Moléculas de guía axonal en la retina del pez cebra adulto

Moléculas de guía axonal en la retina del pez cebra adulto

UNIVERSIDAD DE SALAMANCA
Moléculas de guía axonal en la retina de teleósteos
-Trabajo de Fin de Grado-
Marcos Sande Melón
Salamanca, 2013
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Índice
Agradecimientos
Abreviaturas
Introducción
1. Antecedentes
1.1 Migración de las células ganglionares
1.2 Cono de crecimiento
1.3 Estructura del nervio óptico
1.4 Componentes del nervio óptico
1.5 Moléculas de guía axonal
1.6 Netrinas
1.7 Efrinas
1.8 Slit
1.9 Semaforinas
1.10 Pax2
2. Hipótesis
3. Justificación
4. Objetivos
Pág. 1
Pág. 1
Pág. 2
Pág. 2
Pág. 4
Pág. 4
Pág. 5
Pág. 7
Pág. 8
Pág. 9
Pág. 10
Pág. 10
Pág. 10
Materiales y métodos
5.1 Animales de experimentación
5.2 Grupos experimentales
5.3 Axotomización del nervio óptico
5.4 Extracción de los ojos del pez cebra
5.5 Procesamiento histológico
5.6 Inmunohistoquímica
5.7 Marcadores utilizados
5.8 Procesamiento de imágenes
Pág. 11
Pág. 11
Pág. 11
Pág. 12
Pág. 12
Pág. 13
Pág. 14
Pág. 15
Resultados y discusión
6.1 Resultados Pax2
6.2 Resultados Sox10
Pág. 16
Pág. 21
Conclusiones
Bibliografía
Pág. 25
Pág. 26
Esos besos citoplasmáticos que parecen constituir el éxtasis final de una épica historia de amor
de Santiago Ramón y Cajal.
Agradecer toda la ayuda y paciencia que he recibido durante este trabajo y durante mi formación en
el laboratorio a Héctor, Fernando, y Adrián, que sin ellos no sabría todo lo que sé hoy en día.
A todos los profesores que nos enseñan con placer y que siguen manteniendo interés una vez
finaliza la clase.
A todos mis amigos biólogos, Noelia, Becky, Mario, Víctor, Diego, Usa y Patri, porque llegamos al
final de la carrera y cada uno se va para un lugar diferente, pero hemos pasado cuatro años
maravillosos. No me despido porque seguimos el mismo camino.
A mis padres y mi hermana por subvencionarme la carrera y calmarme antes de los exámenes de
botánica.
A la primera persona que apostó por mí y me dio la oportunidad de aprender a ser científico.
Muchas gracias por estos cuatro años, esperemos que sean muchos más juntos.
Abreviaturas
CNO: Cabeza del nervio óptico
CFNO: Capa de fibras del nervio óptico
DAPI: 4',6-diamidino-2-fenilindol
DO: Disco óptico
DCC: Receptor ausente en el cáncer colorrectal
MS-222: Metanosulfato de tricaína
PBS: Tampón fosfato salino
QO: Quiasma óptico
RGCs: Células ganglionares de la retina
RTK: Receptor de la tirosina kinasa
Sema5A: Semaforina 5A
Shh: Sonic Hedgehog
SIO: Segmento intraorbital
TP: Tampón fosfato
TR: Tracto óptico
TSP: Trombospondina
Introducción
Antecedentes
1.1 Migración de las células ganglionares
La retina es una estructura sensible a la luz, con fotorreceptores, que presenta una estructura
histológica laminar en la que se distinguen diferentes capas, formadas por diferentes tipos celulares.
En la capa de las células ganglionares, encontramos las células ganglionares de la retina (RGCs),
cuyos axones forman el nervio óptico (NO). El desarrollo del nervio óptico ha sido muy estudiado y
es fácilmente manipulable experimentalmente (Inatani, 2005). Los axones de las células
ganglionares navegan desde la retina hasta centros diana del diencéfalo, mesencéfalo y telencéfalo,
contactando con numerosas moléculas de guía axonal que intervienen en pasos críticos permitiendo
guiar a los axones. Las bases moleculares de esta migración comienzan a descubrirse. Así,
diferentes moléculas están implicadas en la correcta migración de los axones hacia sus objetivos,
entre ellas tenemos las Netrinas, Robo y Slit, Efrinas que juegan un papel fundamental (Erskine y
Herrera, 2007). También existen otros factores, como morfógenos, que actúan directamente en la
guía de los axones de las células ganglionares, como Sonic hedgehog (Shh).
1.2 Cono de crecimiento
Los axones que están creciendo finalizan en una estructura conocida como el cono de
crecimiento. El cono de crecimiento es una estructura sensitivo motora que reconoce señales
atrayentes y repelentes, regulando el citoesqueleto y determinando el crecimiento del axón en una
dirección. El cono de crecimiento está formado por diferentes estructuras: la región central, los
filopodios y los lamelopodios. La región central posee microtúbulos y mitocondrias. Los filopodios
son
unas estructuras muy móviles, ricas en actina, y responsables de la integración de la
información exterior. Dicha información actúa sobre segundos mensajeros que provocan la
reorganización del citoesqueleto regulando la dirección y velocidad del crecimiento del axón. El
calcio es un segundo mensajero muy importante, la movilidad del cono de crecimiento es óptima en
una concentración adecuada de calcio, el llamado punto de posición. El calcio, junto con los
nucleótidos cíclicos, intervienen en la regulación de las proteín kinasas, proteín fosfatasas, y Rho
GTPasas permitiendo que el cono de crecimiento crezca, se retraiga o gire (Round y Stein, 2006).
Los microtúbulos migran desde la región central hacia una protuberancia recién creada permitiendo
que el cono de crecimiento se desplace hacia adelante. En la nueva porción del cono de crecimiento
se formarán de nuevo los lamelopodios y los filopodios (Kandel, 2004).
1
1.3 Estructura del nervio óptico
El nervio óptico está formado por axones de las células ganglionares y células gliales, todo ello
rodeado por las meninges. En el nervio óptico de teleósteos se distinguen tres regiones diferentes.
