Manual - BVS-INS - Instituto Nacional de Salud

Transcripción

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© Ministerio de Salud
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Jr. Cápac Yupanqui 1400, Jesús María
Telf. 471-3254 / Fax: 471-7443
Lima, Perú, 1997
Diseño e impresión : Art. Lautrec S.R.Ltda.
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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TECNICOS
PARA EL DIAGNOSTICO SEROLOGICO
DE LA HIDATIDOSIS HUMANA
COMITÉ DE REDACCIÓN:
Blgo. Elizabeth Luz Sánchez Romaní
Dr. César Náquira Velarde
Blga. Sonia Gutierrez Gonzáles
Blgo. Eduardo Ayala Sulca
Tec. Lab. Sonia Medina Alvarez
COMITÉ EDITOR:
Dr. Alfonso Zavaleta Martínez-Vargas
Dr. César Cabezas Sánchez
Dr. Carlos Carrillo Parodi
Dr. Jaime Chang Neyra
MINISTERIO DE SALUD
ALTA DIRECCIÓN
Dr. Marino Costa Bauer
Ministro
Dr. Alejandro Aguinaga Recuenco
Viceministro
Jefe
CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PUBLICA
Director General
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PERFIL DE LOS AUTORES
Blga. M.Sc. Elizabeth Luz Sánchez Romaní
Biólogo-Microbiológo, Maestro en Ciencias
Jefe de División de Parasitología, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA.
Dr. César Náquira Velarde
Médico, Doctor en Medicina
Profesor Principal, Departamento de Microbiología Médica, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Miembro,
Instituto de Medicina Tropical D.A. Carrión Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
Jefe de Laboratorio de Zoonosis, División de Parasitología, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA.
Blga. Sonia Gutiérrez Gonzales
Bióloga asistente, Laboratorio de Zoonosis, División de Parasitología, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA.
Blgo. Eduardo Ayala Sulca
Biólogo asistente, Laboratorio de Zoonosis, División de Parasitología, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA.
Téc. Lab. Sonia Medina Alvarez
Técnico de Laboratorio I, Laboratorio de Zoonosis, División de Parasitología, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS,
MINSA.
PERFIL DE LOS EDITORES
Dr. Alfonso Zavaleta Martínez-Vargas
Médico Cirujano, Doctor en Farmacología
Director General, Centro Nacional de Control de Calidad, INS, MINSA
Profesor Principal, Sección Farmacología, Departamento Académico de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Ciencias y Filosofía,
Universidad Peruana Cayetano Heredia
Miembro, Instituto de Medicina Tropical “Alexander von Humboldt”, Universidad Peruana Cayetano Heredia.
Médico Cirujano, Master en Medicina, Especialista en Enfermedades Infecciosas y Tropicales
Director General, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA.
Profesor invitado de Medicina Tropical, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Universidad Peruana Cayetano Heredia.
Médico Cirujano, Doctor en Medicina
Profesor Principal, Departamento Académico de Microbiología, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia.
Jefe, Instituto Nacional de Salud
Dr. Jaime Chang Neyra
Médico Cirujano, Master of Science in Community Health in Developing Countries
Director Ejecutivo de Garantía de la Calidad y Certificación, Centro Nacional de Control de Calidad, INS, MINSA
Investigador, Instituto de Medicina Tropical “Alexander von Humboldt”, Universidad Peruana Cayetano Heredia.
La edición de este Manual se efectuó en el marco del Convenio de Cooperación suscrito entre el Instituto Nacional de Salud y la
Universidad Peruana Cayetano Heredia.
El Comité Editor agradece al Dr. Jorge Barnaby Rodríguez, por la revisión y los comentarios efectuados a esta obra.
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INDICE
Presentación......................................................................................................................................................... 7
Resolución Jefatural............................................................................................................................................ 8
CAPITULO I
Introducción......................................................................................................................................................... 9
CAPITULO II
Métodos seroinmunológicos para el diagnóstico de la
hidatidosis humana .............................................................................................................................................. 14
CAPITULO III
Prueba de doble difusión arco 5 (DD5)................................................................................................................ 15
CAPITULO IV
Prueba de inmunoblot...........................................................................................................................................19
CAPITULO V
Obtención de muestra de suero.............................................................................................................................25
CAPITULO VI
Conservación y envío de muestras de suero.........................................................................................................28
CAPITULO VII
Bioseguridad.........................................................................................................................................................30
CAPITULO VIII
Referencias Bibliográficas................................................................................................................................... 32
CAPITULO IX
ANEXOS.............................................................................................................................................................. 34
Anexo 1 : Materiales, equipos, reactivos y soluciones
para la prueba de DD5 .........................................................................................................................................35
Anexo 2 : Materiales, equipos, reactivos y soluciones
para la prueba de inmunoblot ...............................................................................................................................39
Anexo 3 : Materiales para obtención de muestras de sangre venosa ...................................................................43
CAPITULO X
Glosario.................................................................................................................................................................44
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PRESENTACIÓN
Las referencias históricas describen que el parásito Equinococcus granulosus fue introducido en la época de
la Colonia, pero es en este siglo que la enfermedad es considerada como un problema emergente de Salud
Pública. La relación epidemiológica hombre -perro- ganado (Bovino, Caprino, Ovino) no ha podido ser rota
hasta la fecha en todo el territorio nacional. Se han intentado tratamientos a humanos y perros; se ha controlado
los animales beneficiados; se ha capacitado a personal de Salud, escolares y comunidad; se ha evaluado el
impacto económico negativo de por lo menos US$ 1'000,000 por año; se han ejecutado estudios, investigaciones
e intervenciones integrales en áreas puntuales. Pese al desarrollo de diferentes métodos diagnósticos utilizados y
fuentes de información (necropsias, hallazgos operatorios, radiología, serología) no existe aún un programa
multisectorial, multidisciplinario y a nivel nacional que permita el abordaje exitoso de esta patología. “No basta
con matar al perro”, es necesario que el personal de salud y de otras áreas técnicas trabaje en conjunto
estrategias de mediano y largo plazo para limitar, eliminar o erradicar un problema endémico que a todas luces
puede seguir avanzando en territorio y numero de personas y animales infestados.
El Instituto Nacional de Salud, dentro de la política sectorial presenta el Manual de Procedimientos Técnicos
para el Diagnóstico Serológico de la Hidatidosis Humana, para su utilización en los laboratorios de diagnóstico
y referencia a nivel nacional y como parte de las labores de difusión técnica de la Red Nacional de Laboratorios
de Salud.
EL COMITE EDITOR
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CAPITULO I
INTRODUCCION
La hidatidosis es una zoonosis parasitaria, que tiene como agentc etiológico la forma larvaria de helmintos de la
Clase Cestoda, Género Echinococcus (Rudolphi, 1801).
Cuatro especies del Género Echinococcus pueden infectar al hombre: E. granulosus, E. multilocularis, E.
oligarthus y E. vogeli. De estas, la especie E. granulosus, es la de mayor importancia desde el punto de vista de
la salud pública y de la producción animal.
