estudio electroforético de la proteinuria en perros sanos y en perros

Transcripción

FACULTAD DE VETERINARIA
UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA
ESTUDIO ELECTROFORÉTICO DE LA
PROTEINURIA EN PERROS SANOS Y EN PERROS
CON ENFERMEDAD RENAL
Memoria presentada por la Licenciada en Veterinaria
Concepción Zaragoza Bayle
para optar al grado de Doctora en Veterinaria
Cáceres, 2001
Da. María Cinta Mañé Seró y D. Rafael Barrera Chacón, Profesores Titulares
del Departamento de Medicina y Sanidad Animal, y D. Francisco Centeno Velázquez,
Profesor Titular del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Genética de
la Universidad de Extremadura, en calidad de Directores del presente trabajo de Tesis
Doctoral, tienen el honor de informar que:
Da. Concepción Zaragoza Bayle viene trabajando desde 1996 en el tema
“Estudio electroforético de la proteinuria en perros sanos y en perros con enfermedad
renal” bajo nuestra dirección.
Que una vez concluido el trabajo y tras el oportuno análisis, reúne la calidad
suficiente para ser presentado ante el correspondiente tribunal con objeto de ser
juzgado.
Lo que firman y rubrican en Cáceres el 30 de Mayo de 2001
Fdo. Ma Cinta Mañé Seró
Fdo. Rafael Barrera Chacón
Fdo. Francisco Centeno Velázquez
Este trabajo de investigación ha sido financiado por la Junta de Extremadura –
Consejería de Educación y Juventud – y el Fondo Social Europeo, a través del I Plan Regional
de Investigación y Desarrollo Tecnológico de Extremadura (O. de 15 de Julio de 1998, D.O.E.
de 25 de Julio).
A mis padres
A Jose Antonio
AGRADECIMIENTOS
- Quiero expresar mi más sincero agradecimiento a mis directores por confiar
en mí para la realización de esta Tesis Doctoral, y por su apoyo y buenos consejos.
Además, y concretamente, quiero agradecer a Da. María Cinta Mañé Seró y D. Rafael
Barrera Chacón el enseñarme todo lo que sé en el campo de la docencia y la clínica. De
igual modo, quiero agradecer a D. Francisco Centeno Velázquez el haberme
introducido en el complicado mundo de la bioquímica.
- A mi madre, Da. Concepción Bayle Bonilla, por su cariño, paciencia con mis
malos momentos y apoyo.
- A D. Joaquín Sánchez Peinado, D. Antonio Jiménez Redondo y D. Santiago
Andrés Díaz, miembros de la Unidad de Patología General y Médica, por el cariño que
siempre me han demostrado y sus ánimos.
- A D. Jose Antonio Tapia García por su ayuda incondicional en la realización
de la presente Tesis Doctoral.
- A la Unidad de Patología Quirúrgica, especialmente a Da. Eva María Pérez
Merino y Da. Beatriz Chacón López, por su ayuda y apoyo en la ejecución de este
trabajo y, sobre todo, su amistad.
- A la Unidad de Bioquímica, especialmente a Da. Ara Rangel Bermejo y
D. Alfonso Mora Corral, por ayudarme a resolver las dudas que surgieron en el
laboratorio.
- A Da. Esther Durán Flórez y Da. Marta González Huecas por su colaboración
en el estudio anatomopatológico.
- A D. Pedro Rodríguez Medina por la ayuda prestada en el análisis estadístico
de este trabajo.
- A todas las personas que me han acompañado día a día con su apoyo y ánimo
en la realización de esta Tesis Doctoral.
A todos ellos muchas gracias.
ÍNDICE
I. INTRODUCCIÓN ------------------------------------------------------------------------------------------------1
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ------------------------------------------------------------------------------6
II.1.- CONCEPTO DE PROTEINURIA --------------------------------------------------------------------------7
II.2.- FISIOLOGÍA -------------------------------------------------------------------------------------------------9
II.2.1.- Proteína urinaria en perros sanos -----------------------------------------------------------------9
II.2.2.- Proteinuria funcional------------------------------------------------------------------------------ 11
II.2.3.- Origen de la proteína normal urinaria --------------------------------------------------------- 12
II.2.3.1.- Filtración glomerular ------------------------------------------------------------------------ 12
II.2.3.2.- Secreción tubular ----------------------------------------------------------------------------- 15
II.2.3.3.- Procedente del tracto urogenital inferior------------------------------------------------- 16
II.3.- FISIOPATOLOGÍA ---------------------------------------------------------------------------------------- 16
II.3.1.- Proteinuria prerrenal ------------------------------------------------------------------------------ 16
II.3.2.- Proteinuria renal ----------------------------------------------------------------------------------- 17
II.3.2.1.- Glomerular------------------------------------------------------------------------------------- 18
II.3.2.2.- Tubular ----------------------------------------------------------------------------------------- 31
II.3.2.3.- Inflamación del parénquima renal -------------------------------------------------------- 34
II.3.3.- Proteinuria postrenal ------------------------------------------------------------------------------ 35
II.4.- DIAGNÓSTICO -------------------------------------------------------------------------------------------- 35
II.4.1.- Anamnesis------------------------------------------------------------------------------------------- 36
II.4.2.- Exploración física---------------------------------------------------------------------------------- 37
II.4.3.- Análisis laboratoriales ---------------------------------------------------------------------------- 37
II.4.3.1.- Sangre ------------------------------------------------------------------------------------------ 37
II.4.3.1.1.- Hematología ----------------------------------------------------------------------------- 38
II.4.3.1.2.- Bioquímica------------------------------------------------------------------------------- 38
II.4.3.1.3.- Serología --------------------------------------------------------------------------------- 40
II.4.3.2.- Orina -------------------------------------------------------------------------------------------- 40
II.4.3.2.1.- Análisis físico-químico---------------------------------------------------------------- 40
II.4.3.2.1.1.- Proteínas---------------------------------------------------------------------------- 40
II.4.3.2.1.2.- Densidad---------------------------------------------------------------------------- 54
II.4.3.2.1.3.- Cociente proteína/creatinina---------------------------------------------------- 55
II.4.3.2.1.4.- Otras determinaciones ----------------------------------------------------------- 62
II.4.3.2.2. - Excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo -------------------------------- 63
II.4.3.2.3. - Sedimento urinario -------------------------------------------------------------------- 64
II.4.4.- Otros métodos complementarios de diagnóstico -------------------------------------------- 66
II.5.- COMPLICACIONES -------------------------------------------------------------------------------------- 67
II.6.- PRONÓSTICO --------------------------------------------------------------------------------------------- 71
II.7.- TRATAMIENTO------------------------------------------------------------------------------------------- 73
III. MATERIALES Y MÉTODOS ----------------------------------------------------------------------------- 78
III.1.- MATERIALES -------------------------------------------------------------------------------------------- 79
III.1.1.- Material animal ----------------------------------------------------------------------------------- 79
III.1.2.- Material de extracción y conservación de las muestras ----------------------------------- 82
III.1.2.1.- Sangre entera--------------------------------------------------------------------------------- 82
III.1.2.2.- Plasma ----------------------------------------------------------------------------------------- 82
III.1.2.3.- Orina ------------------------------------------------------------------------------------------- 83
III.1.3.- Material analítico --------------------------------------------------------------------------------- 83
III.1.3.1.- Sangre entera--------------------------------------------------------------------------------- 83
III.1.3.2.- Plasma ----------------------------------------------------------------------------------------- 84
III.1.3.2.1.- Determinación de alanín-aminotransferasa, fosfatasa alcalina, urea,
creatinina, bilirrubina total, calcio, fósforo, albúmina y proteínas totales----------------- 84
III.1.3.2.2.- Determinación de colesterol--------------------------------------------------------- 85
III.1.3.2.3.- Determinación de sodio y potasio-------------------------------------------------- 85
III.1.3.3.- Orina ------------------------------------------------------------------------------------------- 86
III.1.3.3.1.- Determinación de proteínas --------------------------------------------------------- 86
III.1.3.3.2.- Determinación de creatinina y fósforo -------------------------------------------- 87
III.1.3.3.4.- Determinación de la densidad urinaria -------------------------------------------- 87
III.1.3.3.5.- Otras determinaciones analíticas de la orina ------------------------------------- 87
III.1.4.- Material para electroforesis de muestras de orina en gel de poliacrilamida----------- 88
III.1.5.- Material para Western blotting----------------------------------------------------------------- 90
III.1.5.1.- Material para la transferencia de proteínas--------------------------------------------- 90
III.1.5.2.- Material para el revelado por quimioluminiscencia ---------------------------------- 90
III.1.6.- Material para el estudio de microscopía óptica --------------------------------------------- 91
III.1.6.1.- Material para el estudio de secciones en parafina------------------------------------- 91
III.1.6.2.- Material para el estudio de secciones semifinas--------------------------------------- 92
III.1.7.- Material fotográfico------------------------------------------------------------------------------ 93
III.1.8.- Material informático ----------------------------------------------------------------------------- 93
III.1.9.- Material estadístico------------------------------------------------------------------------------- 94
III.2.- MÉTODOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 94
III.2.1.- Método general empleado en cada animal--------------------------------------------------- 94
III.2.2.- Análisis clínicos ---------------------------------------------------------------------------------- 96
III.2.2.1.- Hematología---------------------------------------------------------------------------------- 96
III.2.2.2.- Bioquímica plasmática --------------------------------------------------------------------- 97
III.2.2.2.1.- Determinación de alanín-aminotransferasa, fosfatasa alcalina, urea,
creatinina, bilirrubina total, calcio, fósforo, albúmina y proteínas totales----------------- 97
III.2.2.2.2.- Determinación de colesterol--------------------------------------------------------- 97
III.2.2.2.4.- Determinación del cociente albúmina/globulina -------------------------------- 98
III.2.2.3.- Urianálisis ------------------------------------------------------------------------------------ 98
III.2.2.3.1.- Examen físico -------------------------------------------------------------------------- 98
III.2.2.3.2.- Examen químico----------------------------------------------------------------------- 98
III.2.2.3.2.1.- Proteínas--------------------------------------------------------------------------- 98
III.2.2.3.2.2.- Creatinina y fósforo ------------------------------------------------------------- 99
III.2.2.3.2.3.- Sodio y potasio------------------------------------------------------------------100
III.2.2.3.3.- Densidad de la orina -----------------------------------------------------------------100
III.2.2.3.4.- Sedimento urinario -------------------------------------------------------------------100
III.2.2.3.5.- Determinación del cociente proteína/creatinina --------------------------------100
III.2.3.- Pruebas de funcionalidad renal ---------------------------------------------------------------100
III.2.3.1.- Excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo ------------------------------------100
III.2.4.- Electroforesis vertical en gel de poliacrilamida SDS-------------------------------------101
III.2.4.1.- Preparación de los geles de poliacrilamida--------------------------------------------101
III.2.4.2.- Preparación de las muestras --------------------------------------------------------------103
III.2.4.3.- Tinción y secado del gel de poliacrilamida -------------------------------------------104
III.2.5.- Western blotting ---------------------------------------------------------------------------------104
III.2.5.1.- Transferencia de proteínas al filtro de nitrocelulosa---------------------------------105
III.2.5.2.- Revelado y detección ----------------------------------------------------------------------106
III.2.6.- Estudio de microscopía óptica ----------------------------------------------------------------107
III.2.6.1.- Estudio de secciones en parafina--------------------------------------------------------107
III.2.6.2.- Estudio de secciones semifinas ----------------------------------------------------------107
III.2.7.- Estudio estadístico-------------------------------------------------------------------------------108
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN --------------------------------------------------------------------------110
IV.1.- OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE ELECTROFORESIS-------------------------------111
IV.1.1.- Concentración de acrilamida ------------------------------------------------------------------111
IV.1.2.- Marcador de pesos moleculares---------------------------------------------------------------112
IV.1.3.- Cantidad de proteínas (µg) de cada muestra------------------------------------------------113
IV.1.4.- Conservación y validez de las muestras tras sucesivas congelaciones ----------------115
IV.2.- OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE WESTERN BLOTTING ---------------------------116
IV.2.1.- Anticuerpos a utilizar ---------------------------------------------------------------------------116
IV.2.2.- Dilución óptima del anticuerpo primario: anti-IgA y anti-IgG -------------------------117
IV.2.3.- Dilución óptima del anticuerpo secundario-------------------------------------------------119
IV.3.- GRUPO CONTROL -------------------------------------------------------------------------------------120
IV.3.1.- Anamnesis y exploración física---------------------------------------------------------------120
IV.3.2.- Análisis de sangre -------------------------------------------------------------------------------120
IV.3.2.1.- Hematología---------------------------------------------------------------------------------120
IV.3.2.2.- Bioquímica sanguínea---------------------------------------------------------------------121
IV.3.3.- Urianálisis -----------------------------------------------------------------------------------------122
IV.3.3.1.- Examen físico-------------------------------------------------------------------------------122
IV.3.3.2.- Densidad -------------------------------------------------------------------------------------123
IV.3.3.3.- Sedimento urinario-------------------------------------------------------------------------123
IV.3.3.4.- Examen químico ---------------------------------------------------------------------------125
IV.3.3.4.1.- Proteínas -------------------------------------------------------------------------------125
IV.3.3.4.1.1.- Cociente proteína/creatinina y concentración de proteínas-------------125
IV.3.3.4.1.2.- Electroforesis y Western blotting -------------------------------------------126
IV.3.3.4.2.- Otras determinaciones---------------------------------------------------------------134
IV.3.4.- Excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo ------------------------------------------135
IV.4.- PIOMETRA ----------------------------------------------------------------------------------------------136
IV.4.2.1.- Hematología---------------------------------------------------------------------------------139
IV.4.3.- Urianálisis -----------------------------------------------------------------------------------------145
IV.4.3.1.- Examen físico-------------------------------------------------------------------------------145
IV.4.3.2.- Densidad -------------------------------------------------------------------------------------146
IV.4.3.4.1.- Proteínas -------------------------------------------------------------------------------149
IV.5.- LEPTOSPIROSIS ----------------------------------------------------------------------------------------167
IV.5.2.1.- Hematología---------------------------------------------------------------------------------170
IV.5.3.- Urianálisis -----------------------------------------------------------------------------------------175
IV.5.3.1.- Examen físico-------------------------------------------------------------------------------175
IV.5.3.2.- Densidad -------------------------------------------------------------------------------------176
IV.5.3.4.1.- Proteínas -------------------------------------------------------------------------------178
IV.6.- LEISHMANIOSIS ---------------------------------------------------------------------------------------195
IV.6.2.1.- Hematología---------------------------------------------------------------------------------200
IV.6.3.- Urianálisis -----------------------------------------------------------------------------------------207
IV.6.3.1.- Examen físico-------------------------------------------------------------------------------207
IV.6.3.2.- Densidad -------------------------------------------------------------------------------------209
IV.6.3.4.1.- Proteínas -------------------------------------------------------------------------------212
IV.6.5.- Anatomía patológica ----------------------------------------------------------------------------226
V. CONCLUSIONES --------------------------------------------------------------------------------------------233
VI. RESUMEN----------------------------------------------------------------------------------------------------236
VII. SUMMARY --------------------------------------------------------------------------------------------------240
VIII. BIBLIOGRAFÍA ------------------------------------------------------------------------------------------244
I. INTRODUCCIÓN
I. Introducción
Los primeros pasos en medicina humana para la caracterización de las
proteínas urinarias, en función de su peso molecular, se llevaron a cabo mediante el
empleo de ultracentrifugación o filtración en gel con el fin de contribuir al diagnóstico
de las enfermedades renales(87). A partir de aquí, y en medicina veterinaria, el papel que
la electroforesis desempeña en la separación e identificación de las proteínas urinarias
en el perro suscitó interés sobre todo desde la década de los sesenta. Porter(317), ya en
1964, realizó un estudio de los coloides que aparecían en la orina de perros sanos.
Desde entonces se ha intentado clarificar el papel que la determinación e identificación
de proteínas en la orina juega en el diagnóstico de la enfermedad renal en el perro(256).
En este sentido, la electroforesis se ha constituido en una técnica fundamental en cuanto
que permite la separación de las proteínas en función de su peso molecular. Con los
datos que proporciona, la proteinuria puede ser clasificada en prerrenal, renal o
postrenal con la consiguiente ayuda que ello supone en la determinación de la etiología
de la enfermedad(250). Además, en función del peso molecular de las proteínas
detectadas en la orina, se puede ayudar a localizar la lesión renal, clasificándola en
glomerular, tubular o de tipo mixto(366). Por otra parte, en la orina de perros
aparentemente sanos pueden aparecer proteínas que, por los medios convencionales de
detección, pasan inadvertidas y que mediante electroforesis pueden evidenciarse, lo que
permite el establecimiento de un diagnóstico con prontitud.
No obstante, la identificación de proteínas específicas, por electroforesis y
según su tamaño molecular, se limita a conclusiones generales sobre el origen de la
proteinuria (glomerular, tubular o ambos). La explicación para esta conclusión estriba
en que proteínas de peso molecular similar, al migrar la misma distancia, pueden
encontrarse en la misma banda(346), algunas proteínas no se visualizan tras realizar la
tinción y, por último, fragmentos de albúmina y sus polímeros pueden presentar
cualquier peso molecular. Sin embargo, el sistema SDS-PAGE junto con Western
-2-
I. Introducción
blotting, proporciona información útil desde un punto de vista clínico y
experimental(399), ya que permite identificar con exactitud las proteínas que se eliminan
por el riñón. Aunque este método es demasiado complejo para el análisis rutinario,
aporta una información inestimable sobre las distintas formas de disfunción renal(223).
Entre aquellas patologías que provocan un daño renal importante, y que
cuentan con una casuística notable en nuestra área geográfica, ocupan un lugar
destacado la piometra, la leptospirosis y la leishmaniosis, las dos últimas como
consecuencia de determinadas condiciones medioambientales.
La piometra es un desorden hormonal asociado al diestro que cursa con una
infección bacteriana en el útero, con bacteriemia de moderada a grave y toxemia, que
pueden poner en peligro la vida del animal(98, 396). Tradicionalmente, la piometra se ha
descrito en hembras de edad media (mayores de 6 años), con estimulaciones repetidas
del útero por la progesterona en el ciclo estral(289). Sin embargo, con el uso común de
estrógenos como inhibidores del celo, la piometra también puede llegar a diagnosticarse
en hembras jóvenes(129).
En esta enfermedad, el depósito de complejos inmunes en el glomérulo puede
causar una glomerulopatía reversible y moderada(220). De hecho, la enfermedad renal y
el posterior fallo de los riñones son complicaciones graves de la piometra en la
perra(370). La lesión glomerular, en este proceso, precede a la tubular siendo la sucesión
normal de acontecimientos: piometra - disfunción glomerular - lesión tubular - fallo
renal(91). En estos casos, el diagnóstico de enfermedad renal se basa en la detección de
proteinuria, lo que sugiere lesión glomerular, y en una incapacidad de concentrar orina
en animales deshidratados, lo que indica lesión tubular distal(184). En estos animales, el
-3-
I. Introducción
pronóstico de la enfermedad va a depender, en gran medida, de la rapidez en el
establecimiento del diagnóstico y en la pronta instauración del tratamiento.
La leptospirosis es una enfermedad de carácter zoonósico, producida por la
infección de serotipos, antigénicamente distintos, de Leptospira interrogans(170). Afecta
a muchas especies de animales, tanto domésticos como salvajes(361,
395)
, que actúan
como reservorios y sirven, a su vez, como fuente potencial de infección para los seres
humanos y para otros huéspedes accidentales(171).
Se caracteriza, sobre todo, por provocar daño hepático y renal(12,
380)
y la
gravedad del proceso depende de muchos factores como la edad y el estado inmunitario
del animal, y la virulencia del serovar infectante(172). El reservorio natural de las
leptospiras patógenas es la luz de los túbulos renales, asociándose la enfermedad a una
nefritis túbulo-intersticial aguda o subaguda(138). En general, los cambios laboratoriales
que se producen en la leptospirosis se correlacionan con la gravedad de la enfermedad
clínica y pueden utilizarse en el diagnóstico del proceso cuando se combinan con
estudios serológicos y el aislamiento del organismo del riñón o de la orina(283).
La leishmaniosis canina, por último, es un proceso multisistémico, parasitario
y enzoótico en el área mediterránea, que está causado por el protozoo Leishmania
infantum(243,
341, 355)
. Se trata de una zoonosis en la que el perro es considerado el
principal reservorio del parásito(130).
En esta enfermedad el daño hepático no es frecuente(130), mientras que la
afectación renal se caracteriza por una glomerulonefritis por complejos inmunes, que
puede llegar a ser muy grave en ausencia de otra sintomatología(76), nefritis intersticial
y, en raras ocasiones, amiloidosis(219,
310, 355)
. Los complejos inmunes provocan una
-4-
I. Introducción
reacción inflamatoria secundaria(202) y la disminución de la perfusión de los capilares
peritubulares conduce a isquemia tubular y del tejido intersticial(350).
Las enfermedades a las que se ha hecho referencia cuentan, entre sus signos
clínicos más comunes, con la aparición de proteinuria, que puede ser de moderada a
grave según la evolución del proceso. Este hecho, unido a las anteriores consideraciones
sobre la importancia de la determinación de las proteínas en la orina, nos han animado a
plantear los objetivos de esta Tesis Doctoral en los siguientes términos:
1.- Establecer el patrón electroforético de la proteinuria oculta en perros sanos.
2.- Determinar el patrón electroforético de la orina de perros con enfermedad
renal, provocada por procesos muy comunes en nuestra área geográfica: piometra,
leptospirosis y leishmaniosis.
3.- Identificar el origen de las proteínas detectadas en la orina de perros
enfermos con el fin de contribuir a localizar la lesión renal.
4.- Determinar el grado de pérdida de las inmunoglobulinas G y A a nivel renal
en las distintas patologías objeto de nuestro estudio.
-5-
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
II. Revisión bibliográfica
La revisión bibliográfica se ha efectuado en:
1.- Servicio de Teledocumentación de la Universidad de Extremadura, en el
que se han consultado las siguientes bases de datos:
- Medline, en el período comprendido entre 1966 y la actualidad.
- Biosis Previews, en el período comprendido entre 1969 y la actualidad.
- Cab Abstracts, en el período comprendido entre 1972 y la actualidad.
2.- Base de datos CABI Publishing desde 1973 hasta la actualidad.
3.- Base de datos INGENTA desde 1973 hasta la actualidad.
II.1.- CONCEPTO DE PROTEINURIA
La orina de perros sanos contiene una pequeña cantidad de proteínas, que se
puede incrementar con ciertas patologías sistémicas, renales y urogenitales(134, 195), en
cuyo caso se dice que el animal presenta proteinuria. Ésta se define como una
concentración anormalmente alta de proteína en la orina(15,
296, 339)
y su causa más
frecuente es la infección del tracto urinario(220). El término proteinuria se prefiere al de
albuminuria porque en la orina normal se han encontrado más de cuarenta proteínas
distintas que pueden aparecer en procesos asociados también con albuminuria(296).
En el caso concreto de que las proteínas presentes sean cadenas ligeras de
inmunoglobulinas, se denomina proteinuria de Bence-Jones. Las gamma-globulinas se
componen de cuatro cadenas peptídicas enlazadas como una unidad. Las dos internas
son más largas y grandes y se llaman “cadenas pesadas” (cadenas H). Las dos externas
más pequeñas, se denominan “cadenas ligeras” (cadenas L). Podemos encontrar dos
tipos de cadenas ligeras: kapa y lambda(296). El monómero de cadena ligera tiene un
-7-
peso molecular aproximado de 22,5 kDa mientras que en los dímeros asciende a
45 kDa. Debido a su pequeño tamaño, monómeros y dímeros de proteínas de BenceJones atraviesan fácilmente los capilares del glomérulo dando lugar a la mencionada
proteinuria(35, 197).
Las proteínas de Bence-Jones se denominan así desde que Henry Bence Jones,
en 1846, determinó la importancia de su detección en la orina. Normalmente se asocian
a mielomas múltiples(58, 392) apareciendo, en el perro, en el 40% de los casos(383), pero
pueden encontrarse también en animales con macroglobulinemia(296), leucemia(35,
82)
,
amiloidosis(322, 349), leishmaniosis visceral(144) y pioderma crónica(53). Las proteínas de
Bence-Jones no son productos de degradación de proteínas anómalas de mielomas, sino
que son sintetizadas por células plasmáticas(296).
En el hombre se ha descrito la proteinuria ortostática o postural. Aparece en un
porcentaje pequeño de personas y consiste en una proteinuria moderada durante el día
que disminuye cuando el individuo se acuesta(106). La pérdida de proteína diaria es
menor de 1 gramo y se trata principalmente de albúmina(325). El mecanismo de la
proteinuria postural se desconoce pero se asocia con congestión o isquemia renal(106).
No se ha descrito en animales(295).
En el estudio de la proteinuria existen dos conceptos importantes de definir:
concentración de proteína y contenido proteico.
La “concentración de proteína” de la orina se define como la cantidad de
proteína por unidad de volumen de orina, mientras que el “contenido de proteína”
relaciona el volumen de orina y la concentración de proteína de la misma. La
concentración de proteína urinaria no refleja con fiabilidad la pérdida diaria de proteína
-8-
debido a las variaciones del volumen urinario en el mismo animal y entre distintos
animales. De este modo, la medida del contenido proteico es más fiable porque se
considera el volumen de orina que se está produciendo(134).
II.2.- FISIOLOGÍA
II.2.1.- Proteína urinaria en perros sanos
Las proteínas presentes en la orina de perros sanos son las filtradas por el
glomérulo y que no se reabsorben en el túbulo, proteínas de Tamm-Horsfall, globulinas
secretoras procedentes del tracto urinario(106), células epiteliales de túbulos y vías
urinarias bajas, enzimas(195), pequeñas cantidades de albúmina y proteínas de peso
molecular alto(276).
La cantidad de proteína presente en la orina humana es menor de
10 mg/dl(189, 295, 317, 325). En la orina de animales sanos también es normal encontrar un
contenido
pequeño
de
proteínas:
valores
inferiores
a
20 mg/kg/día(103),
a
(202, 366)
30 mg/kg/día
, o concentraciones situadas entre 0 y 56 mg/dl en muestras
(189, 295, 317)
obtenidas al azar
. La importancia de la concentración de proteína urinaria
varía de acuerdo a la densidad de la orina(338). Normalmente, concentraciones de
100 mg/dl o inferiores en una orina normal no son significativas. Sin embargo, si la
orina es hipostenúrica, cualquier cantidad de proteína puede ser anormal(220).
La pérdida diaria normal de proteína urinaria en perros se ha cifrado en menos
de 1 g/día(358), menos de 400 mg/día(17,
37)
y menos de 300 mg/día(119). Existe cierta
confusión porque métodos distintos dan resultados también diferentes(111). Utilizando
-9-
Coomassie Brilliant Blue (CBB), Grauer et al.(168) obtuvieron en Beagles adultos,
aunque jóvenes aún, valores que oscilaban entre 0,6 y 5,1 mg/kg/día de excreción de
proteína en orina. Este valor es inferior al obtenido por McCaw et al.(263), que
encontraron utilizando el mismo método (CBB) que los perros objeto de su estudio
excretaban de 1,8 a 22,4 mg/kg/día de proteína en orina. Usando el método del ácido
tricloroacético Ponceau-S (TAC-PS) para esta determinación, White et al.(408) y Center
et al.(67) obtuvieron resultados similares (la excreción máxima de proteína fue de
11,7 mg/kg/día). Según estos resultados, una concentración de proteína urinaria
superior a 20 mg/kg/día evaluada por los métodos CBB y TAC-PS no es normal(250).
Esta cifra se corresponde con un cociente proteína/creatinina en orina (U P/C) situado
entre 0,67 y 0,96, valor acorde con las ecuaciones de regresión lineal establecidas para
perros(67, 168, 263, 408).
Barsanti y Finco(17), en 1979, midieron la concentración de proteína urinaria
por los métodos CBB y TAC-PS en 193 orinas producidas por 157 Beagles que no
presentaban enfermedad del tracto urinario. Esta concentración fue similar en 145
muestras, tanto por el método CBB (media = 23 mg/dl, rango de 4 a 64 mg/dl) como
por el TAC-PS (media = 20 mg/dl, rango de 4 a 95 mg/dl). La pérdida media de
proteína urinaria en 24 horas en 10 animales fue más alta para el método CBB
(media = 70 mg, rango de 24 a 197 mg) que para el TAC-PS (media = 38 mg, rango de
18 a 141 mg). El cociente U P/C en muestras de orina de 24 horas se correlacionó mejor
(r = 0,96) con la pérdida de proteína en 24 horas que la concentración de proteína
urinaria (r = 0,83) con ese mismo valor. Esto implica que dicho cociente predeciría
mejor la pérdida de proteína en 24 horas que únicamente la medida de la concentración
de proteína urinaria.
- 10 -
Biewenga et al.(32), en 1982, evaluaron 29 perros clínicamente normales de
varias razas, sexos y edades y obtuvieron un rango de valores situado entre 2,7 y
23,2 mg/kg de excreción diaria de proteína por el método de TAC-PS, mientras que
DiBartola et al.(106), por el mismo método y en 17 perros (6 machos y 11 hembras),
obtuvieron unos valores de 4,55 a 28,3 mg/kg/día. En ellos la excreción de proteína en
24 horas no fue significativamente diferente entre machos (16,5 ± 10 mg/Kg/día) y
hembras (12,4 ± 6,1 mg/kg/día).
En el estudio realizado por Barsanti y Finco(17) reseñado anteriormente, no
existieron diferencias significativas en la concentración de proteína urinaria entre
muestras recogidas por micción voluntaria, cistocentesis o sondaje. La concentración de
proteína urinaria de perros machos y hembras no fue significativamente diferente
(p > 0,05) cuando la orina se recogió por cistocentesis o por sondaje. Sin embargo, sí
fue significativamente mayor (p < 0,01) la de orina recogida por micción voluntaria en
perros machos que en hembras. La concentración de proteína urinaria no se
correlacionó con el peso o área corporal o edad. Tampoco se correlacionó
estadísticamente con la concentración de creatinina urinaria (r = 0,43) y la densidad
urinaria (r = 0,49).
II.2.2.- Proteinuria funcional
La proteinuria funcional, caracterizada por un aumento en la excreción de
proteína urinaria en ausencia de enfermedad renal, es temporal, reversible y,
normalmente, moderada y no patológica(263, 366). Aparece en situaciones caracterizadas
por un aumento en la actividad del sistema nervioso simpático y consiste
fundamentalmente en la pérdida de albúmina(106). Su mecanismo de producción se
relaciona con una vasoconstricción renal o con cambios en la permeabilidad capilar del
- 11 -
glomérulo(263) que fuerzan el paso de proteínas a la orina(134). Se asocia a ejercicio
intenso(263,
295, 325, 366)
, convulsiones(195), fiebre, exposición a temperaturas extremas,
estrés y fallo cardíaco congestivo(15,
295, 325, 366)
. La proteinuria del fallo cardíaco
congestivo se considera un tipo de proteinuria funcional como resultado de la
congestión pasiva crónica de los riñones(295,
325, 331)
. La proteinuria funcional se ha
caracterizado muy bien en medicina humana, pero en perros aún no se conoce todo
sobre ella(15, 366).
II.2.3.- Origen de la proteína normal urinaria
Cuando la sangre fluye a través del glomérulo, el grado con el que las
proteínas plasmáticas son filtradas depende de su concentración en el plasma, tamaño
molecular, forma y carga(96). La proporción de proteínas plasmáticas filtradas que
aparecen en orina depende también del grado de reabsorción a nivel tubular. Así,
proteínas de bajo peso molecular son reabsorbidas activamente desde el filtrado tubular,
catabolizadas por las células del túbulo proximal, y retornadas a la sangre como
aminoácidos(250).
II.2.3.1.- Filtración glomerular
La orina es un ultrafiltrado del plasma. El filtrado atraviesa tres capas al pasar
desde la luz capilar a la cápsula de Bowman(15, 43):
- 12 -
- Células endoteliales que revisten los capilares glomerulares.
- Membrana basal del glomérulo (no celular):
- Lámina interna.
- Lámina densa.
- Lámina externa.
- Células epiteliales de la cápsula de Bowman (podocitos), con sus
interdigitaciones (pedicelos).
La integridad de las tres láminas asegura el paso restringido de proteínas al
filtrado glomerular(43). Las células endoteliales impiden el contacto de los glóbulos
rojos y las plaquetas con la membrana basal (filtro principal). Los podocitos mantienen
esta membrana y realizan una función fagocítica al retirar macromoléculas atrapadas en
el filtro. En las tres láminas del filtro hay glucoproteínas, que proporcionan una carga
negativa que restringe el transporte de aniones(15). Localizadas entre las células
epiteliales existen células mesangiales que proporcionan soporte estructural a la
membrana basal del glomérulo y que, como pertenecen al sistema reticuloendotelial,
tienen capacidad fagocítica(202). El paso de moléculas a través del filtro glomerular
depende, por tanto, de la concentración plasmática, tamaño molecular, estructura y
carga eléctrica(15).
El tamaño de la proteína parece ser el factor más determinante a la hora de
atravesar la membrana basal del glomérulo(295, 325, 331). El paso de proteínas disminuye a
medida que aumenta el peso molecular, por eso, proteínas de alto peso molecular
(p. ej. IgM, cuyo peso molecular es de 900 kDa) no aparecen en el filtrado glomerular
en cantidades apreciables(250). En general, proteínas con un peso molecular mayor o
igual a 70 kDa(295, 325, 331) y un diámetro superior a 34 nm(166) no atraviesan la barrera
- 13 -
glomerular. La discriminación del tamaño molecular parece ser una función,
principalmente, de la membrana basal del glomérulo(43, 166).
Aunque el plasma contiene altas concentraciones de albúmina, en el filtrado
glomerular sólo aparecen pequeñas cantidades, ya que posee un peso molecular de
aproximadamente entre 66 kDa(250) y 69 kDa, y un diámetro de 36 nm(166). Esta
proteína, con carga negativa y peso molecular que se aproxima al tamaño de los poros
de la barrera de filtración, puede constituir el 40 al 60% de las proteínas urinarias
normales(195).
Las proteínas de bajo peso molecular, que para Lulich y Osborne(250) son las de
peso molecular inferior a 45 kDa, son filtradas libremente por el glomérulo renal. La
concentración de estas proteínas en la orina, como lisozima, mioglobina(195) y
amilasa(81), depende de sus niveles en plasma. Así, proteínas plasmáticas de peso
molecular comprendido entre 1,5 y 45 kDa se filtran fácilmente pero aparecen en menor
cantidad en la orina porque su concentración también es menor en el plasma. Aunque la
hemoglobina tiene un peso molecular pequeño, raramente aparece en el filtrado ya que,
normalmente, se encuentra unida a la haptoglobina, cuyo peso molecular es muy grande
y que utiliza como sistema de transporte(250).
Existen otros factores que, en menor medida que el tamaño molecular, también
intervienen en el paso de moléculas a través del glomérulo. Uno de ellos es la forma de
la proteína. Moléculas con forma alargada atraviesan mejor la pared del glomérulo que
las que tienen forma esférica. Esto es lo que se conoce como “impedimento
estérico”(106).
- 14 -
La interacción electrostática entre macromoléculas y el filtro glomerular es un
factor limítrofe importante en la inclusión de proteínas aniónicas, como la albúmina, en
el filtrado glomerular. Todas las láminas de la pared glomerular contienen
glucoproteínas que son el origen de la carga negativa fija del glomérulo(43). Con ello se
facilita el paso de cationes y se impide el de aniones(195) como la albúmina(250). El
endotelio capilar y la lámina interna de la membrana basal del glomérulo son el
obstáculo más grande a la circulación de polianiones. En un estudio experimental en el
que se provocó daño glomerular, se redujo la carga negativa fija de la pared glomerular
con el consiguiente aumento en la filtración de polianiones(43).
II.2.3.2.- Secreción tubular
Las células epiteliales de los túbulos renales secretan pequeñas cantidades de
proteínas a la luz tubular. La proteína de Tamm-Horsfall, también llamada uromucoide,
es una mucoproteína sintetizada por las células epiteliales y con actividad antiviral(15,
143, 366)
. Se trata de una alfa-globulina que procede del asa ascendente de Henle, túbulos
distales y túbulos colectores y se encuentra presente en la orina del perro en una
concentración de 0,5 a 1 mg/dl(317). Su localización tan precisa hace que la proteína de
Tamm-Horsfall constituya un marcador útil de daño renal a ese nivel(88). En seres
humanos se ha demostrado que puede estar relacionada con la patogénesis de algunos
procesos renales como el síndrome de Fanconi o una nefropatía por cadmio(85, 161).
Los túbulos renales secretan también una uroquinasa e inmunoglobulina A
secretora(15, 366).
- 15 -
II.2.3.3.- Procedente del tracto urogenital inferior
En condiciones normales, además de las proteínas ya enumeradas que aparecen
en la orina (filtradas por el glomérulo y secretadas por los túbulos renales), puede
también encontrarse una pequeña cantidad de proteína procedente de los tractos genital
y urinario inferior(15, 366).
II.3.- FISIOPATOLOGÍA
La proteinuria patológica puede aparecer por causas prerrenales, renales y
postrenales(71). Según esto, la clasificación de la proteinuria se realiza normalmente
dependiendo de cuál sea la zona anatómica de la que procede el exceso de proteínas:
II.3.1.- Proteinuria prerrenal
La proteinuria prerrenal se produce por el paso de proteínas desde la sangre a
la orina a través de un riñón sano(134). Es consecuencia de alteraciones en sistemas
orgánicos no localizados en el tracto urogenital y consiste normalmente en una
albuminuria de grado medio, de presentación temporal(250), poco frecuente en animales
de compañía(217) y rara vez de importancia clínica. Suele acompañarse de una
concentración sérica anormalmente alta de proteínas de bajo peso molecular(402)
provocada entre otras causas, por ejemplo, por deficiencia de proteínas plasmáticas
transportadoras, que conlleva el aumento de proteínas libres disponibles para la
filtración. Las proteínas atraviesan la barrera de filtración glomerular y su alta
concentración supera la capacidad de reabsorción tubular(15).
- 16 -
Existen otras causas, como son:
- Los monómeros y dímeros que constituyen las cadenas ligeras de
inmunoglobulinas (proteínas de Bence-Jones), de peso molecular de 22 kDa(106) y que
aparecen en el mieloma múltiple, también pueden causar proteinuria prerrenal(214).
- Las paraproteinemias son desórdenes que implican la producción de grandes
cantidades de inmunoglobulinas de un único clon de células plasmáticas y se asocian
con algunos casos de leucemia, linfoma e infecciones crónicas(117). También dan lugar a
proteinuria prerrenal.
- El exceso de hemoglobina en la circulación (peso molecular de 68 kDa)(106),
como resultado de hemólisis intravascular (p. ej. anemia hemolítica autoinmune), puede
superar la capacidad transportadora de la haptoglobina y hacer que toda la hemoglobina
libre sea filtrada por el glomérulo provocando hemoglobinuria(15). Otras causas de
hemólisis intravascular las constituyen las patologías microangiopáticas, enfermedades
hereditarias eritrocitarias y procesos oxidativos de los glóbulos rojos (en casos de
intoxicación por cebolla, paracetamol y cobre)(366).
- Otra forma de proteinuria prerrenal es la pérdida masiva de mioglobina (peso
molecular de 17 kDa)(106) por daño muscular grave como consecuencia de trauma(15),
polimiositis grave, ejercicio extremo u otras causas de rabdomiolisis(366).
II.3.2.- Proteinuria renal
La proteinuria asociada con enfermedad renal primaria puede tener tres
orígenes(163):
- 17 -
- Glomerular, por aumento de la filtración de proteínas.
- Tubular, por disminución de la reabsorción o aumento de la secreción de
proteínas.
- Por inflamación del parénquima renal.
II.3.2.1.- Glomerular
Aunque puede existir daño glomerular moderado sin aumento detectable de
proteínas urinarias(32), una proteinuria persistente, en ausencia de infección del tracto
urinario o de sedimento urinario que indique inflamación del tracto urinario inferior, es
el rasgo distintivo de la enfermedad glomerular(66,
168)
. En fases iniciales de la
enfermedad glomerular, los túbulos, el intersticio renal y los vasos sanguíneos pueden
no estar afectados. Cuando avanza la enfermedad, lo que normalmente es inevitable,
estas estructuras también resultan dañadas(142). Además, la proteinuria puede aparecer
en las fases iniciales de otras patologías, persistir durante meses o años en algunos
animales y observarse en perros con morfología glomerular aparentemente normal(32).
En general, la enfermedad glomerular y la pielonefritis son las únicas condiciones que
dan lugar a una proteinuria renal clínicamente significativa(220, 271).
Se
ha
inducido
experimentalmente
una
proteinuria
glomerular
por
“sobrecarga” en perros y ratas mediante administración parenteral de grandes
cantidades de proteínas plasmáticas. Cuando la concentración de proteínas plasmáticas
alcanzaba un valor de 9 g/dl, se excretaban en orina grandes cantidades de albúmina y
proteínas de alto peso molecular(226). En otra experiencia, se han detectado alteraciones
morfológicas en el glomérulo en ratas en los episodios de hiperproteinemia y
proteinuria(275,
406)
. Estas alteraciones desaparecen tras la resolución de la
hiperproteinemia y la proteinuria. La proteinuria glomerular por “sobrecarga” debería
- 18 -
ser considerada como causa de proteinuria en animales que presentan hiperproteinemia
(p. ej. animales con mieloma múltiple o ehrlichiosis)(65).
En el perro, la excreción de proteína urinaria por encima de 29 mg/kg/día(106),
de 65 mg/dl con cualquier densidad(17), o un cociente U P/C mayor de 2(67),
generalmente denota enfermedad glomerular(108). La proteinuria es más intensa en su
fase inicial aunque puede disminuir, cuando el proceso avanza, por disminución de la
filtración glomerular(67). A menudo supera los 400 mg/kg/día(366) y es la más conocida y
grave en el perro. Se produce por alteraciones en la barrera glomerular como
consecuencia de enfermedades que actúan a este nivel dando lugar a la pérdida de
proteínas plasmáticas(366). La proteinuria puede mantenerse sin mostrar sintomatología
hasta que la pérdida de proteína supere los 3,5 g/día, situación asociada, normalmente,
con el síndrome nefrótico(240). Aunque éste se define como la combinación de
proteinuria, hipoalbuminemia, edema, hiperlipidemia y lipiduria, actualmente es
sinónimo de pérdida urinaria masiva de proteínas(366). El daño glomerular se caracteriza
por la pérdida de las cargas negativas fijadas en los capilares del glomérulo(250). Estos
cambios estructurales pueden producirse por procesos primarios como neoplasias(340),
enfermedad por autoanticuerpos de la membrana basal o inflamación, y secundarios
como
depósito
de
inmunocomplejos,
amiloidosis,
hiperfiltración(250)
o
(196, 292)
hiperadrenocorticismo
. En las glomerulopatías inicialmente predomina la
albuminuria pero si progresa la lesión renal aparecen proteínas de alto peso molecular
(inmunoglobulinas y proteínas de la coagulación)(250, 295, 325). Se ha demostrado que la
pérdida de cargas negativas glomerulares se asocia con proteinuria(150), más
concretamente con la pérdida de albúmina y transferrina, y con la pérdida de
podocitos(194). Pero aún no se ha encontrado explicación a las variaciones en la
permeabilidad a la IgG y a proteínas plasmáticas mayores. Aunque su pérdida puede
implicar daño estructural en la membrana basal del glomérulo, se ha demostrado que en
- 19 -
algunas personas con glomerulonefritis, únicamente la IgG con un pk inferior a 8 se
pierde selectivamente, a pesar de que el pk de la IgG sérica abarca un rango de
5,5-10(280).
A medida que el proceso avanza y se dañan más nefronas, la filtración
glomerular va disminuyendo. Las nefronas que aún son funcionales compensan la
pérdida de tejido renal no funcional incrementando el grado de filtración glomerular por
nefrona(312). La hiperfiltración de las nefronas aún funcionales puede exacerbar la
proteinuria y aumentar la hialinización glomerular y la esclerosis. La relación causal
entre hiperfiltración glomerular y glomeruloesclerosis o depósito glomerular de fibrina
no se ha establecido(166) pero la teoría de la hiperfiltración se ha demostrado en perros(50,
160)
.
Las dos causas más comunes de proteinuria son amiloidosis renal y
glomerulonefritis(15,
366)
, sobre todo esta última(80,
250, 278)
con proteinuria, en casos
aislados, por encima de 20 g/día(298). Se diferencian mediante microscopía óptica
porque la amiloidosis presenta depósitos en el glomérulo con propiedades tintoriales
específicas, y en la glomerulonefritis las lesiones glomerulares no contienen sustancia
amiloide(202).
Amiloidosis renal
La amiloidosis se refiere a un grupo diverso de enfermedades caracterizadas,
histológicamente, por el depósito extracelular de fibrillas formadas por la
polimerización de proteínas, que adoptan el denominado patrón transversal beta(24, 77, 100,
109)
. La configuración que poseen dota a estas proteínas de sus propiedades de
insolubilidad, resistencia a la proteolisis y características específicas de tinción(15, 101).
- 20 -
Así, por microscopía óptica y con hematoxilina-eosina, la sustancia amiloide se
visualiza con aspecto homogéneo y eosinófilo(101,
166)
. La sustancia amiloide tiene
birrefringencia verde teñida con rojo Congo y observada con luz polarizada(74, 100). Esta
característica se usa en el diagnóstico clínico de la enfermedad, siendo la conformación
de la proteína y no su secuencia aminoacídica la responsable de esta propiedad(101).
