Capítulo 3 Inmunohistoquímica del pterigión

Transcripción

Capítulo 3
Inmunohistoquímica del pterigión
— INTRODUCCIÓN
— EL LECHO LIMBAR: UN LUGAR ACTIVADOR Y DESACTIVADOR DE SEÑALES
— EXPRESIÓN DEL GEN p53
— LAS COLAGENASAS EN EL PTERIGIÓN
— EXPRESIÓN DEL FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR
— INESTABILIDAD MICRO-SATÉLITE Y PÉRDIDA DE HETEROCIGOCIDAD
EN EL PTERIGIÓN
— LA APOPTOSIS EN EL PTERIGIÓN
— CIRUGÍA ACTUAL DEL PTERIGIÓN
— BIBLIOGRAFÍA
Capítulo 3
Inmunohistoquímica del pterigión
Alejandro de la Torre Burbano
INTRODUCCIÓN
El pterigión es una lesión neoplásica benigna
caracterizada desde el punto de vista histopatológico por un crecimiento fibrovascular local
invasivo del tejido conjuntivo hacia la córnea
(1). Ocurre en la fisura interpalpebral y tiene su
origen en las células madre basales epiteliales
del lecho limbar (CMEL), transformadas, activadas y proliferativas. Esta lesión puede ocurrir en
los lados nasal, temporal, o ser bilateral y aunque su etiología no se conoce por completo,
existe una fuerte evidencia epidemiológica que
compromete a la luz ultravioleta (LUV) como el
mayor factor de riesgo ambiental (2). Los enfermos de pterigión a menudo se quejan de ojo
rojo, irritación crónica y leves cambios en la
visión cuando avanza sobre la córnea.
Tradicionalmente se ha definido como una
lesión degenerativa elastótica crónica. Sin
embargo, los hallazgos por estudios inmunohistoquímicos (IH) y de biología molecular en
CMEL que expresan la mutación del gen p53,
un marcador común en gran variedad de cánceres humanos así como en lesiones actínicas de
la piel, sugiere un desorden proliferativo semejante a un tumor (3) (fig. 1).
Estudios recientes en el pterigión han reconocido que la exposición crónica a la LUV puede
provocar inestabilidad microsatélite, pérdida de
heterocigocidad, disrupción en el proceso normal de apoptosis y oncogénesis.
Con base en la IH de especímenes primarios
y recurrentes, los cambios tisulares observados
en el pterigión podrían explicarse por la mutación del gen p53 como un suceso precoz provocado por la irritación crónica de la LUV;
como consecuencia se altera su proteína y todo
el mecanismo genético de muerte celular programada dependiente del gen de p53. Las CMEL
alteradas se comportan como un tumor, invaden
la córnea a través de la membrana basal arrastrando células conjuntivales a modo de tejido
fibrovascular neoformado (2,4,5).
También se compromete el equilibrio entre la
matriz metaloproteinasa MMPs y los inhibidores
de metaloproteinasas TIMPs, que al promover la
invasión, la degradación y el remodelamiento
del tejido conectivo afectan la membrana basal,
el colágeno tipo IV del estroma corneal y la
membrana de Bowman (2-4).
El factor de crecimiento vascular endotelial,
importante inductor de proliferación celular
Fig. 1: Coloración de hematoxilina y eosina de un caso de
pterigión, la cual muestra un epitelio escamoso con escasas células caliciformes, edema estromal y angio-fibroproliferación.
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endotelial se ha encontrado elevado en el pterigión, así como otros factores angiogénicos y
epiteliales, a saber, el factor de crecimiento
fibroblástico, el factor del crecimiento epidermal unido a la heparina, el factor del crecimiento tisular conectivo, y el factor del crecimiento dependiente de la insulina (4).
En la patogénesis del pterigión se activan
múltiples sistemas celulares, que conducen a
una cascada de procesos complejos y coordinados que al final producen inflamación crónica,
proliferación, remodelamiento del tejido conectivo, angiogénesis e invasión corneal. Por razones desconocidas el lecho activado puede
entrar en períodos de quietud.