La hidatidosis causada por E. granulosus, es una de las zoonosis más difundidas y conocidas mundialmente,
existiendo en tasas variables en todos los continentes. En América del Sur la infección incide, preferentemente,
en los países ganaderos, sobre todo con crianza de ovinos, principalmente en las áreas rurales del Uruguay,
Argentina, Chile, sur del Brasil, Bolivia y Perú.
En el Perú, la hidatidosis está ampliamente difundida en ambientes rurales de la Sierra y también en zonas
urbanas de Arequipa y Lima, debido a la presencia de perros infectados que son traídos de las zonas endémicas a
las ciudades o al deficiente control veterinario de los camales.
En la mayoría de los casos de infección humana, el desarrollo del quiste hidatídico es asintomático. La infección
humana se produce por la ingesta de los huevos de E. granulosus, que generalmente se da en la infancia y la
sintomatología irá a manifestarse tardíamente, esto es, en la edad adulta, cuando el quiste hidatídico haya
alcanzado un tamaño mayor.
Las manifestaciones clínicas de la hidatidosis se relacionan con el estado físico del quiste e integridad de sus
membranas, así como con la localización y tamaño del quiste. Generalmente el crecimiento del quiste se
manifiesta como masa que causa deformación de los órganos y alteraciones funcionales de los mismos.
En casos de localización pulmonar, los signos y síntomas frecuentemente incluyen tos, dolor toráxico,
hemoptisis y/o disnea. Cuando la localización es hepática o abdominal puede haber dolor, masas palpables,
ictericia, hepatomegalia y/o esplenomegalia. Los casos de localización ósea producen destrucción de trabéculas,
necrosis y fractura expontánea. El pronóstico se agrava cuando la localización es en órganos vitales como el
sistema nervioso central, el corazón y los riñones.
La hidatidosis es una de las pocas infecciones parasitarias humanas, cuyo diagnóstico de laboratorio es
principalmente inmunoserológico. Sin embargo, cuando la sintomatología lo indica, son utilizados exámenes
microscópicos dirigidos a la búsqueda de escólices en la orina, o escólices y/o fragmentos de membrana en la
expectoración brónquica así como en líquidos pleurales y abdominales. Es importante señalar que está
contraindicada la punción del quiste, por ser una conducta inductora de choque anafiláctico con riesgo de vida
para el paciente y de causar diseminación hidatídica de consecuencias impredecibles.
El inmunodiagnóstico de la hidatidosis humana es de gran importancia, pues complementa el diagnóstico clínico
en pacientes que presentan manifestaciones o imágenes compatibles con el quiste hidatídico y consiste en la detección de anticuerpos circulantes, antígenos circulantes o células sensibilizadas contra los antígenos del quiste
hidatídico.
CARACTERISTICAS DEL AGENTE ETIOLOGICO
EL VERME ADULTO de E. granulosus es el más pequeño de los céstodes conocidos, pues mide de 3 a 6 mm
de longitud. Su cuerpo está dividido en tres partes principales: el escolex, que tiene forma globosa, con 4
ventosas y un rostelo armado de dos hileras de ganchos, el cuello o región proglotidogénica es delgado y corto; y
la estróbila, formada por 3 ó 4 proglótides, de las cuales la última es grávida.
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LA HIDATIDE, es la larva propiamente dicha. Está formada por dos membranas denominadas laminar y
germinativa y por el líquido hidatídico.
a. La membrana laminar es la más externa y acelular, y está formada por un gran número de láminas
concéntricas. Su consistencia es frági1, rompiéndose fácilmente a la menor presión.
b. La membrana germinativa es la responsable de la proliferación del parásito y de la regulación del
movimiento de macromoléculas del líquido hidatídico por la membrana laminar. A partir de esta membrana
son formadas las vesículas prolígeras que generalmente presentan forma esférica y visibles, como granos de
arena, miden de 250 a 500 μm.
A su vez, a partir de la membrana germinativa de las vesículas prolígeras se originan los Protoescólices, que
vistos al microscopio son pequeñas cabezas invaginadas, de modo que el rostelo y los ganchos quedan
protegidos, en las que la corona de ganchos y los dos pares de ventosas son claramente visibles.
c. El líquido hidatídico, elaborado por la membrana germinativa, es cristalino e incoloro, ocupa los espacios
intersticiales y baña las membrana germinativa.
Tiene composición química variable conteniendo sales y sustancias proteolíticas y glicolíticas. Es tóxico
para el organismo parasitado siendo capaz de sensibilizarlo y consecuentemente provocar la formación de
anticuerpos específicos.
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El E. granulosus es un parásito de ciclo de vida heteroxénico. La forma adulta se desarrolla y se torna
sexualmente madura, en un hospedero definitivo (perro), la forma larvaria o quística tiene lugar en los
hospederos intermediarios (ovinos, bovinos, equinos entre otros), incluyendo el hombre.
En el hospedero definitivo, el verme adulto se encuentra fijo a las vellosidades de la mucosa del intestino
delgado. Las proglótides grávidas, conteniendo varias centenas de huevos, son eliminadas con las heces del
animal a medida que se desprenden de la estróbila.
Los huevos conteniendo la oncósfera (o embrión hexacanto), son ingeridos por los hospederos intermediarios a
través de la vegetación, a partir del suelo contaminado. Cuando la oncósfera es liberada en el intestino delgado
de este hospedero, atraviesa las paredes del intestino y penetra en los vasos sanguíneos y linfáticos, mediante los
cuales es llevada a los tejidos del organismo.
En el hígado o en los pulmones, órganos donde preferentemente se localizan los embriones, la gran mayoría es
destruida por la respuesta inmune del hospedero. Aquellos que sobreviven evolucionan como una pequeña
vesícula llena de líquido incoloro cercado por células mononucleares del hospedero. Esta vesícula es la que al
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enquistarse en los tejidos del hospedero intermediario, irá a representar el inicio de la fase larvaria del parásito y
finalmente al quiste hidatídico, al formarse la membrana adventicia por la fibrosis alrededor de la hidátide o
larva.
Si las vísceras del hospedero intermediario, conteniendo quistes hidatídicos fueran devoradas por los perros, los
escólisis se desarrollarán en su intestino dando origen a la forma adulta de E. granulosus.
El hombre es un hospedero intermediario accidental y no cumple ningún papel en el ciclo evolutivo, sin
embargo, es el principal responsable en perpetuar la infección, ya que alimenta a los perros por costumbre o por
necesidad, con vísceras portadoras de quistes.
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CAPITULO II
METODOS INMUNOLOGICOS PARA EL
DIAGNOSTICO DE LA HIDATIDOSIS HUMANA
Los métodos más utilizados para el diagnóstico de la hidatidosis humana son: Hemaglutinación indirecta (HAI),
Aglutinación de Látex (AL), Doble difusión arco 5 (DD5), Inmunoelectroforesis (lEF) e Inmunoensayo
(ELISA), (8, 13). Los métodos de DD5 e IEF son considerados de referencia en las áreas endémicas de los
países de América del Sur, y están siendo utilizados en el Laboratorio de Zoonosis de la División de
Parasitología del Centro Nacional de Laboratorios de Referencia. El empleo del método de ELISA presenta un
amplio potencial para la detección de portadores asintomáticos en los que se confirmaría el diagnóstico
inmunológico con la prueba de DD5 e Inmunoblot.