La primera, el segmento prequiasmático, que a su vez se divide en dos porciones: el segmento
intraocular (CNO) y el segmento extraocular o intraorbital (SIO). La segunda, el quiasma óptico
(QO). La tercera, el segmento postquiasmático o tracto óptico (TR; Parrilla-Monge, 2010).
Figura 1. Esquema del cerebro de un teleósteo.
BO: bulbo olfatorio; CB: cerebelo; CNO: cabeza
de nervio óptico; OD: ojo derecho; OI: ojo
izquierdo; QO: quiasma óptico; SIO: segmento
intraorbital; TEL: telencéfalo; TO: techo óptico;
TR: tracto óptico. Extraído de Parrilla-Monge,
2010.
1.3.1 Cabeza del nervio óptico
La cabeza del nervio óptico es la zona de transición que se encuentra entre la retina y el
segmento intraorbital. En esta región solo están presentes los axones de las células ganglionares y
células gliales. Las moléculas de guía axonal se expresan de manera diferencial en esta zona,
jugando un papel esencial durante el desarrollo del sistema visual, regeneración y crecimiento
continuado, como es el caso de los teleósteos y anfibios.
1.4 Componentes del nervio óptico
Astrocitos: Son células gliales presentes en el nervio óptico, así como, en la retina. En la retina
madura de los vertebrados se encuentran en la capa de fibras del nervio óptico (CFNO). Sus somas
se disponen entre los axones de las células ganglionares y sus prolongaciones se extienden sobre
varios fascículos nerviosos. En teleósteos se denominan astrocitos reticulares (Maggs y Scholes,
1990). Los astrocitos sirven de sostén, y permiten la nutrición de los axones de las células
ganglionares. Además, juegan un papel fundamental en la guía axonal y en el empaquetamiento de
los axones. Ultraestructuralmente presentan un núcleo eucromático, redondeado y con identaciones.
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Figura 2. Micrografía de microscopia electrónica
de transmisión de dos astrocitos fibrosos. AsP:
Proceso astrocitario, ER: Retículo endoplasmático, f:
filamentos intermedios, G: gránulo de glucógeno; mit:
mitocondria, Nuc: Núcleo. Extraído de Peter et al.,
1991.
Oligodendrocitos: Son células gliales que se encuentran en el nervio óptico (NO) y en la CFNO
en teleósteos (Lillo et al., 1998). Los oligodendrocitos presentan una gran variedad morfológica y
ramificación en sus procesos. Su soma es pequeño y redondeado. Micrografías de microscopia
electrónica muestran que los oligodendrocitos son más electrodensos que los astrocitos, con el
núcleo en posición lateral e irregular.
Su función es formar la vaina de mielina de los axones de las células ganglionares.
Figura 3. Micrografía de microscopia
electrónica de transmisión de un
oligodendrocito.
ER:
Retículo
endoplasmático, mit: mitocondria, N:
Núcleo, OL: Oligodendrocito. Extraído de
Peters et al., 1991.
Microglía: Está presente en la retina y en el nervio óptico. Existen dos tipos de microglía, la
microglía residente o ramificada en estado latente, que en situaciones patológicas se transforma en
microglía ameboide o reactiva. Ésta última tiene una gran capacidad de migración y fagocita
desechos celulares (Parrilla-Monge, 2010).
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1.5 Moléculas de guía axonal
Las moléculas de guía axonal son señales moleculares que permiten a los axones llegar a su
destino tras una serie de pasos individuales, permitiendo que el cono de crecimiento viaje a través
de la retina hacia el disco óptico y posteriormente a la cabeza del nervio óptico para abandonar la
retina.
1.6 Netrina
Las netrinas son una familia de proteínas extracelulares secretadas que
regulan la migración de neuronas y de los conos de crecimiento (Barallobre
et al., 2005). Estas proteínas bifuncionales pueden actuar como
quimioatrayentes y quimiorepulsoras,
interaccionando con receptores
específicos DCC y UNC-5 (Rajasekharan y Kennedy, 2009). La Netrina-1
está conservada en diversas especies animales (Ko et al., 2012), incluyendo
el pez cebra, donde se ha observado la relación entre la expresión de Netrina1 y el crecimiento axonal (Lauderdale et al., 1997). La netrina 1a del pez
cebra comparte un alto grado de similitud de aminoácidos con la netrina-1
Figura 4. Estructura
Netrina-1. Extraído de
Rajasekharan
y
Kennedy, 2009
del pollo y del ratón (Lauderdale et al., 1997). Este alto grado de similitud se encuentra en el
dominio V, homólogo de la laminina (Lauderdale et al., 1997).
Figura 5. Comparación del
grado de similitud entre
netrinas. La netrina-1 está muy
conservada evolutivamente entre
diferentes especies. Siendo la
netrina-1a del pez cebra muy
similar a la netrina-1 de ratón y
pollo. Extraído de Lauderdale et
al., 1997.
La unión de la netrina-1 a sus receptores, provoca una cascada de activación en el citoplasma y
cambios en el citoesqueleto, permitiendo el desarrollo del cono de crecimiento para llegar a su
destino (Moore et al., 2007). Varias señales de transducción y moléculas efectoras se han visto
implicadas en la respuesta a netrina-1, tales como RhoGTPasas, MAP-kinasas, segundos
mensajeros y proteína 1B asociada a microtúbulos (Barallobre et al., 2005).
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Los axones han de abandonar la retina a través del disco
óptico. En esta región, el neuroepitelio expresa netrina-1, que
interacciona con el receptor DCC de los axones (Deiner et al.,
1997) y permite que el cono de crecimiento abandone la retina
(De la Torre et al., 1997). Experimentos in vivo e in vitro han
mostrado una relación espacio-temporal entre la expresión de
la Netrina-1 y el desarrollo del cono de crecimiento axonal de
Figura 6. Sección sagital de la
cabeza del embrión de ratón E14
mostrándose la inmunorreactividad
en color rojo de la netrina-1.
Diamino Fenilindol de color azul
oscuro muestra el neuroepitelio y
núcleos de las células vasculares.
Extraído de Deiner et al., 1997.
las RGCs en embriones de pez cebra (Lauderdale et al., 1997).