La amiloidosis se clasifica según la distribución de los depósitos (localizada o
sistémica) y la naturaleza de la proteína fibrilar y de su precursor. La amiloidosis
localizada afecta exclusivamente a un órgano y es rara en animales domésticos. El
proceso sistémico afecta a más de un órgano y se han descrito la amiloidosis reactiva
(secundaria), la asociada a inmunoglobulinas y la familiar. La primera de ellas se
caracteriza por el depósito tisular de la proteína amiloide A (amiloide AA)(166). La
amiloidosis familiar en la raza Shar Pei es un ejemplo de amiloidosis sistémica
reactiva(100). La asociada a inmunoglobulinas se caracteriza por el depósito tisular de
fragmentos amino-terminal de cadenas ligeras de inmunoglobulinas y se ha descrito en
animales domésticos(349).
Las distintas proteínas amiloides tienen tropismo hacia determinados tejidos,
pero el motivo de esto no se conoce: la proteína amiloide AA tiene predilección por
riñón, bazo e hígado y la asociada a inmunoglobulinas por riñón, bazo, hígado, lengua,
corazón y sistema musculoesquelético. También se desconoce porqué la sustancia
amiloide tiene tropismo por tejidos diferentes según la especie: en el perro por el riñón,
en el gato por el hígado, etc.(166).
Los distintos tipos de sustancia amiloide, teñidos con rojo Congo, presentan
birrefringencia verde, pero el único sensible a la oxidación por permanganato (pierde su
afinidad por la tinción) es el formado por la proteína amiloide AA, típica de la
- 21 -
amiloidosis reactiva, y por β2-microglobulina(105,
101, 110, 166)
. Aunque los depósitos
constituidos por β2-microglobulina se han observado en personas con fallo renal
crónico(105) y amiloidosis(166), no se han descrito en animales domésticos(99, 105, 110, 166).
En el hombre se han referido distintas clases de amiloidosis pero, en pequeños
animales, la única significativa es la amiloidosis sistémica reactiva que se asocia a
procesos inflamatorios, neoplasias y enfermedades infecciosas crónicas(105,
259)
. Es
decir, a procesos que provocan una estimulación inmunológica crónica aunque la
amiloidosis puede desarrollarse sin causa predisponente conocida(108).
Los depósitos amiloides son fragmentos amino-terminal de la proteína
amiloide A sérica (AAS) que se ha caracterizado en distintas especies. En todas ellas,
los aminoácidos de las posiciones 33 a la 45 son los mismos, lo que sugiere un
importante papel funcional de esta parte de la molécula. Aún no está claro si la proteína
amiloide A sérica es degradada parcialmente a amiloide AA en el plasma y,
posteriormente, depositada en los tejidos o si se deposita en ellos y allí es parcialmente
fragmentada para iniciar la formación de fibrillas(166).
La concentración sérica normal de proteína amiloide A es aproximadamente de
1 mg/l y aumenta de 100 a 1000 veces cuando se produce daño tisular (neoplasia,
inflamación, trauma, etc.)(166). Sin embargo, unos niveles altos de amiloide A sérica no
provocan automáticamente amiloidosis, lo que sugiere la implicación de factores
hereditarios o medioambientales en su aparición(105). La proteína amiloide A sérica está
presente en concentraciones elevadas en procesos inflamatorios crónicos(15, 25, 100). Sin
embargo, sólo un 10% de individuos con enfermedad inflamatoria crónica acaban por
desarrollar una amiloidosis(100). El daño crónico en el organismo y a nivel tisular
- 22 -
desencadena la síntesis hepática excesiva de la proteína amiloide A sérica que sufre
polimerización y origina un daño progresivo(105).
La capacidad que tiene el plasma, en condiciones normales, para degradar la
proteína amiloide A disminuye en casos de amiloidosis y de enfermedad inflamatoria
crónica(21). Esta actividad se relaciona con la concentración sérica de albúmina, de
modo que la hipoalbuminemia, en casos de amiloidosis, puede contribuir a la
disminución de esa capacidad. Por otro lado, en casos de inflamación crónica aumenta
la síntesis de inhibidores de proteasas, aumenta la concentración de proteína sérica
amiloide A y, consecuentemente, se favorece la formación de depósitos amiloides(166).
En los perros el depósito amiloide se produce sobre todo en el riñón(112), con
más frecuencia en el glomérulo que en la médula renal(74,
cualquier otro órgano
109, 358)
y antes que en
(142)
. La sustancia amiloide se sitúa en el mesangio y en las
paredes capilares del glomérulo, interfiriendo en el funcionamiento normal glomerular
por su presencia física(166). El depósito glomerular suele ser difuso, global y marcado(109,
112)
mientras que el medular es menos grave y, normalmente, multifocal(109). También se
ha descrito en bazo, hígado, glándulas adrenales, páncreas y submucosa intestinal(70, 174,
381)
.
El examen histológico de los riñones con amiloidosis reactiva pone en
evidencia la existencia de glomérulos grandes o pequeños y escleróticos y casi
totalmente reemplazados por sustancia amiloide. La cápsula de Bowman se engrosa y,
generalmente, se produce atrofia y degeneración tubular. En el intersticio aparecen
grupos dispersos de linfocitos y células plasmáticas(39). La sustancia amiloide da lugar a
fibrosis y disminución del aporte sanguíneo hacia la parte más interna de la médula con
la consiguiente necrosis papilar e incapacidad del riñón de concentrar la orina(15). Se ha
- 23 -
demostrado que, en la amiloidosis, las lesiones histológicas se correlacionan mal con
los parámetros laboratoriales de funcionalidad renal(109).
En perros con amiloidosis la proteinuria es moderada o grave porque la
localización predominante de los depósitos amiloides es glomerular(67,
100, 108, 109)
.
Aunque la amiloidosis se produce también como una enfermedad familiar en perros
Chinese Shar Pei(110) de los que un 36% presentan depósitos en médula renal, sin
presencia significativa en glomérulo(15,
100)
, y proteinuria media o inexistente(100). Por
todo esto, la ausencia de proteinuria no descarta el diagnóstico de amiloidosis,
especialmente en esta raza de perros(101).
En un estudio en 1992 realizado por Bowles y Moiser(39) en perros Beagles con
amiloidosis, los signos más comunes fueron letargia, anorexia, vómitos y pérdida de
peso. Las anomalías clinicopatológicas más frecuentes fueron anemia normocítica y
normocrómica,
hipoalbuminemia,
azotemia,
hipercolesterolemia,
proteinuria
e
hipostenuria. El examen histológico del riñón reveló amiloidosis glomerular de
moderada a grave y amiloidosis medular intersticial media. Secciones de riñón teñidas
con rojo Congo fueron sensibles a permanganato potásico, lo que sugiere amiloidosis
reactiva. Ninguno de los signos clínicos o hallazgos laboratoriales, aunque sugieran la
existencia de amiloidosis, son lo suficientemente específicos para permitir su
diagnóstico. Por tanto, la diferenciación entre la amiloidosis renal y otras nefropatías
que cursen con pérdida de proteínas requiere invariablemente el examen histológico de
tejido renal(358).
- 24 -
Glomerulonefritis
El término glomerulonefritis describe la proliferación celular del glomérulo y
el engrosamiento de la pared de sus capilares(164,
277)
. Se trata de un proceso
inmuno-mediado asociado a estímulos antigénicos crónicos, enfermedades infecciosas,
inflamatorias y neoplásicas(15, 79), desórdenes metabólicos como diabetes mellitus(371) e
hiperadrenocorticismo y a la administración de determinados fármacos y vacunas(162,
366)
. No existe predisposición racial ni de sexo para el desarrollo de glomerulonefritis,
aunque suele aparecer en torno a los cinco años de edad en el perro(240). La
glomerulonefritis, ya sea primaria o secundaria a otro proceso, no es una causa
frecuente de enfermedad en animales de granja(320).
1.- Glomerulonefritis por complejos antígeno-anticuerpo: los complejos
antígeno-anticuerpo, situados en el glomérulo, activan el complemento y provocan daño
glomerular por una reacción de hipersensibilidad de tipo III(165). Puede ocurrir de dos
maneras:
a)
Los
complejos
circulantes
previamente quedan atrapados en el glomérulo
antígeno-anticuerpo
formados
(15, 164, 165)
. Ocurre cuando existe un
exceso moderado de antígenos o un número equivalente de antígenos y anticuerpos en
la circulación(166). Si los anticuerpos son grandes los complejos formados también
alcanzan un gran tamaño, son insolubles y se eliminan rápidamente de la circulación
por células fagocíticas. Si, por el contrario, los antígenos son los de tamaño elevado, los
complejos inmunes no se unen fácilmente al complemento y, por tanto, tienen poca
capacidad para producir daño inmunológico(264). El depósito glomerular de complejos
inmunes formados previamente da lugar a un patrón inmunofluorescente granular con
una localización mesangial o subendotelial de dichos complejos(166).
- 25 -
b) Los complejos inmunes se forman en el glomérulo debido a
antígenos de origen no glomerular y, posteriormente, quedan atrapados en su
membrana(15,
164, 165)
. Los antígenos se localizan en los capilares del glomérulo por
interacción eléctrica o afinidad bioquímica con la membrana basal glomerular(164). Su
depósito da lugar a un patrón inmunofluorescente liso y lineal y se produce,
principalmente, a nivel subepitelial(166).
2.- Glomerulonefritis autoinmune: existe una producción temporal de
anticuerpos dirigidos contra la propia membrana basal del glomérulo(417). Puede surgir
espontáneamente, o seguir a un daño glomerular que origine una membrana basal
antigénica. En algunos casos, su origen se produce por una combinación de factores: en
el hombre se cree que la glomerulonefritis posterior a una infección estreptocócica es de
tipo autoinmune(180), aunque Markowitz et al.(255) demostraron que algunos
estreptococos y la membrana basal del glomérulo cuentan con antígenos comunes. Así,
la respuesta inmune que seguiría a la infección podría ir, en parte, dirigida contra la
membrana basal del individuo enfermo. Es un proceso raro en personas porque su
diagnóstico requiere estudios de microscopía electrónica y/o inmunofluorescencia(180).
No se ha demostrado en condiciones naturales en el perro(15, 80, 108, 166, 179), aunque sí se
ha inducido experimentalmente en esta especie(421) y se ha descrito en un caballo(14).
3.- Depósito de inmunoglobulinas: las inmunoglobulinas son de tipo G, M o
A y su localización puede ser intramesangial, subepitelial o subendotelial a lo largo de
la membrana basal(48). En personas está descrita una nefropatía por depósito de IgA
llamada enfermedad de Berger(26). Este depósito es frecuente en perros sanos y, aunque
es más frecuente acompañando a lesiones glomerulares, en los casos de perros
proteinúricos el depósito de IgA no se asocia específicamente con este tipo de
lesiones(32). Miyauchi et al.(272) realizaron la necropsia de 100 perros y encontraron que,
- 26 -
por inmunofluorescencia, el 47% tenía depósitos de IgA. En algunos animales, además
de IgA, encontraron IgG, IgM y complemento. Aunque en algunos perros que
presentaban depósitos de IgA se identificaron lesiones glomerulares, la localización de
los complejos inmunes dentro del glomérulo no significa necesariamente lesión
glomerular importante. Existen procesos no renales, como ciertas patologías hepáticas,
que provocan el depósito glomerular de inmunocomplejos, especialmente IgA(124).
En el perro la causa de glomerulonefritis parece ser la formación de complejos
inmunes en el glomérulo o el hecho de que, una vez formados, queden atrapados en
él(66, 89). Los antígenos que pueden inducir daño glomerular inmunomediado pueden ser
exógenos, como agentes químicos, bacterianos, parasitarios o virales(410,
420)
o
endógenos, como ADN, inmunoglobulinas, tiroglobulina, antígenos asociados a
tumores y antígenos del epitelio tubular renal(5, 269, 410). Entre los procesos relacionados
con el desarrollo de glomerulonefritis se han descrito: piometra, neoplasias, lupus
eritematoso sistémico, dirofilariosis, adenovirus canino tipo 1, pancreatitis, diabetes
mellitus(5, 8, 31, 239, 419, 420) y leishmaniosis(76, 145, 228, 356, 393). También se han descrito, en
perros clínicamente sanos, cambios glomerulares similares a los observados en varias
formas de glomerulonefritis(372).
Al daño glomerular contribuye la acción de células inflamatorias (leucocitos
polimorfonucleares, monocitos y macrófagos), proteínas del complemento, plaquetas,
factores que intervienen en la coagulación y metabolitos del ácido araquidónico(410). Las
plaquetas juegan un papel importante en el inicio y progresión de la enfermedad. La
activación plaquetaria en el endotelio glomerular, dañado por los complejos inmunes,
aumenta la lesión glomerular porque se liberan agentes vasoactivos y proteínas
catiónicas que alteran la permeabilidad glomerular(57). Por otro lado, los linfocitos T son
activados al reconocer el antígeno, contribuyendo al daño glomerular inmunomediado
- 27 -
ya que activan a otras células mononucleares. Las células mesangiales también activan
a los linfocitos T(267).
Los tromboxanos, las prostaglandinas y los leucotrienos son metabolitos del
ácido araquidónico. Los primeros parecen ser importantes mediadores de la inflamación
y de la proteinuria asociada a la glomerulonefritis(167,
246)
. Inducen la agregación
plaquetaria, tienen quimiotaxis para los neutrófilos y provocan vasoconstricción y
contracción de las células mesangiales, lo que disminuye la filtración glomerular(281).
Las prostaglandinas, por el contrario, inhiben la agregación plaquetaria y tienen efectos
anti-inflamatorios y vasodilatadores en el riñón. Los leucotrienos, al igual que los
tromboxanos, disminuyen la filtración glomerular por vasoconstricción y contracción de
las células mesangiales(208). Además, los leucotrienos atraen neutrófilos y promueven la
activación leucocitaria así como la proliferación de las células mesangiales(365). La
excreción urinaria elevada de tromboxanos se relaciona con inflamación glomerular
mientras que la de leucotrienos es más específica para la inflamación aguda(235).
La localización de los complejos inmunes en las paredes capilares del
glomérulo puede influir en la respuesta inmune. Por ejemplo, a nivel subepitelial
activan el complemento y producen proteinuria, pero no hay respuesta inflamatoria
mediada por neutrófilos y macrófagos. La activación del complemento provoca la
llegada de neutrófilos y macrófagos pero la membrana basal retira los depósitos
inmunes de la circulación y se impide la adherencia de células inflamatorias. Según
esto, los complejos inmunes a nivel subepitelial pueden aumentar la permeabilidad
glomerular en ausencia de células inflamatorias. Si, por el contrario, los complejos
inmunes se forman o se localizan cercanos a la luz capilar, p. ej. a nivel subendotelial,
encontramos más evidencia histológica de inflamación(166). El glomérulo responde a
- 28 -
esta agresión con proliferación celular del mesangio, engrosamiento de su membrana
basal(66) y, finalmente, hialinización glomerular y esclerosis(166).
La glomerulonefritis se puede clasificar según la apariencia de las paredes
capilares del glomérulo, infiltración celular, y grado de fibrosis en: membranosa,
proliferativa, membranoproliferativa y esclerótica(260). En el hombre esta clasificación
se usa para instaurar el tratamiento y establecer el pronóstico pero, en pequeños
animales, esta clasificación no se ha correlacionado con el proceso(15). Las
características más importantes desde el punto de vista de microscopía óptica son:
1.- Membranosa: se produce el engrosamiento difuso de la pared capilar de
la membrana basal y el depósito subepitelial de los complejos inmunes(48, 80, 199), con
una población celular normal(66) o incluso con disminución de esta población(202).
2.- Proliferativa o mesangioproliferativa: se caracteriza por proliferación
celular a nivel del mesangio(48,
80)
, lo que resulta en el aumento del entramado
glomerular(66), estrechamiento de la luz capilar del glomérulo y, por tanto, disminución
del flujo sanguíneo y del grado de filtración glomerular(202).
3.- Membranoproliferativa: se produce un aumento del número de células
mesangiales y del grosor de las paredes capilares del glomérulo(48, 80), sobre todo a nivel
periférico(66).
4.- Esclerótica: el glomérulo aparece retraído y en el mesangio es evidente
la existencia de mucho tejido fibroso conectivo(80).
- 29 -
Aunque para algunos autores la prevalencia más alta de glomerulonefritis se
asocia a la forma proliferativa(66,
frecuentemente
(80)
337)
, para otros es la membranosa la observada más
y en la que la pérdida de proteína/kg en 24 horas en orina y el
cociente U P/C alcanzan los valores más altos(31, 66).
La magnitud de la proteinuria se correlaciona mejor con la naturaleza de la
lesión glomerular que con el estado de la enfermedad renal(108,
372)
y el grado de
(80)
filtración glomerular
. La proteinuria varía entre los diferentes tipos de enfermedad
glomerular. Es mayor, en orden decreciente en importancia, en amiloidosis,
glomerulonefritis, glomeruloesclerosis(108), atrofia glomerular o nefritis intersticial(80),
aunque a veces la glomerulonefritis presenta una proteinuria más marcada que la
amiloidosis(100) porque existen variaciones individuales(102). La excreción urinaria de
proteínas en 24 horas y el cociente proteína/creatinina en orina también son mayores en
caso de amiloidosis que en glomerulonefritis(100, 109).
La proteinuria glomerular, si está causada por glomerulonefritis o amiloidosis,
se caracteriza por ser de gran magnitud y, en muchos casos, dar lugar a signos clínicos
relacionados con la pérdida de proteínas, como pérdida de peso, letargia y, con el
tiempo, síndrome nefrótico. En algunos animales aparecen signos clínicos de
tromboembolismo por la deficiencia de antitrombina III(162), una α2-globulina de
65 kDa aproximadamente de peso molecular que inhibe la coagulación(48). El
tromboembolismo es más frecuente en casos de amiloidosis, probablemente porque ésta
lleva asociada una pérdida mayor de proteínas que la glomerulonefritis(66). Inicialmente,
la proteinuria puede ser el único signo clínico. Sin embargo, la glomerulonefritis o la
amiloidosis darán lugar a daño renal y, si no se soluciona, a fallo renal y síndrome
urémico(15).
- 30 -
II.3.2.2.- Tubular
La proteinuria tubular se produce, principalmente, por la pérdida de globulinas
de bajo peso molecular que son filtradas normalmente pero no son reabsorbidas en los
túbulos renales. Otros dos mecanismos de producción de esta proteinuria son la
secreción tubular de proteínas y la necrosis de los túbulos y la consiguiente entrada de
proteínas al fluido tubular(175,
276, 303)
. La proteinuria tubular, caracterizada por la
presencia en orina de proteínas de bajo peso molecular, se correlaciona con daño
túbulo-intersticial(22, 418).
La proteinuria tubular por “sobrecarga” se asocia con una producción excesiva
de proteínas de peso molecular bajo (mioglobina o hemoglobina) o con una reducción
de las zonas de unión de moléculas transportadoras de estas proteínas (p. ej. la
haptoglobina en el caso de la hemoglobina)(156, 384). Cuando la concentración plasmática
de proteínas de peso molecular bajo (< de 45 kDa) y, por tanto, con gran facilidad para
atravesar los capilares del glomérulo, es muy alta, los mecanismos de reabsorción
tubular se superan y estas proteínas aparecen en orina en cantidades detectables(250).
La proteinuria tubular primaria se caracteriza por una reabsorción tubular
incompleta de proteínas con permeabilidad glomerular normal(15). Se debe a proteínas
de bajo peso molecular (entre 1,5 y 45 kDa)(178) que atraviesan normalmente la barrera
de filtración glomerular. Entre éstas encontramos enzimas (p. ej. lisozima, ribonucleasa,
alanina aminopeptidasa), hormonas polipeptídicas (p. ej. calcitonina, glucagón, insulina,
prolactina, hormona paratiroidea), fibrina y sus productos de degradación, proteína
ligante de retinol(15), α1-microglobulina (27 kDa), β2-microglobulina (sobre 12 kDa) y
aminoácidos(15,
366)
. Mientras que la albúmina, la transferrina o la IgG se consideran
- 31 -
indicativas de daño glomerular(409), el aumento en la orina de β2-microglobulina,
α1-microglobulina, lisozima y proteína ligante de retinol indica alteración tubular(423).
La lisozima aparece en pequeñas concentraciones en la orina de individuos sanos pero
aumenta mucho en casos de patología tubular. Ya en 1968, Hayslett et al.(187)
correlacionaron la lisozimuria con un diagnóstico histopatológico de daño tubular
cuando su concentración en plasma excedía los 45 µg/l. Es utilizada como marcador de
disfunción tubular junto con la γ-glutamiltranspeptidasa(158) y la fosfatasa-alcalina, dos
enzimas localizadas en el epitelio tubular y que, normalmente, sólo aparecen en la orina
en cantidades pequeñas. Las dos cuentan con pesos moleculares altos (200 kDa y
126 kDa respectivamente), lo que impide su pérdida elevada si la membrana basal del
glomérulo es normal. Incluso con niveles altos de estas enzimas en sangre, no son
normalmente filtradas por el glomérulo(188). La cuantificación de β2-microglobulina
también se usa para detectar daño tubular pero presenta desventajas como son su
inestabilidad a pH urinario ácido (pH < 6) y la posibilidad de que varíe su
concentración plasmática, independientemente de la función glomerular(183). En este
sentido, la α1-microglobulina(423) y la proteína ligante de retinol(27) no presentan estas
desventajas y se pueden utilizar como alternativa(28).
La proteinuria tubular es rara, moderada y se asocia a casos de necrosis tubular
aguda(332), fallo renal agudo(391) y crónico, riñón poliquístico y síndrome de Fanconi. La
proteinuria mixta (glomerular y tubular) es más común y puede dificultar el
diagnóstico(15). El síndrome de Fanconi representa un grupo de anormalidades
metabólicas, asociadas a defectos de reabsorción en el túbulo proximal, que provocan la
pérdida de glucosa, aminoácidos, calcio, fosfato, sodio(38, 69, 352), bicarbonato y proteínas
de peso molecular inferior a 50 kDa, acompañado todo esto de acidosis tubular y
poliuria, por insensibilidad a la ADH(69). Su patogénesis, independientemente de su
- 32 -
etiología, la explican dos hipótesis. La primera se refiere a la disminución en la
reabsorción de solutos por alteración de la membrana tubular y la segunda sugiere un
fallo en el metabolismo intracelular de los túbulos en la producción de energía para el
transporte de solutos(19). El síndrome de Fanconi puede ser hereditario (raza Basenji) o
adquirido (intoxicaciones por aminoglucósidos y metales pesados)(15,
366)
. Los signos
clínicos varían en función de la gravedad del defecto tubular. Generalmente, las
pérdidas de glucosa y aminoácidos no son importantes pero frecuentemente aparecen
polidipsia, poliuria, progresión hacia fallo renal(15) y una proteinuria normalmente
moderada(19).
Se ha demostrado la existencia de correlación entre la gravedad de lesiones,
presumiblemente primarias, glomerulares y túbulo-intersticiales. Las alteraciones
hemodinámicas y la proteinuria resultante de la disfunción glomerular pueden jugar un
papel importante en la patogénesis de las lesiones túbulo-intersticiales(216). Así, en casos
de fenómenos de coagulación a nivel glomerular, se produce una disminución del flujo
sanguíneo intersticial(363). También influye en el daño tubular el aumento de la presión
hidrostática en la luz tubular como consecuencia de la existencia de cilindros hialinos
formados por la proteinuria(216). Un daño glomerular y la proteinuria derivada de ello
pueden afectar por mecanismos inmunes a los túbulos. La alteración inmunomediada de
los túbulos, activada por mecanismos humoral y celular, se produce por la llegada de
antígenos a la membrana apical de las células tubulares por la proteinuria existente(123,
138)
. La proteinuria, por sí misma, puede contribuir al daño tubular al provocar el
aumento de la reabsorción a ese nivel(166). Finalmente, la filtración de transferrina en
procesos que cursen con pérdida de proteína urinaria se asocia a la formación de
radicales hidroxilos y a daño tubular(3).
- 33 -
II.3.2.3.- Inflamación del parénquima renal
Los procesos catalogados como glomerulonefritis no tienen lesiones
confinadas únicamente al glomérulo. Del mismo modo, las enfermedades categorizadas
como nefritis túbulo-intersticiales también pueden tener lesiones glomerulares(138).
Cualquier causa que provoque inflamación del parénquima renal induce la
exudación de proteínas inflamatorias hacia el filtrado y por tanto proteinuria(15)
generalmente de media a moderada(138). Entre las más frecuentes se encuentran
infecciones, toxinas, alteraciones inmunológicas y reacciones a fármacos(15). Como
consecuencia del mayor daño tubular que glomerular, la detección clínica de la nefritis
túbulo-intersticial se realiza observando una alteración en la función tubular
desproporcionadamente mayor(138).
Entre las causas más frecuentes de inflamación del parénquima renal se
encuentra la leptospirosis, zoonosis caracterizada sobre todo por provocar daño
hepático y renal(12, 170, 171, 380) y que cuenta entre sus signos clínicos más comunes con
proteinuria. En este proceso, el examen histológico de tejido renal revela nefritis
túbulo-intersticial neutrofílica y linfoplasmocítica de moderada a grave(33) y de curso
agudo o subagudo(138). Estos cambios se deben al paso de las leptospiras por las células
túbulo-intersticiales para alcanzar la luz de los túbulos contorneados. Allí se multiplican
y son eliminadas con la orina(270). La causa principal de la nefritis parece ser, más que
las leptospiras, los determinantes antigénicos retenidos en el riñón que provocarían la
reacción inflamatoria(377).
- 34 -
II.3.3.- Proteinuria postrenal
Las proteínas plasmáticas o tisulares responsables de este tipo de proteinuria se
incorporan a la orina cuando ésta ha atravesado ya el riñón. Se produce por secreciones
genitales y alteraciones del revestimiento epitelial del tracto urogenital por inflamación,
neoplasia, isquemia o trauma distal a los riñones(250). Esta proteinuria es normalmente
moderada y está asociada a un sedimento urinario activo(15, 102). Su diagnóstico resulta
sencillo pues los signos clínicos se atribuyen fácilmente al tracto urinario inferior. Las
lesiones pueden afectar a los uréteres, vejiga, próstata o uretra(15), e incluyen cistitis,
prostatitis, urolitiasis, neoplasia del tracto urogenital, especialmente carcinomas de
células transicionales(15, 366), y vaginitis(15). La proteinuria postrenal puede distinguirse
de la renal evaluando los signos clínicos y el sedimento urinario. Así, la primera se
asocia normalmente con piuria y/o hematuria microscópica. En la segunda, estas células
no aparecen(250).
II.4.- DIAGNÓSTICO
El diagnóstico de la proteinuria no sólo persigue determinar la magnitud de la
misma sino también establecer si está asociada a una neoplasia, enfermedad
inmuno-mediada o infecciosa, hipertensión o administración de drogas o vacunas(366).
El proceso patológico causante de la proteinuria prerrenal se deduce de la
historia, examen físico y otros tests laboratoriales rutinarios. La proteinuria derivada de
lesiones renales es más difícil de diagnosticar y es frecuentemente asintomática en los
estados iniciales de la enfermedad, cuando la pérdida de proteína es moderada. Por el
contrario, la patología causante de proteinuria postrenal generalmente resulta de fácil
- 35 -
diagnóstico. En ella encontramos signos relacionados con el tracto urinario inferior o
genital como disuria, polaquiuria, estranguria y hematuria. La investigación,
identificación y tratamiento del proceso puede prevenir o enlentecer la progresión del
daño renal a fallo renal. Sin embargo, muchos animales con proteinuria renal no
presentan signos hasta que la enfermedad está avanzada y aparecen signos de uremia(15).
La aproximación al diagnóstico debería basarse en las siguientes preguntas(15):
- ¿La proteinuria es persistente?.
- ¿La cantidad de proteína en la orina es significativa?.
- ¿De dónde procede la proteína que se pierde?. Identificar la proteína puede
ayudarnos a determinar cuál es su fuente.
II.4.1.- Anamnesis
Debe realizarse una historia completa ya que existen causas de proteinuria con
predisposición de edad, sexo y raza. También debe preguntarse sobre la historia familiar
de los animales(233,
257, 336)
, sobre todo en razas con lesiones renales hereditarias(307)
como amiloidosis en Shar Peis(110), síndrome de Fanconi en Basenjis(15), nefritis
hereditaria en Bull Terriers(191) y Cocker Spaniels(232,
234)
o glomerulopatías en
Samoyedos(200), Beagles(330) o perros de las montañas de Berna(329). Otras preguntas se
refieren a síntomas que hagan sospechar de enfermedad del tracto urinario inferior
(volumen, color y olor anormales de la orina, incontinencia, polaquiuria y disuria)(192).
Debe investigarse la administración de fármacos, vacunas y la existencia de
enfermedades inflamatorias crónicas que, actuando como estímulo antigénico, provocan
amiloidosis o glomerulonefritis(15). En casos de daño renal grave, con tres cuartas partes
de las nefronas no funcionales, podemos encontrar fallo renal y, consecuentemente,
- 36 -
poliuria, polidipsia, anorexia, nauseas, vómitos(164, 334), diarrea, depresión y un aumento
en la profundidad de la respiración(334).
II.4.2.- Exploración física
Una inflamación crónica o una neoplasia a veces está asociada a la existencia
de glomerulonefritis o amiloidosis. Relacionados con fallo renal crónico podemos
encontrar signos sistémicos inespecíficos, mal pelaje, depresión(15, 209), pérdida de peso,
deshidratación y ulceración de la mucosa oral(166). Resulta de gran utilidad realizar un
análisis minucioso del sistema urogenital, como palpación de ambos riñones, vejiga y
próstata(15). Los riñones, con frecuencia, son pequeños e irregulares en perros con fallo
renal crónico como consecuencia de una enfermedad glomerular, pero pueden tener un
tamaño normal en animales proteinúricos sin azotemia(166). Un examen oftalmológico
podría revelar hipertensión: dilatación y tortuosidad de vasos retinianos, hemorragia
retiniana e hipema. Todo ello presente en casos de hipertensión sistémica grave(118, 220).
También se han descrito lesiones oculares en casos de proteinuria prerrenal. Esto se
debe a la alta concentración de proteínas circulantes y al consiguiente aumento de la
viscosidad sanguínea(214).
II.4.3.- Análisis laboratoriales
II.4.3.1.- Sangre
Los resultados de la hematología y bioquímica sanguínea pueden ser de
utilidad en casos de proteinuria prerrenal y renal. Así, por ejemplo, la hiperproteinemia
o la existencia de hemólisis o leucemia puede sugerir una causa prerrenal. Un cociente
- 37 -
P/C urinario elevado con pocas células en el sedimento urinario y ausencia de
hiperproteinemia es una fuerte evidencia de un problema glomerular(15).
II.4.3.1.1.- Hematología
En perros con fallo renal y proteinuria asociada podemos encontrar una anemia
normocrómica, normocítica y no regenerativa(236) y linfopenia(166). La leucocitosis es
indicativa de proceso inflamatorio y, más concretamente, en un fallo renal el hallazgo
de neutrofilia con desviación a la izquierda sugiere pielonefritis(261).
II.4.3.1.2.- Bioquímica
Debe
sospecharse
una
enfermedad
glomerular
cuando
se
detecta
hipoalbuminemia y no hay evidencia de afección preglomerular o de trastornos
postglomerulares(195). La hipoalbuminemia se produce cuando la pérdida de albúmina
por orina supera la capacidad del hígado de sintetizarla(366). La consiguiente
disminución de la presión oncótica predispone al animal a la aparición de ascitis o
edemas, hecho que ocurre con valores de albúmina plasmática de 1-1,5 g/dl(164). El
hígado responde aumentando la síntesis de lipoproteínas, especialmente de colesterol,
apareciendo hipercolesterolemia(6, 366).
La concentración plasmática de proteínas en un proceso glomerular es
variable. En la amiloidosis, la pérdida de proteínas en la orina es mayor que en casos de
glomerulonefritis y, por tanto, la hipoalbuminemia será más grave(31, 108) y la cantidad
de globulinas en sangre menor. En casos de glomerulonefritis podemos encontrar
hiperglobulinemia por la naturaleza inflamatoria e inmunológica de la enfermedad(80).
- 38 -
En perros con sospecha de enfermedad glomerular se debe investigar la
existencia de una enfermedad sistémica subyacente que provocara el depósito de
complejos inmunes en las paredes de los capilares glomerulares(195), ya que la función
renal puede estar tan disminuida que, en algunas causas renales de proteinuria, se
produzcan elevaciones de urea, creatinina y fósforo(15). Los valores de urea y creatinina
plasmáticos no reflejan con precisión la función renal(60, 141) ya que ambos se encuentran
influidos, en mayor medida la urea, por factores extrarrenales. Además, sólo se produce
su elevación significativa cuando se ha perdido en torno al 70% de la función renal(158)
y está muy avanzada la enfermedad(157). En cualquier caso, unos niveles elevados de
urea se asocian con signos clínicos que reducen la calidad de vida del animal y
contribuyen a la morbilidad del proceso(321). En el 50% de los casos de
glomerulonefritis o amiloidosis renal la azotemia puede ser moderada o estar ausente(80,
109)
, aunque se observa frecuentemente, por ejemplo, en perros Shar Pei con
amiloidosis.
Aún
así,
la
azotemia
puede
reflejar
factores
prerrenales
(p. ej. deshidratación) o renales (más de un 75% de nefronas no funcionales)(166).
Una vez instaurado el fallo renal pueden aumentar los niveles séricos de
fósforo y, en ocasiones, disminuir los de calcio(72). Sin embargo, los mecanismos
reguladores de la homeostasis intentan ajustar las concentraciones de fósforo y calcio
aumentando la secreción de hormona paratiroidea(261). El potasio y la amilasa sérica, al
igual que el fósforo, se excretan por el riñón. Así, una disminución de la función renal
puede provocar hiperamilasemia. Por otro lado, en casos de fallo renal crónico en los
que la reducción de la función renal avanza lentamente, los niveles de potasio se
mantienen normales(83,
284)
. Cuando el fallo renal se produce rápidamente, como en
casos agudos o en patologías postrenales, la concentración sérica de potasio puede estar
incrementada(261, 284).
- 39 -
II.4.3.1.3.- Serología
Las pruebas serológicas están indicadas para detectar enfermedades
infecciosas, dirofilariosis y anticuerpos antinucleares (AAN). La amiloidosis renal suele
acompañarse así mismo de un trastorno infeccioso, inflamatorio o neoplásico
subyacente pero, igual que la glomerulonefritis, con frecuencia no se encuentra un
factor predisponente(195).
II.4.3.2.- Orina
II.4.3.2.1.- Análisis físico-químico
II.4.3.2.1.1.- Proteínas
Los tests laboratoriales tienen distinta capacidad para detectar proteínas en la
orina. Los cualitativos permiten identificarlas y caracterizarlas mientras que los
semicuantitativos, aunque son sencillos de realizar, no son muy sensibles ni específicos.
Los cuantitativos proporcionan resultados fiables pero son más difíciles de llevar a cabo
y requieren equipos más sofisticados que los semicuantitativos. En cualquier caso,
todos los tests deberían realizarse con el sobrenadante de muestras de orina
centrifugadas(106).
- 40 -
Métodos semicuantitativos:
1.- Tiras reactivas
La persistencia de proteinuria, diagnosticada mediante esta técnica, debe ser
confirmada por el examen de muestras sucesivas. Una segunda muestra, obtenida
preferiblemente por cistocentesis, confirmará la persistencia de proteinuria y ayudará a
la localización anatómica del origen de las proteínas. Tras esto, un resultado negativo
implicaría la existencia de proteinuria temporal o de un proceso distal a la vejiga,
aunque hay que tener en cuenta que la muestra recogida por cistocentesis puede
contener elementos procedentes de la uretra proximal y próstata por reflujo de orina
hacia la vejiga(15).
La interpretación de los tests debe realizarse conjuntamente con la densidad de
la orina ya que, por ejemplo, una reacción positiva es más significativa en una orina
diluida que en una concentrada. La muestra de elección es la primera de la mañana por
ser la más concentrada(15). La excreción normal de proteína en orina es inferior a
20-30 mg/kg/día(17). Según esto, los efectos de la densidad de la orina sobre la
importancia de la proteinuria son los siguientes(17, 366):
- En el test la proteína en la orina es “negativa” y la orina tiene cualquier
densidad: normalidad a menos que la proteína principal no sea la albúmina y existan
proteínas de Bence-Jones, globulinas, etc. En este primer caso deberían usarse métodos
cuantitativos de determinación de proteínas como el del ácido sulfosalicílico.
- 41 -
- En el test el resultado es “indicio” y la densidad es < 1.030: si esa
densidad está próxima a 1.030 se debería repetir la analítica. Si, por el contrario, la
orina está muy diluida, se debería cuantificar la proteinuria con un método más fiable.
- En el test el resultado es “indicio” o “+” y la densidad es > 1.030: no
requiere intervención. Quizás repetir el análisis en el futuro.
- En el test el resultado es “+” (30 mg/dl) y la densidad es < 1.030: debería
repetirse la prueba. Si aún persiste el resultado debería cuantificarse por un método más
seguro (ácido sulfosalicílico, cociente urinario P/C).
- En el test el resultado es “++” y la densidad > 1.030: el resultado es
cuestionable, conviene repetir el test.
- En el test el resultado es “++” o más (> 100 mg/dl) y la densidad
es < 1.030: si se descartan artefactos que provoquen el resultado, debería realizarse
inmediatamente una bioquímica sanguínea y un cociente urinario P/C.
La proteinuria induce un cambio de color rápido por reacción con
determinados colorantes a concentraciones proteínicas de 20 mg/dl y mayores(195, 295).
La mayoría de estos tests se basan en el azul de tetrabromofenol, muy sensible a la
albúmina pero insensible a determinadas proteínas urinarias patológicas(15,
189, 366)
,
apareciendo falsos negativos en presencia de globulinas, proteínas de Bence-Jones(15,
, amonio cuaternario(134,
366)
366)
y en orinas ácidas o muestras muy diluidas(106,
También podemos encontrar falsos positivos en casos de pH alcalino(134,
(15, 366)
muestras contaminadas con clorhexidina
131)
.
190, 366)
y
(106, 375)
y cloruro de benzalconio
. La
muestra de orina no debe ser recogida en las 24 horas siguientes a la realización de
- 42 -
radiografías de contraste porque puede aparecer proteinuria temporal y, por tanto, falsos
positivos(126). Por todo esto resulta insuficiente para el diagnóstico definitivo de
proteinuria(134, 253). Además, el test da una intensidad de color máxima para todas las
concentraciones proteicas iguales o superiores a 1 g/dl y, por tanto, no es útil para
valorar la magnitud de la proteinuria por encima de este valor(106).
2.- Tests del ácido sulfosalicílico, ácido nítrico y ácido acético al 5% (métodos
turbidimétricos)
Se basan en la precipitación de las proteínas inducida por agentes químicos (la
mezcla de orina y ácidos provoca turbidez). La densidad del precipitado puede
estimarse visualmente o cuantificarse utilizando densitometría óptica(366). El test del
ácido sulfosalicílico llega a detectar concentraciones de proteínas de 5-10 mg/dl y es 2,4
veces más sensible a la albúmina que a las globulinas(295, 325) aunque también detecta
globulinas, proteínas de Bence-Jones y glucoproteínas(366). Podemos encontrar falsos
positivos en orinas sin centrifugar, con medio de contraste con iodo, penicilina,
cefalosporinas, sulfisoxazol(134,
295, 366)
y metabolitos de la tolbutamida(295). Por el
contrario, los falsos negativos aparecen en orina muy alcalina(106,
diluidas
(106)
. En un estudio realizado por Shiba et al.
(354)
195)
y en las muy
en el que se comparaban los
métodos del ácido sulfosalicílico y el Coomassie Brilliant Blue, se encontró que el 18%
de las muestras de orina mostraban valores de proteína dos veces más altos con el
segundo método que con el primero, por lo que se concluyó que existían proteínas
solubles en ácido sulfosalicílico y que, por tanto, no podían ser cuantificadas por este
método.
- 43 -
Métodos cuantitativos:
Estos métodos son igual de sensibles para la albúmina y para las globulinas,
detectando también proteínas de Bence-Jones y glucoproteínas. Con ellos se analizan
muestras urinarias obtenidas en 24 horas o se usan para determinar el cociente
U P/C(195).
1.- Técnicas
* El método Biuret es una técnica colorimétrica que se basa en la
formación, en condiciones alcalinas, de un complejo péptido-cobre que proporciona un
color azul a la muestra de intensidad variable(207). Se utiliza para la determinación de
proteína sérica pero es poco sensible para medir concentraciones proteicas de
miligramos, a menos que se modifique la concentración de la muestra(302). Si ésta se
concentra por precipitación ácida, los restos de sustancias cromógenas dan lugar a
resultados falsos muy altos(56).
* El método de Lowry está basado en el método de Biuret. La
reacción de las proteínas con el cobre, en condiciones alcalinas, produce Cu+. Este
reacciona, a su vez, con el reactivo de Folin-fenol para dar un fuerte color azul, cuya
intensidad dependerá, fundamentalmente, del contenido en tirosina y triptófano de la
proteína. Presenta la ventaja de ser muy seguro a la hora de medir una mezcla de
proteínas(403), aunque componentes no proteicos de la orina pueden producir
interferencia(302). Entre otras ventajas se encuentran el ser cien veces más sensible que
el método Biuret y no presentar interferencia con la urea, guanidina, algunos
compuestos de sodio, etc.(248).
- 44 -
* El método del ácido tricloroacético-Ponceau S (TCA-PS) se ha
utilizado para medir la proteína en orina(189) y en líquido cerebroespinal en el perro(413).
Este método no se ve afectado por el cociente albúmina/globulina o por la
temperatura(306). Requiere un volumen de muestra pequeño (50-100 µl), es igual de
sensible para la albúmina que para las globulinas y esta sensibilidad se cifra en 2 mg/dl.
Su mayor desventaja es que requiere espectrofotometría(106). Aunque resulta simple de
realizar, requiere la precipitación de proteínas y la retirada del líquido sobrenadante
antes del desarrollo del color para la medida espectrofotométrica. Si el sobrenadante no
se retira en su totalidad aparecerán valores más altos. Por el contrario, si se produce
pérdida de precipitado en la extracción del sobrenadante, los valores estarán por debajo
de lo normal(17).
* El método del Coomassie Brilliant Blue (CBB) está indicado para
cuantificar la proteína en líquidos biológicos(40). Presenta la ventaja de la simplicidad
porque sólo requiere pipetear el reactivo en la muestra y determinar por
espectrofotometría la absorbancia. Este método es sensible y preciso(265). Tiene la
desventaja de variar en su afinidad para teñir distintas proteínas. Así, es más reactivo a
la albúmina que a las globulinas. Por otra parte, la reacción no es lineal y requiere el
uso de una curva estándar más que la extrapolación de la Ley de Beer(40).
2.- Colección de orina durante 24 horas
El examen de la orina recogida en un período de 24 horas es el método de
elección para cuantificar la proteinuria. Utilizando este período de tiempo se minimizan
los errores en dicha cuantificación debidos a variaciones en la densidad urinaria, pero se
requiere caja metabólica o sondaje del animal, lo que encarece el procedimiento(168).
Para su realización el animal se aclimata 24 horas por lo menos a la caja metabólica
- 45 -
donde se recoge la orina. La vejiga se vacía antes y al final de cada período de 24 horas
de recolección, utilizándose un inhibidor del catabolismo bacteriano de la proteína
urinaria. El resultado más fiable se consigue tras repetir varias veces la obtención de
orina en 24 horas(134). La excreción de proteína en 24 horas se halla multiplicando la
concentración de proteína de la muestra por el volumen de la misma producida en esas
24 horas y dividiendo este número por el peso del animal. El valor se expresa
en mg/kg/día(195).
Es el método más aceptado para medir la excreción de proteína urinaria
aunque, entre distintos laboratorios, por utilizar distintas técnicas, no coinciden los
valores considerados como normales. Predispone a la infección urinaria si se usa para la
recogida de orina el sondaje uretral y éste se realiza repetidas veces(134). La recogida de
la orina por micción voluntaria presenta el mayor índice de contaminación bacteriana
posterior (86%) seguido por el sondaje (26%). La cistocentesis no predispone a dicha
contaminación. Por otro lado, esa predisposición es mayor en el caso de las hembras
que en el de los machos(78).
Métodos cualitativos:
1.- Electroforesis
La electroforesis se ha usado, rutinariamente, para la identificación y
separación de proteínas en la orina de perros sanos y enfermos(63,
166, 317)
. Se ha
demostrado, además, que las diferentes localizaciones de las lesiones renales se
caracterizan también por distintas distribuciones de las proteínas urinarias según su
peso molecular(230, 276). Si se asume que el glomérulo se comporta como una membrana
de filtración que retiene proteínas de peso molecular alto, y que los túbulos actúan,
- 46 -
fundamentalmente, reabsorbiendo proteínas de peso molecular bajo, se puede admitir lo
siguiente(279):
1.- Una patología glomerular provoca un aumento en la filtración de proteínas
de peso molecular medio y alto, no reabsorbidas por los túbulos y, por consiguiente,
que aparecen en la orina. El sistema tubular sano reabsorbe proteínas de peso molecular
bajo y, por tanto, no se encuentran en la orina.
2.- La lesión tubular disminuye la reabsorción de proteínas de peso molecular
bajo, mientras que el glomérulo sano impide la filtración de proteínas de peso molecular
mayor. De este modo, en la orina predominan las primeras.
3.- La lesión que afecte al glomérulo y a los túbulos, hecho que ocurre en
cualquier proceso grave del riñón, provoca la aparición en la orina de proteínas de peso
molecular alto y bajo.
