IV Taller de Calidad del Polo Científico Hotel Palco, 13

Transcripción

IV Taller de Calidad del Polo Científico
Hotel Palco, 13-15 de octubre del 2010
Ciudad de La Habana, Cuba
Editores:
Marisely González
Javier Mosquera
Lisette Pucheta
Mario Landys Chovel
Marisel Quintana
Alejandro Beldarían
Ciudad de La Habana, abril de 2011
Edición y corrección:
Lic. Virginia Betancourt López
Primera edición, abril de 2011 (versión electrónica)
© Sobre la presente edición:
Finlay Ediciones, 2011
ISBN: 978-959-7076-34-6
FINLAY EDICIONES
Ave. 212 No. 3112 e/ 31 y 37,
La Coronela, La Lisa,
Ciudad de La Habana, Cuba
CONTENIDO
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD
Enfoque basado en proceso del aseguramiento de la calidad de las producciones comerciales del CIM.
Subprocesos, auditorías e inspecciones, CAPA y documentación
Anais Quicutis Anaya, Yamira Busutil Sosa, Aurora T. García Melo, Maybel Medina Martínez, Antonio Vallín García, Mayra
Santaelena Escobar
Enfoque basado en proceso del sistema de gestión de materiales en el CIM
Abel Falcón Rodríguez, Diana Caridad Borges Vargas, Giselle Rodríguez Alfonzo, Michel Pino González, Amanda Sorell Oviedo,.
Antonio E. Vallín García.
Diseño del Sistema de Gestión de la Calidad según ISO 9001:2008 en Laboratorios AICA
Isabel D Torriente Cuéllar, Yalenis Cruz Landeiro, Andro Vergel Gutiérrez, Noris Caraballo Peñalver, Vivian Tolosa Cubela, Carmen
Ruiz Leiva y cols.
Revisión anual de productos. Experiencias obtenidas en Laboratorios AICA
Andro Vergel Gutiérrez, Sergio Senén Varona Hernández, Yalenis Cruz Landeiro
Gestión de los factores de riesgo que afectan la calidad de la liberación de los productos parenterales
Caridad Moreda Sánchez, Sara Quicute, Elizabeth Rosabal, Vivian San Germán, Dulce M. Raices, Yamarys Novo, Celia Feito
Procedimiento para homologación de productos por proveedores en el CIGB
Norelbys Albelo Rondón, Lourdes Hernández Pérez, Inés Heredia Revilla, Esther García Gato, Mercedes Ortega Pérez, Antonio Pedroso
Cuesta, Carlos García Sánchez, José Luis Marcelo Sainz, Rubén López Edghill.
Eficacia del proceso de gestión de proveedores y su influencia en la liberación de productos,
desde un enfoque de riesgo
Dennis Reinoso Guzmán, Alejandro Beldarraín Iznaga, Valia Vergel de la Osa, Lesneyde Molina Benítez, Lermis Mart
Evaluación de proveedores de insumos directos para la producción del centro de InmunoEnsayo
Dalia Lavadie Ayala, Marlene Casas Vilardell, Liliena López Brauet
Mejoras y evaluación del desempeño del proceso de tratamiento de las no conformidades en el CIGB
Jacquelín Heredia Revilla, Ileana García Martínez, Norelbys Albelo Rondón, Inés Heredia Revilla, Yair Quiñones Maya, Mercedes
Ortega Pérez, Yamila L. Marín Dávila y cols.
Auditorías de la calidad en el Centro de InmunoEnsayo y su impacto en el mejoramiento continuo
Madelyn Sabina Cebreiros,. Grisell Turró Grau, Adriana González Quintero, Liliena López Brauet
Sistema de liberación de productos obtenidos en el Centro de Química Biomolecular
Yerlen Castillo Suárez, Pablo Cabrera Lima, Evys Delá Herrera, Liliana Figueroa Ferrer, Janet Lora García, Marah Curbelo Álvarez y
cols.
Sistema automatizado para la liberación y control de materias primas, componentes y diagnosticadores
en el Centro de InmunoEnsayo
Idania González-Pérez, Roquelina Cuellar Pérez, Madelyn Sabina Cebreiros, Grisell Turró Grau, Liliena López Brauet
Implementación de un sistema documental como parte de la estrategia de gestión de los desechos
generados en el CIGB
Miriam Elena Cisneros Palacio, Yamilet Córdova Morales, Inés Heredia Revilla, Ilena García Martínez, Carlos García Sánchez.
Implantación de un sistema de costos totales de la calidad
Caridad Huete Argota, Andro Vergel Gutiérrez
PRODUCCIÓN
Validación del proceso de producción del HBsAg como IFA de las vacunas Heberbiovac HB y
Heberpenta
Ivonne Rodríguez Lima, Elías Nelson Rodríguez García, Yeny de la Torre Moya, Yoel A. Madruga González, Carlos Basilio Martínez
Laporte, Francis Hernández Coro y cols.
Selección de los peores casos para la validación de la limpieza de los principios activos
Olban Rafael González González , Héctor Colomé Dagneses, Adalberto Izquierdo Castro , Onán Gámes Rodríguez
Obtención de los peores casos para la validación de la limpieza de excipientes
Olban Rafael González González
Evaluación de la limpieza para el proceso de fabricación de clopidogrel
Alejandro Beldarraín Iznaga y Olban González González
CONTROL DE LA CALIDAD
Estabilidad genética de los bancos de células primarios que expresan la proteína BM86
Ileana Sánchez Ortíz, Marieta Marín Bruzos, Niuvis Montoya Echevarría, Nemecio González Fernández, Rosa Basulto Morales, Alain
Moreira Rubio y Jesús Zamora Sánchez
Evaluación de la estabilidad de la cepa Brevundimonas diminuta conservada en leche descremada al 20%
Nancy Burguet Lago, Jennys Roldán Bosmenier, Nelson Sierra Prado, José A. Trimiño Romero
Métodos analíticos para cuantificación de Azitromicina
Alejandro Beldarraín Iznaga, Adalberto Izquierdo Castro y Valia Vergel de la Osa
Optimización de un método ELISA para la determinación de la inmunogenicidad de la vacuna 1E10Alumina
J. Solozábal Armestrong, Maylin Rodríguez Rodríguez y V. Peña Sánchez
Estandarización, y validación del método de determinación del grado de activación del PEG 2,40 kDa-NHS
Lázara Muñoz Hernández, José A. Ramón Hernández, Dinorah Torres Idavoy, Gerardo García Ilera, Ileana Rosales, Inalvis Herrera
Rivas, Margela Montañés Valdez y Cols.
Validación de dos sistemas ELISA para cuantificar IFNpeguilado
Sheila Padrón Morales, Maelys Miyares Estrada, Yurisleydis Aldama Casas, Inalvis Herrera Rivas, Ariadna Serrano Patterson, Odaly
Amarante González, Dinorah Torres Idavoy y cols
Validación de una técnica analítica por HPLC para determinar ácido zoledrónico
María Isabel Reyes Tur, Aylema Romero Diaz , Yenilen Troche Concepción, Marisleydi Begué
Evaluación de los resultados de la verificación analítica del diagnosticador UMELISA HIV 1 + 2
RECOMBINANT del Centro de InmunoEnsayo
Evelyn Gato Orozco, Delia Benítez Gordillo, Regla Herrera Ruíz, Gerardo Baró Román, Liliena López Brauet
Certificación de la calidad del glucómetro SUMA SENSOR SXT en el Centro de InmunoEnsayo
Adriana González Quintero1, María Norvi Mora Sánchez, Liliena López Brauet, Evelyn Gato Orozco, Delia Benítez Gordillo, Héctor
Pérez Molina, Dalia Lavadié Ayala.
Nuevas especificaciones de calidad del gangliósido natural N-Glicolil GM3
Harold Curiel Hernández, Jorge L. Coipel Piney, Raine Garrido Arteaga, Janet C. Lora García, Vicente G. Vérez Bencomo, Violeta
Fernández Santana, María C. Rodríguez Montero, José A. González Lavaut, Yudit Molina Izquierdo, Vladimir Peña Sánchez
Procedimiento de cálculo de los límites de especificación del volumen de envase en el Centro de
InmunoEnsayo
Arién Sánchez González, Roquelina Cuellar Pérez
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD
Enfoque basado en proceso del aseguramiento de la calidad de las producciones comerciales del
CIM. Subprocesos, auditorías e inspecciones, CAPA y documentación
Anais Quicutis Anaya, Yamira Busutil Sosa, Aurora T. García Melo, Maybel Medina Martínez, Antonio Vallín García, Mayra Santaelena
Escobar
Centro de Inmunología Molecular (CIM). Calle 216, esq.15, municipio Playa, Ciudad de la Habana.
Email: [email protected]
El presente trabajo se realizó en el Centro de Inmunología Molecular (CIM), que se dedica a la investigación–producción de
productos farmacéuticos y biotecnológicos y forma parte del Polo Científico de la zona oeste de la capital. El trabajo tiene
como objetivo aplicar la metodología Planificar-Hacer-Verificar-Actuar (P-H-V-A) para diseñar los subprocesos de auditorías
e inspecciones, CAPA, manejo, y archivo de la documentación. Como principales resultados del trabajo se tienen la
confección de los diagramas de flujo de los subprocesos; la propuesta de los indicadores de desempeño de los subprocesos
para conocer cómo se comportan los mismos, las fichas de los subprocesos y los mapas de riesgo. El diseño de los
subprocesos anteriormente mencionados mediante la aplicación de la metodología P-H-V-A permite definir de manera precisa
cuáles son las actividades a realizar en cada etapa de la metodología y cómo se deben realizar. Los indicadores propuestos
permiten medir la eficiencia y la eficacia de los subprocesos y determinar si los mismos alcanzan los resultados planificados.
El diseño de los subprocesos posibilita llevar a cabo la gestión por procesos del aseguramiento de la calidad de las
producciones biofarmacéuticas comerciales e iniciar y mantener acciones de mejora continua.
Palabras clave: Enfoque basado en proceso, metodología P-H-V-A, aseguramiento de la calidad.
Introducción
El CIM es una institución biotecnológica dedicada a la investigación, desarrollo, producción y comercialización de
anticuerpos monoclonales, proteínas recombinantes y vacunas, según los requerimientos de las actuales Buenas Prácticas de
Producción (BPP) y los estándares establecidos por las agencias regulatorias internacionales y nacionales. Su principal
objetivo es lograr productos terapéuticos con elevados niveles de seguridad y eficacia dirigidos fundamentalmente a pacientes
aquejados de enfermedades crónicas no trasmisibles”. (CECMED. Regulación 21:2000).
El CIM cuenta con cuatro productos comerciales y la calidad de los mismos le ha permitido penetrar los mercados del primer
mundo y ocupar un lugar dentro de la fuerte competencia.
Presenta la problemática de que Aseguramiento de la Calidad gestiona las actividades de forma funcional. Por tanto no están
diseñados los subprocesos de auditorías e inspecciones, CAPA y manejo y archivo de la documentación. Es por ello que se
hace necesario diseñar esos subprocesos para poder llevar a cabo la gestión por procesos del aseguramiento de la calidad, lo
que propiciará la mejora continua, la obtención de productos más seguros y eficaces y el aumento de la satisfacción de los
clientes.
Materiales y Métodos
El diseño de los subprocesos se realizó aplicando la metodología P-H-V-A, que es una herramienta muy útil porque permite
planificar, implementar, controlar y mejorar los subprocesos. Además, posibilita definir claramente cuáles son las actividades
a realizar en cada etapa y los responsables, lo que dinamiza la relación entre las personas y los subprocesos y entre los
subprocesos y los resultados.
En la etapa Planificar se define el objetivo del subproceso, el alcance, las responsabilidades, los indicadores; se identifican las
entradas, las salidas, los clientes, los proveedores, los recursos y la documentación del subproceso. En la etapa Hacer se
realiza la calificación y capacitación del personal y se ejecutan los procedimientos establecidos. En la etapa Verificar se
realiza la medición de los indicadores del subproceso, se comparan con el valor de referencia y se analizan los resultados. En
la etapa Actuar se toman decisiones y se realizan las acciones correctivas y preventivas en función de las desviaciones entre
planificar y verificar.
En la realización del trabajo se emplearon técnicas tales como: encuestas, entrevistas, la observación, la revisión de
documentos, los mapas de riesgo, los diagramas de flujo y las fichas de los subprocesos.
1
Resultados y Discusión
A continuación se procede a la aplicación de la metodología para el diseño de los subprocesos anteriormente mencionados.
Subproceso de auditorías e inspecciones
Etapa I: Planificar las auditorías o inspecciones
Objetivo del subproceso: Realizar auditorías o inspecciones con el fin de evaluar y verificar el cumplimiento de las BPF y las
BPL para garantizar el cumplimiento de los requisitos previamente especificados y lograr la satisfacción de los clientes.
Alcance del subproceso: Abarca todas las auditorías o inspecciones internas realizadas a los procesos del CIM y las auditorías
o inspecciones realizadas a los proveedores de servicios analíticos y productos intermedios contratados por el CIM.
Responsabilidades
Los niveles de responsabilidades en el subproceso se estructuran en cuatro niveles.
Nivel I: J´ del Proceso de Aseguramiento de la Calidad
Nivel II: Auditor líder
Nivel III: Auditores
Nivel IV: Especialistas y técnicos de los procesos del CIM
Indicadores del subproceso
¾ Indicador de eficacia
¾ Indicador de eficiencia
% cumplimiento del programa
% NC detectadas internamente Identificación de las entradas, proveedores, salidas y clientes
Las entradas del subproceso, las salidas, los clientes y los proveedores se muestran en la ficha del subproceso (Tabla 1).
Tabla 1: Ficha del subproceso de auditorías e inspecciones.
G-11
“Auditorías o inspecciones”
FSP-2
Objetivo del proceso: Realizar auditorías o inspecciones con el fin de evaluar y verificar el cumplimiento de las BPF y las
BPL para garantizar el cumplimiento de los requisitos previamente especificados y lograr la satisfacción del cliente.
Responsable del proceso: Auditor líder
Documentación:
PNO 1146 “Procedimiento para realizar las inspecciones internas
del CIM”.
“Programa de calidad para las auditorías o inspecciones”
Empieza: Con la selección del equipo auditor que realizará la auditoría o inspección.
Incluye: Auditorías o inspecciones a los procesos del CIM y a los proveedores de servicios analíticos y productos
intermedios.
Termina: Cuando se archiva el informe final.
Entradas: Programa de calidad para las auditorías o inspecciones, PNO 1146, regulaciones, listas de chequeo, informes de
auditorías o inspecciones anteriores, plan de la auditoría o inspección, registro 1108, informe final, informe aprobado.
Proveedores: Agencias regulatorias
Salidas: Plan de la auditoría o inspección, registro 1108, registro 1298, informe final, informe aprobado, informe archivado.
Clientes: Procesos del CIM, proveedores externos.
Registros:
• 1108 “Observaciones y evidencias objetivas”
• 1298 “Identificación y evaluación de las NC”
Indicadores:
% cumplimiento del programa = {[(∑Cantidad A o I realizadas)/ (∑Cantidad A o I planificadas)] *100}
% NC detectadas internamente = {[(∑Cantidad NC detectadas en A o I internas)/ (∑Cantidad NC detectadas en A o I
internas + Cantidad NC detectadas por las Agencias Regulatorias)] * 100}
2
Recursos necesarios para ejecutar el subproceso
- Recursos humanos
Para realizar las auditorías e inspecciones se requiere personal con las competencias laborales adecuadas para desarrollar las
actividades. Estas competencias incluyen la capacitación, la experiencia laboral y la formación académica.
- Recursos materiales
Los recursos materiales utilizados en el subproceso son los materiales de oficina, el material ofimático y los servicios de
tecnologías de información.
Documentación del subproceso
‐
‐
‐
Programa de calidad para las auditorías e inspecciones.
Procedimiento para realizar las inspecciones internas del CIM.
Mapa de riesgos (Tabla 2).
Tabla 2. Mapa de riesgos de las actividades críticas del subproceso de auditorías e inspecciones.
Actividades
Riesgos
Causas
Confección del programa
anual de auditoría o inspección
Que no se incluyan
todos los procesos y los
proveedores
Que no se confeccione
en tiempo
Poco control de lo
que se debe auditar
o inspeccionar
Mala organización
Selección del equipo auditor
Falta de
entrenamiento
Mal selección
Responsables
Entrenamiento y
capacitación del
personal
Auditor líder
Especialistas
de CAPA
Auditor líder
Auditor líder
No detección de las NC
No señalar las
observaciones
Mal entrenamiento
Desconocimiento
de las regulaciones
y guías de BPP
Clasificar las No
Conformidades
Clasificación incorrecta
Desconocimiento
de los tipos de NC
Documentar las NC no
resueltas
Que no se documenten
todas
Mal supervisión
Entrenamiento y
capacitación del
personal
Auditor líder
Mala gestión
Falta de
entrenamiento
Entrenamiento y
capacitación del
personal
Auditores
Especialistas
de CAPA
Desconocimiento
de los criterios de
auditoría
Entrenamiento y
capacitación del
personal
Señalar las conformidades, las
NC y las observaciones
Verificar el cumplimiento de
las acciones correctivas a las
No Conformidades detectadas
en auditorías anteriores
Informar los resultados de la
Auditoría o Inspección
Que no tengan las
competencias laborales
necesarias
Medidas
Confeccionar una
lista de todos los
procesos del CIM
Confeccionar una
lista de todos los
proveedores
Organizar y
planificar las tareas
Entrenamiento y
capacitación del
personal
Realizar un riguroso
proceso de selección
Entrenamiento y
capacitación del
personal
Que no se hayan
ejecutado las acciones
correctivas
Que no se hayan
ejecutado todas las
acciones
Que haya divergencias
entre el equipo auditor
y los auditados
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Auditor líder
Auditor líder
Etapa II: Realizar las auditorías e inspecciones.
Calificación del personal
La calificación del personal incluye la capacitación, la experiencia laboral y la formación académica.
Procedimiento de ejecución de las auditorías e inspecciones
A continuación se describen las actividades a realizar como parte de la ejecución de las auditorías e inspecciones.
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Selección del equipo auditor
Definir los objetivos, el alcance y los criterios de la auditoría o inspección
Confeccionar el plan de la auditoría o inspección
Informar a los auditados la intención de realizar la auditoría o inspección
Asignar las tareas y responsabilidades al equipo auditor
Preparar los documentos de trabajo
Realizar la reunión de apertura
Ejecutar la auditoría o inspección
Reunión del equipo auditor para analizar los resultados
Realizar la reunión de cierre con los auditados
Documentar las No Conformidades
Confeccionar el informe de la auditoría o inspección
Aprobar el informe
Distribuir el informe
Archivar los documentos Etapa III: Medición de los indicadores del subproceso de auditorías e inspecciones y análisis de los resultados.
La eficiencia y la eficacia del subproceso de auditorías o inspecciones se evalúan a través de los indicadores.
Si el indicador % de cumplimiento del programa es ≤ 90% esto indica que el subproceso no se comporta según lo planificado
y esto pudiera estar dado fundamentalmente por:
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Planificación inadecuada de las auditorías e inspecciones
El programa de auditoría no es bien divulgado
Por causas ajenas a los auditores, que impiden que estos realicen las auditorías o inspecciones
Estas causas pueden ser:
‐
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Por remodelación de las áreas
Por paradas productivas
No presencia del personal de los procesos a auditar
Si el indicador % de NC detectadas internamente es ≤ 85% esto indica que el subproceso no se comporta según lo planificado
y esto puede estar dado fundamentalmente por:
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Falta de entrenamiento del personal que realiza las auditorías o inspecciones.
No se gestionan las No Conformidades.
Falta de recursos.
Etapa IV: Actuar
Una vez identificadas las posibles causas que provocan que el subproceso no se comporte según lo planificado se deben
identificar las acciones de mejora más adecuadas e implementar las mismas. Estas acciones de mejora deben estar dirigidas a
alcanzar los resultados planificados.
Estas acciones de mejora son:
‐
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Planificar nueva fecha para las auditorías e inspecciones que no pudieron ser realizadas en la fecha planificada.
Entrenar y capacitar al personal.
Destinar los recursos necesarios para ejecutar las tareas de los planes de acción en el menor tiempo posible.
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Los responsables de realizar estas acciones son los auditores y los J´ de Proceso.
Conclusiones
1.
2.
3.
4.
El diseño de los subprocesos de auditorías e inspecciones, CAPA y manejo y archivo de la documentación mediante
la aplicación de la metodología P-H-V-A permite definir de manera precisa cuáles son las actividades a realizar en
cada etapa de la metodología y cómo se deben realizar.
Los diagramas de flujo confeccionados para los subprocesos anteriormente mencionados constituyen una herramienta
muy útil porque sirven de guía a los especialistas y técnicos en la ejecución de los subprocesos al representar la
secuencia de las actividades y las entradas y salidas.
Se establecieron indicadores para medir la eficiencia y eficacia de los subprocesos y así poder conocer cómo se
comportan los mismos.
Se diseñó un subproceso de Manejo y archivo de la documentación con el cual se le asignan más responsabilidades a
los procesos en materia de documentación y posibilita que la documentación sea más accesible a los usuarios
Referencias
1. Beltrán SJ y otros. “Guía para una gestión basada en procesos”. España: Instituto Andaluz de Tecnología; 2003.
2. Colectivo de autores. “La gestión por proceso” Servicio de Calidad de la Atención Sanitaria. Toledo: Sescam; 2002.
3. Complemento de normas ISO Módulo: “Orientación sobre el Concepto y uso del Enfoque basado en procesos para los sistemas de
gestión” 2008.
4. Cuatrecasas L. “Gestión integral de la calidad. Implantación, control y certificación”. Barcelona, España; 2001.
5. Hoyle D & Thompson J. “Del aseguramiento a la gestión de la calidad: El enfoque basado en procesos”; 2002.
6. Delgado M: “Modulo de Ingeniería de la Calidad. Total. ” La Habana: ISPJAE; 2005.
7. Evans JR y Lindsay W. “Administración y control de la calidad”. España: Internacional Thomson Editores; 1999.
8. EUSKALIT “Gestión y mejora de procesos”. Fundación Vasca para la Calidad; 2002.
9. “Guidance for Industry Q10 Pharmaceutical Quality System”. FDA.GMP; 2009.
10. Delgado M: “Sistema de calidad para el desarrollo de nuevos productos biofarmacéuticos”. La Habana: ISPJAE; 1997.
11. “Requisitos para la solicitud de autorización y modificación de ensayos clínicos”. Regulación No. 21. La Habana: CECMED; 2000.
12. “Medicinal Products for Human and Veterinary Use: Good Manufacturing Practice”. Part II.Volume 4. European Commission; 2005.
13. Norma internacional ISO 9001:2008. “Sistemas de gestión de la calidad-Requisitos”.
14. Norma internacional ISO 19011:2002 “Directrices para la auditoría de los sistemas de gestión de la calidad y/o ambiental”.
15. ICH Topic Q10 “Pharmaceutical Quality System”. Current Step 2 version dated 9 May 2007.
Enfoque basado en proceso del sistema de gestión de materiales en el CIM
Abel Falcón Rodríguez, Diana Caridad Borges Vargas, Giselle Rodríguez Alfonzo, Michel Pino González, Amanda Sorell Oviedo, Antonio
E. Vallín García.
1
Centro de Inmunología Molecular (CIM). Calle 216 esq.15 municipio Playa, Ciudad de la Habana.
El sistema de materiales debe asegurar que las partes involucradas, materias primas, material en proceso, productos
terminados y suministros se desplacen periódicamente de un lugar a otro. En el CIM este sistema se gestiona de forma
funcional y debido al incremento productivo y la diversificación de mercado esta quedándose obsoleto siendo una necesidad
adquirir el enfoque a procesos pues con el mismo se logra una mayor eficacia y eficiencia en las actividades de la
organización logrando aumentar la satisfacción del cliente y favoreciendo al proceso de mejora continua. En este trabajo se
emplearon técnicas tales como revisión de documentos, análisis de No Conformidades (NC), fichas de proceso, indicadores,
diagramas de flujo y técnicas estadísticas. La organización del sistema de materiales enfocado al proceso permitió conocer los
puntos de criticidad dentro del sistema e implementar indicadores que permiten planificar, medir, controlar y mejorar las
actividades mediante la aplicación de acciones de mejora disminuyendo el número de NC detectadas por los clientes. Del
estudio realizado podemos concluir que el cambio de enfoque al sistema de materiales es de vital importancia en la
organización del mismo asegurando la eficiencia y eficacia en el flujo de materiales y permitiendo mejorar indicadores como
tiempo de liberación de materiales y de aprobación de documentos.
Palabras clave: Aseguramiento de la calidad, sistema de materiales, enfoque a proceso.
5
Introducción
En la actualidad el mundo empresarial está marcado por un gran dinamismo y nuevas tecnologías, lo cual conlleva a nuevos
métodos de gestión; la gestión por procesos es uno de los enfoques más coherentes, ya que es una forma de organización
diferente a la clásica organización funcional, y en la que prima la visión del cliente sobre las actividades de la organización.
Los procesos así definidos son gestionados de modo estructurado y sobre su mejora se basa la de la propia organización.
El Centro de Inmunología Molecular (CIM) es una institución biotecnológica dedicada a la investigación, desarrollo,
producción y comercialización de anticuerpos monoclonales, proteínas recombinantes y vacunas, según los requerimientos de
las actuales Buenas Prácticas de Producción (BPP) y los estándares establecidos por las agencias regulatorias internacionales y
nacionales. Su objetivo es lograr productos terapéuticos con elevados niveles de seguridad, eficacia y con impacto tangible en
la supervivencia del cáncer en Cuba a escala poblacional. El CIM es una organización generadora de recursos para el país
operando varias instalaciones científicas y productivas en Cuba y en otros países (1).
El sistema de materiales debe de asegurar que las partes involucradas, materias primas, material en proceso, productos
terminados y suministros se desplacen periódicamente de un lugar a otro. En el CIM este sistema se gestiona de forma
funcional y debido al incremento productivo y diversificación de mercado esta quedándose obsoleto siendo una necesidad
adquirir el enfoque a procesos pues con el mismo se logra una mayor eficacia y eficiencia en las actividades de la
organización, logrando aumentar la satisfacción del cliente y favoreciendo al proceso de mejora continua.
Se utilizaron los datos de las materias primas recepcionadas en el 2010 y las No Conformidades del año 2009 y 2010. Las
principales herramientas empleadas fueron: revisión de documentos, análisis de No Conformidades (NC), Fichas de proceso,
indicadores, diagramas de flujo y técnica estadísticas.
El CIM se rige por un conjunto de normas y regulaciones (BPP, BPD, BPC, BPA), las cuales dictan los requisitos mínimos de
trabajo, que son cumplidos cabalmente, pero con un mecanismo de gestión no adecuado debido al aumento de las No
Conformidades. A través del Enfoque a Procesos se pretende implantar un mecanismo de gestión eficiente que permita
gestionar diferentes actividades relacionadas entre sí (2,3). El proceso de materiales es de suma importancia ya que se encarga
de la gestión de los suministros para la producción. Este es un proceso de apoyo en estado crítico, pues del total de No
Conformidades (111) que se encuentran en el CIM podemos observar que el 19% pertenecen a este proceso o relacionadas
con el mismo (Figura 1)
Figura 1. % que representan las NC de Materiales respecto al total.
Estos datos muestran la necesidad de un sistema de gestión de la calidad que establezca y asegure los requisitos necesarios
para el desarrollo adecuado del proceso de materiales. La organización enfocada a proceso y el establecimiento de los flujos y
fichas de procesos permitió conocer los puntos de criticidad dentro del sistema (Figura 2).
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De la confección de las fichas de proceso se obtuvieron indicadores de eficiencia y eficacia para cada uno de los procesos
como se muestra a continuación:
‐
‐
‐
‐
‐
‐
‐
Ciclo de liberación de materiales (Recepción, muestreo, ensayos y Liberación).
Ciclo de aprobación de las fichas de especificaciones (Revisión, publicación).
Cantidad de materiales aprobados/recepcionado
Cantidad de lotes recepcionados/lotes a reensayar
Cantidad de NC
Cantidad de informes de evaluación de proveedores/total de proveedores
Cantidad de proveedores evaluados/total de proveedores
Figura 2. Flujo del proceso de evaluación de proveedores.
A partir de estos indicadores se tomaron los datos de los materiales recepcionadas en el 2010 y se evaluó el comportamiento
de la actividad durante el año. El comportamiento del proceso de materiales se observa a continuación (Figura 3, Figura 4 y
Figura 5). Durante el año 2010 el ciclo de liberación de las materias primas fue alrededor de 50 días.
Figura 3. Por ciento de cada material con respecto al total
recepcionado.
Figura 4. Estados de los materiales recepcionados.
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Figura 5. Tiempo de liberacion de las materias primas.
Se pudo evaluar el proceso de revisión de fichas de especificaciones. La cantidad de fichas de especificaciones elaboradas,
revisadas y el tempo que se demoró hasta su publicación se puede observar en las Figuras 6, 7 y 8.
Figura 6. Por ciento de fichas de especificaciones
elaboradas por tipo de material.
Figura 7. Estado en que se encuentran las fichas de
especificaciones elaboradas.
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Figura 8. Tiempo de publicacion de las fichas de especificaciones
En el proceso de evaluación de proveedores no se han medido los indicadores de eficiencia y eficacia durante este año pero se
ha estado trabajando en aplicar un único enfoque de gestión de calidad para todos los proveedores, se ha hecho una
clasificación de cada proveedor por individual, basado en el riesgo que tienen estos en el producto y la incapacidad de obtener
un producto de otro proveedor diferente (4,5). Esta clasificación nos permitirá una atención priorizada a los proveedores, una
gestión de proveedores simplificada y una disminución del muestreo de las materias primas disminuyendo costos y tiempo.
Si se realiza un análisis comparativo en el año 2010 de cómo se han comportados las NC desde que se comenzó a organizar el
trabajo con enfoque a proceso y se comenzaron a medir algunos de los indicadores se puede observar (Figura 9) Que hay una
disminución de la cantidad de NC detectadas en un período de tiempo similar.
Figura 9. Por ciento de NC antes y después de implemtar el enfoque a proceso.
Clasificación Enero-Mayo
Clasificación Junio-Octubre
Figura 10. Clasificación de las NC antes y después de implemtar el enfoque a proceso.
9
El cambio de enfoque al sistema de materiales es de vital importancia en la organización del mismo asegurando la eficiencia y
eficacia en el flujo de materiales y permitiendo mejorar indicadores como tiempo de liberación de materiales y de aprobación
de documentos.
Conclusiones
1.
2.
3.
4.
Se organizó el sistema de materiales enfocado a proceso.
Se realizó los diagramas de flujo y los indicadores de eficacia y eficiencia.
Se organizaron los proveedores según la criticidad.
Se disminuyó el número de NC detectadas por los clientes.
Referencias
5. Lage Dávila A. Conferencia: El estudio “built to last”. CIM. 2007.
6. Sistema de gestión de la calidad, http://www.gqs-inc.com.
7. NC, ISO 9000:2008 Sistemas de Gestión de la Calidad — Fundamentos y vocabulario.NC, ISO 9001:2008 ―Sistemas de Gestión de la
Calidad. Requisitos.
8. Manejo de Materiales. http//www.monografias.com
9. Bob Rhoades. Supplier quality management: a risk-based approach. Biopharm International, January 2010.
Diseño del Sistema de Gestión de la Calidad según ISO 9001:2008 en Laboratorios AICA
Isabel D Torriente Cuéllar, Yalenis Cruz Landeiro, Andro Vergel Gutiérrez, Noris Caraballo Peñalver, Vivian Tolosa Cubela, Carmen Ruiz
Leiva y cols.
1
Laboratorio Farmacéutico AICA. Ave 23 e/n 268 y 270 S. Agustín. La Lisa. Telef. 271-2055 .
La empresa Laboratorios AICA tiene un sistema de la calidad implantado certificado por el CECMED. La tendencia moderna
está encaminada al enfoque del proceso, implementándose y certificando los sistemas de gestión de la calidad. Las normas
internacionales ISO 9001 describen los elementos que se deben incluir en los mismos, pero no la forma en que la organización
debe ponerlos en práctica; por lo tanto, el diseño y la aplicación debe dar respuesta a los requerimientos propios y objetivos
particulares de la organización, teniendo en cuenta las características de la producción y las prácticas específicas. Se aplicaron
tres de los principios de las técnicas organizativas de Dirección. Se utilizaron los ocho principios básicos del sistema de
gestión de la calidad de acuerdo con lo establecido en las NC-ISO 9001:2008 y los requisitos de la Norma. Se aplicó la técnica
causa y efecto para identificar en que se debía trabajar y se creó el equipo gestor para realizar la implementación. Como
resultado se elaboró el mapa de los procesos, donde se identificaron las actividades inherentes y se determinaron los
responsables de los procesos. Se elaboraron las fichas de los procesos que incluyen los indicadores de eficacia y se actualizó
el Manual de la Calidad. Se realizó la revisión por la Dirección obteniéndose el programa de mejora. Como resultado, en la
auditoría diagnóstico realizada por el Instituto Nacional de Investigaciones en Normalización, previa certificación, se
obtuvieron resultados satisfactorios por el alto nivel de correspondencia con la Norma ISO 9001: 2008.
Palabras claves: Gestores de procesos; mapa de proceso, fichas de los procesos.
Introducción
El objetivo principal de toda organización debe ser la calidad de los productos que elabora y debe lograr que cumplan una
necesidad o propósito bien definido: satisfacer las expectativas del cliente, ser conforme con las normas y especificaciones
aplicadas, ser conforme con las regulaciones vigentes y aplicables y que ofrezca un costo que presente ganancia. Para lograr lo
anterior es necesario contar con un sistema de gestión de la calidad. Laboratorios AICA tiene un sistema de la calidad
implantado y certificado por el CECMED. La tendencia moderna está encaminada al enfoque del proceso con la interrelación
de los mismos, cuyo objetivo ya no es solo satisfacer al cliente sino exceder sus expectativas incluyendo a otras partes
interesadas (proveedor, organización) por lo que se están implementando y certificando los sistemas de gestión de la calidad.
Las Normas Internacionales de la Familia ISO 9001 describen los elementos que se deben incluir en los sistemas de gestión de
la calidad, pero no la forma en que la organización los debe poner en práctica; por lo tanto, el diseño y la aplicación de un
sistema de gestión de la calidad debe dar respuesta a los requerimientos propios y a los objetivos particulares de la
10
organización, en los cuales debe tenerse en cuenta las características de la producción y las prácticas específicas de la
organización. Entre los elementos a destacar en el sistema de gestión de la calidad es que el mismo debe garantizar que se
encuentren bajo control todos los factores técnicos, administrativos y humanos que influyen en la calidad de los productos y
desarrollar un trabajo en toda la organización para lograr la prevención. El Sistema de Gestión de la Calidad aquí diseñado
tiende a dar respuesta a todos los elementos definidos anteriormente, conjugándose con las características propias de nuestras
producciones.
Metodología
Se aplicaron tres de los principios básicos de las técnicas organizativas de Dirección: el principio de orientación a los
objetivos, ya que a partir de los objetivos estratégicos bien definidos por la Dirección General, las diferentes direcciones
elaboraron los objetivos operacionales y los objetivos de la calidad; el principio de la unidad de la Dirección y la información
manifestado en los Consejos de Dirección, en el cual el Director de Aseguramiento y Control de la Calidad informa los
resultados de la gestión en la implementación del Sistema de Gestión de la Calidad, analizándose críticamente los resultados
obtenidos y adoptándose acuerdos, liderados por la Dirección General, y el principio del progreso científico técnico ya que se
estudiaron las normativas que rigen las Normas ISO y su interrelación con la documentación interna y externa que rigen las
diferentes actividades. Se utilizaron como base los ocho principios básicos del Sistema de Gestión de la Calidad, de acuerdo
con lo establecido en las NC-ISO 9001:2008 (2) y los requisitos de la Norma con las diferentes áreas (Figura 1). Se utilizo el
Ciclo de Vida Demming (Figura 2). Se aplicó la técnica de causa y efecto, también nombrado Diagrama de Ishikawa (Figura
3) para identificar las causas en las que se debe trabajar como parte del sistema de gestión de la calidad según ISO 9001:
2008. Se aplicó por la Alta Dirección la técnica de Dirección llamada tormenta de ideas para rediseñar el enunciado de la
Política de Calidad. Se creó el Equipo Gestor para determinar lo necesario para la implementación e implantación del
sistema de gestión de la calidad. Terminado el trabajo se identificaron las dificultades y las causas en las que se debía trabajar:
estudio y adiestramiento de las Normativas ISO (3,4,5,6) y su relación con regulaciones nacionales (CECMED) (7) e
internacionales (OMS e ICH) (8). Revisión de los 6 documentos mandatarios y los 21 registros solicitados por el Sistema de
Gestión de la Calidad NC-ISO 9001:2008. Revisión del Manual de la Calidad elaborado e implantado en el Centro y
evaluación de su correspondencia con la Norma para el Sistema de Gestión de la Calidad elegido por la organización con
vistas a su certificación. Revisión de la visión de la empresa y la política de la calidad. A partir de este nuevo enfoque se
definió el mapa de los procesos, determinándose los procesos propuestos a certificar con el flujo de producción, los gestores o
dueños de proceso, las fichas de los procesos que incluye los indicadores de eficacia (9,10) y los Procedimientos
Normalizados de Operación, con incidencia en los diferentes procesos. Se divulgaron en toda la organización aspectos
básicos sobre el Sistema de Gestión de la Calidad propuesto y su certificación.
Requisitos
Requisitos Básicos
Básicos norma
norma
NC-ISO
NC-ISO 2001:2008
2001:2008
Recursos
Fi nancieros
Mat eriales
Hu manos
R 6 y R5
Recursos
Pl anear
Responsabilidad
Dirección R5 y R4
Actuar
PROCESO
Entrada
Hacer
Verificar
Realización
Producto R 7 y R4
Sali da
Medición, Análisis
y Mejora R 8 y R5
Controles
Figura 1. Requisitos básicos Norma NC-ISO 9001:2008
11
Fluj o de infor maci ón
Revi si ón por l a Alta Direcci ón.
Eval uaci ón de l os i ndicadores
de eficaci a (R5 ) y ( R8)
Preparaci ón cambi o
Estado actual (R5)
Docu mentaci ón
Eval uaci ón 6 Documentos
Mandatari os y 21 Registros(R4 )
Identificar l os
obj eti vos de l a
Cali dad Medi bl es
(R4) (R5)
Despli egue Requi sitos
Bási cos norma
Di vul gaci ón a todos l os
ni vel es de l a Organi zaci ón
NC-ISO 2001:2008.
(
R4)
I mplantaci ón
Sistema de Gestión
de la Calidad
NC-ISO 9001:2008
y (R5)
Control es defi ni dos
para el proceso
Al cance: Identificaci ón y defi ni ci ón
proceso propuesto para
sel ecci onado ( R8)
certifi caci ón ( R7)
Recursos defi ni dos
para el proceso
Identificaci ón Entradas y
sali das PHVA
sel ecci onado ( R6)
(
.
R4)
Mapa de proceso
Figura 2. Diagrama de causa y efecto
Resultados y discusión
Se ejecutaron las siguientes actividades: Curso sobre la utilización de la NC-ISO 9001:2008: Sistemas de gestión de la
calidad. Requisitos: Curso de Formación de Auditores Internos, cumpliendo con la NC-ISO 19011:2004. Se resolucionó al
representante de la Dirección para el control del sistema de gestión de la calidad. Se elaboró el documento Planificación de la
Calidad que incluye compromisos con la política de la calidad a partir los objetivos de calidad, teniendo en cuenta como
actividades los objetivos operacionales, con responsables y fechas de control. Se elaboraron los objetivos de la calidad con el
nuevo enfoque y se revisó y aprobó por la alta Dirección. Se revisó y aprobó por la Dirección General la política de la calidad.
Se elaboró el Procedimiento Normalizado de Operación para la Revisión del sistema de gestión de la calidad por la Dirección
General (11) y se realizó la 1ra. revisión en el Consejo de Dirección. Se elaboró el documento Programa de mejora de la
calidad a partir de esta revisión. Se diseño, elaboró y aprobó el mapa de proceso de la organización que incluye los procesos
operacionales, estratégicos y de apoyo y la determinación de los gestores o responsables de los procesos (Figura 3). Se elaboró
el procedimiento para la elaboración de las fichas de los procesos (12). Se elaboraron las fichas de los procesos determinados
por la organización en el mapa de procesos, determinándose los indicadores de eficacia, las entradas, salidas, controles y
mediciones de los diferentes procesos. Se logró la participación directa de todos los responsables de los procesos en la
elaboración de las fichas de los procesos. Se actualizó el Manual de la Calidad a partir de la aprobación de los documentos
de calidad solicitados, entre otros el mapa de procesos de la organización. Se realizó el diagnóstico del ININ previa
certificación, concluyendo que el Sistema de Gestión de la Calidad de Laboratorios AICA presenta un alto nivel de
correspondencia con la NC-ISO 9001: 2008.
12
PROCESOS
PROCESOS ES
ESTRAT
TRATÉÉG
G ICOS
ICOS
YOTRASPARTESINTERESADAS
REQUISITOSDELCLIENTE
GES T Ó
I N
C OM ERC IAL
IN V EST G
I AC IÓ N D ES AR R OLLO
GES T Ó
I N D E LA
PR OD U CC IÓ N
PROCESOS
PROCESOS O
OPPERAC
ERAC IO
IONALES
NALES
GEST IÓN
DE
R EC U R SOS
H UM AN OS
GEST IÓN
EC ON ÓM IC O
FN
I AN C IER A
GEST IÓN
AD M IN ISTR A T V
I A
GE ST O
I N DE
IN GEN IER A
I Y
M AN TEN IM IEN TO
PROCE
PROCESOS
SOS DE
DE A
APOYO
POYO
C ON TRO L IN T ERNO
INTERESADAS
GES T Ó
I N DE L A
D IR EC C IÓ N
C AL ID AD
SATISFACCIÓNDELCLIENTEYOTRASPARTES
GES T Ó
I N DE L A
C ON TRO L D EL S IS T EMA
PROCESOS
PROCESOS DE
DEM
M ED
ED IC
ICIÓ
IÓN;
N;AN
ANÁ
ÁLIS
LISIS
IS Y
YM
M EJ
EJORA
ORA
15
Figura 3. Mapa de los procesos
Conclusiones
Se realizó el diseño del Sistema de Gestión de la Calidad de los Laboratorios AICA, según las normas ISO 9001: 2008 a
partir de las tendencias actuales de la documentación nacionales e internacionales, logrando enfoque por procesos, con el
objetivo de solicitar la certificación del Sistema de Gestión de la Calidad. Se aplicó la técnica causa y efecto para identificar
lo que faltaba implementar el sistema de gestión y así realizar el diseño. Se elaboró el mapa de procesos, donde se
identificaron las actividades y se determinaron los gestores o dueños de los procesos. Se realizó la primera revisión por la
Dirección obteniéndose como resultado el programa de mejora. Se rediseñaron la política de la calidad y los objetivos de la
calidad, obteniéndose como resultado la planificación de la calidad. Se elaboraron las fichas de los procesos determinados en
el mapa de procesos. Se realizó el diagnóstico del ININ previa certificación, concluyendo que el sistema de gestión de la
calidad de Laboratorios AICA presenta un alto nivel de correspondencia con la NC-ISO 9001: 2008.
Referencias
1.
2.
3.
4.
5.
6.
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8.
9.
10.
11.
12.
Payret G, Silvera Vegueria L, Carmenate G. Dirección por objetivos. PREGER. Cuba 2006.
NC-ISO 9001:2008. Sistemas de Gestión de la Calidad. Requisitos. ININ. Cuba; 2008.
NC-ISO 19011:2004. Directrices para las Auditorías de los Sistemas de Gestión de la Calidad/ y/ o Ambiental.. ININ. Cuba;
2004.
NC-ISO 1013:2005. Directrices para la documentación de los Sistemas de Gestión de la Calidad y / o Ambiental.. ININ. Cuba;
2005.
NC-ISO 9000:2005 Sistemas de Gestión de la Calidad. Fundamentos y vocabulario. ININ. Cuba; 2008.
NC-ISO 1005:2009. Gestión para el éxito sostenido de una organización. Enfoque de gestión de la calidad. ININ. Cuba; 2009.
Regulación 16-2006. Directrices sobre las buenas prácticas de fabricación de productos farmacéuticos. CECMED. Cuba; 2006.
Pharmaceutical Quality System Q10. ICH Process. FDA.U.S; 2007
C Beltrán Sanz J, Rivas Zapata M, Tejedor Panchón F, Carrasco Pérez R. Guía para una gestión basada en proceso. Andalucía.
Instituto Andaluz de Tecnología; 2002.
Enfoque de procesos STTG N72 R1 N544R2.
Torriente Cuéllar I. Procedimiento Normalizado de Operación PNO-AC1-035 Sistema de Documentación. Procedimiento para la
Revisión del Sistema de Gestión de la Calidad por la Dirección General Laboratorios aica. Cuba; 2010.
Torriente Cuéllar I. PNO-AC1-037 Sistema de documentación. Procedimiento para la elaboración de las Fichas de los Procesos.
Laboratorios aica. Cuba; 2010.
13
Revisión anual de productos. Experiencias obtenidas en Laboratorios AICA
Andro Vergel Gutiérrez, Sergio Senén Varona Hernández, Yalenis Cruz Landeiro
Laboratorio Farmacéutico AICA. Ave 31 e/n 268 y 270 S. Agustín La Lisa.
La revisión anual de producto (RAP) es un análisis histórico de calidad, el cual toma como referencia todos los documentos
regulativos vigentes en el ámbito químico farmacéutico nacional e internacional, así como los lineamientos internos de la
empresa. De acuerdo con las disposiciones legales vigentes, cada empresa que cuente con la autorización para la fabricación
de productos farmacéuticos debe controlar y demostrar que estos sean fabricados adecuadamente, basados en el cumplimiento
de las Buenas Prácticas de Fabricación y en las normas vigentes; en la actualidad una de las formas que exigen los órganos
reguladores para esta demostración es la RAP. Este trabajo persigue como objetivo mostrar las experiencias obtenidas en la
RAP en nuestra empresa durante el año 2009, que nos han permitido entender mejor el proceso de fabricación de los
productos analizados, los factores que afectan directa o indirectamente y las tendencias de calidad presentadas, y obtener
resultados que nos brindan una oportunidad de mejora del mismo.
Palabras clave: Revisión, tendencias, capacidad, parámetros críticos.
Introducción
La revisión anual de productos (RAP) es el análisis histórico de calidad, el cual toma como referencia todos los documentos
regulativos vigentes en el ámbito químico farmacéutico nacional e internacional, así como los lineamientos internos de la
empresa, básicamente es la forma de acumular conocimientos y experiencia de manera coherente y consistente con relación al
comportamiento de los procesos para estar en condiciones de modificar los factores de entrada, que permitan generar mejoras
en procesos y productos progresivamente.
Nos permite entender mejor los procesos, los factores que afectan directa o indirectamente y las tendencias de calidad que
presentan, alcanzar la mejora continua de los procesos más que para conocer si se realiza el simple cumplimiento con las
especificaciones.
De acuerdo con las disposiciones legales vigentes en el país cada empresa que cuente con la autorización para la fabricación
de productos farmacéuticos debe controlar y demostrar que estos sean fabricados adecuadamente, basados en el cumplimiento
de las Buenas Prácticas de Fabricación y en las normas vigentes.
Su importancia viene dada porque:
‐
‐
‐
Facilita el entendimiento de los procesos y evalúa la efectividad del sistema.
Fomenta CAPA y promueve la mejora continua.
Apoya al sistema de control de cambios y la verificación continua de la calidad.
Este trabajo persigue como objetivo mostrar las experiencias obtenidas en la RAP en nuestra empresa durante el año 2009, y
que nos han permitido entender mejor el proceso de fabricación de los productos analizados, los factores que afectan directa o
indirectamente y las tendencias de calidad que presentadas, y obtener resultados que nos brindan una oportunidad de mejora
del mismo.
Para la realización de este trabajo revisamos todos los expedientes de lotes y registros primarios de cada producto (Tabla 1),
donde se recopilaron los datos de pH y valoración, en el control de proceso y producto terminado, y de endotoxinas
bacterianas parámetros críticos de calidad.
Para el procesamiento estadístico de los datos se empleó el Software Minitab-14.
Existe el procedimiento para la revisión anual de productos (RAP), que establece entre otros:
‐
‐
‐
‐
Cronograma de revisión
Los productos deben estar registrados
Los procesos deben estar validados
La realización a cada lote de producto fabricado y liberado en el término de un año, independientemente de su decisión
final (Conforme o No Conforme).
14
Existe un Comité Técnico que solicita a cada una de las áreas implicadas en el proceso, la información necesaria. Cada área
entrega esta información en cumplimiento del cronograma.
Entradas:
Datos Generales del Producto
Descripción, concentración, forma farmacéutica, presentación, período de caducidad, período analizado, número de lotes
fabricados en el año, número de lotes aprobados con desviación, número de lotes rechazados.
Análisis del proceso productivo y rendimiento.
Análisis del comportamiento de las materias primas utilizadas en los lotes, teniendo en cuenta a los proveedores.
Análisis de los controles de procesos y puntos críticos.
Análisis de los resultados analíticos del producto terminado.
Análisis de todos los lotes que no cumplieron con las especificaciones de calidad.
Análisis de todas las desviaciones durante el proceso, las No Conformidades y las investigaciones relacionadas.
Análisis de todos los cambios realizados en los procesos o métodos analíticos.
Análisis de los resultados del monitoreo del Programa de Estabilidad.
Análisis del comportamiento del monitoreo ambiental.
Análisis de las quejas y/o reclamaciones y retiradas de productos (si existen).
Situación de la validación de equipos, procesos, métodos analíticos y sus fechas de revalidación.
Verificación del cumplimento del Programa Metrológico y calibración de equipos.
Análisis del cumplimento del Programa de Mantenimiento a los equipos y áreas.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Se realiza un análisis exhaustivo de todos los lotes fabricados del producto que se está revisando.
‐
Mediante la utilización de técnicas estadísticas (análisis de tendencia, gráficos de control, capacidad de proceso),
empleando el programa MINITAB14.
‐
Para los datos no numéricos se analiza la información suministrada por las áreas (No Conformidades, certificado de
análisis de las materias primas, cumplimiento del programa metrológico, etc.).
‐
Análisis de las mermas y rendimientos.
Con los resultados se elabora un informe preliminar y se discute con el resto de los miembros que integran el Comité Técnico
y es en esta reunión donde se aprueba el informe final.
Salida
‐
‐
‐
Resultados de los análisis (informe final).
Recomendaciones en los casos que se requiera.
Oportunidades de mejora.
La frecuencia con que se realiza la RAP es mensual (según cronograma), informándose de esta misma manera en los Consejos
de Dirección.
Tabla 1. Revisión Anual de Productos Año 2009 y 2010
Año
Productos
Reproducibles
2009
24
24
2010
24
24
Se han revisado 48 productos (74,4%) del total.
Se encuentran bajo control estadístico 5 productos de 17 analizados
estadísticamente
15
Conclusiones
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Todos lo productos revisados presentan los parámetros analizados dentro de las especificaciones (reproducibilidad).
El índice de merma se encuentra por debajo de los parámetros internacionales recomendados para los productos
inyectables.
En dos productos se observó una tendencia marcada en uno de los parámetros críticos al límite superior de
especificación, por lo que se recomendó la reformulación, como acción preventiva.
Se detectaron incumplimientos de procedimiento durante el proceso de elaboración, que aunque no han conllevado a
incumplir con las especificaciones de calidad; de forma preventiva se han adoptado acciones para su eliminación y
evitar que se conviertan en una no conformidad.
En el caso de las endotoxinas bacterianas, contamos con procesos muy capaces, de cumplir con la especificación
establecida, para este parámetro en cada producto analizado.
Se observaron en algunos casos comportamientos con diferencias significativas, producto del cambio de código de MP
del principio activo (PA) Ej.: lidocaína 2%, aminofilina.
De las quejas o reclamaciones recibidas, la causa principal ha sido cambio de coloración, las cuales no han procedido,
detectándose en algunos casos que las UEBMI, no tienen en su poder las especificaciones de calidad actualizadas, y
problemas en las condiciones de almacenamiento.
Durante el año 2009 se produjeron tres retiros de productos, de los cuales dos fueron por mezcla de ampolletas de
productos diferentes y sólo uno fue por problemas de esterilidad.
La principal causa de rechazo, incumplimiento en cuanto a la esterilidad, está asociada a fuera de especificaciones en el
monitoreo del agua (hasta enero del 2009 hubo problemas con la sanitización del sistema de agua) y del monitoreo
ambiental en algunos locales (el sistema de clima no se encuentra validado, lo cual impide un control ambiental 100%
efectivo).
Referencias
1. NC-ISO 9001:2008 Sistemas de Gestión de la Calidad. Requisitos. ININ. Cuba; 2008.
2. Payret G; Silvera Vegueria L; Carmenate G; .Dirección por objetivos. Preger. Centro de Preparación general Cuba; 2006.
3. Torriente Cuéllar I. Implantación del Sistema de Gestión de la Calidad ISO 9001:2008 en Laboratorios AICA. Estado actual. Cuba.
Febrero; 2010.
4. Caraballo Peñalver N; Vergel Gutierrez A; Rodríguez Cabrera. T. Política de Calidad. Laboratorios AICA. Cuba;2010.
5. NC-ISO 19011:2004 Directrices para las Auditorias de los Sistemas de Gestión de la Calidad/ y/ o Ambiental. ININ. Cuba; 2004.
6. NC-ISO 1013:2005 Directrices para la documentación de los Sistemas de Gestión de la Calidad y / o Ambiental. ININ. Cuba; 2005.
7. NC-ISO 9000:2005 Sistemas de Gestión de la Calidad. Fundamentos y vocabulario. ININ. Cuba; 2008.
8. NC-ISO 1005:1997 Gestión de la Calidad. Directrices para los planes de la calidad. ININ. Cuba; 1997.
9. NC-ISO 1005:2009 Gestión para el éxito sostenido de una organización. Enfoque de gestión de la calidad. ININ. Cuba; 2009.
10.Regulación 16-2006 Directrices sobre las buenas practicas de fabricación de productos farmacéuticos. CECMED. Cuba;2006.
11.Pharmaceutical Quality System Q10. ICH Process. FDA.U.S;2007.
12.Guiance for Industry Quality System Approach to Pharmaceutical CGMP. FDA. US. Laboratorios AICA. Cuba. Mayo 2010.
13.Torriente Cuéllar; Cruz Landeiro Y. Planificación de la Calidad. Laboratorios AICA. Cuba;2010.
14.Torriente Cuéllar I. PNO-AC1-035 Sistema de Documentación. Procedimiento para la Revisión del Sistema de Gestión de la Calidad
por la Dirección General
15.Torriente Cuéllar; Cruz Landeiro Y. Programa de Mejora Laboratorios AICA. Cuba. Mayo 2010.
16.Torriente Cuellar I. PNO-AC1-036 Sistema de Documentación. Procedimiento para la elaboración de los Documentos externos.
17.Vergel Gutiérrez A; Varona Hernández S. Gestión por Procesos de los Laboratorios AICA. Cuba. marzo.2010.
