2012 Biología-Veterinaria 2012 – UNIDAD 2 – Guia de Estudio

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2012 Biología-Veterinaria 2012 – UNIDAD 2 – Guia de Estudio
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Dra. María Guadalupe Klich
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UNIDAD 2 – BIOLOGÍA - VETERINARIA
MÉTODOS DE ESTUDIO DE LAS CÉLULAS
Los diversos elementos que existen en la naturaleza presentan tamaños, formas y composiciones distintas, la
mayoría de ellas pueden verse, algunas a simple vista, y otras mediante instrumentos.
Unidades de Masa y Longitud utilizadas en Biología Celular y Molecular
Puesto que las células son pequeñas para poder hablar de sus diferencias son necesarias unas unidades
específicas.

UNIDADES DE LONGITUD:
µm (micra o micrómetro) = 10 -3 mm (milésima parte del milímetro)
nm (nanómetro) = 10 -6 mm
Ä (Ängstrom) = 10 -7 mm

UNIDADES DE PESO:
mg (miligramo) = 10 -3 g
µg (microgramo) = 10 -6 g
ng (nanogramo) = 10 -9 g
pg (picogramo) = 10 -12 g
d (dalton) = peso de un átomo de hidrógeno Ej: H2O =18 d
Kd (kilodalton)! 10 3 d. Ej: Hemoglobina= 64,5 Kd
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Métodos de Observación de las Células
El microscopio (de micro-, μικρο, pequeño, y scopio, σκοπεω, observar) es un instrumento que permite
observar objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a simple vista. El tipo más común y el primero
que se inventó es el microscopio óptico. Se trata de un instrumento óptico que contiene una o varias lentes
que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refracción.
El microscopio fue inventado hacia los años 1610, por Galileo, según los italianos, o por Zacharias Janssen,
en opinión de los holandeses. La palabra microscopio fue utilizada por primera vez por los componentes de
la Accademia dei Lincei, una sociedad científica a la que pertenecía Galileo que publicó un trabajo sobre la
observación microscópica del aspecto de una abeja. Sin embargo, las primeras publicaciones importantes en
el campo de la microscopía aparecen en 1660 y 1665, cuando Marcello Malpighi prueba la teoría de William
Harvey sobre la circulación sanguínea al observar al microscopio los capilares sanguíneos y Robert Hooke
publica su obra Micrographia.
En 1665 Hooke observó con un microscopio un delgado corte de corcho y notó que el material era poroso. y
con poros, en su conjunto, formaban cavidades poco profundas a modo de cajas a las que llamó células. Se
trataba de la primera observación de células muertas. Unos años más tarde, Malpighi, anatomista y biólogo
italiano, observó células vivas. Fue el primero en estudiar tejidos vivos al microscopio.
A mediados del siglo XVII un holandés, Anton Van Leeuwenhoek, utilizando microscopios simples de
fabricación propia, describió por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos. El
microscopista Leeuwenhoek, sin ninguna preparación científica, puede considerarse el fundador de la
bacteriología. Tallaba él mismo sus lupas sobre pequeñas esferas de cristal, cuyos diámetros no alcanzaban
el milímetro (su campo de visión era muy limitado, de décimas de milímetro). Con estas pequeñas distancias
focales alcanzaba los 275 aumentos. Observó los glóbulos de la sangre, las bacterias y los protozoos;
examinó por primera vez los glóbulos rojos y descubrió que el semen contiene espermatozoides. Durante su
vida no reveló sus métodos secretos y a su muerte, en 1723, 26 de sus aparatos fueron cedidos a la Royal
Society de Londres.
Durante el siglo XVIII continuó el progreso y se lograron objetivos acromáticos por asociación de vidrios
pulidos cóncavos y convexos obtenidos en 1740 por H. M. Hall y mejorados por John Dollond. De esta
época son los estudios efectuados por Isaac Newton y Leonhard Euler. En el siglo XIX, al descubrirse que la
dispersión y la refracción se podían modificar con combinaciones adecuadas de dos o más medios ópticos, se
lanzan al mercado objetivos acromáticos excelentes.
Durante el siglo XVIII el microscopio tuvo diversos adelantos mecánicos que aumentaron su estabilidad y su
facilidad de uso, aunque no se desarrollaron por el momento mejoras ópticas. Las mejoras más importantes
de la óptica surgieron en 1877, cuando Ernst Abbe publicó su teoría del microscopio y, por encargo de Carl
Zeiss, mejoró la microscopía de inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro, lo que permite obtener
aumentos mayores. A principios de los años 1930 se había alcanzado el límite teórico para los microscopios
ópticos, no consiguiendo éstos aumentos superiores a 500X o 1000X. Sin embargo, existía un deseo
científico de observar los detalles de estructuras celulares (núcleo, mitocondria, etc.).
