Fermentación maloláctica en vinos

La Fermentación Maloláctica
Cambios organolépticos
Ing. Agr. Silvia Paladino
Conversión de ác.málico
ác málico en ác.
ác láctico,
láctico
catalizada por la enzima maloláctica
COOH
COO
CH2
CHOH
COOH
ác. L(-)Málico
NAD
Mn+2
CH3
CHOH + CO2
COOH
ác. L(+)Láctico
Las bacterias lácticas son los agentes causales de este
cambio
bi
Ácido málico
Propio de las uvas
La concentración depende de la zona donde
se cultivaron las uvas
Zonas templadop
frías
2 a 8 g/L
Z
Zonas
cálidas
álid
< de 2 g/L
g/
Bartowsky, 2005
Bacterias Lácticas
á
Ell vino es un ambiente
b
hostil
h
l para las
l bacterias
b
Bajo pH
Alta concentración de Etanol
Baja concentración de nutrientes
SO2
Bacterias Lácticas
Sólo 4 g
géneros son capaces
p
de sobrevivir en las
condiciones del vino:
Oenococcus
Lactobacillus
P di
Pediococcus
Leuconostoc
Pero sólo Oenococcus oeni soporta pH < 3,5
G m+
Gram
Metabolismo de las bacterias lácticas
H
Homofermentativo
f
t ti
Azúcares
Glicólisis: glucosa
Pediococcus y algunos Lactobacillus
ác. Láctico y CO2
piruvato
Glicólisis
glucosa
ATP
fructosa
glucosa-6-fosfato
fructosa-6-fosfato
ATP
fructosa 1,6-difosfato
1 6-difosfato
Gliceraldehido 3 fosfato
Dihidroxiacetona fosfato
NAD+
NADH
1,3 –difosfoglicerato
3-fosfoglicerato
ATP
2-fosfoglicerato
fosfoenolpiruvato
ATP
piruvato
i
t
Lactato
Metabolismo de las bacterias lácticas
Heterofermentativo
Azúcares
ác. láctico
ác
láctico, etanol
etanol, glicerol
ác. acético, manitol y CO2
Á id cítrico
Ácido
ít i
ác. acético,
á
éti
CO2 y ác.
á
láctico
Vía pentosa fosfato para degradar
hexosas y pentosas
Oenococcus, Leuconostoc y algunos Lactobacillus
Vía Pentosa Fosfato
Glucosa
Fosfo-6-gluconato
ATP ADP
NADP+
CO2
NADPH
Ribulosa 5-Fosfato
5 Fosfato
NADP+
NADPH
Xil l
Xilulosa
5
5-fosfato
f f t
Acetil-fosfato
ADP
A t t
Acetato
ATP
NADH
NAD+
Acetaldehido
NADH
Gliceraldehido 3- fosfato
(glicolisis)
ATP
Piruvato
NAD+
Etanol
ADP
Lactato
Oenococcus oeni
Heterofermentativo: forma ác. Láctico,, CO2 y
etanol o ácido acético a partir de azúcares
Resiste pH < 3,5
Casi todas las FML espontáneas
Comercialmente disponible
Oenococcus oeni
Oenococcus oeni
Oenococcus retenido en filtro de 0,45 micrones
Interacción
ó levadura
l
d
-bacteria
b
Levaduras
Negativos
Competencia por nutrientes
Formación y combinación de SO2
Formación de ácidos grasos de cadena
larga
Positivos
Liberación de polisacáridos de la pared y
proteínas
t í
(li
(lisis)
i )
Evolución del crecimiento bacteriano
Factores q
que influyen
y sobre el crecimiento
bacteriano
• pH
• Temperatura
• SO2, Lisozima
• Alcohol
• Nutrientes
• Oxígeno
• Ácidos
Á id orgánicos
á i
• Bacteriófagos
g
Factores que influyen sobre el crecimiento
bacteriano
• pH
Mínimo pH=3,1
pH 3 1
Oenococcus resistente a pH<3,5
p
,
Lactobacillus y Pediococcus pH>3,5
C t b li
Catabolismo:
pH
H 3,2
32
Á Málico
Ác.