Recientemente, está siendo utilizado el método de Inmunoblot o Western Blotting para el inmunodiagnóstico de
la hidatidosis humana ofreciendo alta sensibilidad y especificidad con respecto a las anteriormente mencionadas
(5). Los resultados de los estudios realizados hasta el momento en las diferentes áreas geográficas, empleando la
técnica de Inmunoblot en el diagnóstico de la hidatidosis humana, muestran antígenos específicos para E.
granulosus con masas relativas variadas (6, 11, 13).
El patrón de reactividad positivo de los pacientes hidatídicos en áreas endémicas de nuestro país está
condicionada al reconocimiento de bandas de Mr entre 21 y 31 kDa (12). Coincidentemente, estas bandas
incluyen péptidos de los dos mayores componentes antigénicos del líquido de quiste hidatidico de E.
granulosus: el antígeno “B” y el antígeno “5”. Este último es el mismo usado en la prueba de DD5,
ampliamente conocida.
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CAPITULO III
PRUEBA DE DOBLE DIFUSION DEL ARCO 5
(DD5)
Es una reacción de precipitación antígeno-anticuerpo en un medio semisólido, que consiste en detectar, en el
suero de un paciente, anticuerpos contra el antígeno del arco 5 (detectada por IEF), mediante la identidad
inmunológica con un suero control positivo.
3.1 PROCEDIMIENTO:
3.1.1.
Utilizar láminas portaobjeto de 2,5 x 7,5 cm sumergidas en alcohol, limpias y secas.
3.1.2.
Rotular en un extremo de las láminas con lápiz punta de diamante, el número y fecha
correspondiente.
3.1.3.
Sobre una superficie nivelada, colocar en la lámina con ayuda de una pipeta, 3,5 mL del gel (Anexo
I, 4.3) licuado en Baño María. (Foto 1).
3.1.4.
Dejar solidificar el gel a temperatura ambiente durante 10 minutos.
3.1.5.
Colocar la lámina en cámara húmeda y dejar enfriar por 15 minutos a 4°C.
3.1.6.
Retirar la lámina de la cámara húmeda y colocarla sobre el diagrama de corte correspondiente
(Anexo I, Figuras 1 y 2).
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3.1.7.
Cortar en el gel los orificios, utilizando los sacabocados con los diámetros correspondientes para los
dos sueros problema (10 mm), el suero control.positivo (6 mm) y el antígeno (1 mm), según el
diagrama (Figura 2). Retirar los geles cortados con una espátula fina procurando evitar dañar los
bordes de los orificios. (Foto 2).
3.1.8.
Colocar la lámina en cámara húmeda.
3.1.9.
Llenar los orificios respectivos: suero problema (150 μL), suero control positivo (50 μL) y el
antígeno (3 μL), utilizando pipetas Pasteur. (Foto 3).
No debe haber burbujas en su interior y el nivel superior debe ser convexo respecto a la superficie
del agar (Anexo I, Figuras 3 y 4).
3.1.10. En el caso del orificio del antígeno, llenar con una pipeta Pasteur adaptado para el diámetro ( 1mm)
la que debe entrar holgadamente en el orificio (sin deformarlo ni agrandarlo). Introducir
verticalmente en el orificio el extremo capilar hasta tocar la superficie del portaobjeto, dejar escurrir
lentamente el antígeno, a medida que se retira la pipeta.
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3.1.11. Dejar difundir el antígeno y los anticuerpos en el agar de la lámina a temperatura ambiente durante
40 - 48 horas.
3.1.12. Finalizada la difusión, sumergir la lámina en Solución Salina Tamponada (SST), pH 7,4 (Anexo I,
4.1), a temperatura ambiente por 36 horas. Durante este período, se cambiará 5 veces la solución de
lavado (SST). En los dos primeros lavados, eliminar de los orificios los posibles precipitados que
pudiesen haber. Para lo cual con ayuda de una pizeta se rociará con SST a presión moderada.
3.1.13. Concluido el lavado, sumergir la lámina en agua destilada por 10 minutos.
3.1.14. Luego envolver la lámina en papel filtro Watman N° 1 previamente humedecido en agua destilada.
3.1.15. Dejarla secar en estufa a 37°C x 18 horas.
3.1.16. Retirar cuidadosamente el papel que envuelve a la lámina humedeciéndolo con agua destilada, en
caso necesario.
3.1.17. Sumergir en solución colorante (Anexo I, 4.4) durante 15-20 minutos, y observar si hay la banda de
precipitación entre antígeno y suero control; de no haberla, dejar la lámina más tiempo en la
solución y continuar este paso.
3.1.18. Escurrir la lámina, enjuagar con agua de caño y volver a escurrir.
3.1.19. Sumergir en solución decolorante (Anexo I, 4.5) durante 20 - 30 minutos, hasta obtener una
decoloración satisfactoria en la lámina y apreciar claramente la banda entre el antígeno y el suero
control.
3.2 LECTURA E INTERPRETACION
La lectura consiste en observar el número de bandas de precipitación entre los orificios del suero problema y
el antígeno. Verificar si alguna de ellas presenta identidad con la banda formada entre el orificio del
antígeno y el suero control positivo. (Foto 4).
La prueba se considera válida cuando se observa la banda de precipitación entre el antígeno y el suero
control positivo; en caso contrario, la prueba carece de valor y debe repetirse el ensayo.
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3.3 INFORME DE RESULTADOS
Informar la presencia (positivo) o ausencia (negativo) del Arco 5 y el número total de bandas observadas:
a) Positivo.
b) Negativo. Anotar la siguiente observación:
“El resultado negativo no siempre indica ausencia de quiste hidatídico, pues esto puede ocurrir en caso de
quiste íntegro (hialino) y calcificado”.
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CAPITULO IV
PRUEBA DE INMUNOBLOT
FUNDAMENTO
Este método permite observar la reacción de los anticuerpos presentes en el suero de un paciente frente a
proteínas antigénicas del líquido hidatídico. Las proteínas son separadas por electroforesis y después transferidas
a una membrana de nitrocelulosa. La membrana es entonces incubada con el suero problema y luego con AntiIgG humano marcado con una enzima. Si el suero tiene anticuerpos, al agregar un substrato cromógeno
adecuado, se origina un producto insoluble que precipita formando bandas en las zonas de proteínas antigénicas.
4.1 PROCEDIMIENTO
4.1.1. ETAPA I:
Separación de las proteínas del antígeno por electroforesis en gel de poliacrilamida conteniendo dodecil
sulfato de sodio (SDS-PAGE).
La separación de las proteínas, componentes antigénicos por SDS-PAGE es realizada siguiendo la
metodología descrita por Tsang et al. (1983-1986), empleando un sistema discontinuo en el gel de separación y en el gel de empaquetamiento. Un sistema vertical (Mini-Protean II electroforesis Cel, BIORAD) resulta apropiado para realizar la separación de las proteínas. (Foto 5).