Microscopía Optica
El ojo humano es capaz de detectar variaciones en la longitud de onda y en la intensidad de la luz. La
microscopía permitió aumentar ambas posibilidades, tanto mediante el uso de instrumentos que amplían el
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poder de resolución como de técnicas que contrarrestan la transparencia de las células aumentando el
contraste de sus estructuras.
La mayoría de los componentes celulares son transparentes, a excepción de algunos pigmentos
citoplasmáticos que absorben ciertas longitudes de onda de la luz. La baja absorción de esas longitudes por
la célula viva se debe al alto contenido de agua. Un método para contrarrestar esta limitación consiste en
emplear colorantes que tiñan selectivamente estos componentes celulares introduciendo diferentes
compuestos que absorben longitudes de onda específicas. Sin embargo, las técnicas de coloración
generalmente no se pueden usar en células vivas.
El Microscopio Óptico
Microscopio óptico. Descripción: A) ocular, B) objetivo, C) portador del objeto, D) lentes de la iluminación,
E) sujeción del objeto, F) espejo de la iluminación.
Un microscopio óptico es un microscopio basado en lentes ópticas. También se le conoce como
microscopio de luz, microscopio fotónico (que utiliza luz o "fotones") o microscopio de campo claro. El
desarrollo de este aparato suele asociarse con los trabajos de Anton van Leeuwenhoek. Los microscopios de
Leeuwenhoek constaban de una única lente pequeña y convexa, montada sobre una plancha, con un
mecanismo para sujetar el material que se iba a examinar (la muestra o espécimen). Este uso de una única
lente convexa se conoce como microscopio simple en el que se incluye la lupa, entre otros aparatos ópticos.
Aplicaciones del microscopio óptico
Este instrumento ha sido de gran utilidad, sobre todo en los campos de la ciencia en donde la estructura y la
organización microscópica es importante, incorporándose con éxito a investigaciones dentro del área de la
química (en el estudio de cristales), la física (en la investigación de las propiedades físicas de los materiales),
la geología (en el análisis de la composición mineralógica de algunas rocas) y, por supuesto, en el campo de
la biología (en el estudio de estructuras microscópicas de la materia viva), por citar algunas disciplinas de la
ciencia.
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Hasta ahora se sigue usando en el laboratorio de histología y anatomía patológica, donde la microscopía
permite determinadas aplicaciones diagnósticas, entre ellas el diagnóstico de certeza del cáncer, numerosas
estructuras cristalinas, pigmentos, lípidos, proteínas, depósitos óseos, etcétera.
Microscopio estereoscópico
El diseño de este instrumento es distinto al del diagrama de más arriba y su utilidad es diferente, pues se
utiliza para ofrecer una imagen estereoscópica (3D) de la muestra. Para ello, y como ocurre en la visión
binocular convencional, es necesario que los dos ojos observen la imagen con ángulos ligeramente distintos.
Obviamente todos los microscopios estereoscópicos, por definición, deben ser binoculares (con un ocular
para cada ojo), por lo que a veces se confunden ambos términos.
Corte de una hoja observado con Microscopio Óptico - 1.bp.blogspot.com/.../s1600/hoja+partida.jpg
Poder de Resolución del Microscopio Óptico
Como en cualquier otro microscopio, en el microscopio óptico el poder de resolución, que es la capacidad
del instrumento de brindar imágenes distintas de puntos muy cercanos, depende de la longitud de onda y de
la apertura numérica del objetivo (relacionada con el índice de refracción del medio).
Límite de resolución: distancia mínima que debe existir entre dos puntos para que puedan ser discriminados
como tales
Para el microscopio óptico varia entre 170 nm y 250 nm dependiendo de si la luz es monocromática o
blanca.
El aumento de la imagen en el microscopio óptico depende principalmente de las lentes del objetivo, con
las cuales el aumento máximo es de 100 X a 120 X. Como el ocular agranda la imagen del objetivo entre 5 y
15 veces, se llega a un aumento de 500 X a 1500 X
Aumento total: aumento objetivo x aumento ocular.
Microscopio electrónico.
