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Curso de Fluorescencia 2008-PEDECIBA
Práctica 4
Efectos del calcio y del pH sobre la interacción
prodan-albúmina seguidos por FRET
Introducción
La transferencia resonante de energía se aplica a la transferencia de energía entre dos
cromóforos. Un cromóforo dador de energía es excitado a un estado capaz de transferrir
energía a través de un acoplamiento de largo alcance (2-9 nm) dipolo-dipolo con el
cromóforo aceptor de energía. Para que el proceso ocurra no es necesario que alguno de
los cromóforos decaiga al estado basal por vías luminiscentes, sin embargo, una forma
del fenómeno que tiene amplias aplicaciones es el FRET entre fluoróforos, y es en esos
casos en que suele usarse FRET como sinónimo de Fluorescence Resonance Energy
Transfer. La transferencia de energía
por resonancia es un fenómeno
electrodinámico (no radiativo) que
ocurre a través del espacio sin
necesidad de contacto entre un dador
excitado y un aceptor en estado basal
que interaccionan como osciladores
acoplados. Para que ocurra FRET
entre fluoróforos la emisión del
dador en ausencia del aceptor debe
Para que la condición de resonancia se
tener lugar a longitudes de onda más
cumpla es necesario que los espectros de
cortas que las del aceptor y debe de
absorción del aceptor y de emisión del
dador se superpongan significativamente.
superponerse al menos parcialmente
con el espectro de absorción de este.
La transferencia es en gran medida independiente del solvente y/o la macromolécula
interviniente, aunque estos pueden afectar el FRET si modifican las propiedades
espectrales de dador y/o aceptor. El FRET contiene información estructural a cerca del
par dador-aceptor, distinta de la revelada por el estudio de la relajación por el solvente,
de reacciones del estado excitado, del apagamiento o de la anisotropía de la
fluorescencia. Las aplicaciones más frecuentes de FRET incluyen la medición de
distancias entre dos sitios en una macromolécula, como por ejemplo la determinación de
la distancia entre un triptofano dador y un
aceptor extrínseco unido en forma
covalente
o
no
covalente;
la
determinación de constantes de afinidad
en
el
estudio
de
interacciones
moleculares; y el estudio de complejos
macromoleculares en los que más de un
par dador-aceptor es posible. Cuanto más
complejo es el sistema, menos
Diagrama de Jabloski para FRET y otros
informativo suele ser el estudio del FRET
fenómenos fluorescentes mencionados en el
en condiciones estacionarias y más útiles
texto.
son los estudios de FRET resuelto en el
tiempo.
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La teoría predice que la constante de velocidad de la transferencia resonante de energía
kT depende linealmente de J(λ), la integral de solapamiento espectral (ec. 1, Fig. 1); e
inversamente con la sexta potencia de la distancia dador aceptor r (ec. 2 y 4). FD(λ) es
la intensidad de fluorescencia corregida del dador en el rango de longitudes de onda λ to
λ + ∆λ con un area bajo la curva para ese rango normalizada a la unidad. εA(λ) es el
coeficiente de extinción molar molecular del aceptor a λ perteneciente al rango antes
mencionado. El término κ2 es un factor que describe la orientación relativa de los
dipolos de transición del dador y
del aceptor, el cual frecuentemente
se asume igual a 2/3. La distancia r
(1)
a la que la eficiencia de
transferencia (E) es del 50% es
denominada la distancia de Förster
(2)
(R0). De estas ecuaciones se puede
deducir que R0 puede calcularse
conociendo
el
rendimiento
cuántico del dador (QD) y la
(3)
constante de decaimiento del dador
excitado en ausencia del aceptor
(τD)-1 y los espectros de emisión
(4)
del dador y de absorción del
aceptor como lo establece la ec. 5.
En estas ecuaciones n es el índice
de
refracción
del
medio
(5)
(típicamente se asume igual a 1.4),
N es el número de Avogadro.