Así, experimentos in vitro han demostrado que la netrina-1
promueve el crecimiento del axón dependiendo de la dosis,
teniendo un máximo desarrollo con una dosis de 100 ng/ml de
netrina-1, observándose que a mayores dosis los axones
crecen menos en ratón (Deiner et al., 1997) y tienen un
máximo desarrollo con 300ng/ml en Xenopus (De la Torre et
al., 1997). La comparación de ojos de embriones mutantes para netrina-1 y ojos de embriones
control demuestran que la netrina-1 es esencial para la guía axonal, pero no para el proceso de
morfogénesis de los axones de las RGCs. En los ojos de embriones mutantes se observa que los
axones de las RGCs se extienden correctamente por la capa de las fibras del nervio óptico (CFNO),
sugiriendo que aquí no interviene la señalización por netrina-1, pero al llegar al disco óptico
muchos axones se extienden hacia otras regiones, sin salir hacia el nervio óptico. Otros estudios
han descrito que la expresión de la netrina-1 en la proximidad de la cabeza del nervio óptico
incrementa la complejidad del cono de crecimiento in vitro (De la Torre et al., 1997). Todo esto
indica que la netrina-1 es esencial en la guía axonal en el disco óptico y de la retina.
1.7 Efrinas
Las efrinas y sus receptores Eph intervienen en la comunicación célula a célula, siendo muy
importantes en la migración celular y en la guía axonal. La familia de las efrinas está formada por
nueve efrinas diferentes, que se clasifican según la afinidad que posean en su unión, como efrina A
o efrina B, según se una al receptor EphA o EphB respectivamente (Goldhsmith et al., 2006). Los
receptores Eph son una gran familia de receptores tirosina kinasa (RTK; Nikolov et al., 2013). En
vertebrados se han descrito dieciséis tipos diferentes de receptores Eph, diez EphA y seis EphB.
Los receptores Eph de los axones de las células ganglionares de la retina interaccionan con
efrinas, permitiendo su desarrollo normal. Intervienen en el establecimiento de mapas topográficos
y guía axonal hacia el disco óptico en la retina. EphB guía directamente a los axones hacia el disco
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óptico, para que salgan de la retina (Cordeiro et al., 2007). La ausencia de EphB2 y EphB3
incrementa la frecuencia de errores en la guía de los axones de las RGCs hacia el disco óptico. Los
errores originados dentro de la retina no están directamente relacionados con la actividad tirosina
kinasa de EphB. Los receptores EphB actúan de manera independiente a kinasa para mediar la guía
axonal dentro de la retina, ya que es el dominio extracelular de EphB el que guía potencialmente a
los axones.
Los errores que se producen en la guía axonal cerca del disco óptico de los dobles mutantes Eph2
EphB3 (Birgbauer et al., 2000) son similares a los defectos en la guía axonal vistos en netrina-1 y
embriones deficientes en DCC (Deiner et al., 1997). Sin embargo, los defectos en netrina-1 y DCC
son mucho más severos, provocando que la mayoría de los axones estén afectados y resulta en la
hipoplasia del disco óptico (Deiner et al., 1997).
Figura 7. Modelo de proteína Eph
actuando como señal de guía axonal
inhibidora. En la retina normal hay un
gradiente ventral-alto a dorsal-bajo. Los
axones dorsales crecen hacia la zona
ventral, la inhibición resultante genera
una gran fasciculación y la guía directa
hacia el disco óptico. Los dobles mutantes
EphB2 y EphB3 presentan crecimiento
hacia la parte ventral y defectos de
desfasciculación alrededor del disco
óptico. Extraído de Birgbauer et al., 2001.
El receptor EphB se expresa en la parte ventral de la retina. Se ha descrito que su dominio
extracelular puede actuar como una señal inhibidora en la guía de los axones de la retina, actuando
como un mecanismo de corrección para que los axones de la retina dorsal, que se expanden en
dirección ventral, no crezcan erróneamente en la parte ventral de la retina sino hacia el disco óptico
(Birgbauer et al., 2001).
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Figura 8. A-B) Animales control, presentan un crecimiento
correcto hacia el disco óptico de los axones de las RGCs. Con la
tinción mediante DiI, se observan los axones en rojo. El disco
óptico está representando mediante un círculo discontinuo. E-F) son
dobles mutantes EphB2-EphB3 en los que se observa errores en la
migración y axones que no se desplazan dentro del disco óptico.
Modificado de Birgbauer et al., 2000.
1.8 Slit
Slit contiene 4 dominios repetidos ricos en leucina en el extremo N-terminal, seguido de siete a
nueve dominios EGF, un dominio laminina G (Morlot et al., 2007) y un módulo rico en cisteína en
el extremo C-terminal. El receptor de Slit es robo, el cual contiene 5 dominios similares a
inmunoglobulina y tres dominios de fibronectina tipo III (Morlot et al., 2007).
Slit y su receptor Robo son esenciales para que los axones de las RGCs migren correctamente en
el sistema visual de vertebrados (Thompson et al., 2009). Slit1 y Slit2 son moléculas
quimiorrepelentes que se encuentran en el tracto óptico (Thompson et al., 2006), y solo Robo1 y
Robo2 se expresan en las RGCs (Erskine et al., 2000). En la retina dorsal, Slit controla la polaridad
inicial del crecimiento de los axones de las RGCs y evita que los axones de las RGCs se localicen
en la retina ventral (Thompson et al., 2006). Las proteínas Robo1 y Robo2 están presentes en la
capa de las RGCs y en los axones, en la cabeza del nervio óptico, así como en otras regiones del
desarrollo de la vía óptica (Thompson et al., 2009).
Figura 9. Sección coronal de la retina
teñida mediante hibridación in situ.
Se observa la expresión del mRNA de
robo1 y robo2 en las células
ganglionares de la retina. Extraído de
Thompson et al., 2007.
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Slit y Robo no son necesarios para la entrada de los axones de las células ganglionares en el
nervio óptico, ya que se ha descrito que en las retinas deficientes en Slit1/2 y deficientes en robo2,
el número de errores en la guía axonal hacia el disco óptico no aumenta. La mayoría de los axones
originados desde la retina dorsal y ventral se extienden normalmente hacia afuera del ojo. En un
pequeño número de casos se han encontrado axones que no salen por el disco óptico (Fig.10). Sin
embargo, tanto la incidencia como la severidad de estos errores son indistinguibles de los
observados en las retinas control (Thompson et al., 2009).