Por tanto, la electroforesis de proteínas urinarias puede ayudar a localizar la
lesión renal. Así, la proteinuria glomerular se caracteriza por la presencia de albúmina y
proteínas plasmáticas de tamaño molecular superior a la albúmina y la tubular también
por albúmina, pero en este caso acompañada por proteínas de tamaño molecular inferior
a la misma(249, 303). Tanto las enfermedades glomerulares iniciales como las hemorragias
tienen patrones electroforéticos semejantes a la electroforesis sérica normal de
proteínas, en los que la albúmina representa la fracción mayor de la pérdida de
proteínas. Esta proteinuria selectiva ocurre cuando los glomérulos pierden sus cargas
negativas fijas y la albúmina pasa libremente por la barrera de filtración en tanto se
retienen las proteínas de peso molecular mayor(195). A medida que progresa la
enfermedad glomerular, se pierden moléculas más grandes, incluso inmunoglobulinas,
- 47 -
lo
que
resulta
en
una
proteinuria
no
selectiva(175,
195,
295)
caracterizada
electroforéticamente por una proporción mayor de proteínas en la región gamma. La
proteinuria de peso molecular bajo, como ocurre en la proteinuria tubular, se acompaña
de un incremento de las fracciones alfa y beta(195).
Todo esto ha apoyado el uso de métodos basados en la separación proteica,
según el tamaño molecular, para la caracterización de patrones de proteínas
urinarias(319). Los primeros trabajos usaron ultracentrifugación o filtración en gel sobre
Sephadex(87). Los resultados fueron de gran interés y valor clínico, pero eran métodos
que consumían mucho tiempo para su uso rutinario en el laboratorio. También se
intentó la determinación inmunológica de proteínas individuales(230). Aunque más
fáciles de aplicar, estos métodos presentan la desventaja de medir sólo un número
limitado de proteínas, pasando por alto otras que pueden tener gran importancia(11). El
método electroforético para la caracterización de las proteínas urinarias, usado
habitualmente, se basa fundamentalmente en la carga molecular más que en el tamaño,
y la orina debe concentrarse si queremos visualizar las bandas de proteínas(304), aunque
las muestras que contienen más de 100 mg/l de proteína no requieren concentración,
con el ahorro de tiempo y la ausencia de pérdida de proteína, por precipitación, que esto
supone(147).
El sistema de electroforesis debe permitir la diferenciación clara de los
patrones de proteínas urinarias en cada muestra de orina, independientemente de la
concentración, que puede variar enormemente (10-10.000 mg/l). Su sensibilidad debería
permitir el análisis de las proteínas con una concentración baja(346). Cuando una mezcla
de proteínas es sometida a electroforesis, la distancia de migración está, para cada
proteína, influida por su carga electrostática así como por su peso molecular. El
tratamiento de esta mezcla con dodecil sulfato sódico (SDS) impulsa la formación de
- 48 -
micelas, cargadas negativamente, y constituidas por proteínas y SDS(279). La unión del
SDS a la proteína provoca un cambio conformacional en su estructura y proteínas
diferentes llegan a poseer una densidad de carga idéntica(242). Así, cuando las
sometemos a electroforesis en gel de poliacrilamida, estas micelas migran una distancia
a través del gel que se correlaciona bien con el tamaño molecular de las proteínas sin
influir dicha carga(400).
El detergente aniónico SDS fue utilizado por Shapiro et al.(353) en 1967 y, más
tarde, por Weber y Osborn(405) (1969) en un sistema de gel continuo, que restringía la
movilidad de las proteínas en base a su peso molecular. Posteriormente, Laemmli(225)
(1970) combinó el efecto del SDS con el sistema de electroforesis discontinuo en gel de
poliacrilamida y el tampón tris-glicina. Se han descrito otras combinaciones de
detergentes y tampones(287), pero la técnica SDS de Laemmli es la de uso más extendido
en la electroforesis de proteínas(242).
El sistema SDS-PAGE presenta la ventaja, en comparación con otras técnicas,
de consumir menos tiempo y de permitir el análisis de proteínas de peso molecular muy
distinto(22, 303). Así, es el método de elección para el análisis simultáneo de patrones que
cuenten con proteínas de bajo y alto peso molecular en casos de patología renal(345, 378).
Por contra, cuenta con la desventaja de que proteínas de peso molecular muy elevado
(α2-macroglobulina, fibrinógeno, etc.) quedan atrapadas en el punto de migración y
proteínas de peso molecular muy bajo (insulina) no son separadas del resto(303).
Se ha demostrado que existe una correlación buena entre los resultados de la
electroforesis de orina en SDS-PAGE y los datos clínicos e histopatológicos de distintas
patologías renales en seres humanos(309) y proteinurias caninas(348). Balant et al.(11), en
personas, correlacionaron la excreción predominante de proteínas de bajo peso
- 49 -
molecular con daño tubular, y de medio y alto peso molecular con daño glomerular.
Además, el sistema SDS-PAGE se comparó con la cromatografía en Sephadex G 100,
con la electroforesis sobre acetato de celulosa, inmunoelectroforesis y electroforesis en
acrilamida sin SDS y se concluyó que el sistema SDS-PAGE proporciona la mayor
información en concordancia con el estado clínico del paciente. Aún así, en la
interpretación de los patrones de orina mediante SDS-PAGE, hay que ser consciente de
los riesgos que conlleva, especialmente en la proteinuria tubular. En estos casos puede
ser necesario otro test de funcionalidad tubular, e incluso una biopsia(249).
Lubega(249), con marcadores de peso molecular en SDS-PAGE, caracterizó las
proteínas urinarias de individuos con patología renal y su frecuencia de presentación.
La albúmina presentó la frecuencia mayor aunque, generalmente, su filtración
glomerular es moderada. Se encontraron bandas de 130 kDa (40%) y 140 kDa (36%),
que podrían coincidir con albúmina polimérica, ya que las muestras de orina se
mantuvieron a -20°C lo que, según Boesken et al.(34) y Hardwicke(182), promueve la
dimerización de la albúmina. La lisozima (20%) se relacionó con daño tubular, aunque
la β2-microglobulina (46,6%) es, probablemente, un indicador mejor de disfunción
tubular(204). En la polimerización de la albúmina urinaria intervienen una molécula de
albúmina alterada, un factor urinario de bajo peso molecular y, por último, la
congelación de la muestra de orina a -14°C durante al menos 48 horas. El factor
urinario cuenta con un peso molecular cifrado en 0,7 kDa y no parece ser un péptido, un
aminoácido o un ácido graso. Por otro lado, la alteración de la molécula de albúmina se
produce una vez que ha abandonado la circulación sanguínea porque en el plasma no se
localiza esa albúmina anómala(116). Pero también en la orina se pueden encontrar
fragmentos de albúmina con varios orígenes. Pueden ser el resultado de una proteolisis
en la orina ya formada o ser consecuencia de una fragmentación parcial en las células
del túbulo proximal y sufrir, posteriormente, exocitosis hacia la orina. Los fragmentos
- 50 -
de albúmina cuentan con un peso molecular de 30 kDa y 45 kDa. Por tanto, la albúmina
en la orina (sobre todo en muestras congeladas) debe considerarse como un grupo
heterogéneo de proteínas que incluye polímeros, monómeros y varios fragmentos de
30 kDa y 45 kDa(412).
Estudios electroforéticos realizados en la orina de perros sanos revelan la
presencia fundamentalmente de albúmina, proteínas de bajo peso molecular(276),
α1-globulinas, α2-globulinas, β1-globulinas y γ-globulinas(422). Por el contrario, en un
trabajo realizado por Biewenga et al.(32) en perros sin signos de enfermedad renal, se
evidenció una proteinuria fisiológica intermedia constituida por albúmina y proteínas de
bajo y alto peso molecular. Schultze y Jensen(348) diferenciaron, mediante electroforesis
en SDS-PAGE, varios patrones de proteínas urinarias. El que aparecía en perros
clínicamente sanos y no proteinúricos (< 30 mg/dl) se caracterizó por tres bandas finas
y tenues con pesos moleculares situados entre 65 kDa (albúmina) y 100 kDa
(transferrina). En perros con glomerulonefritis proliferativa o membranosa crónica
(lesiones principalmente glomerulares) se encontraron entre 12 y 20 bandas, más
gruesas y teñidas intensamente, con pesos moleculares en un rango entre 65kDa y más
de 100 kDa (transferrina). El patrón electroforético tubular se obtuvo en perros con
proteinuria temporal y estuvo formado por 15 bandas de pesos moleculares situados
entre 16 kDa y 198 kDa, de las que la mayoría contó con un peso molecular inferior al
de la albúmina. Por último, se observó un patrón acorde con daño túbulo-intersticial
grave y lesiones glomerulares (patrón mixto) formado por un número entre 16 y más de
40 bandas y con pesos moleculares situados entre 10 kDa y más de 264 kDa.
La caracterización de las proteínas séricas y urinarias, según su peso
molecular, ofrece además la posibilidad de expresar el paso de proteínas desde el
plasma a la orina como el “aclaramiento” para cada fracción proteica. El aclaramiento
- 51 -
de la albúmina es inferior al de otras proteínas de peso molecular bajo debido a la
permeabilidad selectiva de la barrera de filtración glomerular. Por el contrario,
proteínas de peso molecular alto tienen un aclaramiento mayor explicable, únicamente,
por la adición renal o no renal de estas proteínas a la orina o por una disminución
selectiva en la reabsorción. Este último mecanismo, sin embargo, no se ha
demostrado(32).
2.- Western blotting
La identificación de proteínas específicas, por electroforesis y según su tamaño
molecular, se limita a conclusiones generales sobre el origen de la proteinuria
(glomerular, tubular o ambos). Las razones para esta conclusión son que proteínas de
peso molecular similar, al migrar la misma distancia, pueden encontrarse en la misma
banda(346), algunas proteínas no se visualizan tras realizar la tinción y, por último,
fragmentos de albúmina y sus polímeros pueden presentar cualquier peso molecular.
Sin embargo, el sistema SDS-PAGE junto con Western blotting, proporciona
información útil desde un punto de vista clínico y experimental(399). También presenta
ventajas frente a otras técnicas inmunológicas como el ELISA, ya que aporta
información sobre el peso molecular de la proteína a investigar(273) y, por tanto, aunque
el Western blotting es un método demasiado complejo para el análisis rutinario,
proporciona más información sobre las distintas formas de disfunción renal(223).
Tras el desarrollo, en 1975, de la técnica del Southern blotting para identificar
fragmentos de ADN(362), y del Northern blotting para el ARN(4), Towbin et al.(385)
desarrollaron en 1979 la técnica del “blotting” de proteínas que se empezó a conocer, en
una clara alusión a las precedentes, como Western blotting(152,
153)
. Esta técnica
constituye un método simple y muy efectivo a la hora de identificar antígenos
- 52 -
específicos en una mezcla compleja de proteínas(351). Inicialmente, los componentes
polipeptídicos de la muestra son separados mediante el sistema SDS-PAGE, o por otra
técnica para, posteriormente, ser transferidos a un filtro de nitrocelulosa(326). A partir de
aquí, pueden identificarse proteínas específicas por el uso de anticuerpos que se unan a
los antígenos retenidos en dicho filtro, y la visualización posterior del complejo
antígeno-anticuerpo formado(222).
Aunque existen diferentes técnicas para la detección de los anticuerpos unidos
a la membrana de nitrocelulosa, los métodos más utilizados emplean dos tipos de
proteínas de unión. El primero de ellos es la proteína A que se utiliza con un marcaje
radioactivo, o bien conjugada con un marcador enzimático. Esta proteína se une,
específicamente, a la región Fc de la inmunoglobulina G de muchos mamíferos(382). El
segundo método utiliza un anticuerpo específico (anticuerpo secundario) frente a la IgG
de la especie que ha producido el anticuerpo primario. La ventaja que presenta frente a
la proteína A es que el anticuerpo reconoce, únicamente, la inmunoglobulina G de una
determinada especie. El anticuerpo secundario puede estar conjugado con un marcador
enzimático o encontrarse unido a la biotina. En este último caso, la detección se lleva a
cabo mediante la avidina unida a un marcador enzimático(222).
El último paso consiste en la visualización del anticuerpo buscado; para ello
existen múltiples sistemas, aunque la quimioluminiscencia es el de uso más
extendido(242). Los anticuerpos utilizados llevan conjugada peroxidasa, directamente al
anticuerpo primario o bien al secundario que interacciona con el primario. La detección
se realiza incubando las membranas con el sustrato de la peroxidasa, de este modo se
produce una reacción de quimioluminiscencia y la luz producida es capaz de
impresionar un film(176).
- 53 -
Las ventajas que presenta la técnica del Western blotting son muchas: elevada
sensibilidad y resolución, es un método rápido, no utiliza radioactividad y puede
utilizarse con distintos tipos de geles(176). Pero, sobre todo, juega un papel fundamental
a la hora de identificar proteínas específicas. Así, por ejemplo, Berneman et al.(30) al
enfrentar sueros de perros infectados con leishmaniosis a antígenos específicos de esta
enfermedad, demostraron que los anticuerpos que reaccionan son IgG y principalmente
de la subclase IgG4.
II.4.3.2.1.2.- Densidad
La densidad urinaria presenta grandes variaciones individuales pero lo
estimado como normal es un valor de 1.025 o superior a él(133,
184, 294, 368)
. Se ha
demostrado que estas variaciones no se relacionan con el sexo del animal y que la
densidad disminuye por la tarde y con la edad del perro(398). La densidad de la orina se
relaciona con la función tubular y los túbulos renales modifican esta densidad
concentrando o diluyendo la orina para mantener el equilibrio homeostático del
organismo(293, 368). Normalmente, la capacidad de concentrar la orina se pierde antes que
la de diluirla; la pérdida de concentración ocurre cuando los riñones pierden dos tercios
de su funcionalidad(72). En muchos perros con fallo renal crónico por enfermedad
glomerular podemos encontrar isostenuria. Éste es el caso de la amiloidosis, donde los
depósitos situados en el intersticio medular contribuyen, por su presencia física, a la
incapacidad de concentrar la orina por parte de los riñones(166). A veces, y a pesar de
existir daño glomerular, con disminución de la filtración glomerular, la isostenuria
aparece en un porcentaje pequeño de muestras por la conservación de la capacidad de
concentrar la orina que tiene el riñón(298).
- 54 -
II.4.3.2.1.3.- Cociente proteína/creatinina
El cociente proteína/creatinina en orina (U P/C) es un método útil, sensible y
rápido para la detección y cuantificación de proteinuria en muestras de orina recogidas
aleatoriamente. A diferencia de otros tests, este cociente no se afecta por la densidad y
el volumen de orina(250). Se calcula dividiendo las concentraciones de proteína y
creatinina urinarias. Para ello estos dos valores deben tener las mismas unidades
(mg/dl)(15). Los factores de conversión son(15, 366):
- Proteína total desde g/l a mg/dl → x 100
- Creatinina desde µmol/l a mg/dl → /88,4
La evaluación laboratorial cuantitativa de la proteína urinaria depende no sólo
de la cantidad de proteína filtrada, sino también de la concentración que los túbulos
hacen del filtrado. Por tanto, la excreción total de proteína en 24 horas resulta más útil
para cuantificar la pérdida de proteína pero su recogida no es práctica para el clínico(15).
Se ha demostrado que, en el perro, el U P/C en una muestra recogida al azar se
correlaciona bien con la excreción de proteína urinaria medida en 24 horas, con la
presencia de proteinuria o sin ella(2, 10, 17, 67, 168, 408). Así, estudios de regresión lineal han
demostrado que la multiplicación del cociente U P/C por 20, para el método Coomassie
Brilliant Blue (CBB), o por 30 en el del ácido tricloroacético Ponceau-S (TCA-PS) se
aproxima en gran medida a la pérdida de proteína en 24 horas en mg/kg/día(250). Para
otros autores(168, 408), las ecuaciones propuestas para la determinación de la pérdida de
proteína diaria (mg/kg) en orina, según el método utilizado en su cuantificación son las
siguientes:
- 55 -
- Método de CBB: 3,1 + (19,2 x U P/C)
- Método de TCA-PS: 2,8 + (28,72 x U P/C)
Esto ocurre porque la concentración de proteína y de creatinina en la orina se
ven afectadas por la concentración total de solutos y con su cociente no ocurre lo
mismo(103). Además, cuando la función renal es estable, los mecanismos de filtración
glomerular y concentración tubular afectan de igual forma a la proteína y creatinina(67,
250)
.
Sin embargo, a medida que el cociente U P/C excede de un valor estimado de 5
en el perro(2), la correlación entre las dos metodologías es menos consistente y es
posible que el contenido de proteínas en la orina de 24 horas sea un indicador más
seguro y preciso de la pérdida de proteínas(195).
El U P/C sólo se correlaciona con la excreción de proteína en 24 horas en los
casos en que(250):
* El grado de filtración glomerular es estable.
* La pérdida de proteína durante un período de 24 horas es constante.
* La filtración glomerular y la concentración tubular de orina afectan de igual
forma a la proteína y a la creatinina.
* No exista proceso inflamatorio del tracto urinario o no sea significativo el
sedimento urinario(10, 15).
Todo esto puede no ser aplicable bajo ciertas condiciones. P. ej., si el ritmo de
administración de fluidos supera al de producción de orina hay un aumento de la
filtración glomerular(374). También el fallo renal agudo se asocia con cambios rápidos y
- 56 -
significativos en el grado de filtración glomerular. En estos casos, el U P/C contribuye a
determinar el grado de compromiso glomerular. Como consecuencia de la rapidez de
estos cambios, calcular la pérdida proteica diaria a partir del U P/C puede conducir a
error(250).
El método y tiempo de recolección de la muestra de orina, sexo del animal, si
éste está confinado en una caja metabólica y el contenido proteico de la dieta tienen
poco efecto sobre el U P/C(203, 263). Por tanto, estas variables no son importantes en la
interpretación clínica del U P/C. Por otro lado, los gatos excretan creatinina únicamente
por filtración glomerular(136), mientras que los perros machos también eliminan
creatinina por secreción tubular(291, 335). Esta secreción normalmente es mínima pero se
incrementa al aumentar la concentración de creatinina sérica(373). Por esto, los cocientes
U P/C pueden ser menores de lo esperado en perros machos con fallo renal azotémico
de moderado a grave(250).
Las propiedades selectivas del glomérulo en cuanto a tamaño y carga y las
fuerzas hemodinámicas que intervienen a nivel de los capilares glomerulares influyen
en el movimiento de proteína a través de estos últimos. Esas fuerzas hemodinámicas
son importantes por, al menos, dos razones: una perfusión normal mantiene una carga
negativa a través de las paredes de los capilares glomerulares y la cantidad de proteína
que se pierde por orina se relaciona con la cantidad que llega al glomérulo. En animales
con hipoalbuminemia grave, el volumen vascular está disminuido por reducción de la
presión osmótica coloidal. Consecuentemente también se reduce el grado y la cantidad
de proteína que atraviesa el glomérulo, se pierde menos proteína por la orina y el U P/C
puede ser más pequeño que con un volumen vascular normal(250). En este caso, la
hipoalbuminemia interferirá en el uso del cociente U P/C para detectar alteraciones
- 57 -
glomerulares y monitorizar a animales con evidencia de progresión de la enfermedad
renal(67).
Los factores que podrían influir en el U P/C son:
1.- Momento del día: los primeros estudios realizados con orina recogida
entre las 10 AM y las 2 PM demostraron una buena correlación entre el U P/C y los
valores obtenidos en muestras recogidas en 24 horas(408). Estudios posteriores también
encontraron excelente correlación en muestras obtenidas a lo largo del día(168), así como
entre muestras recogidas en el día y en la noche(263).
2.- Método de recogida de la orina: no se encontraron diferencias
significativas en la concentración de proteína de muestras recogidas por micción
voluntaria, cistocentesis o sondaje uretral. Sin embargo, en la orina recogida por
micción voluntaria se encontró mayor concentración de proteína en machos que en
hembras. Como entre muestras obtenidas por cistocentesis no se obtuvieron esas
diferencias, se llegó a la conclusión de que la mayor concentración de los machos se
debe a la adición de proteína desde el tracto urinario inferior(17). En un estudio realizado
por Grauer et al.(168) en 1985, se midió la correlación entre la excreción de proteína
urinaria (en 24 horas) y el U P/C de orinas obtenidas al azar por micción voluntaria en
16 perros sanos y en 14 perros con sospecha de proteinuria renal. Los resultados
obtenidos indican que muestras elegidas al azar y recogidas por micción voluntaria
pueden utilizarse para determinar el U P/C y reflejar la pérdida de proteína en 24 horas.
3.- Dieta: se ha demostrado que la proteína dietética aumenta el
aclaramiento de creatinina. Un aumento proporcional en la proteinuria no causaría
cambio en el U P/C, mientras que un cambio desproporcional en la proteinuria,
- 58 -
comparada con el aclaramiento de creatinina, podría alterar el U P/C(134). Un aumento
de la ingesta proteica no afecta significativamente al cociente P/C en perros con fallo
renal crónico(140) o en perros viejos con un único riñón(139).
4.- Hemorragia: la llegada de sangre a la orina hipotónica provoca hemólisis
y la hemoglobina, así como las proteínas plasmáticas que se pierden con la hemorragia,
aumentan el cociente U P/C(134). A pesar de la contaminación con sangre que existe en
la recogida de orina por sondaje uretral (el sedimento muestra 5-20 eritrocitos/campo),
el cociente es fiable en casos de proteinuria renal grave(10).
5.- Inflamación: la inflamación del tracto urinario inferior aumenta
significativamente el cociente U P/C. Sin embargo, un cociente > 2,0 acompañado de
un sedimento de tipo inflamatorio indica proteinuria patológica del tracto urinario
superior(9).
6.- Infección: en un estudio realizado por Bagley et al.(9) se demostró que
una infección del tracto urinario inducida experimentalmente (por E. coli) aumenta el
cociente U P/C, aunque la magnitud de este aumento no se correlaciona bien con los
recuentos de eritrocitos y leucocitos en orina.
7.- Ejercicio: en personas, un ejercicio físico intenso causa proteinuria
temporal(134). La natación incrementa levemente la proteinuria mientras que la carrera
no produce ninguna variación(250).
8.- Fármacos: la administración de prednisona a perros sanos aumenta el
cociente P/C urinario a valores de 1,2 en un mes y 0,9 en 42 días(404).
- 59 -
Los valores considerados normales del U P/C varían entre distintos
laboratorios porque usan técnicas diferentes para analizar la proteína urinaria. Los
intervalos dados por distintos autores son: 0,01-0,38(67); 0,0-0,31(263); 0,02-0,14(168) y
0,08-0,54(408), aunque Jergens et al.(203) obtuvieron valores situados entre 0,08-1,18.
Según Lulich y Osborne(250) debe valorarse el U P/C de la siguiente forma:
* 0-0,5 = normal
* 0,5-1 = cuestionable
* > 1 = patológico
Otros autores sugieren esta norma(195):
* < 0,5 = normal
* 0,5-1 = importancia dudosa. Repetir la medida.
El cociente U P/C no debe valorarse como algo individual sino en combinación
con otras pruebas diagnósticas. El U P/C aumentado en ausencia de hematuria o
inflamación del tracto urinario sugiere proteinuria prerrenal o renal(134). Aunque la
hematuria microscópica origina reacciones positivas persistentes a proteínas en pruebas
cualitativas, la contaminación urinaria con sangre debe ser importante para que cause
un incremento considerable del cociente U P/C(10).
Posiblemente, la magnitud de la proteinuria glomerular sea un indicador del
daño de la barrera de filtración y, de este modo, cocientes cada vez mayores sugieran
una gravedad creciente de la enfermedad(195). El U P/C no puede diferenciar la
proteinuria asociada a disfunción glomerular de los aumentos en la concentración
plasmática de proteínas de bajo peso molecular (hemoglobina, mioglobina y proteína de
- 60 -
Bence-Jones) o de la exudación de proteínas plasmáticas o tisulares. Así, junto con el
U P/C es necesario el uso de otros tests para descartar proteinuria preglomerular (test
para hemoglobinemia, aumentos en la concentración de globulinas plasmáticas o en la
de creatin fosfoquinasa sérica), y proteinuria postglomerular (cultivo de orina o análisis
del sedimento) y otros para confirmar la existencia de proteinuria glomerular (albúmina
y creatinina sérica y albúmina urinaria). Si no existe hiperproteinemia y no se
encuentran células anormales en el sedimento, un U P/C alto es una fuerte evidencia de
disfunción glomerular(250).
En la evaluación de casos de enfermedad glomerular con evidencia
microscópica de glomeruloesclerosis o atrofia por varias causas, a menudo el U P/C es
inferior a 5 mientras que U P/C situados entre 5 y 13 a menudo se asocian con
glomerulopatía no amiloide(250).
En muchos casos de enfermedad postglomerular, el U P/C no ofrece ventajas
con respecto a los resultados de un urianálisis completo. La interpretación del U P/C se
basa en suponer que, tanto la proteína como la creatinina, se encuentran influidas de
forma similar por los mecanismos de filtración glomerular y concentración tubular. En
animales con proteinuria postglomerular, sin embargo, este exceso de proteína no se ha
filtrado por el glomérulo o se asocia con defectos en la reabsorción tubular de proteínas.
En aquellos casos de hemorragia o inflamación postglomerular el grado de excreción de
creatinina es distinto del de proteína. U P/C elevados en pacientes con enfermedad
postglomerular obligarían a considerar la existencia de proteinuria glomerular; sin
embargo, se requieren estudios complementarios para confirmar que exista una
combinación de ambos desórdenes. Se han observado U P/C superiores a 10 en
animales con infección estafilocócica del tracto urinario inferior(250).
- 61 -
Aunque la magnitud de la proteinuria puede predecir el origen de la proteína
urinaria, existe gran variabilidad entre los cocientes. Como guía general se puede usar
lo siguiente:
U P/C < 0,5: Normal(67, 250).
U P/C = 0,5-1,0: Puede ser normal, pero se sospecha de enfermedad moderada(67,
250)
.
U P/C = 1,0-5,0: Pérdida de proteína media. Sugiere enfermedad prerrenal(67,
250,
, glomerular moderada o postglomerular(366).
366)
U P/C = 5,0-13,0: Pérdida de proteína de media a moderada. Sugiere enfermedad
postrenal, aunque existen lesiones glomerulares que pueden dar valores en este
rango(67, 250) como glomerulonefritis o glomeruloesclerosis progresivas(195).
U P/C > 13,0: Pérdida de proteína grave. Normalmente aparece en casos de
proteinuria glomerular (los animales con amiloidosis tienden a tener los valores más
altos)(67, 250) y también aparece en casos de glomerulonefritis grave(195, 366).
II.4.3.2.1.4.- Otras determinaciones
La determinación de cetonas, bilirrubina y urobilinógeno es útil para el
diagnóstico de determinadas patologías, pero no para procesos que cursen con daño
renal y, consecuentemente, con proteinuria(262).
- 62 -
El pH y la concentración de glucosa de la orina ayudan en el diagnóstico de
patologías poco frecuentes como la acidosis tubular renal en el primer caso, y el
síndrome de Fanconi en el segundo(72).
La existencia de sangre oculta indica la presencia de hemoglobina en la orina
y, aunque hay muchas causas no renales de hemoglobinuria, la principal causa renal es
la hematuria(414). La hemólisis, generalmente, va acompañada de glóbulos rojos en el
sedimento urinario(72). Los hematíes se lisan extravascularmente a consecuencia de una
alcalinidad elevada o de la dilución de la orina(290). En ocasiones puede existir
hematuria, con una sangre oculta en orina negativa, si los eritrocitos no se han roto
como ocurre en una orina concentrada(262).
II.4.3.2.2.- Excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo
La excreción de determinados electrolitos en la orina puede ser útil para
valorar el grado de reabsorción o secreción tubular y, por tanto, evaluar la funcionalidad
tubular(163) y relacionarla con la aparición en la orina de proteínas de bajo peso
molecular(22). La excreción fraccional de un electrolito se define como la proporción de
ese electrolito que escapa a la reabsorción tubular y aparece en la orina(135). Su cálculo
se lleva a cabo relacionando el aclaramiento del electrolito y el de la creatinina
mediante la fórmula(158):
Excreción fraccional y = (Uy x Pcr) / (Ucr x Py) x 100
* y = electrolito a determinar su excreción fraccional.
* Uy = concentración del electrolito en orina (mg/dl).
* Pcr = concentración plasmática de creatinina (mg/dl).
- 63 -
* Ucr = concentración de creatinina en orina (mg/dl).
* Py = concentración plasmática del electrolito (mg/dl).
El cálculo de las distintas excreciones fraccionales presenta la ventaja de no
necesitar un período de tiempo de recolección de orina, aunque debe ser realizado tras
un período de ayuno de 12-15 horas porque la ingesta de alimento y la reabsorción
intestinal pueden influir en su determinación(163). Los valores elevados de la excreción
fraccional pueden indicar disfunción tubular; p. ej. en el síndrome de Fanconi aumentan
las excreciones fraccionales de todos los electrolitos. Aunque sus valores deben
interpretarse con cautela ya que su aumento puede proceder también de la necesidad de
mantener la homeostasis del organismo, p. ej. en casos en los que la masa funcional
renal se encuentra reducida(137).
II.4.3.2.3.- Sedimento urinario
El análisis del sedimento urinario ayuda en la localización de las lesiones del
tracto urinario cuando éstas no van acompañadas de proteinuria(132). Por otro lado,
cuando se detecta una reacción positiva a proteínas en un análisis de orina rutinario es
necesario valorar el sedimento urinario(195). Si hay piuria debe enviarse una muestra de
orina para cultivo de bacterias(73, 231, 338). En caso de hematuria es necesario valorar las
causas de hemorragia de vías urinarias. Un resultado positivo de sangre oculta, sin
eritrocitos intactos en el sedimento, podría indicar hemólisis en una muestra no
procesada a tiempo. A veces está indicado hacer pruebas específicas para detectar
hemoglobinuria o mioglobinuria(195).
La proteinuria debida a exudado inflamatorio puede identificarse por examen
microscópico del sedimento urinario. Un sedimento activo (piuria y hematuria)
- 64 -
generalmente se asocia a proteinuria postglomerular(366). Este hecho ocurre en procesos
inflamatorios o neoplásicos del tracto urinario superior o inferior. La existencia sólo de
hematuria, sin piuria, se asocia a neoplasia(411), inflamaciones del tracto urinario,
trauma, urolitiasis, nefrolitiasis, enfermedad del riñón poliquístico (por erosión de
vasos) y coagulopatías. La presencia de cilindros leucocitarios o eritrocitarios
confirmaría el daño renal. Sin embargo, estos cilindros tienden a desintegrarse en orinas
diluidas y son difíciles de encontrar(15).
El hallazgo de cilindros sugiere enfermedad renal(202,
290, 296)
, aunque revela
muy poco acerca de la gravedad o reversibilidad de las lesiones renales(296). Los
cilindros son estructuras constituidas principalmente por mucoproteína, también
llamada mucoproteína de Tamm-Horsfall(342), secretada por las células epiteliales que
tapizan las asas de Henle, túbulos distales y colectores(344). En caso de enfermedad
glomerular es frecuente la presencia de cilindros granulosos e hialinos(241), sobre todo
de los segundos(102). Los cilindros granulosos aparecen por degeneración de células en
otros cilindros o por precipitación de proteínas plasmáticas filtradas y sugieren daño
tubular nefrotóxico(103). Los cilindros hialinos son frecuentes en casos de proteinuria
(glomerulonefritis y amiloidosis) porque son precipitados puros de la mucoproteína de
Tamm-Horsfall(103, 193, 296) y de albúmina(103). Los cilindros de grasa son raros en el
perro. En presencia de hipercolesterolemia aparecen por la degeneración tubular
siguiente a la ingestión por las células del epitelio y posterior metabolismo de los
lípidos filtrados a través del glomérulo dañado(41) y aparecen en casos de diabetes
mellitus y síndrome nefrótico(103).
Una proteinuria significativa con pocas células en el sedimento sugiere
procesos que no implican inflamación activa del tracto urinario. En esta situación la
- 65 -
evaluación del U P/C, para cuantificar la pérdida de proteína, ayudará a determinar la
magnitud de la proteinuria y su lugar de procedencia(15).
II.4.4.- Otros métodos complementarios de diagnóstico
La medida cualitativa y cuantitativa de proteínas urinarias proporciona
información clínica adicional, pero no tiene valor pronóstico real. Esto hace necesario el
examen histológico del riñón para el diagnóstico final(23, 31) aunque, en personas, parece
ser que la biopsia renal no tiene valor como guía terapéutica en pacientes
proteinúricos(237).
La biopsia renal en perros está indicada cuando es necesario obtener
información más específica sobre la causa, duración y gravedad de una afección o
insuficiencia renal. Los datos obtenidos de esta manera pueden modificar el tratamiento
del caso. Sin embargo, cabe señalar que las enfermedades renales no necesariamente se
correlacionan con la función renal. El objetivo de la biopsia renal es obtener una
muestra diagnóstica del riñón y, a la vez, minimizar el riesgo que supone la anestesia,
una hemorragia o el daño renal inducido por el procedimiento quirúrgico(195). La biopsia
también está indicada en animales no azotémicos o con azotemia moderada y con
proteinuria grave y persistente(366) y en aquellos con proteinuria glomerular idiopática
que persiste o progresa a pesar de la terapia(195). No es necesaria en animales que
muestran algún grado de fallo renal crónico, porque éste es irreversible y no informa del
pronóstico cualquiera que sea la causa originaria(15).
La biopsia renal permite diferenciar la insuficiencia renal aguda de la
crónica(389), determinar la causa específica de la enfermedad renal, como pielonefritis o
toxicidad por etilenglicol, y caracterizar y diferenciar lesiones glomerulares que causan
- 66 -
nefropatía con pérdida de proteínas(195) como la glomerulonefritis y la amiloidosis
renal(15,
100, 164)
. En los perros de raza distinta a la Shar Pei la amiloidosis es,
principalmente, una enfermedad glomerular que se diagnostica por biopsia de la corteza
renal. En perros de raza Shar Pei con amiloidosis familiar, el depósito amiloide puede
ser medular sin afección glomerular. En estos casos el proceso puede ser difícil de
comprobar, a menos que se obtenga suficiente muestra de tejido medular(100, 110).
Esta técnica, no obstante, no es un test diagnóstico para usar ligeramente. La
biopsia percutánea guiada por ecografía es el método de elección(52, 201) aunque lleve
aparejados algunos riesgos(366). La mayoría de los animales presentan hematuria
microscópica durante 1 a 3 días después de la biopsia. La mayor complicación que tiene
es la aparición de hemorragia aunque esto ocurre en menos de un 3% de los casos y,
generalmente, asociada a fallos en la técnica empleada. Antes de su realización debería
efectuarse un análisis hematológico completo con recuento de plaquetas incluido(166).
La biopsia renal está contraindicada en casos de coagulopatías, un único riñón,
hipertensión sistémica grave y lesiones renales asociadas con acúmulo de líquido
(hidronefrosis, quistes o abscesos)(146, 166).
II.5.- COMPLICACIONES
Los individuos que presentan proteinuria grave tienden a padecer trombosis,
aunque es más común en perros con amiloidosis renal (la pérdida de proteína es mayor)
que en casos de glomerulonefritis(66). Son propensos a tromboembolismos por el estado
de hipercoagulabilidad en el que se encuentran como consecuencia de lo siguiente:
- 67 -
1.- Pérdida en la orina de antitrombina III, lo que provoca la activación de los
factores de coagulación IX, X, XI y XII(1, 120, 173, 323).
2.- Activación de la agregación plaquetaria por la hipoalbuminemia y la
hipercolesterolemia(1, 323, 324).
3.- Aumento de la producción de fibrinógeno proporcional a la pérdida de
proteína y a la hipercolesterolemia(1, 120, 323).
4.- Aumento de los factores de coagulación V y VI para compensar la
disminución de la presión oncótica como consecuencia de la proteinuria(323).
5.- Reducción de la fibrinolisis por disminución de la concentración de sus
inhibidores(1, 120, 323).
6.- Pérdida en la orina de la proteína S, co-factor de la proteína C que
neutraliza los factores de la coagulación Va y VIIIa(86, 245, 252).
La concentración sérica de antitrombina III se relaciona estrechamente con la
de albúmina porque tienen pesos moleculares parecidos y su pérdida a través del
glomérulo dañado también será similar. Por eso, en lugar de medir la antitrombina
podemos determinar la albúmina y pronosticar el riesgo de padecer tromboembolismo,
cifrado en los perros en concentraciones séricas de albúmina inferiores a 2 g/dl(80).
La manifestación más frecuente es el tromboembolismo pulmonar(213),
caracterizado por la aparición aguda de disnea grave, taquipnea y cianosis y por
radiografías torácicas normales en esta primera fase. Otras localizaciones del trombo
- 68 -
pueden ser aorta abdominal(366), vasos mesentéricos y coronarios y en la bifurcación de
la aorta(80). Lógicamente, las manifestaciones clínicas dependerán del tamaño y
localización del trombo. Las complicaciones tromboembólicas en animales con
síndrome nefrótico conllevan mal pronóstico(366).
En
animales
con
proteinuria
a
veces
se
observa
hiperlipidemia
(hipercolesterolemia e hipertrigliceridemia)(48). Se produce un aumento en la síntesis
hepática de lípidos y una disminución de su catabolismo como respuesta a la
disminución de la presión oncótica plasmática y/o a la pérdida urinaria de una proteína
reguladora de su catabolismo(29). El grado de hiperlipidemia, en condiciones de ayuno,
se relaciona directamente con el de hipoalbuminemia(48). Así, en animales con síndrome
nefrótico, la concentración plasmática de albúmina es inversamente proporcional a la de
colesterol(13). La concentración de lípidos y colesterol aumenta cuando desciende la de
albúmina al estimularse la síntesis hepática de lipoproteínas de baja densidad(6).
Además, disminuye el catabolismo hepático de lipoproteínas por una función anormal
de la lipasa(166). Estudios hechos en personas y ratas demuestran que la
hipercolesterolemia es un factor de riesgo para el padecimiento de gran variedad de
procesos vasculares, incluyendo la enfermedad renal progresiva(211). En los perros,
también existe esta asociación pero aún no se ha establecido una relación
causa-efecto(48).
La hipertensión sistémica es una complicación, en seres humanos, que
contribuye a la pérdida progresiva de la funcionalidad renal(149). En perros con
proteinuria persistente se puede observar una prevalencia de hipertensión sistémica de
un 80%(84). Se produce por la combinación de una serie de factores: retención de sodio,
fibrosis vascular glomerular, alteración en la liberación de vasoditadores renales y
activación del sistema renina-angiotensina-aldosterona. En perros con sospecha de
- 69 -
enfermedad glomerular se debe monitorizar la presión sanguínea, pues el control de la
hipertensión puede retrasar la progresión de la enfermedad(166).
La retención de sodio es otra complicación de una proteinuria masiva. La
disminución de la presión oncótica por la hipoalbuminemia provoca la aparición de
edema. El descenso resultante del volumen plasmático y del gasto cardíaco estimula el
sistema renina-angiotensina-aldosterona, causando retención de agua y sales y
favoreciendo aún más la formación de edema. Sin embargo, la concentración de
aldosterona frecuentemente es normal o incluso baja en personas con síndrome
nefrótico y el tratamiento con inhibidores de la enzima conversora de angiotensina no
siempre previene la retención de sodio. Por tanto, parece ser que actúan mecanismos
intrarrenales, independientes de la aldosterona, que estarían basados en el aumento de la
reabsorción de sodio a nivel distal de la nefrona o en un defecto en la filtración
glomerular de agua y sodio(166).
En casos de proteinuria grave encontramos alteraciones en la farmacocinética.
Así, por ejemplo, en pacientes proteinúricos, el volumen de distribución de los
fármacos puede estar aumentado resultando en concentraciones plasmáticas
subterapéuticas(48).
Por último, en la orina también se pueden perder sustancias ligadas a proteínas:
- La pérdida urinaria de hierro podría provocar anemia microcítica e
hipocrómica, y la de zinc interferir con la cicatrización de heridas o la función
inmune(48).
- 70 -
- La pérdida de la globulina transportadora de calcitriol puede interferir con
el metabolismo de la vitamina D, aumentando los niveles plasmáticos de la
paratohormona(159).
- La pérdida de la globulina transportadora de la hormona tiroidea puede
interferir con el metabolismo de la misma(127).
- La pérdida de inmunoglobulinas aumenta la susceptibilidad a las
infecciones bacterianas, particularmente en animales con inmunosupresión inducida por
procesos víricos(48).
II.6.- PRONÓSTICO
El pronóstico, en caso de proteinuria, es muy variable y depende de su
etiología. En ocasiones aparece una proteinuria media y temporal de causa desconocida,
que no requiere investigación a menos que se vea perjudicada la función renal o
aparezcan alteraciones en la bioquímica sérica o en el sedimento urinario. La
proteinuria prerrenal o postrenal normalmente es reversible con una terapia específica a
menos que la etiología sea neoplásica. El pronóstico, en casos de proteinuria renal
inmunomediada, depende de la localización de la fuente antigénica. En algunos casos,
el tratamiento de una infección, extirpar una masa neoplásica o interrumpir una terapia
lleva a la resolución completa de la proteinuria. Sin embargo, en la mayoría de los
casos, el proceso causante de la proteinuria no se encuentra y la lesión se denomina
idiopática. Se ha descrito la resolución espontánea de la proteinuria pero en la mayor
parte de los casos se produce daño renal importante(15). El pronóstico de la proteinuria
glomerular es reservado, con una esperanza de vida de aproximadamente un mes en
- 71 -
algunos perros con enfermedad primaria, aunque no hay correlación entre los datos
bioquímicos en el inicio del proceso y el tiempo de vida media. A diferencia de los
casos con patologías estrictamente tubulares, el final del proceso en las glomerulares es
impredecible. Factores como la aparición de trombosis, ascitis o emaciación pueden
complicar el proceso(80). La glomerulonefritis puede tener un curso clínico variable
caracterizado por la remisión clínica del proceso o bien, por una función renal estable
durante un periodo de tiempo largo. La amiloidosis, por el contrario, generalmente es
un enfermedad progresiva y con un desenlace fatal(166). Como el daño renal es casi
inevitable en estos casos, es importante que se establezca el tratamiento antes de que se
desarrolle el fallo renal. Cuando éste se presenta el pronóstico es malo(15).
La cuantificación de proteínas permite seguir la progresión de la enfermedad
renal y la respuesta a la terapia(31). Se debe tener en cuenta que en procesos
glomerulares, debido a la continua reducción del grado de filtración glomerular y a la
hipoalbuminemia progresiva, la disminución de la pérdida diaria de proteínas no
necesariamente implica mejoría del animal ya que puede reflejar un deterioro de la
funcionalidad renal(325). Es necesario valorar la estabilidad del cociente U P/C día a día
en pacientes con función renal estable, aunque este cociente no sirve para vigilar la
progresión de la enfermedad cuando la filtración glomerular cambia con rapidez
(p. ej. en insuficiencia renal aguda). Deben vigilarse la densidad urinaria y la creatinina
sérica porque la disminución de la filtración glomerular, que acompaña al deterioro de
la función renal, provoca la disminución del cociente U P/C. En tanto no se disponga de
más datos, la estimación de la progresión de la enfermedad y los cambios terapéuticos
consecuentes deben basarse en el contenido de proteínas en la orina de 24 horas o en lo
observado en el muestreo repetido del U P/C más que en uno o dos datos clínicos(195).
- 72 -
II.7.- TRATAMIENTO
El tratamiento debe ir encaminado a la causa que provoca la pérdida de
proteína y a controlar los signos clínicos derivados de ella(142). En casos, por ejemplo,
de glomerulonefritis, la producción de inmunocomplejos depende de la presencia del
antígeno. Es el caso de procesos como dirofilariosis, ehrlichiosis(164) y pioderma
bacteriana(20,
95)
. Sin embargo, a veces no se determina la causa que provoca la
proteinuria o, una vez identificada, no se puede eliminar y, por tanto, la terapia va
encaminada a impedir que la enfermedad progrese(142).
El tratamiento consiste en lo siguiente:
1.- La proteína de la dieta afecta directamente a la excreción renal y a la
síntesis hepática de proteínas(210). En muchos animales, la restricción de proteínas
modifica muy poco la concentración plasmática de albúmina porque disminuye, en
igual medida, su síntesis hepática y la excreción renal de proteína(48,
316)
. Para
compensar la albuminuria se ha utilizado la proteína del huevo pero se ha demostrado
que restringir el contenido proteico al del huevo provoca acidosis metabólica
hiperclorémica(313). Conocer la pérdida proteica diaria permite estimar la proteína
necesaria en la dieta para mantener la homeostasis de la albúmina. Sin embargo, la
suplementación dietética con proteína, en animales proteinúricos, se cuestiona porque
puede contribuir a la progresión de la enfermedad glomerular y a la proteinuria(61, 164, 221,
268, 350)
. El aumento de la ingesta proteica aumenta la perfusión renal pero la
hiperfiltración que conlleva daña los capilares glomerulares, perpetúa la proteinuria(44,
311, 313)
y conduce finalmente a una glomeruloesclerosis. Por tanto, se debe reducir
moderadamente la ingesta proteica utilizando una proteína de alta calidad(166) y
aportando, inicialmente, de 2 a 2,5 g de proteína/kg/día(315). En el tratamiento dietético
- 73 -
de estos animales es necesario un control periódico del peso corporal, concentración de
albúmina sérica y excreción de proteína en la orina(47, 250).
2.- La proteinuria grave da lugar a malnutrición proteica y a retención de
líquidos con la aparición de edema o ascitis(48). Los animales con síndrome nefrótico
pueden retener sodio, lo que contribuye a la ascitis, el edema, la hipertensión y la
ganancia de peso(67, 104). En el control de la retención de sodio y la hipertensión se puede
utilizar furosemida (2-4 mg/kg/8 h) y restringir la ingesta de sodio (0,1-0,3% de la
dieta) para retrasar la progresión de los signos clínicos(142).
