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Consejería de Economía y Trabajo
© Avances en Ciencias y Técnicas Enológicas
Transferencia de Tecnología de la Red GIENOL al Sector vitivinícola
Edita:
JUNTA DE EXTREMADURA
Consejería de Economía y Trabajo
Editores científicos:
Dr. Manuel Ramírez Fernández
Dra. Concha de Miguel Gordillo
Dr. José Antonio Regodón Mateos
Dra. Julia Marín Expósito
Dr. Francisco Pérez Nevado
Dra. Mª Luz Álvarez Franco
D. Emiliano Zamora de Alba
Dña. Ana Muñoz González
Dña. Matilde Maqueda Gil
D. Isaac Corbacho Cuello
Dña. Eva María Monago Corchado
Departamento de Ciencias Biomédicas, Área de Microbiología.
Facultad de Ciencias (Edificio Juan Remón Camacho)
Universidad de Extremadura
Av. Elvas s/n, 06071-Badajoz
I.S.B.N.: 978-84-690-6060-5
Depósito Legal: BA-202-2007
Imprime: Artes Gráficas REJAS
E
n primer lugar, quiero dar la bienvenida a quienes el IX Congreso Nacional de
Investigación Enológica ha traído a Extremadura, y desearles que durante su estancia
disfruten de los muchos y variados encantos de nuestra región. Aquí les esperan una
naturaleza excepcionalmente bien conservada, refugio de especies únicas y sustento de una
extraordinaria diversidad biológica; una variedad de paisajes que rivalizan en belleza y
sorprenden por sus contrastes; monumentos del pasado y del presente que, tan bellos como
bien cuidados los primeros, nos transportan fácilmente a otros tiempos, y que, en su apuesta
por nuevos caminos creativos, hacen patentes los segundos, el afán de progreso que hoy
alienta en nuestra Comunidad. Y aquí podrán encontrar también fiestas y tradiciones
artesanales que nos hablan de otras maneras de vivir la relación con la tierra; pueblos y
ciudades vitales, tolerantes y abiertos al futuro; y una gastronomía que ha sabido combinar
materias primas inigualables con modos de elaboración ancestrales y respetuosos con el medio
ambiente, y en la que los vinos tienen un papel central.
Y es que Extremadura es una región de viñas y de vinos.
Las tierras arcillosas o “de barros” que ponen nombre a esa fértil comarca; las márgenes
dejadas por el curso del viejo río que los romanos llamaron Anas; la personalidad de la comarca
de Matanegra, o la especial composición de los suelos de las sierras de Gata, Montánchez y
Cañamero; una acertada combinación de variedades, y, por encima de todo, la firme
determinación de poner en valor esos activos, constituyen las bases sobre las que el viticultor
extremeño de hoy ha sabido crear una oferta de vinos de calidad y prestigio crecientes.
En un corto plazo de tiempo, Extremadura ha dejado de ser la más importante
productora de alcohol de destilación a presentar sus mejores vinos en el exterior. Para ello, ha
sido necesario acometer proyectos de gran envergadura, tanto desde el punto de vista
tecnológico como económico, muchos de los cuales han contado con un importante apoyo de
la administración regional. Esta proeza —permítanme calificarla así— ha sido posible gracias
al trabajo de las cooperativas como factor aglutinante de la oferta, a la incorporación de las
más modernas tecnologías a las bodegas, a la cada vez mayor experiencia y mejor formación
de los enólogos extremeños, y a la atención dedicada a la vertiente comercializadora del
negocio por las empresas del sector.
Un congreso como éste, orientado a difundir los últimos avances de la investigación
enológica, es una invitación al sector vitivinícola extremeño a seguir avanzando e innovando.
Un objetivo que no podrá cumplirse cabalmente si, entre todos, no somos capaces de conseguir
que el trabajo de científicos y técnicos sea conocido y aplicado por las empresas del sector.
Pues bien: a ello quiere contribuir la Junta de Extremadura con la edición de este libro; una
decisión basada en la certeza de que, para renovar su apuesta por la calidad y la competitividad
de sus productos, el sector vitivinícola extremeño debe conocer y aprovechar las aportaciones
de las ponencias que lo integran; y tomada con la esperanza de que contribuya a acortar la
distancia que aún separa sus ámbitos científico-técnico y empresarial.
Manuel Amigo Mateos
Consejero de Economía y Trabajo
Avances en Ciencias y Técnicas Enológicas
M. Ramirez y col. (eds.); Badajoz, 2007
ISBN 978-84-690-6060-5
Índice
Capítulo 1: Microbiología
ANÁLISIS SOBRE EL NÚMERO ÓPTIMO DE AISLADOS PARA DETERMINAR LA DIVERSIDAD DE LEVADURAS
EN LA FERMENTACIÓN........................................................................................................................................................................................................................................... 19
Pilar Santamaría, Patrocinio Garijo, Rosa López, Ana Rosa Gutiérrez
EMPLEO DE LEVADURAS INMOVILIZADAS DE LA ESPECIE Schizosaccharomyces pombe EN LA ELABORACIÓN
DE VINOS TINTOS ....................................................................................................................................................................................................................................................... 22
Ana Rosa Gutiérrez, Susana Sanz, Carmen Olarte, Antonio Palacios, Pilar Santamaría, Patrocinio Garijo, Rosa López
EFECTO DE LA SOBREEXPRESIÓN DEL GEN ADH2 DE Saccharomyces cerevisiae SOBRE EL METABOLOMA Y
PROTEOMA EN UNA CEPA VÍNICA DE Saccharomyces bayanus .......................................................................................................................................... 25
Oscar Maestre, Almudena Fernández-López, Teresa García-Martínez, Rafael Andrés Peinado, Juan Carlos Mauricio
ESTUDIO DE BIODIVERSIDAD Y SELECCIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS EN VINOS TINTOS DE RIOJA ........................................ 28
Carmen Tenorio, Isabel López, Rosa López, Pilar Santamaría, Patrocinio Garijo, Ana Rosa Gutiérrez
INFLUENCIA DE LA CEPA DE BACTERIA USADA PARA LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN LA LIBERACIÓN
DE COMPUESTOS VOLÁTILES DE UN EXTRACTO DE PRECURSORES DE UVA ................................................................................................ 31
P. Hernández-Orte, M. Cersosimo, N. Loscos, J. Cacho, V. Ferreira, E. García-Moruno
MLST (MULTILOCUS SEQUENCE TYPING): UN MÉTODO MOLECULAR PARA LA CARACTERIZACIÓN
INEQUÍVOCA DE CEPAS DE Oenococcus oeni Y Lactobacillus plantarum ....................................................................................................................... 34
Blanca de las Rivas, Ángela Marcobal, Rosario Muñoz
ESTUDIOS IN VITRO SOBRE LA ELIMINACIÓN DE OCRATOXINA A MEDIANTE BACTERIAS LÁCTICAS DEL VINO .............. 36
Héctor Rodríguez, Vincenzo del Prete, Alfonso V. Carrascosa, Blanca de las Rivas, Emilia García-Moruno, Rosario Muñoz
ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DEL GEN RECA PARA LA IDENTIFICACIÓN Y DISCRIMINACIÓN DE CEPAS DE
Lactobacillus hilgardii AISLADAS DE VINO ................................................................................................................................................................................................ 38
Héctor Rodríguez, Blanca de las Rivas, Rosario Muñoz
LEVADURAS NO-Saccharomyces DE ADICIÓN EXÓGENA PARA CRIANZA SOBRE LÍAS................................................................................. 41
Felipe Palomero, Santiago Benito, Antonio Morata, Fernando Calderón, José Antonio Suárez
DETECCIÓN DE Brettanomyces EN VINOS TINTOS MEDIANTE MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVO
DIFERENCIALES ........................................................................................................................................................................................................................................................... 44
Santiago Benito, Felipe Palomero, Antonio Morata, Fernando Calderón, José Antonio Suárez
INOCULACIÓN DE LEVADURAS SECAS ACTIVAS MEDIANTE SIEMBRA DIRECTA: ESTUDIO DE SU
IMPLANTACIÓN.............................................................................................................................................................................................................................................................. 47
Nuria Barrajón, Santiago Alonso, Eva Navascués, Ana Briones
DEGRADACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS PRESENTES EN VINO MEDIANTE CEPAS
DE Lactobacillus plantarum..................................................................................................................................................................................................................................... 49
José María Landete, Héctor Rodríguez, Blanca de las Rivas, Rosario Muñoz
MEJORA DEL PROCESO DE REHIDRATACIÓN DE LA LEVADURA SECA ACTIVA EN ENOLOGÍA ........................................................... 52
Boris Rodríguez Porrata, María Novo, José Guillamon, Nicolás Rozès, Albert Mas, Ricardo Cordero Otero
ESTUDIO DEL EFECTO DE PRÁCTICAS ENOLÓGICAS EN LA EVOLUCIÓN DE DISTINTAS POBLACIONES
MICROBIANAS EMPLEANDO TÉCNICAS INDEPENDIENTES DE CULTIVO ................................................................................................................ 55
Imma Andorrà, Sara Landi, Braulio Esteve-Zarzoso, Albert Mas, José Manuel Guillamón
ANÁLISIS DE LA CONJUGACIÓN DE LEVADURAS HOMOTÁLICAS DURANTE LA FERMENTACIÓN DE MOSTO ...................... 58
Jesús Ambrona, J. A. Regodón, Manuel Ramírez
EFECTO DE LA ADICIÓN DE ÁCIDOS GRASOS SOBRE LA ADAPTACIÓN DE Saccharomyces cerevisiae A BAJAS
TEMPERATURAS .......................................................................................................................................................................................................................................................... 60
Marian Redón, José Manuel Guillamón, Albert Mas, Nicolás Rozès
5
ISBN 978-84-690-6060-5
ECOLOGÍA Y DIVERSIDAD DE BACTERIAS LÁCTICAS Y PRESENCIA DE AMINAS BIÓGENAS EN VINOS DE
CRIANZA BIOLÓGICA ............................................................................................................................................................................................................................................... 63
M. Victoria Moreno-Arribas, M.Carmen Polo
EVALUACIÓN IN VITRO DEL EFECTO DE NUEVOS FUNGICIDAS SOBRE LA FLORA LEVADURIFORME
HABITUAL DE LA UVA ............................................................................................................................................................................................................................................... 65
José María Cayuela, Adela Martínez-Cacha, Paula Payá, José Oliva, Miguel Ángel Cámara, Alberto Barba
CONTRIBUCIÓN DE LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA REALIZADA POR Oenococcus oeni Y Lactobacillus
plantarum, A LA COMPOSICIÓN FENÓLICA NO ANTOCIÁNICA DE VINOS TINTOS ............................................................................................... 67
M. Victoria Moreno-Arribas, Teresa Hernández, Isabel Estrella, Fernanda Ruiz-Larrea
CONTROL DEL ÁCIDO MÁLICO MEDIANTE LA ACCIÓN CONJUNTA DE BACTERIAS Y LEVADURAS
SELECCIONADAS ........................................................................................................................................................................................................................................................ 70
Kenza Almabouada, Almudena Fernández-López, María Sancho, Enrique David Sancho
MODELO MATEMÁTICO DE LOS EFECTOS DE ALGUNAS VARIABLES ENOLÓGICAS SOBRE EL CRECIMIENTO
DE LA LEVADURA VÍNICA...................................................................................................................................................................................................................................... 73
Almudena Fernández- López, Rafaela Dios, Enrique David Sancho
POLIMORFISMO GENÉTICO DE LAS CEPAS DE LA LEVADURA DE LA CRIANZA ................................................................................................ 76
Almudena Fernández-López; María Sancho; Inmaculada Andújar; Kenza Almabouada; Enrique David Sancho
CARACTERIZACIÓN DE LEVADURAS DE VINO ECOLÓGICO DE LA DENOMINACIÓN DE ORIGEN DE
MONTILLA-MORILES ................................................................................................................................................................................................................................................. 78
María Sancho, Inmaculada Andújar, Kenza Almabouada, Almudena Fernández, Enrique David Sancho
CONSTRUCCIÓN DE LEVADURAS VÍNICAS TRANSGÉNICAS ESTÉRILES, IME1∆, INCAPACES DE PERDURAR EN
LA NATURALEZA ........................................................................................................................................................................................................................................................... 81
Jesús Ambrona, Emiliano Zamora, Manuel Ramírez
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE CEPAS ENOLÓGICAS DE Lactobacillus plantarum ........................................................................................ 84
Beatriz Rojo-Bezares, Yolanda Sáenz, Laura Navarro, Lorena Díez, Myriam Zarazaga, Fernanda Ruiz-Larrea, Carmen Torres
EFECTO ANTIMICROBIANO DE LA NISINA SOBRE LA POBLACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS Y ACÉTICAS DE
