación poblacional y biología, por lo que estudiamos dichos parámetros en Ch. insularis y C. sonorensis, en Etla, Oaxaca. 42.5% de las plantas presentaron larvas de cogollero. Ch. insularis fue más abundante en abril y mayo, C. sonorensis al inicio de la infestación, marzo y abril del 2012. Ch. insularis presentó 14.52% de parasitismo, C. sonorensis 19.29%. Las larvas de Ch. insularis y C. sonorensis emergieron del 3er ínstar del huésped. Ch. insularis pupó en 6.21 días; la emergencia del adulto 10.77 días; el desarrollo total 16.98 días. C. sonorensis pupó en 4.22 días; la emergencia del adulto 6.49 días; el desarrollo total 10.71 días. Las hembras de C. sonorensis son más longevas que los machos. Palabras clave: Chelonus insularis, Campoletis sonorensis, control biológico. Population fluctuation of two parasitoids species of the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (Smith) ABSTRACT. In Oaxaca there are 12 species attacking fall armyworm Spodoptera frugiperda; two are the most abundant Campoletis sonorensis and Chelonus insularis. To perform a biological management, we need to know the population dynamics and biology, so we studied these parameters in Ch. insularis and C. sonorensis in Etla, Oaxaca. 42.5% of the plants showed larvae of the fall armyworm. Ch. insularis was more abundant in April and May while C. sonorensis at the beginning of the infestation, March and April 2012. Ch. insularis showed 14.52% parasitism, C. sonorensis 19.29%. The larvae of Ch. insularis and C. sonorensis emerged 3rd instar host. Ch. insularis pupated in 21.6 days, the adult emergence was in 10.77 days, total development in 16.98 days. C. sonorensis pupated in 4.22 days, the adult emergence was in 6.49 days, total development in 10.71 days. C. sonorensis females live longer than males. Key words: Chelonus insularis, Campoletis sonorensis, biological control. Introducción La principal plaga del cultivo de maíz es el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda (Smith) (Lepidoptera: Noctuidae), aunque también puede atacar a otros cultivos como: sorgo, arroz y otras gramíneas. En Oaxaca se han encontrado 12 especies de parasitoides, atacando larvas de S. frugiperda, de la familia Braconidae: Chelonus insularis Cresson Chelonus sp., Cotesia marginiventris Cresso), Homolobus truncator; de la familia Ichneumonidae: Campoletis sonorensis (Cameron), Campoletis sp., Pristomerus spinator (Fabricius), Ophion flavidus, Mesochorus sp.; el Eulophidae: Euplectrus comstockii Howard; los Tachinidae: Archytas sp. y Lespesia sp. Las especies más abundantes son Ch. insularis y C. sonorensis (Martínez-Martínez et al., 2008; Cruz, 2009). Chelonus insularis en forma natural se encuentra abundantemente en México (Cabrera y García, 1985; Pair et al., 1986; Carrillo, 1993; Martínez-Martínez et al., 1998, Molina-Ochoa et al., 2004; Martínez-Martínez et al., 2008; Cruz, 2009). Su distribución comprende desde Estados Unidos hasta América del Sur y el Caribe (Cave, 1995). Ch. insularis también parasita a Spodoptera spp., Helicoverpa zea (Boddie), Trichoplusia ni (Hubner), Feltia subterranea (Fab.), y otras especies de Noctuidae y Pyralidae. Es un endoparasitoide solitario de huevo-larva. 360 Campoletis sonorensis también se encuentra abundantemente en México (Cabrera y García, 1985; Pair et al., 1986; Carrillo, 1993; Martínez-Martínez et al., 1998, Molina-Ochoa et al., 2004; Martínez-Martínez et al., 2008; Cruz, 2009). Originalmente parasita a Trichoplusia ni aunque además parasita a Heliothis virescens y Helicoverpa zea. C. sonorensis es un endoparasitoide solitario que oviposita en la larva y emerge de la larva huésped. Para poder plantear un manejo de estos parasitoides enfocado hacia un control biológico, es indispensable conocer su fluctuación poblacional y biología. Por lo anterior, nuestro objetivo fue estudiar la fluctuación poblacional y algunos aspectos de la biología de los parasitoides Chelonus insularis y Campoletis sonorensis. Materiales y Método El presente estudio se realizó en El distrito de Etla que se localiza en la parte central del estado en la región conocida como Valles Centrales de Oaxaca. Durante los meses de febrero a junio del 2012, semanalmente se revisaron 100 plantas de maíz, menores a un metro de altura, de forma aleatoria, para verificar la presencia de larvas de gusano cogollero, Spodoptera frugiperda. Se registró la cantidad e instar de las larvas para emplearlos en el cálculo de plantas infestadas. Las larvas se colectaron utilizando pinzas entomológicas y se colocaron individualmente en cajas Petri de plástico de 60 x 15 mm y se llevaron al laboratorio de Control Biológico del CIIDIR, bajo condiciones ambientales. Las larvas se alimentaron diariamente con hojas tiernas de maíz, hasta llegaran a formar la pupa. Diariamente se revisaban las pupas para observar y registrar: mortalidad, emergencia de palomillas o de parasitoides. La identificación taxonómica de los parasitoides adultos se realizó con las claves de Cave (1995). Se calculó el número de días que les llevó a las larvas la pupación y la emergencia de los parasitoides adultos. Cuando los parasitoides adultos emergieron se les alimentó con miel de abeja hasta que se registró su mortalidad. Resultados y Discusión Se colectaron un total de 681 larvas de S. frugiperda en diferentes estados de desarrollo, en un total de 1,600 plantas muestreadas. Se encontró que el 42.5% de las plantas muestreadas tuvieron presencia de larvas de S. frugiperda. Fluctuación poblacional. Encontramos que el parasitoide Chelonus insularis se presentó durante todo el periodo muestreado presentando mayor incidencia en los meses de abril y mayo del 2012. La fluctuación poblacional del parasitoide Ch. insularis, se muestra en la figura 1. Al parecer la mayor abundancia de Ch. insularis corresponde con el aumento de la infestación por S. frugiperda como se observa en la figura 1. En promedio Ch. insularis ejerció un 14.52% de parasitismo (calculado en base a palomillas y parasitoides adultos emergidos). Ryder y Pulgar (1969) encontraron en Cuba que el parasitismo por Ch. insularis fue del 12.8% sobre cogollero, pudiendo alcanzar hasta un 25% en los meses de abril, mayo y junio. En Coahuila, Méx. Ríos-Velasco et al. (2011) encontraron un parasitismo de 21.42% debido a Ch. insularis. 361 Figura 1. Fluctuación poblacional del parasitoide Chelonus insularis Cresson en larvas de Spodoptera frugiperda (Smith) en Etla, Oaxaca, 2012. El parasitoide Campoletis sonorensis se presentó durante todo el periodo muestreado, se observó una mayor población de este parasitoide en los meses de marzo y abril del 2012 (Figura 2). Se aprecia que la población de C. sonorensis se comporta de una forma diferente a la del parasitoide Ch. insularis, C. sonorensis se presenta más abundantemente al inicio de la infestación de S. frigiperda. Posiblemente lo anterior se deba a que C. sonorensis tiene otros huéspedes que en ese momento esté parasitando ya que es sabido que parasita otros huéspedes. En promedio C. sonorensis ejerció un 19.29% de parasitismo (calculado en base a palomillas y parasitoides adultos emergidos). El parasitismo obtenido en este estudio debido a C. sonorensis difiere mucho a lo encontrado por Ríos-Velasco et al. (2011) en Coahuila, Méx. quienes obtuvieron un parasitismo de 1.17% por C. sonorensis y Pristomerus sp. Figura 2. Fluctuación poblacional del parasitoide Campoletis sonorensis (Cameron) en larvas de Spodoptera frugiperda (Smith) en Etla, Oaxaca, 2012. Ciclo de vida del parasitoide Chelonus insularis. Se colectaron un total de 54 individuos del parasitoide Ch. insularis. La larva del parasitoide emergió entre el 1ro y 4to instar del huésped. La pupación se llevó a cabo en un promedio de 6.21 días, con un rango entre 3 y 11 362 días; la emergencia del parasitoide adulto fue en promedio de 10.77 días con un rango entre 4 y 14 días; el desarrollo del parasitoide se dio en un total de 16.98 días (Cuadro 1). Cuadro 1. Ciclo de vida de los parasitoides Chelonus insularis Cresson y Campoletis sonorensis (Cameron). Laboratorio de Control Biológico del CIIDIR Oaxaca, IPN. 2012. Larva huésped colectada Inicio de pupación (días) Emergencia del parasitoide adulto (días) Total (días) Chelonus insularis 3er ínstar Rango 1ro a 4to ínstar Promedio 6.21 Rango 3 y 11 Promedio 10.77 Rango 4 y 14 16.98 Campoletis sonorensis 3er ínstar Rango 1ro a 5to ínstar Promedio 4.22 Rango 2 y 10 Promedio 6.49 Rango 3 y 10 10.71 Ciclo de vida del parasitoide Campoletis sonorensis. Se colectaron un total de 76 individuos. La larva del parasitoide emergió del 3er instar del huésped, con un rango entre el 1ro y 5to instar del huésped. Isenhour (1985) también encontró que las larvas de 3er instar son las preferidas, comparandalas con el 2do y 4yo instar, para la oviposición de C. sonorensis. La pupación se llevó a cabo en un promedio de 4.22 días, con un rango entre 2 y 10 días; la emergencia del parasitoide adulto fue en promedio de 6.49 días con un rango entre 3 y 10 días; el desarrollo del parasitoide se dio en un total de 10.71 días (Cuadro 1). En el caso de C. sonorensis se realizó una curva de supervivencia (Figura 3), dónde se observa que las hembras de este parasitoide son más longevas que los machos. Figura 3. Curva de supervivencia para hembras y machos del parasitoide Campoletis sonorensis (Cameron) en laboratorio. 2012. Literatura Citada Cabrera, J. y F. García. 1985. Parasitismo natural sobre gusano cogollero Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) en el estado de Morelos. Resúmenes del XX Congreso Nacional de Entomología. pp. 54. 363 Carrillo S., J. L. 1993. Síntesis del control biológico de Heliothis spp. y Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) en México. Folia Entomol. Mex. 87: 85-93. Cave, R. D. 1995. Manual Para el Reconocimiento de Parasitoides de Plagas Agrícolas en América Central. Primera edición. Zamorano Academia Press. Honduras. 202p. Cruz-Sosa, E. 2009. Evaluación del parasitismo natural en Spodoptera frugiperda (Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) en maíz. Tesis de Maestría en Ciencias. IPN, CIIDIR Unidad Oaxaca. 47 Pp. Isenhour, D. J. 1985. Campoletis sonorensis (Hymenoptera: Ichneumonidae) as a parasitoid of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae): host stage. Preference and functional response. Entomophaga 30: 31-36. Martínez-Martínez, L., E. Cruz-Sosa y R. Jarquín-López. 2008. Control Natural de Spodoptera frugiperda (Smith) en cultivos de maíz en Valles Centrales, Oaxaca, México. Pp. 418421. En: Estrada V. E. G. et al. (Eds.). Entomología Mexicana. Vol. 7. México. Martínez-Martínez, L., M. E. Valdéz, L. Aldana y R. Arzuffi. 1998. Parasitoides del gusano cogollero en el estado de Morelos. Memorias del VI Encuentro de Entomólogos del IPN. Pp. 32. Molina-Ochoa, J., J. E. Carpenter, R. Lezama-Gutiérrez, J. E. Foster, M. González-Ramírez, C. A. Ángel-Sahagún, and J. Farías-Larios. 2004. Natural distribution of Hymenopteran parasitoids of Spodoptera frugiperda (Lepidóptera: Noctuidae) larvae in Mexico. Florida Entomologist 87 (4): 461-472. Pair, S. D., J. R. Raulston, A. N. Sparks and P. B. Martin. 1986. Fall Armyworm (Lepidoptera: Noctuidae) parasitoids: differential spring distribution and incidence on corn and sorghum in the Southern United States and Northeastern Mexico. Environ. Entomol. 15: 342-348. Ríos-Velasco, C., G. Gallegos-Morales, J. Cambero-Campos, E. Cerna-Chávez, M. C. Del Rincón-Castro and R. Valenzuela-García. 2011. Natural enemies of the fall armyworm Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in Coahuila, México. Florida Entomologist 94: 723-726. Ryder, W. D. y N. Pulgar.1969. Apuntes sobre parasitismo de la palomilla del maíz (Spodoptera frugiperda). Rev. Cubana Cienc. Agric. 3:271-276. 364 CALIBRACIÓN DE UNA TÉCNICA DE INCORPORACIÓN DE UN SUELO ARTIFICIAL A DIETA SEMISINTÉTICA PARA DETECCIÓN DE AISLADOS DEL NUCLEOPOLIEDROVIRUS MÚLTIPLE DE Spodoptera frugiperda (J. E. SMITH) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) Dennis A. Infante-Rodríguez1, Gabriel Mercado-Vidal1, Jorge Valenzuela1, Delia Muñoz2 y Trevor Williams1. 1 Instituto de Ecología AC, Xalapa, Veracruz 91070, México, 2 Universidad Pública de Navarra, Arrosadía s/n, Pamplona 31006, España. *[email protected]. RESUMEN. El suelo funciona como reservorio de virus entomopatogenos de lepidópteros plaga. La técnica de detección per os mediante la incorporación de suelos a dieta artificial es un método útil para detección de aislados de baculovirus. En este trabajo se calibró la técnica utilizando una mezcla de suelo artificial a base de 10% (peso/peso) de turba de esfagno, 20% caolinita y 70% arena, como suelo estándar, según las indicaciones de la OECD para la evaluación ecotoxicológica de plaguicidas. Se realizó un experimento de incorporación de suspensiones de poliedros (OBs) del nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera frugiperda (SfMNPV) en suelo artificial a dieta semisintética. Concentraciones de 1x10 4, 1x105 OBs/ml no provocaron muertes por infección per os en las larvas de segundo estadio expuestas. En cambio, concentraciones de 1x10 6 OBs/ml y 1x107 OBs/ml, el porcentaje de larvas infectadas per os fue del 3% y 4% con 4 días de exposición a suelo contaminado con OBs y un periodo posterior a la infección de seis días. Palabras clave: Spodoptera frugiperda, Baculoviridae, suelo artificial, dieta artificial. Calibration of the concentration-mortality response for Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus (SfMNPV) in artificial soil using the diet incorporation technique for infection of Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). ABSTRACT: Soil has been recognized as an important environmental reservoir of entomopathogenic viruses. The diet incorporation technique has been used to detect nucleopolyhedroviruses in greenhouse and field soils. We calibrated the technique using artificial soil (70% sand, 20% kaolin and 10% sphagnum peat) to be used in laboratory bioassays as a standard soil. Bioassays were performed on 540 second instar larvae of Spodoptera frugiperda using OBs+artificial soil mixtures incorporated into semisynthetic diet that was used to feed second instars. Concentrations of 1x10 4 and 1x105 OBs/ml concentration resulted in no virus mortality, whereas concentrations of 1x106 OBs/ml and 1x107 OBs/ml resulted in 3% and 4% virus mortality. Additional studies will be focused on determining the concentration-mortality response at concentrations above 1 x 107 OBs/ml. Key words. Spodoptera frugiperda, Baculoviridae, artificial soil, artificial diet. Introducción La plaga más importante en el cultivo del maíz para Latinoamérica es Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). También ataca a otros cultivos como sorgo, algodón, soya, papa, jitomate y pastos de forrageo (Martínez, 2003). Este insecto presenta un amplio rango de hospederos y se encuentra ampliamente distribuido en norte, centro y Sur América (Sparks, 1979). La mayoría de aplicaciones de insecticidas químicos en maíz están dirigidas al control de este insecto. Sin embargo, durante los últimos años se encuentra en desarrollo una alternativa prometedora y sostenible para su control que consiste en un nucleopoliedrovirus múltiple de S. frugiperda (SfMNPV, género Alphabaculovirus, familia Baculoviridae) que causa epizootias en las poblaciones larvarias de este insecto. Experimentos de campo mostraron que la prevalencia de infección en amplios rangos de aplicación de 6x1012 OBs/ha resulta en aproximadamente el 40% de infección pero la capacidad del virus se encuentra limitada por la degradación ultravioleta a la que se encuentra sujeto (Martínez et al. 2002). 365 Materiales y Método Cría de insectos. Se estableció un pie de cría de S. frugiperda en los laboratorios de la Red de Manejo Biorracional de Plagas y Vectores del Instituto de Ecología A.C. La colonia se mantuvo a temperatura constante (25 ± 2ºC), y con un fotoperiodo de 16:8 h luz/obscuridad. Las larvas fueron criadas sobre una dieta semisintética adaptada de Caballero et al. (2001). Amplificación de inoculo viral de nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera frugiperda (SfMNPV). Un grupo de 100 larvas de tercer instar de la colonia se colocó individualmente en recipientes plásticos con tapa de 25 ml. A cada recipiente se le agregó una larva y un trozo de dieta artificial contaminado superficialmente con una suspensión de 1 x 108 OBs en un volumen de 10 µl de agua destilada estéril. Cuatro días después de la inoculación se cambió la dieta contaminada por dieta no tratada y se revisó la muerte de las larvas durante los 10 días post-inoculación. Las larvas muertas se colectaron y guardaron a 4°C. Se maceró la larva infectada y se agregó en un volúmen de 500 µl de polisorbato 80 (Tween 80) al 0.1% (vol./vol.). Se agitó en un vortex durante 30 s y después se pasó la suspensión por un filtro de malla plástica para eliminar los restos de tegumento presentes. La suspensión fue centrifugada a 5000 rpm durante 5 minutos y el sobrenadante se desechó. A la pastilla de poliedros se le añadió 500 µl de solución de Tween 80, repitiendo el proceso anterior. Posterior al segundo centrifugado, se lavaron los restos de Tween 80 con 1 ml de agua destilada y se realizó un tercer proceso de centrifugado a 5000 rpm. Se resuspendió la pastilla de poliedros con 100 µl de agua destilada y se guardó a 4 ºC. De una alícuota de la suspensión madre se realizaron tres diluciones de 1/100, 1/100, 1/1000. Se realizó un conteo de OBs presentes en la suspensión con la ayuda del microscopio óptico con contraste de fases a 400x y una cámara de conteo Neubauer en donde se colocaron 10 µl de la suspensión de OBs. Cada conteo se realizó por triplicado. Para calcular la concentración de poliedros en la suspensión se utilizó la siguiente formula: Concentración de poliedros = (no. poliedros en cámara × 5 × factor de dilución)/1x10e-4. Finalmente se prepararon tres suspensiones para cada una de las siguientes concentraciones de OBs/ml: 1x104, 1x105, 1x106, adicionalmente se prepararon 6 suspensiones de 1x107 OBs/ml, se guardaron a 8°C con tres testigos con 1 ml de agua destilada. Incorporación de mezclas de OBs y suelo artificial a dieta semisintética e inoculación per os. Muestras de suelo artificial. Se elaboró una mezcla de suelo artificial a base de 10% (peso/peso) de turba de esfagno, 20% caolinita y 70% arena (OECDE, 1984). Todos los elementos se cribaron en una malla de 2 mm; el esfagno y la arena fueron lavados, secados a temperatura ambiente y se revolvieron manualmente en un recipiente plástico durante 15 min. Una muestra de 25 g de la muestra total de suelo artificial se colocó en un sobre de papel y se pesó para obtener el peso húmedo, posteriormente se dejó secar a 103-105°C durante 24 horas y se pesó de nuevo. Se preparó dieta artificial semisintética y se colocó un volúmen de 50 ml en un recipiente plástico de 250 ml de capacidad. Cuando la dieta alcanzaba una temperatura inferior a 50 °C se incorporaba una muestra de 10 g de suelo artificial contaminado con 1 ml de suspensión de OBs de SfMNPV. La mezcla se revolvió vigorosamente hasta incorporar el suelo contaminado con OBs en la dieta. Un total de 540 larvas de segundo estadio de S. frugiperda se individualizaron y se les colocó un trocito de dieta artificial contaminada durante cuatro días de exposición. Después de este tiempo, se colocaba un trocito de dieta artificial no contaminada, se cambió la dieta cada dos días durante los 10 días posteriores a la exposición. Se registró la mortalidad diariamente. 366 Tinción de Giemsa en larvas muertas de S. frugiperda. Mediante tinción Giemsa se confirmó que las larvas muertas en el periodo de prueba de diez días, presentaran o no infección por SfMNPV. Para esto, una pequeña porción de la larva fue tomada con la ayuda de un palillo de madera y se realizó un frotis en un portaobjeto. El frotis se fijó con alcohol metílico de 3-4 min. Después se lavó suavemente con agua de grifo. Se agregaron gotas de solución Giemsa y se esperó 30 min. Finalmente el frotis se lavó con abundante agua directo del chorro del grifo para eliminar el exceso de colorante, se secó a temperatura ambiente y se observó al microscopio a 100X con una gota de aceite de inmersión. Resultados y Discusión Las larvas de segundo estadío aceptaron la dieta y se presentaron pocas muertes por causas no específicas en los testigos (9 individuos) durante el periodo de exposición de 4 días a la dieta con incorporación de suelo más 6 días con dieta artificial. Las demás larvas consumieron la dieta y lograron sobrevivir hasta puparse. Las concentraciones de 1x104, 1x105, 1x106 OBs/ml en suelo artificial no provocaron muertes por poliedrosis. El porcentaje de larvas infectadas de S. frugiperda en el bioensayo de incorporación de mezclas de OBs y suelo artificial a dieta semisintética e inoculación per os fue del 3% en suelo artificial contaminado con 1 ml de suspensión de 1x106 OBs/ml, y de 4% con 1x107 OBs/ml. Después de 4 días de exposición a dieta contaminada y 6 días de observación postratamiento. Esto sugiere que por esta técnica se necesitan concentraciones más elevadas para ampliar el margen de mortalidades. Mediante las tinciones G se confirmó que la muerte de algunas larvas fue por infección de SfMNPV. Figura 1. Larva muerta por infección característica de SfMNPV y tinción Giemsa para confirmar la presencia de OBs. El suelo representa el principal reservorio de muchos virus patógenos de insectos. Los mecanismos de transferencia de virus hacia las plantas han sido poco estudiados pero existe evidencia que algunos baculovirus son transferidos con partículas de suelo, donde se dan interacciones entre minerales en suelos arcillosos con alto contenido de óxidos férricos, atapulgita 367 y caolinita (Christian, 2006) y los microorganismos, humedad y tipo de suelo, pueden afectar la supervivencia de virus en el suelo (Peng et al., 1999) La técnica de incorporación a dieta de Richards y Christian (1999) adaptada por Murillo et al. (2007) demostró tener más sensibilidad que técnicas basadas en PCR o procesos complejos descritos por Ebling y Holmes (2002). La presencia de poliedros de SfMNPV en suelos de la región del Soconusco Chiapas y la presencia de diferencias polimórficas fue demostrada en trabajos de Jiménez (2003) demostrando que existen cepas silvestres del virus, donde el suelo es el principal reservorio dentro del agroecosistema, en el cual la concentración promedio se encuentra entre 7.0 x 105 y 3.0 x 106 OBs/10g de suelo. El hecho de utilizar un suelo estándar facilita los estudios de laboratorio y brinda una metodología sencilla pero de gran utilidad para el entendimiento de los procesos que modulan la interacción poliedro-suelo de gran importancia ecológica para el virus y las poblaciones del insecto huésped. Conclusiones Se observaron 3-4% de muertes por la presencia de SfMNPV en larvas de S. frugiperda de segundo estadio alimentadas per os con un suelo artificial contaminado con poliedros de SfMNPV. Las concentraciones de 1x104, 1x105, 1x106 OBs/ml en suelo artificial no provocaron muertes por lo que en los estudios futuros se utilizarán concentraciones mayores a 1x107 OBs/ml para generar mortalidades elevadas por esta técnica. Agradecimientos Al programa de becas de posgrado del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología y al programa de apoyos de movilidad del Posgrado del INECOL. Literatura Citada Caballero, P., López–Ferber, M. y Williams, T. (2001). Los baculovirus y sus aplicaciones como bioinsecticidas en el control biológico de plagas. Ed. M.V. Phytoma-España, 518pp. Christian, P., Richards, A., y Williams, T. (2006). Differential adsorption of occluded and nonoccluded insect-pathogenic virus to soil-forming minerals. Appl. Environ. Microbiol. 72: 4648-4652. Jiménez Fernández, J.A. (2003). Aislamiento y polimorfismo genético del nucleopoliedrovirus de Spodoptera frugiperda (SMITH) en 9 municipios de la región del Soconusco Chiapas, México. Tesis de licenciatura. Universidad de Ciencias y Artes de Chiapas. 82 pp. Martínez Castillo, A. (2003). Lethal and sublethal interaccions between optical brighteners and nucleopolyhedrovirus in Spodoptera frujiperda (J.E.Smith) (Lepidoptera: Noctunidae) Tesis doctoral. Departamento de Producción Agraria Universidad Pública de Navarrra. 111 pp. Martínez, A.M., D. Goulson, J.W. Chapman, P. Caballero, R. Cave, and Williams T. (2002). Is it feasible to use optical brightener technology with a baculovirus insecticide for resourcepoor maize farmers in Mesoamerica?. Biol. Contr.17:174-181. Murillo, R., Elvira, S., Muñoz, D., Williams, T., y Caballero, P. (2006). Genetic and phenotypic variability in Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus isolates from greenhouse soils in southern Spain. Biol. Control 38:157-165. 368 Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). 1984. Earthworm, acute toxicity test. Guidelines for testing of chemicals N°207. OCDE, París, 9 pp. Peng F., Fuxa J.R., Richter A.R. y Johnson, J. (1999). Effects of heat-sensitive agents. Soil type, moisture, and leaf surface on persistence of Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae) nucleopolyhedrovirus. Environ. Entomol. 28:330-338. Richards, A.R., Christian, P.D. (1999). A rapid bioassay screen for quantifying nucleopolyhedroviruses (Baculoviridae) in the environment. J. Virol. Meth. 82:63-75. Sparks, A.N. (1979). A review of the biology of the fall armyworm. Fla. Entomol. 62:82-87. 369 INGENIERÍA DE PELLETS CON NEMATODOS ENTOMOPATÓGENOS Carlos Inocencio Cortés-Martínez1, Pastor Teodoro Matadamas-Ortiz2 y Jaime Ruiz-Vega2. CIIDIR Unidad Oaxaca. Instituto Politécnico Nacional. Hornos 1003, Santa Cruz Xoxocotlán, Oaxaca, CP 71230, México. [email protected]. 1Estudiante del doctorado en ciencias en conservación y aprovechamiento de recursos naturales del Instituto Politécnico Nacional (IPN). 2Profesores e investigadores del posgrado en ciencias en conservación y aprovechamiento de recursos naturales del Instituto Politécnico Nacional y becarios de la COFAA del IPN RESUMEN. Las formulaciones granulares esféricas (pellets) con nematodos entomopatógenos (NEP) podrían usarse en el control de plagas del suelo por aplicación directa en la superficie. Sin embargo, se necesita diseñar los pellets para reducir la mortalidad de los NEP causada por exposición a factores abióticos, conservar sus capacidades parasitarias y desagregación. En este trabajo se da a conocer una revisión de investigaciones en ingeniería aplicada al estudio de formulaciones granulares. Los resultados muestran que hace falta conocimiento en: caracterización biomecánica de NEP, análisis de los procesos de transferencia de masa y calor en relación con sus procesos fisiológicos, e interacciones entre la cohesión, microestructura e higroscopicidad del material granular en relación con los factores abióticos, metodologías para la adquisición de datos y modelos matemáticos para el diseño de bioplaguicidas. Las investigaciones futuras requieren un abordaje interdisciplinario para el diseño de microestructuras capaces de funcionar como reservorios adecuados para NEP. Palabras clave: Ingeniería, control biológico, reservorios. Engineering of Pellets with Entomopathogenic Nematodes ABSTRACT. The granular spherical formulations (pellets) with entomopathogenic nematodes (EN) can be used in the biological control of agricultural insect-pests soil by direct application in the surface, but require pellets design to reduce the EN mortality caused by exposition to abiotic factors, preserving his parasitic capabilities and disintegration. In this work a revision of investigations in applied engineering to the granular formulations studies is presented. These results indicate that knowledge is missing in areas such as: characterization biomechanics of EN, analysis of mass and heat process in physiological process relation, interactions between cohesion, microstructural and hygroscopicity of the granular material relating to abiotic factors, methodologies for data acquisition and mathematical models for the design of formulations. We concluded that future investigations require an interdisciplinary approach for the microstructures design that work as adequate reservoirs for EN. Key words: Engineering, biological control, reservoirs. Introducción El 37% de la producción agrícola mundial se pierde debido a plagas y enfermedades, (Martínez, 2000) pese al uso de una amplia gama de productos químicos para su prevención y control. Además, aun cuando es frecuente, el control químico no es sustentable para la agricultura moderna, porque actúa agresivamente con el medio ambiente ocasionando graves daños en los ecosistemas. En el año 2004, el mercado mundial estimado para los químicos aplicados en la agricultura estaba distribuido de la siguiente manera: el 45.4% para los herbicidas, el 27.5% de insecticidas y acaricidas, el 21.7% fungicidas y el 5.4% en otros tipos (Van Lenteren, 2012). El control biológico es una alternativa que reduce estos efectos. A nivel mundial, este sistema de control se ha aplicado en 350 millones de hectáreas, lo que corresponden al 8% de tierra bajo cultivo, con rangos de costo-beneficio del orden de 1:20-500 y se prevé que para el año 2050 este sistema generará entre el 35% y el 40% de todos los métodos de protección de cultivos de importancia económica (van Lenteren, 2012). El uso de bacterias, hongos y nematodos entomopatógenos en la agricultura ha sido posible gracias a la disponibilidad de tecnología convencional de pulverizadores agrícolas y al desarrollo de tecnologías de reproducción y formulación masiva de este tipo de agentes de 370 control (Shapiro-Ilan et al., 2012). Aun cuando ya existen aplicaciones comerciales, todavía la brecha entre el uso de bioplaguicidas y plaguicidas químicos es amplia. Por ello, es necesario desarrollar bioplaguicidas con mejores tecnologías de formulación masiva y de aplicación en campo, que permitan alcanzar la misma o mayor eficacia que los plaguicidas químicos, siendo uno de los requisitos para la aceptación y comercialización de estos nuevos productos su estabilidad bajo condiciones de almacenamiento (Santos et al., 2012). Las formulaciones granulares (pellets), esponjas y cadáver han permitido el almacenamiento y transporte de NEP hasta los campos de cultivo donde se disuelven en agua para aplicaciones de control de plagas foliares. De esta manera, el pellet es una estructura que cumple funciones de almacenamiento y transporte para lo cual ha demostrado ser una alternativa viable y práctica (Grewal, 2000a). Sin embargo, para control de plagas superficiales es necesario mejorar la formulación granular para su aplicación directa, es decir: sin disolver, a fin de que los nematodos cuenten con una estructura de protección, hasta que por efecto de la humedad del suelo el pellet se desagregue y queden liberados los NEP, que al dejar de ser inmovilizados y rehidratados recuperarán sus capacidades parasitarias y atacarán a los organismos plaga, sumando de esta manera funciones sustantivas a dicha formulación, la cual la convierten en un reservorio de organismos. Las ventajas de este tipo de formulación en pellets es que puede ser transportada a temperatura ambiente de manera opuesta al envío de embarques de nematodos en hielo o esponjas, lo que reduciría sustancialmente los costos, la estructura tiene buena estabilidad de almacenamiento, el tiempo y las labores previas para la aplicación son bajas (Grewal, 2000a,b) Actualmente, en el Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional-Unidad Oaxaca, dependiente del Instituto Politécnico Nacional, se trabaja para el diseño de un proceso de pelletización mecánica de NEP a través de la experimentación con distintos materiales granulares, aditivos del medio acuoso, edad de los NEP, humedad relativa de almacenamiento, recubrimientos superficiales, entre otros, obteniendo baja supervivencia de los nematodos Steinernema glaseri encapsulados mecánicamente, a causa de la compleja dinámica biológica y microestructural (Ruiz-Vega y Bolaños, 2003; Girón, 2008; Mendoza, 2012). Por ello, el objetivo de este trabajo consistió en investigar los avances recientes de la ingeniería aplicada al mejoramiento de los pellets con NEP a fin de incorporarlos en el planteamiento de nuevos enfoques para futuros trabajos de investigación que tiendan a mejorar el tiempo de supervivencia de los NEP pelletizados mecánicamente. Materiales y Método Se realizó una búsqueda de investigaciones en las publicaciones del Journal of Citation Report (JCR). Seleccionando las publicaciones de los investigadores más destacados en el campo, las revistas con factores de impacto más altos a los cuales se tiene el acceso. Para su análisis los trabajos se clasificaron por componentes del pellet, quedando como materiales arcillosos y nematodos entomopatógenos. Usando los descriptores: engineering, pellets, biomechanics, nematode, mass transfer, model. Resultados y Discusión Factores que influyen en la supervivencia de los nematodos entomopatógenos. La extensión de la vida de anaquel de las formulaciones granulares está determinada por el logro en el incremento del tiempo de supervivencia del NEP, a través de la reducción del metabolismo del 371 organismo. El encapsulamiento en formulaciones granulares (pellets), esponjas y cadáver basan la conservación de los NE y el incremento de su tiempo de vida en almacenamiento, en reservar sus energías mediante la restricción de su movimiento (inmovilización física) o reduciendo el consumo de oxígeno por inducción de un estado parcial de anhidrobiosis (Grewal y Georgis, 1999). El éxito en la aplicación en campo depende de factores bióticos como: capacidad de búsqueda, virulencia, y factores abióticos críticos que incluyen evitación de radiación ultravioleta, humedad y temperatura adecuado del terreno, entre otros, y de su respuesta fisiológica a factores abióticos como: resistencia a la deshidratación, requerimientos de nutrientes, humedad del ambiente (Shapiro-Ilan et al., 2006; Shapiro-Ilan et al., 2012; GirónPablo et al., 2012). Además de que estos factores varían para cada especie. Estudios sobre nematodos entomopatógenos. Hazir et al. (2003) refieren que la supervivencia y capacidad infectiva de los nematodos de las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae está determinado por las características del suelo debido a que la composición del mismo, determina la retención de humedad, canales para el intercambio de oxígeno y de desplazamiento de los organismos, entre otras causas. Shapiro-Ilan et al., (2012) investigaron la respuesta direccional a campos eléctricos en siete especies de NE. Ellos generaron un voltaje de 36 V (3.0 miliamps) y los aplicaron en 4000 nematodos de cada especie por 30 minutos. Sus resultados muestran que Steinernema carpocapsae responde a campos eléctricos y su sensibilidad disminuye con la edad del IJ. Los autores destacan que la importancia de esta respuesta direccional en estrategias de forraje puede ser más importante si se aplica en etapas tempranas del ciclo biológico del nematodo para propiciar su búsqueda del hospedero. Sávoly et al., (2012) analizaron con microscopia electrónica de barrido la morfología de los nematodos Xiphinema vuittenezi y han hecho la caracterización química por Espectrometría por Fluorescencia de Rayos X (XRF). En general, la morfología ha sido bien estudiada (Grewal y Georgis, 1999; García Del Pino, 1996). El contenido de lípidos en infectivos juveniles (IJ) de nematodos Steinernema carpocapsae en formulaciones acuosa y gránulos dispersables en agua ha sido determinado por Grewal (2000a) por medio de calorimétrica enzimática. Niebur y Erdös (1991) estudiaron el aparato locomotriz del nematodo Caenorhabditis elegans en su movimiento ondulatorio (arrastre) en películas de agua. Por la manera en que los músculos corporales deforman la cutícula elástica del cuerpo del nematodo para ejercer fuerzas contractivas contra la presión interna para provocar su movimiento, Harris y Crofton (1957) f p N b E ö (1991) m p “ q hidrostátic ” . Niebur y Erdös (1991) mencionan cuatro fuerzas que actúan en la estructura del nematodo durante su locomoción ondulatoria: presión interna del líquido contenido en el pseudoceloma de los nematodos, fuerzas de la cutícula elástica, fuerzas musculares y fuerzas externas ejercidas por el ambiente. Por lo tanto, para restringir el movimiento de este organismo en reservorios microestructurados es necesario antes determinar las fuerzas mecánicas relacionadas al movimiento natural del nematodo en suelo con agua. Ello permitirá establecer la organización de la estructura del reservorio a escala microscópica. Estudios sobre materiales de encapsulamiento. Los materiales granulares poseen propiedades y características como tamaño y distribución de partículas, higroscopicidad, estructura, densidad, pH, entre otras (Antonides, 1998). Las propiedades insecticidas de la tierra 372 diatomea han sido evaluadas por (Fields et al., 2002) han hecho la caracterización física y química y determinado sus propiedades de adsorción. Wen-Tien et al., (2006) purificaron la tierra diatomea y determinaron su adsorción. Las diatomeas son microalgas catalogadas como materiales del tipo de partícula fina o partículas individuales. El tipo de microestructuras 3D que se forma con este material es pobremente organizado (Sumper and Kröger, 2004; Gordon et al. 2008). En cuanto a microestructuras similares, Hoffmann et al., (2007) realizaron un estudio experimental y desarrollo un modelo constitutivo de la caracterización del comportamiento hidromecánico de pellets de bentonita, material tipificado como suelo expansivo, descritos constitutivamente en el marco de la mecánica de suelos no saturados. Para ello se considera un modelo de tipo elastoplástico con dos superficies de fluencia. Prospectivas de estudio. Se han encontrado otros proyectos para el encapsulamiento de organismos. (Gross et al., 2007a) desarrollaron un modelo matemático cuantitativo que describe los cambios y la remodelación celular en el perfil de oxígeno disuelto cuando células proliferativas son encapsuladas en cuentas del hidrogel. Este modelo también se ha usado para simular el sistema de células encapsuladas en una emulsión de perfluorocarbono (Goh et al., 2010). Sin embargo, hasta el momento faltan proyectos que hayan estudiado las interrelaciones en cuerpos granulares microestructurados con organismos vivos. Mendyk et al., (2010) analizaron las propiedades del pellet para encapsular sustancias medicas con fines farmacéuticos, utilizando redes neuronales artificiales. En este mismo campo se ha investigado la variación de la transferencia de masa en pellets durante el proceso de esferización (Koester y Thommes, 2012). Recientemente, la investigación en esta área está avanzando a través de las fronteras en la ecología, por medio de la integración del conocimiento de otras disciplinas como la biología, ingeniería, entre otras, para mejorar nuestra habilidad de explotar y manejar a los NEP como un agente de control biológico. Campos–Herrera et al., (2012) opinan que investigaciones como éstas se aproximan a proveer una excelente oportunidad para expandir nuestra comprensión de la dinámica de interacciones de redes de alimento del suelo y contribuyen a adelantar la frontera de propiedades emergentes de sistemas complejos. Se encontraron algunos trabajos desarrollados con este enfoque como el de Nielsen y Lewis, (2012) quienes abordaron el estudio de las interrelaciones que los componentes del suelo tienen con el comportamiento del nematodo y hongos. En este mismo sentido, sería útil para el diseño de pellets determinar los requerimientos de humedad y temperatura de los NEP para adaptar su comportamiento y llevarlos a un estado de quiescencia. Determinar los mecanismos de difusividad para la transferencia de humedad y calor que suceden en las formulaciones granulares. Evaluar las condiciones adecuadas del encapsulamiento para conservar las capacidades parasitarias de los NEP. Conclusiones No se encontraron estudios sobre la comprensión de los procesos físicos que suceden en las microestructuras bifásicas (fase liquida y fase acuosa) de los pellets y su interacción con los procesos fisiológicos involucrados en la función de los nematodos entomopatógenos. Es necesario abordar el estudio del pellet con NEP desde un enfoque sistémico con disciplinas de la ingeniería para explicar teóricamente los procesos físicos, químicos y mecánicos que suceden en su interior bajo un abordaje interdisciplinario, desarrollar nuevos métodos de caracterización o aplicar los existentes en otras disciplinas y generar herramientas matemáticas para modelar estas 373 interacciones. Esto contribuiría al mejoramiento de la estabilidad, propiedades funcionales y vida en estantería y seria aplicado a otras especies susceptibles de ser peletizadas. Literatura Citada Antonides, L.E. 1998. Diatomite: US Geological Survey Mineral Commodity Summaries, 56-57. Campos–Herrera, R., Barbercheck, M., Hoy, C. W. y S. P. Stock. 