Nota errores en el manejo del semen - Arisnabarreta
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Nota errores en el manejo del semen - Arisnabarreta
¿Qué hay que saber para preñar? El Méd. Vet. Enrique Arisnabarreta repasa las fallas más frecuentes observadas en condiciones de campo en el manejo del semen y en la técnica de siembra. Ante un mal resultado con inseminación artificial (I.A.), es muy común observar en la práctica diaria que se considere como causa de la infertilidad al semen o a factores complejos muy difíciles de comprobar en condiciones de campo. El manejo reproductivo, la nutrición, la sanidad y los factores ambientales, principalmente las altas temperaturas y elevada humedad, engloban el 96 por ciento de las variaciones en la fertilidad. La genética de la hembra y el toro del servicio sólo representan el tres y el uno por ciento de las diferencias en la tasa de concepción, respectivamente, según se indica en el Gráfico Nº1. La interacción de las diferentes fallas en el manejo de la I.A. afecta significativamente la tasa de preñez; en síntesis, la velocidad con que se preñan las vacas y vaquillonas. Las deficiencias en el manejo de la I.A. –observadas con más frecuencia en el trabajo de campo– y su interacción negativa con la tasa de preñez se resumen en el Gráfico Nº2. Se puede apreciar cómo una detección de celo deficiente, en lo referente al tiempo y periodicidad de observación, reduce la cantidad de animales individualizados para dar servicio, en consecuencia disminuyen la tasa de detección de celo y la tasa de preñez. En el mismo se observa cómo las prácticas inadecuadas en el manejo del material seminal interactúan entre sí negativamente provocando pérdidas en el poder fecundante del semen y en la cantidad de espermatozoides viables. Esta suma de pasos incorrectos afectan negativamente la tasa de concepción y por consiguiente la tasa de preñez. Se aprecia además que la tasa de concepción puede afectarse por una detección de celo cualitativa incorrecta y/o por la siembra del semen en un lugar inadecuado del aparato genital. Por lo tanto, al analizar con detenimiento el Gráfico Nº2 se puede deducir que si se cometen simultáneamente errores en el manejo del semen y en la técnica de siembra, combinados con una deficiente observación de celo, se obtendrá por resultado una tasa de preñez prácticamente nula. CARACTERISTICAS DEL EYACULADO Para lograr un correcto manejo del material seminal, es elemental tener en cuenta algunos conocimientos básicos de las características del eyaculado, descriptas por el profesor R. Saacke, 1986: - El toro eyacula de 5 a 10 cc de semen, compuesto por 1/5 a 2/5 partes de plasma seminal y de 5.000 a 10.000 millones de espermatozoides (aproximadamente 1.000 millones por cc) - La proporción de espermatozoides vivos o mótiles de un eyaculado varía del 50 al 80 por ciento. - La mayor parte del plasma seminal es producido por las glándulas sexuales accesorias: vesículas seminales, próstata y glándulas bulbouretrales o de Cowper. Tiene una composición química compleja, con una variedad amplia de nutrientes. - El espermatozoide está compuesto por una cabeza y una cola, las cuáles pueden ser observadas con claridad al microscopio óptico convencional. Con métodos de tinción como eosina-nigrosina, se visualiza también el capuchón cefálico o acrosoma que recubre la cabeza del espermatozoide (Gráfico Nº3). La integridad estructural del acrosoma es fundamental para lograr la fecundación, dado que contiene enzimas proteolíticas que disuelven el cemento intercelular de la corona radiata y la membrana pelúcida que rodean al óvulo. - Observado con microscopía electrónica, el espermatozoide tiene una estructura más compleja: la cabeza, que contiene el ADN, recubierta por el acrosoma y la cola, que le provee la motilidad, están rodeadas por varias membranas que sectorizan regiones responsables de diferentes funciones. La más importante es la membrana celular externa, la cuál envuelve por completo al espermatozoide. Selecciona los materiales que entran y salen de las células, siendo en consecuencia su integridad estructural elemental para la vida funcional de los espermatozoides. Es muy sensible, al igual que otras membranas, a las injurias causadas por un medio químico adverso, y a condiciones térmicas incompatibles con una normal funcionalidad y poder fecundante. En el Gráfico Nº4 se muestra gráficamente la ultraestructura de la cabeza del espermatozoide, observándose la membrana celular externa que la recubre por completo, el acrosoma, y el núcleo. - El mal manejo del semen es otro importante causante biológico de daño celular y pérdida de fertilidad. A diferencia de otras células del organismo, los espermatozoides son incapaces de reparar por sí mismos alguna parte dañada de su estructura celular. - Son considerados células catabólicas, dado que sólo metabolizan nutrientes con fines energéticos, por ejemplo para la motilidad. No pueden, como las células anabólicas, sintetizar materiales para el crecimiento, división o reparación celular. Por lo tanto, es elemental tener presente que el envejecimiento o la pérdida de funcionalidad comienza rápidamente después de la eyaculación, aumentados significativamente por un mal manejo. En