UN VINO DURANTE SU CONSERVACIÓN ............................................................................................................................................................................................... 87
Yolanda Sáenz, Lorena Díez, Cauré B. Portugal, Beatriz Rojo-Bezares, Myriam Zarazaga, Carmen Torres, Fernanda Ruiz-Larrea
SEGUIMIENTO DE LA AUTOLISIS ACELERADA DE LÍAS DE LEVADURAS POR PECTINASAS Y Β-GLUCANASAS .................. 90
Oscar Fernández; Rocío Rodríguez, Domingo Rodríguez, José Barrau, José Mª Ryan, Zenaida Guadalupe, Belén Ayestarán
EFECTO DE DIFERENTES TRATAMIENTOS DE AUTOLISIS ACELERADA DE LÍAS DE LEVADURAS EN EL COLOR
DE VINOS TINTOS ....................................................................................................................................................................................................................................................... 93
Oscar Fernández; Rocío Rodríguez, Domingo Rodríguez, José Barrau, José Mª Ryan, Zenaida Guadalupe, Belén Ayestarán
PÉPTIDOS CON BIOACTIVIDAD ECA INHIBITORIA Y ANTIOXIDANTE LIBERADOS DURANTE LA AUTOLISIS DE
LAS LEVADURAS .......................................................................................................................................................................................................................................................... 96
Encarnación Pueyo, Juan M. Alcaide-Hidalgo, M. Carmen Polo, Adolfo J. Martínez-Rodríguez
ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DEL PROCESO DE AUTOLISIS SOBRE LA CAPACIDAD DE ADSORCIÓN DE
OCRATOXINA A (OTA) POR CÉLULAS Y PAREDES DE LEVADURA ................................................................................................................................... 99
Adolfo J. Martínez-Rodríguez, Yolanda P. Núñez, Encarnación Pueyo, Alfonso V. Carrascosa
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LEVADURAS TOLERANTES A ALTAS CONCENTRACIONES DE
AZÚCARES .............................................................................................................................................................................................................................................................. 102
Teresa García-Martínez, Oscar Maestre, Rafael Andrés Peinado, Juan José Moreno, Juan Carlos Mauricio
ECOLOGÍA DE LAS FERMENTACIONES ESPONTÁNEAS DE MOSTOS Y SU RELACIÓN CON LA CALIDAD .............................. 105
M. Maqueda, T. Montero, P. Cotilla, M.L. Álvarez, E. Zamora, M. Ramírez
6
BIODIVERSIDAD DE LEVADURAS EN UNA BODEGA DE PAGO ........................................................................................................................................ 108
María Chacón, Mª Jesús Ortiz, Nuria Barrajón, Ana Briones
ISBN 978-84-690-6060-5
Índice
CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DE Oenococcus AISLADAS DE LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA DE VINOS
TINTOS CENCIBEL ELABORADOS EN CASTILLA-LA MANCHA: DISEÑO DE UN CULTIVO INICIADOR ............................................ 110
P.M. Izquierdo; S. Seseña; P. Ruiz; M. Ll. Palop
BIODIVERSIDAD MOLECULAR DE LAS LEVADURAS Saccharomyces “SENSU STRICTO” PRESENTES EN
FERMENTACIONES ESPONTÁNEAS DE EXTREMADURA ..................................................................................................................................................... 113
M. Maqueda, I.M. Barrio Vélez, M.L. Álvarez, E. Zamora, M. Ramírez
LIBERACIÓN Y FORMACIÓN DE AROMAS VARIETALES A PARTIR DE PRECURSORES “GLICOSÍDICOS”
PROCEDENTES DE VARIEDADES NEUTRAS DURANTE EL TRANSCURSO DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA ..................... 116
Natalia Loscos, Purificación Hernández-Orte, Juan Cacho, Vicente Ferreira
ESTUDIO DE LA IMPOSICIÓN DE UNA CEPA DE Acetobacter pasteurianus EN LA PRODUCCIÓN INOCULADA DE
VINAGRE DE VINO POR EL MÉTODO TRADICIONAL Y SUMERGIDO .......................................................................................................................... 119
Carlos Vegas, Wendu Tesfaye, Carla Jara, Estibaliz Mateo, Ángel González, Lourdes Morales, M. Carmen García Parrilla, José Manuel Guillamón,
Montse Poblet, Albert Mas, Ana Troncoso, Mª Jesús Torija
ESTUDIO DE LA VIABILIDAD DE LOS CULTIVOS INICIADORES EN DEPÓSITOS DE FERMENTACIÓN
INOCULADOS MEDIANTE PIE DE CUBA ............................................................................................................................................................................................... 122
Nuria Barrajón, Raquel Martín de Vidales, Eva Navascués, Ana Briones
APLICACIÓN DE UN NUEVO PREPARADO DE LEVADURAS “YSEO” PARA MOSTOS PROBLEMÁTICOS EN SU
FERMENTACIÓN ........................................................................................................................................................................................................................................................ 124
J. C. Bohlscheid, G. Specht, A. Julien, A. Palacios, J. Maloney, B. Bertheau, D. Gore, and Charles G. Edwards
MEJORA DE LA CALIDAD DEL VINO CON LEVADURAS AUTÓCTONAS SELECCIONADAS. ANÁLISIS
ESTADÍSTICO DE 6 CAMPAÑAS ................................................................................................................................................................................................................... 127
M. Maqueda, T. Montero, P. Cotilla, M.L. Álvarez, E. Zamora, M. Ramírez
DISEÑO DE UNA PLANTA PILOTO ECONÓMICA PARA PRODUCCIÓN DE LEVADURAS VÍNICAS ....................................................... 130
M. Maqueda, F. Pérez-Nevado, J.A. Regodón, M. Ramírez
ESTUDIOS DE TOXICIDAD DE LEVADURAS Saccharomyces FRENTE A NO-Saccharomyces DURANTE
FERMENTACIONES DE MOSTO ................................................................................................................................................................................................................... 133
F. Pérez-Nevado, H. Albergaria, T. Hogg, J.A. Regodón, F. Gírio
SEGUIMIENTO MEDIANTE FISH DE BACTERIAS LÁCTICAS DURANTE LA VINIFICACIÓN ....................................................................... 136
Sara Callejón, Lucia Polo, Sergi Ferrer, Isabel Pardo
EMPLEO DEL KIT DE FLUORESCENCIA LIVE/DEAD PARA EL SEGUIMIENTO DE LA VIABILIDAD DE CULTIVOS
INICIADORES INOCULADOS EN VINO .................................................................................................................................................................................................... 138
Sara Callejón, Isabel Pardo, Sergi Ferrer
DIFERENCIAS EN LA GENERACIÓN DE AMINAS EN LA VINIFICACIÓN DE LAS VARIEDADES TEMPRANILLO Y
CABERNET SAUVIGNON .................................................................................................................................................................................................................................... 140
Lucía Polo, Sergi Ferrer, Isabel Pardo
EFECTO DE LA LISOZIMA, SO2, MICROOXIGENACIÓN, TIPO DE RECIPIENTE Y ADICIÓN DE CULTIVOS
MALOLÁCTICOS SOBRE LA GENERACIÓN DE AMINAS EN VINOS DE TEMPRANILLO ............................................................................... 143
IDENTIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS PRESENTES EN EL VINO MEDIANTE HIBRIDACIÓN EN EL
“ENOCHIP” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
Rosario Mañes Lázaro, Sergi Ferrer, Isabel Pardo
DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE Brettanomyces/Dekkera EN VINOS POR TÉCNICAS MOLECULARES.................................. 149
ELABORACIÓN Y COMERCIALIZACIÓN DE LEVADURAS LOCALES SELECCIONADAS ................................................................................. 151
D. Manuel Álvarez Rangel
LA MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA: UNA HERRAMIENTA INNOVADORA PARA EL CONTROL MICROBIOLÓGICO
RÁPIDO EN BODEGA ............................................................................................................................................................................................................................................. 154
Sergi Ferrer, Isabel Pardo
7
ISBN 978-84-690-6060-5
Capítulo 2: Análisis y Control de Calidad
IDENTIFICACIÓN DE DOS NUEVOS FLAVONOLES MAYORITARIOS EN UVAS TINTAS: ß-GLUCÓSIDOS DE
LARICITRINA Y SIRINGETINA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159
Isidro Hermosín Gutiérrez, Noelia Castillo Muñoz, Sergio Gómez Alonso, Esteban García Romero
CARACTERIZACIÓN DEL AROMA DE VINOS TINTOS ENVEJECIDOS. IMPLICACIÓN DE LAS DIFERENTES
FAMILIAS DE ODORANTES EN LA PERCEPCIÓN DE LA NOTA FRUTAL Y OTRAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162
Ana Escudero, Eva Campo, Juan Cacho, Vicente Ferreira
DETERMINACIÓN DE TRANS-RESVERATROL EN VINO MEDIANTE MICRO-HPLC CON DETECCIÓN
FLUORESCENTE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165
Ricardo López, Paola Dugo, Luigi Mondello, Vicente Ferreira
PERFIL AROMÁTICO DE DIFERENTES VINOS TINTOS JÓVENES PROCEDENTES DE LAS ISLAS CANARIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
Laura Culleré, Ana Escudero, Juan Pedro Pérez-Trujillo, Vicente Ferreira, Juan Cacho
RESIDUOS DE NUEVOS FUNGICIDAS EN VINOS: EFECTOS SOBRE EL COLOR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171
José Oliva, Paula Payá, Miguel Ángel Cámara, José María Cayuela, Adela Martínez-Cacha, Alberto Barba
EVOLUCIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS CROMÁTICAS DURANTE LA CRIANZA EN BARICA DE VINOS
ELABORADOS CON LA VARIEDAD TEMPRANILLO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
Eva Mª Monago, Mª Julia Marín y Concepción De Miguel
COMPORTAMIENTO DE LA ACTIVIDAD ODORANTE FRENTE AL PARDEAMIENTO DE VINOS DULCES PEDRO
XIMÉNEZ DURANTE SU CRIANZA OXIDATIVA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177
Luis Zea, Margarita Chaves, Lourdes Moyano y Manuel Medina
ESTUDIO DE LA MADURACIÓN FENÓLICA ZONAL EN LAS VARIEDADES GARNACHA Y CARIÑENA EN LA D.O.
TERRA ALTA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180
Maite Edo, Montse Nadal, Míriam Lampreave
ESTUDIO DE LA MADUREZ FENÓLICA EN EXTRACTOS DE PIELES Y SEMILLAS DE UVA: PUESTA A PUNTO DE
UN MÉTODO DE REFERENCIA BASADO EN LA TÉCNICA DE HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183
Susanna Muñoz, Montserrat Mestres, Olga Busto, Josep Guasch
COMPOSICIÓN FENÓLICA DE VINAGRES OBTENIDOS POR ACETIFICACIÓN CON CULTIVO SUPERFICIAL EN
BARRICAS DE DIFERENTES MADERAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186
Cerezo, A.B., Tesfaye, W., García Parrilla, M.C., Troncoso, A.M.
ACEPTABILIDAD SENSORIAL DE VINOS DE LA TIERRA RIBERA DEL ARLANZA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 189
Encarnación Fernández-Fernández, Josefina Vila-Crespo, Sonia Barrera-Redondo
SCREENING DE TCA EN VINOS TINTOS DE CRIANZA ESPAÑOLES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
M. Luisa Copete, José Miguel Carot, M. Dolores Esteve, M. Dolores Climent, M. Rosario Salinas
ESTRATEGIAS PARA EL ANÁLISIS DE DATOS EN ESTUDIOS DE SCREENING EN VINOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195
Carot, J.M.; Copete, M.L; Esteve, M.D; Climent, M.D.; Salinas, M.R.; Jabaloyes, J.
ESTUDIO PRELIMINAR DE LA PRESENCIA DE 4-ETILFENOL EN VINOS TINTOS DE CRIANZA ESPAÑOLES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198
Teresa Garde, Amaya Zalacain, Cándida Lorenzo, Gonzalo L. Alonso, M. Dolores Climent, M. Dolores Esteve, M. Rosario Salinas
SEGUIMIENTO Y AUTOMATIZACIÓN DE LOS PARÁMETROS ANALÍTICOS DE INTERÉS EN LA FERMENTACIÓN
ALCOHÓLICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
Isabel López Infante, Juan Fernández Novales, José Morales Ordóñez, Pilar Ramírez Pérez, Virginia González Caballero y José Antonio García Mesa
8
ESTUDIO DE DIFERENTES MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCAPTANOS POLIFUNCIONALES,
A NIVEL DE ng l-1, BASADOS EN SU DERIVATIZACIÓN CON PFBBR Y SU POSTERIOR DETECCIÓN MEDIANTE
GC-MS-NICI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
Laura Mateo Vivaracho, Juan Cacho, Vicente Ferreira
ISBN 978-84-690-6060-5
Índice
ESTUDIO COMPARATIVO DEL CONSUMO DE AMINOÁCIDOS Y AMONIO EN ACETIFICACIONES CON CULTIVO
SUPERFICIAL Y AMONIO EN ACETIFICACIONES CON CULTIVO SUPERFICIAL Y SUMERGIDO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207
Raquel Mª Callejón, Wendu Tesfaye, Mª Jesús Torija, Albert Mas, Ana Mª Troncoso, Mª Lourdes Morales
RELACIÓN ENTRE EL TAMAÑO DEL GRANO Y LA CALIDAD DE UVA PARA VINIFICACIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
David García-Víllora, Amaya Zalacain, José R Sáez, Gonzalo L. Alonso, M. Rosario Salinas
APLICACIÓN DE GLICOSIDASAS A VINOS ELABORADOS CON LA VARIEDAD VERDEJO: EFECTO SOBRE SU
COMPOSICIÓN TERPÉNICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212
José Manuel Rodríguez-Nogales, Encarnación Fernández-Fernández, Josefina Vila-Crespo, Rubén Mahamud, Diana Santos
ANÁLISIS COMPARATIVO DE LA FRACCIÓN AROMÁTICA DE VINOS DE LA D.O. RUEDA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 214
José Manuel Rodríguez-Nogales, Encarnación Fernández-Fernández, Josefina Vila-Crespo, Marta Ramas, Sandra Laso
PUESTA A PUNTO DE UN MÉTODO DE ANÁLISIS MEDIANTE GC-MS PARA EL CONTROL DE MADURACIÓN
AROMÁTICA DE LA UVA. ESTUDIOS PRELIMINARES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216
Luciano Vera, M. Pilar Martí, Olga Busto, Josep Guasch
INFLUENCIA DE LOS CLARIFICANTES Y DE LOS COADYUVANTES DEL TIRAJE SOBRE LA CAPACIDAD
ESPUMANTE DE UN VINO BLANCO DE BOBAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 218
García, M. J.; Álvarez, I.; Lizama, V.; Aleixandre, J.L.