4.1.1.1 Antígeno
El antígeno total del líquido hidatídico de ovino (ATLH-O), liofilizado, es suspendido en un buffer
Tris/HCl 0,05 M; pH 8,0 (Anexo II, 3.1) en concentración de 50 mg/mL y centrifugado a 3500 rpm por 30
minutos.
El sobrenadante es conservado entre -40°C y-70°C hasta el momento de su uso.
4.1.1.2 Tratamiento del antígeno
El ATLH-O es diluido volumen a volumen, con una solución de tratamiento de muestra (Anexo II, 3.2). El
antígeno es entonces sometido en Baño María a 100°C por 5 minutos. Luego se adiciona un colorante
marcador de corrida (Anexo II, 3.3) a razón de 1 μL por cada 30 μL de muestra (Laemmli, 1970).
4.1.1.3 Preparación del gel de separación o de corrida para el modelo MiniProtean II, BIO-RAD.
- Usar 2 placas de vidrio de 73 mm de alto x 102 mm de ancho x 1 mm de espesor y 2 espaciadores
de plástico de 0,75 mm de espesor.
- Limpiar las placas de vidrio con alcohol y secarlas.
- Montar las placas, empleando los espaciadores untados con una capa fina de vaselina neutra para
unir las placas.
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-
Preparar el gel en la concentración de 15% según la formula del Anexo II, 3.10
Encajar las placas en un soporte.
Con auxilio de una jeringa colocar el gel en el espacio de las placas montadas hasta 65 mm de
altura e inmediatamente completar con agua destilada.
Dejar polimerizar a temperatura ambiente por 30 minutos.
4.1.1.4 Aplicación del gel de empaquetamiento
- Eliminar el agua destilada de la parte superior del gel, con ayuda de una jeringa.
- Secar con papel filtro la superficie del gel de separación.
- Preparar el gel de empaquetamiento como se indica (Anexo II, 3.10).
- Colocar el gel de empaquetamiento preparado sobre el gel de separación e inmediatamente insertar
un peine preparativo de 0,75 mm de espesor, dejando un espacio entre el fondo del peine y el gel de
separación. (Foto 6).
- Dejar polimerizar a temperatura ambiente por 30 minutos.
4.1.1.5 Preparación de la electroforesis
- Retirar el peine y lavar las cavidades que deja con Buffer Tris-Glicina-SDS o de corrida (Anexo II,
3.9).
- Aplicar en la cavidad del gel de empaquetamiento 40 μL de suspensión de antígeno en una
concentración 4 μg/μL de proteínas.
- En las cavidades del extremo derecho de este gel, colocar 5 μL de proteínas de peso molecular
patrón y 3 uL de peso molecular patrón preteñido.
- Adicionar aproximadamente 200 mL buffer de corrida en el recipiente superior y 300 mL del
mismo buffer en el recipiente inferior de la cubeta, para iniciar la corrida electroforética. (Foto 7).
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4.1.1.6 Corrida electroforética
- Conectar los terminales eléctricos en la fuente de poder. La electroforesis se efectúa a 15 mA por
gel.
- Prestar atención al colorante marcador de corrida.
- Cuando los complejos SDS-proteínas entran uniformemente en el gel de separación o de corrida, la
corriente es aumentada a 30 mA por gel.
- Desconectar el sistema cuando el colorante marcador de corrida alcanza la base del gel de
separación.
4.1.2 ETAPA II:
Transferencia de proteínas del gel de poliacrilamida a la membrana de nitrocelulosa.
Las proteínas son transferidas electroforéticamente del gel para la membrana de nitrocelulosa con poros de
0,22 μm, empleando un recipiente de electroforesis. (Foto 9).
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4.1.2.1 Preparación de la transferencia
-
-
-
En un recipiente conteniendo buffer de transferencia (Anexo II, 4.1) se coloca, el gel sobre una
membrana de nitrocelulosa. Estos a su vez, se colocan entre dos hojas de papel filtro embebidas en
el mismo buffer.
El conjunto de gel, nitrocelulosa y papel de filtro se coloca entre dos esponjas de 3 mm de espesor
y a su vez todo este conjunto queda empacado en una pieza plástica con perforaciones en ambos lados.
Enseguida, este conjunto, se encaja en una cámara de transferencia, con el gel colocado hacia el
cátodo y la membrana de nitrocelulosa hacia el ánodo.
4.1.2.2 Electrotransferencia
-
La electrotransferencia se efectúa a una corriente, variando de 1,5 amperios a 10°C al inicio hasta
2,05 amperios a 35°C al final del proceso, manteniendo el voltaje constante de 55 voltios por una
hora. (Foto 10).
-
Finalizada la electrotransferencia, retirar la membrana de nitrocelulosa y lavar 5 veces por 5
minutos cada una, con buffer fosfato salino (PBS) 0,01M pH 7,2 (Anexo II, 4.2) conteniendo 0,3%
de tween 20 (PBS-T) (Anexo II, 5.3) y 1 vez más con PBS sin tween.
Cortar la tira de nitrocelulosa que contiene los patrones de peso molecular y colorear con solución
al 1% de tinta China.
A continuación cortar la membrana de nitrocelulosa conteniendo las proteínas del antígeno, en tiras
de 3 mm de ancho y guardar a -20°C entre hojas de papel filtro humedecidos en PBS hasta el
momento de su uso.
-
4.1.3 ETAPA III: Reacción inmunoenzimática
-
Emplear placas de plástico divididas en compartimentos.
Colocar tiras de nitrocelulosa conteniendo el antígeno hidatídico en los compartimentos de las
placas. (Foto 11).
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-
Incubar las tiras con PBS-T conteniendo 5% de leche descremada (PBS-TL) (Anexo) por 30
minutos a temperatura ambiente y agitando.
Descartar el PBS-TL y colocar los sueros problemas diluidos a 1:100 en PBS-TL e incubar por 1
hora.
Lavar las tiras 5 veces por 5 minutos cada una, con PBS-T.
Adicionar una solución de anti-IgG humano marcado con peroxidasa diluido a 1:1000 en PBS-TL e
incubar por 1 hora.
Lavar las tiras 5 veces por 5 minutos cada una con PBS-T y 1 vez más con PBS sólo.
Revelar la reacción adicionando una solución conteniendo 5 mg de Diamino bencidina (DAB)
10μL de H2O2 (30%) por cada 10 mL de PBS.
Luego de visualizar las bandas, lavar las tiras varias veces con agua deionizada.
Dejar secar las tiras a temperatura ambiente en la oscuridad.
4.2 Lectura e interpretación de resultados
Consiste en visualizar en las tiras de nitrocelulosa, la presencia o ausencia de bandas de precipitación. En
caso de presencia de bandas anotar sus respectivas masas relalivas (Mr) expresados en unidades de
kilodaltons (kDa). (Foto 12).
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4.3 Informe de resultados
El criterio de positividad para el diagnóstico de la hidatidosis humana, empleando antígeno hidatídico
preparado en el INS, está condicionado al reconocimiento de uno o más péptidos antigénicos de Mr entre
21 y 31 kDa por anticuerpos presentes en el suero del paciente.