Según los datos que se evaluarán en este
capítulo, se puede decir que la patogénesis del
pterigión primario y recurrente resulta de la pérdida de las barreras naturales epiteliales sobre
todo de las células caliciformes, pues facilitan
así la irritación crónica de las CMEL por la LUV,
provocan la mutación del gen p53 sensible a la
LUV, alteran su fenotipo y activan progresivamente otros genes que provocan cambios tisulares. Entonces las CMEL invaden la córnea acom-
3. Inmunohistoquímica del pterigión
pañadas de tejido fibrovascular para destruir la
membrana basal, disolver la membrana de Bowman e infiltrar el estroma corneal superficial y se
comportan como una neoplasia benigna.
EL LECHO LIMBAR: UN LUGAR ACTIVADOR
Y DESACTIVADOR DE SEÑALES
El lecho limbar es el micro ambiente específico donde se localizan, mantienen y reciben
señales las CMEL de células endoteliales, fibroblastos, epitelios y la matriz extracelular (6). Las
células madre son un grupo reducido de células indiferenciadas, capaces de división celular
asimétrica dando lugar a una célula que permanece como célula madre que no migra y a
una segunda célula hija capaz de migrar del
lecho a lo largo de la membrana basal, que se
puede diferenciar como célula del epitelio corneal con rangos diversos de capacidad proliferativa, conocidas como células amplificantes
transitorias TAC (7,12). Las células madre son
responsables de mantener el epitelio corneal
(9,10) (fig. 2).
Fig. 2: El lecho libar para células madre (CMEL). Las señales que activan las CMEL son factores de crecimiento, diferenciación y supervivencia, críticos para sostener el lecho funcional y estructuralmente.
Las señales que activan las CMEL son factores de crecimiento, diferenciación y supervivencia, críticos para sostener el lecho funcional y
estructuralmente (6-8). Todos estos factores dirigen unos gradientes para mantener las CMEL en
un fenotipo indiferenciado durante la vida del
organismo (10). La membrana basal limbar es
distinta en su composición de membrana basal
de los epitelios conjuntivales y corneales, así
como los proteoglicanos del estroma (6).
Con técnicas histoquímicas (azul alcian
8GX, ácido peryódico Schiff) realizadas en el
laboratorio el autor ha podido observar cambios
en los patrones para marcar y diferenciar el pterigión con respecto al tejido normal (fig. 3).
Schermer et al. (13), demostraron que el marcador celular K3 queratina se puede localizar en
todas las células epiteliales menos en las células
madre. Las diversas proteínas se expresan preferentemente en las células limbares basales y se
han estudiado como marcadores; en este grupo
se incluyen:
1. Enzimas metabólicas: α-enolasa, citocromooxidasa, anhidrasa carbónica y transportadores de glucosa.
2. Receptores para factores de crecimiento:
receptor para factor de crecimiento epitelial,
receptor TGFβ1 y 2, TrkA.
3. Componentes cito esqueléticos: queratina
19-35 y vimentin 36.
4. Componentes del ciclo celular: ciclinas D
y E y p107.
5. Otras: α9 integrin, melanina, p63.
Esta distribución enfatiza la heterogeneidad
de fenotipos celulares presentes en el limbo,
pues no existe un marcador preciso para CMEL
sanas (6-12).
El limbo es el lugar de origen de la mayoría
de las displasias corneales epiteliales y de las
neoplasias (6-9).
EXPRESIÓN DEL GEN p53
El gen p53 (fig. 4) es un gen supresor de
tumores que codifica la proteína p53 que controla el ciclo celular normal y previene la formación de neoformaciones. La mutación en el
35
Fig. 3: Técnica histoquímica para sialomucinas y mucinas
neutras de un caso de pterigión. Se observa un epitelio con
metaplasia escamosa.
gen p53 es lo más común en los cánceres
humanos: 70% en cáncer pulmonar, 50% en
cáncer de piel, 20% en cáncer de mama y 10%
en leucemia (14-22). Las alteraciones del gen
p53 se puede identificar por la sobre-expresión
de la proteína p53 descubierta por el anticuerpo
monoclonal clon DO-7, un anticuerpo dirigido
contra los aminoácidos 19 y 26 de la p53 en su
forma nativa y en sus formas mutantes.