2012. Entomopathogenic Nematodes as a Model System for Advancing the Frontiers of Ecology. Journal of Nematology, 44: 162–176. Fields, P, Allen, S., Korunic, Z., McLaughlin A. y T. Stathers. 2002. Standardized testing for diatomaceous earth. Proceedings of the Eighth International Working Conference of Stored-Product Protection, York, U.K. García Del Pino, F. 1996. Los nematodos entomopatógenos, agentes de control de plagas. In: J. Jacas, P. Caballero y J. Ávila (Eds.), Morfología del nematodo: control biológico de plagas y enfermedades, (87-114). Castelló de la Plana: Publicaciones de la Universitat Jaume. Girón-Pablo, S., Ruiz-Vega, J., Pérez-Pacheco, R., Sánchez-García, J. A. y T. Aquino-Bolaños. 2012. Isolation of entomopathogenic nematodes and control of Phyllophaga vetula Horn in Oaxaca, Mexico. African Journal of Biotechnology, 11: 16525-16531. Goh, F., Gross, J. D., Simpson, N. E. y A. Sambanis. 2010. Limited beneficial effects of perfluorocarbon emulsions on encapsulated cells in culture: Experimental and modeling studies. Journal of Biotechnology, 150: 232–239. Gordon, R., Losic, D., Tiffany, M. A., Nagy, S. S. y F. Sterrenburg. 2008. The Glass Menagerie: diatoms for novel applications in nanotechnology. Trends in Biotechnology, 27: 116-127. Grewal, P. S. 2000a. Enhanced ambient storage stability of an entomopathogenic nematode through anhydrobiosis. Pest Management Science, 56: 401-406. Grewal, P. S. 2000b. Anhydrobiotic potential and long-term storage of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae). International Journal for Parasitology, 30: 995-1000. Grewal, P. S. y R. Georgis. 1999. Entomopathogenic nematodes. In: F. R. Hall y J. Menn (Eds.) Methods in biotechnology. Vol. 5: Biopesticides: Use and delivery. (271-299). Totowa, N.J., USA: Humana Press. Gross, J.D., Constantinidis, I. y A. Sambanis. 2007a. Modeling of encapsulated cell systems. Journal of Theoretical Biology, 244: 500–510. Hazir, S., Kaya, H. K., Stock, S. P. y N. Keskin. 2003. Entomopathogenic nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae) for biological control of soil pests. Turkish Journal of Biology, 27: 181-202. Hoffmann, C., Alonso, E.E. y E. Romero. 2007. Hydro-mechanical behaviour of bentonite pellet mixtures. Physics and Chemistry of the Earth, 32: 832–849. Koester, M. y M. Thommes. 2012. Quantification of Mass Transfer During Spheronisation. AAPS Pharmaceutical Science Technology, 13: 493-497. Mendoza-Pérez, M. 2012. Efecto de la dureza del pellet en la mortalidad del nematodo entomopatógeno Steinernema glaseri encapsulado mecánicamente. Tesis de Maestría. CIIDIR-OAXACA, IPN. México. 374 Mendyka, A., Kleinebudde, P., Thommes, M., Yoo, A., Szlek, J. y R. Jachowicz. 2010. Analysis of pellet properties with use of artificial neural networks. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 41: 421–429. Nielsen, A. L. y E. E. Lewis. 2012. Designing the ideal habitat for entomopathogenic use in nursery production. Pest Management Science, 68: 1053–1061. Ruiz-Vega, J. y A. T. Bolaños. 2003. Control biológico de gallina ciega Phyllophaga vetula Horn (Melothidae) bajo condiciones semicontroladas y de campo. In: A. Aragón, M.A. Morón y A. Marín (Eds.), Estudios sobre Coleópteros del suelo en América (pp. 299-331). México: Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Santos, A., García, A., Cotes, A. M. y L. Villamizar. 2012. Efecto de la formulación sobre la vida útil de bioplaguicidas a base de dos aislamientos colombianos de Trichoderma koningiosis Th003 y Trichoderma asrellum Th034. Revista Iberoamericana de Micología, 29: 150-156. Sávoly, Z., Nagy, P., Havancsák, K. y G. Záray. 2012. Microanalytical investigation of nematodes. Microchemical Journal, 105: 83-87. Shapiro-Ilan, D. I., Lewis, E. E., Campbell, J. F. y D. B. Kim-Shapiro. 2012. Directional movement of entomopathogenic nematodes in response to electrical field: effects of species, magnitude of voltage, and infective juvenile age. Journal of Invertebrate Pathology, 109: 34–40. Shapiro-Ilan, D., Gouge, D. H., Piggott, S. J. y P. Fife. 2006. Application technology and environmental considerations for use of entomopathogenic nematodes in biological control. Biological Control, 38: 124–133. Sumper, M. y N. Kröger. 2004. Silica formation in diatoms: the function of long-chain polyamines and silaffins. Journal of Materials Chemistry, 14: 2059–2065. Van Lenteren, J.C. (ed). 2012 IOBC Internet Book of Biological Control, version 6. Wagenningen, the Netherlands. Disponible en: http://www.iobcglobal.org/downlaod/IOBC%20InternetBookBiCoVersion6Spring2012.pdf Wen-Tien, T., Chi-Wei, L. y H. Kuo-Jong. 2006. Characterization and adsorption properties of diatomaceous earth modified by hydrofluoric acid etching, Journal of Colloid and Interface Science, 297: 749–754. 375 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD TÓXICA DE CEPAS NUEVAS DE Bacillus thuringiensis AISLADAS DE YUCATÁN CONTRA Trichoplusia ni (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) José Fernando Ornelas-Pérez1, María Guadalupe Maldonado-Blanco1, Orquídea Pérez-González1, Myriam ElíasSantos1, Mónica Guadalupe Lozano Contreras2 y Carlos Francisco Sandoval-Coronado1. Instituto de Biotecnología, Av. Pedro de Alba y Manuel L. Barragán S/N, Facultad de Ciencias Biológicas, UANL, Ciudad Universitaria, C.P. 66450, San Nicolás de los Garza Nuevo León. 2INIFAP Campo Experimental Mocochá, Carretera Mérida-Motul, Km 25, Mérida Yucatán. [email protected]. RESUMEN. Es imperativo el aislamiento y desarrollo de cepas nuevas nativas de Bacillus thuringiensis con actividad tóxica superior contra Trichoplusia ni, plaga con alto impacto en el cultivo de la col. Se evaluó la toxicidad de 24 aislamientos provenientes de suelo de Yucatán. Estas cepas fueron cultivadas en medio melaza por 3 días a 30°C y 200 rpm. Después de la extracción del complejo espora-cristal se realizaron bioensayos usando dieta artificial contra larvas neonatas de Trichoplusia ni y se seleccionaron 6 cepas nativas en bioensayos preliminares. La cepa YUC-5 causó mortalidad del 100% a concentración de 5 µg/cm2, posteriormente mostró CL50 de 108.1319 ng/cm2, así mismo la cepa YUC-7 causó mortalidad del 100% a la misma concentración y CL50 de 136.668 ng/cm2, mientras que la cepa YUC-6 causó mortalidad del 5.5333 % a concentración de 50 µg/cm2, se utilizó como cepa de referencia a la cepa GM-7 con CL50 de 278.99 ng/cm2. Palabras clave: Bacillus thuringiensis, aislamiento, toxicidad, Trichoplusia ni. Evaluation of toxic activity of Bacillus thuringiensis new strains isolated from Yucatan vs Trichoplusia ni (Lepidoptera: Noctuidae) ABSTRACT. The isolation and development of new strains of Bacillus thuringiensis with high toxic activity against Trichoplusia ni, is necessary. Toxicity of 24 soil isolates from Yucatán was assessed and then we selected 6 new native strains of Bacillus thuringiensis. The strains were cultured in molasses by 3 days at 30° C and 200 rpm. After the recovery of the sporecrystal complex this was tested in artificial diet bioassays against neonate larvae of Trichoplusia ni. YUC-5 strain caused 100% mortality to 5 µg/cm2 concentration, then showed LC50 of 108.1319 ng/cm2, likewise YUC-7 strain caused 100% mortality at the same concentration with LC50 of 136.668 ng/cm2, whereas YUC-6 strain caused 5.53 % mortality at 50 µg/cm2. GM-7 strain was used as reference strain with LC50 of 278.99 ng/cm2. Key words: Bacillus thuringiensis, isolation, toxicity, Trichoplusia ni. Introducción Actualmente se busca sustituir el uso de insecticidas químicos por alternativas de control biológico que eviten los riesgos ecológicos y de salud causados por los químicos. Los insecticidas derivados de Bacillus thuringiensis constituyen el ejemplo más importante de bioinsecticidas que se producen de manera comercial y representan la mayor parte del mercado mundial. En todo el mundo constantemente se siguen aislando nuevas cepas de Bacillus thuringiensis, que muestran poseer nuevas proteínas Cry. Aunque se tienen descritos muchos tipos de proteínas Cry, específicamente para insectos lepidópteros, también se sabe que estos insectos han desarrollado resistencia a las toxinas de Bacillus thuringiensis, de ahí surge la necesidad de buscar cepas nuevas de Bacillus thuringiensis que tengan genes de proteínas que causen mayor actividad tóxica contra insectos lepidópteros. En el presente trabajo el principal objetivo fue aislar, producir el complejo espora-cristal y evaluar la toxicidad de nuevas cepas nativas provenientes de suelo de Yucatán contra larvas del primer estadío larvario de Trichoplusia ni utilizando dieta artificial y comparar la actividad 376 tóxica contra una cepa de referencia, GM-7, que se conoce como altamente tóxica contra el insecto de referencia. Material y Método Las muestras de suelo fueron obtenidas de diversas localidades del Estado de Yucatán. Para el aislamiento de las cepas nuevas nativas se tomó 1 gramo de cada una de las muestras colectadas con las cuales se realizaron suspensiones en agua estéril y posteriormente se calentaron a una temperatura de 80° C, por 10 minutos, posteriormente se hicieron diluciones decimales y se sembraron alícuotas en placas de Agar Nutritivo (Merck) (Cuadro 1). Se incubaron a temperatura de 30° C por 48 horas, al cabo de las cuales se observaron las colonias resultantes y se realizaron frotis de cada una de ellas utilizando tinción con cristal violeta al 2%, para la búsqueda de bacilos esporulados y formadores de cristal (Saleh et al., 1970). Cuadro 1. Composición del medio de cultivo para la producción de Bacillus thuringiensis. Medio de Producción Melaza Ingredientes g/L Fuente de Carbono Melaza 10 Fuente de Nitrógeno LRM 10 Harina de Soya 10 Sales CaCO3 1.0 MgSO4 0.3 ZnSO4 0.02 FeSO4 0.02 MnSO4 0.02 pH 7.0 Una vez aisladas las cepas de las distintas muestras en cultivo puro, se prepararon viales para posterior conservación en papel filtro. Para la fase de producción del complejo esporacristal se activaron las nuevas cepas de Bacillus thuringiensis en tubos con Agar Nutritivo inclinado a pH 7.0 incubándolas a 30°C por 24 hrs, posteriormente de estos tubos, se tomaron varias asadas para inocular en matraces Erlenmeyer de 500 ml, conteniendo 100 ml de medio melaza y harina de soya (Cuadro 1), por triplicado para cada cepa, los cuales se incubaron en agitación a 200 rpm a 30° C por 72 hrs o hasta obtener un 80% de esporulación. Para la recuperación del complejo espora-cristal, se vaciaron los cultivos en vasos de precipitado, los cuales ajustaron a pH 7.0, posteriormente se sometieron a centrifugación a 10,000 r.p.m. por 30 minutos a 5° C. El precipitado se resuspendió en lactosa al 5% en una proporción 1:1.71 V/V, manteniéndose en agitación por 30 minutos, transcurrido este tiempo se agregó lentamente y con agitación, la acetona en proporción 1:3.34 V/V por 30 minutos más, después se dejó reposar por 10 minutos. Toda la mezcla anterior del complejo espora cristal fue filtrada con vacío en un embudo Buchner utilizando papel Whatman # 1, para la obtención del precipitado (Dulmage 1970). Posteriormente se llevó a cabo la evaluación de los extractos insecticidas mediante bioensayos contra larvas de Trichoplusia ni de primer estadío utilizando dieta artificial de Shorey 377 (Burgerjon, 1977). En los bioensayos preliminares se utilizaron concentraciones en µg/cm2: 50, 5 y 2.5. Estas concentraciones del complejo espora-cristal fueron vertidas sobre la superficie de placas de microtítulo conteniendo 1 ml de la dieta Shorey (24/concentración), las cuales se infestaron posteriormente con una larva de primer estadío, incluyendo un control no tratado (solo con agua destilada). Se colocaron tres repeticiones para cada concentración y para el control. Las placas tratadas y control se mantuvieron en condiciones de temperatura de 30°C, y 50-80% de humedad relativa durante tres días. Los resultados de mortalidad se registraron al tercer día postaplicación del bioinsecticida y se sometieron a Análisis de Varianza, seguido de diferenciación de medias, mediante el método de Diferencia Mínima Significativa al nivel del 0.05 (OlivaresSaénz, 1994). Posteriormente las cepas con mayor toxicidad se evaluaron para la determinación de la Concentración Letal Media, donde se utilizaron 6 concentraciones en ng/cm2 500, 400, 350, 300, 250 y 200, usando tres repeticiones para cada concentración y para el control. Las placas tratadas y control se mantuvieron a las mismas condiciones mencionadas anteriormente. Los resultados de mortalidad obtenidos al tercer día post-aplicación fueron sometidos al análisis estadístico Probit computarizado (United States Applied and Environmental Health 1989). Resultados y Discusión Se obtuvieron 24 aislamientos de Bacillus thuringiensis provenientes de suelos de localidades de Yucatán. Del total de aislamientos se seleccionaron 6 cepas nuevas de Bacillus thuringiensis de las cuales cuatro de ellas resultaron con alta actividad tóxica contra las larvas de Trichoplusia ni. En la figura 1 se muestran los porcentajes de mortalidad de larvas de Trichoplusia ni causado por las 24 aislamientos de Bacillus thuringiensis a las 72 horas postaplicación. 120 M O R T A L I D A D 100 AB A A A A A A A B CD 80 AB A BCD CD D AB A A ABC BCD BCD ABC 60 40 E 20 0 F CONT… YUC-2 YUC-3 YUC-4 YUC-5 YUC-6 YUC-7 YUC-8 YUC-9 YUC-10 YUC-11 YUC-12 YUC-13 YUC-14 YUC-15 YUC-16 YUC-17 YUC-18 YUC-19 YUC-20 YUC-21 YUC-22 YUC-23 YUC-24 YUC-25 % Figura 1. Mortalidad de larvas de Trichoplusia ni mostradas por cepas nuevas nativas de Bacillus thuringiensis y control (ANOVA, DMS, p< 0.05). F=128.4041, gl=23,48, p<0.0001 378 La comparación de medias de mortalidad mostró que las cepas YUC-4, YUC-5, YUC-7, YUC-8, YUC-9, YUC-10, YUC-11, YUC-14, YUC-21 y YUC-23 presentaron la mayor toxicidad significativamente contra las larvas de Trichoplusia ni, con mortalidad del 100% a concentración de 5 µg/cm2. Las cepas YUC-2, YUC-3, YUC-12, YUC-13, YUC-15, YUC-17, YUC-18, YUC-19, YUC-20, YUC-22, YUC-24 y YUC-25 mostraron mortalidad mayor del 84%, mientras que las cepas con menor toxicidad fueron YUC-6 y YUC-16, con porcentaje del 0 % y 26%, respectivamente (F=128.4041, gl=23,48, p<0.0001). En el cuadro 2 se presentan los resultados de la CL50 de los extractos insecticidas de las cepas YUC-3, YUC-5, YUC-7, YUC-9, YUC-11 y la comparación con la cepa de referencia, GM-7. Cuadro 2. Comparación de CL50, en ng/cm2, de los extractos insecticidas de las cepas nuevas de Bacillus thuringiensis de suelos de Yucatán, probados en bioensayos contra larvas neonatas de Trichoplusia ni usando dieta artificial. ANOVA, DMS (p≤ 0.05). Letras diferentes en las medias indican diferencia significativa entre las cepas. Repetición YUC-3 YUC-5 YUC-7 YUC-9 YUC-11 1 2 3 Media Desv. estándar 112.6115 151.5829 146.4837 136.8927a 21.18 85.8008 125.1648 113.4301 108.1319a 20.21 126.3547 119.0976 164.5517 136.668a 24.42 204.4070 93.7247 188.8351 162.322ab 59.915 210.6546 222.8894 226.7366 220.093bc 8.3976 GM-7 Cepa Referencia 322.9700 331.3500 182.6500 278.99c 83.538 La comparación de medias mostró que las cepas nuevas YUC-3, YUC-5 y YUC-7 presentaron significativamente mayor mortalidad contra T. ni y también mayor mortalidad que la cepa de referencia GM-7. La cepa YUC-9 presentó mortalidad parcialmente semejante a las cepas anteriormente mencionadas, mientras que la cepa YUC-11 fue la menos tóxica de las 5 cepas nativas evaluadas. La cepa de referencia GM-7 presentó menor toxicidad que las 5 cepas nuevas seleccionadas. Conclusiones Se aislaron 24 cepas nuevas nativas de Bacillus thuringiensis a partir de muestras de suelo del Estado de Yucatán. La mayoría de las cepas evaluadas mostraron alta actividad tóxica en concentraciones de 5 µg/cm2. La cepa YUC-5 fue la presentó la CL50 menor con un promedio de 108.1319 ng/cm2 contra Trichoplusia ni, seguida de la cepa YUC-7 con media de 136.668 ng/cm2, mientras que la cepa YUC-3 presentó similar toxicidad a las anteriores con 136.8927 ng/cm2, por lo que las tres cepas, YUC-5, YUC-7 y YUC-9 resultaron con actividad tóxica superior que la cepa de referencia (GM-7). Literatura Citada Bravo, A.; M. Soberón: I. Gómez; C. Muñoz; L. Pardo; L. Galán; H. Luna; A. Alcázar; B. Pereyra; J. A. Carrillo; R. García; L. Serrano; M. Patiño; E. Galindo; M. C. del Rincón; J. E. Ibarra, 2006. Los microorganismos en el control biológico de insectos y fitopatógenos. Rev. Latinoam. Microbiol. 48(2):113-120. 379 Dulmage, H. T. Correa, J. A. and Martinez A. J. 1970. Coprecipitation with lactose as a means of covering the spore-crystal complex of Bacillus thuringiensis. J. Invertebr Pathol. 15: 15-20. Buregerjon, A. and H. T., Dulmage. 1977. Industrial and international standarization of microbial pesticides I. Bacillus thuringiensis. Entomophaga. 22: 121-129. Saleh, S. M. Harris, R. F. and Alien, O.N. 1970. Recovery of Bacillus thuringiensis var. thuringiensis from field soils. J. Invertebr. Pathol. 15:55-59. Olivares-Sáenz, E. 1994. Paquetes de diseños experimentales FAUANL (Programa computarizado) Version 2.5 Facultad de Agronomía Universidad Autónoma de Nuevo Léon. Marín, Nuevo León Mexico. United States Applied and Environmental Health. Pest Management Program 1989. Pest Resistance Data System. Probit Analysis and Probit Plot. Baltimore, Maryland USA. 380 EVALUACIÓN DE AISLADOS MEXICANOS DE Hirsutella citriformis SPEARE CONTRA Diaphorina citri KUWAYAMA (HEMIPTERA: LIIVIDAE) EN LABORATORIO Orquídea Pérez-González1, María Guadalupe Maldonado-Blanco1, Reyna Ivonne Torres-Acosta2, Raúl RodríguezGuerra2, Myriam Elías-Santos1, J. Isabel López-Arroyo2. 1Instituto de Biotecnología, Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Autónoma de Nuevo León. 66450 San Nicolás de los Garza, N.L., México. 2INIFAP, Campo Experimental General Terán. 67400 Gral. Terán, N.L., México. [email protected]. RESUMEN. Se realizaron cuatro bioensayos para evaluar ocho aislados de Hirsutella citriformis contra Diaphorina citri. En el primero la mortalidad fue del 98 y 70% para los aislados de Tabasco y San Luis Potosí, respectivamente; el registro en el tratamiento testigo fue de 12%. En el segundo bioensayo, la mortalidad mayor fue de 61.3 y la menor de 24% para los aislados de San Luis Potosí y Quintana Roo, respectivamente; el testigo mostró 18.4%. En el tercer bioensayo, la mortalidad fue de 87.4 y 50.8% para las cepas de Colima y Campeche, respectivamente, mientras que en el testigo fue de 20.7% después de 28 días. En el cuarto bioensayo el mayor porcentaje de mortalidad fue de 91.4 y el menor de 86.4% para las cepas de Tabasco1 y Tabasco2, respectivamente; en el testigo el valor fue de 18.5% después de 24 días. Los resultados muestran el potencial para el uso de H. citriformis para el control de D. citri. Palabras clave. Bioensayo, Diaphorina citri, Hirsutella citriformis Evaluation of Hirsutella citriformis speare Mexican isolates against Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liividae) in laboratory ABSTRACT. Bioassays were performed to evaluate eight H. citriformis strains against D. citri. For the first bioassay, the mortality was 98 and 70% for the Tabasco and San Luis Potosí fungal isolates, respectively, after 27 days; whereas in the control the mortality was 12%. For the second bioassay, the highest mortality was 61.3% and the lowest was 24% for San Luis Potosí and Quintana Roo strains respectively; for the control the mortality was 18.4% after 19 days. In the third bioassay the mortality was between 87.4 % and 50.8% for Colima and Campeche strains respectively; whereas for the control was 20.7 after 28 days. For the fourth bioassay the highest mortality rate was 91.4% and the lowest was 86.4% for Tabasco1 and Tabasco2 respectively and for the control was 18.5% after 24 days. The results have implications for the use of H. citriformis for control of D. citri in Mexico. Key words. Bioassay, Diaphorina citri, Hirsutella citriformis. Introducción Diaphorina citri Kuwayama es una plaga cuarentenaria de los cítricos (OEPP-EPPO, 1988) que causa la muerte de los brotes cuando existe alta población de ninfas ya que succiona la savia de tallos, pecíolos y hojas en formación; además es el vector de la bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus, el agente asociado con la enfermedad del Huanglongbing (HLB) o greening (Garnier et al., 2000). En México, el vector del HLB se encuentra presente desde el año 2002 y se extendió rápidamente a todas las áreas citrícolas (Miranda-Salcedo y López-Arroyo, 2009). Se desconoce de tratamientos curativos para los árboles infectados con HLB, los que en poco tiempo son improductivos y finalmente mueren en un período de 3-5 años (Meyer et al., 2007). En México, para el control del vector se han desarrollado y evaluado diversas estrategias, una de ellas consiste en identificar hongos entomopatógenos de D. citri que pudieran ser utilizados en el control de la plaga. Algunas especies de estos se han indicado por infectar a D. citri, principalmente Hirsutella citriformis Speare (Rivero-Aragon y Grillo Ravelo, 2000; Subandiyah et al., 2000; Etienne et al., 2000; Meyer et al., 2007; Hall et al., 2012), Isaria fumosorosea (=Paecilomyces fumosoroseus; Subandiyah et al., 2000) y Beauveria bassiana (Padulla y Alves, 2009). El monitoreo realizado en diversas áreas citrícolas de México, para la 381 búsqueda de insectos micosados de D. citri, ha permitido identificar a Beauveria bassiana e Hirsutella citriformis (Reyes-Rosas et al., 2009; Casique-Valdes et al., 2010) así como Metarhizium anisopliae (Lezama-Gutiérrez et al., 2011). De estos hongos, a H. citriformis se le ha encontrado ocasionando epizootias naturales (González et al., 2008; Reyes-Rosas et al., 2009); por el posible valor que pudiese representar este patógeno para el control de D. citri, durante los últimos cuatro años se han efectuado colectas de H. citriformis en diferentes regiones citrícolas del país, las cuales previamente se han descrito morfológicamente (Pérez-González et al., 2012, 2013); en el presente estudio se han evaluado en bioensayos de laboratorio ocho de los aislamientos del hongo para determinar su viabilidad para el uso en el control biológico de D. citri en México. Materiales y Método Se utilizaron ocho cepas fúngicas aisladas de los estados de Tabasco, San Luis Potosí, Colima, Quintana Roo, Chiapas, Yucatán, Veracruz y Campeche, las cuales fueron caracterizadas morfológicamente en un estudio anterior (Pérez-González et al. 2012, 2013). El trabajo experimental se realizó en las instalaciones del INIFAP en el Campo Experimental General Terán, Nuevo León. Para la preparación del inóculo fúngico de los bioensayos se sembraron cinco pequeños trozos de cultivo de cada cepa en placas con agar papa dextrosa (PDA) y se incubaron a 25± 2°C durante 5 semanas, hasta que se comprobó la formación de conidios en todas ellas. Estas cajas se usaron para la inoculación por contacto directo de los insectos. En los bioensayos tres y cuatro se utilizaron inóculos de cepas de cultivos monospóricos con las cuales ya se contaba. Esta variación que se introdujo fue el uso de aislados monospóricos (cepas de Tabasco, San Luis Potosí y Yucatán) obtenidos de insectos micosados de los bioensayos 1 y 2 para evaluar si podría existir un incremento en la patogenicidad de las cepas después de haber estado en contacto con los insectos. Para los bioensayos se utilizaron recipientes plásticos de 150 ml, los cuales fueron desinfectados con hipoclorito de sodio, después se enjuagaron perfectamente con agua destilada estéril para eliminar los restos del cloro, posteriormente se colocó una esponja estéril saturada con agua destilada estéril y se adicionó una hoja de brote tierno de naranja Valencia. Los adultos utilizados en los bioensayos se anestesiaron colocando en el frasco un trozo de algodón impregnado con 80 µl de cloroformo durante 40 segundos. Los insectos se transfirieron posteriormente a los cultivos esporulados de las cajas con PDA, donde permanecieron por 1 minuto; se colocaron después en los recipientes plásticos. En el primer bioensayo se realizaron 8 repeticiones de 15 adultos c/u, en el segundo se utilizaron 7 repeticiones y en los bioensayos 3 y 4 solamente 6 repeticiones. Se mantuvieron en cámara bioclimática a 25± 2°C, HR de 76± 4% y 16:8 horas luz: oscuridad. Los testigos absolutos de cada uno de los bioensayos fueron tratados igual sin inóculo. Las evaluaciones de supervivencia se realizaron cada tres días, tiempo al cual se cambiaron las hojas de cítricos y el tiempo total de evaluación fue de 19-28 días. Antes de la aplicación de los tratamientos se realizaron observaciones para descartar los insectos que tuvieran algún síntoma de enfermedad u otra anomalía para eliminarlos del estudio, de tal forma que todos los especímenes lucieran completamente sanos. Resultados y Discusión En los resultados del primer bioensayo se observó que la mortalidad en los insectos inició a los 6 días con porcentaje de 7.5 y 3.1% para la cepa de Tabasco y San Luis Potosí, 382 Mortalidad Promedio (%) respectivamente, mientras que en el testigo fue de 1.8%. El último registro de supervivencia se realizó 27 días después del inicio del experimento, donde la tasa media de mortalidad fue de 98 y 70% para los aislados de H. citriformis de Tabasco y San Luis Potosí, respectivamente, sin diferencias significativas entre éstos (F=23.7; gl=2, 21; P=0.000) comparadas de acuerdo al método de Diferencia Mínima Significativa al nivel 0.05, mientras que en el testigo la mortalidad registrada fue de 12% (Fig. 1). En el segundo bioensayo la mortalidad inició al igual que en el anterior a los 6 días después de haber sido inoculados, con porcentajes iniciales de 5.5 y 1.1% para las cepas de Yucatán y Colima, respectivamente; en este bioensayo, el último registro de supervivencia se realizó a los 19 días después de iniciado el experimento, donde la cepa de Xolol, San Luis Potosí, causó el mayor porcentaje promedio de mortalidad, 61.3%, aunque sin diferencias significativas con respecto a la cepa de Yucatán, (F=3.2; gl = 6, 42; p=0.011) que causó 51.3% en el segundo grupo, con diferencia significativa parcial con respecto a las anteriores se ubicaron la cepa de Colima, con 36.5% y Campeche con 42.3%, mientras que en el tercer grupo se encontró a Chiapas con 30.3%, en el último lugar quedó Quintana Roo, con 24%, que no fue completamente diferente del testigo, con 18.4% (Fig. 2). En el tercer bioensayo la mortalidad inició también en el día 6 después de la inoculación, con porcentajes iniciales de 7.0 y 2.8% para las cepas de Colima y Yucatán1, respectivamente, mientras que el último registro de supervivencia se realizó a los 28 días de iniciado el experimento, en el cual la cepa de Colima presentó la mayor tasa promedio de mortalidad con 87.4% aunque sin diferencia significativa con respecto de las cepas de Chiapas (85.7%), Yucatán2 (83.5%) y Yucatán1 (82.5%) (F=3.1; gl=9, 40; p=0.007), en el segundo grupo con diferencia parcial con respecto a las anteriores, se ubicaron las cepas de Veracruz con 79.7%, Xolol1 con 73.8, Xolol2 con 69.9% y Quintana Roo con 64.9 %, mientras que la cepa de Campeche presentó solo 50.8 % de mortalidad, en tanto que el testigo presentó 20.73% (Fig. 3). En el cuarto bioensayo al igual que en todos los bioensayos anteriores, la mortalidad inició a los 6 días después de la inoculación, con porcentajes iniciales de 9.53 y 3.32% para la cepa de Tabasco2 y Colima respectivamente. El último registro de sobrevivencia fue a los 24 días de iniciado el experimento, las mortalidades presentadas por las diferentes cepas fueron similares, entre 86.4 a 89.3% sin diferencias significativas entre ellas (F=17.393; gl=4, 25; P=0.000). El promedio de mortalidad para el testigo fue de 18.5 % (Fig. 4). En todos los bioensayos la aparición de sinemas en los insectos muertos por los hongos probados inició 10 días después de la inoculación. A 100 98.3 80 A 70.0 60 40 20 0 B 12.0 Control Tabasco San Luis Potosí Cepas Evaluadas Figura 1. Porcentaje de mortalidad de adultos de Diaphorina citri causada por dos cepas de Hirsutella citriformis en pruebas de laboratorio. Letras diferentes indican que existe diferencia significativa al nivel 0.05 383 MORTALIDAD PROMEDIO % 100 80 61.34 60 A A ABC BC 43.15 36.46 C 40 AB A AB A 51.31 30.31 24.01 18.38 20 0 Control Yucatán San Luis Colima Q. Roo Chiapas Campeche Figura 2. Porcentaje de mortalidad promedio causado por 6 cepas de Hirsutella citriformis contra adultos de Diaphorina citri. Letras diferentes en cada barra indican que existe diferencia significativa al nivel del 0.05 Mortalidad promedio % 100 AB 80 A 87.43 79.73 A AB A 82.48 83.55 AB 73.78 85.76 69.91 64.88 60 A AB B 50.78 40 C 20.73 20 0 Control Veracruz Colima Quintana Roo Yucatán 1 Yucatán 2 S. L. P 1 S. L. P. 2 Chiapas Campeche MORTALIDAD PROMEDIO % Figura 3. Porcentaje de mortalidad promedio causado por 9 cepas de Hirsutella citriformis contra adultos de Diaphorina citri. Letras diferentes en cada barra indican que existe diferencia significativa al nivel del 0.05. (Las cepas Yucatán 2 y San Luis Potosí 2 son aislados monospóricos de un bioensayo anterior) 120 A 100 89.2 A A A 91.4 86.4 89.3 80 60 B 40 20 0 18.5 Control Veracruz Tabasco 1 Tabasco 2 Colima Figura 4. Porcentaje de mortalidad promedio causado por 9 cepas de Hirsutella citriformis contra adultos de Diaphorina citri. Letras diferentes en cada barra indican que existe diferencia significativa al nivel del 0.05. (La cepa Tabasco 2 es un aislado monospórico de un bioensayo anterior). Las 8 cepas evaluadas presentaron un comportamiento similar a lo encontrado por otros investigadores (Meyer, et al., 2007 y Sánchez-Peña, et al., 2011) en lo referente al inicio de mortalidad (6 días) y la aparición de sinemas (10 días) en los cadáveres de Diaphorina citri. Las tasas de mortalidad media en los bioensayos contra Diaphorina citri en el presente estudio, son 384 menores a las reportadas por otros investigadores que han evaluado a este hongo (Meyer, et al., 2007 y Sánchez-Peña, et al., 2011) los cuales indican mortalidad del 100% después del noveno día y al sexto día respectivamente. Nuestros resultados pueden diferir de los obtenidos por dichos investigadores probablemente porque las condiciones en las cuales se realizaron los bioensayos fueron diferentes a las utilizadas por ellos, como también las cepas pueden exhibir diferente patogenicidad; sin embargo, tomando en cuenta la especificidad que tiene este hongo sobre su blanco, y el hecho de haber evaluado ocho cepas de H. citriformis de diferente origen geográfico, de México, nuestros resultados son suficientes para implicar que existe un gran potencial para el posible uso de H. citriformis para el control de D. citri en el país. Agradecimientos Se agradece al Fondo Sectorial SAGARPA-CONACYT por el financiamiento del proyecto 2009-108591. Literatura Citada Casique-Valdes R., A. Y. Reyes-Martinez, S. R. Sanchez-Peña, M. J. Bidochka and J. I. Lopez Arroyo. 2011. Pathogenicity of Hirsutella citriformis (Ascomycota: Cordycipitaceae) to Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) and Bactericera cockerelli (Hemiptera: Triozidae). Florida Entomologist 94:703-705. Étienne, J., Quilici, S., Marival, D., Franck, A., 2001. Biological control of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) in Guadeloupe by imported Tamarixia radiata (Hymenoptera: Eulophidae). Fruits 56, 307–315. Garnier, M. J. Bové. 2000. Huanglongbing (Greening). P 46-48. En: Timmer, L. W. Garnsey, S. M. and Graham. J.H. Compendium of citrus diseases. Second Edition. APS. Press. St. Paul. Minnesota. González, C. J. C., Castellanos, S. I. E., Fucikovsky, Z. J., López, H. M., Sánchez, R. G, y Elorza, M. P. 2008. Dinamica de Población y tasa de infección de Diaphorina citri al hongo Hirsutella citriformis en Citrus sinensis en Tuxpan; Veracruz, México. 1p. Hall. D. G., M. G. Hentz, J. M. Meyer, A. B. Kriss, T. R. Gottwald and D. G. Boucias. 2012. Observations on the entomopathogenic fungus Hirsutella citriformis attacking adult Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) in a managed citrus grove. Journal of the International Organization for Biological Control. Published online. Lezama-Gutiérrez, R., G. Galván-Gutiérrez, Y. Contreras-Bermudes, S. Díaz-Flores, G. ReyesMartínez, M. Barba-Reynoso, C. Angel-Shagún, H.C. Arredondo-Bernal. 2011. Presencia natural y patogenicidad de los hongos Metarhizium anisopliae y Cordyceps bassiana (Ascomycetes) en ninfas y adultos de Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) en el Estado de Colima. En: Memorias del XXXIV Congreso Nacional de Control Biológico, Monterrey, N. L. Mex. Meyer, J.M., Hoy, M.A. and Boucias, D.G. 2007. Morphological and molecular characterization of a Hirsutellas species infecting the Asian citrus psyllid, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae), in Florida. J. Invertebrate Pathology. 95: 101-109 Miranda-Salcedo, M. A., López-Arroyo, J. I. 2009. Ecología del Psílido Asiático de los cítricos Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae) en Michoacán. P 55. En: Memorias del XXXII Congreso Nacional de Control Biológico, Villahermosa, Tab., Mex. 385 OEPP/EPPO. 1988. Data sheets on quarantine organisms No. 151, Citrus greening bacterium and its vectors Diaphorina citri and Trioza erytreae. EPP/EPPO Bulletin 18:497-507. Padulla, L. F. L. and S. B. Alves. 2009. Susceptibilidade de ninfas de Diaphorina citri a fungos entomopatogenicos. Arquivos do Instituto Biologico 76:297-302. Pérez-González, O., M.G. Maldonado-Blanco, R.I. Torres-Acosta, R. Rodríguez-Guerra, M., Elías-Santos, C.F. Sandoval-Coronado, J.I. López-Arroyo. 2013. Morphological characterization of Hirsutella citriformis Speare Mexican isolates and evaluation against Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae), abstract 6.9. In: Proceedings of the Third International Research Conference on Huanglongbing. USDA-ARS, University of Florida. February 4-7, 2013. Orlando, Fl., U.S.A. Pérez-González, O., Maldonado B, M. G., Torres A., R. I., López A., J. I., Sandoval C., C. F., Elias S., M. y Rodríguez G., R. 2012. Caracterización morfológica de cepas de Hirsutella citriformis Speare aisladas de Diaphorina citri Kuwayama en México, pp. 538-540. En: Memorias del XXXV Congreso Nacional de Control Biológico, Puebla, Puebla, México. Reyes-Rosas, M.A., López-Arroyo, J.I. and Loera-Gallardo, J. 2009. Presencia del hongo entomopatógeno del psílido asiático de los cítricos Diaphorina citri, en Río Bravo, Tamaulipas, México. p. 420-425. En: Memorias del XXXII Congreso Nacional de Control Biológico, Villahermosa, Tabasco, México. Rivero-Aragon, A., Grillo-Ravelo, H., 2000. Natural enemies of Diaphorina citri Kuwayama (Homoptera: Psyllidae) in the central region of Cuba. Centro-Agricola 27 (3), 87–88 (Abstract only). Sánchez-Peña, S.R., Casique-Valdés, R., Bidochka, M. Reyes-Martínez, A.Y. and López-Arroyo, J.I. 2011. Hirsutella citriformis: Caracterización Morfológica y Molecular y Patogenicidad hacia Psylloideos vectores. En: Memorias del II Simposio Nacional sobre investigacion para el manejo del Psyllido Asiático de los Cítricos y Huanglongbing en México. Subandiyah, S., N. Nikon, H. Sato, F. Wagiman, S. Tsuyumu and T. Fakatsu. 2000. Isolation and characterization of two entomopathogenic fungi attacking Diaphorina citri (Homoptera, Psilloidea) in Indonesia. Mycoscience 41:509-513. 386 BIOACTIVIDAD DE Trichilia americana CONTRA Copitarsia decolora (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) Elyda Hernández-Miranda, Rodolfo Figueroa-Brito1 y Víctor Rogelio Castrejón-Gómez1. 1Becarios COFAA. Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional. Yautepec-Jojutla km 6.5, A.P. 24, 62730 San Isidro, Yautepec, Morelos, México. [email protected]; [email protected]; [email protected]. RESUMEN. Se evaluaron extractos de T. americana con los disolventes hexano, acetato de etilo, acetona y metanol a concentraciones de 10, 100, 300 y 1000 ppm en cada uno de ellos. El extracto que presento mayores perspectivas es el de acetato de etilo, ya que se obtuvo el mayor porcentaje de mortalidad, así como el mayor tiempo en el desarrollo larval y el menor peso en las larvas. Palabras clave: Extractos, toxicidad, plaga, Trichilia americana, Copitarsia decolora. Bioactivity from Trichilia americana against Copitarsia decolora (Lepidoptera: Noctuidae) ABSTRACT. Extracts of T. americana were evaluated with solvents hexane, ethyl acetate, acetone and methanol at concentrations of 10, 100, 300 and 1000 ppm in each. The extract that showed higher prospects is ethyl acetate, because it had the highest mortality rate, and as well as the longest larval development and less weight in larvae. Key words: Extracts, toxicity, pest, Trichilia americana, Copitarsia decolora. Introducción Copitarsia decolora Guenée, es una plaga importante de diversas plantas cultivadas como col (Brassica oleracea var capitata), brócoli (Brassica oleracea var italica), coliflor (Brassica oleracea var botritys), cilantro (Coriandrum sativum), y lechuga (Lactuca sativa) (Angulo y Olivares, 2010; Moreno y Serna, 2006; Larrain, 1996). En la col este insecto se presenta todo el año asociado a las diferentes etapas fenológicas del cultivo, la larva se alimenta del brote principal, ocasionándole deformaciones e inclusive la muerte. El ataque más frecuente y más mp p mm f m ó “ b ” ú m barrenador penetrando a su interior para alimentarse (Bautista et al., 2003; Angulo et al., 2006). Otra forma de daño es provocado por la larva que en ocasiones no disminuyen apreciablemente la producción, pero afecta la calidad por presencia de heces contaminantes. Esta especie también es relevante por las barreras fitosanitarias ligadas a ella, debido a que uno de los principales mercados de los productos agrícolas mexicanos es el de los Estados Unidos de Norteamérica, donde es una plaga cuarentenada (SENASICA, 2003; Secretaria de Economía, 2009; USDA, 2009). Motivo por lo cual hay obstáculos para la comercialización de plantas hospederas de dicha especie. Por lo tanto, todos los envíos de crucíferas excepto los procedentes de Mexicali, deben ser inspeccionados y portar un certificado fitosanitario que los declare libre de larvas y adultos de C. decolora. Para su control se utilizan insecticidas químicos con los cuales se causan daños al ambiente e incluso al mismo humano (Basf, 2010; Bayer Crop Science, 2010; Bravo, 2010). Actualmente se buscan nuevos tipos de plaguicidas, que no sean persistentes, que no generen resistencia, que sean específicos, que no sean tóxicos para el hombre ni para los organismos benéficos, que sean biodegradables, efectivos para el control de insectos plaga y adicionalmente de bajo costo (Castillo et al., 2010; Villavicencio y Pérez, 2010). Es necesario por tanto, conocer el efecto potencial como biocida de especies vegetales que conduzca al adecuado método de obtención, uso y manejo del producto con el fin de asegurar su eficacia y mejorar su efectividad. 387 El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto tóxico de diferentes extractos de Trichilia americana sobre el gusano del corazón de la col, Copitarsia decolora. Materiales y Método El insecto. La cría en laboratorio fue iniciada con larvas obtenidas de un cultivo de col ubicado en Juchitepec, Estado de México en 2009, anualmente fueron introducidas larvas de campo. Larvas neonatas fueron obtenidas de dicha cría mantenida en el laboratorio del CEPROBI-IPN a 18 ± 3° C, 60 ± 5% HR y un fotoperiodo invertido de 12:12 h (luz: oscuridad). La planta. La corteza de T. americana obtenida en Iguala, Gro., fue secada a temperatura ambiente bajo sombra durante 15 días. Posteriormente se pulverizó en un molino usando un tamiz de 1 mm. El polvo obtenido fue colocado en bolsas de plástico y guardados en refrigeración (4 ºC) hasta la realización de los bioensayos. Los bioensayos. Para la preparación de los extractos se realizó una maceración en matraces de vidrio de 500 mL durante 72 h con cada uno de los siguientes disolventes: hexano, acetato de etilo, acetona y metanol. Posteriormente se filtró en un matraz de vidrio y se concentró en un rotavapor. Los extractos se evaluaron a concentraciones de 10, 100, 300 y 1000 ppm y fueron mezclados con la dieta artificial (500 g) procurando que la temperatura no fuera mayor a 50° C al momento de adicionar el extracto. Esta mezcla fue vertida en vasos de plástico (30 mL) y una vez que se condensó y enfríó se colocó una larva neonata de C. decolora. El testigo solo consistió de dieta artificial. Cada tratamiento consistió en 100 larvas neonatas. Todos los tratamientos fueron colocados en una cámara de cría en las mismas condiciones descritas anteriormente Las variables de respuesta fueron la mortalidad (%), el peso (mg) y el desarrollo larval (días). Los datos fueron analizados mediante la prueba de Kruskal Wallis y la separación de medias mediante la Prueba de Tukey. Resultados y Discusión Mortalidad. Los tratamientos que provocaron una mortalidad larval igual o mayor al 50 % con respecto a sus testigos fueron los extractos de acetato de etilo y de acetona a 1000 ppm en ambos casos, con valores de mortalidad de 60 y 52.5 %, respectivamente. El extracto de acetona a 10 ppm provocó una mortalidad del 37.5 % de mortalidad (Fig. 1). Lo anterior demuestra un efecto de toxicidad de la planta sobre larvas de C. decolora. Desarrollo. Los extractos que retardaron el desarrollo larval significativamente con respecto a sus testigos fueron los extractos de metanol a 1000 ppm, de hexano a 100 ppm, de acetona a 1000 ppm, y de acetato de etilo a 1000 ppm (Cuadro 1). Este efecto de retardar el crecimiento puede ser tomado como un efecto antialimentario. Peso. Los extractos que provocaron significativamente menor peso en las larvas de C. decolora fueron el de de acetona a 10 y 1000 ppm seguidos del acetato de etilo a 1000 y 300 ppm (Fig. 2). Diferentes estudios han demostrado que los extractos crudos de T. americana tienen un efecto tóxico, antialimentario e inhibitorio del crecimiento en diferentes especies de Noctuidae tales como Spodoptera litura (Wheeler e Isman, 2001; Wheeler et al., 2001), Trichoplusia ni y Pseudaletia unipuncta (Akhtar et al., 2008). Con respecto a los resultados obtenidos en el presente trabajo, relacionados con el efecto de retardar el desarrollo y disminuir el peso larval de C. decolora, aún falta por definir si estos efectos son debido a un efecto antialimentario o 388 inhibitorio del crecimiento, lo que podrían estar relacionados con los limonoides tipo hirtinas, propios de esta planta. Nuevos estudios enfocados en este tema habrán de ser llevados a cabo. % de mortalidad 70 60 50 40 30 20 10 AE4 AE3 AE2 TAE AE1 ACET4 ACET3 ACET2 ACET1 HEX4 TACET HEX3 HEX2 HEX1 MET4 T HEX MET3 MET2 MET1 T MET 0 Tratamientos Figura 1.- Porcentaje de mortalidad de larvas de C. decolora por efecto de diferentes concentraciones de extractos crudos de T. americana en condiciones de laboratorio. TMET = Testigo del extracto metanólico, MET = extracto metanólico. THEX = Testigo del extracto hexánico, HEX = Extracto hexánico. TACET = Testigo de extracto acetónico, ACET = Extracto acetónico. TAE = Testigo de extracto de acetato de etilo, AE = Extracto de acetato de etilo. 1 = 10 ppm. 2 = 100 ppm. 3 = 300 ppm. 4 = 1000 ppm. Cuadro 1.- Efecto de los extractos crudos de T. americana a diferentes concentraciones sobre el desarrollo larval de C. decolora en condiciones de laboratorio. Tratamientos TMET MET1 MET2 MET3 MET4 THEX HEX1 HEX2 HEX3 HEX4 Desarrollo larval(días) 33 35.9 ± 3.5 35.9 ± 3.5 38.1 ± 3.15 39.5 ± 1.84 * 33.9 ± 2.34 34.8 ± 3.92 40.7 ± 4.25 * 33 35.8 ± 3.47 Tratamientos TACET ACET1 ACET2 ACET3 ACET4 TAE AE1 AE2 AE3 AE4 Desarrollo larval(días) 33 35.6 ± 3.46 33.2 ± 1.15 36.2 ± 4.55 39.3 ± 2.15* 33 35.3 ± 3.32 35.1 ± 3.67 36.9 ± 4.38 42.8 ± 5.75 * TMET = Testigo del extracto metanólico, MET = extracto metanólico. THEX = Testigo del extracto hexánico, HEX = Extracto hexánico. TACET = Testigo de extracto acetónico, ACET = Extracto acetónico. TAE = Testigo de extracto de acetato de etilo, AE = extracto de acetato de etilo. 1 = 10 ppm. 2 = 100 ppm. 3 = 300 ppm. 4 = 1000 ppm. H = 291. 34, . . = 20, P ≤ 0.001. Conclusiones Los resultados obtenidos en el presente trabajo con extractos de T. americana, permiten corroborar los resultados obtenidos en trabajos anteriores con polvos de T. americana. El extracto que presentó mayores perspectivas es el de acetato de etilo, ya que se obtuvo el mayor porcentaje de mortalidad, así como el mayor tiempo en el desarrollo larval. El extracto acetónico ocasionó el menor peso en las larvas de C. decolora. Lo cual motiva a seguir las investigaciones con esta 389 planta orientados a generar un agente de biocontrol de insectos. Sin embargo, es necesario realizar estudios con la fauna benéfica para descartar posibles efectos tóxicos. 0.06 0.05 Peso larval (mg) 0.04 0.03 0.02 c c c bc ab 0.01 a a AE1 AE2 AE3 AE4 T AE ACET1 ACET2 ACET3 ACET4 T ACET HEX4 HEX3 HEX2 HEX1 T HEX MET1 MET2 MET3 MET4 T MET 0.00 Tratamientos Figura 2.- Peso de larvas de C. decolora por efecto los extractos crudos de T. americana a diferentes concentraciones en condiciones de laboratorio. TMET = Testigo del extracto metanólico, MET = extracto metanólico. THEX = Testigo del extracto hexánico, HEX = Extracto hexánico. TACET = Testigo de extracto acetónico, ACET = Extracto acetónico. TAE = Testigo de extracto de acetato de etilo, AE = extracto de acetato de etilo. 1 = 10 ppm. 2 = 100 ppm. 3 = 300 ppm. 4 = 1000 ppm.. H = 422, . . = 21, P ≤ 0.001. Agradecimientos. Elyda Hernández-Miranda Agradece al CONACYT y al PIFI por las becas proporcionadas durante sus estudios de Maestría en Ciencias en Manejo Agroecológico de Plagas y Enfermedades en el Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico N . E p b j f p p p SIP 20130885 “Evaluación de extractos de Trichilia americana sobre el gusano del corazón de la col, Copitarsia decolora”. Literatura Citada Akhtar, Y., Yeoung, Y.-R., y M. B. Isman. 2008. Comparative bioactivity of selected extracts from Meliaceae and some commercial botanical insecticides against two noctuid caterpillars, Trichoplusia ni and Pseudaletia unipuncta, Phytochem. Rev. 7: 77–88. 390 Angulo A. O. y S. T. Olivares. 2010. La polilla Copitarsia decolora: revisión del complejo de especies con base en la morfología genital masculina y de los huevos (Lepidoptera: Noctuidae). Rev. Biol. Trop. 58: 769-776. Angulo, A., Olivares, T. y G. Weigert. 2006. Estados inmaduros de lepidópteros noctuidos de importancia agrícola económica y forestal en chile (Lepidoptera: Noctuidae). 1era. ed. Universidad de Concepción, Chile. 33-38 pp. Bautista, N., Hernández, M. y C. Llanderal. 2003. Insectos de importancia agrícola poco conocidos en México. Instituto de Sanidad. Colegio de Posgraduados. México. 33-56 pp. Basf. 2010. Ficha técnica: Talcord@340. Diccionario de Especialidades Agroquímicas: Fertilizantes, agroquímicos y productos orgánicos. Thomson Health Care. 584-585 pp. Bayer Crop Science, 2010. Ficha técnica: Sevin@80%PH. Diccionario de Especialidades Agroquimicas; Fertilizantes agroquímicos y productos orgánicos. Thomson Health Care. 653-654 pp. Bravo, 2010. Ficha técnica: Algodan@350 HC&FREE. Diccionario de Especialidades Agroquimicas; Fertilizantes agroquímicos y productos orgánicos. Thomson Health Care. 1148-1149 pp. Castillo, S. L. E., Jiménez, O. J. J. y H. M. A. Delgado. 2010. Metabolitos secundarios de las familias Annonaceae, Solanaceae y Meliaceae usadas como control biológico de insectos. Tropical and Subtropical Agroecosystems, 12: 445 -462 Larrain, S. P. 1996. Biología de Copitarsia turbata (Lep. Noctuidae). Agricultura técnica (Chile), 56: 220-223 Moreno O. y F. Serna. 2006. Biología de Copitarsia decolora (Lepidoptera: Noctuidae: Cuculliinae), en flores cultivadas del hibrido comercial Alstromeria spp. Rev. Nal. Agr. Medellin. 59: 3257-3270. Secretaria de Economía, 2009. Consultado en línea el 3 de septiembre de 2009; www.economiasnci.gob.mx SENASICA (Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria). 2003. Consultada en línea en septiembre de 2010: www.siap.sagarpa.gob.mx. USDA. 2003. Memorandum of understanding between the United States Department of Agriculture and the Office of the United States Trade representative, and the Secretariat of Agriculture, Livestock, Rural Development Fisheries and Food and the Secretariat of Economy of the Mexican States regarding areas of food and agricultural trade Disponible en internet : http://www.usda.gov/news/release/2002/04/moumexico.htm Villavicencio, N. M. A. y E. B. E. Pérez. 2010. Plantas tradicionalmente usadas como plaguicidas en el Estado de Hidalgo, México. Polibotánica, 30:193-238. Wheeler, D. A. y M. B. Isman. 2001. Antifeedant and toxic activity of Trichilia americana extract against the larvae of Spodoptera litura, Ent. Exp. App. 98: 9–16. Wheeler, D. A., Isman, M. B., Sanchez-Vindas, P. E. y J. T. Arnason. 2001. Screening of Costa Rican Trichilia species for biological activity against the larvae of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Biochem. Syst. Ecol. 29: 347–358. 391 AISLAMIENTO Y EXTRACCIÓN DE ADN DEL COMPLEJO DE HONGOS SIMBIONTES ASOCIADOS A LA HORMIGA ARRIERA (Atta cephalotes) Daniela Villanueva-Mejía, Estudiante de Biología, Universidad del Quindío, Armenia (Quindío-Colombia). [email protected] RESUMEN. Atta cephalotes hace parte de la subfamilia Myrmicinae y a la tribu Attini. Dentro de la cual están incluidas las hormigas polimórficas, cortadoras de estructuras vegetales, cultivadoras del hongo Leucoagaricus gonglylophorus con el cual mantienen una relación simbiótica. Se realizó un aislamiento del hongo asociado a estas, encontrando colonias aéreas, de aspecto algodonoso, vellosas y pulvurulentas, de colores variables y otras colonias opacas de aspecto pastoso y color cremoso. Estos hongos se encuentran bajo caracterización morfológica y molecular para determinar las posibles interacciones entre especies del género y/o la diferenciación de especies para la formación del complejo. Para ello, se están realizando diferentes procedimientos tales como aislar en agar PDA, observar al microscopio con azul de bromofenol y realizar la extracción de ADN con el Protocolo de extracción en arroz para DArt (Diversity ArraysTechnology). Palabras clave: ADN, Simbiosis, Atta cephalotes, Leucoagaricus gonglylophorus DNA isolation and extraction from fungal symbionts complex associated to the hormiga arriera (Atta cephalotes) ABSTRACT. Atta cephalotes is part of the subfamily Myrmicinae and the tribe Attini. Within this, there are included the polymorphic ants, leaf-cutting ants, fungus cultivators Leucoagaricus gonglylophorus with which they maintain a symbiotic relationship. There were isolations of the fungus associated to them, finding colonial areas aspects, with cottony, downy and dusty variable colors, and other colonies were opaque of herbal and creamy color. These fungi are being characterized morphological and molecularly to determine the possible interactions between species from the genre and/or the differentiation of species for the formation of the complex. For that, there have been made different procedures such as isolating in PDA agar, observation on microscope with bromophenol blue, and making the extraction of DNA with the rice DNA Extraction Protocol for DArT (Diversity ArraysTechnology). Key words: DNA, Symbiosis, Atta cephalotes, Leucoagaricus gonglylophorus Introducción Todas las hormigas cultivadoras de hongo pertenecen a la tribu Attini, se agrupan en 12 géneros y alrededor de 210 especies; el 95% de las especies se ubican en la región neotropical y el 5% en el neartico (Mayhé y Jaffé, 1998). Los géneros Atta y Acromyrmex conocidas comúnmente como hormigas podadoras, arrieras, forrajeras o corta hojas, se diferencian de los otros géneros de hormigas Attini debido a su capacidad para cortar material vegetal para el cultivo del hongo; son géneros evolutivamente más recientes y se considera que concentran la más alta evolución de la sociabilidad en los insectos (Escobar et al., 2002). Estas hormigas se caracterizan por un sistema de castas, el cuidado cooperativo de las crías y el solapamiento de generaciones de obreras dentro de la colonia. El sistema de castas consiste en la división de las funciones dentro de un hormiguero, por grupos de hormigas que difieren morfológicamente (North et al., 1997; Kaspari, 2003). Las hormigas forrajeras cortan material vegetal para el cultivo del hongo, frecuentemente obtenido de plantaciones agrícolas y forestales por lo que se han convertido en una de las cinco plagas más importantes de América Latina (Ricci et al., 2005, Escobar et al., 2002, Ortiz y Orduz, 2000). Por lo tanto, el conocimiento de aspectos relacionados con la biología y los actores involucrados en el proceso del cultivo del hongo simbiótico y del hongo como tal son muy 392 importantes para emprender la búsqueda de alternativas de manejo eficaces y efectivas a largo plazo. El primer informe del hongo simbiótico se remonta a 1874 cuando Thomas Belt descubrió la razón del forrajeo de las hormigas (Escobar et al., 2002). Posteriormente Moller en 1895 investigó el hongo cultivado por las hormigas del género Acromyrmex y lo clasificó como Rozites gongylophora. En 1938 Sthael y Kintzel, de manera individual, concluyeron que el hongo cultivado por varias especies de Atta podría ser R. gongylophora; sin embargo, no había acuerdo entre los investigadores (Perez 1947). Actualmente, se conoce que la mayoría de hongos simbióticos cultivados por las hormigas pertenecen a la familia lepiotaceae dentro de la clase basidiomiceto y la tribu leucocoprineae (Kumar et al., 2006, Chapela et al., 1994, Hinkle et al., 1994). Las hormigas forrajeras cultivan un clon ancestral de reproducción asexual que ha coevolucionado junto a ellas y proviene del hongo leucocoprineous cultivado por las attini menores; este hongo en cultivos de agar puede producir esforóforos (cuerpos reproductores) pero en la naturaleza depende completamente de las hormigas para su reproducción debido probablemente a que los genes responsables de la reproducción sexual se expresan en funciones alternativas como la formación de gongilidios, ricos en carbonidratos y proteínas que sirven de alimento único para las larvas y la reina de la colonia como principal alimento para el resto de castas (Currie 2001, Hinkle et al., 1994). Varias investigaciones han demostrado que el hongo cultivado presenta baja variabilidad genética y escasa evidencia de intercambio genético en regiones geográficas grandes y que Atta cephalotes y otras especies cultivan Leucoagaricus gongylophorus (Mikheyev et al., 2007, Silva et al., 2004, Fisher et al., 1996). El propósito del presente trabajo es caracterizar morfológica y molecularmente los hongos asociados a las hormigas cortadoras de hojas (Atta cephalotes) y determinar si son varias especies del género Leucoagaricus las que interactúan o son especies de otros géneros las que están formando el complejo de hongos. Materiales y Método Se tomaron 5 muestras del hongo simbionte del laboratorio de fitopatología de Smurfit Kappa Cartón de Colombia, cada muestra fue aislada en una caja Petri sobre agar PDA, volvieron a ser aisladas obteniendo un total de 10 cajas de Petri sobre las que se realizó una observación al microscopio con azul de bromofenol y posteriormente se procedió a realizar la extracción de ADN con el protocolo de extracción en arroz para DArt (Diversity ArraysTechnology) de cada una de las muestras obtenidas. Resultados y Discusión Primero y Segundo Aislamiento: Al realizar el primer y el segundo aislamiento de las muestras, se observó una gran variedad de formas, colores y tamaños (Figs. 1 y 2). Clasificando los hongos encontrados de manera general en mohos y levaduras. Según García et al. (2004) los mohos se desarrollan en el laboratorio sobre la superficie de sustratos o medios de cultivo, formando colonias aéreas, de aspecto algodonoso, vellosas o pulvurulentas y de color variable y las levaduras crecen en los medios de cultivo sólidos formando colonias opacas, de aspecto pastoso, color cremoso aunque algunas especies son característicamente pigmentadas, el 44.4% y el 55.5% de las muestras presentaban estas características respectivamente. 393 Figura 1. Crecimiento de hongos en agar PDA en el primer aislamiento Figura 2. Diversidad de Hongos creciendo en agar PDA en el segundo aislamiento. Observación al microscopio: Los hongos se colocaron al microscopio con azul de bromofenol con un aumento de 40x, se observaron hifas aseptadas y septadas algunas con terminaciones en protuberancias mostrando presencia de gongilidios (Fig. 3), donde se acumulan vacuolas ricas en nutrientes (Hölldobler y Wilson, 1990; North et al., 1997; Vellinga, 2004), lo que permite determinar que algunos de los hongos observados allí, pertenecen al género Leucoagaricus y otros se observaron esporulados (Fig. 4). Extracción de ADN: El ADN obtenido se tiene almacenado y está listo para ser analizado. Las hormigas arrieras de los géneros Atta y Acromyrmex (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae: Attini) se presentan en colonias eusociales y ocurren en relación simbiótica mutualista con un grupo de hongos basidiomicetos, de clasificación incierta, variablemente denominados Attamyces bromatificus, Agaricus bisporus, Lepiota procera o Leucocoprinus gongilophora (Agaricales: Lepiotaceae: Leucocoprini) (Cherret et al., 1989; Kingle et al., 1994; Chapela et al., 1994). La relación ectosimbiotica obligada entre arrieras y el hongo permite que aquellas plantas que no pueden ser utilizadas directamente como alimento de las arrieras por sus efectos insecticidas, si puedan ser aprovechadas como nutrientes de los hongos, los cuales poseen mecanismos para neutralizar esos compuestos antialimentarios naturales de las plantas. De esta manera, las larvas de las arrieras son alimentadas por los hongos que cultivan sus hermanas adultas, las cuales se alimentan directamente de la savia de las hojas que cortan y eligen aquellas hojas con sustancias no formícidas. 394 Figura 3. Hongos observados al microscopio con objetivo de 40x, presentan hifas aseptadas y septadas. Figura 4. Hongos esporulados observados con objetivo de 40x. Mientras la especie fungal se ve favorecida por la simbiosis, ya que es propagada por las cortadoras, estas se vuelven poblaciones de insectos dominantes por su capacidad de explotar un 395 gigantesco abanico de recursos vegetales (Cherrett et al., 1989). A partir de los diversos hongos encontrados se deduce que hay presencia de otros hongos del mismo género o de otros géneros posiblemente por el tipo de alimentación de estas hormigas, ya que se alimentan de hojas de eucalipto, pino y naranjo. Actualmente algunos investigadores están de acuerdo en cuanto a la existencia de una asociación mutualista múltiple entre las hormigas arrieras (Attini), el hongo cultivado (Leucocoprinae), micoparásitos especializados (Escovopsis), la bacteria productora de antibióticos (Pseudonocardia), la levadura negra (Phialophora) y las bacterias fijadoras de nitrógeno (Klebsiella y Pantoea) (Pinto-Tomás et al., 2009, Little y Currie 2007; Poulsen et al. 2007, Kumar et al., 2006, Gerardo et al., 2006). Por lo anterior no se descarta la interacción de otros hongos en esta simbiosis múltiple, la cual será comprobada con estudios moleculares posteriormente. Agradecimientos A Smurfit Kappa Cartón de Colombia por proporcionarme las muestras, a la Universidad del Quindío y a mis profesores Diego Fernando Marmolejo y Víctor Hugo García Merchán por contribuir a mi formación académica. Literatura Citada Chapela, I. H., Rehner, S. A., Schultz, T. R. and U. G. Mueller. 1994. Evolutionary history of the symbiosis between fungus growing ants and their fungi. Science 266: 1691-1695. Cherret, J. M., R. J. Powell. and D. J. Stradling. 1989. The mutualism between leafcutting ants and their fungus. Insectos-fungus interations. En: 14th Symp. Royal Entomol. Soc. Cap 4. pp 93-120. Currie, C. R. 2001. A community of ants, fungi, and bacteria: A Multilateral Approach to Studying Symbiosis.Annu. Rev. Microbiol.2001.55:357-380. Escobar-Duran, R., García Cossio, F., Rentería, N. Y. y M. J. C. Neita. 2002. Manejo y control de hormiga arriera (Atta spp and Acromyrmex spp.) en sistemas de producción de importancia económica en el departamento del Chocó. Cartilla 1 y 2. Ministerio de Agricultura- PRONATTA-Universidad Tecnológica del Chocó. CO.53 p. Fisher, P. J., Stradling, D. J. and D. N. Pegler. 1994. Leucoagaricus basidiomata from a live nest of the leaf-cutting ant Atta cephalotes. Mycol. Res 1994; 98: 884-888. Garcia, P., Fernandez del Barrio, M. T. y F. Paredes-Salido. 2004. Microbiología clínica practica. 2da ed. Cádiz. pp. 401-404. Gerardo, N. M., Jacobs, S. R., Currie, C. R. and U. G. Mueller. 2006. Ancient Host-Pathogen Associations Maintained by Specificity of Chemotaxis and Antibiosis. PLoS Biol 4(8): e235 Hikle, G., Wetterer, J. K. Schultz, T. R. and M. L. Sogin. 1994. Phylogeny of the attine fungi based on analysis of small subunit ribosomal RNA gene sequences. Science 266: 1695-97. Hölldobler, B. and E. O. Wilson. 1990. The Ants. The Belknap Press of Harward University Press, Cambridge, MA, U.S.A. 712 pp. Kaspari, M. 2003. Introducción a la ecología de las hormigas, p. 97 – 112. En Fernández, F. (Editor). Introducción a las Hormigas de la Región Neotropical. Instituto de Investigaciones de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt, Bogotá, Colombia. 396 Kumar, H; Patole, M. S. and Y. S. Shouche. 2006. Fungal farming : a story of four partner evolution. Current Science. 90 (11): 1463-1464. Little, A. E. F. and C. R. Currie. 2007. Symbiotic complexy: discovery of a fifth symbiont in the attine ant-microbe symbiosis. Biology letters. 3: 501-504. Mayhé-Nunes, A. J. and K. Jaffé. 1998. On the biogeography of Attini (Hymenoptera: Formicidae). Ecotropicos. 11 (1): 45-54. Mikheyev, A. S., Mueller, U. G. and J. J. Boomsma. 2007. Population genetic signatures of diffuse coevolution between leaf-cutting ants and their cultivar fungi. Molecular Ecology 16: 209-216. North, R. D., Jackson, C. W. and P. E. Howse. 1997. Evolutionary aspects of ant-fungus interactions in the leaf-cutting ants. Trends Ecol. Evolut., 12: 386-389. Ortiz, A. and S. Orduz. 2000. In vitro evaluation of Trichoderma and Gliocladium antagonism against the symbiotic fungus of the leaf-cutting ant Atta cephalotes. Micophatologia. 150: 53-60. Pérez-Alcalá, R. 1947. El problema de las hormigas del género Atta Fabr., en la América. Instituto Interamericano de Ciencias Agrícolas. Turrialba, CR. Tesis 74 p. Pinto-Tomás, A. A., Anderson, M. A., Suen, G., Stevenson, D. M., Chu, F. T. S., Cleland; W. W., Weimer, P. J. and C. R. Currie. 2009. Symbiotic Nitrogen Fixation in the Fungus Garden of Leaf-Cutter Ant. Science 326 (5956): 1029-1148. Poulsen, M., Erhardt, D. P., Molinario, D. J., Lin, T. L. and C. R. Currie. 2007. Antagonistic Bacterial Interactions Help Shape Host-Symbiont Dynamics Within the Fungus-Growing Ant-Microbe Mutualism. Plos ONE 2 (9): e960. Ricci, M., Benítez, D., Padin, S. y A. Maceiras. 2005. Hormigas argentinas: comportamiento, distribución y control. Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. Universidad Nacional de La Plata. AR. 27 p. Silva-Pinhati, A. C. O., Bacci, M. J. and G. Hinkle. 2004. Low variation in ribosomal DNA and internal transcribed spacers of the symbiotic fungi of leaf-cutting ant (Attini: Formicidae). Brazilian journal of medical and biological research. 37: 1463-1472. Vellinga, E. C. 2004. Ecology and distribution of lepiotaceous fungi (Agaricaceae)-A review. Nova Hedwigia, 78: 273-299. 397 VARIACIONES ESTACIONALES EN LA INCIDENCIA DE PATÓGENOS NATURALES DE LA GARRAPATA DEL GANADO Rhipicephalus (Boophilus) microplus (ACARI: IXODIDAE) Estefan Miranda-Miranda1, Raquel Cossio-Bayugar1 y Alfredo Peláez-Flores 2. 1Centro nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria INIFAP Carr. Fed. Cuernavaca-Cuautla No. 8534, Jiutepec Morelos 62550. [email protected], [email protected]. 2 Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria. SAGARPA, Carr. Fed. Cuernavaca-Cuautla No. 8534, Jiutepec Morelos 62550. [email protected]. RESUMEN. 8500 hembras repletas de la garrapata del Ganado Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae), fueron inspeccionadas en busca de síntomas de infección micótica y /o bacteriana a lo largo de dos años. Las garrapatas afectadas por infecciones de este tipo fueron incapaces de ovipositar, desarrollaron un distintivo color oscuro con crecimiento de micelio y conidióforos sobre las cutículas así como un exudado amarillento en la región del poro genital. Se identificó al hongo productor de aflatoxina Aspergillus flavus y a la cocobacteria bacteria Gram+ Staphylococcus saprophyticus, como los principales responsables de esta sintomatología. Los registros estacionales sobre la prevalencia de esto microorganismos patógenos sobre las garrapatas demuestran que las condiciones naturales óptimas ocurren en los meses húmedos y cálidos (junio a agosto) mientras que durante el período invernal la prevalencia de patógenos naturales de la garrapata es casi imperceptibles. Este estudio podría usarse para el diseño de mejores estrategias de control biológico estacional de la garrapata del ganado R. microplus. Palabras clave. Aspergillus spp, Rhipicephalus microplus Infección micótica, Taxonomía Molecular Seasonal Variantions in the prevalence of natural pathogens of the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae) ABSTRACT. 8500 engorged female ticks Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae) were inspected for symptoms of fungal and/or bacteriological infection during a two-year period. Affected ticks were unable to oviposit, developed a distinctive dark color with mycelium and fungal conidiophorae growth over their cuticle and a yellowish exudate at the genital pore. An aflatoxin producing fungus Aspergillus flavus and a Gram+ cocci-bacteria Staphylococus saprophyticus were identified as responsible for the symptoms. Seasonal records on the tick natural pathogens prevalence showed that optimal natural conditions occurred during warm and humid months (June to August) whereas winter period the pathogenic activity over the ticks were almost imperceptible. This study could be useful in designing better cattle tick seasonal biological control strategies. Key words. Aspergillus spp, Rhipicephalus microplus, Mycotic infection. Introducción La garrapatas del genero Rhipicephalus spp son ectoparásitos hematófagos persistentes y vectores de enfermedades infecciosas que afectan a una gran variedad de animales (Nuñez et al., 1985; de Castro 1997, Cossio-Bayugar et al., 2012), sin embargo, estos ácaros ixódidos también cuentan con numerosos enemigos naturales que los depredan y/o los infectan causando un impacto notable en sus poblaciones (Miranda-Miranda et al., 2010, 2011, 2012). Algunos de los microorganismos patógenos que infectan a las garrapatas pueden identificarse por los síntomas de enfermedad que inducen en ellas. Entre éstos se han reportado varias especies de bacterias del genero Staphylococcus que son capaces de infectar huevos, larvas y a las hembras ingurgitadas de garrapatas del ganado R. decoloratus y R. geigy (Amoo et al., 1997) así como diferentes estadios de desarrollo de la garrapata del perro R. sanguineus (Adejinmi y Ayinmode, 2008). Recientemente, nuestro grupo de trabajo ha demostrado que la bacteria Staphylococcus saprophyticus, es un virulento patógeno natural de la garrapata del ganado R. microplus que impide a las garrapatas infectadas, ovipositar y mueren antes de completar su ciclo biológico (Miranda-Miranda et al., 2010), nuestro equipo de investigación también ha demostrado que por 398 lo menos existe un hongo del género Aspergillus de la especie flavus que naturalmente produce infecciones letales en las garrapatas del ganado (Miranda-Miranda et al., 2012). Así como algunos insectos que de manera natural depredan las hembras repletas de R. microplus y sus masas ovígeras (Miranda-Miranda et al., 2011) Existen pocos datos en la literatura sobre el efecto que estos agentes infecciosos tienen en la salud de las mismas garrapatas, y menos aún sobre el efecto patógeno que algunas bacterias y hongos constituyentes de la flora normal de los artrópodos y/o de los hospederos pudiesen tener sobre las garrapatas (Miranda-Miranda et al., 2010). Existe sin embargo, un gran interés en este tema, ya que los potenciales efectos patológicos de los organismos patógenos naturales sobre los vectores de las principales enfermedades infecciosas transmitidas por garrapatas, podrían ser usadas como control biológico de estos vectores, evitando de esta manera el uso intensivo de plaguicidas dañinos para el ambiente y la salud humana (Miranda-Miranda et al., 2011, 2012). En este trabajo reportamos las variaciones estacionales del la incidencia de dos enfermedades naturales que causan una importante mortalidad en estos ectoparásitos hematófagos del ganado Material y Método Las garrapatas usadas en este estudio fueron cultivadas en las instalaciones de Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria de la SAGARPA, infestando bovinos estabulados y de movimientos restringidos acorde a reporte previo (Cossio-Bayugar et al., 2012). Se identificaron garrapatas adultas repletas que mostraran oscurecimiento de la cutícula, crecimiento micelial y/o exudados a nivel de poro genital durante un período de dos años, con el fin de identificar los hongos y las bacterias capaces de infectar las garrapatas. Se tomaron muestras de micelio, hemolinfa y exudado de las garrapatas que presentaron exudado acorde a metodología ya reportada (Miranda-Miranda et al., 2010, 2012). Se utilizó agar dextrosa Sabouraud para el cultivo de los aislados de hongos y agar soya tripticasa para cultivar muestras de los exudados y hemolinfa de las garrapatas acorde a reportes previos (Miranda-Miranda et al., 2010, 2012), se hicieron tinciones de Gram para identificar al microscopio las bacterias presentes en el exudado y los cultivos bacterianos y tinción de algodón azul para identificar los conidióforos de las muestras de hongos. Se hicieron pruebas bioquímicas a los cultivos bacterianos tales como: Catalasa, Coagulasa, gelatinasa, resistencia a novobiocina así como la generación de ácidos a partir de diferentes azúcares de acuerdo a lo reportado por otros autores con la finalidad de determinar el género y la especie de las bacterias aisladas de los exudados garrapatas (Hajek et al., 1996, Miranda-Miranda et al., 2010). Se hicieron pruebas de producción de quitinasa en presencia de quitina coloidal así como presencia de aflatoxinas en agar dextrosa Sabouraud. Se obtuvo el ADN genómico a partir de los cultivos bacterianos y micóticos utilizando un procedimiento comercial (Wizard Genomic, Promega USA), a partir de este ADN se hizo PCR utilizado iniciadores degenerados capaces de detectar los genes 16 ribosomales de diferentes bacterias (Ghebremedhin et al., 2008) y los genes ribosomales 18 S de diferentes hongos (Borneman y Hartin, 2000), los amplicones obtenidos fueron clonados en un plásmido comercial de secuenciación (TOPO T/A Invitrogen) y enviado a secuenciar al IBT-UNAM. Se hizo la comparación de la secuencias ribosomales de las bacterias y hongos aislados de de garrapatas con aquellas ya reportadas en el GENBANK mediante el algoritmo Blast disponible en línea en: www.ncbi.nih.gov. 399 Resultados Se colectaron 8500 hembras repletas de las cuales se identificaron 495 (5.8%) con infección producidas por S. Saprophyticus (Fig. 1) así como 510 mostrando señales de aspergilosis (Fig. 2). Estos exudados al ser examinados al microscopio mostraron numerosas coco-bacterias gram + de aproximadamente 1 µm de diámetro agrupadas en racimos (Fig. 1B). Los exudados y hemolinfa cultivados en medios bacterianos, produjeron numerosas colonias bacterianas y micóticas. Las pruebas bioquímicas y de morfología general indicaron que estas bacterias pertenecen al género Staphylococcus sp., y los hongos a el género Aspergillus sp. Las secuencias 16 S ribosomales obtenidos de estas bacterias y los 18 S de los hongos comparadas mediante el algoritmo BLAST identificaron un alineamiento significativo con Staphylococcus saprophyticus y Aspergillus flavus. El seguimiento estacional de la prevalencia de los patógenos sobre las garrapatas mostró que la máxima prevalencia para ambos microorganismos se observó en los meses de junio a septiembre (Fig. 2). A B Figura 1. Cambio de coloración y exudado sintomático de la infección bacteriana. A. Aspecto de garrapatas enfermas por infección bacteriana y/o micótica. B. aspecto de una infección bacteriana típica de las garrapatas repletas adultasdonde se observa la porción del hipostoma y poro genital totalmente cubiertos de un exudado semitransparente. Discusión y Conclusión Este trabajo describe dos enfermedades infecciosas de la garrapata del ganado, ambas enfermedades se presentan en sus fases tempranas como un cambio de coloración de la cutícula o un exudado discreto en el área del poro genital e hipostoma (Fig. 1B), que puede estar acompañado por crecimiento de micelio. Estos síntomas solo son evidentes en garrapatas repletas adultas enfermas y hasta este punto son indistinguibles de las garrapatas sanas. Las observaciones mencionadas motivaron a nuestro grupo de trabajo a tratar de aislar e identificar a los agentes etiológicos de estas enfermedades así como su incidencia natural estacional. Las tinciones de muestras de exudados y conidióforos analizadas demostraron que las bacterias pertenecían al género Staphylococcus sp., y los hongos se identificaron como representativos del género Aspergillus sp por lo que decidimos hacer la bacteriología, micología y taxonomía molecular 400 especializada en la identificación de especies de bacterias y hongos pertenecientes a esos géneros de microorganismos, mismas que demostraron que los cultivo bacterianos de exudados de garrapatas enfermas contienen S. Saprophyticus mientras que el hongo se identificó como A. flavus. Una vez identificados los patógenos se hizo posible hacer el seguimiento de la incidencia de estos patógenos naturales en R. microplus a lo largo de dos años, lo que ha permitido observar que la prevalencia es mayor durante los meses húmedos y cálidos mientras que la estación fría muestra las prevalencias más bajas (Fig. 2B). Acorde a la literatura, A. flavus es la especie de hongo con capacidad entomopatógena más reportada en la literatura científica, tiene la capacidad de infectar la cutícula de una gran variedad de artrópodos, debido a que libera diversas isozimas de quitinasas extracelulares capaces de perforar la cutícula de los artrópodos y alimentarse de la hemolinfa y órganos internos (St. Leger et al., 1993) mientras que las bacterias del género Staphylococcus sp son capaces de producir septicemia en el torrente circulatorio de los mamíferos, la garrapata del ganado ingurgitada es 90% sangre de bovino por lo que es posible aseverar que S. saprophyticus infecta la sangre del bovino y de paso a la garrapata misma ocasionándole la muerte antes de completar su ciclo. A B Figura 2. Crecimiento micelial en garrapatas con aspergillosis. A Posterior al cambio de coloración es posible observar crecimiento micelial cuyos conidióforos y pruebas bioquímicas identifican como A. flavus. B Existen variaciones estacionales que muestran las mayores prevalencias durante los meses cálidos y húmedos . Las observaciones realizadas durante el desarrollo de este trabajo en la cutícula de las garrapatas afectadas, corroboran que las hifas del hongo crecen al interior de la quitina lo que sugiere el efecto degradativo de las quitinasas sobre las cutículas de las garrapatas. Algunos estudios previos han demostrado que los hongos del género Aspergillus sp son capaces de producir naturalmente una enfermedad semejante a la aquí descrita en garrapatas del perro R. sanguineous (Estrada-Peña et al., 1992), aunque no queda claro si las garrapatas mueren por envenenamiento de aflatoxinas, lo que explicaría el cambio de coloración cuticular, o mueren por la infección misma a los órganos internos de la garrapata. Esto, sin duda será el tema de análisis experimental subsecuente. El presente estudio informa por primera vez un caso de aspergilosis natural letal en R. microplus y corrobora el potencial de Aspergillus sp previamente reportado en el control biológico de garrapatas pertenecientes al género Rhipicephalus sp incluyendo a la garrapata del 401 ganado. Consideramos que estos hallazgos, abren la puerta para desarrollar estudios destinados a aprovechar el potencial valor de Staphylococcus saprophyticus y Aspergillus flavus en el control biológico de la garrapata del ganado R. microplus. Agradecimientos. Este trabajo fue parcialmente financiado por SEP-CONACT (proyecto No. 103026) Literatura Citada Adejinmi, J. O. y A. B. Ayinmode. 