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CAPITULO V
OBTENCION DE LA MUESTRA DE
SUERO SANGUINEO
El suero sanguíneo es el material que se solicita para el examen serológico de la hidatidosis humana, la cual se
obtiene de sangre venosa siguiendo el procedimiento que a continuación se indica.
1.
Colocar sobre la mesa de trabajo todo el material que se necesita para obtener la muestra (Anexo III).
2.
Si el paciente se encuentra en el laboratorio, haga que se siente de manera que el brazo quede colocado,
paralelamente, a la mesa de trabajo donde se hará la extracción de sangre. Ponga el brazo del paciente sobre
la mesa de trabajo apoyándolo en un pequeño cojín bajo el codo, con la palma de la mano vuelta hacia
arriba.
3.
Si el paciente se encuentra en cama extienda el brazo del paciente en una posición descansada.
4.
El sitio más adecuado para la extracción de sangre es la vena que se encuentra en el pliegue anterior del
codo, en el punto donde es más gruesa y visible.
5.
Coloque la ligadura alrededor del brazo y sujete firmemente los extremos.
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6.
Con la mano izquierda, tire del extremo de la ligadura cruzándola y a continuación introduzca este extremo
por debajo de la parte principal de la ligadura. De acuerdo a la Figura, la ligadura se deberá ajustar sólo lo
suficiente para aminorar la corriente sanguínea y dilatar las venas, sin apretarlo tanto que reduzca el paso de
sangre por las arterias.
7.
Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la dilatación de las venas.
8.
Con el dedo índice de la mano izquierda palpe la vena en que introducirá la aguja.
9.
Desinfectar la zona de la piel donde se realizará la punción con un pedazo de algodón embebido en alcohol
yodado.
10. Usando guantes, tomar la jeringa con la mano derecha, colocando la yema del dedo índice sobre la base de
la aguja.
11. Colocar la aguja sobre la vena con el bisel hacia arriba; introduzca la aguja en el centro de la vena, sin
titubeos, 1-1,5 cm aproximadamente.
12. Con la mano izquierda tire hacia atrás el émbolo de la jeringa. muy lentamente. Deberá entrar la sangre en la
jeringa, hasta completar 5 mL; si no entra la sangre inténtelo nuevamente.
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13. Retirar la ligadura tirando del extremo doblado.
14. Aplicar un pedazo de algodón seco sobre la zona por donde se punzó la piel. Saque la aguja con un
movimiento rápido.
15. Pedir al paciente que presione, firmemente, el algodón durante tres minutos, con el brazo extendido.
16. Luego de extraída la sangre por punción venosa, retire la aguja de la jeringa y colóquela en un depósito de
metal (para autoclavar y eliminar); vierta, lentamente, la sangre en un tubo de prueba sin anticoagulante y
tápelo. Deje reposar el tubo con la sangre en posición vertical, en una gradilla, por un lapso de 30 minutos a
2 horas, centrifugar la sangre de 2000 a 2500 rpm durante 5 minutos. Si no dispone de centrífuga, la sangre
se puede dejar varias horas en la refrigeradora; el suero se separará del coágulo.
17. Destapar el tubo y aspirar el suero con una pipeta de Pasteur.
18. Depositar el suero en un tubo limpio y seco, así estará listo para realizar la prueba.
19. Si se remitiese la muestra a otro laboratorio, coloque el suero en viales de plástico con tapa o en frasco de
Weathon o de tipo penicilina, estéril, de 5 mL de capacidad, colocando inmediatamente la tapa y sellando
con papel parafinado o cera.
20. Rotular y codificar el frasco de inmediato.
27
CAPITULO VI
CONSERVACION Y ENVIO DE
MUESTRAS DE SUERO
Las muestras contenidas en viales o frasquitos pueden conservarse en refrigeración (4°C) por período de tiempo
cortos (hasta 1 día) y deben congelarse (freezer a 0°C) si se requiere conservarlas por mayor tiempo y si se
cuenta con el equipo necesario a -20°C.
Cuando las muestra no pueden ser procesadas en el mismo laboratorio o cuando se desea una confirmación del
diagnóstico, éstas deben ser enviadas a otro laboratorio.
Para efectuar el envío de las muestras de suero se deben seguir los siguientes pasos:
-
Colocar los frasquitos con las muestras de suero, rotulados apropiadamente, en una bolsa plástica y luego
acondicionarlas en un contenedor secundario (recipiente de plástico) rodeado de hielo seco o cubos de hielo.
El recipiente secundario debe ser colocado en una caja de tecnopor u otro material que conserve
temperaturas bajas.
Se debe adjuntar la ficha epidemiológica envuelta en una bolsa plástica o mica, cuidando que no se moje el
papel.
Cerrar y sellar herméticamente la caja térmica.
Rotular la caja térmica con los siguientes datos en caso de ser enviado al Laboratorio de Referencia
Nacional:
URGENTE
LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL
Jr. Cápac Yupanqui 1400 – Jesús María – Lima
Teléfono: 471-9920; Fax: 471-2529
contiene MATERIAL BIOLOGICO PERECIBLE
28
29
CAPITULO VII
BIOSEGURIDAD
Es un conjunto de medidas preventivas destinados a proteger la salud y la seguridad del personal, durante su
trabajo, en los laboratorios donde se manipulan productos biológicos.
El suero sanguíneo, y en ocasiones líquido cefalorraquídeo, son los productos biológicos principales que se
procesan en las pruebas de diagnóstico inmunológico de la Hidatidosis humana.
Los laboratorios donde se realizan las pruebas, deben ser de nivel de bioseguridad 2, esto implica las siguientes
medidas:
1. DEL PERSONAL DE LABORATORIO
-
Toda persona que manipula sangre o sus derivados, debe estar vacunada contra el virus de la Hepatitis
B.
Al momento de extraer la sangre debe vestir mandil, amarrarse el cabello largo o usar gorro y evitar
tener brazaletes y collares.
Usar guantes, jeringas y agujas descartables o vacutainers. Nunca utilizar sólo la aguja para la
extracción de sangre, evitar pipetear fluidos.
1.1 Manipulación y eliminación de sangre y sus productos
-
-
-
La extracción, centrifugación y separación de suero, deben hacerse usando guantes descartables.
Las agujas usadas, no deben devolverse al capuchón de plástico, sino colocarlas en lejía para luego
cremarlas juntamente con las jeringas usadas. Estas deben colocarse en un recipiente metálico o
recipiente que resista la esterilización en autoclave, antes de eliminarlas.
El operador es el responsable de desinfectar el área de trabajo antes y después de cada sesión de trabajo
con fenol al 5%, cresol al 3% u otro desinfectante, dejándolos actuar durante 30 minutos. Durante este
proceso no comer.
El coágulo y suero innecesarios, deben eliminarse a un recipiente con desinfectante, lejía por ejemplo.
Los tubos de prueba, pipetas y láminas de microscopio pueden decontaminarse sumergiéndolas en
mezcla sulfocrómica o lejía antes de lavarlas.
2. DEL AMBIENTE DE LABORATORIO
-
Las paredes y pisos deben ser lisos, de preferencia paredes enchapadas con mayólica y pisos de
marmolina o cemento, que facilitan la limpieza con soluciones desinfectantes.