18.Torriente Cuéllar I. PNO-AC1-037 Sistema de documentación. Procedimiento para la elaboración de las Fichas de los Procesos. (Draf)
Cuba. Mayo 2010.
19.Cruz Landeiro Y; Torriente Cuéllar I .Rediseño del Manual de Calidad de los Laboratorios AICA. Cuba. Mayo 2010.
Gestión de los factores de riesgo que afectan la calidad de la liberación de los productos
parenterales
Caridad Moreda, Sara Quicute, Elizabeth Rosabal, Vivian San Germán, Dulce M. Raices, Yamarys Novo, Celia Feito
Centro Nacional de Biopreparados. Carretera Beltrán Km 1½. Bejucal. La Habana.
16
La liberación de lotes constituye una de las funciones básicas establecidas por la Organización Mundial de la Salud (OMS)
para vacunas y otros medicamentos biológicos, pues estos requieren de un control especial debido a su origen. En la
actualidad se aplican diferentes métodos de análisis de riesgos en la industria farmacéutica, con vistas a identificar probables
fallas y los controles apropiados, evaluar los riesgos y el impacto en el proceso o producto. El objetivo esencial de este trabajo
fue identificar los peligros específicos y las medidas para su control en el proceso de Liberación de Lotes de productos
parenterales de BioCen, con el fin de garantizar una mayor eficacia en dicho proceso. Se realizaron las operaciones de
diagrama del flujo, identificación de los posibles riesgos en cada una de las actividades del proceso y la valoración del alcance
del riesgo a partir de la formula RPN= (Severidad)x (Ocurrencia)x(Detección). En la valoración de los riesgos en cada una de
las actividades del proceso en estudio dio como resultado que el evento de riesgo con impacto directo es el otorgamiento de la
fecha de vencimiento del producto en la orden de producción. Los resultados obtenidos a partir de este trabajo dieron lugar a
medidas correctivas apropiadas que inciden de manera satisfactoria en la mejora de la eficacia del proceso de liberación de
lotes de las producciones de parenterales. Dentro las medidas se encuentran la implementación de la doble revisión de las
órdenes de producción correspondiente a la etapa de envase y la confección de un procedimiento que normalice los aspectos
críticos a tener en cuenta por el especialista principal en la supervisión de la liberación del lote.
Palabras clave: Liberación de lotes 1, análisis de riesgo 2, productos parenterales 3.
Introducción
Los medicamentos biológicos, como las vacunas, no siempre pueden definirse químicamente, debido a que son moléculas
complejas y a la variabilidad inherente de los sistemas; es por ello que cada lote de producción de un producto biológico
puede considerarse único. Por consiguiente, estos productos están sujetos a verificación exhaustiva sobre la base lote a lote, a
partir de requisitos establecidos. El control independiente de los lotes de vacuna es especialmente importante puesto que estas
son administradas a pacientes sanos, en su mayoría niños, por lo que deben ser inocuas y eficaces (1-3).
La liberación de lotes constituye una de las funciones básicas establecidas por la Organización Mundial de la Salud (OMS)
para vacunas y otros medicamentos biológicos pues estos requieren de un control especial debido a su origen (1-3).
El proceso de Liberación de Lotes tiene como función:
-
Revisar toda la documentación que se generan en el proceso productivo y de los ensayos de Control de la Calidad en
cuanto a que se cumplan las buenas prácticas de producción, laboratorio y documentación.
Emitir a los clientes internos y externos la documentación de liberación que certifica que el producto terminado está apto
o no para su uso o comercialización.
-
En la actualidad se aplican diferentes métodos de análisis de riesgos en la industria farmacéutica, con vistas a identificar las
potenciales fallas y los controles apropiados para evaluar los riesgos y el impacto en el proceso o al producto (
Durante el proceso de liberación de los productos parenterales inciden diferentes factores que pueden constituir riesgos en la
calidad de la liberación. Estos factores fueron valorados, a partir de un grupo de expertos, con vistas a determinar su impacto
en la calidad de la liberación.
Los eventos potenciales que afectan la calidad de la liberación de las producciones parenterales fueron evaluados por RPN=
(Severidad)x(Ocurrencia)x(Detección). A partir del resultado se generan unas series de acciones que permiten el aumento de
la eficacia del proceso de liberación de los productos parenterales.
El objetivo esencial de este trabajo es identificar los peligros específicos y las medidas para su control en el proceso de
Liberación de Lotes de productos parenterales de BioCen, con el fin de garantizar una mayor eficacia en dicho proceso.
Para el desarrollo de este trabajo se realizaron las siguientes operaciones:
1.
2.
3.
Análisis del diagrama de flujo del proceso de liberación de lotes de las producciones de parenterales.
Identificación de los eventos potenciales (riesgos) en cada una de las actividades del proceso que afectan la calidad del
resultado final de la liberación.
Evaluación de los eventos potenciales mediante la formula RPN= (Severidad)x(Ocurrencia)x(Detección), donde: RPN:
Número de prioridad del riesgo; S: Severidad del impacto; P: probabilidad de detección del fallo y O: Probabilidad de
ocurrencia del fallo.
17
4.
Se asignó un valor a la severidad del impacto, probabilidad de detección y a la probabilidad de ocurrencia del fallo,
teniendo presente los siguientes criterios:
‐
Valoración de severidad de impacto (S). La valoración de la severidad del impacto se realizará teniendo en cuenta:
posible daño en el equipo o sistema, impacto financiero, posible afectación a la seguridad y eficacia del producto, daño
a la imagen o especificaciones de calidad del producto, etc.
‐
Probabilidad de detección (D). Probabilidad de que la falla, evento o escenario de riesgo sea detectado con mayo o
menor facilidad y precisión.
‐
Valoración de la ocurrencia (O). Valoración de la ocurrencia del riesgo, es decir, la probabilidad de que el riesgo se
presente (si el riesgo que se evalúa tiene una alta frecuencia de que se presente o no). La valoración de la ocurrencia
debe ser asignada para cada riesgo identificado.
5. Se asignaron valores de 1 al 10 para darle un valor a la severidad del impacto, probabilidad de ocurrencia del fallo y a la
probabilidad de detección, utilizando los criterios dados en la siguiente escala de evaluación (Tabla 1)
Tabla 1. Escala de evaluación.
Rango de Valores
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
Severidad (S)
Daño mayor
severidad
Ocurrencia (O)
/
muy
alta
Muy alta probabilidad de ocurrencia
Detección (D)
Prácticamente imposible que se
detecte
Inconveniente mayor
Alta probabilidad de ocurrencia
Baja capacidad de detección
Inconveniente menor
Moderada probabilidad de ocurrencia
Alta capacidad de detección
Efecto mínimo o sin efecto
Baja probabilidad de ocurrencia
Certeza de detección
Se determinó el alcance de las acciones a tomar y su inmediatez (cambio, revalidación, validación, seguimiento etc.) a partir
de calcular el grado de riesgo conforme a la siguiente escala (Tabla 2).
Tabla 2. Grado de riesgo.
NPR
< 42
42 a 143
Clasificación de la
Operación o Función
NO Impacto
NO Impacto
Documentar
144 a 279
Impacto Indirecto
> 279
Impacto Directo
Alcance de las Acciones
No requiere acción inmediata.
Sólo identificar áreas de oportunidad,
acción de mejora, acción preventiva
Acción solo sobre los elementos
involucrados
Requiere acción inmediata
Identificador
BLANCO
COLOR VERDE
COLOR
AMARILLO
COLOR
ROJO
6. Definiciones del plan de acción.
A partir del análisis del diagrama de flujo podemos observar que básicamente la función de liberación de lotes de productos
parenterales consiste en:
‐
‐
‐
‐
Revisión de órdenes de producción y otorgamiento de la fecha de vencimiento del producto terminado.
Revisión de los registros de producción y de ensayos de laboratorio.
Liberación del lote.
Custodia de los expedientes de lotes.
18
En la Tabla 3 se recoge la evaluación que se realiza a los diferentes eventos de riesgo que pudieran ocurrir en el proceso de
liberación de lotes de los productos parenterales.
Tabla 3. Evaluación de los riesgos.
Evento
Calificación del personal
La no observancia de una no conformidad en los registros de producción
La no detección de fallas o deficiencias ocurridas durante la fabricación del lote.
La no observancia de una no conformidad en los ensayos de control
Otorgamiento de la fecha de vencimiento del producto parenteral en cuestión
Conciliación de cantidades del producto entre etapas.
Entrega al cliente de la documentación o información
Incorrecta ubicación del expediente de lote
1
2
3
4
5
6
7
8
S
10
10
10
10
10
10
10
10
O
1
2
2
2
5
4
8
1
D
3
8
8
8
8
5
1
6
NPR
30
160
160
160
400
200
80
60
Una vez realizada la evaluación se procedió a realizar la mitigación de los riesgos, en la Tabla 4 se recogen las acciones a
tomar.
Tabla 4. Medidas a tomar para la mitigación de los riesgo (fallas).
Evento
La no observancia de una no conformidad en los registros
de producción
La no detección de fallas o deficiencias ocurridas durante la
fabricación del lote.
La no observancia de una no conformidad en los ensayos
de control.
NPR
160
6
Conciliación de cantidades del producto entre etapas.
200
7
Entrega al cliente de la documentación o información
80
5
Otorgamiento de la fecha de vencimiento del producto
parenteral en cuestión
400
8
Incorrecta ubicación del expediente de lote
60
2
3
4
Mitigación de riesgo
Elaborar un procedimiento para ser usado en la
activad de supervisión de la Liberación del
Lote, en que se establezca el chequeo de estos
eventos de riesgo
Establecer por procedimiento la doble revisión
de la Orden de producción que involucra la
designación de la fecha de vencimiento.
Establecer una supervisión mensual de los
archivos de lote.
Podemos observar que el único impacto directo que se refiere en la Tabla 4 es el otorgamiento de la fecha de vencimiento del
producto parenteral en cuestión, que puede ser mitigado estableciendo una doble de revisión de la orden de producción. Se
detectaron como impacto indirecto la conciliación de cantidades, la no observancia de las No Conformidades en general y la
no detección de fallas o deficiencias en el proceso de fabricación del lote, las fallas por este concepto pueden disminuirse o
eliminarse si en la supervisión de la liberación del lote se toma en cuenta el chequeo estos elementos.
Conclusiones
1.
En el proceso de liberación de lotes de productos parenterales se identificaron las fallas potenciales siguientes: la
calificación del personal; la no observancia de una no conformidad en los registros de producción; la no detección de
fallas o deficiencias ocurridas durante la fabricación del lote; la no observancia de una no conformidad en los
ensayos de control, otorgamiento de la fecha de vencimiento del producto parenteral en cuestión; la conciliación de
cantidades del producto entre etapas, en la entrega al cliente de a documentación o información y por último la
incorrecta ubicación del expediente de lote.
2.
La única falla con impacto directo es el otorgamiento de la fecha de vencimiento del producto parenteral en cuestión,
que puede ser mitigado estableciendo una doble de revisión.
3.
Se detectaron como impacto indirecto la conciliación de cantidades, la no observancia de las No Conformidades en
general y la no detección de fallas o deficiencias en el proceso de fabricación del lote. Las fallas por este concepto
19
pueden disminuirse o eliminarse si en la supervisión de la liberación del lote se toma en cuenta el chequeo estos
elementos.
Referencias
1.
2.
3.
International Conference on Harmonization. Q9. Quality Risk Management: 2006 June.
Administración de riesgos. Curso TERRAFARMA 2008.
Moreda C, San Germán V, Pérez S y otros. III Taller de Calidad del Polo. Análisis de las propiedades del proceso de liberación de
lotes.
Procedimiento para homologación de productos por proveedores en el CIGB
Norelbys Albelo Rondón, Lourdes Hernández Pérez, Inés Heredia Revilla, Esther García Gato, Mercedes Ortega Pérez, Antonio Pedroso
Cuesta, Carlos García Sánchez, José Luis Marcelo Sainz, Rubén López Edghill.
Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB). Ave 31 s/n e/158 y 190, Cubanacán, Playa. Ciudad Habana.
El sistema de evaluación de proveedores constituye un requisito fundamental de los sistemas de calidad y las buenas prácticas.
En el CIGB se han establecido diferentes métodos para la evaluación de productos y nuevos proveedores para realizar su
aprobación. El presente trabajo tiene como objetivo presentar el nuevo procedimiento establecido para la homologación de
materias primas y materiales. Para ello se revisó la bibliografía relacionada con la temática, además de aplicar métodos como:
tormenta de ideas, toma de decisiones en grupo, etc., que permitió realizar la implementación de un nuevo sistema de
evaluación. La homologación de las materias primas y componentes críticos es un proceso que consiste en la comparación de
las especificaciones de un mismo producto, de dos o más casas comerciales, para demostrar entre otros aspectos, si las
características de calidad son similares. La homologación será realizada en dos casos fundamentalmente: Productos
suministrados por alguno de los proveedores aprobados y que sean del tipo de producto que los mismos habitualmente
suministran y productos suministrados por nuevos proveedores y que sean de igual calidad a los utilizados en el CIGB. Con la
implementación de este nuevo procedimiento se ha realizado la homologación de 68 materias primas, fundamentalmente de
proveedores reconocidos como Applichem, Panreac y Merck, lo cual ha constituido una garantía para el suministro de
diferentes productos provenientes de otras casas comerciales, evitando así paradas productivas asociada al desabastecimiento
de insumos.
Palabras clave: Homologación, proveedores, materias primas.
Introducción
El sistema de evaluación de proveedores constituye un requisito fundamental de los sistemas de calidad y las buenas prácticas.
En el CIGB se han establecido diferentes métodos para la evaluación de productos y nuevos proveedores para realizar su
aprobación. El presente trabajo tiene como objetivo presentar el nuevo procedimiento establecido para la homologación de
materias primas y materiales.
Para cumplir este objetivo se revisó bibliografía relacionada con la temática, además de aplicar métodos como: tormenta de
ideas, toma de decisiones en grupo, etc., que permitió realizar la implementación del nuevo sistema de homologación de
materiales.
Se establecieron las responsabilidades pertinentes de todas las partes que participan en el proceso, así como el diagrama de
proceso.
La homologación de las materias primas y componentes críticos es un proceso que consiste en la comparación de las
especificaciones de un mismo producto, de dos o más casas comerciales, para demostrar entre otros aspectos, si las
características de calidad son similares. La homologación será realizada en dos casos fundamentalmente:
20
-
Productos suministrados por algunos de los proveedores aprobados y que sean del tipo de producto que los mismos
habitualmente suministran.
Productos suministrados por nuevos proveedores y que sean de igual calidad a los utilizados en el CIGB.
1.
Procedimiento a seguir para la realización de la homologación
a)
Realizar la propuesta por productos de la homologación inicial. (Dpto. compras o área específica)
b) Determinar responsable del llenado de la documentación.
c)
Llenado de la planilla de homologación.
d) Complete el registro de homologación de materiales con la siguiente información:
2.
-
Categoría: La categoría del material (materia prima y reactivos críticos o componente crítico).
-
Descripción: Nombre del producto objeto de comparación
-
Calidad: la Calidad del producto y el No. de parte (NP) a que corresponde.
-
De cada proveedor (Aprobado y Nuevo) refiera el nombre, el documento de consulta y el No. de catálogo,
temperatura de almacenamiento y si el producto cumple con la Farmacopea.
-
Enumere las especificaciones principales de ambos proveedores con el valor de cada una reportado por el
fabricante y el valor o rango reportado en la especificación de calidad y en la Farmacopea si procede.
-
Defina con los especialistas de Análisis Químico si los valores son homólogos y cuales ensayos se realizarán
inicialmente (I), cuáles de rutina (R) o cuales no procede realizar (NP).
-
Revisión inicial del criterio de homologación y la firma del Dpto. de Análisis Químico.
-
Busque la conformidad del resto de los usuarios del proceso que realiza y refleje si se requieren pruebas
tecnológicas.
-
Realice las revisiones del documento.
e)
Proceda a entregar al especialista del Dpto. de Inspección y Auditoría el registro con copia de las especificaciones de
ambos fabricantes, monografías de la Farmacopea u otro documento que considere de soporte al proceso de
homologación para que sea revisado, se emita los conclusiones finales del proceso y se apruebe el mismo.
f)
Cuando se apruebe o rechace la homologación, el Dpto. de Inspección y Auditoría informará las conclusiones del
proceso por correo electrónico a todos los que participaron en el mismo, incluyendo el Dpto. Compras.
g)
Proceda a comunicar al área para que se realice la actualización de la especificación correspondiente.
Productos que sean suministrados por los proveedores habituales.
Este caso solo requerirá que sea realizado la comparación y llenado del SIC-3052.
3.
Productos que sean suministrados por nuevos proveedores.
En el caso de nuevos proveedores que sean objeto de homologación de productos aprobados en el CIGB se realizará un
control de cambio.
4. Codificación de los procesos de homologación
Cada homologación será codificada de la siguiente forma:
HAAA-XXXX
Donde:
H: Homologación
AAA: Consecutivo de los procesos de Homologación que se realicen.
XXXX: Año.
Ejemplo: H001-2010, Se corresponde con la primera homologación realizada del año 2010.
21
Conclusiones
Con la implementación de este nuevo procedimiento se ha realizado la homologación de 68 materias primas,
fundamentalmente de proveedores reconocidos como Applichem, Panreac y Merck, lo cual ha constituido una garantía para el
suministro de diferentes productos provenientes de otras casas comerciales, evitando así paradas productivas asociada al
desabastecimiento de insumos.
Referencias
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
PPO 4.10.190.10 “Procedimiento para la homologación de Materias Primas y Componentes”.
PPO 4.10.088.94 “ Procedimiento para la evaluación y aprobación de proveedores de insumos”
ISO 9001: 2008 Sistemas de Gestión de la Calidad: Requisitos.
ISO 9004: 2008 Sistemas de Gestión de la Calidad: Directrices para la Mejora del Desempeño.
Regulación No. 16-2006. Directrices sobre Buenas Prácticas para la Fabricación de Productos Farmacéuticos. CECMED.
Good Manufacturing Practice Guide for Active Pharmaceutical Ingredients: ICH Harmonised Tripartite Guideline. Año 2000.
Quality Assurance Workbook for Phamaceutical Manufactures. PDA. Capítulo 6: Purchasing.
Eficacia del proceso de gestión de proveedores y su influencia en la liberación de productos, desde
un enfoque de riesgo
Dennis Reinoso Guzmán1, Alejandro Beldarraín Iznaga2, Valia Vergel de la Osa2, Lesneyde Molina Benítez2, Lermis Martínez2.
1
Centro Nacional de Biopreparados (BioCen). Carretera Beltrán Km 1½. Bejucal. La Habana.
Laboratorios Novatec. Ave. 15, No. 216A03 e/ 216A y 222. Atabey, Playa. Ciudad Habana.
2
Para cualquier empresa farmacéutica un elemento importante dentro del ciclo de producción es contar con una eficiente
gestión en la liberación de las materias primas, para la fabricación de un producto terminado eficaz para la comercialización.
Considerando la complejidad y diversidad de los productos fabricados en los Laboratorios Novatec, el presente trabajo
propone demostrar, partiendo de un enfoque previo de riesgo, la eficacia del proceso de gestión de proveedores mediante la
aplicación de la estrategia propuesta por el Grupo Homologado de Evaluación de Proveedores (GHEP) del Polo y su
influencia en el proceso de liberación de materias primas y producto terminado, teniendo en cuenta la complejidad de los
ensayos realizados a los productos suministrados.
Introducción
El presente trabajo propone demostrar la eficacia del proceso de gestión de proveedores y su influencia en el proceso de
liberación de materias primas y productos terminados fabricados en Laboratorios Novatec, desde un enfoque de riesgo.
Problema técnico
22
¿Qué dicen las regulaciones nacionales?
Según el CECMED (1).
8.9. Las materias primas serán adquiridas por proveedores aprobados.
8.12. Todos los materiales recibidos serán revisados o comprobados para asegurar que el envío corresponde al pedido.
8.14. Diferentes lotes serán considerados por separado para el muestreo, ensayo y liberación.
8.16. Se adoptaran medidas para asegurar la identidad del contenido de cada recipiente contenedor.
¿Qué dicen las regulaciones europeas?
Acorde a la EMEA (3).
2.7 Management of Outsourced Activities and Purchased Materials The pharmaceutical company is ultimately responsible to
ensure processes are in place to assure the control of outsourced activities and quality of purchased materials. These processes
should incorporate quality risk management and include: (a) Assessing prior to outsourcing operations or selecting material
suppliers, the suitability and competence of the other party to carry out the activity or provide the material using a defined
supply chain (e.g., audits, material evaluations, qualification); (d) Monitoring incoming ingredients and materials to ensure
they are from approved sources using the agreed supply chain.
Acorde a la ISO(4).
7.4.1 Proceso de compras.
La organización debe evaluar y seleccionar los proveedores en función de su capacidad para suministrar productos de acuerdo
con los requisitos de la organización. El tipo y el grado del control aplicado al proveedor y al producto adquirido debe
depender del impacto del producto adquirido en la posterior realización del producto o sobre el producto final.
¿Qué experiencias aporta la industria?
La tendencia de la industria de los países desarrollados a partir de la década de los 90´ del siglo pasado se muestra en el
esquema siguiente:
Escenarios de trabajo
Actual (Escenario 1): Muestrear todos los lotes y realizar todos los análisis definidos. (Mayor costo de calidad-menor riesgo)
Propuesta 1 (Escenario 2): Muestrear todos los lotes, identificarlos por IRTF, y con frecuencia específica realizarle todos los
análisis. (Costo de calidad medio-Riesgo medio)
Propuesta 2 (Escenario 3): Muestrear todos los lotes, identificarlos por IRTF. (Menor costo de calidad-Mayor riesgo)
Análisis de Riesgo
Número de prioridad del riesgo
NPR = S x O x D
NPR, Número de Prioridad del Riesgo
S: Severidad del Impacto
O: Probabilidad de ocurrencia de fallo.
D: Probabilidad de detección del fallo;
23
Escalas de evaluación
Rango
5
Severidad (S)
Daño muy alto
Ocurrencia (O)
Muy alta probabilidad
4
3
2
1
Daño alto
Daño medio
Inconveniente menor
Efecto mínimo
Alta probabilidad
Probabilidad media
Baja probabilidad
Muy baja probabilidad
NPR
1-25
26-75
76-125
Detección (D)
Prácticamente
imposible
Detección remota
Detección moderada
Detección segura
Certeza total
Alcance
Positivo o Riesgo
mínimo
Negativo o Riesgo
medio
Cuestionable o
Riesgo alto
Evaluación del Riesgo
Escenario 1
Producto
Meprobamato
ASA
Captopril
Omeprazol
Azitromicina
Pentoxifilina
Enalapril
S
5
5
5
5
5
5
5
O
2
1
3
1
2
1
1
D
2
2
2
2
2
2
2
NPR
20
10
30
10
20
10
10
S
5
5
5
5
5
5
5
O
2
1
3
1
2
1
1
D
3
3
3
3
3
3
3
NPR
30
15
45
15
30
15
15
S
5
5
5
5
5
5
5
O
2
1
3
1
2
1
1
P
4
4
4
4
4
4
4
NPR
40
20
60
20
40
20
20
Escenario 2
Producto
Meprobamato
ASA
Captopril
Omeprazol
Azitromicina
Pentoxifilina
Enalapril
Escenario 3
Producto
Meprobamato
ASA
Captopril
Omeprazol
Azitromicina
Pentoxifilina
Enalapril
24
Posible solución
Se utilizaron las siguientes herramientas: evaluación histórica de lotes producidos en los años 2008-2009, análisis de causas de
No Conformidades y análisis de riesgo de diferentes escenarios para proponer una frecuencia no seriada para liberación de MP
y lotes fabricados basándonos en la profesionalidad de los suministradores, la complejidad de los análisis físicos, químicos y
microbiológicos.
Para tres escenarios de tiempo en la liberación, su impacto económico para la salida comercial, el ahorro por análisis y la
liberación de capacidades analíticas se estudió un mecanismo viable para darle respuesta a la dinámica para la liberación de
los lotes en Laboratorios Novatec, proponiéndose una variante que cumple con el objeto social de la empresa.
Relación de proveedores evaluados por tipo de material y servicios
25
Eficacia Proceso de Evaluación de Proveedores
Impacto económico-regulador
Propuesta seleccionada (Escenario 2): Muestrear todos los lotes, identificarlos por IRTF, y con frecuencia específica
realizarle todos los análisis. (Costo de calidad medio-Riesgo medio)
Producto
Meprobamato
ASA
Captopril
Omeprazol
Azitromicina
Pentoxifilina
Enalapril
MP
18
11
6
9
3
3
3
t análisis (h)
24
24
24
24
24
24
24
Horas/MP
556,8
148,8
115,2
100,8
52,8
52,8
14,4
Costo (%)
25-30
25-30
25-30
25-30
25-30
25-30
25-30
Regulación
90
90
90
90
90
90
90
Conclusiones
Las propuestas de liberación de lotes de Materias Primas, Excipientes y Producto Terminado, incrementan la dinámica del
proceso de liberación de lotes, disminuyendo los costos por análisis en un 70% manteniendo el marco regulador.
Referencias
1. «Directrices sobre BPF de productos farmacéuticos». Regulación No 16-2006
2. «BPF para formas orales». Regulación No.16-2006 Anexo 2.
3. «Pharmaceutical Quality System». ICH Q10: 2008
4. «Sistemas de Gestión de la Calidad—Requisitos» ISO 9001:2008
Evaluación de proveedores de insumos directos para la producción del centro de InmunoEnsayo
Dalia Lavadie Ayala, Marlene Casas Vilardell, Liliena López Brauet
Centro de InmunoEnsayo. Calle 134 y Ave. 25, Cubanacán, Playa. Teléfono: 208-2929 ext 347.
Email: [email protected]@[email protected].
La evaluación de proveedores constituye un instrumento importante en un sistema de calidad, ya que nos permite contar con
un seguimiento sistemático y documentado del grado de cumplimiento de quienes aportan las materias primas adquiridas
(MPA) a nuestro proceso de producción. En el Centro de InmunoEnsayo (CIE) la actividad de inspección de MPA tiene por
objetivo auditar continuamente la calidad de los productos recibidos de los proveedores, garantizando que cumplan con la
calidad requerida. Con el objetivo de asegurar que todos las MPA posean el nivel de calidad deseado, se estableció un sistema
de evaluación inicial para proveedores potenciales y un sistema de evaluación del desempeño histórico para los proveedores
actuales que incluyen: calidad del producto recibido, entrega y documentación del producto en el tiempo convenido y
desempeño de los servicios. Los resultados de estas evaluaciones les ha permitido a los especialistas tomar la mejor decisión
en las compras. Además de establecer un sistema para la selección y evaluación de proveedores cumpliendo con la regulación
de Buenas Prácticas de Fabricación de Diagnosticadores (BPFD). Esta metodología ha permitido el cumplimiento de los
26
parámetros de producción en conformidad con las especificaciones de las MPA, garantizando uniformidad, identificación
clara de los problemas, reducción significativa de costos de producción, cumplimiento en las entregas, incremento en la
productividad, identificación de proveedores con oportunidad de mejora, demostrando que el establecimiento de la selección
y evaluación de proveedores es una herramienta de mejora continua de la calidad.
Palabras clave: Evaluación de proveedores, materia prima adquirida, Inmunoensayo.
Introducción
La evaluación de proveedores constituye un instrumento importante en un sistema de calidad, por cuanto nos permite contar
con un seguimiento sistemático y documentado del grado de cumplimiento de quienes aportan las materias primas adquiridas
y material de envase a nuestro proceso de producción.
En el Centro de InmunoEnsayo (CIE), la actividad de inspección de materias primas adquiridas (MPA) y material de envase
(ME), tiene por objetivo auditar continuamente la calidad de los productos recibidos de los proveedores, garantizando que las
materias primas que ingresan al proceso productivo lo hagan con la calidad asegurada.
Con el objetivo de asegurar que todos los productos adquiridos en el CIE posean el nivel de calidad deseado y en conformidad
con los requisitos de los clientes, se estableció un sistema de evaluación de proveedores en el CIE para las compras de
materiales, definiendo criterios para la selección y evaluación de los suministradores, los que permiten a los especialistas
tomar la mejor decisión en las compras (1).
Para la implementación de la metodología de selección y evaluación de proveedores de MPA y ME es necesario la existencia
de un sistema documental que asegure que la recepción, ensayos aplicables, certificados de análisis de proveedores aprobados,
así como todos los procedimientos, registros y especificaciones relacionados con ellos, muestren evidencias objetivas del
cumplimiento de las BPFD vigentes (2, 3, 4, 5 y 6).
El Departamento de Aseguramiento y Control de la Calidad del CIE implementó un sistema de selección y evaluación de
proveedores, considerando los siguientes aspectos:
1. Se realizó el estudio y la interpretación de los capítulos: 11-”Compras” y 12-“Contratación” de la regulación No 20-2004
“Buenas Prácticas de Fabricación para Diagnosticadores” (BPFD), emitida por el CECMED (2).
2. Establecimiento de los procedimientos y registros para la selección y evaluación de proveedores de MPA y ME (1).
3. Inspección y evaluación de los resultados de las MPA y los ME.
4. El método de análisis que se utilizó fue el comportamiento histórico de lo resultados de la calidad de los insumos,
evaluando el comportamiento de los criterios de desempeño comerciales y de la calidad de de los insumos suministrados
por los proveedores (1), tales como desempeño en las entregas, en las ofertas, en los servicios, evaluación de muestras,
cantidad de reclamaciones, información de aseguramiento de la calidad, documentación, certificación etc., en un período
precedente de un año y comparándolo con los valores considerados como aceptables.
5. Elaboración de los expedientes de cada proveedor de MPA y ME, con la información necesaria.
6. Evaluación y clasificación de los proveedores, organizándolos por categorías (1, 2, 6,7, 9). (Tabla 1)
Tabla 1. Categorías y clasificación de proveedores.
EVALUACIÓN (%)
86-100
70-85
50-69
< 50
CALIFICACIÓN
Excelente
Buena
Regular
Insatisfactoria
CLASIFICACIÓN / CATEGORÍA
Calificado o preferido
Condicionado
En desarrollo
No Aprobado
Con el estudio de los capítulos 11-”Compras” y 12-“Contratación”, se procedió a la realización de la evaluación de los
proveedores del CIE (Figura 1), donde se observan los comportamientos que los proveedores han mostrado, respecto a los
parámetros comerciales y de calidad. El desempeño de los proveedores se realizó mediante la existencia de datos históricos.
27
El resultado de la evaluación es útil para incluir a los proveedores en uno de los cuatro niveles que se relacionan en la Tabla 1,
comprobándose que el 85% corresponde a la categoría de preferido, con calificación de excelente y el 14% a la categoría de
condicionado, con calificación de buena (Tabla 1 ).
Se estableció que las MPA y los ME, sean adquiridos solo de aquellos proveedores que estén aprobados, revisándose las
ofertas y los contratos antes de ser aceptados, para asegurarnos que los requisitos están definidos y documentados (9,10).
Manteniendo actualizados los registros para la concertación, revisión de contratos y la coordinación de las actividades
relacionadas con estos. En todo momento se garantiza que los proveedores cumplan con los aspectos específicos de las BPFD
vigentes que requiera el servicio que se solicita (2).
Se llevaran a cabo actividades de evaluación continua (evaluación inicial y re-evaluaciones) con los proveedores en
dependencia de su calificación (Tabla 2). La información para evaluar a los proveedores provino de los procesos de
inspección, pero también puede proceder de cualquier otro proceso del que se obtenga información sobre el proveedor y sus
productos:
1.
Homologación de proveedores
2.
Auditorias “in situ”
3.
Análisis de muestras etc.
Resultados de evaluación de los proveedores
Calificación
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
T2105
C1305
L0805
B0105
S1905
A0405
A0605
C0205
G1505
B1205
A1105
R1705
B2205
A1005
B2606
B2305
G1405
H0905
M0505
C0305
S0705
I1605
K2005
C2406
C2506
I2706
Proveedores
Figura 1. Resultados de la evaluación de los proveedores.
Tabla 2. Vigencia de evaluación de los proveedores según su clasificación. Vigencia
de
Evaluación ( años)
la
CLASIFICACION DEL PROVEEDOR
Calificado o preferido
Condicionado
3
2
En desarrollo
1
Conclusiones
Entre los beneficios que ha reportado esta metodología se encuentran: el establecimiento de los registros y selección de
proveedores, cumpliendo con las normas internacionales y las BPFD; el cumplimiento de los parámetros de producción en
conformidad con las especificaciones de las materias primas y materiales de envase; uniformidad en la calidad de los
materiales; identificación clara de los problemas de calidad de los proveedores; reducción significativa de los costos de
producción, mediante la reducción de análisis de los insumos adquiridos; garantía y aseguramiento de la calidad de los
productos adquiridos; cumplimiento en las entregas; incremento en la productividad; identificación de proveedores con
oportunidad de mejora, demostrando que el establecimiento de la selección, evaluación y reevaluación de proveedores es una
herramienta de mejora continúa de la calidad; mejor relación y comunicación con los proveedores; aplicación de una técnica
cuantitativa que clasifica a los proveedores en categorías que se emplean como base para la realización de compras,
disminuyendo la incertidumbre, cuando se debe tomar una decisión; aumento de la capacidad de negociación con los
proveedores; control eficaz de las No Conformidades y acciones correctivas / preventivas y comunicación eficiente entre las
áreas de recibimiento, inspección e importación.
28
Referencias
1. PNO: 00-009”Procedimiento para la selección y evaluación de proveedores de materiales para la producción de diagnosticadores del
Centro de InmunoEnsayo”.
2. Regulación 20-2004: “Buenas Prácticas para la Producción de los Diagnosticadores”. CECMED.
3. ISO 9000:2005 “Sistema de Gestión de la Calidad. Fundamentos y Vocabularios.
4. ISO 9001:2000 “Sistema de Gestión de la Calidad. Requisitos
5. ISO 9004:2000 Sistemas de Gestión de la calidad- Directrices para la mejora del desempeño.
6. ISO 9001:94. Modelo para el aseguramiento de la calidad en el diseño, el desarrollo, la producción, la instalación y el servicio postventa.
7. Trade point La Habana Febrero 18, 2004.
8. J M Juran, “Manual de Control de Calidad”, Volumen I, capítulo 15.
9. Trade point. La Habana, febrero 18, 2004.
10.Acuerdo sobre Contratación Pública. Organización Mundial del Comercio, artículo VIII: Calificación de proveedores.
Mejoras y evaluación del desempeño del proceso de tratamiento de las No Conformidades en el
CIGB
Jacquelín Heredia Revilla, Ileana García Martínez, Norelbys Albelo Rondón, Inés Heredia Revilla, Yair Quiñones Maya, Mercedes Ortega
Pérez, Yamila L. Marín Dávila y cols.
Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB). Ave 31 s/n e/158 y 190, Cubanacán, Playa. Ciudad Habana.
En las empresas farmacéuticas es inevitable que ocurran No Conformidades, por lo que para manejar tales incumplimientos se
debe incluir la gestión de las No Conformidades. El objetivo de este trabajo es realizar mejoras al proceso de tratamientos de
No Conformidades y evaluar el desempeño. Para cumplir este objetivo se revisó un conjunto de bibliografía, además de
aplicar métodos como entrevistas, tormenta de ideas, toma de decisiones en grupo que permitió realizar el diagnóstico y
análisis de la situación y ofrecer la solución del problema. Con el diagnóstico realizado se ejecutaron un conjunto de acciones
de mejoras que garantizaron un correcto desempeño de la actividad. Se definieron nuevas responsabilidades, se establecieron
nuevos tiempos para el trámite, se profundizó en el procedimiento de investigación de la causa raíz y se realizó una
capacitación al personal; se estableció la notificación de No Conformidades a nivel de direcciones, entre otras. La
implementación de estas acciones permitió resultados notables en la actividad: Se logró determinar la causa raíz del 93,4% de
las No Conformidades evitando la recurrencia, se consiguió disminuir el número de No Conformidades en un 44,7%, y se
amplió el proceso de tratamiento de las No Conformidades a las áreas de Investigación-Desarrollo, Bioterio, Control de
Proceso y Metrología. El desempeño de este mecanismo fue posible evaluarlo durante al año 2008-2009 a través de varias
inspecciones externas: ANVISA, OMS, Sanofi, los cuales dejaron constancia de los resultados positivos alcanzados.
Palabras clave: No Conformidades, mejoras.
Introducción
El fabricante debe asumir la responsabilidad de la calidad de los productos farmacéuticos para asegurar que sean apropiados
para el uso previsto, que reúnan los requisitos necesarios para su comercialización y que no sea riesgoso para el paciente,
debido a su inocuidad, calidad o eficacia inadecuada (OMS, 1992).
Para que sea posible aplicar los objetivos cualitativos se debe contar con un sistema de gestión de calidad (SGC) de amplio
alcance y correctamente aplicado, que incorpore las prácticas adecuadas de fabricación y de control de la calidad. Es preciso
que sea documentado y que su eficacia sea controlada. Todas las partes del sistema de garantía de la calidad deben ser
atendidas por personal competente (OMS, 1992).
Un eficiente proceso de gestión de las No Conformidades en un SGC no se limita a cumplir las regulaciones vigentes sino que
es un proceso organizado que debe detectar, investigar, documentar, identificar la verdadera causa las No Conformidades con
el objetivo de tomar las acciones correctivas y preventivas que eliminen las deficiencias (OMS, 2005).
El Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB) cuenta con un SGC que integra las Buenas Prácticas de Fabricación
y el resto de las acciones asociadas al control y el aseguramiento de la calidad de sus productos. Con vistas a lograr altos
29
niveles de efectividad en el sistema de No Conformidades, en el año 2007 establecimos una serie de mejoras, las cuales sean
evaluadas en este trabajo como objetivo principal, así como el desempeño del mecanismo durante el período 2008 y 1er
semestre del 2009.
Para cumplir este objetivo se creó un grupo de trabajo con especialistas de la Dirección de Aseguramiento de la Calidad que
realizaron la evaluación del proceso de gestión de las No Conformidades teniendo en cuenta el cumplimiento de las mejoras
implementadas al mecanismo. Fueron utilizadas una serie de herramientas y técnicas de investigación entre las que se
encuentran la recopilación y análisis de datos, tormenta de ideas y la toma de decisiones en grupo, entre otras. El objeto de
estudio fueron las desviaciones de proceso y el control de productos no conformes (CPNC), fueron escogidos estos dos
mecanismos por ser los que más no-conformidades reportan al SGC. Se revisaron los registros y procedimientos de esta
actividad para dar un diagnóstico de su comportamiento mediante indicadores. Se realizó una comparación del período 2006
y 1er semestre del 2007 (antes de implementar las mejoras) con el período 2008 y 1er semestre del 2009 (después de
implementadas las mejoras).
Mejoras implementadas en estos mecanismos y que serán evaluadas en este trabajo:
1.
Se definió que debe existir un único procedimiento (PPO 4.10.051.06) para el trámite de las No Conformidades del
Sistema de Calidad, con excepción de las quejas que serán tramitadas por su procedimiento. Este procedimiento será el
que englobe de manera general como se tramitaran las No Conformidades del sistema.
2. Se realizó nueva edición de los procedimientos 4.10.051.06, 4.10.028.92 y 4.10.122.96 donde:
2a. Se creó un nuevo registro para documentar las No Conformidades (SIC 0064)
2b. Se definieron nuevas responsabilidades para el tratamiento de las No Conformidades, quedando que el área donde
ocurra la no conformidad es la responsable de notificarla y de realizar la investigación, esta investigación es revisada
por el jefe de departamento y el director del área. Los especialistas de aseguramiento de la calidad son responsables de
revisar la investigación y las acciones correctivas y el director de Aseguramiento de la calidad aprueba finalmente la no
conformidad.
2c. Se establecieron nuevos tiempos para el trámite de las No Conformidades, definiéndose 15 días hábiles para realizar
la investigación a partir del momento en que ocurre, y 7 días hábiles para ser revisada y aprobada por aseguramiento de
la calidad.
2d. Se estableció la evaluación por parte de aseguramiento de la No Conformidades en la cual el especialista y el
director de aseguramiento clasifica la no conformidad, pueda pedir más elementos a la investigación realizada, expone
su criterio general acerca de la no conformidad y decidirá que se hará con el lote.
2e. Se estableció la notificación de No Conformidades a nivel de direcciones.
2f. Se estableció que se le entregué copia de las No Conformidades a las áreas con vistas a que puedan tener las acciones
correctivas a cumplir y la decisión con respecto al lote.
3. Se profundizó en el procedimiento que explica los pasos a seguir para la investigación de la causa raíz (PPO
4.10.126.06) en cuanto a que se sumaron nuevas técnicas de investigación.
4. Se realizó una capacitación a todo el personal que tramita las No Conformidades en relación a las nuevas ediciones de
los procedimientos
5. Se confeccionaron bases de datos para las No Conformidades de ambos mecanismos con vista a facilitar el seguimiento
de las acciones correctivas a tiempo.
6. Se estableció el reporte semanal, mensual y trimestral de las No Conformidades a la alta dirección lo cual hace que esta
pueda se vincule al proceso de gestión de las No Conformidades.
30
La evaluación realizada nos permitió constatar que se cumplió con lo establecido en el PPO 4.10.051.06 para el trámite de las
No Conformidades en cuanto a:
‐
‐
‐
‐
‐
‐
‐
‐
Se utilizó el registro SIC-0064 de notificación de No Conformidades y el registro SIC 0998 de investigación de la causa
raíz siempre que procediera.
Se cumplió con las responsabilidades establecidas para el trámite de las No Conformidades.
En todos los casos se entregaron las copias de las No Conformidades a las partes implicadas y las mismas fueron
tramitadas por personal que fue entrenado antes de realizar el trámite.
Fueron notificadas un total de cinco desviaciones a nivel de direcciones.
En cuanto a los informes acerca de la gestión de las No Conformidades a la alta dirección se realizaron 56 reportes
semanales, 17 mensuales y 7 trimestrales.
Se amplió el trámite de las NC a otras áreas del CIGB (Bioterio, Metrología, Control de proceso e InvestigaciónDesarrollo).
Se realizaron 13 reuniones de No Conformidades entre directores con vista a que sean analizadas las No Conformidades
que se encuentran sin cerrar en el sistema.
Alrededor de un 68% de las acciones correctivas que involucran otras áreas son firmadas por el responsable de la misma
(no establecido documentalmente)
En la Figura 1 se puede apreciar la comparación entre el total de desviaciones de proceso (1A) y CPNC (1B) tramitados en el
2006 y 1er semestre del 2007 y los tramitados en el 2008 y 1er semestre del 2009.
160
500
140
# de desviaciones
450
400
456
120
300
# de CPNC
350
2006- 2007
250
2008- 2009
100
147
80
CPNC
60
200
150
40
100
125
50
20
29
0
0
2006- 2007
2008- 2009
2006- 2007
2008- 2009
Los gráficos anteriores muestran como disminuyeron significativamente el número de desviaciones y CPNC después de
implementadas las mejoras.
En la Figura 2 se compara el por ciento de cumplimiento de las acciones correctivas de las desviaciones (2A) y el CPNC (2B)
tramitados en el 2006 y 1er semestre del 2007 y los tramitados en el 2008 y 1er semestre del 2009.
90
% d e c u m p lim ie n to d e la s A C
80%
70
60
50
58.9%
40
30
20
10
86%
90
80
70
60
46.6%
50
40
30
20
10
0
0
2006-1semestre 2007
% d e c u m p l i m i e n to d e l a s A C
100
80
2008-1 semestre 2009
2006-1semestre 2007
31
2008-1 semestre 2009
Los gráficos anteriores muestran como aumenta significativamente el % de cumplimiento de las acciones correctivas de las
desviaciones y productos no conformes después de implementadas las bases de datos de las acciones correctivas de ambos
mecanismos como herramienta para aumentar la eficiencia del seguimiento de las acciones correctiva.
En la Figura 3 se evalúa el tiempo promedio en que se realiza la investigación por parte de los responsables de la no
conformidad. 3A desviaciones y 3B CPNC.
3A
Tiempo de trámite de desviaciones 25 D í Tiempo de trámite establecido 20 Tiempo de trámite promedio 19,3
15 15
15
a 13,9
10 s 7 5 0 7,39 2008/s
2008
Años
2006 3B
Tiempo de trámite establecido Tiempo de trámite de CPNC
Tiempo de trámite promedio 70
60 D 54
50
í 40
a 30
s 57.3 15 20
15
19
10
0
2006
2008/s
2008
Años
Este indicador fue evaluado para el año 2006 comparándolo con el 2008. El gráfico del tiempo de trámite de las desviaciones
muestra que ni en el año 2006 (7,39 días promedio) ni en el año 2008 (19,3 días promedio) se cumplieron los tiempos
establecidos. Cuando se realizaron las mejoras, se amplió el tiempo para realizar la investigación de 7 días a 15 días, con el
objetivo de que se dispusiera del tiempo necesario para realizar una investigación profunda, ya que en el año 2006 a pesar de
que estuvo muy cerca de cumplirse el tiempo, las investigaciones no tenían la calidad suficiente y las No Conformidades eran
recurrentes. Cuando se analizaron los datos, se observó que las producciones de planta 4 y planta 2 eran las que estaban
afectando este resultado con 71 días y 35 días respectivamente como promedio. Ambas producciones presentaron en este
período problemas de personal que afectaron este resultado, se efectúo nuevamente el cálculo, exceptuando estas dos
producciones, y como muestra el gráfico si se cumplieron los tiempos para realizar la investigación (2008/S).
32
Para el CPNC, a pesar de que en el año 2006 no estaban definidos los tiempos, estos fueron calculados (57,3 días promedio) si
lo comparamos con el tiempo definido en el 2008 (15 días) podemos decir que ninguno de los períodos analizados cumplió el
tiempo para realizar la investigación (2008= 54 días promedio). En este caso también el tiempo promedio de las
investigaciones estuvo afectado por las producciones de planta 4 con 135 días promedio y planta 2 con 80 días promedio. En
este caso también realizamos el cálculo sin tener en cuenta estas producciones y el tiempo promedio no se cumple, pero
presenta una mejora significativa (19 días promedio).
Total de no Conformidades
400
70
300
250
Total de desviaciones
200
Total sin causa raíz
150
65 (100 %)
60
N ú m e ro d e C P N C
Número de desviaciones
350
Total sin causa raíz
342 (100%)
108 (29 %)
100
42 (100 %)
50
40
38 (58 %)
30
18 (100%)
20
10
5 (12%)
1
50
0
3 (16%)
0
2006-2007
2008-2009
2006-2007
2008-2009
En la Figura 4 se muestra el número de No Conformidades en que no se encuentra la causa raíz después de haber realizado la
investigación de la No Conformidad.
Este indicador fue evaluado en algunas de las producciones que mayor número de no conformidades reportaron. Para las
desviaciones se realizó con planta 2, planta 4 y planta 3 y para los productos no conformes de planta 5, planta 2 y planta 4.
Como muestran los gráficos el número de no conformidades sin causa raíz para ambos mecanismos disminuyó
considerablemente en el período 2008 y1er semestre del 2009.
En la Figura 5 se puede observar la recurrencia de las no conformidades en los productos que más No Conformidades
presentaron.
En el período 2006 y 1er semestre del 2007 este análisis fue realizado con las producciones planta 2, planta 4 y planta 1 por ser
las que mayor número de desviaciones reportaron, observándose 10 recurrencias. Para el caso de los productos no conformes
se realizó el mismo análisis con las producciones de planta 8 y planta 9 donde se observaron 8 recurrencias.
En el período 2008 y 1er semestre 2009 este análisis también fue realizado con aquellas producciones que más No
Conformidades aportaron al sistema, se revisaron las desviaciones de planta 2, planta 4 y planta 3 y planta 9 donde se observó
que no existió recurrencia. En el CPNC solo se observaron 4 recurrencias por el mismo incumplimiento en las producciones
de Planta 12, planta 2, planta 4. En la producción de la planta 5 no se observó recurrencia.
Recurrencia de no conformidades.
12
Desv: 10
10
Recurrencia
CPNC: 8
8
Desv.
6
CPNC: 4
4
2
Desv: 0
0
2006-2007
2008-2009
Figura 5. Recurrencia de no conformidades
33
CPNC
Este indicador, a pesar de que en el CPNC se observaron cuatro recurrencias, podemos evaluarlo como positivo al compararlo
con el 1er período analizado, ya que en las desviaciones no se observaron recurrencias y en los productos no conformes
disminuyeron de 8 a 4. No existieron reportes de No Conformidades por una causa común que afectara al sistema de gestión
de las No Conformidades.
La primera edición del PPO 4.10.126.06 para la investigación de la causa de las No Conformidades fue aprobada en el año
2006. A partir de esta fecha el SGC contaba con las técnicas definidas para la investigación de las No Conformidades. Se
realizó un muestreo en el cual se revisaron las desviaciones y el CPNC de las producciones de HB, FCE (p4), HIB y FCE (p2)
en el período comprendido entre la aprobación del PPO y el mes de junio del 2007. En ningún caso se pudo evidenciar el uso
de las herramientas de investigación que se describen en el procedimiento, lo cual tienen lógica, ya que no se realizó ningún
entrenamiento al personal involucrado en esta actividad cuando se aprobó el PPO 4.10.126.06.
Después de implementadas las mejoras al proceso de gestión de las No Conformidades se realizó un entrenamiento correctivo
en todos los procedimientos involucrados incluyendo el PPO 4.10.126.06.
En el período 2008 y 1er semestre del 2009 se revisaron al 100 % todas las desviaciones y los productos no conformes y se
evidenció que siempre que la causa raíz no está identificada preliminarmente se utiliza alguna de las técnicas de investigación
descrita en el PPO 4.10.126.06.
Conclusiones
Las acciones de mejora implementadas en el sistema de gestión de No Conformidades demostraron un desempeño positivo del
sistema de gestión de las No Conformidades. El desempeño de este mecanismo fue posible evaluarlo durante los años 20082009 en los cuales se recibieron numerosas inspecciones externas como: Sanofi, ANVISA, auditoría al Bioterio para la
Certificación ISO 9001:2008 e inspección de la OMS para la certificación de la vacuna HB y Quimihib, los cuales dejaron
constancia del resultado positivo que experimentó el mecanismo de tratamiento de No Conformidades del CIGB.
Referencias
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
CECMED, Regulación 16-2006, Directrices .sobre el cumplimiento de las Buenas Prácticas de Fabricación de productos
farmacéuticos. C. Habana, Cuba. 2006.
CIPAM, Comisión Internacional de Prácticas Adecuadas de Fabricación. Manejo de No Conformidades, México 2004.
FDA, Draft Guidance Quality Systems Approach to Pharmaceutical Current Good Manufacturing Practice Regulations, step USA
2004.
Martínez E, Publicación Manejo de No Conformidades en la Industria Farmacéutica. Parte 2. México 2004.
OMS, Curso de Gestión de Calidad para laboratorios. Módulo 8 Gestión de No Conformidades. Washington D.C. USA 2005.
Salina A, La recolección de datos, revisado en diciembre/2005, www.monografias.com/trabajos12/recodat/recodat.shtml.
Bolaños. L, Curso Manejo de No Conformidades y control de cambios C. Habana. Cuba 2006.
Martínez E, Curso de Administración efectiva del sistema de No Conformidades y control de cambios. C. Habana. Cuba 2008.
Auditorías de la calidad en el Centro de InmunoEnsayo y su impacto en el mejoramiento continuo
Madelyn Sabina Cebreiros, Grisell Turró Grau, Adriana González Quintero, Liliena López Brauet
Centro de InmunoEnsayo. Calle 134 y Ave. 25, Cubanacán, Playa. Teléfono: 208-2929 ext 347.
Email:[email protected].
El Centro de InmunoEnsayo (CIE) cuenta con un sistema de gestión de la calidad que comprende los procedimientos para
asegurar la confiabilidad de los diagnosticadores y posibilita la adopción de acciones. El objetivo del trabajo fue describir la
metodología empleada para la realización de las auditorías internas, así como su impacto en el mejoramiento continuo. Para
esto se preparó y capacitó al personal del área de Aseguramiento de la Calidad en cursos de “Formación de auditores internos
de la calidad” y se realizó el estudio e interpretación del Capítulo 16: “Auditorías” de la Regulación No. 20-2004 del
CECMED. Las técnicas empleadas fueron el trabajo en grupo, entrevistas, muestreo aleatorio para la revisión de la
documentación, el diagrama de Pareto, el diagrama de pastel y la tormenta de ideas. En las auditorías se detectaron 174 No
Conformidades en cinco años. Los principales problemas que afectaron la calidad del producto en más de un 80% fueron:
método inadecuado e incompleto, mal almacenamiento, falta de información, material sin identificar y vencido, entre otros.
Los problemas con las maquinarias, el medio ambiente y la medición fueron los menos significativos, ya que representaron un
20%. Para la mejora de los procesos se propusieron 170 acciones correctivas, efectuándose gradualmente en los plazos
34
previstos para cada una de ellas, para un 73% de cumplimiento. Los grupos que más incidieron en la calidad del producto
fueron métodos de trabajo, materiales y mano de obra y los sistemas de auditorias, acciones correctivas y preventivas son
herramientas de gestión para garantizar un mejoramiento continuo.
Palabras clave: Auditorías, calidad, acciones correctivas y preventivas.
Introducción
A finales de la década de 1970 la salud pública cubana había alcanzado ya importantes éxitos en la erradicación de
enfermedades infecto-contagiosas, imponiéndose la necesidad de pasar a una etapa superior; así se concibió la estrategia de
impulsar el desarrollo de las ciencias y su aplicación en la medicina preventiva de forma gratuita, masiva y extendida a todo el
país y se profundizó en la búsqueda de soluciones económicas y propias en la esfera del diagnóstico precoz de diferentes
enfermedades.
De esta forma se funda el Centro de InmunoEnsayo en el año 1987 como un centro de investigación y producción de equipos
y medios de diagnóstico de la tecnología SUMA. En el mismo se producen estuches de reactivos para diagnóstico de
diferentes enfermedades, los que se basan en las técnicas inmunoenzimáticas del tipo ultramicroELISA (UMELISA) y un
conjunto de equipos complementarios que integran en conjunto el sistema ultramicroanalítico (SUMA).
En los últimos cinco años (2004-2009) las ventas de las exportaciones del CIE han crecido mayoritariamente en los mercados
de Venezuela, Brasil, México y Argentina, que resultan de beneficio indirecto para nuestro pueblo, pero de forma directa han
permitido la extensión de la tecnología SUMA a varias provincias cubanas para garantizar la salud del futuro. Las pruebas que
se hacen a nuestras gestantes para evitar malformaciones congénitas y enfermedades transmisibles como el VIH y la hepatitis
B y las realizadas al momento del nacimiento, llevan a nuestra infancia a un nivel de prevención comparable con el de los
países más desarrollados.
Con el fin de alcanzar procesos productivos más eficientes y con resultados concretos se hacen grandes transformaciones o
cambios, en ocasiones no se identifican las oportunidades de mejora que pueden traducirse en información valiosa para
mejorar o transformar dichos procesos o diseñar y rediseñar los mismos. Para trabajar en la mejora continua se han definido e
implementado procesos necesarios como son las auditorías internas, acciones preventivas y correctivas, entre otros (6).