La proteína p53 nativa es clave en el control
de la división celular anómala; una mutación en
el gen p53 puede resultar en una proliferación
celular incontrolada (15-24).
La proteína p53 es un factor de trascripción
que interactúa y aumenta la tasa de trascripción
de otros 6 genes conocidos: p21, MDM2,
GADD45, Bax, IGF-BP y ciclina G, para llevar a
cabo el reconocimiento de la naturaleza normal
del DNA en la división celular, que permite la
replicación tisular o conduce la célula a la
apoptosis (28).
36
Fig. 4: Muestra de pterigión marcada con el anticuerpo
monoclonar p53 (DO-7-DAKO). Se observa patrón de marcaje nuclear en células basales y algunas células superficiales.
Normalmente en una célula la proteína p53
existe en forma p53 activa a bajas concentraciones y tiene un período corto de vida media,
cerca de 20 minutos, lo que la hace invisible a
los colorantes inmunohistoquímicos actuales;
por tanto siempre que es objetivada es un indicador de mutación (15-17).
La célula utiliza varias proteínas para reconocer las diferentes alteraciones en el DNA. Las
proteínas que reconocen células con genomas
inestables debido al daño en el DNA o células
en micro-ambientes anormales, envían señales
para elevar los niveles de p53, que a su vez
aumenta su actividad como factor de trascripción e inicia una cascada en la que participan
genes como p21, ciclinas y complejos Cdk, que
pueden bloquear la progresión del ciclo celular;
así se establece el control normal en la mitosis
celular conduciendo las células hacia la apoptosis dependiente de p53, y mantiene en esta
forma la normalidad tisular (16,19,20). La proteína p53 también se manifiesta en la fase G2-M y
previene la entrada prematura en la fase S del
ciclo celular (18).
La acción crónica de la LUV en las CMEL provoca mutaciones en el gen p53, pues cambia la
secuencia específica del dominio localizado entre
los aminoácidos 120 y 192, y como producto hay
contactos defectuosos en el DNA con pérdida en
la capacidad del p53 para actuar como factor de
trascripción, de donde resultan una proliferación
celular incontrolada y un cambio para las señales
que activan los factores de crecimiento y la vía de
las ciclinas D1-Cdk4 (16-21).
En la patogénesis del pterigión se ha reportado una tasa alta de inmunorreactividad para
p53 en el epitelio basal y los estudios concluyen
que ese hallazgo confirma las mutaciones de
p53 y que desempeña un papel importante en
los orígenes del pterigión (fig. 4).
Tsai et al. (3), en un estudio reciente encontraron 22,8% como prevalencia de expresión de p53
en 127 pterigión. Al revisar 8 estudios inmunohistoquímicos por Medline informaron como tinciones positivas las cifras de 7,9%, 36,8%, 37,5%,
38,1%, 50%, 53,8%, 60% y 100%, lo que sugiere la necesidad de estandarizar los estudios inmunohistoquímicos para definir la prevalencia exacta de mutación del gen p53 (14). Por ahora; la presencia de mutación de p53 en el pterigión nos
explica su naturaleza y su patogénesis.
LAS COLAGENASAS EN EL PTERIGIÓN
Una de las características histopatológicas
del crecimiento del pterigión es la proliferación
fibrovascular (24) y su invasividad hacia la córnea, lo cual explica la tendencia a la reproducción posquirúrgica (25). Otra característica es
que, en la medida en que el tejido fibrovascular
progresa se pierden la membrana basal, la
membrana de Bowman y el estroma corneal
superficial, facilitado por la matriz de metaloproteinasas (6,26,27).