Figura 10. Cuantificación de
errores en la guía axonal
hacia el disco óptico. Slit y
Robo no intervienen en la guía
de axones en la retina, ya que
no
hay
diferencias
significativas entre el fenotipo
salvaje
y los
fenotipos
deficientes en Slit y Robo.
Thompson et al., 2009
1.9 Semaforinas
Las Semaforinas son una gran familia de proteínas que participan en la guía axonal, en la
migración celular y en la morfogénesis (Zheng et al., 2008). La semaforina 5A (Sema5A), es una
proteína transmembrana que se expresa en las células neuroepiteliales del disco óptico y a lo largo
del nervio óptico (Oster et al., 2003).
La semaforina 5A inhibe el crecimiento de los axones de las células ganglionares por sí misma y
en combinación con la netrina-1, laminina o L1 (Oster et al., 2003). La alteración de la función de
Sema5A con anticuerpos bloqueantes, da lugar a que algunos axones se desvíen de la ruta principal
(Zheng et al., 2008). Algunos axones no abandonan la retina por el disco óptico y se proyectan
erróneamente dentro de la retina (Zheng et al., 2008), indicando la importancia de la semaforina 5A
en la guía axonal hacia el nervio óptico.
Las Semaforinas clase V son únicas ya que contienen un dominio sema y 7 repetidos de
trombospondina tipo1 en sus dominios extracelulares. La actividad inhibidora de la Sema5A está
dentro de su dominio sema, como ha sido descrito en la Sema3A (Koppel et al., 1997).
Adicionalmente, la actividad inhibidora total requiere de otras regiones en el dominio extracelular.
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Otro aspecto único de la semaforina clase V son los siete repetidos tipo 1 de trombospondina
(TSP) en el dominio extracelular. Los repetidos de trombospondina combinados con el dominio
semaforina claramente resultan en una molécula con actividad inhibidora para el crecimiento de los
axones. Gracias a los repetidos de TSP la sema5A se puede asociar con otras proteínas (Oster et
al., 2003).
Figura 11. Tinción mediante hibridación in situ
de la semaforina 5A.
A. Hibridación in situ de Sema5A en el disco
óptico y a lo largo del tracto óptico.
B. Hibridación in situ de Sema5A en el disco
óptico
E. Hibridación in situ de Sema5A en el tracto
óptico.
Extraído de Oster et al., 2003.
1.10 Pax2
Las proteínas Pax son una familia de factores de transcripción conservados durante la evolución.
Esta familia de genes pax se caracterizan por la presencia de un dominio paired- domain de unión
al ADN de 128 aminoácidos altamente conservado (Czerny et al., 1993). Este dominio se encuentra
en el extremo N-terminal y es el responsable de reconocer los genes diana.
Se ha comprobado que Pax2 es un factor de transcripción esencial para la formación del ojo y
que la expresión se mantiene en estado adulto (Macdonald et al., 1997). En teleósteos adultos, Pax2
se conserva en una población de astroglía perteneciente a astrocitos reticulares y a la glía limitante
en el NO y la CNO. En otros modelos animales, tales como el ratón, los astrocitos de la CNO, así
como, los astrocitos de la CFNO son positivos para Pax2, pero en rata la expresión disminuye en el
estado adulto. Además, en humanos la síntesis de Pax2 está presente en astrocitos de una región que
rodea la CNO. Se piensa que Pax2 interviene en la guía axonal de los axones de las RGCs.
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Hipótesis, justificación y
objetivos
Hipótesis de trabajo
La expresión y la función del factor de transcripción pax2 se conserva en el pez cebra adulto
(Danio rerio), permitiendo la guía de los axones hacía el disco óptico para abandonar la retina.
Justificación
En los teleósteos, el desarrollo ocular no cesa y se mantiene durante el estado adulto. Por ello en
este trabajo, pretendemos estudiar la guía de los axones en la retina del pez cebra adulto, analizando
la distribución del factor de transcripción Pax2, el cual interacciona con otras moléculas de guía
axonal como la netrinas y efrinas.
Se han realizado pocos estudios de guía axonal durante el estado adulto de los teleósteos, y no
existen estudios que muestren si la función de Pax2 se mantiene en el pez cebra adulto. Otra
cuestión a resolver es si este factor se modifica tras lesiones en el nervio óptico en el estado adulto,
lo cual tampoco ha sido estudiado en el pez cebra adulto.
Debido a que estas proteínas están ampliamente conservadas evolutivamente en diferentes
grupos animales, los resultados y conclusiones aquí descritas pueden ser extrapolados a otros
modelos animales, y tener repercusión en los estudios sobre regeneración de axones en la edad
adulta en otros modelos animales.
Objetivos
1. Analizar la distribución de Pax2 en el pez cebra adulto (Danio rerio).
2. Determinar las posibles modificaciones de la distribución de Pax2 tras la lesión del nervio
óptico en el pez cebra adulto (Danio rerio).
3. Comprobar si hay alguna asociación entre Pax2 y los axones de las células ganglionares.
4. Analizar la expresión de Sox10, marcador de oligodendrocitos, en el pez cebra adulto
(Danio rerio).
5. Determinar las posibles modificaciones de la distribución de Sox10 tras la lesión del nervio
óptico en el pez cebra adulto (Danio rerio).
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Materiales y métodos
Materiales y metodos
5.1 Animales de experimentación
En el presente trabajo de Fin de Grado en Biología se emplearon 8 ejemplares de pez cebra
adulto (Danio rerio; Hamilton-Buchanan, 1822), disponibles en el Instituto de Neurociencias de
Castilla y León (INCyL). Los animales en el laboratorio fueron mantenidos en acuarios a 28ºC, con
agua desionizada suplementada con sales Instant Ocean® (Aquarium Systems, Mentor, Ohio;
EE.UU) a una concentración de 0,3 g/l, con un fotoperiodo de
catorce horas de luz y diez horas de oscuridad, y alimentados
entre 5 y 7 veces al día. Los animales fueron manipulados
siguiendo
las
directrices
de
la
Comunidad
Europea
(86/609/EEC y 2003/65/EC) y la legislación española (RD
1201/2005, BOE 252/34367-91, 2005) vigentes para el uso y
cuidado de animales de experimentación. Además, los animales
fueron anestesiados con metanosulfonato de tricaína (MS-222)
antes de cualquier tipo de operación.