Un microscopio electrónico es aquél que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar
imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar una capacidad de aumento
muy superior a los microscopios convencionales. El primer microscopio electrónico fue diseñado por Ernst
Ruska, Max Knoll y Jhener entre 1925 y 1930, quiénes se basaron en los estudios de Louis-Victor de Broglie
acerca de las propiedades ondulatorias de los electrones.
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Un microscopio electrónico, funciona con un haz de electrones generados por un cañón electrónico,
acelerados por un alto voltaje y focalizados por medio de lentes magnéticas (todo ello al alto vacío ya que
los electrones son absorbidos por el aire). Los electrones atraviesan la muestra (debidamente deshidratada) y
la amplificación se produce por un conjunto de lentes magnéticas que forman una imagen sobre una placa
fotográfica o sobre una pantalla sensible al impacto de los electrones que transfiere la imagen formada a la
pantalla de un ordenador. Los microscopios electrónicos sólo se pueden ver en blanco y negro, puesto que no
utilizan la luz, pero se le pueden dar colores en el ordenador. Como se puede apreciar, su funcionamiento es
semejante a un monitor monocromático
Microscopio electrónico de transmisión (MET)
El microscopio electrónico de transmisión emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto cuya imagen se
desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan
formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un microscopio electrónico de transmisión debe
cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de Angstroms. Los microscopios
electrónicos de transmisión pueden aumentar la imagen de un objeto hasta un millón de veces. Los
electrones son dispersados cuando pasan a través de una fina sección del especimen, y luego detectados y
proyectados hacia una imagen sobre una pantalla fluorescente.
Poros en la membrane nuclear cmap.udg.co.cu:8001/rid=1G90C008R-29MY5B5-
H1T.
Microscopio electrónico de barrido. (MEB)
Permite obtener imágenes topográficas tridimensionales de los objetos en estudio. En el microscopio
electrónico de barrido la muestra es recubierta con una capa de metal delgado, y es barrida con electrones
enviados desde un cañón. Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la
zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectadas en una imagen de TV. Su
resolución está entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Permite obtener imágenes de gran resolución
en materiales pétreos, metálicos y orgánicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por
electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su superficie.
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Polen - upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb
Estructura
Disposición de los elementos que componen un organismo y que pueden llegar a verse con un microscopio
óptico
Ultraestructura
disposición de los elementos más pequeños que forman un organismo. Partículas y estructuras más allá del
poder de resolución del microscopio óptico y que solo son visibles con el ultramicroscopio o microscopio
electrónico
Microscopio de contraste de fases
El microscopio de contraste de fases permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para
células vivas. Se recurre a cambios de fase (retrasos) en las radiaciones que atraviesan las estructuras
biológicas. Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una
célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de
refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que
pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos ópticos
del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce
un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del
especimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos
microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.
El microscopio de contraste de fases convierte las diferencias de índice de refracción en diferencias de
claros/oscuros, que se hacen visibles al ojo humano.
Microscopio de NOMARSKI o Microscopio de Interferencia
Una variante del microscopio de contraste de fases es el Microscopio de NOMARSKI o microscopio de
Interferencia en el que el rayo de luz blanca, después de atravesar las dos lentes, se divide en dos rayos
polarizados que siguen trayectorias distintas y que se interfieren entre sí. La imagen resultante aparece en
relieve. Este microscopio es útil para el estudio “in vivo” de células. Permite determinar cambios en el índice
de refracción, mientras que el microcopio de fase solo revela las discontinuidades mas notables.
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Aquí tenemos un ejemplo, varios paramecios conjugándose,
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Vistos con contraste positivo (a la derecha) y en contraste negativo (a la derecha)
3.bp.blogspot.com/_SBO4k-8eZTI/SHkdjH1XE6I/AA...
Microscopio de luz ultravioleta
La imagen en el microscopio de luz ultravioleta depende de la absorción de esa luz por las moléculas de la
muestra. La fuente de luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, por lo tanto puede alcanzar una
resolución de 100 nm. La microscopia ultravioleta no es muy diferente del funcionamiento de un
espectrofotómetro pero sus resultados son registrados en fotografías. La muestra no se puede observar
directamente a través del ocular porque la luz ultravioleta puede dañar la retina. El método sirve para
detectar ácidos nucleicos, proteínas que contienen determinados aminoácidos. Mediante longitudes de ondas
específicas para la iluminación se puede obtener mediciones espectrofotométricas para cuantificar el DNA y
el RNA de cada célula.