2008. Transmission of Bacteria Isolates Through all the Developmental Stages of Dog Ticks (Bacteriological Evidence). Journal of Animal and Veterinary Advances. 7(8): 959-962. Amoo, A. O., Dipeolu, O. O., Akinboade, A.O. y A. Adeyemi. 1987. Bacterial isolation from and transmission by Boophilus decoloratus and Boophilus geigyi. Folia Parasitologica (Praha). 34: 69-74. Cossio-Bayugar, R., Miranda-Miranda, E., Narváez-Padilla, V., Olvera-Valenca, F. y E. Reynaud. 2012. Perturbation of tyraminergic/octopaminergic function inhibits oviposition in the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Journal of Insect Physiology. 58: 628–633. De Castro, J. J. 1997. Sustainable tick and tickborne disease control in livestock improvement in developing countries. Veterinary Parasitology. 71: 77-97. Estrada-Peña, A., González, J. y A. Casasolas. 1990. The activity of Aspergillus ochraceus (fungi) on replete females of Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) in natural and experimental conditions. Folia Parasitologica. 37: 331-336. Ghebremedhin, B., Layer, F., König, W., König, B. 2008. Genetic classification and distinguishing of Staphylococcus species based on different partial gap, 16S rRNA, hsp60, rpoB, sodA, and tuf gene sequences. Journal of Clinical Microbiology. 46(3):101925. Hájek, V., Meugnier, H., Bes, M., Brun, Y., Fiedler, F., Chmela, Z., Lasne, Y., Fleurette, J. y J. Freney. 1996. Staphylococcus saprophyticus subsp. bovis subsp. nov., isolated from bovine nostrils. International Journal of Systematic Microbiology. 46(3): 792-796. Miranda-Miranda, E., Cossio-Bayugar, R., Quezada-Delgado, M. D. R., Sachman-Ruiz, B, y E. Reynaud E. 2010. Staphylococcus saprophyticus is a pathogen of the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Biocontrol Science and Technology. 20: 10551067. Miranda-Miranda. E., Cossio-Bayugar, R., Martinez-Ibañez, F. y C. R. Bautista-Garfias. 2011. Megaselia scalaris reared on Rhipicephalus (Boophilus) microplus laboratory cultures. Medical and Veterinary Entomology. 25(3): 344-347. Miranda-Miranda. E., Cossio-Bayugar, R. y F. Martinez-Ibañez, 2012. Natural occurrence of lethal aspergillosis in the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae). Parasitology. 139:259-263. Nuñez, J. L., Muñoz Cobeñas, M. E. y H. L. Moltedo, 1995. Boophilus microplus.la garrapata común del ganado vacuno. Editorial Hemisferio Sur. pp1-14. St. Leger, R. J., Staples, R. C. y W. R. Donald. 1993. Entomopathogenic isolates of Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, and Aspergillus flavus produce multiple extracellular chitinase isozymes. Journal of Invertebrate Pathology. 61: 81-84. 402 ESTUDIO DE PATÓGENICIDAD DE CEPAS Y AISLADOS DE NEMATODOS ENTOMOPAGENOS CONTRA Scyphophorus acupunctatus (COLEOPTERA: CURCULIONIDAE) GYLLENHAL 1 Eva Judith Hueso-Guerrero, 1Jalil Fallad-Chávez, 1Jose Luis Sepúlveda-Torres, Juan Silva-Rúelas, Karen PiedraMollinedo, Conrado Miguel Rendón-Ramírez. 1Departamento de Producción Agrícola, Universidad de Guadalajara, Av.Independencia Nacional # 151, Autlán de Navarro, Jalisco, 48900, MEXICO. [email protected], [email protected], [email protected]. RESUMEN. Se evaluó la patogenicidad de dos cepas exóticas de nematodos entomopatógenos; Steinernema carpocapsae cepas All California y Florida y a cuatro aislados nativos del género Steinernema spp. contra larvas de Scyphophorus acupunctatus las cuales se inocularon en un gradiente de concentración 10, 20, 50, 100 y 500 infectivos juveniles. El experimento se realizó utilizando cajas de Petri en laboratorio. Se registró la mortalidad durante 120 horas. Las larvas muertas se colocaron en trampas de White para confirmar la presencia de nematodos entomopatógenos con la emergencia de infectivos juveniles. Los datos de la mortalidad se analizaron mediante un análisis de varianza. Las larvas de S. acupunctatus fueron susceptibles a todos los nematodos entomopatógenos evaluados. Los resultados de la evaluación de las cepas y aislados nativos sugieren que tienen potencial para utilizarse como alternativa de control contra las larvas de S. acupunctatus en plantas de Agave tequilana Weber var. azul. Palabras clave: Steinernemátidos, control biológico, picudo, biotecnología. Pathogenicity Study of strains and isolates entomopathogenic nematodes against Scyphophorus acupunctatus (Coleoptera: Curculionidae) Gyllenhal ABSTRACT. We evaluated the pathogenicity of exotic strains of entomopathogenic nematodes for Steinernema carpocapsae All California and Florida strains and to four native strains of genus Steinernema spp. against larvae of Scyphophorus acupunctatus which were inoculated in a concentration gradient of 10, 20, 50, 100 and 500 infective juveniles. The experiment was conducted in dishes of Petri in the laboratory conditions. Mortality was recorded for 120 hours. Dead larvae were placed in traps of White to confirm the presence of nematodes by the emergence of infective juveniles. An analysis of variance was performed for mortality data. The larvae of S. acupunctatus were susceptible to all entomopathogenic nematodes. The results of the evaluation of the native strains and isolates suggest that have potential to be used as an alternative control against larvae of S. acupunctatus on plants of Agave tequilana Weber var. Azul. Key words: Steinermatidae, biological control, Weevil, biotechnology. Introducción En el presente trabajo se estudió la patogenicidad del nematodo Steinernematidae sp., contra las larvas el picudo del agave Scyphophorus acupunctatus (Coleoptera: Curculionidae). Que son especies benéficas y se utilizan para el control de insectos plaga. Aunque algunas especies presentan una modesta virulencia (Gaugler, 1981). Los nematodos entomopatógenos (NEPs) steinernemátidos y heterorhabdítidos son patógenos obligados en condiciones naturales (Kaya y Gaugler, 1993; Smart, 1995) y se caracterizan por su asociación con una bacteria específica (Thomas y Poinar, 1979). Además por la capacidad de poseer quimiorreceptores, buscar activamente a su presa para liquidarlos rápidamente. Han sido considerados como agentes biológicos potenciales de muchos insectos plaga de importancia económica (Gaugler y Kaya, 1990; Kaya y Gaugler, 1993; Liu y Poinar, 2000). Debido a su especificidad hacia su hospedero, los NEPs no causan daños a los mamíferos, plantas y otros invertebrados que son diferentes a su hospedero (Akhurst y Boemare, 1990; Boemare et al., 1996). La mayoría de los insectos muertos por nematodos steinernemátidos se tornan de color café-amarillo. Los géneros de NEPs 403 Steinernema y Heterorhabditis son agentes biológicos para el control de Curculiónidos (Gaugler, 1993). Las plagas de picudos no son difíciles de controlar con insecticidas químicos pero este grupo de insectos es muy susceptible de ser controlado con NEPs ya que las larvas y pupas de “p ” m p b p Steinernema spp. Se ha comprobado que los NEPs en campo pueden sustituir a las aplicaciones de los insecticidas (Klein, 1990). Los aislamientos realizados con H. bacteriophora demuestran un 100% de control en larvas de picudos. Esta cepa muestra tolerancia a las bajas temperaturas de hasta 12 ºC. Materiales y Método Se colectaron plantas naturalmente infestadas con S. acupunctatus de un predio cultivado por la compañía Tequila Cuervo, S. A. de C. V. en el Municipio de Autlán de Navarro, Jalisco b N19º 43.735’ W104º 20.844’ v ó 886 m. . .m. Durante la colecta de las larvas de S. acupunctatus dentro de la piña de agave, se identificaron y separaron todas aquellas larvas muertas que presentaron la sintomatología de infestación natural por NEPs tales como color café o marrón obscuros, con cuerpo blando o que presentaron desechos gomosos por los orificios naturales. Las larvas se lavaron con agua destilada para desinfectarse y fueron trasferidas a trampas de White (1927). Los aislados obtenidos fueron nominados como Steinernema sp. AN1, Steinernema sp. AN2, Steinernema sp. AN3 y Steinernema sp. AN4, respectivamente. Los aislados se conservaron hasta su aplicación en larvas de S. acupunctatus y G. mellonella, siguiendo los procesos descritos por Woodring y Kaya (1988). El bioensayo tuvo como finalidad determinar la patogenicidad de los aislados de NEPs con diferentes concentraciones de JI de nematodos contra larvas de S. acupunctatus a (Hueso et al., 2006). Se infectaron las larvas de S. acupunctatus con NEPs y se aplicó un gradiente de seis concentraciones: 10, 20, 50, 100, 200 y 500 JI (Thurston, et al., 1993). Para cada concentración se formaron un grupo de 40 larvas colocadas individualmente en cajas de Petri (60 X 10 mm) sobre una capa de papel filtro (Whatman 1) y cada larva fue infectada con un mililitro de suspensión siguiendo la técnica descrita por Woodring y Kaya (1988). Las cajas de Petri con las larvas infectadas fueron colocadas en bolsa de plástico para mantener la humedad e incubadas en la obscuridad a una temperatura 25 ºC ± 1 ºC (Glazer y Navon, 1991; Glazer, 1992). Un grupo de 40 larvas fueron considerados testigo y se aplicó un mililitro de agua destilada estéril. Para conocer la evolución de la mortalidad de las larvas a través del tiempo se registró cada 24 horas durante un periodo de 120 horas (Epsky y Capinera, 1994). Las larvas muertas fueron removidas, examinadas y transferidas a las trampas de White para confirmar la presencia de NEPs (Woodring y Kaya, 1988). El análisis de varianza (ANOVA) fue realizado sobre el porcentaje de m p v f m ó √% p m (L m et al., 2000). Las medias fueron separadas usando la prueba de Tukey al 0.05 de probabilidad (SPSS, 2003). Resultados Los resultados de la evaluación de patogenicidad de los NEPs con diferentes concentraciones exhibieron una evolución en la mortalidad larvaria conforme incrementaba la concentración y el tiempo de exposición. La evolución del porcentaje mortalidad en cada nematodo en la concentración de 10 JI, se observa que a las 24 horas los aislados AN1 y AN2 muestran mortalidad de larvas, así también se observa en la cepa S. carpocapsae All (California). La prosperidad en la evolución de mortalidad se observó a las 48 horas en todos los nematodos 404 en un rango de 2.5% a 72.5% hasta llegar a las 120 horas. La cepa S. riobrave fue la que presentó el menor porcentaje de mortalidad después de cinco días (Cuadro 1). El análisis de varianza mostró diferencias significativas entre las cepas y aislados aplicados a las larvas de S. acupunctatus con respecto a la mortalidad acumulada a diferentes tiempos hasta 120 horas en las seis concentraciones. Cuadro 1. Evolución del porcentaje de mortalidad de larvas de S. acupunctatus infestadas con cuatro cepas y cuatro aislados de nematodos entomopatógenos con una concentración de 10 IJ por mL. CEPAS S. riobrave AN3 S. riobrave AN4 S. riobrave S. carpocapsae All (Florida) H. indica S. riobrave AN1 S. carpocapsae All (California) S. riobrave AN2 ANOVA CONCENTRACION DE 10 TIEMPO (horas) 24 48 72 96 120 0.0 b 22.5 abc 22.5 b 37.5 bc 37.5 bc 0.0 b 20.0 bc 20.0 b 32.5 bc 32.5 bc 0.0 b 2.5 d 2.5 c 2.5 e 5.0 e 0.0 b 42.5 a 58.0 a 70.0 a 72.5 a 0.0 b 10.0 c 10.0 b 10.0 d 12.5 de 2.5 ab 12.5 c 12.5 b 20.0 cd 20.0 cd 2.5 ab 15.0 bc 20.0 b 52.5 ab 57.5 ab 7.5 a 32.5 ab 55.0 a 70.0 a 70.0 a (F=3.000; (F=17.796; (F=28.405; (F=38.899; (F=30.974; gl=7, 31, gl=7, 31, P< gl=7, 31, gl=7, 31, gl=7, 31, P< 0.021) 0.000) P< 0.000) P< 0.000) P< 0.000) Los valores dentro de la columna, seguidos por la misma letra no son estadísticamente diferentes en base a la prueba de medias de Tukey al 0.05 de probabilidad. Se observa el progreso de la mortalidad en la concentración de 20 JI por nematodo. Hay un incremento en la mortalidad de cada cepa con respecto a la concentración. Sin embargo dos de los aislados nativos incrementaron la mortalidad a las 24 horas con respecto a la concentración, logrando 100% de mortalidad a las 96 horas el aislado AN2. La cepa S. carpocapsae se distingue a las 48 horas con 75% de mortalidad hasta un 92.5% a las 120 horas. Se observa que la cepa con menor porcentaje sigue siendo la cepa S. riobrave (Cuadro 2). Con respecto a la mortalidad registrada en la concentración de 50 JI. Se observa en Cuadro 3. Igual que en las concentraciones anteriores a las 48 horas la mortalidad se manifiesta en todos los nematodos. En este mismo tiempo la cepa S. carpocapsae All Florida y el aislado AN4, se distinguen por alcanzar el 72.5 y 87.5% respectivamente en mortalidad con respecto a la concentración. El aislado AN2 a las 72 horas muestra un 75% de mortalidad hasta un 85% a las 120 horas. El desarrollo en la evolución de mortalidad en la concentración de 100 JI muestras diferencias con respecto al comportamiento de mortalidad por nematodo. El aislado S. riobrave AN1 incrementa la mortalidad a las 24 horas hasta un 40% y progresa hasta el 85% a las 120 horas. Así también, a las 24 horas la cepa de H. indica obtiene un porcentaje de 22.5% de mortalidad similar al alcanzado a las 96 horas en la concentración de 50 JI por larva (Cuadro 3). Sin embargo, la cepa S. riobrave no muestra cambio en la mortalidad con respecto a la concentración ni al tiempo de exposición (Cuadro 4). 405 Cuadro 2. Evolución del porcentaje de mortalidad de larvas de S. acupunctatus infestadas con cuatro cepas y cuatro aislados de nematodos entomopatógenos con una concentración de 20 IJ por mililitro. CONCENTRACION DE 20 TIEMPO (horas) 48 72 96 15.0 de 15.0 d 25.0 d CEPAS S. riobrave AN3 24 0.0 b 120 40.0 d S. riobrave AN4 0.0 b 57.5 ab 65.0 ab 67.5 abc 70.0 bc S .riobrave 0.0 b 7.5 e 10.0 d 12.5 de 12.5 e (Florida) 0.0 b 75.0 a 85.0 a 87.5 ab 92.5 ab H. indica 0.0 b 0.0 f 0.0 e 7.5 e 17.5 e S. riobrave AN1 17.5 a 42.5 bc 45.0 bc 60.0 bc 60.0 cd (California) 0.0 b 22.5 cd 37.5 c 50.0 c 50.0 bc S. riobrave AN2 15.0 a 40.0 bc 85.0 a 100.0 a 100.0 a S carpocapsae All S.carpocapsae All (F=40.09 (F=50.68 (F=85.00 ANOVA 4; gl=7, (F=42.59 (F=106.54; 4; gl=7, 3; gl=7, 31, 8; gl=7, gl=7, 31, P< 31, P< 31, P< P< 31, P< 0.000) 0.000) 0.000) 0.000) 0.000) Los valores dentro de la columna, seguidos por la misma letra no son estadísticamente diferentes en base a la prueba de medias de Tukey al 0.05 de probabilidad. Cuadro 3. Evolución del porcentaje de mortalidad de larvas de S. acupunctatus infestadas con cuatro cepas y cuatro aislados de nematodos entomopatógenos con una concentración de 50 IJ por mililitro. CEPAS S. riobrave AN3 S. riobrave AN4 S. riobrave S. carpocapsae All (Florida) H. indica S. riobrave AN1 S. carpocapsae All (California) S. riobrave AN2 ANOVA 24 0.0 b 0.0 b 0.0 b 0.0 b 0.0 b 10.0 a CONCENTRACION DE 50 TIEMPO (horas) 48 72 96 22.5 b 32.5 cd 32.5 c 72.5 a 80.0 ab 87.5 a 2.5 c 10.0 e 12.5 d 87.5 a 95.0 a 97.5 a 7.5 c 15.0 de 27.5 cd 25.0 b 37.5 c 50.0 cd 120 47.5 d 90.0 ab 12.5 e 97.5 a 52.5 cd 55.0 bcd 2.5 b 22.5 b 42.5 bc 65.0 ab 65.0 abcd 12.5 a 37.5 b 75.0 ab 80.0 ab 85.0 abc (F=24.721; (F=41.790; (F=21.803; (F=26.150; (F=19.746; gl=7, 31, gl=7, 31, gl=7, 31, gl=7, 31, gl=7, 31, P< 0.000) P< 0.000) P< 0.000) P< 0.000) P< 0.000) Los valores dentro de la columna, seguidos por la misma letra no son estadísticamente diferentes en base a la prueba de medias de Tukey al 0.05 de probabilidad. 406 Cuadro 4. Evolución del porcentaje de mortalidad de larvas de S. acupunctatus infestadas con cuatro cepas y cuatro aislados de nematodos entomopatógenos con una concentración de 100 IJ por mililitro. CEPAS S. riobrave AN3 S. riobrave AN4 S. riobrave S. carpocapsae All (Florida) H. indica S. riobrave AN1 S. carpocapsae All (California) S. riobrave AN2 ANOVA 24 0.0 d 0.0 d 0.0 d 0.0 d 22.5 b 40.0 a CONCENTRACION DE 100 TIEMPO (horas) 48 72 96 7.5 d 7.5 d 70.0 c 75.0 ab 85.0 ab 90.0 ab 0.0 e 10.0 d 12.5 d 95.0 a 97.5 a 100.0 a 52.5 bc 62.5 bc 67.5 c 70.0 ab 75.0 abc 77.5 bc 120 75.0 b 95.0 a 12.5 c 100.0 a 72.5 b 85.0 ab 2.5 d 2.5 de 90.0 a 92.5 ab 100.0 a 10.0 c 37.5 c 57.5 c 70.0 c 75.0 b (F=75.512; (F=89.240; (F=83.511; (F=88.697; (F=91.767; gl=7, 31, gl=7, 31, gl=7, 31, gl=7, 31, gl=7, 31, P< 0.000) P< 0.000) P< 0.000) P< 0.000) P< 0.000) Los valores dentro de la columna, seguidos por la misma letra no son estadísticamente diferentes en base a la prueba de medias de Tukey al 0.05 de probabilidad. En tanto, la mortalidad registrada a las 24 horas de los nematodos en la concentración de 200 JI, se distingue el aislado AN1 con un 75% hasta alcanzar el 97.5% de mortalidad a las 96 horas. Sin embargo el nematodo S. carpocapsae All (Florida) a las 48 horas extermina casi el total de larvas, culminado el 100% de mortalidad a las 72 horas (Cuadro 5). 5 Cuadro 5. Evolución del porcentaje de mortalidad de larvas de S. acupunctatus infestadas con cuatro cepas y cuatro aislados de nematodos entomopatógenos con una concentración de 200 IJ por mililitro. CEPAS S. riobrave AN3 S. riobrave AN4 S. riobrave S. carpocapsae All (Florida) H. indica S. riobrave AN1 S. carpocapsae All (California) S. riobrave AN2 ANOVA 24 0.0 c 0.0 c 0.0 c CONCENTRACION DE 200 TIEMPO (horas) 48 72 96 42.5 b 57.5 cd 60.0 bc 67.5 ab 70.0 bc 90.0 a 2.5 c 12.5 f 17.5 d 120 67.5 bc 95.0 ab 17.5 d 0.0 c 17.5 b 75.0 a 97.5 a 42.5 b 95.0 a 100.0 a 57.5 c 97.5 ab 100.0 a 45.0 d 95.0 ab 100.0 a 47.5 c 97.5 a 2.5 c 10.0 c 92.5 ab 97.5 a 100.0 a 12.5 b 47.5 b 57.5 cd 77.5 ab 95.0 ab (F=93.478; (F=40.002; (F=37.258; (F=29.842; (F=29.427; gl=7, 31, gl=7, 31, gl=7, 31, gl=7, 31, gl=7, 31, P< 0.000) P< 0.000) P< 0.000) P< 0.000) P< 0.000) Los valores dentro de la columna, seguidos por la misma letra no son estadísticamente diferentes en base a la prueba de medias de Tukey al 0.05 de probabilidad. Los resultados de la evaluación de la concentración de 500 JI es similar a la anterior, el aislado AN1 alcanzó el 70% a las 24 horas. La cepa S. carpocapsae All (Florida), además del aislado AN4 mostraron arriba del 90% de mortalidad a las 48 horas. Sin embargo, a las 72 horas 407 S. carpocapsae All (Florida) al igual que el aislado AN2 alcanzaron a eliminar el 100% de larvas (Cuadro 6). Considerando los resultados de la evolución en la mortalidad de cada nematodo se seleccionaron aquellos que se mostraron más patógenos para realizar la evaluación de virulencia, descartando a los menos patógenos: S. riobrave, H. indica y AN3 (Cuadro 6). Cuadro 6. Evolución del porcentaje de mortalidad acumulada de larvas de S. acupunctatus infestadas con cuatro cepas y cuatro aislados de nematodos entomopatógenos a una concentración de 500 IJ por mililitro. CEPAS S. riobrave AN3 S. riobrave AN4 S. riobrave S. carpocapsae All (Florida) H. indica S. riobrave AN1 S. carpocapsae All (California) S. riobrave AN2 ANOVA 24 0.0 d 0.0 d 0.0 d CONCENTRACION DE 500 TIEMPO (horas) 48 72 96 20.0 c 25.0 b 67.5 b 95.0 a 97.5 a 97.5 a 0.0 d 12.5 c 15.0 d 120 87.5 a 97.5 a 17.5 c 0.0 d 7.5 c 70.0 a 97.5 a 35.0 c 90.0 ab 100.0 a 60.0 b 95.0 a 100.0 a 37.5 b 95.0 a 100.0 a 40.0 c 95.0 a 5.0 cd 5.0 d 95.0 a 97.5 a 100.0 a 35.0 b 65.0 b 100.0 a 100.0 a 100.0 a (F=56.044; (F=111.484; (F=86.084; (F=51.347; (F=53.188; gl=7, 31, gl=7, 31, P< gl=7, 31, gl=7, 31, gl=7, 31, P< 0.000) 0.000) P< 0.000) P< 0.000) P< 0.000) Los valores dentro de la columna, seguidos por la misma letra no son estadísticamente diferentes en base a la prueba de medias de Tukey al 0.05 de probabilidad. Agradecimientos Por los apoyos recibidos a COECYTJAL y la Universidad de Guadalajara. Literatura Citada Akhurst, R. J. y Boemare, N. E. (1990). Biology and taxonomy of Xenorhabdus. En R. Gaugler y Kaya, H. K. (Eds.), Entomopathogenic Nematodes in Biological Control (pp. 75-90). Boca Raton, Florida: CRC Press. Boemare, N. E., Laumond, C. y Mauleon, H. (1996). The Entomopathogenic nematode bacterium complex: biology, life cycle and vertebrate safety. Biocontrol Sci. Technol. 6: 33-34. Epsky, N. D. y Capinera, J. L. (1994). Invasion efficiency as measure of efficacy of the entomogenous nematode Steinernema carpocapsae (Rhabditida: Steinernematidae). J. Econ. Entomol, 87: 366-370. Gaugler, R. (1981). Biological control potential of Neoaplectanid nematodes. J. Nematol, 13: 241-249. Glazer, I. y Navon, A. (1991). Activity and persistence of entomoparasitic nematodes tested against Heliothis armigera (Lepidoptera: Noctuidae), J. Econ. Entomol, 83: 17951800. Glazer, I. (1992). Measures for evaluation of Entomopathogenic nematode infectivity to insects. En: Nematology from Molecule to Ecosystem (Gommers, F.J. y Mass, P. W. Th. ( Eds). (pp. 195-200), Invergowrie, Dundee: European Society of Nematologists. 408 Hopkinson, D. y Maseru, E. A. (1970). The Control of the Sisal weevil (Scyphophorus interstitialis Gyll. Curculionidae, Coleoptera) in Sisal in Tanzania. V-ways of reducing weevil attack. East African Agricultural and Forestry Journal. 35(3): 286-290. Kaya, H. K. y Gaugler, R. (1993). Entomopathogenic nematodes. Ann. Rev. Entomol, 38: 181206. Liu, J., y Poinar, G. O. Jr. (2000). Control of insect pest with Entomopathogenic nematodes: the impact of molecular biology and phylogenetic reconstruction. Ann Rev Entomol. 45: 287306. Lezama-Gutierrez, R., A. Trujillo-De la Luz, J. Molina-Ochoa, O. Rebolledo-Dominguez, A. R. Pescador, M. López-Edwards y M. Aluja. (2000). Virulence of Metarhizium anisopliae (Deuteromycotina: Hyphomycetes) on Anastrepha ludens (Diptera: Tephritidae): laboratory and Field Trials. J. Econ. Entomol. 93(4): 1080-1084. Smart, G. C Jr. (1995). Entomopathogenic nematodes for the biological control of insects. J. Nematol, 27: 529-534. Thomas, G. M., y Poinar Jr., G. O. (1979). Xenorhabdus gen. Nov., a genus of entomopathogenic, nematophilic bacteria of the family Entorobacteriaceae. Int. J. Syst. Bacteriol, 29: 352-360. Klein, M. G. (1990). Efficacy Against Soil-Inhabiting Insect Pests. En: Entomopathogenic Nematodos in Biological Control. Gaugler R. Kaya H. K. (Eds.). (pp. 195-210), Boca Raton, F. L: CRC Press. White, G. F. (1927). A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science, 66: 302-303. Woodring, J. L. y Kaya, H. K. (1988). Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Techniques. (Pp.13-16), Southern Cooperative Series Bulletin, 331, Fayeteville, Arkansas, E.U.A: 409 DEPREDACIÓN DE Pseliopus (HEMIPTERA: REDUVIIDAE) SOBRE Tetranychus urticae KOCH (ACARI: TETRANYCHIDAE) Sulpicio Vázquez-Baxcajay, Agustín Hernández-Juárez, Omegar Hernández-Bautista, Epifanio Castro-Del Ángel, Jerónimo Landeros-Flores y Salvador Ordaz-Silva. Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Departamento de Parasitología. Calzada Antonio Narro # 1923, Buenavista, Saltillo, Coahuila, México, CP 25315. [email protected] RESUMEN. Pselliopus sp. (Hemiptera: Reduviidae) ha sido muy poco investigado respecto a la depredación sobre alguna especie de artrópodo, por lo que se realizaron observaciones de la capacidad depredadora del primer instar de este género sobre hembras adultas del ácaro T. urticae bajo condiciones de laboratorio, colocando un ejemplar del depredador en cajas de Petri con ácaros como presa, observándose que el depredador consume un gran número de ácaros, esta información valiosa es útil para realizar posteriores estudios sobre su comportamiento de depredación donde se pueda evaluar su capacidad depredadora sobre diversas plagas de importancia económica. Palabras clave: Hemiptera, Reduviidae, Pselliopus, Depredación, Tetranychus urticae. Depredation of Pselliopus sp. (Hemiptera: Reduviidae) versus Tetranychus urticae Koch (Acari: Tetranychiidae) ABSTRACT. Pselliopus sp. (Hemiptera: Reduviidae) has been very little research regarding predation role on some species of arthropod, the predatory capacity of the first instar of this genera was observed versus T. urticae adult female under laboratory conditions. A first instar bug was placing in a petri dish with mite as a prey; predator consumed a large number of mites, this information is valuable for posterior studies over predator behavior where we can assessment their predatory capacity on some pests of economic importance. Key words: Hemiptera, Reduviidae, Pselliopus, Depredation, Tetranychus urticae. Introducción La familia Reduviidae en su mayoría son depredadores generalistas que se alimentan sobre una amplia variedad de presas (Miller, 1971) tales como insectos y otros artrópodos terrestres, para capturar su presa estos insectos se posan sobre la planta a la espera de la misma, capturándola con sus patas anteriores para de inmediato insertar su rostro y paralizarlas (Brailovsky et al., 2007), llegando a suprimir más de 18 plagas del orden Lepidoptera, Coleoptera y Hemiptera, tanto en laboratorio como en campo (Ambrose, 1999; Sahayaraj, 2003;2006); por su parte Sahayaraj y Sujatha (2011) mencionan que estos depredadores polífagos son poco específicos en la selección de la presa, sin embargo, sí podrían ser de utilidad para reducir el brote de muchas especies plaga incluyendo a los ácaros fitófagos, como es el caso del ácaro de dos manchas (Tetranychus urticae Koch) plaga muy importante para la agricultura en México que ataca al tomate (Lycopersicum esculentum Mill.), fresa (Fragaria vesca L.), papaya (Carica papaya L.), cítricos (Citrus sinensis Osb.), rosal (Rosa spp) y clavel (Dianthus caryophyllus L.) entre otros (Rodríguez, 2012); para buscar contrarrestar los daños producidos por estos en los cultivos agrícolas, por lo que Sahayaraj (2004, 2006) señala que podrían desempeñar un papel vital dentro de un programa de Manejo Integrado de Plagas (MIP). Dentro del contexto del MIP, uno de los componentes principales es el control biológico, donde los enemigos naturales (depredadores, parasitoides y patógenos) juegan un papel importante, la adaptación de esta estrategia ayuda a reducir el uso de insecticidas; lo que hace al control más económico, ecológico y socialmente aceptable (De Bach y Hagen, 1991), sin embargo, su valor como regulador de poblaciones de insectos plaga raramente ha sido 410 investigado, por lo que existe un interés por el descubrimiento de depredadores generalistas que no sean denso-dependientes para la búsqueda de su presa (Murdoch et al., 1985). Dentro de esta familia se encuentra el genero Pselliopus, el cual se caracteriza por tener en el hemiélitro una areola cuadrangular, el artejo rostral I es más corto que el II, y el fémur anterior es más corto que el posterior (Brailovsky y Barrera, 2004), y el primer segmento del labium más corto que el segundo (Slater y Baranowski, 1978) Desafortunadamente, el potencial biológico de este género no ha sido investigado en cuanto a su capacidad de depredación con ácaros fitófagos y en estudios de liberación a gran escala no existen reportes de su potencial como agente de control biológico. Por lo antes mencionado, se hicieron observaciones de la depredación de ninfas de primer instar de chinches del genero Pselliopus sobre hembras adultas del ácaro T. urticae en condiciones de laboratorio. Materiales y Método La presente investigación se realizó en la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN), en el laboratorio de Taxonomía de insectos del Departamento de Parasitología en Buenavista, Saltillo, Coahuila. Las especies que se utilizaron para el estudio de depredación fueron T. urticae como presa y Pselliopus sp., como depredador. La colonia de Tetranychus urticae se inició con material biológico colectado en huertas de manzano en Huachichil, Municipio de Arteaga, Coahuila. Los ácaros de campo fueron puestos en plantas de frijol para incrementar la colonia bajo condiciones controladas de invernadero (27±2°C; 70±5% H. R.). Para este trabajo se utilizaron solo hembras adultas. Las chinches depredadoras del genero Pselliopus fueron obtenidas directamente de campo en la Sierra de Álvarez, San Luis Potosí que constituye un área natural protegida (16,900 ha), y se b p 22° 00’ 22° 21’ 48” N m 100° 31’ 36” 100° 46’ 05” W (G í et al., 1999) Se colectaron masas de huevos (Fig. 1) y se trasladaron al Departamento de Parasitología, para su posterior eclosión; de las cuales se utilizaron ninfas de primer instar (recién emergidas para la realización de las observaciones). Figura 1. Masas de huevos de Pselliopus sp en campo. Se colocaron en cajas de Petri de diámetro de 5.5 cm un individuo depredador con ácaros de T. urticae como presa única bajo condiciones de laboratorio (25 ± 2 °C y60 ± 5 % H. R.) y 411 mediante un microscopio estereoscopio se realizaron las observaciones de la depredación cada ocho horas. Resultados y Discusión De acuerdo a las observaciones hechas en este trabajo podemos afirmar que el depredador Pselliopus sp., consume un gran número de ácaros de T. urticae, plaga importante en una diversidad de cultivos. Estas observaciones concuerdan con lo mencionado por Brailovsky y Barrera (2004), quienes indican que la mayoría de los redúvidos son depredadores de insectos y otros artrópodos terrestres, los cuales capturan con sus patas anteriores para de inmediato insertar el rostro y paralizarlos (Fig. 2), así como también es reportado en estudios realizados por Ambrose y Sahayaraj (1993); Sahayaraj y Ambrose (1994); Sahayaraj (1995); Sahayaraj y Ambrose (1995) Cogni et al., (2002); Claver y Ambrose (2002), quienes mencionan que la familia Reduviidae se caracteriza por ser depredadora y destacan que el tamaño del depredador en los primeros instares prefieren presas de tamaño pequeño y al aumentar de tamaño cambian sus preferencias a presas de mayor tamaño. Aunque en este trabajo solo se alimentó al depredador con Tetranychus urticae sin la oportunidad de darle preferencia hacia alguna otra presa, Foglar et al. (1990) mencionan que Macrolophus caliginosus (Hemiptera: Miridae) tiene efecto de depredación sobre T. urticae y al evaluar este mirido con el ácaro y el pulgón Myzus persicae tuvo mayor preferencia por este último, confirmando los resultados obtenidos por Fauvel et al. (1987). El presente trabajo aporta información valiosa concerniente a la capacidad de depredación de Pselliopus sp., durante las etapas tempranas de su ciclo de vida para regular poblaciones de ácaros plaga y además su importancia radica en el hecho de que no hay informes precedentes sobre la depredación de alguna especie de este género, aunque si bien se sabe que la familia Reduviidae es depredadora. Este resultado indica que el género Pselliopus puede ser una nueva opción en el control biológico de esta especie. Figura 2. Chinche de Pselliopus sp., depredando T. urticae 412 El presente trabajo constituye la primera observación de la depredación de los redúvidos consumiendo ácaros tetraniquidos; es importante hacer una identificación taxonómica de la especie en trabajos posteriores y también se precisa de la evaluación de su comportamiento depredador para establecer la estrategia de uso de sus características en el control biologico de ácaros fitófagos y plagas. Conclusión El género Pselliopus tiene la capacidad de alimentarse de T. urticae, y dado que no es conocido su hábito depredador sobre este grupo de organismos, la incipiente investigación de este organismo determinara si este es un posible candidato a agente de control biológico. Literatura Citada Ambrose, D. P. 1999. Assasin Bugs. Science publishers. Inc. Enfield New Hampshire: USA. 337 pp. Ambrose, D. P. and K. Sahayaraj. 1993. Predatory potential and stage preference of reduviid predator, Allaeocranum quadrisignatum (Reuter) on Dysdercus cingulatus Fabricius. J Biol. Cont.7: 12-14. Brailovsky, H. y E. Barrera. 2004. Especies nuevas de Pselliopus (Hemiptera: Heteroptera: Reduviidae: Harpactorinae) de México. Anales del Instituto de Biología. Universidad Nacional Autónoma de México Serie Zoología. 75 (1): 313-330. Brailovsky, H., Mariño R. y E. Barrera. 2007. Cinco especies nuevas de Pselliopus (Hemiptera: Heteroptera: Reduviidae: Harpactorinae: Harpactorini) para México. Revista Mexicana de Biodiversidad 78: 85-98. Claver, M. A, Ramasubbu G, Ravichandran B. and D. P. Ambrose.2002. Searching behaviour and functional response of Rhynocoris longifrons (Stål) (Heteroptera: Reduviidae), a key predator of pod sucking bug, Clavigralla gibbosa Spinola. Entomol. 27: 339-346. Cogni, R., Freitas A. V. L. and B. F. Amaral Filho. 2002, Influence of prey size on predation success by ZeluslongipesL. (Heteroptera: Reduviidae). J. App Entomol, 126: 74-78. De Bach, P. and D. Hagen. 1991. Biological control by natural enemies 2nd ed. Cambridge University Press, Cambridge. 440 pp. Fauvel, G., Malausa, J. C. and B. Kaspar.1987. Etude en laboratoire des principales caract6ristiques biologiques de Macrolophus caliginosus (Heteroptera: Miridae). Entomophaga. 32: 529-543 Foglar H., Malausa, J. C. and E. Wajnberg. 1990. The functional response and preference of Macrolophus caliginosus (Heteroptera: Miridae) for two of its prey: Myzus persicae and Tetranychus urticae. Entomophaga 35 (3): 465-474 Jeppson, L. K., H. M. Keifer and E. N. Baker. 1975. Mites injurious to economic plants. University of California Press. The Angeles, USA. 614 pp. Miller, N. C. E. 1971. The Biology of Heteroptera England. E. W. Casey Ltd. 2nd ed. 206 pp. Murdoch, W. W., Chesson, J. and Chesson, P. L. 1985. Biological control in theory and practice. American Nature. 135: 344-366. Rodriguez N. S. 2012. Importancia agrícola y económica de los ácaros. En: Ácaros de importancia agrícola. Estrada V. E., Acuña S. A. J., Chaires G. P.M., Equihua M. A. (Editores). Colegio de Postgraduados, México. Pp 98-108. 413 Sahayaraj, K. 1995. Bioefficacy and prey size suitability of Rhynocoris marginatus Fab. To Helicoverpa armigera Hubner of groundnut. Fres Envir Bul. 4: 270-278. Sahayaraj, K. 2003. Hunter reduviids in cotton bug control. Agrobios 1(12): 9 -11. Sahayaraj, K. 2004. Indian Insect Predators in Biological control. (Editor). Dayas Publication, New Delhi. 400 pp. Sahayaraj, K. 2006. Ecological adaptive featurs of Hunter Reduviids (Heteroptera: Reduviidae: Reduviinae) and their biological control In: Guptha, V. K. A. K. and Verma. 2006. (Eds). Perspective in animal ecology and reproduction. (Vol. 3). Daya Publishing House, New Delhi. Pp. 22-49. Sahayaraj, K. and D. P. Ambrose. 1994. Stage and host preference and functional response of a Reduviid predator Acanthspis pedestris Stal to four cotton pests. J Biol. Cont. 8: 23-26 Sahayaraj, K. and S. Sujatha. 2011. Temperature-Dependent Biology & Physiology Reduviids. Nova Science Publishers Inc. 146 pp. Sahayaraj, K. and D. P. Ambrose. 1995. Short term, functional response and stage preference of the reduviid predator Ectomocoris tibialis Distant to cotton stainer Dysdercus cingulatus Fab. Ger. J. App Zool. 81:219-225. Slater, J. A. and R. M. Baranowski. 1978. How to know the true bugs (Hemiptera-Heteroptera). Wm. C. Brown company publishers. Unites States of America. 256 pp. 414 EFECTO DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS SOBRE Ceraeochrysa valida y Eremochrysa punctinervis (NEUROPTERA: CHRYSOPIDAE) DEPREDADORES DE Diaphorina citri KUWAYAMA (HEMIPTERA: LIVIIDAE) EN MÉXICO Fátima Lizeth Gandarilla-Pacheco1, Isela Quintero-Zapata1, Raúl Rodríguez-Guerra2, Myriam Elías Santos1, Carlos Francisco Sandoval-Coronado1, Luis Jesús Galán-Wong1. 1Universidad Autónoma de Nuevo León, UANL, Facultad de Ciencias Biológicas, Av. Universidad S/N Ciudad Universitaria, San Nicolás de los Garza, Nuevo León, C.P. 66451. 2INIFAP, Campo Experimental General Terán. 