Figura 12. Pez cebra adulto
(Danio rerio)
5.2 Grupos experimentales
Se usaron dos grupos experimentales. El grupo uno, un grupo control al que no se realizó ningún
tipo de cirugía previa al sacrificio. El grupo dos al que se le realizó la axotomización del nervio
óptico a un ojo, y tras tres días fue sacrificado.
GRUPO 1
GRUPO 2
Ojo izquierdo
Ojo derecho
Ojo izquierdo
Ojo derecho
No manipulado,
No manipulado,
No manipulado,
Manipulado
Control
Control
Contralateral
Lesionado
Tabla 1. Grupos experimentales
5.3 Axotomización del nervio óptico
El procedimiento comenzó con la anestesia de los animales sumergiéndolos en una solución de
metanosulfonato de tricaína (MS-222, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, EE.UU.) a una
concentración de 0,3 g/l. A continuación realizamos el corte del nervio óptico provocando una
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destrucción temporal de los axones de las células ganglionares. Esta técnica permite estudiar la
regeneración de los axones de las células ganglionares de la retina y su interacción con las células
de la glía, ya que los teleósteos tienen la capacidad de regenerar los axones de las células
ganglionares.
Para realizar correctamente la lesión del nervio óptico usamos unas pinzas con las que retiramos
el tejido conjuntivo que rodea al ojo, y conseguimos tener acceso al nervio óptico. Posteriormente
con la ayuda de unas tijeras de precisión realizamos un corte transversal del mismo. Durante el
proceso, hay que tener cuidado de no dañar la arteria oftálmica, ya que produciría sangrado y
destrucción del ojo por falta de riego sanguíneo.
La lesión se realizó en el ojo derecho del pez cebra, mientras que el ojo izquierdo quedó intacto
para provocar el menor estrés posible al animal, y medir posteriormente si se produce algún cambio.
Los peces cebras se mantuvieron vivos durante tres días. Tras este periodo fueron sacrificados
para medir los posibles cambios producidos en la retina.
5.4 Extracción de los ojos del pez cebra
Tras sacrificar al animal se procedió a la extracción bajo lupa de los ojos, cortando la
musculatura extraocular y el tejido conjuntivo que rodea al ojo. Finalmente se extrajo el ojo
cortando el nervio óptico. Una vez extraído, se realiza una pequeña incisión en la córnea y se
presiona mediante dos pinzas para sacar el cristalino, esto es necesario para evitar problemas en la
obtención posterior de las secciones histológicas.
5.5 Procesamiento histológico
Los ojos extraídos se fijaron en una mezcla de paraformaldehido al 4% en tampón fosfato (TP)
0,1M y pH 7,4, durante cuatro horas a temperatura ambiente. Posteriormente se crioprotegieron
mediante inmersión en sacarosa al 30% en TP 0,1 M, manteniéndose durante dos días a 4ºC en
agitación hasta que los ojos se hundieron en el líquido de crioprotección.
Una vez crioprotegidos se encastraron en moldes rellenos de OCT® en los que se orientaron los
ojos para su corte. Posteriormente se congelaron con nitrógeno líquido y se cortaron en un criostato
(Thermus Scientific Microm HM 560) a una temperatura de -29ºC. Se realizaron secciones
coronales de 12 µm de espesor que se recogieron en portaobjetos superfrost (Thermo Scientific,
Braunschweig, Alemania). Las secciones se almacenaron a -30ºC hasta su posterior uso.
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Bloque de OCT
Figura 13. Representación gráfica de la obtención de una sección en el criostato.
Modificado de Parrilla-Monge, 2010
5.6 Inmunohistoquímica
La Inmunohistoquímica es una técnica muy útil que permite el marcaje de proteínas basándose
en el principio de unión antígeno-anticuerpo. Mediante
esta técnica podemos detectar la
localización de las distintas proteínas y ver qué tipos celulares las expresan.
Para realizar esta técnica, las secciones se descongelaron a temperatura ambiente durante una
hora y se lavaron 3 veces cada 10 minutos con tampón fosfato salino 0,1M pH 7,4 (PBS) en
agitación para rehidratar el tejido.
Tras los lavados iniciamos la preincubación utilizando suero no inmune procedente de la misma
especie que el anticuerpo secundario que se va a utilizar posteriormente. La preincubación se
realizó con suero de cabra 5%, DMSO 1% y Triton X-100 0,2% en TP (Probus S.A.) en el tejido.
Con este paso ayudamos a que los anticuerpos penetren mejor y reducimos el número de uniones
inespecíficas.
Tras una hora de preincubación en una cámara de humedad, se procedió a realizar la incubación,
la cual se realizó con suero de cabra 5%, DMSO 1%, Triton X-100 0,2% en TP (Probus S.A.) y el
anticuerpo primario correspondiente en TP. Los anticuerpos primarios utilizados se recogen en la
tabla 2.
Después de un día de incubación, las secciones se lavan en PBS, y posteriormente se incuban en
el anticuerpo secundario fluorescente. Las secciones se mantienen en una cámara de humedad
durante una hora. La incubación se realizó con suero de cabra 5%, DMSO 1%, Triton X-100 0,2%
(Probus S.A.) y el anticuerpo secundario correspondiente en TP obtenido de cabra. Los anticuerpos
secundarios se recogen en la tabla 3.
Para terminar, lavamos con PBS más gelatina de pez que ayuda a eliminar la fluorescencia de
fondo. Los portaobjetos se montaron con un medio comercial Prolong® Gold Antifade Reagent
(Invitrogen) y cubreobjetos para su posterior análisis en el microscopio.
13
ANTICUERPOS PRIMARIOS
Antígeno
Anticuerpo
Dilución de uso
Casa comercial
Zn8
IgG monoclonal ratón
1:400
Hybridoma Bank
Pax2
IgG policlonal conejo
1:500
Covance
Sox10
IgG policlonal conejo
1:500
Cedida por Prof. Appel
Tabla 2. Relación de anticuerpos primarios
ANTICUERPOS SECUNDARIOS
Método
Antígeno
Anticuerpo
Conjugado
Casa comercial
Fluorescencia
IgG ratón
IgG de cabra
Cy2
Jackson
Fluorescencia
IgG conejo
IgG de cabra
Cy3
Jackson
Fluorescencia
IgG conejo
IgG de cabra
Cy3
Jackson
Tabla 3. Relación de anticuerpos secundarios
5.7 Marcadores utilizados
Pax2: El anticuerpo policlonal anti-Pax2 detecta una proteína de 22kDa. La proteína Pax2 en
teleósteos se ha descrito que está presente en astrocitos del nervio óptico, pudiendo tener un papel
en la regeneración y en el crecimiento continuado en la retina (Parrilla-Monge, 2010).
