Caracterización molecular de aislamientos de Escherichia coli

Caracterización molecular de aislamientos de Escherichia coli

Esquivel P, et al • Caracterización molecular de aislamientos de Encherichia coli...
artículo original/artigo original
Caracterización molecular de aislamientos de
Escherichia coli productores de diarrea en niños y
adultos de la ciudad de Corrientes, Argentina
Molecular characterization of diarrheagenic Escherichia coli isolates from
children and adults in the city of Corrientes, Argentina
Patricia Esquivel1
Viviana Lifschitz2
Liliana S. Lösch3
Marcelo G. Medina3
Ana M. Pato4
Adriana Cacciamani5
Luis A. Merino6*
Magister en Ciencias del Medio Ambiente y
la Salud. Facultad de Medicina, Universidad
Nacional del Nordeste, Sargento Cabral 2001,
Corrientes, Argentina; 2 Magister en Ciencias
del Medio Ambiente y la Salud. Facultad de
Medicina, Universidad Nacional del Nordeste,
Sargento Cabral 2001, Corrientes, Argentina
y Laboratorio de Microbiología, Hospital “J.
R. Vidal”, Corrientes, Argentina; 3 Magister
en Ciencias Médicas Tropicales. Facultad de
Medicina, Universidad Nacional del Nordeste,
Sargento Cabral 2001, Corrientes, Argentina;
4
Especialista en Microbiología. Laboratorio de
Microbiología, Hospital “A. I. de Llano”, Ayacucho 3288, Corrientes, Argentina; 5 Bioquímica.
Laboratorio de Microbiología, Hospital “J. R.
Vidal”, Necochea 1050, Corrientes, Argentina;
6
Doctor en Bioquímica. Facultad de Medicina,
Universidad Nacional del Nordeste, Sargento
Cabral 2001, Corrientes, Argentina.
1
Rev Panam Infectol 2010;12(3):17-21.
Conflicto de intereses: ninguno
Recibido en 24/6/2009.
Aceptado para publicación en 12/4/2010.
Resumen
El objetivo de este trabajo fue determinar la frecuencia de
Escherichia coli diarreogénicas en la ciudad de Corrientes. De
pacientes con diarrea de los cuales no se aisló Salmonella ni
Shigella, se seleccionaron aislamientos de E. coli los cuales se
estudiaron mediante PCR múltiple usando cebadores que detectan
los siguientes genes: elt, est, eae, stx, ipaH y aggR. En 40 (31%)
muestras provenientes de 129 pacientes se detectaron cepas de
E. coli portadoras de algún factor de patogenicidad, siendo la
frecuencia global de los tipos patogénicos la siguiente: E. coli
enterotoxigénica - ECET (8,5%), E. coli enteroagregativa - ECEA
(7,8%), E. coli productora de toxina Shiga - ECTS (7,0%), E. coli
enteropatógena - ECEP (4,7%) y E. coli enteroinvasiva - ECEI
(3,1%). La prevalencia de E. coli diarreogénicas encontrada en
pacientes con diarrea aguda justifica la utilización de métodos de
biología molecular para arribar a un correcto diagnóstico etiológico
que aporte conocimientos tendientes a tomar medidas de prevención y control de estas patologías.
Palabras clave: Escherichia coli, diarrea, factores de virulencia.
Abstract
The aim of this work was to determine the frequency of
diarrheagenic Escherichia coli in the City of Corrientes, Argentina.
In patients with diarrhea in which nor Salmonella or Shigella were
recovered, the isolates of E. coli were selected to be studied by
multiplex PCR using primers that detect the following genes: elt, est,
eae, stx, ipaH and aggR. Over 129 patients, E. coli strains carrying
at least one pathogenicity factor were detected in 40 (31%) samples. The overall incidence of pathogenic types was: enterotoxigenic
E. coli - ETEC (8.5%), enteroaggregative E. coli - EAEC (7.8%),
Shiga toxin-producing E. coli - STEC (7.0%), enteropathogenic
E. coli - EPEC (4.7%) and enteroinvasive E. coli - EIEC (3.1%).
The frequency of diarrheagenic E. coli found in patients with acute
diarrhea justifies the use of molecular biology methods to achieve
at the right etiologic diagnosis, which will provide the knowledge
17
Rev Panam Infectol 2010;12(3):17-21.
to take the measures for prevention and control of
these diseases.