3.- Los fármacos antihipertensivos reducen la proteinuria mediante sus efectos
a nivel de presión arterial sistémica, flujo sanguíneo en el glomérulo o permeabilidad
selectiva glomerular(48). Los inhibidores de la enzima conversora de angiotensina
(IECA) y los antagonistas de los canales de calcio disminuyen la proteinuria, aunque los
últimos provocan glomeruloesclerosis. Los IECA reducen la proteinuria sin afectar a la
síntesis hepática de proteínas e independientemente de la ingestión de proteína con la
dieta(51). Basan su acción en la vasodilatación que provocan en la arteriola eferente del
glomérulo, lo que disminuye la filtración glomerular(49). Parece demostrado que en
seres humanos, la administración de IECA atenúa la proteinuria por disminuir el
tamaño de los poros capilares del glomérulo y, además, mejora el metabolismo de las
lipoproteínas. El depósito de lípidos en el mesangio glomerular puede contribuir a la
proteinuria y a la aparición de glomeruloesclerosis(164).
4.- Los antiinflamatorios no esteroides disminuyen la producción de
prostaglandinas vasodilatadoras que actúan en la arteriola aferente del glomérulo(49).
Reducen la tasa de filtración glomerular y, consecuentemente, la pérdida de proteínas.
Sin embargo, su uso es limitado debido a su toxicidad a nivel gastrointestinal y renal(48).
- 74 -
5.- Existe controversia respecto a la utilización de agentes esteroides e
inmunosupresores para tratar procesos glomerulares aunque pueden ser de gran valor
porque, por ejemplo, muchas glomerulonefritis caninas son inmunomediadas(202). Se
han
utilizado,
clínica
y
experimentalmente,
corticoesteroides,
azatioprina,
ciclofosfamida y ciclosporina para impedir la producción de inmunoglobulinas por los
linfocitos B o para alterar la función de los T(164). En todos los casos y, más
concretamente, en el de la ciclosporina, la frecuencia de aparición de efectos
secundarios desaconseja su uso(390). Entre estos efectos secundarios encontramos la
inhibición de la respuesta de los tejidos a la agresión, el empeoramiento de la uremia
por los efectos catabólicos de los glucocorticoides y, por último, la formación de
complejos inmunes activos que aumentan el daño glomerular(202). Aún así, si se utilizan
agentes inmunosupresores se debe controlar el cociente P/C urinario mensualmente y
suspender su administración al aumentar la proteinuria(164). En seres humanos con
amiloidosis reactiva se ha obtenido buenos resultados con terapia citotóxica basada en
clorambucil, ciclofosfamida y azatioprina(376).
En perros con glomerulonefritis se cuestiona el uso de corticoides por la
asociación que existe entre hiperadrenocorticismo o administración de corticoides
prolongadamente y glomerulonefritis(404) y tromboembolismo, así como por la falta de
respuesta terapéutica a su uso. La excepción se produce en aquellos casos en los que el
proceso primario responde al tratamiento con corticoides como en el lupus eritematoso
sistémico(166).
6.- En el tratamiento de la glomerulonefritis es fundamental disminuir la
respuesta glomerular a los complejos inmunes y para ello se está utilizando la
aspirina(324). Existen evidencias que demuestran que las plaquetas y tromboxanos
intervienen en la patogénesis de la glomerulonefritis y la aspirina, a bajas dosis, inhibe
- 75 -
selectivamente la producción de tromboxanos(164,
386)
. Esto se traduce en una
disminución de la proteinuria, de la infiltración de neutrófilos y, finalmente, de la
proliferación celular y depósito de fibrina en el glomérulo(167,
246)
. También se están
utilizando análogos de prostaglandinas y una suplementación dietética con ácidos
grasos omega-3 poliinsaturados para disminuir la síntesis de tromboxanos y
leucotrienos(164). Se ha demostrado que los ácidos grasos, en seres humanos con
síndrome nefrótico, disminuyen la hipertensión, las concentraciones de triglicéridos y
de colesterol y la agregación plaquetaria(7, 177).
7.- La medida de las concentraciones de antitrombina III y de fibrinógeno es
necesaria para determinar qué individuos deben ser tratados por problemas de
hipercoagulabilidad. Los perros con concentraciones de antitrombina III inferiores al
70% de lo normal y de fibrinógeno superiores a 300 mg/dl son candidatos a la terapia
anticoagulante(164). Para ello se han utilizado agentes antiplaquetarios, heparina y
cumarinas(324). Si se usa warfarina, su dosis debe individualizarse monitorizando el
tiempo de protrombina. La aspirina a dosis bajas se administra fácilmente en el
tratamiento ambulatorio y no requiere monitorización especial como las cumarinas, por
eso es el tratamiento anticoagulante de elección. En casos de glomerulonefritis, una
consecuencia que aparece es el acúmulo de fibrina en el glomérulo, por lo que el
tratamiento anticoagulante cumpliría un doble propósito(164).
8.- En el tromboembolismo se han utilizado, experimentalmente, en medicina
veterinaria agentes fibrinolíticos: estreptoquinasa y uroquinasa(213,
215)
. Pero estas
sustancias son caras para su uso en veterinaria(324) y su acción inespecífica puede
potenciar la hemorragia espontánea(333).
- 76 -
9.- El uso del dimetilsulfóxido (DMSO) en el tratamiento de la amiloidosis en
el perro es controvertido. Los beneficios obtenidos con él incluyen la solubilización de
las fibrillas amiloides, disminución de la concentración sérica de su precursor (proteína
sérica AA) y la reducción de la inflamación intersticial y la fibrosis de los riñones
afectados. Por otro lado, su administración produce efectos secundarios no deseables
como náuseas, anorexia y disminución de la ingesta de agua(166).
10.- La colchicina entorpece la liberación de la proteína sérica AA por los
hepatocitos al cerrar los microtúbulos e impedir su secreción y, por tanto, es utilizada en
el tratamiento de la amiloidosis. Sin embargo, no existe evidencia de que su efecto sea
beneficioso una vez que el proceso ha dado lugar a fallo renal(166). La colchicina es un
poco tóxica en seres humanos y entre sus efectos secundarios nos encontramos con
vómitos, diarrea y nauseas(238).
Existen tratamientos experimentales para la amiloidosis con terbutalina y
aminofilina, porque aumentan la adenosín monofostato cíclica e inhiben el depósito
amiloide(42).
Otra
terapia
experimental
se
está
realizando
con
4’-yodo-4’-deoxydoxorubicina, pues inhibe la formación de las fibrillas amiloides y
favorece la reabsorción de los depósitos de amiloide asociados a inmunoglobulinas(155).
Estos tratamientos no se han aplicado aún en la clínica de pequeños animales(166).
- 77 -
III. MATERIALES Y MÉTODOS
III. Materiales y métodos
III.1.- MATERIALES
III.1.1.- Material animal
En el presente trabajo se han utilizado 47 perros de diferente sexo, raza y edad,
aunque todos ellos adultos, procedentes de la Consulta Pública de Patología Médica del
Hospital Clínico Veterinario de la Universidad de Extremadura, donde se les
diagnosticó uno de los siguientes procesos: piometra, leptospirosis o leishmaniosis.
Concretamente, la distribución de patologías y número de animales fue la siguiente: 15
perros presentaron piometra, 10 leptospirosis y 22 leishmaniosis. Además se han usado,
como grupo control, 20 perros sanos procedentes de particulares de nuestro ámbito de
trabajo. La reseña de los distintos animales se presenta en las TABLAS 1, 2, 3 y 4.
PERRO
Raza
Sexo
Edad (meses) Peso (kg) Hábitat
Alimentación
1
cruce
hembra
60
35
perrera
pienso
2
Podenco
hembra
36
19
perrera
pienso
3
Podenco
hembra
36
13
perrera
pienso
4
Podenco
hembra
48
14
perrera
pienso
5
cruce
hembra
72
33
chalet
pienso
6
cruce
hembra
84
45
chalet
pienso
7
Mastín
hembra
90
43
patio
pienso
8
Pitbull Terrier
hembra
38
24
piso
pienso
9
Cocker
hembra
50
10
piso
pienso
10
Doberman
hembra
26
24
piso
pienso
11
cruce
macho
39
24
perrera
pienso
12
Rottweiler
macho
12
42
chalet
pollo, arroz, pienso
13
Mastín
macho
66
44
chalet
pienso
- 79 -
14
Pastor Alemán
macho
132
36
chalet
pienso
15
Pitbull Terrier
macho
30
26
casa
pienso, sobras
16
Pastor Alemán
macho
20
32
perrera
pienso
17
Bobtail
macho
60
33
casa
pienso
18
Boxer
macho
49
36
piso
pienso
19
Boxer
macho
19
28
piso
pienso
20
Boxer
macho
48
42
piso
pienso, casera
TABLA 1: reseña de los animales que forman el grupo control.
PERRO
Raza
Sexo
21
Siberian Husky
hembra
24
18
casa
pienso, latas, arroz
Podenco Ibicenco hembra
53
31
perrera
pan, pollo
22
Alimentación
23
Pastor Alemán
hembra
168
46
casa
pienso
24
cruce
hembra
36
34
finca
pienso
25
San Bernardo
hembra
48
46
chalet
pienso, sobras
26
cruce
hembra
100
16
piso
pienso
27
cruce
hembra
68
14
piso
pienso, huesos
28
Mastín
hembra
108
50
taller
pienso, sobras
29
Pastor Belga
hembra
87
24
chalet
pienso
30
Labrador
hembra
36
34
piso
pienso
31
Cocker
hembra
60
17
casa
pienso
32
cruce
hembra
132
38
casa
pienso, sobras
33
cruce
hembra
124
6
piso
pienso
34
cruce
hembra
96
10
piso
pienso
35
Pastor Alemán
hembra
120
25
chalet
pienso
TABLA 2: reseña de los animales que forman el grupo con piometra.
- 80 -
PERRO
Raza
Sexo
Alimentación
36
Mastín Napolitano
macho
45
55
piso
pienso
37
Epagneul Bretón
macho
24
16
chalet
arroz, pienso
38
cruce
macho
67
35
casa
pienso
39
Pastor Belga
macho
120
33
piso
pienso, latas, sobras
40
Cocker
macho
60
14
piso
pienso, pollo
41
Pitbull Terrier
hembra
16
25
chalet
pienso
42
cruce
macho
72
51
jardín
pienso, casera
43
cruce
hembra
132
12
parcela
casera
44
Siberian Husky
macho
108
23
casa
pienso
45
cruce
hembra
105
11
casa
arroz, carne
TABLA 3: reseña de los animales que forman el grupo con leptospirosis.
PERRO
Raza
Sexo
Alimentación
46
Pastor Belga
hembra
60
20
finca
huesos, pasta
47
Mastín
hembra
120
30
casa
pienso, casera
48
Dogo Alemán
macho
60
43
chalet
pienso
49
Pastor Belga
macho
96
28
chalet
pienso
50
Schnauzer
hembra
36
24
casa
pienso, carne
51
Bobtail
macho
60
33
parcela
sobras
52
Boxer
macho
30
26
casa
pienso
53
Pastor Alemán
macho
87
22
chalet
pienso
54
cruce
macho
61
30
parcela
pienso, casera
55
Setter Inglés
macho
108
20
casa
pienso, arroz, pollo
56
Sabueso Baviera
macho
29
20
finca
pienso
57
Cocker
hembra
139
13
casa
pienso
58
Rottweiler
hembra
17
27
casa
pienso
59
Pastor Alemán
macho
48
30
chalet
pienso
- 81 -
60
Braco Alemán
macho
28
27
casa
pienso, arroz, carne
61
Braco Alemán
hembra
24
22
patio
pienso, pollo
62
cruce
hembra
72
22
chalet
pienso
63
Pastor Alemán
hembra
38
22
parcela
pienso, huesos, carne
64
Braco Alemán
hembra
120
23
chalet
pienso
65
Teckel
macho
40
8
casa
latas, salchichas
66
Siberian Husky
macho
36
18
piso
pienso, casera
67
Pastor Collie
hembra
109
25
chalet
pienso, latas
TABLA 4: reseña de los animales que forman el grupo con leishmaniosis.
III.1.2.- Material de extracción y conservación de las muestras
III.1.2.1.- Sangre entera
- Alcohol de 96° y algodón.
- Banda hemostática de goma (banda Smarch).
- Jeringuillas estériles de 2 cc.
- Agujas hipodérmicas de calibre 21.
- EDTA tripotásico (laboratorios QCA).
- Tubos de ensayo de 5 cc.
III.1.2.2.- Plasma
- Alcohol de 96° y algodón.
- Banda hemostática de goma (banda Smarch).
- Jeringuillas estériles de 5 cc.
- Agujas hipodérmicas de calibre 21.
- 82 -
- Heparina sódica (laboratorios QCA).
- Centrifugadora Selecta, Centronic.
- Pipetas Pasteur.
- Tubos de polipropileno para microcentrífuga (laboratorios Sigma).
- Congelador Jouan, VX 530.
III.1.2.3.- Orina
- Sondas estériles para cateterización vesical de diferentes diámetros.
- Guantes de látex estériles.
- Povidona yodada (Betadine disolución quirúrgica).
- Jeringuillas estériles de 10 y de 20 cc.
- Gasas.
- Tubos de ensayo cónicos.
- Pipetas Pasteur.
- Tubos de polipropileno para microcentrífuga (laboratorios Sigma).
- Congelador Jouan, VX 530.
III.1.3.- Material analítico
III.1.3.1.- Sangre entera
- Analizador automático de sangre Sysmex, F 800.
- Disolución lisante de glóbulos rojos Quicklyser-II-TM QLS-200.
- Disolución diluyente Cellpack.
- 83 -
- Solución de limpieza de analizadores automáticos de sangre Manoresh.
- Técnica rápida de tinción para hematología Diff-Quick, comercializada por
laboratorios Baxter Dade AG.
- Portaobjetos.
- Aceite de inmersión.
- Microscopio Nikon, Labophot.
- Contador de células manual Crison, Leucoform 829.
III.1.3.2.- Plasma
III.1.3.2.1.- Determinación de alanín-aminotransferasa, fosfatasa
alcalina, urea, creatinina, bilirrubina total, calcio, fósforo, albúmina y proteínas
totales
- Kit para la determinación de alanín-aminotransferasa (ALT), comercializado
por los laboratorios Human y con referencia 12 012.
- Kit para la determinación de fosfatasa alcalina (ALP), comercializado por los
laboratorios Human y con referencia 12 017.
- Kit para la determinación de urea, comercializado por los laboratorios
Gernon y con referencia GN 70500.
- Kit para la determinación de creatinina, comercializado por los laboratorios
- Kit para la determinación de bilirrubina total, comercializado por los
laboratorios Gernon y con referencia GN 96125.
- Kit para la determinación de calcio arsenazo, comercializado por los
laboratorios Gernon y con referencia GN 12000.
- 84 -
- Kit para la determinación de fósforo, comercializado por los laboratorios
- Kit para la determinación de albúmina, comercializado por los laboratorios
bioMérieux y con referencia 61 051.
- Kit para la determinación de proteínas totales, comercializado por los
laboratorios bioMérieux y con referencia 61 602.
- Suero bovino para control de calidad en química clínica valorado Humatrol
N, comercializado por los laboratorios Human y con referencia 13 511.
- Agua destilada.
- Tubos de ensayo de vidrio de 5 cc.
- Tubos de ensayo desechables de 5 cc.
- Pipetas automáticas de diferentes volúmenes y puntas de pipeta apropiadas.
- Agitador Gricel, modelo 3.0.
- Espectrofotómetro para química clínica Clima Plus.
III.1.3.2.2.- Determinación de colesterol
- Fotómetro de reflectancia Ames, Seralyzer III.
- Tiras reactivas Ames para la determinación de colesterol y referencia 2715.
III.1.3.2.3.- Determinación de sodio y potasio
- Fotómetro de llama Meteor, Nak II.
- Patrón de calibración para fotometría de llama y absorción atómica Ionomat,
comercializado por laboratorios Knickerbocker y con referencia B 301.
- Cubetas desechables.
- 85 -
III.1.3.3.- Orina
III.1.3.3.1.- Determinación de proteínas
Los productos químicos utilizados son de calidad reactivo, comercializados por
los laboratorios Merck, Panreac y Sigma:
* Disolución de albúmina sérica bovina al 0,02%
* Disolución A: CO3Na2 al 2% y NaOH 0,1 N
* Disolución B1: SO4Cu(H2O)5 al 1%
* Disolución B2: Tartrato potásico al 2%
* Disolución C: mezcla de A, B1 y B2 en proporción 50:0,5:0,5 preparada antes
de su empleo.
* Disolución de Folín-Fenol-Ciocalteus: una parte de Folín-Fenol + dos de
agua.
- Balanza electrónica And, FX-320.
- Agitador magnético con calentador P Selecta, Agimatic E.
- Agitador de tubos Mixo-Tub, 30 Gri-Gel.
- Espectrofotómetro Shimadzu, UV-160 con un sistema multiposicionador de
celdillas y sistema Peltier CPS-240A.
- Pipetas de vidrio de 5 ml.
- Pipetas automáticas de distintos volúmenes y puntas de pipeta apropiadas.
- 86 -
III.1.3.3.2.- Determinación de creatinina y fósforo
- Kit para la determinación de creatinina, comercializado por los laboratorios
- Kit para la determinación de fósforo, comercializado por los laboratorios
- Agua destilada.
- Tubos de ensayo de vidrio de 5 cc.
- Tubos de ensayo desechables de 5 cc.
- Pipetas automáticas de diferentes volúmenes y puntas de pipeta apropiadas.
- Agitador Gricel, modelo 3.0.
- Espectrofotómetro para química clínica Clima Plus.
- Fotómetro de llama Meteor, NAK II.
- Patrón de calibración para fotometría de llama y absorción atómica
comercializado por laboratorios Gernon y referencia GN 2001005.
- Cubetas desechables.
III.1.3.3.4.- Determinación de la densidad urinaria
- Refractómetro Hills, Urolithiasis program.
III.1.3.3.5.- Otras determinaciones analíticas de la orina
- Tubos de ensayo cónicos de 10 cc.
- 87 -
- Tiras reactivas Multistix 10 SG, comercializadas por Bayer.
- Pipetas Pasteur.
- Portaobjetos y cubreobjetos.
- Microscopio Nikon, Labophot.
III.1.4.- Material para electroforesis de muestras de orina en gel de
poliacrilamida
- Tampones: Los productos químicos utilizados son de calidad reactivo,
comercializados por los laboratorios Merck, Panreac, Sigma y Bio-Rad.
- Disolución 1 de acrilamida-bisacrilamida al 30:0,8 %. Tras su
preparación se filtra la disolución para eliminar partículas que puedan alterar la
polimerización.
- Disolución 2 (para el gel separador o inferior): TRIS 1,5 M pH 8,8
con HCl y SDS al 0,4%.
- Disolución 3 (para el gel de carga o superior): TRIS 0,5 M pH 6,8
con HCl y SDS al 0,4%.
- Disolución de persulfato amónico al 10%, preparada el mismo día
de su uso.
- TEMED.
- Tampón de electroforesis Laemmli: TRIS 25 mM, glicina 192 mM
y SDS al 0,1%.
- Disolución tampón de la muestra (se utilizará 10 veces diluida):
TRIS 500 mM, SDS al 20% y ß-mercaptoetanol 1,43 M. Una vez disuelto el TRIS y el
SDS, y antes de añadir el ß-mercaptoetanol, se lleva a pH 6,8 con HCl.
- 88 -
- Tampón de muestra (azul de bromofenol): TRIS 20 mM pH 7 con
HCl y azul de bromofenol al 0,1%.
- Disolución colorante para el gel de poliacrilamida: Coomassie
Brilliant Blue R 250 al 0,2%, metanol al 45% y ácido acético al 10%. Tras su
preparación se filtra para evitar partículas sólidas que pudieran quedar adheridas al gel.
- Disolución decolorante para el gel de poliacrilamida: metanol al
20%, ácido acético al 10% y glicerol al 1%.
- Disolución de conservación: glicerol al 6% y ácido acético al 4%.
- Marcadores de peso molecular: para la identificación de las bandas de
proteínas se utilizaron las siguientes proteínas de peso molecular conocido, con un
rango comprendido entre 14,4 y 94 kDa y comercializadas por Pharmacia:
α-lactoalbúmina de leche bovina (14,4 kDa), inhibidor de la tripsina de soja (20,1 kDa),
anhidrasa carbónica de eritrocitos bovinos (30 kDa), ovoalbúmina de clara de huevo (43
kDa), albúmina sérica bovina (67 kDa) y fosforilasa b de músculo de conejo (94 kDa).
- pHmetro Crison, MicropH 2002.
- Termobloque Techene.Ori.Block, DB-3H.
- Puntas de pipeta especiales para el depósito de las muestras.
- Sistema de electroforesis Mini-Protean II Cell, comercializado por
laboratorios Bio-Rad.
- Fuente de alimentación PowerPac 300, comercializada por laboratorios BioRad.
- Densitómetro Pharmacia LKB, Ultro scan XL.
- Secador de geles de acrilamida mediante aire, comercializado por
laboratorios Bio-Rad.
- 89 -
III.1.5.- Material para Western blotting
III.1.5.1.- Material para la transferencia de proteínas
- Tampón CAPS: CAPS 10 mM y metanol al 10%. Se disuelve el CAPS en
agua destilada a 4°C y, antes de añadir el metanol, se lleva a pH 11. Se guarda en
refrigeración hasta su uso el mismo día de fabricación.
- Papel Whatman 3MM, comercializado por laboratorios Sigma.
- Membranas de nitrocelulosa Trans-Blot Transfer medium, comercializadas
por Bio-Rad.
- Sistema Mini Trans-Blo Cell, comercializado por laboratorios Bio-Rad.
- Fuente de alimentación PowerPac 300, comercializada por laboratorios BioRad.
- pHmetro Crison, MicropH 2002.
- Frigorífico Crolls, GFN 9603.
III.1.5.2.- Material para el revelado por quimioluminiscencia
- Leche en polvo desnatada Molico.
- Tampón PBS-Tween 20 para todos los lavados del revelado:
* K2HPO4 0,08 M
* KH2PO4 0,02 M
* NaCl 0,1 M
* Tween 20 al 0,2%
- 90 -
- Anticuerpos primarios anti-IgA y anti-IgG de suero de perro, obtenidos en
conejo y comercializados por Violin 2000.
- Anticuerpo secundario anti-IgG de suero de conejo obtenido en cabra,
conjugado con peroxidasa y comercializado por Violin 2000.
- SuperSignal Substrate, comercializado por Pierce.
- Film Kodak X-OMAT; XAR-5,8 x 10 in, comercializado por Sigma.
- Líquido revelador Tetenal, Roenterol, comercializado por Sigma.
- Líquido fijador Tetenal, Superfix 25, comercializado por Sigma.
- Chasis sin rejilla Okamoto MGF Co-Ltd, PL-Btype.
III.1.6.- Material para el estudio de microscopía óptica
III.1.6.1.- Material para el estudio de secciones en parafina
- Formaldehído tamponado al 3,7-4%.
- Alcohol etílico absoluto.
- Alcohol etílico de 96°.
- Xileno.
- Parafina de 56-58°C.
- Agua destilada.
- Reactivos para la tinción de hematoxilina-eosina.
- Reactivos para la tinción de P.A.S.
- Medio de montaje Eukitt.
- Frascos de 100 ml para la recogida de muestra.
- Procesador de tejidos Leica TP 1020.
- Dispensador de parafina P Selecta.
- Microtomo Medim DDM System Pathologie.
- 91 -
- Portacuchillas.
- Cuchillas desechables Feather R 35.
- Portaobjetos y cubreobjetos.
- Estufa Carbolite Eurotherm.
- Baño para secciones en parafina Electrothermal.
- Balanza de precisión Precisa 600C.
- Fotomicroscopio Nikon Optiphot.
III.1.6.2.- Material para el estudio de secciones semifinas
- Agua destilada.
- Glutaraldehido al 25%.
- Carbón activo.
- Ácido clorhídrico 1 N.
- Tetraóxido de osmio (500 mg).
- Alcohol etílico de 96°.
- Alcohol etílico absoluto.
- Acetato de uranilo.
- Óxido de propileno.
- Glycidether 100 (Epon 812).
- Dodecinilsuccinilandride (DDSA).
- 2,4,6-Tris (dimethylaminomethyl)-phenol (DMP-30).
- Methylnorvonen-2,3-dicarboxylico anhidro (MNA).
- Ultramicrotomo Ultracut Reichert-Jung.
- phmetro Hanna Instrumets 8417.
- Estufa Carbolite Eurotherm.
- Azul de Toluidina.
- 92 -
- Fotomicroscopio Nikon Optiphot.
III.1.7.- Material fotográfico
-Equipo de fotografía para microscopio compuesto de cámara Nikon FX-35A y
disparador Microflex Nikon HFX-II.
- Película fotográfica Kodak Ektachrome 160 T.
III.1.8.- Material informático
- Ordenador Pentium Premier.
- Ordenador Macintosh LCIII.
- Ordenador Compaq Presario 1246.
- Escáner ScanJet 4C.
- Programa informático Ultroscan GSXL.
- Programa Filemaker Pro 4.0.
- Programa Microsoft Office 2000.
- Programa Corel Draw 8.
- Programa Micrografx Picture Publisher LE.
- Impresora Epson LX 400.
- Impresora Macintosh Personal LaserWriter.
- Impresora Hewlett Packard DeskJet 710C.
- Impresora Hewlett Packard LaserJet 2100 TN.
- 93 -
III.1.9.- Material estadístico
- Programa estadístico SPSS (2000) licenciado para la Universidad de
Extremadura.
Como guías de consulta se han utilizado:
* Dohoo, I.R. y Waltner-Toews, D. Interpreting clinical research Part I.
General considerations. The Compendium on Continuing Education 1985; 7: 473-478.
* Dohoo, I.R. y Waltner-Toews, D. Interpreting clinical research Part II.
Descriptive and experimental studies. The Compendium on Continuing Education
1985; 7: 513-519.
* Dohoo, I.R. y Waltner-Toews, D. Interpreting clinical research Part III.
Observational studies and interpretation of results. The Compendium on Continuing
Education 1985; 7: 605-613.
* Smith, R.D. Veterinary clinical epidemiology. A problem-oriented approach
2ª ed. Boca Raton: CRC Press 1995.
* Sokal, R.R. y Romlf, F.V. Biometría. Madrid: Blume 1979.
III.2.- MÉTODOS
III.2.1.- Método general empleado en cada animal
Se realizó, en primer lugar, una anamnesis completa en la que se determinó la
edad, raza, hábitat, alimentación, estado vacunal y el peso corporal del animal. Del
- 94 -
mismo modo se investigó la existencia de patologías previas y de cualquier signo de
enfermedad.
Una vez obtenidos los datos anteriores, se siguió con la exploración física
consistente en la toma de la temperatura rectal, aspecto de mucosas, presencia de
deshidratación, ascitis o edema, palpación lumbar, exploración ganglionar y
auscultación cardíaca y pulmonar. A continuación se realizaron tantas pruebas
diagnósticas como fueron necesarias para determinar la enfermedad que padecía el
animal. El diagnóstico definitivo de cada uno de los procesos objeto de nuestro estudio
se realizó de la siguiente manera:
1.- Las piometras se diagnosticaron mediante ecografía y radiografía
abdominal.
2.- Las leptospirosis se identificaron por microscopía de campo oscuro en orina
y se confirmaron por aglutinación microscópica en plasma.
3.- Las leishmaniosis se diagnosticaron mediante ELISA en plasma.
En todos los perros se extrajo la sangre por punción de la vena cefálica, previa
desinfección de la zona, utilizando como anticoagulante EDTA tripotásico (2 ml de
sangre) y heparina sódica (5 ml de sangre). La primera de las muestras se destinó al
análisis hematológico inmediato y a la realización de un frotis sanguíneo para el
recuento diferencial de glóbulos blancos. La segunda se centrifugó a 3.000 r.p.m.
durante diez minutos. El plasma obtenido se utilizó para realizar inmediatamente las
determinaciones correspondientes.
La extracción de orina se realizó mediante sondaje vesical, en condiciones
estériles, con sonda flexible y desinfección del orificio externo de la uretra con una
- 95 -
disolución de povidona yodada (Betadine). Una vez obtenida la orina se realizó su
examen físico, químico y del sedimento urinario, centrifugando 5 cc de la misma a 1000
r.p.m. durante cinco minutos. Una porción del sobrenadante se congeló a -40°C para la
realización de la electroforesis en SDS-PAGE y consiguiente transferencia y revelado
de las proteínas urinarias, y el resto se utilizó en la determinación de creatinina y
proteínas. La porción de muestra sin centrifugar se usó para las determinaciones de
fósforo, sodio y potasio.
A los perros del grupo control, una vez comprobada la ausencia de patología,
se les aplicó la misma metodología que a los animales de los grupos problema.
III.2.2.- Análisis clínicos
III.2.2.1.- Hematología
La sangre se procesó inmediatamente en un analizador automático Sysmex
F-800, con EDTA tripotásico como anticoagulante. Los parámetros obtenidos fueron:
recuento de glóbulos rojos, valor hematocrito, concentración de hemoglobina, índices
de Wintrobe, recuento de glóbulos blancos y recuento de plaquetas.
El recuento diferencial de glóbulos blancos, con un método de tinción rápida,
se llevó a cabo mediante la identificación de 200 leucocitos por microscopía.
- 96 -
III.2.2.2.- Bioquímica plasmática
III.2.2.2.1.- Determinación de alanín-aminotransferasa, fosfatasa
alcalina, urea, creatinina, bilirrubina total, calcio, fósforo, albúmina y proteínas
totales
Todas las determinaciones se llevaron a cabo el mismo día de recogida de la
muestra en un espectrofotómetro de química clínica y con los reactivos apropiados para
cada caso.
En los animales en los que se observó hipoalbuminemia, el calcio sérico se
corrigió mediante la fórmula(286):
Calcio corregido (mg/dl) = calcio medido (mg/dl) – albúmina (g/dl) + 3,5
III.2.2.2.2.- Determinación de colesterol
Su determinación se realizó en un analizador de química sanguínea en fase
sólida.
Se determinaron mediante fotometría de llama, utilizando patrones de
calibración específicos para fotometría de llama y absorción atómica.
- 97 -
III.2.2.2.4.- Determinación del cociente albúmina/globulina
Se calculó dividiendo la concentración de albúmina y globulinas plasmáticas.
III.2.2.3.- Urianálisis
III.2.2.3.1.- Examen físico
El color, aspecto y olor de la orina se evaluaron por observación directa de la
misma.
III.2.2.3.2.- Examen químico
El examen químico se llevó a cabo mediante tiras reactivas de orina que
valoran los siguientes parámetros: glucosa, bilirrubina, ácido acetoacético (cetonas),
sangre, proteínas, urobilinógeno, pH, nitritos y leucocitos.
III.2.2.3.2.1.- Proteínas
La determinación de la concentración de proteínas totales, en el sobrenadante
de la orina centrifugada, se midió según el método de Lowry et al.(248), descrito en 1951,
por su gran sensibilidad, utilizando albúmina sérica bovina como patrón de referencia.
Para ello se prepara un blanco, siete diluciones de la disolución patrón de seroalbúmina
(concentraciones de proteínas de 100, 150, 300, 500, 1000, 1500 y 2000 µg/ml,
respectivamente) y las distintas orinas problema. Se van añadiendo la disolución de
albúmina o, en su caso, las muestras problema, el agua destilada y la disolución C, tras
lo cual se agita la mezcla. A continuación se agrega el reactivo de Folín-Fenol en dos
- 98 -
partes, agitando después de añadir cada uno de los 200 µl. Los distintos volúmenes (en
µl) aparecen reflejados en la TABLA 5.
Blanco
1
2
3
4
5
6
7
Problema
Disol. albúmina
—
50
75
150
250
500
750
1000
—
H2O
1000
950
925
850
750
500
250
—
900
Disolución C
4000
4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000
4000
Folín-Fenol
400
400
400
400
400
400
400
400
400
Orina
—
—
—
—
—
—
—
—
100
TABLA 5: protocolo para la determinación de la concentración de proteínas en la orina
mediante el método de Lowry et al.(248) (1951).
Tras un tiempo de reposo comprendido entre 30 y 60 minutos, se lee su
absorbancia a 550 nm frente al blanco. Con las siete diluciones de concentración
proteica conocida se construye la gráfica patrón para conocer la concentración en
proteínas de la muestra problema, expresada en µg/ml de orina.
III.2.2.3.2.2.- Creatinina y fósforo
Se determinaron el mismo día de recogida de la muestra y en un
espectrofotómetro de química clínica con los reactivos apropiados para cada caso. Para
su cuantificación, la orina se diluyó 50 veces en el caso de la creatinina y 10 veces en el
del fósforo.
- 99 -
III.2.2.3.2.3.- Sodio y potasio
Se determinaron mediante fotometría de llama utilizando patrones de
calibración específicos para fotometría de llama y absorción atómica.
III.2.2.3.3.- Densidad de la orina
La densidad se determinó por refractometría.
III.2.2.3.4.- Sedimento urinario
Con el examen microscópico del sedimento se cuantificó en 10 campos la
presencia, a 40x, de los siguientes elementos: células epiteliales, glóbulos rojos,
glóbulos blancos, cilindros, cristales y bacterias.
III.2.2.3.5.- Determinación del cociente proteína/creatinina
Se halló mediante la división de la concentración de proteína y creatinina,
ambas expresadas en mg/dl, en la muestra de orina centrifugada.
III.2.3.- Pruebas de funcionalidad renal
III.2.3.1.- Excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo
Se determinan mediante la fórmula:
Excreción fraccional y = (Uy x Pcr) / (Ucr x Py) x 100
- 100 -
* y = electrolito a determinar su excreción fraccional.
* Uy = concentración del electrolito en orina (mg/dl).
* Pcr = concentración plasmática de creatinina (mg/dl).
* Ucr = concentración de creatinina en orina (mg/dl).
* Py = concentración plasmática del electrolito (mg/dl).
III.2.4.- Electroforesis vertical en gel de poliacrilamida SDS (según la
técnica de Laemmli, U.K.(225), 1970)
La electroforesis en gel de poliacrilamida y en presencia de dodecil sulfato
sódico se utiliza para la separación de proteínas únicamente en función de su peso
molecular. La concentración de acrilamida y bisacrilamida varía en función del tamaño
de las proteínas que se pretenden separar. En nuestro caso, los geles se han preparado a
partir de una disolución madre de acrilamida al 30% y bisacrilamida al 0,8%. Cada
experimento ha constado de dos electroforesis idénticas:
- Un gel era teñido y decolorado para estudiar las distintas bandas proteicas en
el densitómetro.
- El segundo gel se ha usado para la transferencia de proteínas a la membrana
de nitrocelulosa, incubación de la misma con los correspondientes anticuerpos y
revelado por quimioluminiscencia de las bandas encontradas.
III.2.4.1.- Preparación de los geles de poliacrilamida
La técnica utilizada en nuestro estudio ha sido la electroforesis discontinua de
Laemmli(225) (1970), caracterizada porque la concentración de acrilamida es distinta
- 101 -
para cada parte del gel: la inferior tiene una concentración del 10,4% y la superior del
4%. El pH también difiere en cada una de ellas: la primera cuenta con un pH de 8,8 y la
segunda con uno de 6,8.
El tampón Laemmli contiene SDS y glicina que juegan un papel fundamental
en la resolución de la técnica. Con el primero, y por tener afinidad por las partes
hidrofóbicas de las proteínas, se consigue la desnaturalización de las mismas y dotarlas
de carga negativa. Por otro lado, la glicina juega un papel muy importante en la
concentración de la muestra a su paso por el gel de carga. Este gel tiene un pH de 6,8
que coincide con el punto isoeléctrico de la glicina y por tanto actúa frenando la
migración. De esta forma, se consigue que la muestra llegue al gel separador marcando
un frente muy estrecho, lo que aumenta la resolución de la técnica(75, 97).
La composición de los geles de cada electroforesis, para los que se utilizan las
disoluciones reseñadas con anterioridad, queda reflejada en la TABLA 6 con los
volúmenes correspondientes expresados en µl:
Gel separador (10,4%) Gel de carga (4%)
Disolución 1
1700
400
Disolución 2
1250
—
Disolución 3
—
700
Agua destilada
2100
1570
TEMED
2,3
1,6
Persulfato amónico
18,7
25
- 102 -
TABLA 6: protocolo para la preparación de los geles utilizados en la realización
de electroforesis en gel de poliacrilamida y en presencia de SDS. Volúmenes en
µl y calculados para Mini-Protean II Cell de Bio-Rad.
Se añaden las distintas disoluciones de los geles separador y de carga, por
separado, a excepción del TEMED y el persulfato amónico. A continuación sumamos
éstos al separador para que se inicie la polimerización y el gel se vierte entre los
cristales de electroforesis, previamente montados. Seguidamente, añadimos el TEMED
y el persulfato a la mezcla del gel de carga que se irá vertiendo, con ayuda de una pipeta
Pasteur, sobre el primero para evitar su mezcla. Se colocan los peines en ambos
soportes y se espera entre 15 y 20 minutos a que polimericen los geles. Transcurrido
este tiempo se retiran los peines y se lavan los pocillos con agua destilada para eliminar
burbujas de aire. Se colocan los cristales en el soporte con los electrodos y se añade
tampón Laemmli en el espacio que queda entre los dos cristales. A continuación se
vierte por el exterior de los soportes hasta cubrir los electrodos y se procede a depositar
cada muestra en su pocillo con unas puntas de pipeta especiales para ello.
III.2.4.2.- Preparación de las muestras
En cada electroforesis se dispone de 10 pocillos donde se depositan un
marcador de pesos moleculares, la orina de un perro sano (control) y 8 orinas de perros
objeto de nuestro estudio. El volumen depositado en cada pocillo fue de 25 µl con el fin
de evitar la mezcla de muestras de varios pocillos. En el caso de las muestras de orina
están constituidos por: 2 µl de glicerol, 2,5 µl de tampón de la muestra 10 veces
concentrado y 1 µl de azul de bromofenol. El resto lo forman la orina y el agua. La
cantidad de proteínas incluida en cada muestra se estandarizó en 5 µg, con el fin de
favorecer el estudio cualitativo de las bandas proteicas. Las muestras de orina se
- 103 -
acompañan de un marcador de pesos moleculares comprendidos entre 14,4 y 94 kDa.
En este caso los 25 µl de la muestra están constituidos por 2 µl de glicerol, 1,5 µl de
tampón, 1 µl de azul de bromofenol, 2,5 µl de marcador y 18 µl de agua.
Una vez preparada la muestra se agita y se introduce en termobloque durante 1
minuto y 10 segundos a 100°C con el fin de desnaturalizar las proteínas. Por último, se
depositan las muestras en sus pocillos correspondientes y se conecta el sistema a la
fuente de alimentación, realizándose la electroforesis a voltaje constante de 100 mV
para el gel de carga y de 150 mV para el separador. Se da por finalizada la migración
cuando el azul del frente alcanza el extremo inferior del gel.
III.2.4.3.- Tinción y secado del gel de poliacrilamida
Concluida la migración se retiran los cristales y uno de los geles se introduce
en el colorante (Coomassie Brilliant Blue), en agitación y durante media hora. A
continuación, se decolora durante dos horas más y se deja equilibrar el gel en el tampón
de conservación hasta su lectura en el densitómetro. Finaliza el proceso cuando, una vez
leído, se seca con aire caliente, durante 1 hora, en el secador de geles. El otro gel, una
vez separado de los cristales de electroforesis, sigue el proceso de Western blotting.
III.2.5.- Western blotting
Esta técnica(318,
385)
se basa en la realización de una electroforesis en gel de
acrilamida, transferencia posterior de las proteínas desde el gel a una membrana de
nitrocelulosa y revelado y detección de estas proteínas. Para ello, cuando las proteínas
se han transferido a la membrana se les hace contactar con un anticuerpo primario de la
proteína a identificar y con el anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario está
- 104 -
conjugado con peroxidasa y en presencia del sustrato formará un producto fluorescente.
De este modo se detecta la presencia de una proteína específica mediante
autorradiografía. En nuestro estudio los anticuerpos primarios empleados fueron antiIgA y anti-IgG de perro y el secundario elegido resultó válido para ambos.
III.2.5.1.- Transferencia de proteínas al filtro de nitrocelulosa (según
la técnica de Matsudaira, P.(258), 1987 con modificaciones de Centeno, F. et al.(64), 1994)
La transferencia se basa en el paso de proteínas desde el gel de acrilamida al
filtro de nitrocelulosa mediante la aplicación de una corriente eléctrica. Para ello,
cortamos con guantes dos trozos de papel Whatman 3MM y uno de nitrocelulosa de
dimensiones 9x7 cm. Se disponen cubetas con tampón CAPS, previamente preparado y
conservado en refrigeración, donde se humedecen el papel Whatman, la nitrocelulosa,
las esponjas del transblot y el gel de acrilamida. Se prepara el soporte de transferencia
siguiendo este orden: esponja, papel Whatman, gel de acrilamida, nitrocelulosa, papel
Whatman y esponja. Al colocar la nitrocelulosa sobre el gel no deben quedar burbujas
de aire entre ambos, pues disminuirían la transferencia de las proteínas. A continuación
se marcan las distintas calles con lápiz. El gel debe coincidir con el lado negro del
soporte (polo negativo) ya que las proteínas, con carga negativa, migrarán hacia la
nitrocelulosa situada en el polo positivo (lado rojo). Se introduce el soporte de
transferencia en el transblot y se coloca en la cubeta de electroforesis junto con un
recipiente con hielo. Se vierte en la cubeta el tampón CAPS de transferencia y se
conecta a la fuente de alimentación durante hora y media, con agitación y a 90-100
voltios. El amperaje no debe superar los 300 mA. Si ocurriera esto, bastará con
disminuir el voltaje.
- 105 -
Terminada la transferencia teñimos el gel (Coomassie Brilliant Blue), en
agitación durante media hora y lo decoloramos para comprobar el grado de
transferencia que, en las condiciones reseñadas, fue completa en la mayor parte de los
experimentos.
III.2.5.2.- Revelado y detección
El primer paso en el revelado y detección es saturar el filtro de nitrocelulosa
para evitar uniones inespecíficas de los anticuerpos. Para ello, se preparan 20 ml de
tampón PBS-Tween 20 con leche en polvo desnatada al 10%, en los que se sumerge el
filtro en agitación durante 30 minutos. A continuación se realizan dos lavados de un
minuto cada uno en 20 ml de PBS-Tween 20, cantidad y tampón que se usará en cada
lavado, y se incuba la nitrocelulosa con el anticuerpo primario a una dilución de 1/1000
(a menos que se indique otra cosa) en PBS-Tween durante una hora a temperatura
ambiente. De nuevo se lava la membrana dos veces durante 1 minuto y una vez durante
10 minutos y se incuba, en las mismas condiciones, durante media hora en el anticuerpo
secundario (diluido en principio a 1/1000). Seguidamente se lava el filtro una vez
durante 1 minuto y dos veces durante 10 minutos, tras lo cual se deja secar la
nitrocelulosa para llevar a cabo el revelado por quimioluminiscencia(401).
Para revelar se mezclan en una cubeta y a partes iguales (3,5 ml/disolución) las
soluciones Luminol y Enhancer del kit de revelado (SuperSignal Substrate). A
continuación se sumerge el filtro en esta disolución durante 5 minutos, asegurándonos
que queda bien empapado. Trascurridos los 5 minutos se envuelve en plástico,
procurando que no aparezcan burbujas de aire, y se fija en la placa de autorradiografía
con la cara donde se encuentran las proteínas hacia arriba para contactar con la película.
- 106 -
Una vez en la cámara oscura se coloca la película y se deja el tiempo de
exposición adecuado (15 sg, 30 sg o 1 minuto) para, a continuación, sumergirla en el
líquido revelador hasta que se oscurezca, lavarla en agua y dejarla en el líquido fijador
durante tres minutos. Por último se lava la película en agua y se deja secar. Según el
resultado obtenido se puede exponer, durante más o menos tiempo, otra película.
III.2.6.- Estudio de microscopía óptica
Se han seleccionado, para el estudio microscópico, las muestras de ambos
riñones de 3 perros con leishmaniosis que fueron eutanasiados en nuestra consulta por
distintos motivos.
III.2.6.1.- Estudio de secciones en parafina
Las muestras de riñón seleccionadas para este estudio se fijaron en formol
tamponado al 3,7-4%, procesándose según las técnicas habituales en microscopía óptica
e incluyéndose en parafina. A continuación se obtuvieron los bloques correspondientes,
a partir de los cuales se realizaron cortes de 5 µm que, posteriormente, se tiñeron con
los métodos de hematoxilina-eosina y P.A.S.
III.2.6.2.- Estudio de secciones semifinas
Las muestras reservadas para este estudio se fijaron, por inmersión rápida en
glutaraldehído al 2,5%, en solución tampón cacodilato 0,1 M. A continuación se
lavaron en dicho tampón y se llevó a cabo su refijación en tetraóxido de osmio al 1% en
solución tampón cacodilato 0,1 M. Nuevamente se lavaron las muestras con la solución
tampón, deshidratándolas mediante pasos sucesivos por alcoholes etílicos en escala
- 107 -
ascendente, desde alcohol de 50° hasta absoluto, este último con acetato de uranilo al
3%.
Seguidamente las muestras se sumergieron, por este orden, en alcohol
absoluto, en óxido de propileno puro y en una mezcla al 50% de este último y la
correspondiente resina. El proceso finalizó incluyendo las muestras en dicha resina,
constituida por la mezcla de Epon, DDSA, MNA y DMP-30. De los bloques obtenidos
se realizaron secciones semifinas que fueron teñidas con el colorante Azul de Toluidina.
III.2.7.- Estudio estadístico
Las variables pertenecientes al estudio de los análisis clínicos realizados, se
han descrito mediante la media, desviación estándar, valor máximo y valor mínimo. En
el caso del estudio electroforético, el peso molecular y la cantidad de proteína
observada en cada banda se han descrito mediante la media y la desviación estándar.
El efecto en dichas variables del cuadro patológico en el que se encuadraba
cada animal, se determinó mediante un análisis de la varianza (ANOVA) a una vía, en
el que el efecto grupo presentaba 4 niveles (control, piometra, leptospirosis y
leishmaniosis). Se utilizó sistemáticamente, como covariable, el peso del animal (kg),
en la medida en que pudiera ser un factor que influyera en la variable en estudio. En
caso de que este análisis resultara estadísticamente significativo, las diferencias entre
las medias de los 4 grupos experimentales se establecieron “a posteriori” mediante una
prueba de Tukey, con un nivel de significación estandarizado (p < 0,05).
