(Microsoft PowerPoint - DETECCI\323N DE RESISTENCIA

(Microsoft PowerPoint - DETECCI\323N DE RESISTENCIA

DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR
MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM
POSITIVAS Y NEGATIVAS.
Dra. Norma Velázquez Guadarrama
Laboratorio de Investigación en Bacteriología
Antibiótico
Toda sustancia de origen natural o
sintética con la capacidad de destruir o
impedir el desarrollo de un organismo
vivo.
3) Alcanzar el sitio blanco
para ejercer su efecto
2) Penetrar en el interior de la
bacteria, concentrarse y
permanecer activo
1) Concentrarse en el órgano,
tejido o células donde se
encuentren las bacterias
• antibióticos
naturales:
producidos
por
microorganismos (por ejemplo la penicilina)
• antibióticos semi-sintéticos: disponen de un
esqueleto producido por microorganismos y
modificado químicamente (por ejemplo, la
ampicilina)
• quimioterápicos: son fármacos totalmente de
síntesis creados en el laboratorio (por ejemplo,
las sulfamidas)
Clasificación de los
antibióticos
• Naturaleza Química
• Mecanismo de Acción
Naturaleza Química
• Beta-lactámicos
– Penicilina
– Cefalosporinas
– Monobactámicos
– Carbapenems
– Inhibidores de Betalactamasas
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Polipéptidos
Aminoglucosidos
Anfenicoles
Tetraciclinas
Macrolidos
Glucopeptidos
Lincosamidas
Sulfonamidas
Inhibidores de la folato redutasa
Quinolonas
En base a su mecanismo
de acción
Acción de la Teicoplanina en la
Síntesis de Pared Bacteriana
Resistencia Bacteriana
• Pérdida de la sensibilidad de un
microorganismo a un antimicrobiano al
que originalmente era susceptible.
• Capacidad de las bacterias de
desarrollar mecanismos para evadir
el efecto de los antibióticos a los
cuales eran previamente susceptible
• Natural:
Cuando
integrantes de una
especie
son
todos
los
determinada
resistentes.
• Adquirida: Cuando afecta a algunos
integrantes de una especie pero no a
la totalidad.
Resistencia antimicrobiana
Bacteria Susceptible
Bacteria Resistente
Transferencia de Genes
de Resistance
Nueva Bacteria Resistente
Centers for Disease Control and Prevention Campaign to Prevent Antimicrobial Resistance in Healthcare Settings
Resistencia adquirida
• Cromosómica: se origina por mutaciones
• Extracromosómica
– Plasmidos
– Trasposones
– Integrones
Mecanismos de transferencia
genética
conjugación
Transformación
Transducción
The Science Creative Quarterely Jan- March 2007
Disminución de la permeabilidad
celular
BOMBAS DE EXPULSIÓN ACTIVA
RESISTENCIA A LA VANCOMICINA EN S. aureus
Identificación y Susceptibilidad
(CLSI) Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI/2007
Determinación del perfil de susceptibilidad
antimicrobiana por la prueba de difusión
con disco
(CLSI) Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI/2007
Antibióticos activos in vitro sin
eficacia clínica
(CLSI) Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI/2007
Prueba del Doble Disco para determinar
Fenotipo “D”
FENOTIPO cMLS
SENSIBLE
FENOTIPO M
FENOTIPO iMLS
Detección de BLEEs por prueba de
doble disco
Disco de la izquierda con 30 µg de CTX y disco central con 20
mas 10µg de amoxicilina con ác. clavulánico y a la derecha
disco con 30 µg de CAZ, muestran un fenotipo de resistencia
a ambas cefalosporinas
CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Oct. 1995, p. 557–584
Determinación de la inducción de
β-lactamasas AmpC
Cefotaxima
Cefoxitina
E-test para determinación
de MBL
E-test por un extremo imipenem (IP) y en el otro extremo
imipenem más EDTA (IPI), reducción de 3 diluciones en la
CIM en presencia de EDTA prueba positiva para metalo-β
βlactamasa (MBL), recomienda como S. malthophilia
Walsh. CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Apr. 2005, p. 306–325
ATCC13636 como control +
Concentración Inhibitoria Mínima
stock
MH
Antibióticos
Solidificar
Inhibición del
crecimiento
Lectura e interpretación de
placas
Oxa 0.25µ
0.25µg/ml
Oxa 2µ
2µg/ml
Oxa 0.5 µg/ml
Oxa 1µ
1µg/ml
Oxa 4µ
4µg/ml
MÉTODOS
• Aislamiento en Gelosa Sangre
Verificación
de cepas
• Aislamiento en Gelosa Sal-Manitol
• Catalasa
• Prueba de la Coagulasa
Método de difusión en disco
Susceptibilidad
Antimicrobiana
SAMR
Extracción de DNA
Kit de extracción de
DNA Genómico Wizard®
Concentración Mínima Inhibitoria (MIC)
Prueba del doble disco para determinar Fenotipo “D”
Identificación del gen mecA y
tipificación del SCCmec por PCR-Multiplex
Identificación del gen mecA y tipificación del
SCCmec por PCR-Múltiplex
1
2
3
4
Tipo II
Tipo IVa
5
6
7
8
Tipo V
Tipo II
9
10
Tamaño
Amplicón
(pb)
Especificidad
613
SCCmec I
398
SCCmec II
280
SCCmec III
776
SCC
SCCmec
IVa
493
SCCmec IVb
200
SCCmec IVc
881
SCCmec IVd
325
SCCmec V
147
mec A
Gel de agarosa 2%
Claritromicina
Mecanismo de acción:
Interfiere en la síntesis de
proteínas, se fija a la
subunidad 50S ribosomal.