Los pisos deben limpiarse todos los días con soluciones desinfectantes (pinosan, cresol, entre otros). No
se debe barrer en seco ni encerar.
Al sistema de desagüe, sólo se debe eliminar los agentes biológicos o químicos, previamente
descontaminados, neutralizados o inactivados.
El ambiente debe ser amplio, con suficiente iluminación, adecuadamente ventilación y que los servicios
de agua, luz y gas funcionen satisfactoriamente.
Las mesas de trabajo deben estar confeccionadas de material sólido, con superficies lisas, impermeables
y resistentes a las sustancias corrosivas y de fácil limpieza.
3. ACCIDENTES
3.1 Inoculación accidental, cortes o abrasiones, quemaduras pequeñas
La persona accidentada debe lavarse las zonas afectadas y concurrir al servicio médico más cercano para
el tratamiento adecuado del problema.
3.2 Ingestión de material posiblemente peligroso
30
La persona acudirá inmediatamente al servicio médico más cercano para el tratamíento adecuado.
3.3 Contacto con material sospechoso de poder contener virus de la hepatitis B o virus de la
inmunodeficiencia humana, dengue, fiebre amarilla, influenza etc.
-
Se debe lavar la zona afectada con agua y jabón, favoreciendo el sangrado de la lesión, si es necesario,
se cubre la herida con un apósito.
Se concurrirá al servicio médico más cercano para determinar la gravedad y la posible contaminación
con sangre.
Se informará del accidente a las autoridades competentes.
Se tomará una muestra inicial de sangre del trabajador que será examinada serológicamente para
Hepatitis B, VIH, dengue y fiebre amarilla entre otros.
Se debe examinar, de la misma manera, una muestra del material con que se contaminó el personal.
Si la serología de VIH del trabajador es negativa, este examen debe repetirse mensualmente hasta el
sexto mes. La continuidad de la serología negativa indica que el trabajador no se ha contaminado.
31
CAPITULO VIII
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1.
CENTRO PANAMERICANO DE ZOONOSIS. 1979. Prueba de doble difusión arco 5 para el diagnóstico
de la hidatidosis humana. (Nota Técnica N°22). Buenos Aires, Ramos Mejía.
2.
COLTORTI E. & VARELA-DIAZ V. 1978. Inmunología e inmunodiagnóstico de la hidatidosis humana.
Med. Argent. 1a. Serie. (6):135-147.
3.
GOMES DE MORAES RUY. 1971. Parasitología Médica. Rio de Janeiro, Atheneu. 219 p.
4.
KAGAN I. 1968. A review of serological tests for the diagnosis of hydatid disease. Bull. WHO 39: 25-37.
5.
LAEMMLI U. 1970. Cleavage of estructural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.
Nature 227: 680- 685.
6.
MADDISON S., SLEMENDA S., SCHANTZ P., FRIED J., WILSON M. & TSANG V. 1989. A specific
diagnostic antigen of Echinococcus granulosus with an apparent molecular weight of 8 kDa. Am. J. Trop.
Med. Hyg. 40 (4): 377-383.
7.
NAQUIRA, C.; BULLON, F; BALVIN, G.; REYES, N. & SANCHEZ, E. 1989. Epidemiología de la
hidatidosis en el Perú. En: Anales del seminario nacional de zoonosis y enfermedades de alimentación
alimentaria, Ministerio de Salud. 122-134.
8.
NOBLE, E. & NOBLE, G. 1965. Parasitología: Biología de los Parásitos animales. 2ed. Mexico:
Interamericana. 258-262.
9.
ORGANIZACION PANAMERICANA DE LA SALUD. 1986. Zoonosis y enfermedades transmisibles
comunes al hombre y a los animales. Washington, OPS. (Publicación Científica 503).
10. PEREZ FONTANA V. 1944. Tratado de la hidatidosis. En: Arch. Inter. Hidatid. Vol 1, Fasc. 1. Imprenta
Nacionales, Uruguay. 174 p.
11. PLANCHART S., BOTTO C., ALARCON DE NOYA B., BONIFACINO R., VIVAS L., SPENCER L. &
VIVAS S. 1994. Evaluation of the double diffusion, enzyme immunoassay and inmunoblotting techniques,
for the diagnosis of human hydatid disease in tropical areas. Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 36 (3):205210.
12. SANCHEZ E. 1995. Determinacao de antigenos relevantes da forma larvar do Echinococcus granulosus:
Padronizacao e aplicafao do “Immunoblot” no diagnostico da hidatidose humana. Instituto Oswaldo CruzFIOCRUZ. Rio de Janeiro. Tese de Mestría.
13. SHAMBESH M., GRAING P., GUSBI A., ECHTUISH E. & WEN H. 1995. Immunoblot evaluation of the
100 and 130 kDa antigens in camel hydatid cyst fluid for the serodignosis of human cyst echinococosis in
Libya. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 89: 276-279.
14. TSANG V., HANCOCK K., WILSON, M., PALMER, D., WHALEY S., McDOUGAL J. & KENNEDY S.
1986. Enzyme-linked inmunoelectrotransfer blot tecnique (western blot) for human T-Iymphotropic virus
type III/lymphadenopathy- associated virus (HTLV-III/LAV) antibodies. Immunology series No.15
procedual guide. 1-25.
15. TSANG V., PERALTA M & SIMONS R. 1983. Enzyme-linked inmunoelectrotransfer blot tecniques
(EITB) for studying the specificities of antigens and antibodies separated by gel electrophoresis. Met.
Enzymol. 92: 377-391.
32
16. VARELA-DIAZ V. & COLTORTI E. 1974. Técnicas para el diagnóstico inmunológico de la hidatidosis
humana. Centro Panamericano de Zoonosis, OPS/OMS (Monog. Cient. Tec. 7), Ramos Mejia, Provincia de
Bs. As., Argentina.
17. VARELA-DIAZ, V., GUARNERA E. & COLTORTI E. 1986. Ventajas y limitaciones de los métodos
inmunológicos y de detección por imágenes para el diagnóstico de la hidatidosis. Bol. Of. Sanit. Panam.
100(4): 369-383.
18. VARELA-DIAZ, V., GUISANTES J., RICARDES, M., YARZABAL L. & COLTORTI E. 1975.
Evaluation of whole and purified hydatid fIuid antigens in the diagnosis of human hydatidosis by the
immunoelectrophoresis test. Am. J. Trop. Med. Hyg. 24: 304-311.
33
CAPITULO IX
ANEXOS
34
ANEXO I
MATERIALES, EQUIPOS, REACTIVOS Y
SOLUCIONES PARA DD5
1. MATERIALES Y EQUIPOS
-
Láminas portaobjeto
Tubos de ensayo de 16 x 125 mm, tapa rosca
Pipetas Pasteur
Pipeta de 5 mL
Placas petri 100 x 15 mm.
Tubos de vidrio en “U” por 5 mm de diámetro
Beaker de 1 L.