El microscopio de luz ultravioleta utiliza el rango ultravioleta del espectro luminoso en lugar del rango
visible, bien para aumentar la resolución con una longitud de onda menor o para mejorar el detalle
absorbiendo selectivamente distintas longitudes de onda de la banda ultravioleta. Dado que el vidrio no
transmite las longitudes de onda más cortas de la luz ultravioleta, los elementos ópticos de estos
microscopios están hechos con cuarzo, fluorita o sistemas de espejos aluminizados. Además, dado que la
radiación ultravioleta es invisible, la imagen se muestra con fosforescencia, en fotografía o con un escáner
electrónico. El microscopio de luz ultravioleta se utiliza en la investigación científica.
Microscopio de Fluorescencia
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El microscopio de fluorescencia es una variación del microscopio de luz ultravioleta en el que los objetos
son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la
radiación electromagnética emitida por las moléculas que han absorbido la excitación primaria y reemitido
una luz con mayor longitud de onda. Para dejar pasar sólo la emisión secundaria deseada, se deben colocar
filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo. Se usa para detectar sustancias con
autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con fluorocromos.
El fenómeno de la fluorescencia se produce cuando un electrón de un átomo absorbe toda la energía de una
determinada longitud de onda de la luz, saltando a otros orbitales. Es una situación inestable durante la cual
se emite la mayor parte de la energía que se ha absorbido (con mayor longitud de onda) y vuelve a
desplazarse a su orbital.
Aprovechando este fenómeno, se han creado los fluorocromos. Para utilizarlos necesitamos una bombilla
que emita luz ultravioleta y luz visible. Para excitar el flurocromo necesitamos un filtro de excitación que
seleccione la longitud de onda que excita nuestro flurocromo.
Microscopio Confocal
El microscopio confocal es un microscopio que emplea una técnica óptica de imagen para incrementar el
contraste y/o reconstruir imágenes tridimensionales. Esta técnica ha ido adquiriendo cada vez mayor
popularidad entre las comunidades científica e industrial. Se aplica típicamente en las ciencias de la vida y
en la inspección de semiconductores. El concepto de imagen confocal fue patentado por Marvin Minsky en
1957.
En el caso del microscopio confocal de rayos láser la fuente de iluminación es, como dice su nombre, la luz
de un láser. Esta luz potente y monocromática (o sea, de un sólo color) excita en la muestra lo que se llama
fluorescencia. Es decir, cuando un espécimen sea iluminado con luz de cierto color, éste emitirá luz
brillante de otros colores. El contraste es siempre impresionante pues sólo la muestra fluorescerá y el fondo
permanecerá completamente oscuro. Pero lo más extraordinario de este microscopio es que cualquier parte
de la muestra que esté fuera de foco, será invisible. Por lo tanto, el enfoque en toda foto obtenida por
microscopía confocal de rayos láser será perfecto.
Más aún, aunque en microscopía confocal de rayos láser cada imagen representa un sólo plano de un
espécimen que, en realidad, es tridimensional, si se retratan de forma sucesiva los distintos planos que
integran la muestra, el microscopio puede hacer una reconstrucción completa del espécimen que lo muestre
en sus tres dimensiones. Esta reconstrucción tridimensional podrá incluso ser rotada para estudiar la muestra
desde un ángulo distinto a aquel desde el cual se retrató.
microscopico.wordpress.com/confocal/
Métodos de Preparación de Células y Tejidos
En la mayoría de los organismos las células forman tejidos y órganos (pluricelulares) y no pueden
observarse directamente, sino que deben sufrir un tratamiento hasta poder observarlos al microscopio
Proceso De Fijación.
Durante este proceso se inmoviliza a las células matándolas pero preservándolas y la sustancia utilizada es el
fijador.
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En términos químicos la fijación consiste en establecer puentes entre las diferentes macromoléculas que
constituyen la célula, de forma que quedan situadas fijas en su posición original.
Por otra parte el fijador prepara a las células para la tinción (hace permeable las células a los colorantes).
Hay que realizar rebanadas finas para poder observar los tejidos y órganos al microscopio. Se utilizan los
micrótomos. Existen diversos tipos, pero el más corriente es el micrótomo de rotación.
En el brazo que sube y baja tenemos el tejido que queremos cortar, y para ello hay una manivela.
Cada vuelta de la manivela, el brazo se mueve un número determinado de µm. Abajo hay una cuchilla que
puede ser de acero, vidrio e incluso de diamante y el material depende del grosor de la sección que queramos
obtener. Cada vez que el brazo baja se corta una sección que se dispone en el portaobjetos.
El grosor de las secciones para microscopía óptica es de 1-10 µm. Para microscopía electrónica las secciones
tienen un grosor siempre por debajo de 0,1 µm.