Zn8: El anticuerpo policlonal reconoce a una molécula de superficie llamada neurolina, que
pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas. Permite detectar los axones en crecimiento de
las células ganglionares de la retina. En procesos de regeneración la neurolina permite la guía de los
axones. Sin embargo, en neuronas maduras solo está presente en los lugares de contacto y sinapsis,
pudiendo estar implicada en la comunicación célula a célula y transducción de señales (ParrillaMonge, 2010).
Sox10: El anticuerpo policlonal reconoce a Sox10, un factor de transcripción que posee un
dominio HMG (grupo de alta movilidad) de unión al ADN. Estudios en mutantes de pez cebra
demuestran que es necesario para la diferenciación de los oligodendrocitos. También parece que
interviene en la expresión de genes que codifican factores que median entre axones y
oligodendrocitos, necesarios para la supervivencia de los axones. En el sistema nervioso adulto, la
proteína sox10 está presente en oligodendrocitos diferenciados (Parrilla-Monge, 2010).
14
5.8 Procesamiento de imágenes
Las imágenes fueron tomadas con el microscopio de campo claro y epifluorescencia Olympus
Provis AX70 y con una cámara digital Olympus DP70. El programa usado para la captación de
imágenes fue DP controller y DP manager (Olympus Optical CO., LTD. 2002). Las imágenes
fueron posteriormente procesadas con Adobe Photoshop® CS6.
15
Resultados y discusión
Resultados y discusion
Para comprobar la distribución del factor de transcripción Pax2 y de Sox10 en la retina del
pez cebra adulto, concretamente en la cabeza del nervio óptico de la retina, utilizamos técnicas de
inmunohistoquímica descritas en el apartado de Material y Métodos. Además, analizamos dos
grupos de experimentación, el grupo uno que sirve de control, y el grupo dos con un ojo lesionado y
el otro al que no se le realizó ninguna operación.
6.1 Grupo 1. Nervio óptico control. Pax2
La distribución de las células Pax2 positivas no es regular a lo largo de la cabeza del nervio
óptico. La mayoría de células marcadas se encuentran concentradas en la parte más vitreal de la
cabeza del nervio óptico (Fig.14.1A; flechas), el disco óptico, por donde los axones de las células
ganglionares abandonan la retina. En el disco óptico, hay células marcadas intensamente y que
muestran una forma oval característica de astrocitos.
En la región donde limitan CNO, retina, coroides y esclera, observamos células positivas para
Pax2 (Fig.14.1B; cabezas de flechas). Estos astrocitos tienen forma alargada, son de menor tamaño
y están dispuestos en hileras.
Cuando nos desplazamos hacia la parte más escleral de la cabeza del nervio óptico, podemos
observar como los astrocitos adquieren una morfología fusiforme, siendo posible diferenciarlos de
los astrocitos del disco óptico (Fig.14.1C; cabezas de flechas huecas).
Por otra parte, el marcaje con Zn8 nos permite observar axones jóvenes provenientes de
células ganglionares de la retina. Muchos de los axones marcados mediante Zn8 se encuentran
asociados longitudinalmente con células Pax2 positivas (Fig.14.2; flechas). Ello sugiere que los
astrocitos Pax2 positivos intervienen en la guía de los axones jóvenes en la cabeza del nervio
óptico, permitiendo la conducción de los mismos hacia el disco óptico, para salir de la retina
posteriormente.
16
1
2
1
2
Figura 14. Sección de la CNO en un animal control con triple marcaje Pax2 (rojo)-Zn8
(verde)-DAPI (azul). 1) A. Células positivas para Pax2 (rojo; flechas) en el disco óptico (DO)
marcadas intensamente y con morfología oval. B. Células Pax2 positivas (cabeza de flechas)
dispuestas en hileras. C. Células Pax2 positivas (cabeza de flechas huecas) con morfología
fusiforme. 2) Axones jóvenes Zn8 positivos (flechas), células Pax2 positivas (cabeza de flecha)
en la CNO. Escala 200 µm.
Grupo 2. Nervio óptico contralateral al lesionado. Pax2
A los tres días postlesión no se observaron cambios en la forma ni en la disposición de las
células positivas para Pax2 en la cabeza del nervio óptico (Fig.15.1 y 15.2; cabezas de flechas). Sin
embargo, aunque no se ha cuantificado, si se observa una menor proporción de células Pax2
positivas en comparación con los nervios ópticos control (Fig.14).
Se observan células Pax2 positivas en el DO y en la parte más escleral de la CNO (Fig.15.1 y
15.2; cabezas de flechas). En algunos casos también es posible ver como algunos astrocitos se
encuentran asociados a axones jóvenes Zn8 positivos (Fig.15.1; flechas).
1
2
Figura 15. Sección de la CNO del ojo contralateral al lesionado con triple marcaje Pax2
(rojo)-Zn8 (verde)-DAPI (azul). 1) Células positivas para Pax2 (cabezas de flechas) en el
disco óptico (DO) y en la parte más escleral marcadas intensamente, y axones jóvenes Zn8
positivos (flechas). 2) Células Pax2 positivas en el DO con forma oval (cabeza de flechas).
Escala 200 µm.
17
Grupo 2. Nervio óptico lesionado. Pax2
A los tres días postlesión no se observaron cambios morfológicos, ni modificaciones en la
localización de las células positivas para Pax2 en la cabeza del nervio óptico (Fig.16.1 y 16.2). Sin
embargo, aunque es difícil de cuantificar, si se observa una menor proporción de células Pax2
positivas en comparación con los nervios ópticos control (Fig. 14.1 y 14.2).
El número de células marcadas en el disco óptico parece menor en todas las secciones de
nervios ópticos lesionados comparado con el nervio óptico control. Los astrocitos Pax2 positivos
siguen manteniendo la forma oval (Fig.16.1A).