El modelo de ANOVA seguido en todos los casos ha sido el siguiente:
- 108 -
Xij = µ + Wi + Gj + ε
Xij = valor presentado para una variable dada, por el perro i perteneciente al
grupo experimental j.
µ = media general de la población.
Wi = efecto debido a la covariable peso del perro i.
Gj = efecto debido al grupo j en el que está incluido el perro i (control,
piometra, leptospirosis o leishmaniosis).
ε = error.
Para el caso particular de las frecuencias de presentación de las distintas
bandas proteicas, las posibles diferencias entre cada 2 grupos se estableció mediante
una prueba de χ2.
- 109 -
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
IV. Resultados y discusión: optimización
IV.1.- OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE ELECTROFORESIS
IV.1.1.- Concentración de acrilamida
Los parámetros que influyen en la resolución de proteínas separadas por
SDS-PAGE, en un sistema discontinuo, son la proporción de acrilamida/bisacrilamida
en los geles de carga (superior) y separador (inferior), el pH de estos geles y el método
de preparación de las muestras(206). En nuestro estudio se utilizó una proporción de
acrilamida-bisacrilamida de 30:0,8% y, a partir de aquí, se realizaron sucesivas
electroforesis con una concentración fija de acrilamida del 4% para el gel de carga y
con concentraciones crecientes (7,5%, 10,4%, 12,5%, 13,5% y 15%) para el separador.
Los resultados obtenidos en orinas de perros sanos y problemas mostraron que la
mayoría de las proteínas urinarias, objeto de nuestro estudio, presentaban un peso
molecular en torno a 60 kDa y, por tanto, la concentración de acrilamida-bisacrilamida
óptima debía ser intermedia. Con concentraciones altas en el gel separador (13,5% o
15%) las proteínas de peso molecular superior a 67 kDa no se separaban y, por el
contrario, con una concentración baja (7,5%) se perdían proteínas de peso molecular
inferior a 30 kDa. Tras sucesivos experimentos el porcentaje de acrilamida para el gel
separador se fijó en 10,4% y en 4% para el de carga (FIGURA 1).
- 111 -
FIGURA 1: bandas observadas en la electroforesis de orina de un perro
sano (calle 1), dos perros con leptospirosis (calles 2 y 3), tres perras con
piometra (calles 4, 5 y 6) y tres perros con leishmaniosis (calles 7, 8 y 9).
Pm = marcador de pesos moleculares.
IV.1.2.- Marcador de pesos moleculares
En la puesta a punto del método a emplear se utilizaron, en una primera fase,
dos tipos de marcadores:
1.- Marcador de bajo peso molecular (LMW) constituido por: α-lactoalbúmina
de leche bovina (14,4 kDa), inhibidor de la tripsina de soja (20,1 kDa), anhidrasa
carbónica de eritrocitos bovinos (30 kDa), ovoalbúmina de clara de huevo (43 kDa),
albúmina sérica bovina (67 kDa) y fosforilasa b de músculo de conejo (94 kDa).
2.- Marcador de alto peso molecular (HMW) constituido por: glutámico
deshidrogenasa de hígado bovino (53 kDa), transferrina humana (76 kDa), βgalactosidasa de E. coli (116 kDa), α2-macroglobulina de plasma bovino (170 kDa) y
miosina de músculo de conejo (212 kDa).
- 112 -
Las bandas que se encontraron, al utilizar el HMW, no se correspondieron con
el patrón esperado para ese marcador, es decir, 5 bandas perfectamente definidas.
Aparecía un número superior de bandas (FIGURA 2), con la consiguiente imposibilidad
de fijar sus distintos pesos moleculares y su invalidación para nuestro trabajo. Este
hecho puede achacarse al porcentaje de acrilamida elegido (10,4%) que, para separar
proteínas de peso molecular alto, no es el más adecuado. Por el contrario, el LMW
mostraba 6 bandas nítidas y fue elegido como marcador de los pesos moleculares de
nuestras proteínas (FIGURA 2).
FIGURA 2: marcadores de bajo (LMW) y alto peso molecular (HMW).
IV.1.3.- Cantidad de proteínas (µ
µg) de cada muestra
- 113 -
Las muestras utilizadas estuvieron constituidas por orina centrifugada con el
fin de eliminar células, cuyo contenido proteico pudiera interferir en los resultados
electroforéticos.
Se deben tener en cuenta tres factores para determinar la cantidad de proteína a
cargar en la electroforesis: grosor del gel, número de bandas que aparecen en la muestra
y, principalmente, el método de detección de esas proteínas. Para la estandarización de
esta cantidad se partió de estudios anteriores(154) y se comenzó con cantidades de 3 µg,
5 µg y 10 µg, utilizando siempre las mismas muestras (una del grupo control y dos del
grupo problema). Los resultados obtenidos se muestran en la FIGURA 3. Cuando la
cantidad de proteína cargada fue de 3 µg las bandas fueron muy tenues y en la orina del
grupo control, con menor número de bandas, su visualización fue difícil (calle 1). Al
depositar 10 µg de proteína ocurrió lo contrario pues las bandas se superponían, con la
consiguiente falta de definición, sobre todo en las orinas problema (calles 8 y 9). Por
todo ello se fijó la cantidad de proteína en 5 µg/pocillo tanto en las orinas del grupo
control como en las del grupo problema (calles 4, 5 y 6).
- 114 -
FIGURA 3: electroforesis de una orina del grupo control y dos del problema con 3 µg,
5 µg y 10 µg de proteína en la muestra. Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 =
control, 3 µg. Calle 2 = problema (piometra), 3 µg. Calle 3 = problema (leishmaniosis), 3
µg. Calle 4 = control, 5 µg. Calle 5 = problema (piometra), 5 µg. Calle 6 = problema
(leishmaniosis), 5 µg. Calle 7 = control, 10 µg. Calle 8 = problema (piometra), 10 µg.
Calle 9 = problema (leishmaniosis), 10 µg.
IV.1.4.- Conservación y validez de las muestras tras sucesivas
congelaciones
En ocasiones, la cantidad de orina almacenada a -40°C, hasta su estudio
electroforético, no fue muy elevada. Para prevenir que una muestra fuera insuficiente,
se comprobó cuantas congelaciones-descongelaciones sucesivas de la orina se podían
realizar sin que se alterara el patrón electroforético de la misma. Para ello se eligió la
orina de un perro control, con suficiente cantidad de muestra almacenada, y a 6
fracciones de la misma se las sometió, respectivamente, a 1, 2... hasta 6
congelaciones-descongelaciones sucesivas, y se incluyeron en una electroforesis. Se
comprobó que las 6 muestras, cada una de ellas congelada un número diferente de
veces, presentaban el mismo patrón electroforético (FIGURA 4) y que, por tanto, la
- 115 -
realización de al menos 6 congelaciones-descongelaciones sucesivas de la orina no
afectaban a nuestro estudio.
FIGURA 4: patrón electroforético de la orina de un perro control sometida
a sucesivas congelaciones-descongelaciones, desde una (calle 1) hasta un
máximo de seis (calle 6). Pm = marcador de pesos moleculares.
IV.2.- OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE WESTERN BLOTTING
IV.2.1.- Anticuerpos a utilizar
Desde el primer momento se planteó identificar mediante Western blotting las
inmunoglobulinas que podían aparecer en la orina de perros sanos y de animales con
enfermedad renal debida a distintas patologías. Los anticuerpos primarios que se pensó
utilizar fueron anti-IgA, anti-IgG y anti-IgM de suero de perro, obtenidos en conejo, y
como anticuerpo secundario anti-IgG de suero de conejo, obtenido en cabra y
- 116 -
conjugado con peroxidasa. Se optimizaron las diluciones de los tres anticuerpos
primarios y del secundario, como posteriormente se mencionará. El anti-IgM se
descartó de este estudio debido a que los resultados obtenidos con él no fueron
concluyentes. Esta inmunoglobulina es secretada en su forma polimérica, constituida
por cinco y, en ocasiones, seis subunidades de 180 kDa, de modo que su peso molecular
alcanza los 900 kDa, lo que dificulta su excreción por el riñón(383).
IV.2.2.- Dilución óptima del anticuerpo primario: anti-IgA y anti-IgG
Los dos anticuerpos se probaron por separado y ambos a unas diluciones
1:1.000, 1:2.000, 1:5.000 y 1:10.000, fijando el anticuerpo secundario a 1:2.500 para
una primera aproximación a la dilución óptima a la que serían, posteriormente,
utilizados. Para ello se utilizaron las orinas de un perro control y de un perro con
leishmaniosis y se comprobó que la señal era nítida en la dilución 1:10.000 y que con
diluciones menores aparecían muchas uniones inespecíficas y una alta señal de fondo,
que hacían difícil las cuantificaciones posteriores (FIGURA 5).
- 117 -
FIGURA 5: optimización de la concentración del anticuerpo primario
anti-IgA en la orina de un perro sano (grupo control) y en la de un perro
problema (grupo con leishmaniosis). Calles 1 y 2 = orina control y problema,
respectivamente; cp = cadena pesada, cl = cadena ligera.
En el caso del anticuerpo anti-IgA se probó con diluciones mayores,
concretamente 1:15.000, 1:20.000 y 1:25.000, pero la señal a partir de 1:10.000 se hacía
muy tenue, llegando a desaparecer en el caso de las diluciones 1:20.000 y 1:25.000. Por
todo ello, y unificando criterios, se fijó la dilución de los anticuerpos anti-IgA y
anti-IgG en 1:10.000 (FIGURA 6).
FIGURA 6: optimización de la concentración del anticuerpo primario anti-IgA
en la orina de un perro sano (grupo control) y en la de un perro problema (grupo
con leishmaniosis). Calles 1 y 2 = orina control y problema, respectivamente;
cp = cadena pesada, cl = cadena ligera.
- 118 -
IV.2.3.- Dilución óptima del anticuerpo secundario
Una vez fijada la dilución de los anticuerpos primarios en 1:10.000 y
utilizando las mismas muestras de orina, se optimizó la dilución del anticuerpo
secundario. Para ello se reveló la membrana de nitrocelulosa con distintas diluciones de
éste: 1:2.500, 1:5.000, 1:10.000 y 1:20.000 para cada anticuerpo primario (dilución
1:10.000) (FIGURA 7). Con la primera de las diluciones la señal fue muy fuerte y con
las dos últimas muy tenue, por lo que se eligió como óptima la dilución 1:5.000 tanto
para el anticuerpo anti-IgA como para el anti-IgG.
A lo largo de esta Tesis Doctoral, el uso de la quimioluminiscencia como
método de detección permitió, a partir de un tiempo de exposición para cada film de 30
segundos, incrementar dicho tiempo a 1 minuto cuando la señal obtenida fue muy tenue
o reducirlo a 15 segundos si, por el contrario, la señal mostró ser demasiado intensa.
FIGURA 7: optimización de la concentración del anticuerpo secundario en la
orina de un perro sano (grupo control) y en la de un perro problema (grupo con
leishmaniosis). Calles 1 y 2 = orina control y problema, respectivamente;
cp = cadena pesada, cl = cadena ligera.
- 119 -
IV. Resultados y discusión: control
IV.3.- GRUPO CONTROL
IV.3.1.- Anamnesis y exploración física
La anamnesis y exploración física de los 20 perros que forman el grupo control
fue normal, sin que se apreciaran alteraciones en ninguno de los sistemas orgánicos
examinados.
IV.3.2.- Análisis de sangre
IV.3.2.1.- Hematología
Los valores medios de la serie roja (TABLA 7), recuento de plaquetas
(TABLA 8) y serie blanca (TABLA 9) del grupo control coincidieron con los descritos
como fisiológicos para la especie canina por numerosos autores(54,
198, 274, 379, 387)
. En
cinco perros de los veinte que forman este grupo, se observó un aumento moderado del
recuento de eritrocitos, concentración de hemoglobina y hematocrito. Comprobada la
ausencia de otras alteraciones analíticas, se atribuyó a una contracción esplénica
inducida por el estrés(388), provocado en estos animales al realizar la correspondiente
exploración física y posterior recogida de muestras.
Parámetro
Media Desv. estándar Valor máx. Valor mín.
RGR (x106/µ
µl)
7,28
1,13
9,23
5,31
HGB (g/dl)
16,83
2,00
19,90
13,70
HCT (%)
52
8
63
38
VCM (fl)
71,28
2,30
75,50
65,60
- 120 -
HCM (pg)
23,35
2,24
27,10
16,80
CHCM (g/dl)
32,74
2,91
36,80
23,80
TABLA 7: valores de la serie roja del
glóbulos rojos (RGR); concentración de
hematocrito (HCT); volumen corpuscular
corpuscular media (HCM); concentración
media (CHCM).
PLT (x103/µ
µl)
grupo control. Recuento de
hemoglobina (HGB); valor
medio (VCM); hemoglobina
de hemoglobina corpuscular
Media
Desv. estándar
Valor máx.
Valor mín.
313,60
184,94
764,00
116,00
TABLA 8: valores del recuento de plaquetas (PLT) del grupo control.
Parámetro
Media
Desv. estándar
Valor máx.
Valor mín.
RGB (x103/µ
µl)
9,17
3,16
16,20
5,70
N. bastonados/µ
µl
364
426
1360
0
N. segmentados/µ
µl
6198
2611
11700
2156
Basófilos/µ
µl
0
0
0
0
Eosinófilos/µ
µl
504
319
1134
0
Linfocitos/µ
µl
1633
1074
4896
390
Monocitos/µ
µl
421
257
972
0
TABLA 9: valores de la serie blanca del grupo control. Recuento total (RGB) y
diferencial de glóbulos blancos.
IV.3.2.2.- Bioquímica sanguínea
- 121 -
Al igual que en el caso de la hematología, en la bioquímica sanguínea del
grupo control (TABLA 10) tampoco se encontraron diferencias respecto a lo descrito
por distintos autores para la especie canina(54, 198, 274, 379, 387).
Parámetro
Media
Desv. estándar
Valor máx.
Valor mín.
Urea (mg/dl)
30,15
6,97
45,00
17,00
Creatinina (mg/dl)
1,09
0,18
1,30
0,80
FA (UI/l)
22,15
13,48
55,00
4,00
ALT (UI/l)
41,05
15,18
94,00
22,00
BT (mg/dl)
0,30
0,09
0,40
0,10
Calcio (mg/dl)
9,94
0,48
10,90
9,30
Fósforo (mg/dl)
4,21
0,57
5,10
3,20
Colesterol (mg/dl)
229,15
59,44
380,00
136,00
Sodio (mEq/l)
143,45
7,88
156,00
133,00
Potasio (mEq/l)
4,46
0,59
6,00
3,50
PT (g/dl)
6,89
0,64
7,50
6,00
Albúmina (g/dl)
3,14
0,27
3,50
2,50
Cociente A/G
0,88
0,21
1,25
0,50
TABLA 10: valores de la bioquímica sanguínea del grupo control. Concentraciones
de urea, creatinina, fosfatasa alcalina (FA), alanín aminotransferasa (ALT),
bilirrubina total (BT), calcio, fósforo, colesterol, sodio, potasio, proteínas totales
(PT), albúmina y cociente albúmina-globulina (A/G).
IV.3.3.- Urianálisis
IV.3.3.1.- Examen físico
- 122 -
Los resultados del análisis del color, olor y aspecto de la orina del grupo
control coincidieron con los descritos como fisiológicos para la especie canina(251, 296,
297)
.
IV.3.3.2.- Densidad
El valor medio de la densidad urinaria (TABLA 11), así como los valores
individuales obtenidos en el grupo de animales sanos se encontraron dentro del rango
establecido como normal para el perro(251). Sólo el perro N°4 mostró una densidad de la
orina levemente inferior (1013). Este resultado carece de significación clínica, en
ausencia de otras alteraciones analíticas, debido a la capacidad que tienen los riñones
para mantener la homeostasis del organismo a partir de variaciones en su función
glomerular y tubular(297).
Densidad
Media
Desv. estándar
Valor máx.
Valor mín.
1033
11
1055
1013
TABLA 11: valores de la densidad de la orina del grupo control.
IV.3.3.3.- Sedimento urinario
El sedimento de los perros del grupo control (TABLA 12) no mostró
alteraciones en ninguno de los elementos a cuantificar, con respecto a lo descrito por
distintos autores para la especie canina(72,
(10)
sangre
y células escamosas
(72)
251, 296)
. A pesar de la contaminación con
descrita en la obtención de orina por sondaje uretral,
- 123 -
en nuestro estudio no se observaron valores altos en el recuento de ambos tipos
celulares.
Perro Céls. escam. Céls. transic. Céls. tubul. Glób. rojos Glób. blancos Cilindros Cristales Bacterias
1
1/3c
—
—
2/c
3/c
—
—
—
2
—
—
—
—
—
—
1 amorfo/3c
—
3
1/2c
—
—
3/c
—
—
—
—
4
—
1/4c
—
2/c
1/c
—
—
—
5
1/2c
—
—
3/c
—
—
—
—
6
—
1/3c
—
—
—
—
—
—
7
1/3c
—
—
1/c
—
—
—
—
8
1/5c
—
—
—
—
—
—
—
9
1/3c
—
—
1/5c
—
—
—
—
10
1/4c
—
—
2/c
—
—
—
—
11
—
—
—
1/2c
—
—
1 amorfo/3c
—
12
—
1/5c
—
—
—
—
1 amorfo/4c
—
13
1/3c
—
—
4/c
1/c
—
—
—
14
—
1/2c
—
—
—
—
1 amorfo/2c
—
15
1/3c
—
—
—
1/3c
—
1 amorfo/4c
—
16
1/4c
—
—
—
—
—
—
—
17
1/5c
—
—
2/c
—
—
—
—
18
1/2c
—
—
2/c
—
—
1 amorfo/2c
—
19
2/c
—
—
4/c
—
—
—
—
20
1/4c
—
—
1/c
—
—
1 amorfo/4c
—
TABLA 12: sedimento urinario del grupo control (40x). Recuento por campo (/c) de células escamosas,
células de transición, células tubulares, glóbulos rojos, glóbulos blancos, cilindros, cristales y bacterias.
- 124 -
IV.3.3.4.- Examen químico
IV.3.3.4.1.- Proteínas
IV.3.3.4.1.1.- Cociente proteína/creatinina y concentración de
proteínas
El cociente proteína/creatinina (U P/C) en una muestra recogida al azar se
correlaciona bien con la excreción de proteína urinaria medida en 24 horas, con la
presencia de proteinuria o sin ella(2, 10, 17, 67, 168, 408). Cuando la función renal es estable,
los mecanismos de filtración glomerular y concentración tubular afectan de igual forma
a la proteína y a la creatinina(67,
250)
; por tanto, la determinación del cociente U P/C
elimina la variación del volumen de orina(15). En el grupo control, los valores medios
obtenidos del U P/C y de la concentración de proteína en orina (TABLA 13), así como
sus valores individuales, se encontraron comprendidos dentro del rango establecido
como fisiológico en la especie canina(195, 220, 250). Sólo un perro mostró un U P/C alto
(1,33). En este animal, el resto de las pruebas realizadas (analítica sanguínea, urinaria y
Western blotting de orina) no demostraron la presencia de alteraciones que pudieran
confirmar la existencia de una proteinuria significativa. Así, no se observó anemia
(hematocrito = 53%) o hiperbilirrubinemia (bilirrubina total = 0,20 mg/dl) que pudieran
indicar
hemólisis
y,
por
tanto,
hemoglobinuria;
tampoco
hipoalbuminemia
(albúmina = 3,40 g/dl); hiperproteinemia (proteínas totales = 7,00 g/dl) ni azotemia
(urea = 39,00 mg/dl, creatinina = 1,20 mg/dl). En el urianálisis la orina presentó un
color normal con lo que se descartó la posibilidad de mioglobinuria, el sedimento no
fue significativo y no hubo resultado positivo en el test de sangre oculta. Por último, el
resultado del Western blotting en este perro no mostró diferencias con respecto al resto
de animales del grupo (FIGURAS 10 y 11, calle 6). Se ha descrito la existencia de una
- 125 -
proteinuria, consecuencia de fiebre, convulsiones, estrés, temperaturas extremas o
ejercicio físico, que suele ser transitoria y rara vez de importancia clínica(18, 195).
Parámetro Media Desv. estándar
Valor máx.
Valor mín.
U P/C
0,51
0,26
1,33
0,21
Proteínas
53,18
25,01
110,89
18,92
TABLA 13: valores del cociente proteína/creatinina (U P/C) y la
concentración de proteínas (mg/dl) en orina del grupo control.
IV.3.3.4.1.2.- Electroforesis y Western blotting
Los pesos moleculares de las bandas observadas en las electroforesis del grupo
control y de las patologías estudiadas se distribuyeron en intervalos de 10 kDa en cada
orina puesto que, con el sistema SDS-PAGE, el cálculo del peso molecular de una
proteína se puede realizar con una exactitud variable entre el 5 y el 10%(148).
En la electroforesis de las orinas de perros del grupo control, constituido por
10 machos y 10 hembras, se identificaron hasta 5 bandas diferentes (FIGURAS 8 y 9).
- 126 -
FIGURA 8: lectura densitométrica de la electroforesis de orina de un perro
control (5 bandas).
FIGURA 9: bandas observadas en la electroforesis del grupo control. Pm =
marcador de pesos moleculares. Calles 1-9 = orinas del grupo control.
- 127 -
Prácticamente en todas las muestras analizadas (TABLA 14) se identificaron
las dos bandas de mayor peso molecular (105,00 ± 3,66 kDa y 73,09 ± 2,91 kDa,
respectivamente) (TABLA 15); tan sólo hubo un animal (perro Nº3), sin características
clínicas diferentes respecto al resto de perros de este grupo, en el que no se identificó la
banda de peso molecular localizada en el intervalo de 70-80 kDa.
Intervalo
Pm (kDa)
100-110
70-80
30-40
20-30
10-20
100%
95%
30%
25%
50%
Control
TABLA 14: frecuencias de presentación de las bandas observadas
en la electroforesis del grupo control.
Intervalo
Pm (kDa)
N° perros
N = 20
Media ± SD
Pm (kDa)
Media ± SD
Prot. (µ
µg)
Media ± SD
Área (%)
100-110
20
105,00 ± 3,66
1,73 ± 1,22
34,67 ± 24,47
90-100
0
—
—
—
80-90
0
—
—
—
70-80
19
73,09 ± 2,91
1,68 ± 1,02
33,56 ± 20,45
60-70
0
—
—
—
50-60
0
—
—
—
40-50
0
—
—
—
30-40
6
35,24 ± 2,61
0,62 ± 0,31
12,48 ± 6,12
20-30
5
28,26 ± 2,77
1,12 ± 0,79
22,46 ± 15,83
10-20
10
13,69 ± 1,12
2,41 ± 0,86
48,17 ± 17,24
- 128 -
TABLA 15: media ± desviación estándar (SD) del peso molecular (Pm),
cantidad de proteína (Prot.) y área de las bandas que aparecen en la orina del
grupo control.
La primera banda, de peso molecular = 105,00 kDa, mostró un área media del
34,67% (TABLA 15) que representa, de los 5 µg que se depositaron en cada pocillo,
1,73 µg de proteína, aunque esta cuantificación es relativa. La tinción utilizada para
evidenciar las distintas bandas (Coomassie Brilliant Blue) presenta diferente
especificidad para cada proteína, por lo que su determinación cuantitativa en función
del grado de tinción requeriría una curva patrón para cada proteína(181). Mientras que
Müller-Peddinghaus y Trautwein(276), en la orina de perros Beagles clínicamente sanos,
sólo observaron la presencia de albúmina y proteínas de peso molecular inferior a ella,
Schultze y Jensen(348), en un estudio llevado a cabo en perros también clínicamente
sanos y no proteinúricos, detectaron mediante electroforesis en SDS-PAGE tres bandas
bien diferenciadas, de pesos moleculares situados entre 100 kDa y 65 kDa. La primera
de estas bandas, identificada por los mencionados autores como transferrina, se localiza
en un rango de pesos moleculares en el que estaría incluida la observada en el grupo
control, de 105,00 ± 3,66 kDa. Coincidimos con estos autores en el límite en cuanto a
peso molecular se refiere, utilizando la técnica de electroforesis SDS-PAGE, de las
proteínas detectables en la orina de perros sanos, localizado aproximadamente en los
100 kDa (TABLA 15).
La segunda banda detectada (73,09 ± 2,91 kDa) se puede asociar con la
albúmina, cuyo peso molecular se ha descrito en torno a los 69 kDa(166). La diferencia
observada en el peso molecular de esta proteína respecto al descrito por estos autores
vendría dada por el sistema de electroforesis utilizado que, como se ha comentado
anteriormente, permite calcular el peso molecular de una proteína con una exactitud
- 129 -
variable entre el 5 y el 10%(148). En nuestro estudio esta banda representó el
33,56 ± 20,45% del área total de las bandas observadas en el grupo control (TABLA
15). Se ha descrito que la albúmina puede constituir entre el 40% y el 60% de las
proteínas urinarias normales(195), porcentaje al que se aproxima el observado en nuestro
estudio.
La siguiente banda, cuya frecuencia de presentación fue considerablemente
inferior a la encontrada en las dos bandas anteriores (TABLA 14), se observó en el
intervalo situado entre 10 kDa y 20 kDa (13,69 ± 1,12 kDa) y presentó una cantidad de
proteína de 2,41 ± 0,86 µg (TABLA 15). Esta banda fue la de mayor área (48,17 ±
17,24) de cuantas aparecieron en el grupo control (TABLA 15) y, por tanto, la
excretada en mayor cantidad. Puede ser identificada como una β2-microglobulina,
localizada en la región de los 12 kDa, y con la lisozima, localizada en la región de los
14,40 kDa. Tanto una como otra han sido descritas en la orina de perros sanos por
distintos autores(15, 366).
Las dos bandas restantes, de bajo peso molecular, se han observado con menor
frecuencia, y fueron las encontradas en los intervalos de 30-40 kDa (6 perros) y
20-30 kDa (5 perros), respectivamente (TABLA 15). En el primer caso, el valor medio
encontrado para su peso molecular y su contenido en proteína fue de 35,24 ± 2,61 kDa
y 0,62 ± 0,31 µg, respectivamente (TABLA 15). Esta banda fue la de menor área en el
grupo de perros sanos (TABLA 15) y parece corresponderse con un fragmento de
albúmina, de peso molecular situado en torno a 30-45 kDa, y que describieron Wiggins
et al.(412) en 1985. Este fragmento se produciría a consecuencia de no utilizar
inhibidores de proteasas en el método pues, aunque en todo el proceso las muestras se
mantuvieron en refrigeración, no podemos descartar que se produjera una proteolisis de
- 130 -
la albúmina. En la banda localizada dentro del intervalo comprendido entre 20 kDa y
30 kDa se obtuvo un peso molecular de 28,26 ± 2,77 kDa (TABLA 15), que coincide
con el descrito para la α1-microglobulina (27 kDa)(250). Esta proteína ha sido utilizada,
junto con la β2-microglobulina (mencionada con anterioridad), para detectar un daño
renal de tipo tubular, en el caso de que aparezcan en cantidades elevadas en la orina. La
última, a diferencia de la α1-microglobulina(28), presenta desventajas debido a su
inestabilidad cuando el pH urinario es ácido (pH < 6) y al hecho de que varíe su
concentración plasmática independientemente de la función glomerular(183).
Por último, es necesario destacar que el grupo control estudiado no presentó
bandas de proteínas en los intervalos de peso molecular por encima de 110 kDa y en los
comprendidos entre 80-100 kDa y 40-70 kDa (TABLA 15).
El grupo control (perros sanos) presentó, por lo tanto, un patrón electroforético
de la orina que demuestra la existencia de una escasa presencia de proteínas, tal y como
indica en este grupo el cociente proteína/creatinina urinario = 0,51 ± 0,26 y la
concentración
media
total
de
proteína
excretada
por
estos
animales
(53,18 ± 25,01 mg/dl) (TABLA 13). Concentraciones en torno a los 100 mg/dl o
inferiores, en una orina con densidad normal, no son significativas(220). La electroforesis
se caracteriza principalmente por la existencia de dos bandas tenues (área relativa de
34,67% y 33,56%) presentes en prácticamente todos los animales, con pesos
moleculares en torno a los 105 kDa y 73,09 kDa. Una tercera banda de mayor
intensidad (área relativa de 48,17%) aparece en el 50% de los animales. En algunos
perros, aparecen además dos bandas de bajo peso molecular (20-40 kDa), con menor
cantidad de proteína que las tres descritas como más frecuentes (TABLA 15). Se debe
tener presente que las condiciones empleadas en el método, desnaturalizantes y sin el
- 131 -
uso de inhibidores de proteasas, pueden favorecer la aparición en la electroforesis de
proteínas de bajo peso molecular o fragmentos de otras proteínas que, en su estado
nativo y en el organismo, poseen un peso molecular mayor.
En la realización del Western blotting utilizando como anticuerpo primario
anti-IgG, no se observó esta inmunoglobulina en la orina de perros sanos. Sólo aparece
una única banda (FIGURA 10) en todos los animales que formaron el grupo control,
situada en el rango de peso molecular comprendido entre 67 kDa y 94 kDa y asociada a
la banda que en la electroforesis se relacionó con la albúmina. Su localización no
coincide con la descrita para las cadenas pesadas (45 kDa) y ligeras (25 kDa) de
IgG(299). Además, en la autorradiografìa se observaron dos señales en el marcador de
pesos moleculares, en la región de las bandas correspondientes a la albúmina (67 kDa)
y a la anhidrasa carbónica (30 kDa), que pueden asociarse también a uniones
inespecíficas del anticuerpo (FIGURA 10).
FIGURA 10: bandas observadas en el Western blotting de las orinas del grupo control al utilizar
anti-IgG. Pm = marcador de pesos moleculares. Calles 1-9 = nueve orinas de perros sanos. Uniones
inespecíficas del anticuerpo en el intervalo de 70-80 kDa (calles 1-9) y en el marcador de pesos
moleculares (67 kDa y 30 kDa). No se observan cadenas pesadas o ligeras de IgG.
- 132 -
La banda obtenida en la orina se corresponde con la descrita previamente en la
electroforesis (73,09 ± 2,91 kDa), y que se atribuye a la albúmina (FIGURA 9). El uso
de anticuerpos policlonales en nuestro estudio puede favorecer que dichas moléculas
identifiquen al azar proteínas distintas a su antígeno específico.
Una banda semejante se detecta cuando el anticuerpo primario utilizado es
anti-IgA (FIGURA 11). Del mismo modo se observan dos señales en el marcador de
pesos moleculares asociadas a la albúmina (67 kDa) y a la anhidrasa carbónica (30 kDa)
(FIGURA 11). En este caso tampoco la banda observada en la orina se corresponde con
las cadenas ligeras y pesadas de esta inmunoglobulina, aunque se ha descrito que la IgA
se puede encontrar, en pequeñas cantidades, en la orina de perros sanos producida por
tejidos linfoides de las paredes del tracto urinario(383). Esta banda se observó en los 20
animales que formaron el grupo control. También, en este caso, la existencia de esta
banda se puede atribuir al uso de anticuerpos policlonales.
FIGURA 11: bandas observadas en el Western blotting de las orinas del grupo control al utilizar
anti-IgA. Pm = marcador de pesos moleculares. Calles 1-9 = nueve orinas de perros sanos. Uniones
inespecíficas del anticuerpo en el intervalo de 70-80 kDa (calles 1-9) y en el marcador de pesos
moleculares (67 kDa y 30 kDa). No se observan cadenas pesadas o ligeras de IgA.
- 133 -
IV.3.3.4.2.- Otras determinaciones
Las determinaciones de glucosa, bilirrubina, cetonas, sangre oculta, pH,
urobilinógeno, nitritos y proteínas en la orina de los animales del grupo control,
analizadas mediante tira reactiva (TABLA 16), coincidieron con lo descrito como
normal en la especie canina, en muestras obtenidas por cateterización uretral(10, 72).
Perro
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Glucosa
-
Bilirrubina
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Cetonas
-
Sangre
Indicios
Indicios
Indicios
Indicios
+
Indicios
+
-
pH
7
7
6
7
7,5
7,5
7,5
7,5
7
6
7
6,5
7,5
7
7,5
7
6,5
7,5
7,5
6,5
Urobilinógeno Nitritos Proteínas
Normal
+
Normal
Indicios
Normal
Indicios
Normal
Normal
Indicios
Normal
Indicios
Normal
Normal
Indicios
Normal
+
Normal
Indicios
Normal
+
Normal
Indicios
Normal
+
Normal
Indicios
Normal
Indicios
Normal
+
Normal
+
Normal
+
Normal
+
Normal
Indicios
TABLA 16: datos analíticos de la orina del grupo control.
- 134 -
IV.3.4.- Excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo
Los valores medios de las distintas excreciones fraccionales en el grupo
control (TABLA 17) coincidieron con los descritos por distintos autores como normales
en el perro(198). En cuanto a los valores individuales, cabe mencionar los casos de los
perros N°5 y N°17 que presentaron una excreción fraccional de sodio (EF Na) de 1,53 y
una excreción fraccional de potasio (EF K) de 37, respectivamente. En ambos animales
no se detectaron alteraciones en otros parámetros analíticos que pudieran explicar el
origen de estos valores. Se ha descrito que las excreciones fraccionales de los distintos
electrolitos se encuentran muy influidas por la dieta del animal(135). Teniendo en cuenta
que esta variable no se tuvo en cuenta a la hora de realizar la recogida de muestras, no
se puede descartar como causa de estos valores altos.
Parámetro Media
Desv. estándar
Valor máx.
Valor mín.
EF Na
0,58
0,28
1,53
0,20
EF K
17,17
7,09
37,00
5,92
EF P
20,13
12,67
39,00
4,00
TABLA 17: valores de la excreción fraccional de sodio (EF Na), potasio
(EF K) y fósforo (EF P) del grupo control.
- 135 -
IV. Resultados y discusión: piometra
IV.4.- PIOMETRA
La sintomatología que presentan los animales con piometra está perfectamente
descrita por numerosos autores(16,
129, 186, 285)
. En nuestro estudio, los síntomas más
frecuentes fueron anorexia, depresión, poliuria y polidipsia, con un 87% de
presentación cada uno. Otros síntomas menos comunes fueron pérdida de peso (47%),
vómitos (33%), diarrea (20%) y coluria (7%) (TABLA 18). Esta sintomatología
coincide con lo aportado por diversos autores para esta enfermedad, cuya gravedad
depende, fundamentalmente, de la permeabilidad del cuello uterino(186, 285). En nuestro
estudio, el 67% de las piometras fueron de cuello abierto (TABLA 19).
Perro Anorexia Depresión Pérdida peso Vómitos Diarrea Poliuria Polidipsia Polaquiuria Coluria
21
Sí
Sí
Sí
No
No
No
No
No
No
22
Sí
Sí
Sí
Sí
No
Sí
Sí
No
No
23
Sí
Sí
No
No
No
No
No
No
No
24
No
No
No
No
No
Sí
Sí
No
No
25
Sí
Sí
Sí
No
Sí
Sí
Sí
No
No
26
Sí
Sí
No
No
Sí
Sí
Sí
No
No
27
Sí
Sí
Sí
Sí
No
Sí
Sí
No
No
28
Sí
Sí
Sí
No
No
Sí
Sí
No
No
29
Sí
Sí
Sí
No
No
Sí
Sí
No
No
30
No
No
No
No
No
Sí
Sí
No
No
31
Sí
Sí
No
Sí
No
Sí
Sí
No
Sí
32
Sí
Sí
No
No
No
Sí
Sí
No
No
33
Sí
Sí
No
No
No
Sí
Sí
No
No
34
Sí
Sí
No
Sí
No
Sí
Sí
No
No
- 136 -
35
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
No
No
TABLA 18: anamnesis y sintomatología correspondiente al grupo de perras con piometra.
En la exploración física (TABLA 19), el signo clínico encontrado más
frecuentemente fue la descarga vaginal (67%), sanguinolenta y/o purulenta, porcentaje
que coincide con lo observado por Barrera et al.(16) en 1992. El aumento de la
temperatura rectal, hallado en un 53% de los casos, parece estar asociado con la
inflamación uterina y la infección bacteriana secundaria, así como con la bacteriemia y
septicemia que pueda desarrollarse(129). Otros signos encontrados fueron deshidratación
(33%), abdomen abultado (27%) por agrandamiento del útero, mucosas pálidas (20%) y
aumento del tamaño ganglionar (20%). Por el contrario, y como es lógico, no se
observaron signos clínicos propios de otras enfermedades estudiadas en la presente
Tesis Doctoral, y que no están relacionados directamente con cuadros de piometra, tales
como ascitis o edemas, dolor a la palpación renal, lesiones cutáneas, onicogriposis,
tonsilitis ni cojeras. Cabe mencionar el hallazgo, en el 20% de los casos, de nódulos
mamarios. Aunque los tumores mamarios no se relacionan con ciclos estrales
anormales(224), la mayoría se desarrollan entre los 8 y 10 años(45), edad que coincide con
la de mayor frecuencia de presentación de piometra(129) y con la de este 20% de
animales.
- 137 -
Perro Ta rectal Deshidrat.
Mucosas
Ascitis
Edema
Dolor renal
Exudado
vaginal
Abdomen Lesiones
Aumento
Onicogriposis
Tonsilitis Cojera
abultado cutáneas
ganglios
Otros
21
39,5°
5%
Pálidas
No
No
No
No
No
No
Retrofar.
No
No
22
39,5°
5%
Normales
No
No
Sanguinolento
No
No
No
Retrofar.
No
No
23
38,0°
No
Normales
No
No
Purulento
Sí
No
No
No
No
No
24
38,6°
No
Normales
No
No
Sanguino-purul.
No
No
No
No
No
No
25
39,2°
5%
Congestivas
No
No
Purulento
No
No
No
No
No
No
Coprostasis
26
39,9°
No
Pálidas
No
No
Sanguinolento
No
No
No
No
No
No
Nódulo mamario
27
38,6°
No
Congestivas
No
No
No
No
No
No
No
No
No
Nódulo subcutáneo
28
39,2°
No
Congestivas
No
No
Sanguinolento
No
No
No
No
No
No
29
37,8°
5%
Normales
No
No
Sí
No
No
No
No
No
30
39,4°
No
Normales
No
No
Purulento
No
No
No
No
No
No
31
39,8°
No
Normales
No
No
No
Sí
No
No
No
No
No
Abdomen agudo
32
38,5°
No
Normales
No
No
Sanguino-purul.
No
No
No
Poplíteos
No
No
Nódulo mamario
33
37,9°
No
Pálidas
No
No
No
Sí
No
No
No
No
No
Nódulo mamario
34
39,9°
No
Normales
No
No
Purulento
No
No
No
No
No
No
35
38,6°
7%
Normal
No
No
Sanguinolento
No
No
No
No
No
no
No
TABLA 19: exploración física correspondiente al grupo de perras con piometra.
Enf. periodontal
Coprostasis
Los valores medios de la serie roja (TABLA 20), a excepción de los índices de
Wintrobe, son inferiores y presentaron diferencias estadísticamente significativas con
respecto al grupo control (TABLA 21). El tipo de anemia que observamos en nuestro
estudio, en el 67% de los animales, está descrita en la piometra y se caracteriza por ser
normocítica, normocrómica y no regenerativa como consecuencia del carácter crónico
de esta enfermedad inflamatoria(129).
Parámetro
Media Desv. estándar
Valor máx.
Valor mín.
RGR (x106/µ
µl)
5,41
1,11
7,96
3,93
HGB (g/dl)
12,59
2,61
18,00
8,30
HCT (%)
37
6
48
28
VCM (fl)
68,82
4,20
76,60
60,70
HCM (pg)
23,33
1,94
26,70
19,10
CHCM (g/dl)
33,93
2,47
37,30
28,90
TABLA 20: valores de la serie roja del grupo con piometra. Recuento de
glóbulos rojos (RGR); concentración de hemoglobina (HGB); valor hematocrito
(HCT); volumen corpuscular medio (VCM); hemoglobina corpuscular media
(HCM); concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM).
- 139 -
Parámetro
CONTROL
PIOMETRA
RGR (x106/µ
µl)
7,28 ± 1,13
5,41 ± 1,11
HGB (g/dl)
16,83 ± 2,00
12,59 ± 2,61
HCT (%)
52 ± 8
37 ± 6
TABLA 21: media ± desviación estándar de los parámetros de
la serie roja del grupo con piometra que presentaron diferencia
estadísticamente significativa respecto al grupo control (p <
0,01).
No se han obtenido diferencias significativas con respecto al grupo control
para el recuento plaquetario, cuya modificación no está descrita en esta enfermedad(266).
Los valores obtenidos se muestran en la TABLA 22.
PLT (x103/µ
µl)
228,07
139,18
Valor máx.
Valor mín.
497,00
89,00
TABLA 22: valores del recuento de plaquetas (PLT) del grupo con piometra.
El hallazgo más significativo de la hematología de estas perras lo constituye la
leucocitosis(125, 394), caracterizada por neutrofilia absoluta con desviación a la izquierda
indicativa de una infección grave con septicemia(68, 151, 186). El valor medio obtenido en
el presente trabajo para el recuento leucocitario ha sido de 28.170 ± 20.710
leucocitos/µl (TABLA 23), observándose una diferencia estadísticamente significativa
si se compara con el grupo control (TABLA 24), a pesar de la gran variabilidad
observada en los recuentos, que oscila entre 6.400 y 82.200 leucocitos/µl (TABLA 23).
No obstante, más de la mitad de las perras estudiadas (9 animales de 15 en total)
presentaron un recuento leucocitario superior al normal. Las observaciones descritas
- 140 -
para el recuento leucocitario se deben, como es lógico, a una neutrofilia con desviación
a la izquierda, con una media de 19.107 ± 14.067 neutrófilos segmentados/µl y un
recuento de 5.415 ± 8.444 neutrófilos bastonados/µl (TABLA 23), hecho que ya
describieron De Schepper et al.(94). En ambos casos se observaron diferencias
estadísticamente significativas con respecto al grupo control, al igual que para el
recuento de monocitos (TABLA 24), con un valor de 1.023 ± 799 monocitos/µl en el
grupo de piometras. Aunque no se ha descrito la monocitosis como característica de la
hematología de las piometras caninas, su presentación, no obstante, es lógica, pues
acompaña a procesos en los que aumentan las necesidades de macrófagos y en los que
hay acúmulo de material purulento(229).
Parámetro
Media
Desv. estándar
Valor máx.
Valor mín.
RGB (x103/µ
µl)
28,17
20,71
82,20
6,40
N. bastonados/µ
µl
5415
8444
33702
0
N. segmentados/µ
µl 19107
14067
45210
2926
Basófilos/µ
µl
0
0
0
0
Eosinófilos/µ
µl
410
478
1338
0
Linfocitos/µ
µl
2210
1542
4715
372
Monocitos/µ
µl
1023
799
2466
0
TABLA 23: valores de la serie blanca del grupo con piometra. Recuento total
(RGB) y diferencial de glóbulos blancos.
- 141 -
Parámetro
CONTROL
PIOMETRA
Significación
RGB (x103/µ
µl)
9,17 ± 3,16
28,17 ± 20,71
p < 0,001
N. bastonados/µ
µl
364 ± 426
5415 ± 8444
p < 0,01
N. segmentados/µ
µl
6198 ± 2611
19107 ± 14067
p < 0,001
421 ± 257
1023 ± 799
p < 0,05
Monocitos/µ
µl
TABLA 24: media ± desviación estándar de los parámetros de la serie blanca del
grupo con piometra que presentaron diferencia estadísticamente significativa
respecto al grupo control.
En la piometra canina, los cambios en los parámetros bioquímicos sanguíneos
más frecuentemente descritos son hiperproteinemia e hiperglobulinemia(128, 205), como
consecuencia de la deshidratación y/o de la estimulación crónica antigénica del sistema
inmune. Tal apreciación coincide con lo observado en el grupo de perras estudiado
(TABLA 25). Así, en la TABLA 26 se observa la existencia de diferencia significativa
en el cociente A/G. La disminución en los valores de este cociente y de albúmina,
respecto a los obtenidos en el grupo control (TABLA 26), indica claramente un
aumento de la concentración de globulinas. También se aprecia un aumento en la
concentración de proteínas totales, aunque sin diferencia estadísticamente significativa
con respecto al grupo control, posiblemente porque el estado de hidratación de las
perras con piometra era bastante bueno, tan sólo 4 de ellas presentaron una
deshidratación del 5% y en un caso la deshidratación fue del 7% (TABLA 19). La
diferencia estadística observada para la concentración de albúmina (TABLA 26) es más
difícil de explicar, aunque la hipoalbuminemia ha sido descrita en esta enfermedad(36).
No obstante, y como se discutirá en el apartado correspondiente a la electroforesis de
orina, la proteinuria es un signo clínico común en la piometra y entre las proteínas que
- 142 -
se excretan, la albúmina es la primera que empieza a perderse vía renal, lo que
explicaría el hallazgo de esta hipoalbuminemia. Además, se trata de animales que llevan
enfermos un período de tiempo considerablemente largo, antes de que los dueños se
decidan a acudir a la consulta del veterinario. Durante este período de tiempo, suelen
presentar anorexia más o menos acentuada, lo que puede disminuir la síntesis hepática
de albúmina y contrarrestar, en cierto grado, la hiperproteinemia consecuente con la
deshidratación y a la hiperglobulinemia. De ahí la importancia de determinar el cociente
A/G.