El Departamento de Aseguramiento y Control de la Calidad (DACC) del CIE, cuenta con una metodología de control y
certificación de la calidad que abarca desde la materia prima hasta el producto terminado. Esta comprende todos aquellos
procedimientos realizados para asegurar la confiabilidad de los diagnosticadores y posibilita la adopción de medidas dirigidas
a evitar o minimizar las posibles fuentes de errores, asegurándose de esta forma el correcto desarrollo de las operaciones de
producción. Como parte de esta metodología se planifican y ejecutan auditorías internas dirigidas a verificar el cumplimiento
de las buenas prácticas de fabricación de diagnosticadores.
El presente trabajo tiene como objetivo describir la metodología para la realización de las auditorías internas, así como, su
impacto en el mejoramiento continuo.
Materiales:
-
Regulación No. 20-2004 “Buenas Prácticas para la Fabricación de Diagnosticadores”, CECMED, 2004. Estudio e
interpretación del capítulo 16 Auditorías (2).
PNO 10-001 Procedimiento para la realización de auditorías internas al sistema de calidad.
Métodos:
-
Preparación y capacitación del personal del área de Aseguramiento de la Calidad en los cursos de “Formación de auditores
internos de la calidad” por el grupo empresarial Terrafarma de México (4) y el Instituto de Investigaciones en
Normalización (3).
Después de la preparación del personal y para realizar las auditorías se siguieron los siguientes pasos (7):
-
Establecimiento del programa de auditorías.
Selección del equipo auditor.
Organización inicial de la auditoría.
Revisión de los documentos de referencia.
35
-
Actividades de la auditoría in situ con reunión de apertura y realización de la auditoría mediante la aplicación de una de las
técnicas de muestreo.
Muestreo aleatorio para la revisión de la documentación.
Entrevista individual o colectiva.
Observación visual in situ.
Hallazgo de la auditoría.
Reunión de clausura para enunciar las No Conformidades a la parte auditada.
Entrega de las acciones correctivas por parte de los auditados.
Auditoría de seguimiento.
Para el trabajo se emplearon los datos de las No Conformidades detectadas en las auditorías de primera parte o internas (5)
realizadas en un período de 5 años (2004-2009). Las No Conformidades existentes se dividieron en 6 grupos de aspectos como
se describe en la bibliografía consultada y que son llamadas las fuerzas universales del proceso, según el Sr. Kaoru Ishikawa
(1).
Los grupos quedaron conformados de la siguiente manera:
Método de trabajo: incluyó procedimientos, registros, instrucciones de trabajo, literatura interior, método de ensayo.
Materiales: incluyó materias primas, soluciones aditivas, materiales impresos y de envase, los componentes y
diagnosticadores, material referencia.
Mano de obra: incluyó al elemento humano.
Maquinarias: incluyó el uso correcto, mantenimiento y limpieza de equipos y máquinas de trabajo.
Medio ambiente: incluyó las condiciones de iluminación, limpieza, organización, espacio, humedad y temperatura de locales
de trabajo y almacenamiento.
Medición: incluyó la calibración de pipetas, equipos y maquinarias y medición de parámetros en soluciones.
Análisis estadístico
Para cada grupo se calculó el porcentaje de incidencia de las No Conformidades. Para la mejora continua se realizó el
procesamiento de datos numéricos mediante el Diagrama de Pareto a los grupos que tenían mayor número de No
Conformidades.
En la Tabla 1 se muestran los resultados de las auditorias internas a sistemas y procesos de los últimos cinco años (20042009).
Tabla 1. Resultados de las auditorías internas.
Grupos
Método de trabajo
Materiales
Mano de obra
Maquinarias
Medio ambiente
Medición
Total
No Conformidades
82
31
24
17
11
9
174
Con todos los datos se confeccionó un diagrama pastel, el cual representa los grupos y el porcentaje de ocurrencia, teniendo en
cuenta la frecuencia de cada problema (Figura 1).
36
Mano de obra
13,8 %
Materiales
17,8 %
Maquinarias
9,7 %
Medio ambiente
6,3 %
Medición
5,2 %
Método de trabajo
47,1 %
Figura 1. Grupos y porcentajes de ocurrencia de las No Conformidades.
Como se puede apreciar los problemas con mayor ocurrencia son los relacionados con el método de trabajo, los materiales y la
mano de obra, representando casi el 80% del total, para estos grupos se realizó un Diagrama de Pareto.
Los problemas relacionados con las maquinarias, el medio ambiente y la medición son los menos significativos ya que
representan un 20%, aunque no dejan de ser aspectos que intervienen en la calidad del producto.
Los Diagramas de Pareto mostrados en las Figuras 2, 3 y 4 representan los problemas fundamentales de los tres grupos de
mayor incidencia en las No Conformidades.
Como se observa en los diagramas de Pareto los principales problemas que pueden estar afectando la calidad del producto en
más de un 80 % son:
-
Método inadecuado.
Método incompleto.
Mal almacenamiento en el material.
Falta de información del material.
Material sin identificar.
Material vencido.
Incumplimiento de responsabilidades.
Falta de información en los documentos.
37
Figura 2. Diagrama de Pareto de Método de trabajo
Leyenda: Método inadecuado: no se utilizó el documento vigente, Método incompleto: cambio en el método actual, es decir, se hizo algún cambio que no
estaba incluido o faltaba algo por hacer del método, Ausencia de documentos: falta el documento en el sistema o la copia en el puesto de trabajo.
Figura 3. Diagrama de Pareto de Materiales
Leyenda: Mal almacenamiento: material no tiene las condiciones requeridas de almacenamiento, Falta de información: no existe la información necesaria
dentro del contrato y las especificaciones de los productos, Sin identificar: no presenta etiqueta de identificación el producto, Vencido: material fuera del
plazo de validez, Ausencia de registro: no existe el registro para la recepción, control y distribución del material.
38
Figura 4. Diagrama de Pareto de Mano de obra.
Leyenda: Incumplimiento de responsabilidad: Personal que incumple con sus responsabilidades, Falta de información: Información o datos insuficientes
en el documento, Falta de calificación y capacitación: Personal no calificado y no capacitado, Falta personal: Insuficiente mano de obra.
La auditoría y la acción correctiva son elementos del sistema de gestión de la calidad que están estrechamente relacionados y
trabajan al unísono para lograr un objetivo común. La fase de cierre comienza cuando el auditado entrega el plan de acción
que requiere de soluciones inmediatas, acciones correctivas, así como las responsabilidades específicas y la fecha para cumplir
cada acción. El equipo auditor conjuntamente con el coordinador de las acciones correctivas va verificando el cumplimiento
de las acciones para el seguimiento y cierre de la auditoría.
Para el período analizado se propusieron 170 acciones correctivas para la mejora de los procesos, efectuándose gradualmente
en los plazos previstos para cada una de ellas, para un 73% de cumplimiento. Las acciones que no se han cumplimentado se
deben en su mayoría a inversiones que se están realizando en el CIE.
Los problemas detectados nos brindan claramente una idea sobre las etapas del proceso donde hay que centrar el trabajo de
mejora, para lo cual el DACC en estrecho vínculo de trabajo con la Dirección de Producción del CIE se propone el siguiente
plan de acción:
-
Realizar seminarios relacionados con los temas de Buenas Prácticas de Fabricación para actualizar conocimientos.
Realizar curso de Buenas Prácticas de Fabricación de Diagnosticadores para revisar la Regulación No. 20-2004.
Capacitar al personal en temas relacionados con el Sistema de Gestión de la Calidad de acuerdo con sus responsabilidades.
Asegurar el manejo seguro, el almacenamiento y la distribución de los materiales y materias primas.
Establecer un plan de revisión de la base documental con el objetivo de determinar los documentos incompletos e
inadecuados.
Incidir en la reducción del tiempo de respuesta de las acciones con las áreas auditadas.
Redefinir las responsabilidades a todos los niveles de dirección y de áreas y actualizar la línea de sucesión de mando.
Conclusiones
-
Los grupos que más incidieron en la calidad del producto fueron métodos de trabajo, materiales y mano de obra.
Los resultados de las auditorías internas constituyeron una herramienta para la mejora continua.
39
-
La dirección del CIE es la principal promotora para la ejecución de las acciones debido a que aporta los recursos
necesarios, conduce estratégicamente el trabajo organizacional necesario para dar respuesta a las necesidades, demandas y
exigencias en la producción de diagnosticadores.
Referencias
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Dennis R. Arter. Auditorías de calidad: mejorar la productividad. 3ra edición. Milwaukee:ASQ Quality Press; 2003.
CECMED. Regulación Sanitaria No. 20-2004: Buenas Prácticas de Fabricación de Diagnosticadores, CECMED.
Folleto de Texto de Adiestramiento. Formación de Auditores Internos de la Calidad. ININ, 1998.
Folleto de Presentación del Curso. Formación de auditores de calidad. TERRA FARMA, S.A DE C.V.F. 2006.
NC ISO: 9000:2005 Sistemas de gestión de la calidad. Fundamentos y Vocabulario.
NC ISO: 9001:2008 Sistemas de Gestión de la Calidad. Requisitos.
NC ISO: 19011:2004 Directrices para las Auditorias de los Sistemas de Gestión de la Calidad/Ambiental.
Sistema de liberación de productos obtenidos en el Centro de Química Biomolecular
Yerlen Castillo Suárez, Pablo Cabrera Lima, Evys Delá Herrera, Liliana Figueroa Ferrer, Janet Lora García, Marah Curbelo Álvarez y cols.
Centro de Química Biomolecular. Ave. 21 y 200, Rpto. Atabey, Municipio Playa, Apdo. Postal 16042, Ciudad de La Habana.
El Centro de Química Biomolecular (CQB), institución de nueva creación, comenzó a producir desde finales del 2009
intermedios químicos para la obtención de Ingredientes Farmacéuticos Activos (IFAs) de vacunas que se producen en
instituciones de la Industria Biotecnológica Cubana, siendo como requisito indispensable el diseño de un Sistema de gestión
de calidad (SGC) que garantice seguridad y calidad de los productos obtenidos. El objetivo del trabajo es mostrar la
metodología desarrollada en el CQB para la liberación de materias primas y productos finales. Con este trabajo se llegó a una
propuesta para la liberación de las materias primas y productos finales en el CQB, que incluye: recepción de las materias
primas en el almacén, correspondencia de los certificados de calidad del proveedor y los ensayos de control de acuerdo a las
especificaciones, controles al producto final, revisión de los registros analíticos y del proceso, inspecciones de calidad y
tratamiento de No Conformidades. Se aplicó la metodología propuesta en la liberación de 20 lotes de reactivos utilizados
como materias primas y en la de 6 lotes de 3 productos finales diferentes, lo que permitió evaluar las características
específicas de cada materia prima de acuerdo con su incidencia sobre la calidad del producto final, así como garantizar la
documentación requerida por las Buenas Prácticas de Fabricación para el correcto funcionamiento del SGC implementado.
Por los resultados obtenidos se decidió establecer dicha metodología para todas las producciones del centro, la que fue
aprobada como Procedimientos Normalizados de Operación del SGC del CQB.
Palabras clave: Liberación, materias primas, productos finales.
Introducción
El Centro de Química Biomolecular (CQB) es una institución dedicada a la Investigación-Desarrollo y Producción, que
trabaja en el desarrollo a ciclo completo de biomoléculas, utilizando herramientas de la química para la obtención de vacunas
y productos similares, fundamentalmente para la salud humana.
Su visión es ser una institución de excelencia totalmente integrada al Sistema de la Biotecnología Cubana. Sus producciones,
de última generación, obtenidas con el empleo de herramientas de la química, lograrán alcanzar un impacto en las salidas de la
Industria Biotecnológica Cubana (IBC) para el mejoramiento de la salud humana y la potenciación de las capacidades
exportadoras del país.
Desde finales de 2009 se comenzó a producir en las instalaciones del CQB intermedios químicos que serán empleados en la
obtención de Ingredientes Farmacéuticos Activos (IFAs) de vacunas que se producen en varias instituciones de la IBC.
Debido a lo anterior fue necesario diseñar un sistema de gestión de calidad (SGC), teniendo en cuenta las regulaciones de las
Buenas Prácticas dictadas por el CECMED. Se realizó una adecuación de los requisitos de las mismas para los productos que
se llevan a cabo en estos momentos en el Centro que no son considerados ni IFAs ni productos farmacéuticos terminados
como tal, los cuales son incorporados a los procesos productivos de la IBC. Por tanto, resulta imprescindible garantizar la
seguridad y calidad de los mismos. Para lograr esto, se comenzó a trabajar en los sistemas de liberación de materias primas y
productos finales.
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El objetivo de este trabajo fue mostrar la metodología desarrollada en el CQB para la liberación de materias primas y
productos finales, los cuales constituyen aspectos de gran importancia dentro del diseño del SGC.
Para el desarrollo del trabajo se realizó un estudio particularizado de las regulaciones emitidas por el CECMED de Buenas
Prácticas de Fabricación (Reg. 16/2006) y Buenas Prácticas de Laboratorio para el Control de Medicamentos (Reg. 37/2004).
Se revisaron las especificaciones establecidas por los productores para cada una de las materias primas que intervienen en los
procesos, entre otros aspectos establecidos en los procedimientos normalizados de operación.
Se realizaron entrevistas al personal responsable de la producción y el control de calidad, y también se empleó la observación
directa de los procesos con vistas a definir los puntos críticos de los mismos.
La metodología propuesta para llevar a cabo la liberación de las materias primas y los productos finales del CQB se describe
de forma explícita a continuación:
Metodología para la liberación de materias primas
Según las regulaciones de Buenas Prácticas, las materias primas (MP) de un proceso productivo deben ser liberadas por
Calidad. Se propusieron dos variantes para la liberación de las MP que intervienen en las producciones de la institución:
Liberación solamente por Certificado de Calidad del proveedor [a)] y Liberación por Ensayos [b)]. La liberación solamente
por Certificado de Calidad se aplica cuando las MP no son las más críticas para el proceso ni para la calidad final del producto
terminado y, además, sobre la base de contar con un proveedor reconocido, con un historial de desempeño satisfactorio. En el
caso de la liberación por ensayos se aplica a las MP críticas, teniendo en cuenta la disponibilidad analítica existente, de forma
que se pueda demostrar la identidad de las mismas y cuando sea importante para el proceso y para la calidad final del
producto, evaluar la pureza o contenido de impurezas.
a) Liberación solamente por Certificado de Calidad
Una vez que llegan las materias primas (MP) al almacén, estas son recepcionadas y ubicadas en el área de cuarentena. A partir
de una notificación por escrito del Departamento de Logística y del listado de las mismas que serán liberadas por Certificado
de Calidad del proveedor (RAC# 14), el especialista de calidad tiene conocimiento de su llegada. La Figura 1 muestra de
forma resumida esta metodología. En caso que el proveedor no envíe el Certificado de Calidad o el mismo no corresponda con
las especificaciones elaboradas por el productor, se aplicará la variante de liberación por ensayos para tomar la decisión de
aprobar o rechazar la misma. A pesar de esto se deben tomar acciones correctivas y preventivas, ya que estas desviaciones
constituyen No Conformidades (NC). De la misma manera serán tratadas las NC en caso de que sean detectadas durante la
inspección en el almacén. En caso que la MP sea aprobada, se le da salida del área de cuarentena y se ubica en el área
destinada a tal fin. En el caso contrario (MP rechazada), se le da salida del área de cuarentena y se destina a otros usos, de
acuerdo a lo establecido en un procedimiento para el tratamiento de un producto no conforme.
b) Liberación por Ensayos
A partir de una notificación por escrito del Departamento de Logística y del listado de las MP a liberar por ensayos (RAC#
19), el especialista de Calidad tiene conocimiento de la llegada del producto. En la Figura 2 se muestra de forma resumida esta
metodología.
La ubicación de las MP en el almacén se realiza de la misma forma que se explicó en la variante anterior. En este caso,
siempre se realizará el muestreo a las mismas por Control de Calidad para la realización de los ensayos establecidos para cada
una de las MP, además de la revisión de los Certificados de Calidad, siendo tomados ambos elementos para la decisión de
aprobación o rechazo. También se realizará el tratamiento de las NC que se detecten durante todo el proceso de liberación. Ya
sea aplicando esta variante o la liberación solamente por Cetificado de Calidad, se elabora un Expediente para cada MP,
conformado con toda la documentación que fundamenta la aprobación o rechazo, que incluye: Certificado de Calidad de la
MP, Informe de Resultados de los Ensayos (para el caso de la liberación por ensayos), Especificaciones de Calidad elaboradas
por el productor, Reportes de Inspección a la MP en el almacén e Informe Resumen del criterio de Liberación.
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A partir de la notificación y del RAC# 14
“SI” Certif. Calidad
“NO” Certif. Calidad
Certificado vs. Especificación
“SI” corresponde
Buscar en Internet según proveedor
“NO” corresponde
(No Conformidad)
Inspección al producto
SI
NO
(No Conformidad)
Reanalizar según Liberación por
Ensayos
Informe Resumen del criterio de Liberación
(Comunicar a Logística para reclamación)
“SATISFACTORIO”
“NO SATISFACTORIO”
Poner etiqueta
Poner etiqueta
APROBADO
RECHAZADO
No Conformidad
Figura 1. Liberación de MP solamente por Certificados de Calidad del proveedor.
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A partir de la notificación y del RAC# 19
“SI” Certif. Calidad
“NO” Certif. Calidad
Buscar en Internet según proveedor
“NO”
“SI”
(No Conformidad)
(No Conformidad)
(Comunicar a Logística para reclamación)
Solicitud de Análisis (RCC # 1)
El Lab. Control de Calidad realiza el Muestreo (RCC# 3)
Se realizan los “ENSAYOS” según especificaciones
“CUMPLE”
“NO CUMPLE”
Inspección al producto
Informe Resumen del criterio de Liberación
Poner etiqueta
Poner etiqueta
APROBADO
RECHAZADO
Figura 2: Liberación de MP por Ensayos.
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No Conformidad
Espec. de Aseg. Calidad revisa el Expediente de Lote y registra en RAC# 7
RAL
RPL
Resultados de los controles
Resultados de
Inf. Resultados
Resumen Prod.
realizados a sistemas críticos
Inspeccciones
Revisión de todos los documentos y devoluc.
a los responsables en caso de existir algún señalamiento
(No Conformidad)
Listas de Chequeo:
RAC# 104: Contenido del RAL
RAC# 105: Contenido del RPL
RAC# 8: Revisión de doc. en AC
Aseg. Calidad emite informe resumen de liberación
(RAC# 62)
Vicedirectora de Calidad
Certificado de Calidad (RAC# 57)
Notificación de liberac. producto final (RAC# 56)
“SATISFACTORIO”
“NO SATISFACTORIO”
Poner etiqueta
Poner etiqueta
APROBADO
RECHAZADO
No Conformidad
Leyenda:RAC: Registro de Aseguramiento de la Calidad; RCC: Registro de Control de Calidad; RAL: Registro Analítico del Lote;
RPL: Registro de Producción del Lote.
Figura 3. Liberación de productos finales.
Metodología para la liberación de productos finales
Una vez terminada la producción del lote, el personal designado del área de producción solicita en el Laboratorio de Control
de Calidad, la realización de los ensayos para el control de su producto a través del RCC# 1: Solicitud de Análisis. El
especialista de documentación recepciona las muestras, tanto de ensayos como de retención, en el RCC# 4: Recepción de
muestras en el Laboratorio de Control de Calidad para la realización de los ensayos correspondientes, según las
especificaciones de calidad de cada producto final por parte del técnico designado. Una vez concluidos los ensayos, el Jefe del
Laboratorio revisa los registros y aprueba los mismos. Los resultados se entregan a Aseguramiento de la Calidad (AC) junto
con el RCC# 86: Informe de Resultados, el cual forma parte del RAL.
El Jefe de Producción entrega los registros junto con un resumen de la producción del lote a aseguramiento de la calidad, lo
cual constituye el RPL.
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La Figura 3 muestra la metodología resumida del proceso de liberación de productos finales.
Al igual que para la liberación de las materias primas se tiene en cuenta el tratamiento de las NC, tanto si se detectan en las
inspecciones realizadas al proceso productivo como durante el proceso de liberación, se tendrá en cuenta el impacto de las NC
en la calidad del producto final, para decidir si se aprueba o rechaza el mismo.
Aplicación de la metodología de liberación de materias primas y productos finales
La metodología propuesta se aplicó a los procesos productivos actuales del centro, dirigidos a la obtención de:
- intermedios químicos [5-azido-3-oxapentanol (Espaciador); N-succinimidil-3-maleimido propionato; 1,2,3,5-tetra-O-acetilβ-D-Ribofuranósido y 5-O-alil-2,3,4-tri-O-bencil-D-Ribitol] que serán empleados en la obtención de la vacuna Quimi-Hib por
el CIGB,
- gangliósidos naturales (NacGM3 y NGcGM3), materia prima fundamental, empleada en la obtención de vacunas en el CIM.
Al aplicar la metodología de liberación a 20 lotes de materias primas y 6 lotes de tres productos finales diferentes, no se
presentaron ni detectaron NC críticas que afectaran al proceso ni a la calidad del producto final, lo que se evidencia en la
operatividad de la metodología propuesta.
Conclusiones
En el CQB se cuenta con una metodología para la liberación de materias primas y productos finales, con la adecuación de los
requisitos de las Buenas Prácticas de Fabricación. Por los resultados obtenidos durante su aplicación, esta metodología fue
aprobada como Procedimientos Normalizados de Operación del SGC, implementado en el centro.
Referencias
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Delá E. Implementación de un Sistema de Calidad para el Laboratorio de Análisis y Control de Calidad a partir del cumplimiento de
los principios de BPL, 1999.
ICHQ 10. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human
Use. ICH Harmonised Tripartite Guideline Pharmaceutical Quality System. Current Step 4 version, 2008.
Normas de la Unión Europea 66-904-8-9. Gestión de la calidad y elementos de un Sistema de Calidad. Reglas generales, 1992.
Penabad A y cols. Consideraciones acerca de la organización del aseguramiento de la calidad en las empresas, 1991.
Regulación No. 37/2004. Buenas Prácticas de Laboratorio para el control de medicamentos. CECMED, 2004.
Regulación No. 16/2006. Directrices sobre Buenas Prácticas de Fabricación de Productos Farmacéuticos. CECMED, 2006.
Sistema automatizado para la liberación y control de materias primas, componentes y
diagnosticadores en el Centro de InmunoEnsayo
Idania González-Pérez1, Roquelina Cuellar Pérez1, Madelyn Sabina Cebreiros2, Grisell Turró Grau2, Liliena López Brauet2
Departamento de Aseguramiento de la Calidad para Inmunoquímica (DACIQ).
Departamento de Aseguramiento y Control de la Calidad (DACC), Centro de InmunoEnsayo: Calle 134 y ave 25, Apartado Postal 6653, CP
11600, Cubanacán, Playa
Los avances registrados en las ciencias informáticas en los últimos años han favorecido su aplicación en todas las ramas de la
economía y en particular en la producción de bienes. El presente trabajo tuvo como objetivo la automatización del proceso de
emisión y archivo en bases de datos (BD), creadas en Microsoft Access 2007, de los reportes de liberación (RL) de materias
primas, componentes y diagnosticadores producidos en el Centro de InmunoEnsayo (CIE), como parte del control sobre estas
producciones. Los RL emitidos por el Departamento de Aseguramiento y Control de la Calidad (DACC) y programas Access,
InfoPath y Outlook del paquete Microsoft Office 2007. Mediante la actualización automática de las BD de materias primas
adquiridas, materias primas producidas, componentes y diagnosticadores, mediante el envío por correo electrónico, a los
destinatarios implicados, de los formularios con los RL. Se confeccionaron y publicaron las cuatro BD, así como los
formularios correspondientes para la emisión de los RL. Las BD, actualizadas sin esfuerzo adicional al desplegado en la
emisión de los RL tradicionales, permiten archivar de manera sistemática, rápida, automatizada, accesible y segura, toda la
información contenida en los RL emitidos por el DACC para el control de la producción de diagnosticadores en el CIE. El
45
sistema desarrollado es más confiable, seguro y amigable que la forma anterior de emisión y almacenamiento de los RL: evita
errores humanos en su generación, permite hacer las consultas de manera mucho más fácil, posibilita la generación de
informes con una mayor calidad, e implica mayor eficiencia para el operario.
Palabras clave: Aseguramiento de la calidad, automatización, informatización, bases de datos, Microsoft Access, Microsoft
Infopath
Introducción
El término Informatik apareció por primera vez en Alemania en el año 1957 y fue acuñado casi simultáneamente en francés
(Informatique) e inglés (Informatics) en el año 1962. Unos años más tarde, en 1968, el mundo de habla hispana lo adoptó
como INFORMÁTICA (1), como acrónimo de las palabras INFORmación y autoMÁTICA. Esta disciplina, que ha alcanzado
gran desarrollo y auge producto del desarrollo tecnológico logrado en los últimos años y de la disminución de los precios de
los equipos informáticos, puede definirse como un conjunto de conocimientos científicos y de técnicas que hacen posible el
tratamiento automático de la información por medio de ordenadores. Se trata del almacenamiento en soporte informático de
datos con una estructura lógica, para su posterior tratamiento automatizado con determinados objetivos.
La informatización, como nueva tendencia en la economía mundial, se ha convertido en uno de los pilares fundamentales de
los sistemas de gestión de la calidad, aportando un altísimo valor agregado, al favorecer la organización operativa de los
procesos involucrados y la recopilación estructurada de la información, lo que contribuye, además, a la trazabilidad. Es por
esto que la disponibilidad de soportes informáticos, como parte de un sistema de gestión de calidad que aporte herramientas
para la mejor implementación y control de todos los procesos y que permita realizar las tareas mejor y más rápido, es un
objetivo importante para la empresa moderna. La nueva edición de la Norma ISO 9001 (2) contribuye a la informatización de
las empresas que implantan sistemas de calidad acorde con sus regulaciones. La necesidad de aplicar técnicas estadísticas,
analizar la información y datos recogidos y valorar la capacidad de los procesos, puntos reflejados en esta norma de calidad,
evidencian la importancia que la informática debe cobrar en cualquier empresa, independientemente de su tamaño o actividad,
ya sea industrial o de servicios.
El presente trabajo tiene que ver con el empleo de un sistema informático1 (3) sencillo, articulado en base a utilidades que
ofrece el paquete de Office 2007, para su empleo en el aseguramiento y control de la calidad de la producción de
diagnosticadores en el Centro de InmunoEnsayo (CIE), perteneciente al Polo Científico de la Habana. Específicamente se trata
de la automatización del proceso de emisión y archivo en bases de datos (BD)2 creadas con la ayuda del gestor de BD (GBD)3
Microsoft Access 2007, de los reportes de liberación (RL) de materias primas adquiridas (MPA), materias primas producidas
(MPP), componentes y diagnosticadores, producidos en nuestro centro.
Como materiales se emplearon básicamente los siguientes programas del paquete Microsoft Office 2007: InfoPath 2007, para
la creación de formularios con campos imagen de los contenidos en los RL tradicionales; Access 2007, para la creación de las
BD reservorio de la información de liberación; el servicio de correo electrónico Outlook 2007; así como la información de
liberación de MPA, MPP, componentes y diagnosticadores producidos por la agrupación de Inmunoquímica (IQ) del CIE.
El método empleado para la realización del trabajo consistió en la recopilación, a través de correo electrónico, de la
información de liberación contenida en los formularios creados en InfoPath, con salva automática de la misma en bases de
datos compartidas en red, las cuales fueron elaboradas empleando Access como GBD.
Diagnóstico de la situación previo a la mejora. Descripción de los procedimientos
Tradicionalmente la liberación y el control de las materias primas, tanto adquiridas como producidas, así como de los
componentes y diagnosticadores producidos por la agrupación de IQ de nuestro centro, se realizaba a través de los procesos de
emisión de RL, empleando el servicio de mensajería Outlook y del archivo/consulta de los mismos, respectivamente. En
1
Sistema Informático- conjunto de hardware, software y soporte humano.
BD- conjunto de datos almacenados en la computadora con una estructura lógica, organizados en campos (columnas) y registros (filas) y diseñado para
facilitar su mantenimiento y acceso de forma estándar.
3
GBD‐ conjunto de herramientas que le permiten al usuario, sea común o especializado, manipular en términos abstractos los datos contenidos en la base, manteniendo su integridad, confidencialidad y seguridad. 2
46
correspondencia, el autorizo de las órdenes de producción (OP) se producía previa consulta de los correos de liberación
almacenados. El método resultaba trabajoso por el gran volumen de información a consultar, más aún cuando existen MPP y
MPA con períodos de validez muy extensos, e incluso un número importante de MPA con vencimiento no definido, por lo que
son útiles hasta su agotamiento; lo que obligaba a revisar un gran número de correos distribuidos en períodos largos de
tiempo. Este almacenamiento fraccionado de la información, en diferentes mensajes de correo algunos muy dispersos en el
tiempo, impedía el control global de los RL emitidos, dificultando así la trazabilidad de las producciones y la realización de
análisis retrospectivos.
Planificación de la mejora
Con estos antecedentes nos trazamos los siguientes objetivos para la informatización de las tareas de liberación y control de
materias primas, componentes y diagnosticadores, producidos en nuestro centro:
-
Crear formularios en Microsoft InfoPath 2007, con campos que colectaran toda la información contenida en los RL,
tradicionalmente emitidos por el Departamento de Aseguramiento y Control de la Calidad (DACC).
Activar el servicio de envío por correo electrónico de estos formularios, con actualización paralela de las BD creadas,
con el fin de documentar de manera electrónica y de fácil acceso, la información contenida en los RL emitidos.
Esto es importante pues dichos reportes, equivalentes a registros4 en las BD, son usados de manera frecuente durante
toda la vida útil de los productos correspondientes (MPA, MPP, y componentes).
Almacenar de igual modo, en una BD relacional5 creada al efecto, toda la información contenida en los RL de
diagnosticadores (RLD), que contienen detalles relacionados con el diagnosticador y otros acerca de los envíos de
comercialización.
Archivar estos RL como parte del historial de la producción del CIE, aunque queden inactivos una vez se agoten o
alcancen la fecha de caducidad las materias primas, componentes y diagnosticadores que los generaron.
La planificación incluyó además encuentros con el personal de liberación de lotes encargado de la emisión de los RL, para
concientizarlos de la necesidad, factibilidad y ventajas del cambio propuesto y llegar a un consenso sobre la estructura y
contenido de los formularios.
Diseño y puesta en marcha de la mejora
Se aplicaron las reglas y principios básicos para el diseño de BD (4,5): la información a incluir en los reportes fue organizada
y dividida en temas y estos a su vez en tablas, mientras que los elementos de información fueron convertidos en campos
(columnas en la tabla). Un paso importante en el proceso de diseño lo constituyó la elección de la clave principal6 de cada
tabla. En el caso de las BD de MPA y diagnosticadores, se seleccionaron como clave principal los campos # de registro de
entrada de la MPA y # RLD, únicos para cada MPA y diagnosticador, respectivamente. Para las BD de MPP y componentes
se tomó como clave principal un identificador autonumérico generado automáticamente por las bases, pues en estos casos no
hay campos, o combinación única de estos (clave compuesta), que puedan con seguridad no repetirse en las bases.
A las tablas ya creadas se les aplicaron las reglas de normalización de los datos, para garantizar una estructura correcta. El
diseño fue sometido a análisis empleando la opción que ofrece Microsoft Office Access 2007 para este fin, con el objetivo de
detectar posibles errores.
En el proceso de puesta en marcha se realizó el ajuste final del formato de cada campo en las BD y se añadieron las
restricciones posibles a los mismos en los formularios, con el objetivo de disminuir o eliminar errores durante la entrada de los
datos. También se tuvieron en cuenta aspectos de uniformidad y estética.
Una vez disponibles con las características de funcionalidad requeridas, los formularios y BD fueron publicados en una
carpeta compartida en red, para su empleo por los usuarios.
Por último, la puesta en marcha también incluyó la instrucción del personal para el correcto llenado de los formularios y
consulta de las BD.
4
5
6
Registro-una fila en la tabla con varios campos de información o columnas.
BD relacional-BD en la cual la información se almacena en varias tablas independientes, pero que contienen campos comunes, de manera que los valores
coincidentes en dos tablas son usados para relacionar información de ambas, generándose una tercera tabla que combina los datos solicitados de las tablas
origen. En las BD relacionales se almacena un tipo de datos específico sólo una vez.
Clave principal- campo o conjunto de campos de la tabla que identifican inequívocamente cada registro almacenado en la misma, proporcionando un
identificador exclusivo para cada fila que permite acelerar el proceso de acceso a los datos.
47
Se implementó, como parte del Sistema de Gestión de la Calidad de nuestro centro, un procedimiento informatizado para la
mejora de las tareas de liberación de lotes y control de materias primas, componentes y diagnosticadores. El mismo permite
archivar los RL emitidos en 4 BD creadas en Microsoft Office Access 2007. La actualización automática de las BD se logra
mediante el envío por correo electrónico de formularios diseñados en Microsoft Office InfoPath 2007, los cuales contienen la
información incluida en los RL tradicionales.
Sin esfuerzo adicional al desplegado anteriormente en la confección de correos con los RL y minimizado este con las ventajas
que ofrece la entrada de información en las BD, mediante el llenado y envío por correo de los formularios, las cuales se
explican en esta sección, se hizo posible la actualización sistemática y automática de las cuatro BD creadas. Resultado
colateral de este trabajo pueden considerarse también las facilidades y ventajas que ofrece el almacenamiento de los RL en
estas BD, las cuales se exponen en el texto.
Procedimiento paso a paso para la emisión y envío de los formularios y la actualización de las BD
La Figura 1 muestra una imagen del formulario elaborado para la emisión de los RL de componentes. El formulario diseñado
permite la liberación de más de un componente en un solo envío, por la disponibilidad al final del mismo del botón para
insertar un nuevo elemento (Figura 1).
El procedimiento para la emisión del reporte y actualización automática de la BD correspondiente es el siguiente:
1. Llenado, por el personal encargado de la liberación de los lotes, del formulario abierto en Microsoft Office Infopath
2007.
2. Selección de la opción, disponible en el submenú de Archivo del formulario (Figura 2) y envío a los destintarios
habituales y al administrador de las BD.
3. Recepción del mensaje por los destinatarios en vista HTML y también como fichero .xml adjunto.
4. Selección por el administrador de la BD de la opción Enviar (Figura 1), en el formulario .xml abierto en Microsoft
Office InfoPath 2007, produciéndose automáticamente la actualización de la BD correspondiente.
Optamos por el procesamiento manual de los datos incluidos en los formularios, lo que significa que la operación de
exportación para transferir los datos recopilados a la BD de destino se inicia manualmente, según el punto 4 del procedimiento
descrito anteriormente. De haber escogido el procesamiento automático de las respuestas, cuando estas llegan al buzón de
entrada Outlook y Access funcionan conjuntamente, para exportar el contenido de los formularios de cada una de las
respuestas a la BD. Este procesamiento automático ahorra tiempo y esfuerzo considerables, pero deben cumplirse un conjunto
de condiciones en el momento de llegar las respuestas al buzón de entrada, para que estas puedan ser exportadas
correctamente y el proceso de actualización ocurra sin dificultad. Por esta razón se decidió escoger el método manual de inicio
de la operación de exportación y que fuera el administrador de las BD quien realizara la acción y no el personal que emite el
RL.
La BD Componentes, mostrada en la Figura 3, se actualiza con el envío del formulario de la Figura 1.
La Figura 4 muestra una imagen de la BD relacional Diagnosticadores. Esta BD está compuesta por tres tablas.
Diagnosticadores liberados y Detalles de envío son las tablas principales. La tercera tabla, Órdenes de Compra, permite
establecer las relaciones entre las dos anteriores.
48
Figura 1: Vista del formulario para la emisión del RL de
componentes.
Figura 2: Vista del submenú Archivo en el formulario de la Figura
1, donde aparece la opción de envío a destinatarios por correo
electrónico.
.
Figura 3: Vista de la BD Componentes. Acumula más de 1000 registros en casi dos años de explotación del sistema.
Figura 4: Vista de la BD relacional Diagnosticadores. Acumula aproximadamente 500 registros en casi dos años de explotación del sistema.
49
Implementación de un sistema documental como parte de la estrategia de gestión de los desechos
generados en el CIGB
Miriam Elena Cisneros Palacio1, Yamilet Córdova Morales2, Inés Heredia Revilla2, Ilena García Martínez2 y Carlos García Sánchez3.
1
. Departamento de Higiene y Seguridad Industrial, Dirección de Producción, CIGB.
2.
Dirección de Aseguramiento de la Calidad, Dirección de Calidad, CIGB.
Uno de los puntos críticos en toda la actividad biotecnológica es la adopción de métodos para una gestión eficaz de los
desechos que permitan disminuir cualquier impacto negativo sobre las personas y el medio ambiente. Para dar cumplimiento a
las exigencias ambientales vigentes relacionadas con las actividades industriales en el área de la biotecnología deben
establecerse sistemas eficientes de gestión basados en procedimientos operacionales documentados, que cubran tanto las
operaciones generadoras de desechos clasificados como peligrosos. El presente trabajo describe la implementación de un
sistema documental estructurado para la gestión de desechos, aplicado por 10 años en el CIGB. Para el diagnóstico inicial se
seleccionaron las unidades productivas ubicadas en la planta de producción, donde se obtienen los Ingredientes Farmacéuticos
Activos (IFAs). Para determinar la complejidad de los desechos generados se utilizó el método de evaluación de riesgos,
descrito en el Manual de Prevención de Residuos Peligrosos para la pequeña y mediana industria de Valencia (IMPIVA);
posteriormente se confeccionaron procedimientos generales que describen las acciones establecidas para la gestión de
desechos generados en procesos biotecnológicos (a pequeña o gran escala), para condiciones normales y para desviaciones en
tales condiciones. Nos permite contar por primera vez con un sistema documental auditable y con trazabilidad, conformado
por un conjunto de procedimientos y acciones que abarcan la variedad en la forma de presentación y contenido de los
desechos generados de los procesos biotecnológicos del CIGB y que cumplen con lo establecido en las regulaciones vigentes.
Palabras clave: Gestión de desechos, desechos peligrosos, medio ambiente.
Introducción
La política y estrategia ambiental del CIGB está encaminada a lograr que sus productos tengan una alta calidad y se generen a
partir de producciones limpias, siendo de interés el diseño, implantación y mantenimiento de un sistema de gestión ambiental
según las normas ISO 14000 para garantizar una protección ambiental sobre la base del mejoramiento continuo (1,2). El
ámbito regulatorio internacional hace que una de las ventajas competitivas de las empresas sea la certificación de sus
producciones por organizaciones reguladoras internacionales, lo cual es un reflejo de la calidad de sus productos y la
preocupación de la empresa por preservar el medio ambiente. Este hecho favoreció que surgiera internacionalmente del
sistema de normas ISO, una guía metodológica para las empresas y los países que quieren adoptar sistemas de calidad (ISO
9001) y gestión ambiental (ISO 14 000) (2,3).
El sistema de gestión ambiental incluye todos aquellos aspectos inherentes a la empresa que puedan impactar el medio
ambiente. Su introducción y puesta en práctica no supone necesariamente, por sí sola, una reducción del impacto
medioambiental, ya que se prevé cierta mejora como consecuencia de un enfoque estructurado y lógico, pero hay que tener en
cuenta que su utilización contribuye a alcanzar sus metas ambientales y económicas, así como establecer y evaluar los
procedimientos que den solución a su política y objetivos ambientales. Este sistema además, debe contener resultados
medibles y estar documentado de manera que se puedan controlar los aspectos ambientales de la organización e incidir en
ellos para el perfeccionamiento continuo (4).
Dentro de la empresa los procesos productivos constituyen los sistemas críticos debido fundamentalmente a los volúmenes de
trabajo que se generan, por lo que en una primera etapa se debe identificar y resolver el posible impacto ambiental de estos
procesos (entradas y salidas) a través de una evaluación y gestión de riesgos bien documentada. Para lograr el éxito de
cualquier sistema de gestión ambiental debe establecerse una gestión estructurada de los residuales que se generen, debe
contarse con un sistema documental donde se describan las medidas de prevención, minimización, separación, manipulación,
almacenamiento, tratamiento, reutilización, transporte y destino final de los residuos generados por el proceso biotecnológico
a pequeña y gran escala (5).
La Regulación No 16:2006 del CECMED con relación al tratamiento de desechos generados en los procesos productivos de
las empresas de fabricación de medicamentos plantea entre otras cosas, que deben establecerse los requisitos, procedimientos
50
y otras especificaciones que deben cumplirse en el desarrollo de actividades que originen emisiones o depósitos susceptibles
de producir daños al medio ambiente (6).
Este trabajo tuvo su punto de partida, la concepción de un sistema documental para la manipulación, clasificación,
evacuación, tratamiento y disposición final de residuales, conformado por un conjunto de procedimientos y acciones que
abarcan la variedad en la forma de presentación y contenido de los desechos generados de los procesos biotecnológicos del
Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología.
Para el diagnóstico inicial se seleccionó la Dirección de Producción (DP) del Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología
por realizarse en ellas todas las producciones para la obtención de Ingredientes Farmacéuticos Activos (IFAs).
La determinación de la complejidad de los desechos generados en las diferentes unidades productivas fue elaborada a partir de
la evaluación de riesgos descrita en el informe técnico “Metodología para la evaluación de los riesgos inherentes al manejo de
desechos de la industria biotecnológica” (7, 9).
Partiendo del PPO 4.26.030.94 “Manipulación general de los desechos en laboratorios y áreas de producción del CIGB” (no
vigente), se redactaron una serie de procedimientos generales que describen las medidas de prevención, minimización,
separación, manipulación, almacenamiento, tratamiento, reutilización, transporte y tratamiento, de los desechos generados por
un proceso biotecnológico (pequeña o gran escala), para condiciones normales y para desviaciones en tales condiciones (8).
En cada uno de los documentos generados se establecen las responsabilidades y obligaciones de todo el personal involucrado
(directivos, auditores y empleados) dentro del sistema y se describen los métodos utilizados para una gestión eficaz de los
desechos. Es una documentación auditable y trazable en correspondencia a la regulación vigente (Figura 1). (6).
Figura 1. Diagrama del Sistema de documentación que se establece para el manejo de residuales en la Dirección de Producción del Centro
de Ingeniería Genética y Biotecnología.
1. PPO 4.29.036.00 PPO Procedimiento para la recogida de residual sólido de las áreas de producción (Anexo 1).
Este documento es aplicable de todos los desechos sólidos (biológicos y comunes) generados durante los procesos de
producción de cada área. Su aplicación permite: realizar la clasificación “in situ” del residual sólido (común y biológico),
registrar frecuencia de generación y evaluar el consumo de combustible, energía y emisiones a la atmósfera por concepto de
incineración.
51
2. PPO 4.29.033.00 Procedimiento para la incineración de cadáveres de animales (Anexo 2).
Permite registrar la incineración de los cadáveres de animales mayores o menores de experimentación y/o consumo, ubicados
en las áreas de animales estabulados del Bioterio.
3. PPO 4.29.031.98 Procedimiento organizativo previo a la destrucción de productos (Anexo 3).
Aplicable a materias primas y materiales de entrada, productos intermedios, cepas, bancos celulares de primario y de trabajo
en proceso y producto final, graneles, material de envase (primario y secundario), productos ubicados en cámaras frías
pertenecientes al área de Comercialización y ensayos clínicos, productos ubicados en almacenes, muestras generadas por los
laboratorios de Estabilidad y Patrones, placebos, materiales y muestras generadas por los laboratorios analíticos, materiales y
otros productos que requieran de destrucción ubicados en otras áreas de la institución, que hayan sido declarados rechazados o
estén vencidos, retirados o devueltos.
Su aplicación permite:
•
Dar cumplimiento al principio de Cierre de los ciclos de vida de los productos.
•
Establecerlo como un indicador importante de la eficiencia productiva a partir de la cuantificación de las pérdidas de
producto y costos por concepto de perdidas.
•
Tomar acciones correctivas sobre las principales causas que produjeron pérdidas por concepto de tratamiento de
productos que se convierten en residuales para accionar sobre ellos, aspecto importante dentro de la gestión de la
empresa.
4. PPO 4.29.032.00 Procedimiento para las destrucciones de productos (Anexo 4).
Complementa el PPO 4.29.031.98, ya que en el se describen los métodos para la destrucción de los productos declarados
vencidos, rechazados o declarados no conformes, etc., que son declarados previamente en el SIC-0830 para su destrucción
Ventajas del sistema con respecto a la forma anterior de emisión, almacenamiento y consulta de los RL
•
Los formularios son muy cómodos de usar facilitando el trabajo con opciones como: selección de texto a partir de una
lista, selección de fechas de un calendario y autocompletar. Esto evita errores en el proceso de llenado de los mismos.
•
Las restricciones que se imponen a los campos del formulario (propiedades, tipo de datos: texto, #, fecha,
autonumérico, etc) limitan su posible contenido y evitan de esta manera la ocurrencia de errores, frecuentes cuando se
introduce gran cantidad de información por teclado.
•
La obligatoriedad impuesta en el llenado de los campos de los formularios evita su omisión por error.
Por las razones anteriores el almacenamiento de los RL en formato .xml o de BD, actualizada a partir de los formularios,
resulta más seguro y confiable en cuanto a integridad y calidad de la información, que un texto introducido por teclado en
cualquier editor de texto.
•
El empleo de claves principales que identifican los registros de manera única en las BD previene la duplicación de
información en las mismas, o la repetición de información en campos no permitidos, como pudiera ocurrir en el sistema
anterior de generación y almacenamiento de RL: repetición de un # de registro de entrada de MPA o de un # de RLD.
•
El GBD empleado es muy fácil de usar, por lo que puede ser explotado por un usuario común, con las ventajas que
ofrece el arreglo de datos en BD. Permite el almacenamiento de grandes volúmenes de información, con posibilidad de
consultar de manera rápida la de interés mediante el filtraje rápido, consulta dirigida por campo de interés, entre otras.
Esto facilita por ejemplo la tarea de realización de consultas para el autorizo de las OP de MPP, componentes y
diagnosticadores. Además, el formato de almacenamiento es compatible con otros existentes, permitiendo importar y
exportar datos desde y hacia éstos, lo que le imprime flexibilidad a la plataforma. Otra ventaja consiste en la posibilidad
que da de generar informes de gran calidad a partir de la información almacenada.
•
El almacenamiento de los RL en BD compartidas como carpeta en red, que es la forma más simple de compartir datos y
resulta suficiente para el propósito nuestro, permite mayor accesibilidad a la información y un mayor número de usuarios
beneficiados con su consulta.
52
•
Por último, muchas de las ventajas anteriores implican un beneficio para el operario, que se traduce en más eficiencia.
Conclusiones
Como mismo el aseguramiento de la calidad se ha convertido en un elemento diferenciador, ligado a la necesidad de las
organizaciones de demostrar que sus productos y servicios poseen cualidades distintivas, la carencia de buenos sistemas de
información, seguimiento y control de resultados se incluye entre los factores internos de las empresas que atentan contra la
mejora continua.
Como resultado de este trabajo fue posible, sin esfuerzo adicional al normalmente desplegado en la confección de los RL
tradicionales y empleando los soportes humanos, lógicos y físicos existentes en nuestros departamentos de aseguramiento de
la calidad, actualizar de manera automática y sistemática las BD creadas, que permiten a los compañeros de Control de
Calidad llevar el control de las materias primas, componentes y diagnosticadores producidos en nuestro centro.
El sistema desarrollado resulta ventajoso con respecto a la forma anterior de emisión y almacenamiento de los RL, evitando
errores humanos en su generación; por lo que implica mayor eficiencia para el operario y una mayor confiabilidad y seguridad
de la información. Adicionalmente facilita el trabajo del operario por humanización de la tarea a realizar, permite una mayor
accesibilidad a la información almacenada y posibilita la generación de informes con una mayor calidad.
Referencias
1.
2.
3.
4.
5.
http://es.wikipedia.org
Norma ISO 9001: 2008. Alineación con la Norma ISO 9001: 2000.
Collen MF. The origins of informatics. J Am Med Inform Assoc 1994;1(2):91-107.
Ayuda de Microsoft Office Access 2007.
Víctor Hugo Dorantes González y colegas. Curso de Bases de Datos y PostgreSQL. México, abril 2001.
53
Anexo 1. Planilla de Recogida y Clasificación del residual sólido de las áreas de producción.
CENTRO DE INGENIERÍA GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA SIC‐0881 DIRECCIÓN DE PRODUCCIÓN Edición 02 PLANILLA DE RECOGIDA Y CLASIFICACIÓN DEL RESIDUAL SÓLIDO DE LAS ÁREAS DE PRODUCCIÓN Fecha Hora de recogida Área Folio: Página 1 de 1 Nº Bolsas Biológico Nº Bolsas Común Nº Bolsas de Biomasa Observaciones: REALIZADO POR: FIRMA: CARGO: FECHA: / / REVISADO POR: FIRMA: CARGO: FECHA: / / APROBADO POR: FIRMA: CARGO: FECHA: / / PPO 4.29.036.00 54
Anexo 2. Solicitud de destrucción de cadáveres de animales.
CENTRO DE INGENIERÍA GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA DIRECCIÓN DE PRODUCCIÓN SOLICITUD DE DESTRUCCIÓN DE CADÁVERES DE ANIMALES No. de Solicitud: Especie Cantidad SIC‐0868 PPO 4.29.033.00 Edición 03 Folio: Página 1 de 1 Fecha de solicitud: No de lote Centro: Causa de muerte Inoculado (Sí o No) Tipo de inóculo: Fecha de la última inoculación: Valoración de la epizootiología: Observaciones: Recibido por: Fecha: Hora: Firma: SOLICITADO POR: FIRMA: CARGO: FECHA: AVALADO POR: FIRMA: CARGO: FECHA: 55
/ / / / IV Taller de Calidad del Polo Científico
Anexo 3. Registro de destrucción de cadáveres de animales.
CENTRO DE INGENIERÍA GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA SIC‐0832 PPO 4.29.033.00 DIRECCIÓN DE PRODUCCIÓN Edición 03 Folio: REGISTRO DE DESTRUCCIÓN DE CADÁVERES DE ANIMALES Página 1 de 1 Nº de Solicitud: Fecha de solicitud: Centro: Especie Cantidad No de lote Motivo de la destrucción Inoculado (Sí o No) MÉTODO DE DESTRUCCIÓN Incineración: PPO 4.29.032.00 Enterramiento: Fecha de destrucción: Hora comienzo: Otros: Hora terminación: Observaciones: REALIZADO POR: FIRMA: CARGO: FECHA: APROBADO POR: FIRMA: CARGO: FECHA: 56
/ / / / IV Taller de Calidad del Polo Científico
Anexo 4. Registro de destrucción de productos.
CENTRO DE INGENIERÍA GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA SIC‐ 0830 PPO 4.29.031.98 DIRECCIÓN DE PRODUCCIÓN Edición 07 Folio: REGISTRO DE DESTRUCCIÓN DE PRODUCTOS Página 1 de 1 No. de Solicitud: Fecha de Solicitud: Área: Producto Clasificación Presentación No. de lote Cantidad Volumen Motivo de la destrucción Vencido: Rechazado: Deteriorado: Devuelto: Retirado: Otros: Proveniente de No Conformidad: Código: ‐ Proveniente de Queja: ‐ Código: ‐ Proveniente de Acción Rápida: ‐ Código: ‐ Proveniente de Devolución: ‐ Código: ‐ Proveniente de Retirada: ‐ Código: ‐ Observaciones:
SOLICITADO POR: CARGO: REVISADO POR:
CARGO:
FIRMA: FECHA: Incineración: / / FIRMA:
FECHA:
Cuantificación de las pérdidas REALIZADO POR: CARGO: Método de destrucción Inactivación química: Esterilización: FIRMA: FECHA: Trituración: / /
Valor : _____________ / / PPO 4.29.032.00 Dilución: Otros: Observaciones:
REVISADO POR: CARGO: APROBADO POR: CARGO: 57
FIRMA: FECHA: FIRMA: FECHA: / / / / IV Taller de Calidad del Polo Científico
Implantación de un sistema de costos totales de la calidad
Caridad Huete Argota, Andro Vergel Gutierrez
Empresa Laboratorios AICA. Ave 23 e/ 268 y 270. San Agustín, La Lisa.
Email: [email protected].
En el proceso de mejora continua del sistema de calidad es necesario saber qué se debe mejorar mediante la cuantificación en
términos monetarios de los costos de calidad. Podemos afirmar que la reducción de los mismos es una manera de incrementar
beneficios en la organización. Basado en lo anterior, se propuso como objetivo en este trabajo diseñar una metodología para
implantar un sistema de costos totales de calidad en la empresa Laboratorios AICA. Para ello se estudió y aplicó la Norma
ISO 10014:2006; los elementos que integran los costos de calidad y los métodos para calcularlos, así como la metodología
para establecer los pasos de la implantación del sistema de costos totales de calidad según varios autores. Se pudo comprobar
que la empresa está en un estado óptimo para lograr implantar el sistema y que debe priorizar acciones referidas a mejorar las
“relaciones mutuamente beneficiosas con el proveedor” y en el “enfoque basado en procesos”. Se escogió el enfoque basado
en procesos para identificar los costos de conformidad y de no conformidad relacionados. No se pudo determinar el costo de
cada tarea asociada ni realizar el cálculo de los costos totales de calidad, pues estos actualmente no se encuentran clasificados
como tal. Finalmente se diseñó el plan de acción para implantar el sistema de costos totales de calidad en nuestra Empresa.
Palabras clave: Costos totales de calidad, mejora, implantar.
Introducción
Se entienden como costos de calidad aquellos incurridos en el diseño, implementación, operación y mantenimiento de los
sistemas de calidad de una organización, aquellos costos de la organización comprometidos en los procesos de mejoramiento
continuo de la calidad y los costos de sistemas, productos y servicios frustrados o que han fracasado al no tener en el mercado
el éxito que se esperaba (1,2).
Los Costos de Calidad forman parte integral del costo de producción, tradicionalmente estos se encuentran dentro del estado
de pérdida y ganancia de una empresa, los que no se cuantifican por separados para poder aplicar las medidas correctivas
(3,4).
Existen numerosas ventajas asociadas al cálculo de los costos totales de la calidad, entre las que podemos mencionar que
proporciona una entidad manejable, una visión única de la calidad, un sistema de prioridades para los problemas y la manera
de distribuir correctamente el costo de la calidad para obtener máximos beneficios; además mejora el uso eficaz de los
recursos, la rentabilidad, los ingresos y nos brinda una medida de las mejoras realizadas; también mejora el desempeño, la
credibilidad y sostenibilidad de la organización. El costo de calidad cumple una finalidad única al ser utilizado como
herramienta de la administración destinada a enfocar la atención sobre la dirección por la calidad (5,6).
Para mantener un buen desempeño económico, las organizaciones necesitan emplear sistemas de la calidad cada vez más
eficientes, encaminados a minimizar las mermas, reprocesos, devoluciones y quejas, previniendo los errores y cumpliendo los
requerimientos del cliente dentro de un marco de productividad, costo y tiempo que garantice las utilidades de las mismas
(7, 2). Tomando en cuenta los criterios anteriores se propuso como objetivo en este trabajo, diseñar una metodología para la
implantación de un sistema de costos totales de la calidad en la empresa Laboratorios AICA.