Máli
pH 3,5
p
,
Azúcares
Velocidad de FML
Factores que influyen sobre el crecimiento
bacteriano
• Temperatura
<15ºC
FML no progresa
20-25ºC óptimo
p
• SO2
<30
30 mg/L
/L SO2 Total
T t l
Hasta 0,5
, mg/L
g/ SO2 Molecular
Ataque al acetaldehído y ác. pirúvico
Factores q
que influyen
y sobre el crecimiento
bacteriano
• Lisozima
Autorizada por INV Res.33/2009
Dosis máxima acumulada: 500 mg/L
( )
Controla bacterias Gram (+)
ataca la pared celular.
No controla levaduras ni bacterias acéticas
acéticas.
Efectiva a pH alto.
No modifica características organolépticas.
(proteínas);
); tintos (taninos
(
y color))
Problemas: blancos (p
Factores que influyen sobre el crecimiento
bacteriano:lisozima
Yun Cai Gao et al, AJGWR, 8, 76-83, 2002
Factores que influyen sobre el crecimiento
bacteriano
• Alcohol
13 5% limitante
13,5%
Mayor
y cont. Alcohol,, FML más lenta
• Nutrientes
R
Requerimientos
i i t complejos
l j
Autólisis de levaduras
Factores q
que influyen
y sobre el crecimiento
bacteriano
• Oxígeno
Las bacterias lácticas son microaerófilas
Aireación moderada: estimula FML
Aireación intensa: ácido acético
• Acidos orgánicos
g
Fumarato y ác. Grasos: inhibidores
Factores q
que influyen
y sobre el crecimiento
bacteriano
• Bacteriófagos
Partículas semejantes a virus , que infectan
y lisan bacterias
Encontrados sobre bacterias de la FML
P ibl responsabilidad
Posible
bilid d en FML problemáticas
bl áti
Consecuencias de la FML
Modificación de la acidez
Descriptores
p
para
p
un vino que
q ha completado
p
la
FML exitosamente
Manteca
Levadura
d
Vainilla
Especias
Nuez
Miell
Cuero
Tostado
Mayor volumen en boca
Mayor persistencia en boca
Menor astringencia
Reducción de los aromas vegetales,herbáceos
Descriptores
p
para
p
un vino que
q ha completado
p
la
FML sin control a pH > 3,5
Aromas lácticos intensos
Yogurt rancio
Notas de sudor
Ac. Acético
Notas animales
Cuero mojado
Fósforo quemado
Fruta en descomposición
Amargo
g intenso al final de boca
Consecuencias de la FML
C bi organolépticos:
Cambios
lé ti
sabor, aroma, color, textura
Modificaciones higiénico sanitarias
Estabilidad microbiana
FML: cambios organolépticos
Sabor
Modificación de la acidez
Acidez total y pH
Acidez volátil
FML: cambios organolépticos
Sabor
Acidez total: disminuye hasta 2g/L
pH: aumenta 0,1-0,25 unidades
Acidez volátil: aumenta aprox.
aprox 0,2
0 2 g/L
FML: cambios organolépticos
Sabor
Málico (diácido)
Láctico (monoácido)
Málico es un ácido más fuerte que láctico
pK1 = 3,45
pK = 3,78
Málico: duro
Láctico: untuoso
FML cambios
FML:
bi organolépticos
lé ti
Sabor y Aroma
Color
FML: cambios organolépticos
Aroma y sabor
Modificación del carácter floral ó frutal
Incorporación de aromas lácticos,
lácticos
manteca (diacetilo), nueces
Mayor complejidad aromática
á
Menor percepción de la astringencia
Mayor untuosidad
Potencialmente: Gusto a “ratón”
Gusto a geranio
Diacetilo
C
C
C
C
H3
O
O
H3
1 - 4 mg/L
positivo
5 - 7 mg/L
defecto
manteca, manteca rancia
movie
o
pop-corn
pop o
Umbral de detección en vino
0.2 mg/L para Chardonnay
0.9 mg/L para Pinot Noir hasta 2.8 mg/L para Cabernet
Sauvignon (Martineau et al., 1995a).