las especies de interés zootécnico, el semen es depositado, por servicio natural (S.N.), en la vagina o en el cuello del útero. En el primer grupo se encuentran los conejos y los rumiantes. En el otro se encuentran los equinos, porcinos y caninos, en los cuales el semen entra directamente al útero o es introducido por presión a través del canal cervical. Adicionalmente, el semen puede, por su fracción gelatinosa, formar un tapón en el cuello del útero para facilitar su retención, como ocurre en los suinos. En el Gráfico Nº5 se observan los eventos secuenciales, desde la eyaculación a la fertilización, en S.N. o I.A. Considerando estos eventos y que en el proceso de congelación-descongelamiento se pierde en promedio el 50% de los espermatozoides vivos aproximadamente, es fundamental para poder competir con el toro –que está en contacto permanente con la hembra– realizar un estricto plan de trabajo en lo referente a la identificación de las hembras en celo, al momento adecuado para inseminar, extremando al máximo los cuidados en el manejo del material seminal, y en la técnica de siembra, utilizando como mínimo 5 millones de espermatozoides con motilidad progresiva por dosis de semen descongelado. FALLAS MAS FRECUENTES Las fallas más frecuentes observadas en condiciones de campo en el manejo del semen y en la técnica de siembra, se describen a continuación: • Nivel de capacitación y experiencia del inseminador. Un idóneo bien capacitado es tan importante como un buen observador de celo, más aun si se tiene en cuenta que cuando la I.A. está organizada en forma de circuito, al compartir el inseminador, los establecimientos que lo componen se verán afectados por su nivel de eficiencia. Es bien conocido por los profesionales que prestan apoyo técnico en el campo, que un número considerable de inseminadores van adquiriendo paulatinamente procedimientos incorrectos que luego adoptan como técnica de rutina. Aunque esos vicios, que son múltiples, individualmente alteran muy poco los resultados, la sumatoria de sus efectos puede disminuir significativamente la tasa de concepción lograda, según se indica en el Gráfico Nº6. Del Gráfico Nº6 se desprende lo siguiente: - La falta de cuidado en una determinada maniobra puede provocar pequeñas pérdidas de espermatozoides, dado que el semen es muy frágil y el daño en su morfología es irreversible. Además es altamente perecedero y de muy breve viabilidad. - La suma de errores afecta significativamente la pérdida de material seminal. - La diferencia entre un buen inseminador y uno mediocre radica en la cantidad de espermatozoides viables que depositan en el cuerpo del útero. Para reforzar lo expresado más arriba se menciona un trabajo de investigación realizado por Hunter, en 1968, en el cuál se evalúa la fertilidad obtenida por un grupo de inseminadores de distinto nivel de eficiencia, con dosis de semen de diez y veinte millones de espermatozoides por unidad. En el Cuadro Nº1 se observa que disminuye la fertilidad del semen al reducir la cantidad de espermatozoides por unidad de siembra. Pero si se clasifica a los técnicos inseminadores por los resultados de fertilidad que habían obtenido previo al ensayo, se comprueba que cuando los técnicos de baja eficiencia utilizaron dosis de semen con diez millones de espermatozoides, la fertilidad disminuyó significativamente. Por el contrario, con el grupo de mejor nivel no hubo disminución de la fertilidad al utilizar el semen con menor cantidad de espermatozoides. Se considera que como consecuencia de un mejor cuidado y manejo del semen, además de realizar la siembra en el lugar más adecuado, los inseminadores de mayor eficiencia depositaron más espermatozoides viables en el cuerpo del útero. Es interesante mencionar, en relación al Cuadro Nº1, que algunos inseminadores al utilizar voluntariamente una pajuela para dos hembras disminuyen la cantidad de espermatozoides sembrados por servicio. Esta práctica de manejo, además de afectar la tasa de concepción, puede ser la vía de contagio de enfermedades venéreas trichomoniasis-campylobacteriosis, bacterianas y virales, particularmente leucosis. • Estados emocionales Hay situaciones problemáticas de diversa índole –principalmente familiares, laborales y económicas– que pueden afectar el estado emocional del inseminador y repercuten negativamente en su eficiencia laboral. Es muy frecuente observar en el campo, ante inconvenientes como los mencionados con anterioridad, disminuciones significativas en la fertilidad de los servicios obtenidos por inseminadores de dilatada experiencia y alta eficiencia. Resulta imprescindible tener en cuenta que la técnica de I.A. requiere una atención cuidadosa y pormenorizada para realizar una serie de pasos delicados que permitan lograr altas tasas de concepción. El estado emocional alterado es una gran limitante para lograrlas. Por otra parte, se considera importante mencionar que si se realizan comentarios adversos sobre el grado de fertilidad de una partida de semen en presencia del técnico inseminador, es probable que se logre un mal resultado. Uwland, en 1983, comprobó que la mera sugestión del inseminador podría alterar el porcentaje de concepción. A tal efecto, realizó un ensayo con doce inseminadores con