OBTENCIÓN INSTANTÁNEA DE LA MADUREZ TECNOLÓGICA DE LA UVA DE LA VENDIMIA 2006 POR MEDIO DE
ESPECTROFOTOMETRÍA DE INFRARROJO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221
Rosario Vila, José Ignacio Fernández, Rocío Gil, Adrián Martínez
EFECTO DE LA ADICIÓN PREFERMENTATIVA DE COPIGMENTOS EN LA COMPOSICIÓN POLIFENÓLICA DE
LOS VINOS DE TEMPRANILLO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223
Victoria Lizama; Inmaculada Álvarez; Mª José García; Rafael Apolinar; José Luis Aleixandre
EFECTO DE GLUTATIÓN Y L-CISTEÍNA COMO INHIBIDORES DE LA FORMACIÓN DE COMPUESTOS PARDOS
DERIVADOS DE LA REACCIÓN DE (+)-CATEQUINA Y ÁCIDO GLIOXÍLICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 226
T. Márquez, C. Millán, J. Mérida, J. M. Ortega
ESTUDIO DEL POTENCIAL DE LA VARIEDAD PALOMINO FINO PARA LA ELABORACIÓN DE AGUARDIENTES
PARA BRANDY DE JEREZ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229
Mª Soledad Jurado, Belén Puertas, Emma Cantos
EVOLUCIÓN DE AMINAS EN VINO CHARDONNAY ENVEJECIDO SOBRE LÍAS: INFLUENCIA DEL BATONNAGE . . . . . . . . . . . . . . . . 232
Ana González Marco, Nerea Jiménez Moreno y Carmen Ancín Azpilicueta
EFECTO INHIBIDOR DEL VINO EN LA FORMACIÓN DE ALGUNOS TÓXICOS CULINARIOS EN EL PROCESADO DE
ALIMENTOS CÁRNICOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235
M. R. Khan, R. Busquets, L. Puignou
CARACTERIZACIÓN DE LA FRACCIÓN VOLÁTIL DE VINOS DULCES NATURALES ANDALUCES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238
R. Márquez, R. Natera, R. Castro, C. García
DIFERENCIACIÓN ENTRE LOS CULTIVARES ALBARÍN BLANCO Y BLANCO LEGÍTIMO POR SUS PERFILES
FENÓLICOS EN HPLC-DAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241
Antón Masa, Mar Vilanova
CARACTERIZACIÓN DE LA INFLUENCIA DEL COLOR SOBRE MEDIDAS ÓPTICAS IR PARA MONITORIZAR LA
PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE VINO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244
Miguel A. Pérez, A. García, Jesús A. Baro, R. Crespo, Carlos E. Carleos, Luis M. Cárcel
DETERMINACIÓN DEL ESTADO DE MADUREZ DE UVAS TINTAS MINORITARIAS EN CASTILLA-LA MANCHA
MEDIANTE ANÁLISIS SENSORIAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248
E. Sánchez-Palomo; P.M. Pérez Juan; M.A. González-Viñas
9
ISBN 978-84-690-6060-5
EFECTOS DE PYRACLOSTROBIN EN EL PROCESO FERMENTATIVO DE UVAS VARIEDAD TEMPRANILLO Y EN
LAS CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICAS DEL VINO ELABORADO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251
Laura Lagunas-Allué ,Luis Vaquero-Fernández, María Teresa Martínez-Soria, Purificación Fernández-Zurbano, Jesús Sanz-Asensio, Miguel LópezAlonso, Luis Carlos Mateo-García
EFECTOS DE LA UTILIZACIÓN DEL FUNGICIDA PIRIMETANIL EN LA ELABORACIÓN DE VINOS TINTOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254
Luis Vaquero-Fernández, Laura Lagunas-Allué, María Teresa Martínez-Soria, Purificación Femández-Zurbano, Jesús Sanz-Asensio, Miguel LópezAlonso, Luis Carlos Mateo-García
PERFIL DEL AROMA DE VINOS TINTOS DE VARIEDADES MINORITARIAS EN LA REGIÓN DE CASTILLA-LA
MANCHA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 257
E. Sánchez-Palomo; M.S. Pérez Coello; M.A. González-Viñas
NUEVA APORTACIÓN ANALÍTICA PARA EL ESTUDIO DEL CAMBIO DE COLOR DE LOS VINOS TINTOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 259
María-Pilar Sáenz Navajas, María Teresa Tena, Purificación Fernández Zurbano
PREPARACIÓN DE EXTRACTOS ENZIMÁTICOS ACUOSOS RICOS EN POLIFENOLES Y ALTA CAPACIDAD
ANTIOXIDANTE A PARTIR DE SUB-PRODUCTOS DE LA VINIFICACIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262
Ana García-Martínez, L., Olga Cremades, Isabel Galocha, Juan Parrado, Juan Bautista
INFLUENCIA DE UN FITONUTRIENTE CON FITOHORMONAS EN LA EXPRESIÓN DE ANTOCIANOS Y EL COLOR
EN UVAS SYRAH Y CABERNET SAUVIGNON . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 265
Parrado J., Escudero-Gilete M.L., García-Martínez A., Romero E., Bautista J., González-Miret M.L., Heredia, F.J.
CONTROL DE PARÁMETROS RELACIONADOS CON LA CALIDAD Y SEGURIDAD ALIMENTARIA EN LA
ELABORACIÓN DE VINOS DULCES NATURALES ANDALUCES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268
Mª Jesús Hernández, Mónica Schwarz, Mª de Valme García-Moreno, Dominico A. Guillén, Carmelo G. Barroso
SEGUIMIENTO EN CONTINUO DE MICROFERMENTACIONES ALCOHÓLICAS MEDIANTE RESONANCIA
MAGNÉTICA NUCLEAR DE PROTÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271
Eva López-Rituerto, Iván Antón, Alberto Avenoza, Jesús H. Busto, Jesús M. Peregrina
ELIMINACIÓN DE PLOMO EN VINAGRES SINTÉTICOS Y DE VINO MEDIANTE RESINAS DE INTERCAMBIO
IÓNICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274
Mariela Alejandra Labbé, Fernando Noé Salazar, Francisco López
DESARROLLO DE UN SISTEMA DE FOTODERIVATIZACIÓN POST-COLUMNA ON-LINE PARA EL ANÁLISIS DE
TRANS-RESVERATROL Y TRANS-PICEIDO EN VINO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 277
Teresa Galeano, Isabel Durán, Diego Airado
Capítulo 3: Crianza y Envejecimiento
EFECTO DE LAS CONDICIONES DE SECADO SOBRE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA MADERA DE ROBLE
DESTINADA AL SECTOR TONELERO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283
Juana Martínez, Sonia Ojeda, Pilar Rubio, Estrella Cadahía, Brígida Fernández de Simón
ESTUDIO COMPARATIVO DE LA EVOLUCIÓN EN BOTELLA DURANTE CUATRO AÑOS DE UN VINO TINTO
SOMETIDO A DISTINTOS TIPOS DE ENVEJECIMIENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286
María del Álamo Sanza, Ignacio Nevares Domínguez, Carlos Martín Lobera, Laura Gallego Álvarez, Sagrario Merino García
APLICACIÓN DE FRAGMENTOS DE ROBLE EN LA ELABORACIÓN DE VINOS BLANCOS. INCIDENCIA SOBRE LA
COMPOSICIÓN Y CALIDAD SENSORIAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289
Juana Martínez, Sonia Ojeda, Pilar Rubio
10
INFLUENCIA DEL ENVEJECIMIENTO EN BARRICAS DE DISTINTO ORIGEN, TOSTADO Y VOLUMEN EN EL PERFIL
AROMÁTICO DE VINOS TINTOS DE MONASTRELL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292
P. Rodríguez Rodríguez, P. Rabión; J.M. López Roca y E. Gómez Plaza
ISBN 978-84-690-6060-5
Índice
EFECTO DE LAS TÉCNICAS ALTERNATIVAS A LA CRIANZA SOBRE LÍAS EN LA COMPOSICIÓN AROMÁTICA DE
UN VINO BLANCO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 294
Juan J. Rodríguez Bencomo; Silvia Pérez Magariño.; Carlos González Huerta.; Miriam Ortega Heras
ESTUDIO DE PREFERENCIAS ENTRE VINOS TINTOS ELABORADOS CON CHIPS Y ENVEJECIDOS EN
BARRICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 297
Silvia Pérez-Magariño, Miriam Ortega-Heras, Juan José Rodríguez-Bencomo, Pascual Herrera, Carlos González-Huerta, Mª Luisa González-Sanjosé
INFLUENCIA DEL TIPO DE VIRUTA DE ROBLE EMPLEADO SOBRE LA COMPOSICIÓN FENÓLICA DE UN VINO
DE LA VARIEDAD TINTA DEL PAÍS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 300
Miriam Ortega-Heras, Silvia Pérez-Magariño, Estela Cano-Mozo, Pascual Herrera, Carlos González-Huerta, Mª Luisa González-Sanjosé
EFECTO DE LA ADICIÓN DE VIRUTAS DE DIFERENTES FORMATOS EN EL AROMA Y LA CALIDAD SENSORIAL
DE LOS VINOS DE MONASTRELL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303
A.G. Lozano-Lencina; A.B. Bautista-Ortín; M. Cano-López; F. Pardo-Minguez; E. Gómez-Plaza; J.M. López-Roca
COMPARACIÓN DE LA CRIANZA SOBRE LÍAS CON OTRAS TÉCNICAS ALTERNATIVAS: MODIFICACIÓN DE LOS
PARÁMETROS QUE AFECTAN A LAS CARACTERÍSTICAS SENSORIALES DE UN VINO DE LA VARIEDAD VERDEJO . . . . . 306
Estela Cano-Mozo, Juan José Rodríguez-Bencomo, Miriam Ortega-Heras, Pascual Herrera, Carlos González-Huerta, Silvia Pérez-Magariño
EVOLUCIÓN DE LA COMPOSICIÓN POLIFENÓLICA DE VINOS MONOVARIETALES DE LAS VARIEDADES
TEMPRANILLO, CABERNET SAUVIGNON Y MERLOT DE LA D.O. NAVARRA ENVEJECIDOS EN MADERA DE ROBLE
ESPAÑOL Y FRANCÉS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 309
Estrella Cadahía, Pilar Poveda, Miriam Sanz, Brígida Fernández de Simón, Javier Colio
EVOLUCIÓN DE LA COMPOSICIÓN VOLÁTIL Y CARACTERÍSTICAS SENSORIALES DE VINOS DE TEMPRANILLO,
CABERNET SAUVIGNON Y MERLOT DE LA D.O. NAVARRA, ENVEJECIDOS EN MADERA DE ROBLE ESPAÑOL Y
FRANCÉS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 312
Fernández de Simón, Brígida; Poveda, Pilar; Sanz, Miriam; Cadahía, Estrella; Colio, Javier
INFLUENCIA DE LA TURBIDEZ DEL VINO SOBRE LA ACUMULACIÓN DE COMPUESTOS VOLÁTILES
PROCEDENTES DE LA BARRICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 315
Nerea Jiménez Moreno, Ana González Marco y Carmen Ancín Azpilicueta
FIJACIÓN DE COMPUESTOS VOLÁTILES PROCEDENTES DE LA MADERA DE ROBLE POR LAS LÍAS DEL VINO . . . . . . . . . . . . 318
Carmen Ancín Azpilicueta, Nerea Jiménez Moreno, Ana González Marco
INFLUENCIA DE LA FERMENTACIÓN EN BARRICA EN LA CONCENTRACIÓN DE ÉSTERES DEL VINO CHARDONNAY . . . . 321
EL PODER ANTIOXIDANTE COMO PARÁMETRO INDICATIVO DEL ENVEJECIMIENTO DE PRODUCTOS
VITIVINÍCOLAS DEL MARCO DE JEREZ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 324
Mónica Schwarz, Cristina Martínez, Mª Carmen Rodríguez, Dominico A. Guillén
RESULTADOS DE LA MICROOXIGENACIÓN DURANTE EL PROCESAMIENTO DE UN VINO MONOVARIETAL DE
VITIS VINÍFERA CV. TEMPRANILLO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 327
Cristina Pino; Begoña Bartolomé; Julián Superviola; Carmen Gómez-Cordovés
CARACTERIZACIÓN ANALÍTICA DEL BRANDY DE JEREZ Y SU CORRELACIÓN CON LA VEJEZ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 330
Cristina Martínez, M. Carmen Rodríguez, Dominico Guillén, Carmelo García
INFLUENCIA DE LAS LÍAS DURANTE EL PROCESO DE ENVEJECIMIENTO EN BARRICA Y BOTELLA DE UN VINO
MONOVARIETAL DE Vitis vinifera CV TEMPRANILLO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333
Cristina Pino; Begoña Bartolomé; Julián Superviola; Carmen Gómez-Cordovés
11
ISBN 978-84-690-6060-5
Capítulo 4: Tecnología Enológica
OPTIMIZACIÓN DE LA GESTIÓN DEL SULFUROSO DURANTE EL PROCESO DE ELABORACIÓN Y CRIANZA DE
VINOS TINTOS DE CALIDAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 339
Paloma González, Silvia González, José Carlos García, Gregorio Antolín
EFECTO DE LA MACERACIÓN PELICULAR SOBRE EL AROMA LIBRE Y LIGADO DE MOSTOS Y VINOS DE LA
VARIEDAD LISTÁN BLANCO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 341
Juan P. Pérez Trujillo; Juan J. Rodríguez Bencomo; Juan J. Méndez Siverio; Juan F. Cacho Palomar
INFLUENCIA DE LA MICROOXIGENACIÓN SOBRE EL COLOR, LA COMPOSICIÓN EN COMPUESTOS FENÓLICOS
Y LA ASTRINGENCIA DEL VINO TINTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 344
Canals, R., Llaudy, M.C., Kontoudakis, N., Gálvez, E., Magriñá, M., Santed, J., Fort, F. , Canals, J.M. y Zamora, F.