La matriz de metaloproteinasas MMPs está
formada por una familia de más de 21 proteasas genéticamente distintas sintetizadas y
secretadas por una variedad de tipo celulares
que incluyen fibroblastos, células epiteliales,
PMN, etc., y que son capaces de modificar y
degradar de modo efectivo todas las proteínas de la matriz extracelular especialmente:
colágeno, elastina, fibronectina y proteoglicanos.
Se han dividido en 5 grupos: colagenasas
(MPP-1, MMP-8 y MMP-13), gelatinasas (MMP2 y MMP-9), estromelisinas (MMP-3, MMP-10 y
MMP-11), membrana tipo MMP y metaloelastasas (27-30).
Por lo menos 4 inhibidores tisulares de metaloproteinasas, los TIMPS también los expresan
varios tipos de células incluidos los fibroblastos.
Los TIMPs y la Alfa2 macroglobulina son inhibidores de las formas activas de MMPs (30).
El equilibrio entre la actividad de MMPs y sus
inhibidores TIMPs determina la extensión de la
proteolisis, y resulta en remodelación y degradación de tejido conectivo. En general, un ratio
incrementado MMPs-TIMPs se correlaciona con
la capacidad de invasión tumoral. Se sabe que
los fibroblastos del pterigión cuando crecen en
cultivo muestran elevada expresión de MMPs
(28).
Los estudios recientes de Li et al. (25), evidencian que sólo en la cabeza del pterigión hay
un alza significante de la actividad de MMP-1 y
MMP-3. No existen cambios en la expresión de
MMP-2, TIMP-1 y TIMP-2, en las otras regiones
del pterigión, ni en la córnea, ni en la conjuntiva normal (24). Estos datos proporcionan la evidencia o soportan el concepto que la invasión
del pterigión en parte se facilita por una población poco común de fibroblastos activados en
su cabeza o ápex (29,30).
La MMP1 es una colagenasa intersticial que
puede degradar colágeno fibrilar nativo tipo I, II,
III, X y XI, MMP-3 o estromelisina-1, específica
para degradar caseína, proteoglicanos, fibronectina, elastina, laminina, así como colágenos
tipos III, IV, V, y IX. Cuando estas dos metaloproteinasas colaboran, aumentan la acción proteolítica (26,27).
37
Entonces es concebible que la sobreproducción de MMP-1 y MMP-3 con relación a su
TIMPs facilite el efecto invasor de los fibroblastos de la cabeza del pterigión en la córnea, para
degradar la membrana basal, la membrana de
Bowman y el estroma superficial de la córnea,
hallazgos histopatológicos bien reconocidos en
esta enfermedad. La expresión alta de MMP-1 y
MMP-3, sin cambio en los TIMPs, se ha propuesto también como la base de metástasis de
las células tumorales donde la invasión celular
es una característica común. Es, pues una posible evidencia de que el pterigión sea un tumor
benigno (31,32).
Los daños en el colágeno y en la elastina, signos clásicos de «degeneración elastótica»,
secundarios a la exposición crónica a la LUV,
ahora se entienden como resultado de la acción
proteolítica en la matriz extracelular del tejido
conectivo (33).
EXPRESIÓN DEL FACTOR DE CRECIMIENTO
ENDOTELIAL VASCULAR
Los factores de crecimiento se identificaron
originalmente como estimuladores de la mitosis
de las células tisulares, mientras se creía que las
citoquinas afectaban la mitosis y diferenciación
de las células inflamatorias, pero hoy se sabe
que unos y otras interactúan (33). La formación
y progresión del pterigión dependiente de la
fibrosis y neovascularización ocurre por un
equilibrio entre inhibidores angiogénicos, estimuladores angiogénicos y factores de crecimiento (34-39).
El factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF) es un importante inductor de angiogénesis durante la embriogénesis (35), la remodelación de tejidos, la cicatrización de heridas, así
como en los tumores. Se encuentra altamente
expresado en el pterigión con respecto a las
conjuntivas humanas sanas, y esto sugiere un
compromiso directo o indirecto en la patología
del pterigión. Además induce la proliferación y
la migración de las células endoteliales y actúa
también como un factor quimiotáctico para los
monocitos (34-36).