Parámetro
Urea (mg/dl)
52,20
57,86
252,00
17,00
Creatinina (mg/dl)
1,30
0,36
2,30
0,90
FA (UI/l)
81,47
137,80
440,00
8,00
ALT (UI/l)
40,00
55,92
234,00
10,00
BT (mg/dl)
0,37
0,21
1,00
0,10
Calcio (mg/dl)
8,97
0,55
9,70
7,90
Calcio corregido (mg/dl)
9,91
0,40
10,30
9,00
Fósforo (mg/dl)
5,05
1,41
8,70
3,10
Colesterol (mg/dl)
303,20
93,91
448,00
94,00
Sodio (mEq/l)
143,80
20,39
196,00
97,00
Potasio (mEq/l)
4,09
1,11
7,30
2,50
PT (g/dl)
8,23
1,13
11,00
6,80
Albúmina (g/dl)
2,53
0,48
3,30
1,80
Cociente A/G
0,47
0,17
0,76
0,23
TABLA 25: valores de la bioquímica sanguínea del grupo con piometra.
Concentraciones de urea, creatinina, fosfatasa alcalina (FA), alanín
aminotransferasa (ALT), bilirrubina total (BT), calcio, fósforo, colesterol, sodio,
potasio, proteínas totales (PT), albúmina y cociente albúmina-globulina (A/G).
- 143 -
Parámetro
CONTROL
PIOMETRA
Albúmina (g/dl)
3,14 ± 0,27
2,53 ± 0,48
Cociente A/G
0,88 ± 0,21
0,47 ± 0,17
TABLA 26: media ± desviación estándar de los parámetros
de la bioquímica sanguínea del grupo con piometra que
presentaron diferencia estadísticamente significativa
respecto al grupo control (p < 0,001).
El resto de parámetros bioquímicos no presentan una alteración evidente en su
determinación (TABLA 25). No obstante, y aunque estadísticamente no existan
diferencias, se debe reseñar el aumento, aunque discreto, en la concentración de urea
sanguínea (52,20 ± 57,86 mg/dl), creatinina (1,30 ± 0,36 mg/dl) y fosfatasa alcalina
(81,47 ± 137,80 UI/l), descrito por diversos autores(59,
205)
. El incremento de urea y
creatinina se atribuye a la presencia de deshidratación, ya mencionada anteriormente, y
al fallo renal que, en ocasiones, acompaña a la piometra(92). En este sentido, cabe
destacar los valores encontrados en la perra N°29 que presentó 252 mg/dl de urea y
2,3 mg/dl de creatinina. El aumento de fosfatasa alcalina en la piometra es indicativo de
daño hepatocelular por la septicemia y/o disminución de la circulación hepática y por
hipoxia celular en caso de que exista deshidratación(128). La perra N°29 también mostró
signos de colestasis como lo demuestran los valores aumentados de bilirrubina total (1
mg/dl) y fosfatasa alcalina (440 UI/l) que presentó este animal. Aunque el valor medio
de colesterol tampoco presentó diferencia estadística con el del grupo control, en un
53% de las perras observamos hipercolesterolemia asociada, en todos los casos, a
hipoalbuminemia, parámetro cuya discusión se realizó anteriormente. Se ha descrito, en
casos de niveles disminuidos de albúmina sérica, un aumento en la síntesis hepática de
colesterol, cuya finalidad parece ser el mantenimiento de la presión oncótica de la
sangre(6, 366). Por último, se ha descrito un descenso en los valores de ALT debido a la
- 144 -
inhibición, con bajos niveles de endotoxinas de E. coli, de la enzima implicada en su
síntesis(93, 397), no observado en nuestro estudio. Sí se debe mencionar que en la perra
N°30 se observó un valor de ALT de 234 UI/l atribuible, según De Schepper et al.(93), a
necrosis hepática por niveles altos de dichas endotoxinas.
Las orinas N°24 y 26 fueron prácticamente transparentes (TABLA 27), lo que
se atribuye a la existencia, como comentaremos posteriormente, de isostenuria en el
primer caso (1015) e hipostenuria en el segundo (1006). Las perras N°21, 22 y 31
mostraron una orina con color oscuro, aspecto turbio y olor fuerte (TABLA 27). En el
primer animal se relaciona con una densidad alta (1045) y un elevado número de
eritrocitos en la orina (TABLA 30), mientras que en el segundo y tercer caso, aunque su
densidad no fue tan elevada, sí encontramos elementos celulares en el N°22 (TABLA
30) y un número elevado de cristales en el N°31 (TABLA 30). De igual modo, las
orinas N°25, 27, 28 y 29 presentaron aspecto turbio (TABLA 27) atribuible a su
contenido en elementos celulares, eritrocitos y cristales(297).
Perro
Color
Aspecto
Olor
21
Oscuro
Turbio
Fuerte
22
Oscuro
Turbio
Fuerte
23
Amarillo
Claro
Normal
24
Incolora
Claro
Normal
- 145 -
25
Amarillo
Turbio
Fuerte
26
Incolora
Claro
Normal
27
Amarillo
Turbio
Normal
28
Amarillo
Muy turbio
Normal
29
Amarillo
Turbio
Fuerte
30
Amarillo
Claro
Normal
31
Oscuro
Turbio
Fuerte
32
Amarillo
Claro
Normal
33
Amarillo
Claro
Normal
34
Amarillo
Claro
Normal
35
Amarillo
Claro
Normal
TABLA 27: examen físico de la orina del grupo con piometra.
IV.4.3.2.- Densidad
En los datos obtenidos en nuestro estudio (TABLA 28) el 33% de las perras
mostraron isostenuria y el 7% hipostenuria. Tres de los 5 animales que presentaron
isostenuria (N°25, 28 y 29) manifestaron signos de fallo renal primario. Además,
también diagnosticamos fallo renal en la N°32 que presentó valores de urea y creatinina
sanguíneas aumentados y una densidad urinaria de 1020.
El valor medio de la densidad fue el único que, en el urianálisis, presentó
diferencia estadísticamente significativa con respecto al grupo control (TABLA 29). Se
caracteriza por ser muy inferior (1019 ± 10) al de dicho grupo (1033 ± 11) y por estar
próximo a la isostenuria. En la piometra está descrita la aparición de isostenuria
(densidad entre 1007 y 1015) o hipostenuria (densidad < 1007)(72) por daño tubular y,
- 146 -
por tanto, insensibilidad a la hormona antidiurética y, en casos de toxemia, por
interferencia en la reabsorción de sodio y cloro(128).
Densidad
Media
Desv. estándar
Valor máx.
Valor mín.
1019
10
1045
1006
TABLA 28: valores de la densidad urinaria del grupo con piometra.
Densidad
CONTROL
PIOMETRA
1033 ± 11
1019 ± 10
TABLA 29: media ± desviación estándar de la
densidad de la orina de los grupos control y con
piometra (p < 0,001).
En el sedimento urinario del grupo con piometra se encontraron, en el 87% de
los casos, células escamosas en número variable (TABLA 30). Su origen se atribuye a
contaminación procedente de uretra o vagina(72). Se debe tener en cuenta que la
extracción de la orina se realizó, en todos los casos, por sondaje vesical. El reducido
número de células de transición, tubulares, glóbulos blancos y cristales (TABLA 30)
encontrados en los distintos sedimentos no reviste significación clínica(296). En las
perras N°22, 26, 29 y 32 se observó un número elevado de eritrocitos (TABLA 30). En
las dos primeras parece deberse a contaminación, pues estos animales presentaron
descarga vaginal sanguinolenta. En los dos restantes se puede atribuir a fallo renal pues
- 147 -
el N°29 mostró valores de urea (252 mg/dl) y de creatinina (2,3 mg/dl) altos y en la
N°32, aunque la concentración de urea no fue tan importante (39 mg/dl) la creatinina
mostró un valor de 1,6 mg/dl.
No se observaron, en ningún caso, cilindros o bacterias (TABLA 30), aunque
está descrita la aparición de bacteriuria en casos de infección del tracto urinario
concomitante(205,
370)
. No obstante, el sedimento siempre se realizó en fresco y no se
llevaron a cabo tinciones específicas ni cultivos de orina.
Perro Céls. escam.Céls. trans. Céls. tubul. Glób. rojos Glób. blancos Cilindros Cristales
Bacterias
21
—
—
—
7/c
—
—
—
—
22
5/c
—
2/c
15/c
3/c
—
—
—
23
1/3c
—
—
1/2c
—
—
—
—
24
1/4c
—
—
—
—
—
—
—
25
1/4c
—
—
8/c
5/c
—
1 amorfo/2c
—
26
—
1/3c
—
10/c
—
—
—
—
27
1/2c
1/5c
—
3/c
—
—
1 amorfo/6c
—
28
3/c
—
—
6/c
—
—
1 amorfo/4c
—
29
1/5c
—
3/c
Incontables
—
—
1 estruvita/8c
—
30
1/4c
—
—
2/c
—
—
1 amorfo/6c
—
31
1/2c
—
—
5/c
—
—
2 amorfos/c
—
32
1/4c
—
—
15/c
—
—
—
—
33
3/c
—
—
1/c
—
—
—
—
34
2/c
—
—
3/c
—
—
2 amorfos/c
—
35
1/2c
—
—
—
—
—
1 amorfo/6c
—
TABLA 30: sedimento urinario del grupo con piometra (40x). Recuento por campo (/c) de células
escamosas, células de transición, células tubulares, glóbulos rojos, glóbulos blancos, cilindros, cristales y
bacterias.
- 148 -
proteínas
El valor medio de la concentración de proteína urinaria obtenido en este grupo
se encontró en el rango considerado normal para la especie canina, mientras que el
observado para el U P/C (TABLA 31) es indicativo de una pérdida moderada de
proteínas(366). Aún así, no se observó diferencia estadísticamente significativa de estos
parámetros con respecto al grupo control, aunque sus valores individuales fueron muy
variables. En la piometra, el depósito de complejos inmunes en el glomérulo puede
causar una glomerulopatía reversible y moderada y, consecuentemente, una
proteinuria(220) también moderada(90). Se ha descrito su aparición en un tercio de los
animales con piometra(205). En el presente estudio 3 animales mostraron valores
considerablemente altos de U P/C: 3,29 en la perra N°33, asociado a isostenuria (1012);
2,47 en la N°32, con un valor de creatinina de 1,6 mg/dl; y 2,41 en la perra N°29,
asociado a isostenuria (1015) y azotemia grave (252 mg/dl de urea y 2,3 mg/dl de
creatinina). De ellas, las dos últimas presentaron fallo renal primario. El U P/C de las
otras dos perras con fallo renal fue normal (0,28 en la N°25 y 0,27 en la N°28 y se
correspondió con una excreción de proteína baja (9,94 y 22,30 mg/dl, respectivamente).
Este hecho puede deberse a que en enfermedades glomerulares, a medida que el proceso
avanza, la proteinuria puede llegar a disminuir por una reducción de la tasa de filtración
glomerular(67, 325) y provocar la disminución del cociente U P/C(195).
- 149 -
Parámetro Media
Desv. estándar
Valor máx.
Valor mín.
U P/C
1,03
0,97
3,29
0,14
Proteínas
40,12
34,44
126,04
3,61
concentración de proteínas (mg/dl) en orina del grupo con piometra.
La piometra canina es una enfermedad de carácter hormonal que se caracteriza
por producir una glomerulopatía por depósito de complejos inmunes(166,
220)
,
responsable de una alteración renal de gravedad variable según sea la intensidad del
proceso. Dicha glomerulopatía es, la mayor parte de las veces, difícil de demostrar,
puesto que no siempre los datos analíticos demuestran un daño funcional manifiesto del
riñón, y la biopsia renal no es una técnica diagnóstica de rutina. Esto es lo que parece
ocurrir en el grupo de animales objeto del presente estudio, en los que excepto en los
cuatro diagnosticados de fallo renal (N° 25, 28, 29 y 32), los parámetros bioquímicos
renales se manifiestan sólo moderadamente alterados (TABLA 25). Conforme el cuadro
avanza, se va desarrollando progresivamente una alteración de tipo tubular(370).
Esta alteración renal, a la que se ha hecho referencia, suele ser lo
suficientemente intensa como para producir un cambio cualitativo y cuantitativo en la
eliminación de proteínas urinarias del perro, indicativo de un proceso fisiopatológico
muy complejo y difícil de explicar.
La orina de las perras con piometra se caracteriza por presentar, en la
electroforesis realizada mediante la técnica de SDS-PAGE, un evidente y significativo
- 150 -
aumento en el número de bandas (FIGURA 12, calles 2-8) cuando se compara con los
perros sanos (FIGURA 12, calle 1).
FIGURA 12: bandas observadas en la electroforesis del grupo con
piometra. Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina de una
perra del grupo control, calles 2-8 = orinas de perras del grupo con
piometra.
Mientras que en el grupo control se han encontrado hasta 5 bandas (FIGURA 8
y TABLA 15), en las perras con esta enfermedad se han identificado hasta 9 bandas
diferentes (FIGURA 13 y TABLA 32), con una diferencia estadísticamente
significativa (p < 0,001) en las frecuencias de presentación de las distintas bandas entre
ambos grupos. El número de bandas varía de un animal a otro (TABLA 32),
dependiendo del daño producido en la capacidad de filtración glomerular en el
riñón(250).
- 151 -
FIGURA 13: lectura densitométrica de la electroforesis de orina de una
perra con piometra (9 bandas).
Media ± SD Media ± SD
Pm (kDa)
Prot. (µ
µg)
Media ± SD
Área (%)
Intervalo
Pm (kDa)
N° perros
N = 15
120-130
1
130,00
2,12
42,50
110-120
0
—
—
—
*100-110
12
106,92 ± 1,88
0,86 ± 1,14
17,19 ± 22,70
90-100
0
—
—
—
80-90
10
83,49 ± 2,77
0,39 ± 0,57
7,70 ± 11,45
*70-80
14
70,29 ± 4,75
1,99 ± 1,22
39,84 ± 24,34
60-70
0
—
—
—
50-60
7
54,16 ± 1,13
0,50 ± 0,16
10,03 ± 3,19
40-50
7
42,62 ± 1,46
0,61 ± 0,35
12,19 ± 7,09
*30-40
11
35,19 ± 1,88
0,59 ± 0,39
11,71 ± 7,76
*20-30
10
27,02 ± 2,02
1,01 ± 0,49
20,13 ± 9,89
- 152 -
10
*10-20
15,23 ± 1,97
0,65 ± 0,48
13,09 ± 9,61
* Bandas observadas también en el grupo control.
TABLA 32: media ± desviación estándar (SD) del peso molecular (Pm),
cantidad de proteína (Prot.) y área de las bandas que aparecen en la orina del
grupo de piometras, con la excepción del intervalo de 120-130 kDa, en el que
sólo se observó una banda en una perra.
Las 5 bandas descritas en el grupo de perros sanos aparecen también en los
animales enfermos (TABLA 32). Como en los primeros, las encontradas con mayor
frecuencia fueron las comprendidas en los intervalos de peso molecular de 100-110 kDa
y
70-80 kDa
(TABLA
33),
con
valores
medios
de
106,92 ± 1,88 kDa
y
70,29 ± 4,75 kDa respectivamente (TABLA 32), y que parecen corresponderse, como
se ha discutido previamente, con la transferrina(348) y la albúmina(166).
Pm (kDa)
120-130
100-110
80-90
70-80
50-60
40-50
30-40
20-30
10-20
Control
—
100%
—
95%
—
—
30%
25%
50%
Piometra
7%
80%
67%
93%
47%
47%
73%
67%
67%
TABLA 33: frecuencias de presentación de las bandas observadas en los grupos control y con piometra.
La banda localizada en el intervalo de 70-80 kDa de peso molecular mostró un
aumento del área, obtenida en su lectura densitométrica, respecto a la observada en el
grupo control (TABLA 34 y FIGURA 14), aunque no fue estadísticamente
significativa.
- 153 -
Intervalo
Pm (kDa)
CONTROL
PIOMETRA
70-80
33,56 ± 20,45
39,84 ± 24,34
TABLA 34: media ± desviación estándar del área
(%) de la banda observada en el intervalo de 70-80
kDa en los grupos control y con piometra.
Sin embargo, y aunque la técnica de electroforesis proporciona información
principalmente de carácter cualitativo(249, 279), este incremento del área puede indicar la
existencia de un aumento en la cantidad eliminada de esta proteína (1,99 ± 1,22 µg)
(TABLA 32) respecto al grupo de animales sanos (1,68 ± 1,02 µg) (TABLA 15), puesto
que los valores obtenidos son referidos a una cantidad fija de proteína urinaria (5 µg)
(FIGURA 14) y lo único que cambian son las proporciones.
FIGURA 14: bandas obtenidas en el intervalo de
peso molecular de 70-80 kDa en los grupos control y
con piometra. Pm = marcador de pesos moleculares.
Calle 1 = orina grupo control. Calle 2 = orina grupo
con piometra.
- 154 -
El UP/C, como ya se ha indicado, no presentó diferencia estadísticamente
significativa entre ambos grupos, lo que demuestra que la proteinuria no fue muy
intensa, aunque los resultados obtenidos parecen indicar que la excreción de albúmina
está incrementada. En la fase inicial de las enfermedades glomerulares se ha descrito
que la albúmina representa la fracción mayor de la pérdida de proteínas(195) y, de hecho,
en el presente estudio, la proteína que se corresponde por su peso molecular con la
albúmina, presenta la mayor área media (39,84 ± 24,34 %) de cuantas bandas se
observaron en la electroforesis (TABLA 32), lo que no sucede en el grupo control
(TABLA 15). Es importante recordar que existe una hipoalbuminemia con diferencia
estadísticamente significativa respecto a los valores de albúmina sérica (TABLA 26) de
los animales sanos. Por lo tanto, es lógico considerar que la hipoalbuminemia se debe
en parte a la pérdida urinaria de esta proteína.
Como proteínas de bajo peso molecular se detectaron 5 bandas, localizadas en
los intervalos de 10-20 kDa, 20-30 kDa, 30-40 kDa (todas ellas presentes también en el
grupo control), 40-50 kDa y 50-60 kDa (FIGURA 15).
- 155 -
FIGURA 15: bandas de bajo peso molecular (10-60 kDa) obtenidas en la
electroforesis de la orina de perras con piometra. Calles 1-6 = orinas grupo
con piometra.
Entre las bandas que se observaron en ambos grupos sólo mostró diferencia
estadísticamente significativa, en cuanto a la cantidad de proteína/banda, la localizada
en el intervalo de 10-20 kDa (TABLA 35), con una disminución de este valor respecto
al grupo control. Las observadas en los intervalos de 20-30 kDa y 30-40 kDa también
presentaron esta disminución, aunque no fue significativa.
Intervalo
Pm (kDa)
CONTROL
(N = 20)
PIOMETRA
(N = 15)
10-20
2,41 ± 0,86
(n = 10)
0,65 ± 0,48
(n = 10)
cantidad de proteína (µg/banda) de los grupos
control y con piometra (p < 0,001).
- 156 -
La presencia de un mayor número de bandas de bajo peso molecular, y con
mayor frecuencia de presentación que en el caso del grupo control (TABLA 33), es una
consecuencia de la glomerulonefritis desarrollada en la piometra. No obstante, ello no
indica necesariamente que todas estas bandas sean indicativas de la eliminación de
proteínas de bajo peso molecular. No se debe olvidar que con la presente técnica se
produce la ruptura de puentes disulfuros y, posiblemente, de estructuras proteicas
unidas por enlaces no covalentes, lo que puede dar lugar a fragmentos de peso
molecular más bajo, aunque en proteínas oligoméricas, la proteína en su estado nativo
que es la que realmente se elimina por el riñón, tenga un peso molecular alto.
Es lo que ocurre en el caso de las inmunoglobulinas. El uso de
β-mercaptoetanol en el método provoca la ruptura de puentes disulfuros y la separación
de las inmunoglobulinas en cadenas pesadas y ligeras(303). Sus pesos moleculares se han
calculado alrededor de los 45 kDa y 25 kDa respectivamente(299), valores en torno a los
que se encuentran los pesos moleculares de las bandas reflejadas en la TABLA 32. La
cadenas pesadas de inmunoglobulinas deben estar incluidas, por lo tanto, en las
proteínas detectadas en el intervalo de 40-50 kDa de la electroforesis, mientras que las
cadenas ligeras lo estarían en el intervalo de 20-30 kDa. Con el fin de comprobar tal
hipótesis, se realizó un Western-blotting.
Cuando se utilizó como anticuerpo primario anti-IgG se observó, en todas las
muestras del grupo, la única banda presente en el Western-blotting del grupo control, y
que se relaciona con una unión inespecífica del anticuerpo (FIGURA 16). En este caso,
dicha banda se correspondió con la identificada en la electroforesis en el intervalo
correspondiente a la albúmina (FIGURA 12). Al igual que en dicho grupo, se
observaron dos señales en el marcador de pesos moleculares asociadas a los pesos
moleculares de 67 kDa y 30 kDa (FIGURA 16).
- 157 -
Además, en 4 animales (Nº 22, 28, 29 y 33) de los 15 que formaron este grupo,
se observaron 2 bandas en cada perro, localizadas en los intervalos de 40-50 kDa y
20-30 kDa respectivamente (FIGURA 16), y asociadas a los pesos moleculares que se
muestran en la TABLA 36.
FIGURA 16: bandas observadas en el Western blotting de las orinas
del grupo con piometra al utilizar anti-IgG. Pm = marcador de pesos
moleculares. Calle 1 = orina de perra sana, calles 2 y 3 = orinas de
perras con piometra. Uniones inespecíficas del anticuerpo en el
intervalo de 70-80 kDa (calles 1, 2 y 3) y en el marcador de pesos
moleculares (67 kDa y 30 kDa). Se observan cadenas pesada (cp) y
ligera (cl) de IgG (calle 3).
- 158 -
N°22
N°28
N°29
N°33
40-50 kDa
45,25
44,13
41,6
43,40
20-30 kDa
24,55
26,30
27,10
24,86
TABLA 36: pesos moleculares de las bandas evidenciadas
por Western blotting utilizando anti-IgG en el grupo con
piometra.
En este caso se corresponden con la inmunoglobulina G. Esta inmunoglobulina
es la que existe en mayor proporción en el plasma y, aunque su peso molecular es alto
(180 kDa), puede aparecer en la orina por alteración de la barrera glomerular(383). Entre
los animales que presentaron IgG en sus orinas se observaron las alteraciones analíticas
más acusadas en el grupo de piometras. Así, se observa azotemia de moderada a grave:
valores de urea situados entre 39 mg/dl y 252 mg/dl y de creatinina entre 1,3 mg/dl y
2,3 mg/dl; hiperfosfatemia: fósforo entre 5,8 mg/dl y 8,7 mg/dl; hipercolesterolemia:
colesterol entre 320 mg/dl y 437 mg/dl; hiperproteinemia: proteínas totales séricas entre
8 g/dl y 11 g/dl; hipoalbuminemia: albúmina entre 2,1 g/dl y 2,7 g/dl; disminución del
cociente albúmina/globulina: entre 0,23 y 0,48; isostenuria: densidad de la orina entre
1012 y 1017; aumento del cociente proteína/creatinina en orina: entre 1,31 y 3,29;
aumento de la excreción fraccional de potasio (entre 20% y 148%) y fósforo (entre 42%
y 122%). Estos resultados indican que en estos animales el daño renal fue lo
suficientemente intenso como para permitir que la IgG atravesara la barrera glomerular
y se identificara en la orina (FIGURA 16).
Cuando el anticuerpo primario utilizado fue anti-IgA también se observaron en
todos los animales las bandas atribuidas a uniones inespecíficas del anticuerpo
(FIGURA 17), a las que ya se ha hecho referencia (FIGURA 16). Además, en los
- 159 -
mismos perros que en el caso de la IgG, con daño renal, se observó una señal adicional
en los intervalos de peso molecular de 40-50 kDa y de 20-30 kDa (TABLA 37).
N°22
N°28
N°29
N°33
40-50 kDa
—
44,13
41,60
—
20-30 kDa
24,55
26,30
—
24,86
TABLA 37: pesos moleculares de las bandas evidenciadas por
Western blotting utilizando anti-IgA como anticuerpo primario
en el grupo con piometra.
En 3 de estos animales sólo se observó una banda (FIGURA 17) que podría
corresponderse, al no detectarse las correspondientes cadenas complementarias de las
inmunoglobulinas, con uniones inespecíficas del anticuerpo. Los pesos moleculares
(TABLA 37) de las bandas se correspondieron también con los descritos para las
cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas y que se han calculado alrededor de
45 kDa y 25 kDa, respectivamente(299). Las bandas observadas fueron menos intensas y
en menor número que en el caso del anticuerpo anti-IgG como se observa en la
FIGURA 17.
- 160 -
FIGURA 17: bandas observadas en el Western blotting de las orinas del
grupo con piometra al utilizar anti-IgA. Pm = marcador de pesos
moleculares. Calle 1 = orina de perra sana, calles 2-4 = tres orinas de
perras con piometra. Uniones inespecíficas del anticuerpo en el marcador
de pesos moleculares (67 kDa y 30 kDa) y en los intervalos de 70-80 kDa
(calles 1, 2, 3 y 4) y 40-50 kDa (calle 4). Se observan cadenas pesada (cp)
y ligera (cl) de IgA (calle 3).
La explicación a la menor presencia de esta inmunoglobulina respecto a la IgG
parece radicar en su peso molecular, superior al de esta última, y a su menor
concentración en el plasma. Así, mientras que los niveles séricos de IgG en el perro se
sitúan entre 1.000-2.000 mg/dl, los de IgA se han calculado entre 20-150 mg/dl(383). Por
otro lado, la inmunoglobulina A tiene un peso molecular de 160 kDa, aunque
normalmente es secretada como dímero, al que se une posteriormente una pieza
secretora alcanzando un peso molecular total de 360 kDa(383). Esto implica mayor
dificultad para atravesar la barrera glomerular y aparecer en el filtrado. El epitelio de
los túbulos renales también produce la inmunoglobulina A secretora(15, 366), por lo que
un daño grave a ese nivel podría provocar la liberación de esta inmunoglobulina a la
orina con su posterior detección. En cualquier caso, y aunque se ha descrito que la IgA
- 161 -
puede aparecer en pequeñas cantidades en la orina de perros sanos, en nuestro estudio
no se observó en el grupo control (FIGURA 11).
Al comparar el número de animales que presentaron bandas en los intervalos
de 40-50 kDa y 20-30 kDa en la electroforesis (TABLA 32) y en el Western blotting
(TABLAS 36 y 37), se observa claramente que en ambos intervalos y en el caso de la
electroforesis, este número es superior. Esto demuestra la presencia en la orina de
proteínas localizadas en esos intervalos de peso molecular, diferentes a las
inmunoglobulinas G y A.
Es importante destacar que en 10 de los 15 animales analizados aparecen
proteínas en el intervalo de peso molecular de 80-90 kDa (TABLA 32), lo que supone
la confirmación en el filtrado glomerular de proteínas de alto peso molecular (FIGURA
18), que no aparecen en el grupo control (TABLA 15). La banda localizada a este nivel
presentó un peso molecular de 83,49 ± 2,77 kDa (TABLA 32) y aparece en el 67% de
las perras con piometra (TABLA 33). La escasa área ocupada (7,70 ± 11,45%) y su
también escasa cantidad media de proteína (0,39 ± 0,57 µg) (TABLA 32) indican que
se elimina en baja proporción.
FIGURA 18: banda observada en el intervalo de 80-90 kDa en el grupo con piometras
(calles 3, 4, 6, 7 y 8). Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina de perra sana,
calles 2-8 = siete orinas de perras con piometra.
- 162 -
Por último, en una sola perra (N°35) se detectó una banda cuyo peso molecular
fue de 130 kDa. En este animal fue la banda mayoritaria, con un área relativa del
42,50% y 2,12 µg de proteína (TABLA 32), de los 5 µg que formaron la muestra. Al
relacionar el área con la concentración total de proteína (3,61 mg/dl), la banda
representó 1,53 mg/dl de la misma. No obstante, el perro N°35 presentó una densidad
de 1009, con la interferencia que esto supone, como a continuación se discute, a la hora
de valorar esos datos. Por lo demás, el animal no mostró azotemia grave ni un U P/C
elevado que indicaran mayor daño renal que el resto de animales y, así, justificar la
presencia de esta banda.
Paradójicamente, al comparar los valores medios de la excreción total de
proteínas en el grupo control (53,18 ± 25,01 mg/dl ) y en el de piometras
(40,12 ± 34,44 mg/dl ) se observa que en el primero la proteinuria es sensiblemente
mayor (TABLA 38), aunque la diferencia no es significativa.
Concentración
de proteína
(mg/dl)
CONTROL
PIOMETRA
53,18 ± 25,01
40,12 ± 34,44
TABLA 38: valores de la concentración total de proteína
(mg/dl) en la orina de los grupos control y con piometra.
La importancia de la concentración de proteína urinaria varía de acuerdo a la
densidad(338). Normalmente, concentraciones de 100 mg/dl con una densidad igual o
superior a 1020-1025, no son significativas. Sin embargo, si la orina es hipostenúrica, la
presencia de cualquier cantidad de proteína puede ser anormal(220). En nuestro estudio
se observa una diferencia estadísticamente significativa (TABLA 29) en la densidad de
- 163 -
la orina de las perras con piometra (1019 ± 10), respecto al grupo control (1033 ± 11).
Se pudo comprobar además que, en las perras que presentaron isostenuria e
hipostenuria, la concentración total de proteína en la orina osciló entre 3,61 mg/dl y
24,18 mg/dl, mientras que en el resto de animales la concentración de proteína fue
siempre superior a estos valores. La disminución en la capacidad de concentrar la orina
se produce por daño tubular y, consecuentemente, insensibilidad a la hormona
antidiurética, y también en casos de toxemia, por interferencia en la reabsorción de
sodio y cloro(128). En cualquier caso, teniendo en cuenta que el U P/C no se afecta por la
densidad y el volumen de orina(250), se puede asegurar que la proteinuria en estos perros
es discreta ya que su cociente proteína/creatinina (1,03 ± 0,97) (TABLA 31) sí fue
superior al del grupo control (0,51 ± 0,26) (TABLA 13).
En líneas generales, la proteinuria de la piometra canina se caracteriza por ser
moderada y por estar su cuantificación influida, en gran medida, por la disminución de
la densidad urinaria que caracteriza a esta enfermedad. El patrón electroforético de la
orina puede calificarse como típicamente glomerular, con un predominio en la
eliminación de proteínas de medio-alto peso molecular(158, 250, 297, 348), representado entre
otras por albúmina e inmunoglobulinas G y A. En concreto, y en cuanto a la excreción
de inmunoglobulinas en la orina, el 27% de las perras con piometra eliminaron IgG y el
7% IgA. Las proteínas de medio-alto peso molecular constituyen en este grupo el
58,9% de todas las proteínas separadas mediante electroforesis (TABLA 32). En este
sentido, es importante destacar que en el 67% de las perras con piometra se observó una
banda en el intervalo de peso molecular de 80-90 kDa (TABLA 33), lo que supone la
confirmación en el filtrado glomerular de proteínas de alto peso molecular (FIGURA
18), que no se observan en el grupo de perros sanos (TABLA 15).
- 164 -
Las determinaciones de glucosa, cetonas, urobilinógeno y nitritos en la orina
de los animales con piometra no tuvieron significación clínica (TABLA 39). Tampoco
la presencia de bilirrubina en orina aunque se ha descrito la bilirrubinuria, en ausencia
de hiperbilirrubinemia, en un 31% de perras con piometra(308). También el pH de las
orinas se encontró dentro del rango considerado normal en la especie canina:
5,00-8,50(18). En cuanto a la determinación de sangre oculta, los resultados positivos
encontrados en su análisis (TABLA 39) coincidieron con el recuento de eritrocitos en el
examen del sedimento urinario (TABLA 30) cuya discusión se realizó anteriormente.
En el análisis del contenido de proteínas, la perra N°21 (TABLA 39) presentó la
coloración más intensa de todo el grupo, con “++” de proteínas en la orina que se
correspondieron con una concentración de proteínas de 126,04 mg/dl, la más elevada de
las perras con piometra.
Perro Glucosa Bilirrubina Cetonas Sangre pH Urobilinógeno Nitritos Proteínas
21
-
+
-
+
6
Normal
-
++
22
-
+
-
+++
6
Normal
-
+
23
-
+
-
-
6,5
Normal
-
Indicios
24
-
-
-
-
6
Normal
-
Indicios
25
-
-
-
-
6
Normal
-
+
26
-
-
-
++
6
Normal
-
-
27
-
+
-
Indicios 7,5
Normal
-
+
28
-
+
-
Indicios 6
Normal
-
+
29
-
-
-
+++
6
Normal
-
+
30
-
-
-
-
6,5
Normal
-
Indicios
31
-
-
-
-
8
Normal
-
+
- 165 -
32
-
-
-
++
6
Normal
-
+
33
-
+
-
+
8
Normal
-
+
34
-
-
-
Normal
-
Indicios
35
-
-
-
Normal
-
-
Indicios 7,5
-
7,5
TABLA 39: datos analíticos de la orina del grupo de perras con piometra.
No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en las
excreciones fraccionales de sodio, potasio y fósforo del grupo con piometra con
respecto al grupo control, aunque se obtuvieron valores medios altos (TABLA 40). De
hecho, el 47% de los animales mostraron un valor de EF Na por encima de lo
considerado normal para la especie canina(198) y lo mismo ocurrió en el caso de la EF K
(67%) y de la EF P (27%). La excreción fraccional de los distintos electrolitos refleja la
función tubular(135) y, en la piometra, aunque se ha descrito que la lesión glomerular
precede a la tubular(91), también se ha descrito nefritis túbulo-intersticial moderada sin
la presencia de lesiones glomerulares específicas(370).
Parámetro Media
Desv. estándar
Valor máx.
Valor mín.
EF Na
2,65
4,80
19,00
0,11
EF K
41,82
39,57
148,00
11,00
EF P
28,34
29,38
122,00
5,00
(EF K) y fósforo (EF P) del grupo con piometra.
- 166 -
IV. Resultados y discusión: leptospirosis
IV.5.- LEPTOSPIROSIS
La leptospirosis canina es una enfermedad que cursa con una gran variedad de
síntomas. En nuestro estudio, la sintomatología presentada por los distintos animales
fue variable, tal y como se aprecia en la TABLA 41. Los síntomas más frecuentemente
observados fueron los siguientes: anorexia (70%), depresión (70%), coluria (60%),
vómitos (60%) y diarrea (50%). Con menos frecuencia se detectó polidipsia (40%),
poliuria (30%), pérdida de peso (30%) y polaquiuria (10%). Tal sintomatología
coincide con la descrita para esta enfermedad por Rentko et al.(327), Brown et al.(46),
Salgado(343) y Birnbaum et al.(33).
36
No
No
No
No
No
No
No
No
No
37
No
No
No
Sí
Sí
No
No
No
Sí
38
No
No
No
No
No
Sí
Sí
Sí
Sí
39
Sí
Sí
No
No
Sí
No
No
No
Sí
40
Sí
Sí
No
Sí
No
No
Sí
No
Sí
41
Sí
Sí
Sí
Sí
No
Sí
Sí
No
No
42
Sí
Sí
No
No
No
No
No
No
Sí
43
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
No
No
44
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
No
No
No
Sí
45
Sí
Sí
No
Sí
Sí
No
No
No
No
TABLA 41: anamnesis y sintomatología correspondiente al grupo de perros con leptospirosis.
- 167 -
La exploración física ha demostrado ser bastante inespecífica. No se han
observado frecuencias de presentación altas en ninguno de los parámetros estudiados.
Los signos clínicos descritos como más frecuentes en dicha enfermedad(46,
327, 343)
aparecen en nuestro estudio, aunque con un grado de incidencia bajo (TABLA 42). Ello
puede ser debido a que las formas más frecuentes de presentación de la leptospirosis, en
la zona geográfica en la que se ha realizado el estudio, son subaguda y crónica(343). No
se ha observado ningún caso de exudado vaginal, abultamiento abdominal, lesiones
cutáneas ni onicogriposis (TABLA 42), puesto que no son signos clínicos
característicos de esa enfermedad.
- 168 -
Ascitis Dolor Exudado Abdomen Lesiones
Aumento
Onicogriposis
Tonsilitis Cojera
vaginal abultado cutáneas
ganglios
Perro Ta rectal Deshidrat. Mucosas Edema renal
Otros
36
38,1°
No
Normales
No
No
No
No
No
No
No
No
No
37
38,0°
No
Normal
No
No
No
No
No
No
No
No
No
38
38,7°
No
Normal
No
No
No
No
Pioderma
No
No
No
No
Gingivitis
39
39,0°
No
Pálidas
No
Sí
No
No
No
No
Retrofar.
No
Sí
Nódulos pulmonares
40
38,0°
No
Normal
No
No
No
No
No
No
No
No
No
Urolitos
41
38,5°
No
Normal
No
No
No
No
No
No
No
No
No
Soplo sistólico
42
39,5°
No
Normal
No
No
No
No
No
No
No
No
Sí
Tumor prostático
43
37,7°
No
Pálidas
No
Sí
No
No
No
No
No
No
No
Abdomen agudo
44
38,9°
5%
Pálidas
No
No
No
No
No
No
No
No
No
Abdomen agudo
45
35,6°
5%
Normal
No
No
No
No
No
No
No
No
No
Abdomen agudo
TABLA 42: exploración física correspondiente al grupo de perros con leptospirosis.
No se han obtenido diferencias significativas con respecto al grupo control
para ninguno de los parámetros estudiados de la serie roja. Los valores medios para los
datos analíticos encontrados (TABLA 43) son semejantes a los descritos previamente
por otros autores(247,
327, 343, 369)
. Keenan et al.(212) describieron anemia normocítica y
normocrómica en un grupo de perros infectados experimentalmente con L. interrogans
serotipo bataviae, asociada a hemorragias y a pérdida de sangre, alteraciones no
detectadas en los animales estudiados en el presente trabajo. Tan sólo observamos
anemia como consecuencia de fallo renal en dos animales, los N°41 y 43, con valor
hematocrito de 39% y 32%, respectivamente.
Parámetro
Valor máx.
Valor mín.
RGR (x106/µ
µl)
6,55
1,05
8,30
4,71
HGB (g/dl)
14,57
2,84
18,80
9,00
HCT (%)
45
7
59
32
VCM (fl)
68,62
1,89
71,50
66,20
HCM (pg)
22,31
3,29
26,40
15,90
CHCM (g/dl)
32,52
4,78
37,60
23,10
TABLA 43: valores de la serie roja del grupo con leptospirosis. Recuento de
glóbulos rojos (RGR); concentración de hemoglobina (HGB); valor
hematocrito (HCT); volumen corpuscular medio (VCM); hemoglobina
corpuscular media (HCM); concentración de hemoglobina corpuscular media
(CHCM).
- 170 -
Tampoco se ha observado diferencia significativa en el recuento plaquetario de
este grupo (TABLA 44) respecto al control, a pesar de estar descrita una
trombocitopenia por agregación plaquetaria(169,
172, 212, 282, 328)
. No obstante, y según
estos mismos autores, dicha trombocitopenia aparece durante la fase precoz de la
enfermedad.
PLT (x103/µ
µl)
263,60
147,72
Valor máx.
Valor mín.
598,00
58,00
TABLA 44: valores del recuento de plaquetas (PLT) del grupo con
leptospirosis.
Por último, en lo que respecta a la serie blanca, las modificaciones más
frecuentemente descritas en la leptospirosis canina son leucocitosis(169,
172, 212, 328)
,
neutrofilia, linfopenia, monocitosis(270, 328) y eosinopenia(212). No obstante, el recuento
de leucocitos oscila mucho ya que depende de distintos factores, tales como gravedad
de la infección, estado inmunitario del hospedador, tiempo transcurrido desde la
primoinfección y enfermedades concomitantes(172, 343). Todo ello ayuda a explicar por
qué los valores medios de estos parámetros (TABLA 45) no presentan diferencias
significativas con respecto al grupo control. Sólo los perros N°40, 41 y 45 presentaron
recuentos leucocitarios elevados: 22.300/µl, 33.300/µl y 47.700/µl respectivamente. En
los tres animales se diagnosticó fallo renal primario. En el caso del N°41, la enfermedad
estaba muy avanzada, hasta el punto de ocasionar la muerte del animal como
consecuencia de un fallo renal crónico.
- 171 -
Parámetro
Media
Desv. estándar
RGB (x103/µ
µl)
19,61
12,46
47,70
5,50
N. bastonados/µ
µl
276
299
768
0
12520
42930
3132
N. segmentados/µ
µl 15326
Valor máx. Valor mín.
Basófilos/µ
µl
0
0
0
0
Eosinófilos/µ
µl
775
770
2016
0
Linfocitos/µ
µl
2524
1238
4509
715
Monocitos/µ
µl
708
738
2262
0
TABLA 45: valores de la serie blanca del grupo con leptospirosis. Recuento
total (RGB) y diferencial de glóbulos blancos.
En el estudio realizado de la bioquímica sanguínea (TABLA 46) sólo se ha
observado diferencia significativa para el cociente A/G (TABLA 47).
Parámetro
Urea (mg/dl)
93,60
69,95
201,00
24,00
Creatinina (mg/dl)
2,11
1,51
5,70
0,90
FA (UI/l)
40,00
62,88
213,00
6,00
ALT (UI/l)
49,90
32,71
126,00
18,00
BT (mg/dl)
0,41
0,16
0,80
0,20
Calcio (mg/dl)
9,44
0,66
10,30
8,50
Calcio corregido (mg/dl) 10,25
0,16
10,40
10,00
6,42
4,10
15,90
3,30
Fósforo (mg/dl)
- 172 -
Colesterol (mg/dl)
273,20
136,46
556,00
131,00
Sodio (mEq/l)
144,80
5,94
154,00
138,00
Potasio (mEq/l)
4,71
0,66
5,90
3,80
PT (g/dl)
7,16
1,78
10,30
4,50
Albúmina (g/dl)
2,64
0,60
3,60
1,80
Cociente A/G
0,65
0,25
1,00
0,32
TABLA 46: valores de la bioquímica sanguínea del grupo con leptospirosis.
Cociente A/G
CONTROL
LEPTOSPIROSIS
0,88 ± 0,21
0,65 ± 0,25
TABLA 47: media ± desviación estándar del cociente A/G de
los grupos control y con leptospirosis (p < 0,001).
No se han observado diferencias estadísticamente significativas para los
valores de urea y creatinina a pesar de que los valores medios obtenidos están
claramente aumentados (TABLA 46), debido al hallazgo de concentraciones
individuales considerablemente altas para estos parámetros. Así, en el caso de la urea,
los perros N°36, 40, 41, 43 y 45 presentaron concentraciones de 122 mg/dl, 134 mg/dl,
172 mg/dl, 201 mg/dl y 155 mg/dl respectivamente; en el caso de la creatinina, los
valores obtenidos para estos mismos animales fueron de 1,60 mg/dl; 2,50 mg/dl;
2,50 mg/dl; 5,70 mg/dl y 3,40 mg/dl respectivamente. En un estudio llevado a cabo por
Brown et al.(46), en perros naturalmente infectados de leptospirosis, se observó que el
90% presentaba fallo renal mientras que la afectación del hígado era menor. En nuestro
- 173 -
estudio hemos obtenido un porcentaje de fallo renal del 50%. La leptospirosis es la
causa clínica más importante de nefritis y fallo renal agudo en perros(146).
Tampoco los valores medios encontrados para la fosfatasa alcalina (FA),
alanín aminotransferasa (ALT), bilirrubina total (BT) y colesterol (TABLA 46)
presentaron diferencias significativas con el grupo control, aunque se observa un
moderado ascenso de todos ellos, a pesar de haberse descrito al hígado como el segundo
órgano más dañado en casos de leptospirosis canina(171). Sólo un 30% de los perros
mostraron algún grado de daño hepatocelular, hecho que coincide con la alteración
hepática descrita por Greene y Shotts(172) para esta enfermedad y que, sin llegar a
provocar signos clínicos de ictericia, se caracteriza por obstrucción de las vías biliares.
En este sentido, sólo el perro N°45 presentó ligera hiperbilirrubinemia, indicativa de
colestasis. Los valores plasmáticos de colesterol, aunque de modo inespecífico, se
observaron aumentados en tres perros (N°41, 43 y 45). Los tres mostraron fallo renal y,
además, en ellos se obtuvieron los valores de albúmina más bajos: 2,00 g/dl; 1,80 g/dl y
2,50 g/dl respectivamente, a pesar de que este último se encontraba deshidratado. Los
valores medios de sodio y potasio plasmáticos (TABLA 46) también fueron similares a
los del grupo control, aunque alteraciones en su concentración (hiponatremia e
hipopotasemia) se han descrito asociadas a la disfunción renal y gastrointestinal que, en
ocasiones, provoca la leptospirosis(328).
Keenan et al.(212) y Greene y Shotts(172), han descrito una hipocalcemia
relacionada con hipoalbuminemia y con la disminución de la concentración de calcio
ligado a proteínas. Sin embargo, el valor medio de calcio es sólo levemente inferior al
control y el valor medio de calcio corregido es incluso ligeramente superior (TABLA
46). El valor medio del fósforo sérico no presentó diferencia estadística respecto al
grupo control a pesar de estar aumentado (TABLA 46). En cuatro animales de los diez
- 174 -
que formaron este grupo se observó hiperfosfatemia: 6,30 mg/dl; 6,40 mg/dl;
11,40 mg/dl y 15,90 mg/dl, consecuencia del fallo renal.
En cuanto a la concentración de proteínas totales y de albúmina, se obtuvieron
valores muy diferentes (TABLA 46), lo que provoca que tampoco se detectaran
diferencias significativas con el grupo de perros sanos al comparar los valores medios.
Así, las proteínas totales oscilaron entre 4,50 g/dl del perro N°39 y 10,3 g/dl del perro
Nº 45 (TABLA 46). Esta variedad en los resultados se debe a la influencia de varios
factores, como son la edad del animal, la presencia de anticuerpos, la pérdida de
proteínas por la orina como consecuencia del daño renal e incluso la posibilidad de
hemorragias internas descritas en la enfermedad(212,
343)
. Además, el perro N°45
presentó una deshidratación del 5% (TABLA 42). El aumento de la síntesis de
inmunoglobulinas y la hipoalbuminemia consecuencia del daño renal, que caracterizan
a la leptospirosis(227), parecen ser las explicaciones más lógicas para razonar la
diferencia significativa encontrada en el cociente A/G (TABLA 47).