diferentes grados de eficiencia, utilizando eyaculados de cinco toros divididos en mitades y envasados en pajuelas de 0,25 cc marcadas en un extremo con colores negro o rojo. Antes de realizar la distribución del semen, los inseminadores fueron informados en forma colectiva que iban a participar de un ensayo de fertilidad y se les indicó reiteradamente que el semen envasado en las pajuelas con marcas negras, podría ser más fértil. En el Cuadro Nº2 se indican los resultados logrados. El análisis del Cuadro Nº2 muestra que los inseminadores con menor porcentaje de No Retorno fueron los que obtuvieron mayores diferencias de fertilidad con diferentes colores de pajuelas. La correlación entre el porcentaje de No Retorno del inseminador y la diferencia en el porcentaje de No Retorno entre los colores de las pajuelas fue altamente significativa (r=-0,95; P<0,001). Este autor señala al respecto que los inseminadores de menor eficiencia trataron con mayor cuidado el semen que consideraban más fértil. Por el contrario, con el material seminal que creían subjetivamente de inferior poder fecundante, cometieron errores en la técnica de inseminación. • Irregularidad en el reaprovisionamiento de nitrógeno líquido La aplicación de rutinas incorrectas en el reaprovisionamiento de nitrógeno líquido, fundamentalmente en lo referente a frecuencia y periodicidad, más la falta de control del nivel de nitrógeno de la conservadora pueden afectar la integridad estructural, el poder fecundante y la viabilidad espermática. Si bien, con vapores de nitrógeno en la conservadora es posible mantener la fertilidad del semen por 24 horas es elemental que el nitrógeno líquido cubra la totalidad de las pajuelas y llene el gobelet mientras el semen es almacenado en la conservadora. Las pajuelas son más susceptibles a sufrir un daño en su poder fecundante, al incrementarse la temperatura rápidamente, cuando el canastillo es elevado hacia la boca de la conservadora sin la presencia de nitrógeno líquido en el gobelet. Al respecto, Nur y col., 2006, estudiaron los efectos detrimentales del incremento de temperatura y la resistencia de las células espermáticas al choque a frío posterior al descongelamiento, considerando diferentes niveles de nitrógeno líquido en la conservadora. Utilizaron dos conservadoras con tres canastillos, con 100 dosis de semen cada uno, con alto y bajo nivel de nitrógeno líquido. En la primera, el nivel interior era de 3 cm. de nitrógeno, lo que permitía cubrir sólo 2 cm. la parte inferior de la pajuela. En la número dos, el nivel de nitrógeno líquido era alto, dado que contenía 17 cm. en su interior, 2 cm. por encima de la pajuela. En ambas conservadoras el canastillo N°1 sirvió como control, sin ninguna manipulación. El canastillo N°2 fue elevado y descendido 100 veces hasta el cuello de la conservadora y mantenido a ese nivel por 10 segundos. Mientras que la base del canastillo N°3 superó la boca de la conservadora y fue mantenido a ese nivel por 20 segundos. Se evaluó la motilidad, la integridad acrosomal y la permeabilidad de la membrana celular. Según se puede apreciar en la figura 7 el choque a frío posterior al descongelamiento causó daños significativos en la motilidad, en la integridad de la membrana y en el acrosoma de los espermatozoides de ambas conservadoras. No obstante, el material seminal conservado con bajo nivel de nitrógeno y mantenido fuera de la conservadora por 20 segundos fue más dañado por el choque a frío. Además, del nivel de nitrógeno, la manipulación del canastillo tenía un efecto negativo en los espermatozoides sometidos o no al choque a frío. Es muy preocupante, la alta frecuencia con que se observa semen deteriorado o totalmente inutilizado, a consecuencia de un incorrecto manejo del canastillo de la conservadora en la extracción de semen en la rutina diaria. Gráfico Nº7 Efectos del nivel de nitrógeno líquido de la conservadora, la técnica de extracción de semen del canastillo y el choque a frío posterior al descongelamiento, sobre la motilidad e integridad estructural espermática. 50 45 40 Porcentaje 35 30 25 20 15 10 5 0 37°C/30 choque a frío 37°C/30 choque a frío NNLB NNLB NNLA NNLA Sin Manip. Sin Manip. Sin Manip. Sin Manip. 37°C/30 choque a frío 37°C/30 choque a frío 37°C/30 choque a frío 37°C/30 choque a frío NNLB NNLB NNLA NNLA NNLB NNLB NNLA NNLA Manip. Normal Manip. Normal Manip. Normal Manip. Normal Manip. Incorr. Manip. Incorr. Manip. Incorr. Manip. Incorr. Manejo del canastillo - NNL - Temperatura motilidad acrosomas defectuosos perm. memb. Fuente: Adaptado de Nur y col., 2006. (*)Nivel de nitrógeno líquido alto (NNLA) y bajo (NNLB). • Choque por frío Desde la extracción de la conservadora a nitrógeno líquido, hasta la siembra de la hembra en celo, el semen es expuesto a múltiples variaciones de temperatura que pueden afectar su integridad estructural y poder fecundante. Un error muy frecuente, en épocas invernales, consiste en someter al semen descongelado a temperaturas inferiores a la del agua utilizada para el descongelamiento. Dependiendo del tiempo de exposición y la diferencia térmica, se producen daños en la morfología espermática e incluso la muerte de los espermatozoides. Este error de manejo denominado choque por frío es producido