MEDIDA E INTERPRETACIÓN DE BAJOS NIVELES DE OXÍGENO DISUELTO EN VINOS TINTOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 347
Ignacio Nevares, Luis Miguel Cárcel, Carlos Martín, Laura Gallego, María del Álamo
IDENTIFICACIÓN Y SELECCIÓN DE DESCRIPTORES PARA LA CARACTERIZACIÓN SENSORIAL DE VINOS DE LA
D.O. RUEDA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350
Encarnación Fernández-Fernández, José Manuel Rodríguez-Nogales, Josefina Vila-Crespo, Cristina Arias-Bocos
INFLUENCIA DEL TOSTADO DE LA MADERA EN LAS CARACTERÍSTICAS FENOLICAS DE LOS VINOS TINTOS
TRATADOS CON CHIPS Y PEQUEÑAS DOSIS DE OXIGENO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 352
Sagrario Merino García, Laura Gallego Álvarez, Carlos Martín Lobera, Ignacio Nevares Domínguez, María del Álamo Sanza
PROCEDIMIENTO DE MEDIDA DEL “AGOTAMIENTO DEL CHIP” DE ROBLE PARA LA DETERMINACIÓN DE SU
POTENCIAL ENOLÓGICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 355
Carlos Martín, Vanesa Domínguez, Gloria Mayoral, Laura Gallego, Luis Miguel Cárcel, Ignacio Nevares y María del Álamo
CARACTERIZACIÓN ELECTROFORÉTICA DE LAS PROTEÍNAS QUE COMPONEN LA QUIEBRA PROTEICA
ESPONTÁNEA DEL VINO BLANCO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 358
Esteruelas, M., Poinsaut, P., Sieczkowski, N., Manteau, S., Fort, F., Canals, J.M., Zamora, F.
ESTABILIZACIÓN DEL COLOR EN VINO TINTO MEDIANTE UTILIZACIÓN DE MICROOXIGENACIÓN Y CHIPS DE
MADERA DE ROBLE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 361
Belén Puertas, Emma Cantos, Mª Jesús Jiménez, Mª Soledad Jurado, Mª José Serrano, Raúl F. Guerrero
ESTUDIO Y OPTIMIZACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO PARA LA ESTIMACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE
MADUREZ FENÓLICA DE LA UVA TINTA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 364
S. Fragoso, M. Mestres, O. Busto y J. Guasch
OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE ELIMINACIÓN DE ÁCIDO GLUCÓNICO EN MOSTOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 367
Rafael Andrés Peinado, Oscar Maestre, Juan José Moreno, Juan Carlos Mauricio
INCIDENCIA DEL TIPO DE CHIPS EN LOS NIVELES DE COMPUESTOS VOLÁTILES DE LA MADERA PRESENTES
EN UN VINO DE MENCÍA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 369
Mª Luisa González-Sanjosé, Beatriz Angulo-Palacios, Carlos González-Huerta, Miriam Ortega-Heras, Silvia Pérez-Magariño
ESTUDIO DEL POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE VINOS DE MENCÍA MACERADOS CON CHIPS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 372
Mª Luisa González-Sanjosé, Pilar Muñiz, Mª Dolores Rivero-Pérez, Miriam Ortega-Heras, Silvia Pérez-Magariño
ESTUDIO OLFATIMÉTRICO DEL AROMA DEL VINAGRE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 375
Laura Aceña, M. Pilar Martí, Montserrat Mestres y Josep Guasch
FACTORES QUE AFECTAN A LA INERCIA QUÍMICA DE LOS TAPONES DE CORCHO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 378
José Ramón González-Adrados, Mª José Cáceres Esteban, Florentino González-Hernández, José Luis García de Ceca, Mª Concepción García-Vallejo
12
INFLUENCIA DE LOS TRATAMIENTOS DE LAVADO EN LA COMPOSICIÓN FENÓLICA DE TAPONES DE CORCHO
PARA USO ENOLÓGICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 381
Teresa Hernández, Isabel Estrella, José Ramón González-Adrados, María Concepción García-Vallejo, Roser Juanola, Marta Moliner
ISBN 978-84-690-6060-5
Índice
WINEGAR: WOOD SOLUTIONS TO EXCESSIVE ACETIFICATION LENGTH IN TRADITIONAL VINEGAR PRODUCTION . . . 384
Albert Mas
APLICACIÓN DE LA TECNOLOGIA NIRS EN LA DETERMINACIÓN DE GLÚCIDOS DURANTE LAS ETAPAS DE
MADURACIÓN Y VINIFICACIÓN DE LA UVA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 387
Isabel López Infante, Juan Fernández Novales, José Morales Ordóñez, Pilar Ramírez Pérez, Virginia González Caballero y José Antonio García Mesa
EVOLUCIÓN DE LA FRACCIÓN DEL COLOR DURANTE LA PASIFICACIÓN TRADICIONAL POR SOLEO DE LA UVA
PEDRO XIMÉNEZ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 390
Julieta Mérida, M. José Ruiz, María P. Serratosa, Azahara López-Toledano, Manuel Medina
DESARROLLO DE UN CONTROLADOR LÓGICO BORROSO PARA LA MACERACIÓN DE VINOS TINTOS JÓVENES . . . . . . . . 393
M.C. Alonso; L.M. Navas; L.M. Cárcel; G. Ruiz; I. Nevares; M. Del Álamo
CONTROL DEL PROCESO DE ACETIFICACIÓN MEDIANTE SBSE-GC-MS E IR-MEDIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 396
Enrique Durán Guerrero, Remedios Castro Mejías, Ramón Natera Marín, Miguel Palma Lovillo, Carmelo García Barroso
ESTUDIO COMPARATIVO DE DISTINTOS SISTEMAS DE SECADO DE UVA PARA VINOS DULCES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 399
Raquel Márquez Cabeza, Remedios Castro Mejías, Ramón Natera Marín, Carmelo García Barros
ESTUDIO DE LA FASE DE FLOCULACIÓN EN EL PROCESO DE CLARIFICACIÓN POR ENCOLADO DE VINO TINTO . . . . . . 402
Nerea Iturmendi, Goiuria Beloki, Remedios Marín
EFECTO DE DISTINTOS PORCENTAJES DE SANGRADO EN LA ELABORACIÓN DE VINOS DE LA VARIEDAD MENCÍA . . . 405
José Manuel Porrúa; Ana Añón Novillo ; Manuel Maximino Losada Arias; Eugenio Revilla y Jorge López Domínguez
MÉTODO MEJORADO PARA LA DETERMINACIÓN DE AMINAS BIÓGENAS EN MOSTOS Y VINOS MEDIANTE
EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA, DERIVATIZACIÓN CON AQC Y HPLC FASE REVERSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 408
Almudena Peña-Gallego, Purificación Hernández-Orte, Juan Cacho, Vicente Ferreira
EVALUACIÓN EN LÍNEA DE LA TURBIDEZ DEL VINO MEDIANTE UN NUEVO TURBIDÍMETRO DE FIBRA ÓPTICA . . . . . . . . . . . . . 411
Raúl Crespo, Antonio García, Miguel A. Pérez, Jesús A. Baro, María del Álamo, Luís M. Cárcel
EFECTO DE LA MICROOXIGENACIÓN DESPUÉS DE LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN EL AROMA Y
COMPOSICIÓN FENÓLICA DE UN VINO CENCIBEL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 414
María Jesús Cejudo Bastante, Emilia Guchu, Isidro Hermosín Gutiérrez, María Soledad Pérez Coello
EFECTO DE NUEVAS TÉCNICAS DE VINIFICACIÓN SOBRE EL PERFIL ANTOCIÁNICO DE VINOS DE
MONASTRELL, SYRAH Y CABERNET SAUVIGNON . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 417
Hernández-Jiménez, A.; Gil-Muñoz, R.; Bautista-Ortín, A.B.; Ros-García, J.M. ; López-Roca, J.M. ; Gómez-Plaza, E.
OBTENCIÓN DE MUESTRAS ESTABLES EN EL TIEMPO PARA EL SEGUIMIENTO DE LA MADUREZ FENÓLICA.
ESTUDIO DEL EFECTO DE LA CONGELACIÓN DE UVAS TINTAS SOBRE EL COLOR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 420
S. Fragoso, M. Mestres, O. Busto y J. Guasch
SARMIENTOS DE LA VID: MATERIAL DE PARTIDA PARA LA PREPARACIÓN DE CARBÓN ACTIVADO CON
APLICACIONES EN LA INDUSTRIA ENOLÓGICA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 423
Esperanza Valdés Sánchez; Mara Olivares Marín; Carmen Fernández González; Vicente Gómez Serrano; Vincenzo Del Prete;
Raquel Manzano Durán; y Emilia García Moruno
TRATAMIENTOS DE MICRO-OXIGENACIÓN A ESCALA INDUSTRIAL. INFLUENCIA SOBRE EL COLOR DE UN VINO
TINTO TRAS SEIS MESES DE ENVEJECIMIENTO EN BOTELLA Y EN BARRICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 426
Alicia González del Pozo, Montserrat Navarro, Iñigo Arozarena, Ana Casp
CONTROL EN LÍNEA DE LA VINIFICACIÓN. DISEÑO Y DESARROLLO DE UN PROTOTIPO INTELIGENTE PARA
DEPÓSITOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 429
Ignacio Nevares, Raúl Crespo, María del Álamo, L. M. Navas, Jesús A. Baro, Luis M. Cárcel
ALTERNATIVAS A LA DISMINUCIÓN DE METANOL EN LOS AGUARDIENTES DE ORUJO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432
Ignacio Orriols Fernández, Sandra María Cortés Diéguez, Cristina López Vázquez, Daniel Fornos, Rubén Suárez Pérez
13
ISBN 978-84-690-6060-5
Capítulo 5: Viticultura
INFLUENCIA DE LA CLOROSIS FÉRRICA SOBRE EL RENDIMIENTO FOTOSINTÉTICO DEL VIÑEDO CV.
TEMPRANILLO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 437
Pedro Martín, Mª Rosa González, Luis C. Núñez, Raquel González, Pablo J. Zarco-Tejada
INFLUENCIA DEL GRADO DE MADURACIÓN SOBRE EL COLOR, LA COMPOSICIÓN FENÓLICA Y LA
ASTRINGENCIA DEL VINO; DIFERENCIAS ENTRE HOMBROS Y PUNTAS DEL RACIMO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 440
Canals, R., Llaudy, M.C., Kontoudakis, N., Cabanillas, P., Fort, F., Canals, J.M., Zamora, F.
CARACTERIZACIÓN DE DIFERENTES VARIEDADES ESPAÑOLAS DE VITIS VINÍFERA L. MEDIANTE LA TÉCNICA
DE LOS MICROSATÉLITES (SSR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 443
Catalina Baig, Tomas Puig, Nuria Barbera, Joan M. Canals, Fernando Zamora, Francesca Fort
EVALUACIÓN DEL POTENCIAL AGRONÓMICO Y ENOLÓGICO DE VITIS VINIFERA LADO, UNA VARIEDAD
MINORITARIA DE UVA BLANCA CULTIVADA EN LA DENOMINACIÓN DE ORIGEN RIBEIRO (GALICIA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 446
Pilar Blanco, Iván Vázquez, Alfonso Losada, Francisco Rego, Ignacio Orriols
VARIACIÓN DEL CONTENIDO DE POTASIO EN HOJA, MOSTO Y VINO EN FUNCIÓN DE DIVERSOS FACTORES DE
LA PRODUCCIÓN VITÍCOLA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 449
Sergio Ibáñez, Ignacio Martín, Enrique García-Escudero
INFLUENCIA MESOCLIMÁTICA SOBRE EL CONTENIDO POLIFENÓLICO DE LA UVA DE LA VARIEDAD CABERNET
SAUVIGNON . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 452
Mª José Serrano, Belén Puertas, Emma Cantos , Jesús Barreiro , Alberto García de Luján
INFLUENCIA DEL CLIMA Y DE LA CARGA EN LA MADURACIÓN DE LA VARIEDAD MERLOT EN CASTILLA-LA
MANCHA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 455
Isidro Hermosín Gutiérrez, Elena García González, Ana María Rivero Rincón, Pilar Almansa Domínguez, Sandra Bravo Martín-Consuegra,
José Ángel Amorós Ortiz-Villajos
EFECTO DEL SISTEMA DE CONDUCCIÓN EN LAS CARACTERÍSTICAS CROMÁTICAS Y COMPOSICIÓN FENÓLICA
DE VINOS TINTOS GALLEGOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 458
E. Soto Vázquez, S. Río Segade, I. Vázquez Rodríguez, J. F. Rego Martínez
INFLUENCIA DEL SISTEMA DE CONDUCCIÓN EN LA COMPOSICIÓN FENÓLICA DE VINOS TINTOS ELABORADOS
A PARTIR DE VARIEDADES MINORITARIAS GALLEGAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 461
S. Río Segade , E. Soto Vázquez, I. Vázquez Rodríguez, F. Rego Martínez
RESPUESTA AGRONÓMICA DE VARIEDADES TINTAS CULTIVADAS EN GALICIA EN DIFERENTES SISTEMAS DE
CONDUCCIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 464
Iván Vázquez, Francisco Rego, Elvira Soto, Emilia Díaz, Alfonso Losada, Ignacio Orriols, Susana Río
CRECIMIENTO DE LA BAYA DE TEMPRANILLO EN TRES DENSIDADES DE PLANTACIÓN EN DIFERENTES
SITUACIONES DE CULTIVO EN EL VALLE DEL DUERO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 468
E. Barajas, J.A. Rubio, Mª.V. Alburquerque, J. Yuste
MADUREZ DE LAS BAYAS DE TEMPRANILLO EN FUNCIÓN DE SU POSICIÓN ESPACIAL EN EL RACIMO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 471
J. Yuste, M.A. San Miguel, E. de la Iglesia, E. Barajas
INFLUENCIA DEL ACLAREO EN VINOS PROCEDENTES DE LAS VARIEDADES TEMPRANILLO Y SYRAH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 474
Rocío Gil-Muñoz; Sherezade García-Peralta ; José Ignacio Fernández-Fernández ; Adrián Martínez-Cutillas; Encarna Gómez-Plaza
INFLUENCIA DEL DESHOJADO DE LAS VARIEDADES TEMPRANILLO Y MENCÍA CULTIVADAS EN LA D.O.