Bartowsky & Henschke, 2004
Diacetilo
Catabolismo del ác. Cítrico
Contenido de ácido málico en mostos
1 a 8 g/L
Contenido de ácido cítrico en mostos
0,1 a 0,7 g/L
Metabolismo del ácido cítrico en Oenococcus oeni
(Ramos et al, 1995, en Bartowsky & Henshke, 2004)
Citrato liasa
Diacetilo
Clave del gráfico metabolismo del ácido cítrico
1.Citrato liasa
2. Oxaloacetato
l
3. Piruvato decarboxilasa
4. Alfa acetolactato sintasa
5. Alfa acetolactato decarboxilasa
6. Diacetil reductasa
7. Acetoina
ceto a reductasa
eductasa
8. Lactato deshidrogenasa
9. Complejo Piruvato deshidrogenasa
10 Acetato quinasa
10.
11. Decarboxilación no enzimática del alfa acetolactato
12. Aspartato aminotransferasa, TPP, Tiamina PP
Diacetilo
Las levaduras pueden formar también
diacetilo
diacetilo,
pero debido al ambiente
reductor de la FA, es reducido a acetoina
y 2,
2 3 butilen
b til glicol.
li l
Los productos reducidos son menos
tóxicos (para la levadura) que el diacetilo,
diacetilo
y además esta reducción aumenta la
concentración
ó de NAD Y NADP
Diacetilo
El metabolismo del ácido cítrico no se
inicia hasta que se haya metabolizado
más de la mitad del ácido málico.
málico
(B t
(Bartowsky
k &H
Henshke,
hk 2004)
FML en Cabernet Sauvignon
g
Factores que afectan la producción de
diacetilo en vino
Caso real: El vino tenía 1,8
1 8 mg/L de diacetilo,
diacetilo
producto de la FA.
El diacetilo p
producido en la FML llegó
g a un máximo
cuando se consumió el 95% del ácido málico, que
coincide con el 75% del ácido cítrico metabolizado.
Cuando todo el ác.
ác cítrico (día 20) se ha consumido,
consumido
la concentración de diacetilo ha decrecido
prácticamente al nivel inicial.
inicial
Factores que afectan la producción de
diacetilo en vino
¿Que ha ocurrido?
Umbrales de detección
Diacetilo 0,2 a 2,8 mg/L
A t í 150 mg/L
Acetoína
/L
2,3 butanodiol 600 mg/L
No contribuyen organolépticamente, por estar debajo del umbral
Bartowsky & Henshke, 2004
Factores q
que afectan la producción
p
de
diacetilo en vino
La cantidad final de diacetilo en un vino depende
de la cantidad producida (FA y FML) y de la
intensidad de la reducción posterior sufrida.
La intensidad de la reducción del diacetilo depende
de la cepa de bacterias que interviene,
interviene en ausencia
de levaduras.
Factores que afectan la producción de
diacetilo en vino
El metabolismo de los ácidos málico y cítrico depende
de la etapa de crecimiento de las bacterias presentes.
No hay degradación de ácido málico hasta que la
población
bl ió no alcanza
l
0,5
0 5 a 1 x 106 ufc/mL.
f / L
Factores que afectan la producción de diacetilo en
vino
/
Gran número de bacterias 108 ufc/mL
No hay multiplicación de bacterias
Los ácidos málico y cítrico son degradados
g
simultáneamente por actividad de las células no
proliferantes.
Menor producción de diacetilo.
Bajo número de bacterias 106 ufc/mL
Hayy multiplicación
p
de bacterias
Se degrada inicialmente el ácido málico, posteriormente es
atacado el ác. cítrico. Mayor producción de diacetilo.
Factores q
que afectan la producción
p
de
diacetilo en vino
Pinot Noir
Contenido de diacetilo después de FA
FA=0,5
0,5 mg/L
Inoculado
Inoc
lado con 2 X 104 ufc/mL
fc/mL
Diacetilo producido en FML = 3,9 mg/L
Inoculado con 2 X 106 cfu/mL
Diacetilo producido en FML = 1,7 mg/L
Factores q
que afectan la producción
p
de
diacetilo en vino
Bartowsky & Henshke, 2004
Factores q
que afectan la producción
p
de
diacetilo en vino
Temperatura
En general, óptimo para LAB: 27°C
En vino: 15 a 25°C
óptimo para O.