por dos motivos principales: - No frotar con papel higiénico la recamara de la jeringa metálica, mientras se descongela el semen. Sobre todo en época invernal, determina un daño significativo, por choque a frío, de la morfología espermática, fundamentalmente en la membrana celular externa y el acrosoma. En el Gráfico Nº8 se puede apreciar como al disminuir la temperatura espermática, al colocar la pajuela descongelada, previa exposición a temperatura ambiente de 5°C durante un minuto, en una jeringa metálica templada o no, por el frotamiento con papel, y el consiguiente daño de los espermatozoides en función del grado de disminución de la temperatura del instrumental. Gráfico Nº8 Efecto de la temperatura ambiente sobre el daño espermático considerando si se efectúa o no el calentamiento de la jeringa para inseminar. Fuente: A.I. Managment Manual. American Breeders Service, Second Edition, 1986. - No proteger, por debajo de la ropa del inseminador, la jeringa armada hasta introducirla en la vagina de la hembra a inseminar. La protección se debe realizar evitando el contacto directo del complejo jeringa-vaina-pajuela con la piel. Particularmente con las axilas, dado que el sudor y los desodorantes o antitranspirantes son altamente tóxicos para el semen. En algunas ocasiones para contrarrestar el shock por frío, en condiciones ambientales extremas, los inseminadores descongelan el semen en el aparato genital de la hembra. Si bien se estaría evitando el shock por frío, el procedimiento incorrecto de descongelamiento produce stress osmótico y cristales. En un estudio realizado por DeJarnette y col. en el año 2000, se comprobó que las pajuelas descongeladas en agua a 35°C y expuestas posteriormente a 0°C, de uno a cinco minutos, sufren daños irreversibles en su integridad estructural. En la figura 9 se observa que es significativamente mayor el porcentaje de acrosomas dañados a partir de los tres minutos de exposición a 0°C, dado que a partir de este período sufren el fenómeno de recongelamiento. No obstante, se desprende de la figura 5 que la maniobra de evitar el shock a frío, descongelando directamente en el aparato genital de la hembra es más grave aún, dado que produce el mayor porcentaje de acrosomas dañados. Gráfico Nº9 Porcentaje de acrosomas intactos considerando el método de descongelamiento y los minutos de exposición al shock a frío. Fuente: DeJarnette y col., 2000. • Técnica de descongelamiento errónea A excepción de los casos extremos, en que la temperatura durante el descongelamiento se eleva de tal manera que destruye los espermatozoides, el proceso de fertilización puede ocurrir con diferentes métodos de descongelamiento. Sin embargo, debe maximizarse el poder fecundante del semen, para lograr los mejores resultados, fundamentalmente con los inseminadores de menor eficiencia. Para favorecer la fisiología espermática se requiere un método de descongelamiento rápido. No obstante, si durante el proceso de descongelamiento, la temperatura espermática se eleva por encima de la temperatura corporal (37ºC), el semen puede dañarse. La magnitud del daño depende de la temperatura alcanzada y el tiempo sometido a esas condiciones adversas. Para observar, si los cambios en la fisiología espermática, causados por diferentes temperaturas de descongelamiento, tenían algún efecto sobre la capacidad fecundante del semen, Pace, en 1982, realizó un ensayo con tres diferentes temperaturas de descongelamiento: a) agua con hielo (1 a 2ºC); b) agua a temperatura ambiente 20ºC; c) agua a 37ºC. No utilizó temperaturas más elevadas por el posible abuso bajo condiciones de rutina de campo. Se realizaron 15884 primeros servicios, provenientes de 14 toros, con 49 inseminadores. Los mejores resultados fueron obtenidos con el descongelamiento en agua a 37ºC, 4,6% de diferencia en promedio en la tasa de no retorno a 90 días, con el agua con hielo o a temperatura ambiente. No obstante, es muy interesante observar, según se indica en la figura 10, las diferencias entre inseminadores al utilizar las temperaturas de descongelamiento más extremas (agua a 37ºC o agua con hielo): • El rango entre inseminadores fue de 36%, 82 y 46% de No Retorno 60/90 para el mejor y el peor inseminador; • La diferente longitud de las flechas, indica que los inseminadores de menor eficiencia tenían un rango expresado en el porcentaje de No Retorno 60/90, significativamente mayor, que el de los inseminadores de mejor nivel, entre ambos métodos de descongelamiento. Esta diferencia, en parte se explicaría, dado que el mayor poder fecundante logrado con el descongelamiento a 37ºC, compensaría un inadecuado manejo del semen y una inapropiada técnica de siembra. Gráfico Nº10 Tasa de No Retorno a los 90 días considerando inseminadores y temperatura de descongelamiento. Fuente: Pace, 1982. En un segundo ensayo evaluó el porcentaje de preñez obtenido con semen descongelado en agua, a 37ºC o directamente en el aparato genital de la hembra. Se utilizaron 527 vaquillonas y semen de 20 toros. El tiempo transcurrido entre la extracción del semen del nitrógeno líquido, hasta la colocación de la jeringa armada, en la vagina fue de 30 segundos. La jeringa metálica se mantuvo en el cuello del útero durante 10 segundos antes de realizar la siembra, dado que en algunos casos resultaba imposible expulsar la totalidad del semen. La diferencia fue de 5,2% entre ambos métodos, según se aprecia en la figura 11, a favor del descongelamiento en agua a 37ºC. Gráfico Nº11 Porcentaje de preñez en primer servicio considerando el método de descongelamiento. 