VALDEORRAS EN LOS PARÁMETROS DE PRODUCCIÓN Y EN LA COMPOSICIÓN DE MOSTOS Y VINOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 477
Mar González Velázquez; Ana Añón Novillo; Manuel Maximino Losada Arias; Eugenio Revilla y Jorge López Domínguez
14
ESTUDIO DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS EN SUELOS DE VIÑEDOS DE CONSERVACIÓN Y VIÑEDOS
TRADICIONALES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 481
Ana Muñoz, Antonio López-Piñeiro, José A. Regodón, Emiliano Zamora, Manuel Ramírez
ISBN 978-84-690-6060-5
Índice
UTILIZACIÓN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO: UNA OPCIÓN EN LA VITIVINICULTURA DE CALIDAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 484
Mª Soledad Rodríguez, Laura Lagunas, Luis Vaquero, Mª Teresa Martínez, Marta Dizy, Jesús Sanz, Miguel López, Luis C. Mateo, Purificación Fernández
INFLUENCIA DEL TRATAMIENTO CON PROHEXADIONA DE CALCIO EN EL COLOR DE LAS UVAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 487
M.S. Rodríguez, L. Lagunas, L. Vaquero, J.F. Echávarri, F. Ayala, M.C. Fernández, M.T. Martínez-Soria, M. Dizy, J. Sanz-Asensio,
M. López-Alonso, L.C. Mateo, P. Fernández-Zurbano
INFLUENCIA DE LAS CONDICIONES CLIMÁTICAS EN LA SÍNTESIS DE ANTOCIANOS DURANTE LA MADURACIÓN
DE LAS UVAS DE VITIS VINIFERA L. CV. MERLOT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 490
Rafael Suárez, Pedro Martín-Alvárez, Begoña Bartolomé, Carmen Gómez-Cordovés
ESTUDIO DE LA INCIDENCIA DEL NIVEL DE CARGA BAJO DIFERENTES DOSIS DE RIEGO EN CV. TEMPRANILLO
EN EXTREMADURA DURANTE LA CAMPAÑA 2005. (I) ASPECTOS AGRONÓMICOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 492
Daniel Moreno, David Uriarte, Mª Esperanza Valdés, José Mª Carmona y Mª del Henar Prieto
EN EXTREMADURA DURANTE LA CAMPAÑA 2005. (II) MADUREZ TECNOLÓGICA Y FENÓLICA DE LAS BAYAS . . . . . . . . . . . . . . . . 495
Esther Gamero, Raquel Manzano, David Uriarte, Daniel Moreno, M. Henar Prieto y Esperanza Valdés E.
EN EXTREMADURA DURANTE LA CAMPAÑA 2005. (III) CALIDAD FENÓLICA Y CROMÁTICA DE LOS VINOS
ELABORADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 498
Esperanza Valdés; Raquel Manzano; Esther Gamero; M. Fernanda Fernández, David Uriarte; Daniel Moreno y M. Henar Prieto
EFECTO DEL RIEGO Y EL ACLAREO DE RACIMOS SOBRE EL TAMAÑO Y CALIDAD DE LAS BAYAS EN UVA TINTA
CV TEMPRANILLO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 501
David Uriarte; Daniel Moreno; Joaquín Picón; Raquel Manzano; Esther Gamero; Esperanza Valdés; Mª Henar Prieto
EXPERIENCIA DE ADAPTACIÓN DE 15 VARIEDADES TINTAS PARA LA DIVERSIFICACIÓN DE VINOS TINTOS DE
ALTA CALIDAD EN ANDALUCIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 504
Miguel Lara Benítez; José Mª González Moreno; Mª José Serrano Albarrán; Alberto García de Luján; Belén Puertas García
RELACIÓN ENTRE EL CONTENIDO DE K EN HOJA Y EL pH Y LA ACIDEZ DE MOSTOS DE LA VARIEDAD ALBARIÑO . . . 507
David Landin, Aranzazu Jorge, Miriam Lampreave, Montse Nadal, Felipe Macias
EFECTO DE LA LUZ SOBRE EL CONTENIDO DE VITAMINA C DURANTE EL DESARROLLO Y MADURACIÓN DE LA
UVA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 510
María del Carmen Gómez-Jiménez, Fernanda Agius, Miguel Angel Botella, Victoriano Valpuesta
INFLUENCIA DEL RIEGO Y DEL SISTEMA DE CONDUCCIÓN EN LA COMPOSICIÓN FENÓLICA DE VINOS
ELABORADOS CON LA VARIEDAD TEMPRANILLO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 513
E. Monago, M.J. Marín, A.M. Rodríguez y J.I. Maynar
15
Página 16 blanca
Microbiología
Página 18 blanca
ISBN 978-84-690-6060-5
ANÁLISIS SOBRE EL NÚMERO ÓPTIMO DE AISLADOS PARA DETERMINAR LA
DIVERSIDAD DE LEVADURAS EN LA FERMENTACIÓN
Pilar Santamaría1, Patrocinio Garijo1, Rosa López1, Ana Rosa Gutiérrez2
1
2
Servicio de Investigación y Desarrollo Tecnológico de La Rioja (CIDA). Ctra. de Mendavia-Logroño (NA 134, km. 88),
26071 Logroño (La Rioja). Tel. 941291833. e-mail: [email protected].
Departamento de Agricultura y Alimentación (CCT), Universidad de La Rioja. C/ Madre de Dios, 51, 26006 Logroño, (La Rioja).
Resumen:
El objetivo de este trabajo fue establecer el número mínimo de aislamientos y el momento más adecuado de realizarlos, para determinar la diversidad de Saccharomyces cerevisiae en la fermentación alcohólica. Se estudiaron tres fermentaciones, y en cada una se tomaron muestras de levaduras en tres momentos: inicio, fermentación tumultuosa y final. En cada
uno de ellos se caracterizaron a nivel clonal un número variable de levaduras (5, 10, 15, 20 y 25). Todas las levaduras aisladas
al inicio del encubado se caracterizaron como No-Saccharomyces. En general, se observa que el número de cepas distintas
aumenta al final del proceso y que un porcentaje bajo de clones coinciden en fermentación tumultuosa y final, por lo que un
muestreo en ambos puntos da más información sobre la diversidad del depósito. El estudio de 10 aislados en ambos momentos proporciona valores de diversidad similar a la obtenida al analizar 25 cepas en cada punto, por lo que el muestreo de 10 colonias aisladas en fermentación tumultuosa y al final del proceso, parece ser un número adecuado para llevar a cabo estudios
de biodiversidad de la especie Saccharomyces cerevisiae en depósitos de vinificación.
Palabras clave: Saccharomyces cerevisiae, biodiversidad, fermentación alcohólica, aislamientos, inoculación.
1. INTRODUCCIÓN
La fermentación alcohólica espontánea del mosto
de uva es un proceso complejo llevado a cabo por la acción
secuencial de diferentes géneros y especies de levadura. Las
levaduras indígenas con baja capacidad fermentativa crecen
durante las primeras etapas del encubado, pero cuando la
concentración de etanol aumenta en el medio, las levaduras
más tolerantes al mismo, pertenecientes principalmente a la
especie Saccharomyces cerevisiae, completan la fermentación. También se ha puesto de manifiesto que en el curso de
una fermentación espontánea pueden participar diferentes
cepas o clones de Saccharomyces cerevisiae.
En los últimos años se han realizado varios trabajos
sobre la ecología de levaduras vínicas, con el fin de establecer si las fermentaciones espontáneas son conducidas por
un alto o bajo número de cepas de S. cerevisiae y si hay estabilidad de estas cepas en las bodegas de un año a otro, es
decir si existen “cepas típicas” de un ecosistema (bodega o
región) [4]. También se ha evidenciado que la diversidad está
condicionada por la localización geográfica [2], por el año de
estudio [6] y por la tecnología de vinificación empleada [1,5].
No obstante, se han obtenido resultados contradictorios en
las fuentes consultadas: en unos casos se ha encontrado una
cepa claramente dominante y en otros una sucesión de
cepas presentes en un porcentaje muy pequeño [3]. Estos
resultados contradictorios pueden deberse a aspectos como:
zona geográfica, edad de la bodega, técnica de elaboración,
práctica de inoculación, materiales empleados, e incluso la
propia metodología de muestreo seguida en los estudios.
Los trabajos sobre ecología de fermentaciones industriales aportan datos más precisos y fiables cuanto mayor
es el número de días muestreados y mayor el número de ais-
lamientos por muestra. Sin embargo, el número de aislados
a estudiar no puede ser muy elevado si se quieren obtener
datos rápidos y no excesivamente costosos. La pauta utilizada sistemáticamente por nuestro equipo en los estudios
sobre ecología de fermentaciones es tomar muestras en los
depósitos tres veces a lo largo del proceso fermentativo (inicio, mitad y final), y aislar 10 colonias de levadura en cada
momento. El objetivo de este estudio fue valorar esta metodología de trabajo y establecer el número mínimo de tomas
de muestra y de aislamientos a realizar en cada una, con el
fin de determinar la diversidad de Saccharomyces cerevisiae
y las cepas de esta especie responsables de la fermentación
alcohólica.
2. MATERIAL Y MÉTODOS
Se estudiaron las levaduras en tres fermentaciones
espontáneas llevadas a cabo en tres bodegas diferentes de
la D.O.Ca. Rioja durante las vendimias del año 2005. En
cada depósito, se tomaron muestras del mosto en fermentación en tres momentos del proceso: encubado, fermentación
tumultuosa y final. Las muestras fueron trasladadas en condiciones estériles al laboratorio, donde fueron sembradas en
placas petri con medio Cloranfenicol Glucosa Agar e incubadas a 25ºC durante 48-72 horas. De cada una de las placas
se tomaron al azar 25 colonias de levadura que se sembraron en tubos con Agar Malta y se almacenaron hasta su posterior examen. Todas las colonias aisladas fueron sometidas
al análisis de restricción de su ADN mitocondrial, lo que nos
permitió clasificar las levaduras por su género (Saccharomyces o no-Saccharomyces), así como comparar las
cepas de Saccharomyces cerevisiae [3]. Los datos se estudiaron agrupando aleatoriamente las 25 colonias de levadu-
19
ISBN 978-84-690-6060-5
ras aisladas en bloques de 5, 10, 15, 20 y 25. Esta metodología de trabajo permitió evaluar la diversidad clonal de las levaduras y la presencia de cepas comunes en las distintas
etapas de la vinificación, así como comparar los resultados
obtenidos en función del número de aislados estudiados. La
diversidad (%) se calcula como: cepas distintas / cepas totales x 100.
3. RESULTADOS
Todos los aislamientos realizados en el momento
del encubado fueron identificados como levaduras No-Saccharomyces, y por lo que este muestreo no se consideró en
este estudio.
Los resultados obtenidos al estudiar todos los aislados (25 colonias en cada etapa) mostraron diferencias en la
diversidad clonal en las tres vinificaciones estudiadas (Tabla
1): en la Bodega 1 hubo una diversidad alta (64% en fermentación tumultuosa y 80% al final de la misma), en la Bodega 3 la diversidad fue muy baja (28% en ambos
momentos), mientras que en la Bodega 2 se dió una situación
intermedia con una diversidad del 32 y 68% respectivamente.
Estos datos explican que en la Bodega 1 no hubiera cepas
dominantes (datos no mostrados); en la Bodega 2, algún clon
se encontró en cantidades algo superiores al resto pero sin
ser dominantes (datos no mostrados), mientras que en la Bodega 3 dos clones (I y IV) dominaron claramente sobre el
resto (Tabla 2).
en fermentación tumultuosa y final (4 de 32 en la Bodega 1;
5 de 20 en la Bodega 2, y 3 de 11 en la Bodega 3). Por estas
causas, un muestreo en ambos puntos proporciona más información sobre la diversidad del depósito, y no sería aconsejable reducir a uno los momentos de muestreo durante la
fermentación.
Por otra parte, como se observa en la Tabla 1, un
muestreo de 10-15 aislados en ambos momentos da valores de diversidad similar a la obtenida al muestrear 25 cepas
en cada punto. Por ello, sin tener conocimiento previo de las
características de una bodega o depósito concreto, un análisis de 10-15 aislados daría resultados bastante aproximados a los obtenidos con 25. El estudio de cinco colonias da
valores de diversidad mucho mayores que con un número
mayor de aislados, por lo que éste sería un número rechazable a la hora de llevar a cabo estudios de biodiversidad.
No obstante, como se muestra en la tabla 2, cuando la biodiversidad es más baja (Bodega 3), o como sería el caso de
los controles de implantación de cepas comerciales inoculadas, con 5 aislados se podría detectar ya la cepa o cepas
dominantes, y en porcentajes similares a los obtenidos con
25 aislados.
Tabla 3. Número de clones diferentes de Saccharomyces
cerevisiae identificados en cada fase de fermentación
en función del número de aislados estudiados
Tabla 1. Variación de la diversidad clonal (%) en
las distintas vinificaciones y fases de fermentación
en función del número de aislados estudiados.
4. CONCLUSIONES
Tabla 2. Presencia (%) de los distintos clones de Saccharomyces
cerevisiae, en función del número de aislados estudiados en la
bodega 3. Datos medios de fermentación tumultuosa y final.
La metodología seguida hasta el momento para estudios de diversidad (muestreo en 3 momentos de la fermentación alcohólica con 10 colonias estudiadas en cada
punto), da resultados similares a los obtenidos al aumentar el
número de colonias estudiadas a 25. No obstante, este número podría aumentarse a 15 aislados para ajustar más los
resultados, salvo en el caso de controles de implantación de
cepas inoculadas, donde podría reducirse a 5 colonias.
5. BIBLIOGRAFÍA
20
El número de cepas distintas identificadas en los
depósitos aumentó al aumentar el número de aislados estudiados (Tabla 3), especialmente al final de la fermentación en
las Bodegas 1 y 2. Un porcentaje bajo de clones coincidieron
1. EPIFANIO, S.; SANTAMARÍA, P.; LÓPEZ, R.; GUTIÉRREZ, A.R. 1999. The influence of enological practices on the selection of wild yeast strains in
spontaneous fermentation. Am. J. Enol. Vitic. 50 (2)
219-224.