En la evaluación física de la orina de los perros con leptospirosis se observó
color oscuro y olor fuerte de la misma en los perros N°38, 39 y 42 (TABLA 48). Los
dos hechos se relacionan con una densidad urinaria elevada, concretamente 1042, 1046
y 1041 respectivamente, las más elevadas de todo el grupo. La orina del perro N°45
presentó un color verde, hecho que se asocia con la presencia de bilirrubina en la
orina(72) y que se confirmó por la determinación de dicho parámetro (TABLA 59)
mediante tira reactiva. En sangre presentó un valor de bilirrubina total sérica de
- 175 -
0,8 mg/dl. Se ha descrito que la bilirrubinuria, en la leptospirosis, puede preceder
generalmente a la hiperbilirrubinemia(172). El aspecto turbio de la orina N°42 se
relaciona con su gran contenido en glóbulos rojos (TABLA 50). El resto de las orinas
mostraron características normales (TABLA 48).
Perro
Color
Aspecto
Olor
36
Amarillo
Claro
Normal
37
Amarillo
Claro
Normal
38
Oscuro
Claro
Fuerte
39
Oscuro
Claro
Fuerte
40
Amarillo
Claro
Normal
41
Amarillo
Claro
Normal
42
Oscuro
Turbio
Fuerte
43
Amarillo
Claro
Normal
44
Amarillo
Claro
Normal
45
Verde
Claro
Normal
TABLA 48: examen físico de la orina del grupo con leptospirosis.
IV.5.3.2.- Densidad
El valor medio de la densidad urinaria (TABLA 49) no presentó diferencia
estadísticamente significativa con respecto al grupo control. Sólo en el caso del perro
N°41 la orina fue isostenúrica(72), hecho que coincide con lo descrito, en casos de
leptospirosis, por diversos autores(33, 227).
- 176 -
Densidad
Media
Desv. estándar
Valor máx.
Valor mín.
1029
11
1046
1014
TABLA 49: valores de la densidad de la orina del grupo con leptospirosis.
En el sedimento urinario de los perros con leptospirosis se encontraron, en
general, células escamosas en diferente cantidad (TABLA 50). Su origen se atribuye a
una contaminación procedente de uretra o vagina(72) y debido a que la extracción de la
orina se realizó por sondaje vesical. El reducido número de células de transición,
tubulares, glóbulos blancos y cristales encontrados en los distintos sedimentos (TABLA
50) no reviste significación clínica(296). En los perros N°38, 39, 40, 41 y 42 se
observaron glóbulos rojos (TABLA 50) en número superior a 5/c, límite considerado
como normal(297). En el caso de los N°40 y 41 su existencia es compatible con el daño
renal que presentaban dichos animales (urea: 134 mg/dl y 172 mg/dl respectivamente;
creatinina: 2,50 mg/dl para ambos). Por el contrario, en los perros N°38, 39 y 42 la
hematuria microscópica es atribuible a trauma iatrogénico por sondaje vesical(18). En el
perro N°45, con analítica compatible con fallo renal (urea: 155 mg/dl y creatinina:
3,40 mg/dl), se observó un cilindro granular (TABLA 50), hecho descrito en casos de
leptospirosis(327) y que se asocia con daño a nivel de túbulos renales(172). No se
observaron bacterias en ninguno de los sedimentos de estos perros (TABLA 50).
- 177 -
Perro Céls. escam. Céls. trans. Céls. tubul. Glób. rojos Glób. blancos Cilindros Cristales Bacterias
36
1/3c
—
—
2/c
4/c
—
—
—
37
—
—
—
2/c
1/c
—
1 amorfo/5c
—
38
1/8c
—
—
Incontables
—
—
1 oxalato
—
39
1/3c
2/c
3/c
Incontables
—
—
1 amorfo/8c
—
40
1/5c
—
—
Incontables
—
—
—
—
41
1/c
—
—
10/c
2/c
—
—
—
42
1/3c
—
—
Incontables
2/c
—
1 amorfo/6c
—
43
1/4c
1/6c
—
5/c
—
—
1 amorfo/4c
—
44
1/2c
—
—
—
—
—
—
—
45
1/c
—
—
3/c
—
1 granular
—
—
TABLA 50: sedimento urinario del grupo con leptospirosis (40x). Recuento por campo (/c) de células
bacterias.
proteínas
Aunque los valores medios han sido superiores a los observados en el grupo de
perros sanos, debido a la variabilidad de los resultados obtenidos no se han encontrado
diferencias estadísticamente significativas entre los valores medios del cociente U P/C y
la concentración de proteínas en la orina del grupo con leptospirosis y el grupo control,
a pesar de haberse observado valores individuales altos (TABLA 51). Así, los perros
N°37, 39, 41, 43 y 45 presentaron un U P/C de 1,94; 4,90; 3,79; 9,34 y 2,09
respectivamente. En los dos primeros no fue acompañado de otras alteraciones
- 178 -
analíticas, mientras que en los perros N°41, 43 y 45 se diagnosticó fallo renal. En la
leptospirosis y, más concretamente en el urianálisis, la proteinuria es un hallazgo
común, por lo que en algunos casos se puede observar un aumento del cociente
U P/C(33). Por otro lado, los perros N°39, 43 y 44 mostraron una concentración de
proteínas en la orina superior a 100 mg/dl, aunque sólo el N°43 mostró signos de fallo
renal.
Parámetro Media
Desv. estándar
Valor máx.
Valor mín.
U P/C
2,59
2,79
9,34
0,19
Proteínas
94,79
81,89
249,73
29,38
concentración de proteínas (mg/dl) en orina del grupo con leptospirosis.
Igual que sucede en el grupo de animales con piometra, también aquí se han
obtenido valores de U P/C normales en perros con fallo renal. Concretamente los N°36
(U P/C = 0,19) y N°40 (U P/C = 0,73) que también presentaron una tasa baja de
proteinuria (32,91 mg/dl y 29,38 mg/dl, respectivamente). Además de la explicación
aportada en los animales con piometra, en este caso parece que existe también relación
con el sexo de los animales (los dos son machos). Los perros machos también eliminan
creatinina por secreción tubular(291, 335) y esta secreción, que normalmente es mínima, se
incrementa al aumentar la concentración de creatinina sérica(373). Por esto, los U P/C
pueden ser menores de lo esperado en perros machos con fallo renal azotémico de
moderado a grave(250).
- 179 -
Como se ha comentado anteriormente, la piometra es una enfermedad que
cursa, fundamentalmente, con glomerulopatía(31,
220)
y, por tanto, con proteinuria
caracterizada por la presencia de albúmina y proteínas de tamaño molecular superior a
ésta(305). La leptospirosis, por el contrario, se caracteriza por provocar, principalmente,
una nefropatía túbulo-intersticial(138). Entre las consecuencias fisiopatológicas que de
ello se derivan, se encuentra el incremento en la excreción, también de albúmina, pero
en este caso acompañada por proteínas de tamaño molecular inferior a ella(249).
El patrón electroforético de este grupo se caracteriza, fundamentalmente, por la
eliminación de proteínas de peso molecular bajo, como consecuencia posiblemente de
la alteración en la reabsorción tubular de proteínas con este peso molecular. Cuando se
realizó el estudio electroforético de estas orinas (FIGURA 19) se identificaron hasta un
total de 8 bandas diferentes (FIGURA 20 y TABLA 52), observadas también en el
grupo de animales con piometra (FIGURA 13) y de las que 5, como ocurría en estos
últimos, se correspondieron con las únicas localizadas en el grupo control (TABLA 52).
- 180 -
FIGURA 19: bandas observadas en la electroforesis del grupo con leptospirosis.
Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina del grupo control,
calles 2-9 = orinas del grupo con leptospirosis.
- 181 -
FIGURA 20: lectura densitométrica de la electroforesis de orina de un perro con
leptospirosis (8 bandas).
Media ± SD
Prot. (µ
µg)
Media ± SD
Área (%)
109,75 ± 4,65 0,34 ± 0,30
6,86 ± 5,99
Intervalo
Pm (kDa)
N° perros
N = 10
Media ± SD
Pm (kDa)
*100-110
8
90-100
0
—
—
—
80-90
6
83,48 ± 2,36
0,14 ± 0,10
2,80 ± 1,92
*70-80
10
71,30 ± 5,18
1,13 ± 1,00
22,67 ± 19,91
60-70
0
—
—
—
50-60
5
55,46 ± 2,53
1,07 ± 1,18
21,40 ± 23,56
40-50
4
43,15 ± 1,39
0,71 ± 0,54
14,23 ± 10,72
*30-40
8
34,38 ± 1,72
0,47 ± 0,25
9,49 ± 5,03
*20-30
8
26,06 ± 1,80
0,78 ± 0,75
15,68 ± 14,90
*10-20
10
13,39 ± 1,04
1,68 ± 1,41
33,64 ± 28,13
TABLA 52: media ± desviación estándar del peso molecular (Pm), cantidad
de proteína (Prot.) y área de las bandas que aparecen en la orina del grupo con
leptospirosis.
Debido a la coincidencia de las distintas bandas entre este grupo y el de
piometras, la diferencia estadísticamente significativa que existe en sus frecuencias de
presentación es menor que cuando se compara con el grupo control (TABLA 53).
LEPTOSPIROSIS
CONTROL
PIOMETRA
p < 0,001
p < 0,01
TABLA 53: nivel de la diferencia estadísticamente
siginificativa existente entre las frecuencias de
presentación de las bandas electroforéticas del grupo con
leptospirosis y los grupos control y con piometra.
- 182 -
En la leptospirosis canina debemos destacar que, a diferencia de los grupos
anteriores, las proteínas de más bajo peso molecular, localizadas en el intervalo de
10 kDa a 40 kDa, se observaron en la mayor parte de los animales, y como se muestra
en la TABLA 54, con una frecuencia de presentación igual o superior al 80%.
Intervalo Pm (kDa) Control
Piometra
Leptospirosis
120-130
—
7%
—
100-110
100%
80%
80%
80-90
—
67%
60%
70-80
95%
93%
100%
50-60
—
47%
50%
40-50
—
47%
40%
30-40
30%
73%
80%
20-30
25%
67%
80%
10-20
50%
67%
100%
TABLA 54: frecuencias de presentación de las bandas observadas
en los grupos control, con piometra y con leptospirosis.
Cuando se aplicó un análisis de varianza sobre las 5 bandas que aparecen en
los grupos control, piometra y leptospirosis, sólo se encontraron diferencias
estadísticamente significativas, respecto a la cantidad de proteína (µg/banda), en los
intervalos de peso molecular de 100-110 kDa y 10-20 kDa (TABLA 55).
- 183 -
Intervalo
Pm (kDa)
CONTROL
(N = 20)
PIOMETRA
(N = 15)
LEPTOSPIROSIS
(N = 10)
100-110
1,73 ± 1,22 A
0,86 ± 1,14 AB
0,34 ± 0,30 B
10-20
2,41 ± 0,86 A
0,65 ± 0,48 B
1,68 ± 1,41 A
TABLA 55: media ± desviación estándar de la cantidad de proteína
(µg/banda) de los grupos control, piometra y leptospirosis. Letras
diferentes en el mismo intervalo de peso molecular implican diferencias
significativas (p < 0,05).
Así, no se observó diferencia estadística en la cantidad de proteína (µg/banda)
en el intervalo de peso molecular de 10-20 kDa respecto al grupo control, pero sí
respecto al de piometras (TABLA 55). En la leptospirosis, la excreción de la proteína
localizada en la región de la lisozima y β2-microglobulina, o de otras proteínas de peso
molecular localizado en este intervalo, parece ser mayor a la producida en los casos de
piometra (FIGURA 21).
FIGURA 21: electroforesis de las orinas de una perra
con piometra (calle 1) y con leptospirosis (calle 2).
Banda localizada en el intervalo de peso molecular de
10-20 kDa. Pm = marcador de pesos moleculares.
- 184 -
En la piometra el daño renal consiste, principalmente, en una glomerulonefritis
por depósito de complejos inmunes(166), mientras que la leptospirosis provoca, sobre
todo, una nefritis túbulo-intersticial(138). Esta lesión conlleva la disminución de la
funcionalidad tubular, como lo demuestran los valores individuales altos de la excreción
fraccional de sodio, potasio y fósforo observados en el 80%, 90% y 70%
respectivamente, de los animales de este grupo. El daño en los túbulos renales
disminuye la reabsorción de proteínas de bajo peso molecular a ese nivel, con su
consiguiente aumento en la orina. De hecho, la lisozima y la β2-microglobulina se han
utilizado para detectar un daño renal de tipo tubular, en el caso de que aparezcan en
cantidades elevadas en la orina(204, 423).
En la leptospirosis se incorporan a la orina tanto proteínas de alto (80-90 kDa)
como de bajo (40-60 kDa) peso molecular que no aparecen en el grupo de perros sanos
(TABLA 52), y que provocan un cambio en la distribución de las bandas que se
observan en ambos grupos. A ello se debe el que, en el intervalo de 100-110 kDa
(109,75 ± 4,65 kDa), se observe una diferencia estadísticamente significativa en la
cantidad de proteína/banda respecto al grupo control, con un valor medio inferior en la
leptospirosis (TABLA 55). Tal disminución se observa no sólo en el intervalo
mencionado, sino también en el resto de las 5 bandas que aparecen en ambos grupos,
incluida la ya comentada de 10-20 kDa (TABLA 52).
En el intervalo de 20-30 kDa (26,06 ± 1,80 kDa) (TABLA 52), la mayor
concentración de proteína (desde 0,30 µg en el perro N°36 hasta 2,15 µg en el perro
N°45) se observó en los animales N°36, 39, 41, 43 y 45 (FIGURA 22).
- 185 -
FIGURA 22: banda observada en el
intervalo de peso molecular de 20-30 kDa
(calle 1) en la orina del perro N°45,
perteneciente al grupo con leptospirosis. Pm
= marcador de pesos moleculares.
Estos animales, a excepción del N°39, mostraron además, las alteraciones
analíticas más acusadas: azotemia grave (urea desde 155 mg/dl a 201 mg/dl y creatinina
desde 2,5 mg/dl a 5,7 mg/dl), hiperfosfatemia (fósforo entre 6,3 mg/dl y 15,9 mg/dl),
hipercolesterolemia (colesterol desde 332 mg/dl a 556 mg/dl), hipoalbuminemia
(albúmina entre 1,8 g/dl y 2,5 mg/dl), disminución del cociente albúmina/globulina
(entre 0,32 y 0,47), aumento del cociente P/C en orina (entre 2,09 y 9,34) y, por último,
aumento en las excreciones fraccionales de sodio (entre 2% y 8%), potasio (entre 29% y
177%) y fósforo (entre 14% y 126%).
Del mismo modo, la banda localizada en el intervalo de 40-50 kDa
(43,15 ± 1,39 kDa) y una cantidad media de proteína de 0,71 ± 0,54 µg, se observó en 4
de los 5 perros (TABLA 52) que experimentaron la proteinuria mayor. Son los animales
N°39, 41, 43 y 45 (FIGURA 23), citados anteriormente, con valores de proteinuria de
249,73 mg/dl; 94,77 mg/dl; 233,72 mg/dl y 52,30 mg/dl respectivamente y los valores
más altos de U P/C (4,90; 3,79; 9,34 y 2,09).
- 186 -
FIGURA 23: banda observada en el
intervalo de peso molecular de 40-50 kDa
(calle 1) en la orina del perro N°45,
perteneciente al grupo con leptospirosis. Pm
= marcador de pesos moleculares.
Ambos intervalos de pesos moleculares coinciden con la zona de migración de
las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas(299). Su relación se comprobó
mediante la técnica de Western blotting en las orinas de este grupo.
Con los anticuerpos utilizados en este estudio (anti-IgG y anti-IgA) se
observaron, en la mayoría de los animales, las bandas asociadas a una unión
inespecífica de los anticuerpos, localizadas en el intervalo de peso molecular de
70-80 kDa (FIGURA 24). También, y por la misma razón, se visualizaron dos bandas
del marcador de pesos moleculares (67 kDa = albúmina sérica bovina y 30 kDa =
anhidrasa carbónica) (FIGURA 24), ya descritas en los grupos anteriores. Por último, y
relacionada también con el uso de anticuerpos policlonales, se observó una señal
inespecífica en el intervalo de pesos moleculares de 10-20 kDa en 5 muestras (FIGURA
24), cuya aparición coincidió con las orinas que presentaron, en la electroforesis, mayor
cantidad de proteína en este intervalo. Cuando se utilizó específicamente el anticuerpo
- 187 -
primario anti-IgG, se comprobó que las bandas observadas en los intervalos de peso
molecular de 40-50 kDa y 20-30 kDa se correspondían con cadenas pesadas y ligeras de
inmunoglobulinas en 3 perros (TABLA 56).
FIGURA 24: bandas observadas en el Western blotting de las orinas del grupo con
leptospirosis al utilizar anti-IgG. Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina grupo
control, calles 2-8 = siete orinas grupo con leptospirosis. Uniones inespecíficas del anticuerpo
en el marcador de pesos moleculares (67 kDa y 30 kDa) y en los intervalos de 70-80 kDa (calles
1, 2, 3, 4, 6 y 8), 40-50 kDa (calle 8), 20-30 kDa (calle 3) y 10-20 kDa (calles 4, 6 y 8). Se
observan cadenas pesadas (cp) y ligeras (cl) de IgG (calles 5 y 7).
N°36
N°39
N°41
N°43
N°45
40-50 kDa
43-67
—
43,23
44,95
44,90
20-30 kDa
25,7
25,33
27,25
24,53
—
TABLA 56: peso molecular (kDa) de las bandas evidenciadas por Western
blotting utilizando anti-IgG en el grupo con leptospirosis.
- 188 -
Como ya se ha indicado, estos animales se encuentran entre los que mostraron
las alteraciones analíticas renales más graves. En vista de los resultados obtenidos en el
inmunoblotting, en estos animales existe un daño de los glomérulos suficiente como
para permitir el paso de inmunoglobulina G al filtrado glomerular(195), con su posterior
fragmentación en cadenas ligeras y pesadas (FIGURA 24) al aplicar las condiciones
desnaturalizantes del método.
Cabe mencionar que, en el caso del perro N°36, el peso molecular de la banda
correspondiente a la cadena pesada de IgG (TABLA 56) no se pudo concretar porque,
posiblemente por problemas de tinción, la banda no se visualizó en la electroforesis.
Sólo podemos afirmar que se situó entre 43 kDa y 67 kDa, límites establecidos por el
marcador de pesos moleculares utilizado. Por otro lado, en los perros N°39 y 45, no se
observaron las bandas asociadas a las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas,
respectivamente (TABLA 56), aunque en la electroforesis sí se evidenciaron unas
bandas de pesos moleculares de 42,80 kDa y 24,43 kDa. Pudiera ocurrir que esas
bandas evidenciadas en los perros N°39 y 45 no se correspondan con inmunoglobulinas
y se trate de uniones inespecíficas del anticuerpo.
Con el anticuerpo primario anti-IgA se observó, además de las señales
inespecíficas a las que ya se ha hecho referencia, una señal correspondiente a cadenas
pesadas y ligeras de IgA en 2 perros, los N°41 y 43 (FIGURA 25). Estos animales
mostraron las alteraciones analíticas más evidentes y, además, presentaron IgG en sus
orinas (TABLA 56).
- 189 -
leptospirosis al utilizar anti-IgA. Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina grupo
control, calles 2-9 = ocho orinas grupo con leptospirosis. Uniones inespecíficas del anticuerpo
en el marcador de pesos moleculares (67 kDa y 30 kDa) y en los intervalos de 70-80 kDa (calles
1, 2, 3, 4, 6, 8 y 9) y 20-30 kDa (calle 3). Se observan cadenas pesadas (cp) y ligeras (cl) de IgA
(calles 5 y 7).
Los pesos moleculares de las bandas observadas (TABLA 57) coincidieron con
los descritos para las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas, aunque la
intensidad de las bandas (FIGURA 25) fue menor que en el caso de la IgG. En los
perros N°39 y 45 sólo se observó la banda de peso molecular correspondiente a las
cadenas ligeras de inmunoglobulinas (TABLA 57) por lo que, al no evidenciarse sus
respectivas cadenas pesadas, podrían corresponderse con uniones inespecíficas del
anticuerpo.
- 190 -
N°39
N°41
N°43
N°45
40-50 kDa
—
43,23
44,95
—
20-30 kDa
25,33
27,25
24,53
24,43
TABLA 57: peso molecular (kDa) de las bandas evidenciadas por
Western blotting utilizando anti-IgA como anticuerpo primario en
el grupo con leptospirosis.
Aunque sólo 5 orinas mostraron señal de quimioluminiscencia en el intervalo
de 20-30 kDa, hubo otros animales (TABLA 52) que en la electroforesis presentaron
bandas en este intervalo. Pudo ocurrir que estas proteínas no fueran cadenas ligeras de
inmunoglobulinas sino proteínas de peso molecular similar (p.ej. α1-microglobulina) o
fragmentos de otras de peso molecular alto originados por la desnaturalización de las
proteínas o por proteolisis.
En la electroforesis, además de estas bandas y como ya se ha descrito, se ha
observado la aparición de otras dos no visibles en el grupo control, localizadas en los
intervalos de peso molecular de 80-90 kDa y 50-60 kDa (TABLA 52). Ninguna de ellas
mostró diferencias estadísticamente significativas respecto a la cantidad de proteína
(µg/banda) con las observadas en el grupo de piometras (TABLA 58).
50-60 kDa
80-90 kDa
PIOMETRA
0,50 ± 0,16
0,39 ± 0,57
LEPTOSPIROSIS
1,07 ± 1,18
0,14 ± 0,10
TABLA 58: cantidad media de proteína (µg/banda) de los intervalos de
50-60 kDa y 80-90 kDa en los grupos con piometra y leptospirosis.
- 191 -
En líneas generales, se puede concluir que las proteínas de bajo peso molecular
suponen en este grupo el 70,2% de todas las proteínas, índice claro de que el patrón
electroforético de la orina de perros con leptospirosis es típicamente tubular. Este
patrón electroforético se caracteriza por la disminución en la excreción de proteínas de
medio-alto peso molecular y el aumento de las de bajo peso molecular(158, 250, 297, 348). No
obstante, se debe tener en cuenta que algunas de estas bandas pueden corresponderse
con fragmentos derivados de fenómenos de proteolisis y/o de la desnaturalización de
proteínas de mayor peso molecular, como es el caso de las inmunoglobulinas. En
cualquier caso, las condiciones aplicadas en el método, a lo largo de esta Tesis
Doctoral, han sido las mismas para todas las muestras estudiadas, hecho que aporta
veracidad a estos resultados. En el caso concreto de las inmunoglobulinas, aparecen con
una incidencia baja (aproximadamente en un tercio de los perros estudiados) y en
concentración escasa. En la región de proteínas de alto peso molecular, superior a
69 kDa, la mayor parte de las mismas se corresponde con la albúmina (TABLA 52) y, si
bien es verdad que aparecen dos proteínas con pesos moleculares mayores (80-90 kDa y
100-110 kDa) (TABLA 52) y con una frecuencia de presentación alta (60% y 80%
respectivamente) (TABLA 54), sus áreas son mínimas (2,8 ± 1,92% y 6,86 ± 5,99%
respectivamente) (TABLA 52), indicativo de que aparecen en la orina en escasa
concentración.
En la orina de los perros con leptospirosis la cuantificación de glucosa,
cetonas, urobilinógeno y nitritos no fue significativa (TABLA 59). Sólo el perro N°45
mostró indicios de glucosa (TABLA 59). Se ha descrito glucosuria, en casos de
leptospirosis, como reflejo del daño tubular que provoca la enfermedad(327, 328). También
el perro N°45 fue el único en dar significativo al análisis de bilirrubina en la orina
- 192 -
(TABLA 59). Presentaba una concentración de bilirrubina total en sangre de 0,8 mg/dl
lo
que
explicaría
la
bilirrubinuria
que,
generalmente,
precede
a
la
(172, 296)
hiperbilirrubinemia
.
El pH de las orinas del grupo de leptospirosis (TABLA 59) se encontró dentro
del rango considerado normal en la especie canina: 5,00-8,50(18).
El resultado positivo de sangre oculta en las orinas de este grupo de perros
(TABLA 59) coincidió, en todos los casos, con un recuento alto de eritrocitos en el
examen del sedimento urinario (TABLA 50), cuya discusión se realizó anteriormente.
La determinación de proteínas en 4 orinas no fue significativa, mientras que se
observaron “++” de proteínas en 4 perros de los que 2 mostraron fallo renal (N°41 y
45). El número máximo de cruces se observó en 2 animales, uno de los cuales (N°43)
mostró las alteraciones analíticas más graves de todo el grupo de perros con
leptospirosis. La cuantificación de la proteinuria mediante el método de Lowry et al.(248)
coincidió, en todos los casos, con los resultados de esta determinación.
Perro
Glucosa
Bilirrubina
Cetonas Sangre
pH Urobilinógeno Nitritos Proteínas
36
-
-
-
Indicios
6
Normal
-
+
37
-
+
-
Indicios
6,5
Normal
-
+
38
-
+
-
+++
8
Normal
-
++
39
-
+
-
+++
8
Normal
-
+++
40
-
+
-
++++
6
Normal
-
+
41
-
-
-
+++
6
Normal
-
++
42
-
-
-
+++
6,5
Normal
-
+
43
-
-
-
+
8,5
Normal
-
+++
- 193 -
44
-
+
-
-
6,5
Normal
-
++
45
Indicios
++
-
+
5
Normal
-
++
TABLA 59: datos analíticos de la orina del grupo de perros con leptospirosis.
El valor medio de la excreción fraccional de sodio, potasio y fósforo en los
perros con leptospirosis no mostró diferencia estadísticamente significativa con el grupo
control, aunque sus valores medios fueron superiores a los de este grupo y también
fueron altos (TABLA 60) para lo considerado normal en la especie canina(198). El
estudio reveló valores individuales altos en el 80% de los animales para la excreción
fraccional de sodio, 90% para la del potasio y 70% para la del fósforo. La causa de
estos resultados parece ser la alteración funcional en los túbulos renales debido a la
nefritis túbulo intersticial con la que cursa la leptospirosis(138), responsable de la pérdida
de proteínas de bajo peso molecular.
Parámetro Media
Desv. estándar
Valor máx.
Valor mín.
EF Na
2,93
2,19
8,00
0,38
EF K
76,10
56,00
177,00
17,00
EF P
54,32
31,78
126,00
14,00
(EF K) y fósforo (EF P) del grupo con leptospirosis
- 194 -
IV. Resultados y discusión: leishmaniosis
IV.6.- LEISHMANIOSIS
La leishmaniosis canina es un proceso multisistémico y, por tanto, con una
sintomatología muy variada. En nuestro estudio, la sintomatología referida por los
dueños de los perros de este grupo concuerda con la descrita por diversos autores para
esta enfermedad(76, 205, 218, 228). La frecuencia de presentación de la misma (TABLA 61)
fue la siguiente: anorexia (77%), depresión (77%), pérdida de peso (73%), poliuria
(45%), polidipsia (45%), vómitos (41%), coluria (18%) y diarrea (18%).
46
Sí
Sí
Sí
Sí
No
No
No
No
Sí
47
Sí
Sí
Sí
No
No
No
No
No
No
48
Sí
Sí
Sí
Sí
No
No
No
No
No
49
Sí
Sí
Sí
No
No
Sí
Sí
No
No
50
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
No
No
51
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
No
No
No
No
52
No
No
No
No
No
No
No
No
No
53
Sí
Sí
Sí
Sí
No
Sí
Sí
No
No
54
No
No
No
No
No
No
No
No
Sí
55
Sí
Sí
No
No
No
Sí
Sí
No
No
56
No
No
No
No
No
No
No
No
No
57
No
No
No
No
No
No
No
No
No
58
Sí
Sí
Sí
Sí
No
Sí
Sí
No
No
59
Sí
Sí
Sí
Sí
No
No sabe
No sabe
No
No
60
Sí
Sí
Sí
Sí
No
Sí
Sí
No
No
61
No
No
No
No
No
No
No
No
Sí
- 195 -
62
Sí
Sí
Sí
No sabe No sabe No sabe
No sabe
No sabe
No
63
Sí
Sí
Sí
No
No
Sí
Sí
No
No
64
Sí
Sí
Sí
No
Sí
Sí
Sí
No
No
65
Sí
Sí
Sí
No
No
No sabe
No sabe
No
No
66
Sí
Sí
Sí
No
No
Sí
Sí
No
No
67
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
No
Sí
TABLA 61: anamnesis y sintomatología correspondiente al grupo de perros con leishmaniosis.
Los signos clínicos de la leishmaniosis más frecuentes suelen ser
linfadenomegalia,
mucosas
pálidas,
esplenomegalia,
lesiones
dérmicas
y
onicogriposis(55, 76, 219). En nuestro estudio, los signos observados con mayor frecuencia
(TABLAS 62 y 63) fueron el aumento del tamaño de ganglios periféricos (73%), la
palidez de mucosas (68%) y la existencia de lesiones cutáneas de distinto tipo (64%), lo
que coincide con lo descrito por los autores citados. También se observaron
onicogriposis y grado variable de deshidratación en un 41% y 36%, respectivamente, de
los animales. El 32% de los perros mostraron dolor a la palpación renal asociado, en la
mayor parte de los casos, con azotemia grave. En tres animales (N°48, 49 y 55) se
observó cojera, hecho relacionado con neuralgias, poliartritis, polimiositis, úlceras
interdigitales o, incluso, lesiones osteolíticas o periostitis proliferativas(356). En otros
tres perros (N°54, 59 y 61) se observó fiebre. En nuestro estudio ningún animal
presentó exudado vaginal o ascitis y sólo uno de los 22 animales mostró edema en
extremidades posteriores (N°59) asociado con hipoalbuminemia (1,4 g/dl). Cabe
mencionar otros hallazgos, como epistaxis, descrita en la leishmaniosis como resultado
de trombocitopenia o de vasculitis(356) y que observamos en dos perros (N°51 y 57);
enfermedades concomitantes como otitis, consecuencia de la inmunodepresión que
provoca la leishmaniosis(356); úlceras orales en cuatro perros atribuibles a la estomatitis
urémica(219); signos oculares como conjuntivitis(76) y depósitos corneales de lípidos
- 196 -
(perro N°66), cuya aparición se asocia a alteraciones en su metabolismo que conducen a
hiperlipidemia(357,
367)
. En este sentido, este animal mostró un valor de colesterol de
335 mg/dl. Por último, se observó ictericia en el perro N°67 asociada a un valor de
bilirrubina total sérica de 3,40 mg/dl.
- 197 -
Mucosas
Onicogriposis
Edema renal vaginal abultado cutáneas
Aumento
ganglios
Tonsilitis Cojera
46
37,3°
5%
Pálidas
No
No
No
No
No
No
No
No
no
47
38,4°
7%
Pálidas
No
Sí
No
No
Sí
Sí
Retrof.
No
No
48
38,7°
No
Pálidas
No
No
No
No
Sí
No
Poplíteos
No
Sí
49
39,1°
No
Congestivas
No
No
No
No
Sí
No
Poplíteos
No
Sí
50
37,4°
5%
Pálidas
No
Sí
No
No
No
No
Poplíteos
No
No
51
38,3°
No
Pálidas
No
Sí
No
No
Sí
Sí
Poplíteos
No
No
52
37,7°
No
Pálidas
No
No
No
No
Sí
No
Retrof., poplít
No
No
53
38,0°
7%
Pálidas
No
No
No
No
Sí
No
Poplíteos
No
No
54
39,9°
No
Congestivas
No
No
No
No
Sí
Sí
Pre-escapular
No
No
55
38,0°
5%
Pálidas
No
Sí
No
No
No
No
No
No
Sí
56
38,1°
No
Normales
No
No
No
No
Sí
Sí
Poplíteos
No
No
TABLA 62: exploración física correspondiente al grupo de perros con leishmaniosis.
Otros
Nódulo subcutáneo
Úlceras orales
Epistaxis
Conjuntivitis
Prurito
Onicogriposis
Edema renal vaginal abultado cutáneas
Mucosas
Aumento
ganglios
Tonsilitis Cojera
Otros
57
39,0°
No
Normales
No
No
No
No
Sí
No
Retrof., poplít
Sí
No
Tos, epistaxis, otitis
58
38,5°
No
Normales
No
No
No
No
Sí
Sí
Poplíteos
No
No
Conjuntivitis, úlceras orales
59
39,7°
No
Pálidas
Edema
No
No
No
No
No
No
No
No
Disnea, abdomen agudo
60
39,1°
No
Pálidas
No
No
No
No
No
No
No
No
No
Temblores
61
39,6°
No
Congestivas
No
No
No
No
Sí
No
Retrof., poplít
No
No
62
38,3°
No
Pálidas
No
Sí
No
No
Sí
Sí
Poplíteos
No
No
Tos
63
37,5°
No
Pálidas
No
No
No
No
No
Sí
Retrof., poplít
No
No
Úlceras orales
64
38,5°
No
Pálidas
No
No
No
Sí
No
No
No
No
No
Conjuntivitis
65
38,2°
7%
Pálidas
No
Sí
No
No
Sí
Sí
Poplíteos
No
No
Abdomen agudo
66
38,8°
5%
Muy pálidas
No
Sí
No
No
Sí
No
No
No
No
Depósitos corneales
67
38,7°
5%
Ictéricas
No
No
No
No
No
Sí
Poplíteos
No
No
Úlceras orales
TABLA 63: exploración física correspondiente al grupo de perros con leishmaniosis.
En la leishmaniosis canina se ha descrito la aparición de una anemia
normocítica y normocrómica escasamente o nada regenerativa(76, 219), normalmente por
disminución de la eritropoyesis por enfermedad renal crónica que puede agravarse por
pérdida de sangre, por disminución de la vida media de los eritrocitos(356) o por
secuestro de hierro debido a mecanismos inflamatorios(244). Los resultados obtenidos en
nuestro estudio concuerdan con lo descrito por estos autores (TABLA 64). Así,
encontramos diferencias estadísticamente significativas entre los valores medios del
recuento de eritrocitos, hematocrito y concentración de hemoglobina del grupo con
leishmaniosis y el grupo control (TABLA 65). Por el contrario, no se observó esta
diferencia en el caso de los índices de Wintrobe, lo que indica que la anemia es no
regenerativa. Esta anemia es debida en gran medida al fallo renal, que aparece en 16 de
los 22 perros estudiados (73%), el porcentaje más alto de los tres procesos estudiados.
Parámetro
Media
Desv. estándar
Valor máx.
Valor mín.
RGR (x106/µ
µl)
4,38
1,32
6,09
1,53
HGB (g/dl)
10,11
2,84
13,50
3,50
HCT (%)
30
9
43
11
VCM (fl)
69,15
4,75
81,40
61,20
HCM (pg)
23,31
1,79
27,10
20,40
CHCM (g/dl)
33,76
2,38
37,10
28,60
TABLA 64: valores de la serie roja del grupo con leishmaniosis. Recuento de
glóbulos rojos (RGR); concentración de hemoglobina (HGB); valor hematocrito
(HCT); volumen corpuscular medio (VCM); hemoglobina corpuscular media
(HCM); concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM).
- 200 -
Parámetro
CONTROL
LEISHMANIOSIS
RGR (x106/µ
µl)
7,28 ± 1,13
4,38 ± 1,32
HGB (g/dl)
16,83 ± 2,00
10,11 ± 2,84
HCT (%)
52 ± 8
30 ± 9
TABLA 65: media ± desviación estándar de los parámetros de
la serie roja del grupo con leishmaniosis que presentaron
diferencia estadísticamente significativa respecto al grupo
control (p < 0,001).
El valor medio del recuento de plaquetas de este grupo (TABLA 66) no mostró
diferencia estadística respecto al control a pesar de que un 41% de los animales con
leishmaniosis mostraron un recuento inferior a 150.000 plaquetas/µl. En este sentido, se
ha descrito en algunos casos la aparición de trombocitopenia por supresión de la médula
ósea, autoanticuerpos, etc.(356).
PLT (x103/µ
µl)
Media
Desv. estándar
Valor máx.
Valor mín.
214,73
139,18
548,00
86,00
TABLA 66: valores del recuento de plaquetas (PLT) del grupo con leishmaniosis.
En el análisis de la serie blanca (TABLA 67) sólo observamos diferencias
estadísticas entre el valor medio del recuento de eosinófilos de este grupo y el control
(TABLA 68). El resto de parámetros mostró valores medios similares a los obtenidos
en el grupo control (TABLA 67) aunque en la leishmaniosis se ha descrito la presencia
tanto de leucocitosis con desviación a la izquierda(347) como de leucopenia(130). En
nuestro estudio hemos observado valores individuales de glóbulos blancos aumentados
y disminuidos, que no han alterado el recuento medio de leucocitos. La eosinopenia
detectada fue acompañada de alteraciones en el recuento diferencial del resto de células
- 201 -
leucocitarias, compatibles con un leucograma de estrés(229), aunque sin significación
estadística.
Parámetro
Media
Desv. estándar
Valor máx. Valor mín.
RGB (x103/µ
µl)
10,79
9,12
45,10
1,10
N. bastonados/µ
µl
628
1517
7216
0
N. segmentados/µ
µl
8346
6767
30668
748
Basófilos/µ
µl
0
0
0
0
Eosinófilos/µ
µl
114
137
536
0
Linfocitos/µ
µl
1170
1160
4961
94
Monocitos/µ
µl
532
523
2255
0
TABLA 67: valores de la serie blanca del grupo con leishmaniosis. Recuento
total (RGB) y diferencial de glóbulos blancos.
Eosinófilos/µ
µl
CONTROL
LEISHMANIOSIS
504 ± 319
114 ± 137
TABLA 68: media ± desviación estándar del recuento de
eosinófilos/µl de los grupos control y con leishmaniosis (p <
0,001).
Aunque en un estudio realizado por Palacio et al.(301) no se encontraron
diferencias significativas entre las concentraciones séricas de urea y de creatinina de un
grupo control y de otro con leishmaniosis, en nuestro caso sí se han observado dichas
diferencias. Así, los valores medios de ambos parámetros en este grupo fueron muy
superiores a los obtenidos en el control (TABLA 69). Se ha descrito la azotemia como
- 202 -
uno de los hallazgos laboratoriales más característicos de la enfermedad(76,
219)
; de
hecho, en nuestro estudio se observó en el 73% de los casos. La afectación renal que se
produce en la leishmaniosis se caracteriza por glomerulonefritis por complejos
inmunes(76, 288), nefritis intersticial(254) y, en raras ocasiones, amiloidosis(310, 355).
Parámetro
CONTROL
LEISHMANIOSIS
Urea (mg/dl)
30,15 ± 6,97
157,18 ± 106,76
Creatinina (mg/dl)
1,09 ± 0,18
4,53 ± 4,07
Fósforo (mg/dl)
4,21 ± 0,57
12,09 ± 7,38
PT (g/dl)
6,89 ± 0,64
8,87 ± 2,17
Albúmina (g/dl)
3,14 ± 0,27
2,16 ± 0,59
Cociente A/G
0,88 ± 0,21
0,35 ± 0,14
TABLA 69: media ± desviación estándar de los parámetros de la
bioquímica sanguínea del grupo con leishmaniosis que
presentaron diferencia estadísticamente significativa respecto al
grupo control (p < 0,001).
El daño hepático en la leishmaniosis no es frecuente(130), aunque se han
descrito casos que llevaron asociado un fallo hepático(122) y cuya aparición se relacionó
con un mal pronóstico de la enfermedad(393). En nuestro estudio no se observaron
diferencias estadísticas en los valores de alanín aminotransferasa (ALT), bilirrubina
total (BT) y fosfatasa alcalina (FA) entre este grupo y el control. Tampoco los valores
medios de estos parámetros (TABLA 70) superaron los establecidos como normales
para la especie canina aunque, en el caso de la FA, se observaron valores elevados en
los perros N°48, 65 y 66 (160 UI/l, 172 UI/l y 188 UI/l respectivamente) acompañado,
sólo en el N°65, de hiperbilirrubinemia discreta (BT = 0,9 mg/dl). Está descrito que la
colestasis cursa con un aumento de ambos parámetros(416), aunque en nuestro estudio no
- 203 -
se pudo confirmar su existencia. También se observó hiperbilirrubinemia en el perro
N°67 (BT = 3,40 mg/dl), sin otra alteración en la analítica sanguínea que pudiera
explicar el aumento en la concentración de bilirrubina total.
Parámetro
Urea (mg/dl)
157,18
106,76
384,00
23,00
Creatinina (mg/dl)
4,53
4,07
18,00
0,80
FA (UI/l)
58,31
55,92
188,00
3,00
ALT (UI/l)
37,68
14,89
64,00
12,00
BT (mg/dl)
0,54
0,66
3,40
0,20
Calcio (mg/dl)
7,87
1,68
9,80
4,60
Calcio corregido (mg/dl)
9,17
1,79
10,50
4,60
Fósforo (mg/dl)
12,09
7,38
28,90
3,20
Colesterol (mg/dl)
284,50
106,18
594,00
142,00
Sodio (mEq/l)
144,86
8,11
153,00
123,00
Potasio (mEq/l)
4,65
0,99
6,50
2,60
PT (g/dl)
8,87
2,17
14,00
5,40
Albúmina (g/dl)
2,16
0,59
3,20
1,30
Cociente A/G
0,35
0,14
0,74
0,13
TABLA 70: valores de la bioquímica sanguínea del grupo con leishmaniosis.
El valor medio de calcio no presentó diferencia estadísticamente significativa
respecto al grupo control. Los valores del calcio corregido se encontraron comprendidos
en un rango entre 4,60 mg/dl y 10,50 mg/dl (TABLA 70) mostrando, un 27% de los
animales, valores inferiores a los considerados normales en el perro. Cabe mencionar
- 204 -
que todos los casos de hipocalcemia se acompañaron de hiperfosfatemia. La
hipocalcemia del fallo renal, consecuencia de la reducción de la síntesis de calcitriol
entre otras causas, se encuentra estrechamente relacionada con el aumento del fósforo
sérico(314). La concentración media de fósforo plasmático presentó diferencia estadística
respecto al control, con un valor medio muy superior a éste (TABLA 69). En este
sentido, el 68% de los animales de este grupo mostraron hiperfosfatemia, con un valor
máximo de 28,90 mg/dl (TABLA 70). La hiperfosfatemia, consecuencia de la
disminución de la filtración glomerular, aparece frecuentemente en el fallo renal que
provoca la leishmaniosis(219).
Los valores medios de colesterol, sodio y potasio de este grupo no mostraron
diferencias significativas respecto al grupo control. Se observó hipercolesterolemia en
el 27% de los animales con leishmaniosis, obteniéndose un valor máximo de 594 mg/dl
(TABLA 70) para este grupo. En todos los casos estuvo asociada a niveles disminuidos
de albúmina sérica y su causa podría ser el mantenimiento de la presión oncótica de la
sangre(6, 366). Aunque el valor medio de sodio plasmático (TABLA 70) fue similar al del
grupo control (TABLA 10), encontramos 5 animales con hiponatremia no relacionada
con esta enfermedad. Se ha descrito la aparición de una pseudohiponatremia asociada al
uso de espectrofotometría de llama para la determinación de sodio y a
hiperproteinemia(107) que explicaría este hallazgo, ya que en nuestro caso ambos
condicionantes estuvieron presentes. La concentración media de potasio plasmático
(TABLA 70) también fue similar a la del grupo control (TABLA 10) aunque en los
perros N°51 y 67 se observó hipokalemia (3,20 y 2,60 mEq/l, respectivamente) y en los
N°50 y 57 hiperkalemia (6,10 y 6,50 mEq/l, respectivamente). La hipokalemia
manifestada por los dos primeros parece deberse a la gastroenteritis urémica grave y a
la poliuria marcada que presentaron (ambos tenían fallo renal), pues se ha descrito que
las causas más comunes de la disminución del potasio plasmático son las pérdidas por
- 205 -
vómitos, diarreas y por orina en casos de fallo renal poliúrico(415). La excreción
fraccional de potasio (EF K) puede ayudar a determinar el origen de la pérdida de
potasio.
Así,
una
EF K < 6%
se
relaciona
principalmente
con
pérdidas
gastrointestinales, mientras que una EF K > 6% se asocia con pérdidas urinarias(107). En
el caso de estos dos animales las EF K fueron 39 y 206, respectivamente. La
hiperkalemia observada en el perro N°50 se atribuye a la acidosis consecuente al fallo
renal crónico(415) que presentó, mientras que en el perro N°57 y una vez descartadas
todas sus posibles causas, el aumento de potasio plasmático se atribuye al uso de
heparina sódica, en lugar de heparina de litio, como anticoagulante en la extracción de
la sangre(107).
Los hallazgos laboratoriales más comunes en la analítica sanguínea de perros
con leishmaniosis son hiperproteinemia e hipoalbuminemia(76, 145). La primera de ellas
es reflejo de la hiperglobulinemia que provoca la respuesta inmune, mientras que la
segunda es el resultado, fundamentalmente, de la proteinuria que conlleva el daño renal
que produce. En nuestro estudio observamos diferencia significativa entre los valores
medios de la concentración de proteínas totales, albúmina sérica y cociente
albúmina-globulina (A/G) de este grupo y el control (TABLA 69). El promedio de las
proteínas totales séricas en estos animales fue el más elevado de todas las patologías
estudiadas, con un rango de valores situados entre 5,40 g/dl y 14 g/dl (TABLA 70). De
hecho, el 73% de los casos manifestaron hiperproteinemia y, de éstos, sólo el 44%
mostró algún grado de deshidratación clínica, representada por presencia del pliegue de
piel, hundimiento ocular y sequedad de mucosas. El valor hematocrito, en este proceso,
no es un parámetro muy útil para valorar el estado de hidratación del animal pues la
leishmaniosis se caracteriza por una anemia normocítica y normocrómica(76,
219)
, que
hemos apreciado en nuestro estudio. Así, el aumento del hematocrito por deshidratación
se enmascara con la disminución del recuento de eritrocitos por la anemia. En cualquier
- 206 -
caso, ninguno de los animales mostró un hematocrito superior al 43% (TABLA 64). La
leishmaniosis se caracteriza también por una proteinuria elevada, con la consecuente
pérdida de proteínas séricas por la orina y entre ellas, sobre todo, de albúmina.