67400 Gral. Terán, N.L., Méx. México. [email protected]. RESUMEN. Se realizaron bioensayos con Ceraeochrysa valida y Eremochrysa punctinervis, los cuales se han reportado como depredadores de Diaphorina citri, para evaluar el efecto de Beauveria bassiana y de Isaria fumosorosea que presentaron potencial para el control de ninfas y/o adultos de D. citri. En el ensayo con larvas de primer y segundo estadio de C. valida los tratamientos evaluados causaron una mortalidad promedio de hasta 35.70 % y en adultos de hasta 49.98 %. Respecto al ensayo con larvas de tercer estadio de E. punctinervis, los tratamientos evaluados causaron una mortalidad promedio de 10 % y en adultos de hasta 50 %. Los resultados obtenidos sugieren que los crisópidos fueron susceptibles a la infección por los hongos entomopatógenos evaluados. El presente trabajo proporciona bases para un empleo más seguro de los entomopatógenos en el control del psílido asiático de los cítricos en México. Palabras clave: Hongos entomopatógenos, Ceraeochrysa valida, Eremochrysa punctinervis. Effect of entomopathogenic fungi on Ceraeochrysa valida and Eremochrysa punctinervis (Neuroptera: Chrysopidae) predators of Diaphorina citri kuwayama (Hemiptera: Liviidae) in Mexico ABSTRACT. We conducted bioassays with Ceraeochrysa valida and Eremochrysa punctinervis, the which ones have been reported as predators of Diaphorina citri, to evaluate the effect of Beauveria bassiana and Isaria fumosorosea that showed potential for control of nymphs and / or adults of D. citri. In the experiment with larvae first and second stage of C. valida the evaluated treatments caused an average mortality of up to 35.70% and 49.98% in adults. Regarding third stage larvae of E. punctinervis, the evaluated treatments caused an average mortality of 10% and up to 50% in adults. The results suggest that the lacewings were susceptible to infection by entomopathogenic fungi. This work provides basis for the safer use of entomopathogens in controlling Asian citrus psyllid in Mexico. Key words: Entomopathogenic fungi, Ceraeochrysa valida, Eremochrysa punctinervis. Introducción Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) es considerada una de las plagas más devastadoras por ser el vector de Candidatus Liberibacter asiaticus una de los tres agentes bacterial “H b ” ( v é et al., 2006). Esta enfermedad es considerada como una de las más destructivas de los cítricos en el mundo, por la severidad de los síntomas, la rapidez con la que se dispersa y porque afecta a todas las especies comerciales de cítricos (National Research Council, 2010). En los últimos años se han redoblado esfuerzos a nivel mundial para establecer nuevas y mejores estrategias de control del vector; entre éstas se incluye el uso de control biológico, ya que el psílido está sujeto a varios niveles de este tipo de control en toda su distribución geográfica, principalmente por varias especies de depredadores de las familias Coccinellidae (Coleoptera), Chrysopidae (Neuroptera), Syrphidae (Diptera) , algunas especies de arañas, parasitoides como Tamarixia radiata (Waterston) y Diaphorencyrtus aligarhensis (Shafee, Alam y Agarwal) y en los últimos años, hongos entomopatógenos como Isaria fumosorosea Wize , Hirsutella citriformis Speare , Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. (Hall, 415 2008). En evaluaciones de hongos entomopatógenos contra D. citri se han obtenido resultados variables (Avery et al., 2009; Hoy et al., 2010; Stauderman et al., 2012). Para México, existen resultados promisorios de algunas cepas de hongos (Mellín-Rosas et al.,2009; Sánchez-González et al.,2011; Gandarilla-Pacheco et al., 2011); sin embargo, debido a que depredadores y parasitoides que afectan al psílido, pueden ser vulnerables a la infección por dichos entomopatógenos (Goettel et al., 1990), en el presente estudio se evaluó el efecto de aislados de B. bassiana y cepas de I. fumosorosea con potencial para el control de D. citri sobre larvas de primer y segundo estadio de C. valida y de tercer estadio de E. punctinervis que se han reportado como depredadores del psílido asiático de los cítricos. Materiales y Método Cría de insectos depredadores. La cría fue proporcionada por el Laboratorio de Investigación en Control Biológico del Campo Experimental General Terán, del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), con sede en General Terán, Nuevo León, México. Para los bioensayos se utilizaron los depredadores C. valida (Banks) y E. punctinervis (MacLachlan). Preparación de la suspensión de conidios. Para los bioensayos con insectos benéficos se seleccionaron los aislados HIB-2, HIB-3, HIB-4, HIB-5 de B. bassiana y las cepas Pfr-612 y Pfr114 de I. fumosorosea, las cuales fueron inoculadas en agar papa dextrosa (PDA) y se incubaron a 28ºC por 14 días. Posteriormente se realizaron suspensiones a una concentración de 1 x 108 conidios mL-1. Bioensayos con Ceraeochrysa valida y Eremochrysa punctinervis. Para evaluar la patogenicidad de las cepas de hongos entomopatógenos se utilizaron larvas de C. valida de primer y segundo estadio y de tercer estadio de E. punctinervis, los insectos fueron asperjados con suspensiones de conidios a una concentración de 1 x 108 de cada una de los aislados y/o cepas evaluados y se colocaron por separado en cajas petri de 10 x 15 mm. Se utilizaron catorce insectos por tratamiento, además de dos testigos, uno con Tween 80 al 0.1 % (v/v) y uno sin tratar. Todos los tratamientos fueron incubados a temperatura constante de 28±1ºC, y un fotoperiodo de 12:12 h (L: O). La mortalidad de los insectos fue evaluada durante 28 días. Resultados En el bioensayo con larvas de primer estadio de C. valida, los tratamientos evaluados causaron una mortalidad promedio de 7.14 - 35.70 % registrándose el valor mínimo para el aislado HIB-4 y el máximo para el aislado HIB-3, en pupas de 0-14.28%. Respecto a los adultos las mortalidades por causa de los tratamientos fueron de 14.28 - 49.98 % (Cuadro 1). En el bioensayo con larvas de segundo estadio de C. valida, los tratamientos evaluados causaron una mortalidad promedio de 0 - 35.70 % registrándose el valor mínimo para el aislado HIB-5 y el máximo para el aislado HIB-3, en pupas de 0 - 7.14 %. Respecto a los adultos las mortalidades por causa de los tratamientos fueron de 14.28 - 49.98 % (Cuadro 2). En el bioensayo con larvas de tercer estadio de E. punctinervis, los tratamientos evaluados causaron una mortalidad promedio de 0-10 %, en pupas de 0-100%, registrándose el valor mínimo para el aislado HIB-5 y el máximo para el aislado HIB-3. Respecto a los adultos las mortalidades por causa de los tratamientos fueron de 10 - 50 % (Cuadro 3). 416 Cuadro 1. Mortalidad promedio de Ceraeochrysa valida por aislados de B. bassiana (HIB-2, HIB-3, HIB-4 y HIB5) y cepas de I. fumosorosea (Pfr-612 y Pfr-114). * Mortalidad X (IC a 95 %) Tratamiento HIB-2 HIB-3 HIB-4 HIB-5 Pfr-612 Pfr-114 Testigo Tween 80 Testigo absoluto Larva 1 28.56 (26.49-30.63) 35.70 (33.50-37.90) 0 21.42 (19.54-23.00) 7.14 (5.97-8.31) 14.28 (12.68-15.88) 7.14 (5.97-8.31) 14.28 (12.68-15.88) Pupa 0 7.14 (5.97-8.31) 0 7.14 (5.97-8.31) 14.28 (12.68-15.88) 0 7.14 (5.97-8.31) 0 * Mortalidad es expresada en porcentaje (%) Adulto 42.84 (40.57-45.11) 14.28 (12.68-15.88) 42.84 (40.57-45.11) 35.70 (33.50-37.90) 14.28 (12.68-15.88) 49.98 (47.69-52.27) 28.56 (26.49-30.63) 35.70 (33.50-37.90) Cuadro 2. Mortalidad promedio de Ceraeochrysa valida por aislados de B. bassiana (HIB-2, HIB-3, HIB-4 y HIB5) y cepas de I. fumosorosea (Pfr-612 y Pfr-114). Tratamiento HIB-2 HIB-3 HIB-4 HIB-5 Pfr-612 Pfr-114 Testigo Tween 80 Testigo absoluto * Mortalidad X (IC a 95 %) Larva 2 7.14 (5.97-8.31) 35.70 (33.50-37.90) 7.14 (5.97-8.31) 0 21.42 (19.54-23.00) 7.14 (5.97-8.31) 0 0 Pupa 7.14 (5.97-8.31) 0 7.14 (5.97-8.31) 0 7.14 (5.97-8.31) 7.14 (5.97-8.31) 7.14 (5.97-8.31) 7.14 (5.97-8.31) * Mortalidad es expresada en porcentaje (%) Adulto 49.98 (47.69-52.27) 35.70 (33.50-37.90) 28.56 (26.49-30.63) 42.84 (40.57-45.11) 14.28 (12.68-15.88) 28.56 (26.49-30.63) 71.40 (69.33-73.47) 28.56 (26.49-30.63) Cuadro 3. Mortalidad promedio de Eremochrysa punctinervis por aislados de B. bassiana (HIB-2, HIB-3, HIB-4 y HIB-5) y cepas de I. fumosorosea (Pfr-612 y Pfr-114). Tratamiento HIB-2 HIB-3 HIB-4 HIB-5 Pfr-612 Pfr-114 Testigo Tween 80 Testigo absoluto * Mortalidad X (IC a 95 %) Larva 2 10 (7.63-12.37) 0 0 10 (7.63-12.37) 10 (7.63-12.37) 0 10 (7.63-12.37) 10 (7.63-12.37) * Mortalidad es expresada en porcentaje (%) Pupa 70 (66.36-73.64) 100 50 (46.04-53.96) 0 20 (16.84-23.16) 20 (16.84-23.16) 10 (7.63-12.37) 20 (16.84-23.16) Adulto 10 (7.63-12.37) 0 40 (36.12-43.88) 20 (16.84-23.16) 30 (26.37-33.63) 50 (46.04-53.96) 40 (36.12-43.88) 50 (46.04-53.96) Discusión En el presente trabajo las cepas y/o aislados de B. bassiana e I. fumosorosea que indujeron mayor mortalidad contra ninfas y/o adultos de D. citri en un estudio anterior (Gandarilla-Pacheco et al., 2011) se evaluaron sobre larvas de C. valida y E. punctinervis para determinar su efecto sobre estos depredadores de D. citri. 417 En contraste con B. bassiana y M. anisopliae (Zimmermann 2007a, b) existen pocas investigaciones de los efectos de las diferentes especies de Isaria sobre organismos benéficos noblanco. Goettel et al (1990) publicaron una lista de hospederos no blanco para Isaria farinosa, sin embargo I. fumosorosea no fue enlistada. Por otro lado, la mayoría de los experimentos sobre los efectos secundarios de I. fumosorosea sobre organismos benéficos no blanco están elaborados en conexión con el uso de este entomopatógeno como agente de control biológico y en general resultó compatible con varios organismos benéficos asociados a las plagas en las que fue evaluado este hongo (Zimmermann, 2008). En estudios anteriores, Chrysoperla carnea y Chrysoperla sinica (Neuroptera: Chrysopidae) dos importantes depredadores generalistas fueron enlistados por Smith (1993) como insectos hospederos de I. fumosorosea. Estos resultados coinciden con los obtenidos en el presente trabajo con Eremochrysa punctinervis donde se registraron valores de hasta 100 % de mortalidad en pupas y de hasta 50 % en adultos, mientras que para larvas de primer y segundo estadio de C. valida se registró una mortalidad de 35.70 % y de hasta 49.98 % en adultos. Estos resultados difieren notablemente con los reportados por Berlanga-Padilla y López-Arroyo (2006) quienes no reportaron mortalidad de larvas de segundo estadio de C. valida a una concentración de 1x 107 conidios mL-1, sin embargo, Butt et al. (1994) y James y Lighthart (1994) indican que la mortalidad depende de la concentración del hongo. El realizar evaluaciones de los hongos entomopatógenos que demuestren potencial para el control de D. citri sobre insectos no blanco o benéficos para determinar su inocuidad sobre ellos, proporcionará bases para una utilización más segura de estos entomopatógenos para el control del psílido ya que el objetivo final en la mayoría de los programas de manejo integrado de plagas de importancia económica es realizar la aplicación a nivel de campo. Agradecimientos La investigación fue apoyada con fondos provistos por el Proyecto PAICYT CN1008-11 y Proyecto FONSEC SAGARPA-CONACYT número 2009-108591. Se agradece la ayuda en varios aspectos de J.I. López Arroyo. Literatura Citada Avery, P. B., Hunter, W.B., Hall, D.G., Jackson, M.A., Powell, A. and M. Rogers. 2009. Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) infection and dissemination of the entomopathogenic fungus Isaria fumosorosea (Hypocreales: Cordycipitaceae) under laboratory conditions. Fla. Entomol. 92:608-618. Berlanga-Padilla, A. M. y J. I. López-Arroyo. 2006. Efecto de hongos entomopatógenos en depredadores del pulgón café de los cítricos (Homoptera: Aphididae) pp. 384-388. En: Memorias del XXIX Congreso Nacional de Control Biológico. Manzanillo, Colima, México. Bové, J .M. 2006. Huanglongbing: a destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. J. Plant Pathol. 88: 7–37. Butt, T. M., Ibrahim, L., Ball, B. V. and S. J.Clark. 1994. Pathogenicity of the entomogenous fungi Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana against crucifer pests and the honey bee. Biocontrol Sci. Technol. 4: 207-214 Gandarilla-Pacheco F. L., López-Arroyo, J. I., Quintero-Zapata, I., Rodríguez-Guerra, R. y C. F. Sandoval-Coronado. 2011. Bioensayos para la evaluación de Beauveria bassiana 418 (Balsamo) Vuillemin contra ninfas de Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae), pp: 135-140. En: Memorias XXXIV Congreso Nacional de Control Biológico. Elías-Santos M., Arévalo-Niño, K., Quintero-Zapata, I., Solís-Rojas, C., SandovalCoronado, C.F., Luna-Olvera, H.A., Pereyra-Alférez, B., Morales-Ramos, L. H., y Maldonado- Blanco M. G. (Eds.). Monterrey, N.L., México, UANL, FCB-IB. Goettel, M. S., Poprawski, T. J., Vandenberg, J. D., Li Z. and D.W. Roberts. 1990. Safety to non target invertebrates of fungal biocontrol agents, pp. 209-231. In: Laird, M., Lacey, L.A, and Davidson, E. W. (Eds.). Safety of microbial insecticides. CRC Press, Boca Raton, FL. Hall, D. G. 2008. Biological Control of Diaphorina citri. En: Resúmenes del I Taller Internacional sobre Huanglongbing de los cítricos (Candidatus Liberibacter spp.) y el psílido asiático de los cítricos (Diaphorina citri). Servicio Nacional De Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria-SAGARPA y Organización Norteamericana de Protección a las Plantas. Mayo 2008, Hermosillo, Son. Méx. Hoy, M. A., Singh, R. and M. Rogers. 2010. Evaluation of a novel isolate of Isaria fumosorosea for control of the Asian citrus psyllid Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae). Fla. Entomol. 93: 24-32. James, R. R. and B. Lighthart. 1994. Susceptibility of the convergent lady beetle (Coleoptera: Coccinellidae) to four entomogenous fungi. Environ. Entomol. 23:190-192. Mellín-Rosas, M. A., Hernández-Betancourt, I., Núñez-Camargo, M. y H. C. Arredondo-Bernal. 2011. Efectividad de hongos entomopatógenos en el control del psílido de los cítricos Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) en Colima, pp: 367-372. En: López-Arroyo, J.I. y González-Lauck V.W. (Comp.). Memoria 2do Simposio Nacional sobre Investigación para el Manejo del Psílido Asiático de los Cítricos y el Huanglongbing en México, Montecillo, Edo., de México, México. Centro Regional de Investigación del Noreste (CIRNE), Campo Experimental General Terán. National Research Council. 2010. Strategic Planning for the Florida Citrus Industry: Addressing Citrus Greening Disease. Washington, DC: The National Academies Press. Sánchez-González, J. A. y H. C. Arredondo-Bernal. 2009. Entomófagos asociados al psílido asiático de los cítricos Diaphorina citri Kuwayama en el estado de Colima, pp. 364-368. En: Zapata-Mata, R., Contreras-Sánchez, W. M., Granados-Berber, A. A. y ArriagaWeiss. S. L. (Eds.). Memorias del XXXII Congreso Nacional de Control Biológico. Villahermosa, Tabasco, México. Smith, P. 1993. Control of Bemisia tabaci and the potential of Paecilomyces fumosoroseus as a biopesticide. Biocontrol News and Information 14:71-78. Stauderman, K., Avery, P., Aristizábal, L. and S. Arthurs. 2012. Evaluation of Isaria fumosorosea (Hypocreales: Cordycipitaceae) for control of the Asian citrus psyllid, Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae). Biocontrol Sci. and Techn. 22:747-761. Zimmermann, G. 2007 a. Review on safety of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Beauveria brongniartii. Biocontrol Sci. Techn. 17: 553-596. Zimmermann, G. 2007 b. Review on Safety of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Biocontrol Sci. Techn. 17:879-920. Zimmermann, G. 2008. The entomopathogenic fungi Isaria farinosa (formerly Paecilomyces farinosus) and the Isaria fumosorosea species complex (formerly Paecilomyces fumosoroseus): biology, ecology and use in biological control Biocontrol Sci. Techn. 18: 865-901. 419 TOXICIDAD DE CIPERMETRINA Y DELTAMETRINA EN LARVAS DE Chrysoperla carnea (STEPHENS), (NEUROPTERA: CHRYSOPIDAE), EN APLICACIÓN TÓPICA EN CONDICIONES DE LABORATORIO Karla Escobedo-Quevedo1, Arturo Huerta-de la Peña1, y Patricia Ramírez-Carrasco1. Colegio de Postgraduados Campus Puebla. km 125.5 Carr. Fed. Méx-Pue. C.P. 72760. Puebla, Pue. México. [email protected]., [email protected]. RESUMEN. El manejo de insectos plaga en la actualidad considera insecticidas de menor toxicidad al ser humano y de menor impacto ambiental. La Cipermetrina y Deltametrina son insecticidas piretroides con estas características, aunque son tóxicos para peces y abejas. Con el propósito de evaluar la toxicidad de estos insecticidas sobre larvas de Chrysoperla carnea, se realizó este trabajo en condiciones de laboratorio. Las soluciones con insecticidas fueron diluidas en acetona y preparadas considerando las dosis máximas utilizadas en campo. Las soluciones con insecticida se aplicaron sobre la parte dorsal de cada larva (0.5 µl), utilizando una micropipeta. En cada tratamiento se realizaron 20 réplicas y se adicionó un testigo con acetona. La Cipermetrina resultó ser el insecticida de mayor toxicidad, ya que a las 24 horas la mortalidad fue de 90%, hasta llegar a un 95% a las 72 horas. La Deltametrina fue menos tóxica, con un 30% de mortalidad. Palabras clave: Efectos secundarios, insecticidas, piretroides, control biológico. Toxicity of Cypermethrin and Deltamethrin on Chrysoperla carnea (Stephens) Larvae, in topical application under laboratory conditions ABSTRACT. The Insect pest management currently considers the use of insecticides that are less toxic to humans and of low environmental impact. Cypermethrin and Deltamethrin are pyrethroid insecticides with these characteristics, but they are toxic to fish and bees. In order to evaluate the toxicity of these insecticides on the common green lacewing larvae Chrysoperla carnea, this study was performed under laboratory conditions. The insecticide solutions were diluted with acetone and prepared considering the maximum doses rate recommended on field. The insecticide solutions were applied upon dorsal area of each larvae (0.5 µl), using a micropipette. In each treatment 20 replicates were performed and a control with acetone was added. Cypermethrin was the most toxic insecticide, since after 24 hours the mortality rate was 90%, reaching 95% at 72 hours. Deltamethrin was less toxic, with a mortality rate of 30%. Key words: Side effects, insecticides, pyrethroids, biological control Introducción El manejo de insectos plaga en la agricultura ha ido evolucionando de manera significativa, del uso unilateral y excesivo de insecticidas de síntesis de alta toxicidad hacia la utilización de compuestos de mayor selectividad y de menor impacto ambiental. Esta evolución se ha dado debido a los efectos secundarios de los insecticidas utilizados como la contaminación ambiental, eliminación de fauna benéfica, resistencia de las especies plaga y casos de intoxicación en las personas que aplican estas sustancias químicas (Bernal et al. 2012). Las tendencias actuales en el manejo de insectos plaga en la agricultura consideran, entre otros, el Manejo Integrado de Plagas (MIP), concepto conocido desde hace varias décadas y que sigue siendo vigente, como una opción sustentable en la producción de alimentos inocuos para la población. En los programas MIP, se incorporan insecticidas biorracionales como los insecticidas naturales derivados de plantas como el nim y las piretrinas, entre otros. Así mismo, se utilizan insecticidas derivados de metabolitos de microorganismos como es el caso del Spinosad, que son productos de baja toxicidad para el humano y de bajo impacto ambiental. Otro método muy importante en el MIP, es el Control biológico, mediante el uso de especies parasitoides, depredadores y microorganismos entomopatógenos. En los últimos años, se han propuesto 420 sistemas de manejo integrado, donde se incorporan insecticidas biorracionales o de moderada toxicidad, que puedan ser compatibles con el Control Biológico de plagas, es decir, que tengan el menor efecto posible en los insectos benéficos (Nicholls, 2008). La Cipermetrina y Deltametrina, son insecticidas piretroides que poseen excelentes características debido a su rápido efecto de choque (Knock down) y a su baja toxicidad en mamíferos (Philogène et al. 2002). La Cipermetrina (Piretroide tipo II), es uno de los insecticidas de este grupo más utilizados por su efectividad contra insectos plaga de la agricultura (Fernández et al. 2007). Es moderadamente tóxico, según WHO para mamíferos y aves, pero altamente tóxico para organismos acuáticos, su medio de acción es de contacto y por ingestión que impide señales neuromusculares (Liñán, 1997). La Deltametrina, es un insecticida con actividad tóxica superior a las piretrinas naturales; actúa en dosis muy bajas, es poco residual y tiene cierta actividad repelente. Su modo de acción es por contacto e ingestión, en el interior del insecto afecta gravemente a su sistema nervioso provocando la muerte del organismo (Piazuelo et al. 2009). En lo que se refiere al Control Biológico, la crisopa (Chrysoperla carnea), representa sin duda uno de los más útiles aliados del agricultor en su lucha contra algunas especies plaga especialmente áfidos, cóccidos y aleuródidos, ya que depredan activamente sobre estos insectos (Aspock et al. 1980). C. carnea ha sido propuesta como especie relevante para realizar ensayos sobre efectos secundarios de los plaguicidas que quieren ser registrados en la Unión Europea para su uso en frutales (Barret et al. 1994), ya que tienen gran capacidad reproductiva, voracidad y elevada agresividad biológica. En el presente trabajo se evaluó la toxicidad de la Cipermetrina y Deltametrina, en aplicación tópica sobre larvas (L3) de C. carnea en condiciones de laboratorio, con el propósito de conocer su compatibilidad para ser utilizados de manera conjunta en programas de control integrado de plagas. Materiales y Método Cría de Chrysoperla carnea. Los insectos utilizados se obtuvieron de una cría que se mantiene en el laboratorio de Entomología del Colegio de Postgraduados Campus Puebla, en una cámara bioclimática visitable con las siguientes condiciones de temperatura, humedad y luz: 24°C ± 2 y H R 70% ± 5 y 16:8 horas luz/oscuridad. Los adultos de C. carnea fueron alimentados con la dieta artificial propuesta por Vogt et al. (2001) y las larvas se alimentaron con huevos de Sitotroga cerealella, que fueron adquiridos en un Centro de Reproducción de Organismos Benéficos. Insecticidas y dosis. Se evaluaron los insecticidas Cipermetrina y Deltametrina, a la máxima dosis comercial recomendada en campo, mostrada en la etiqueta de ambos envases. En ambos casos, la dosis recomendada fueron de 500 ml/100 litros de agua; por lo que se prepararon las cantidades de 0.5 ml de Cipermetrina/10 ml de acetona, y así mismo se realizó 0.5 ml de Deltametrina/10 ml de acetona por tratarse de aplicación tópica. Las soluciones preparadas de los insecticidas mencionadas anteriormente se aplicaron tópicamente 0.5µl sobre la parte dorsal de cada larva de tercer estadio de C. carnea, utilizando una micropipeta marca eppendorf® calibrada y esterilizada previamente. En cada tratamiento se realizaron 20 réplicas; así mismo, se incluyó un testigo, en el que solo se aplicó 0.5µl de acetona sin insecticida. Una vez que cada larva (réplica) fue tratada, se aisló en una caja petri de plástico y se le agregó alimento (huevos de Sitotroga cerealella). La variable evaluada fue la mortalidad de larvas a las 24, 48 y 72 horas, 421 después de la aplicación de los tratamientos, en caso de que sobrevivieran las larvas, se continuaría evaluando su desarrollo hasta llegar al estado adulto. Análisis estadístico. Se utilizó un diseño completamente al azar y los datos fueron sometidos a un análisis de varianza y una prueba de medias de Tukey, mediante el Programa Statgraphics V. 4.0. Resultados y Discusión La Cipermetrina y Deltametrina mostraron efectos tóxicos sobre larvas de tercer estadio de C. carnea aplicados de manera tópica, encontrándose diferencias significativas entre estas y el testigo. La mortalidad de larvas en el testigo a las 24 horas fue del 0%, mientras que el tratamiento con Cipermetrina fue del 90% en este mismo período de tiempo; en el caso de la Deltametrina, la mortalidad de larvas a las 24 horas fue del 30% (Cuadro 1). Cuadro 1. Mortalidad de larvas (L3) de Chrysoperla carnea, tratadas con Cipermetrina y Deltametrina en aplicación tópica en condiciones de laboratorio. Mortalidad % ± E.E. Tratamiento 24 horas 48 horas 72 horas Control 0% ± 0.00 a 0 % ± 0.00 a 0 % ± 0.00 a Cipermetrina 90% ± 0.068 b 90 % ± 0.068 b 95 % ± 0.05 b Deltametrina 30% ± 0.100 c 30 % ± 0.10 35% ± 0.10 c c *Letras iguales dentro de la misma columna muestran que no hubo diferencia estadística entre tratamientos. A las 48 horas de la aplicación de los tratamientos, la mortalidad de larvas (L3) de C. carnea tratadas con Cipermetrina continuó siendo del 90%, incrementándose a 95% a las 72 horas. En el tratamiento con Deltametrina, la mortalidad de larvas permaneció en 30% a las 48 horas y se incrementó a las 72 horas a un 35%. En el testigo, la mortalidad se mantuvo constante y fue del 0% a las 24, 48 y 72 horas. La Cipermetrina es un insecticida que ha mostrado ser tóxico para diferentes estadios de C. carnea y por diferentes medios de exposición; por ejemplo, en tratamiento residual, se ha observado hasta un 90% de mortalidad a las 72 horas (Huerta et al. 2012). En el caso de C. externa, se trataron huevos por el método de inmersión, encontrándose una mortalidad de estos entre un 96 y un 100% (Rimoldi et al. 2008). En el caso de la Deltametrina, se ha observado que es menos tóxica que la Cipermetrina, ya que Poletti y Omoto (2012), encontraron un 30% de mortalidad de larvas de C. carnea tratadas tópicamente. De acuerdo a la clasificación de toxicidad de los plaguicidas según la OILB, por sus efectos sobre los enemigos naturales en condiciones de laboratorio, la Cipermetrina quedaría ubicada en la categoría III, la cual es moderadamente tóxica, mientras que la Deltametrina estaría ubicada en la categoría II siendo ésta ligeramente tóxica (Cuadro 2). En el presente trabajo, aunque se observó alta toxicidad sobre todo en el caso de la Cipermetrina, es importante mencionar que de acuerdo con la metodología propuesta por la OILB, es necesario realizar este tipo de ensayos en condiciones de semicampo y si aún se observa alta toxicidad, entonces se llevaría el mismo experimento a condiciones de campo, ya que como sabemos, en estos trabajos de laboratorio, las larvas de C. carnea son tratadas en las condiciones menos favorables para el insecto, por lo que se esperaría menor toxicidad a nivel de semicampo y 422 campo por las condiciones naturales que intervienen y debido a que las larvas tendrían condiciones menos restrictivas, pudiéndose desplazar a zonas o partes de la planta de menor contaminación. Cuadro 2. Análisis del nivel de toxicidad de la Cipermetrina y Deltametrina sobre larvas (L3) de Chrysoperla carnea en aplicación tópica, según la clasificación de la OILB. Reducción de Mortalidad (%) respecto al testigo Categoría OILB** ≤ 30 30-70 80-99 Semicampo y campo ≤ 25 25-50 51-75 1 2 3 ≥ 99 ≥ 75 4 Laboratorio * Mortalidad de larvas (%) respecto al testigo en aplicación tópica en laboratorio. Cipermetrina Inocuo Ligeramente tóxico Moderadamente tóxico Tóxico 90-95 Deltametrina 30-35 *Resultados obtenidos en el presente ensayo en condiciones de laboratorio. ** Organización Internacional de lucha biológica. Conclusiones La Cipermetrina y Deltametrina resultaron ser moderadamente y ligeramente tóxicas respectivamente, en aplicación tópica sobre larvas de tercer estadio de Crysoperla carnea, en condiciones de laboratorio. Los niveles de toxicidad de estos dos insecticidas deben ser evaluados en condiciones de semicampo y campo, ya que por lo general se ha observado una disminución importante en la toxicidad bajo estas condiciones y con esto poder concluir su compatibilidad con C. carnea. Agradecimientos Al Colegio de Postgraduados Campus Puebla, a la Línea prioritaria de investigación LPI 10 y LPI 7. Por financiar el presente trabajo de investigación. Literatura Citada Aspock, H., Aspock, U., Holzel, H. 1980. Die Neuropteren Europas. Goecke & Evers, Krefeld, Vol. 1: 495. Bernal, G. M., Jara, D. A., Santos, B. A., Zavala, V. J. 2012. Contaminación por plaguicidas. EN Agricultura y Contaminación del agua. UNAM. Capitulo VIII pp. 173. Barret, K. L., Grandy, N., Harrison, E. G., Hassan, S., y Oomen, P. 1994. Guidance document on regulatory testing procedures for pesticides with non-target arthropods. 51 pp. Fernández, V. C., Morala L., Paggi J. S. B. 2007. Evaluación de los efectos de la Cipermetrina (Piretroide) sobre el plancton en microcosmos. Revista FABICIB, 11: 11-27 Huerta-de la Peña A., E. M. Martinez-Méndez., P. Ramirez-Carrasco., A. L. Chacón-Aguayo., P. Chávez-Pérez., M.M. Llamas-Peña. 2012. Toxicidad de los insecticidas: Spinosad, Malation, Dicofol y Cipermetrina, sobre huevos y larvas (L2) de Chrysoperla carnea (Stephens) en condiciones de laboratorio. EN: Entomología mexicana. Vol. 11(1). 423 Armando Equihua Martínez, Edith G. Estrada Venegas, Jesús A. Acuña Soto, M. Patricia Chaires Grijalba y Guadalupe Durán Ramírez. Liñán, V. C. 1997. Farmacología vegetal. Compendium de las sustancias activas, insectos y ácaros utilizados en la prevención y control de plagas, enfermedades y plantas no deseadas así como en la regulación de la fisiología de los vegetales cultivados. Ediciones Agrotécnicas. Madrid. Nicholls, E. C. I. 2008. Control biológico de insectos: Un enfoque agroecológico. Ciencia y Tecnología. Primera edición. Editorial Universidad de Antioquia. Disponible en: http://globalalternatives.org/files/Control%20biologico%20de%20insectos,%20un%20enf oque%20agroecolgico.pdf Piazuelo, R. M. M., Ramírez J. G. I., González O. R. 2009. Resistencia a deltametrina de cepas de Blattella germanica (Dictyoptera: Blattellidae) en la ciudad de Cali, Colombia. Cubana Médica Tropical. 61 (3): 213-219. Philogene, B. J. R., Regnault-Roger C., Vincent C. 2002. Produits phytosanitaires insecticides d´origine végétale: promesses d´hier et d´aujourd´hui. EN: Regnault-Roger, C., Philogène, B.J.R., Vincent, C. (Eds.), Biopesticides d´origine végétale. Tec&Doc Editions, London, UK: 2-17. Poletti, M., Omoto C. 2012. Susceptibility to deltamethrin in the predatory mites Neoseiulus californicus and Phytoseiulus macropilis (Acari: Phytoseiidae) populations in protected ornamental crops in Brazil. Experimental and Applied Acarology. 58(4): 385-393. Rimoldi, F., Schneider I. M., Ronco E. A.2008. Susceptibility of Chrysoperla externa Eggs (Neuroptera: Chrisopidae) to conventional and biorational insectivides. Environmental Entomology. 37 (5): 1252-1257. Rosenheim, A. J., Limburg D. D., Colfer R. 1999. Impact of generalist predators on a biological control agent, Chrysoperla carnea: Direct observations. Ecological Applications. 9(2): 409-417. Vogt, H., Viñuela E. 2001. Effects of pesticides on lacewings in the crop environment. MCEWEN, P., NEW, T.R., WHITTINGTON, A.E. (Eds.). Cambridge University Press. UK. pp. 357-365. 424 PARASITOIDES ASOCIADOS A CHINCHES APESTOSAS (HEMIPTERA: PENTATOMIDAE) EN MÉXICO Alejandro González-Hernández1, María de Lourdes Ramírez-Ahuja1 y José Isabel López-Arroyo2. Facultad de Ciencias Biológicas de la Univ. Autónoma de Nuevo León. Pedro de Alba y Manuel L. Barragán s/n Cd. Universitaria San Nicolás de los Garza N.L. C.P. 66451 1. Campo Experimental General Terán-CIRNE-INIFAP, Km 31 Carr. Montemorelos-China. Gral. Terán, N.L. México C.P. 674002. [email protected], [email protected], [email protected] RESUMEN. La chinche apestosa café marmoleada, Halyomorpha halys Stál (Hemiptera: Pentatomidae) se ha convertido en una importante plaga agrícola en Estados Unidos de América, debido a su capacidad de invadir diversas áreas cultivadas y urbanas, y que por su diseminación, México se encuentra bajo riesgo de ser invadido por este insecto en un plazo corto. El presente estudio se realizó para identificar las especies de parasitoides asociadas a especies de pentatómidos, chinches apestosas (Hemiptera: Pentatomidae) en Estados Unidos de América y México, para conocer enemigos naturales potenciales de dicha plaga en el país que pudiesen ser aprovechados en programas de control biológico. Para esto, se revisó material depositado en el Instituto Smithsonian, en Washington D.C., la Academia de Ciencias de California, la Univ. de California Berkeley y la Colección de Insectos Benéficos Entomófagos-UANL. Se observaron 162 registros de 36 especies de parasitoides de huevos en cuatro familias de Hymenoptera: Scelionidae, Encyrtidae, Eupelmidae y Eurytomidae asociadas a 35 especies de Pentatomidae. Scelionidae presentó mayor número de especies que parasitan pentatómidos; sin embargo, se carece de registros de parasitoides asociados directamente a H. halys. Palabras clave: Pentatomidae, parasitoides, Halyomorpha halys Parasitoids associated to stink bugs (Hemiptera: Pentatomidae) in México ABSTRACT. The Brown marmorated stink bug, Halyomorpha halys Stál (Hemiptera: Pentatomidae) has become a major agricultural pest in the United States of America, due to its ability to invade various crop settings and urban areas. As its dissemination in the USA is occurring very fast, Mexico is under a pest invasion risk in the short term. We conducted this study to identify the species of parasitoids associated to Pentatomidae in Mexico and the USA; the goal was to determine natural enemies for the pest in the country with potential for its use in biological control programs. We reviewed the material deposited in the Smithsonian Institute in Washington DC, the California Academy of Sciences, the University of California Berkeley and the Coleccion de Insectos Benéficos Entomófagos UANL. There were 162 records of 36 species of egg parasitoids of four families of Hymenoptera: Scelionidae, Encyrtidae, Eurytomidae and Eupelmidae associated to 35 species of Pentatomidae. Scelionidae presented the highest number of species that parasitize pentatomids; however, no record of parasitoids directly associated to H. halys was found. Key words: Pentatomidae, parasitoids, Halyomorpha halys Introducción La chinche apestosa café marmoleada (Halyomorpha halys Stál) es una especie nativa de Asia, perteneciente a la familia Pentatomidae (Hemiptera) y es conocida como una plaga agrícola en su país de origen; se introdujo, aparentemente por accidente en el este de Pennsylvania, E.U.A. Fue notada por primera vez en septiembre del 1998 en Allentown. En septiembre de 2010 esta especie ya había sido registrada en 37 condados de diferentes estados en Estados Unidos de América. Recientemente, H. halys se ha convertido en una plaga grave de frutas, vegetales y cultivos agrícolas en la región del Este medio y debido a su rápida capacidad de dispersión es probable que afecte estos productos en otras áreas en los Estados Unidos de América y México. Además de causar daños a los cultivos, esta especie es molesta tanto dentro como fuera de casas y edificios cuando busca sitios para hibernar. Existe gran preocupación debido a los daños que ocasiona esta chinche. La plaga se ha tratado de controlar con insecticidas; sin embargo, los costos se han elevado enormemente y los productores se basan en materiales que están 425 programadas para cancelación; el manejo actual de la plaga ha sido insuficiente por la necesidad de insecticidas de amplio espectro (Nielsen et al., 2008; Leskey et al., 2012). Entre los enemigos naturales de H. halys, en China se encuentran: Trissolcus flavipes Thomon, Telenomus mitsukurii (Ashmead), Telenomus sp., y Anastatus sp. (Guo y Jun, 2007) Cincuenta y siete especies entre dos familias de Díptera y cinco familias de Himenóptera son registradas parasitando Nezara viridula en el mundo (Walker 1988). En México se reportan varias especies de moscas taquínidas que parasitan ninfas y adultos de chinches como Trichopoda nr. indivisa y Phasia sp., que parasitan Brochymena sulcata; Euthera tentatrix que parasita Euschistus servus; Cylindromyia sp. y Trichopoda sp. que parasitan Chlorochroa ligata (Tarango et al. 2003). Debido a la gran capacidad de H. halys para invadir diversas áreas, el objetivo de este trabajo fue identificar las especies parasitoides registradas en chinches apestosas de Pentatomidae en México. Materiales y Método Se revisaron especímenes parasitoides depositados en la Colección de Insectos Benéficos Entomófagos CIBE en México. Además, se revisó el material depositado en tres colecciones de Estados Unidos de América: el Instituto Smithsonian (IS) en Washington D.C., la Academia de Ciencias de California (CAS) y la Universidad de California Berkeley (UCB). En CIBE-UANL se determinaron los especímenes cuya información curatorial se asoció a pentatómidos, realizando una identificación temporal de especies con claves de Johnson (1983), Gates (2008), Gibson et al (1997) e información de hospederos de Walker (1988); posteriormente, algunas especies fueron corroboradas por especialistas. Se tomaron registros de parasitoides asociados a pentatómidos de las colecciones CAS, IS y UCB. Resultados y Discusión Se observó un total de 162 registros de 36 especies de parasitoides de huevos incluidos en ocho géneros, de cuatro familias de Hymenoptera: Scelionidae, Encyrtidae, Eupelmidae y Eurytomidae, asociadas a 35 especies de Pentatomidae: 1 Acrosternum hilare, 2 Apateticus bracteatus, 3 Apateticus nigrolimbatus, 4 Archimecus antenatus, 5 Banasa dimidiata, 6 Brochymena annulata?, 7 Brochymena caudripustulata, 8 Brochymena sp., 9 Brochymena sulcata, 10 Chlorochroa sayii, 11 Clorochroa ligata, 12 Cosmopepla bimaculatus, 13 Cosmopepla carinatus, 14 Dinocoris macraspis ?, 15 Edessa bifida, 16 Edessa reticulata, 17 Euschistus conspersus, 18 Euschistus impectiventris, 19 Euschistus servus, 20 Euschistus sp, 21 Loxa flavicollis, 22 Murgantia histrionica, 23 Nezara stictica, 24 Nezara viridula, 25 Nezara? Sp., 26 Oebalus pugnax, 27 Pentatoma sayii, 28 Pentatómido, 29 Peribalus limbolarius, 30 Perillus sp., 31 Podisus maculiventris, 32 Podisus serieventris, 33 Tetyra bipunctata, 34 Thyanta custator, 35 Thyanta sp. (Cuadro 1). Cuatro de las familias mencionadas por Walker (1988) coinciden con este trabajo con excepción de la familia Pteromalidae. La familia Scelionidae presentó mayor número de especies siendo el género Trissolcus el que presentó el mayor número de especies que parasitan Pentatomidae. Se observó en la mayoría de especies una posible especificidad de hospedero, sin embargo, las especies Trissolcus euschisti y T. utahensis muestran varios hospederos, en esta revisión no se encontraron especímenes de parasitoides asociados directamente a Halyomorpha halys. 426 Cuadro 1. Parasitoides asociados a huevos de chinches apestosas (Hemiptera: Pentatomidae). FAMILIA / ESPECIE Scelionidae Gryon myrmecophilum (Ashmead) G. obesum Masner G. parkeri (Fouts) G. pensylvanicum (Ahsmead) Psix tunetanus (Mineo & Szabó) Telenomus cristatus Johnson T. electus? T. goliathus Johnson T. meridionalis Ahsmead T. persimilis Ahsmead T. podisi Ahsmead T. smithi Ahsmead Trissolcus ashmeadi (Morrill) T. basalis (Wollaston) T. brochymenae (Ashmead) T. edessae Fouts T. erugatus Johnson T. euschisti (Ashmead) HOSPEDERO 28 35 28 28 28 28 28 28 14, 28 28 10, 12, 13, 17, 18, 19, 20, 25, 27, 28, 29, 31, 34 28 28 24 1, 22, 24, 28 1, 15 34 1, 5, 7, 20, 22, 26, 28, 30, 31, 33 T. hullensis (Harrington) 2, 28 T. murgantiae Ashmead T. occiduus Johnson T. radix Johnson T. solocis Johnson T. thyantae Ashmead T. utahensis (Ahsmead) 22 27 28 28 20, 24 10, 11, 18, 27 28, 35 Encyrtidae Ooencyrtus anasae (Ahsmead) O. californicus Girault O. johnsoni (Howard) O. nr. Johnsoni Eupelmidae Anastatus ashmeadi (Melander & Brues) 20, 28 10 10, 22, 28, 31, 35 22 28 427 DISTRIBUCIÓN USA MÉXICO Arz Ca., La. Fla. Ca. Tenn. Ca., Fla., Md.,Kns., Oh., S.C., Tenn., Tx Fla., La, SC. Ark., Fla., Kns., La., N.C., Miss., Va. La., Kns. Ca. Ca., D.C.. Fla., Ga., Md., Mich., La., S.C., Va. Mon. Ca. Ca., N.M. Ga., Md. Ca., N.M., Tx., Utah N.Y., Tenn. Tx. Ariz., Ca, Mo. Nc., Tenn. N.L., Tam. Chih., N.L. Coah., N.L. Tam. Ver. Chih. Mex. B.C., B.C.S., Mor., Tam. Mex. Chih. Tam. Coah., N.L., Tam., Ver. N.L. Coah., Chih., N.L. Coah., N.L., Tam. Coah. Coah. S.L.P. QRoo Cuadro 1 Continuación FAMILIA / ESPECIE A. floridanus Roth & Willis A. mirabilis (Walsh& Riley) A. pearsalli Ashmead A. reduvii (Howard) Eurytomidae Neorileya ashmeadii Crawford N. flavipes Ashmead HOSPEDERO 28 28 6 4, 5, 7, 8, 9, 21, 23 28 16 DISTRIBUCIÓN USA MÉXICO QRoo Md. QRoo D.C. Fla., Oh., Wis., N.L., Chih. Ill., Chih., Pue. Chis., N.L. Ver. En caso de una invasión de México por H. halys, se espera que el impacto sea menor ante la riqueza y diversidad de grupos de parasitoides que ocurren en el país, ya que varias de las especies registradas que atacan pentatómidos en Estados Unidos también se registraron para México. Es importante destacar la aparente similitud morfológica de B. quadripustulata y H. halys por lo cual sería importante verificar similitudes bioecológicas, abriendo la posibilidad que especies de parasitoides nativos de Brochymena sean utilizadas en la regulación de la especie invasora en México; por ejemplo, Brochymena quadripustulata y B. sulcata son especies de chinches apestosas muy comunes en nogal y en áreas urbanas del Norte y Noreste de México, donde son reguladas en forma natural por Trissolcus euschisti (Tarango et. al. 2003) y Neorileya flavipes y Anastatus reduvii (González 1979). Agradecimientos Al Instituto Inter Americano para la Cooperación en Agricultura (IICA-PROCINORTE) por su apoyo en la realización de este trabajo. A los curadores y especialistas por su ayuda en la revisión de las colecciones Dr. Matthew Buffington (ARS.USDA-IS), Dr. W. Polawski y Dr. Norm Penny (CAS), Dr. Robert Zuparco (CAS-UCB), y Peter Oboyski (UCB). Literatura Citada Gates, M. W. 2008. Species Revision and Generic Systematics of World Releyinae (Hymenoptera: Eurytomidae). University of California Publications in Entomology, Volume 127. University of California Press Berkeley and Los Angeles, California. 