100 90 80 P o r c e n ta je d e p r e ñ e z 70 60 50 40 30 272 Vaq. 255 Vaq. 20 10 0 Agua a 37ºC En la vaca Método de descongelamiento Fuente: Pace y col., 1982. Estas diferencias se explicarían, si bien la temperatura en el aparato genital de la hembra es de 38ºC porque el descongelamiento lleva más tiempo, dado que la transferencia de calor al semen es más lenta y además porque los primeros 30 segundos ocurren a temperatura ambiente. En un tercer ensayo se observó el tiempo que se requiere para descongelar el semen con diferentes métodos. En la figura 12 se muestran las curvas de descongelamiento para: a) agua a 37ºC; b) agua a 1 – 2ºC; c) en el aparato genital de la vaca y d) en el bolsillo de la camisa del inseminador. Se desprende de la figura 9 que el agua es el mejor conductor de la temperatura y que el baño térmico a 36ºC permite llevar, en menos de 15 segundos, a cero grados centígrados la temperatura del semen. Pace remarca la importancia de pasar lo más rápido posible, durante el descongelamiento de -20ºC a 0ºC, para lograr el máximo poder fecundante del semen descongelado. Gráfico Nº12 Tiempo requerido, por el semen descongelado, para alcanzar los 0°C, considerando el método de descongelamiento. Fuente: Pace y col., 1982. • Cantidad de dosis descongeladas simultáneamente Las organizaciones dedicadas al procesamiento y comercialización de semen recomiendan, que no se descongelen más dosis simultáneamente a las que puedan ser utilizadas en un periodo no superior a los quince minutos, manteniendo constante la temperatura de descongelamiento a 35°C, e impidiendo además que las pajuelas tomen contacto entre sí. Estas condiciones no son fáciles de lograr en nuestras condiciones de campo y además no son recomendables para el común de los inseminadores. Cuando se efectúan recomendaciones sobre normas de manejo del semen, es muy apropiado pensar en éstos, que son la gran mayoría., no en los expertos con gran experiencia, que pertenecen a un grupo absolutamente minoritario. Hay que ser sumamente cuidadoso y conservador al efectuar recomendaciones de manejo. Es fundamental tener en cuenta, que existe una interacción negativa entre el nivel de eficiencia del inseminador y la cantidad de espermatozoides viables que se depositan en el cuerpo del útero. Además, es muy importante considerar que el principal producto del metabolismo de los espermatozoides es el ácido láctico. Este se acumula a medida que transcurre el tiempo entre el descongelado y la siembra, alterando el medio y la viabilidad espermática. En la figura 13 se observa, si no realiza la siembra de inmediato, una disminución en la viabilidad de los espermatozoides en función del paso del tiempo y la temperatura de descongelamiento. A 37°C, se recuperan más espermatozoides y con mayor vigor que descongelando a 5°C. Paradójicamente, si no se realiza la I.A. de inmediato, a bajas temperaturas hay mayor viabilidad espermática a partir de los 15 minutos al estar disminuida la actividad metabólica de las gametas. Por esta razón, que en realidad se utilizó por sentido común y ante la necesidad de agudizar el ingenio, se permitió la implementación de la I.A. en la década del 70, con el consiguiente mejoramiento genético, en pequeños establecimientos que no integraban un circuito o no podían adquirir una conservadora a nitrógeno líquido. Esta se compartía en forma cooperativa en el lugar donde se entregaba la leche. El semen se descongelaba, en agua con hielo a 5°C, en un recipiente de poliestireno expandido, tomando la precaución que las unidades descongeladas no tomaran contacto entre sí ni con el hielo. El material seminal descongelado, se transportaba hasta las unidades de ordeño para realizar la siembra correspondiente, obteniendo, bajo esas circunstancias, resultados satisfactorios. Gráfico Nº13 Efecto de mantener el semen en el agua de descongelamiento a 5°C y a 37°C. Fuente: A.I. Managment Manual. American Breeders Service, Second Edition, 1986. Lo ideal, desde el punto de vista práctico, es descongelar e inseminar inmediatamente. En una publicación realizada por Dejarnette, y col. 2002, en la cual se mencionan siete trabajos con más de 19.000 inseminaciones, se concluye que el número de pajuelas descongeladas simultáneamente, para no afectar la fertilidad, depende de la metodología de manejo empleada. A conclusiones similares arribaron Dalton y col., 2004, en un trabajo a campo realizado en rodeos lecheros con pajuelas de 0,5 ml. para evaluar si había efecto detrimental en la fertilidad de los servicios al descongelar varias dosis simultáneamente. Estos autores concluyen que había diferencias significativas en el nivel de los inseminadores, 18 unidades porcentuales, considerando el nivel de capacitación. Resaltando, además, la importancia de respetar al máximo las normas de manejo, fundamentalmente en mantener la temperatura de descongelamiento constante y no descongelar más unidades de semen