2. GUILLAMÓN, J.M. 1996. Estudio ecológico de la fermentación alcohólica mediante la utilización de mar-
ISBN 978-84-690-6060-5
cadores moleculares. Tesis doctoral. Universidad de Valencia.
3. QUEROL, A.; BARRIO, E.; RAMÓN, D. 1994. Population dynamics of wine yeast strains in natural fermentation. Int. J. Food Microbiol. 21, 315-323.
4. SABATE, J.; CANO, J.; QUEROL, A.; GUILLAMÓN, J.M.
1988. Diversity of Saccharomyces strains in wine fermentations: analysis for two consecutive years. Lett.
Appl. Microbiol. 26, 452-255.
5. TORIJA, M.J.; ROZÉS, N.; POBLET, M.; GUILLAMÓN,
J.M.; MAS, A. 2003. Effects of fermentation temperature on the strain population of Saccharomyces cerevisiae. Int. J. Food Microbiol. 80, 47-53.
6. VAN DER WESTHUIZEN, T.J.; AUGUSTYN, O.P.H.;
KHAN, W.; PRETORIUS, I.S. 2000. Seasonal variation
of indigenous Saccharomyces cerevisiae strains
isolated from vineyards of the Western Cape in South
africa. S. Afr. J. Enol. Vitic., 21, 1, 10-16.
21
ISBN 978-84-690-6060-5
EMPLEO DE LEVADURAS INMOVILIZADAS DE LA ESPECIE Schizosaccharomyces
pombe EN LA ELABORACIÓN DE VINOS TINTOS
Ana Rosa Gutiérrez1, Susana Sanz1, Carmen Olarte1, Antonio Palacios1, Pilar Santamaría2, Patrocinio Garijo2, Rosa López 2
1
2
Departamento de Agricultura y Alimentación (CCT), Universidad de La Rioja. C/ Madre de Dios, 51,
26006 Logroño, (La Rioja). Tel. 941299727 e-mail: [email protected]
Servicio de Investigación y Desarrollo Tecnológico de La Rioja (CIDA). Ctra. de Mendavia-Logroño (NA 134, km. 88),
26071 Logroño (La Rioja).
Resumen:
En este trabajo se estudió la posibilidad de realizar la Fermentación maloalcohólica (FMA) conducida por levaduras
inmovilizadas de la especie Schizosaccharomyces pombe, como una alternativa a la Fermentación Maloláctica (FML) llevada
a cabo por bacterias lácticas. El estudio se desarrolló con una partida de uva tinta, en la que se intentó inducir la FMA tanto en
el mosto como en el vino, es decir, antes y después de la fermentación alcohólica. En ninguno de los dos casos se llevó a cabo
la fermentación maloalcohólica, a pesar de acondicionar los depósitos para favorecer el desarrollo de estas levaduras, y fueron
las bacterias lácticas autóctonas las que degradaron el ácido málico. Al analizar las perlitas que contenían las levaduras después
del ensayo, se detectó que se había producido una deshidratación de las mismas que impedían el intercambio con el medio, a
pesar de que las levaduras del interior seguían vivas. Esta deshidratación se produjo probablemente por el excesivo contenido
en polifenoles del líquido, puesto que las perlitas aparecían totalmente teñidas de rojo y con un diámetro reducido.
Palabras clave: Schizosaccharomyces pombe, Vino Tinto, Levaduras Inmovilizadas, Fermentación Maloláctica,
Fermentación Maloalcohólica.
1. INTRODUCCIÓN
22
En la actualidad, los procesos de elaboración de
vinos de calidad tienden a evitar la presencia de compuestos
con riesgo para la salud (aminas biógenas, carbamato de
etilo,...), y a desarrollar y estabilizar la calidad aromática y organoléptica del producto. La fermentación maloláctica es una
transformación microbiológica, beneficiosa en algunos casos,
pero que puede causar alteraciones en este sentido: acumulación de sustancias tóxicas y desviaciones organolépticas
[2]. Por tanto, para evitar este problema habría que ejercer un
estricto control sobre la fermentación maloláctica o impedirla,
y con ello anular la presencia de las bacterias lácticas durante la vinificación.
La desacidificación de los vinos y su estabilización
al eliminar el ácido málico presente, puede llevarse a cabo
además de por la FML, mediante la actuación de levaduras
de la especie Schizosaccharomyces pombe, que realizan la
fermentación maloalcohólica, transformando el ácido málico
en etanol y CO2. Sin embargo, estas levaduras no se han
utilizado hasta hoy a nivel industrial porque si permanecen
en el mosto durante un tiempo largo, provocan una
disminución del carácter varietal y la aparición de sabores y
aromas desagradables [8]. Por otro lado, la inoculación de
los depósitos con microorganismos tiene el inconveniente de
la pérdida de control sobre los mismos una vez que éstos se
han adicionado al depósito. Sin embargo, el empleo de
microorganismos inmovilizados en estructuras sólidas, que
no se desintegran en el contacto con el mosto o el vino, y
que permiten retirarlos del medio en cualquier momento,
hace que el microorganismo esté bajo control en todo
momento.
En los vinos blancos, la FML no es unánimemente
aceptada por los enólogos porque induce un carácter vinoso
y pérdida de afrutado, aspectos no deseados en la mayoría de
los vinos blancos. El empleo de Schizosaccharomyces como
alternativa a la FML para este tipo de vinos se ha experimentado en algunas zonas frias con resultados muy prometedores. En el caso de los vinos tintos, se pueden hacer diferentes
consideraciones según el tipo de vino. Así, en los vinos destinados a crianza la presencia de las bacterias lácticas, a
pesar de los riesgos, parece ser imprescindible, ya que el
aporte de polisacáridos durante la plasmolisis celular mejora
enormemente las características del vino. Sin embargo, en
los vinos tintos de consumo joven, debe permanecer más el
carácter de afrutado y pueden ser más ligeros, por lo que las
características aportadas por la FML no son imprescindibles
La utilización de Schizosaccharomyces pombe en
forma inmovilizada, es la alternativa a la FML para vinos tintos que se estudió en este trabajo.
El ensayo se realizó a partir de uva tinta de la variedad tempranillo que fue procesada mediante estrujado,
despalillado y sulfitado en la bodega experimental del CIDA.
Se llevaron a cabo dos vinificaciones (por triplicado) en depósitos de 25 litros: Testigo, y Tratado con levaduras de desacidificación. Los depósitos Testigo fueron sulfitados a razón
de 30 mg/l de sulfuroso, se sembraron con LSA y se acondicionaron a 22ºC. Los depósitos problema se sulfitaron a
razón de 15 mg/l para no inhibir el desarrollo de las levaduras Schizosaccharomyces pombe, y fueron inoculados con
la dosis correspondiente de levaduras inmovilizadas previa-
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En el ensayo llevado a cabo sobre mosto, el inicio
de la fermentación alcohólica se retrasó 4 días en los depósitos inoculados con Schizosaccharomyces pombe , pero el
contenido de ácido málico no se modificó durante este
tiempo, ni tampoco durante el desarrollo de la fermentación.
Estos resultados son contrarios a lo encontrado por otros autores [5,6], que emplearon estas levaduras inmovilizadas con
éxito, tanto en mostos blancos como en tintos.
En los ensayos desarrollados sobre vino, se obtuvieron los mismos resultados en los depósitos y en los matraces. La fermentación maloláctica de los depósitos
sembrados con bacterias comerciales se inició rápidamente
y se completó en 10 días. Sin embargo, en los depósitos testigo y en los sembrados con Schizosaccharomyces pombe,
tardó en arrancar 25 días y su duración fue similar que en los
depósitos inoculados (Tabla 1). La acumulación en el medio
de ácido láctico, así como el crecimiento de bacterias lácticas
confirmó que en el depósito inoculado con Schizosaccharomyces pombe, fueron las bacterias y no las levaduras inmovilizadas los agentes de esta transformación. En otros
trabajos se han encontrado resultados contradictorios al inocular estas levaduras en vinos. Algunos autores [3,7] demostraron el consumo total de ácido málico aún en ausencia
de azúcares. Sin embargo, en otros trabajos se afirma que
siempre es necesaria la presencia de azúcar para asegurar
la actividad [1,4].
mente hidratadas e introducidas en bolsitas de tela de visillo
esterilizada y que contenía un contrapeso para impedir que
flotasen. Estos depósitos se mantuvieron a una temperatura
de 17ºC para retrasar el inicio de la fermentación alcohólica
y permitir la degradación del málico por las levaduras de la
especie Schizosaccharomyces pombe inmovilizadas. Todas
las fermentaciones se siguieron mediante análisis diario de la
densidad, el ácido málico y la temperatura.
Tras la fermentación alcohólica, los vinos testigo
fueron mezclados y la mezcla se distribuyó en 6 depósitos
de 15 litros y en 6 matraces de 2 litros. Dos envases de cada
tipo se inocularon con Schizosaccharomyces pombe inmovilizadas, otros dos con bacterias lácticas comerciales y los dos
restantes quedaron como testigos. Los depósitos se colocaron en una cámara de la bodega del CIDA a 20ºC y los matraces se llevaron a un laboratorio de la Universidad de La
Rioja, almacenándolos también a 20ºC, y se mantuvieron en
esas condiciones durante 1 mes. La evolución de los depósitos se siguió mediante análisis de los ácidos málico y láctico, y de las bacterias lácticas presentes.
3. RESULTADOS
Los tres intentos de inducir la Fermentación Maloalcohólica, tanto antes como después de la fermentación alcohólica, no tuvieron éxito, a pesar de acondicionar los
depósitos para favorecer el desarrollo de estas levaduras.
Tabla 1. Evolución de los ácidos málico, láctico y bacterias lácticas durante el ensayo de laboratorio
Al analizar las perlitas que contenían las levaduras
después de los ensayos, se detectó que se había producido
una disminución en el diámetro de las mismas de aproximadamente cinco veces respecto al que tenían tras la hidratación inicial, y que además aparecían totalmente teñidas de
rojo (Figura 1). La rotura de las perlitas mediante aplastamiento sobre suero fisiológico, y la siembra posterior del ex-
tracto en medio cloranfenicol Glucosa Agar, demostró que las
levaduras del interior de las perlitas seguían vivas. Estos
datos inducen a pensar que se produjo una deshidratación
de las perlitas que impidió el intercambio con el medio, a
pesar de que las levaduras del interior seguían vivas. Esta
deshidratación se produjo probablemente por la presencia de
polifenoles en el líquido.
Fig. 1. Aspecto de las perlitas antes de ser hidratadas(a), después de un ensayo (b) y tras rehidratarlas después de su uso (c)
a
b
c
23
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4. CONCLUSIONES
La disminución de tamaño y la fijación de polifenoles sufrida por las perlitas de alginato que contenían las levaduras de la especie Schizosaccharomyces pombe han
podido ser las causas de la no funcionalidad de estas levaduras y de la no realización de la fermentación maloalcohólica. Sería necesario estudiar el efecto de la carga polifenólica
del líquido ejerce sobre la permeabilidad de las perlitas de alginato, y en definitiva sobre el acceso de las levaduras a los
sustratos.
5. BIBLIOGRAFÍA
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ISBN 978-84-690-6060-5
EFECTO DE LA SOBREEXPRESIÓN DEL GEN ADH2 DE Saccharomyces cerevisiae
SOBRE EL METABOLOMA Y PROTEOMA EN UNA CEPA VÍNICA DE
SACCHAROMYCES BAYANUS
Oscar Maestre1, Almudena Fernández-López1, Teresa García-Martínez1, Rafael Andrés Peinado2,
Juan Carlos Mauricio1
1
2
Resumen:
Departamento de Microbiología. Universidad de Córdoba. Campus Universitario de Rabanales. Edificio Severo Ochoa.
Tlf: 957218640, e-mail: [email protected]
Departamento de Química Agrícola y Edafología. Universidad de Córdoba. Campus Universitario de Rabanales. Edificio Marie Curie.
La isoenzima alcohol deshidrogenada II (ADH II), que transforma el etanol en acetaldehído con generación de NADH,
es codificada por el gen ADH2. La síntesis de la ADH II está reprimida por glucosa, así que ésta se expresa cuando la levadura
crece a expensas de etanol, como en la crianza biológica de los vinos finos. La sobreexpresión de la isoenzima ADH II durante
la fermentación alcohólica no afectó al perfil proteómico, ni a los contenidos en acetaldehído, etanol ni glicerol. Sin embargo, sí
se observaron aumentos en la concentración de acetoina, ácido acético, ácido decanoico y en la relación NAD+/NADH, y
disminuciones en el crecimiento celular, en los contenidos de pantolactona, de ciertos alcoholes superiores y ésteres, y en la
relación NADP+/NADPH, con respecto al control.
Palabras clave: acetoina, alcohol deshidrogenada II, etanol, proteoma, metaboloma.
1. INTRODUCCIÓN
En Saccharomyces cerevisiae hay al menos cinco
genes que codifican para cinco isoenzimas de la alcohol deshidrogenada implicadas en el metabolismo del etanol, ADH1
a ADH5. Las isoenzimas ADH I, III, IV y V reducen el acetaldehído a etanol durante la fermentación alcohólica, mientras
que la ADH II cataliza la reacción inversa de oxidación de etanol a acetaldehído. Cuando la glucosa se agota del medio, la
ADH II es la primera enzima responsable en utilizar el etanol
como fuente de carbono. Mutantes de S. cerevisiae carentes
de actividad alcohol deshidrogenada son incapaces de crecer
con etanol como única fuente de carbono y estos mutantes
acumulan elevados niveles de glicerol. Aunque las secuencias que codifican ADH1 y ADH2 tienen una similitud del
89%, sus productos ADH I y II difieren en la afinidad del sustrato, la ADH II tiene una Km diez veces inferior para el etanol que el resto de las ADHs. Para estudiar el efecto de la
sobreexpresión ADH II en la cepa V5 de Saccharomyces bayanus (MATa, ura3) en fermentación, se ha clonado el gen
ADH2 de S. cerevisiae en un plásmido de expresión multicopia (pVT100-U) bajo el control del promotor constitutivo
ADH1. La sobreexpresión se comprobó por análisis enzimático y proteómico de la cepa V5-pVT100-U-ADH2 a las 48
horas en células creciendo en glucosa y se comparó con la
cepa V5-pVT100-U control. Tras la comprobación de la sobreexpresión constitutiva del gen ADH2, se ha estudiado el
comportamiento fisiológico del recombinante durante la fermentación alcohólica de la glucosa. Para ello se ha analizado: la concentración intracelular de coenzimas de
óxido-reducción (piridín nucleótidos), el perfil proteómico, los
contenidos en compuestos volátiles en el medio y el crecimiento celular.