Los tejidos y órganos son estructuras muy frágiles y no pueden cortarse directamente con el micrótomo (son
blandos). Antes hay que realizar el proceso de inclusión.
La inclusión consiste en sumergir los tejidos y órganos en una sustancia que se denomina medio de inclusión
que cuando está en forma líquida penetra en el interior de un tejido. Ese medio de inclusión se puede volver
sólido y al volverse sólido se obtiene un bloque duro y rígido que se puede cortar en el microtomo.
Existen dos tipos principales de medios de inclusión:

Las parafinas que a una temperatura mayor a 55-60ºc son líquidas, y a Tª ambiente son sólidas.

Las resinas sintéticas, que a Tª ambiente son líquidas y a más de 70ºC se lleva a cabo un proceso de
polimeriazación irreversible de forma que el bloque es imposible que vuelva a disolverse.
Hay un método alternativo a la inclusión. La pieza puede volverse dura mediante la congelación, que
normalmente se realiza en nitrógeno líquido que está a temperatura baja o a nieve carbónica, , Tº de -70ºC.
El seccionamiento de la pieza congelada se lleva a cabo en un micrótomo con una cámara fría de -20ºC que
recibe el nombre de micrótomo criostático o criostato.
Cuando observamos una sección con el microscopio de campo claro no vemos prácticamente nada, pues las
células suelen ser invisibles y hay que llevar a cabo el proceso de tinción, para el que se utilizan una serie de
colorantes orgánicos. Cada colorante se une a un componente específico de la célula.
Cultivo de Células y Tejidos
El cultivo celular es el proceso mediante el que células, ya sean células procariotas o eucariotas pueden
cultivarse en condiciones controladas. En la práctica el término "cultivo celular" se usa normalmente en
referencia al cultivo de células aisladas de eucariotas pluricelulares, especialmente células animales. El
desarrollo histórico y metodológico del cultivo celular está íntimamente ligado a los del cultivo de tejidos y
el cultivo de órganos.
El cultivo de células animales empezó a ser una técnica rutinaria de laboratorio durante los años 50, pero el
concepto de mantener líneas de células vivas separadas del tejido de origen fue descubierto en el siglo XIX.
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El cultivo masivo de líneas celulares animales es fundamental para la manufactura de vacunas virales y
diversos productos biotecnológicos. Los productos biológicos producidos mediante la tecnología del ADN
recombinante en cultivo celular incluyen enzimas, hormonas sintéticas, inmunobiológicos (anticuerpos
monoclonales, interleucinas, linfoquinas y agentes anticancerígenos). A pesar de que muchas proteínas
pueden producirse mediante ADN recombinante en cultivos bacterianos, las proteínas más complejas que
son glicosiladas (modificadas mediante el agregado de carbohidratos) deben producirse en células animales.
Un ejemplo relevante de tales proteínas complejas es la hormona eritropoyetina. Actualmente, se están
realizando investigaciones para producir tales proteínas complejas en células de insectos o de plantas
superiores, debido al alto costo que implica producir tales proteínas complejas en células de mamíferos.
El cultivo de tejidos vegetales es una técnica basada en colocar un fragmento de planta en un recipiente
ayudado con soluciones nutritivas artificiales y hormonas vegetales; para propagarla en condiciones o en un
medio estéril, es decir en un medio libre de microorganismos (limpio). Cada fragmento origina una planta
idéntica a la que se tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades
artificiales.
Suspensiones celulares
En las últimas décadas se ha desarrollado diferentes sistemas para los cultivos de protoplastos, células,
tejidos y órganos vegetales; uno de ellos es el cultivo en suspensión (suspensiones celulares), el cual
constituye una forma para mantener y propagar células vegetales.
Las suspensiones celulares consisten en células libres y agregados celulares distribuidos en un medio en
movimiento. Estas suspensiones pueden ser permanentes si tienen un suministro continuo de nutrimentos.
Citometría de flujo
La citometría de flujo es una técnica de análisis celular que implica medir las características de dispersión de
luz y fluorescencia que poseen las células conforme se las hace pasar a través de un rayo de luz. Para su
análisis por citometría de flujo, las células deben encontrarse individualmente en suspensión en un fluido.
Las células sanguíneas pueden analizarse prácticamente de manera directa, las células de tejidos sólidos
deben primero dispersarse. Las células pueden hacerse pasar a muy altas velocidades (pueden llegar a
alcanzarse velocidades cercanas a las 100,000 células por segundo).