Para el análisis y el cálculo de los costos con vistas a diseñar la metodología para implantar el sistema, se realizó una amplia
búsqueda bibliográfica y se trazó la línea siguiente:
1. Estudio y aplicación de la Norma ISO 10014:2006 (cuestionario para la autoevaluación inicial y diagrama RADAR) (8).
2. Determinación de los diferentes elementos que integran los costos de la calidad (de conformidad y no conformidad) (9,6, 7).
a) Costos de prevención:
‐
‐
‐
Revisión del diseño.
Calificación del producto.
Revisión de los planos.
58
‐
‐
‐
‐
‐
‐
‐
‐
‐
Orientación de la ingeniería en función de la calidad.
Programas y planes de aseguramiento de la calidad.
Evaluación de proveedores.
Capacitación a proveedores sobre calidad.
Revisión de especificaciones.
Estudios sobre la capacidad y potencialidad de los procesos.
Entrenamiento para la operación.
Capacitación general para la calidad.
Auditorías de calidad y mantenimiento preventivo.
b) Costos de evaluación:
‐
‐
‐
‐
‐
‐
‐
‐
‐
Inspección y pruebas a materias primas, material de envase, productos terminados, desinfectantes y otros.
Análisis del cumplimiento con las especificaciones.
Vigilancia de proveedores.
Actividades para la aceptación del producto.
Aceptación del control del proceso.
Inspección de embarque.
Estado de la medición y reportes de progreso.
Calibración de equipos de pruebas e inspección.
Revisión de la documentación.
c) Costos por fallos internos:
‐
‐
‐
‐
‐
‐
Mermas.
Rediseño, reprocesos, retrabajos.
Ordenes de cambio para Ingeniería o para Compras.
Costos de reparaciones.
Productos fuera de especificaciones.
Rechazos y destrucciones de materias primas y productos terminados.
d) Costos por fallos externos:
‐
‐
‐
Asuntos con los clientes (reclamaciones, demandas, atención de quejas, negociaciones, etc.).
Errores en las especificaciones dadas por el cliente, de facturación e instrucciones del producto.
Producto maltratado durante el transporte.
3. Búsqueda de métodos para el cálculo de los costos de calidad relacionándolos con una base que representa un nivel de
actividad determinado en un periodo establecido (10,5).
4. Análisis de diferentes metodologías para establecer los pasos de la implantación de un sistema de costos totales de la
calidad según Harrington, Oriol Amat, Carlos Colunga Dávila y Arturo Saldierna Gómez (1, 6).
Primeramente se realizó el cuestionario para la autoevaluación inicial que aparece en la Norma ISO 10014:2006, el cual
proporciona una primera visión general de la madurez de la organización y es la herramienta de selección clave para
determinar el apartado más apropiado para priorizar las acciones de mejora. Este cuestionario se aplicó entre cinco
trabajadores (directivos y técnicos) de la empresa con gran experiencia y conocimiento para finalmente llegar a un consenso
de puntuación media según los niveles de madurez establecidos en la norma.
Para reflejar los resultados de la autoevaluación se empleó el diagrama RADAR, mostrado en la Figura 1, pudiendo decir que
la empresa se encuentra en un estado óptimo para lograr la implementación de este sistema. No obstante, sugerimos que el
principio de la gestión más apropiado para determinar las acciones de mejora son las “relaciones mutuamente beneficiosas con
el proveedor” y en el “enfoque basado en procesos” que alcanzan la menor puntuación media asignada.
Por otro lado, los costos del aseguramiento interno o costos operativos de la calidad, como también suelen llamarse, se pueden
clasificar en dos tipos (1,3).
59
Costos de conformidad: aquellos costos en que se incurre para satisfacer todas las necesidades declaradas e implícitas de los
clientes en ausencia de fallos en el proceso existente (asociados para evitar fallos y para comprobar la calidad existente). A su
vez se clasifican en costos de prevención y de evaluación.
Costos de no conformidad: aquellos costos en que se incurre debido a fallos en el proceso existente. Constituidos por fallos
internos (antes de la venta) y externos (una vez entregados al cliente.
5 Enfoque al cliente
Relaciones mutuamente beneficiosas con el
proveedor
4
3
Liderazgo
2
1
Enfoque basado en hechos para la toma
de decisión
Participación
0
d l
l
Enfoque basado en procesos
Mejora continua
Enfoque del sistema para la
gestión
Figura. 1: RADAR. Resultado de la autoevaluación (puntuación media).
Como vimos anteriormente, a través de los resultados del diagrama RADAR se llegó a la conclusión de que nuestra empresa
debe priorizar las acciones referidas a mejorar las “relaciones mutuamente beneficiosas con el proveedor” y en el “enfoque
basado en procesos”. Ambos principios son muy importantes pero se decidió escoger el enfoque basado en procesos de forma
general, para identificar preliminarmente, los costos de conformidad y de no conformidad asociados a este como se muestran
en la Tabla 1, pues un resultado deseado resulta más eficiente cuando las actividades y los recursos implicados se gestionan
como un proceso. Por otra parte, para seleccionar la oportunidad de mejora y garantizar el éxito de este principio de gestión y
la integración de los mismos se sugirió aplicar la metodología planificar-hacer-verificar-actuar (PHVA). Esta herramienta
permite a la alta Dirección evaluar los requisitos, planificar las actividades, asignar los recursos apropiados, implementar
acciones de mejora continua y medir los resultados con el fin de determinar su eficacia (8,10).
Tabla 1. Costos de Conformidad y de No Conformidad asociados al “enfoque basado en procesos”.
Costos de Conformidad y No
Conformidad
Prevención
Evaluación
Fallos internos
Fallos externos
Enfoque basado en procesos.
Tareas asociadas
Ingeniería de la Calidad.
Calificación del personal.
Auditorías de la Calidad.
Análisis del la capacidad del equipo y del proceso.
Análisis de las materias primas y material de envase.
Inspecciones en el almacén de productos terminados.
Control de proceso.
Ensayos de control de calidad y microbiológico a los
productos terminados.
Lotes destruidos por contaminación.
Reprocesamientos.
Paralizaciones de la producción por desperfectos.
Mermas.
Devoluciones de los clientes.
Ajustes por quejas y reclamaciones.
Maltrato de los productos en la transportación.
Tratamiento de las reclamaciones.
60
Estos costos se pueden calcular relacionándolos con una base que representa un nivel de actividad determinado en un periodo
establecido, por ejemplo, en base a los costos de producción, las ventas que se pueden ver afectadas por variaciones en la
política de precios, el salario pero que se modifica por afectaciones en las políticas salariales y también en relación a bases de
tipo numéricas, siendo estas los números de unidades fabricadas o vendidas, el número de horas de producción directa o el
número de empleados (3, 10).
Es válido aclarar que nuestra empresa realiza y lleva todas las cuentas de los gastos incurridos por cada centro de costo, pero
estos no están identificados según el término costos de calidad, por lo que en estos momentos no podemos brindar una
información completa sobre el costo de cada tarea asociada que se describe en la Tabla 1, ni por tanto realizar el cálculo de los
costos totales de calidad en base a una actividad determinada. Sin embargo, todo lo anterior sirvió de base para proponer un
programa de trabajo conjunto entre la Dirección de Aseguramiento y Control de la Calidad (DACC) y la Dirección de
Economía, que permita completar este análisis e implementar el sistema de costos totales de la calidad. Para ello se trazó un
plan de acción que comprende los pasos siguientes:
1- Crear un grupo de trabajo integrado por la DACC y la Dirección de Economía.
2- Capacitar al personal y establecer las funciones de cada integrante del equipo de trabajo.
3- Escoger el área donde se va a realizar la prueba piloto para comenzar con el programa.
4- Identificar, clasificar y organizar dentro del sistema de costos actual los que corresponden a costos de calidad.
5- Presentar el proyecto a la alta Dirección para que sea aprobado el mismo.
6- Comenzar con la evaluación de los costos de calidad en el periodo de prueba y revisar los informes de costos trimestrales.
7- Implementación del programa a todas las áreas de la empresa, modificándolo según la experiencia en caso de ser necesario.
Conclusiones
1.
A través del cuestionario inicial y el diagrama RADAR, según la Norma ISO 10014:2006, se estableció que el principio
de la gestión más apropiado para determinar las acciones de mejora son las “relaciones mutuamente beneficiosas con el
proveedor” y en el “enfoque basado en procesos”.
2.
Se lograron identificar de forma preliminar los costos de conformidad y de no conformidad asociados al enfoque basado
en procesos.
3.
No se pudo realizar el cálculo del costo relacionado con cada tarea para obtener un valor, ni por tanto realizar el cálculo
de los costos totales de la calidad, debido a que estos no están identificados actualmente según el término costos de la
calidad en nuestra empresa.
4.
Se estableció el plan de acción para implementar el sistema de costos totales de la calidad, pues la empresa se encuentra
en un estado óptimo para lograrlo.
Referencias
5.
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7.
8.
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10.
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Las normas de la familia ISO 9000. Aplicación práctica. Folleto de texto. ININ. Cuba, 1996.
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Juran J. Handbook. 4ed. New York: McGraw-Hill; 1990:1-30, 1-46.
Barrie D, Plunkett J. Quality Costing. London, U.K., 1992.
Norma ISO 10014:2006. Gestión de la Calidad- Directrices para la obtención de beneficios financieros y económicos.
Rodríguez E, Cisneros X, Grau S, Pérez M. Evaluación de los costos de la calidad en la Empresa Farmacéutica " 8 de Marzo".
SINTEFARMA 2000; 6(1).
Juran J, Gryna F. Análisis y planeación de la calidad. 3ed. México; 1995.
61
PRODUCCIÓN
Validación del proceso de producción del HBsAg como IFA de las vacunas Heberbiovac HB y
Heberpenta
Ivonne Rodríguez Lima, Elías Nelson Rodríguez García, Yeny de la Torre Moya, Yoel A. Madruga González, Carlos Basilio Martínez
Laporte, Francis Hernández Coro y cols.
Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, Ave 31 entre 158 y 190, Cubanacán, Playa.
La producción del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg), como ingrediente farmacéutico activo
(IFA) para la producción de vacunas fue establecida en la Planta # 1 del Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología
en 1991. Desde el año 2000 esta producción fue evaluada y certificada por la Organización Mundial de la Salud para ser
suministradores de la UNICEF. En el 2008 se reestructuró la estrategia de validación de esta producción y se creó un
protocolo de validación del proceso, que incluye los aspectos siguientes: calificación del desempeño de los sistemas
tecnológicos, demostración de la consistencia del proceso de producción, caracterización específica de cada paso,
remoción de impurezas del proceso y demostración del tiempo de vida útil de los geles cromatográficos. A finales del
2008 se realizó el mantenimiento general de las instalaciones y a la arrancada de la producción se ejecutó la calificación
de los sistemas tecnológicos. En los tres primeros lotes de la campaña 2009 se tomaron muestras adicionales para la
caracterización específica de cada paso y la remoción de impurezas del proceso; además, se demostró la consistencia por
el cumplimiento de los límites establecidos como puntos de control e inspección y las características de calidad del IFA.
La validación demostró que la combinación de los diferentes pasos del proceso permite reducir las impurezas y obtener
consistentemente un IFA que cumple con sus atributos de calidad.
Palabras clave: Validación de proceso, HBsAg, vacuna antihepatitis B.
Introducción
El antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) constituye el principio activo de la vacunas Heberbiovac
HB y Heberpenta. El HBsAg es una proteína producida por vía recombinante en la levadura Pichia pastoris.
El proceso de producción del HBsAg consta de tres etapas esenciales: fermentación, recobrado y purificación final. En la
etapa de fermentación se logra el crecimiento de la levadura Pichia pastoris y la expresión del HBsAg, de forma
intracelular. En los pasos de recobrado se incluyen: la cosecha y lavado de la biomasa, la ruptura celular, la precipitación
ácida de la crema rota y la centrifugación, con el objetivo de separar la proteína de interés del resto de los componentes
celulares y de impurezas propias del metabolismo de la levadura. Los pasos de purificación tienen como objetivo
disminuir los niveles de impurezas, hasta valores aceptables para un producto inyectable.
La validación es la evidencia documentada de que un proceso es capaz de producir consistentemente un producto con los
atributos de calidad requeridos para su uso, con el objetivo de garantizar la seguridad y protección de los usuarios.
Cuando se trata de productos farmacéuticos esta es una exigencia regulatoria y constituye un requisito indispensable para
la obtención de la licencia de producción. Las inspecciones de Buenas Prácticas de Fabricación realizadas por los
organismos regulatorios nacionales e internacionales exigen la validación como una demostración de garantía de calidad
del producto.
Se realizó la validación concurrente del proceso en tres lotes consecutivos a escala industrial, teniendo en cuenta los
siguientes aspectos:
•
•
Controles del proceso: Se tomaron muestras de cada paso del proceso para cuantificar la concentración de HBsAg
por ELISA, el rendimiento de HBsAg y el recobrado de cada paso del proceso.
Puntos de inspección: Se evaluó el cumplimiento de los límites establecidos como puntos de inspección del proceso:
nivel de contaminación microbiológica al final de la fermentación (FER) y la crema lavada, rendimiento de HBsAg
en fermentación, concentración de HBsAg en el sobrenadante de la precipitación ácida, pureza por electroforesis en
el pool de eluatos de la cromatografía de inmunoafinidad (IAF), nivel de contaminantes en el eluato de intercambio
iónico positivo y perfil cromatográfico en HPLC.
62
• Controles de calidad del IFA: Se analizó el cumplimiento de los límites especificación para los controles de calidad
del IFA: Pureza por electroforesis, contenido de carbohidratos, lípidos, proteínas de levadura, ADN, IgG munino y
tiocianato de potasio.
• Remoción de impurezas del proceso: Se evaluó el nivel de remoción de carbohidratos, lípidos, proteínas de levadura,
ADN, IgG murino y tiocianato de potasio, en los diferentes pasos del proceso.
Se determinó el tiempo de vida útil de la resina cromatográfica empleada en el paso de cromatografía de inmunoafinidad.
Mediante validación retrospectiva se evaluó el desempeño de cinco inmunoadsorbentes utilizados en un año de trabajo,
evaluando el comportamiento del recobrado del paso, la pureza del producto obtenido y el contenido de IgG murino.
Puntos de inspección y controles de proceso
Los tres lotes estudiados en la validación del proceso cumplieron los límites establecidos como puntos de control e
inspección. El recobrado por pasos tuvo un comportamiento similar en los tres lotes (Figura 1). Las mayores pérdidas de
HBsAg están en los pasos de precipitación (SH) y en adsorción-desorción en tierras de diatomeas (ADS). Estos
resultados son similares a los reportados por Hardy en el año 2000 (1).
% g HBsAg vs
Fermentación
Lote 1
Lote 2
Lote 3
FER: Fermentación,
RUP: Ruptura celular,
SH: Precipitación ácida,
ADS: Adsorción-Desorción,
CCT: Concentración-Diafiltración,
IIN: Intercambio Iónico Negativo,
IAF: Inmunoafinidad,
TTA: Tratamiento térmico,
DES: Desalinizado,
IIP: Intercambio Iónico Positivo,
DIF: Concentración-Diafiltración,
HPLC: Cromatografía líquida de
resolución,
IFA: Ingrediente Farmacéutico Activo
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
FER
RUP
SH
ADS
CCT
IIN
IAF
TTA
DES
IIP
DIF
HPLC
IFA
Pasos del Proceso
alta
Figura 1. Recobrado de HBsAg en los diferentes pasos del proceso
Proceso de fermentación: Los tres lotes tuvieron diferente tiempo de fermentación, entre 120 y 150 horas (Tabla 1). El
Lote 1 fue el de menor tiempo de fermentación y por tanto menor cantidad de biomasa, pero el rendimiento y la
productividad fue similar al resto de los lotes. Para todos los parámetros analizados el coeficiente de variación fue menor
del 10%, lo que evidencia la reproducibilidad entre los lotes.
Tabla 1. Caracterización específica del paso de fermentación
Parámetros
Tiempo de Fermentación (h)
Cantidad de biomasa (kg)
Rendimiento
(g biomasa/ g glicerol) (g
biomasa/ g metanol)
Productividad
(kg biomasa/L.h)
Productividad
(g HBsAg/L.h)
Límites
120 - 150
≥ 500
Lote 1
127,00
636,66
Lote 2
148,00
694,99
Lote 3
139,34
697,80
Media
138,11
676,48
Desviac
10,55
34,52
CV (%)
7,64
5,10
≥ 0,18
≥ 0,65
0,25
0,85
0,22
0,79
0,21
0,82
0,23
0,82
0,02
0,03
8,21
3,50
≥ 4,00
5,01
4,70
5,01
4,91
0,18
3,70
≥ 0,30
0,34
0,38
0,36
0,36
0,02
4,89
Adsorción-desorción en tierras de diatomeas (ADS): La capacidad del adsorción fue mayor del 97% y la elusión
estuvo entre 50% y 70%; similar a los resultados reportados por Agraz y col. en 1993 (2).
63
Concentración por ultrafiltración (CCT): No se detectó HBsAg en el permeado del paso de concentración y el flux fue
superior al 60% del valor inicial durante todo el proceso. Estas variables demuestran un buen desempeño de este paso.
Cromatografía de inmunoafinidad: La capacidad de adsorción fue superior al 75% y de elusión superior al 50%;
similar a otros reportes previos (3).
Perfil cromatográficos en HPLC analítico: Se observó que la homogeneidad del material purificado va aumentando en
la medida que avanza el proceso de purificación cromatográfica y hay reproducibilidad en los resultados de los tres lotes
(Figura 3). En el intercambio iónico negativo (IIN) la fracción correspondiente al HBsAg, con tiempo de retención de
aproximadamente 24 min, es minoritaria debido a que este es el primer paso de purificación cromatográfica. En el paso
de cromatografía de inmunoafinidad (IAF) la fracción de HBsAg se hace mayoritaria porque ya es un producto con más
de 85% de pureza por electroforesis. Estos resultados confirman que este es el principal paso en el proceso de
purificación del HBsAg. A partir del paso de concentración-diafiltración (DIF) se obtiene un perfil cromatográfico
similar al IFA.
a. IIN b. IAF c.TTA d. DES e. IIP f. DIF g. HPLC h. IFA Tiempo de retensión (min)
Tiempo de retensión (min)
Tiempo de retensión (min)
Figura 3. Perfil cromatográfico en el HPLC analítico. Condiciones: columna TSK G5000 PWXL, Flujo 0,6 mL/min, volumen de
muestra 100 μL.
Remoción de impurezas
En la Figura 4 se observa que en el paso de concentración (CCT) se remueve un logaritmo del contenido de
carbohidratos, lípidos y ADN presente en el sobrenadante de la precipitación ácida (SH). En el intercambio iónico
negativo (IIN) se remueven cuatro logaritmos del contenido de ADN, cumpliendo la función para la cual fue diseñado
este paso (4). La cromatografía de inmunoafinidad (IAF) es el paso determinante en la purificación porque reduce un
logaritmo del contenido de ADN, dos logaritmos de lípidos y de proteínas de levadura y tres logaritmos de carbohidratos;
además se eleva la pureza por electroforesis de 45 a más de 85%. El desalinizado (DES) y la concentración – diafiltración
(DIF) remueven dos logaritmos de KSCN, cada uno y un logaritmo de IgG entre los dos pasos. El intercambio iónico
positivo reduce un logaritmo de ADN y el resto de los pasos completan la remoción de trazas de estas impurezas. Estos
resultados son similares a los reportados por Hardy y colaboradores en el año 2000 (1).
Determinación del tiempo de vida útil de los Inmunoadsorbentes
Se evaluó el desempeño de los cinco inmunoadsorbentes (utilizados entre 16 y 19 ciclos), que se emplearon a escala de
producción durante el año 2008, todos los sublotes procesados tuvieron un desempeño satisfactorio, cumpliendo con los
límites establecidos como controles de proceso: pureza (≥ 80%) y de recobrado (≥ 30%). En la Figura 5 aparecen los
resultados promedio por corrida o ciclo cromatográfico para los cinco inmunoadsorbentes y se observa que el recobrado
promedio tiende a disminuir ligeramente a medida que aumenta el número de ciclos (Figura 5A). Con respecto a la
pureza se mantiene estable, sin tendencia a la disminución a medida que aumenta el número de ciclos (Figura 5B). El
64
contenido de IgG si tiene una tendencia a disminuir (Figura 5C), lo cual resulta favorable, pues esta es una impureza del
proceso.
Impurezas
(% másico)
Remoción de Impurezas
Pureza (%)
120
1.E+03
R Carb
1.E+02
100
R Lip
1.E+01
R DNA
80
1.E+00
R Lev
R IgG
60
1.E‐01
R KSCN
Pureza
1.E‐02
40
1.E‐03
20
1.E‐04
0
1.E‐05
RUP
SH
CCT
IIN
IAF
DES
IIP
DIF
HPLC
IFA
Pasos del Proceso
Figura 4. Remoción de impurezas del proceso
A
100%
Recobrado (%)
90%
80%
70%
60%
50%
C
B
100
40%
1.20
1.00
Pureza (%)
95
30%
0.80
0
85
2
4
6
8
10
Ciclo
80
IgG (%)
90
20%
12
0.60
14
16
18
20
0.40
0.20
75
0.00
70
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Ciclo
Ciclo
Figura 5. Comportamiento promedio del desempeño de los Inmunoadsorbentes por ciclo cromatográfico . A: Recobrado del proceso.
B: Pureza del producto obtenido, C: Impurezas de IgG coeluidas con el producto de interés, expresado en por ciento másico
IgG/HBsAg.
Conclusiones
Los tres lotes analizados cumplieron con los límites establecidos como controles del proceso, puntos de inspección y
características de calidad del IFA. Los resultados de la caracterización específica de los pasos de fermentación,
adsorción-desorción, concentración y cromatografía de inmunoafinidad cumplieron con los límites de aceptación
establecidos. La combinación de los diferentes pasos del proceso reduce los niveles de impurezas y permite obtener
consistentemente un IFA que cumple con las especificaciones de calidad establecidas; por tanto el proceso mantiene el
estado de validado.
65
Referencias
1.
2.
3.
4.
Hardy E, Martínez E, Diago D, Díaz R, González D, Herrera L. Large-scale production of recombinant hepatitis B surface
antigen from Pichia pastoris. Journal of Biotechnology 2000;77:157-67.
Agraz A, Quiñones Y, Expósito N, Breña F, Madruga Y, Pentón E, Herrera L. Adsorption-desorption of recombinant hepatitis B
surface antigen (r-HBsAg) from P. pastoris on diatomaceous earth matrix: optimization of parameters for purification. Biotech
Bioeng 1993;42:1238-44.
Valdés V, Medina Y, Fernández E, Geada D, Ferro W, Álvarez T, et al. Analysis of the Influence of Five Variables on an
Established Immunoaffinity Chromatography Procedure to Purify a Pichia pastoris Yeast Derived-HBsAg for Pharmaceutical
Use. Latin American Journal of Pharmacy 2008;27(6): 880-6.
Beldarrain A, Candelario M, Rodríguez J, Tejera J, Calvo Y, Madruga Y. DNA removal from a purification process of
recombinant hepatitis B surface antigen. Electronic Journal of Biotechnology 2007;10(1).
Selección de los peores casos para la validación de la limpieza de los principios activos
Olban Rafael González González , Héctor Colomé Dagneses, Adalberto Izquierdo Castro , Onán Gámes Rodríguez
Laboratorios Novatec. Ave. 15, No. 216A03 e/ 216A y 222. Atabey, Playa, C. Habana.
En este trabajo se elaboran matrices, donde se incluyen un total de 48 productos, que se producen en régimen de
campaña, en equipos no dedicados, utilizándose diferentes vías para su fabricación, con el objetivo de identificar
productos representativos, denominados peores casos. Estos productos fueron calificados por cuatro expertos escogidos
según experiencia y grado científico, los cuales evaluaron tres variables: solubilidad, toxicidad, tamaño de dosis, a partir
de un análisis tradicional de riesgo y uno de concordancia entre expertos. El número de expertos no se obtiene a priori,
sino que se calcula a partir de herramientas estadísticas, con un nivel de confianza del 95% y un por ciento de error
tolerado. Se obtuvieron los peores casos, a partir de las calificaciones de los expertos. Esto constituye en sí una
condición necesaria pero no suficiente; si no existe un consenso entre los expertos, es por ello que se realiza una prueba
de hipótesis según Kendall, para finalmente no extender la validación de la limpieza a toda la cartera de productos, sino a
12 productos más complejos y problemáticos, constituyendo estos los productos distintivos que contienen los aspectos
más críticos, como «casos más desfavorables»..
Palabras claves: Validación de la limpieza, Prueba de concordancia por Kendall, expertos.
Introducción
Laboratorios NOVATEC es una instalación destinada a elaborar formas farmacéuticas sólidas (polvos, granulados y
pellets) para la elaboración de comprimidos y el llenado de cápsulas duras de gelatina. Posee una cartera de producto
extensa con 48 formas sólidas orales, que se producen en régimen de campaña, en equipos no dedicados, utilizándose
diferentes vías para su fabricación que permiten cumplir su misión productiva con las exigencias de las autoridades
reguladoras (1,2,7) y una de estas exigencias es la de poseer validados ciertos procesos y entre ellos los procesos
encaminados a la limpieza.
La validación es una operación costosa, pero desde un punto de vista de productividad económica puede optimizarse en sí
mismo, si se aplican con ciertos criterios “ahorradores” de recursos (3).
1.
Practicar reagrupamientos de validación, experiencia muy útil en las validaciones de limpieza, solo el producto (6)
más problemático, extrapolando las conclusiones al resto de productos.
2.
Validar el caso más desfavorable de acuerdo al producto que se obtenga durante la selección, utilizando herramientas
estadísticas.
El objetivo principal de este trabajo lo constituye la selección de los peores casos para la validación de la limpieza de
productos que contienen en su formulación diversos principios activos, con características disímiles, evaluados a través
de criterios expuestos en los análisis de riesgos tradicionales y calificados mediante la utilización de herramientas
estadísticas a partir de conclusiones extraídas con expertos, con la realización de prueba de hipótesis (Kendall) para
establecer concordancia entre expertos, con la determinación finalmente de los peores casos.
66
Los cálculos se realizaron a partir de datos recopilados a través de cuatro expertos dedicados directamente en la
fabricación de formas sólidas orales, ellos laboran en áreas significativas como son: laboratorios, técnico-productivo y
departamento de investigación y desarrollo.
Se emplea el método de expertos debido a la carencia de datos estadísticos y se construyen matrices de principios activos
versus variables, tales como (Tablas 3, 4, 5): solubilidad en agua, toxicidad y tamaño de las dosis de las formas orales
sólidas que se elaboran, utilizándose básicamente la experiencia del personal más capacitado para la identificación de los
contaminantes más complejos a la hora de la limpieza del equipamiento tecnológico normalmente no dedicados. El
procedimiento para evaluar la aceptación de las variables evaluados por los expertos se confirma mediante prueba de
concordancia por Kendall, como herramienta estadística, utilizando para el cálculo un software especializado.
La validación de la limpieza constituye una evidencia documentada que los procedimientos de limpiezas (3), reducen de
manera consistente y uniforme los residuos en la superficie, así como su carga microbiológica en equipos, accesorios, a
niveles aceptables preestablecidos, garantizando su reproducibilidad, para ello es necesario la identificación de los
principios activos, excipientes (8), agentes de limpiezas y otros productos más complejos a la hora de la limpieza (7), que
participen durante la fabricación de la forma sólida. Las producciones farmacéuticas requieren del establecimiento de
límites de aceptación de residuos, donde el principio activo A no debe estar, o por lo menos en valores inferiores a los
límites aceptados, en el subsiguiente principio activo B (4).
En este trabajo se parte de un análisis de severidad (Tabla 1) para llegar a la solución, pues las calificaciones de los
expertos durante el estudio de las variables son recogidas en varias matrices (Tabla 3,4,5), sin embargo los resultados
obtenidos individualmente para cada producto que se elaboran en nuestro centro, tiene un carácter necesario, pero no
suficiente. Es por ello que se analiza el consenso con los expertos, que finalmente mediante una prueba de hipótesis,
evalúan la severidad de las variables solamente en el principio activo.
Estos riesgos son la falta de solubilidad de las formas orales durante los enjuagues y limpiezas de las superficies de los
equipos de producción que por demás cumplen con los requerimientos de ser materiales resistentes a la corrosión e
higiénicos con aceros inoxidables austeniticos, a la toxicidad de los principios activos y las altas dosis presentes en las
formas orales sólidas que inciden en la calidad de las limpiezas.
Toda la cartera de productos elaborados en nuestro centro fueron agrupados en una matriz para cada variable, donde los
expertos calificaban las variables de solubilidad, toxicidad y tamaño de dosis con valores en un rango de 1 a 10, donde el
valor de 1 será el de menor incidencia y 10 será donde la incidencia sea mayor, según el estado de severidad, como
comúnmente se realiza para los análisis de riesgo (5). (Tabla 1).
Tabla 1. Severidad utilizada para la evaluación de los
expertos
ESCALA DE SEVERIDAD
Peligro sin Advertencia.
RIESGO)
Peligro con Advertencia.
(ALTO
EVALUACIÓN
Tabla 2. NC (1-α) VERSUS PERCENTIL K
10
NC (1-α)
K
9
0,90
2,6896
0,95
3,8416
0,99
6,6564
Severidad Muy Alta.
8
Severidad Alta.
7
Severidad Moderada.
6
Severidad Baja.
5
Severidad Muy Baja.
4
Severidad Menor.
Severidad Muy Menor.
3
2
Severidad Nula. (BAJO RIESGO)
1
67
Caracterización del método de expertos para la selección de los peores casos.
Fortalezas
1. El modelo surge de un enfoque plural.
2. El número de factores tenido en cuenta por
un grupo es siempre mayor del que podría
considerar una sola persona.
3. Suple la falta de información estadística
sobre los variables en estudio.
Debilidades
Puede triunfar el argumento más citado en lugar de ser el de
mayor validez.
2. La presión de la mayoría sobre el conjunto puede provocar
alineamientos con teorías erróneas.
La posición, la personalidad o las facilidades de comunicación de
algunos participantes puede evidenciar la vulnerabilidad informativa
o comunicativa del resto y convencerlo.
1.
Forma de participación de los expertos
Los expertos califican individualmente las variables propuestas, sin la presencia de otros expertos para disminuir
debilidades. En caso de que no exista concordancia entre ellos, se va a una segunda ronda, donde se solicita por segunda
vez una calificación, con la participación única del moderador, donde recomienda según datos recogidos por los otros
expertos, calificaciones que puedan flexibilizar las notaciones, sin que se pierda la veracidad y disminuyan tendencias
extremas.
Pasos realizados para la selección de los peores casos para la validación de la limpieza de los principios activos
1. Cálculo del número de expertos (CE) que deben participar durante la obtención de los peores casos (1). (Ecuación
1).
Cálculo del número de expertos (CE):
(1)
Donde :
p: % de error que se tolera. (2%)
K: Percentil asociado con el Nivel de Confianza NC (1-α).
D: Nivel de precisión. (13%)
El valor de CE obtenido en la ecuación de cálculo de expertos fue de CE=4,4, se aproxima a 4, por lo que se toma el
valor de CE=4. Las variables de la ecuación 1 (p, D), fueron valores recomendados por la literatura especializada (5).
2. Identificación del número de modo de fallos (N). En nuestro caso este valor es de N = 3, pues se analizará las
siguientes variables: Solubilidad, Tamaño de Dosis, Toxicidad de los principios activos.
3. Se calcula el coeficiente de concordancia W, el cual cumple la condición [0 ≤ W ≤1]. Este coeficiente es calculado
con las evaluaciones de las matrices (Tabla 3,4,5), pues pueden tener respuestas ligadas o no y para cada una de ellas
existe un a ecuación matemática, al igual que para las desviaciones. En general existen respuestas ligadas en nuestro
estudio y no nos detendremos en esto, pues sus valores fueron calculados con el empleo de software de expertos.
4. Comparación de las desviaciones calculadas mediante el software, con los valores tabulados críticos de S para prueba
de concordancia de Kendall (9).
Como la comparación entre los expertos no puede realizarse con todos los productos contra todas las calificaciones de los
expertos, por limitaciones del software, la Stabla se calcula al comparar 5 productos y 5 calificaciones de expertos cada
vez, según la característica introducida en el software de H=5 y su valor según las Tablas 3,4,5 es de Stabla (9)=88,4,
excepcionalmente para los últimos 6 productos con H=6, donde Stabla (9) =143,3 contra la Scalc, para prueba de
concordancia de Kendall para un nivel de confianza de 95%.
5. Prueba de hipótesis para concordancia según:
H0: No hay Concordancia: Si S tabla < S calc se acepta H0
H1: Hay Concordancia: Si S tabla > S calc se rechaza H0 y existe concordancia.
En las Tablas de resultados 3, 4 y 5 se ilustran las desviaciones calculadas Scalc y se compara con la tabulada Stabla y se
plantea la solución en la prueba de la hipótesis. En ocasiones no existe concordancia y es necesario llegar a una segunda
ronda.
68
Tabla 3. Matriz de expertos para determinación del peor caso (solubilidad) para limpieza de principio activo
α=0,05
No.
PRODUCTOS
E1 E2 E3 E4 Rj Rmedia St para H=5yCE=4 0<W<1
1 ASA 500mg
8
8
5
7 28
7,00
88,40
0,84
2 Acido Ascórbico
1
1
1
2 5
1,25
88,40
0,84
A.
Nicotínico
3 50mg
6
4
3
7 20
5,00
88,40
0,84
4 Alusil
7
7
6 10 30
7,50
88,40
0,84
Alendronato
70
5 mg
5
1
4
3 13
3,25
88,40
0,84
Amlodipino
10
6 Mg
6
6
5
6 23
5,75
88,40
0,22
Atorvastatina 10
mg
7
6
6 24
6,00
88,40
0,20
5
Atorvastatina 20
7 mg
7
5
6 23
5,75
88,40
0,20
5
Azitromicina 250
mg
6
7
5
7 25
6,25
88,40
0,20
Azitromicina 500
8 mg
7
7
6
7 27
6,75
88,40
0,20
i ronda
α=0,05
ii ronda
Scal
Si Scal>St
Scal
135,0
135,0
Si Scal>St
E1 E2 E3 E4 Rj Rmedia St para N=5yCE=4 0<W<1
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
135,0
135,0
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
135,0
Ho:se rechaza
35,5
Ho:se acepta
6
6
5
6
23
5,75
88,40
0,71
112,5
Ho:se rechaza
35,5
Ho:se acepta
6
6
6
6
24
6
88,40
0,71
112,5
Ho:se rechaza
35,5
Ho:se acepta
6
6
6
6
24
6
88,40
0,71
112,5
Ho:se rechaza
35,5
Ho:se acepta
7
7
6
7
27
6,75
88,40
0,71
112,5
Ho:se rechaza
35,5
Ho:se acepta
7
7
7
7
28
7
88,40
0,71
112,5
Ho:se rechaza
9
Bisacodilo 5 mg
Captopril 25 mg
8
2
9
1
7
3
9
2
33
8
8,25
2,00
88,40
88,40
0,67
0,67
107
107
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
10
2
1
3
2
8
2,00
88,40
0,67
107
Ho:se rechaza
4
1
5
2
12
3,00
88,40
0,67
107
Ho:se rechaza
11
Captopril 50 mg
Carvelidol
6,25
mg
Carvelidol
12,5
mg
4
2
5
2
13
3,25
88,40
0,67
107
Ho:se rechaza
12
Celecoxib 100 mg
5
8
6
7
26
6,50
88,40
0,31
31
Ho:se acepta
7
8
6
7
28
7
88,40
0,84
134
Ho:se rechaza
13
6
1
2
2
11
2,75
88,40
0,31
31
Ho:se acepta
3
1
2
2
8
2
88,40
0,84
134
Ho:se rechaza
14
Clopidogrel 75 mg
Didanosina
100
mg
4
1
5
8
18
4,50
88,40
0,31
31
Ho:se acepta
4
5
5
6
20
5
88,40
0,84
134
Ho:se rechaza
15
Enalapril 10 mg
Enalapril 20 mg
5
5
8
8
5
5
6
6
24
24
6,00
6,00
88,40
88,40
0,31
0,31
31
31
Ho:se acepta
Ho:se acepta
5
5
6
6
5
5
6
6
22
22
5,5
5,5
88,40
88,40
0,84
0,84
134
134
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
16
Estavudina 40 mg
4
2
4
3
13
3,25
88,40
0,49
78,5
Ho:se acepta
4
3
4
3
14
3,5
88,40
0,84
133,5
Ho:se rechaza
17
Efavirenz 200 mg
Fluconazol
150
mg
4
4
3
6
17
4,25
88,40
0,49
78,5
Ho:se acepta
4
4
5
6
19
4,75
88,40
0,84
133,5
Ho:se rechaza
5
18
8
6
8
27
6,75
88,40
0,49
78,5
Ho:se acepta
8
8
6
8
30
7,5
88,40
0,84
133,5
Ho:se rechaza
5
6
6
6
23
5,75
88,40
0,49
78,5
Ho:se acepta
5
6
6
6
23
5,75
88,40
0,84
133,5
Ho:se rechaza
4
10
3
8
25
6,25
88,40
0,49
78,5
Ho:se acepta
7
6
8
8
29
7,25
88,40
0,84
133,5
Ho:se rechaza
21
Indinavir 200 mg
Itraconazol
100
mg
Lamivudina 150
mg
5
1
6
3
15
3,75
88,40
0,33
52
Ho:se acepta
3
1
4
3
11
2,75
88,40
0,58
92,5
Ho:se rechaza
22
Lozartán 50 mg
4
1
5
2
12
3,00
88,40
0,33
52
Ho:se acepta
4
4
3
2
13
3,25
88,40
0,58
92,5
Ho:se rechaza
19
20
69
Tabla 3 (CONT). Matriz de expertos para determinación del peor caso (solubilidad) para limpieza de principio activo
23
Loratadina 10 mg
7
3
4
10
24
6,00
88,40
0,33
52
Ho:se acepta
2
3
4
3
12
3
88,40
0,58
92,5
Ho:se rechaza
24
Lisinopril 20 mg
3
2
2
2
9
2,25
88,40
0,33
52
Ho:se acepta
3
2
2
2
9
2,25
88,40
0,58
92,5
Ho:se rechaza
25
Meprobamato 500 mg
2
2
6
8
18
4,50
88,40
0,33
52
Ho:se acepta
7
7
6
8
28
7
88,40
0,58
92,5
Ho:se rechaza
26
Mefenesina
9
1
3
4
17
4,25
88,40
0,19
30,5
Ho:se acepta
4
1
3
4
12
3
88,40
0,89
142
Ho:se rechaza
27
Metformina 500 mg
10
1
1
2
14
3,50
88,40
0,19
30,5
Ho:se acepta
3
1
1
2
7
1,75
88,40
0,89
142
Ho:se rechaza
28
Mandelamina 500 mg
10
4
1
3
18
4,50
88,40
0,19
30,5
Ho:se acepta
4
4
1
3
12
3
88,40
0,89
142
Ho:se rechaza
29
Metilpolisiloxano
9
7
8
3
27
6,75
88,40
0,19
30,5
Ho:se acepta
9
7
8
7
31
7,75
88,40
0,89
142
Ho:se rechaza
30
Nevirapina 200 mg
5
9
9
9
32
8,00
88,40
0,19
30,5
Ho:se acepta
10
9
9
9
37
9,25
88,40
0,89
142
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
31
Novavir
4
10
6
8
28
7,00
88,40
0,30
48,5
Ho:se acepta
7
7
6
8
28
7
88,40
0,61
97,5
32
Omeprazol 20 mg
2
8
5
8
23
5,75
88,40
0,30
48,5
Ho:se acepta
6
8
7
8
29
7,25
88,40
0,61
97,5
Ho:se rechaza
33
Ondasentronl 4 y 8 mg
8
7
4
6
25
6,25
88,40
0,30
48,5
Ho:se acepta
6
7
4
6
23
5,75
88,40
0,61
97,5
Ho:se rechaza
34
Oseltamivir 75 mg
7
1
5
3
16
4,00
88,40
0,30
48,5
Ho:se acepta
7
5
5
4
21
5,25
88,40
0,61
97,5
Ho:se rechaza
35
Orlistab 200 mg
4
4
4
4
16
4,00
88,40
0,30
48,5
Ho:se acepta
4
4
4
4
16
4
88,40
0,61
97,5
Ho:se rechaza
36
Pregabalin 100 mg
4
8
4
3
19
4,75
88,40
0,09
14
Ho:se acepta
4
3
4
3
14
3,5
88,40
0,67
106,5
Ho:se rechaza
37
Pentoxifilina 400 mg
8
1
5
3
17
4,25
88,40
0,09
14
Ho:se acepta
3
3
3
3
12
3
88,40
0,67
106,5
Ho:se rechaza
38
Sildenafil 50 mg
7
3
4
5
19
4,75
88,40
0,09
14
Ho:se acepta
4
3
4
4
15
3,75
88,40
0,67
106,5
Ho:se rechaza
39
Ribavirina 200 mg
8
1
5
2
16
4,00
88,40
0,09
14
Ho:se acepta
3
2
3
2
10
2,5
88,40
0,67
106,5
Ho:se rechaza
40
41
Risperidona 3 mg
Tadalafil 10 y 20 mg
Terazosina 2 mg
7
8
8
6
10
7
3
2
3
2
8
3
18
28
21
4,50
7,00
5,25
88,40
88,40
88,40
0,09
0,46
0,46
14
73
73
Ho:se acepta
Ho:se acepta
Ho:se acepta
3
8
4
2
8
4
3
7
3
2
8
3
10
31
14
2,5
7,75
3,5
88,40
88,40
88,40
0,67
0,91
0,91
106,5
146
146
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
42
Terazosina 5 mg
8
7
3
3
21
5,25
88,40
0,46
73
Ho:se acepta
4
4
3
3
14
3,5
88,40
0,91
146
Ho:se rechaza
43
Trifluoperazina 5 mg
9
7
10
10
36
9
88,40
0,46
73
Ho:se acepta
9
9
10
10
38
9,5
88,40
0,91
146
Ho:se rechaza
44
Triviral 40 mg
10
10
10
10
40
10,00
88,40
0,46
73
Ho:se acepta
10
10
10
10
40
10
88,40
0,91
146
Ho:se rechaza
Zidovudina 100 mg
7
4
6
6
23
5,75
143,30
0,23
64,5
Ho:se acepta
7
6
6
6
25
6,25
143,30
0,92
256,5
Ho:se rechaza
45
Zidovudina 300 mg
7
4
6
6
23
5,75
143,30
0,23
64,5
Ho:se acepta
7
6
6
6
25
6,25
143,30
0,92
256,5
Ho:se rechaza
Montelukast 5 mg
5
1
2
2
10
2,5
143,30
0,23
64,5
Ho:se acepta
1
1
2
2
6
1,5
143,30
0,92
256,5
Ho:se rechaza
46
Montelukast 10 mg
5
1
2
2
10
2,5
143,30
0,23
64,5
Ho:se acepta
2
1
2
2
7
1,75
143,30
0,92
256,5
Ho:se rechaza
47
Sumatriptan 100 mg
5
9
8
9
31
7,75
143,30
0,23
64,5
Ho:se acepta
8
9
8
9
34
8,5
143,30
0,92
256,5
Ho:se rechaza
48
Glimepiride 4 mg
8
10
2
9
29
7,25
143,30
0,23
64,5
Ho:se acepta
8
8
10
9
35
8,75
143,30
0,92
256,5
Ho:se rechaza
E1,E2,E3,E4 : Identificación de los Expertos, R j: Sumatoria de las calificaciones de los expertos, R media: Media de las calificaciones de los expertos, S t: Desviaciones obtenida de tablas,
S cal: Desviaciones calculadas, W : Coeficiente de concordancia [ 0 ≤ W ≤1], Scal>St : Criterio de rechazo de la hipótesis
70
Tabla 4. Matriz de expertos para determinacion del peor caso (t. dosis) para limpieza de principio activo
α=0,05
No.
1
PRODUCTOS
Stpara N=5yCE=4 0<W<1
88,40
0,80
I RONDA
ASA 500mg
E1
10
E2
10
E3
8
E4
10
Rj
38
Rmed
9,50
Scal
128,5
Si Scal>St
Ho:se rechaza
2
3
4
5
Acido Ascórb. 500mg
A. Nicotínico 50mg
Alusil
Alendronato 70 mg
10
3
10
4
9
4
10
3
8
4
8
5
8
4
9
5
35
15
37
17
8,75
3,75
9,25
4,25
88,40
88,40
88,40
88,40
0,80
0,80
0,80
0,80
128,5
128,5
128,5
128,5
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
6
Amlodipino 10 mg
Atorvastatina 10 mg
5
5
2
3
3
3
4
3
14
14
3,50
3,50
88,40
88,40
0,84
0,84
134,0
134,0
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
7
Atorvastatina 20 mg
Azitromicina 250 mg
5
7
3
6
4
6
4
7
16
26
4,00
6,50
88,40
88,40
0,84
0,84
134,0
134,0
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
8
Azitromicina 500 mg
10
10
8
9
37
9,25
9
Bisacodilo 5 mg
Captopril 25 mg
3
4
3
3
2
4
3
4
11
15
2,75
3,75
88,40
0,84
134,0
Ho:se rechaza
88,40
88,40
0,70
0,70
112
112
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
10
Captopril 50 mg
6
5
5
5
21
5,25
88,40
0,70
112
Ho:se rechaza
Carvelidol 6,25 mg
3
3
2
2
10
2,50
88,40
0,70
112
Ho:se rechaza
11
Carvelidol 12,5 mg
5
3
3
3
14
3,50
88,40
0,70
112
Ho:se rechaza
12
Celecoxib 100 mg
6
4
5
5
20
5,00
88,40
0,83
133,5
Ho:se rechaza
13
14
Clopidogrel 75 mg
Didanosina 100 mg 100mg
Enalapril 10 mg
5
6
3
3
7
3
5
7
3
5
8
2
18
28
11
4,50
7,00
2,75
88,40
88,40
88,40
0,83
0,83
0,83
133,5
133,5
133,5
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
15
Enalapril 20 mg
4
3
4
3
14
3,50
88,40
0,83
133,5
Ho:se rechaza
16
17
Estavudina 40 mg
Efavirenz 200 mg 200 mg
3
6
4
5
4
5
5
5
16
21
4,00
5,25
88,40
88,40
0,63
0,63
100
100
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
18
19
20
Fluconazol 150 mg
Indinavir 200 mg 200 mg
Itraconazol 100 mg
7
5
6
7
6
4
6
5
6
7
6
5
27
22
21
6,75
5,50
5,25
88,40
88,40
88,40
0,63
0,63
0,63
100
100
100
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
21
Lamivudina 150 mg
4
4
6
5
19
4,75
88,40
0,83
132,5
Ho:se rechaza
22
Lozartán 50 mg
3
3
4
3
13
3,25
88,40
0,83
132,5
Ho:se rechaza
23
Loratadina 10 mg
3
2
2
3
10
2,50
88,40
0,83
132,5
Ho:se rechaza
24
Lisinopril 20 mg
3
3
2
3
11
2,75
88,40
0,83
132,5
Ho:se rechaza
25
Meprobamato 500 mg
10
9
8
9
36
9,00
88,40
0,83
132,5
Ho:se rechaza
26
Mefenesina 500 mg
9
10
8
9
36
9,00
88,40
0,81
130
Ho:se rechaza
27
Metformina 500 mg
10
10
8
9
37
9,25
88,40
0,81
130
Ho:se rechaza
28
Mandelamina 500 mg 500 mg
8
10
9
8
35
8,75
88,40
0,81
130
Ho:se rechaza
71
29
Metilpolisiloxano
3
3
3
3
12
3,00
88,40
0,81
130
Ho:se rechaza
30
Nevirapina 200 mg
5
4
7
5
21
5,25
88,40
0,81
130
Ho:se rechaza
31
Novavir
9
10
9
8
36
9,00
88,40
0,84
134
Ho:se rechaza
32
Omeprazol 20 mg
3
3
5
5
16
4,00
88,40
0,84
134
Ho:se rechaza
33
Ondasentronl 4 y 8 mg
2
4
2
4
12
3,00
88,40
0,84
134
Ho:se rechaza
34
Oseltamivir 75 mg
3
3
5
5
16
4,00
88,40
0,84
134
Ho:se rechaza
35
Orlistab 200 mg
7
5
7
6
25
6,25
88,40
0,84
134
Ho:se rechaza
36
Pregabalin 100 mg
6
6
7
6
25
6,25
88,40
0,87
138
Ho:se rechaza
37
7
8
7
7
29
7,25
88,40
0,87
138
Ho:se rechaza
38
Sildenafil 50 mg
4
3
4
5
16
4,00
88,40
0,87
138
Ho:se rechaza
39
Ribavirina 200 mg
7
5
6
6
24
6,00
88,40
0,87
138
Ho:se rechaza
40
Risperidona 3 mg 3 mg
3
3
3
3
12
3,00
88,40
0,87
138
Ho:se rechaza
41
Tadalafil 10 y 20 mg
2
1
2
3
8
2,00
88,40
0,58
92,5
Ho:se rechaza
Terazosina 2 mg
1
2
2
2
7
1,75
88,40
0,58
92,5
Ho:se rechaza
42
Terazosina 5 mg
2
3
3
2
10
2,50
88,40
0,58
92,5
Ho:se rechaza
43
2
1
2
3
8
2,00
88,40
0,58
92,5
Ho:se rechaza
44
Triviral 40 mg
10
9
10
10
39
9,75
88,40
0,58
92,5
Ho:se rechaza
Zidovudina 100 mg
4
5
5
5
19
4,75
143,30
0,90
251
Ho:se rechaza
Zidovudina 300 mg
6
7
6
7
26
6,50
143,30
0,90
251
Ho:se rechaza
Montelukast 5 mg
2
1
1
2
6
1,50
143,30
0,90
251
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
45
46
Montelukast 10 mg
2
2
2
2
8
2,00
143,30
0,90
251
47
Sumatriptan 100 mg
4
3
5
4
16
4,00
143,30
0,90
251
Ho:se rechaza
48
Glimepiride 4 mg
1
1
1
2
5
1,25
143,30
0,90
251
Ho:se rechaza
E1,E2,E3,E4: Identificación de los Expertos, R j: Sumatoria de las calificaciones de los expertos, R media: Media de las calificaciones de los expertos, S t: Desviaciones obtenida de
tablas, S cal: Desviaciones calculadas, W : Coeficiente de concordancia [ 0 ≤ W ≤1], Scal>St : Criterio de rechazo de la hipótesis
72
Tabla 5. Matriz de expertos para determinación del peor caso (toxicidad) para limpieza de principio activo
α=0,05 I RONDA
No. PRODUCTOS
1 ASA 500 mg
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Acido Ascórbico
A. Nicotínico 50
mg
Alusil
Alendronato 70
mg
Amlodipino
10
Mg
Atorvastatina10
mg
Atorvastatina20
mg
Azitromicina 250
mg
Azitromicina500
mg
Bisacodilo 5 mg
Captopril 25 mg
Captopril 50 mg
Carvelidol 6,25
mg
Carvelidol 12,5
mg
E1 E2 E3 E4 Rj Rmed Stpara N=5yCE=4
2
3
3
2 10 2,50
88,40
0<W<1
0,78
Scal
125,0
Si Scal>St
Ho:se rechaza
α=0,05 II RONDA
E1 E2 E3 E4 Rj Rmed St para N=5yCE=4 0<W<1
Scal
Si Scal>St
1
1
1
1
4
1,00
88,40
0,78
125,0
Ho:se rechaza
7
3
8
3
7
3
7
3
29
12
7,25
3,00
88,40
88,40
0,78
0,78
125,0
125,0
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
3
1
4
2
10
2,50
88,40
0,78
125,0
Ho:se rechaza
4
4
4
4
16
4,00
88,40
0,57
91,0
Ho:se rechaza
7
6
6
6
25
6,25
88,40
0,57
91,0
Ho:se rechaza
7
6
7
6
26
6,50
88,40
0,57
91,0
Ho:se rechaza
6
6
7
5
24
6,00
88,40
0,57
91,0
Ho:se rechaza
6
7
7
6
26
6,50
88,40
0,57
91,0
Ho:se rechaza
7
4
4
7
3
3
8
3
3
7
3
3
29
13
13
7,25
3,25
3,25
88,40
88,40
88,40
0,57
0,57
0,57
91,0
91,0
91,0
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
Ho:se rechaza
3
3
4
4
14
3,50
88,40
0,57
91,0
Ho:se rechaza
3
4
4
4
15
3,75
88,40
0,57
91,0
Ho:se rechaza
7
7
7
28
7,00
88,40
0,40
63,5
Ho:se acepta
7
7
7
7
28
7
88,40
0,71
113 Ho:se rechaza
Celecoxib
100
mg
7
Clopidogrel
75
mg
7
Didanosina 100
mg
10
Enalapril 10 mg
9
Enalapril 20 mg
9
1
5
5
18
4,50
88,40
0,40
63,5
Ho:se acepta
4
3
5
5
17
4,25
88,40
0,71
113 Ho:se rechaza
2
6
6
10
5
5
10 32
5 25
5 25
8,00
6,25
6,25
88,40
88,40
88,40
0,40
0,40
0,40
63,5
63,5
63,5
Ho:se acepta
Ho:se acepta
Ho:se acepta
10
9
9
8
6
6
10
5
5
10 38
5 25
5 25
9,5
6,25
6,25
88,40
88,40
88,40
0,71
0,71
0,71
113 Ho:se rechaza
113 Ho:se rechaza
113 Ho:se rechaza
16
Estavudina 40 mg
9
4
10
9
32
8,00
88,40
0,51
82
Ho:se acepta
9
8
10
9
36
9
88,40
0,79
126 Ho:se rechaza
17
18
Efavirenz 200 mg
Fluconazol 150
8
8
8
8
10
7
9
8
35
31
8,75
7,75
88,40
88,40
0,51
0,51
82
82
Ho:se acepta
Ho:se acepta
8
8
8
8
10
7
9
8
35
31
8,75
7,75
88,40
88,40
0,79
0,79
126 Ho:se rechaza
126 Ho:se rechaza
12
13
14
15
73
3
10
10 33
8,25
88,40
0,51
82
Ho:se acepta
10
9
10
10
39
9,75
88,40
0,79
126 Ho:se rechaza
20
mg
Indinavir 200 mg 10
Itraconazol 100
mg
7
3
6
4
20
5,00
88,40
0,51
82
Ho:se acepta
5
3
6
4
18
4,5
88,40
0,79
126 Ho:se rechaza
21
22
Lamivudina 150
mg
Lozartán 50 mg
9
7
3
1
10
4
10 32
4 16
8,00
4,00
88,40
88,40
0,66
0,66
105,5
105,5
Ho: se rechaza
Ho: se rechaza
23
Loratadina 10 mg
2
3
4
2
11
2,75
88,40
0,66
105,5
Ho: se rechaza
24
Lisinopril 20 mg
7
2
2
5
16
4,00
88,40
0,66
105,5
Ho:se rechaza
25
Meprobamato
500 mg
8
3
6
6
23
5,75
88,40
0,66
105,5
Ho:se rechaza
5
4
3
4
16
4,00
88,40
0,73
116,5
Ho:se rechaza
8
3
5
5
21
5,25
88,40
0,73
116,5
Ho:se rechaza
4
8
5
5
22
5,50
88,40
0,73
116,5
Ho:se rechaza
19
26
27
28
29
Mefenesina
Metformina 500
mg
Mandelamina
500 mg
Metilpolisiloxano
Nevirapina 200
mg
2
3
4
2
11
2,75
88,40
0,73
116,5
Ho:se rechaza
9
9
10
10 38
9,50
88,40
0,73
116,5
Ho:se rechaza
31
Novavir
10
10
10
10 40
10,00
88,40
0,71
113
Ho:se rechaza
32
Omeprazol 20 mg
Ondasentron 4 y
8 mg
Oseltamivir
75
mg
7
3
5
5
20
5,00
88,40
0,71
113
Ho:se rechaza
7
5
6
6
24
6,00
88,40
0,71
113
Ho:se rechaza
8
2
9
9
28
7,00
88,40
0,71
113
Ho:se rechaza
Orlistab 200 mg
Pregabalin
100
mg
Pentoxifilina 400
mg
8
6
6
6
26
6,50
88,40
0,71
113
Ho:se rechaza
9
8
6
7
30
7,50
88,40
0,38
60
Ho:se acepta
6
8
6
7
27
6,75
88,40
0,82
131 Ho:se rechaza
8
4
5
8
25
6,25
88,40
0,38
60
Ho:se acepta
5
4
5
5
19
4,75
88,40
0,82
131 Ho:se rechaza
7
3
5
7
22
5,50
88,40
0,38
60
Ho:se acepta
5
3
5
5
18
4,5
88,40
0,82
131 Ho:se rechaza
8
3
8
8
27
6,75
88,40
0,38
60
Ho:se acepta
8
8
8
8
32
8
88,40
0,82
131 Ho:se rechaza
8
6
6
8
28
7,00
88,40
0,38
60
Ho:se acepta
8
6
6
8
28
7
88,40
0,82
131 Ho:se rechaza
7
6
5
6
24
6,00
88,40
0,54
86
Ho:se acepta
7
6
5
6
24
6
88,40
0,79
126 Ho:se rechaza
30
33
34
35
36
37
38
40
Sildenafil 50 mg
Ribavirina
200
mg
Risperidona
3
mg
41
Tadalafil 10 y 20
mg
39
74
42
Terazosina 2 mg
7
6
8
7
28
7,00
88,40
0,54
86
Ho:se acepta
7
6
8
7
28
7
88,40
0,79
126 Ho:se rechaza
7
6
8
7
28
7,00
88,40
0,54
86
Ho:se acepta
7
6
8
7
28
7
88,40
0,79
126 Ho:se rechaza
43
Terazosina 5 mg
Trifluoperazina5
mg
10
1
9
10 30
7,50
88,40
0,54
86
Ho:se acepta
10
10
9
10 39
9,75
88,40
0,79
126 Ho:se rechaza
Triviral 40 mg
10
Zidovudina 100
10
mg
Zidovudina 300
mg
10
10
10
10 40
10,00
88,40
0,54
86
Ho:se acepta
10
10
10
10 40
10
88,40
0,79
126 Ho:se rechaza
7
10
9
36
9,00
143,30
0,67
106
Ho:se acepta
10
9
10
9
9,5
88,40
0,88
246 Ho:se rechaza
7
10
10 37
9,25
143,30
0,67
106
Ho:se acepta
10
10
10
10 40
10
88,40
0,88
246 Ho:se rechaza
7
1
5
6
19
4,75
143,30
0,67
106
Ho:se acepta
5
5
5
6
21
5,25
88,40
0,88
246 Ho:se rechaza
7
1
5
7
20
5,00
143,30
0,67
106
Ho:se acepta
7
5
5
7
24
6
88,40
0,88
246 Ho:se rechaza
47
Montelukast 5 mg
Montelukast 10
mg
Sumatriptan 100
mg
7
9
9
8
33
8,25
143,30
0,67
106
Ho:se acepta
7
9
9
8
33
8,25
88,40
0,88
246 Ho:se rechaza
48
Glimepiride 4 mg
6
7
5
8
26
6,50
143,30
0,67
6
7
6
7
26
6,5
88,40
0,88
246 Ho:se rechaza
44
45
46
106 Ho:se acepta
38
E1,E2,E3,E4 : Identificación de los expertos, Rj: Sumatoria de las calificaciones de los expertos, R media: Media de las calificaciones de los expertos, St: Desviaciones obtenida de
tablas, Scal: Desviaciones calculadas, W : Coeficiente de concordancia [ 0 ≤ W ≤1], Scal>St : Criterio de rechazo de la hipótesis
75
Tabla 6. Calificación de los peores casos principio activo para la limpieza según expertos
No.