En la región donde limitan CNO, retina, coroides y esclera, también se observan células
positivas para Pax2 (Fig.16.1B). Estos astrocitos presentan forma alargada, son de menor tamaño en
comparación con los astrocitos del disco óptico y están dispuestos en hileras.
En la parte más escleral se observan células Pax2 positivas con morfología fusiforme
(Fig.16.1C). El número de astrocitos en esta región es menor al observado en los nervios ópticos
control (Fig. 14).
En los nervios ópticos lesionados no encontramos axones jóvenes positivos para Zn8 en la
cabeza del nervio óptico. Este hecho puede deberse a que las células ganglionares no hayan podido
regenerar axones jóvenes en este periodo de tiempo.
1
2
Figura 16. Sección de la CNO en un animal lesionado con triple marcaje Pax2 (rojo)-Zn8
(verde)-DAPI (azul). 1) A. Células positivas para Pax2 (rojo; flechas) en el disco óptico (DO)
marcadas intensamente y con forma oval. B. Células Pax2 positivas (cabezas de flechas) dispuestas
en hileras. C. Células Pax2 positivas (cabeza de flechas huecas) con morfología fusiforme. 2) A.
Células positivas para Pax2 (rojo; cabezas de flechas huecas) en el disco óptico (DO) marcadas
intensamente y con morfología oval. Escala 200 µm.
18
1
2
A
B
3
4
Figura 17. Comparación entre controles y lesionados, tanto del ojo lesionado como del contralateral a
la lesión, con triple marcaje Pax2 (rojo)-Zn8 (verde)-DAPI (azul). 1) Control. A. Células positivas para
Pax2 (rojo; flechas) en el disco óptico (DO) marcadas intensamente y con morfología oval. B. Células Pax2
positivas (cabeza de flechas) dispuestas en hileras. C. Células Pax2 positivas (cabeza de flechas huecas) con
morfología fusiforme. 2) Contralateral al lesionado. A. Células positivas para Pax2 (cabezas de flechas) en
el disco óptico (DO) marcadas intensamente. B. Axones jóvenes Zn8 positivos (flechas). 3) Lesionado. A.
Células positivas para Pax2 (flechas) en el disco óptico (DO) marcadas intensamente y con morfología oval.
B. Células Pax2 positivas (cabezas de flechas) dispuestas en hileras. C. Células Pax2 positivas (cabeza de
flechas huecas) con morfología fusiforme. 4) Control. Axones jóvenes Zn8 positivos (flechas) y células
Pax2 positivas (cabeza de flecha) en la CNO. Escala 200 µm.
Durante los últimos años se está intentando elucidar el papel de numerosas proteínas implicadas
en la guía axonal de los axones de las células ganglionares de la retina (ver Introducción). Algunos
autores han propuesto que factores de transcripción, como Pax6 y Pax2 que se expresan en la retina,
pueden tener un papel fundamental en la guía axonal en el pez cebra durante la regeneración
(Rodger et al., 2006). Se han realizado diversas investigaciones sobre la expresión de Pax6 en la
retina, pero pocos son los autores que han realizado estudios sobre Pax2. En la bibliografía
científica no hemos encontrado estudios que analicen las posibles variaciones en la expresión de
Pax2 en el nervio óptico control respecto a la axotomización del mismo en pez cebra. Sin embargo,
si se han realizado estudios sobre Pax2 en la retina del carpín (Parrilla et al., 2012; Parrilla et al.,
2013), su localización y su expresión en el nervio óptico control respecto al nervio óptico pinzado
y criolesionado (Parrilla et al., 2012).
19
Tabla 4. Expresión del ARNm de Pax2 y número
de células pax2 positivas tras pinzamiento en la
retina del carpín. Extraído de Parrilla et al., 2013.
En el presente trabajo no hemos realizado estudios que permitan medir la expresión del ARNm
de Pax2, ni hemos cuantificado el número de células Pax2 positivas. Aun así, nuestros resultados
son coherentes con los datos mostrados por Parrilla et al., 2012, en los que se describe como el
número de células positivas para Pax2 desciende tras dos días postpinzamiento en la retina del
carpín. La lesión que provocamos en el pez cebra puede ser la responsable en gran medida de la
disminución de astrocitos Pax2 positivos. Además, es posible que la degeneración de los axones de
las células ganglionares libere numerosas moléculas de señalización de muerte celular, como la
caspasa-3 y produzca la muerte de los astrocitos, los cuales se encuentran interaccionando con los
axones de las células ganglionares (García y Koke, 2009).
Por otra parte, se ha observado que en mayores espacios de tiempo, el número de células Pax2
positivas aumenta significativamente, coincidiendo con la llegada de axones jóvenes Zn8 positivos
a la cabeza del nervio óptico (Parrilla et al., 2012). Por ello, muchos autores sostienen que Pax2
puede jugar un papel esencial en la guía de estos axones jóvenes Zn8 positivos en la cabeza del
nervio óptico. Nuestro periodo de exposición no permite una regeneración de tal calibre, por lo que
no podemos comprobar dicha llegada de axones y su interacción con astrocitos tras una lesión. Sin
embargo, en los nervios ópticos control, sí observamos una clara interacción entre astrocitos Pax2
positivos con axones jóvenes Zn8 positivos (Fig.14.2).
Nuestros resultados muestran que la expresión de Pax2 se mantiene en el pez cebra adulto y que
los astrocitos Pax2 positivos interaccionan con los axones, guiándolos a través de la cabeza del
nervio óptico para que lleguen correctamente a sus destinos, como la hipótesis planteaba.
En futuras investigaciones sería interesante estudiar a diferentes periodos de tiempo tras la lesión
cómo varía la expresión del mRNA para Pax2 mediante hibridación in situ y PCR, cuantificar el
número de células Pax2 positivas mediante técnicas de inmunofluorescencia y realizar un conteo
celular. Además, sería muy interesante comparar el número de células positivas para Netrina-1 y la
20
expresión de la misma en nervios ópticos control y nervios ópticos lesionados, ya que uno de los
genes diana de Pax2 es la netrina.-1. Se han realizado estudios similares sobre la expresión de
netrina-1 en teleósteos como en carpín (Petrausch et al., 2000), pero no en pez cebra.