Key words: Escherichia coli, diarrhea, virulence
factors.
Introducción
A pesar de la existencia de estudios que indican
que Escherichia coli es un importante agente etiológico
de diarrea y representa el mayor problema de salud
pública en los países en desarrollo,(1) en los cultivos
rutinarios de muestras provenientes de pacientes con
diarrea aguda sólo se llega al diagnóstico etiológico en
aquellos casos en los cuales el agente involucrado son
Salmonella, Shigella o Campylobacter.
E. coli presenta un amplio conjunto de serotipos
entre los cuales sólo algunos son responsables de causar enteritis en humanos y dado que la mayoría de ellos
se encuentran formando parte de la biota habitual del
tracto digestivo del hombre, cada vez que se obtiene un
aislamiento de esta bacteria a partir de heces diarreicas se hace imprescindible diferenciar aquellos tipos
capaces de producir enfermedad entérica de aquellos
que sólo se encuentran como comensales.(2)
Las cepas diarreogénicas de Escherichia coli se
clasifican en Escherichia coli Enterotoxigénica (ECET),
Escherichia coli Enteropatógena (ECEP), Escherichia
coli Enteroinvasiva (ECEI), Escherichia coli Enteroagregativa (ECEA), Escherichia coli productora de
toxina Shiga (ECTS) y Escherichia coli de Adherencia
Difusa (ECAD).(1)
Datos publicados por diversos autores atribuyen a
cada tipo patogénico distribuciones diferentes según
la edad de los pacientes y regiones geográficas.(3,4)
El objetivo de este trabajo fue determinar la
frecuencia de los diferentes tipos patogénicos de E.
coli productores de diarrea obtenidas en la ciudad de
Corrientes (Argentina).
Materiales y métodos
Pacientes: Se incluyeron en el presente trabajo
pacientes pediátricos y adultos con cuadro de diarrea
aguda, definida como el aumento de la frecuencia,
fluidez y/o volumen de las deposiciones, con pérdida
variable de agua y electrolitos y cuya duración es menor
de 14 días,(5) que asistieron en carácter de ambulatorios entre noviembre de 2005 y noviembre de 2007
a dos centros de salud privados y dos hospitales de
la ciudad de Corrientes. Los pacientes adultos y los
tutores legales que acompañaban a los niños prestaron
su consentimiento escrito para la toma de muestra
y fueron informados acerca del uso que se haría de
los resultados de los análisis efectuados, según el
protocolo aprobado por los Comités de Ética de las
instituciones participantes.
18
Determinación del tamaño de la muestra: Durante el
año 2005 se notificaron a través de los laboratorios 58
casos de diarrea aguda por cada 100.000 habitantes
en la provincia de Corrientes(6) y si se tiene en cuenta
que la población de la ciudad de Corrientes, capital
de la provincia homónima, es de aproximadamente
330.000 habitantes7, podría inferirse que en los dos
años estudiados debieron notificarse cerca de 380
casos de diarrea aguda en esa ciudad. Si se toma como
base los datos de prevalencia de E. coli diarreogénicas
en otros países (máxima: 10% y mínima: 1%),(8-10)
mediante el programa Epi Info se obtiene que para
una población de 380 pacientes con diarrea aguda es
necesario estudiar un mínimo de 91 pacientes (Nivel
de confianza 99,9%).