1
2
3
4
5
PRODUCTOS
ASA 500mg
Acido Ascórbico
A. Nicotínico 50mg
Alusil
Alendronato 70 mg
SOLUBILIDAD
28
5
20
30
13
TAMAÑO DE
DOSIS
38
35
15
37
17
6
Amlodipino 10 Mg
Atorvastatina10 mg
Atorvastatina20 mg
Azitromicina250
mg
Azitromicina500
mg
Bisacodilo 5 mg
Captopril 25 mg
Captopril 50 mg
Carvelidol 6,25 mg
23
24
24
14
14
16
27
26
28
33
8
8
12
37
11
15
21
10
11
12
13
Carvelidol 12,5 mg
Celecoxib 100 mg
Clopidogrel 75 mg
13
28
8
14
20
18
14
15
Didanosina 100 mg
Enalapril 10 mg
Enalapril 20 mg
20
22
22
16
Estavudina 40 mg
17
18
19
20
21
22
23
24
7
8
9
10
25
26
27
28
29
VIA DE
PEORES CASOS
TOXICIDAD TOTAL FABRICACION
( Si/No)
V. Seca
10
76
No
V. Húmeda PC
4
44
No
V.
Húmeda
PC
29
64
No
V. Seca
12
79
No
10
40
No
V. Húmeda PC
16
53
No
V. Húmeda
25
63
No
V. Húmeda
26
66
No
V. Seca
24
77
Si
V. Húmeda
26
91
Si
V. Húmeda PC
29
73
Si
V. Seca
13
36
No
V. Seca
13
42
No
V.
Seca
14
36
No
V.
Seca
15
42
No
28
17
76
43
28
11
14
38
25
25
86
58
61
14
16
36
66
Efavirenz 200 mg
Fluconazol 150 mg
Indinavir 200 mg
Itraconazol 100 mg
19
30
23
29
21
27
22
21
35
31
39
18
75
88
84
68
Lamivudina 150 mg
Lozartán 50 mg
Loratadina 10 mg
Lisinopril 20 mg
Meprobamato 500
mg
11
13
12
9
19
13
10
11
32
16
11
16
62
42
33
36
28
36
23
87
Mefenesina 500 mg
Metformina
500
mg
Mandelamina 500
mg
Metilpolisiloxano
12
36
16
64
7
37
21
65
V. Seca
V. Húmeda
V. Húmeda
V. Húmeda
V. Húumeda
V. Húmeda
V. Seca
V. Húmeda
V. Seca
V. Húmeda
V. Húmeda
V. Húmeda PC
No
No
Si
Si
No
No
No
No
No
No
No
V. Húumeda
35
12
22
11
69
54
Nevirapina 200 mg
Novavir
Omeprazol 20 mg
Ondasentron 4 y 8
mg
Oseltamivir 75 mg
37
28
29
21
36
16
38
40
20
96
104
65
23
21
12
16
24
28
59
65
35
Orlistab 200 mg
16
25
26
67
V. Húumeda
-
36
37
Pregabalin 100 mg
Pentoxifilina
400
14
12
25
29
27
19
66
60
V. Seca
V. Húumeda
33
34
Si
No
No
No
V. Húmeda
V. Húmeda
12
31
30
31
32
Si
No
76
V. Húmeda
V. Seca
-
No
No
Si
Si
No
No
No
No
No
No
mg
38
39
Sildenafil 50 mg
Ribavirina 200 mg
15
10
16
24
18
32
49
66
40
10
12
28
50
43
Risperidona 3 mg
Tadalafil 10 y 20
mg
Terazosina 2 mg
Terazosina 5 mg
Trifluoperazina
5
mg
44
Triviral 40 mg
41
42
V. Húmeda
V. Húumeda
V. Húumeda
31
14
14
8
7
10
24
28
28
63
49
52
38
8
39
85
40
39
40
119
V. Húmeda
Si
Si
Si
No
No
Si
V. Húmeda
V. Húmeda
V. Húmeda PC
No
No
No
Si
Zidovudina 100 mg
25
19
38
82
47
Zidovudina 300 mg
Montelukast 5 mg
Montelukast 10 mg
Sumatriptan 100 mg
25
6
7
34
26
6
8
16
40
21
24
33
91
33
39
83
48
Glimepiride 4 mg
35
5
26
66
V. Húmeda
V. Húmeda
V. Húmeda
V. Húmeda
V. Húmeda
46
No
V. Húmeda
V. Húmeda PC
45
No
No
No
Conclusiones
En el grupo de los "peores casos" resultaron seleccionados: azitromicina 250 mg y 500 mg, bisacodilo 5 mg, fluconazol
150 mg, celecoxib 100 mg, didanosina 100 mg, indinavir 200 mg, nevirapina 200 mg, novavir, trifluoperacina 5 mg,
triviral 40 mg, zidovudina 300 mg, sumatriptan 100 mg. Los datos se detallan en la tabla de resultados 7, donde los
peores casos se obtienen a partir de valores superiores a 70 con una concordancia entre los expertos con un nivel de
confianza del 95%.
Referencias
1.
2.
3.
4.
5.
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9.
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Hernández Roberto. Utilización de los expertos en el análisis de riesgos. CENTRO DE INMUNOLOGÍA MOLECULAR.
Octubre 2009.
Plan Maestro de Validación de Laboratorios NOVATEC. Agosto 2010.
FDA, Guide to Inspections of Validation of Clearing Processes, Division of Investigations, Office of Regional Operations, Office
of Regulatory affairs, July1993.
González González Rafael Olban. Obtención de los peores casos para la validación de la limpieza de excipientes. Agosto 2010.
Tablas de valores críticos de S para prueba de concordancia de Kendall.
Obtención de los peores casos para la validación de la limpieza de excipientes
Olban Rafael González González
Laboratorios Novatec. Ave. 15, No. 216A03 e/ 216A y 222. Atabey, Playa. C. Habana.
[email protected]
Luego de estudiar y seleccionar los peores casos para principios activos, para un total de 48 productos que se elaboran en
régimen de campaña, en equipos no dedicados y por diferentes vías de fabricación, fue necesario también identificar los
excipientes más representativos, a partir de la construcción de una matriz principio activo versus excipiente. Se utilizó
como herramienta una escala de severidad como en los análisis de riesgo y una combinación matemática de variables
para obtener respuestas de la complejidad de los excipientes, que expliquen las observaciones realizados por los
tecnólogos y operarios de experiencia. Observamos que existen ciertas formas sólidas orales que a pesar de tener
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principios activos dóciles en cuanto a sus variables farmacológicas, como su solubilidad, tamaño de dosis y toxicidad, se
advierte la tendencia de aferrarse a las superficies de los equipos y mostraban poca facilidad para ser arrastrados, al
mezclar principios activos benignos con excipientes menos felices. Se obtuvieron los peores casos para los excipientes
que permitieron distinguir los productos que los contenían en su formulación e incluirlos en los productos más
representativos para la validación de la limpieza.
Palabras clave: Excipientes, solubilidad, interpolación
Introducción
La elaboración de productos farmacéuticos requiere que para validar las limpiezas deben ser calculados límites de
residuos aceptables, no sólo para los principios activos (1) farmacéuticos, sino también para excipientes, agentes de
limpieza, productos degradados y biocarga. Estos niveles son determinados de acuerdo con el potencial farmacológico,
solubilidad, toxicidad que puedan tener un efecto contaminante en el próximo producto a fabricar en una misma superficie
del equipamiento.
Ahora nos ocupa la obtención de los peores casos de excipientes a la hora de la limpieza del equipamiento. En ocasiones
estudiamos principios activos, no encontrando riesgos en sí mismo, cuando se analizan las variables farmacológicas
tradicionales, pero para la obtención de las formas sólidas se emplean numerosos excipientes que por sus características
ponen obstáculos en las limpiezas de estas formulaciones. Un ejemplo es la pentoxifilina, producto elaborado en nuestro
laboratorio que no aparece en el listado de los peores casos para principios activos (1), pero es conocido por la experiencia
de tecnólogos y operarios una particular dificultad en su arrastre.
La identificación de estos excipientes permiten modificar las condiciones de limpieza, pues un principio activo fácil de
eliminar combinado con un excipiente rebelde, puede pasar a otro producto, si los valores de obtención de residuos son
mayores a los límites aceptados y comprometan la calidad producida; es por ello que la identificación de estos excipientes
garantizan al fabricante validar la limpieza de ciertos productos, como es el ejemplo de la pentoxifilina.
La validación es una operación costosa (2), pero debe garantizar la disminución de costos y por ello debe optimizarse
reagrupando, lo cual es una práctica muy útil en el que se analizan los productos más problemáticos, extrapolando las
conclusiones al resto de productos. Será necesario validar solamente aquellos casos desfavorables, seleccionándolos como
los más representativos.
El objetivo principal de este trabajo lo constituye la selección de los peores casos para la validación de la limpieza de
productos que contienen diversos excipientes, con estructuras moleculares disímiles, evaluándolos a través de un código.
Se utiliza un análisis de severidad y se califica mediante valores numéricos que ilustran matemáticamente, la relación de
un peor caso de excipiente, con un principio activo no identificado como desfavorable para la limpieza.
Metodología
Los cálculos se realizaron a partir de datos recopilados en métodos maestros y hojas de procesos, del sistema documental
de nuestro centro. Se construye una hoja dinámica EXCEL para la obtención de valores que son utilizados para la
obtención de variables, que evalúen los excipientes para cada forma sólida fabricada en laboratorios NOVATEC.
No es suficiente conocer el comportamiento de los principios activos durante la limpieza de los equipos, también es
necesario asegurar la eliminación de los excipientes o las mezclas de estos en sus formulaciones.
Pasos realizados para la selección de los peores casos para la validación de la limpieza de excipientes
1. Construcción de una matriz producto versus excipientes (Tabla 2), donde se tome en cuenta el peso del lote total de la
formulación y se detalle las fracciones en peso de sus excipientes para determinar dos (A y B) de tres (A, B, C) variables
(Tabla 3). Estas variables son:
1. 1 Fracción del excipiente dentro del lote (variable A).
Esta variable constituye la sumatoria de las relaciones de las masas del excipiente utilizado en cada producto contra la
masa total de la formulación. El objetivo es conocer la fracción de excipientes para realizar una buena limpieza en
dependencia del peso de las formulaciones en determinado número de formas orales farmacéuticas.
78
1.2 Número de productos con el mismo excipiente(Identificado como variable B).
Esta variable posibilita identificar más de una forma oral con el mismo excipiente. Constituye la sumatoria de los
productos que utilizan el mismo excipiente.
2.
Solubilidad en agua del excipiente (variable C).
Sin duda es una de las más importantes variables, para la validación de la limpieza, la cual se combina con las variables
anteriores, para eliminar semejanzas en cuanto al grado de solubilidad. Para ello se tomó el siguiente criterio:
< 0,1
g soluto / 100 mg de agua
(INSOLUBLE)
0,1 a 1
(POCO SOLUBLE)
1 a 10
(MODERADAMENTE SOLUBLE)
10 a 100
(BASTANTE SOLUBLE)
> 100
(MUY SOLUBLE)
3. La evaluación y procesamiento de datos se realiza con el criterio de los análisis de riesgos tradicionales, donde puede
asignársele a las variables valores únicos entre 1 y 10, y el valor de mínimo representado por 1 será el de menor
incidencia y 10 será donde la incidencia tenga un peso mayor (Tabla 1).
Tabla 1. Evaluación de severidades
ESCALA DE SEVERIDAD
EVALUACIÓN
Peligro sin Advertencia. (ALTO RIESGO)
10
Peligro con Advertencia.
9
Severidad Muy Alta.
8
Severidad Alta.
Severidad Moderada.
7
6
Severidad Baja.
5
Severidad Muy Baja.
4
Severidad Menor.
Severidad Muy Menor.
3
2
Severidad Nula. (BAJO RIESGO)
1
En la evaluación de las variables se consideran:
1.
La relación de variables A/B, el cual arroja un valor y a estos valores se le asigna una escala de severidad, el cual se
calcula asignando el valor máximo de la escala de severidad (10) al mayor valor obtenido de la relación A/B y al
valor mínimo de la escala de severidad (1) al menor valor extraído de la relación A/B. Los valores intermedios en
A/B son interpolados para obtener un valor de la escala de severidad.
2.
La evaluación del número de productos con el mismo excipiente (identificado como variable B). Se obtiene
asignando un valor máximo en la escala de severidad de 10 a excipientes que se utilicen entre 1 y 3 formas orales
farmacéuticas. El valor mínimo de 1 a excipientes que se utilicen en 10 o más formas orales farmacéuticas. Los
valores intermedios de B, son interpolados igualmente para obtener valores de la escala se severidad.
3.
La solubilidad en agua del excipiente. (Identificado como variable C)
Se evaluó asignándole valores numéricos a las solubilidades de la siguiente forma:
INSOLUBLE
Valor numérico asignado de 9 a 10
POCO SOLUBLE
MODERADAMENTE SOLUBLE
Valor numérico asignado de 4 y 5
BASTANTE SOLUBLE
Valor numérico asignado de 3
MUY SOLUBLE
79
4.
La evaluación final se realiza con la suma promediada de las calificaciones en las variables A/B, B, C. Los valores
obtenidos son llevados también según análisis de severidad, evaluados en riesgosos o no y clasificando como peores
casos, si sus valores se encuentran por encima de 6.25.
Conclusiones
En el grupo de los "peores casos" resultaron seleccionadas las evaluaciones finales con valores por encima de 6,25,
tomando las medias de las evaluaciones de las variables expuestas anteriormente (Tabla 3):
1.
Hipromelosa HPMC E10 conocida también como hidroxipropilmetil celulosa, que corresponde a la forma oral
farmacéutica pentoxifilina, montelukast, taladafil. Se selecciona por la experiencia técnica acumulada la
pentoxifilina, con lo cual se suma al listado de los peores casos (1), existiendo una corroboración con las
opiniones tomadas en cuenta de operarios y tecnólogos.
2.
Gel de hidróxido de aluminio, que corresponde a la forma oral farmacéutica alusil, que ya no se fabrica en
nuestra industria, pero queda señalada en caso de retomar su producción en el futuro.
3.
Carbonato de calcio, que corresponde a la forma oral farmacéutica atorvastatina y didanosina. Se selecciona por
la experiencia técnica acumulada la didanosina, coincidiendo con el peor caso en principio activo en estudios
anteriores.
4.
Aspartano, que corresponde a la forma oral farmacéutica atorvastatina y didanosina. Se selecciona por la
experiencia técnica acumulada la didanosina, coincidiendo con el peor caso en principio activo en estudios
anteriores.
5.
Hidróxido de magnesio, que corresponde a la forma oral farmacéutica didanosina, coincidiendo con el peor caso
en principio activo en estudios anteriores.
6. Manitol, que corresponde a la forma oral farmacéutica alusil y montelukast. No se selecciona
pues en la práctica su solubilidad en agua es muy buena y no debe ser considerado.
80
10
11
12
13
14
206
79,6
Azitromicina250 mg
Azitromicina500 mg
100
115
Bisacodilo 5 mg
Captopril 25 mg
Captopril 50 mg
Carvelidol 6,25 mg
Carvelidol 12,5 mg
220
100
100
90
90
30
Policoat YS-1-7003
0,014
Gel de AlOH
Trisilicato de magnesio
Polivinilpirrolidona PVPK90
Policoat YS-30
Almidón Pregelatinizada
Sacarina Sódica
Aspartano
Carbonato de Calcio
Hidroxido de Magnesio
Dioxido de Silicio Coloidal
PH101/PH102
Celulosa microcristalina
Lactosa anhidra
Sacarosa
Gelatina
Croscarmelosa Sódica
Talco
Estearato de Magnesio
Acacia
Lauril Sulfatos de Sodio
Sodio Almidón Glicolato
dihidratado
Fosfato de calcio dibásico
Alcohol Isopropilico
0,13
3
30
11
3,57
1
11
0,22
3,179 9,08 0,27
4,54
158
77,5
77,5
2
4
13
188,3
Lamivudina 150 mg
Lozartan
205
34,63
4,5
4,5
10
23
24
25
Loratadina 10 mg
Lisinopril
Meprobamato 400 mg
100
70,73
5
16
14
200
5,5
26
27
28
29
30
Mefenesina 500 mg
Metformina 500 mg
Mandelamina 500
Moclobemida
Nevirapina 200 mg
160
154,6
204,6
197,9
96
24
8,7
10
60
17,92
9,6
4,8
31
32
33
34
35
Novavir
Omeprazol
Ondasentron
Oseltamivir 75 mg
Orlistab
100
8,21
4
36
37
38
39
40
Pregabalin 100 mg(F-3)
Sildenafil 50 mg
Ribavirina 200 mg
Risperidona 3 mg
42,5
206,2
206
90
166
47
10,66
41
Tadalafil 10 mg
Tadalafil 20 mg
Terazosina 2 mg
Terazosina 5 mg
Triviral 40 mg
188
157
110
110
180
212,2
87,17
3,16 106,4
3,88 91,24
81,64
84,9
125,45
33,54
Zidovudina 100 mg
Zidovudina 300 mg
Montelukast 5 mg
Montelukast 10 mg
Sumatriptan 100 mg
Glimepiride 4 mg
100
158,6
90
184
2,7
4,93
1,26
1,26
5
4,5
9
9
2,8
4,5
4,5
5,61
17
16
20
8
2
4,5
16
5,5
1,92
54,66
1,8
0,12
38
3,6
3,6
8,5
26,1
26,1
18,22
54,66
1,82
12,49
0,57
1
1,35
1
2,2
5
13,5
0,9
2,23
4,44
8,87
3,32
3,3
90
19,2
10,63
4,8 2,18
1,92
1,92
4,8
4,8
39
46,6
2,51
0,45
1,1
0,97
0,96
1,1
1,1
3,6
2,06
4,12
33
13
28
9
2,2
2,2
26,18
25,6
5,4
0,474
21
2
2
17
4
3
3
12
5,05
3
0,3
28
81
0,
6,18
10
6,16
19
39,8
2,7
2,84
0,45
60,41
0,1
0,0
9,47
0,0
0,25 0,658 0,081 0,115 0,49 3,369 0,065
7
13
4
0,
6
0,0
8,18
8,18
9
0,47
6
5,85
0,265
11
0,275
24,54
24,54
16,5
16,5
1,25
3,78
12
85,14
20,6
0,9
0,94
0,292 13,722 0,795 2,4 0,022 0,5 1,7 0,15 0,6 0,351 0,42 0,04 0,1
3
0,
3
3
4,62
39,81
73,84
15,6
0,96
4
27
4
3,75
6
3,15
1,22
0,96
6,16
0,
0,28
0,98
1,1
31,5
1,65 2,13
5,5
5,5
81
6
12,13 62,17 1,14
0,
0,64
50
140
4,12
0,45
0,45
1,1
1,35
3,1
10
8
4,5
5,5
6
3
22
20
37,34
20,3
2,25
40
42,86
2
3,64
3,83
2,19
2
0,9
0,9
69,37
64,89
67
28,35
42,68
28,57
36
21
22
SUMATORIA RELACION DE
MASA DEL EXCIPIENTE/MASA
TOTAL DEL LOTE
SUMATORIA
DE
LOS
PRODUCTOS QUE UTILIZAN EL
EXCIPIENTE
Propilparabeno
Atorvastatina10 mg
Atorvastatina20 mg
9
100
90
150
110
10
46
47
48
Metilparabeno
118,9
Estavudina 40 mg
Efavirenz 200mg (F-0)
Fluconazol 150 mg
Indinavir 200 mg
Itraconazol 100mg(F-0)
45
Manitol
180
15
7,1
110
90
160
42
43
44
14,62
21
54,03
Didanosina 100mg
Enalapril 10 mg
Enalapril 20 mg
15
16
17
18
19
20
Kollidon VA64
Almidón de Maiz
Almidon pregelatinizado
Bicarbonato de Sodio
180
216
200
Celecoxib
Clopidogrel 75 mg
Alcohol Etilico
Lactosa monohidratada
7
Hipromelosa HPMC E10
ASA 500mg
Acido Ascórbico
A. Nicotínico 50mg
Alusil
Alendronato
Amlodipino 10 Mg
8
9
PESO DEL LOTE
PRODUCTOS/EXCIPIENTES
No.
1
2
3
4
5
6
Polivinilpirrolidona PVPK25
Tabla 2. Matriz Producto versus excipientes
3
2
21
10
0,11
1
0,746 0,01 0,003
2
2
1
0
0
0,08 0,024 0,143 0,7443 0,0007
1
1
1
2
1
7E-05
1
0,214 0,273 0,0
1
7
9
Tabla 3. Calificación de los peores casos para excipientes
.
A
Fracción
dentro de
lotes
B
C
No. de prod con
el excipiente
Solub. H2O
1 Hipromelosa HPMC E10
0,292
3
2 Lactosa monohidratada
13,627
28
Poco soluble
3 Polivinilpirrolidona PVPK25
0,7953
21
2,43
5 Bicarbonato de Sodio
6 Almidon pregelatinizado
Excipientes
A/B
2,80
10
10
7,60
0,487
10,00
1
7
6,00
Basta soluble
0,038
1,70
1
4
2,23
12
Muy soluble
0,203
4,74
1
1
2,25
0,0219
2
Muy soluble
0,011
1,20
10
1
4,07
0,4959
2
Muy soluble
0,248
5,58
10
1
5,53
1,73
17
Muy soluble
0,102
2,88
1
1
1,63
8 Kollidon VA64
0,1575
4
Muy soluble
0,039
1,73
7
1
3,24
9 Alcohol Isopropilico
0,6345
3
Muy soluble
0,212
4,91
10
1
5,30
0,35
3
moder Soluble 0,117
3,16
10
4
5,72
11 Sodio Almidón Glicolato
0,4279
12
moder Soluble 0,036
1,66
1
5
2,55
12 Lauril Sulfatos de Sodio
0,036
3
moder Soluble 0,012
1,22
10
5
5,41
13 Acacia
0,137
28
0,005
1,09
1
1
1,03
14 Estearato de Magnesio
0,2988
7
Pract. insoluble 0,043
1,79
4
10
5,26
15 Talco
0,249
13
1,35
0
10
3,78
16 Croscarmelosa Sódica
0,63
4
Basta soluble
0,158
3,91
7
4
4,97
17 Gelatina
0,08
3
Muy soluble
0,027
1,49
10
2
4,50
18 Sacarosa
19 Lactosa anhidra
0,11
0,4899
2
21
Basta soluble
Poco soluble
0,055
0,023
2,02
1,43
10
1
4
7
5,34
3,14
20 Celulosa microcristalina PH101/PH102
21 Dioxido de Silicio Coloidal
3,34
0,064
10
1
Basta soluble
Basta soluble
0,334
0,064
7,18
2,18
1
10
4
4
4,06
5,39
22 Hidróxido de Magnesio
0,11
1
Poco soluble
0,110
3,03
10
6
6,34
23 Carbonato de Calcio
0,7464
2
Poco soluble
0,373
7,90
10
6
7,97
24 Aspartano
0,011
2
moder Soluble 0,006
1,10
10
4
5,03
4 Alcohol Etilico
7 Almidón de Maiz
10 Fosfato de cálcio dibásico dihidratado
Evaluación de A/B Evaluación de B Evaluación de C Evaluación Final
Muy soluble
82
25 Sacarina Sódica
0,0025
1
27 Policoat YS-30
0,078
28 Polivinilpirrolidona PVPK90
0,003
1,04
10
2
4,35
1
moder Soluble 0,078
2,44
10
3
5,15
0,024
1
Basta soluble
0,024
1,44
10
4
5,15
29 Trisilicato de magnesio
0,1428
1
Basta soluble
0,143
3,64
10
3
5,55
30 Manitol
0,744
2
Muy soluble
0,372
7,88
10
1
6,29
31 Metilparabeno
0,00065
1
Basta soluble
0,001
1,01
10
3
4,67
32 Propilparabeno
0,00007
1
Basta soluble
0,000
1,00
10
3
4,67
33 Gel de AlOH
0,2143
1
Poco soluble
0,214
4,96
10
6
6,99
0,27
7
moder Soluble 0,039
1,71
4
3
2,90
0,005
0,0077
0,01
9
1
1
1,01
1,14
1,18
3
10
10
6
6
2
3,34
5,71
4,39
34 Policoat YS-1-7003
35 Colorante
37 Dióxido de Titanio
38 Estearilfumarato Sódico
Muy soluble
Poco soluble
Poco soluble
Muy soluble
0,001
0,008
0,010
Referencias
1.
2.
3.
González González Rafael Olban. Selección de los peores casos para la validación de la limpieza de los principios activos. Octubre 2010.
Agencia Española de Medicamentos y Productos sanitarios. Anexo 15 Calificación y Validación.
3. Hernández Roberto. Utilización de los expertos en el análisis de riesgos. CIM. Oct.2009.
83
Evaluación de la limpieza para el proceso de fabricación de clopidogrel
Alejandro Beldarraín Iznaga y Olban González González
Laboratorios Novatec. Ave. 15, No. 216A03 e/ 216A y 222. Atabey, Playa. C. Habana, Telef. 271-5789; 271-5868; 271-5653 ext 210, 217.
Email:[email protected]; [email protected]
En el presente trabajo se informa de un método genérico por cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) para comprobar
el proceso de limpieza del clopidogrel en su flujo productivo dentro de una planta multiproductos. El método cromatográfico
fue validado utilizando una columna de fase reversa C-18, AL-016084, 250 x 0,46 mm, (Alimatic, Cuba), siendo las
condiciones de corrida, velocidad de flujo, fL = 1 mL/min; fase móvil, 15% Trietilamina pH 3,5 – 85% MeOH a 30 °C y
detección a 233 nm. El desarrollo del método y su validación para el análisis del control de la limpieza, unido a controles
microbiológicos de superficies de equipos limpios son descritos para demostrar la efectividad en los ensayos para el control de
limpieza dentro de las Buenas Prácticas de Fabricación para la Industria Farmacéutica. Para los procesos de mezclado,
troquelación y revestimiento, los límites de aceptación de residuos están por debajo de 10 ppm. El método para cuantificar
clopidogrel, por CLAR-FI, es válido en términos de linealidad, sensibilidad, precisión, exactitud y especificidad. Los
procedimientos de limpieza son eficientes en términos de eliminación de residuos de clopidogrel, ingrediente activo, poco
soluble en agua y medianamente complejo de remover después de fabricado.
Palabras claves: Clopidogrel, Validación de limpieza, CLAR-FI.
Introducción
Los productos farmacéuticos y sus ingredientes activos pueden ser contaminados por otros productos farmacéuticos e
ingredientes activos, por los agentes de limpieza, por microorganismos u otros materiales como lubricantes, partículas de aire,
materias primas, sustancias intermediarias y auxiliares. En muchos casos el mismo equipo puede ser usado para la elaboración
de diferentes productos subsecuentes; es esencial, entonces, no solo un buen procedimiento de limpieza sino también una
adecuada estrategia de validación de limpieza (1-3). El clopidogrel, es un fármaco indicado para la reducción de eventos
ateroscleróticos (infarto de miocardio, infarto cerebral, muerte de causa vascular) en pacientes con antecedentes de
aterosclerosis sintomática definida por infarto cerebral isquémico (desde los 7 días hasta un máximo de
6 meses), infarto
de miocardio o anteriopatía periférica establecida, que Laboratorios Novatec fabrica en sus instalaciones en las presentaciones
de 75 mg (4). En el presente trabajo se informan los resultados alcanzados en la evaluación de la limpieza de este
medicamento en varias de las etapas de su fabricación, incluida la validación del método analítico, por CLAR, utilizado para
los cálculos de límites de residuos.
Sustancia química de referencia: Se pesó en balanza analítica 15 mg de un estándar interno de clopidogrel GL20371107 con
una potencia de 99,09% y se diluyó en 10 mL de MeOH, de donde se tomaron a continuación 3 mL a una concentración de
1,5 mg/mL y se diluyeron a 50 mL con una solución de 85% MeOH-15% H2O. Luego de mezclado por sonicación durante 10
min y filtrado, el patrón a 90 μg/mL fue inyectado directamente a la columna cromatográfica. Todos los materiales analizados
fueron tomados directamente del proceso de fabricación en sus diferentes etapas.
Sistema cromatográfico: El sistema de cromatografía líquida de alta resolución, CLAR, es tipo Smartline (Knauer,
Alemania) compuesto por un administrador Manager 5000, una bomba cuaternaria S-1000, detector UV-2500 todo integrado
al programa ClarityChrom v2.4 para adquisición, procesamiento y reporte de datos (Knauer, Alemania). La separación se
realizó en una columna de fase inversa C-18, AL-016084, 250 x 0,46 mm (Alimatic, Cuba). Las condiciones de corrida
fueron: velocidad de flujo, fL = 1 mL/min; fase móvil, 15% Trietilamina pH 3,5 – 85% MeOH a 30 °C. La detección se
realizó a 233 nm y se inyectaron tres veces 20 μL de la muestra a evaluar.
Hisopado de superficies para análisis de límite de residuos: Los hisopos estériles, listos para su uso tipo Euroturbo®
(Deltalab, España) fueron manipulados antes de muestrear las superficies, humedecidos previamente en la fase móvil de
CLAR que fue utilizada como solución de resuspensión. Todas las superficies hisopadas fueron de aproximadamente
30 cm2.
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Muestreo microbiológico de superficies: El muestreo microbiológico de las superficies, antes y después de limpiar, ser
realizó por placa de contacto (4). Las muestras fueron tomadas en superficies adyacentes a las hisopadas, manteniendo la
placa 10 segundos sobre la superficie por ambos lados.
Estudio de la efectividad del procedimiento de limpieza: La metodología utilizada fue muestrear las etapas de mezclado de
componentes de la formulación en los bines, el proceso de troquelación y revestimiento, después de finalizada las operaciones
industriales para calcular la cantidad de residuos en superficie y posteriormente las mismas superficies luego de aplicado el
procedimiento de limpieza (Figura 1).
Figura 1. Metodología para la validación del proceso de fabricación del clopidogrel tabletas 75 mg.
Para los cálculos de residuos se muestreó y las muestras fueron incubadas 12 h antes de ser inyectadas por triplicado, como se
describe en sistema cromatográfico. Como control positivo, Control (+) se utilizó una muestra de patrón de clopidogrel a una
concentración aproximada de 90 μg/mL y se utilizó la curva de calibración obtenida durante la validación del método (2). La
técnica cromatográfica para la cuantificación de clopidogrel fue validada en correspondencia a los lineamientos internos de la
empresa y demostró ser lineal en el rango 4,5-135 μg/mL, con un límite de cuantificación de 0,6 μg/mL (5).
Para demostrar la efectividad del recobro del método de hisopado se simuló la operación. Para ello se pesaron en 1000 μg de
patrón de clopidogrel, se depositaron en una superficie plana de aceroinoxidable que fue hisopada. Las muestras resultantes se
diluyeron en 10 mL de fase móvil para CLAR y se dejaron incubando a 20±2 °C durante 12 h, para ser finalmente analizadas
por CLAR. Como control positivo, Control (+), fue utilizado un patrón preparado a una concentración de 100 μg/mL y
analizado por triplicado en CLAR.
Resultados
Las respuestas cromatográficas para los controles realizados antes del estudio se presentan en la Figura 2. Como se observa, la
señal característica para el principio activo de clopidogrel, tiene un tiempo de retención de tR =7,19±0,12 min, donde no se
detectan otras señales para otros componentes de la muestra, fase móvil, placebo o hisopo, que puedan contribuir al área final
que se corresponde con la masa recuperada.
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Figura 2. Cromatogramas típicos obtenidos durante la valoración
de clopidogrel para el estudio de limpieza del proceso de
fabricación. Las muestras analizadas fueron:
1) Solución de solubilización (fase móvil utilizada en
cromatografía). 2) Placebo de la formulación (excipiente en
correspondencia a la composición de la tableta sin el ingrediente
activo). 3) Control negativo (hisopo en solución de solubilización
después de 24 horas) y 4) STD clopidogrel GL20371107.
Para los cálculos de residuos se muestreó y las muestras fueron
incubadas 12 horas antes de ser inyectadas por triplicado como se describe en sistema cromatográfico. Como control positivo,
Control (+), se utilizó una muestra de patrón de clopidogrel a una concentración aproximada de 90 μg/mL, utilizándose la
curva de calibración obtenida durante la validación del método (2). La técnica cromatográfica para la cuantificación de
clopidogrel fue validada en correspondencia a los lineamientos internos de la empresa y demostró ser lineal en el rango 4,5135 μg/mL, con un límite de cuantificación de 0,6 μg/mL (5).
Para demostrar la efectividad del recobro del método de hisopado se simuló la operación. Para ello, se pesaron en 1000 μg de
patrón de clopidogrel, se depositaron en una superficie plana de acero inoxidable que fue hisopada. Las muestras resultantes,
se diluyeron en 10 mL de fase móvil para CLAR y se dejaron incubando a 20±2 °C durante 12 horas, para ser finalmente
analizadas por CLAR como se describió anteriormente. Como control positivo, Control (+), fue utilizado un patrón preparado
a una concentración de 100 μg/mL y analizado por triplicado en CLAR.
Estudios de recobro del hisopado de superficie por CLAR
El parámetro más importante a la hora de evaluar un método de hisopado de superficies, es el conocimiento del porcentaje de
recobrado de la operación per se, lo cual determina los niveles de recobro alcanzado y que debe cumplimentar ciertos límites.
Teóricamente el resultado ideal de una simulación de hisopado debe ser cercano al 100%, aunque esto depende de la
solubilidad intrínseca del residuo, la naturaleza de las superficies a hisopar y la solución de resuspensión (1-3). Los resultados
del recobrado alcanzados en nuestro estudio, fueron 93,22±2,23%, valor este muy satisfactorios pues nos indica que todos
nuestros resultados para la evaluación de la limpieza tiene una certeza mayor al 90%. En principio, estos resultados eran
esperados por la selección de la fase móvil de CLAR como solución de resuspensión de las muestras, sin tratamiento posterior
de las mismas. Como las superficies de los equipos a muestrear son de acero inoxidable 316L por diseño, la solución de
solubilización para las muestras nos es corrosiva y muy soluble a la acción posterior del agua de enjuague.
Proceso de mezclado en bines. Para el proceso de mezclado en la etapa de formulación se tomaron 10 puntos que cubren
toda el área de los bines, A = 3,25 m2, muestras antes y después del procedimiento de limpieza (Figura 3). Los resultados de
la evaluación indican una cantidad considerable de residuos no homogéneamente distribuidos en la geometría de los bines,
que luego del procedimiento de limpieza alcanzan valores de residuos por unidad de volumen cercanos al límite de
cuantificación para la técnica analítica utilizada (Tabla 1).
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Figura 3. Muestreo de los bines en la etapa de mezclado de componentes para la fabricación de clopidogrel, tabletas de 75
mg.
Proceso de compresión por troquelación. Para el proceso de compresión solo se muestreó después de limpiado el equipo.
Las muestras tomadas fueron: 1) Estrella alimentadora, 2) Alimentador, 3) Tolva alimentadora, 4) Conducto de alimentación,
5) Torre de punzones, 6) Cavidad de punzones superiores, 7) Cavidad de punzones inferiores, 8) Mesa alimentadora, 9)
Estación de descarga y 10) Vibrador de estación de descarga, los cuales cubren un área superficial equivalente a 2,08 m2
(Tabla 1). Los resultados indican un proceso efectivo de limpieza (Tabla 1).
Proceso de revestimiento: Para el proceso de revestimiento en el bombo, se tomaron muestras antes y después de la cámara
limpia según se indica en la Figura 4. Estos puntos cubren toda la geometría de la cámara que está en contacto con la tableta y
la solución de revestimiento, dándonos una panorámica general de sus condiciones en términos de residuos. Los resultados
indican un proceso efectivo de limpieza (Tabla 1).
Figura 4: Puntos de muestreo dentro del bombo de revestimiento durante la
evaluación de la limpieza para el proceso de fabricación del clopidogrel. Los números
indican: 1) Paleta 1, 2) Rolo 1, 3) pared frontal del bombo, 4) fondo del bombo, 5)
frente del bombo, puerta, 6) Paleta 2 y 7) Rolo 2.
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Tabla 1: Resultados de la evaluación de limpieza para la fabricación de clopidogrel tabletas 75 mg.
Condición
Muestra
Concentración
(μg/mL)
masa μg
Clopidogrel μg/cm2
Proceso de mezclado
Sucio
Control (+)
87,36±0,19
1310,37±2,88
43,68±0,1
Mejor punto
5,01±0,17
75,15±2,51
Peor punto
314,60±1,34
4718,98±20,08
Limpio
Control (+)
87,36±0,19
2,51±0,08
157,30±0,67
1310,37±2,88
43,68±0,10
Peor punto
0,77±0,18
11,55±2,71
0,38±0,09
Mejor punto
0,47±0,05
7,03±0,77
0,23±0,03
Proceso de compresión
Limpio
Control (+)
90,11±0,29
1351,71±4,41
45,06±0,15
Peor punto
0,60±0,06
8,98±0,85
0,30±0,03
Mejor punto
0,51±0,04
7,60±0,53
0,25±0,02
Proceso de revestimiento
Sucio
Control (+)
88,37±0,28
1325,55±4,21
44,18±0,14
Peor punto
1,97±0,07
29,51±1,03
0,98±0,03
Mejor punto
1,16±0,13
17,39±1,98
0,58±0,07
Limpio
Control (+)
90,21±0,07
1353,19±1,04
45,11±0,03
Peor punto
0,58±0,05
8,75±0,72
0,29±0,02
Mejor punto
0,50±0,02
7,51±0,31
0,25±0,01
Para los tres procesos, los análisis microbiológicos después de la limpieza demostraron que todos los puntos registraron
conteos 10 UFC/g para bacterias y hongos, cumpliendo la especificación de producto terminado (3).
Cálculos de límites de residuos permisibles
Para los cálculos de residuos permisibles del producto A, clopidogrel, en un producto B siguiente a fabricar en los mismos
equipos consideramos varios de los productos que tienen menor tamaño de lote en masa y menor cantidad de principio activo
en la formulación (1-3). Las cantidades de principio activo, tamaños de lote y dosis máximas y mínimas diarias (Tabla 2). El
límite permisible de residuos de clopidogrel en lotes de amlodipino, atorvastatina, azitromicina, bisacodilo, carvelidol,
enalapril, montelukast, pregabalin y ribavirina, como producto B, fueron calculadas por la ecuación 1, pero para ello la técnica
analítica para determinar clopidogrel, debe caracterizarse por un límite de detección calculado por la ecuación 2 (1-2).
88
Donde Tam.LtB, Tamaño del lote B; Dos.minA, Dosis mínima del producto A; F.S, factor de seguridad; Dos.maxB, Dosis
máxima de B; Supef, superficie muestreada en cm2; A, área del equipo limpiado y Vs, volumen de la solución donde se
solubilizó la muestra hisopada.
Tabla 2: Cálculo de los límites de residuos permisibles para diferentes productos fabricados en distintas etapas
después de fabricado el clopidogrel 75 mg.
Principio
Activo
Dosis (mg)
Lim. Equipo (mg/cm2)
Tamaño
Lote (kg)
Tecn.
Dosis
(mg)
Dosis
Min
(mg)
Max
LAR
(ppm)
10
Lim.
Equipo
(mg/cm2)
10
750
Límite
(mg/mL)
41,54
Mezclado
Revestimiento
Amlodipino
10
Límite
(mg/mL)
180,00
Atorvastatina
20
206,00
20
20
375
23,77
47,54
37,14
74,28
24,52
12,26
Azitromicina
250
100,00
250
250
30
0,92
1,85
1,44
2,88
0,95
0,48
500
185,15
Bisacodilo
5
220,00
5
5
1500
101,54
203,08
158,65
317,31
104,76
52,38
Clopidogrel
75
188,33
75
75
100
5,79
11,59
9,05
18,11
5,98
2,99
Carvelidol
6,25
90,00
6,25
6,25
1200
33,23
66,46
51,92
103,85
34,29
17,14
12,5
90,00
Enalapril
10
20
180,00
20
20
375
20,77
41,54
32,45
64,90
21,43
10,71
20
90,00
20
20
375
10,38
20,77
16,23
32,45
10,71
5,36
Montelukast
5
10
184,30
Pregabalin
100
42,50
100
100
75
0,98
1,96
1,53
3,06
1,01
0,51
Ribavirina
200
90,00
200
200
37,5
1,04
2,08
1,62
3,25
1,07
0,54
500
500
12,50
90,00
90,00
15
12,5
10
10
600
10
5
0,85
5
10
1500
750
Lim. Equipo (mg/cm2)
Límite Tecn. (mg/mL)
83,08
64,90
129,81
42,86
21,43
1,71
16,62
750
Tecn.
Compresión
1,34
33,23
20,77
41,54
42,53
2,67
25,96
41,54
83,08
85,06
0,88
51,92
32,45
64,90
66,46
0,44
17,14
64,90
21,43
129,81
132,91
8,57
42,86
43,88
10,71
21,43
21,94
Conclusiones
Los resultados informados en el presente trabajo indican: 1) Que el procedimiento de limpieza utilizado en el lecho fluidizado
es eficiente en términos de eliminación de residuos de clopidogrel, ingrediente activo poco soluble en agua y medianamente
complejo de remover después de fabricado, 2) La combinación de CLAR e hisopado en superficies para determinación
microbiológica de microorganismos viables, demostraron ser efectivas y suficientemente cuantitativas para la evaluación de
límites aceptables de residuos de clopidogrel y 3) La metodología seguida en este trabajo, puede aplicarse a cualquier proceso
de fabricación de formas orales sólidas en Lab. Novatec y al equipamiento utilizado en su fabricación.
Referencias
1.
2.
3.
4.
5.
Forman, G. L and Mullen M. V (1993) Determining cleaning validation acceptance limits for pharmaceutical manufacturing
operations. Pharm. Technol. 17 (4) 54-60.
LeBlanc, D (2000) Establishing scientifically justified acceptance criteria for cleaning validation of APIs. Pharm Technol. 24 (7) 160168.
Hwang R.C (2000) How to establish an effective maintenance program for cleaning validation.
Registro Sanitario Clopidogel 75 mg. CECMED M-08-062-BOT 2010.
Beldarraín A. Validación del método para la valoración de clopidogrel producto terminado por CLAR. 2010. Informe Técnico.
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CONTROL DE LA CALIDAD
Estabilidad genética de los bancos de células primarios que expresan la proteína
BM86
Ileana Sánchez Ortíz, Marieta Marín Bruzos, Niuvis Montoya Echevarría, Nemecio González Fernández, Rosa Basulto Morales, Alain
Moreira Rubio y Jesús Zamora Sánchez
Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología de Camagüey. Circunvalación Norte. Apdo. 387. Teléfono: 261024
La extensión de los bancos de células de Pichia pastori MB9 recombinante requiere de un estudio previo de estabilidad
genética. El objetivo de este trabajo fue demostrar que después de un alto número de generaciones se mantiene integrado en el
genoma de esta levadura el gen que codifica para la proteína BM 86. Se calcularon las generaciones celulares en el proceso
productivo de esta proteína y se diseñó una fermentación que duplicara este número. Mil colonias del final del proceso se
replicaron a medio mínimo de levadura (MSS) con y sin histidina para determinar el porcentaje de conservación de este
marcador de selección. El ácido desoxirronucleico (ADN) de 10 colonias se purificó y se realizó una reacción en cadena de la
polimerasa (RCP) con los cebadores 5’ GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3’ del promotor AOX1 y 5’
CCCAAAATTATTAAGAGCGCCTCC 3’ del terminador GAPt y se secuenció la banda de ADN por Macrogen. También se
realizó un Southern blot del ADN digerido con Eco RI. El marcador de selección se conservó en el 99,3% de las colonias y la
secuencia de ADN mostró una homología del 100% con la secuencia inicial del banco de células. El patrón de integración del
gen bm86 fue el esperado, dando una banda con una talla de 8,9 kb. La cepa después de 90 generaciones es estable
genéticamente y conserva intacto el gen para la expresión de la proteína BM86. La cepa Pichia pastori MB9 mantiene las
características del clon inicial después de 90 generaciones, lo que garantiza su utilización cómo fuente de nuevos Bancos de
células.
Palabras clave: Estabilidad genética, recombinante; Pichia pastori, bancos de células
Introducción
El análisis de la estabilidad genética de las células de un banco es imprescindible para determinar que la secuencia que
codifica para el producto final es correcta y se mantiene en las células hasta el final del proceso (1). Mutaciones a nivel de la
secuencia genética producidas por las células pueden ser incorporadas y mantenidas, dando como resultado final una proteína
cuyas características pueden ser adversas en su utilización posterior (2).
Los bancos de células de la cepa recombinante Pichia pastori MB9 garantizan la integridad genética de este sistema de
expresión cuando se almacenan en condiciones estables. Esta levadura tiene integrada a su genoma el gen para la expresión de
la proteína Bm86, ingrediente farmacéutico activo de la vacuna contra la garrapata Gavac. Las regulaciones (2) establecen que
para construcciones integradas es posible preparar nuevos Bancos de Células Primario (BCP) o de Trabajo (BCT) mediante
extensiones a partir de un BCP inicial, pero esto debe ser avalado por un estudio de número de generaciones que demuestre el
mantenimiento de la información de interés en el genoma celular.
A partir de lo anterior el objetivo de este trabajo fue demostrar que después de alcanzar el número de generaciones del proceso
productivo, la cepa recombinante P. pastori MB9 conserva integra la información genética para la expresión de la proteína
BM86.
Medios de cultivos y soluciones. Se empleó en la fermentación el medio mínimo salino (NH4)2SO4 (11,5 g/l), KH2PO4 (14,5 g/l),
MgSO4 · 7H2O (3,9 g/l), CaCl2· 2H2O (0,22 g/l), EDTA (0,41 g/l), solución de vitaminas 400 X (2,6 mL/l), solución de sales trazas
1000 X (1,03 mL/l) al que se ajustó pH a 4,7 ± 0,1 con solución amoniacal (0,25%) y se esterilizó a 1 atmósfera durante 15
minutos. La solución de vitaminas 400 X (K2HPO4 (0,8 g/l), Pantotenato de calcio (0,8 g/l), Diclorhidrato de tiamina (0,8 g/l),
Myo-inositol, (1,6 g/l) Nicotinamida o ácido nicotínico(0,2 g/l), Clorhidrato de piridoxal (0,8 g/l), D(+) Biotina (0,8 g/l)) y la
solución de sales trazas 1000 X ZnSO4 · 7H20 (10,0 g/l), CuSO4 · 5H20 (1,0 g/l), KI (0,4 g/l), MnSO4 · H2O (0,2 g/l), Na2MoO4 ·
2H2O(1,4 g/l), H3BO3(0,095 g/l), FeCl3 · 6H2O (23,8 g/l) se esterilizaron por filtración.
90
Determinación del número de generaciones del proceso productivo. El número de generaciones celulares se calculó según lo
descrito para un cultivo en fase exponencial (3). Los números de células iniciales y finales se obtuvieron de los expedientes
maestros de los lotes de fermentación realizados en el CIGB Camagüey a partir del año 2002 y hasta el 2008.
Proceso de fermentación de la cepa Pichia pastoris MB9. A partir del número de generaciones histórico del proceso
productivo de la proteína BM86, se diseño una fermentación dónde al final se duplicara este parámetro cinético. En
condiciones asépticas se inocularon 3 colonias en un erlenmeyer con 50 de medio salino. El frasco se incubó a 28 ± 2 ºC y
250 rpm durante 48 horas. A partir de este se inocularon 100 µl del cultivo en otro frasco con 50 de medio salino y se incubó
en iguales condiciones. El procedimiento anterior se repitió hasta 10 veces. El cultivo en 50 se añadió en 450 de medio salino
estéril con iguales parámetros de incubación.
La fermentación en el biorreactor con un volumen inicial de 2 litros, se dividió en tres etapas: crecimiento en glicerol, shock
con metanol e incremento con flujo exponencial de metanol. Los parámetros iniciales de operación fueron temperatura 30 °C,
agitación 750 rpm, aireación 1,5 vvm (3 L/min) y pH 3,5. A partir de la adición de metanol se controló automáticamente el pH
a 5,5. El flujo inicial de metanol fue de 1,99 mL/h y se incrementó exponencialmente a una velocidad de 0,035 h-1.
Obtención de colonias. Se realizaron diluciones decimales seriadas hasta 10-7 y se sembraron 100 µl de las últimas 3
diluciones por diseminación con espátula de Drigalsky en medio Agar Triptona Soya. Las placas se incubaron durante 72 h a
30 ± 2 ºC.
Purificación de ADN cromosomal. El ADN cromosomal se purificó según el manual de Sambrook, Frisch y Maniatis (1989)
(4).
Reacción en cadena de la polimerasa (RCP). Se utilizaron los oligos: 5’ GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3’
CCCAAAATTATTAAGAGCGCCTCC 3’
y 5’
La reacción se realizó a partir de 20 ng de las muestras de ADN de colonias del final de la fermentación con más de 90 pases y
se tomó cómo control positivo una muestra de ADN purificada directamente del Banco de Células Primario. Consistió en 1
ciclo de 1 minuto a 94 °C, 1 minuto a 56 °C y 2,5 minutos a 72 °C. Se repitió 35 veces el ciclo y a continuación 5 minutos a
72 °C y se enfrió a 10 ºC.
Determinación de Marcadores de Selección. Se replicaron 1000 colonias obtenidas del final de la fermentación a medio
mínimo de levadura (MSS) con y sin histidina. Se contaron las colonias y para determinar la conservación del marcador de
selección se calculó el porcentaje de colonias que crecen en medio con histidina en relación al número de colonias en medio
sin este aminoácido.
Secuencia del gen. Las bandas obtenidas por PCR se purificaron y secuenciaron en la firma Macrogen a partir de los
siguientes cebadores. AOX1 (GACTGGTTCCAATT GACAAGC), BMI (CGTGCAAGACAAGGGAGTGCAGC), BMM
(GGCTCTACCGT CGCCGAAGATGGC), BMM2 (CAGGAAACTACAAGCATGCGAGC),
BMM3 (GGG
AGCCTGCCAAAGACTCTTGC) y BMM4 (TCCCCTATCCGACCGATGTC).
Resultados
En la Tabla 1 se muestra el cálculo del número de generaciones por etapas del proceso productivo
Tabla 1. Resultado de la determinación del número de generaciones en fermentaciones para la obtención de la proteína
BM86.