38
Normalmente al VEGF lo inhibe de modo
selectivo y directo el factor de crecimiento
conectivo tisular (CTGF). La producción de
MMPs es un evento común en la patogénesis
del pterigión que rompe CTGF (36,37), y reactiva así la acción angiogénica e inflamatoria del
VEGF y esto induce la proliferación endotelial
celular y la angiogénesis del pterigión. El VEGF
afecta el micro ambiente del lecho limbar necesario en la patogenia de esta entidad. En el ojo
la proteína del VEGF se ha descubierto en tejidos normales bien vascularizados como la conjuntiva, el iris y la retina (34,38,39).
En las células inflamatorias del pterigión y en
los cultivos de fibroblastos del mismo se han
encontrado: factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor β transformador del crecimiento
TGFβ, y factor α de necrosis tumoral (38). Estos
hallazgos permiten afirmar que las citoquinas y
los factores de crecimiento contribuyen a la proliferación celular, a la inflamación, a remodelar
el tejido conectivo y a la angiogénesis, típicas
del pterigión (40,41).
La mitomicina C (MC) inhibe el sistema TGFβ
y disminuye la posibilidad de cicatrización.
Hay estudios recientes que han identificado
capilares intraepiteliales en el pterigión con factores de crecimiento de fibroblasto básico en
tejido conectivo acompañado de mastocitos.
Los fibroblastos en particular tienen cierto papel
en la recurrencia del pterigión, dado que existe
una fuerte inmunorreactividad para factor básico de crecimiento de los fibroblastos en el pterigión recurrente (36-42).
INESTABILIDAD MICRO-SATÉLITE Y PÉRDIDA
DE HETEROCIGOCIDAD EN EL PTERIGIÓN
La pérdida de heterocigocidad celular (LOH)
significa perder la multifuncionalidad de las
CMEL. Entre los genes que juegan un papel en
la carcinogénesis, están los genes supresores de
tumores (TSG), los cuales a menudo son inactivados por mutaciones o pérdida del material
genético en un alelo. LOH es un marcador de la
existencia de TSG (43,44).
La inestabilidad genética en la forma de LOH
se ha visto en condiciones benignas como queratosis actínica de la piel, en lesiones premalignas, por ejemplo displasias de bajo grado y en
otras más serias, cáncer escamocelular (43-46).
El hecho de que el pterigión muestre el fenómeno LOH sugiere que los genes que suprimen
los tumores se pueden comprometer en el desarrollo de tal lesión. LOH en el pterigión se ha
encontrado con una incidencia alta en la región
17Q, hallazgo semejante en algunas lesiones
neoplásicas de pulmón, mama, esófago, riñones,
vejiga, piel y sangre. Estos hallazgos sugieren que
los genes supresores de tumor localizados en esta
área pueden tener un papel muy importante en el
desarrollo de la neoplasia (44,45).
En el tejido conjuntival normal que se toma
de sitios protegidos por los párpados no se halla
LOH; esto puede indicar un posible vínculo
entre LOH y la exposición a la LUV (44).
Se ha sugerido una predisposición genética
hacia el desarrollo del pterigión como una
forma de herencia autosómica dominante. La
correlación de incidencia familiar del pterigión
en jóvenes aparece en varios estudios, sin
embargo, el hallazgo de LOH que no se relaciona de modo significante con la historia familiar está de acuerdo con el concepto de LOH
como un evento somático (46).
La evidencia del papel de la LUV se aprecia
en los estudios de TSG. El método usual para
localizar los sitios en el genoma de los candidatos a TSG se hace al descubrir la pérdida de
heterocigocidad con marcadores microsatélites
altamente polimórficos. Una de las características de las células neoplásicas es la tasa mutacional alta por parte de los genes polimórficos y
se refleja en la actividad de microsatélites de
DNA (47). Detorakis et al. (44), al examinar 15
marcadores microsatélites en las regiones 17P,
17Q, 13Q, 9P y 9Q con la reacción de la polimerasa en 50 pterigión, encontraron que la perdida de heterocigocidad es común (se observó
con más frecuencia en 9P [48%] y 17Q [42%]),
mientras que la inestabilidad microsatélite de
DNA es rara (44,45-49).