Recolección y procesamiento de muestras: Las muestras de heces se recolectaron y procesaron por métodos
habituales de coprocultivo para la detección de patógenos gastrointestinales.(11) De cada dos casos que arrojaron resultados negativos para Salmonella y Shigella, se
seleccionó un cultivo y de éste, se conservaron en agar
blando 5 aislamientos identificados bioquímicamente
como Escherichia coli. Estas cepas fueron posteriormente resembradas en agar Cisteína Lactosa Deficiente en
Electrolitos durante 18 horas a 37ºC.(11)
Detección de genes de virulencia: Una colonia de
cada aislamiento se resuspendió en 200 ml de Tritón
1% en buffer Tris-EDTA (pH 8,0). Luego de 10 minutos
de incubación en baño de agua a 100ºC las muestras
fueron centrifugadas a 10000 rpm durante 10 minutos
y el ADN presente en el sobrenadante fue usado como
templado. Este procedimiento es una modificación
del propuesto por Toma y cols. quienes parten de
bacterias provenientes de un cultivo nocturno en caldo
Luria-Bertani y como agente lisante utilizan un buffer
conteniendo Tween 20 y proteinasa K.(12)
La amplificación mediante PCR se realizó de acuerdo al protocolo estandarizado por Toma y cols.(12) Brevemente, la mezcla de reacción contenía 10 mM de TRISHCl (pH 8,3), 50 mM de KCl, 0,1% de gelatina, 1,5 mM
de Cl2Mg, 2,5 U de Taq ADN polimerasa, 0,2 mM
de desoxinucleótidos trifosfato, los cebadores en las
concentraciones que se muestran en la tabla 1 y 5 ml
del templado. Se utilizaron 6 pares de cebadores que
detectan 6 genes codificantes de factores de virulencia correspondientes a 5 tipos patogénicos a saber:
ECET (elt y est), ECEP (eae), ECTS (stx), ECEI (ipaH)
y ECEAg (aggR). El programa de amplificación fue
de 30 ciclos de: 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 52ºC y
1 minuto a 72ºC más una extensión final de 10 minutos
a 72ºC. Como controles positivos se incluyeron cepas
de E. coli correspondientes a las diferentes categorías
patogénicas y como control negativo se utilizó un
aislamiento de E. coli ATCC® 25922, carente de los
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Tabla 1. Características de los cebadores utilizados en la caracterización de aislamientos de Escherichia coli
mediante PCR múltiple
Cebador
Concentración
en la mezcla
SK1
0,125 µM
SK2
0,125 µM
VTcom-u
0,25 µM
VTcom-d
0,25 µM
AL65
0,5 µM
AL125
0,5 µM
LTL
0,25 µM
LTR
0,25 µM
ipaIII
0,125 µM
ipaIV
0,125 µM
aggRks1
0,25 µM
aggRks2
0,25 µM
Gen
Tamaño banda
(Pb)
eae
881
stx
518
est
147
elt
322
IpaH
619
Sequencia (5´ to 3’)
Tipos
CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC
ECEP
y
ECEH
CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG
GAGCGAAATAATTTATATGTG
ECTS
TGATGATGGCAATTCAGTAT
TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG
ECET
CCTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC
TCTCTATGTGCATACGGAGC
ECET
CCATACTGATTGCCGCAAT
GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC
ECEI
GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC
AggR
GTATACACAAAAGAAGGAAGC
254
ECEA
ACAGAATCGTCAGCATCAGC
Abreviaturas: ECET: E. coli Enterotoxigénica, ECEA: E. coli Enteroagregativa, ECTS: Escherichia coli productora de toxina Shiga, ECEP: E. coli Enteropatógena, ECEI: E. coli
Enteroinvasiva, ECEH: E. coli Enterohemorrrágica
factores de patogenicidad buscados. De cada producto
final de la PCR, 20 ml se sometieron a electroforesis
en gel de agarosa al 2% durante 35 minutos a 75 V.
El gel fue teñido durante 10 minutos con bromuro de
etidio (0,5 mg/ml) y visualizado con luz UV. El buffer
utilizado tanto en la cuba electroforética como en la
preparación del gel de agarosa fue TRIS-Acetato-EDTA
(TAE). Los patrones de banda obtenidos se analizaron
mediante el programa UVITec.