Etapa de fermentación
Número de generaciones
27 L
38,8
150 L
4,6
La levadura Pichia pastori cepa MB9 utilizada en la producción de la proteína BM86 alcanza 43,5 generaciones en el proceso
fermentativo establecido para la obtención del inmunógeno de la vacuna Gavac.
91
La fermentación en el biorreactor después de un gran número de subcultivos de la cepa se desarrolló satisfactoriamente y
alcanzó una biomasa final de 300g/L. (Figura 1)
1,0E+11
Viabilidad (UFC/mL)
Peso húmedo (g/L)
1000
100
10
1,0E+10
1,0E+09
1,0E+08
1
0
20
40
60
80
1,0E+07
100
0
Tiempo (h)
20
40
60
80
100
Tiempo (h)
A
B
Figura 1. Cinética decrecimiento por peso húmedo (a) y por conteo de células viables (b) de la cepa Pichia pastori MB9 en biorreactor de
2L a 750 rpm y 30 ºC después de un alto número de generaciones celulares.
Después de 90 generaciones la determinación del marcador de selección en muestras del final de la fermentación se conservó
en el 99,3 % de las colonias (Tabla 2)
Tabla 2. Número de colonias crecidas en los medios de cultivos MSS con y sin histidina y porcentaje de conservador del
marcador de selección después de 90 generaciones.
Colonias en medio MSS +histidina
1000
Colonias en medio MSS
993
% de conservación del marcador de selección.
99,3%
El PCR realizado con cebadores que se unen al promotor AOX1 y en el terminador GAPt del gen, permitió la detección de la
banda de interés con una altura aproximada de entre 2-2,3 kb que se corresponde con lo esperado tanto en el ADN de las
colonias obtenidas al final de la fermentación (1-4) con un alto número de generaciones cómo en el ADN obtenido
directamente del Banco de Células Primario (Figura 2).
Tabla 3. Resultado del análisis del Southern Blot realizado a 10 colonias del Banco de
Digestión/ADN
EcoR I
1
2
3
4
ADN de MP36( control negativo)
No hibrida
5
ADN del Banco de Celulas
Banda de
8,9 kb
C - PM
92
pCAMBIA2300 (control positivo)
Banda de 10,7 kb
Figura 2. Banda del gen BM86 amplificado por reacción en cadena de la polimerasa a partir de ADN de colonias de una fermentación con
más de 90 generaciones (1-4) y de ADN de colonias obtenidas directamente del BCP (5). C- cepa Pichia pastori MP3 utilizada cómo
control negativo. PM. ADN del fago Lamda digerido con Hind III.
El análisis de la secuencia de ADN del gen después de 90 generaciones presentó una homología del 100 % con la secuencia
reportada en el chequeo inicial realizado al BCP. Los extremos de la molécula no presentan mutaciones respecto a lo
reportado por Rand y colaboradores en 1989 (5) y se mantienen las modificaciones encontradas en el resto de la molécula.
El estudio de estabilidad genética de la construcción fue satisfactorio y demostró que la cepa después de 90 generaciones es
estable genéticamente y conserva intacto el gen para la expresión de la proteína BM86.
Conclusiones
La cepa Pichia pastori MB9 mantiene las características del clon inicial después de 90 generaciones lo que garantiza su
utilización cómo fuente de nuevos Bancos de Células.
Agradecimientos
Agradecemos su colaboración a Amilcar Arena Cruz1, Zeila Santana Vázquez, Maida Candelario Frómeta, Leonardo Martín
Martín, Eladio Salazar Gómez, Diasmarys Salinas Rodríguez, de los centros de Ingeniería Genética y Biotecnología de
Camagüey e Ingeniería Genética y Biotecnología, de Ciudad de La Habana, respectivamente.
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Evaluación de la estabilidad de la cepa Brevundimonas diminuta conservada en leche descremada
al 20%
Nancy Burguet Lago, Jennys Roldán Bosmenier, Nelson Sierra Prado, José A. Trimiño Romero.
Laboratorios Liorad. Calle 27 A / 264 y 268 Rpto. San Agustín La Lisa. Ciudad Habana Cuba.
Para el mantenimiento y conservación de la cepa Brevundimonas diminuta, se reconoce internacionalmente el empleo de
Caldo Lactosa Salina (CLS) o Pasta de Células Congeladas (PCC), ambos efectivos en la producción de suspensiones de este
microorganismo que alcanzan altos índices de supervivencia. En este trabajo se evaluó la estabilidad de esta cepa empleando
el Caldo Triptona Soya (CTS) como medio de crecimiento y la leche descremada al 20% como sustancia lioprotectora y la
liofilización como método de conservación durante un período de 18 meses. Los resultados obtenidos demuestran que el
método empleado ha permitido una excelente estabilidad durante el tiempo objeto de estudio.
Palabras clave: Brevundimonas diminuta 1, estabilidad 2, sustancia lioprotectora 3.
Introducción
La colección de cultivos microbianos debe mantener cepas viables sin cambios morfológicos, fisiológicos o genéticos y
dominar algunas técnicas y metodologías para su mantenimiento y conservación, entre los que se puede citar la liofilización,
método por excelencia para la conservación de microorganismos a largo plazo (5,7).
93
Las cepas de referencia depositadas en colecciones de cultivo de microorganismos en laboratorios de control de la calidad de
la industria biofarmacéutica, son usadas en esquemas de certificaciones de calidad, el microorganismo Pseudomonas
diminuta, actualmente reclasificado como Brevundimonas diminuta, se encuentra registrada en la Colección Americana de
Cultivos Tipo ATCC con el número 19146 (2). Es el microorganismo estándar para las pruebas de reto bacteriano, las cuales
son utilizadas para determinar el grado de esterilización de un filtro durante la validación de los procesos de filtración, siendo
este el método de elección para la esterilización en las producciones de medicamentos sensibles al calor y de uso parenteral.
(3, 4).
Para la conservación de este microorganismo, se reconocen dos métodos estándares: el Caldo Lactosa Salina (CLS) y la Pasta
de Células (PCC), en este trabajo formulamos otra variante para su conservación a largo plazo y propusimos como objetivo la
evaluación de de la estabilidad de la cepa Brevundimonas diminuta conservada en leche descremada al 20% (14, 17).
Para la obtención de la suspensión de microorganismos a liofilizar se restituyó el ámpula original de la cepa Brevundimonas
diminuta con medio de cultivo Caldo Triptona Soya (CTS) a su volumen de liofilización y se diseminó en forma de césped 20
µl de la suspensión del microorganismo, en una placa de Triptona Soya Agar (TSA), la que se incubó de 18- 24 horas de 30 35 °C, y a la que se le realizó tinción de Gram para comprobar la pureza, se tomó un cuarto del crecimiento del cultivo con un
hisopo estéril y se inoculó un erlenmeyer que contenía 100 ml de (CTS) el que se colocó 37 °C durante 2 horas en zaranda a
150 – 170 rpm, una vez transcurrido el periodo de incubación se centrifugó a 10000 rpm por 30 minutos, se desechó el
sobrenadante y se resuspendió la biomasa con (CTS) , se tomó muestra para realizar el ensayo de pureza y viabilidad antes del
proceso de liofilización.(9,17).
Se distribuyó 1ml del cultivo de forma homogénea en bulbos estériles y se adicionó igual cantidad de leche descremada al
20% como sustancia lioprotectora para su conservación, se colocó el tapón sobre la boca del bulbo y este sobre la bandeja de
una liofilizadora experimental de laboratorio, una vez concluido el proceso, los bulbos se sellaron al vacío y fueron
identificadas con una etiqueta con los siguientes datos: género y especie, código de la cepa, número de lote y fecha de
liofilización, se tomó muestra para ensayo de viabilidad y pureza y posteriormente se almacenaron entre 2 y 8˚C para
garantizar su estabilidad a largo plazo, se les realizaron controles de calidad con una frecuencia semestral. (10,15).
Para demostrar la estabilidad genética de este cultivo, a los 18 meses se le realizó observación macroscópica y microscópica
de las colonias crecidas, se observaron las características tintoríales mediante la técnica de tinción de Gram, para determinar
caracteres fenotípicos se utilizaron pruebas que permiten identificar la presencia de la enzima citocromo oxidasa,
fermentaciones de glucosa, manitol, sorbitol, sacarosa, inositol y rafinosa, descarboxilación de lisina y arginina, utilización del
citrato y el malonato, y la hidrólisis de la urea y de la O-N-galactosidasa (ONPG) , para los ensayo.se empleó el Sistema
Enterosystem 18 R que se comercializa para identificación de bacterias Gram negativas, para la comprobación de la motilidad
se utilizó el medio para este fin, preparado en tubos a razón de 10 ml y solidificado en columna, se realizó una siembra por
punción central hasta una profundidad de 5 cm y se incubó durante 48 horas a 37 0C.(6, 13).
La viabilidad y la pureza se realizaron según los Procedimientos Normalizados de Operación (PNO) establecidos en el
laboratorio para el control de calidad de las cepas, se tomó como criterio de aceptación cultivos puros con un orden de
viabilidad mayor a 10 5 UFC/ml. (11), (12)
Resulta importante destacar que la determinación de la pureza, en todas las etapas evaluadas demostró la presencia de cultivo
puro, no se detectó ningún contaminante a las 24 y 72 horas de incubación, la observación microscópica de frotis teñidos,
evidenciaron bacilos muy pequeños, Gram negativos, lo que coincide con lo reportado en el certificado de análisis de esta
cepa por la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) lo que permite plantear que el método de conservación empleado
permite reducir al mínimo la posibilidad de contaminación.(1,11).
La información obtenida a través de las características morfológicas – tintoriales y culturales se corresponden con el
microorganismo en estudio, las colonias observadas fueron de pequeño a mediano tamaño, redondeadas, grisáceas, de
consistencia homogénea y brillosa (3, 6).
Los resultados de las pruebas bioquímicas que se muestran en la tabla 1, coincidieron con lo reportado en el certificado de
calidad, el crecimiento de este microorganismo en presencia de los azucares probados mostró reacciones negativas en todos
los casos, ya que no posee la enzima que permite metabolizar los mismos, este es un comportamiento descrito en bibliografía
como característico de los microorganismos fermentadores, de igual forma no posee la capacidad enzimática para
94
descarboxilar los aminoácidos probados lisina y arginina, mostrando respuesta negativa , tampoco es capaz de emplear el
citrato y el malonato como única fuente de carbono, ni posee la capacidad de hidrolizar la urea y la O-N galactosidasa, el
crecimiento en el medio fluido para la detección de motilidad mostró resultado positivo al observarse una zona difusa con
enturbiamiento del medio alrededor del sitio de inoculación , lo que demostró la presencia de flagelo polar, la reacción de la
oxidasa de igual forma resultó positiva lo que muestra que posee la enzima citocromo oxidasa. (1, 6, 8).
Tabla 1. Muestra los resultados de las reacciones bioquímicas de la cepa Brevundimonas diminuta (ATCC19146)
Identificación Bioquímica
Descarboxilación de la lisina
Descarboxilación de la arginina.
Utilización del citrato
Utilización del malonato
Hidrólisis de la urea
Hidrólisis de ON-galactosidasa (ONPG)
Fermentación de la Glucosa
Fermentación del Manitol
Fermentación del Sorbitol
Fermentación del Inositol.
Fermentación de la Sacarosa
Fermentación de Rafinosa.
Motilidad.
Oxidasa
Resultados de las reacciones Bioquímicas
Reacción Positiva
Reacción Negativa
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(+)
(+)
Teniendo en cuenta, además, la información ofrecida por los resultados de las pruebas bioquímicas y tomando como
referencia que no se ha excedido de tres pases de la cepa original, podemos concluir que constituye una evidencia que se
corresponde con la cepa Brevundimonas diminuta por lo que se demostró la estabilidad genética de este cultivo (7).
Aunque la literatura consultada refiere otros métodos para el mantenimiento y conservación de esta cepa, los resultados de la
viabilidad obtenido durante el periodo de estudio (Tabla 2) indican que el método elegido cumple con uno de los objetivos
fundamentales a tener en cuenta al escoger un método de conservación, que es garantizar al menos la supervivencia del 70%
de las células. (12,14)
Tabla 2. Muestra los resultados del estudio de viabilidad y pureza de la cepa Brevundimonas diminuta (ATCC19146)
durante un periodo de 18 meses.
Viabilidad (UFC/ml)
Microorganismo
Antes
de liofilizar
Después
liofilizar
Brevundimonas
diminuta
3,1 x 109
3,8 x 108
de
6
Meses
12
Meses
18
Meses
Pureza
1,8x108
2,9x107
1,9x107
Cumple
Debe tenerse en cuenta que en este trabajo los resultados no resultan aún concluyente, ya que el tiempo que llevan esta cepa
depositada en la colección es de apenas 18 meses, haciendo esta consideración, se puede decir que la elección del método de
conservación empleado resultó efectivo, esto corrobora lo que se ha venido reportando internacionalmente, que no existe un
método único para la conservación de los cultivos microbianos, lo importante es considerar métodos y medios activos para la
conservación de cepas, el método ideal es el que pruebe adecuadamente su validez en el mantenimiento de las características
morfológicas y fisiológicas de la misma (5,7,16,17).
Los resultados obtenidos con esta cepa reafirman 100% lo descrito por otros autores y otros estudios similares realizado en el
laboratorio con otras cepas de referencias, que la liofilización debido a sus numerosas ventajas tales como la pérdida mínima
de la viabilidad, fácil reconstitución lo que hace más exacta la dosificación y estabilidad prolongada es el método más
empleado por las colecciones internacionales de cultivos tipo para la conservación de los microorganismos En este caso se
evidenció que el aditivo que se añadió con el objetivo de mejorar las características del producto durante el proceso de
liofilización fue capaz de mejorar la apariencia del producto (14, 15).
95
Conclusiones
La cepa de referencia Brevundimonas diminuta conservada en leche descremada al 20% se mantuvo estable en el período
evaluado, confirmando la factibilidad del método de conservación empleado y garantizando la confiabilidad de los ensayos
realizados en el control de la calidad, donde se utilicen suspensiones de cultivo de este microorganismo.
Referencias
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Métodos analíticos para cuantificación de azitromicina
Alejandro Beldarraín Iznaga, Adalberto Izquierdo Castro y Valia Vergel de la Osa
Laboratorios Novatec. Ave. 15, No. 216A03 e/ 216A y 222. Atabey, Playa. C. Habana, Telef. 271-5789; 271-5868; 271-5653
ext 210, 217.
El presente trabajo informa dos métodos para la determinación de azitromicina producto terminado, uno por cromatografía
líquida de alta resolución (CLAR) con detección UV a 210 nm y otro por espectroscopia de infrarroja con transformada de
Fourier (EIRTF) en el rango de 700-2000 cm-1, como alternativa al método tradicional de CLAR con detección
electroquímica. El método cromatográfico se realizó con una columna de fase reversa C-18, 15 x 0,46 cm (Alimatic, Cuba);
siendo las condiciones de corrida, velocidad de flujo, fL = 1 mL/min; fase móvil, tampón NaH2 PO4 45 mmol/L pH 3,0: AcN
45:15 (v/v) a 37 °C y la fase acuosa conteniendo 2 mmol/L de heptanosulfonato de sodio. Para la EIRTF se desarrollo una
metodología utilizando las potencialidades del programa informático Enzomic (Thermo Scientific, USA). Para 25 lotes de
cápsulas y 20 de tabletas fabricados en el año 2009-2010, ambos métodos demostraron ser muy reproducibles para la
96
identificación del principio activo, la determinación de la uniformidad de dosis, porcentajes de valoración y disolución,
demostrándose que pueden eficientemente ser utilizados durante el análisis analítico rutinario para la liberación de lotes
fabricados. Con la combinación de ambas metodologías fueron liberados analíticamente 25 lotes de cápsulas y 12 de tabletas
fabricadas 2010, permitiéndonos una respuesta adecuada y una alternativa viable ante una contingencia logística.
Palabras clave: Cuantificación de azitromicina, CLAR, EIRTF 2.
Introducción
El azitromicina, antibiótico macrólido semisintético, es el ingrediente farmacéutico activo de un medicamento indicado para el
tratamiento de infecciones leves a moderadas provocadas por una gran variedad de bacterias gran negativas y positivas, que en
dosis de 250 y 500 mg fabrica Laboratorios Novatec (1). Una gran variedad de métodos analíticos han sido informados para
determinar la cantidad de principio activo en formas farmacéuticas diversas considerando que el método cromatográfico
descrito en Farmacopea utiliza una fase móvil a pH 11 y una columna muy específica “gamma-alumina” con detección
electroquímica el cual es muy caro y dificultoso en ejecutar por cuestiones claras de logística, siendo necesario en términos de
control de calidad contar con métodos efectivos y asequibles (2-7). El presente trabajo informa dos métodos para el análisis de
Azitromicina en formas farmacéuticas sólidas orales por espectroscopia de infrarrojo con transformada de Fourier (EITR) y
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR) que pueden eficientemente ser utilizados durante el análisis analítico
rutinario para la liberación de lotes fabricados como una alternativa viable ante una contingencia logística por falta de aquellos
componentes descritos en el método oficialmente registrado (8).
Espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (EITF): La identificación de azitromicina por EITR se realizó en
un espectrofotómetro Nicolet IR200 (Thermo Electron Scientific Instrument Co., USA) con detección ATR desde 4000 cm-1
hasta 700 cm-1 a 6,25 cm-1/minutos en una placa de cristal de germanio. Los espectros obtenidos fueron tratados y analizados
por el software EZ OMNIC (Thermo Electron Scientific Instrument Co., USA). Los resultados fueron comparados frente a un
estándar de trabajo de azitromicina, STD Azitromicina Lote 0707002 y varios lotes de tabletas, liberados según las
especificaciones vigentes. La identificación de los picos espectrales se realizó con el software EZ OMNIC (Thermo Electron
Scientific Instrument Co., USA) considerando un umbral absoluto de 100% y una sensibilidad de 60%. El cálculo del
porcentaje de similitud espectral en función de los picos identificados y el área total de los picos en la zona de mayor similitud
espectral, se realizó con el mismo software. .
Sistema cromatográfico: El sistema de cromatografía líquida de alta resolución es tipo Smartline (Knauer, Alemania)
compuesto por un administrador Manager 5000, una bomba cuaternaria S-1000, detector UV-2500 todo integrado al programa
ClarityChrom v2.4 para adquisición, procesamiento y 3 reporte de datos (Knauer, Alemania). La separación se realizó en una
columna de fase inversa C-18, 15 x 0,46 cm (Alimatic, Cuba). Las condiciones de corrida fueron ligeramente modificadas de
las informadas por Yang y col. (2009): velocidad de flujo, fL = 1 mL/min; fase móvil, tampón NaH2 PO4 45 mmol/L pH 3,0:
AcN 45:15 (v/v), 2 mmol/L de heptanosulfonato de sodio y temperatura de 37°C. La detección se realizó a 210 nm y se
inyectaron 20 μL de la muestra a una concentración de 1 mg/mL. Cálculos: Los porcentajes del principio activo presente en
tabletas y cápsulas fueron calculados por la relación entre las áreas de la muestras problemas frente al áreas del estándar de
referencia o de lotes de contenido conocido preparados todos una concentración de 1 mg/mL.
Cálculo del contenido de principio activo en tabletas y cápsulas por EIRTF. La tableta de 500 mg de azitromicina tiene
una formulación en la cual aproximadamente el 77% corresponde al principio activo, 3,4% de fosfato de calcio dibásico, 9,8%
de sodio almidón glicolato, 4,9% de polivinilpirrolidona K-25. Por otra parte la cápsula de 250 mg de azitromicina se
compone aprox. De 62% de principio activo, 28% lactosa y 10% de almidón de maíz (1). Estas proporciones para ambas
formas farmacéuticas permiten su cuantificación por EIRTF considerando que la mayoría de la intensidad espectral debe
corresponder a la estructura química del principio activo. En la Figura 1 se observan los resultados obtenidos en los análisis
espectrales para tabletas de 500 mg y cápsulas de 250 mg de Azitromicina. Los espectros típicos para ambas formas
farmacéuticas, señales 3-8, tienen una similitud espectral 76-82% y 60-65% para tabletas y cápsulas respectivamente frente al
estándar de referencia, señal 2, lo cual puede explicarse por la proporción del principio activo en ambas formulaciones. Sobre
estas evidencias, estudiamos la posición de los máximos espectrales para obtener una correlación que permita identificar los
grupos funcionales del principio activo de ambas forma farmacéuticas frente al espectro del estándar.
Tanto para tabletas de 500 mg como cápsulas de 250 mg comprobamos que existe una gran correspondencia por posición e
intensidad de varios de los picos presentes en los espectros para los lotes fabricados en las longitudes de onda 834, 858, 958,
97
993, 1004, 1033, 1049, 1082, 1156, 1168, 1189, 1252, 1270, 1341, 1377, 1720 cm-1, al ser comparado con el estándar de
referencia indicando claramente que las muestras analizadas se corresponden con Azitromicina producto terminado. Estos
resultados indican que la región 1300-960 cm-1 es donde la similitud espectral para ambas formas farmacéuticas alcanza un
95% frente al estándar de referencia, correspondiendo la diferencia a la 4, contribución de los excipientes que componen la
formulación. Por lo tanto, esta región fue integrada para calcular el área de respuesta y cuantificar así el porcentaje de
principio activo en ambas formas farmacéuticas para compararlas frente al estándar de referencia y lotes de ambas formas
farmacéuticas liberados en correspondencia con el método analítico descrito en el registro sanitario (Tabla 1). Cuando
comparamos las respuestas en áreas para lotes de tabletas y cápsulas en estudio frente a lotes de las mismas formas
farmacéuticas analizados con el método analítico descrito en el registro sanitario, y tomados como referencia para nuestro
trabajo, comprobamos que la valoración relativa en términos de porcentaje de principio activo de los lotes en estudio cumple
el criterio de aceptación para la valoración de 90-110% (8). Comparados las áreas con la calculada para el estándar
comprobamos que los valores de valoración relativa decrecen menos de 3% lo cual indica que los valores calculados cumplen
con la especificación establecida para este parámetro.
Figura 1. Comportamiento espectral por EIRTF para lotes de tabletas revestidas de Azitromicina 500 mg fabricadas en Laboratorios
Novatec. Las señales corresponden a; Izquierda: 1) Línea Base espectral; 2) STD Azitromicina Lote 0707002; 3) Promedio de lotes de
referencia de tabletas; 4) Lote de Tableta 1; 5) Lote de Tableta 2; 6) Lote de Tableta 3; 7) Lote de Tableta 4 y 8) Lote de Tableta 5.
Derecha: 1) Línea Base espectral; 2) STD Azitromicina Lote 0707002; 3) Promedio de lotes de referencia de cápsulas; 4) Lote
de Cápsula 1; 5) Lote de cápsulas 2; 6) Lote de cápsulas 3; 7) Lote de cápsulas 4 y 8) Lote de cápsulas 5.
Tabla 1. Tabletas y cápsulas fabricadas Laboratorios Novatec cuantificadas por EIRTF como método alternativo.
Área
unidades
Lote
1 (n = 5)
2 (n = 5)
3 (n = 5)
4 (n= 5)
5 (n =5)
Referencia (n = 15)
STD Azitrom
Tabletas 500 mg
10,56±0,10
10,57±0,08
10,11±0,11
10,24±0,16
10,00±0,15
10,11±0,33
10,55±0,26
Cápsulas 250 mg
5,090±0,079
5,155±0,017
5,167±0,07
5,272±0,088
5,186±0,032
5,063±0,27
5,272±0,006
98
Valoración relativa
%
Tabletas 500 mg
104,42±0,08
104,58 ±0,06
99,99 ±0,08
101,28 ±0,11
98,90 ±0,12
97,62±3,44
100
Cápsulas 250 mg
100,56±1,50
101,83±0,32
102,07±1,33
104,14±1,62
102,45±0,62
96,14±2,97
100
Estos resultados indican que la EIRTF puede ser utilizada para calcular la valoración relativa de tabletas y cápsulas de
azitromicina con un error menor del 5%, pudiendo ser utilizado como un método alternativo en contingencias logísticas por
falta de los insumos necesarios del método registrado. Siguiendo este procedimiento, fueron liberados analíticamente 6 lotes
de tabletas y 8 cápsulas fabricados en el 2010. Por este método puede evaluarse los porcentajes de valoración y uniformidad
de contenido según especificaciones. Sin embargo el porcentaje de disolución no es posible evaluarlo por la configuración del
instrumental disponible, lo cual es necesario realizarlo por técnicas de CLAR.
Cálculo del contenido de principio activo en tabletas y cápsulas por CLAR con detección UV
El método utilizado fue una adecuación del descrito por Yan y col (7), donde ajustamos la concentración de la muestra
inyectada, la temperatura durante la separación fue elevada 12°C y la composición de la fase móvil. Los cromatograma que
caracterizan la separación indican un tR = 6,861±0,019 minutos (0,273%), Área = 57,993±0,755 mV s (1,302%), Altura =
3,639±0,050 mV (1,379%), además de la ausencia de otros picos cuantificables dentro de un umbral superior a 0,01 mV,
indicativos de la ausencia de compuestos de degradación formados durante la fabricación de ambas formas farmacéuticas
(Figura 2). Los porcentajes del principio activo calculados según las áreas obtenidas para tres inyecciones cumplen con las
especificaciones vigentes (Tabla 2).
Figura 2. Cromatogramas típicos obtenidos para la cuantificación de azitromicina, tabletas de 500 mg y cápsulas de 250 mg, utilizando un
método alternativo por CLAR con detección UV. Las señales son: 1) STD azitromicina Lote 0707002, 2) Lote de Tableta 1, 3) Lote de
Tabletas 2, 4) Lote de cápsulas 1, 5) Lote de cápsulas 2, Lotes de cápsulas 3.
Tabla 2: Cuantificación de azitromicina por CLAR con detección UV.
Inyección
Lote 1
1
2
3
4
5
Promedio
DE
DER
Lote 2
97,1
98,44
98,78
99,03
98,37
98,34
0,74
0,76
Tabletas
Lote 3
98,89
100,29
99,61
100,08
99,67
99,71
0,54
0,54
Cápsulas
Lote 1
100,57
100,97
98,89
99,11
99,24
99,76
0,94
0,95
99
100,25
99,84
99,56
99,08
99,36
99,62
0,45
0,45
Lote 2
97,22
98,07
97,87
98,67
98,24
98,01
0,53
0,54
Lote 3
99,33
99,08
100,37
99,37
99,22
99,47
0,51
0,52
Como se observa, los resultados son muy reproducibles en términos de cuantificación de principio 7 activo de azitromicina
indicando un comportamiento similar durante el proceso de separación cromatográfica, independientemente de la forma
farmacéutica analizada. Cabe destacar que los perfiles cromatográficos son muy similares a los informados por Yang y col (8)
independientemente de las variaciones realizadas al método para hacerlo mas simple en la preparación y ejecución analítica.
Conclusiones
Los métodos informados en este trabajo demostraron ser apropiados para la cuantificación de azitromicina y fueron utilizados
satisfactoriamente para la liberación analítica de 25 lotes de cápsulas y 12 de tabletas fabricadas en el 2009-2010 en términos
de porcentaje de valoración, uniformidad de contenido y disolución en correspondencia a los criterios definidos en el registro
sanitario, quedando pendiente su validación la cual es ejecutada en la actualidad. Ambas variantes constituyen alternativas
viables para cualquier laboratorio analítico por lo que serán incluidas en un futuro cercano en el registro de sanitario
correspondiente.
Referencias
1.
2.
3.
4.
5.
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8.
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Biomedical Analysis 2009; 49: 811–815.
Optimización de un método ELISA para la determinación de la inmunogenicidad de la vacuna
1E10-Alumina
J. Solozábal Armestrong, Maylin Rodríguez Rodríguez y V. Peña Sánchez.
Centro de Inmunologia Molecular (CIM), 216 esq 15, Atabey, Playa, Ciudad de La Habana, Cuba.
Introducción
En la unidad de Control de la Calidad del Centro de Inmunología Molecular (CIM) es donde culmina la optimización de los
métodos analíticos transferidos desde la unidad de Desarrollo (I+D). La actividad biológica de la vacuna antitumoral 1E10Alumina para la inmunoterapia de tumores de mama, colon, pulmón y de melanoma (1, 2, 4, 6), puede determinarse por la
respuesta que esta vacuna es capaz de levantar en pollos Leghorn (3), y detectarse por ELISA. El método consiste en la
medición de la respuesta inmune (RI) contra el antígeno Neu glicolil GM3 (NGcGM3), gangliósido que mimifica el idiotipo
del AcM 1E10 (1). Dicho método fue optimizado para parámetros tales como la precisión y la señal inespecífica para estimar
la seroconversión de los animales. El objetivo del presente trabajo fue optimizar el método ELISA para la determinación de la
actividad biológica de la vacuna 1E10-Alumina. Materiales y métodos: Pollos Leghorn fueron inoculados con una dosis única
de la vacuna, y los antisueros se colectaron a los 0, 7, 14, 21 y 28 días. Placas NUNC “Polysorp” son recubiertas con
NGcGM3 en Metanol y los sitios libres se bloquean con una solución de BSA al 1%. Luego, los antisueros de pollo son
incubados en PBS-BSA 1% durante 2 horas a 37 °C, y después de lavar se completa la inmuno-reacción a través de un
conjugado específico anti IgY-Fosfatasa alcalina durante otra hora a 37 °C. La RI es determinada a través de un valor de corte
de dos veces la absorbancia del suero preinmune. Para la optimización se siguió la metodología de “prueba y error” de
variables cruzadas de los diferentes parámetros del ensayo. El método ELISA para la medición de la inmunogenicidad en
pollos transferido desde la unidad de Desarrollo exhibía una precisión intra-ensayo superior al 20% de forma aleatoria. Por
otra parte la RI se determinaba con una baja señal a una dilución de 1:100 de los sueros, con una elevada señal de fondo. Se
logró una mayor reproducibilidad del método, aumentando la precisión, con mayor resolución entre las señales del suero preinmune y la RI específica, reduciendo además de forma considerable la señal de fondo. El método ELISA de determinación de
inmunogenicidad en pollos para la evaluación de la Actividad Biológica de la Vacuna 1E10-Alúmina fue optimizado según
las normas establecidas para el Control de la Calidad.
Palabras clave: ELISA, NGcGM3, Vacuna 1E10-Alúmina, Actividad biológica, Inmunogenicidad.
100
1.
Esquema de Inmunización: Pollos Leghorn machos de 6 a 8 semanas (aproximadamente entre 400 y 600 gramos de peso),
fueron inoculados con 400 µg de NGcGM3 por animal, por vía subcutánea (SC). Antes de la inoculación primaria se les
extrajo sangre de las venas braquiales (tiempo cero o suero Pre-Inmune), y luego a las semanas 1, 2, 3 y 4 (entre los 7 y
los 28 días). Las muestras de sangre obtenidas se incubaron a temperatura ambiente hasta formación del coágulo, y
seguidamente fueron centrifugadas para finalmente extraer el suero. Las muestras de suero de los animales individuales
para cada tiempo de extracción fueron mezcladas y conservadas a -20 °C hasta su uso.
2.
ELISA para la medición de la inmunogenicidad: El gangliósido NGcGM3 fue obtenido de eritrocitos de caballo (lote
4003-L0810) y su pureza fue evaluada por HPTLC (Figura 1). Este material fue disuelto con cloroformo: metanol (2:1) y
fraccionado para una masa de 24 µg por frasco, dejándose evaporar hasta secado total y conservándose a -30 °C hasta su
uso. Este material fue reconstituido con 6 mL de Metanol, ultrasonicado durante 5 min y las placas fueron recubiertas a
50µL/pozo, e incubadas durante 1,5 hr a 37 °C hasta secado total. Después de 3 lavados con PBS, las placas son
bloqueadas con 100µL/pozo de una solución de BSA al 1% en PBS durante 30 min a 37 °C, para una vez descartada esta
solución de los pozos y todo resto de humedad contra papel absorbente, aplicar las muestras preparadas a la dilución
1:100 en solución 1% de BSA en PBS, a 50µL/pozo. Luego de incubar las placas por 2hr a 37 °C en cámara húmeda,
estas son lavadas 3 veces con PBS, y se aplican 50µL/pozo de la solución de Conjugado anti IgY-Fosfatasa alcalina
diluido 1:5000 en solución de BSA 1% en PBS, y posterior a otra incubación de 1hr a 37°C en cámara húmeda y los
correspondientes lavados con PBS, la inmunorreaccion es revelada con p-Nitrofenilfosfato (p-NPP) en solución de
Dietanolamina pH 9,8 durante 30 min a Temperatura Ambiente. La reacción enzimática es detenida con solución de
Hidróxido de Sodio 3M, y la lectura de las Absorbancias se realizó a 405nm en un lector DIALAB ELx800. La Respuesta
Inmune (RI) positiva se estima a partir de un Valor de Corte (VC) de 2 veces la Absorbancia del suero Pre-Inmune (PI)
entre los 14 y los 28 días, en un mínimo de 80% de los animales inoculados.
Control positivo NGcGM3
NGcGM3 Lote 4003-L0810
Control negativo NAcGM3
Figura 1. Evaluación por HPTLC de la pureza del lote de Gangliósido utilizado como material
de recubrimiento durante el estudio de optimización.
3.
Optimización del método ELISA: Para la optimización del procedimiento de determinación de la inmunogenicidad de la
vacuna, se utilizó la metodología de prueba y error de variables cruzadas, donde en cada corrida se evaluaba el efecto de
la variación de uno de los parámetros del ensayo, mientras los demás se mantenían constantes, hasta alcanzar de forma
consistente un aumento de la Precisión del método (coeficientes de variación inferiores al 10% para la Precisión Intraensayo e inferiores al 20% para la Precisión Interensayo), así como una relación señal-ruido aceptable (aumento de la
distancia entre las Absorbancias del Blanco del ensayo y las señales específicas de la Respuesta Inmune), que permitiera a
su vez reducir la distancia entre el Valor de Corte y la señal de fondo del ELISA. Los diferentes parámetros evaluados se
muestran en la Tabla 1.
101
Tabla 1. Conjunto de variables del ensayo utilizadas para la optimización del método.
PARÁMETRO
Concentración
tiempo
Temperatura
(°C)
Tampón/
Solución.
Reactivo/
Lote
4ug/8ug
1,5 hr/3hr/
overnight
Temp. Amb/
4 °C/
37 °C
Metanol/
PBS
L0810/
L0807/
Alexis
0,25/0,5/
1%
0,5hr/1hr
---------
PBS*
BSA/
PVA**
BSA 1%
LD 5% / 2%
Tween 20
-----------
----------
1:100/
Rango
2 hr*
37 °C*
Rango de dils.
1 hr*
37 °C*
0% / 0,05%
Tween 20
-----------
----------
Recubrimiento
Bloqueo
Solución de
Ensayo
Inmuno-rreaccion
Conjugado
Solución de
Lavado
--------(Ver
Concentración de
la Solución de
Ensayo)
Otros
(Vol., n)
Vol 50
uL/100uL
n (replicas)
3/4/6
--------Anti IgY-AP/HRP
---------
PBS*
---------
*Parámetros que no variaron durante el estudio.
**PVA (MW 30000-70000, preparado en PBS a 0 °C)
Temp. Amb. (Temperatura Ambiente)
LD (Leche descremada)
Las transferencias tecnológicas de métodos analíticos entre laboratorios son parte del ciclo de vida de un producto y
constituye uno de los problemas fundamentales de la Biotecnología actual. Las normas ICH, y las diferentes agencias
regulatorias internacionales establecen las pautas y recomendaciones de cómo deben transcurrir dichas transferencias, cuándo
hacerlas, etc, con el objetivo de garantizar que no se afecte el propósito para el que fue destinado, ni en consecuencia la
calidad del producto que evalúa (10).
El Departamento de Control de la Calidad del CIM cuenta con un método ELISA que simula la Actividad Biológica de la
Vacuna 1E10-Alúmina, a través de la interacción molecular Idiotipo anti-Idiotipo entre el AcM 1E10 y el AcM P3 (Figura 2).
Esta evidencia de reconocimiento molecular in vitro como principio para levantar la respuesta inmune esperada contra
tumores de origen epitelial (3, 5), no basta para demostrar la efectividad de la vacuna, razón por la que el Departamento I+D
se dio a la tarea de desarrollar otro procedimiento, culminando en un método ELISA para determinar la inmunogenicidad in
vivo, como prueba más efectiva para evaluar este atributo de calidad en la vacuna terapéutica. Pero al momento de la
transferencia tecnológica entre ambos Departamentos, este nuevo método presentaba un bajo nivel de desempeño en cuanto a
la Precisión, la señal de fondo, el VC especificado y en consecuencia un bajo título de la respuesta positiva.
102
Ab 1 =
Ab 3
Figura 2. Red Idiotipo anti-Idiotipo, RI sobre la que se basa el tratamiento antitumoral con la Vacuna 1E10-Alumina.
El desempeño del método original de I+D fue prefijado por los resultados primarios de 3 corridas consecutivas, que se
aprecian en la Figura 3. La Figura 3A muestra el perfil de la RI a los diferentes tiempos; obsérvese la elevada señal de fondo a
través del Blanco del ensayo, estimado en 0.087, y la baja resolución de Absorbancias que se obtiene entre la respuesta a los
14 días de inoculados los animales y el VC. A pesar de evidenciarse una inflexión de la RI a los 21 días, dicha respuesta se
mantiene por encima del VC durante las 4 semanas evaluadas. Por su parte la figura 3B exhibe claramente la baja Precisión
del método, tanto en la repetibilidad (con valores de Coeficiente de Variación cercanos al 20%), como en la Precisión
Intermedia para el factor día de la corrida, variabilidad inaceptable desde el punto de vista del estado del arte descrito en la
literatura para este tipo de métodos, así como desde el punto de vista regulatorio, para ser asimilado como un método para el
control de la calidad del atributo Actividad Biológica de la vacuna.
Figura 3. Desempeño de 3 corridas consecutivas del método ELISA transferido de I+D.
Los primeros parámetros evaluados como variables durante el proceso de optimización del método ELISA se centraron en la
etapa de recubrimiento: la concentración del NGcGM3, y la extensión del tiempo de incubación con reducción de la
temperatura. Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 4.
103
Figura 4. Respuesta de la variación de las condiciones de incubación en la etapa de Recubrimiento.
Como puede apreciarse no se observaron diferencias entre 4 y 8µg/mL de NGcGM3 en el recubrimiento (Figura 4A), ni entre
las diferentes condiciones de incubación de esta etapa del ensayo (Figura 4B), sobre el aumento de las señales de absorbancias
con respecto a las condiciones originales, de lo que se puede concluir que ya a 4µg/mL de NGcGM3 se encuentra saturada
toda la superficie de poliestireno calidad Polysorp, y que 1,5 h a 37 °C constituyen tiempo y energía cinética suficientes para
alcanzar la velocidad de difusión y capacidad de adsorción requeridos por este analito para adherirse a la fase sólida.
De la evaluación de la influencia de la composición de la Solución de Ensayo, así como de la inclusión del detergente Tween
20 en las etapas de lavados (Figura 5) se obtuvo que en presencia de Leche descremada (LD) al 2%, la señal específica de la
RI disminuye considerablemente con respecto a la composición con BSA al 1%. El efecto positivo de la BSA se vio
potenciado cuando este parámetro se conjugó con la inclusión del detergente Tween 20 en la solución de lavado, obteniéndose
la mayor diferencia entre las señales de Absorbancias base (BL) y la RI a los 14 días de entre todas las variables evaluadas.
Este resultado evidenció que el Tween 20 en los lavados entre las diferentes etapas de incubación, resultaba definitorio para el
alcance de un mejor desempeño del método de ensayo, por lo que se decidió continuar el proceso de optimización fijando este
parámetro como una constante más del ensayo.
Figura 5. Resultados correspondientes a las
variaciones en la composición de la solución de ensayo
para la inmunorreaccion primaria e inclusión de Tween
20
En este punto se probaron otras condiciones como fueron la dilución óptima de trabajo del conjugado, y la enzima conjugada
al anticuerpo anti IgY, encontrándose una mínima señal de fondo (“background”), así como una mayor velocidad de reacción
enzimática, con un conjugado anti IgY-Peroxidasa (SIGMA A-9046), a la dilución 1:3000, por lo que fue esta otra de las
condiciones fijadas como constantes para continuar el proceso de optimización del método (datos no mostrados).
Por su parte, de la evaluación de las condiciones de bloqueo, mediante la comparación de los bloqueadores BSA y Polivinilo
alcohol (PVA), se obtuvo un pico diferencial en la RI entre los días 7 y 14 bajo la condición de Bloqueo con 0,25% de PVA
conjuntamente con los lavados con detergente, respecto al bloqueo con BSA al 1% y una solución de lavado sin detergente,
como se aprecia en la Figura 6, quedando determinado no sólo la inefectividad de lavar solo con PBS 0,15M, sino
confirmándose la necesidad de la introducción del Tween 20 en la Solución de Lavado.
104
BL
PI
7d
14d
21d
28d
Figura 6. Perfil de la RI que se alcanza al variar las condiciones en la etapa de Bloqueo.
En la tecnología ELISA es muy utilizada una etapa de bloqueo de los espacios que quedan libres sobre la fase solida después
de la etapa de recubrimiento con el reactivo de captura, para evitar la adsorción inespecífica de reactivos secundarios a esta
primera etapa, y también para estabilizar estéricamente el reactivo inmovilizado(8). Entre los agentes bloqueadores más
comúnmente utilizados se encuentran la BSA y la OVA, la caseína, la gelatina, y la leche descremada; agentes no proteicos
como el PVA y el Polivinilpirrolidona (PVP), así como detergentes como el Tween 20 (7).
El presente trabajo demostró la superioridad del PVA sobre la BSA como agente bloqueador sobre la superficie Polysorp bajo
las condiciones evaluadas, presumiblemente debido a que el estado polimérico y polihidroxilado de este reactivo en solución
acuosa permitió la formación de una película estacionaria sobre el poliestireno calidad Polysorp, así como en interacción con
las porciones polares del NGcGM3 del recubrimiento (Figura 7), estabilizándolo en la fase sólida.
Figura 7. Estructuras moleculares de los gangliósidos (izquierda) y del detergente no iónico Tween 20 (derecha).
La inclusión del detergente no iónico Tween 20 en la Solución de Lavado reforzó las diferencias entre las señales de fondo y
la RI específica. Es conocido que su efecto lavador se basa en la habilidad de dispersar las moléculas hidrofóbicas en medio
acuoso, dado su carácter anfipático (Figura 7), eliminando las uniones más inestables (inespecíficas) en los lavados posteriores
a cada etapa de reacción del método ELISA, y protegiendo de este modo a las reacciones específicas del probable
impedimento estérico que pudieran provocar los analitos débilmente enlazados, especialmente en el lavado posterior a la
incubación del Conjugado (9).
Otros estudios realizados fueron la comparabilidad entre diferentes lotes de NGcGM3 de recubrimiento, el efecto del numero
de réplicas (pozos) sobre la precisión, el PBS como tampón de recubrimiento a diferentes tiempos y temperatura de
105
incubación, la presencia de Tween en la solución de ensayo, el volumen de ensayo (datos no mostrados), que llevaron
finalmente a la optimización del método ELISA y a un nuevo protocolo de ensayo a partir de las modificaciones introducidas,
cuya esencia se describe a continuación:
A)
B)
C)
D)
Todos los lavados con PBS-Tween 20 al 0.05% en lugar de PBS.
Cambio de bloqueo con BSA 1% por PVA 0,25%.
Aumento de n: de aplicación de los sueros por triplicado a sextuplicado.
Conjugado anti IgY-HRP 1:3000 en lugar del anti IgY-Fosfatasa Alcalina 1:5000.
Con estas nuevas condiciones de ensayo se re-evaluó el perfil de la RI en comparación con el método originalmente
desarrollado por I+D (Figura 8).
Figura 8. Resultados comparativos entre el
método optimizado con respecto al original
de I+D.
Para el método optimizado se observó una señal de fondo muy reducida y una absorbancia para el suero PI al mismo nivel del
Blanco, permitiendo de esta forma el aumento de la resolución entre la señal RI específica y el fondo del ensayo entre los 7 y
los 14 días, y en consecuencia un VC fijado a un nivel de absorbancia inferior incluso a la respuesta a los 7 días, fenómeno
que no se observa en el perfil de la RI sin optimizar, y que por otra parte garantiza la inclusión de mayor cantidad de sueros
como positivos (animales respondedores) dentro de un rango de absorbancia de aproximadamente 0,400 unidades. De igual
forma en la Figura 8 puede apreciarse la diferencia entre las RI posterior a los 14 días, manteniéndose una distancia entre
ambas respuestas de 0.400 unidades como promedio.
Por último se logró optimizar la precisión del método ELISA, tanto entre réplicas (pozos) en la misma placa como entre
corridas en días diferentes, como se observa en la Figura 9. Nótese como disminuyó la variabilidad en ambos aspectos,
medida a través de los coeficientes de variación, quedando inferior al 10% del promedio de 3 a 6 réplicas (luego de los
cambios introducidos al protocolo, el número de réplicas promediadas dejó de ser un parámetro crítico del ensayo, no obstante
permaneció en el nuevo protocolo la evaluación de las muestras por sextuplicado) dentro del mismo ensayo, e inferior al 20%
entre diferentes corridas. En este resultado fue determinante la combinación de los 3 cambios fundamentales: el Bloqueo con
PVA, los lavados con Tween 20, y la calidad del Conjugado anti IgY-Peroxidasa, que resultó ser más específico que el
Conjugado con Fosfatasa alcalina.
Figura 9. Resultados comparativos de la Precisión Intraensayo (izquierda) e Interensayo (derecha) entre el método optimizado con respecto
al original de I+D.
106
Conclusiones
Se optimizó el método ELISA para la medición de la inmunogenicidad de la Vacuna 1E10 para los parámetros siguientes:
-
La introducción del detergente en la solución de lavado, el bloqueo con PVA al 0,25% y el cambio de conjugado
resultaron definitorios en la optimización del desempeño del método.
La precisión intraensayo, disminuyó a valores de CV inferiores al 10%; y la Precisión Intermedia para el factor día, a CV
inferiores al 20%.
Disminuyó la señal de fondo del método de niveles de absorbancia de aproximadamente 0,090 hasta 0,054. Los valores
del suero preinmune igualmente bajaron hasta 0,055.
La RI se hizo claramente evidente a los 14 días de inoculación de los animales, de un valor de corte estimado a partir del
resultado del suero preinmune que permite el aumento de los por cientos de animales respondedores, o pudiera estimarse
un nuevo Valor de Corte de 3 o 4 veces el valor de Absorbancia del suero PI, evaluando los mismos en varias diluciones
seriadas, aumentando así la exigencia del método para la identificación de los sueros respondedores.
-
Referencias
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Díaz et al. Clin Immunol 2003; 107: 80-89.
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Daniel F Alfonso, Daniel E. Gómez and Ana m. Vázquez. Expert Rev Vaccines 2003; 2(6).
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non-self-matter. Ana M. Hernández. Immunobiology 2005; 210:11-21.
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high-risk and metastatic breast cancer patients. Marcelo D. Guthmann et al. J Immunother 2006;29(2).
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8. Blocking agent and detergent in ELISA. Peter Esser. Technical Bulletin: 09. Thermo Scientific.
9. Detergent in Polystyrene ELISA. Peter Esser. Technical Bulletin: 08. Thermo Scientific.
10. ICH Q10. Pharmaceutical quality system, 2007.
Estandarización y validación del método de determinación del grado de activación del PEG 2,40 kDaNHS
Lázara Muñoz Hernández1, José A, Ramón Hernández2, Dinorah Torres Idavoy1, Gerardo García Ilera1, Ileana Rosales1, Inalvis Herrera
Rivas1, Margela Montañés Valdés1 y Cols.
Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología: Ave 186 % 31 y 33 Reparto Cubanchan, Playa.
Centro de Biomateriales. Universidad de la Habana.
Email:[email protected]
Una de las aplicaciones de la tecnología de Pegilación ha sido la obtención del Interferón α2b conjugado a polietilenglicol
(INF-PEG2,40 kDa), PEGYFERON. La activación del PEG como éster de N-hidroxisuccinimida (PEG2,40 kDa-NHS), influye
marcadamente en la eficiencia del proceso de pegilación por lo que el grado de activación del de la molécula es un atributo de
calidad especificado para este producto intermedio. El objetivo de este trabajo consistió en estandarizar y validar el método
colorimétrico de determinación de grupos aminos libres, basado en la disminución de la absorbancia a 414 nm del color
amarillo cunando el reactivo glicil-glicina reacciona con el PEG2,40 kDa-NHS. El método tradicional, descrito para este fin, fue
estandarizado en placas de 96 pocillos, posibilitando minimizar la variabilidad entre las réplicas de una misma muestra. Bajo
estas condiciones la curva de calibración resultó lineal en el rango de 0 a 2 mM de Glicil-glicina obteniéndose valores de R2
superior a 0,98, sin interferencias del PEG2,40 kDa-OH. El método resultó ser exacto y preciso obteniéndose un porciento de
recuperación global (Rglobal) estadísticamente igual al 100% para un nivel de significación de 0,05 (97,97 ± 4%), C.V intra-
107
ensayo= 4%, inter-ensayos=6%, e interlaboratorios 3%. El método establecido resultó adecuado para la determinación
indirecta del grado de activación del PEG2,40 kDa-NHS pues los parámetros validados en el procedimiento descrito
correspondieron con los criterios de aceptación establecidos.
Palabras clave: grado de activación, PEG activado, PEG2,40 kDa-NHS.
Introducción
Durante los últimos años, la tecnología de Pegilación ha tenido grandes avances en el desarrollo de formulaciones de acción
prolongada. Esta tecnología ha sido aplicada a varias proteínas farmacéuticamente activas (1), entre ellas al Interferón α2b.
Una de las etapas fundamentales en el proceso de obtención del PEGYFERON es la síntesis y activación del PEG2,40 kDa-OH
como éster de N-hidroxisuccinimida (PEG2,40 kDa-NHS). El grado de activación de esta molécula es esencial para una eficiente
conjugación, por lo que constituye un atributo de calidad especificado para este producto intermedio. Como en toda
producción de medicamentos diseñada de acuerdo con las Buenas Prácticas de Fabricación (BPF), es imprescindible lograr el
control del producto en diferentes estadios de elaboración, con el objetivo de detectar cualquier desviación de las
especificaciones de calidad. Según las normativas establecidas por las regulaciones nacionales e internacionales, referentes a
la correcta fabricación y control de calidad de los medicamentos, la validación no sólo debe aplicarse a los procesos de
fabricación, sino también a sus métodos de análisis y control, siendo éste un requisito a tener en cuenta en la presentación de
los registros sanitarios de los medicamentos (2,3,4,5,6,7). En este trabajo se muestran los resultados de la estandarización y
validación de un método colorimétrito que permite determinar indirectamente el grado de activación del PEG2,40 kDa-NHS
mediante la cuantificación del contenido de aminas libres remanentes en el reactivo Glicil glicina después de su reacción
equimolar con la molécula de PEG2,40 kDa-NHS, los cuales pueden ser extrapolados a otros validaciones de ensayos de
cuantificación similar a este.
Reactivos químicos
Para la realización de la técnica analítica se empleó glicil glicina suministrada por Riedel–de Haen, solución de ácido
picrylsulfónico (TNBS) 5%, suministrado por SIGMA y Acido bórico calidad p.a, suministrado por MERCK. Para la
confección de la curva de calibración se empleó PEG20 kDa suministrado por MERCK.
Método analítico
Se empleó el método colorimétrico descrito en la literatura para la evaluación de la activación de grupos acilantes como el
grupo NHS (8,9) después de estandarizado. En tubos eppendorf de 1,5 mL se prepararon diferentes concentraciones de Glicil
glicina (0-2 mM) en relación equimolar de PEG20 kDa. Las muestras se prepararon adicionando a 2 mM de PEG2,40 kDa-NHS, 2
mM de Glicil glicina. En placas de 96 pocillos se aplicaron 34 µL de las muestras, posteriormente se adicionaron 332 µL de la
solución mezcla (Acido bórico 0,1 M, pH 9,0 + 0,03 M de TNBS), se incubaron 30 min a temperatura ambiente y finalmente
las absorbancias se leyeron a 414 nm en un lector de placas (MULTISKAN). Para determinar el grado de activación, los
valores de concentración de glicil glicina determinados para las muestras, fueron interpolados en una curva de correlación de
concentración de glicil glicina vs porciento teórico de activación.
Validación del método
Como se reporta por Morpurgo and Veronese (8). El grado de activación del PEG2,40 kDa-NHS, es determinado indirectamente a
partir de la correlación existente entre la concentración del reactivo glicil glicina y el porcentaje de activación teórico. Es por
ello que se evaluaron los parámetros correspondientes de la determinación de la concentración de glicil glicina para las
muestras de PEG2,40 kDa-NHS. El método es considerado un método de cuantificación, que pertenece a la categoría II, según lo
definido en las normativas internacionales (3), por lo que los parámetros a evaluar son: especificidad, linealidad, exactitud,
precisión (repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad).
Especificidad
Se estudiaron las interferencias del placebo de la muestra de PEG2,40 kDa-NHS en el ensayo, a partir del análisis comparativo de
las respuestas en unidades de absorbancias (UA) del placebo (PEG2,40 kDa-OH) y la referencia del ensayo (PEG20 kDa) al valor
máximo y mínimo de concentración de glicil glicina (0 y 2 mM). La validez de los resultados fueron demostrados mediante el
análisis estadísticos de homogeneidad de varianza (FFicsher) seguido de una prueba de comparación de medias (tStudent)
108
empleando las herramientas estadísticas del Microsoft Office Excel. Se tomó como criterio de aceptación la no existencia de
diferencias significativas (Fexperimental≤Fcrítica,), entre las varianzas y las respuestas (texperimental ≤ tcrítica) comparadas, para un nivel
de significación (α) igual a 0,05.
Linealidad
Se analizaron tres curvas de concentraciones 0; 0,2; 0,4; 0,6; 1,0; 1,6 y 2,0 mM, con tres réplicas por punto. La prueba fue
válida cuando el coeficiente de determinación (R2) fue superior a 0,98 y la probabilidad (P) reportada por el ANOVA de
significación de la pendiente, fue menor que 0,01, para un α igual a 0,01. Para el análisis estadístico ANOVA se emplearon las
herramientas estadísticas del Microsoft Office Excel.
Exactitud: Se prepararon muestras de placebo (PEG2,40 kDa-OH) del PEG2,40 kDa-NHS a una concentración de 2 mM y se hicieron
mezclas de este con una solución de Glicil glicina de concentración conocida, de forma que las concentraciones finales fueran:
0,8 mM, 0,5 mM y 0,1 mM. Para determinar la influencia de la concentración en la variabilidad de los resultados se realizó
una prueba GCorchra,, y para comparar el recobrado medio obtenido con el recobrado esperado (100%), se aplicó la prueba t
Student. Se consideraron como criterios de validez valores de Gexperimental≤ Gtabulada, y texperimental≤ttabulada para un α igual a 0,05
(2,7).