que las que pueden ser utilizadas en un período de quince minutos. Cuando hay varios animales para inseminar simultáneamente, bajo un programa de inseminación sistemática a tiempo fijo, lo más práctico y eficiente consiste en formar un equipo de trabajo para que un idóneo realice el descongelamiento y armado del complejo jeringa-vaina-pajuela, mientras el inseminador más experimentado sólo realice la técnica de siembra. Con esta metodología de manejo, más la integración de personal para efectuar las tareas de encierre en instalaciones adecuadas, se puede de inseminar más de una vaca por minuto, en promedio setenta por hora, con un intervalo descongelamiento-siembra inferior a sesenta segundos, logrando excelentes resultados de preñez. • Instrumental de mala calidad Se observa con bastante frecuencia, la utilización de elementos de mala calidad e inadecuados para realizar la siembra del material seminal, fundamentalmente cuando se decide, por desconocimiento, efectuar una disminución de gastos, dado que el valor del instrumental no tiene impacto alguno en el costo de la I.A. Por el contrario, los serios problemas de infertilidad, que por su origen, se podrían denominar “instrumental”, al emplear jeringas y/o vainas inapropiados, los perjuicios económicos que se ocasionan pueden llegar a ser cuantiosos. Las fallas de calidad más comunes encontradas en la práctica diaria se enumeran a continuación: - Jeringas: • construidas con aleaciones metálicas deficientes que se quiebran con suma facilidad ante la mínima dificultad para atravesar el canal cervical. • con falta de tope interior para evitar que la pajuela se vaya al fondo de el cuerpo de la misma. • con diámetro insuficiente del cuerpo, que impide la colocación de la pajuela acoplada con el intermediario plástico de la vaina - Vainas: • elaboradas con material, sin la consistencia adecuada que se doblan en el ángulo al intentar el cateterismo del canal cervical. • con corte de insuficiente longitud en su extremo inferior, que impide el descenso de la misma hasta hacer tope con la base del cono de la jeringa, obstaculizando, su sujeción con la arandela plástica o el cerrojo de la “quick-lock” • con diámetro inadecuado del intermediario plástico que no permite un acople perfecto con la pajuela. • de material abrasivo que produce lesiones traumáticas en el cuello del útero y en el endometrio. Como síntesis, de las consecuencias negativas, por la utilización de instrumental de mala calidad, para realizar la I.A., se mencionan: - complicaciones para realizar las tareas de armado del complejo pajuelaintermediario-vaina-jeringa - dificultades para realizar el cateterismo del canal cervical y la técnica de siembra. - pérdidas parciales o totales del material seminal entre la pajuela y la vaina. - lesiones lacerantes del endometrio y el canal cervical dando origen a pequeñas hemorragias, provocando el fenómeno de capacitación precoz de los espermatozoides sembrados, ocasionado por la β-amilasa de los eosinófilos; más el desarrollo de cervicitis y endometritis inespecífica. • Armado incorrecto del instrumental En el Gráfico Nº14 se puede apreciar cómo queda armado incorrectamente el complejo pajuela-intermediario-vaina-jeringa, de manera de formar una unidad sin pérdidas de continuidad, esto es fundamental para lograr que el total de los espermatozoides contenidos en la unidad descongelada sea depositado en el cuerpo del útero. Gráfico Nº14 Diagrama del complejo pajuela-intermediario-vaina-jeringa. Fuente: Practical aspects of reproductives technologies for cattle breeding. Cattle Breeding Technologies, 2008. Los errores cometidos con más frecuencia por inseminadores inexpertos o mal capacitados son los siguientes: - corte en ángulo de la pajuela, que provoca un acople imperfecto con el intermediario plástico. - acople incompleto de la pajuela con el intermediario plástico. - utilización de vainas o jeringas inadecuadas para el tipo de pajuela descongelada. - colocar en primer término, en la jeringa o en la vaina, la pajuela por el extremo opuesto al tapón mayor. - sujeción incompleta o deficiente de la vaina a la jeringa, impidiendo el accionar del émbolo. Todos estos errores, al igual que la utilización de instrumental de mala calidad, determinan, que gran parte, o la totalidad del semen utilizado para la siembra quede en el interior de la pajuela o entre esta y la vaina, ocasionando un servicio de bajísima o mala fertilidad. • Lugar de siembra incorrecto Una correcta técnica de siembra es un importantísimo requisito que se necesita para lograr la fecundación. Las características anatómicas del cuello del útero, con una proyección intravaginal en un fondo de saco, de tres a cinco centímetros de profundidad a su alrededor; más el trayecto sinuoso en espiral del canal cervical, reducido en su luz por tres poderosos anillos circulares, dificultan la tarea del inseminador con escasa experiencia. La falta de práctica, que le resta sensibilidad a sus manos, es la principal dificultad para: - Ubicarse en el interior de la hembra. - Superar con la jeringa los accidentes anatómicos de la cervix. - Depositar el semen en el cuerpo del útero. Se considera que, en los primeros trabajos realizados, hay una diferencia en promedio de