Fundamentalmente, ésta es la causa de la hipoalbuminemia que apareció en el 73% de
los animales y, aunque el 62% de los perros que mostraron hipoalbuminemia
presentaron valores < 2 g/dl de albúmina, sólo en un caso se observó la aparición de
edema como complicación derivada de esto. Otros hechos que pudieron contribuir a la
hipoalbuminemia fueron la anorexia presente en el 77% de los perros, la diarrea
consecuencia de la enterocolitis urémica (14%) (TABLA 61) con la consiguiente
malaabsorción, y el desvío de la síntesis hepática de albúmina hacia la producción de
proteínas propias de la inflamación(62, 121). Ninguno de los animales mostró indicios de
insuficiencia hepática crónica, secuestro de líquido en cavidades corporales o pérdida
elevada de sangre que, según lo descrito por algunos autores(407), pudieran colaborar en
la aparición de hipoalbuminemia. El valor medio del cociente albúmina-globulina
(A/G) fue también el más bajo de todos los procesos que engloba nuestro estudio, con
un valor mínimo de 0,13 (TABLA 70). Es un hallazgo lógico en esta enfermedad ya
que, como se ha comentado anteriormente, la concentración de albúmina en los
animales que padecen leishmaniosis es muy baja y la de globulinas muy elevada.
En el examen de la orina en este grupo observamos color oscuro y olor fuerte
en los perros numerados como 54, 61 y 67 (TABLA 71). En los dos primeros se
atribuye a una densidad urinaria alta (1046 y 1038, respectivamente), mientras que en el
perro N°67, con una densidad de la orina de 1027, el color oscuro se asocia con
- 207 -
bilirrubinuria. En este animal, y mediante tira reactiva, la cuantificación de bilirrubina
en orina dio un resultado superior a “+++” (TABLA 80) hecho que se acompañó de una
concentración de bilirrubina total en sangre de 3,40 mg/dl. En los animales N°47, 48 y
65 se observó un aspecto de la orina muy claro (TABLA 71), atribuible a la isostenuria
que mostraron (1012, 1017 y 1013). Los perros N°50, 61 y 67 presentaron una orina de
aspecto turbio (TABLA 71) asociado al alto contenido en elementos celulares,
eritrocitos o cristales(18) que presentaron (TABLA 74). El examen físico de la orina del
resto de animales no manifestó alteraciones en ninguna de las características analizadas
(TABLA 71).
Perro
Color
Aspecto
Olor
46
Amarillo
Claro
Normal
47
Amarillo
Muy claro
Normal
48
Amarillo
Muy claro
Normal
49
Amarillo
Claro
Normal
50
Amarillo
Turbio
Normal
51
Amarillo
Claro
Normal
52
Amarillo
Claro
Normal
53
Amarillo
Claro
Normal
54
Oscuro
Claro
Fuerte
55
Amarillo
Claro
Normal
56
Amarillo
Claro
Normal
57
Amarillo
Claro
Normal
58
Amarillo
Claro
Normal
59
Amarillo
Claro
Normal
60
Amarillo
Claro
Normal
61
Oscuro
Turbio
Fuerte
- 208 -
62
Amarillo
Claro
Normal
63
Amarillo
Claro
Fuerte
64
Amarillo
Claro
Normal
65
Amarillo
Muy claro
Normal
66
Amarillo
Claro
Normal
67
Oscuro
Turbio
Fuerte
TABLA 71: examen físico de la orina del grupo con leishmaniosis.
IV.6.3.2.- Densidad
Los valores individuales de la densidad se situaron en un rango comprendido
entre 1012 y 1046 (TABLA 72), aunque el valor medio obtenido mostró diferencia
estadística respecto al grupo control (TABLA 73), a diferencia de lo descrito por otros
autores(300). El 41% de los perros mostró isostenuria asociada, en todos los casos, a
azotemia de moderada a grave (valores de urea de 118 mg/dl a 364 mg/dl y de
creatinina de 2,70 mg/dl a 9,70 mg/dl). Normalmente, la capacidad de concentrar la
orina desaparece antes que la de diluirla, hecho que ocurre cuando se pierden dos
tercios de la funcionalidad renal(72). A diferencia del grupo de las piometras, en ningún
caso se observó hipostenuria.
Densidad
Media
Desv. estándar
Valor máx.
Valor mín.
1021
8
1046
1012
TABLA 72: valores de la densidad de la orina del grupo con
leishmaniosis.
- 209 -
Densidad
CONTROL
LEISHMANIOSIS
1033 ± 11
1021 ± 8
densidad de los grupos control y con leishmaniosis (p
< 0,001).
El sedimento urinario del grupo con leishmaniosis presentó células escamosas
en diferente cantidad (TABLA 74), atribuible su presencia a contaminación procedente
de uretra o vagina(72) y provocada por el sondaje vesical realizado en la extracción de
orina. El número de células de transición, tubulares, glóbulos blancos y cristales
observado en cada orina (TABLA 74) no reviste significación clínica, pues el
sedimento de perros sanos puede contener un pequeño número de estas células sin
llevar asociada ninguna patología(297). Por el contrario, cabe destacar el elevado número
de eritrocitos (TABLA 74) observado en este grupo y que se puede asociar a la
patogénesis de la enfermedad, con afectación fundamentalmente renal. No obstante,
según los resultados obtenidos, no podemos correlacionar la hematuria microscópica
con las alteraciones clínicas y analíticas encontradas y, por tanto, con el daño renal. En
el perro N°60 se observó un único cilindro granular (TABLA 74). El hallazgo de un
número significativo de cilindros en el sedimento indica daño tubular, aunque su
ausencia no descarta una enfermedad tubular activa(251). Ninguno de los perros, como se
observa en la TABLA 74, mostró bacteriuria.
- 210 -
Perro Céls. escam.Céls. transic Céls. tubul. Glób. rojosGlób. blancos Cilindros
Cristales Bacterias
46
—
—
4/c
12/c
5/c
—
—
—
47
1/c
—
3/c
4/c
3/c
—
—
—
48
—
—
—
Incontables
—
—
—
—
49
2/c
1/c
—
2/c
1/c
—
1 estruvita/6c
—
50
—
2/c
1/c
15/c
2/c
—
—
—
51
—
1/c
—
4/c
—
—
1 amorfo/5c
—
52
—
1/3c
—
8/c
2/c
—
1 estruvita/3c
—
53
1/2c
1/4c
—
Incontables
—
—
—
—
54
1/5c
—
1/8c
4/c
1/c
—
—
—
55
1/c
—
—
2/c
—
—
1 estruvita/4c
—
56
—
1/2c
1/c
7/c
1/c
—
1 amorfo/2c
—
57
—
—
—
5/c
2/c
—
—
—
58
2/c
—
4/c
7/c
3/c
—
1 amorfo/4c
—
59
—
2/c
—
2/c
—
—
—
—
60
1/6c
1/4c
—
20/c
—
61
1/5c
3/c
—
30/c
—
—
1 amorfo/2c
—
62
1/3c
2/c
—
14/c
—
—
1 amorfo/3c
—
63
1/2c
—
—
—
—
—
—
—
64
1/2c
1/3c
—
—
—
—
1 amorfo/5c
—
65
—
1/3c
—
Incontables
—
—
1 amorfo/8c
—
66
3/c
2/c
—
8/c
—
—
—
—
67
1/2c
—
5/c
Incontables
—
—
—
—
1 granular 1 amorfo/3c
—
TABLA 74: sedimento urinario del grupo con leishmaniosis (40x). Recuento por campo (/c) de células
bacterias.
- 211 -
proteínas
La proteinuria es uno de los hallazgos laboratoriales más comunes en animales
con leishmaniosis(219). En nuestro estudio, los valores medios del cociente U P/C y la
concentración de proteína en orina observados en este grupo (TABLA 75) fueron los
más altos de todos los grupos estudiados (TABLA 76).
Parámetro Media
Desv. estándar
Valor máx.
Valor mín.
U P/C
5,45
6,95
27,48
0,38
Proteínas
154,91
142,44
493,17
27,36
concentración de proteínas (mg/dl) en orina del grupo con leishmaniosis.
Control
Piometra
Leptospirosis
Leishmaniosis
U P/C
0,51 ± 0,26
1,03 ± 0,97
2,59 ± 2,79
5,45 ± 6,95
Proteínas
53,18 ± 25,01
40,12 ± 34,44
94,79 ± 81,89
154,91 ± 142,44
TABLA 76: media ± desviación estándar del cociente proteína/creatinina (U P/C) y
la concentración de proteína (mg/dl) en orina de los grupos control, con piometra,
leptospirosis y leishmaniosis.
- 212 -
Se ha demostrado que existe buena correlación entre la excreción de proteína
en 24 horas y el U P/C obtenido en una sola muestra(10,
17, 408)
. En este sentido, se
encontró diferencia estadística (p < 0,01) entre el valor medio del U P/C de este grupo y
el control (TABLA 76), con un 73% de los animales con valores superiores a lo
considerado normal para la especie canina. Los resultados se situaron en un rango
comprendido entre 0,38 y 27,48 (TABLA 75) y, generalmente, su incremento llevó
asociado otras alteraciones analíticas como azotemia, hiperfosfatemia, etc. Tres de los
casos que mostraron valores normales de U P/C (N°51, 53 y 56) corresponden a
animales con fallo renal, los tres son machos y presentan los valores más bajos de
proteína en orina de todo el grupo (27,36; 27,49 y 30,02 mg/dl, respectivamente). Por
tanto, este hecho puede explicarse por las mismas razones que en el grupo de
leptospirosis. De todas formas, y en líneas generales, el cociente U P/C constituye un
índice excelente de la filtración glomerular en animales afectados por esta
enfermedad(300).
La proteinuria que se presenta en la leishmaniosis canina puede ser de
moderada a grave, y se desarrolla como consecuencia de una glomerulonefritis por
depósito de complejos inmunes(76) y de la instauración de una nefritis intersticial(219, 310,
355)
. La alteración renal en el grupo de perros con leishmaniosis es evidente, y se puede
comprobar tanto por los resultados obtenidos en el estudio analítico como en los del
estudio anatomopatológico. En estos animales, cuando acuden a la consulta veterinaria,
es muy frecuente que se haya instaurado anemia (TABLA 65), azotemia,
hiperfosfatemia, hipoalbuminemia (TABLA 69), isostenuria (TABLA 73) y aumento
del cociente U P/C (TABLA 76). Todo ello conlleva la aparición de un patrón
- 213 -
electroforético mixto caracterizado por la presencia de proteínas de alto y bajo peso
molecular(158, 250, 297, 348), como se puede observar en los perros de este grupo y que a
continuación se procede a desarrollar.
En la electroforesis de la orina de perros con leishmaniosis hemos obtenido
hasta un total de 11 bandas diferentes siendo, por tanto, el grupo estudiado que presenta
mayor número de bandas (FIGURAS 26 y 27).
FIGURA 26: lectura densitométrica de la electroforesis de orina de un perro con
leishmaniosis (11 bandas).
- 214 -
FIGURA 27: electroforesis del grupo con leishmaniosis. Pm = marcador de
pesos moleculares. Calle 1 = orina del grupo control, calles 2-9 = orinas del
grupo con leishmaniosis.
El patrón electroforético de la orina en este grupo es marcadamente diferente al
descrito en los perros sanos, tal y como lo demuestra el estudio estadístico realizado de
las frecuencias de presentación de las distintas bandas, en el que se observa una
diferencia estadísticamente significativa entre ambos grupos (p < 0,001). Si se compara
este esquema electroforético con el de los distintos grupos analizados (TABLA 77), se
observa claramente que los perros con leishmaniosis pierden proteínas de diferente peso
molecular (FIGURA 27), aunque es evidente que las que aparecen en mayor número de
animales son las de peso molecular medio y bajo, localizadas en los intervalos
comprendidos entre 70-80 kDa y 10-60 kDa (TABLA 77).
- 215 -
Intervalo Control Piometra Leptospirosis Leishmaniosis
—
—
—
5%
140-150
130-140
—
—
—
9%
120-130
—
7%
—
—
110-120
—
—
—
14%
100-110
100%
80%
80%
82%
80-90
—
67%
60%
45%
70-80
95%
93%
100%
100%
50-60
—
47%
50%
100%
40-50
—
47%
40%
86%
30-40
30%
73%
80%
100%
20-30
25%
67%
80%
95%
10-20
50%
67%
100%
95%
TABLA 77: frecuencias de presentación de las bandas observadas en
los grupos control, piometra, leptospirosis y leishmaniosis.
Se observan también proteínas de alto peso molecular (80-150 kDa), aunque en
menor número de animales, como consecuencia quizás del diferente grado de daño
renal entre animales de forma individual (TABLA 77).
En la TABLA 78 se detalla el valor medio del área ocupada por cada banda,
junto con la media de su peso molecular y la cantidad media de proteína. Al realizar el
análisis estadístico del área que ocupó cada banda y, por tanto, de la cantidad de
proteína/banda, sólo se observó diferencia estadísticamente significativa en los
intervalos comprendidos entre 100-110 kDa y 10-20 kDa, respecto al grupo control en
los dos intervalos y con la leptospirosis en el de 10-20 kDa (TABLA 79). Se observó
una disminución de este valor en la leishmaniosis, respecto al resto de grupos (TABLA
79). Esto no indica necesariamente que la eliminación de proteínas localizadas en estos
- 216 -
intervalos sea menor, puesto que los valores obtenidos son referidos a una cantidad fija
de proteína urinaria (5 µg) y lo único que cambian son las proporciones.
Media ± SD Media ± SD
Prot. (µ
µg)
Área (%)
Intervalo
Pm (kDa)
N° perros
N = 22
Media ± SD
Pm (kDa)
140-150
1
143,00
0,03
0,50
130-140
2
132,00 ± 0,00
0,03 ± 0,01
0,50 ± 0,14
120-130
0
—
—
—
110-120
3
113,67 ± 1,53
0,03 ± 0,02
0,50 ± 0,30
*100-110
18
102,01 ± 4,46
0,11 ± 0,15
2,21 ± 2,95
90-100
0
—
—
—
80-90
10
83,65 ± 1,34
0,11 ± 0,06
2,10 ± 1,25
*70-80
22
71,32 ± 5,32
1,96 ± 1,04
39,20 ± 20,82
60-70
0
—
—
—
50-60
22
54,43 ± 1,79
0,98 ± 0,87
19,65 ± 17,43
40-50
19
43,89 ± 1,53
0,80 ± 0,58
16,07 ± 11,54
*30-40
22
35,13 ± 1,15
0,31 ± 0,23
6,27 ± 4,64
*20-30
21
26,12 ± 1,63
0,66 ± 0,33
13,15 ± 6,59
*10-20
21
16,05 ± 1,50
0,29 ± 0,22
5,81 ± 4,35
TABLA 78: media ± desviación estándar del peso molecular (Pm),
cantidad de proteína (Prot.) y área de las bandas que aparecen en la orina
del grupo con leishmaniosis, con la excepción del intervalo de 140-150
kDa, en el que sólo se observó una banda en un perro.
- 217 -
Intervalo
Pm (kDa)
CONTROL
(N = 20)
PIOMETRA
(N = 15)
LEPTOSPIROSIS
(N = 10)
LEISHMANIOSIS
(N = 22)
100-110
1,73 ± 1,22
A
0,86 ± 1,14
AB
0,34 ± 0,30
B
0,11 ± 0,15
B
10-20
2,41 ± 0,86
A
0,65 ± 0,48
B
1,68 ± 1,41
A
0,29 ± 0,22
B
TABLA 79: media ± desviación estándar de la cantidad de proteína (µg/banda) de los grupos
control, piometra, leptospirosis y leishmaniosis. Letras diferentes en el mismo rango de peso
molecular implican diferencias significativas (p < 0,05).
Las bandas observadas con mayor frecuencia fueron las de peso molecular
bajo (TABLA 77), entre las que se encuentran las localizadas en los intervalos de
20-30 kDa (26,12 ± 1,63 kDa) y 40-50 kDa (43,89 ± 1,53 kDa), encontradas en 21 y 19
animales respectivamente (TABLA 78). Al igual que en los grupos anteriores, en estos
intervalos están incluidas las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas. Al realizar
el Western blotting con el fin de comprobar la existencia de pérdida de
inmunoglobulinas vía renal, y contribuir por lo tanto a la confirmación de la lesión del
riñón, se obtuvo un resultado positivo en un porcentaje elevado de animales (68%). Con
ambos anticuerpos se observó también una señal inespecífica en la banda localizada en
el intervalo de 70-80 kDa en la electroforesis y en dos bandas del marcador de pesos
moleculares (FIGURAS 28 y 29), discutidas en los grupos anteriores. Al utilizar
anti-IgG se observaron dos bandas muy intensas en 15 perros de los 22 que forman este
grupo. De estos 15 animales, 13 presentaron fallo renal con alteraciones analíticas tan
acusadas que explicarían el paso de IgG a través de la barrera de filtración glomerular.
Los dos restantes (N°61 y 64) no mostraron fallo renal, aunque sus U P/C fueron los
más elevados de los perros sin fallo renal de este grupo (4,71 en el perro N°61 y 4,66 en
el N°64) ya que el resto de perros sin fallo renal y que no eliminaron IgG en sus orinas,
presentaron un U P/C comprendido entre 0,38 y 1,61. Por tanto, se observa que, aunque
los resultados de la bioquímica plasmática son similares en estos animales, hay una
clara diferencia en la eliminación de proteínas por orina cuantificada por el U P/C, que
- 218 -
implica una mayor lesión glomerular y la eliminación de IgG. La banda de mayor peso
molecular (43,89 ± 1,53 kDa) se observó, en todos los casos, en el intervalo de
40-50 kDa, correspondiéndose con las cadenas pesadas de IgG (FIGURA 28). La de
peso molecular más bajo (26,12 ± 1,63 kDa), localizada también en todos los animales
en el intervalo de 20-30 kDa, se asocia a las cadenas ligeras de IgG (FIGURA 28). En
tres animales sólo se observó la banda de peso molecular relacionado con las cadenas
pesadas de inmunoglobulinas (FIGURA 28) por lo que, al no evidenciarse sus
respectivas cadenas ligeras, puede corresponder a uniones inespecíficas del anticuerpo.
leishmaniosis al utilizar anti-IgG. Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina
grupo control, calles 2-9 = ocho orinas grupo con leishmaniosis. Uniones inespecíficas del
anticuerpo en el marcador de pesos moleculares (67 kDa y 30 kDa) y en los intervalos de
70-80 kDa (calle 1) y 40-50 kDa (calles 2, 4 y 9). Se observan cadenas pesadas (cp) y
ligeras (cl) de IgG (calles 3, 5, 6, 7 y 8).
Cuando el anticuerpo utilizado fue anti-IgA, se observaron dos bandas en 12
perros; todos ellos presentaron también IgG en sus orinas. Por tanto, un 80% de los
animales que eliminaron IgG excretaban también IgA. La banda de mayor peso
molecular se situó en el intervalo de 40-50 kDa (FIGURA 29) y se corresponde con
cadenas pesadas de IgA, mientras que la localizada en el intervalo de 20-30 kDa
- 219 -
(FIGURA 29) se asocia a cadenas ligeras de esta inmunoglobulina. La señal observada
fue mucho menos intensa y, como se ha comentado, se visualizó en menor número de
animales que la IgG. No se debe olvidar que esta inmunoglobulina tiene menor
concentración en el plasma y que su peso molecular es mayor(383). Todo esto favorece
que su eliminación por el riñón, aunque exista un fuerte daño glomerular, sea menor. En
dos orinas sólo se observó la banda de peso molecular relacionado con las cadenas
ligeras de inmunoglobulinas (FIGURA 29). Al no observarse sus respectivas cadenas
pesadas, pueden atribuirse a uniones inespecíficas del anticuerpo.
leishmaniosis al utilizar anti-IgA. Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina
grupo control, calles 2-9 = 8 orinas grupo con leishmaniosis. Uniones inespecíficas del
anticuerpo en el marcador de pesos moleculares (67 kDa y 30 kDa) y en los intervalos
de 70-80 kDa (calle 1) y 20-30 kDa (calles 2 y 9). Se observan cadenas pesadas (cp) y
ligeras (cl) de IgA (calles 3, 5, 6, 7 y 8).
Al comparar el número de animales que presentaron estas bandas en la
electroforesis (TABLA 78) y en el Western blotting, se observa que, en ambos
intervalos y en el primer caso, este número es superior. Esto demuestra la aparición en
la orina de proteínas de bajo peso molecular, diferentes a las inmunoglobulinas G y A.
- 220 -
En la electroforesis de este grupo también se visualizaron, en todos los perros
(TABLA 77), bandas en los intervalos de 70-80 kDa, 50-60 kDa y 30-40 kDa
(FIGURA 30), con pesos moleculares de 71,32 ± 5,32; 54,43 ± 1,79 y 35,13 ± 1,15 kDa
respectivamente (TABLA 78).
FIGURA 30: bandas observadas en los intervalos de 70-80 kDa, 50-60 kDa y 30-40 kDa en la
electroforesis de la orina de perros con leishmaniosis. Pm = marcador de pesos moleculares.
Calle 1 = orina grupo control, calles 2-9 = ocho orinas grupo con leishmaniosis.
En intervalos de peso molecular mayor la frecuencia de presentación de las
distintas bandas disminuyó en gran medida. Sólo la banda localizada en el intervalo de
100-110 kDa mostró una presentación elevada (82%), al igual que ocurrió en los perros
sanos (100%), con piometra (80%) y con leptospirosis (80%) estudiados (TABLA 77).
En los intervalos de 110-120 kDa y de 130-150 kDa se visualizó una banda en 6
animales: N°46, 58 y 62 (113,67 ± 1,53 kDa); N°55 y 67 (132,00 ± 0,00 kDa) y N°66
(143,00 kDa) (FIGURA 31).
- 221 -
FIGURA 31: bandas observadas en los intervalos de 130-150 kDa (calles 3, 4 y 6) y
110-120 kDa (calles 3, 4 y 6) en la electroforesis de orina de los perros con leishmaniosis.
Pm = marcador de pesos moleculares. Calle 1 = orina grupo control, calles 2-7 = seis
orinas grupo con leishmaniosis.
De estos 6 perros, sólo uno (N°55) no mostró en el Western blotting cadenas
ligeras y pesadas de IgG y su analítica presentó como única alteración evidente
hiperfosfatemia (6,90 mg/dl). El resto de los animales (N°46, 58, 62, 66 y 67)
mostraron alteraciones muy acusadas: azotemia grave (urea desde 118 mg/dl a
384 mg/dl y creatinina desde 2,80 mg/dl a 7,70 mg/dl), hiperfosfatemia (fósforo entre
14,10 mg/dl y 22,70 mg/dl), hipercolesterolemia (colesterol desde 335 mg/dl a
594 mg/dl), hipoalbuminemia (albúmina entre 1,60 g/dl y 2,50 mg/dl), disminución del
cociente albúmina/globulina (entre 0,20 y 0,45), aumento del cociente P/C en orina
(entre 2,32 y 14,42) y, por último, aumento en las excreciones fraccionales de sodio
(entre 4% y 24%), potasio (entre 85% y 325%) y fósforo (55% sólo en el N°58).
Según los resultados obtenidos, la electroforesis de orina de los animales con
leishmaniosis demuestra la presencia de un patrón proteico mixto, con presencia de
proteínas de bajo y alto peso molecular (FIGURA 27). Así, las proteínas de bajo peso
molecular, es decir aquellas de peso molecular inferior a la albúmina según Biewenga et
al.(32), constituyen el 57,9% de todas las proteínas, y el resto se reparte entre proteínas
de medio-alto peso molecular. Estos resultados muestran la existencia de un importante
daño a nivel glomerular y tubular, aunque en este último caso se debe tener presente
- 222 -
que las condiciones del método empleado, desnaturalizantes y sin el uso de inhibidores
de proteasas, pueden provocar la aparición en la electroforesis de proteínas de bajo peso
molecular (como las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas) o fragmentos de
otras proteínas que, en su estado nativo y en el organismo, cuentan con un peso
molecular mayor. Los resultados observados en el Western blotting, sí demuestran
claramente que el daño glomerular existe, ya que la proporción de cadenas pesadas y
ligeras observadas en este grupo es la más elevada de los tres procesos estudiados, tanto
para la inmunoglobulina G (68%), como en menor medida para la A (55%).
El análisis del contenido en glucosa, cetonas, urobilinógeno y nitritos de la
orina, en los perros con leishmaniosis, no reveló importancia clínica (TABLA 80). Al
igual que la determinación de bilirrubina que sólo fue significativa en el perro N°67
(TABLA 80) y que, como se ha comentado anteriormente, se relaciona con una
bilirrubinemia de 3,40 mg/dl. La cuantificación de sangre oculta mostró resultado
positivo en grado variable (TABLA 80) en un 86% de los casos, y se correlaciona con
lo observado en el sedimento urinario (TABLA 74). El pH urinario de todos los perros
(TABLA 80) se encontró dentro del rango establecido como fisiológico para esta
especie(18).
En la determinación del contenido de proteínas, 18 muestras presentaron “++”
o más de “++” en la orina. De las 4 orinas que mostraron “+”, 2 se correspondieron con
valores de U P/C normales y las dos restantes, con U P/C levemente aumentados (0,76
y 1,61). La interpretación de estos tests debe realizarse conjuntamente con la densidad
de la orina porque una reacción positiva es más significativa en una orina diluida que en
una concentrada. Como se ha comentado anteriormente, el 41% de los animales
- 223 -
mostraron una orina isostenúrica con la interferencia que esto supone en la
cuantificación de la proteinuria. Estos tests dan una intensidad de color máxima para
todas las concentraciones proteicas iguales o superiores a 1 g/dl y, por tanto, no son
útiles para valorar la magnitud de la proteinuria por encima de este valor(106).
Perro Glucosa Bilirrubina Cetonas Sangre pH Urobilinóg. Nitritos Proteínas
46
-
+
-
++
6,5
Normal
-
++++
47
-
-
-
+
6
Normal
-
++++
48
-
-
-
Normal
-
++++
49
-
-
-
+
6
Normal
-
+++
50
-
-
-
+++
6
Normal
-
++++
51
-
-
-
+
6
Normal
-
+
52
-
-
-
++
6,5
Normal
-
++
53
-
-
-
++++
6
Normal
-
++
54
-
+
-
-
6
Normal
-
+
55
-
+
-
+
6,5
Normal
-
+
56
-
-
-
++
6
Normal
-
++
57
-
+
-
++
7,5
Normal
-
+
58
-
-
-
++
6
Normal
-
+++
59
-
-
-
+
6,5
Normal
-
++++
60
-
-
-
+++
6,5
Normal
-
++++
61
-
+
-
+++
7
Normal
-
++++
62
-
-
-
++
7
Normal
-
++++
63
-
-
-
-
6
Normal
-
++++
64
-
+
-
-
8
Normal
-
+++
65
-
-
-
Normal
-
+++
66
-
-
-
Normal
-
+++
67
-
>+++
-
Normal
-
++++
++++ 6,5
++++ 7,5
++
6
++++ 6,5
TABLA 80: datos analíticos de la orina del grupo de perros con leishmaniosis.
- 224 -
En la leishmaniosis, los complejos inmunes provocan una reacción
inflamatoria secundaria(202) y la disminución de la perfusión de los capilares
peritubulares conduce a isquemia tubular y del tejido intersticial(350). Si se tiene en
cuenta que la excreción fraccional de los distintos electrolitos refleja la función
tubular(135), los altos valores obtenidos en las excreciones fraccionales (TABLA 81) y la
consecuente diferencia estadística que se ha encontrado entre éstos y el grupo control
(TABLA 82), parecen consecuencia lógica de la enfermedad. Los valores individuales
de la EF Na estuvieron en un rango comprendido entre 0,10 y 24,30 (TABLA 81),
observándose un 73% de los mismos por encima de lo considerado normal para el
perro. En el caso de la EF K, los resultados oscilaron entre 11 y 413 (TABLA 81) y el
porcentaje que mostró valores altos se situó en un 82%. En ambos casos, estos
resultados se relacionaron, en líneas generales, con el resto de parámetros analíticos
evaluados. La EF P (TABLA 81) requiere mención aparte puesto que, en este caso, el
porcentaje de animales que mostraron valores altos fue muy inferior, concretamente, un
41%. Este hecho parece relacionarse con la hiperfosfatemia que, en un 68%,
manifestaron los perros de este grupo y, como ésta, el menor número de animales con
un EF P alto, es consecuencia de la disminución de la filtración glomerular y, por tanto,
de la excreción de fósforo.
Parámetro Media
Desv. estándar
Valor máx.
Valor mín.
EF Na
5,03
5,76
24,30
0,10
EF K
125,23
112,67
413,00
11,00
EF P
49,68
40,96
157,00
3,00
(EF K) y fósforo (EF P) del grupo con leishmaniosis.
- 225 -
Parámetro
CONTROL
LEISHMANIOSIS
Significación
EF (Na)
0,58 ± 0,28
5,03 ± 5,76
p < 0,05
EF (K)
17,17 ± 7,09
125,23 ± 112,67
p < 0,001
EF (P)
20,13 ± 12,67
49,68 ± 40,96
p < 0,01
TABLA 82: media ± desviación estándar de las excreciones fraccionales
de sodio, potasio y fósforo de los grupos control y con leishmaniosis.
IV.6.5.- Anatomía patológica
Disponemos del estudio efectuado a las muestras de riñón de tres perros,
afectados todos de leishmaniosis, y que fueron eutanasiados a petición del propietario.
Perro N°47
Las alteraciones morfológicas de este riñón se circunscriben fundamentalmente
a nivel cortical, no observándose cambios significativos en la médula renal. En los
glomérulos se visualiza un aumento de la celularidad así como un incremento de la
matriz mesangial (FIGURA 32).
- 226 -
FIGURA 32: glomerulonefritis mesangioproliferativa en un perro con
leishmaniosis. (Azul de Toluidina, x 40).
Otro cambio que, aún no siendo constante, se repite con cierta asiduidad es la
fibrosis periglomerular, apreciada en un gran número de corpúsculos renales. A nivel
del intersticio se observa un infiltrado celular constituido por células mononucleares,
fundamentalmente linfocitos y células plasmáticas. Los túbulos corticales manifiestan
cambios degenerativos que son más intensos cuanto mayor es la nefritis intersticial. Se
aprecia degeneración vacuolar e hidrópica (FIGURA 33), con destrucción total de las
células tubulares en los procesos más lesivos, así como atrofia tubular y glomerular por
compresión del infiltrado mononuclear.
- 227 -
FIGURA 33: degeneración vacuolar e hidrópica de los túbulos renales en
un perro con leishmaniosis. (Azul de Toluidina, x 100).
El diagnóstico anatomopatológico fue glomerulonefritis mesangioproliferativa
crónica y nefritis intersticial.
Perro N°53
Las manifestaciones histopatológicas observadas en los riñones de este animal
se han caracterizado por la presencia de abundantes dilataciones quísticas a nivel
cortical, que afectan tanto a túbulos como a corpúsculos renales y en cuyo interior
aparecen, en ocasiones, restos celulares y sales de calcio. Algunos glomérulos, que en
su mayoría se encuentran atróficos, muestran hialinización y áreas de fibrosis (FIGURA
34).
- 228 -
FIGURA 34: dilataciones quísticas de corpúsculos renales y túbulos,
atrofia glomerular, calcificaciones de la cápsula de Bowman y
membrana basal tubular e infiltrado inflamatorio intersticial en un
perro con leishmaniosis. (Hematoxilina-eosina, x 100).
Tanto en la cara parietal de la cápsula de Bowman como en la membrana basal
de los túbulos se describen áreas de calcificación, que son también visualizadas a nivel
medular (FIGURA 35). El intersticio de la cortical contiene un intenso infiltrado
inflamatorio constituido, fundamentalmente, por células plasmáticas, linfocitos y, en
menor cantidad, macrófagos.
- 229 -
FIGURA 35: depósitos de sales de calcio peritubulares y tubulares e
infiltrado inflamatorio mononuclear en un perro con leishmaniosis.
(Hematoxilina-eosina, x 200).
El diagnóstico anatomopatológico fue glomerulonefritis esclerótica crónica
con calcificaciones glomerulares, nefritis intersticial y presencia de abundantes
microquistes.
Perro N°65
Las alteraciones histopatológicas más llamativas en este animal se observan a
nivel de la corteza renal. En los glomérulos se aprecia la presencia de sustancia hialina
y algunos corpúsculos renales desarrollan fibrosis y atrofia (FIGURA 36). La mayoría
de los túbulos están degenerados, carecen de núcleos y en sus luces aparecen algunos
hematíes, así como una gran cantidad de sustancia de naturaleza proteica, identificada
- 230 -
también en túbulos medulares. El intersticio está ocupado por un infiltrado inflamatorio
integrado por linfocitos y, en menor cantidad, células plasmáticas.
FIGURA 36: fibrosis periglomerular con áreas de hialinización en el
glómerulo. Infiltrado inflamatorio intersticial linfo-plasmocitario con
cantidad discreta de pigmento ambarino (hemosiderina) y presencia de
hematíes en el espacio urinario y en la luz tubular. (Hematoxilina-eosina, x
200).
El diagnóstico anatomopatológico fue glomerulonefritis esclerótica crónica,
nefritis intersticial y abundante presencia de cilindros hialinos.
Las lesiones renales se correspondieron con las descritas por diversos autores
en la leishmaniosis(254, 288, 310) y son las responsables de la eliminación de proteínas de
alto y bajo peso molecular, así como de IgG e IgA, observada en los tres perros y según
se ha descrito previamente.
- 231 -
Los tres animales presentaron un fallo renal crónico importante, con orina
isostenúrica, aumento de urea y creatinina en plasma, hiperfosfatemia y, los dos
últimos, hipocalcemia. Además, los tres perros presentaron una concentración de
proteínas en orina y un valor del U P/C sensiblemente inferiores a los valores medios
obtenidos en el grupo de perros con leishmaniosis para estos parámetros.
Concretamente, la mayor concentración de proteínas en orina se observó en el perro
N°47, con 46,56 mg/dl, mientras la media del grupo fue de 154 ± 142,44 mg/dl. El
mayor U P/C correspondió al perro N°65 (1,80), también inferior a la media del grupo
(5,45 ± 6,95). Esto concuerda con los autores(67, 195, 325) que describen una reducción
paulatina
de
la
proteinuria
a
medida
que
avanza
la
lesión
glomerular.
- 232 -
V. CONCLUSIONES
V. Conclusiones
1.- El patrón electroforético de la orina de los perros sanos se caracteriza por
presentar, en todos los casos, dos bandas tenues con pesos moleculares en torno a los
105,00 kDa y 73,09 kDa. En algunos perros aparecen, además, tres bandas de bajo peso
molecular situadas en el intervalo de 10-40 kDa. En ningún caso se detectó la
eliminación de IgG y/o IgA.
2.- El grupo de perras con piometra, presentó la menor proteinuria de todos los
grupos estudiados, aunque se debe tener en cuenta que la disminución en la capacidad
de concentrar la orina con la que cursa la enfermedad, interfiere en la cuantificación de
dicha proteinuria. El patrón electroforético de la orina de estos animales muestra,
además de las cinco bandas presentes en el grupo control, otras cuatro bandas situadas
en los intervalos de pesos moleculares de 40-50 kDa, 50-60 kDa, 80-90 kDa y 120-130
kDa. Dicho patrón caracteriza la existencia de una lesión fundamentalmente glomerular,
puesto que las proteínas de medio-alto peso molecular constituyen el 58,9% de todas las
proteínas separadas mediante electroforesis. Este grupo presentó la menor eliminación
de inmunoglobulinas de los animales enfermos estudiados, con un 27% para IgG y un
7% para IgA.
3.- El patrón electroforético de la orina de perros con leptospirosis presenta,
además de las cinco bandas observadas en el grupo control, tres bandas localizadas en
los intervalos de 40-50 kDa, 50-60 kDa y 80-90 kDa. Dicho patrón electroforético
puede definirse como típicamente tubular ya que en este grupo, las proteínas de bajo
peso molecular constituyen el 70,2% de todas las proteínas separadas mediante
electroforesis. En el grupo de perros con leptospirosis, un 30% de los animales
eliminaron IgG en la orina y un 20% IgA.
- 234 -
V. Conclusiones
4.- La proteinuria observada en el grupo de perros con leishmaniosis fue la
mayor de todos los grupos estudiados. Su patrón electroforético se caracteriza por la
presencia de las ocho bandas observadas en el grupo con leptospirosis y, además, por la
aparición de tres bandas localizadas en los intervalos de 110-120 kDa, 130-140 kDa y
140-150 kDa. La electroforesis de orina de estos animales demuestra la presencia de un
patrón proteico mixto, con la eliminación de un 57,9% de proteínas de bajo peso
molecular y un 42,1% de medio-alto peso molecular. El grupo de perros con
leishmaniosis presentó la mayor eliminación de inmunoglobulinas de los animales
estudiados, con un 68% para IgG y un 55% para IgA.
- 235 -
VI. RESUMEN
VI. Resumen
En el presente trabajo se ha realizado un estudio de la proteinuria en cuatro
grupos de perros adultos: un grupo control formado por 20 animales sanos y tres grupos
en los que se diagnosticaron distintas enfermedades que cursan con daño renal. Así, se
han estudiado 15 perras con piometra, 10 perros con leptospirosis y 22 perros con
leishmaniosis. A todos ellos, además de las pruebas pertinentes para diagnosticar las
distintas patologías, se les realizó la correspondiente anamnesis y exploración física, así
como analítica sanguínea y de orina. En estas últimas muestras, además de determinar la
concentración de proteínas y el cociente proteína/creatinina en la orina (U P/C), se
llevaron a cabo electroforesis en SDS-PAGE y Western blotting utilizando como
anticuerpos anti-IgG y anti-IgA.
En el grupo control se obtuvo una concentración media de proteínas en orina
de 53,18 ± 25,01 mg/dl y un U P/C de 0,51 ± 0,26. La electroforesis de orina de este
grupo mostró la presencia de hasta 5 bandas diferentes. Las mayoritarias se situaron en
los intervalos de 100-110 kDa y 70-80 kDa, pues se observaron respectivamente en el
100% y en el 95% de los animales. En menor proporción aparecen, además, bandas en
los siguientes intervalos: 30-40 kDa (30%), 20-30 kDa (25%) y 10-20 kDa (50%). En
ningún animal se detectó IgG o IgA en la orina.
En las perras con piometra la concentración media de proteínas en orina fue de
40,12 ± 34,44 mg/dl y el U P/C de 1,03 ± 0,97. En la electroforesis se evidenciaron
hasta 9 bandas diferentes, 5 de las cuales coinciden con las del grupo control: intervalos
de peso molecular de 100-110 kDa (80%), 70-80 kDa (93%), 30-40 kDa (73%), 20-30
kDa y 10-20 kDa (ambas en el 67% de las perras). Las bandas que no aparecieron en los
animales sanos se observaron en los siguientes intervalos: 80-90 kDa (67%) y, con
frecuencias de presentación mucho menores, 120-130 kDa, 50-60 kDa y 40-50 kDa. El
Western blotting reveló la eliminación de IgG en 4 perras (27%), de las cuales una
- 237 -
VI. Resumen
eliminó también IgA. El patrón electroforético de la orina en este grupo es típicamente
glomerular, con un aumento de la eliminación de proteínas de medio-alto peso
molecular que constituyeron el 58,9% del total.
Los perros con leptospirosis presentaron una concentración media de proteínas
en orina de 94,79 ± 81,89 mg/dl y un U P/C de 2,59 ± 2,79. En la electroforesis se
obtuvieron hasta 8 bandas, de las que 5 coinciden con las observadas en los perros
sanos: 70-80 kDa (100%), 10-20 kDa (100%, porcentaje que duplica al observado en el
grupo control en este intervalo), 100-110 kDa, 30-40 kDa y 20-30 kDa (todas ellas en el
80% de las muestras). Las bandas de este grupo que no se observaron en el grupo
control aparecieron en menor número de animales y se situaron en los intervalos de 8090 kDa, 50-60 kDa y 40-50 kDa. Se detectó IgG en 3 perros (30%), dos de los cuales
eliminaron también IgA. Las proteínas mayoritarias en este grupo (70,2%) fueron las de
bajo peso molecular, lo que indica que el patrón electroforético de la orina de estos
perros es fundamentalmente tubular, hecho acorde con la nefropatía túbulo-intersticial
que caracteriza a la leptospirosis.
Finalmente, el grupo de perros con leishmaniosis presentó la mayor
concentración media de proteínas en orina (154,91 ± 142,44 mg/dl) y el mayor U P/C
(5,45 ± 6,95) de todos los grupos estudiados. También en la electroforesis se evidenció
el mayor número de bandas (11). Las 5 que coinciden con el grupo control aparecen en
un alto porcentaje de animales: 70-80 kDa y 30-40 kDa en el 100%, 20-30 kDa y 10-20
kDa en el 95% y 100-110 kDa en el 82%. Las 6 bandas restantes son las siguientes: 5060 kDa (100%), 40-50 kDa (86%) y, en menor número de animales las situadas en los
intervalos de 140-150 kDa, 130-140 kDa, 110-120 kDa y 80-90 kDa. En 15 perros
(68%) se detectó IgG; 12 de ellos eliminaron también IgA, convirtiéndose este grupo en
el que eliminó inmunoglobulinas en mayor proporción. Su patrón electroforético es
- 238 -
VI. Resumen
mixto, con el 57,9% de proteínas de bajo peso molecular y, el resto, proteínas de medioalto peso molecular.
- 239 -
VII. SUMMARY
VII. Summary
In the present work, proteinuria in four groups of adult dogs has been studied:
one group of twenty healthy dogs and three groups suffering from disorders
characterized by renal damage. Therefore, fifteen bitches with pyometra, ten dogs with
leptospirosis and twenty-two dogs suffering from leishmaniasis have been studied. All
the animals, in addition to the appropriate tests to get the diagnosis, underwent the
proper anamnesis, physical examination as well as blood and urine tests. Also, in urine
samples protein concentration and protein/creatinine ratio (U P/C) were determined,
and sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and
Western blotting using anti-IgG and anti-IgA antibodies were carried out.
In the control group, the average protein concentration in urine samples was
53,18 ± 25,01 mg/dl and the U P/C was 0,51 ± 0,26. The urine electrophoresis of this
group showed up to five different bands. The majority of bands were located in
100-110 kDa and 70-80 kDa intervals, which were presented on 100% and 95% of the
animals, respectively. Moreover, with less frequency, bands in the following intervals:
30-40 kDa (30%), 20-30 kDa (25%) and 10-20 kDa (50%) were found. It was not
possible to detect IgG or IgA in any animals.
In the bitches suffering from pyometra, the average protein concentration in
urine samples was 40,12 ± 34,44 mg/dl and the U P/C was 1,03 ± 0,97. The urine
electrophoresis of this group showed up to nine different bands, five of them coincided
with the bands found in the control group: 100-110 kDa (80%), 70-80 kDa (93%), 3040 kDa (73%), 20-30 kDa and 10-20 kDa (both of them on 67% of the bitches). The
bands not found in the healthy dogs were observed in the following intervals: 80-90
kDa (67%) and, with less frequency, 120-130 kDa, 50-60 kDa and 40-50 kDa. In four
bitches (27%) IgG was detected, one of them eliminated IgA too. Urine electrophoretic
- 241 -
VII. Summary
pattern in this group can be catalogued as glomerular, with more elimination of
medium-high molecular weight proteins (58,9%).
The group with leptospirosis showed an average protein concentration in urine
of 94,79 ± 81,89 mg/dl and the U P/C was 2,59 ± 2,79. In the electrophoresis eight
bands we observed. Five of them coincided with the bands found in the healthy dogs:
70-80 kDa (100%), 10-20 kDa (100%, which is double than that achieved in control
group for this interval), 100-110 kDa, 30-40 kDa and 20-30 kDa (all the bands were
observed in the 80% of samples). In this group, the bands which were not found in the
healthy dogs, were observed in a lower number of animals and they were detected in the
intervals of 80-90 kDa, 50-60 kDa y 40-50 kDa. On three dogs (30%) IgG could be
detected, and two of them eliminated IgA too. In this group, the majority proteins
(70,2%) had a low molecular weight and, therefore, the urine electrophoretic pattern in
this group can be catalogued as tubular. This finding is in accordance with the tubulointerstitial nephropathy that characterizes leptospirosis.
Finally, the group of dogs suffering from leishmaniasis showed the highest
average protein concentration in urine (154,91 ± 142,44 mg/dl) and the highest U P/C
(5,45 ± 6,95) among all the studied groups. Also, in the electrophoresis the highest
number of bands (11) we found. The five bands that coincide with the control group
were observed in a high percentage of animals: 70-80 kDa and 30-40 kDa in 100%, 2030 kDa and 10-20 kDa in 95% and, finally, 100-110 kDa in 82% of the animals. The
other six bands were grouped as follows: 50-60 kDa (100%), 40-50 kDa (86%) and, in
less animals, 140-150 kDa, 130-140 kDa, 110-120 kDa and 80-90 kDa. In fifteen dogs
(68,2%) IgG was detected; twelve of them eliminated IgA too. Therefore, this group
was which excreted immunoglobulins in the highest proportion. The electrophoretic
- 242 -
VII. Summary
pattern of this group can be catalogued as mixed, with 57,9% of the proteins with low
molecular weight and the rest medium-high.
- 243 -
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estudio electroforético de la proteinuria en perros sanos y en perros

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