Precisión: Se determinó la precisión intra-ensayo o repetibilidad por el análisis sextuplicado de una muestra de PEG2,40 kDaNHS; la precisión inter-ensayo o precisión intermedia, con el análisis por triplicado de la misma muestra, durante tres días
diferentes por un analista del mismo laboratorio, y la precisión inter-laboratorios o reproducibilidad con el análisis por
triplicado de la muestra, por dos analistas de dos laboratorios diferentes en tres días diferentes. En todos los casos, se calculó
la media, la desviación estándar (D.E) y el coeficiente de variación (C.V). Se tomaron como criterios de aceptación:
repetibilidad: C.V≤5 %, precisión intermedia: C.V≤10 % y reproducibilidad: C.V≤15 %.
Estandarización del método analítico
El método colorimétrico aplicado, descrito en la literatura para la determinación de grupos acilantes, como es el caso del
grupo NHS (8), se estandarizó en placas de 96 pocillos empleando una longitud de onda a 414 nm y 30 min de incubación a
temperatura ambiente. El empleo de placas de 96 pocillos minimizó las variaciones de las absorbancias entre las réplicas de
una muestra. Los resultados obtenidos al comparar las pendientes y regresión de las curvas de calibración del ensayo a
diferentes tiempos de incubación (15, 30 y 60 min) evidenciaron que a 30 min de incubación a temperatura ambiente es
suficiente para conseguir una buena sensibilidad, similar a la reportada por Snyder y Socinsky (9). Teniendo en cuenta lo
sugerido por Morpurgo and Veronese (8), para la determinación del grado de activación se empleó una curva de correlación
entre la concentración de Glicil glicina y Porciento de activación teórico, considerando 100% de activación, 0 mM de Glicil
glicina y 0% de activación, 2 mM de Glicil glicina.
Validación del método analítico
La validación de un método analítico es el proceso mediante el cual queda establecido, por estudios experimentales, que la
capacidad del método satisface los requisitos para la aplicación analítica deseada. Esta se fundamenta en la determinación de
diversos parámetros que se aplican de acuerdo con la categoría a la que pertenezcan (2). En este trabajo se presentan los
resultados obtenidos al validar la técnica colorimétrica para la estimación del grado de activación del PEG2,40 kDa-NHS el cual
es empleado como materia prima en la obtención del IFA del PEGYFERON.
Estudio de interferencia
Según los resultados obtenidos Tabla 1, el placebo de la muestra de PEG2,40 kDa-NHS no mostró interferencias en el ensayo. En
la prueba FFisher realizada para la comparación de las varianzas de las repuestas de las muestras preparadas con 0 y 2 mM de
glicil glicina, se obtuvieron valores de Fexperimental≤Fcrítica (Fexperimental=3,11 y 3,83 respectivamente, Fcrítica=5,05 para un α igual a
0,05), indicando que no existen diferencias significativas entre las varianzas de las respuestas del placebo y las de la
referencia. En la prueba tStudent asumiendo igual varianzas, se obtuvieron valores de texperimental≤tcrítica (texperimental=0,99 y 0,14
respectivamente, tcrítica=2,23, para un α = 0,05). Estos resultados indican que el método analítico tiene la capacidad de medir
específicamente el analito (aminas libres) sin interferencias de ninguno de los compuesto presente en el placebo de la muestra
de PEG2,40 kDa-NHS, lo cual es una condición esencial para conseguir buena exactitud (2,6).
109
Tabla 1: Resultados (A) y pruebas estadísticas (B) realizadas a los datos experimentales en el estudio de interferencia del
placebo de las muestras de PEG2,40 kDa-NHS en el ensayo. Aparecen sombrados los valores de los estadígrafos FFisher y tStudent
que se comparan en cada caso.
Valores de las respuestas (UA)
A
Glicil-glicina 0 mM
Glicil-glicina 2 mM
Referencias
PEG20KDa
0.148
0.146
0.149
0.149
placebo del INF-PEG2,40KDa-NHS
PEG2,40KDa-OH
0.148
0.148
0.148
0.153
0.150
0.152
0.153
0.150
0.417
0.419
0.417
0.417
0.417
0.421
0.418
0.416
0.413
0.422
0.416
0.421
B
Prueba F para varianzas de dos muestras
Glicil-glicina 0 mM
F
P(F<=f) una cola
Valor crítico para F (una cola)
Glicil-glicina 2 mM
3.11
0.12
5.05
F
P(F<=f) una cola
Valor crítico para F (una cola)
3.93
0.08
5.05
Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales
Media
Varianza
Observaciones
Varianza agrupada
Diferencia hipotética de las medias
Grados de libertad
Estadístico t
P(T<=t) una cola
Valor crítico de t (una cola)
P(T<=t) dos colas
Valor crítico de t (dos colas)
PEG2,40KDa-OH
0.150
6.47E-06
6
PEG20KDa
0.148
2.01E-05
6
Media
Varianza
Observaciones
1.33E-05
0
10
0.99
0.17
1.81
0.35
2.23
Varianza agrupada
Diferencia hipotética de las medias
Grados de libertad
Estadístico t
P(T<=t) una cola
Valor crítico de t (una cola)
P(T<=t) dos colas
Valor crítico de t (dos colas)
PEG2,40KDa-oH
0.418
3.04E-06
6
PEG20KDa
0.418
1.19E-05
6
7.49E-06
0
10
0.14
0.45
1.81
0.89
2.23
Linealidad
En la Figura 1A se muestran los gráficos de las tres curvas patrones ensayadas para determinar la linealidad del método.
Como puede observarse, existe una proporcionalidad entre la concentración de glicil glicina y la respuesta (Absorbancia) en
un rango de 0 a 2 mM de glicil glicina 1X, demostrada mediante la interpretación estadística de R2 y un ANOVA de la
regresión de las curvas de calibración. En todos los casos se obtuvieron curvas de calibraciones con R2≥0,980 cumpliendo con
el criterio de aceptación establecido para esta prueba coincidiendo con lo reportados por otros autores (2, 5,6, 10,11) Los
valores de probabilidad (P) resultaron ser menores de 0,01, indicando que existe una relación estadísticamente significativa
entre las dos variables; concentración y absorbancia, para un α igual a 0,01 (7).
Para establecer los límites de confianza de la pendiente y el intercepto, se emplearon los resultados de las absorbancias medias
de cada concentración en la curva de calibración, de seis curvas, realizadas en dos laboratorios diferentes. El ANOVA de la
regresión reportó que la curva modelo obtenida, tiene una pendiente de 0,1779 y un intercepto igual a 0,0003. Los límites de
confianza (LC) de estos parámetros resultaron ser; para la pendiente entre 0,1685 y 0,1872, y para el intercepto entre -0,00980
y 0,0103.
110
B
Conc. Glicil glicina (mM)
A
Absorbancias a 414 nm (UA)
2,5
0,400
0,350
0,300
0,250
2,0
y = -0,0199x + 1,9945
R2 = 0,9999
1,5
1,0
0,5
0,0
0
0,200
20
40
60
80
100
120
grado de activación (%)
0,150
0,100
0,050
0,000
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Conc. glicil-glicina (mM)
Curva 1: Y=0,1756x, R2=0,9994, ANOVA: P=1,56x10-28
Figura 1. Gráfico de las curvas ensayadas para determinar la linealidad del método de determinación de la concentración de Glicil glicina y
su conversión a % de activación del PEG2,40kDa-NHS
Exactitud
La prueba estadística GCorchran, empleada para el análisis repetido de independencia, descrita por Mc Donal (12) fue empleada
para analizar la influencia del factor concentración en la variabilidad de los resultados. El valor de Gexperimental igual a 0,54
menor que Gtabulada(α=0,05; k=3; n=3) (0,87) indicó que el factor concentración no tiene influencia en la variabilidad de los
porcientos de recuperación obtenidos para un α igual a 0,05 y por tanto es posible calcular la Media, D.E y C.V asumiendo
todos los porcientos de recuperación (R). Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 2, el valor medio global de la
recuperación (Media global del % de R) fue igual a 97 %, no existiendo diferencias significativas entre este valor y el 100 %
(texperimental=1,4≤ttabulada=2,3) para un α igual a 0,05. Estos resultados indican que es posible estimar con exactitud la
concentración de glicil glicina sin interferencias de la matriz de la muestra de INF-PEG2,40 kDa-NHS (2). Teniendo en
consideración que el grado de activación de la muestra es medida de forma indirecta a partir de la correlación entre esta
concentración de glicil glicina y el porciento de activación, se infiere que la exactitud del método es adecuada.
Tabla 2. Resultados experimentales del estudio de exactitud a partir de las muestras construidas a diferentes
concentraciones de glicil glicina, equivalentes a diferentes porcientos de activación
V. Esperado
(µg/mL)
V. Esperado
(% de activación)
0,8
60
0,5
75
0,1
95
V. Observado
(% de acrtivación)
63
62
62
69
67
68
92
93
93
% de R.
(%)
105
103
104
92
89
91
96
97
98
Media. % de R. D.E % de R.
(%)
C.V
(%)
Varianza
104
0,89
0,9
0,8
91
1,31
1,4
1,7
97
0,78
0,8
0,6
111
G experimental
G tabulada (p=0,05,k=3, n=3)
Media Global de % de R
D.E Global de % de R.
C.V Global (%)
tcrítica
texperimetal
t*D. E/ √n
m + t*D. E/ √n
m - t*D. E/ √n
0,55
0,87
97
5,8
6,0
2,3
1,4
4,47
102
93
%
%
%
%
%
Precisión intermedia
El C.V de la precisión intra-ensayo obtenido por el análisis sextuplicado de una muestra de PEG2,40 kDa-NHS por un analista
fue igual a 4%, el C.V de la precisión intra-ensayo obtenido del análisis por triplicado de una muestra, durante tres días
diferentes por un analista de un mismo laboratorio, resultó igual al 6% y el resultados del C.V de la reproducibilidad fue igual
a 3%.
En todos los casos, los C.V obtenidos cumplieron satisfactoriamente los criterios de aceptación. Muchos reportes de métodos
cuantitativos colorímetros refieren C.V. intra e inter ensayos inferiores a 5 y 10 % respectivamente (6,10,15) como se
muestran en este trabajo. En el caso de los C.V inter laboratorios algunos autores coinciden con el criterio presentado en este
trabajo para este tipo de método analítico (C.V≤15%). Además no existieron diferencias significativas entre los porcientos de
activación obtenidos por los dos analistas que realizaron los ensayos diseñados para la precisión interlaboratorios (Figura 2)
demostrado estadísticamente mediante el ANOVA entre grupos, se obtuvieron valores de P igual a 0,44 para el factor
Analistas e igual a 0,07 para el factor días, mayores que 0,05 para un α igual a 0,05.
300
250
200
150
100
50
0
Laboratorio 1
Laboratorio 2
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Figura 2. Resultados de la reproducibilidad del método, a partir de los resultados experimentales del grado de activación del PEG2,40kDaNHS cuantificado en dos laboratorios durantes tres días diferentes.
Conclusiones
Se estandarizó el método de determinación del grado de activación en placas de 96 pocillos lo cual permite minimizar la
variabilidad entre muestras. Los resultados del estudio de validación del método para la determinación del grado de activación
del PEG2,40 kDa-NHS, indican que el ensayo es lineal en el rango de 0 a 2 mM de glicil glicina. Se demostró, además, que no
existen interferencias de la matriz de las muestras en el método, lo cual fue esencial para conseguir la buena exactitud
mostrada. En esta prueba los resultados evidenciaron que no existieron diferencias significativas entre el valor esperado y el
valor experimental de la concentración de glicil glicina en las mezclas analizadas. El método resultó ser preciso, cumpliéndose
satisfactoriamente todos los criterios d aceptación de esta prueba.
Estos resultados evidencian que el ensayo colorimétrico estandarizado es adecuado para la determinación indirecta del grado
de activación en las muestras de PEG activado como Ester de hidroxisuccinimida, esencial para la obtención del
PERYFERON.
Los rangos obtenidos para los diferentes parámetros analizados son muy similares a los reportados por otros autores en la
validación de otras técnicas analíticas (4,5,6).
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Validación de dos sistemas ELISA para cuantificar IFNpeguilado
Sheila Padrón Morales, Maelys Miyares Estrada, Yurisleydis Aldama Casas, Inalvis Herrera Rivas, Ariadna Serrano Patterson, Odaly
Amarante González, Dinorah Torres Idavoy y cols (Fidel R. Castro Odio, Rolando Paez Meireles, Susset Valderrama Concepción,
Raymersy Aldana Wilson.
Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB) Ave.31 entre 158 y 190, Cubanacán, Playa. Habana 10600, Cuba.
El CIGB ha desarrollado la tecnología para la obtención del Interferón Pegilado (IFNPEG) usado en el tratamiento de diversas
enfermedades virales y tumorales. Con el objetivo de contar con una herramienta para cuantificar el producto de IFN,
conjugado con PEG40 y PEG48, en el Laboratorio de Analítica de la Dirección de Desarrollo del Centro, se estableció y
validó dos sistemas inmunoenzimáticos tipo ELISA ¨sándwich¨. Los parámetros validados fueron especificidad, linealidad y
rango del sistema, precisión y exactitud. Las curvas de ambas técnicas fueron lineales en el rango de trabajo de 29,5 a 5,9
ng/mL y de 300 a 50 ng/mL, para el ELISA de IFNPEG40 e IFNPEG48, respectivamente. Los límites de cuantificación
fueron los últimos puntos de las curvas con aceptada precisión y exactitud. La precisión del sistema cumplió con los criterios
de aceptación establecidos: Repetibilidad (C.V ≤ 10%) y Precisión Intermedia (C.V ≤ 15%). El método resultó ser exacto
(recuperación 100 ± 10%), fue demostrado mediante la comparación con otro método de cuantificación de proteínas (D.O a
280 nm), y una prueba de paralelismo. Concluimos que la validación realizada fue satisfactoria. Los ELISAs validados
constituyeron una valiosa técnica para el estudio de la Farmacocinética del IFNPEG, estudios de estabilidad, y la liberación de
lotes utilizados en los estudios clínicos.
Palabras clave: IFN peguilado, ELISA, Validación.
Introducción
Los interferones (IFNs) comprenden una familia de citocinas con propiedades biológicas características, entre las que se
encuentran: actividad antiviral, inmunorreguladora y antiproliferativa, entre otras. El desarrollo de las técnicas de ingeniería
genética ha permitido la producción de interferones (1, 2, 3), en cantidad y calidad adecuada para su empleo en ensayos
clínicos. En el mundo en general y en nuestro país en particular, cada vez es más creciente el empleo del interferón α2b
recombinante en el tratamiento de enfermedades virales y tumorales (4, 5, 6). Pero existen determinados inconvenientes que
atentan contra el éxito de la terapia del IFN como: la rápida eliminación, susceptibilidad a la degradación por proteasas,
113
inmunogenicidad y antigenicidad (7). Una alternativa para evitar estas limitaciones ha sido el empleo del método de la
pegilación del IFN-α2b, el cual consiste en la conjugación química a un polímero de polietilénglicol (PEG) (7). Con el
IFNPEG se mejoraron las propiedades farmacocinéticas según se demostró en estudios con animales y en voluntarios sanos
(7). Con estos indicios, el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB) desarrolló dos formulaciones diferentes de
IFN-α2b pegilado con PEG de 40 kDa y de 48 kDa. Como parte del desarrollo del producto, se establecieron dos sistemas
inmunoenzimáticos tipo ELISA ¨sándwich¨, sensible y específico, para la cuantificación ambos conjugados de IFNPEG. El
objetivo de este trabajo fue la validación de dos sistemas ELISA para cuantificar IFNPEG40 e IFNPEG48, empleados en el
análisis de lotes utilizados en los estudios clínicos, estudios de estabilidad y estudios Farmacocinéticos.
Procedimientos de los ELISAs: Se realizó una estandarización previa de ambas técnicas, según reportado en la literatura (8,
9, 10). Se incluyó: preparación y caracterización de los materiales de referencia para la curva de calibración; optimización del
recubrimiento; establecimiento de las condiciones óptimas de los inmunoreactantes involucrados (anticuerpo monoclonal
CBIFNA2.3 para el recubrimiento, y el conjugado anticuerpo monoclonal CBIFNA2.4 con peroxidada, para el revelado) (11);
tiempos y temperaturas de incubación. Las técnicas estandarizadas requirieron de cuatros pasos:
1er- Recubrimiento de la placa de reacción (NUNC, Maxisorp) con CBIFNA2.3, 10 μg/mL en Tampón Fosfato Salino pH 7.2
(PBS) (KH2PO4 0,02%; Na2HPO4 0,12 %; KCl 0,02 %; NaCl 0,8 %) (PBS), 16-18 h a 2-8 °C; 2do- Incubación del antígeno:
Curva de Calibración de IFNPEG40 (29,5; 23,6; 17,7; 11,8; 5,9 ng/mL), y de IFNPEG48 (300; 250; 200; 150; 100;
50 ng/mL), y muestras de Ingrediente Farmacéutico Activo (IFA) y Producto Terminado (PT), 1 h a 37 °C; 3erReconocimiento del CBIFNA2.4 unido a peroxidada, dilución 1:5000, 1 h a 37 °C; 4to- Revelado por aplicación del sustrato:
ortofenilendiamida al 0,05% y peróxido de hidrógeno al 0,05%, diluido en Tampón Fosfato-Citrato pH 5,5 (ácido cítrico
0,048 M; Na2HPO4 0,1 M), 10 min, 20-25 °C; la reacción enzimática se detuvo con ácido sulfúrico 2 N, 50 μL por pocillo.
Las lecturas se realizaron en un lector de placas (Sensident Scan, Finlandia) a una longitud de onda de 492 nm. El volumen de
reacción en todos los casos fue de 100 μL por pocillo. Después de cada paso se realizaron 4 lavados de la placa de reacción
con Tween 20 al 0,05%. El tampón empleado para las muestras y conjugado fue PBS y leche descremada al 1%. Se empleó un
programa computadorizado diseñado en Microsoft Excel 2003, para construir la curva de calibración y calcular la
concentración de las muestras por interpolación en la curva.
Parámetros de validación: Por tratarse de un ensayo cuantitativo destinado a cuantificar el producto de IFNPEG, se
evaluaron para ambos ELISAs, los siguientes parámetros: especificidad; linealidad y rango; precisión y exactitud (10, 12, 13,
14).
Especificidad: Se realizaron tres pruebas: (a) Evaluación de la interferencia de las sustancias estructuralmente cercanos al
analito (IFN libre y PEG libre), se ensayaron en el sistema IFN libre y PEG libre, y se compararon los valores de absorbancia
a 492 nm obtenidos, con la respuesta del blanco del ensayo, mediante una prueba t de Student, para determinar si existían
diferencias significativas entre ellos, para una probabilidad de 95 %. (b) Evaluación de la interferencia del placebo empleado
en la formulación de las muestras, se procedió igual que el ensayo anterior pero con los tampones. (c) Evaluación de la
capacidad del método de medir muestras estresadas con calor, se calentaron muestras del material de referencia de IFNPEG40
e IFNPEG48, a 60 °C de 1 a 7 horas. Se aplicaron en los ELISAs y se compararon los valores de absorbancia obtenidos a 492
nm, con las muestras sin calentar, mediante una prueba t de Student para determinar si existían diferencias significativas para
una probabilidad de 95%.
Linealidad y rango: Se realizaron tres experimentos independientes y se determinaron los siguientes parámetros para evaluar
la linealidad del sistema: Coeficiente de determinación (R2) (≥ 0,97), ANOVA de la falta de ajuste (P ≥ 0,05), ANOVA de
Significación de la pendiente (P ≤ 0,01). Para establecer el rango de trabajo se analizó la precisión (Coeficiente de Variación
CV ≤ 10 %) y la exactitud (recuperación 100 ± 10 %), de cada uno de los puntos del rango lineal de la curva de regresión.
Precisión: Se ensayaron muestras de IFA y PT en ambos sistemas, en los rangos alto medio y bajo de la curva de calibración,
con tres réplicas independientes. Para estudiar la repetibilidad (precisión intraensayo), se realizó el ensayo bajo las mismas
condiciones de operación por un analista, en el mismo día. Se determinó la variabilidad de la concentración media de cada
muestra ensayada (CV ≤ 10 %). Para estudiar la precisión intermedia (precisión interensayos), se realizó el ensayo anterior
pero bajo diferentes condiciones de operación, diferentes reactivos, tres analistas diferentes y en tres días distintos, en el
mismo laboratorio. Se determinó la variabilidad por un mismo analista en días diferentes, y entre analistas (CV ≤ 15 %).
Exactitud: Se realizaron dos pruebas: Ensayo de Paralelismo o de dilución, y Comparación de Métodos. En la primera, se
analizaron muestras de IFA y PT, con tres réplicas independientes en el rango alto, medio y bajo de la curva de calibración.
114
Se determinó la variabilidad de la concentración media entre los rangos (CV ≤ 10 %), para cada muestra. En la segunda
prueba, se realizó el ensayo anterior y se compararon los valores medios obtenidos en el ELISA, con el valor teórico obtenido
por D.O a 280 nm, (Recuperación 100 ± 10 %). También se realizó un ensayo t de Student para determinar si existían
diferencias significativas entre el valor medio obtenido y el valor teórico esperado, para un 95 % de confianza.
Con anterioridad se había reportado el establecimiento de un ELISA tipo ¨sándwich¨ para cuantificar el IFN-α2b producido en
el CIGB (11). Con la tecnología de la peguilación, se afectó la capacidad del reconocimiento de los inmunoreactantes
utilizados en el sistema (anticuerpo de recubrimiento CBIFNA2.3 y conjugado anticuerpo CBIFNA2.4 con peroxidada) por el
IFN (Figura 1). Esto ocurre principalmente por el impedimento estérico provocado por las cadenas de PEG, que limita el
reconocimiento proteína-proteína (15). Como se muestra en la Figura 1, la variante IFNPEG48 es menos reconocida por el
sistema, pues el Peg 48 kDa tiene más ramificaciones de las cadenas de PEG, 4 ramas, con respecto el Peg 40 kDa que posee
dos, lo que ocasiona un mayor öcultamiento estérico, y por consiguiente la disminución de la capacidad del reconocimiento
del anticuerpo por los sitios de unión del IFN. Es por esto que fue necesario volver establecer dos sistemas ELISA, con los
mismos inmunorreactantes que se contaban, para cuantificar el IFNPEG40 e IFNPEG48 producidos en el Centro. La
validación de las nuevas técnicas resultaba imprescindible, para considerarlas apropiada para su uso en el control de calidad
del producto, estudios de estabilidad, y la liberación de lotes para su uso en la clínica.
1,0
IFN
2,0
IFNPEG40
1,5
IFNPEG48
1,0
0,5
0,0
0
5
10
15
20
25
Absorbancia a 492nm
Absobancia a 492nm
2,5
IFNPEG48
0,6
0,4
0,2
0,0
0h
30
Concentración de Proteína ng/mL
Figura 1. Evaluación por ELISA de las tres
biomoléculas de IFN
IFNPEG40
0,8
1h
3h
5h
7h
Tiempo de calentamiento a 60oC
Figura 2. Resultados de los ELISAs con muestras
calentadas
La mayoría de las guías existentes sobre validación (12, 13, 14) establecen los conceptos y los parámetros a evaluar de manera
muy general, de acuerdo con el método analítico en cuestión. El diseño de la validación empleado en el presente trabajo se
realizó teniendo en cuenta estos principios generales, adaptados a la técnica que nos ocupa y mostró ser apropiado, ya que los
resultados obtenidos para cada parámetro estudiado, se encontraron dentro de los criterios de aceptación establecidos, como se
verá a continuación.
La especificidad de ambos sistemas, de detectar el analito sin interferencia de ningún otro compuesto, se estudió a través de
tres pruebas: (a) Se demostró que el método no reacciona con el PEG, y que el IFN libre interfiere en la exactitud del ensayo
(Data no presentada). Se estudió que este sistema posee una gran sensibilidad por el IFN no conjugado, característica que
tiene la ventaja de servir como una älarma¨ en muestras de IFNPEG que tengan contaminantes de IFN libre, pues en la
evaluación de las muestras, su exactitud no daría satisfactoria, poniendo en sobre aviso el estado del producto. (b) Se demostró
que el placebo empleado en la formulación de las muestras de IFA y PT no interfieren en el sistema (Data no presentada). (c)
Se evaluó la capacidad del método de medir muestras estresadas con calor. En la Figura 2 se expone como el sistema pierde
progresivamente la capacidad de identificar la molécula de IFNPEG ante condiciones desnaturalizantes, pues los anticuerpos
utilizados reconocen epítopes conformacionales (11). Los ELISAs validados al ser susceptibles a cambios conformacionales
en la molécula, pueden usarse en la evaluación de la calidad de los estándares y lotes almacenados durante largos períodos de
tiempo.
115
La linealidad de ambos sistemas resultó satisfactoria, como se muestra en la Tabla 1, cumpliéndose con los criterios de
aceptación establecidos. El rango de trabajo determinado fue de 29,5 a 5,9 ng/mL y de 300 a 50 ng/mL, para el ELISA de
IFNPEG40 e IFNPEG48, respectivamente, todos los puntos de las curvas de calibración tuvieron aceptada precisión y
exactitud. Los límites de cuantificación fueron los últimos puntos de la curva. Esta diferencia en la concentración del IFN en
las curvas de los dos sistemas, se debe al mayor öcultamiento estérico¨ de la molécula del IFN cuando es conjugada con el
PEG 48 kDa, que trae consigo una disminución del reconocimiento de los anticuerpos utilizados en el ensayo. Es por esto que
fue necesario aumentar la concentración de la curva estándar para el IFNPEG48. Este sistema es menos sensible, pero cumple
con el objetivo para el cual fue diseñado: cuantificar muestras de IFA y PT de IFNPEG48.
Tabla 1. Resultados del análisis estadístico de los tres ensayos del estudio de linealidad de la curva de calibración.
ELISA IFNPEG40
Parámetros
Coef. de determinación (R2)
Probabilidad asociada a F es mayor que 0,05
(para el ANOVA de la falta de ajuste)
Probabilidad asociada a F es menor que 0,01
(para la Significación de la pendiente)
ELISA IFNPEG48
Ensayo1
0,999
Ensayo2
0,997
Ensayo3
0,993
Ensayo1
0,984
Ensayo2
0,994
Ensayo3
0,988
0,323
0,665
0,157
0,620
0,546
0,543
8,3E-20
1,3E-17
1,6E-15
9,7E-16
2,6E-19
6,7E-17
La evaluación de la precisión de ambos sistemas se hizo con muestras de IFA y PT para cada caso. El análisis de los datos de
las concentraciones obtenidas por los diferentes analistas generó los resultados de la precisión intra e interensayos que se
muestran en la Tabla 2, cumpliéndose con los criterios de aceptación para la repetibilidad (CV≤10%) y la precisión intermedia
(CV ≤ 15 %).
Tabla 2. Resultados del ensayo de precisión. C.V (%) máximo de cada analista (A).
ELISA
Muestras
ELISA
IFNPEG40
ELISA
IFNPEG48
IFA
PT
IFA
PT
Mismo analista
Entre analistas
A1
A2
A3
11,4 9,0 13,8
1,6
3,3
3,6
3,2
5,8
6,5 12,1 4,8
4,4
4,7 12,9 10,5
4,4
Repetibilidad
A1
8,5
7,9
4,5
9,2
A2
8,5
8,1
5,8
7,9
A3
4,2
8,9
7,8
9,9
El estudio de la exactitud se hizo a través de dos pruebas. La primera, el Ensayo de Paralelismo o de dilución, evaluó que el
analito en el estándar y en las muestras, tuvieran un comportamiento similar, así como, el efecto ¨matriz¨. Los resultados de la
repetibilidad (Tabla 2), se usaron para el análisis de esta prueba, cumpliéndose con el criterio de aceptación: CV entre los tres
rangos para cada muestra ≤10%. La segunda prueba de la exactitud fue la comparación de las concentraciones de las muestras
obtenidas en el ELISA, con el valor teórico obtenido por la técnica D.O a 280 nm. En la Tabla 3 se puede observar cómo
todos los parámetros cumplieron con el criterio de aceptación establecido (Recuperación 100 ± 10 %, y Tcalc. ≤ Tteo).
Tabla 3. Análisis de la exactitud por comparación con otro método de cuantificación de proteínas. La concentración se
expresa en µg/mL. C.teo se refiere a la concentración teórica calculada por D.O. a 280 nm, C.M se refiere a la concentración
promedio obtenida, R % se refiere al porcentaje de recuperación.
Muestra
s
IFA
PT
ELISA IFNPEG40
C.teo
180
C.teo
600
C.M
173,4
C.M
617,2
CV.
8,5
CV.
4,4
R. %
96,3
R%
102,9
ELISA IFNPEG48
Tteo.
2,31
Tteo.
2,31
Tcalc.
1,35
Tcalc.
1,88
116
C.teo
258
C.teo
220
C.M
264,0
C.M
218,6
CV.
3,8
CV.
7,0
R. %
102,3
R.%
99,4
Tteo.
2,31
Tteo.
2,31
Tcalc.
1,76
Tcalc.
0,26
Conclusiones
Hasta donde conocemos, este es el primer reporte en la literatura científica del uso de un sistema ELISA para cuantificar IFN
pegilado. Los resultados de la validación de nuestros dos sistemas ELISAs demuestran que es apropiado para la cuantificación
del IFNPEG40 e IFNPEG48, al cumplir con los requisitos analíticos para ser empleado en el control de la calidad de este
producto. Los ELISAs validados han constituido una valiosa herramienta para el estudio de la Farmacocinética del IFNPEG,
estudios de estabilidad, y la liberación de lotes utilizados en la clínica.
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Validación de una técnica analítica por HPLC para determinar ácido zoledrónico
María Isabel Reyes Tur1, Aylema Romero Díaz 2, Yenilen Troche Concepción3, Marisleydi Begué 4
1
Máster en Tecnología y Control de Medicamentos Laboratorios LIORAD Ave 27A No 26402 e/ 264 y 268, San Agustín, Municipio La
Lisa, La Habana, Cuba.
2
Licenciada en Bioquímica Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM) Ave 26 No 1605 entre Boyeros y Puentes
Grandes CP 10 600 Plaza de la Revolución, La Habana, Cuba.
3
Máster en Tecnología y Control de Medicamentos Laboratorios LIORAD Ave 27A No 26402 e/ 264 y 268, San Agustín, Municipio La
Lisa, La Habana, Cuba.
4
Técnica en Tecnología de la Salud CIDEM Ave 26 No 1 605 entre Boyeros y Puentes Grandes CP 10 600 Plaza de la Revolución, La
Habana, Cuba.
El ácido zoledrónico es un bifosfonato de tercera generación que posee un uso probado en enfermedades relacionadas con los
huesos tales como: osteoporosis y metástasis de hueso del cáncer de mama, cuello, próstata, por lo que para su introducción es
117
necesario contar con una técnica analítica que permita cuantificar el contenido del principio activo, tanto en la materia prima
como en el producto terminado. Para el desarrollo y validación del método analítico por Cromatografía Líquida de Alta
Resolución (CLAR) se utilizó una fase móvil de 5 mM de fosfato de potasio monobásico y 10 mM de sulfato de
tetrabutilamonio, un flujo de 1,0 mL/min, a una longitud de onda de 215 nm, una columna C 18 de 5 µm y se evalúan los
parámetros de linealidad, exactitud, precisión, especificidad y robustez. Los resultados obtenidos en cada uno de estos
parámetros evaluados y procesados estadísticamente demuestran la linealidad, precisión, especificidad y robustez del método,
por lo que se plantea que es válido para cuantificar contenido de principio activo tanto de la materia prima como del producto
terminado.
Palabras clave: ácido zoledrónico; validación de métodos analíticos; HPLC /RP-IP
Introducción
Los bifosfonatos son análogos del pirofosfato y posee una eficacia terapéutica demostrada para el tratamiento de la
ostesporosis, osteopenia, hipercalcemia, y más recientemente en la metástasis de hueso (1). La validación de una técnica
analítica se define como el proceso establecido para la obtención de pruebas convenientemente documentadas y demostrativas
de que un método de control, es lo suficientemente confiable para producir el resultado previsto dentro de intervalos definidos
(2).
Según clasificación de la OMS (Clase C) y la USP (Categoría I), para validar un método que sea utilizado para determinar
cuantitativamente la concentración de una sustancia farmacéutica a granel o de un ingrediente activo en una forma terminada,
se realizan los ensayos de exactitud, precisión, linealidad, selectividad y robustez (3). A partir de esta clasificación se presenta
el desarrollo y la validación de una técnica analítica para cuantificar el contenido de principio activo en la materia prima y el
producto terminado de ácido zoledrónico.
Condiciones cromatográficas: El método cromatográfico procede usando una columna octadecil silica gel para
cromatografía de 5µm (Uptisphere), con elusión a 1.0 mL/min. a una longitud de onda ( λ) = 215 nm y um volumen de
inyección de 20 µL.
Preparación de la fase móvil: Pesar 5 mM de fosfato de potasio monobásico y 10 mM de sulfato de tetrabutilamonio y
transfiera a un volumétrico de 1000, complete volumen con agua destilada y homogenice.
Preparación de la solución de referencia: Pese con precisión 21,32 mg de sustancia de referencia de ácido zoledrónico
monohidratado y transfiera a un matraz aforado de 50 mL. Añada 4 mL de Hidróxido de Sodio 0,1N y aplique ultrasónico por
10 min hasta disolución. Complete el volumen con fase móvil y homogenice.
Para el análisis de la linealidad: Se realizó el modelo de tres determinaciones para cinco concentraciones diferentes: 60, 80,
100, 120 y 140%, estas soluciones fueron inyectadas por triplicado, en tres días diferentes.
Para comprobar la exactitud: Se realizó el modelo de tres réplicas, para tres concentraciones diferentes de ácido zoledrónico
(80, 100, 120 %,) determinándose el % de recuperación, la desviación estándar y el coeficiente de variación (CV).
Para la evaluación de la precisión: Se realizó mediante el estudio de repetibilidad y la precisión intermedia.
Repetibilidad
La repetibilidad se estudió sobre la base de seis determinaciones, correspondientes al 100% de la concentración de ácido
zoledrónico. Se preparó un patrón con iguales condiciones, se inyectaron las muestras y el estándar en el cromatógrafo.
El estudio de precisión intermedia, se realizó por dos analistas, en tres días diferentes, a tres niveles de concentración,
correspondientes a 0,6 mg/mL, 0,8 mg/mL y 1 mg/mL respectivamente (que representan el 80, 100 y 120% de la
concentración teórica).
Se calculó el contenido de ácido zoledrónico cada día, para cada analista y se compararon los resultados analíticos entre ellos.
En el estudio de especificidad: Se analizaron la sustancia de referencia del ácido zoledrónico, el placebo, muestras de la
materia prima, muestras de producto terminado y muestras sometidas a condiciones drásticas tales como: hidrólisis ácida por
118
calentamiento a reflujo con ácido clorhídrico (HCL) 5 N durante 1 h; Hidrólisis básica por calentamiento a reflujo con
hidróxido de sodio (NaOH) 5 N durante 1 h oxidación por calentamiento en baño de María de una solución del analito con
gotas de peróxido de hidrógeno (H2O2) y fotólisis; sometiendo el analito en solución a degradación bajo la luz solar directa
durante 7 días.
Se inyectaron en el cromatógrafo la solución que contenía la muestra del placebo recientemente preparada y otra cargada con
analito a la concentración de trabajo (0,8 mg/mL) y se verificó si había interferencias de los excipientes a la longitud de onda
de trabajo.
Para el estudio de robustez: Se realizaron variaciones en la temperatura, la humedad, analistas, el lote de reactivos y el
laboratorio, tomándose como referencia el valor de 1 para los resultados obtenidos en el CIDEM y el de -1 para los
correspondientes a los laboratorios LIORAD, para un total de doce determinaciones, mediante un diseñó un experimento
factorial fraccionado.
Linealidad: Los resultados del estudio de linealidad muestran coeficientes de regresión (r) y de determinación (r2) superiores
a los exigidos: 0,999 y 0,998, para unos límites de r ≥ 0,990 y r2 ≥ 0,980, respectivamente. Cuando se aplicó la prueba de
linealidad mediante el coeficiente de variación de los factores de respuesta (C.V F = 1,41%) y la desviación estándar relativa
de la pendiente (SD rel(%)=1,52) los resultados obtenidos fueron inferiores al normado como máximo para estos indicadores:
5 y 2%, respectivamente, lo que demuestra la adecuada linealidad de acuerdo con el límite establecido La ecuación que se
expresa según y= 0,1804805 X + 0,17885, cumpliendo con Y= bX+a, para la ecuación de la recta. En la Figura 1 se puede
observar que no existen diferencias significativas entre los valores experimentales y los puntos de la recta. El sistema fue
lineal en el rango de concentraciones de 60-140%, de acuerdo a los criterios estadísticos establecidos al procesar los
resultados. El intervalo de confianza de la pendiente, a ± t Sa fue: 1,082552; -0,72485. Este intervalo, como está establecido
en los límites, debe incluir al cero; para p = 0,05.
Figura 1. Estudio de linealidad
Exactitud: Los valores de por ciento de recobro (R media = 99,46%) estuvieron dentro de los límites establecidos (98-102%)
y el C.V (0,83%) para cada uno de los niveles de concentración estudiados (80-120 %), resultaron ser menores que el 2%. Al
realizar la prueba de significación, se obtuvo una t calculada (t cal.= 1,93) menor que t tabulada (t tab=2,306), confirmándose
así que el método posee una buena exactitud para una p= 0,005 % y n-1 gl. En la influencia del factor concentración sobre la
variabilidad de los resultados de la exactitud (prueba de Cochran), se obtuvo que G calculada (G cal=0,58) fue menor que G
tabulada (G tab=0,797) para una probabilidad de 0,05, k=3 y n=3; por lo tanto, las varianzas de las concentraciones empleadas
son equivalentes indicando que la concentración no influye en la variabilidad de estos.
Precisión: Al evaluar la precisión del método mediante el estudio de repetibilidad y la precisión intermedia, se obtienen los
siguientes resultados:
Repetibilidad: Al evaluar este parámetro se obtiene un C.V=0,66%, lo que muestra que el método es repetible ya que el valor
obtenido es menor que el 1,5% establecido como límite.
119
Precisión intermedia: Los resultados del estudio de precisión intermedia, según se muestra en la Tabla 2, demuestran que no
existen diferencias significativas entre las precisiones alcanzadas por los analistas en diferentes días para una p=0,05%, ya que
los valores de F calculada (F cal.) son menores que F tabulada (F tab.). Los valores de las t cal. resultaron menores que las t
tab. en cada caso, por lo que no existen diferencias entre los valores medios obtenidos por los analistas.
En el análisis de la variabilidad, teniendo en cuenta el factor día y analista, se puede observar que se cumple con el criterio de
aceptación (CV ≤ 2,0%) establecido como límite, de modo que los errores aleatorios no repercutieron apreciablemente sobre
el método desarrollado. El conjunto de estos resultados permite asegurar que los mismos fueron homogéneos, ratificando la
precisión del método en estudio.
Tabla 1. Resultados y análisis estadístico del estudio de la precisión intermedia.
80 %
1er analista 2do analista
100 %
120 %
80,68
80,62
100,23
100,25
119,75
120,00
80,88
80,63
100,25
100,18
120,31
119,70
80,70
80,59
100,27
100,20
119,60
119,80
80,65
80,73
100,22
100,22
119,90
119,70
80,63
80,71
100,26
100,26
120,27
119,90
80,80
80,64
100,21
100,27
119,80
119,90
80,82
80,80
100,21
99,60
119,90
120,10
80,73
80,70
100,18
100,18
120,03
119,90
80,81
80,65
100,3
100,10
120,10
119,90
Media
80,74
80,67
100,23
100,14
120. 00
119,88
Varianza
0,007
0,004
0,001
0,041
0,029
0,016
S
0,086
0,066
0,037
0,20
0,170
0,127
C. V
0,11
0,08
0,04
0,20
0,141
0,106
1er día
2do día
3er día
Fcal = 1,728 Ftab =3,440
tcal = -1, 933 ttab = 2,120
Fcal = 0 Ftab =3,440
tcal = -1,410 ttab = 2,120
Fcal = 1,245 Ftab =3,440
tcal = 1,931 ttab = 2,120
Tabla 2: Comparación de resultados obtenidos con la muestra en condiciones normales y bajo hidrólisis ácida.
Pico
mg inyectados
mg recuperados
Ácido zoledrónico
4, 10
4, 09
Ácido zoledrónico
(hidrólisis ácida)
4, 07
4, 05
Especificaciones
4 mg ± 0, 4
Robustez
De acuerdo con los resultados obtenidos, con la aplicación del experimento factorial fraccionado, se introducen varios
cambios a la vez, garantizando así la estimación del efecto global de cada factor. Los valores de concentración poseen un
valor medio de 99,14 para un C.V de 0,53%. En este caso, ninguno de los efectos tienen los p valores inferiores a 0,05,
indicando que no existen diferencias estadísticamente significativas al 95,0% de nivel de confianza entre los valores obtenidos
ante las variaciones de cada factor. Por lo que se puede afirmar que el método puede ser utilizado independientemente de las
variaciones que se realicen.
120
Especificidad
Los resultados que se muestran en las Figuras 2 y 3 corresponden a los cromatogramas obtenidos en la realización del ensayo
de especificidad de la técnica.
La Figura 2 refleja los picos obtenidos para el placebo, la sustancia de referencia y la muestra de producto terminado, bajo
condiciones normales, observándose en el caso del placebo (A) un pico perteneciente al citrato de sodio, presente en la
formulación, el cual eluye en todos los casos en un tiempo de retención aproximado de 6,7 min; de igual forma se observa un
pico alrededor de los 3,5 min, que pertenece a la sustancia de referencia de ácido zoledrónico (B) y en el cromatograma (C)
obtenido para el producto terminado, se observa la coincidencia en los tiempos de retención pertenecientes al ácido
zoledrónico y citrato de sodio mostrados con anterioridad, por lo que los excipientes utilizados en la formulación no
interfieren en la determinación del principio activo, en condiciones normales.
Los cromatogramas que se presentan en la Figura 3 corresponden a la muestra sometida a condiciones de estrés: oxidación
(D), hidrólisis acida (E), hidrólisis básica (F), y fotólisis (G). En estos no se observan picos que interfieren con la señal del
analito en cuestión, objetivo fundamental del ensayo de especificidad, aunque de acuerdo a estos resultados se evidencia que
el producto es sensible a procesos de oxidación, para asegurar la calidad de este durante su fabricación, se mantiene bajo
atmósfera de nitrógeno en la preparación y el llenado.
Figura 2: Cromatogramas obtenidos (A) placebo, (B) patrón de ácido zoledrónico, (C) ácido zoledrónico producto terminado en
condiciones normales. (picos 1, 2 pertenecen al citrato de sodio y ácido zoledrónico respectivamente).
Figura 3: Cromatogramas obtenidos del producto terminado bajo condiciones de estrés (D) oxidación, (E) hidrólisis ácida, (F)
hidrólisis básica, (G) fotólisis. (1, 2, 3 y 4 picos pertenecientes al citrato de sodio, ácido zoledrónico, productos de degradación de
la oxidación e hidrólisis ácida respectivamente).
121
Como resultado de la hidrólisis ácida (E) a la que fue sometida el producto, se observan dos picos, uno en el rango de tiempo
de retención donde eluye el principio activo, y otro a 3,9 ± 0,05 min, que al compararlo con el placebo correspondiente
sometido a condiciones similares se observa la presencia de un producto de degradación. Es factible señalar que según
Dierksmeier (4), la resolución (R) es la medida con que una columna es capaz de separar dos solutos con tiempos de retención
muy semejantes Por lo que los picos están completamente separados cuando tienen valores de R calculado mayor que 1,5,
aunque para los trabajos prácticos es suficiente que sea igual o mayor que 1. En este caso el valor de la resolución entre el
pico que pudiera interferir en la determinación del principio activo con respecto al del ácido zoledrónico posee una resolución
de 1,8. Por otro lado se determinan las cantidades recuperadas e inyectadas de ácido zoledrónico obtenido tanto en la muestra
bajo condiciones normales como en la hidrólisis ácida, mostrándose en la Tabla 2, que para ambos casos, la concentración se
mantuvo dentro de los límites permisibles de especificación; los cromatogramas obtenidos al someter la muestra a hidrólisis
básica y a la luz (F y G) respectivamente corroboran la estabilidad del producto bajo estas condiciones.
Por lo que el método es capaz de identificar el principio activo en presencia de otras sustancias y cuantificar el analito
presente tanto en la materia prima como en el producto terminado en condiciones normales y de estrés (5).
Conclusiones
Para cada uno de los parámetros estudiados, el método de CLAR empleado, es válido para el análisis del producto liofilizado
de ácido zoledrónico, para el control de calidad y estudio de estabilidad.
Referencias
1.
Seaman JJ, Bruno G, Horst F Use of zoledronate for the manufacture of the medicament for the treatment of bone
metabolism disease US Patent 2007; 20070054885.
2.
International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. ICH Q2
(R1) Validation of analitical procedures: Text and metodology, 2003.
Foods and Drugs Administration. 21 Codes of Federal Regulations Part 11 (CFR Parte 211. 194(a) (2).
Dierksmeier G. Métodos Cromatográficos. Editorial Científico Técnica. 2005. Cuba.
3.
4.
Evaluación de los resultados de la verificación analítica del diagnosticador UMELISA HIV 1 + 2
RECOMBINANT del Centro de InmunoEnsayo
Evelyn Gato Orozco, Delia Benítez Gordillo, Regla Herrera Ruíz, Gerardo Baró Román, Liliena López Brauet
Centro de InmunoEnsayo. Calle 134 y Avenida 25. Cubanacán. Teléfono 208 29 29.
Uno de los grandes problemas asociados al Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), es su circulación asintomática.
En el Centro de InmunoEnsayo (CIE), se desarrolló y produce el UMELISA HIV 1+2 RECOMBINANT, para disponer de
una prueba nacional que brinde cobertura a los programas de certificación de la sangre, materno infantil y vigilancia
epidemiológica. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el desempeño de la verificación analítica de este diagnosticador
en el período 2008-2009. El material de referencia empleado fue un panel de comprobación de la zona gris del ensayo
preparado internamente en el Laboratorio de Control de la Calidad. Los datos estaban registrados en los expedientes de los 22
lotes producidos en el 2008 y los 29 del 2009. Los resultados de cada año y entre los dos años, se compararon mediante un
análisis ANOVA y la prueba t de Student, respectivamente. A cada muestra del panel se le calculó la media de su resultado
anual y se correlacionó con la media esperada. La comparación estadística mostró que no hubo diferencias entre los lotes
producidos en cada año, ni al realizar la comparación entre ambos años. Para cada muestra se obtuvo una adecuada
correlación entre las medias anuales y las esperadas. La semejanza de los resultados en el período analizado avala la
reproducibilidad de este diagnosticador, lo cual constituye una garantía de la calidad diagnóstica en el servicio de salud
brindado con esta prueba.
Palabras clave: HIV, vigilancia, diagnosticador.
Introducción
Los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1 y VIH-2) son los agentes etiológicos del síndrome de inmunodeficiencia
adquirida (SIDA) en humanos (1). El SIDA es una compleja enfermedad debida a múltiples interacciones que ocurren entre el
VIH y el huésped, quien finalmente presenta una profunda inmunodepresión que lo predispone a infecciones oportunistas y
122
neoplasias que lo llevan a la muerte. Se considera la enfermedad infecciosa más seria que afecta a la humanidad con más de
42 millones de personas portadoras del virus, y con una mortalidad de casi el 100% (2).
En un individuo con VIH, el virus se encuentra en todos los fluidos corporales, pero sólo el semen, los fluidos vaginales y
preeyaculatorios, la leche materna y la sangre, se reconocen como infectantes. Así, las relaciones sexuales sin protección, la
exposición directa a sangre o derivados de ésta, la gestación, el parto y lactancia materna son las vías de transmisión
reconocidas (3).
Uno de los grandes problemas asociados a esta enfermedad, es su circulación asintomática, por lo que se ha convertido en un
reto para la humanidad. Debido a la carencia de una vacuna preventiva y de un tratamiento eficaz para eliminar el agente
causal, los servicios de laboratorio son un componente esencial en el diagnóstico y seguimiento de las personas infectadas con
el VIH (4).
A finales de 1988 en el Centro de InmunoEnsayo (CIE) se desarrolló el estuche UMELISA HIV 1+2 RECOMBINANT para
la detección de anticuerpos al VIH y dar cobertura a los programas de certificación de la sangre, materno infantil y vigilancia
epidemiológica. Se introduce en la red nacional en los primeros años de la década de 1990 y en la actualidad el número de
determinaciones anuales producidas sobrepasa los 6 millones.
Como parte del control de la producción establecida en las Buenas Prácticas de Fabricación para Diagnosticadores (5), en la
División de Aseguramiento y Control de la Calidad Analítica (DACCA) del CIE se realiza la verificación analítica a cada lote
de este diagnosticador con el propósito de comprobar el cumplimiento de los requisitos de calidad y dar la conformidad para
su distribución en la red nacional de laboratorios.
Teniendo en cuenta la importancia que revisten los procesos de seguimiento, medición, análisis y mejora necesarios para
demostrar la conformidad con los requisitos del producto, el objetivo de este trabajo fue evaluar el desempeño de la
verificación analítica del UMELISA HIV 1+2 RECOMBINANT en el período 2008-2009.
Expedientes de lotes
Se utilizaron 51 expedientes de lote, de los cuales 22 fueron del año 2008 y 29 del año 2009.
UMELISA VIH 1+ 2 RECOMBINANT
Ensayo inmunoenzimático indirecto, para la detección de anticuerpos IgG al VIH en suero, plasma o sangre seca sobre papel
de filtro (6). Utiliza como fase sólida placas de ultramicroELISA revestidas con los antígenos en las que se incuban las
muestras y si contienen anticuerpos específicos, estos se fijan a los antígenos. Luego de un lavado para la eliminación de los
componentes no fijados se añade un conjugado anti-IgG Humana/Fosfatasa Alcalina que reacciona a los anticuerpos fijados
anteriormente. Se realiza otro lavado para eliminar el exceso de conjugado y se añade un sustrato fluorigénico (4metilumberiferil fosfato). La intensidad de la fluorescencia emitida permite detectar la presencia de anticuerpos al VIH 1 o
VIH 2. La lectura, validación e interpretación de los resultados se realiza de forma automática con el lector y el paquete de
programas UMELISA HIV 1+2 RECOMBINANT que realiza el cálculo de relación de fluorescencia según la siguiente
fórmula: Calc = (Fi-BB) / (P-BB), donde:
Fi: Fluorescencia de la muestra, BB: Fluorescencia del Blanco y P: Fluorescencia del Control Positivo
Verificación analítica
Con un muestreo aleatorio simple y de acuerdo al tamaño del lote, se seleccionan los estuches a utilizar en la verificación. A
continuación, empleando los materiales de referencia (MR), se realiza la verificación analítica según el procedimiento
normalizado de operación para la certificación de la calidad del diagnosticador UMELISA HIV 1+2 RECOMBINANT (7).
Recopilación de los datos
De los expedientes de lote, se extrajeron los datos del panel de comprobación de la zona gris (MR1 al MR6), teniendo en
cuenta que el mismo está compuesto por seis muestras que incluyen el espectro de resultados de este ensayo (no reactivo,
borderline (BL) y reactivo).
Análisis estadístico
Para el análisis de las diferencias en los resultados de un año, los valores de las muestras del panel de comprobación de la
zona gris en los lotes producidos en ese período de tiempo, se compararon mediante un análisis de varianzas (ANOVA).
123
Después de comprobar que no existían diferencias entre los lotes anuales y con el propósito de analizar si existían diferencias
entre los resultados de los dos años, se calculó la media anual de cada muestra, y se realizó una comparación con el
estadígrafo t de Student.
Ambas pruebas se realizaron para un nivel de significación de α ≥ 0,05 con el programa STATGRAPHICS Plus 5,0.
Finalmente, la media anual de cada material de referencia, se correlacionó con la media esperada.
Al realizar la comparación de todos los resultados del panel de comprobación de la zona gris en el año 2008 se obtuvo un
valor de p de 1, que al ser mayor de 0,05 evidenció que no hubo diferencias significativas entre los 22 lotes producidos ese
año. Un comportamiento similar se obtuvo al comparar los 29 lotes del 2009 ya que la p calculada en este caso, fue también 1.
En las Figuras 1 y 2 se evidencia la similitud en los valores de relación de las muestras del panel a lo largo de las
producciones de esos años.
Valor de
relación
"Calc"1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122
lotes
MR 1
MR 2
MR 5
MR 6
MR 3
MR 4
Figura 1. Resultados de los lotes del año 2008.
Valor de
relación
1
"Calc"0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29
lotes
MR 1
MR 5
MR 2
MR 6
MR 3
MR 4
Figura 2. Resultados de los lotes del año 2009.
No se obtuvieron diferencias significativas en la comparación de las medias anuales (Tabla 1). El valor de p fue de 0,952374,
el cual al igual que en los casos anteriores fue superior al nivel de significación fijado.
124
Tabla 1. Medias anuales (Calc) de las muestras del panel de zona gris.
MR
Media de valores de relación
1
2
Año 2008
0,06
0,14
Año 2009
0,07
0,14
3
0,26
0,26
4
0,29
0,3
5
0,47
0,48
6
0,7
0,72
Al correlacionar las medias de cada año con los valores esperados se obtuvieron coeficientes de correlación adecuados. Éstos,
en ambos casos fueron mayores de 0,9 (Tabla 2).
Tabla 2. Análisis de correlación.
Valores de
referencia
0,05
MR 1
0,13
MR 2
0,26
MR 3
0,30
MR 4
0,50
MR 5
0,69
MR 6
Coeficiente de correlación de Pearson
Panel de Zona gris
Media anual 2008
Media anual 2009
0,06
0,14
0,26
0,29
0,47
0,70
0,998
0,07
0,14
0,26
0,30
0,48
0,72
0,997
En todos los lotes analizados este grupo de muestras conservó los valores de relación dentro de sus respectivos límites de
control.
Los resultados anteriores confirman que el diagnosticador UMELISA HIV 1 + 2 RECOMBINANT mantuvo una apropiada
reproducibilidad durante los años 2008-2009. Esta es una de las características funcionales que se analizan en los estudios de
idoneidad de un diagnosticador (8).
Conclusiones
La semejanza de los resultados en el período analizado, unido a que todos los lotes evaluados fueron certificados
satisfactoriamente por el Laboratorio de Investigaciones del SIDA (LISIDA), avalan la reproducibilidad de este
diagnosticador, el cumplimiento de las especificaciones de calidad del UMELISA HIV 1+2 RECOMBINANT y evidencian
que la verificación analítica es un procedimiento válido para evaluar el desempeño de los diagnosticadores.
Todo lo anterior constituye una garantía de la calidad diagnóstica en el servicio de salud brindado con esta prueba, teniendo en
cuenta que cualquier falla funcional que tuviera, podría implicar un daño potencial para la salud humana. En el caso de un
resultado falso negativo porque la enfermedad se seguiría propagando al hacer un mal diagnóstico y no se podría establecer la
cadena epidemiológica, mientras que un resultado falso positivo afectaría psíquicamente al individuo, por el gran impacto que
tiene esta enfermedad.