diez unidades porcentuales en la tasa de concepción entre los novatos, y los de dilatada trayectoria. Si el semen no se deposita en el cuerpo del útero disminuye en forma notoria la fertilidad según se aprecia en el cuadro 3. Cuadro Nº3 Lugar de siembra y su relación con el porcentaje de fertilidad. Porcentaje de Fertilidad 55 40 13 Lugar de siembra Cuerpo del útero Cervix Vagina Fuente: Gwasdauskas, 1978. Graham, 1966; observó según se aprecia en el cuadro 4, que el 86% de los inseminadores con mayor porcentaje de concepción realizaban la siembra en el cuerpo del útero. Por el contrario, los técnicos que habían obtenido un bajo porcentaje de fertilidad, depositaban el semen en diferentes partes del aparato genital y solamente un 30% de estos efectuaban la siembra en el lugar adecuado. Cuadro Nº4 Lugar donde realizaron la siembra del semen los inseminadores de baja y alta fertilidad. Porcentaje de fertilidad por inseminador Lugar de siembra <70% >78% Cuerpo del útero Porcentaje de inseminadores 30 86 Cuerno derecho 43 14 Cuerno izquierdo 4 0 Cérvix 20 0 3 0 Vagina Fuente: Graham, 1966. Si bien, hay migración de espermatozoides de un cuerno uterino a otro, la probabilidad de fertilizar el óvulo es menor, cuando la siembra se realiza en el cuerno opuesto al ovario en que ocurre la ovulación. Esto fue demostrado por Hawk y Tanabe, en 1986, mediante un ensayo con vacas superovuladas, veintiuna de primer servicio y siete repetidoras que promediaban 4,7 inseminaciones infértiles. En la I.A. el semen fue depositado en la curvatura mayor del cuerno uterino, a la mitad de la distancia entre el orificio cervical anterior y la unión útero-tubárica. Las vacas se sacrificaron entre los dos y siete días posteriores al celo para cuantificar, recuperar y examinar los óvulos fertilizados. Los resultados logrados se indican en el cuadro 5. Cuadro Nº5 Cantidad de óvulos recuperados y fertilizados considerando el lugar de siembra intracornual en relación al ovario en que ocurrió la ovulación. Porcentaje de fertilidad Porcentaje Óvulos de óvulos recuperados fertilizados I.A. en el cuerno uterino del mismo lado de la ovulación I.A en el cuerno uterino del lado opuesto a la ovulación Cantidad de vacas Tipo de vientre 21 De primer servicio 362 74 (a) 81 (b) 68 (b) 7 Repetidoras 128 43 (a) 54 (c) 32 (c) (a) P<0.001 (b) P<0.01 (c) P<0.25 Fuente: Hawk y Tanabe, 1986. Hay que tener en cuenta además, que la mayor parte del semen se elimina al exterior a las pocas horas posteriores a la inseminación y el lugar de siembra del material seminal tiene un gran impacto en el porcentaje de espermatozoides eliminados hacia la vagina. Gallagher y Senger, 1989, demostraron según se observa en la figura 15, que el movimiento retrogrado del semen hacia la vagina se duplica si la siembra se realiza en la mitad del cuello uterino respecto a la efectuada en el cuerpo y cuernos del útero. No hay diferencia en el porcentaje de espermatozoides eliminados al exterior del aparato genital, si la siembra se realiza en el cuerpo o en los cuernos del útero. En consecuencia, el reconocimiento del lugar de siembra por el inseminador es de suma importancia, dado que al depositar el semen en la mitad del cuello del útero, puede ocasionar una pérdida de espermatozoides de tal magnitud que afecte la fertilidad. Gráfico Nº15 Porcentaje acumulado de espermatozoides recuperados por hora en la vagina considerando el lugar de siembra del material seminal. Fuente: Gallagher y Senger 1989. Por otra parte es importante recalcar que existe una polémica entre quienes defienden la teoría de que el cuerpo del útero es el lugar indicado y aquellos que dicen que debe depositarse media dosis en un cuerno uterino y media dosis en el otro cuerno. El Dr. W. N. Graves, en 1991, realizó una investigación que parece dar la respuesta definitiva a un viejo interrogante. El objetivo de su trabajo fue comparar la técnica de inseminación en el cuerpo del útero versus la inseminación en los cuernos uterinos. Se utilizaron 364 vacas y 138 vaquillonas de raza Jersey. La inseminación fue realizada por dos técnicos, con 10 y 20 años de experiencia cada uno, reentrenados para este ensayo. Los resultados obtenidos se indican en el cuadro 6. Cuadro Nº6 Porcentaje de concepción considerando el lugar de siembra. Lugar de siembra Número de animales Cuerpo del útero Cuernos uterinos Total Fuente: Graves, 1991. 286 216 502 % de concepción 62,9 54,2 59,2 Los resultados son claros, el cuerpo del útero es el lugar mas adecuado para realizar la siembra del material seminal. Como síntesis final, para maximizar el poder fecundante del semen, se recomienda seguir las acciones de manejo que se mencionan a continuación: ♦ Tener un programa de reaprovisionamiento de nitrógeno líquido en función de la autonomía de la conservadora. ♦ Realizar un control periódico y regular cada siete días para comprobar el nivel de nitrógeno que no debe ser inferior a doce centímetros. Ante un consumo excesivo o la observación de hielo en la zona del cuello de la conservadora, recurrir de inmediato a la empresa de I.A. proveedora de insumos. ♦ Observar los registros antes de realizar la extracción del semen. ♦ Extraer el semen con pinza metálica, en la zona nevada del cuello, sin que el