Frasco Coplin
Frasco de vidrio de boca ancha con tapa de 100 x 80 mm aproximadamente
Lápiz con punta de diamante
Papel filtro (Whatman N° 1)
Pizeta de 500 mL
Guantes de látex
Bulbo para pipetas
Sacabocados para corte de 1, 6 y 10 mm de diámetro
Diagrama para corte (DD5)
Reloj de laboratorio
Refrigeradora
Estufa
Balanza
Potenciómetro
2. REACTIVOS Y SOLUCIONES
-
-
Antígeno Hidatídico
Suero problema
Suero control positivo a antígeno del Arco 5
Agar Noble (Difco)
Alcohol Etílico 95°
Merthiolate en polvo
Cloruro de Sodio
Fosfato dibásico de potasio
Fosfato monobásico de potasio
Colorante amido Schwarz (negro amido)
Acido acético glacial
Agua destilada
Lejía
3. PREPARACION DE ANTIGENO HIDATIDICO
El antígeno del arco 5 se encuentra en el líquido hidatídico.
3.1 Obtención del líquido Hidatídico:
El líquido extraído asépticamente (con jeringa) de quistes hidatídicos de animales, se deja decantar en
probeta para permitir la sedimentación de arenilla hidatídica y posibles restos de membranas que hayan
sido arrastrados en la aspiración. Una vez sedimentados los elementos más gruesos, el sobrenadante se
transfiere a frascos para centrifugar a 2500 rpm durante 30 minutos. El líquido sobrenadante se congela
35
inmediatamente.
3.2. Diálisis y Liofilización:
El líquido hidatídico descongelado, se transfiere a una bolsa de diálisis y se dializa a 4°C contra un
volumen 25 veces mayor de agua destilada. Conviene dializar no menos de un litro de líquido
hidatídico proveniente de varios quistes. El agua contra la cual se dializa dicho líquido se cambia cuatro
veces, a intervalos de 24 horas. En consecuencia, la diálisis completa requiere cuatro días, y la relación
entre el volumen de agua empleada y el volumen de líquido hidatídico dializado es de 100 a 1.
Después de dializado, el líquido hidatídico presenta un aspecto opalescente debido a la precipitación de
ciertas fracciones proteínicas. El contenido total de la bolsa de diálisis (incluido el precipitado) se
trasvasa a frascos de tamaño adecuado para su liofilización (ejemplo frascos tipo penicilina). Es
conveniente llenar los frascos solamente hasta un cuarto de su capacidad, para facilitar la congelación
del líquido sobre las paredes lo que se consigue realizando la congelación mediante rotación del frasco
en un baño de mezcla refrigerante (hielo seco- alcohol) o manteniéndolos a -80°C. Después de
congelado el líquido hidatídico, se procede a su liofilización, tomando las precauciones necesarias para
que durante este proceso la temperatura externa no exceda de los 20°C.
El líquido hidatídico liofilizado que contiene el antígeno del arco 5, deberá guardarse en frascos
perfectamente cerrados en un lugar seco y fresco hasta el momento de su empleo.
3.3 Control de Calidad del Antígeno Producido
El antígeno del líquido hidatídico obtenido según el procedimiento que se ha indicado, se controla
mediante la prueba de inmunoelectroforesis para buscar la presencia del Arco 5; para ello, se comparan
el antígeno producido y uno de referencia, frente a un suero positivo.
El antígeno producido se considera satisfactorio cuando se verifica la formación de la banda del arco 5
y de no menos de otras cinco bandas. La banda de precipitación correspondiente al arco 5 debe ser bien
definida y su morfología y ubicación debe estar una imagen en espejo de la morfología y ubicación del
arco 5, resultante de la interacción del suero y antígeno de referencia. (Foto 13).
4. PREPARACION DE SOLUCIONES PARA DD5
4.1 Solución Salina Tamponada (Sst) 0,1M - pH 7,4
Solución Fisiológica (NaCl 0,85 gr%) ................................................ 900 mL
Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4) 0,1 M .................................... 100 mL
Ajustar pH 7,4 con solución KH2PO4 0,1 M.
4.2 Preparación de Solución Antigénica
Pesar 50 μg de antígeno hidatídico liofilizado y disolver en 1 mL de SST 0,1 M, pH 7,4. Esta solución
puede ser conservada en congelación a -20°C o a 4°C hasta 10 días.
36
4.3 Preparación del Agar Noble
Pesar 1,2 gr. de Agar Noble (Difco o similar) y disolver en 100 mL de SST 0,1 M, pH 7,4 adicionada
de un conservador (10 mg de merthiolate).
4.4 Solución Colorante
Amido Schwarz (Negro Amido) ................................................ 0,1 g
Acido acético glacial ................................................................ 20,0 mL
Agua destilada c.s.p. ............................................................. 1000,0 mL
Conservar a temperatura ambiente en frasco color caramelo perfectamente cerrado.
4.5 Solución Decolorante
Alcohol etílico de 95° ............................................................ 400,0 mL
Acido acético glacial .............................................................. 100,0 mL
Agua destilada c.s.p .............................................................. 1000,0 mL
Conservar a temperatura ambiente en frasco perfectamente cerrado.
DIAGRAMA PARA EL CORTE DEL AGAR
EN LA PRUEBA DE DOBLE DIFUSION ARCO 5
37
38
ANEXO II
MATERIALES, EQUIPOS, REACTIVOS Y
SOLUCIONES PARA INMUNOBLOT
1. MATERIALES Y EQUIPOS
-
2 placas de vidrio de 73 mm de alto x 102 mm de ancho x 1 mm de espesor.
2 espaciadores de plástico de 0,75 rnm de espesor.
Jeringas de 5 mL.
Peines separadores de especímenes.
Nitrocelulosa con poros de 0,22 μm.
Esponjas de 3 mm de espesor.
Papel filtro (Blotting paper).
Placas de plástico divididas en compartimentos (Mini-Incubation Trays).
Un sistema vertical Tipo Mini-Protean II electrophoretic cell, BIO-RAD.
Mini-Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cells Tipo “BIO-RAD”-USA.
2. REACTIVOS Y SOLUClONES
-
Antígeno de líquido hidatídico de ovino (ATLH-O) liofilizado.
Suero problema.
Sueros control positivo.
Sueros control negativo.
Anti- IgG humano marcado con peroxidasa.
Tris o Trizma base.
2-mercaptoetanol.
Azul de bromofenol.
Peso molecular estándar.
Acrilamida.
Bis-acrilamida.
Temed.
Dodecil sulfato de sodio (SDS).
Metanol.
Alcohol etílico.
Diamino-bencidina (DAB).
Peróxido de hidrógeno (30%).
Fosfato de sodio dibásico.
Fosfato de sodio monobásico.
Tween 20.
Leche descremada.
Coomassie blue R-250.
Solución decolorante.
3. PREPARACION BUFFER Y SOLUCIONES PARA SDS-PAGE
3.1 Buffer Tris/HCl 0,05M, pH 8,0
Tris .................................................................................................. 0,6 g
NaCl ................................................................................................ 0,6 g
Agua destilada q.s.p .................................................................... 100,0 mL
Ajustar pH 8,0 con HCl concentrado.