O oeni : 20 a 22°C
18°C menor concentración de diacetilo
27°C mayor concentración de diacetilo
Pero : Menor velocidad de remetabolismo del
diacetilo a menor temperatura
Factores q
que afectan la producción
p
de
diacetilo en vino
pH
Menor pH
p
mayor concentración de diacetilo
La formación de ácido acético a partir de ácido
cítrico se ve favorecida a pH elevados
Factores q
que afectan la producción
p
de
diacetilo en vino
Concentración de ácido cítrico en el vino
Contenido de ácido cítrico en mostos 0,1
, a 0,7
, g/L
g/
Bauer y Dicks, 2004
La degradación del ácido cítrico requiere glucosa, ya que
O.oeni no puede emplear el ác. Cítrico como única fuente
de carbono.
Mayor concentración de ác. cítrico se asocia con mayor
concentración de diacetilo, pero también con mayor conc.
de ác.
ác acético
Factores q
que afectan la producción
p
de diacetilo en vino
Presencia de azúcares fermentescibles en el vino
Factores que afectan la producción de diacetilo en vino
3 fases
Fase I:
Crecimiento celular, consumo de azúcares, producción de
lactato Limitada producción de acetato.
lactato.
acetato No hay ataque al
ác. Málico ni al ác. Cítrico.
Fase II:
Cesa el consumo de azúcares. Fase estacionaria del
c ecimiento cel
crecimiento
celular.
la Se inicia el catabolismo del ác.
ác Málico y
la producción de lactato. No hay producción de acético.
F
Fase
III
III:
Fase estacionaria del consumo de malato. Se inicia
catabolismo
t b li
del
d l citrato
it t y producción
d ió de
d acetato.
t t
Factores q
que afectan la producción
p
de diacetilo en vino
La citrato liasa es reprimida por glucosa
Citrato
liasa
El crecimiento de las bacterias durante la FML,, puede
p
provocar
p
una considerable
producción de ácido acético, si hay suficientes azúcares durante la FML.
Factores que afectan la producción de diacetilo en vino
SO2
El SO2 reacciona con las funciones aldehído y cetona
Combina con diacetilo en forma reversible y exotérmica, el
pierde su aroma característico.
diacetilo combinado p
El SO2 reduce la cantidad de diacetilo libre
libre, disminuyendo
el descriptor manteca en el vino. Disminuye el SO2 libre,
aumenta el carácter manteca.
Mayor
y percepción
p
p
de diacetilo a mayor
y temperatura.
p
Factores que afectan la producción de diacetilo en vino
Contacto con el aire durante la fermentación
La conversión de acetolactato a diacetilo es una decarboxilación no
enzimática, se ve favorecida en presencia de oxígeno.
Diacetilo formado en anaerobiosis=
anaerobiosis 2 mg/L
Diacetilo formado en semiaerobiosis= 12 mg/L
Diacetilo presente 20 días después de finalizada FML= 0,5 mg/L
Vino chardonnay
Nielsen, J. C.; Richelieu; M.; 1999. Citado por Bartowsky & Henshke, 2004
Factores que afectan la producción de diacetilo en vino
Contacto con borras de levaduras
S h
Saccharomyces
cerevisiae
i i es capaz de
d producir
d i y de
d
degradar diacetilo.
La presencia de borras de levaduras
levaduras, especialmente si son
agitadas, disminuye el tenor de diacetilo.
Vino Pinot noir
Fin de FA= 0,5 mg/L de diacetilo
Fin de FML =3,9
=3 9 mg/L de diacetilo
Después de filtración y sulfitado=1,7 mg/L
Conservación sobre borras por 4 semanas = 0
0,2
2 mg/L
Las borras son bioquímicamente activas y reduce el diacetilo a acetoína y
butanodiol.
