Análisis Microbiológicos

Metodologías para implementar Estándares
Internacionales de pureza del Azafrán
Análisis Microbiológicos
Dª Olga Acevedo Regalado
Dr. Rafael Rotger
Dr. José Luis Novella
Dra. Leonor Nozal
Normativa microbiológica
sobre especies
• Normativa española (R.D. 2242/1984, de 26-IX):
• Ausencia de microorganismos patógenos y sus toxinas
• Ausencia de Salmonella en 25 g
• Escherichia coli: ≤10 UFC/g
• Esporulados anaerobios sulfito-reductores: ≤103 UFC/g
• Recomendaciones ICMSF (1974, 2005):
• Aerobios mesófilos totales: ≤10
106 UFC/g
• Hongos y Coliformes: ≤104 UFC/g
• E. coli y Clostridium perfringens: ≤103 UFC/g
• Recomendaciones
R
d i
dde lla U
Unión
ió Europea
E
(2004/24/CE)
(2004/24/CE):
• Ausencia de Salmonella en 25 g
• Bacillus cereus: satisfactorio ≤102 UFC/g;
g; aceptable
p
≤103 UFC/gg
• Clostridium perfringens: satisfactorio ≤103 UFC/g; aceptable ≤104 UFC/g
• Enterobacteriaceae: para discriminar especies irradiadas
• Aflatoxinas: niveles permitidos por la normativa UE
Análisis de la calidad
microbiológica de 80 muestras
de azafrán
• Origen:
Detección de Salmonella
25 g azafrán + 225 ml
Agua Peptona + 0.1%
Tween80
Enriquecimiento
selectivo
Detección de
Staphylococcus
Pre-enriquecimiento
Pre
enriquecimiento (16 h
h, 37 ºC)
C)
Homogeneizado
–
–
–
–
–
–
Irán: 33
Italia: 15
Grecia: 15
España: 14
Marruecos: 2
I di 1
India:
Stomacher
Recuentos de
bacterias y hongos
Dil i
Diluciones
d
decimales
i l
Recuento de bacterias y hongos
Filtración para
recuento de mohos
y levaduras
Sabouraud
(2-4 días at 24 ºC)
5 min a 80 ºC para
recuento de
esporulados
Dil i
Diluciones
10-11 a 10-44
Recuento de aerobios totales,
coliformes,
lif
E
Enterobacterias
t b t i y E.
E coli.
li
Anaerobios
sulfitoreductores
reductores,
Clostridium
perfringens y
Bacillus cereus
cereus.
Resultados del análisis
microbiológico de 80 muestras
de azafrán
• Ausencia de Salmonella en 25 g en todas las
muestras, confirmada por PCR.
• Presencia
P
i d
de E.
E colili en 5 muestras
t
(6 25%)
(6.25%),
confirmada por PCR.
• Presencia de Staphylococcus aureus en 3
muestras (3.75%), confirmada por PCR.
• Ausencia de Aspergillus spp.
spp
• 76 muestras (95%) cumplieron la normativa
española.
Niveles de microorganismos en azafrán
Aerobios totales
Aerobios esporulados
Enterobacterias
Coliformes totales
70
50
Clostridios Sulfito-red.
Clostridium perfringens
40
Levaduras
Mohos
30
20
10
7
610
E
10
E
10
E
510
E
6
5
10
E
410
E
4
310
E
10
E
10
E
210
E
3
2
110
E
10
E
10
0
<
% de m
muestras
60
Porcentaje de muestras
con niveles
i l más
á elevados
l
d
% de muesttras de ca
ada país
Irán
*Incumplen normativa española
**Sobrepasan recomendaciones ICMSF
70
60
Grecia
50
It li
Italia
40
España
30
20
10
**
>1
0
10
ra
s
s>
va
Le
in g
r fr
pe
du
en
us
re
B.
E4
E2
E2
>1
0
E1
li >
10
co
E.
ce
C.
*
lif o
Co
ac
ob
t er
En
rm
t er
es
ia s
>1
0E
>1
0
4*
E4
*
6*
0E
>1
al
ot
bT
ro
Ae
*
0
Supervivencia de
S l
Salmonella
ll en azafrán
fá
1,E+07
1,E+06
Log
g UFC
1,E+05
1,E+04
1,E+03
1,E+02
,
Enteritidis
Enteritidis FT1
Typhimurium DT104
1,E+01
Tiempo de reducción
decimal (D): 2 días
Typhimurium DT104B
Control*
Control
1,E+00
0
4
Días
*Promedio de las 4 cepas en ausencia de azafrán
7
Propuesta de método
microbiológico
Triturar 25 g azafrán en molino de
bolas para análisis químico y
microbiológico
Pesar ∼5 g (±0
(±0.1)
1) y resuspender en 45
ml de agua de peptona tamponada
(ISO 6579) (±0,1% Tween80)
Detección de
Salmonella
CULTIVO
((ISO 6579))
Reposar 10 min Tª
amb.
Recuentos:
E. coli
PCR
0,5 ml
Mezclar
Dos alícuotas 1 ml
Anaerobios
esporulados
sulfito reductores
sulfito-reductores
O
Pre-enriquecimiento
16±1 h, 37 ºC
PCR
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Cebadores para el gen invA de Salmonella
5’-CGGTGGTTTTAAGCGTACTCTT-3’
5
CGG GG
GCG C C 3
5’-CGAATATGCTCCACAAGGTTA-3’
0,5 ml preenriquecimiento
Filtración
Electroforesis en
agarosa
D t
Detección
ió
Nº de
ciclos:
Minutos:
Tª (ºC)
1
5
94
1
94
1
55,6
1
72
3
72
30
1
TOTAL: 4-6
HORAS
Lisis
DNA +
cebadores +
Taq-polimerasa
Taq
polimerasa
purificación
DNA
Detección de Salmonella
por cultivo (ISO 6579)
Dos alícuotas
de 1 ml del preenriquecimiento
q
• Caldo Rappaport-Vassiliadis
• Caldo Muller-Kauffman
24 h
Otro agar
selectivo
para
Salmonella
XLD
Agar
24 h
Identificación
bioquímica y
serológica
24-48 h
Resultados de la
validación interlaboratorios
Método:
E
Especificidad
ifi id d
Sensibilidad
Exactitud
Concentración
de Salmonella
Alta: [5×106]
Media: [5×103]
Baja: [5×102]
PCR
Cultivo (ISO 6579)
100 0 %
100.0
100 0 %
100.0
77.8 %
66.7 %
100.0 %
83.4 %
18.8 %
16.7 %
66.2 %
75.0 %
Media de dos réplicas
réplicas, analizadas por 9 laboratorios
laboratorios.