Al atravesar el rayo de luz, las células interaccionan con este causando dispersión de la luz, basándose en la
difracción de la luz en sentido frontal, se puede evaluar el tamaño de las células que pasan y al medir la
reflexión de la luz de manera lateral se evalúa la granularidad o complejidad de estas. Además de la
dispersión de la luz, si previamente a su análisis se coloca a las células en presencia de anticuerpos
monoclonales marcados con moléculas fluorescentes, se pueden evaluar que células poseen los antígenos
complementarios a los anticuerpos monoclonales usados.
La tecnología tiene aplicaciones en un número de campos, incluyendo la biología molecular, la patología, la
inmunología, la biología vegetal y la biología marina.
Es especialmente útil en el campo de la biología molecular cuando se usan anticuerpos etiquetados
fluorescentemente. Estos anticuerpos específicos se unen a antígenos de las células y ayudan a dar
información de las características específicas de dichas células estudiadas. Tiene grandes aplicaciones en
medicina (especialmente en trasplantes, hematología, inmunología de tumores y quimioterapia, genética y
selección de esperma en IVF).
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En la biología marina, las propiedades autofluorescentes del plancton fotosintético pueden ser explotadas por
citometría de flujo para caracterizar la abundancia y estructura de las comunidades marinas..
Citoquímica e Histoquímica
Consiste en la identificación in situ de los diferentes compuestos químicos de las células o tejidos. Es cuali y
cuantitativa.
Para la determinación citoquímica de una sustancia deben cumplirse los siguientes requisitos: 1- debe ser
inmovilizada en su posición original. 2- deber ser identificada por un procedimiento que sea específico para
ella o para un grupo químico que contenga. Esto se logra por medio de métodos físicos o por reacciones
químicas similares a las usadas en química analítica, pero adaptadas a los tejidos.
Fraccionamiento Subcelular
El fraccionamiento subcelular es un conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo obtener
fracciones puras o enriquecidas en un determinado componente celular, ya sea éste un orgánulo
(mitocondrias, núcleos, peroxisomas, ..) una fracción de membrana (membrana total, plasmática, dominio
basolateral, dominio apical,...), complejos multiproteicos (citoesqueleto de actina, microtúbulos, poros
nucleares, etc..), etc...
Todo proceso de fraccionamiento subcelular tiene dos etapas :


rotura de las células o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular) en el que la fracción
deseada se encuentre en condiciones adecuadas para su purificación.
separación de la fracción deseada del resto de componentes de la célula o del tejido mediante algún
criterio como puede ser una diferencia de densidad (centrifugación en gradientes o centrifugación
diferencial), la presencia de algún antígeno (cromatografía de inmunoafinidad, inmunoprecipitación,
etc.)
Técnicas de rotura de células y tejidos
El primer paso en la purificación de la mayoría de las proteínas y estructuras subcelulares es la rotura de los
tejidos o de las células para obtener un lisado celular en el que la proteína, el complejo multiproteico o la
estructura subcelular se encuentre en condiciones que permitan su aislamiento. Esto se consigue empleando
procedimientos mecánicos suaves conocidos generalmente como homogenización. Estos métodos producen
la rotura de las membranas celulares, suavemente, con lo que se libera el contenido celular.
Los procedimientos de homogenización más comunes son :




sonicación. Consiste en la aplicación de ultrasonidos a una suspensión celular. La intensa agitación
producida destruye las membranas celulares. Dependiendo de la frecuencia, intensidad y energía
aplicada se pueden destruir asimismo las estructuras subcelulares e incluso solubilizar complejos
proteicos. Se suele aplicar en frio para evitar el sobrecalentamiento de las muestras que podría
provocar la desnaturalización de las proteínas.
uso de detergentes que solubilicen las membranas celulares.
pasar las células a través de orificios de diámetros reducidos que provocan la rotura de las
membranas celulares.
homogenizadores. Se trata de romper las células con la ayuda de un émbolo rotatorio que se ajusta
perfectamente a las gruesas paredes de un tubo de cristal especial, el homogenizador. Existen
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dispositivos de homogenización en los que está calibrada la separación entre el émbolo y la pared de
cristal para producir homogenizados con un tamaño de partícula determinado.
Centrifugación
Una vez obtenido el lisado o homogenado celular se ha de proceder a su fraccionamiento. Una de las
técnicas más empleadas es la centrifugación. Se basa en hacer girar el tubo a gran velocidad de forma que se
produzca la acumulación en el fondo del mismo de las partículas que tienden a hundirse por tener una
densidad mayor que la del medio en que se encuentran. Así, después de la centrifugación la muestra,
homogénea, se habrá separado en dos fracciones : sobrenadante ('supernatant'), fracción homogénea que no
ha sedimentado, y el sedimento ('pellet') que ha quedado adherida al fondo del tubo.