Krieger et al, 2000 citado por Bartowsky & Henshke, 2004
Reacciones del diacetilo con otros
compuestos
Diacetilo + malv.
malv 3 glucósido = derivados del
tipo Castavinol (incoloros)
Diacetilo + cisteína = aromas azufrados,,
florales, frutados, tostados, carnes asadas
Casta inol
Castavinol
Antociano
Diacetilo
C t i l
Castavinol
Castagnino et al
al,1996
1996
Otras modificaciones del aroma
Acetato de etilo
Umbral : 10 mg/L
p
frutal
descriptor:
descriptor: solvente, a mayores concentraciones
Lactato de etilo
Umbral:90 mg/L
descriptor: frutal
Producción de glicosidasas
Precursores aromáticos
Depende
p
de la cepa
p de bacterias y de la variedad de uvas.
Viognier vs Muscat
Azúcar + monoterpenos = inodoro
Azúcar + monoterpenos + β glicosidasa = hidrólisis =
= terpeno
p
libre aromático
Ejemplos: 3 hidroxidamascenona, alfa terpineol, vainillina,
metil vainillato, linalol, nerol y geraniol
Producción de glicosidasas
Oenococcus oeni hidroliza precursores aromáticos glicosilados, por acción
de β- glucosidadas.
A pH más elevado, mayor actividad de la enzima
U li
Ugliano
et al.
l JJ. A
A.Food
F d Ch
Chem., 2003
2003, 51,
1 5073-5078
0 3 0 8
Producción de glicosidasas
Ataque a los antocianinas
s
β glicosidasa
li
id
El aglucón es incoloro o pardo
Se pierde el color rojo original
Gusto (olor) a “Ratón”
Ratón
Metabolismo de aminoácidos
Heterofermentativos
2-acetil
2
til tetra
t t hid
hidro piridina
i idi
2-acetil 1-pirrolidina
2 etill tetra hidropiridina
2hd
d
Homofermentativos
Mínima o nula p
producción
Lisina
Ornitina
Oenococcus oeni,
L
Leuconostoc
t mesenteroides
t id
algunos Lactobacillus
Gusto (Olor) a Ratón
Mousy off flavors
Pediococcus
Lactobacillus plantarum
Gusto (olor) a geranio
COOH
CH
CH
CH
CH
CH3
Ác.sórbico
No tóxico para seres humanos
Fungistático:
inhibe levaduras
no afecta a las bacterias
Límite legal: 200 mg/L (INV R N° C.8/2010)
Gusto (olor) a geranio
At
Ataque
d
dell ác.
á Sórbico
Só bi por las
l bact.
b t Lácticas
Lá ti
Sorbil alcohol
2,4 hexadien 1 ol + etanol
2-etoxi-hexa 3,5 dieno : olor a geranio
Umbral de percepción: 100 ng/L
Ocurre cuando no hay suficiente SO2 para controlar a las
bacterias
Este defecto no se puede corregir
•
Producción de fenoles volátiles
Degradación de ác. cinámicos
Pediococcus (algunas cepas)
Lactobacillus
actobac us b
brevis
e s
Lactobacillus plantarum
Oenococcus (algunas cepas)
Producción de fenoles volátiles
Degradación de ác. tartárico
Lactobacillus
En condiciones aeróbicas
Producción
P
d ió de
d ác.
á acético,
éti
lá
láctico
ti y
succínico
D
Degradación
d ió del
d l acetaldehido
ld hid
Algunas cepas de Oenococcus oeni
Lactobacillus
Acetaldehido
ácido acético
etanol
Potencial liberación de SO2
FML incompleta o prolongada
Degradación
g
del glicerol
g
Solo: Lactobacillus brevis
Lactobacillus hilgardii
Pediococcus pentosaceus
p
Glicerol
3 hidroxi propionaldehido
Conservación prolongada en medio ácido
Acroleína
Reacción con fenoles del vino
Compuesto amargo
Sensaciones táctiles asociadas a la
producción de polisacáridos
Pediococcus damnosus
Biosíntesis de polímeros exocelulares
polisacáridos
β -d- Glucano
Oenococcus oeni tiene actividad de tipo β -dGl
Glucosidasa
id
Sensaciones táctiles asociadas a la
producción de polisacáridos
Consecuencias
Niveles excesivos
Vinos siruposos, desagradables
Dificultades en las filtraciones
Niveles moderados
Mayor cuerpo y volumen en boca
S Q Liu,
S.Q.