La albúmina sérica humana (HSA) es una proteína multidominio con varios estados
conformacionales plegados en función del pH. Según se ha propuesto, la transición de la
forma neutra a la forma básica podría ser relevante in vivo (pH1/2 = 8). Además, la HSA
presenta propiedades alostéricas. Se compone de una única cadena polipeptídica de 585
residuos y se organiza en tres dominios homólogos (cada uno dividido en dos
subdominios A y B). Entre otras
funciones, la HSA es responsable
del
transporte
de
varios
metabolitos, hormonas y fármacos,
para lo que dispone de más de una
veintena de sitios de unión. El sitio
preferencial de unión a Ca2+ de la
HSA aún mal definido se hallaría
en el dominio I, y es de baja a
moderada afinidad (Kd en el rango
mM). La unión de Ca2+ aumenta
con el pH y facilitaría la transición
N--B Algunos de estos sitios han
sido muy bien descriptos ya, tal es
el caso del sitio de unión a
fármacos de Sudlow I (SI). Este
sitio se localiza en el el dominio II,
HSA (PDB 1BM0), dominios I, II y III en
mora, verde y azul.
subdominio A. El prodan es un
fluoróforo sintético derivado del
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naftaleno que fue introducido por G. Weber para
el estudio de la polaridad de los sitios de unión
en proteínas, particularmente de su sitio de
unión en la albúmina. Se ha demostrado que el
prodan se une a SI con una constante de
afinidad de 4x105 M-1 (25°C), la cual no cambia
con el pH en el rango de pH de 6-9, y que el prodan (6-propionil-2-dimetilaminonaftaleno,
C15H17NO, 227.31 g/mol)
prodan unido puede actuar como aceptor de
energía del Trp 214 (dominio II, subdominio B). La solubilidad del prodan en agua es
limitada (∼4 µM) y la interacción con la HSA ocurre por fuerzas de van der Waals, por
lo que la misma es dependiente de la fuerza iónica (Ic, ec. 6).
(6)
Objetivos
1) Estudiar el efecto del pH (6.5-9.0) sobre la distancia aparente Trp-prodan.
2) Estudiar los efectos de la unión de Ca2+ (0-2.4 mM) sobre la fluorescencia de
prodan-HSA a pH 6.5 y 9.0.
Materiales
Soluciones:
HSA 1 mM en H2O
Prodan 5 mM en etanol
Buffer (A) Tris-HCl 50 mM pH 9.0, I = 0.15.
Buffer (B) Tris-HCl 50 mM pH 9.0, CaCl2 24 mM, I = 0.15.
Buffer (C) HEPESH/HEPESNa 50 mM pH 6.5, I = 0.15.
Buffer (D) HEPESH/HEPESNa 50 mM pH 6.5, CaCl2 24 mM, I = 0.15.
Materiales:
Piseta con agua
Piseta con etanol
Cubeta de fluorescencia de quarzo
Juego de micropipetas automáticas
Tips
Papel suave para secado de cubeta
Procedimiento N°1
Encendido y preparación del espectrofluorímetro, seteo del potencial del
foromultiplicador.
Condiciones experimentales fijas: T = 25ºC.
Se prepararán por monuplicado las mezclas que aparecen en la Tabla I en tubos
plásticos de 1.5 mL y se registrarán espectros de emisión excitando a 295nm (305-570
nm) y 360 nm (370-570 nm).
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Tabla I. Efectos del pH
Buffer A
(µL)
Buffer C
(µL)
HSA
(µL)
Prodan
(µL)
Referencia
Prodan
500
500
-
2
Referencia
HSA
500
500
3.5
-
Blanco
500
500
-
-
1
-
1000
3.5
2
2
100
900
“
“
3
200
800
“
“
4
500
500
“
“
5
800
200
“
“
6
900
100
“
“
7
1000
-
“
“
pH medido
Procedimiento N°2
Encendido y preparación del espectrofluorímetro, seteo del potencial del
foromultiplicador.
Condiciones experimentales fijas: T = 25ºC.
Se prepararán por monuplicado las mezclas que aparecen en la Tabla II en tubos
plásticos de 1.5 mL y se registrarán espectros de emisión excitando a 295nm (305-570
nm) y 360 nm (370-570 nm).
Tabla II. Efectos de la unión de Ca2+
pH 6.5
Buffer C Buffer D HSA
(µL)
(µL)
(µL)
Prodan
(µL)
1
980
0
20
2 µL
2
955
25
“
3
930
50
4
905
5
880
pH 9.0
Buffer A
(µL)
Buffer B
(µL)
HSA
(µL)
Prodan
(µL)
1
980
0
20
2
“
2
955
25
“
“
“
“
3
930
50
“
“
75
“
“
4
905
75
“
“
100
“
“
5
880
100
“
“
Analice y discuta los resultados.
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Procesamiento y Análisis de datos.