2.1. Microorganismos y condiciones de fermentación
Escherichia coli DH5α se usó para los experimentos
de clonación. La cepa modelo haploide V5 de Saccharomyces bayanus (MATa, ura3) que se ha usado en este estudio
fue derivada de la cepa industrial W6 de vino de la región de
Champagne y tiene características similares a las cepas de
levaduras industriales. La cepa de levadura se conservó y
creció en medio YPD (1% de extracto de levadura, 2% de
peptona y 5% de glucosa). El medio de fermentación que se
empleó para los experimentos fue YNB sin aminoácidos con
100 g/L de glucosa. Las fermentaciones se llevaron a cabo en
matraces de 250 mL cerrados con tapón de goma atravesados por una punta de micropipeta y termostatizados a 28 ºC
con agitación continua a 175 rpm durante 48 h. Dichas fermentaciones se inocularon con 5 x 106 células/mL.
2.2. Manipulación de ADN, técnicas de clonación, y
métodos de transformación
Las enzimas de restricción y modificación se usaron según las instrucciones del fabricante. Los plásmidos se
prepararon según los protocolos estándares. Los oligonucleótidos purificados para PCR fueron sintetizados por SigmaGenosys (UK). La transformación de E. coli se realizó por el
método del CaCl2-RbCl2. S. cerevisiae se transformó por el
procedimiento del acetato de litio.
2.3. Construcción del plásmido
El plásmido multicopia pVT100-U-ADH2 contiene el
gen ADH2. Este gen fue clonado bajo el control del promotor
25
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constitutivo de la ADH I de S. cerevisiae, y amplificado por
PCR del plásmido pMW5 usando los oligonucleótidos lindantes del casete de expresión (cebador directo:
CGTCTGCAGAATGTCTATTCCAGAAACTCAA, cebador inverso: ATGGATCCCGCTTATTTAG AAGTGTCAACAACG),
en los cuales se introdujeron los sitios de restricción BamHI
y PstI. El fragmento de PCR se digirió con BamHI y PstI y se
clonó dentro de los sitios BamHI y PstI del plásmido pVT100U para dar el vector pVT100-U-ADH2.
2.4. Análisis proteómico
Para la preparación de los extractos de células de
levadura y electroforesis bidimensional se siguió el protocolo
de Khoudoli et al. [1]. La identificación de las proteínas se realizó en el Servicio Central de Apoyo a la Investigación (SCAI)
de la Universidad de Córdoba.
2.5. Métodos analíticos
El recuento de células viables se determinó por recuento directo al microscopio óptico en cámara de Thoma por
la técnica del Azul de Metileno. Para la valoración de la ADH
I y II se siguió el método descrito por Mauricio et al. [2]. La
cuantificación de proteínas se realizó por el método de Bradford. La determinación de los coenzimas se realizó por HPLC
con detector UV. El etanol, los compuestos volátiles mayoritarios y polioles, así como los volátiles minoritarios se determinaron por cromatografía de gases.
Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
3. RESULTADOS
La sobreexpresión de la isoenzima ADH II de S.cerevisiae en la cepa V5 de S. bayanus se ha comprobado por
el análisis in vitro de la actividad ADH II (Tabla 1) y el análisis
proteómico. El número de células viables fue ligeramente inferior en el transformante V5-pVT100-U-ADH2 (Tabla 1).
Tabla 2. Concentraciones intracelulares de los nicotinamida
adenina dinucleótidos de los transformantes V5-pVT100-U y
V5-pVT100-U-ADH2 a las 48 horas creciendo en medio
YNB sin aminoácidos con 100 g/L de glucosa
puestos: etanol, acetaldehído, glicerol, alcoholes isoamílicos,
2-feniletanol, propanoato de etilo, butanodiona, 3-OHbutirato de etilo, ácido isobutanoico, ácido butanoico, ácidos
2 y 3 metil butanoico, alcohol furfurílico, ácido hexanoico,
ácido octanoico. Sin embargo, sí se observaron disminuciones en algunos alcoholes superiores, ésteres y en la pantolactona, así como aumentos en la concentración de acetoina,
ácido acético y ácido decanoico (Tabla 3).
Se ha comprobado que la sobreexpresión de las enzimas de la glicólisis no aumentan el flujo glicolítico, lo que
significa que la glicólisis está herméticamente regulada y es
muy resistente a los cambios [3]. Sin embargo, cuando se ha
intentado modificar la levadura para la sobreproducción de
algún producto, como por ejemplo glicerol, también se ha producido la acumulación de otros productos no deseables [4].
Las estrategias de ingeniería genética que se han llevado a
cabo para modificar la acumulación de glicerol en vinos son
un claro ejemplo de la dificultad que supone alterar el metabolismo de las levaduras en el sentido deseado sin ocasionar
efectos colaterales indeseables en el producto que se desea
mejorar.
Tabla 3. Concentraciones de compuestos volátiles y polioles en
los medios fermentados por los dos transformantes V5-pVT100-U
y V5-pVT100-U-ADH2 a las 48 horas creciendo en medio YNB
sin aminoácidos con 100 g/L de glucosa
Tabla 1. Actividades enzimáticas de la alcohol deshidrogenasa
I y II (U/mg proteína) y número de células viables de los
transformantes V5-pVT100-U y V5-pVT100-U-ADH2 a
las 48 horas creciendo en medio YNB sin aminoácidos
con 100 g/L de glucosa
26
La sobreexpresión de la isoenzima ADH II no afectó
al perfil proteómico, pero sí al potencial de oxido-reducción de
la célula, la relación NAD+/NADH fue mayor en la cepa que
sobreexpresó el gen ADH2, lo que puede indicar una mayor
cantidad de reacciones de reducción. Por el contrario la relación NADP+/NADPH fue algo menor en este transformante
(Tabla 2).
En cuanto al impacto que tiene la sobreexpresión
del gen ADH2 sobre el metaboloma de la levadura, no se observaron diferencias significativas en los siguientes com-
4. CONCLUSIONES
La sobreexpresión del gen ADH2 en S. bayanus no
afectó al perfil proteómico, ni a la producción de los compuestos mayoritarios de la fermentación (etanol y glicerol), ni
tampoco al contenido de acetaldehído, pero sí produjo aumentos en otros productos secundarios como acetoina, ácido
acético y ácido decanoico, y disminuciones en algunos alcoholes superiores, ésteres y en la pantolactona.
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5. BIBLIOGRAFÍA
1. KHOUDOLI, G.A.; PORTER, I.M.; BLOW, J.J.; SWEDLOW, J.R. 2004. Optimisation of the two-dimensional gel electrophoresis protocol using the Taguchi
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2. MAURICIO, J.C.; MORENO, J.J.; ORTEGA, J.M. 1997.
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dehydrogenases from two flor yeasts during controlled wine aging. J. Agric. Food Chem. 45,1967-1971.
3. SMITS, H.P.; HAUF, J.; MÜLLER, S.; HOBLEY, T.J.; ZIMMERMANN, F.K.; HAHN-HÄGERDAL, B.; NIELSEN, J.;
OLSSON, L. 2000. Simultaneous overexpression of
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the fermentative capacity of Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16,1325-1334.
4. REMIZE, F.; ROUSTAN, J.L.; SABLAYROLLES, J.M.;
BARRE, P.; DEQUIN, S. 1999. Glycerol overproduction
by engineered Saccharomyces cerevisiae wine yeast
strains leads to substantial changes in by-product
formation and to a stimulation of fermentation rate in
stationary phase. Appl. Environ. Microbiol. 65,143-149.
6. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado por el Proyecto
AGL2005-01232/ALI concedido por el Ministerio de Educación y Ciencia de España y Fondos FEDER.
27
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ESTUDIO DE BIODIVERSIDAD Y SELECCIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS EN
VINOS TINTOS DE RIOJA
Carmen Tenorio1, Isabel López1, Rosa López1, Pilar Santamaría1, Patrocinio Garijo1, Ana Rosa Gutierrez2
1 Centro de Investigación y Desarrollo Agrario de la Rioja (CIDA). Ctra. Mendavia-Logroño Km 88 NA 134. Tf: 941291383. [email protected]
2. Departamento de Agricultura y Alimentación. Universidad de La Rioja.Madre de Dios 51 26006
Resumen:
Con el objetivo de llevar a cabo una selección de bacterias lácticas para la elaboración de vinos tintos en la D. O.
Ca.Rioja, se han elegido 7 bodegas distribuidas en las tres subzonas de la denominación (Rioja Alta, Rioja Baja y Rioja Alavesa),
en las que nunca se han utilizado inóculos comerciales de BL. Se ha seleccionado un depósito de cada bodega y se han tomado
muestras en distintos momentos de la fermentación maloláctica: fin de fermentación alcohólica, plena FML y fin de FML. De cada
muestra, se ha efectuado el recuento y aislamiento de 15 colonias de BL elegidas al azar para posteriormente llevar a cabo su
identificación a nivel de especie y clon, mediante las técnicas de microbiología clásicas y biología molecular (PCR, PFGE).
Palabras clave: Bacterias lácticas, fermentación maloláctica espontánea.
1. INTRODUCCIÓN
Tradicionalmente, la fermentación maloláctica
(FML) se ha llevado a cabo por la flora espontánea de bacterias que acompaña a la uva y al vino, pero en ocasiones el
proceso no se lleva a cabo, o no se hace en el momento adecuado, ni en óptimas condiciones, ya que son muchos los factores que influyen en el crecimiento y el desarrollo de las
bacterias lácticas (BL) del vino. Desde hace años, existen
numerosos trabajos acerca de un mejor control del proceso
mediante la utilización de cultivos iniciadores seleccionados,
para asegurar el completo desarrollo de la FML y controlar la
calidad de los productos secundarios formados.
En la campaña de 2006 se ha iniciado un trabajo de
selección de BL autóctonas de Rioja para la elaboración de
vinos tintos. Es necesario disponer de estos cultivos, ya que
además de mantener mejor la tipicidad de los vinos, la implantación, a veces problemática, mejora cuando se utilizan
bacterias seleccionadas en el lugar de origen y adaptadas a
las características del vino a sembrar
Para desarrollar este trabajo, se han aislado en la
campaña de 2006 bacterias en fermentaciones malolácticas
espontáneas en 7 bodegas de Rioja. La identificación de
estos aislamientos ha permitido estudiar la diversidad de
cepas que han participado en ellas.
28
Para este estudio se han elegido 7 bodegas repartidas en las tres subzonas de la D.O.Ca. Rioja (Rioja Alta,
Rioja Baja y Rioja Alavesa), en las que “nunca” se han utilizado inóculos comerciales de BL. Se seleccionó un depósito
de cada bodega y se tomaron muestras en distintos momentos: fin de fermentación alcohólica (FA), plena (degradación
del 60% del ácido málico) y fin de FML.
En todos los vinos se analizaron los parámetros químicos (pH, º alcohólico (% v/v), ácido málico, ácido láctico,
acidez volátil y el color [intensidad de color (IC) e Índice de
polifenoIes totales (IPT).
El desarrollo de la FML se controló midiendo la degradación de ácido málico mediante test enzimático. De los
distintos momentos elegidos, se tomó la muestra en frascos
estériles y fue transportada al laboratorio para ser procesada.
Las muestras fueron sembradas en el medio selectivo adecuado para el crecimiento de BL (MRS agar modificado) al
que se le añadió pimaricina para inhibir el crecimiento de levaduras y azida sódica para inhibir el crecimiento de bacterias acéticas. Se efectuó el recuento y se aislaron 15
colonias de BL elegidas al azar para posteriormente llevar a
cabo su identificación a nivel de especie y clon.
Para la identificación a nivel de especie se han utilizado técnicas de microbiología clásicas (tinción de gram,
catalasa, API 50 CHL…) [3] [4] y biología molecular PCR especifica de especie [1] [5]. Para llegar a nivel de clon, a todos
los aislados se les ha sometido a la técnica de electroforesis
por campos pulsantes (PFGE) [2] obteniendo así los distintos
clones que han intervenido en la FML.
3. RESULTADOS
Los resultados analíticos de los vinos antes y después de la FML (Tabla 1), mostraron que en general los vinos
tuvieron elevados pH y contenidos de ácido málico acordes
con la variedad tempranillo. La acidez volátil, como es de esperar, aumentó durante la degradación maloláctica, siendo
más apreciable en los vinos 4 y 7. La disminución de la intensidad de color varió en función de las bodegas y es de
destacar que fue menor para los vinos en los que la FML fue
más larga (Tabla 2).
De todos los muestreos realizados, se han obtenido un total de 271 aislados, que han sido identificados siguiendo la metodología descrita anteriormente. Los
recuentos obtenidos de BL para cada bodega y en cada momento del muestreo efectuado, así como las identificaciones
quedan reflejados en la Tabla 2:
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Tabla 1a. Datos analíticos obtenidos en cada bodega
antes y después de la FML.
Tabla 1b. Datos analíticos obtenidos en cada bodega
antes y después de la FML.
Tabla 2. Resultados obtenidos en las bodegas muestreadas durante la FML: Bacterias viables (UFC/ml)
y especies presentes (%) en distintos momentos de la FML.
El recuento de las colonias de BL aisladas al final de
la FA, mostró que en función de las bodegas, su nº oscilaba
entre 1 y 5 unidades logarítmicas. Los mayores recuentos se
obtuvieron en los vinos en los que en los que en este momento se había degradado parte del ácido málico (1 y 2), ya
que se detectó cierta concentración de ácido láctico (Tabla
1). Esta situación no implicó necesariamente una mayor formación de acidez volátil, pero sugiere cierta superposición
entre la FA y la FML.