Análisis estadístico: El tratamiento estadístico de
los datos se llevó a cabo mediante el programa Epi
Info 2000 aplicándose la prueba de chi cuadrado para
variables cualitativas, considerando el Test Exacto de
Fisher para valores menores a 5 y fijándose un valor
de p <0,05 para la significación estadística.
Resultados
Sobre 320 cultivos de materia fecal realizados en
los centros participantes, 258 (80%) fueron negativos para Salmonella o Shigella. De éstos, 129 (50%)
fueron seleccionados para estudiar los aislamientos de
Escherichia coli. Estas muestras correspondieron a 85
pacientes con edades entre 1,2 meses y 14 años y a
44 pacientes con edades entre 16 y 73 años.
En 40/129 muestras se detectaron cepas de
Escherichia coli diarreogénicas lo que arroja una
prevalencia del 31% en pacientes con diarrea aguda
cuya etiología por Salmonella o Shigella había sido
descartada. Si se considera que solamente se estudió
la mitad de los cultivos negativos para esos dos patógenos, la prevalencia global de E. coli diarreogénicas
Tabla 2. Frecuencia de los distintos tipos patogénicos de
E. coli según el grupo etario de los pacientes estudiados
Muestras
Pacientes
< 14 años
Pacientes
> 14 años
Total
n
%
n
%
n
%
Positivas
28
32,9
12
27,3
40
31,0
ECET
7
8,2
4
9,1
11
8,5
ECEA
8
9,4
2
4,5
10
7,8
ECTS
6
7,1
3
6,8
9
7,0
ECEP
3
3,5
3
6,8
6
4,7
ECEI
4
4,7
0
0
4
3,1
Negativas
57
67,1
32
72,7
89
69,0
Totales
85
100
44
100
129
100
Abreviaturas: ECET: E. coli Enterotoxigénica, ECEA: E. coli Enteroagregativa, ECTS:
Escherichia coli productora de toxina Shiga, ECEP: E. coli Enteropatógena, ECEI: E.
coli Enteroinvasiva.
sobre el total de los pacientes incluidos sería del 25%.
En la tabla 2 se presenta la frecuencia absoluta y
porcentual de los resultados obtenidos según el grupo
etario de los pacientes. Con la excepción de ECEI que
no se detectó en pacientes mayores de 14 años, se
hallaron genes de virulencia correspondientes a todos
los tipos patogénicos estudiados en ambos grupos de
edades, sin diferencias significativas entre los hallazgos de los diferentes tipos patogénicos y las edades
de los pacientes.
En aquellas muestras que resultaron positivas
para el gen stx también se detectó el gen eae, ambos
correspondientes al tipo patogénico ECST.
19
Rev Panam Infectol 2010;12(3):17-21.
Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa de los
productos de amplificación de E. coli diarreogénicas.
Calles 2 a 13: cepas provenientes de pacientes con
diarrea; calles 14 a 19: Controles positivos (se indican
los genes correspondientes a cada banda). Calles 1 y
20: Marcador de pesos moleculares de 100 pb.
En la figura 1 se muestran las bandas obtenidas
con los productos de amplificación mediante electroforesis en gel de agarosa para cada tipo patogénico.
Discusión
Aunque la determinación de la etiología de las
diarreas agudas no siempre es indispensable para la
instauración de un tratamiento específico, es de fundamental importancia para conocer la epidemiología
de los diferentes agentes, para obtener información
de utilidad tendiente a establecer conductas desde el
punto de vista de la Salud Pública y para encarar el
desarrollo de futuras vacunas.