332 pp. Gibson, G. A. P., J. T. Huber, and J. B. Woolley (Editors). 1997. Annotated Keys to the Genera of Nearctic Chalcidoidea (Hymenoptera). NRC Research Press, Ottawa, Ontario, Canada. 794 p. González-Hernández, A. 1979. Parasitismo de los Huevecillos de Chinches Apestosas (Hemiptera: Pentatomidae) en la zona central del Estado de Nuevo León, México. Agricultura Tropical 1 (3): 256-263. Guo-Yue, Y., Z. Jun-Ming. 2007. The Brown-marmorated Stink Bug, Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae), pp. 58-62 In: International Workshop on Biological Control of Invasive Species of Forests. Beijing, P.R. China. 428 Johnson, N. F. 1984. Revision of the Nearctic species of the Trissolcus flavipes group (Hymenoptera: Scelionidae). Proceedings of the Entomological Society of Washington 86: 797-807. Leskey, T. C., B. D. Short, B. R. Butler, and S. E. Wright. 2012. Impact of the invasive brown marmorated stink bug, Halyomorpha halys (Stál), in Mid-Atlantic tree fruit orchards in the United States: Case studies of commercial management. Psyche (535062) 14 pp. Nielsen, A. L., P. W. Shearer, and G. C. Hamilton. 2008. Toxicity of insecticides to Halyomorpha halys (Hemiptera: Pentatomidae) using glass-vial bioassays. Journal of Economic Entomology 101(4):1439-1442. Tarango, S., M. García y A. González-Hernández. 2003. Especies, daño y control natural de chinches en nogal pecanero. INIFAP. Folleto técnico No. 14. pp: 4-39. Walker, A. J. 1988. World Review of the Parasitoids of the Southern Green Stink Bug Nezara viridula (L.) (Heteroptera: Pentatomidae). In Annals of the Entomological Society of America 81(2): 262-273. 429 EVALUACION DE SEIS CEPAS DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS SOBRE Diatraea magnifactella DYAR (LEPIDOPTERA CRAMBIDAE) Iveth del Rocío Castro-Ortega1, Alicia Fonseca-González2, Adriana Gabriela Trejo-Loyo3*, Víctor Manuel Hernández-Velázquez2*, Luis Angel Rodríguez-del-Bosque4 y Laura Patricia Lina- García2*. 1Facultad de Ciencias Agropecuarias, 2Laboratorio de Control Biológico, Centro de Investigación en Biotecnología; 3Laboratorio de Parasitología Vegetal, Centro de Investigaciones Biológicas. Universidad Autónoma del Estado de Morelos, Av. Universidad No. 1001, Col. Chamilpa, C.P. 62209. Cuernavaca Morelos. 4INIFAP Campo Experimental Río Bravo, Tamaulipas. *CA de Entomología y Fitopatología, UAEMOR-CA-73. [email protected]. RESUMEN. El barrenador del tallo Diatraea magnifactella, es la plaga más importante en el cultivo de caña de azúcar. Convencionalmente su control es a base de insecticidas químicos, pero su uso indiscriminado ha provocado daños en el ambiente, por lo cual se investigan alternativas de control inocuas al ambiente. En este trabajo se evaluó la patogenicidad de las cepas de hongos entomopatógenos Cb103, Cb120, Cb121, Cb138 de Cordyceps bassiana y Ma141 y Ma156 de Metarhizium anisopliae aislados de suelos de caña de azúcar y cadáveres de D. magnifactella de los estados de Colima, Morelos y Jalisco a las concentraciones de 1X104 y 1X108 conidios por ml. Se seleccionó la cepa Ma156 que ocasionó la mayor mortalidad con un porcentaje de 93.33% con la concentración conidial de 1X10 8 y se obtuvo la CL50 de 4.3X104 conidios por ml. Palabras clave: patogenicidad, virulencia, concentración letal 50, barrenador. Evaluation of six entomopathogenic fungi strains against Diatraea magnifactella (Lepidoptera: Crambidae) ABSTRACT. The stem borer Diatraea magnifactella, is the most important pest in sugarcane cultivars. Conventional control is based on chemical insecticides, but indiscriminate use has caused damage in the environment, whereby control alternatives harmless to the environment are investigated. In this study we evaluated the pathogenicity of strains of entomopathogenic fungi Cb103, Cb120, Cb121, Cb138 of Cordyceps bassiana and Ma141, Ma156 of Metarhizium anisopliae isolated from sugarcane soils and corpses of D. magnifactella from Colima, Morelos and Jalisco, we used the concentrations of 1x108 1x104 conidia per ml. Strain Ma156 was selected because it caused highest mortality with a percentage of 93.33% with the conidial concentration of 1x108 and the LC50 was obtained with 4.3X104 conidia per ml. Key words: pathogenicity, virulence, letal concentration 50, stem borer. Introducción El complejo de insectos barrenadores del tallo es un problema crónico que sufren especies de la familia Poaceae en cualquier región del mundo donde se cultiva alguna gramínea. En México, Diatraea magnifactella Dyar se alimenta principalmente de caña de azúcar y ocasionalmente de maíz, causando daños significativos en caña de azúcar con pérdidas en el rendimiento aproximadas del 80%, mientras que en maíz puede ser del 40% (Rodríguez-del Bosque y Vejar-Coto, 2008). Los métodos convencionales para el control de D. magnifactella son principalmente el cultural y el químico, este último causa severos daños de contaminación y salud (Galindo, 2009), además de la generación de resistencia del insecto plaga. Debido a estos inconvenientes deben buscarse alternativas de control que no afecten la integridad ambiental. El control biológico con microorganismos es una alternativa factible para el combate de plagas, donde los hongos entomopatógenos tienen preeminencia frente a otros entomopatógenos. Los hongos se encuentran asociados con insectos que viven en diversos hábitats, los más utilizados en el mundo son Metahrizium anisopliae y Cordyceps bassiana (=Beauveria bassiana), aunque existen 700 especies en aproximadamente 100 géneros que tienen una amplia distribución a nivel mundial 430 (Faria y Wraight, 2007) Como parte del proyecto Aislamiento, e identificación de enemigos naturales de barrenadores de caña de azúcar de Colima y Morelos con potencial como agentes de control biológico (PROMEP), se aislaron cepas de dos especies de hongos, las cuales se consideraron importantes de evaluar para determinar su patogenicidad y virulencia sobre D. magnifactella. Materiales y Método La investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Control Biológico de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos. Se emplearon larvas neonatas de D. magnifactella, que se obtuvieron de la cría establecida en el laboratorio de Control Biológico (CEIB-UAEM). Se evaluaron cepas de dos especies de hongos Cordiceps bassiana y Metarhizium anisopliae. Las cepas evaluadas fueron Cb120, Cb121, Cb138, Ma141 y Ma156 que provienen de muestras de suelo e insectos de caña de azúcar de Colima, Morelos y Jalisco. Patogenicidad. Se realizaron suspensiones conidiales de 1x104 y 1x108 de las seis cepas y se adicionaron con Tween 80 al 0.5%, el testigo sólo contenía agua con Tween. El proceso de inoculación fue por inmersión, introduciendo un fragmento de hoja de maíz de (3x3 cm) por un periodo de 1 minuto en cada una de las suspensiones conidiales y/o testigo en agitación constante y se colocaron en papel secante para eliminar el exceso de humedad. Posteriormente se colocaron dentro de una caja petri (de 60x15 mm) con papel filtro (90 mm) en el fondo y se le incorporaron cinco larvas neonatas de D. magnifactella. Después de tres días, las larvas sobrevivientes se pasaron una caja petri con dieta merídica. Cada unidad experimental consistió en una caja petri con cinco larvas de D. magnifactella y tres repeticiones para cada tratamiento. Los bioensayos se revisaron a los 3, 5 y 7 días. Virulencia. Se determinó la virulencia con las concentraciones conidiales 0, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107 y 1x108 para la cepa que mostró mayor porcentaje de mortalidad, el proceso de inoculación fue por el método de inmersión anteriormente descrito. Análisis estadístico. Se estableció un diseño experimental completamente al azar. Los porcentajes de mortalidad, se f m √ , p p á varianza y una comparación múltiple de medias con la prueba de Tukey a un nivel de significancia de 0.05. La determinación de virulencia se realizó con el programa Polo plus con un análisis probit. Resultados y Discusión En la figura 1 se muestran los porcentajes de mortalidad obtenidos con las diferentes cepas, donde se observa que los mayores porcentajes correspondieron a las cepas de Metarhizium anisipliae Ma141 y Ma156 a una concentración de 1X108 conidios por ml, aunque no hubo diferencias estadísticas significativas con los otros tratamientos; sin embargo, se observó mayor número de esporas en menor tiempo en la cepa Ma156 que fue aislada en Colima de D. magnifactella por lo cual se continuó el trabajo con esta cepa. Lezama et al. (2010) evaluaron la susceptibilidad de larvas neonatas de D. magnifactella a cepas de M. anisopliae y C. bassiana y reportan mortalidades del 80% al 90% coincidiendo con los resultados obtenidos en la presente evaluación. Se estimó la virulencia de la cepa Ma156 con una CL50 de 4.3X104 conidios por ml (Fig. 2), obteniéndose resultados menores a los reportados por Destefano et al (2005) y Osorio y Canal (2011), quienes reportan una CL50 de 8,44 X109 y 9,44 X106, respectivamente para otras cepas de 431 M. anisopliae sobre Anastrepha spp. En tanto que Quesada-Moraga et al. (2006), reportan para otras cepas de M. anisopliae una CL50 de 1X105 conidios por ml sobre Bemisia tabaci. A 100 AB A AB 80 ABC 60 C BC 40 20 D 0 Figura 1. Patogenicidad de hongos entomopatógenos sobre D. magnifactella. El comportamiento de los entomopatógenos presenta diferencias que están influenciadas por factores bióticos y abióticos como lo refiere (Berlanga y Hernández, 2002). Aún siendo la misma cepa pueden existir diferencias patogénicas que también tienen que ver con el sistema inmunológico del hospedero. Figura 2. Virulencia de la cepa Ma156 sobre D. magnifactella 432 Agradecimientos A p f p P OMEP: “A m , identificación de enemigos naturales de barrenadores de caña de azúcar de Colima y Morelos con potencial como agentes de b ó ” . Literatura Citada Berlanga P. A. M. y Hernández V. V. M. 2002. Efecto de la temperatura sobre el crecimiento y virulecia de Metarhizium anisopliae M.a. var. acrididum y Beauveria bassiana en Shistocera piceifrons. Manejo integrado de plagas. Costa Rica. N°63 Pp51-55 Destéfano, R. R. H., I. J. Bechara, C. L. Messias and A. E. Piedrabuena. 2005. Effectiveness of Metarhizium anisopliae against immature stages of Anastrepha fraterculus fruit fly (Diptera: Tephritidae). Brazilian Journal of Microbiology. 36 (1): 94-99. Faria, M. R and S. P. Wraight 2007. Mycoinsecticides and mycoacaricides acomprehensive list of formulation types. Biological control. 43: 237-256. Galindo, R G. 2009. Efectos en la salud de peones agrícolas, por contaminación de plaguicidas del valle agrícola de Navolato, Sinaloa. C mp S mp “L ó plaguicidas en México: mp p p v ”. U v A ó m E Morelos. Cuernavaca. pp. 27 Lezama G. R, J, Molina. O., H. A. Palacios A., M. P. España. L. y J. Lozano G. 2010. Susceptibilidad de larvas neonatas de D. magnifactella Dyar (Lepidoptera: Pyralidae) a los hongos entomopatógenos Metarhizium anisopliae, Cordyceps bassiana Isaria fumosorosea. En memoria XXXIII Congreso de control biológico, Uruapan Michocan. Pp. 19-32. Osorio, A. F y Canal N.A. 2011. Selección de Cepas de Hongos Entomopatógenos para el Manejo de Anastrepha obliqua (Macquart, 1835) (Diptera: Tephritidae) en Colombia. Rev. Fac. Nal. Agr. Medellín. 64 (2): 6129-6139. Quesada-Moraga, E., A. A. Maranhao, E., P. Valverde-García y C. Santiago-Álvarez. 2006. Selection of Beauveria bassiana isolates for control of the whiteflies Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum on the basis of their virulence, thermal requirements and toxicogenic activity. Biological Control. 36: 274-287. Rodríguez-Del Bosque, L. A. y G. Vejar-Cota. 2008. Barrenadores del Tallo (Lepidoptera: Crambidae) del Maíz y Caña de Azúcar. Pp 9-22. En: Arredondo B. H. C. y L. A. Rodríguez del Bosque (Eds.). Casos de Control biológico en México. Ed Mundi-Prensa. 433 ENEMIGOS NATURALES DEL PULGÓN Brevicoryne brassicae L. Tania Sánchez-González, Samuel Ramírez-Alarcón y Mateo Vargas-Hernández. Departamento de Parasitología Agrícola, Universidad Autónoma Chapingo. Km 38.5 carretera México- Texcoco. CP. 56230, Chapingo, México. [email protected]; [email protected] RESUMEN. Se identificaron tres especies de parasitoides de Brevicoryne brassicae, Diaeretiella rapae, el parasitoide más abundante, Aphidius colemani y Lysiphlebus testaceipes. También tres hiperparasitoides fueron registrados: Asaphes sp., Pachyneuron sp., y Alloxysta fuscicornis. Palabras Clave: pulgón, parasitoides e hiperparasitoides Natural enemies of aphid Brevicoryne brassicae L. ABSTRACT. We identified three species of parasitoids of Brevicoryne brassicae, Diaeretiella rapae, the most abundant parasitoid, Aphidius colemani and Lysiphlebus testaceipes. Three hyperparasitoids were also recorded: Asaphes sp. Pachyneuron sp. and Alloxysta fuscicornis. Key words: aphid, parasitoids and hiperparasitoids. Introducción Los enemigos naturales son el recurso fundamental del control biológico y provienen de una gran cantidad de grupos taxonómicos que difieren ampliamente en su biología y ecología (Van Driesche et al., 2007). El conocimiento de todo esto nos permite tomar ventaja para poder establecer y llevar a cabo un buen programa de control biológico. Una de las plagas más importantes del cultivo de brócoli, son los áfidos. La facilidad de movilidad de estos insectos a cualquier parte de la planta y en cualquiera de sus estadíos es lo que propicia el daño principal pues contamina a los cultivos de brasicáceas y por lo tanto la calidad de la cosecha se ve demeritada (Bujanos y Marín, 1996). Las poblaciones del pulgón cenizo (Brevicoryne brassicae) y del polífago Myzus persicae pueden incrementarse a tales niveles que causan serios daños a cultivos de brasicáceas. La finalidad de esta investigación fue: Conocer las especies parasitoides del pulgón Brevicoryne brassicae, en tres localidades agrícolas: en la zona de Mixquic, Tláhuac, Distrito Federal y la zona de Influencia de Chapingo. Materiales y Método Se establecieron tres localidades de colecta: el campo experimental de la Universidad Autónoma Chapingo y la región agrícola contigua de San Diego ambas ubicadas en estado de México (19°29′23″N 98°53′37″O). Y otra correspondiente a la zona agrícola de San Andrés Mixquic, delegación de Tláhuac D.F. (19°13′29″N 98°57′52″O) Las colectas manuales se realizaron semanalmente en cultivos comerciales de brócoli Brassica oleracea var. Itálica. A partir del 11 de febrero al 22 de octubre del 2011. Y estas consistieron en observar las plantas de brócoli para ubicar los pulgones parasitados (momias), para esto se utilizó: una lupa, tijeras, y contenedores de plástico. Las momias colectadas fueron llevadas al laboratorio de Control biológico del Departamento de Parasitología Agrícola donde fueron colocadas en vasos desechables cubiertos con tela de organza para su emergencia a temperatura ambiente de 22 °C. Ya emergidos los parasitoides, se les alimentó con gotas de miel de abeja y se dejó que murieran de manera natural. Para su preservación se colocaron en cápsulas de gel junto con su momia. 434 Resultados y Discusión Se colectaron un total de 2, 904 momias del pulgón Brevycorine brasicae del 25 de Febrero al 22 de Octubre del 2011.De las cuales 1102 en el Campo Experimental de la Universidad Autónoma Chapingo, México; 898 en San Diego, Texcoco,México y 904 fueron colectadas en San Andrés Mixquic, Tláhuac, D. F. Se identificaron tres especies de himenópteros parasitoides: Diaeretiella rapae, Aphidius colemani Lysiphlebus testaceipes; (Hymenoptera: Braconidae) y tres especies de hiperparasitoides Alloxysta fuscicornis, (Hymenoptera: Cynipoidea: Figitidae). Asaphes sp., y Pachyneuron sp. (Hymenoptera: Pteromalidae) (Fig. 1). En el cuadro 1 se presenta la abundancia de estas especies en los tres sitios de colecta. Donde se muestra claramente que la especie dominante en las tres localidades es Diaeretiella rapae. Diaeretiella rapae Lysiphlebus testaceipes Aphidius colemani Alloxysta fuscicornis Pachyneuron sp. Asaphes sp. Figura 1. Parasitoides e hiperparasitoides de Brevicoryne brassicae. Los resultados concuerdan con el trabajo de De Souza y Bueno (1992) quienes colectaron 7 027 momias de áfidos en brasicáceas en Brasil. El 79% de emergencia correspondió a la especie D. rapae, siendo así la más importante. La acción de D. rapae ha sido un factor significativo en el estudio del desarrollo de poblaciones de áfidos en Polonia (Wiech y Jankowska, 1994), en los E.U.A. (López et al., 1989), en Kenia (Bahana y Karuhize, 1986) y en otros lugares. En Polonia Wiech y Jankowska (1994) registró el mayor parasitismo promedio de B. brassicae en la col (22%), en comparación con otros cultivos de Brassica, mientras que el parasitismo alcanzó el 35% de la colza y mostaza en Polonia, aunque en el este último caso, el 435 parasitismo fue ineficaz para el control de áfidos (Gabry y Zyczewska 1998). D. rapae utiliza el olor de las crucíferas como referencia. Cuadro1. Abundancia de parasitoides e hiperparasitoides de Myzus persicae en tres localidades agrícolas. Especie D. rapae A. colemani L. testaceipes A. fuscicornis Asaphes sp. Pachyneuron sp Sin emerger TOTAL Campo Chapingo, Méx. 969 47 23 3 8 10 42 1102 San Diego Texcoco, Méx 792 41 17 3 5 7 33 898 San Andrés Mixquic, D.F. 801 15 33 12 7 5 31 904 La inmovilidad de B. brassicae representa una baja defensa contra el parasitismo, pero su capa de cera ofrece un grado de protección. D. rapae parece tener una gama más amplia de áfidos huéspedes en los Estados Unidos que en Europa. (CABI, 2012). Por otra parte la presencia de hiperparasitoides podría limitar su eficacia en la regulación poblacional del pulgón, pero con base en nuestros resultados el hiperparasitismo es muy bajo en las tres localidades, y aparentemente representan un bajo porcentaje de regulación de las poblaciones del pulgón. Conclusiones Diaeretiella rapae es el parasitoide más importante debido a la frecuencia con la que se presenta. Representa el 88.22% del total de momias colectadas. Las 6 especies momificadoras de áfidos, se encontraron en los 3 sitios de muestreo. El porcentaje de frecuencia de Aphidius colemani, fue mayor en Chapingo (4.26%) y Texcoco (4.57%) que en San Andrés Mixquic (1.66%). Lysiphlebus testaceipes tuvo mayor frecuencia en San Andrés Mixquic que en Chapingo y Texcoco, Estado de México. El porcentaje de frecuencia para L. testaceipes fue del 3.65% mientras que para Chapingo y Texcoco fue del 2% aproximadamente. Los hiperparasitoides están presentes en los 3 sitios de muestreo y su frecuencia es mínima, cabe destacar que el hiperparasitoide Alloxysta fuscicornis, presenta mayor frecuencia en San Andrés Mixquic, que en Chapingo y Texcoco. El porcentaje de no emergencia, es mínimo ya que en total solo representa un 3,65%. Agradecimientos Al Dr. Refugio Lomelí del Instituto de Fitosanidad del Colegio de Postgraduados por su ayuda en la identificación del material colectado y al M. en C. Jorge Valdés Carrasco, por la ayuda en la toma de fotografías de los ejemplares. Literatura Citada Bahana, J. and G. Karuhize. 1986. Th f D p (M ’I h) (H m p : Braconidae) in the population control of the cabagge aphid,Brevicoryne brassicae L. (Hemiptera: Aphididae) in Kenya. Insect science and its Apliplications, 7 (5) 605-609. 436 Bujanos, R. M. y A. J. Marín. 1996. Plagas de los cultivos de crucíferas en El Bajío, México. Publicación especial núm. 2. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Celaya, Guanajuato. México. CA I . 2012. C p P C mp m. Th W ’ M C mp h v S for Crop Protection Information. www.cabi.org De Souza, B. M. and V. H. P. Bueno 1994. Parasitoids and hyperparasitoids of mummies of Brevicoryne brassicae (Linnaeus, 1758) (Hemiptera: Aphididae). Revista de Agricultura (Piracicaba), 67 (1): 55-62. Gabry, S. B. and J. Chora Zyczewska. 1998. Probing behaviour of the cabbage aphid (Brevicoryne brassicae L.) on host and non-host plants. Progress in Plant Protection, 38 (2): 395-397. López, E. R., Van Driesche, R. G. and T. S. Bellows. 1989. Direct measurement of host and parasitoid recruitment for assessment of total losses due parasitism in acontinously breeding species, the cabbage aphid, Brevicoryne brassicae (L.) (Hemiptera: Aphididae). Bulletin of Entomological Research, 79: 47-59. Van Driesche, R. G., Hoodle, M. S. y T. D. Center. 2007. Control de Plagas y Malezas por Enemigas Naturales. U.S. Department of Agriculture. U.S. Forest Service. Forest Health Technology Enterprise Team. Wiech, K. and B. Jankowska.1994. The occurence of pests and beneficial insects on different cruciferous vegetables. Materiay Sesji Instytutu Ochrony Ros^acute∼lin, 34 (1): 229-236. 437 EFECTO DE LAS DIETAS NATURALES Y DEL SUSTRATO DE OVIPOSICIÓN, EN LA PRODUCCIÓN DE HUEVOS DE Oebalus insularis (HETEROPTERA: PENTATOMIDAE), COMO BASE PARA UN PROGRAMA DE MULTIPLICACIÓN DE Telenomus podisi (HYMENOPTERA: PLATYGASTRIDAE) Bruno Zachrisson, Pamela Polanco y Onesio Martinez. Instituto de Investigación Agropecuaria de Panamá, Calle Carlos R. Lara, Ciudad del Saber, Clayton, Panamá, República de Panamá. [email protected] RESUMEN. El cultivo de arroz (Oryza sativa), es afectado principalmente por Oebalus insularis. La utilización de parasitoides oófagos, en la reducción de la población de la plaga, es la estrategia de manejo recomendada. Por lo que, se determinó el efecto de la interacción de diferentes dietas naturales (Oryza sativa, Echinocloa colona, Eclipta alba) y la superficie de oviposición, en la producción de huevos de O. insularis y su impacto en la multiplicación de Telenomus podisi, en condiciones controladas. Los ensayos se instalaron a 28+20C de temperatura, 80+5% de humedad relativa y 12 horas de fotofase, obteniéndose huevos provenientes de adultos de O. insularis alimentados en cada una de las dietas naturales, en cada uno de los sustratos de oviposición. Los huevos de la plaga, obtenidos en cada tratamiento, fueron sometidos al parasitismo de T. podisi. El parasitismo de T. podisi, fue afectado por el sustrato de oviposición, resultando el papel de toalla el de mejores resultados. Palabras clave: Oebalus insularis, dietas naturales, Telenomus podisi. Naturals diets and the oviposition surface effects, in the Oebalus insularis (Heteroptera: Pentatomidae) eggs production, as a base for the massal rearing program of Telenomus podisi (Hymenoptera: Platygastridae) ABSTRACT. The cultivation of rice (Oryza sativa), is affected mainly by Oebalus insularis. The usage of parasitoid eggs, in the reduction of the plague population, is the recommended management strategy. For that reason, the interaction effect of different natural diets (Oryza sativa, Echinocloa colona, Eclipta alba) and the oviposition surface was determined in the egg production of O. insularis and its impact in the multiplication of Telenomus podisi, under controlled conditions. The trials were installed at 28+20C temperature, 80+5% relative humidity and12 hours photophase, obtaining eggs from O. insularis adults that were fed from the natural diets and oviposition substrate. The plague eggs obtained from each treatment were exposed to T. podisi parasitism. The parasitism of T. podisi was affected by the oviposition substrate, resulting paper towel for best results. Key words: Oebalus insularis, Naturals diets, Telenomus podisi. Introducción El insecto- plaga Oebalus insularis, es uno de los principales insectos chupadores que causan mermas significativas al cultivo del arroz (Oryza sativa), en el continente americano (Pantoja, 1997). En América Central y Panamá, O. insularis se reporta como una de las especies más comunes en arrozales, representando el 95% de los especímenes de pentatomideos en este cultivo (King y Saunders, 1984). Por lo que, la inserción del estilete del insecto en el grano facilita y favorece la entrada del complejo de fitopátogenos al interior de este (Shannon, 1989; Pantoja, 1997). El comportamiento alimenticio de Oebalus insularis, ha sido ampliamente estudiado, destacándose la preferencia por otras especies de gramíneas consideradas malezas (Echinocloa colona, Echinocloa crus-galli, Paspalum conjugatum y Paspalum virgatum) (Nilakhe, 1976; Pantoja, 1997; Rashid et al., 2005). Por la bioecología de esta plaga y lo característico del daño, el control biológico dirigido a la fase de huevo que es la mejor opción de manejo (Zachrisson 2005, 2009). En vista de que la aplicación de insecticidas, solo incrementaría los costos de producción, contaminando el agro ecosistema (Zachrisson, 2009), considerando la inviabilidad económica, social y ambiental. En Panamá, el registro de Telenomus podisi y de Trissolcus basalis, ha proporcionado los subsidios necesarios para la implementación y desarrollo 438 de un programa de control biológico de O. insularis (Zachrisson, 2005, 2009; Zachrisson y Martinez 2011). La producción y la calidad de huevos por insectos chupadores de la familia Pentatomidae, depende de los nutrientes asimilados (Naresh y Smith 1983, Panizzi 2009). Estos resultados representan avances significativos, cuando son utilizados para la multiplicación de insectos chupadores, en condiciones controladas. En donde la calidad de los huevos de O. insularis, provenientes de condiciones bióticas controladas, pueden incrementar la tasa de parasitismo de T. podisi (Zachrisson 2009). Por lo cual, el presente estudio tuvo como objetivo, determinar la interacción del impacto de la nutrición de adultos de O. insularis y del sustrato de oviposición, en la multiplicación de T. podisi, en condiciones controladas. Materiales y Método Con la finalidad de establecer la multiplicación de O. insularis, en condiciones bióticas controladas, se colectaron adultos de campo Oebalus insularis y Telenomus podisi, en parcelas de arroz libres de la aplicación de insecticidas. Las hembras de O. insularis obtenidas en condiciones controladas (28°+2°C temperatura, 80 + 5% humedad relativa y fotofase de 12 horas), fueron alimentadas de manera independiente con cada una de las dietas naturales evaluadas (Oryza sativa y Echinocloa colona). La obtención de las oviposturas de O. insularis, provenientes de las diferentes dietas naturales y de los sustratos de oviposición evaluados (hilo de lana, algodón, papel toalla y hoha de arroz), fueron sometidos al parasitismo de T. podisi. En cada tratamiento se utilizaron 50 hembras de O. insularis, considerándose un número de 15 huevos por ovipostura, para cada tratamiento. Estas fueron sometidas al parasitismo de T. podisi, considerado la proporción de 15 huevos por parasitoide. El diseño experimental utilizado fue completo al azar y los datos fueron transformados en arc sen raíz de x y sometidos a la prueba de análisis homogeneidad de varianza y posteriormente al Análisis de Varianza (ANOVA) al nivel del 5% de probabilidad. La discriminación entre las medias, se realizó por medio de la prueba de Tukey. Resultados y Discusión El porcentaje de oviposición de Oebalus insularis, sobre el papel toalla, fue superior al 90% (Cuadro 1). El mismo favoreció la oviposición de la plaga, diferenciándose estadísticamente del sustrato natural hoja de O. sativa (Cuadro 1). Los estudios realizados por (Silva y Panizzi, 2009), registraron la preferencia de oviposición de Euchistus heros (Heteroptera: Pentatomidae) sobre sustratos artificiales, sin embargo, el sustrato artificial está condicionado por factores físicos y químicos (Panizzi, 2009). Cuadro 1. Porcentaje de oviposición de Oebalus insularis (Heteroptera: Pentatomidae) por sustrato, en condiciones controladas de temperatura (28+2ºC), humedad relativa (80+5%) y fotofase de 12 horas. Sustrato Hilo de lana Algodón Papel toalla Hoja de arroz Oryza sativa (%) 78.6 B a 50.8 D a 91.5 A a 72.7 B a 439 Echinocloa colona (%) 76.4 B a 53.8 D a 99 A a 65 D a De esta forma, se asume que el papel toalla presenta una superficie propicia para el comportamiento de oviposición de O. insularis. Contrario a lo observado en la literatura (Panizzi, 2009), en donde los estímulos químicos y la influencia de los aleloquímicos, encontrados en sustratos naturales como la hoja de arroz, inducen a la oviposición de la plaga. La tasa de parasitismo de T. podisi mostró resultados superiores al 90% en huevos de O. insularis colectados sobre papel toalla (Cuadro 2). La elevada tasa de parasitismo de T. podisi registrada en posturas de O. insularis, corresponde con la elevada tasa de oviposición, que fueron observadas en el papel toalla (Cuadro 2). Por lo cual, se consideró éste como el sustrato que favoreció significativamente el comportamiento de oviposición de la plaga. Aspecto que tiene un valor relevante desde el punto de vista práctico para la multiplicación, tanto de la plaga como del parasitoide. El comportamiento de oviposición de T. podisi, sobre huevos de O. insularis, sugiere que la aceptación del huésped (huevo), se da en función de la calidad nutricional de este. El mismo comportamiento fue observado para T. basalis, en huevos de Nezara viridula (Heteroptera: Pentatomidae) (Correa-Ferreira, 1987). Cuadro 2. Porcentaje de parasitismo de Trissolcus basalis (Himenoptera: Platygastridae), en posturas de Oebalus insularis (Heteroptera: Pentatomidae), obtenidos en diferentes sustratos de oviposición, en condiciones controladas de temperatura (28+2ºC), humedad relativa (80+5%) y fotofase de 12 horas. Sustrato Hilo de lana Algodón Papel toalla Hoja de arroz Oryza sativa (%) 78.9 Ba 56.7 CD a 95.1 A a 46.0 D a Echinocloa colona (%) 73.5 B a 54.8 C a 97.3 A a 41.0 D a Conclusión El parasitismo de Telenomus podisi, fue afectado por el sustrato de oviposición y no por la alimentación de Oebalus insularis. El papel toalla como el sustrato de oviposición fue superior a los otros sustratos, sin afectar el parasitismo de T. podisi. Literatura Citada Correa-Ferreira, B. S. 1987. Ciclo de vida e comportamentos de oviposicao do parasitoides de ovos T. Mitsukurri. Embrapa, Centro Nacional de Pesquisa de Soja. Resultados de Pesquisa de soja, 130-132. King, A. B. y Saunders, J. L. 1984. The invertebrate pests of annual food crops in Central America. London. Overseas Development Administration CATIE. 121-124. Naresh, J. S. y Smith, C. M. 1983. Development and survival of rice stink bugs (Hemiptera: Pentatomidae) reared on different host plants at four temperatures. Environment Entomology, 12:1496-1499. Nilakhe, S. S. 1976. Overwintering, survival, fecundity, and mating behavior of the rice stink bug. Annals of the Entomological Society of America, 69:717-720. Panizzi, A.R. 2009. Suboptimal nutrition and feeding behavior of hemipterans on less preferred plant food sources. Anais da Sociedade Entomológica do Brasil, 29:1-12. 440 Pantoja, A. 1997. Artrópodos relacionados con el arroz en América Latina. En Pantoja, A., Fischer, A; Correa-Victoria, B; Sanint, L. y Ramirez, R. (Eds.). En: Arroz, Manejo Integrado de Plagas, Artrópodos, enfermedades y malezas (MIP). Ed. CIAT. Pp: 59-98. Rashid, T., Johnson, D. T. y Bernhardt, J. L. 2005 Feeding preference, fecundity and egg hatch of rice stink bug on artificial diet, rice and alternate host grasses. Southwestern Entomologist, 30: 257–262. Saunders, J., Coto, T. y King, A. 1998. Plagas invertebradas en cultivos alimenticios de América Central. London, UK, ODA. 174. Shannon, P. 1989. Programa de Manejo Integrado de Plagas: Arroz. En: Andrews, K. & Quezada, J.R., Manejo Integrado de Plagas en la agricultura. Estado actual y futuro. Escuela Agrícola Panamericana. El Zamorano. Honduras. 623 p. Silva, F. A. C. & Panizzi, A. R. 2009. Oviposition of the Neotropical brown stink bug Euschistus heros (Heteroptera: Pentatomidae) on artificial and on natural substrates. Florida Entomologist, 92:513-515. Zachrisson, B. A. 2005. Efecto de la arquitectura de variedades de arroz, sobre el parasitismo natural de huevos de Oebalus insularis (Stal) (Heteroptera: Pentatomidae). En Resúmenes del Programa Agrícola Centroamericano para el mejoramiento de cultivos y animales (PCCMCA), Panamá, 51: 14. Zachrisson, B. A. 2009. Avances en el Control Biológico de Plagas de arroz en Panamá (Oryza sativa), por medio de parasitoides oófagos, en Panamá. Instituto de Investigación Agropecuaria de Panamá. Departamento de Ediciones y Publicaciones. Panamá. 12 p. Zachrisson, B. y Martinez, O. 2011. Bioecología de Telenomus podisi (Ashmead) y Trissolcus basalis (Wollaston) (Himenoptera: Scelionidae), parasitoides oófagos de Oebalus insularis (Stal) (Heteroptera: Pentatomidae). Tecnociencia, 13: 65-76. 441 EVALUACION DE LA TOXICIDAD DE PROTEINAS Cry DE Bacillus thuringiensis EN LARVAS DE Scyphophorus acupunctatus GYLLENHAL (COLEOPTERA: CURCULIONIDAE) Mirna Gutiérrez-Ochoa1, Ma. Elena Valdés-Estrada1 y Lucila Aldana-Llanos1. Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional. Carretera Yautepec-Jojutla Km. 6, A.P. 24, 62731 San Isidro, Yautepec, Morelos, México. 1Becarios COFAA, EDI. 2Centro de Investigaciones Biológicas, Lab., de Parasitología Vegetal, Universidad Autónoma del Edo., de Morelos, Av. Universidad 1001, Col. Chamilpa, Cuernavaca, Mor. [email protected]. RESUMEN: El picudo negro Scyphophorus acupunctatus Gyllenhal, es la plaga mas importante del cultivo del nardo, ya que infesta hasta el 51% de los bulbos por lo que es necesario encontrar un insecticida biológico. En este trabajo se evaluó la actividad toxica in vitro de cepas de Bt y proteínas Cry sobre larvas neonatas de S. acupunctatus. En los bioensayos se evaluaron tres cepas de B. thuringiensis a una concentración de 0.400mg de proteína total/mL de dieta. Con la proteína Cry3Aa se obtuvo una mortalidad de 24% larval, seguida por la cepa B. thuringiensis israelensis (Bti) con un 20% y la proteína Cry1Aa 8%, en el control no se observó mortalidad. También se observó una disminución en el peso, siendo Bti la que causó mayor reducción. A pesar de no provocar un alto porcentaje de mortalidad en las larvas tratadas, si se observó una disminución en el peso, por lo que sería importante determinar si esta reducción tiene efecto en el desarrollo y fecundidad de las hembras adultas. Palabras clave: control biológico de plagas, cepas, coleóptero, bioensayo. Evaluation of the toxicity of Cry proteins from Bacillus thuringiensis in larvae of Scyphophorus acupunctatus Gyllenhal (Coleoptera: Curculionidae) ABSTRACT. The black picudo Scyphophorus acupunctatus Gyllenhal, is the most important plague of the nard cultive, because it infest the 51% of the bulbes so it is necessary to find a biological insecticide. In this work it was evaluated the toxic activity in vitro of stocks of Bt and Crv proteins over newborn larves of S. acupunctatus. In the bioassays there were evaluated three stocks of B. thuringiensis on a concentration of 0.400 mg of total protein /mL of diet. With the protein Cry3Aa it got a 24% of larval mortality, followed by stock B. thuringiensis israelensis (Bti) with a 20% and the protein Cry1Aa 8%, there was no mortality on control. It was also observed a drop in the weight, being Bti the one that didn´t cause a reduction. Although not to cause a high mortality percentage on treated larvas, it was observed a drop in weight, so it would be important to settle if this reduction has an effect on the development and fertility of the adulthood females. Key words: biological pest control, cry proteins, beetle, bioassay. Introducción En el Estado de Morelos, el cultivo de ornamentales es muy rentable, por lo que en los últimos años se ha incrementado la superficie dedicada a esta actividad. El nardo Polianthes tuberosa es una de las plantas más cultivadas por sus características y por su perfume. Morelos es el principal productor de flor de nardo a nivel nacional, debido a que cuenta con una mayor superficie cultivada respecto a otros estados. El picudo negro Scyphophorus acupunctatus Gyllenhal, es la plaga mas importante de esta planta, ya que infesta 51% de los bulbos (Camino et al., 2002). Las larvas se alimentan de los bulbos y también inducen la putrefacción de los tejidos vegetales mediante la transmisión de microbios asociados que pueden causar la muerte prematura del huésped (Fig. 1) (Warning y Smith 1986). 442 Figura 1. Larvas de S. acupunctatus dañando bulbo de nardo Para el control de este insecto se realizan aspersiones indiscriminadas de plaguicidas químicos y los productores invierten más de la mitad del costo del cultivo en insecticidas, por lo que es necesario evaluar un insecticida biológico como Bacillus thuringiensis (Bt) como medida de control para el picudo del nardo. Bacillus thuringiensis es un miembro del grupo Bacillus cereus que incluye las especies B. cereus, B. anthracis y B. mycoides, la característica que distingue a B. thuringiensis de los otros miembros del grupo B. cereus son sus propiedades entomopatógenas (Bravo et al., 2005). Esta bacteria produce una o más inclusiones paraesporales, también llamados cristales, durante la fase estacionaria, en cantidades que pueden ser hasta del 30% de la proteína total de la célula, son liberadas al medio con las esporas cuando la célula se lisa. Las inclusiones contienen varios tipos de protoxinas llamadas δ-endotoxinas (proteínas Cry) (de Maagd, 2002; Koziel et al., 1993; Li, et al., 1996). Las proteínas Cry son utilizadas como plaguicidas biológicos, se han reportado por mostrar actividad tóxica contra insectos coleópteros. Sharpe (1976) reportó que la ICPS de B. thuringiensis variedad galleriae NRRI. B-1027 fue tóxica al escarabajo japonés Popillia japonica. Krieg et al. (1983) describieron la primera cepa productora de proteína cry3 con actividad contra el escarabajo colorado de la papa Leptinotarsa decemlineata. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la actividad toxica in vitro de cepas de Bt y proteínas Cry con actividad contra coleópteros sobre larvas neonatas de S. acupunctatus. Materiales y Método El pie de cría se estableció a partir de insectos colectados en el municipio de Emiliano Zapata estado de Morelos. Los adultos se pusieron en parejas con un trozo de bulbo de nardo de aproximadamente 15 g, para la alimentación y oviposición. Los huevecillos fueron separados de los bulbos de nardo y colocados en cajas petri (60X15 mm) con papel filtro húmedo, selladas con papel adherente kleen pack, incubados a 27°±1°C, hasta la eclosión de larvas. La cepa y proteínas Cry evaluadas se obtuvieron de la colección de Bt del laboratorio de Parasitología Vegetal/UAEM. Los bioensayos se realizaron utilizando tres cepas de B. thuringiensis a una concentración de 0.400mg de proteína total/mL de dieta y se preparó un volumen total de 125 mL de dieta. La dieta se preparó moliendo en licuadora todos los ingredientes (Valdés-Estrada et al., 2012), el complejo espora-cristal se mezcló con la dieta artificial agregando al final el agar bacteriológico, posteriormente se colocó la dieta en cajas Petri (60X15 mm), el control negativo fue dieta artificial sin B. thuringiensis. El diseño experimental fue completamente al azar, se utilizaron 25 larvas del primer estadio de S. acupunctatus por tratamiento con dos repeticiones. Posteriormente se colocaron en la incubadora a 27±1 ºC, bajo humedad relativa de 60-70%, 443 hasta la obtención de adultos. Se evaluó mortalidad larval y peso larval a los 20 días, el análisis estadístico fue ANOVA. Resultados y Discusión Con la proteína Cry3Aa se obtuvo una mortalidad de 24% larval, seguida por la cepa B. thuringiensis israelensis (Bti) con un 20% y la proteína Cry1Aa 8%, en el control no se observó mortalidad (Fig. 2). También se observó una disminución en el peso, siendo Bti la que causó mayor reducción y la Cr3Aa (Fig. 3). Se ha reportado que la proteína Cry3Aa es tóxica para diversas especies de coleópteros (van Frankenhuyzen, 2009) y Bti es tóxica a larvas de Hipothenemus hampei (Mendez-López et al. 2003), a pesar de que a la concentración utilizada no causó un alto porcentaje de mortalidad en las larvas tratadas, si se observó una disminución en el peso, por lo que sería importante determinar si esta reducción tiene efecto en el desarrollo y fecundidad de las hembras adultas. 25% 24% 20% Porcentaje % 20% 15% 10% 8% 5% 0% 0% Cry 3Aa Bti Cry 1Aa Testigo Figura 2. Porcentaje de mortalidad larval de S. acupunctatus causada por proteínas Cry e israelensis de Bacillus thuringiensis. 0.013912 0.014 0.012 0.010356 Peso mg 0.01 0.006908 0.008 0.006 0.003192 0.004 0.002 0 Testigo Cry 1Aa Cry 3Aa 10 Bti Figura 3. Efecto de proteínas Cry e israelensis de Bacillis thuringiensis sobre larvas de S. acupunctatus a los 20 días. 444 Literatura Citada Bravo, A., M. Soberón y S. S. Gill. 2005. Bacillus thuringiensis: Mechanisms and Use. En: Comprehensive Molecular Insect Science Control. L I. Gilbert, K. Iatrou y S. S. Gill (Eds.). Elsevier. Primera Edición. 175-205 pp. Camino, L. M., Castrejón, G. V., Figueroa, B. R., Aldana, L. L., and Valdes, E. M. E. 2002. Scyphophorus acupunctatus Gyllenhall, (Coleoptera: Curculionidae) Attacking Polianthes tuberosa (Liliales: Agavaceae) in Morelos, México. Florida Entomol. 85(2): 392-393 De Maagd, R. A. 2002. Environmental impact of insect-resistant plants expressing a Bt toxin. II Non-target effects (Update) and Bt resistance in target insects. Note 218. Plant Research International B. V., Wageningen. The Netherlandas. 62 pp. Koziel, M. G., N. B. Carozzi, T. C. Currier, G. W. Warren y S. V. Evola. 1993. The insecticidal crystals proteins of Bacillus thuringiensis: past, present and future uses. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. II: 173-228. Krieg, V., A. Huger, G. Langenbruch y W. Schnetter. 1983. Bacillus thuringiensis var. Tenebriomis, a new patothype effective against larve of coleopteran. Z. Angew. Entomol. 96, 500-508. Li, J., P. A. Koni y D. J. Ellar. 1996. Structura of the mosquitocidal δ-endotoxin CytB from Bacillus thuringiensis sp. kyushuensis and implications for membrane pore formation. Journal of Molecular Biology. 257 (1): 129-152. Mendez-López, I., R. Basurto-Rios y J. E. Ibarra. 2003. Bacillus thuringiensis serovar israelensis is highly toxic to the coffeeberry borer, Hypothenemus hampei Ferr. (Coleoptera: Scolytidae). FEMS Microbiology Letters. 226: 73-77. Sharpe, E. S. 1976. Toxicity of the parasporal cristal of Bacillus thuringiensis to Japonense Beetle larve. J. Invertebr. Pathol.27, 421-422. Valdés-Estrada, Aldana-Llanos, Jiménez-Pérez, Gutiérrez-Ochoa and Hernández-Reyes 2012. Diets for Rearing Scyphophorus acupunctatus (Coleoptera: Curculonidae). Florida Entomologist. 2012. Van Frankenhuyzen, K. 2009. Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis crystal proteins. Journal of Invertebrate Pathology. 101: 1-16. Waring G, Smith R. 1986. Natural history and ecology of Scyphophorus acupunctatus (Coleoptera: Curculionidae) and its associated microbes in cultived and native agaves. Ann Entomol Soc Am 79:334-340. 445 INFECCIÓN DE MOSQUITOS Aedes aegypti (DIPTERA: CULICIDAE) VECTORES DEL DENGUE POR HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Liliana Molina-Tovar, Dalia Mejía-Martínez, Luis Alberto Cisneros-Vázquez y María Guadalupe Vázquez-Martínez. Centro Regional de Investigación en Salud Pública. Instituto Nacional de Salud Pública. 4ª Norte y 19 Poniente s/n, Colonia Centro C.P. 30700. Tapachula, Chiapas, México. [email protected]. RESUMEN. En este trabajo se evaluó la patogenicidad de diferentes cepas nativas de hongos sobre la fase de larva y adulto del mosquito Aedes aegypti. Los bioensayos reportaron que Trichoderma longibrachiatum causó una patogenicidad mayor que los demás hongos tanto para la fase de larvas y adultos de mosquitos. En el caso del hongo Metarhizium anisopliae causó mayor patogenicidad sobre la fase adulta que sobre la fase de larva. Aspergillus aculeatus tuvo una patogenicidad menor que M. anisopliae en larvas y adultos; Aspergillus clavatus desarrolló mejor patogenicidad en adultos y Gliocladium virens tuvo menor patogenicidad en adultos que en larvas. En conclusión, el aislamiento nativo con alta actividad entomopatógena sobre larvas y adultos hembras de Ae. aegypti fue la cepa de T. longibrachiatum, por lo que este hongo puede ser un buen candidato para desarrollarlo como bioinsecticida y usarlo en el control de mosquitos Ae. aegypti vectores de Dengue. Palabras clave: bioinsecticida, control biológico, Dengue, hongos entomopatógenos. Infection of mosquitoes Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) vector of the dengue by entomopathogenic fungi ABSTRACT. This study assessed the pathogenicity of different native strains of fungi on the stage of larva and adult of the mosquito Aedes aegypti. The bioassays reported that Trichoderma longibrachiatum caused the higher pathogenicity both for the phase of larvae and adults of mosquitoes. In the case of the fungus Metarhizium anisopliae was more pathogenic on the adult phase than on the larva stage. Aspergillus aculeatus was less pathogenic than M. anisopliae in larvae and adults; Aspergillus clavatus developed better pathogenicity in adults and Gliocladium virens had lower pathogenicity in adults than in larvae. In conclusion, the native isolation with high entomopathogenic activity on Ae. aegypti larvae and adult females was the strain of T. longibrachiatum, by which this fungus may be a good candidate to develop it as a bioinsecticide and use it in Ae. aegypti mosquito control. Key words: bioinsecticide, biological control, Dengue, entomopathogenic fungi. Introducción En los últimos años se han incrementado los reportes de que los mosquitos Aedes aegypti han desarrollado resistencia hacia los insecticidas, lo cual dificulta el control de este vector. En México, se ha reportado resistencia en poblaciones de Ae. aegypti en los estados de Baja California, Nuevo León, Veracruz, Quintana Roo, Yucatán, Guerrero y Chiapas (Flores et al., 2005; García et al., 2009; Aponte-Incapie et al., 2011). En áreas donde los mosquitos vectores han desarrollado resistencia a los insecticidas químicos, los hongos se convierten en una herramienta eficaz para controlar a las poblaciones de mosquitos (Howard et al., 2010). En mosquitos vectores de Dengue se ha reportado que los hongos Metarhizium anisopliae (Silva et al., 2004), Leptolegnia chapmanii (Peliza et al., 2007), Beauveria bassiana (Miranpuri y Khachatourians, 2001) y Aspergillus clavatus (Seye et al., 2009) causaron mortalidades significativamente altas en larvas de Ae. aegypti, mientras que M. anisopliae, B. bassiana (Scholte et al., 2007; Rodrigues de Paula et al., 2008), Paecilomyces carneus, Isaria fumosorosea, Lecanicillium muscarium y L. psalliotae (Leles et al., 2010) mostraron su capacidad infectiva sobre el estado adulto. Hasta el momento, Lagenidium giganteum es el único hongo que se comercializa como agente de control de larvas de mosquitos, sin embargo, su uso se limita a lugares con 446 temperaturas menores de 30ºC (Kerwin et al., 1994), por lo que se sugiere que para el desarrollo biotecnológico de bioinsecticidas se deben usar cepas nativas, ya que tienen mayor probabilidad de éxito si se emplean en campo en relación a una cepa foránea que tendrá que adaptarse al medio (Castillo, 2006). Por lo anterior, el objetivo de este trabajo fue evaluar la patogenicidad de diferentes cepas nativas de hongos sobre la fase de larva y adulto del mosquito Ae. aegypti. Materiales y Método Cultivo de hongos entomopatógenos. Las cepas nativas de hongos que se evaluaron fueron: Fusarium oxisporum, Penicillium citrinum(a), Talaromyces flavus, P. variotti(a), Aspergillus niger, Aspergillus clavatunicus, Aspergillus flavus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus nidulans, Aspergillus fumigatus, Trichoderma longibrachiatum, Gliocladium virens, P. variotti(b) y Penicillium citrinum(b), que fueron obtenidas del cepario de entomopatógenos del laboratorio de patógenos y vectores del Centro Regional de Investigación en Salud Pública (CRISP). También se utilizó la cepa foránea M. anisopliae (cepa 33 de gallina ciega) donada por el Centro de Investigación y Estudios Avanzados (CINVESTAV), unidad Irapuato. Las cepas fueron previamente reactivadas pasándolas por un insecto hospedero para promover la patogenicidad. Los hongos se cultivaron en placas petri con medio de cultivo agar dextrosa Sabouraud (SDA, Bioxon), mediante la técnica del papel celofán (Dennis y Webster 1971), en la cual se colocó sobre el medio solidificado un círculo de papel celofán previamente esterilizado y acorde a las dimensiones de la placa. Las cepas se inocularon sobre el papel celofán y se incubaron a 27±2°C hasta la esporulación. Preparación de la suspensión de conidias. Se colectaron las conidias del papel celofán y con una espátula se transfirieron a un matraz que contenía 150 mL de solución Tween 80 al 0.01%. La suspensión se mezcló en un sonicador de baño de agua a 28°C por 15 minutos, alternando con agitaciones manuales cada cinco minutos. Conteo de conidias. Para determinar la concentración de la suspensión de conidias se tomó una alícuota de 20 μL ó 1:100 p ó ám N üb . S llevó a cabo el conteo de conidias en el microscopio óptico por el método B de la técnica reportada por Hansen (2000). Viabilidad de conidias. Se sembraron 5 alícuotas de 5 µL de la suspensión de conidias en placas con medio Sabouraud y se incubó a 27°C hasta el momento de la germinación. Se realizó el conteo de las conidias germinadas y se determinó el porcentaje de germinación de acuerdo a la siguiente fórmula: % de viabilidad= (Conidias germinadas/Total de conidias) x 100 Bioensayos de patogenicidad a) Fase Larvaria. Los bioensayos se realizaron en vasos desechables de plástico de 8 oz conteniendo 100 mL de una suspensión de conidias y se agregaron 25 larvas de Ae. aegypti de tercer estadio. Se evaluaron 16 tratamientos, 14 de ellos con cepas nativas de hongos, uno con M. anisopliae y uno que consistió de solución Tween 80 sin conidias (control). Los bioensayos se realizaron en una cámara ambiental a 27ºC y un fotoperiodo de 12 horas luz y 12 horas de oscuridad. Todos los tratamientos tuvieron cuatro repeticiones y se cuantificó el porcentaje de mortalidad a las 24, 48 y 72 hrs. Para los bioensayos se utilizaron suspensiones de conidias a una concentración de 1x108 conidias/mL con una viabilidad de 90%. b) Fase Adulta. Se evaluaron ocho tratamientos: cinco cepas nativas de hongos patógenas, uno con M. anisopliae, uno que consistió en una solución de Tween 80 al 0.01% sin 447 conidias y un tratamiento con papeletas secas. Para cada tratamiento fungal se aplicaron suspensiones de conidias en papeletas (hojas de papel filtro estériles) que luego fueron colocadas dentro de recipientes plásticos de exposición, cuyas tapaderas tenían mallas también tratadas con conidias. Las papeletas y mallas fueron impregnadas con 15 mL de una suspensión de conidias a una concentración de 2x1010 conidias/mL (Mnyone et al., 2009; Mnyone et al., 2011) y con una viabilidad del 100%, la impregnación se realizó usando jeringas de 10 mL. Las superficies tratadas se dejaron secar por 24 hrs antes del experimento. Grupos de 20 mosquitos hembras de 2 a 3 días de edad sin alimentar, fueron expuestos por 16 días a los tratamientos y mantenidos en una cámara ambiental a 27°C, 70% humedad relativa y fotoperiodo de 12:12 hrs luz/oscuridad. Todos los mosquitos fueron alimentados con solución de sacarosa al 5% impregnada sobre algodón y colocados sobre la malla de las tapas de los recipientes. Cada 24 hrs se realizaron observaciones para evaluar la mortalidad. Los mosquitos muertos fueron removidos diariamente, lavados con solución de hipoclorito de sodio al 1% por 20 segundos y luego enjuagados dos veces en agua destilada estéril por 20 segundos. Cada mosquito muerto se colocó de manera individual en cajas petri que contenían papel filtro humedecido y se sellaron con parafilm para formar una cámara húmeda que estimuló la esporulación. Todos los tratamientos tuvieron cuatro repeticiones, y cada tratamiento fungal fue realizado en eventos separados para evitar contaminación cruzada. Se evaluó la mortalidad y la infección causada por cada tratamiento. Resultados y Discusión Todas las cepas de hongos nativos causaron mortalidad en larvas de 3er. estadio de Ae. aegypti, sin embargo, se observaron diferencias (P<0.05) en la capacidad patógena entre los diferentes hongos (Cuadro 1). Trichoderma longibrachiatum y F. oxisporum causaron 100% de mortalidad a las 24 y 72 hrs, respectivamente; M. anisopliae, A. niger y A. aculeatus causaron una mortalidad entre 81 y 91% a las 72 hrs; mientras P. variotti (b) presentó la virulencia más baja con 2% de mortalidad. Trichoderma longibrachiatum, durante su proceso de infección, no causó esporulación sobre larvas de Ae. aegypti durante las 72 hrs en que se realizaron observaciones a las larvas muertas. Cuadro 1. Mortalidad larvaria de Aedes aegypti a las 24 hrs de exposición a cada tratamiento. Tratamiento Trichoderma longibrachiatum Aspergillus aculeatus Metarhizium anisopliae Fusarium oxisporum Penicillium citrinum(a) Gliocladium virens Paecilomyces variotti(a) Aspergillus flavus Aspergillus nidulans Aspergillus niger Aspergillus clavatunicus Talaromyces flavus Paecilomyces variotti(b) Penicillium citrinum(b) Aspergillus fumigatus Control Porcentaje de Mortalidad 100% A 76% B 65% B 39% C 24% C D E F G H I 26% D E F H 20% D E F G H I 13% D F G H I J K 15% D E F G H I 8% D F G H I J K 3% G I J K L M N Ñ 3% G I J K L M N Ñ 1% J K L M N Ñ 0% J K L M N Ñ 0% J K L M N Ñ 0% J K L M N Ñ *Tratamientos seguidos por la misma letra son iguales estadísticamente (0.05). 448 Control La cepa de T. longibrachiatum fue la cepa más entomopatógena sobre adultos de Ae. aegypti, ya que la mortalidad al día 16 fue de 51.25%. Metarhizium anisopliae, A. aculeatus, A. clavatus y A. niger, causaron una mortalidad de 28.75%,13.75%, 12.50% y 10%, respectivamente a los 16 días de exposición. Gliocladium virens fue la cepa con menor patogenicidad, ya que causó una mortalidad de 8.75% a los 16 días (Cuadro 2). Cuadro 2. Mortalidad (%) causada por cada cepa de hongo sobre mosquitos adultos de Aedes aegypti durante 16 días de monitoreo. Cepas de hongos Trichoderma longibrachiatum Metarhizium anisopliae Aspergillus aculeatus Aspergillus clavatus Aspergillus niger Gliocladium virens Mortalidad (%) 51.25 28.75 13.75 12.5 10 8.75 El análisis de la varianza para la mortalidad de los mosquitos Ae. aegypti indicó una diferencia significativa entre la mortalidad causada por los diferentes tratamientos de hongos (P<0.05). De acuerdo a los resultados obtenidos por las pruebas múltiples de rangos, la diferencia mínima significativa de los diferentes tratamientos de hongos indica que las cepas de hongos ejercen diferente nivel de patogenicidad sobre el mosquito adulto Ae. aegypti, siendo la mortalidad causada por T. longibrachiatum diferente a las mortalidades causadas por G. virens, A. niger, A. aculeatus, A. clavatus, pero similar a la causada por M. anisopliae (P<0.05). Se observó que todos los hongos desarrollaron micelio sobre los adultos expuestos, aunque cada uno a diferentes tiempos. Trichoderma longibrachiatum fue el hongo que desarrolló el micelio más rápidamente y de forma abundante sobre el cuerpo del mosquito Ae. aegypti. Trichoderma longibrachiatum tuvo una patogenicidad mayor con respecto a los demás hongos tanto para la fase de larvas y adultos de mosquitos Ae. aegypti. En el caso del hongo M. anisopliae tuvo mayor patogenidad sobre la fase adulta que sobre la fase de larva. Aspergillus aculeatus conservó una patogenidad menor que M. anisopliae en larvas y adultos; Aspergillus clavatus desarrolló mejor patogenicidad en adultos y G. virens tuvo menor patogenicidad en adultos que en larvas de Ae. aegypti. Conclusiones El aislamiento nativo con alta actividad entomopatógena sobre larvas y adultos hembras de Ae. aegypti fue la cepa de T. longibrachiatum, por lo que este hongo puede ser un buen candidato para desarrollarlo como bioinsecticida y usarlo en el control de mosquitos Ae. aegypti vectores de Dengue. Agradecimientos Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, que financió este estudio a través del Proyecto No. 182722 de los fondos sectoriales SSA. 449 Literatura Citada Aponte-Incapie, A., Dzul-Manzanilla, A. F., Che-Mendoza, A., Penilla-Navarro, R. P., Manrique-Saide, P. y A. Rodríguez-Ramírez. 2011. Resistencia a insecticidas piretroides mediada por mutaciones kdr en Aedes aegypti del estado de Guerrero, México, En: CruzMiranda, S. G., Tello-Flores, J., Mendoza-Flores, A. y A. Morales-Moreno. Entomol. Mex, 10:655-660. Castillo, Z. 2006. Uso de Metarhizium anisopliae para el control biológico del salivazo (Aeneolamia spp. y Prosapia spp.) en pastizales de Brachiaria decumbens en el Petén, Guatemala. Tesis de Maestría. Centro Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza. Turrialba, Costa Rica. Dennis, C. y J. Webster. 1971. Antagonisitc properties of species-groups of Trichoderma. I: Production of non-volatile antibiotics. Trans. Brit. Mycol. Soc, 57:25-39. Flores, A. E., Albeldano-Vazquez, W., Salas, I. F., Badii, M. H., Becerra, H. L, et al. 2005. Elevated alpha-esterase levels associated with permethrin tolerance in Aedes aegypti (L.) from Baja California, Mexico. Pest. Biochem. Physiol, 82:66-78. García, G. P., Flores, A. E., Fernández-Salas, I., Saavedra-Rodríguez, K., Reyes-Solis, G., et al. 2009. Recent rapid rise of a permethrin knock down resistance allele in Aedes aegypti in Mexico. PLoS Negl. Trop. Dis, 3(10). e531.doi:10.1371/journal.pntd.0000531 Hansen, P. J. 2000. Use of a hemacytometer. Department of Animal Sciences. University of Florida. Pp. 10-15. Howard, A. F. V., Koenraadt, C. J. M., Farenhorst, M., Knols, B. G. J. y W. Takken. 2010. Pyrethroid resistance in Anopheles gambiae leads to increased susceptibility to the entompathogenic fungi Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana. Malar. J, 9:168. Kerwin, J. L., Dritz, D. A. y R. K. Washino. 1994. Pilot scale production and application in wildlife ponds of Lagenidium giganteum (Oomycetes: Lagenidiales). J. Am. Mosq. Control Assoc, 10:451-455. Leles, R. N., Almeida, N., Nunes, L. F., Santos, A. H., Garcia, H. H. y C. Luz. 2010. Pathogenicity of some hypocrealean fungi to adult Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Parasitol. Res, 107:1271-1274. Miranpuri, G. S. y G. G. Khachatourians. 2001. Infection sites of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana in the larva of the mosquito Aedes aegypti. Entomol. Exp. Appl, 59: 19-27. Mnyone, L. L., Kirby, M. J., Lwetoijera D. W., Mpingwa, M. W., Knols, B. G. J., Takken, W. y T. L. Russell. 2009. Infection of the malaria mosquito, Anopheles gambiae with two species of entomopathogenic fungi: effects of concentration, co-formulation, exposure time and persistence. Malar. J, 8:309. Mnyone, L. L., Kirby, M. J., Mpingwa, M. W., Dickson, W., Lwetoijera, W., Knols, B. G. J., Takken, W., Koenraadt, C. y T. L. Russell. 2011. Infection of Anopheles gambiae mosquitoes with entomopathogenic fungi: effects of host age and blood-feeding status. Parasitol. Res, 108:317-322. Peliza, S., López-Lastra, C., Becnel, J., Bisaro, V. y J. Garcia. 2007. Biotic and abiotic factors affecting Leptogenia chapmanii infection in Aedes aegypti. J. Am. Mosq. Control Assoc, 23:177-181. Rodriguez de Paula, A., Souza, E., Ronald, C., Pinheiro, M. y R. Ian. 2008. Susceptibility of adult Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) to infection by Metarhizium anisopliae and 450 Beauveria bassiana: prospects for Dengue vector control. Biocontrol Sci. Techn, 10: 1017-1025. Scholte, E. J., Takken, W. y G. J. Bart. 2007. Infection of adult Aedes aegypti and Ae. albopictus mosquitoes with the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Acta Trop, 102: 151-158. Seye, F., Faye, O., Ndiaye, M., Njie, E. y J. M. Afoutou. 2009. Pathogenicity of the fungus Aspergillus clavatus, isolated from the locust, Oedaleus senegalensis, against larvae of the mosquitoes Aedes aegpyti, Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus. J. Insect. Sci, 11:1-7. Silva, R., Silva, H. y C. Luz. 2004. Effect of Metarhizium anisopliae isolated from soil samples of central Brazilian cerrado against Aedes aegypti larvae under laboratory conditions. Rev. Patol. Trop, 33:207-216. 451 HONGOS ENTOMOPATOGENOS Y EXTRACTOS VEGETALES CONTRA ESCAMA BLANCA (Aulacaspis tubercularis NEWSTEAD). EN CULTIVO DE MANGO EN SAN LUIS LA LOMA, MUNICIPIO DE TECPAN DE GALEANA, GRO. MÉXICO Juan Pérez-Salgado1, María Divina Ángel-Ríos1, Alejandro Arteaga-Deloya1, Elías Hernández-Castro2 y Agustín Damián-Nava2. 1Unidad Académica de Ciencias Naturales U.A.G. Carretera Chilpancingo-Petaquillas. Rancho Shalako. Chilpancingo, Gro. 2Unidad Académica de Ciencias Ambientales y Agropecuarias. Carretera IgualaTuxpan. Iguala, Gro., de la Universidad Autónoma de Guerrero. [email protected]. RESUMEN. El estudio se realizó con el objetivo de evaluar en campo la patogenicidad de dos hongos entomopatógenos y el efecto de tres extractos de semillas de vegetales contra escama blanca en mango. Después de realizar dos aplicaciones a hojas de mango y bajo un diseño de bloques completamente al azar, se encontraron diferencias significativas entre los diferentes tratamientos aplicados, en el cual los mejores tratamientos de la aplicación fueron los tratamientos TI (Extracto de Higuerilla (Ricinus communis L.) y el TIII (Extracto de Paraíso (Melia azedarach L.), con más del 50% en su primera aplicación, hasta un 70.5% de mortalidad en su segunda aplicación en el número de colonias y hembras. El TII (Hongo Metarhizium anisopliae) fue el mejor tratamiento, alcanzado un 58% de mortalidad de la plaga en su segunda aplicación. Palabras clave: Escama blanca, hongos entomopatógenos, extractos vegetales, mango Entomopathogenic fungi and plant extracts against flake white (Aulacaspis tubercularis (Newstead). For the cultivation of mango in San Luis the Loma, Municipality of Tecpan de Galeana, Gro. Mexico ABSTRACT. The study was conducted with the objective of evaluating on field, the pathogenicity of two entomopathogenic fungi and the effect three extracts from seeds of plants against flake white mango. After two applications to handle sheets and under a randomized complete block design, significant differences were found between the different treatments applied, in which the best treatments for implementation were the treatments TI (Extract of castor (Ricinus communis L. ) and TIII (Extract of Paradise (Melia azedarach L. ), with more than 50% on your first application, up to a 70.5 % mortality in its second application on the number of colonies and females. The TII (fungus Metarhizium anisopliae) was the best treatment in the case of the entomopathogenic fungi, reached a 58% mortality of the pest in its second application. Key words: Flake white, entomopathogenic, plant extracts, mango. Introducción El Mango (Mangifera indica L) es uno de los frutos de mayor importancia a nivel mundial, ya que ocupa el quinto lugar dentro de los principales productos frutícolas. México es el principal exportador de mango en el mundo. Actualmente el estado de Guerrero se encuentra dentro de los mayores productores ocupando el primer lugar en producción y exportación de mango en México, con más de 353 mil toneladas por año, exportándose principalmente hacia Estados Unidos, Japón, Francia y España (Mora et al., 2002) y (Ayala-Garay et al., 2009). Entre los principales problemas fitosanitarios que afectan al mango destacan las plagas presentándose gran cantidad de insectos con hábitos alimenticios diversos y cuya presencia en sí no determina que dañe al mango. Las plagas más importantes por los daños directos al fruto, o indirectos (follaje y ramas) son: la mosca de la fruta, trips, hormigas y escamas (Prieto et al., 2005). Los insectos escama o escamas son insectos chupadores de savia, que incluyen todos los miembros de la superfamilia Coccoidea (Orden Hemiptera). Las escamas ocurren en todas las zonas zoogeográficas del mundo, son insectos muy pequeños, de forma redondeada, ovalada o alargada, característica determinada por la presencia de un caparazón que recubre su cuerpo (Vargas et al., 2006). Los estudios en escama blanca se limitan solo a la identificación y a la dinámica poblacional como el de Durán (2010) y son pocos los trabajos que se enfocan al control 452 de esta. Por lo tanto es importante encontrar alternativas que sean eficaces para el control de la escama blanca (Aulacapsis tubercularis (Newstead) como evaluar cepas de hongos entomopatógenos nativos y extractos de semillas de plantas con propiedades insecticidas, para contribuir en una estrategia de manejo integrado de plagas del mango y así controlar en un ambiente sustentable a dichas plagas. Materiales y Método El trabajo se realizó en una Huerta de mango en San Luis La Loma, Mpio. De Tecpan de Galeana Gro, México, áf , 17° 16’ 40.9’’ 100° 53’ 42.2’’ 29m m m ( L T ). Obtención de extractos vegetales y hongos entomopatógenos. Para obtener los extractos vegetales se colectaron semillas de Higuerilla (Ricinus communis L.), Paraíso (Melia azedarach L.) y Guanábana (Annona muricata L.). Después de que la semilla se pulverizó se sometió a extracción de sus metabolitos secundarios mediante un extractor de Soxhiet, proceso que consiste en calentar alcohol hasta su temperatura de ebullición, condensar los vapores formados y recolectarlos por arrastre para pasarlo posteriormente por un rotavapor para eliminar el alcohol y así obtener los concentrados de los metabolitos de cada semilla, listos para utilizarlos a concentraciones de 8 % en agua. Los hongos entomopatógenos Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana se tomaron del cepario del Laboratorio de diagnóstico y control de plagas de la Unidad Académica de Ciencias Naturales de la Universidad Autónoma de Guerrero los que se reprodujeron masivamente en bolsas de poli papel con 500 gramos de arroz previamente esterilizado. Originando junto con los extractos cinco tratamientos (Cuadro 1). Las aplicaciones se hicieron con aspersores que aplicaron aproximadamente 0.5 militros por aspersión a las hojas de mango. Cuadro 1. Numeración de los tratamientos. Número de tratamientos I II III IV V Nombre Extracto semilla de Higuerilla Hongo Metarhizium anisopliae Extracto semilla de Paraíso Extracto semilla de Guanábana Hongo Beauveria bassiana Para el diseño experimental se seleccionaron árboles bajo un diseño de bloques completamente al azar, con cinco repeticiones para cada tratamiento y bloque donde se marcaron cinco árboles de los cuales se seleccionaron cinco ramas completamente al azar para poder aplicar los tratamientos, de estas cinco ramas, se eligieron cuatro hojas y a cada una de estas hojas se les asigno un número del uno al cuatro, dando un total de 100 muestras para evaluar los tratamientos, las aplicaciones fueron en dos ocasiones con un intervalo de aplicación entre una y otra de siete días, las cuales se realizaron durante la tarde. Esto se realizó con la ayuda de un aspersor, con el cual se aplicaron los tratamientos sobre el haz y el envés de cada una de las hojas. Antes y después de hacer cada aplicación, se contó el número de colonias para poder evaluar la mortalidad de esta plaga. 453 Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) con el programa de computo SAS (Stadistic Analysis System versión 9.0) y la prueba de Tukey con =0.05 para determinar cuál de los extractos u hongos entomopatógenos fue mejor con respecto a los parámetros considerados. Resultados y Discusión El efecto de los diferentes tratamientos (extractos vegetales y hongos entomopatógenos) contra Escama Blanca A. tubercularis, en mango realizado en campo, a nivel de hojas sobre el haz y envés, mostró diferencias significativas entre los diferentes tratamientos aplicados. El TIII (Extracto semilla de Paraíso (M. azedarach), fue el más efectivo, inhibiendo su desarrollo poblacional después de 7 días de su primera aplicación, en un 51.5%. El análisis de varianza de mortalidad del número de colonias o hembras, indica que en la parcela donde se aplicaron los diferentes tratamientos, mostraron efectos diferentes en su acción contra la Escama Blanca donde el TI (Extracto semilla de Higuerilla (R. communis), el TII (Hongo Metarhizium anisopliae) y el TIII (Extracto semilla de Paraíso (M. azedarach) resultaron ser los más efectivos contra esta plaga (Cuadro2). Cuadro 2. Resultados de la comparación de medias entre los tratamientos contra la mortalidad de Escama Blanca (Aulacaspis tubercularis (Newstead), a los siete días de la primera aplicación. Trat 4 5 2 1 3 Media 0.0 12.0 30.5 41.5 51.5 Gpo. Tukey B AB AB A A Medias con la misma letra no son significativamente diferentes. Para la segunda aplicación de tratamientos contra escama blanca, también se observaron diferencias altamente significativas entre los diferentes tratamientos aplicados, esto muestra que entre los tratamientos existieron efectos importantes en la mortalidad de escamas. El tratamiento más efectivo, con respecto a la mortalidad de Escama Blanca, como lo indica la comparación de medias, fue el TIII (Extracto semilla de Paraíso (M. azedarach), alcanzando inhibir el desarrollo poblacional de la plaga hasta un 70.5 % (Cuadro 3). Cuadro 3. Resultados de la comparación de medias entre los tratamientos contra la mortalidad de Escama Blanca (Aulacaspis tubercularis (Newstead). Trat 4 5 2 1 3 Media 19.5 35.5 58 63 70.5 Gpo. Tukey B AB A A A Medias con la misma letra no son significativamente diferentes. 454 El tratamiento más efectivo para el control de la Escama Blanca fue el extracto de Paraíso (M. azedarach), ya que presentó una mortalidad de 70.5% permitiendo actuar como controlador de esta plaga, como lo hacen otros extractos de otras plantas y principalmente los extractos a base de Neem (A. indica) planta de la misma familia del Paraíso. El extracto de Higuerilla (R. communis), en solo una aplicación alcanzó 41.5% de mortalidad del insecto plaga, gracias a que presenta aceites minerales como el aceite de ricino, y como sabemos hasta la fecha esta plaga solo se ha controlado a base de aceites minerales como los reportados por (Urías et al., 2010), quien trabajó con jabones y algunos aceites donde encontró que los tratamientos mostraron resultados sobresalientes. La aplicación de los tratamientos, a base de extractos de semilla de Higuerilla (R. communis) y Paraíso (M. azedarach), fueron los mejores en controlar a A. tubercularis, alcanzando un 63% y 70.5% respectivamente. Respecto a los hongos entomopatógenos utilizados en este estudio, el TII (Hongo M. anisopliae) fue el mejor tratamiento, alcanzado un 58% de mortalidad de la plaga en su segunda aplicación. Esto lo compara con un buen número de trabajos desarrollados por distintos investigadores en el mundo y en nuestro país (Pérez, et al., 2010), al utilizar diferentes hongos entomopatógenos para el control de plagas, solo que en escama blanca en mango no existen estudios que nos muestren el uso de estos, ya que por naturaleza de esta plaga presenta un caparazón que protege su cuerpo, lo que hace difícil su control. Agradecimientos A la Universidad Autónoma de Guerrero a través de la Dirección de Investigación por el financiamiento de este trabajo bajo la convocatoria 2011. A los productores de mango de la región Costa Grande por las facilidades brindadas al presente estudio. Literatura Citada Ayala-Garay, A., Almaguer-Vargas, J., De la Trinidad-Pérez, N., Caamal-Cauich, I., Rendón, R. 2009. Competitividad de la producción de mango (Mangifera indica L) en Michoacán. Revista Chapingo. Serie Horticultura. 15 (2): 133-140 pp. Durán, T. Y. 2010. Identificación y caracterización de escamas (Hemiptera; Sternorrhyncha; Coccoidea) en el cultivo de mango en el municipio de Tecpan de galeana del estado de Guerrero. Tesis de licenciatura. Fac. Ciencias, Universidad Autónoma de Guerrero. México. 1-48 p. Mora, J., Gamboa, J. y Elizondo, R. 2002. Guía para el cultivo del Mango. La Uruca, San José, Costa Rica. 1-11 pp. Prieto, J., Covarrubias, J., Romero, A. y Figueroa, J. 2005. Paquete tecnológico para el cultivo de Mango en el estado de Colima. Gobierno del estado de Colima. 27 p. Pérez-Salgado J., Ángel-Ríos M.D., Hernández-Castro E., Dorantes-Delgado A. y HernándezParra, N. 2010. Extractos vegetales, hongos entomopatógenos y un insecticida comercial contra el gusano cogollero (Spodoptera frugiperda J. E. Smith) en el cultivo de maíz. Entomología Mexicana. Vol. 9. 135-137 pp. Urías-López, M., Hernández-Fuentes, l., Osuna- García, J., Pérez-Barraza, M., García-Álvarez, N., Gonzales-Carrillo, J. 2010. Efectividad biológica de detergentes comerciales sobre la escama blanca del mango (Hemíptera: Diaspididae). Entomología Mexicana. Vol. 9. 583587 pp. Vargas, R. y Rodríguez, S. 2006. Escama latania. Manejo de plagas en Paltos y Cítricos. 163 p. 455 ASPECTOS BIOLÓGICOS Y POBLACIONALES DE Chrysoperla comanche (Banks) (NEUROPTERA: CHRYSOPIDAE) DEPREDADOR DE Diaphorina citri Kuwayama (HEMIPTERA: PSYLLIDAE) Iliana Pacheco-Rueda1, J. Refugio Lomeli-Flores1, Héctor González-Hernández1, J. Isabel López-Arroyo2, Ma. Teresa Santillán-Galicia1, J. Jesús Romero-Napoles1. 1Colegio de Postgraduados, Instituto de Fitosanidad. Km. 36.5 Carr. México-Texcoco, Montecillo, 56230 Texcoco, Estado de México. 2Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental General Terán. Km. 31 Carr. Montemorelos-China, 67400 General Terán, Nuevo León. [email protected]. RESUMEN. Las ninfas y adultos de Diaphorina citri dañan al follaje de las plantas hospederas y es el principal vector del HLB. Una alternativa al control químico es el uso de depredadores, siendo los crisópidos uno de los candidatos potenciales. Por lo que se tuvo como objetivo en este trabajo estudiar en condiciones de laboratorio el ciclo biológico y algunos parámetros poblacionales de Chrysoperla comanche (Banks). En todos los experimentos las larvas del depredador fueron alimentadas con ninfas de D. citri. El ciclo biológico de C. comanche fue de 25.5 días. Las hembras fueron más longevas que los machos. La fecundidad (mx) y la tasa neta de reproducción (Ro) alcanzaron valores ligeramente bajos en comparación con otros Chrysopidae. Palabras clave: ciclo biológico, tabla de vida, crisopas, Psílido Asiático de los Cítricos. Biological aspects and population parameters of Chrysoperla comanche (Banks) (Neuroptera: Chrysopidae) predators of Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae) ABSTRACT. Nymphs and adults of Diaphorina citri may damage the foliage of citrus plants, and this species is the most important vector of the HLB. An alternative to chemical control is the use of chysopid predators. Thus, the objective of this study was to assess the life cycle and some population parameters of Chrysoperla comanche (Banks) under laboratory conditions. In all experiments, the chrysopid larvae were fed with nymphs of D. citri. The life cycle of C. comanche was 25.5 days. Females lived longer than males. The fecundity (mx) and net reproductive rate (Ro) reached values slightly low compared with other Chrysopidae. Key words: Biological control, life-table, chysopids, Asian Citrus Psyllid. Introducción Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae) fue reportada por primera vez en México en 2002 en plantaciones de cítricos de Campeche, y es el principal vector de la enfermedad denominada Huanglongbing (HLB) (Alemán et al., 2007). En México, se mantiene un programa de control de la bacteria, entre otras estrategias, a través del manejo de su vector, mediante la liberación masiva del parasitoide Tamarixia radiata Burks (Hymenoptera: Eulophidae) y algunos hongos entomopatógenos; Isaria fumosorosea y Metarhizium anizopliae (CNRCB, 2009), de igual forma, se están buscando algunas alternativas que complementen la acción de este parasitoide, ya que el costo productivo es muy alto. Una de éstas es el uso de depredadores como los neurópteros de la familia Chrysopidae que han demostrado su potencial en el control de algunas plagas de hortalizas y frutales, además de ser relativamente fáciles de reproducir (López-Arroyo et al. 2005). Sin embargo, hace falta complementar algunos aspectos biológicos que permitan conocer su potencial en el control del psíllido, por lo que en el presente trabajo se propone estudiar el ciclo biológico y algunos parámetros poblacionales de Chrysoperla comanche en condiciones de laboratorio. 