Liu 2002
Cambios en el color
La intensidad colorante disminuye un 25% 30%
El pH aumenta 0,1 a 0,25 unidades
Los antocianos varían su color según el pH
FML y el color de los vinos
p
pH
AV g/L
AT g/L
/L
IC
Antoc. mg/L
Testigo
FML
3,82
,
0,19
5 01
5,01
1,026
,
673,6
4,01
,
0,36
3 90
3,90
0,764
,
657,8
Paladino, Galiotti, Formento, Rev. Fac. C. Agrarias, 2001
Perfil organoléptico del vino Malbec
con y sin FML
C o llo r
4
B o c a Am a rg o
N a riz F ru ta d o
3
2
B o c a H e rb á c e o
N a riz E s p e c ia s
1
0
B o c a Alc o h ó lic o
B o c a Ac id e z
B o c a U n tu o s id a d
B o c a As trin g e n c ia
B o c a F ru ta d o
T e s tig
go
F ML
M difi i
Modificaciones
higiénico
hi ié i sanitarias
it i
Decarboxilación de los aminoácidos
• Producción de Aminas biógenas : histamina
>1
1 mg/L
/L provoca reacciones
i
en personas sensibles
ibl
Causa picazón, problemas respiratorios, secreción nasal
Vinos de pH alto, más histamina.
Bacterias en contacto con el vino luego del fin de FML, más histamina.
• Producción
P d ió de
d etil
til carbamato
b
t
Arginina
urea
etil carbamato
Estabilidad microbiana
Consumo de Nutrientes
Producción de Toxinas
Aumento
A
t d
de pH
H
Desarrollo p
posible de bacterias acéticas
Estabilidad
b l d d microbiana
b
La FML solo confiere estabilidad ante un
nuevo ataque de bacterias lácticas.
No surgirán problemas en la botella
Finalmente:
¿Permitir la realización de FML ó no?
¿FML espontánea
p
ó Inocular bacterias?
¿Cuándo inocular?
¿Có
¿Cómo
controlar
t l ell proceso??
¿Permitir q
que se degrade
g
el ác. Cítrico?
¿Cuándo y cómo finalizar la FML?
Bibliografía
Bartowsky, E. Oenococcus oeni and malolactic fermentation- moving into the molecular arena. Australian Journal of
Grape and Wine Research. 2005, 11 (174-187).
Bartowsky, E., Henschke,P. The “buttery” atribute of wine -diacetyl- desirability, spoilage and beyond. Int. J. of Food
Microbiology. 2004. 96 (235-252).
Bauer, R. and L.M.T. Dicks. Control of Malolactic Fermentation in Wine. A Review.S. Afr. J. Enol. Vitic. 2004. Vol. 25, No. 2.
Castagnino, C.; Chèze, C.; Vercauteren, J. 1996 : les molécules des futurs millésimes bordelais? Bull. Soc. Pharm.
Bordeaux, 1997, 136, 19-36
Liu, S. Q. Malolactic fermentation in wine – Beyond deacidification. J. of Applied Microbiology. 2002, 92 (589-601).
Paladino, S.; Galiotti, H.; Formento, J. La fermentación maloláctica y el color de los vinos tintos. Rev. Fac. C. Agrarias.
2001, Tomo XXXIII, N°2 (105-110).
Swiegers, J.;Bartowsky,
S
k E.; Henschke,P.;
hk
Pretorius,I. Yeast and
d bacterial
b
l modulation
d l
off wine aroma and
d flavour..
fl
Australian
l
Journal of Grape and Wine Research. 2005, 11 (139-173).
Ugliano, M.; Genovese, A.; Moio, L. Hydrolysis of wine aroma precursors during malolactic fermentation with four
commercial starter cultures of Oenococcus oeni.
oeni J.
J Agric.
Agric Food Chem.
Chem 2003,
2003 51 (5073-5078)
(5073 5078)
Yun Cai Gao et al, Inhibition of spoilage lactic acid bacteria by lysozyme during wine alcoholic fermentation. Aust. J. Grape
and Wine Research.2002, 8 (76-83).
Muchas Gracias