Debido a la similitud fenotípica entre los aislamientos de Escherichia coli, la metodología de PCR
múltiple ha sido utilizada para identificar y diferenciar
cepas patogénicas en numerosos estudios.(13) Con la
idea de reunir en una sola reacción el número mínimo
de cebadores que permitan caracterizar los cinco tipos
patogénicos de E. coli, se diseñaron PCR múltiples
con diferentes combinaciones de cebadores, lo cual
permite en pocas horas identificarlos.(14)
Existen pocos datos acerca de los distintos tipos
patogénicos de E. coli en nuestro país debido a que
no todos los centros asistenciales poseen capacidad
operativa para aplicar la técnica de PCR entre los aislamientos de estos patógenos. En un trabajo realizado
en la ciudad de San Luis, los autores encontraron
que la prevalencia de ECTS y EIEC fue de 0,6% y
de 1,5% para EPEC en coprocultivos donde no se
aisló Salmonella o Shigella, cifras muy inferiores a
las encontradas en el presente trabajo en la ciudad
de Corrientes.(15)
El hallazgo del 31% de muestras con algún factor
de patogenicidad entre la población estudiada es se-
20
mejante a los datos encontrados en Finlandia (35%)
cuando se estudiaron diarreas del viajero, pero muy
superior a lo reportado en ese mismo país cuando se
estudiaron residentes que presentaron diarrea aguda
(5,5%), lo cual parece lógico si se considera que en
los países nórdicos, la mayoría de los casos de diarreas
se consideran importados.(4,16)
ECST presenta una alta prevalencia en nuestro
país y algunos serotipos, especialmente el 0159, se
relacionan con el desarrollo de Síndrome Urémico Hemolítico en niños.(17) En el presente trabajo se detectó
el gen que codifica para la toxina Shiga en 6 niños
y 3 adultos, de los cuales ninguno presentó diarrea
sanguinolenta.
ECEA es reconocido como un patógeno entérico
emergente y estudios previamente publicados destacan
su importancia en la diarrea del viajero y lo presentan
como la causa del 15% de las diarreas en niños en
países en desarrollo y del 4% en los niños de países
industrializados;(18) en la serie incluida en este estudio
fue el tipo patogénico más frecuente, especialmente
entre las muestras pediátricas.
Según estudios previos, la frecuencia de aislamiento de ECET en niños con diarrea varía del 10 al
30%, mientras que en adultos su presencia puede ser
asintomática y poco frecuente o producir diarrea del
viajero;(19) en el presente trabajo este tipo patogénico
prevaleció en ambos grupos por lo que debería replantearse su rol como agente etiológico de diarrea en
adultos residentes, una vez descartada la presencia de
cualquier otro tipo de patógeno entérico u otra causa
no infecciosa.
La prevalencia de los diferentes tipos de E. coli
diarreogénicas presentan variaciones sustanciales entre las diferentes regiones; tal es así que las frecuencias
de ECEI, ECTS y ECET en pacientes menores de 14
años encontradas en el presente trabajo son superiores
a las reportadas en Vietnam y Dinamarca para el mismo
grupo etario.(9,20)
Los hallazgos de esta investigación refuerzan
la idea de quienes sostienen que, aunque sin gran
impacto en el tratamiento sintomático, conocer la
verdadera etiología de las diarreas agudas ayuda a
delinear estrategias de prevención y control para evitar
la aparición de nuevos casos,(21) permite obtener datos
para el desarrollo de futuras vacunas,(22) a la vez que
refuerza la necesidad de mejorar la vigilancia de las
infecciones producidas por estas bacterias.(17)
Conclusiones
La alta prevalencia de tipos patogénicos de E.
coli encontrada en pacientes con diarrea justifica la
utilización de métodos de biología molecular para arribar a un correcto diagnóstico etiológico que permita
Esquivel P, et al • Caracterización molecular de aislamientos de Encherichia coli...
comprender mejor la epidemiología de estos patógenos
y contribuir a la implementación de medidas sanitarias
de prevención y control.
Agradecimientos
Los autores desean expresar su agradecimiento a
la Fundación “Alberto J. Roemmers” por el subsidio
otorgado para la realización del presente trabajo,
al Servicio de Fisiopatogenia del Instituto Nacional
de Enfermedades Infecciosas ANLIS “Dr. Carlos G.
Malbrán” por la provisión de las cepas utilizadas
como controles y a Gerardo Deluca por su inestimable
apoyo técnico.
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Correspondencia:
Dr. Luis A. Merino
Lavalle 2842. 3400, Corrientes, Argentina.
e-mail: [email protected]
21