Claritromicina
Mutación puntual en el
gen
23S
rRNA,
principalmente en las
posiciones:
2142 (A2142 a G/C/T).
2143 (A2143 a G/C).
Condiciones de Amplificación gen 23S
PCR
Desnaturalización
Alineamiento
Extensión
94ºC ----- 30s
50ºC ----- 30s
72ºC ----- 60s
30 ciclos
Condiciones de digestión Bsa I
Enzima Bsa I
DNA Amplicon
5U
5µg
55ºC / 1 hora
Micromarker DNA
pb
458
434
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
100 pb promega
1500
1000
900
800
700
600
500
400
300
298
200
174
102
80
100
Tetraciclina
Mecanismo de acción:
Inhibe la síntesis de
proteínas por la unión a
la
subunidad
30S
ribosomal y bloqueando
el sitio de unión del
tRNA-aminoacil.
Mutaciones
por
sustitución y deleciones
en el rRNA 16S,
involucra
las
posiciones:
AGA 926-928 TTC
Tetraciclina
Identificación de mutaciones en el gen
16S del rRNA
GEN
OLIGONUCLEÓTIDOS
AMPLIFICADO
16S
16S-880fw
5-ATAGACGGGGACCCGCACAAG-3
16S-999rv
5-TGGCAAGCCAGACACTCCA-3
120 pb.
Condiciones de PCR:
94ºC/ 15 min. preincubación
95ºC/ 10 seg. desnaturalización
56ºC/ 10 seg. alineamiento
72ºC/ 10 min. extensión
30 ciclos
Amplificados se mandaran a
secuenciar para determinar
las mutaciones de los
nucleótidos 926 a 928 del
gen 16S del rRNA.
(Glocker E. et al, 2005)
Metronidazol
Mecanismo de acción:
Produce pérdida de la
estructura helicoidal del DNA,
inhibición de la síntesis de
ácidos nucleicos y muerte
celular.
Mutaciones
sin
sentido
(deleciones o inserciones) en
el gen rdxA y frxA que
codifican
para
nitrorreductasas.
Dos
tipos
de
cepas
resistentes
aquellas
que
requieren solo la inactivación
de rdxA y aquellas que
requieren de la inactivación
de rdxA y frxA
frxA
Identificación de los genes rdxA y
frxA
GEN
OLIGONUCLEÓTIDOS
AMPLIFICADO
rdxA
rdxA-F
5-GCAGGAGCATCAGATAGTTCT-3
rdxA-R
5-GGGATTTTATTGTATGCTACAA-3
886 pb.
frxA
frxA-F
5-GGATATGGCAGCCGTTTATCATT -3
frxA-R
5-GAATAGGCATCATTTAAGAGATTA-3
Condiciones de PCR:
780 pb.
Mutación no habrá
amplificación de los genes.
94ºC/ 2 min. preincubación
95ºC/ 4 seg. desnaturalización
58ºC/ 40 seg. alineamiento
72ºC/ 1 min. extensión
30 ciclos
Sin mutación amplificación
de los genes.
72ºC/ 10 min. extensión final
Jeong J.Y et al, 2000, Jeong J.Y et al, 2001
CONTROL DE CALIDAD DE LOS
MÉTODOS A EMPLEAR
• E. faecalis ATCC 29212
• GENTAMICINA 4-16 µg/mL
• VANCOMICINA 1-4 µg/mL
• OXACILINA 8-32 µg/mL
• HLRA sensible (gentamicina 500 µg/mL, HLRA
estreptomicina 200 µg/mL)
• E. faecalis ATCC 59212
• HLRA resistente
• VancomicinaR 6 µg/mL en BHI
Oligonucleótidos para la amplificación
por PCR de Enterococcus resistentes a
elevados niveles de Gentamicina y
Estreptomicina
Producto
amplificado (pb)
Referencia
5´-TGA TGA TTT TCC TTT GAT GT-3´
5´-CAA TCT TTA TAA GTC CTT TT-3´
1,395
Suk-Kyung
Lim,Koichi Tanimoto,
5´-ACT GGC TTA ATC AAT TTG GG-3´
5´-GCC TTT CCG CCA CCT CAC CG-3´
597
Udo, E. E., N. AlSweih,
GEN
SECUENCIA
aac(6’)-Ie
aph(2’’)-Ia
(Gm)
ant(6’) (Sm)
Condiciones de la PCR
para los genes
ant (6’)(Sm) y aac (6’)- aph (2’’) (Gm)
Ciclo
Temperatura
Tiempo
No.