6.2 Grupo 1. Nervio óptico control. Sox10
Los oligodendrocitos se caracterizan por ser MBP+/Sox10+, como se ha descrito previamente en
la literatura tanto en ratón como en carpín (Parrilla Monge, 2010).
Hemos visto que las células positivas para Sox10 se encuentran formando hileras tanto en el disco
óptico como en parte más escleral de la cabeza del nervio óptico (Fig.18; flechas). En el disco
óptico los oligodendrocitos forman grupos característicos (Fig.18; cabezas de flechas). Las células
Sox10 positivas se encuentran entre los axones marcados mediante Zn8 (Fig.18; cabezas de flechas
huecas).
Figura 18. Sección de la CNO en un animal control con
triple marcaje Sox10 (rojo)-Zn8 (verde)-DAPI (azul).
Células positivas para Sox10 en el DO en grupos (rojo;
cabezas de flechas). Oligodendrocitos dispuestos en
hileras (flechas) rodeando un axón Zn8 positivo (cabeza
de flechas huecas) Escala 200 µm.
Grupo 2. Nervio óptico contralateral al lesionado. Sox10
Hemos observado que las células positivas para Sox10 mantienen una localización y morfología
similar a la observada en el nervio óptico control (Fig.18). Los oligodendrocitos se encuentran
formando grupos en el disco óptico (Fig.19.1 y 19.2; flechas). En la parte más escleral los
oligodendrocitos forman hileras características de esta zona (Fig.19.1 y 19.2; cabezas de flechas).
En la mayoría de las secciones analizadas se observa una mayor densidad de células positivas a
Sox10 respecto al control.
21
1
2
Figura 19. Sección de la CNO de la retina contralateral a la lesión de un animal, con
doble marcaje Sox10 (rojo)-DAPI (azul). 1) Células positivas para Sox10 en el DO en
grupos (rojo; flechas). Oligodendrocitos dispuestos en hileras (cabezas de flechas). 2) Células
positivas para Sox10 en el DO en grupos (rojo; flechas). Oligodendrocitos dispuestos en
hileras (cabezas de flechas). Escala 200 µm.
Grupo 2. Nervio óptico lesionado. Sox10
En el nervio óptico lesionado (Fig.20), los oligodendrocitos Sox10 positivos mantienen una
localización y morfología similar a la observada en el nervio óptico control (Fig.18). Sin embargo,
el número de oligodendrocitos positivos para Sox10 es muy escaso (Fig.20). Se observan pequeños
grupos aislados en el disco óptico y unas pocas células en hileras dispuestas en la región más
escleral de la cabeza del nervio óptico (Fig.20). Como en el caso de Pax2, no encontramos axones
positivos para Zn8 en secciones de nervios ópticos lesionados de grupo 2.
Figura 20. Sección de la CNO de la retina de un animal
lesionado con doble marcaje Sox10 (rojo)-DAPI (azul).
Células positivas para Sox10 en el DO en grupos (rojo;
cabezas de flechas). Oligodendrocitos dispuestos en hileras
(flechas). Escala 200 µm.
22
1
2
3
4
Figura 21. Retinas de animales control, contralaterales y lesionados con doble y triple marcaje Sox10
(rojo)-DAPI (azul)-Zn8 (verde). 1) Control. Células positivas para Sox10 en el DO en grupos (rojo;
cabezas de flechas). Oligodendrocitos dispuestos en hileras (flechas) rodeando un axón Zn8 positivo (cabeza
de flechas huecas) 2) Contralateral al lesionado. Células positivas para Sox10 en el DO en grupos (rojo;
flechas). Oligodendrocitos dispuestos en hileras (cabezas de flechas). Oligodendrocitos dispuestos en grupos
(cabezas de flechas huecas). 3) Contralateral al lesionado. Células positivas para Sox10 en el DO en
grupos (rojo; flechas). Oligodendrocitos dispuestos en hileras (cabezas de flechas). 4) Lesionado. Células
positivas para Sox10 en el DO en grupos (rojo; cabezas de flechas). Oligodendrocitos dispuestos en hileras
(flechas). Escala 200 µm.
Los datos obtenidos en el presente trabajo concuerdan con los datos mostrados en estudios previos
realizados en otros teleósteos como el carpín (Parrilla-Monge, 2010), en los que se muestra que tras
el pinzamiento del nervio óptico, durante los primeros siete días tras la lesión, el número de
oligodendrocitos Sox10 positivos disminuye en la cabeza del nervio óptico. Ello puede ser debido a
factores apoptóticos que se liberan desde los axones destruidos durante la axotomización del nervio
óptico (García y Koke, 2009).
No hemos encontrado en la bibliografía científica datos que muestren los cambios producidos en
el ojo no lesionado de los peces correspondientes al grupo dos (Ver apartado Materiales y
Métodos), en los que hemos visto que también se producen cambios aunque no se haya lesionado
(Panagis et al., 2005). En estudios futuros, sería interesante comparar la expresión del ARNm de
23
Sox10 entre los dos grupos experimentales, para cuantificar los cambios observados en este trabajo
y cuantificar el número de células Sox10 positivas entre los mismos.
24
Conclusiones
De acuerdo con los objetivos planteados en este Trabajo de Fin de Grado, y como consecuencia de
los resultados obtenidos y de la discusión llevada a cabo, hemos llegado a las siguientes
conclusiones:
I.
Las células positivas a Pax2 pueden participar en la guía de los axones de las células
ganglionares de la retina en procesos de regeneración del nervio óptico del pez cebra adulto
(Danio rerio).
II.
Sox10 está presente en oligodendrocitos de la cabeza del nervio óptico que se encuentran
asociados a los axones en crecimiento, modificándose su número tras una lesión en el pez
cebra adulto (Danio rerio).
25
26
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28
El presente trabajo de Fin de Grado en Biología, bibliográfico y
experimental, se realiza un resumen de las principales moléculas de
guía axonal presentes en la retina del pez cebra. Además, analizamos
la distribución de Pax2 en la cabeza del nervio óptico, sugiriendo que
tiene un papel en la guía de los axones de las células ganglionares.
También analizamos la distribución del marcador de oligodendrocitos
Sox10, observando como varían las células de la glía tras una lesión.