456 Materiales y Método Material biológico. Los psílidos fueron proporcionados por el Centro Nacional de Referencia de Control Biológico (CNRCB), Tecomán Colima, éstos se encuentran establecidos sobre plantas de Murraya paniculata (L.) en condiciones de invernadero. La colonia de C. comanche (Banks) fue reproducida dentro del departamento de Insectos Entomófagos de dicho centro. En el presente estudio, el pie de cría de adultos de C. comanche se estableció en cilindros de PVC (25 cm de alto y 12 cm de diámetro), forrados en su interior por cartulina negra para la oviposición de las hembras y provistos con una dieta artificial a base de polen, spirulina, acido ascórbico, miel, agua y levadura de cerveza. Las larvas, se alimentaron con huevos de Sitotroga cerealella (Olivier) (Lepidoptera: Gellechiidae). Ciclo biológico y tabla de vida. A partir de cuatro cohortes de huevos de C. comanche (33, 24, 20 y 23), se manipularon un total de 100 huevos con menos de 24 h de edad. Estos fueron colocados individualmente en cajas Petri de acrílico (4 cm de diámetro), la caja contaba con perforaciones laterales y cubierto con tela organdí para su ventilación. Al emerger las larvas del depredador, se alimentaron en promedio con 50 ninfas de D. citri. Cada 24 h se realizaron observaciones y se retiraba el alimento para colocar uno fresco. La presencia de la exuvia de cada ínstar larval fue utilizada para estimar la duración de los estados biológicos. Los parámetros que se registraron fueron; total de huevos eclosionados, larvas que mudaron al siguiente ínstar, larvas que pasaron a pupas y los individuos que llegaron a adulto. De los datos del ciclo biológico, longevidad de adultos y parámetros poblacionales se estimaron medias y el error estándar (Ott, 1993). Se realizó un análisis de regresión lineal entre el porcentaje de sobrevivencia y el tiempo (días) (SAS, 2009). Fecundidad. Esta se obtuvo a partir de 10 parejas; cada pareja se colocó en vasos de unicel de 10 cm de alto y 15 cm de diámetro, la tapa fue perforada y cubierta con tela de organdí, para su ventilación. El recipiente de unicel contaba con un orificio lateral, el cual se tapó con algodón húmedo; de esta manera los adultos recibieron una fuente de agua. Adicionalmente, fueron alimentados con dieta artificial. Se estimó la reproducción de C. comanche considerando el período de preoviposición, oviposición, así como el número de huevos depositados por día por hembra. Del experimento anterior, fueron utilizados los datos para estimar los parámetros de fecundidad (mx), tasa neta de reproducción (Ro), tasa intrínseca de crecimiento (rm), tasa finita de reproducción (λ) mp (T), p m L f b (M et al. 2000, SAS 2009). Ambos experimentos se mantuvieron en una cámara de cría en condiciones de laboratorio a 25±2ºC con 60-70% HR y un fotoperiodo de16:8 (L:O). Resultados y Discusión La duración del ciclo biológico (huevo hasta la emergencia del adulto) fue de 25.5±0.22 días, con un rango entre 20 y 31 días. De los 79 individuos que llegaron a adultos, 44 fueron hembras y 35 machos; el ciclo biológico de estos se completó a los 26.1 y 24.74 días, respectivamente. El huevo eclosionó en promedio a los 4.23 días y el estado larval III fue el que duró más tiempo (3.96 días) (Cuadro 1). Auad et al. (2001) y Giffoni et al. (2007) señalan para Chrysoperla externa (Hagen) un ciclo biológico de 26.1±0.10 días, a una temperatura de 26ºC, alimentados con huevos de S. cerealella. Al comparar el ciclo biológico de especies de Chrysoperla con otros géneros como 457 Ceraeochrysa; se asume que las especies de Ceraeochrysa tienen un ciclo biológico de mayor duración (López -Arroyo et al. 1999; Ramírez-Delgado et al. 2007; Khuhro et al. 2012). Cuadro 1. Tiempo de duración del ciclo biológico de Chrysoperla comanche sobre D. citri. 1número de individuos, 2 error estándar. Ínstar Huevo Larva I Larva II Total n Media ± EE2 100 4.23±0.07 99 3.45±0.07 97 3.31±0.12 Rango 3-7 2-5 2-6 Larva III Pupa Total 95 91 79 2-7 7-15 20-31 1 3.96±0.14 10.1±0.13 25.5±0.22 Hembras (n=44) Media ± EE2 Rango 4.09±0.16 3-7 3.54±0.15 2-5 3.23±0.18 2-6 4.0±0.21 10.18±0.19 26.1±0.32 2-7 7-15 20-31 Machos (n=35) Media ± EE2 Rango 4.2±0.08 3-5 3.49±0.12 2-4 3.51±0.20 2-6 3.54±0.23 10.0±0.22 25.74±0.36 2-6 7-12 22-31 Longevidad de adultos. La longevidad promedio de adultos fue de 35.9±2.8 días (rango de 10 a 58 días). Las hembras presentaron longevidad de 38 días (rango de 21 a 58 días), los machos con menor longevidad de 32.9 días (rango de 10 a 55 días). Goncalves et al. (2003), señalan que el tipo de alimentación afecta la duración de longevidad en adultos y larvas de Chrysopidae. En este trabajo, posiblemente la larga longevidad de las hembras, se deba a que requieran más carbohidratos, para la producción de huevos. Como lo indica Miller y Cave (1987) para Micromus posticus (Hemerobiidae). Sobrevivencia. En todos los estados de desarrollo C. comanche se observó mortalidad. Sólo el 79 % de los organismos llegaron a adultos. La sobrevivencia disminuyó 0.718 % por cada día que transcurre durante el periodo de su vida (Fig. 1). Se asume que C. comanche tiene una alta tasa de sobrevivencia en comparación con otras especies como Chrysoperla carnea y Chrysoperla rufilabris (Tauber y Tauber 1983). y = 100 -0.718 x r2 = 0.9533 Figura 1. Curva de sobrevivencia (%) en condiciones de laboratorio de Chrysoperla comanche. Tabla de vida y de fecundidad. La pupa y adulto presentaron la mayor tasa de mortalidad (qx) 4.3 y 12.4 %, respectivamente; en cambio los tres ínstares larvales registraron el 2%. La esperanza de vida (ex) fue alta en las tres primeras etapas de desarrollo, siendo el huevo 458 con el mayor valor (5.29) y el adulto con el menor (1.0) (Cuadro 2). La q x para C. comanche en su estado larval fue bajo (6.3%) cuando se compara con larvas de C. carnea (33%) alimentadas con piojos harinosos (Gautam et al., 2009). En estado de pupa, Jokar et al., (2012) obtienen en C. carnea una qx alta (13.3%) y una ex baja (5.0), cuando son alimentados con pulgones. Algunos individuos mueren durante el proceso de muda; el cual puede ser consecuencia de varios factores que influya en la cría de insectos como; temperatura, fotoperiodo, humedad y dieta (Rodríguezdel-Bosque y Arredondo-Bernal, 2007). En general, se cree que es determinante el tipo de alimentación que reciban los inmaduros, y puede afectar en estado adulto el tiempo de desarrollo y disminuir la sobrevivencia, la fecundidad y longevidad de éstos (Principi y Canard 1984; Khuhro et al. 2012). Cuadro 2. Tabla de vida de Chrysoperla comanche en condiciones de laboratorio. Intervalo de edad (x), número de individuos (nx), número de individuos muertos (dx), tasa de mortalidad (qx), esperanza de vida (ex). Huevo (H), Larvas (LI, LII, LIII), Pupa (P), adulto (A). x (Días) 0-H H-LI LI-LII LII-LIII LIII-P P-A nx 100 99 97 95 94 89 dx 1 2 2 2 4 11 qx 0.01 0.02 0.021 0.021 0.043 0.124 Lx 150 148 145 142 139 69 Tx 791 642 494 350 208 69 ex 5.291 4.349 3.419 2.461 1.498 1 lx(100) 100 99 97 95 94 89 La capacidad reproductiva de C. comanche sobre D. citri fue en promedio de 180 huevos por hembra, lo cual equivale a una fecundidad de 4.75±1.15 huevos por hembra por día, con un máximo de 39 huevos. El período de preoviposición duró 4.3± 0.47 días, posteriormente más del 90% de las hembras comenzaron a poner huevos a partir del día 9 y fue cuando se registró un máximo de 9.4 huevos/hembra/día. La fecundidad fluctuó a partir del día 5 al 45, la cual disminuyó a partir del día 47 hasta el 61, cuando se registró la última oviposición (Fig. 2). En C. carnea se ha observado una máxima fecundidad de 75.9 huevos por hembra (Gautam et al., 2009). De acuerdo con Jokar et al. (2012) cada hembra de C. carnea tuvo un promedio de 215 huevos, esto equivale a una fecundidad de 10.15±0.38 huevos por hembra por día con una dieta de Bemisia tabaci (Gennadium) (Hemiptera: Aleyrodidae). Figura 2. Curva de fecundidad de hembras de Chrysoperla comanche criadas sobre Diaphorina citri. 459 Con la fecundidad de C. comanche se estimaron los parámetros poblacional reproductivos de la especie cuando es alimentada con D. citri; la Ro de C. comanche fue 81.58, la rm fue de 0.1846, T f 23.84 í λ f 1.20. E b j m C. carnea, se obtuvo una Ro de 112.02 cuando se ocupó una dieta con B. tabaci (Gautam et al. 2009). Conclusiones Chrysoperla comanche presentó un ciclo biológico semejante a otras especies de Chrysoperla, pero más corta que especies de Ceraeochrysa. Las hembras son más longevas que los machos. La ex en C. comanche en estado de huevo es alta (5.2), y en adulto es baja (1.0). Con el presente estudio se obtuvuvieron algunos aspectos biológicos de C. comanche, sin embargo, se recomienda hacer comparaciones con parámetros poblacionales D. citri, que permitan inferir el potencial reproductivo de las especies sobre el insecto plaga. Agradecimientos Este estudio forma parte del proyecto 1106033A (SAGARPA-CONACYT) Manejo de enfermedad Huanglongbing (HLB) mediante el control de poblaciones del vector Diaphorina citri, el psíllido asiático de los cítricos. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca otorgada al primer autor. Al Instituto Nacional de Investigación Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), General Terán, Nuevo León, por el material de crisopas. Al Centro Nacional de Referencia de Control Biológico (CNRCB, DGSV, SENASICA, SAGARPA), por las facilidades prestadas para realizar los experimentos y por el material proporcionado del insecto plaga. Literatura Citada Alemán, J., H. Baños y J. Ravelo. 2007. Diaphorina citri y la enfermedad huanglonbing: una combinación destructiva para la producción citrícola. Revista Protección Vegetal, 22: 154-165. Auad, A. M., L. C. Toscano., A .L. Boica E S. De Freitas.2001. Aspectos biológicos dos estádios imaturos de Chrysoperla externa (Hagen) e Ceraeochrysa cincta (Schneider) (Neuroptera: Chrysopidae) alimentados com ovos e ninfas de Bemisia tabaci (Gennadius) biotipo B (Hemiptera: Aleyrodidae). Neutropical Entomology 30(3):429-432. Gautam, S., A. K. Singh. and R.D. Gautam. 2009. Comparative life table analysis of chrysopids reared on Phenacoccus solenopsis Tinsley in laboratory. Journal Biological Control, 23(4): 393-402. Giffoni, J., N. Valera, F. Díaz y C. Vásquez. 2007. Ciclo biológico de Chrysoperla externa (Hagen) (Neuroptera: Chrysopidae) alimentada con diferentes presas. Bioagro 19(2): 109113. Goncalves, S. C., A. M. Auad., B. Souza., C. F. Carvalho, y J. P. Bonani. 2004. Aspectos biológicos de Chrysoperla externa (Hangen) (Neuroptera: Chrysopidae) alimentada com Bemisia tabaci (Gennadius) biotipo B (Hemiptera: Aleyrodidae) criada en tres hospedeiros. Ciencia e Agrotecnologia, 28 (2): 243-250. Jokam, M. M. Zarabi. 2012. Investigation effect three diets on life table parameters Chrysoperla carnea (Steph.) (Neuroptera: Chrysopidae) under laboratory conditions. Egypt. Acad. J. Biolog. Sci., 5(1): 107-114. 460 Khuhro, N. H., H. Chen., Y. Zhang., L. Zhang., M.Wang. 2012. Effect of different prey species on the life history parameters of Chrysoperla sinica (Neuroptera: Chrysopidae). European Journal of Entomology, 109:175-180. López-Arrollo, J. L., C. A. Tauber., M. J. Tauber. 1999. Effects of prey on supervival, development and reproduction of trash-carrying chrysopids (Neuroptera: Ceraeochrysa). Enviromental Entomology 28(6):1182-1188. López-Arroyo, J. I., M. A. Peña, M. A. Rocha Peña., J. Loera. 2005. Ocurrencia en México del psílido asiático Diaphorina citri (Homoptera: Psyllidae), pp.C68. En: Memorias del VII Congreso Internacional de Fitopatología. SMF. Chihuahua, Chih., Méx. Maia, A. H. N., A. J. Liuz., C. Campanhola. 2000. Statistical inference on associated fertility life table parameters using jackknife technique: computational aspects. Journal of Economic Entomology, 93:511-518. Miller, L. G. and R. D. Cave. 1987. Bionomics of Micromus posticus (Walker) (Neuroptera: Hemerobiidae) with descriptions of the immature stages. Proceedings of the Entomological Society of Washington, 89:779-789. Ott, R. L. 1993. An introduction to stadistical methods and data analysis, 4th ed. Duxbury, Belmont, CA. Principi, M. M., M.Canard. 1984. Feeding habits, pp.76-92. In M. Canard, Y. Sémeria, and T.R. New (Eds.), Biology of Chrysopidae. Dr. W. Junk Publishers, The Hague. The Netherlands. Ramírez-Delgado, M., J. I. López-Arroyo., A. González-Hernández., M. H. Baddi-Zabeh. 2007. Rasgos biológicos y poblacionales del depredador Ceraeochrysa sp.nr. cincta (México) (Neuroptera: Chrysopidae). Acta Zoológica Mexicana 23(3): 79-95. Rodríguez-del-Bosque, L. A., H. C. Arredondo-Bernal. 2007. Teoría y Aplicación del Control Biológico, Sociedad Mexicana de Control Biológico, México. 303 p. SAS Institute Inc. 2000.SAS/ STAT users´s guide, version 9. SAS Institute Inc, Cary, NC. Tauber, M. J., C. A. Tauber. 1983. Life history of Chrysopa carnea and Chrysopa rufilabris (Neuroptera: Chrysopidae): influence of humidity. Annals of the Entomological Society of America, 76(2): 282-285. 461 EVALUACIÓN DEL RIESGO DEL PARASITOIDE DE HUEVOS Trissolcus halyomorphae (SCELIONIDAE) PARA CONTROLAR LA CHINCHE Halyomorpha halys (PENTATOMIDAE) EN LOS ESTADOS UNIDOS DE NORTE AMÉRICA Julio Medal, Trevor Smith y Andrew Santa Cruz. Florida Department of Agriculture and Consumer Services, Division of Plant Industry. Gainesville, Florida 32601. Estados Unidos. [email protected]; [email protected]; [email protected] RESUMEN. Se realizaron pruebas de especificidad en la cuarentena de Gainesville, Florida con la avispa parasítica Trissolcus haylyomorphae (Scelionidae), introducida de china, exponiendo hembras adultas a los huevos del chinche Halyomorpha halys (Pentatomidae). Esta chinche fue detectada por primera vez en Pennsylvania, Estados Unidos en 1998, probablemente introducida accidentalmente en material de embalaje. Para el 2013, esta chinche se ha dispersado en 38 estados y está causando daños considerables a árboles frutales, leguminosas de grano y vegetales. Como parte de la evaluación del riesgo para la liberación del parasitoide de huevos, se llevaron a cabos pruebas de selección y no-selección con 20 especies de chinches fitófagos y depredadores de Florida. Los resultados mostraron que el parasitoide de huevos tiene preferencia por la chinche objetivo y la mayor parte de las especies evaluadas (11) no mostraron ningún desarrollo del parasitoide, y 8 especies mostraron un nivel bajo de parasitismo. Palabras clave: Control biológico, Pentatomidae, Parasitoide de huevos, Estados Unidos Risk assessment of the egg parasitoid Trissolcus halyomorphae (Scelionidae) for biocontrol of Halyomorpha halys (Pentatomidae) in the USA ABSTRACT. Host-specificity tests were conducted at the Gainesville quarantine in Florida with the egg-parasitoid Trissolcus halyomorphae (Scelionidae), introduced from China, exposing female adults to egg masses of Halyomorpha halys (Pentatomidae). This insect was found in Pennsylvania, USA in 1998, accidentally introduced in packing material. In 2013 it has spread in 38 states and is causing significant damages to tree fruits, legumes and vegetables. As part of the risk-assessment to release the egg parasitoid, were conducted choice and no-choice feeding oviposition tests with twenty species of stink bugs including Florida phytophagous and predators. Results indicated that the egg-parasitoid prefers the target pest, and most of the non target tested (11) showed no parasitoid development and 8 had a low level of parasitoid emergence. Key words: Biological Control, Pentatomidae, Egg parasitoid, USA Introducción La chinche asiática Halyomorpha halys Stål (Heteroptera: Pentatomidae) (Fig. 1) fue introducida en 1998 en los Estados Unidos de América probablemente en material de embalaje (NAPIS, 2009). Este insecto es nativo de China, Japón, Corea y Taiwan (Hsiao, 1977; Zhang, 1985). Para el 2013, este insecto se ha dispersado en 38 estados (Fig. 2) incluyendo la Florida donde aunque no está establecido todavía, ha sido interceptado en repetidas ocasiones en varias regiones del estado (Halbert y Hodges, 2011; The Northeastern IPM Center, 2012). El rango de plantas hospederas es sumamente amplio incluyendo frutas tropicales y de regiones templadas, vegetales, leguminosas de granos y forrajeras, ornamentales y plantas silvestres (Hamilton y Shearer, 2003; Nielsen y Hamilton, 2009; Medal et al., 2012). En las regiones frías, este insecto sobrevive las bajas temperaturas del invierno penetrando las viviendas y otras estructuras encerradas convirtiéndose en una plaga urbana. En la primavera, los adultos migran hacia los campos de cultivos donde desarrollan poblaciones elevadas causando daños serios a las plantas hospedantes (Gill et al., 2010). 462 Figura 1. Halyomorpha halys (hembra y macho). Figura 2. Distribución de Halyomorpha halys Estados UnidosFuente: The Northeastern IPM Center. El parasitoide de huevos, Trissolcus halyomorphae Yang (Hymenoptera: Scelionidae) (Fig. 3) descrito por Yang et al., (2009) fue introducido de China dentro de cuarentenas en los Estados Unidos para ser evaluado como un agente potencial para control biológico de H. halys. Figura 3. Trissolcus halyomorphae (hembra y macho). Materiales y Método Como parte de la evaluación del riesgo para la liberación del parasitoide de huevos Trissolcus halyomorphae, se llevaron a cabo pruebas de especificidad (sin escogencia, con escogencia) en la cuarentena de Gainesville, Florida exponiendo hembras adultas de T. halyomorphae a 20 especies de chinches hediondos incluyendo fitófagos y depredadores en las familias Pentatomidae, Plataspidae y Scutelleridae (Cuadro 1). Una hembra adulta individual del parasitoide fue expuesta a una masa de huevos de cada especie de chinche evaluada dentro de un recipiente trasparente plástico (8 cm largo x 3 cm ancho) con papel impregnado con miel pura durante 24 horas en una cámara de crecimiento con 16 horas de fotoperíodo (16:8 h Luz/Oscuridad) a 20°C y 60% de humedad relativa. Se utilizó un diseño completamente al azar con más de 20 repeticiones. El número de parasitoides emergidos, el número de ninfas de las chinches, y el número de huevos no eclosionados en cada recipiente fueron registrados. Resultados y Discusión Resultados obtenidos en las pruebas de especificidad (sin escogencia, con escogencia) con el parasitoide de huevos T. halyomorphae y las 20 especies de chinches evaluadas pueden observarse en el cuadro 1. El nivel más alto de parasitismo (82%) fue obtenido con la chinche objetivo H. halys. En once de las especies de chinches evaluadas, el parasitoide de huevos no 463 pudo desarrollarse; dos especies de chinches mostraron un nivel de parasitismo menor del 1%; tres especies de chinches tuvieron un nivel de emergencia del parasitoide menor del 20%; y tres chinches (el depredador Podisus maculiventris; una plaga seria de los cultivos Thyanta custator; y una plaga secundaria de los cultivos Loxa flavicollis) tuvieron del 26 al 28 de parasitismo en las p b ‘ ’. E p b v p m P. maculiventris se redujo del 28% (sin escogencia) al 14% (con escogencia) (Cuadro 1). Pruebas de especificidad en la cuarentena de la Florida, Estados Unidos N Amé ‘w ’ m mp (Ch ) p h h p están llevando a cabo para determinar con mayor certeza el verdadero rango ecológico del parasitoide de huevos. Cuadro 1. Nivel de parasitismo en las chinches evaluadas en pruebas sin escogencia y con escogencia en una cámara de crecimiento dentro de cuarentena. Gainesville, Florida, Estados Unidos. Género Especie Sin Escogencia Megacopta Euschistus Proxys Nezara Murgantia Oebalus Piezodorus Mormidea Chinavia Euschistus Thyanta Podisus Holcostethus Orsilochides Euthyrhynchus Homaemus Edessa Loxa Alcaeorrhynchus Halyomorpha cribraria quadrator punctulatus viridula histrionica pugnax guildinii pama marginata servus custator maculiventris limbolarius guttata floridanus proteus bifida flavicollis grandis halys 0 0 0 0 0 0 0 0 0.9 0.3 26 28 16 17 16 0 0 28 0 82 Con Escogencia Con Escogencia Objectivo No Objectivo _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 79 0.7 86 0.7 89 2 89 14 90 20 91 16 _ _ _ _ _ _ Conclusiones Los resultados obtenidos en las pruebas de especificidad llevadas a cabo en pequeños recipientes en la cuarentena indican que el parasitoide de huevos, T. halyomorphae tiene un rango de hospederos limitado oligófago bajo las limitadas condiciones artificiales evaluado en las cuales no existen las condiciones naturales para expresar y responder a todas las señales de atracción o factores químicos (olfatorios) y morfológicos (color y forma del hábitat de los hospederos) que juegan un papel fundamental en la búsqueda y contacto con los hospederos naturales. No debe de rechazarse un agente potencial de control biológico únicamente basado en el rango fisiológico de hospederos obtenido bajos condiciones restringidas de jaulas o pequeños recipientes en cuarentena, sino que debe evaluarse el rango de especificidad de un agente 464 potencial de control biológico ya sea de insectos plagas o plantas invasoras bajo condiciones naturales en el lugar de origen de los organismos invasores de nuevas localidades geográficas. Consideramos que el parasito de huevos evaluado tiene un gran potencial para ser utilizado como un efectivo medio de control natural del chinche asiático invasor la cual tiene un amplio rango de plantas hospederas y se encuentra actualmente causando considerables pérdidas económicas a los agricultores de varias regiones de los Estados Unidos de Norte América. Los muestreos de campo que actualmente se están llevando a cabo por colaboradores en China, lugar de origen de la plaga y del enemigo natural suministrarán información sobre el rango ecológico del parásito de huevos en su hábitat original lo que contribuirá a la evaluación del riesgo de liberar este agente potencial de control biológico, y facilitará la aprobación de la liberación en el campo de este agente promisorio de control biológico. Agradecimientos Nuestro agradecimiento al Dr. Kim Hoelmer (USDA-ARS, Francia), Dra. Christine Dieckhoff y Kathleen Tatman (USDA-ARS, Newark, Delaware, Estados Unidos) por proveer el protocolo de las pruebas de especificidad en cuarentena para el parasito de huevos, Trissolcus halyomorphae, y por proveer el parasitoide y la chinche objetivo Halyomorpha halys para iniciar nuestras colonias de crías y poder llevar a cabo las pruebas del rango de hospederos. Literatura Citada Gill, S., Klick, S. and Kenney, S. 2010. Brown marmorated stink bug. IPM Pest Alert. University of Maryland Extension. 4p. Halbert, S. and Hodges, G. 2011. The brown marmorated stink bug, Halyomorpha halys (Stal). Pest Alert. Florida Department of Agriculture, Division Plant Industry. DACS-P-01763. 4pp. Hamilton, G. C. and Shearer, P. W. 2003. Brown marmorated stink bug – a new exotic insect in New Jersey. Fact Sheet FS002. Rutgers Cooperative Extension. 2p. Hsiao, T. Y. 1977. A handbook for the determination of the Chinese Hemiptera-Heteroptera. Vol. 1, Science Press. Biejing, China. Medal, J., Smith, T., Fox, T., Santa Cruz, A., Poplin, A. and Hodges, A. 2012. Rearing of the brown marmorated stink bug Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae). Florida Entomologist 95(3): 800-802. Napis. 2009. Reported status of brown marmorated stink bug, Halyomorpha halys. National Agricultural Pest Information System Pest Tracker. Http://pest.ceris.purdue.edu/searchmap.php?selectName=IQAQQKA (2 Julio 2009). Nielsen, A. L. and Hamilton, G. C. 2009. Seasonal occurrence and impact of Halyomorpha halys (Hemiptera: Pentatomidae) in tree fruit. Annals Entomological Society America 102: 608616. The Northeastern IPM Center. 2012. www.northeastipm.org. Yang, Z. Q., Yao, Y. X., Qiu, L. F. and Li, Z. X. 2009. A new species of Trissolcus (Hymenoptera: Scelionidae) parasitizing eggs of Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) in China with comments on its biology. Annals Entomological Society America 102(1): 39-47. Zhang, S. M. (Ed.) 1985. Economic Insect fauna of China, Fasc. 31, Hemiptera (1). Science Press. Biejing, China. 465 USO DE NEMATODOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE Gymnetis sp. (COLEPTERA: SCARABAEIDAE) EN PERÚ Mónica Narrea-Cango, Jenny Malpartida-Zevallos, Claudia Sofia Picho-Gómez y Melisa Elisée Vargas-Flores. Museo de Entomología. Universidad Nacional Agraria La Molina. Av. La Molina s/n La Molina. Lima, Perú. [email protected], [email protected], [email protected], [email protected] RESUMEN. Los escarabajos de la familia Scarabaeidae, tanto adultos como larvas son consideradas como insectos plagas de gran importancia económica, en especial las larvas que se alimentan directamente de las raíces de diversos cultivos, afectando su desarrollo y ocasionando en muchos casos la muerte de las plantas. Dentro de esta familia, la especie Gymnetis sp., se ha convertido en plaga importante del cultivo de vid (Vitis vinífera var. Red globe) por lo que se realizaron pruebas preliminares, bajo condiciones de laboratorio, para evaluar el efecto de Heterorhabditis sp. (Rhabditida: Heterorhabditidae) sobre larvas del tercer estadio de esta especie. Los resultados obtenidos hasta el momento muestran que el nemátodo causó alta mortalidad en esta plaga, siendo promisorio para convertirse en un componente del Manejo Integrado de Plagas. Palabras clave: Heterorhabditis sp., Gymnetis sp., Scarabaeidae. Use of entomopathogenic nematodes to effective control of Gymnetis sp. (Coleptera: Scarabaeidae) in Perú. ABSTRACT. The beetles of the family Scarabaeidae, both adults and larvae are considered insect pests of major economic importance; especially the larvae feed directly on the roots of various crops, affecting their development and in many cases causing death of plants. Within this family, the specie Gymnetis sp., has become important pest of grape (Vitis vinífera var Red globe), therefore were conducted preliminary tests, to evaluate the effect of Heterorhabditis sp. (Rhabditida: Heterorhabditidae) on larvae Gymnetis sp. (Coleoptera: Scarabaeidae) under laboratory conditions. The results show that the nematode caused high mortality in the larval stages of this pest, being promising to become a component of Integrated Pest Management. Key words: Heterorhabditis sp., Gymnetis sp., Scarabaeidae. Introducción El Valle de Ica es una de las zonas con mayor producción de vid (Vitis vinífera), en el Perú, desde el año 2011, los agricultores de la zona del Distrito de Santiago se han enfrentado a una nueva plaga, identificada por la Entomóloga Mónica Narrea de la Universidad Nacional Agraria La Molina de Lima, como Gymnetis sp. (Fig. 1), el cual es un escarabeido fuertemente atraído hacia los campos de vid por la mala práctica agrícola de incorporar materia orgánica fresca o poco descompuesta. Su adaptación al cultivo de vid es alta, al punto que las autoras consideran que se puede convertir en una de las plagas claves de vid, pues en campo se observa a las larvas alimentándose no solo de materia orgánica sino también de las raíces y los adultos atacan principalmente racimos y brotes, lo que ocasiona severas pérdidas en la cosecha. Campos con lotes fuertemente infestados con larvas han tenido bajos rendimientos de racimos y fuerte estrés de plantas en la campaña 2012. 466 Figura 1. Vista del adulto de Gymnetis sp., atacando racimos de vid. La presencia de esta plaga, ha ocasionado la aplicación intensa de plaguicidas químicos, incrementando los costos de producción tal como señala Sañudo y Guzmán (1995) así como, un desequilibrio en el agroecosistema. Duarte (2012), cita que el uso del control biológico como componente del Manejo Integrado de Plagas cada vez es más frecuente y recomendado para revertir esta situación, porque permite reducir costos, cumplir con las medidas fitosanitarias internacionales y apoyar la preservación del ambiente y la salud. Es por ello que en la búsqueda de alternativas para controlar esta plaga, se plantea el uso del nematodo entomopatógeno (NEP) de la familia Heterorhabditidae, el cual es usado principalmente en cultivos agrícolas, sobre insectos que poseen un estadio susceptible en el suelo o sobre la superficie (Rosales et al., 1999). El presente trabajo se realizó con el propósito de evaluar bajo condiciones de laboratorio, el control de larvas del tercer estadio larval de Gymnetis sp., mediante la aplicación del nematodo entomopatógeno Heterorhabditis sp., como una alternativa eficaz para el control de esta plaga. La evaluación sobre larvas del tercer estadio larval, fue para estandarizar con otros estudios y que es corroborado por Quintero (2003), quien trabajó con Phyllophaga menestriesi que señala que el tercer estadio es el más dañino al permanecer más tiempo alimentándose de las raíces principales de las plantas, y por lo tanto, es sobre éste en el que se centralizan los esfuerzos de control químico y biológico. Materiales y Método Entre los meses de diciembre del 2012 a marzo del 2013, se colectaron larvas del tercer estadio de Gymnetis sp., de campos de vid ubicados en el Valle de Ica Distrito de Santiago (Fig. 2). Las larvas colectadas fueron colocadas en recipientes de plásticos de 50 cc con tapas de tela, a los que se incorporó previamente 200 cc del suelo de la misma zona. Se trasladaron al laboratorio y se dejaron en cuarentena por 30 días para descartar las larvas enfermas. 467 Figura 2. Larvas del tercer estadio de Gymnetis sp., tal como se observa en campos de vid. Los estados infectivos del nemátodo Heterorhabditis sp. (Rhabditida: Heterorhabditidae). Fueron facilitados por el Programa de Control Biológico del Servicio Nacional de Sanidad Agraria del Perú (SENASA – Perú), gracias a la colaboración de la Blga. Hilda Gamarra. Estos fueron remitidos en esponjas de 10 x 10 cm, conteniendo una suspensión de agua con los nematodos en su estado juvenil o J2. Para extraer los nematodos, se colocó una de las esponjas en un recipiente de un litro conteniendo 500 ml de agua destilada y agitando muy suavemente por cinco minutos. A partir de la solución madre se tomó un mililitro de nematodos y se diluyó en 9 ml de agua destilada estéril, en una placa de conteo (Fig. 3) y con un estereoscopio se realizaron los cálculos pertinentes, para ajustar una concentración final de 103 J2/ml de Heterorhabditis sp. Figura 3. Placa usada para en contar Heterorhabditis sp. Las larvas del tercer estadio, colectadas directamente de los campos de vid afectados, fueron preparadas antes de iniciar los tratamientos, realizándose la limpieza y desinfección de las mismas, con hipoclorito de sodio al 0.5% por 1 minuto, luego se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril, eliminándose el exceso de humedad sobre papel toalla. Se realizaron dos tratamientos y un testigo, con cinco repeticiones cada uno y tres individuos por tratamiento: 468 El primer tratamiento (T1) fue por inmersión de las larvas de Gymnetis sp., en 20 ml de la concentración de prueba, dejándolas en reposo y colocándolas luego en grupos de tres individuos en recipientes plásticos desechables de 500 ml que contenían 250 gr de sustrato de abono orgánico certificado, los recipientes fueron tapados con tapas ventiladas mediante malla de tela que facilite la ventilación. El segundo tratamiento (T2) fue por aplicación directa de 10 ml de la concentración de prueba sobre cada uno de los recipientes plásticos desechables de 500 ml que contenían 250 gr de sustrato de abono orgánico certificado, a los que previamente se había colocado tres larvas de Gymnetis sp. (Fig. 4). Figura 4. Aplicación al sustrato de suelo una solución 10 ml de Heterorhabditis sp. El tercer tratamiento (T3), fue el testigo y consistió en larvas limpias y desinfectadas previamente sin aplicación y colocadas directamente sobre los recipientes contendiendo el sustrato indicado. En los tres tratamientos los frascos fueron rotulados con el código del tratamiento y la fecha y almacenados en oscuridad en el Laboratorio de Crianza de Insectos de la Universidad Nacional Agraria La Molina, a temperatura ambiente de 22°C +/- 1ºC. Las evaluaciones se realizaron diariamente, registrándose síntomas y mortalidad. Resultados y Discusión En todos los tratamientos, la toma de datos de mortalidad se realizó hasta el día cinco, tiempo en el cual los tratamientos T1 y T2 alcanzaron el 100% de mortalidad de las larvas de Gymnetis sp., correspondiente a la concentración de 103 J2/m de Heterorhabditis sp. En el cuadro 1 se puede observar que estos dos tratamientos, ocasionaron el día cuarto una mortalidad del 20%. Si bien es cierto esta mortalidad total final, se obtuvó con una alta concentración confirma lo señalado por Koppenhofer et al. (2004) que indican que una elevada concentración de nematodos ocasiona una alta mortalidad de larvas de Scarabaeidae. Con respecto al testigo o tratamiento T3, no se observó mortalidad en ninguna de las repeticiones, continuando la larva su ciclo biológico hasta alcanzar el estado adulto, lo cual ocurrió en un tiempo promedio 78 días después del ensayo. En tal sentido dado la igualdad de 469 resultados entre T1 y T2 y la alta diferencia en los resultados entre T1 y T3 o entre T2 y T3, no fue necesario el análisis estadístico, que corrobora los resultados obtenidos. Cuadro 1: Mortalidad (%) del nematode Heterorhabditis sp. Sobre larvas L3 de Gymnetis sp. (Coleoptera: Scarabaeidae), bajo condiciones de laboratorio, según tratamiento. Tratamiento T1 T2 T3 Día 1 0 0 0 Mortalidad en porcentaje (%) registrada en forma diaria Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 0 0 20 100 0 0 20 100 0 0 0 0 En los tratamientos T1 y T2 las larvas presentaron coloración rojiza causada por la infección con el nematodo, además bajo el estereoscopio, se observó gran cantidad de nematodos vivos sobre las larvas muertas de Gymnetis sp. Tal como lo menciona Ishibashi y Kondo (1990), Heterorabditis sp., es el género con mayor posibilidad de penetración gracias a que posee un diente terminal con el que raspa las áreas intersegmentales y la cutícula del insecto, facilitando su entrada al cuerpo del insecto. El tamaño de la larva es un factor importante al momento de plantear el control, Deseö et al. (1992) encontraron que al trabajar con Melolontha melolontha, las larvas del tercer estadio no eran susceptibles a cepas de Heterorabditis al igual que Quintero (2003) que obtuvo solo 10.5% de mortalidad sobre larvas del Phyllophaga menestriesi, sin embargo, Gymnetis sp., presentó una alta susceptibilidad de 100%, similar a Wright et al. (1988), que encontraron que el porcentaje de mortalidad ocasionado por Heterorabditis sobre larvas de Popillia japonica fue del 100% mientras que Smits (1992) encontró que Heterorabditis cepa HE-87.3 causó el 98% de mortalidad sobre Phyllopertha horticola. Las larvas que conformaban el tratamiento control, no presentaron mortalidad, lo que confirma el buen estado de salud de las larvas. Shahina et al. (2009) obtuvieron alto porcentaje de mortalidad, 95% utilizando 150 J2/ml en el primer estadio larval, 97% con 200 J2/ml en el tercer estadio larval y 100% con 300 J2/ml en el último estadio de Rhynchophorus ferrugineus, concentraciones bajas en comparación al presente trabajo en el que se utilizó una concentración alta de 10000 J2/ml obteniéndose alta mortalidad. Los resultados se muestran promisorios, por lo que se continuará la investigación para determinar dosis efectiva, cepas virulentas, susceptibilidad de diferentes estados de desarrollo y pruebas en campo, con el fin de implementarlo en un programa efectivo de Manejo Integrado de Plagas. Conclusiones Las larvas del tercer estadio de Gymnetis sp., que se encuentran atacando campos de vid en Perú, son susceptibles al nematodo entomopatógeno Heterorabditis sp. La concentración de 103 J2/ml de Heterorabditis sp., resultó efectiva al obtener 100% de mortalidad al quinto día de aplicación. Agradecimientos Agradecemos a la Biól. Hilda Gamarra, del Laboratorio de Producción de Nematodos de SENASA, por proporcionar el material biológico para el presente trabajo y a la Ing. Sibyl Loayza, por las facilidades prestadas en el muestreo de larvas. 470 Literatura Citada Deseö, K., G. Lazzari and R. Zelger. 1992. Scarab problems and microbial control in Italy. En: T. A Jackson. and T. R. Glare (Eds.). Use of pathogens in scarab pest management, Intercept. Andover. Inglaterra. pp. 247-251. Duarte, F. 2012. El control biológico como estrategia para apoyar las exportaciones agrícolas no tradicionales en Perú: un análisis empírico. Rev. Contabilidad y Negocios (7) 14. pp 81100. Ishibashi, N. and E. Kondo. 1990. Behavior of infective juveniles. En: R. Gauler and H. Kaya (Eds.). Entomopathogenic nematodes in biological control. CRC Press, Inc. Estados Unidos. pp. 139-150. Koppenhofer, A. M., E. M. Fuzy, R. L. Crocker, W. D. Gelernter and S. Polavarapu. 2004. Pathogenicity of Heterorhabditis bacteriophora, Steinernema glaseri, and S. scarabaei (Rhabditida: Heterorhabditidae, Steinernematidae) against 12 white grub species (Coleoptera: Scarabaeidae). Biocontrol Sci. Technol. 14(1): 87-92. Quintero, M. 2003. Comparación en el laboratorio de la patogenicidad de tres especies nativas de nemátodos entomopatógenos (Rhabditida) sobre larvas de tercer instar de Phyllophaga menestriesi (Blanchard) (Coleoptera: Scarabaeidae). Tesis para optar el título de Bióloga. Programa académico de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad del Valle. Chile. pp. 1-58. Rosales, C., Suarez, Z., Navas, R. y V. Tellechea. 1999. Nemátodos entomopatógenos: II. Uso en el control biológico. FONAIAP DIVULGA. N°64, Octubre –Diciembre 1999. Sañudo, B. y G. Guzmán. 1995. Experiencias en el manejo de chisas en Nariño. Labranza Cero 5(1): 1-7. Shahina F., Gulsher M., Javed, S., Khanum T. and M. I. Bhatti. 2009. Susceptibility of different life stages of red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus, to entomopathogenic nematodes. International Journal of Nematology. 19(2): 232-240. Smits, P. 1992. Control of white grubs, Phyllopertha horticola and Amphimallon solstitiales in grass with Heterorhabditid nematodes. En: T. A Jackson and T. R. Glare (Eds.). Use of pathogens in scarab pest management, Intercept. Andover. Inglaterra. pp. 229-235. Wright, R. J., M. G. Villani and F. Agudelo-Silva. 1988. Steinernematid and heterorhabditid nematodes for control of larval European chafers and Japanese beetles 1. (Coleoptera: Scarabaeidae) in potted yew. Journal of Economic Entomology. 81(1):152-157. 471