canastillo supere la boca de la conservadora. ♦ Eliminar la gota de nitrógeno del tapón de algodón sacudiendo la pajuela enérgicamente dos veces. ♦ Descongelar, una dosis por vez, en agua entre 34 a 37°C, durante treinta segundos a un minuto. Si hay varias vacas para inseminar simultáneamente, una persona debe realizar el descongelamiento del semen y el armado de la jeringa y otra realizar la técnica de siembra, para minimizar las probabilidades de dañar el semen y disminuir la fatiga muscular del operador. ♦ Frotar con papel higiénico la recamara de la jeringa durante el descongelamiento. ♦ Extraer la pajuela, secarla y cortar en ángulo recto inmediatamente por debajo del extremo sellado con ultrasonido. ♦ Realizar el acople, de la pajuela con el intermediario de la vaina, antes de introducirla en la jeringa para inseminar. ♦ Asegurar la vaina firmemente al cono de la jeringa con la arandela de plástico o con el “cerrojo”. ♦ Proteger con la mano el extremo de la jeringa o entre la ropa del inseminador para evitar cambios de temperatura hasta iniciar la I.A. ♦ Mantener la higiene de los labios vulvares, limpiándolos con una servilleta de papel descartable. Separarlos manualmente e introducir con rapidez la jeringa por el techo del vestíbulo de la vulva y la vagina, para evitar la uretra y la vejiga. ♦ Tomar el cuello del útero y realizar el cateterismo con suavidad evitando maniobras bruscas que lesionen el endometrio. ♦ Depositar lentamente la totalidad del semen, inmediatamente por delante del orificio anterior del cuello del útero. ♦ Retirar la jeringa lentamente y con suavidad para evitar el reflujo de semen. ♦ Realizar el masaje de clítoris durante siete segundos al finalizar la siembra. En resumen, si se realiza una correcta individualización de los animales en celo, se aplican adecuadas acciones de manejo con el semen, como las mencionadas anteriormente, y se deposita el material seminal en el cuerpo del útero, se obtendrán altas tasas de concepción y de preñez, permitiendo lograr una excelente eficiencia reproductiva. Méd. Vet. Enrique Arisnabarreta Agradecimientos: A la Lic. Lucía Andreozzi, por el análisis estadístico Gráfico Nº1 MANEJO Y AMBIENTE, CLAVES EN LA FERTILIDAD Distribución de las causas primarias que afectan a la fertilidad Fuente: Weigel, K., 2001. Gráfico Nº3 EL ESPERMATOZOIDE, SUS PARTES Observación de espermatozoides a 1.600 aumentos en microfotografías de alto contraste en blanco y negro, con la técnica de tinción eosina-nigrosina. Se destaca la cabeza, cubierta por el acrosoma o capuchón cefálico, y la cola. Fuente: Barth y Oko, 1989. Gráfico Nº4 LA CABEZA DEL ESPERMATOZOIDE Ultraestructura de la cabeza del espermatozoide bovino observada con microscopía electrónica. Fuente: Saacke, 1986. Gráfico Nº5 EL CAMINO DEL ESPERMATOZOIDE Eventos secuenciales desde la eyaculación a la fertilización. 1234- Almacenamiento epididimal de espermatozoides Servicio Natural Líquido seminal ampolla deferencial vesículas seminales próstata glándulas bulbouretrales Inseminación Artificial Fondo de saco vaginal Eyaculado Dilución Congelación motilidad Deposición sin paso o reflujo cervix Almacenamiento Descongelación Motilidad Inseminación Útero Fagocitosis leucocitaria Motilidad/capacitación Oviducto Pérdida en abdomen Fusión/capacitación Fertilización Fusión/reacción acrosómica penetración Muerte pre-embrionaria Cigoto Muerte embrionaria temprana Nidación y desarrollo Producción de la proteína D14 (Señal de reconocimiento materno) Gestación Fuente: Den Daas, 1997, citado por R. Espinoza 1998. Gráfico Nº6 LA SUMATORIA DE ERRORES SE HACE NOTAR Efectos acumulativos de errores en el manejo de la I.A. que disminuyen la cantidad de espermatozoides depositados en el aparato genital de la hembra. Fuente: Practical aspects of reproductives technologies for cattle breeding. Cattle Breeding Technologies, 2008. (*) Se parte del supuesto que la hembra recibe un promedio de doce a quince millones de espermatozoides vivos mediante la siembra del material seminal en el cuerpo del útero. Cuadro Nº1 PASA TAMBIEN POR LA HABILIDAD DEL INSEMINADOR Porcentaje de fertilidad considerando el nivel de eficiencia del inseminador y la cantidad de espermatozoides por unidad de siembra. Clasificación de los inseminadores por los resultados logrados previos al ensayo Alta eficiencia Baja eficiencia Total Fuente: Hunter, 1968. Cantidad de espermatozoides por dosis 20.000.000 Total de primeros servicios 2.885 2.670 5.555 Porcentaje de No Retorno 82,3 80,0 81,0 10.000.000 Total de primeros servicios 2.875 2.996 5.871 Porcentaje de No Retorno 81,1 71,2 76,1 Cuadro Nº2 EL COMENTARIO NEGATIVO PREVIO INFLUYE Porcentaje de No Retorno a servicio de 56 días logrado por inseminadores de distinta eficiencia influenciados por comentarios previos y negativos de la fertilidad del semen. Pajuelas con marca Roja Pajuelas con marca Negra Cuatro inseminadores con % de No Ret. superior al promedio Cuatro inseminadores con % de No Ret. Promedio Cuatro inseminadores con % de No Ret. inferior al promedio n.s.= No significativo Fuente: Uwland, 1983. Primeros servicios % No Ret. 56 días Primeros servicios % No Ret. 56 días 1.115 73,5 1.115 73,9 n.s. Χ2=0,06 947 70,7 950 73,3 n.s. Χ2=0,06 957 67,0 976 72,3 n.s. Χ2=0,06