Determinación de eficiencias de FRET. La eficiencia del FRET (E) en el caso de dos
cromóforos fluorescentes puede evaluarse fácilmente como el cociente entre la
fluorescencia del dador Trp214 (FD) menos la fluorescencia del dador Trp214 en
presencia del aceptor (FDA) sobre FD (ec. 7). FD y FDA pueden ser evaluadas como la
intensidad de la fluorescencia a una λ o la integración de la intensidad entre λa y λb
siempre que no existan en ese rango contribuciones de otros fluoróforos. Tanto en el
caso de aceptores unidos en
forma covalente como no E = (FD-FDA)/FD
(7)
covalente,
es
necesario
considerar la fracción de
marcado de la proteína en el
cálculo de la eficiencia del FRET
(ec. 8), donde fA es la fracción
(8)
del aceptor marcado (en este caso
unido a la HSA).
Cálculo de la fracción de HSA en complejo con prodan. Se conoce que la HSA posee
un único sitio de unión a prodan. La reacción de unión tiene una estequiometria de 1 y
una constante de afinidad de 4x105 M-1 a T = 25ºC, la que no varía con el pH en el
rango en estudio. Usando esta Ka, y los valores de las concentraciones totales de HSA y
de prodan, puede calcularese la concentración de HSA libre y así la fracción de aceptor
marcado (ec. 9-11).
HSAL + prodanL ÅÆ HSA-prodan
HSAL =
− b + b 2 − 4 K A (− HSAT )
2K A
b = K A ( prodanT − HSAT ) + 1
(9)
(10)
(11)
Cálculo de R0. Este se realiza de acuerdo con la ec. 5. Primero ha de calcularse J(λ) (ec.
1) usando los espectros de absorción del aceptor de y de emisión del dador. Los
espectros pueden procesarse con ayuda de programas que permitan realizar
integraciones numéricas. El
espectro de emisión del dador
(305-570nm) debe integrarse
(1)
para calcular su área (Á). Luego,
las intensidades del espectro
original deben corregirse por un
factor constante igual a (Á)-1, así
(5)
se obtiene FD(λ), la intensidad
emisiva
corregida
(adimensional) del dador para
cada λ. El coeficiente de
(12)
extinción molecular del aceptor
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(prodan) para el rango de λ relevante (305-570 nm) puede obtenerse conociendo un
valor de referencia (εprodan, 360nm = 18400 M-1cm-1). Puede construirse una tabla con cada
término del producto de FD(λ) por εA(λ) por λ4 y procesar los datos paso a paso, para
que los eventuales errores puedan ser advertidos más fácilmente. Grafique FD(λ)εA(λ)λ4
en función de λ y a continuación integre numéricamente FD(λ)εA(λ)λ4 para el rango de
λ relevante (305-570 nm), obteniendo así J(λ). Si εA(λ) está expresado en unidades de
M–1cm–1 y λ en nm, entonces se expresará J(λ) en unidades de M–1cm–1nm4. De acuerdo
con la ec. 5, conociendo J(λ), usando constantes físicas y trigonométricas reportadas y
tomando κ2 = 2/3 (se asume típicamente este valor) y QD = 0.11 (de la literatura),
podemos calcular R0. En forma abreviada, R0 en Å puede calcularse como lo indica la
ec. 12.
Determinaciones de la distancia Trp214-prodan (r) por cambios en la fluorescencia del
dador. Conociendo R0 y E, podemos deducir r en función del pH. Grafique r = f(pH).
Analice y discuta.
Determinaciones de la distancia Trp214-prodan (r) por cambios en la fluorescencia del
aceptor. Si el aceptor de energía es un fluoróforo, la transferencia de energía desde el
dador debe notarse como una emisión potenciada del acepor cuando excitamos al dador.
Sin embargo, la excitación del dador Trp no es totalmente selectiva ya que a la λ
seleccionada (295 nm) el aceptor también absorbe en forma significativa. Este es un
problema casi siempre presente, en muchos trabajos soslayado, que dificulta la
interpretación de resultados en términos de distancias a partir de la fluorescencia del
aceptor. Se han desarrollado correcciones para el cálculo de las eficiencias de la
transferencia (ec. 13), pero para aplicarlas es necesario tener un rendimiento de
marcado de 100%, lo que es frecuentemente imposible (por detalles ver sección 13.7 de
“Principios de Espectroscopía de
(13)
Fluorescencia, 3ª ed,). Analice y
discuta los resultados.
Bibliografía
Principles of fluorescence spectroscopy, 3rd Ed., JR Lakowicz, Springer.
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