39
3.2 Solución de tratamiento de muestra
Tris/HCl 0,5 M pH 6,80 .................................................................... 95 mL
2 mercapto-etanol ........................................................................... 0,05 g
SDS .................................................................................................. 0,02 g
3.3 Solución colorante marcador de corrida
Azul de bromofenol ....................................................................... 0,05 g
Glicerol .......................................................................................... 8,00 mL
Tris/HCl 0,5 M pH 8,0 ................................................................... 1,00 mL
Agua deionizada .............................................................................. 1,00 mL
Diluir la muestra 1:2 en el tampón de tratamiento, hervir por 10 minutos. Adicionar solución marcador
de corrida 3 μL por cada 100 μL de la muestra.
3.4 Solución stock de poliacrilamida
Acrilamida ...................................................................................... 14,6 g
N N’ bis-acrilamida .......................................................................... 0,4 g
Agua deionizada q.s.p ..................................................................... 50,0 mL
Pesar en tubo de plástico, disolverlos en agua caliente, esperar hasta que se enfríe y completar el
volumen. Conservar a 4ºC.
3.5 Buffer de gel de empaquetamiento 0,5 M, pH 6,8
Tris 0,5 M ............................................................................................ 6,0 g
3.6 Buffer de gel de separación o de corrida 1,5 M, pH 8
Tris 1,5 M .......................................................................................... 18,15 g
3.7 Solución de persulfato de amonio (APS) a 10%
Persulfato de amonio ........................................................................ 10,0 g
Alícuotar y conservar a -20ºC.
3.8 Solución de Dodecil sulfato de sodio (SDS) a 10%
SDS (95%) ........................................................................................ 10,0 g
Conservar a 40ºC o a temperatura ambiente.
3.9 Buffer de corrida (superior/inferior) Tris 0,05M
Tris ó Trizma base ............................................................................... 30,0 g
Glicina 0,192 M .................................................................................. 14,4 g
SDS a 10% ........................................................................................... 10,0 mL
Agua deionizada ............................................................................... 1000,0 mL
3.10 Fórmula de concentración de gel de empaquetamiento y de separación o de corrida al 12% y 15%
40
4. PREPARACION DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA LA TRANSFERENCIA
4.1 Buffer de transferencia Tris 0,5 M
Tris ó Trizma base ............................................................................... 102,8 g
Metanol ................................................................................................ 400,0 mL
Agua deionizada ................................................................................ 2000,0 mL
Ajustar pH 9,18 con HCl concentrado
4.2 Buffer fosfato salino 0,01 M, pH 7.2 (PBS)
Preparar 2 soluciones como sigue:
A. NaH2PO4.H2O (fosfato monobásico de sodio) ............................... 1,37 g
NaCl ................................................................................................... 8,76 g
Agua deionizada q.s.p ................................................................. 1000,00 mL
B. Na2PO4.7H2O .................................................................................. 2,68 g
NaCl ................................................................................................... 8,76 g
Agua deionizada .......................................................................... 1000,00 mL
Mezclar las soluciones A y B (aproximadamente 5 partes de A para 6 partes de B). Ajustar el pH 7,2.
5. PREPARACION DE SOLUCIONES PARA REACCION INMUNOENZIMATICA
5.1 Conjugado anti-IgG humano diluido a 1:1000 en PBS-TL
5.2 Sueros controles negativo, positivo y suero problema diluidos a 1:100 en PBS-TL
5.3 PBS-T
PBS 0.01 M Ph 7,2 ............................................................................... 100,0 mL
Tween ......................................................................................................... 3,0 mL
5.4 PBS-TL
PBS ........................................................................................................ 100,0 mL
Leche descremada ...................................................................................... 5,0 g
41
5.5 Solución reveladora
3,3’ diaminobenzidina tetracloridrato ...................................................... 5,0 mg
PBS 0,01 M pH 7,2 .................................................................................. 10,0 mL
H2O2 (30 volúmenes) ................................................................................ 10,0 μL
42
ANEXO III
MATERIALES PARA OBTENCION DE
MUESTRA DE SANGRE VENOSA
Según el procedimiento que emplee:
¾
¾
-
Tubos vacutainer estériles.
Jeringa descartable de 5 mL.
Agujas descartables 20 x 1G.
Ligaduras de 2,5 mm de diámetro.
Algodón.
Alcohol yodado.
Depósito de metal (tarros) para descartar las agujas.
Frasco de vidrio de boca ancha (para colocar jeringas en solución de lejía).
Lejía al 3-5%.
Gradillas.
Mascarillas (opcional).
Guantes.
Cuaderno de registro.
43
CAPITULO X
GLOSARIO
Antígeno: Sustancia extraña al organismo que induce la respuesta del sistema inmune.
Anticuerpo: Proteínas (inmunoglobulinas) producidas por el organismo, en respuesta al ingreso de una
sustancia extraña (antígeno).
Dilución: Mezcla de una sustancia con una o más partes de otra (diluyente) que no altere las características de
la primera y que reduzca su concentración..
Enfermedad: Proceso mórbido con síntomas definidos que afecta a todo el organismo o parte del mismo.
Enzima: Proteína que actúa como catalizador orgánico sobre un substrato específico.
Embrión hexacanto: Embrión de tenia con seis ganchos (oncósfera).
Estróbilo: Toda la cadena de proglótides de la tenia.
Escólex: Cabeza de una tenia; puede adherirse a la pared intestinal mediante ventosas o ganchos.
Helminto: Gusano que puede ser nemátodo, céstodo o tremátodo.
Hospedero: Organismo en el cual vive un parásito.
Hospedero intermediario: Ser que se requiere en el ciclo vital, en el cual debe verificarse el desarrollo larval
esencial antes de que un parásito infecte a su hospedero definitivo o a hospederos intermediarios adicionales.
Infección: Penetración y multiplicación de un microorganismo en un hospedero, independientemente de la
presentación de síntomas y/o patología.
Inmunoglobulinas: Proteína con actividad de anticuerpo específica, responsable de la inmunidad humoral; hay
cinco clases distintas IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.
Proglótide: Segmento de la tenia que contiene los sistemas reproductores masculino y femenino; pueden ser
inmaduros, maduros y grávidos.
Quiste hidatídico: Estado larval de la tenia del género Echinococcus; consiste en una vesícula grande que
posee 1) una membrana germinal interna desde la cual los escolises y los quiste hijos se desarrollan avanzan
para proyectarse en la vesícula, 2) una membrana circular y 3) una membrana adventicia.
Quiste multilocular: Quistes que contienen muchas vesículas.
Quiste unilocular: Quiste que contiene sólo una vesícula.
Título serológico: La cantidad de suero necesaria para producir una reacción biológica con otra sustancia,
medida generalmente como la máxima dilución del suero testigo que aún mantiene dicha reactividad.
Zoonosis: Enfermedad de animales transmisible a los seres humanos.
Esta publicación se terminó de imprimir
en Diciembre de 1997 en los
Talleres Gráficos de Art. Lautrec S.R.Ltda.
Av. Paseo de la República 731 - Lima 13
Tel/Fax: 423-7616
44

Manual - BVS-INS - Instituto Nacional de Salud

Transcripción

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