Ciclos
Desnaturalización
inicial
94° C
5 min.
1
Desnaturalización
94° C
1min.
Alineamiento
47° C
1min.
Extensión
72° C
1min.
Extensión final
72° C
5min.
**El almacenamiento es a 4°C
30
1
Electroferograma de los productos de la
PCR para los genes ant (6’) y aac (6’)- aph
(2’’) de cepas HLRA
M
C(-) C(+) C(-) C(+)
(Sm) (Sm) (Gm) (Gm)
1
2
3
4
5
6
3000
2000
1395 pb
1000
(Gm)
597 pb
(Sm)
500
100
Fig 11. Ensayo de PCR para cepas HLRA. Línea M; MPM; línea C(-) ATCC 59212; línea
C(+), ATCC 29212; lineas nones son cepas HRLA aac (6’)- aph (2’’) (+) ; líneas pares
son cepas HLRA ant (6’) (+).
•
•
•
•
Obtención cepas (gram, catalasa, 6.5%NaCl)
“over.night”
Extracción de DNA total (kit Wizard® de Promega)
Amplificación por PCR
Oligonucleótidos para la amplificación por PCR de los genes
vanA y vanB de cepas de enterococos
Vancomicina
Resistentes
Producto
Referencia
amplificado (pb)
GEN
SECUENCIA
Van A
5'- CAT GAA TAG AAT AAA AGT TGC AAT A - 3'
5'- CCC CTT TAA CGC TAA TAC GAT CAA - 3'
1,030
Clark, N. C.,
Van B
5’GTG ACA AAC CGG AGG CGA GGA 3’
5’CCG CCA TCC TCC TGC AAA AAA 3’
433
Clark, N. C.,
Condiciones de la PCR para el gen
vanA y vanB
PROGRAMACIÓN PARA GENES Van A.
Ciclo
Temperatura
Tiempo
No.
Ciclos
Desnaturalización
inicial
94° C
5 min.
1
Desnaturalización
94° C
1min.
Alineamiento
55° C
1min.
Extensión
72° C
1min.
Extensión final
72° C
5min.
**El almacenamiento es a 4°C
30
1
Electroferograma de los productos de la
amplificación por PCR para los genes vanA y
vanB
1
2
3
4
C(+) C(+)
7
8
M
3000
1000
500
433 pb.
vanB
200
100
Pie de figura
3000
1,030 pb.
vanA
500
400
200
100
Fig10. Ensayo de PCR para cepas EVR . Línea M; MPM; línea C(+), ATCC 29212; línea 3, capa
EVR con vanB (+); lineas 4,7,8 cepas EVR con vanA (+); líneas restantes vanA y vanB (-)
Macrorestricción con enzima NotI
empleando PFGE
Cepa
1. Lavado con sol. salina EDTA,
(1min. 5000 rpm) y decantar
2. Agregar 1ml. de sol. PIV
(TRIS-HCl 2M (pH 7.6) + NaCl
5M+ agua destilada estéril)
Cepa microbiana
37°C/ 3 días
Bloques al 2%
Agarosa de
bajo punto de
fusión
Agregar 1ml de
sol. de lisis EC
Incubar/ 1 hr.
adicionar a los
bloques
(Hosaka Y. et al, 2005)
Decantar la solución
Decantar la sol. ES
agregar 1ml de sol. ES
Agregar regulador TE
conteniendo
sol.
fluorada
de
fenilmetilsulfonil.
Incubar a 50°C/ 48hrs
Sol. ES: EDTA (pH 9-9.5)0.5M +
Proteinasa K + sarcosil 20%
Incubar a tem.
ambiente/20
min.
Corte de los
bloques de
agarosa
Hacer 3
lavados
con TE
por 10
min. c/u
Incubar a temp.
ambiente/ 4 hrs.
Decantar la sol.
Sol.
TrisEDTA
Incubar con
regulador de la
enzima NotI/ 30 min.
Incubar a
37ºC/ 16 hrs.
PFGE
con 50U de
fragmentos de 40 a
NotI
20 kb a 9 V/cm a 14ºC
/30 hrs/ 11 min.
fragmentos de 20 a 10
kb a 9 V/cm a 14ºC
/26 hrs/ 3 min.
Buffer TBE 0.5 X
Pseudomonas aeruginosa
multirresistentes
28H 116D 356H 379U 382D 452H 437H 438H 483H 498H 668H 672H 845H 925H
436.5
388
339.5
291
242.5
194
145.5
97
48.5
Foto gel de agarosa 1.2% de P.ae digeridas con enzima Spe I
Marcador
4U ºT amb
4U 4ºC
4U Liof
197UºT amb
197U 4ºC
197U Liof
397U ºT amb
397U 4ºC
397U Liof