Centrífuga
Las centrífugas son instrumentos que permiten someter a las muestras a intensas fuerzas que producen la
sedimentación en poco tiempo de las partículas que tienen una densida mayor que la del medio que las
rodea. En general se diferencian en función de los márgenes de aceleración a que someten a las muestras en :
centrífugas (de pocas g a aprox. 3000 xg), super-centrífugas (o centrífugas de alta velocidad, rango de
2000 xg a 20000 xg) y ultracentrífugas (de 15000 xg a 600000xg). En las centrífugas se suele controlar la
temperatura de la cámara para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido a la fricción. En las
ultracentrífugas, la velocidad extrema (más de 100000 rpm), hace que sea neceario hacer un intenso vacio en
la cámara de la centrífuga para evitar el calentamiento de rotor y muestra.
Centrifugación diferencia La centrifugación diferencial se basa en la existencia de diferentes partículas en
la suspensión que difieren en su densidad de la del medio. Si se centrifuga en condiciones suaves (poco
tiempo, poco fuerza de aceleración) sedimentarán las partículas mayores y/o más densas. Cuando el
sobrenadante de la primera centrifugación es centrifugado de nuevo en condiciones de mas tiempo y más
fuerza de aceleración sedimentan de nuevo las partículas más densas presentes,.. y así sucesivamente. Se
pueden aplicar condiciones crecientes de severidad en la centrifugación y obtener una colección de
sedimentos que corresponden sucesivamente a fracciones de partículas de diferente tamaño y/o densidad.
Análisis Molecular del ADN
Este tema se explicará en las Unidades 6 y 7 cuando se posean conocimientos sobre la estructura del ADN.
Normas generales de uso del laboratorio
Para el desarrollo de las prácticas es conveniente tener en cuenta algunas normas elementales que
deben ser observadas con toda escrupulosidad.
1. Antes de realizar una práctica, debe leerse detenidamente para adquirir una idea clara de su
objetivo, fundamento y técnica. Los resultados deben ser siempre anotados cuidadosamente
apenas se conozcan.
2. El orden y la limpieza deben presidir todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia, al
terminar cada práctica se procederá a limpiar cuidadosamente el material que se ha utilizado.
3. Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material.
4. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el que se
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necesita y de los posibles riesgos de su manipulación.
5. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar
con el profesor.
6. No tacar con las manos y menos con la boca los productos químicos.
7. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios, deben
manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos.
8. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) deben mantenerse alejados de las llamas de
los mecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos productos, se hará al baño María,
nunca directamente a la llama. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de
cerrar las llaves de paso al apagar la llama.
9. Cuando se manejan productos corrosivos (ácidos, álcalis, etc.) deberá hacerse con cuidado para
evitar que salpiquen el cuerpo o los vestidos. Nunca se verterán bruscamente en los tubos de
ensayo, sino que se dejarán resbalar suavemente por su pared.
10. Cuando se quiera diluir un ácido, nunca se debe echar agua sobre ellos; siempre al contrario:
ácido sobre agua.
11. Cuando se vierta un producto líquido, el frasco que lo contiene se inclinará de forma que la
etiqueta quede en la parte superior para evitar que si escurre líquido se deteriore dicha etiqueta y
no se pueda identificar el contenido del frasco.
12. No pipetear nunca con la boca. Se debe utilizar la bomba manual, una jeringuilla o artilugio que
se disponga en el Centro.
13. Las pipetas se cogerán de forma que sea el dedo índice el que tape su extremo superior para
regular la caída de líquido.
14. Al enrasar un líquido con una determinada división de escala graduada debe evitarse el error de
paralaje levantando el recipiente graduado a la altura de los ojos para que la visual al enrase sea
horizontal.
15. Cuando se calientan a la llama tubos de ensayo que contienen líquidos debe evitarse la
ebullición violenta por el peligro que existe de producir salpicaduras. El tubo de ensayo se
acercará a la llama inclinado y procurando que ésta actúe sobre la mitad superior del contenido
y, cuando se observe que se inicia la ebullición rápida, se retirará, acercándolo nuevamente a los
pocos segundos y retirándolo otra vez al producirse una nueva ebullición, realizando así un
calentamiento intermitente. En cualquier caso, se evitará dirigir la boca del tubo hacia la cara o
hacia otra persona.