Además, la pérdida de la heterocigocidad en
la región 9Q se vio más a menudo en el pteri-
gión recurrente y se correlacionó con factores
de riesgo como la exposición temprana a la
LUV y vivir en un área de peligro (49).
LA APOPTOSIS EN EL PTERIGIÓN
El mantenimiento de la homeostasis celular
está regulado esencialmente por una fina interrelación entre la proliferación y la apoptosis
celular, que se define como la muerte celular
programada para las células que han alcanzado
el término de su ciclo vital, según varias características: disminución del volumen, marginación de la cromatina y fragmentación del DNA
(50,51). Se ha propuesto la necesidad de la trascripción mediada por p53 para inducir apoptosis. Sin embargo, no todos los eventos apoptóticos son mediados por p53. La opción depende
del tipo celular (52).
Los inhibidores de la apoptosis incluyen
genes tales como el bcl-2 y bclx1 mientras que
los promotores incluyen otros genes como el
bax, bad, bak, bcl-xs. Dos de los genes que son
regulados por p53 definen el destino de la célula (bax-bcl-2). Si p53 inhibe la expresión de bcl2 promueve la expresión de bax iniciando el
camino de la apoptosis (51-53).
En un estudio de Tan y col (51), se evaluaron
15 muestras de pterigión junto con 15 tejidos
conjuntivales normales del mismo ojo para
Fig. 5: Corte conjuntival para iniciar la disección.
39
observar la expresión de genes asociados con la
inducción o represión de apoptosis p53, bcl-2 y
bax. En los pterigión se encontraron células
apoptóticas limitadas esencialmente a la capa
epitelial basal situada inmediatamente adyacente
al soporte fibrovascular. Esas células expresaron
niveles significativos de p53 y de bax, así como
la proteína inhibidora de la apoptosis bcl-2. En
contraste, las muestras de conjuntiva normal no
expresaron bcl-2 y las células apoptóticas fueron
vistas a través de todo el espesor de la capa epitelial acopladas con niveles altos de expresión de
bax. Estos resultados están a favor de la teoría por
la cual en el desarrollo del pterigión hay trastorno del proceso de apoptosis (51-53).
CIRUGÍA ACTUAL DEL PTERIGIÓN
Una vez conocidas las bases inmunohistoquímicas del pterigión, el objetivo del tratamiento quirúrgico debe ser: retirar todo el tejido
fibrovascular invasivo, inflamado y neoformado
(54-57) (figs. 5, 6, 7 y 8). En nuestra opinión,
además de la reconstrucción anatómica, estética y funcional del lecho limbar debe realizarse
aplicación tópica de mitomicina C al 0,02%
(intraoperatoria de 0,2 mg/ml durante 30 segundos) (54) (figs. 9 y 10).
Para la reconstrucción anatómica, estética y
funcional, utilizamos un auto injerto conjuntival
Fig. 6: Cuerpo del pterigión preparado para cortar a ras de
la córnea.
40
Fig. 7: Lecho córneo-limbar.
Fig. 8: Puliendo la superficie desnuda córneo-escleral.
Fig. 9: Mitomicina C colocada sobre esclera con microesponja y viscoelástico.
Fig. 10: Autoinjerto in situ, limbo a limbo.
de la conjuntiva bulbar superior, o si no hubiera conjuntiva sana injertamos membrana amniótica (57).
El autor quiere agradecer al Doctor Oscar
Tamayo, Morfólogo e Inmunólogo de la Universidad del Valle y de la Universidad Santiago de
Cali por la revisión del manuscrito y el trabajo
de laboratorio.
3.
4.
5.
6.
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Capítulo 3 Inmunohistoquímica del pterigión

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