Referencia
1- Carrillo P, Díaz G. HIV y HTLV: dos retrovirus que interfieren con el sistema inmune. Rev. Méd. Hosp. Nac. Niños 2002;37(1-2):6569.
2- Rambaut A, Posada D, Crandall KA, Holmes EC. The causes and consequences of HIV evolution. Nature Reviews Genetics
2004;5:52-61
3- Pokrovskii VV. Infection and demography. Ter Arkh 2007;79(11):5-9.
4- Saksena NK, Rodes B, Wang B, Soriano V. Elite HIV controllers: myth or reality? AIDS Rev 2007;9(4):195-207.
5- Centro para el Control Estatal de la Calidad de los Medicamentos (CECMED). Regulación 20. Buenas Prácticas de Fabricación para
Diagnosticadores 2004.
125
6- Morales E, Alonso V, Pozo L, González A, Figueiras Y, González A, “et al”. Evaluación de la aplicación del ensayo UMELISA HIV
1+2 RECOMBINANT en muestras de sangre seca sobre papel de filtro S & S 903. Rev Biomed 2004;15:149-155.
7- División de Aseguramiento y Control de la Calidad Analítica (DACCA), CIE. PNO-03-022. Procedimiento para la certificación de la
calidad del diagnosticador UMELISA HIV 1+2 RECOMBINANT 2006.
8- Oficina Nacional de Normalización. NC-EN 13612 Evaluación del funcionamiento de los diagnosticadores 2006.
Certificación de la calidad del glucómetro SUMA SENSOR SXT en el Centro de InmunoEnsayo
Adriana González Quintero1, María Norvi Mora Sánchez, Liliena López Brauet, Evelyn Gato Orozco, Delia Benítez Gordillo, Héctor Pérez
Molina, Dalia Lavadié Ayala.
Centro de InmunoEnsayo, Calle 134, esq. Ave. 25. Rpto. Cubanacán, Playa, 208-2929, ext. 347.
Email:[email protected]
Nuestro centro importa desde la República Popular China el sistema de control de glucosa en sangre SUMA SENSOR SXT,
para medir la concentración de glucosa en sangre. La introducción en Cuba de un sistema de este tipo, le brinda la posibilidad
a los pacientes diabéticos de contar con un instrumento para el monitoreo de su enfermedad, así como de tomar acciones de
control con respecto a sus niveles de glucosa. El objetivo de este trabajo fue desarrollar y poner en práctica un procedimiento
para la certificación de la calidad de los lotes de glucómetros que se reciben en el Centro de InmunoEnsayo (CIE) mediante la
comprobación del acabado general y de las características funcionales de los mismos. Esto nos permite realizar una liberación
interna de los lotes como distribuidores del producto y poner en manos del Sistema Nacional de Salud, un equipo con una
probada calidad. Se llevaron a cabo procedimientos para la evaluación de la exactitud y la precisión de este sistema y se
tuvieron en cuenta los aspectos más relevantes de su acabado superficial. Los resultados obtenidos demostraron que el sistema
muestra una adecuada exactitud y precisión, cumpliendo con los criterios funcionales establecidos internacionalmente para el
uso de este tipo de equipos y con las especificaciones relacionadas con el acabado externo. Con lo anteriormente expuesto, se
considera que se dispone de un sistema de certificación de la calidad del producto SUMA SENSOR SXT que permitirá al CIE
la liberación de cada lote procedente del proveedor externo.
Palabras clave: glucómetro; precisión; exactitud.
Introducción
Con el desarrollo científico técnico y los cambios que tienen lugar en el modo de actuar y en la forma de vida de la sociedad
contemporánea, la incidencia de la diabetes tiende a aumentar a nivel mundial.
Las complicaciones de la diabetes constituyen una de las principales causas que repercuten en la salud y atentan contra la vida
de los enfermos; en la actualidad no hay una cura radical para este padecimiento, sólo mediante dieta adecuada, medicamentos
y ejercicios físicos puede ejercerse influencia para que el nivel de glucosa en sangre se controle hasta niveles normales.
Nuestro centro ha comenzado a importar desde la República Popular China el sistema de control de glucosa en sangre SUMA
SENSOR SXT, el cual está diseñado para medir cuantitativamente la concentración de glucosa en sangre; medición que es
usada para la prevención y el tratamiento de los trastornos del metabolismo de la glucosa, específicamente la Diabetes
Mellitus.
La introducción en Cuba de un sistema de este tipo, le brinda la posibilidad a los pacientes diabéticos de contar con un
instrumento para el monitoreo de su enfermedad, así como de tomar acciones de control con respecto a su nivel de glucosa en
sangre.
El sistema de control de glucosa en sangre SUMA SENSOR SXT está compuesto por tres partes: el glucómetro, los
biosensores y la solución control. El glucómetro y los biosensores se usan en combinación y con su ayuda se puede medir la
concentración de glucosa en 3 μL de una muestra de sangre en 25 segundos. Su producción se ajusta a la Norma Internacional
ISO 15 197 “In vitro diagnostic test systems-Requirements for blood-glucose monitoring systems for self-testing in managing
diabetes mellitus”.
El objetivo de este trabajo fue desarrollar y poner en práctica un procedimiento para la certificación de la calidad de los lotes
de glucómetros que se reciben en el CIE independiente del productor, mediante la comprobación del acabado general de los
equipos y de las características funcionales de los mismos, mediante la aplicación de un método de muestreo. Esto nos permite
126
realizar una liberación interna de los lotes y poner en manos del Sistema Nacional de Salud, un equipo con una probada
calidad, teniendo en cuenta la importancia que reviste el hecho de contar en nuestro país con un sistema de este tipo.
Principio básico de funcionamiento del Glucómetro SUMA SENSOR SXT
El sistema de control de glucosa en sangre SUMA SENSOR SXT es un producto de alta tecnología científico-técnica que
combina la biotecnología moderna con la tecnología microelectrónica, este equipo médico funciona según el principio de
reacción biológica electroquímica, la muestra de sangre es absorbida dentro del biosensor por acción capilar. La glucosa en la
muestra reacciona con la glucosa oxidasa y el ferricianuro de potasio en el biosensor, produciendo ferrocianuro de potasio, el
cual es producido en proporción a la concentración de glucosa en la muestra de sangre. La oxidación del ferrocianuro de
potasio produce una corriente eléctrica que después es convertida por el glucómetro y mostrada en la pantalla como
concentración de glucosa. Es un sistema simple y rápido para el control diario del nivel de glucosa en sangre.
Especificaciones del sistema de control de glucosa en sangre SUMA SENSOR SXT (3).
Muestra: Sangre capilar total fresca.
Volumen de la muestra: Aproximadamente 3 microlitros.
Rango de resultados: 2,2 mmol/L - 27,8 mmol/L (40 mg/dL - 500 mg/dL).
Tiempo de prueba: 25 segundos.
Calibración: Plasma-equivalente.
Temperatura de operación: 10 - 35 ºC
Humedad: Menor del 80 %
- Glucómetros
- Biosensores
- Solución control
- Se siguieron los procedimientos de muestreo descritos en normas internacionales (1).
- Se tuvieron en cuenta para la certificación los criterios descritos para este tipo de ensayo, según las normas internacionales
(2).
- Especificaciones de los biosensores SUMA SENSOR SXT, proporcionadas por el fabricante (3).
- Especificaciones de la solución control SUMA SENSOR SXT, proporcionadas por el fabricante (4).
Método de muestreo
La selección de la muestra para la certificación de los lotes de glucómetros recibidos en el CIE se realizó a partir del
procedimiento descrito en la norma internacional ISO 2859-1:1999. A continuación se detallan las características del método
utilizado, así como el procedimiento que se llevó a cabo.
Plan de muestreo
- Tipo de inspección: Se empleó la inspección por atributos, que es un método muy robusto y simple, basado en la cantidad de
unidades no conformes o en el número de no conformidades.
- Tamaño de lote (n): Varía en cada envío.
- Nivel de Inspección: Especial 4, requiere menor cantidad de muestra.
- Esquema de muestreo: Simple.
- Severidad de la inspección: Normal
- Nivel calidad aceptable (NCA): 1,5
Etapas que se llevaron a cabo para seleccionar el tamaño de la muestra, según la norma Internacional
Siguiendo los procedimientos de muestreo descritos en la norma ISO 2859-1:1999, se determinó la letra código del tamaño de
muestra en función del tamaño del lote (n) y del nivel de inspección.
Se seleccionó el tamaño de la muestra (n), el número de aceptación (Ac) y el número de rechazo (Re) en la Tabla 2 A de la
Norma ISO 2859:1999.
Se tomó una muestra aleatoria de “n” unidades y se procedió a la certificación.
127
Método para la comprobación del acabado general
Se realizó el examen visual en cada uno de los equipos y se procedió al llenado del registro diseñado para recoger los
resultados de este procedimiento. Las características que se tuvieron en cuenta para la comprobación del acabado general se
describen a continuación:
Inspección exterior
Glucómetro de control de glucosa en sangre SUMA SENSOR SXT
La superficie externa: lisa, brillante y limpia, sin deformaciones o cualquier otro signo de daño.
Identificación del producto: las letras, números y marcas deben ser claras y legibles.
Pintura y tratamiento superficial: color uniforme, textura suave, sin marcas de arañazos o rajaduras.
Teclado y Pantalla: funcionamiento adecuado de las teclas y claridad en lo que muestra la pantalla.
Estuche: sin roturas en las costuras o rajaduras en el material.
Manual de usuario: existencia.
Instrumento de punción: existencia y buen estado.
Caja: sin roturas y rotulado con letra visible.
Biosensores de control de glucosa en sangre
Identificación del producto: código y fecha de vencimiento en letras y números claros y legibles.
Estuche o bolsa: herméticas.
Caja: sin roturas, información en letra visible. Presencia del número de lote, código y fecha de vencimiento.
Instrucciones de almacenamiento: en letras legibles y claras.
Lancetas: existencia.
Cantidad requerida: correspondencia entre el total de Biosensores y lancetas, de acuerdo a lo indicado en la caja.
Frasco de Solución Control
Calidad del sellado: hermeticidad del frasco.
Identificación del producto: las letras, números y marcas en su superficie, claras y legibles.
Identificación del lote: presencia del número de lote y la fecha de vencimiento.
Temperatura de conservación: existencia del dato en letras claras y legibles.
Métodos para la evaluación de las características funcionales
Método de evaluación de la exactitud
La exactitud no es más que la concordancia estrecha entre el resultado de una medición y el valor verdadero de la misma. Para
la comprobación de este parámetro se utilizó como referencia la Solución Control que acompaña al sistema, cuya
concentración está definida por el fabricante en el rotulado del frasco.
En cada uno de los glucómetros a certificar se realizaron dos lecturas de la concentración de esta solución utilizando dos
biosensores pertenecientes a un mismo lote y siguiendo las instrucciones descritas en el Instructivo de los Biosensores y en el
Manual de Usuario del Glucómetro. Se calculó el promedio de las dos mediciones de cada glucómetro, así como el promedio
total de las mediciones; los valores obtenidos se compararon con la concentración de la solución control que muestra el frasco
que se tomó como referencia.
Método de evaluación de la precisión
Para la evaluación de la precisión del sistema se tuvieron en cuenta la Reproducibilidad y la Repetibilidad, que caracterizan la
dispersión o variabilidad del proceso.
128
Repetibilidad
La repetibilidad, es la variación de las mediciones obtenidas con un instrumento cuando se usa varias veces por el mismo
operador, para medir la misma característica, en las mismas muestras. En el caso que nos ocupa, se evaluó la solución control,
por no contar hasta el momento con muestras con una probada estabilidad que pudieran ser utilizadas como materiales de
referencia. En cada uno de los glucómetros a certificar se realizaron el mismo día y por el mismo operario, tres lecturas
sucesivas de la concentración de la solución control, utilizando tres biosensores pertenecientes a un mismo lote.
Posteriormente se calculó el valor promedio, la desviación estándar y el coeficiente de variación, de las tres mediciones en
cada glucómetro y del total de las lecturas.
Reproducibilidad
La reproducibilidad es la variación en el promedio de las mediciones efectuadas por operadores diferentes, usando el mismo
instrumento para medir la misma característica, en el mismo grupo de muestras. Para la evaluación del glucómetro SUMA
SENSOR SXT se midió durante tres días y por dos operarios diferentes, la concentración de la solución control. En cada
glucómetro a certificar, cada operario realizó una única lectura de la concentración de esta solución durante tres días,
utilizando tres biosensores pertenecientes a un mismo lote. Posteriormente se calculó el valor promedio, la desviación estándar
y el coeficiente de variación de cada una de las lecturas, por día y por operario, así como los valores totales de las mediciones.
Muestra seleccionada
Aplicando el esquema de muestreo antes explicado, la cantidad de glucómetros a certificar fue de 33, los cuales fueron
seleccionados aleatoriamente en el área de almacenamiento del centro.
Para la selección de la muestra de biosensores empleada en la certificación se aplicó el mismo esquema de muestreo que en el
caso de los glucómetros, partiendo de lotes certificados.
Comprobación del acabado general
El lote cumplió satisfactoriamente con todos los aspectos que se tuvieron en cuenta en la comprobación del acabado general,
se puede decir que el sistema de control de glucosa en sangre SUMA SENSOR SXT es pequeño, útil y fácil de usar y
transportar. Tiene un diseño atractivo, los caracteres mostrados en la pantalla poseen un tamaño adecuado, lo cual facilita la
correcta visualización de los mismos.
El sistema almacena información de las lecturas diarias, así como el promedio de las lecturas realizadas en los últimas siete,
catorce y veintiocho días, lo cual le confiere un valor especial para el seguimiento y control de la glucosa en los pacientes que
así lo requieran.
Evaluación de la exactitud
El valor de concentración de la solución control tomado como referencia fue de 8 a 11 mmol/L. Tanto el valor de
concentración promedio de cada equipo como el valor promedio total (8,80 mmol/L), se encontraron dentro del rango
esperado, así mismo, las mediciones individuales mostraron el mismo comportamiento.
Evaluación de la precisión
Repetibilidad y reproducibilidad
En la Tabla 1. se exponen los criterios que se tomaron en cuenta como referencia para la evaluación de la Repetibilidad y la
Reproducibilidad del sistema SUMA SENSOR SXT, descritos por la Norma Internacional ISO 15197, así como los resultados
obtenidos en nuestro estudio.
129
Tabla 1. Evaluación de repetibilidad y reproducibilidad.
Rango de medición
Criterio de aceptación
(mmol/L)
Margen de error aceptable CV (%)
Concentraciones > 5,5
< 7,5
Repetibilidad
8,86
3,98
Operario 1 (total)
8,94
4,82
Día 1
8,89
4,76
Día 2
8,78
4,53
Día 3
9,15
4,28
Operario 2 (total)
9,16
4,66
Día 1
8,92
5,28
Día 2
9,18
4,05
Día 3
9,39
3,01
Valor Total
9,05
4,88
Reproducibilidad
Se tomó el criterio establecido por la Norma ISO 15197 para muestras con concentraciones superiores a 5,5 mmol/L pues en
todo momento se trabajó con la Solución Control, cuya concentración es mayor al valor reportado.
Como puede apreciarse, el 100 % de los resultados obtenidos durante la certificación, cumplen con los criterios establecidos
internacionalmente para este tipo de sistema.
Conclusiones
- El glucómetro SUMA SENSOR SXT dispone de un método de certificación de la calidad que le permitirá al CIE, como
distribuidor, garantizar la confiabilidad del uso del equipo en el Sistema Nacional de Salud.
- El equipo cumple con los criterios de exactitud y precisión descritos en la Norma ISO 15 197.
- Ya se trabaja en la preparación de soluciones internas o materiales de referencia, con tres niveles de concentración
conocidas, que serán empleados en la certificación de los glucómetros en el Centro de InmunoEnsayo.
Referencias
1. Norma ISO 2859-1:1999 (E): Sampling procedures for inspection by attributes. Part 0: Introduction to the ISO 2859 attributes sampling
system.
2. Norma ISO 15 197 “In vitro diagnostic test systems-Requirements for blood-glucose monitoring systems for self-testing in managing
diabetes mellitus”.
3. Specification SXT Blood Glucose Test Strip, 2008.
4. Specification of Control Solution SumaSensor, 2008.
Nuevas especificaciones de calidad del gangliósido natural N-Glicolil GM3
Harold Curiel Hernández1, Jorge L. Coipel Piney1, Raine Garrido Arteaga1, Janet C. Lora García1, Vicente G. Vérez Bencomo1, Violeta
Fernández Santana1, Maria C. Rodríguez Montero1, José A. González Lavaut1, Yudit Molina Izquierdo1, Vladimir Peña Sánchez2.
1
Centro de Química Biomolecular (CQB). Ave. 21 y 200, Rpto Atabey, Playa, Apdo Postal 16042, Ciudad de La Habana. Tel: (537) 2717925/271-7822/271-7809
2
Centro de Inmunología Molecular (CIM). Ave. 15 y 216, Rpto Siboney, Playa, Ciudad de La Habana.
E-mail: [email protected]
El N-Glicolil GM3 es un gangliósido que se obtiene a partir de eritrocitos de sangre equina y al estar sobreexpresado en
distintos tipos de tumores, se utiliza como blanco de la inmunoterapia activa contra tumores. El CIM obtuvo el N-Glicolil
130
GM3 a nivel de laboratorio y dicho proceso fue transferido al CQB. Este centro ha trabajado en incrementar la escala de
producción para obtener las cantidades a emplear en ensayos clínicos. Los controles de calidad realizados por el CIM y
transferidos al CQB incluían ensayos para evaluar la identidad y pureza, pero no contemplaban la totalidad de las posibles
impurezas, contenidas en el gangliósido, ni la naturaleza de las mismas. En este trabajo se propone ampliar las
especificaciones de calidad, sustituyéndolas por otras más abarcadoras en la caracterización físico-química, para el
cumplimiento de los requisitos identidad, pureza y contenido de impurezas. Las técnicas empleadas fueron: RMN y HPTLC
con detección densitométrica para evaluar la identidad y pureza, respectivamente. Para determinar el contenido de impurezas
se aplicó TLC revelando con ninhidrina, para otros lípidos, colorimetría (Lowry) para proteínas y RMN para los residuales
químicos del proceso. En las nuevas especificaciones, se estableció un método de RMN donde las señales que aparezcan en el
espectro de la muestra deben corresponderse con las del espectro de referencia. Además, se estableció un método de HPTLC
con detección densitométrica para cuantificar N-Glicolil GM3 con relación a otros gangliósidos. Se establecieron los límites
mínimos para el contenido de impurezas tipo lípidos por el método de TLC, proteínas por el método de Lowry y de residuales
químicos del proceso (cloroformo, metanol y acetato de sodio) por el método de RMN.
Palabras clave: especificaciones de calidad; identidad; pureza, impurezas.
Introducción
El N-Glicolil GM3 es un gangliósido, formado por una unidad de ácido siálico N-glicolilado, una de lactosa y una ceramida,
que se obtiene a partir de eritrocitos de sangre equina (1). Los gangliósidos se expresan en las membranas celulares de los
tejidos de los mamíferos. Estas moléculas están involucradas en las interacciones intercelulares modulando el crecimiento
celular y la respuesta inmune (2). Los gangliósidos están sobreexpresados en distintos tipos de tumores, como son: el
melanoma, los atrocitomas, sarcomas, neuroblastomas y el cáncer de pulmón de células pequeñas (2). Se han escogido
determinados gangliósidos como blancos de la inmunoterapia activa contra tumores; entre otros se encuentra el N-Glicolil
GM3. La estructura del mismo consiste en una parte oligosacarídica formada por la monosialil-lactosa (el ácido siálico está Nglicolilado) y la cadena ceramida constituida por cadenas de ácidos grasos de 16, 18, 20, 22, 24 y 26 átomos de carbonos (3).
El Centro de Inmunología Molecular (CIM) desarrolló un proceso de obtención del gangliósido a nivel de laboratorio a partir
de eritrocitos de sangre equina. Con este procedimiento se obtuvieron las primeras evidencias clínicas del gangliósido NGlicolil GM3 como componente fundamental de una vacuna terapéutica contra el cáncer de mama (NGcGM3/VSSP). Este
procedimiento de laboratorio y los ensayos para controlar la calidad del producto (especificaciones de calidad) se transfirieron
al Centro de Química Biomolecular (CQB). El CQB asumió la responsabilidad de producir el gangliósido, desarrollando para
ello un proceso productivo que tiene como base el procedimiento de laboratorio transferido.
Las especificaciones de calidad o ensayos de control para medir la calidad del N-glicolil GM3 asimilados en el CQB fueron:
identificación y pureza por cromatografía de capa delgada y pureza por cromatografía líquida de alta resolución. En dichas
especificaciones no se tenía en cuenta la cuantificación ni la naturaleza de todas las posibles impurezas.
En la actualidad, se dispone de un proceso productivo que ha incrementado cinco veces la escala de laboratorio, se han
establecido controles de proceso y ello ha permitido satisfacer las demandas de producto. Además, las nuevas producciones
están involucradas en ensayos clínicos, por lo que es necesario aumentar el rigor del control de calidad de los lotes de
producción. Debido a lo anterior se han propuesto nuevas especificaciones de calidad para el N-Glicolil GM3 que permiten
demostrar su identidad, pureza y contenido de impurezas, incluyendo el contenido de reactivos y disolventes residuales que
pueden contaminar el producto.
Resonancia magnética nuclear (RMN)
La metodología se describe en el PNO-CCGM3-005 del CQB (4). Las muestras se preparan disolviendo 10 mg de N-Glicolil
GM3 en 0,5 mL de dimetilsulfóxido deuterado que contiene dimetilformamida a 2 mg/mL como patrón interno. El equipo
empleado es un espectrómetro Bruker/DSPect AC 250F que cuenta con una sonda dual 1H/13C de detección directa. La
adquisición y el procesamiento de los datos se realizan mediante el programa NTNMR.
Cromatografía de capa delgada de alta resolución (HPTLC).
La metodología se describe en el PNO-CCGM3-003 del CQB (5). Se preparan disoluciones de la muestra y el patrón a una
concentración de 1 mg/mL en una mezcla de cloroformo/metanol 2:1 v/v. Se aplican 5 µL de cada una de las disoluciones en
131
placas para HPTLC de sílice gel 60 (10x10 cm). Como fase móvil se emplea la mezcla cloroformo:metanol:disolución de KCl
0,25 % en amoniaco 2,5 mol/L (5:4:1 v/v/v). Como reveladores se emplean, en 2 placas separadas, el orcinol/H2SO4 y la
ninhidrina. La determinación cuantitativa se realiza con un densitómetro CAMAG TLC Scanner II y el programa BioChrom.
Determinación de proteínas por Lowry
La metodología se describe en el PNO-CCGM3-006 del CQB (6). Se prepara una disolución acuosa de la muestra a una
concentración de 2 mg/mL. Además, se preparan disoluciones a diferentes concentraciones 10, 20, 30, 40 y 50 μg/mL (curva
patrón) de albúmina de suero bovino (BSA). Tanto la muestra como las disoluciones de la curva se tratan con 100 μL de
hidróxido de sodio 1 mol/L. Luego, se añade 1 mL de la mezcla carbonato de sodio 2 %:sulfato de cobre (II) pentahidratado 1
%:citrato de sodio 2 % (10:0,1:0,1 v/v/v). Finalmente, se añaden 100 μL de reactivo de Follin-Ciocalteus 1 mol/L. La
determinación cuantitativa se realiza en un espectrofotómetro Genesys 6 de longitud de onda variable fijado a 750 nm.
La resonancia magnética nuclear (RMN) es una de las técnicas más potentes para determinar la identidad de los compuestos
hidrocarbonados (entre otros tipos de compuestos). Este es un método absoluto y tiene la capacidad de aportar información
sobre la estructura química de las moléculas orgánicas, por lo que resulta el procedimiento ideal para evaluar la identidad del
producto de interés (N-Glicolil-GM3) (7) y la presencia de impurezas residuales del proceso (cloroformo, metanol y acetato
de sodio). Además de la técnica de RMN, otra técnica que permite evaluar la identidad de los gangliósidos es la cromatografía
de capa delgada de alta resolución (HPTLC, por sus siglas en inglés). La misma se emplea normalmente en el análisis de los
gangliósidos naturales.
Las potencialidades de la técnica HPTLC para identificar el gangliósido pueden extenderse a un análisis cuantitativo si se
emplea la detección densitométrica. En este caso, se puede evaluar la pureza del gangliósido con respecto a la presencia de
otros gangliósidos. Esto se debe a que el revelado con orcinol/sulfúrico es especifico para gangliósidos que contengan
cualquier tipo de azúcar.
Se debe tener en cuenta que el proceso productivo de extracción del gangliósido N-Glicolil-GM3 garantiza, en diferentes
etapas, la eliminación de sustancias de naturaleza diferente a la de los glicolípidos u otros gangliósidos, pero puede no ser
efectivo en la extracción selectiva del N-Glicolil-GM3 en presencia de otros gangliósidos similares como el N-Acetil-GM3.
Por otra parte, se conoce que en los eritrocitos equinos casi el 98 % del contenido de gangliósidos corresponde al N-GlicolilGM3 y el resto a otros gangliósidos.
Los fosfolípidos constituyen un grupo de sustancias que incluye: esfingomielina, fosfatidiletanolamina, lisofosfatidilcolina,
fosfatidilserina, fosfatidilinositol, diaraquidoil fosfatidilcolina y fosfatidilcolina, entre otros. Estos pueden estar presentes en
mayor o menor cuantía en los eritrocitos equinos y caninos (8) y al poseer propiedades físicas similares a las del producto
pueden acompañarlo, constituyendo impurezas. Dichos fosfolípidos resultan positivos al revelado con ninhidrina de una placa
cromatográfica de capa delgada y de esta forma pueden ser discriminados.
El contenido de ADN y de proteínas es un requisito que se exige a productos farmacéuticos obtenidos de fuentes naturales y
generalmente se establece un límite máximo del 1% (y hasta 3% para el caso de proteínas). En nuestro caso, el gangliósido NGlicolil-GM3 se obtiene a partir de eritrocitos equinos. Es conocido que los eritrocitos maduros de los mamíferos carecen de
núcleo y mitocondria, organelos intracelulares que son las posibles fuentes de ADN de las células. Aunque el N-Glicolil-GM3
proceda de una célula que no aporta ADN, pudiera suceder que durante el proceso de obtención de los eritrocitos equinos, los
mismos quedaran contaminados con otras células que aporten ADN. En estudios previos (9) realizados a las materia prima
fundamental empleada para obtener el N-Glicolil-GM3 se demostró que la misma no contiene ADN, por tanto, en la estrategia
para proponer las nuevas especificaciones no se incluyó la determinación de ADN como impureza.
Teniendo en cuenta lo anterior, la nueva propuesta incluye evaluaciones que aportan mayor información sobre los atributos de
calidad del producto y son las siguientes: identidad estructural (RMN), cuantificación de impurezas (fosfolípidos y otros
gangliósidos por HPTLC con detección densitométrica, proteinas por Lowry y residuales del proceso por RMN).
Identidad por resonancia magnética nuclear (RMN).
Al evaluar la identidad del N-Glicolil GM3 por RMN-1H se obtuvieron los espectros de varios lotes del producto y se
compararon con lo descrito en la literatura (7). Las señales detectadas más significativas, que caracterizan a esta molécula, son
las siguientes: dos multipletos (δ5,55 y δ5,38 ppm) correspondientes a los protones insaturados (olefínicos) de la ceramida;
dos dobletos (δ4,23 y δ4,17 ppm) correspondientes a los protones anoméricos de β-D-galactosa y β-D-glucosa; un singuleto
(δ3,87 ppm) perteneciente a los protones metilénicos (CH2) del grupo N-glicolil ácido siálico; múltiples señales (δ1,60 –
132
δ1,10 ppm) pertenecientes a los protones metilénicos (CH2) de la ceramida; un tripleto (δ0,86 ppm) que pertenece a los
protones metílicos (CH3) de la ceramida.
En la Figura 1A se muestra el espectro de referencia del N-Glicolil GM3 natural. Puede observarse que hay señales
características de diferentes partes de la estructura del gangliósido como son la ceramida y los azúcares incluyendo el tipo de
ácido siálico en la molécula de GM3.
A
C
B
1
2
3
Fig. 1. A- Espectro de RMN 1H del N-Glicolil GM3. B- Muestras corridas en una placa de HPTLC revelada con orcinol. Identificación de
las muestras: 1 – 3 N-Glicolil GM3 contaminado con 3 % de N-Acetil GM3. C- detección densitométrica de la muestra 3
Identidad y pureza por cromatografía de capa delgada de alta resolución (HPTLC)
A pesar de que el método HPTLC para evaluar la identidad forma parte de las especificaciones transferidas, se realizaron
modificaciones al mismo. En la nueva propuesta se incluyó la detección densitométrica para la cuantificación del N-Glicolil
GM3 y otros gangliósidos como impurezas. Se comprobó que cuando el N-Glicolil GM3 está contaminado con N-Acetil GM3
en un 3% (m/m), la banda del segundo es detectable visualmente y cuantificando por normalización interna (Figura 1B y 1C)
se obtiene una relación 95/5% con una adecuada repetibilidad (CV menor de 0,3% para tres determinaciones).
Este método también aporta a la identidad del producto, por lo cual se mantuvo este criterio en la nueva propuesta de
especificación. Sin embargo el objetivo fundamental de la utilización de este método en la nueva propuesta fue definir un
límite en la especificación de pureza que consiste en que la mancha de N-Glicolil GM3 represente más del 95% con relación a
otras que puedan detectarse.
Determinación de impurezas en base a otros lípidos
El objetivo en la nueva propuesta fue definir un límite en la especificación de impureza en base a otros lípidos. Se evaluó la
fosfatidiletanolamina como control positivo en el análisis por TLC revelando con ninhidrina. Este control positivo se pone
como referencia en la placa de TLC al ser un método relativo y no específico. Se comprobó que la fosfatidiletanolamina se
separa del gangliósido y el límite de detección (visual) es del 2% (20 µg) con respecto a una disolución de N-Glicolil GM3
(1 mg/mL). La repetibilidad del método se evaluó con un control positivo de N-Glicolil GM3 (1 mg/mL) contaminado con
fosfatidiletanolamina al 3%, obteniéndose el mismo resultado para tres placas diferentes.
Para la especificación en este caso se propone como límite que no se detecten manchas del producto al revelar con ninhidrina
o en caso que sean detectadas, su intensidad sea menor que la obtenida para el control positivo.
Determinación de impurezas en base a proteínas
Se evaluó la técnica colorimétrica Lowry en 8 lotes y se obtuvieron resultados entre 0,20 y 1,10% (m/m). Además, se evaluó
la exactitud del método mediante la contaminación con 20 µg de BSA (equivalentes a 2% m/m) de 2 lotes que tenían 0,7% de
proteína y se obtuvo un recobrado del 100% (2,8% de proteína). Con esto se demostró que el método es capaz de detectar
pequeños cambios en la composición del gangliósido con respecto al contenido de proteínas.
El límite propuesto para este ensayo es que el contenido de proteína sea menor del 3%.
Determinación de impurezas en base a residuales químicos del proceso
Empleando el mismo espectro de RMN obtenido para el análisis de la identidad se realizó el análisis cuantitativo y
semicuantitativo de los residuales químicos provenientes del proceso de extracción (metanol, cloroformo y acetato de sodio),
133
ya que se obtiene una señal que caracteriza inequívocamente a cada uno de ellos. Se puede realizar el análisis cuantitativo (10)
para el cloroformo y el acetato de sodio empleando dimetilformamida como patrón interno. En el caso del metanol solo puede
ser semicuantitativo ya que la señal del mismo coincide con una señal del producto, pero la sobrepasa a cierta concentración
de metanol (5 ppm). La Figura 2 muestra el espectro de referencia para los residuales químicos en una muestra de 10 mg de
GM3. El límite de detección de esta técnica es de 5 ppm para el metanol, que es 600 veces menor que el límite según ICH y
USP (3000 ppm). Para el caso del cloroformo, el límite de detección es de 10 ppm que es seis veces menor que lo permitido
según ICH y USP (60 ppm) (11).
Se analizaron 25 lotes de N-Glicolil GM3, aplicando la metodología propuesta, a los que se les determinó el contenido de
cloroformo, metanol y acetato de sodio. En ninguno de los lotes analizados se detectó cloroformo o metanol y el contenido de
acetato de sodio se encontró entre 0,0 y 5,1%. En 19 de los 25 lotes el contenido de acetato de sodio (NaOAc en la Figura 2)
fue menor al 3%.
A pesar de lo anterior, se propone como límite para el contenido de acetato de sodio un 4%. Este parámetro se debe continuar
estudiando para lograr ajustarlo dentro del proceso productivo.
Figura 2. Espectro de RMN 1H de referencia de impurezas (cloroformo, metanol y acetato de sodio) en el producto.
Propuesta final de nuevas especificaciones
-
Identidad (RMN y HPTLC): Correspondencia con el espectro o sustancia de referencia.
Pureza con respecto a otros gangliósidos (HPTLC, orcinol/sulfúrico, densitometría): ≥ 95%
Impurezas sobre la base de otros lípidos (TLC, ninhidrina, densitometría): ≤ 3%
Impurezas sobre la base de proteínas (Lowry): ≤ 3 %
Impurezas sobre la base de residuales químicos del proceso (RMN): cloroformo ≤ 10 ppm, metanol ≤ 5 ppm y acetato de
sodio ≤ 4%
Conclusiones
Se desarrollaron nuevas especificaciones para el control de calidad del N-Glicolil GM3 natural obtenidos en el CQB, que
permitieron garantizar la calidad del producto para su uso en estudios de ensayos clínicos.
Referencias
1234-
Ledeen R. The chemistry of gangliosides: A review. Journal of the American Oil Chemists Society 1966;43(2):57-66.
Inmunoterapia activa con preparado vacunal con el gangliósido NGcGM3 acoplado al VSSP en el tratamiento de pacientes con
melanoma maligno avanzado. CIM-INOR 1999.
Human Metabolome Database, http://www.hmdb.ca/metabolites/HMDB04847. Fecha consultada: 25/02/2009.
PNO-CCGM3-005: Control de la calidad de los gangliósidos por RMN1H. CQB 2010.
134
567-
PNO-CCGM3-003: Control de la calidad de los gangliósidos por cromatografía en capa delgada. CQB 2010.
PNO-CCGM3-006: Determinación de proteínas en gangliósidos por el método de Lowry. CQB 2010.
Siebert HC, Reuter G, Schauer R, Von der Lieth CW, Dabrowski J. Solution conformations of GM3 gangliosides containing
different sialic acid residues as revealed by NOE-based distance mapping, molecular mechanics, and molecular dynamics
calculations. Biochemistry 1992;31:6962-6971.
8- Nouri-Sorkhabi MH, Agar NS, Sullivan DR, Gallagher C, Kuchel PW. Phospholipid composition of erythrocyte membranes and
plasma of mammalian blood including australian marsupials; Quantitative 31p NMR analysis using detergent. Comp. Biochem.
Physiol. 1996;113B(2):221-27.
9- González T y col. Determinación de DNA en muestras de eritrocitos equinos liofilizados. Informe de Resultados. CIM 2010.
10- Jones IC et al. Mag. Reson. Chem. 2005;43:497-509.
11- Guía para la industria Q3C(2). Conferencia internacional de armonización de requerimientos técnicos para el registro de productos
farmacéuticos de uso humano. 2003.
Procedimiento de cálculo de los límites de especificación del volumen de envase en el Centro de
InmunoEnsayo
Arién Sánchez González, Roquelina Cuellar Pérez
Centro de Inmunoensayo. Calle 134 y Avenida 25. Cubanacán. Teléfono 2082929.
El Centro de InmunoEnsayo produce diagnosticadores que contienen reactivos de diferentes volúmenes de envase. El objetivo
de este trabajo es establecer un procedimiento utilizando herramientas estadísticas para calcular los límites de especificación
del volumen de envase para el control en el proceso de llenado. El reactivo Sustrato, cuya presentación final es liofilizado y
con un volumen de envase de 2 mL, fue seleccionado para el estudio. Se realizó una prueba de variabilidad del volumen de
envase para 2 mL en la máquina llenadora Bausch Stroebel KSF 1020, dispensando tres subgrupos de 30 frascos con
interrupciones de proceso al finalizar cada uno, para estimar los límites de especificación. Al reactivo Sustrato se le calcularon
los límites de especificación del peso del volumen de envase para su control durante el proceso de llenado, se muestrearon
diez frascos por lote de un total de cinco. Del procesamiento de los datos muestreados en el software estadístico Minitab se
obtuvieron los siguientes resultados: El límite de especificación del volumen de envase (LEVE) para el reactivo Sustrato es
2,0 ± 0,008 mL y expresado en peso es 2,138 ± 0,022 g. El LEVE se utilizará para el control de la calibración de la máquina
llenadora a 2 mL y su equivalente en peso del reactivo para el control en línea del proceso de llenado. Ambos límites son
válidos solo para la bomba, mangueras y agujas dispensadoras utilizadas. Las interrupciones provocadas no alteraron
significativamente la tendencia central del volumen dispensado en la prueba.
Palabras Clave: Reactivo; Proceso; Variabilidad; Límites de especificación; Gráfico de control.
Introducción
En el Centro de InmunoEnsayo se producen diagnosticadores que contienen varios reactivos con diferentes volúmenes de
envase, algunos se preparan listos para el uso (LPU) y otros son productos liofilizados que se reconstituyen para su posterior
utilización. El control del volumen de envase dentro del proceso de llenado es de vital importancia, sobre todo para los
productos liofilizados que necesitan tener la mayor precisión posible del volumen establecido porque al ser reconstituidos si
no tienen la concentración adecuada para que ocurra la reacción química en los pocillos de las placas, se obtienen resultados
erróneos afectando la funcionalidad del diagnosticador. Los reactivos LPU tienen incluido en el volumen de llenado un
porcentaje de seguridad sobre el volumen exacto a utilizar para el funcionamiento del diagnosticador, por lo que el control de
proceso está destinado fundamentalmente a que no ocurran excesos en la dispensación que provoquen pérdidas innecesarias
de producto
El objetivo de este trabajo es establecer una metodología o procedimiento para calcular los límites de especificación del
volumen de envase de los reactivos que se producen en el Centro, aplicando herramientas estadísticas para estimar la
variabilidad que le agrega al proceso de envase el sistema de dispensación de la máquina llenadora Bausch Stroebel KSF
1020. El reactivo seleccionado para aplicar la metodología diseñada es el componente común a varios diagnosticadores:
Sustrato (LPU), con volumen de llenado de 2 mL. No obstante el procedimiento a seguir es válido para cualquier reactivo y
volumen a envasar con los formatos de frascos 35x18mm (3 mL), 40x22mm (7,5 mL), 45x24mm (10 mL) y 65x30mm (25
mL).
135
Prueba de variabilidad del volumen de envase en la máquina llenadora Bausch Stroebel KSF 1020
1. Seleccionar la(s) bomba(s), mangueras y agujas de dosificación acorde al volumen a envasar. Colocarlas en la posición
correcta en la máquina llenadora.
2. Utilizar agua purificada a una temperatura entre 20 °C y 25 °C para realizar la prueba de variabilidad del volumen de
envase porque su densidad es aproximadamente 1 g/mL.
3. Cebar las bombas y mangueras de dispensación eliminado las burbujas de aire.
4. Pesar los frascos a utilizar en la prueba de variabilidad del volumen envase en una balanza analítica (comprobar
calibración y nivelación).
5. Ajustar el sistema de dispensación de la máquina llenadora al volumen deseado. Poner en la máquina 15 frascos y a
continuación un frasco previamente marcado y pesado (frasco muestra: FM), seguido de 3 frascos para evitar que la
dispensación se detenga antes de ser llenado el FM. Pesar el FM y chequear que el volumen dispensado de agua
purificada pese exactamente el valor requerido con una variación de ±2 mg (equivalente a ±2 μL), sino seguir ajustando el
sistema de dispensación aplicando el mismo procedimiento anterior. Obtener al menos 3 FM consecutivos bajo estas
mismas condiciones para considerar que el sistema de dispensación de la máquina llenadora está ajustado.
6. Poner en la máquina llenadora 15 frascos seguido de una muestra de al menos 30 frascos previamente marcados y
pesados. Al final colocar 3 frascos para evitar que la dispensación se detenga antes de ser llenado el último FM.
7. Repetir el paso anterior al menos 3 veces utilizando la misma cantidad frascos, con el objetivo de formar subgrupos con
igual tamaño de muestra. Parar la dispensación al finalizar cada subgrupo para simular posibles interrupciones de proceso
y estudiar el comportamiento de la máquina llenadora.
8. Pesar cada frasco dispensado de los subgrupos formados y restarle el peso del frasco vacío previamente registrado para
obtener el peso del agua purificada equivalente al volumen de dispensación.
9. Procesar los valores obtenidos en cada subgrupo con ayuda de un software que tenga programada las siguientes
herramientas estadísticas utilizando un nivel de confianza (NC) del 95%:
- Aleatoriedad de cada subgrupo por separado y en conjunto.
- Normalidad (pruebas Anderson-Darling, Ryan-Joiner o Kolmogorov-Smirnov) de cada subgrupo por separado y en
conjunto.
- Prueba de “Análisis de varianza de un factor utilizando el estadígrafo Fisher (F)” para probar que las medias del peso de
agua purificada de cada subgrupo no tienen diferencias significativas entre sí.
- Prueba de “Igualdad de varianzas” para probar que las varianzas del peso de agua purificada de cada subgrupo no tienen
diferencias significativas entre sí.
- Variables estadísticas del conjunto de muestras de los subgrupos: media, desviación estándar S, coeficiente de variación,
valor mínimo, cuartil 25% (Q1), mediana (Q2), cuartil 75 % (Q3) y valor máximo.
- Gráfico de control del conjunto de muestras de los subgrupos (como requisito se deben cumplir las pruebas estadísticas
de aleatoriedad y normalidad) con variabilidad σ, 2σ y 3σ que incluyen aproximadamente el 64 %, 95 % y 99 % de la
población en estudio respectivamente.
10. Analizar los resultados de las variables estadísticas y de los gráficos de control para establecer los límites de
especificación del volumen de envase deseado.
11. Los límites de especificación del volumen de envase establecidos con el procedimiento anterior son válidos solo para
la(s) bomba(s), mangueras y agujas con que se realizó el estudio.
Cálculo del peso del volumen de envase del reactivo
1. Realizar el estudio al menos a 5 lotes del reactivo a una temperatura entre 20 y 25 °C.
2. De cada lote tomar 10 de frascos de muestra durante el envase con frecuencia de muestreo:
- Frecuencia de muestreo = Total de frascos del lote / 10 (se redondea por defecto)
136
3- Calcular la densidad del reactivo. Si el volumen de envase es mayor que 1 mL, extraer de cada frasco 1 mL de reactivo con
una pipeta (comprobar calibración) y pesarlo en una balanza analítica introduciendo el líquido en un frasco previamente
tarado. Si el volumen de envase del reactivo es de
1 mL o menor, extraer de cada frasco la mitad del volumen con una
pipeta y pesarlo igualmente en una balanza analítica. Con los valores de la masa y el volumen extraído se calcula la densidad
del reactivo en cada frasco:
- Densidad (g/mL) = masa (g) / volumen (mL)
4- Procesar los valores obtenidos en cada lote con ayuda de un software utilizando las mismas herramientas estadísticas
descritas en el paso #9 del procedimiento de la “Prueba de variabilidad del volumen envase de la máquina llenadora”. El NC
es 95 %.
5- Analizar los resultados de las variables estadísticas y de los gráficos de control obtenidos en el paso anterior para establecer
los límites de especificación de la densidad del reactivo.
6- Calcular los límites de especificación del peso del volumen de envase del reactivo multiplicando el volumen de envase
deseado por los límites de especificación de la densidad establecidos en el paso anterior.
7- Recalcular por regla de tres los límites de especificación del peso del volumen de envase del reactivo en correspondencia
con los límites de especificación del volumen de envase para incluir la variabilidad del sistema de dispensación de la máquina
llenadora en el control del proceso.
LSE ó LIE Peso del Volumen de Envase → Volumen de Envase
LSE ó LIE Peso del Volumen de Envase Recalculado (?) → LSE ó LIE del Volumen de Envase
LSE: Límite Superior de Especificación
LC: Línea Central
LIE: Límite Inferior de Especificación
Variabilidad del volumen de envase a 2 mL en la máquina llenadora Bausch Stroebel KSF 1020.
El peso del volumen de agua purificada a 25°C dispensada en los tres subgrupos de 30 frascos para una calibración a 2 mL de
la máquina llenadora se muestra en la siguiente tabla.
Tabla 1. Peso del volumen de agua purificada por frasco
Subgrupo 1
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Peso (g)
2,001
1,9999
1,9974
2,0031
2,0039
2,0037
1,9982
2,0023
1,9985
2,001
1,9982
2,0065
1,9973
2,0017
2,0004
No
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Subgrupo 2
Peso (g)
2,0005
1,9963
1,9952
2,0045
2,0021
2,0013
1,9991
1,9999
2,0029
2,0007
1,9984
2,0032
2,0041
2,0033
1,9982
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Peso (g)
No
16
1,9991
17
2,0009
18
2,0006
19
2,0034
20
2,0015
21
2,001
22
2,0011
23
2,0022
24
2,0017
25
1,9978
26
1,9976
27
2,0002
28
2,0034
29
2,0009
30
1,9983
137
Subgrupo 3
Peso (g)
2,0045
1,9974
1,9979
2,004
2,0004
2,0037
1,9997
2,0006
2,0005
2,0026
2,0035
1,9988
2,0016
1,9989
1,9983
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Peso (g)
1,997
2,0027
2,0013
1,9981
2,0019
1,9992
1,9987
1,9976
2,0017
2,0027
1,998
1,9999
1,9996
1,9957
2,0001
No
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Peso (g)
1,9986
2,0025
1,9986
2,0041
1,9982
2,0023
2,0027
2,0025
1,9943
1,9996
1,9995
1,9961
2,0035
1,9988
2,0023
Utilizando el software estadístico Minitab 14 para procesar las muestras obtenidas en la prueba de variabilidad, se comprobó
que los tres subgrupos por separado y en conjunto cumplen las condiciones de aleatoriedad (prueba Run Test) y normalidad
(prueba Anderson-Darling con α = 0,05 < P-Value = 0,262 para el conjunto de muestras de los tres subgrupos) con un NC del
95%. Además las medias y varianzas de los tres subgrupos no tienen diferencias significativas entre si con α = 0,05 < P-Value
= 0,328 One-Way ANOVA y α = 0,05 < P-Value = 0,349 Bartlett´s Test respectivamente.
Los gráficos de control a σ y 2σ (ver figura 1) presentan puntos fuera de control tanto en el gráfico de media como de
variabilidad, o sea, no están en control estadístico, por lo que los límites de especificación serán establecidos utilizando el
gráfico de control a 3σ (ver figura 1), en el cual el conjunto de muestras de los tres subgrupos obtenidos en la prueba de
variabilidad del volumen de envase a 2 mL se encuentran dentro de los límites de control estadístico calculados.
P e s o de A gua P ur ifica da por F r a s co
2 .0 10
Individual Value
+ 3 S L= 2 . 0 0 8 2 6
2 .0 05
+ 2 S L= 2 . 0 0 5 6 7
2 .0 00
+ 1 S L= 2 . 0 0 3 0 7
_
X= 2 .0 0 04 7
-1 S L= 1 . 9 9 7 8 8
-2 S L= 1 . 9 9 5 2 8
1 .9 95
-3 S L= 1 . 9 9 2 6 8
1
10
19
28
37
46
O b s e r v a tio n
55
64
73
82
M oving Range
0 .0 1 00
+ 3 S L= 0 . 0 0 9 5 7
0 .0 0 75
+ 2 S L= 0 . 0 0 7 3 6
0 .0 0 50
+ 1 S L= 0 . 0 0 5 1 4
__
M R = 0 .00 2 9 3
0 .0 0 25
-1 S L= 0 . 0 0 0 7 2
-3 S L= 0
-2
0 .0 0 00
1
10
19
28
37
46
O b s e r v a tio n
55
64
73
82
Figura 1. Gráfico de control a σ, 2σ y 3σ del peso de agua purificada por frasco.
Los límites de especificación del volumen de envase a 2 mL para el reactivo Sustrato utilizando la máquina llenadora Bausch
Stroebel KSF 1020, la bomba de dispensación 0,3 – 2,1 mL 5196 NT449518010L/0901 con agujas dosificadoras de diámetro
2,0 mm son: 2,0 ± 0,008 mL. Estos límites de especificación serán utilizados para el control de la calibración de la máquina
llenadora antes del proceso de llenado.
Acorde a los resultados obtenidos en las pruebas de homogeneidad de las medias y varianzas donde no existían diferencias
significativas entre los tres subgrupos, se concluye que las interrupciones realizadas en la dispensación al finalizar los 30
frascos de muestra de cada subgrupo no alteran la tendencia central del volumen dosificado en la prueba desde su inicio.
Cálculo del peso del volumen de envase del reactivo Sustrato
Las densidades de las 10 muestras tomadas a 5 lotes de reactivo Sustrato se muestran en la siguiente tabla.
Tabla 2. Densidad del reactivo Sustrato por frasco.
Muestras
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1013-0311
(g/mL)
1,0748
1,0689
1,0703
1,0678
1,0693
1,0698
1,0676
1,0667
1,0683
1,0680
1002-0411
(g/mL)
1,0719
1,0665
1,0687
1,0708
1,0694
1,0710
1,0701
1,0667
1,0639
1,0650
Lotes Sustrato
1004-0711
(g/mL)
1,0738
1,0663
1,0658
1,0739
1,0670
1,0687
1,0729
1,0688
1,0707
1,0723
1005-0711
(g/mL)
1,0686
1,0693
1,0661
1,0673
1,0656
1,0653
1,0689
1,0657
1,0702
1,0685
1006-0911
(g/mL)
1,0698
1,0681
1,0716
1,0724
1,0684
1,0696
1,0708
1,0732
1,0679
1,0683
Temperatura
23,4 °C
24,6 °C
24,1 °C
22,9 °C
23,8 °C
138
Utilizando el software estadístico Minitab 14 para procesar las muestras obtenidas de los cinco lotes de reactivo sustrato, se
comprobó que cumple las condiciones de aleatoriedad (prueba Run Test) y normalidad (prueba Anderson-Darling α = 0,05 <
P-Value = 0,737) con un NC del 95%. Además las medias y varianzas de los cinco lotes no tienen diferencias significativas
entre sí con α = 0,05 < P-Value = 0,118 One-Way ANOVA y α = 0,05 < P-Value = 0,428 Bartlett´s Test respectivamente.
Los gráficos de control a σ y 2σ (Figura 2) muestran puntos fuera de control tanto en el gráfico de media como de variabilidad
o sea no están en control estadístico, por lo que los límites de especificación de la densidad del reactivo Sustrato serán
establecidos utilizando el gráfico de control a 3σ (Figura 2), en el cual el conjunto de muestras de los cinco lotes muestreados
se encuentra dentro de los límites de control estadístico calculados.
D e ns ida d de l R e a c ti v o S us tr a to po r F r a s c o
+ 3 S L= 1 .0 7 6 2 2
Individual V alue
1 .0 7 6
+ 2 S L= 1 .0 7 3 8 2
1 .0 7 2
+ 1 S L= 1 .0 7 1 4 2
_
X= 1 .0 6 9 0 3
1 .0 6 8
-1 S L= 1 .0 6 6 6 3
-2 S L= 1 .0 6 4 2 3
1 .0 6 4
-3 S L= 1 .0 6 1 8 3
1 .0 6 0
1
6
11
16
21
26
O b s e r v a t io n
31
36
41
46
+ 3 S L= 0 .0 0 8 8 3 5
M oving Range
0 .0 0 8
+ 2 S L= 0 .0 0 6 7 9 1
0 .0 0 6
+ 1 S L= 0 .0 0 4 7 4 8
0 .0 0 4
__
M R = 0 .0 0 2 7 0 4
0 .0 0 2
-1 S L= 0 .0 0 0 6 6 0
-3 S L= 0
-2
0 .0 0 0
1
6
11
16
21
26
O b s e r v a t io n
31
36
41
46
Figura 2. Control a σ, 2σ y 3σ de la densidad del reactivo Sustrato por frasco.
Los límites de especificación de la densidad del reactivo Sustrato a una temperatura entre 20 °C y 25 °C son: 1,069 ± 0,007
g/mL.
Límites de especificación del peso del volumen de envase del reactivo Sustrato.
LSE Peso del Volumen de Envase (g) = LSE Densidad (1,076 g/mL) x Volumen de Envase (2mL)
LC Peso del Volumen de Envase (g) = LC Densidad (1,069 g/mL) x Volumen de Envase (2 mL)
LIE Peso del Volumen de Envase (g) = LIE Densidad (1,062 g/mL) x Volumen de Envase (2 mL)
Los límites de especificación del peso del volumen de envase del reactivo Sustrato para 2 mL a una temperatura entre 20°C y
25 °C son: 2,138 ± 0,014 g.
Recálculo de los límites de especificación del peso del volumen de envase del reactivo Sustrato.
LSE Peso del Volumen de Envase (2,152 g) → Volumen de Envase (2 mL)
LSE Peso del Volumen de Envase Recalculado (?) → LSE del Volumen de Envase (2,008 mL)
LSE del Peso del Volumen de Envase Recalculado = 2,1606 g ≈ 2,160 g
LIE Peso del Volumen de Envase (2,124 g) → Volumen de Envase (2 mL)
LIE Peso del Volumen de Envase Recalculado (?) → LIE del Volumen de Envase (1,992 mL)
LIE del Peso del Volumen de Envase Recalculado = 2,1155 g ≈ 2,116 g
Finalmente los límites de especificación del peso del volumen de envase del reactivo Sustrato a una temperatura entre 20 °C y
25 °C son: 2,138 ± 0,022 g. Estos límites de especificación serán utilizados para el control en línea del proceso de llenado.
139
Conclusiones
1. Los límites de especificación del volumen de envase del reactivo Sustrato utilizando la máquina llenadora Bausch
Stroebel KSF 1020, la bomba de dispensación 0,3-2,1 mL 5196 NT449518010L/0901 con agujas dosificadoras de
diámetro 2,0 mm son 2,0 ± 0,008 mL.
2. Los límites de especificación del volumen de envase del reactivo Sustrato calculado en la prueba de variabilidad son
válidos solo para la bomba, mangueras y agujas utilizadas.
3. Las interrupciones en la dispensación realizadas al finalizar los 30 frascos de muestra de cada subgrupo no alteran la
tendencia central del volumen dosificado en la prueba desde su inicio.
4. Los límites de especificación del peso del volumen de envase del reactivo Sustrato a utilizar en el control en línea del
proceso de llenado a una temperatura entre 20 y 25 °C son 2,138 ± 0,022 g.
Referencias
12-
Procedimiento de Operación de la Máquina Llenadora de Frascos Bausch Stroebel KSF 1020. PNO IX-01-14. Edición No 2. 5/2004.
CIE.
Walpole E. Ronald. Estadística y Probabilidad para Ingenieros.. Sexta Edición. Pearson Education ; 1999.
140

IV Taller de Calidad del Polo Científico Hotel Palco, 13

Transcripción

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