16. Cualquier material de vidrio no debe enfriarse bruscamente justo después de haberlos calentado
con el fin de evitar roturas.
17. Los cubreobjetos y portaobjetos deben tomarse por los bordes para evitar que se engrasen.
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Trabajo Práctico Unidad 2
El Microscopio óptico compuesto
PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO


Sistema mecánico
o SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.
o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular,
…..
o REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los
objetivos.
o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico
que consigue el enfoque correcto.
Sistema óptico
o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.
o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.
o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.
o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
SISTEMA MECÁNICO
Este sistema sostiene al sistema óptico y aloja los elementos necesarios para la iluminación y enfoque
del preparado.
Pie: brinda apoyo y estabilidad al aparato.
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Vástago: soporta la platina, tubo y tornillos de ajuste macro y micrométrico.
Tornillo de Ajuste: provocan el desplazamiento del tubo o la platina en sentido vertical, lo que
permite el enfoque.
Tubo: en su extremo superior se halla el ocular, y en el inferior el objetivo. Se trata de un cilindro
metálico cuyo interior se encuentra pintado de negro, lo que evita la reflexión de la luz. Normalmente
tiene una longitud de 170 mm.
Platina: es una plataforma horizontal sobre la cual se coloca y sujeta el preparado a observar, tiene un
orificio central que permite el paso de la luz y un venier que posibilita la relocalización de los detalles
de interés.
Subplatina: sostiene al condenador y se ubica por debajo de la platina.
SISTEMA ÓPTICO
Se compone de un sistema óptico de observación y un sistema óptico de iluminación; el primero
consta de:
Objetivo: está formado por un sistema de pequeñas lentes ubicadas muy cercanas una de la otra, la
que se halla en el extremo distal del objetivo se denomina lente frontal. Los objetivos pueden ser
objetivos a seco (no hay ninguna sustancia interpuesta entre la lente frontal y el preparado), u
objetivos de inmersión (entre la lente frontal y el preparado se coloca una sustancia cuyo índice de
refracción es muy similar al del vidrio).
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Ocular: es un tubo cilíndrico con un diafragma fijo en el centro y una lente en cada extremo, la
superior se denomina lente ocular y la inferior lente colectora.
El sistema óptico de iluminación consta de:
Condensador: concentra el haz de luz sobre el plano del objeto que se encuentra en la platina. Debajo
de él se encuentra el diafragma iris que regula la cantidad de luz que llega al condensador.
Fuente de Luz: es una lámpara que está ubicada en la parte inferior del aparato, en caso de no poseerla
debe ubicarse una fuente de luz externa (lámpara incandescente común) aproximadamente a 30 cm.
del espejo.
CARACTERISTICAS DE LOS OBJETIVOS:
imagen, por ejemplo, 4:1, 40:1, 65:1, etc.
distancia que debe existir entre dos objetos para que
puedan visualizarse por separado.
en relación inversa con el límite de resolución.
s la propiedad de permitir la observación simultánea de varios
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planos del preparado. Es inversamente proporcional a la escala de reproducción o aumento.
cuando está enfocado. Disminuye cuando aumenta la escala de reproducción del objetivo.
aumento total de la imagen que observamos es el producto entre el aumento del objetivo y el del
ocular. Ejemplo: si tenemos colocado el objetivo cuya escala de reproducción es 40:1 y nuestro ocular
tiene un aumento de 10x, entonces el aumento total será 40 x 10 = 400.
MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO
1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina
completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar
en esas condiciones.
2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10
aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.
4. Para realizar el enfoque:
a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo
macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que
se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de
ellos o ambos.
b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la
preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el
micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con
mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió
por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la
operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y
por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se
descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una
preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.
6. Empleo del objetivo de inmersión:
. Bajar totalmente la platina.
a. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la
zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.
b. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y
el de x40.
c. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
d. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.
e. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la
gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la
lente.
f. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo
de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el
riesgo de accidente es muy grande.
g. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver
a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea
enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.
h. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el
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objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la
preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en
posición de observación.
i. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica.
Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.
MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES
1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de
observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la
misma y dejarlo cubierto con su funda.
2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para
evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe
guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.
3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con
un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.
4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio.
5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo
con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier
caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a
secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o
xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en
exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción.
6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina,
revólver y condensador).
7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la
preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo
agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular.
8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido,
secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol.
9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al
acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos.
Recursos Didácticos para Biología. José A. Cortés .com
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