A excepción de la bodega 3, la especie dominante
en los vinos al final de la FA fue O. oeni.
En el momento de máxima degradación de ácido
málico, en 4 de las bodegas se obtuvieron recuentos del
orden de 107 UFC/ml. En la bodega 3 fue mucho menor, lo
que dio origen a una FML muy larga (112 días), que no se
tradujo en una mayor producción de acidez volátil, y que además dio lugar al menor porcentaje de disminución de la IC
durante la transformación maloláctica.
Al final de la FML, la población de BL fue muy elevada en todas las bodegas, con lo que se comprueba la necesidad de estabilización temprana de los vinos para evitar
consecuencias desagradables por parte de las bacterias que
ya han degradado todo el ácido málico y podrían degradar
otros componentes del vino.
La diversidad clonal de O. oeni varió en función de
la bodega (Tabla 3), destacando la bodega 1 por ser en la
que menor diversidad se encontró y la bodega 2 por la que
más.
En general, fue baja en los vinos al final de FA y se
aumento considerablemente durante el proceso fermentativo
cambiando además los clones a medida que la FML evoluciona.
Tabla 3. Clones de O. oeni encontrados en las distintas bodegas.
29
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4. CONCLUSIONES
La cepa predominante en todas las fermentaciones
fue Oenococcus oeni. Al estudiar la diversidad clonal en cada
momento de muestreo de las cepas de Oenococcus encontradas, se ha observado una mayor diversidad al fin de la FML
5. BIBLIOGRAFÍA
1. BENEDUCE, L., SPANO, G., VERNILE, A., TARANTINO,
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INFLUENCIA DE LA CEPA DE BACTERIA USADA PARA LA FERMENTACIÓN
MALOLÁCTICA EN LA LIBERACIÓN DE COMPUESTOS VOLÁTILES DE UN
EXTRACTO DE PRECURSORES DE UVA
P. Hernandez-Orte1, M. Cersosimo2, N. Loscos1, J. Cacho1, V. Ferreira1,
E. Garcia-Moruno2
1
Laboratorio de Análisis del aroma y Enología. Dpto Química Analítica. Facultad de Ciencias. Universidad de Zaragoza.
C/ Pedro Cerbuna, 12. 50009 Zaragoza. Telf. 976762503. E-mail:[email protected]
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Resumen:
CRA-Istituto Sperimentale per L’Enologia, Via Pietro Micca, 35. 14100 Asti, Italy.
En la uva se encuentran precursores no odorantes, unidos a distintos azucares mediante enlaces glicosidicos. El
objetivo de este trabajo es chequear la capacidad β-glicosidasica de distintas bacterias vínicas para liberar aromas. Para ello
se ha estudiado la capacidad de 20 bacterias (Lactobacillus, Pediococcus y Oenococcus) para hidrolizar glicósidos en
condiciones óptimas, utilizando p-NPG como substrato a pH=5. De todas las cepas estudiadas solo presentan capacidad
hidrolitica elevada 5 cepas de Oenococcus oeni y 3 de Lactobacillus.
Estas cepas se han seleccionado para realizar fermentaciones malolácticas usando vinos sintéticos a los que se les
había adicionado previamente un extracto de precursores obtenidos de distintas uvas de vitis vinifera. Según los resultados
obtenidos del análisis de los compuestos volátiles liberados, existen diferencias significativas entre las distintas cepas de
Oenococcus oeni ensayadas y con las cepas de Lactobacillus, a pesar de que estas ultimas no han realizado la FML.
Palabras clave: Precursores, Oenococcus, Lactobacillus, aroma
1. INTRODUCCIÓN
Las uvas tienen precursores aromáticos glicosilados. Estos precursores constituyen una potente reserva de
aromas activos que pueden liberarse al vino durante el proceso de vinificación o crianza, aumentando así la complejidad del aroma del mismo [1]. Además de las levaduras en la
elaboración del vino participan también las bacterias lácticas
(LAB). La capacidad de estas bacterias para liberar compuestos aromáticos de sus precursores glicosilados puede
contribuir a la modificación del aroma de los vinos al acabar
la fermentación maloláctica (FML). Varias especies de LAB
pertenecientes a los géneros Oenococcus, Lactobacillus y
Pediococcus pueden conducir la FML en vino pero son las
bacterias de la especie O.oeni las que mejor adaptadas están
a las condiciones de pH y elevado grado alcohólico del vino,
y por lo tanto, son las que conducen esta fermentación mas
frecuentemente. El objetivo de este estudio ha sido evaluar la
capacidad metabólica de distintas bacterias lácticas para alterar la fracción volátil del vino mediante la liberación de compuestos aromáticos de sus precursores no odorantes.
Se han estudiado un total de 10 cepas de O. Oeni,
8 cepas de Lactobacillus sp y 2 cepas de Pediococcus parvulus. Estas cepas pertenecen a la colección del Istituto Sperimentale per l’Enologia (ISE) de Asti, aisladas originalmente
de mostos y vinos de distintas bodegas italianas y de otros
países (tabla 1). O. oeni fueron cultivadas en de Man Rogosa
Sharpe (MRS) de (Merck, Darmstadt, Germany), pH 4.8. Las
cepas de los géneros Lactobacillus y Pediococcus fueron cul-
tivadas en MRS ambas a pH 6. Todas las bacterias fueron incubadas a 30 ºC. Se dejaron crecer el tiempo suficiente para
obtener una densidad óptica a 600 nm equivalente a 50.106
células /ml. 20 ml del cultivo así obtenido se centrifugaron a
5000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se descartó.
La actividad enzimática se midió usando como sustrato el pnitrophenyl-β-D-glucopyranoside (p-PNG). Las bacterias que
presentaron una actividad β-glucosidasica fuerte (tabla 1) fueron seleccionadas para realizar la fermentación maloláctica.
Para ello se prepararon 12 tratamientos por duplicado. A 8
de ellos se les añadieron 100 ml del vino sintético, 2.4 ml del
extracto de precursores glicosidicos (equivale a la misma
concentración de precursores de la variedad usada) y un inoculo de 108 células/mL para cada una de las bacterias. Otros
dos fueron inoculados con bacterias (B2 y B3) pero sin precursores y finalmente los otros dos tratamientos se usaron
como blancos sin bacterias, a uno de ellos se le añadieron los
precursores (B1) y al otro solo el vino sintético (B4). Los vinos
así preparados se dejaron en un incubador a 20 ºC para que
realizaran la FML.
La FML se llevo a cabo empleando un vino sintético
formado por: etanol 11%(v/v); Acido tartarico 5 g/L; acido málico 3 g/L; acido acético 0.2 g/L; D-glucosa 2 g/L; D- fructosa
2 g/L; NaCl 0.2 g/L; (NH4 )2 SO4 1 g/L; K2HPO4 2g/L;
MgSO4 7.H2O 0.2g/L; MnSO4.H2O 0.05g/L; extracto de levadura 2 g/L. El pH fue ajustado a 3.5 con KOH 1N. El medio
fue esterilizado por filtración a 0.22 mm. Las bacterias se propagaron primero en MRS pH 4.8 para las cepas de O.oeni y
a pH 6 para las cepas de Lactobacillus. Después se subcultivaron en vino sintético diluido 1:1 con agua estéril. La evolución de la FML se siguió determinando el acido málico cada
15 días.
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Los precursores fueron extraídos siguiendo el procedimiento optimizado por Ibarz y col. [2] usando 4 variedades diferentes (Macabeo, Sauvignon Blanc, Merlot y
Parraleta). Los extractos obtenidos de todos los mostos y los
hollejos fueron finalmente mezclados.
Compuestos volátiles (análisis SPE y GC–Ion Trap–
MS). Los análisis se realizaron siguiendo el protocolo propuesto y validado por López et al. [3].
3. RESULTADOS
3.1 Actividad glicosidásica
En el screening realizado de las 20 cepas de bacterias lácticas estudiadas, 8 cepas presentaron una elevada
actividad hidrolitica (tabla 1) por lo que se seleccionaron para
el siguiente estudio. Los datos obtenidos sugieren que esta
actividad es bastante frecuente en cepas de Oenococcus
oeni y de Lactobacillus casei y poco frecuente en cepas de
Lactobacillus hilgardii y de Pediococcus parvulus.
3.2. Compuestos aromáticos liberados
De todas las cepas probadas solo realizaron la FML
las pertenecientes a la especie O.oeni. Ninguna cepa de Lactobacillus consumió el acido málico en 45 días. En la tabla 2
se presenta el incremento de los compuestos volátiles liberados en muestras inoculadas con O.oeni y L.casei.
Para la mayoría de los 42 compuestos aromáticos
encontrados se ha producido un incremento del 100% en los
experimentos donde se habían puesto precursores, independientemente de si se había realizado la fermentación maloláctica o no. Los compuestos 2-fenoxietanol, furfural y los
ácidos 2 y 3 metilbutiricos han disminuido su concentración
en presencia de precursores. Se ha calculado la significativi-
dad de los resultados después de realizar el test t. Como se
puede observar la mayoría de los compuestos presentan diferencias significativas para las dos bacterias.
En la figura 1 se puede ver la suma de los compuestos volátiles de la tabla 2 agrupados por familias de compuestos para todas las bacterias estudiadas.
Las bacterias O. oeni liberan mas derivados lipidicos, fenoles volátiles y vainillas que los Lactobacillus. Dentro
de todas las cepas de O. oeni la ISE 5008 es la que produce
cantidades mas elevadas de estos compuestos. Respecto a
los norisoprenoides la cepa de O. oeni 5106 presenta incrementos entre el 10 y el 25%. Para los terpenos las cepas
5008, 5106 y 5199 liberan alrededor de un 25% más de estos
compuestos que el resto.
4. CONCLUSIONES
Con los resultados obtenidos vemos que no es necesario que se produzca la fermentación maloláctica para
que las bacterias liberen enzimas capaces de actuar sobre
los precursores de la uva. La presencia de elevadas poblaciones de Lactobacillus ha conducido a la liberación de compuestos aromáticos de sus precursores, sin que se haya
producido la metabolización del acido málico.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. WILLIAMS, P.J.; STRAUSS, C.R.; WILSON, B.; MASSYWESTROPP, R.A. 1982. J. Chromatogr. A., 235, 471-480.
2. IBARZ, M. J.; FERREIRA, V.; HERNANDEZ-ORTE, P.;
LOSCOS, N.; CACHO, J. 2006. J.Chromatogr. A, 1116,
217-229.
3. LÓPEZ, R.; AZNAR, M.; CACHO, J.; FERREIRA, V. A
2002. J. Chromatogr., 966, 166-177.
Figura 1. Compuestos volátiles liberados agrupados por familias de compuestos.
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Tabla 1. Distribución de la actividad β-glicosidasa entre las distintas bacterias probadas.
Tabla 2. Incremento de los compuestos volátiles liberados por LAB en muestras con y sin precursores.
El incremento se expresa en mg/L, excepto en los compuestos marcados con el superindice1.
En ese caso esta expresado como área relativa.
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MLST (MULTILOCUS SEQUENCE TYPING): UN MÉTODO MOLECULAR
PARA LA CARACTERIZACIÓN INEQUÍVOCA DE CEPAS DE
Oenococcus oeni Y Lactobacillus plantarum
Blanca de las Rivas, Angela Marcobal, Rosario Muñoz
Resumen:
Departamento de Microbiología, Instituto de Fermentaciones Industriales, CSIC;
C/ Juan de la Cierva 3, 28006 Madrid, Tno. 91 562 2900, E-mail:[email protected]
La Biología Molecular proporciona técnicas para discriminar claramente entre distintas cepas de una misma especie.
Entre las técnicas moleculares disponibles destaca la técnica de secuenciación multilocular MLST (MultiLocus Sequence Typing)
que se basa en el análisis de las secuencias parciales de una serie de genes conservados. En nuestro laboratorio hemos
aplicado esta técnica para el estudio de cepas de Oenococcus oeni y Lactobacillus plantarum. Los resultados obtenidos con la
técnica de MLST se han comparado con los resultados obtenidos con otras dos técnicas habituales para la tipificación de cepas
bacterianas, como son la ribotipia y el análisis RFLP de la región intergénica entre el 16S-23S rDNA. Los resultados demuestran
que la técnica de MLST es la que presenta una mayor discriminación entre las cepas de una misma especie.
Palabras clave: Método de tipificación; Oenococcus oeni; Lactobacillus plantarum; fermentación maloláctica;
identificación.
1. INTRODUCCIÓN
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La fermentación maloláctica es una etapa importante en el proceso de vinificación. Generalmente, la fermentación maloláctica se produce espontáneamente como
consecuencia del desarrollo de las bacterias lácticas después
de la fermentación alcohólica. Cuando la fermentación maloláctica se desarrolla espontáneamente, y debido a la diversidad de cepas de bacterias lácticas presentes, tanto las
propiedades organolépticas como sanitarias del vino obtenido
son impredecibles. Con objeto de ejercer un mayor control
sobre este proceso, entre los elaboradores se está comenzando a imponer la práctica de la inoculación del vino con preparaciones de cultivos malolácticos comerciales o bien con
bacterias malolácticas aisladas en la propia bodega. Por ello,
es de gran importancia el disponer de unos métodos que permitan discriminar a nivel de cepa, puesto que muchas de las
características sensoriales y sanitarias del vino final van a depender de las bacterias lácticas que han realizado este proceso. La Biología Molecular proporciona técnicas para
discriminar claramente entre distintas cepas de una misma
especie. Entre las técnicas moleculares disponibles destaca la
técnica de secuenciación multilocular MLST (MultiLocus Sequence Typing) que se basa en el análisis de las secuencias
parciales de una serie de genes conservados; pequeñas variaciones en la secuencia de estos genes permiten diferenciar
claramente las distintas cepas de la misma especie. Es decir,
se necesitan métodos que no sólo confirmen que es Oenococcus oeni la bacteria que está llevando a cabo la fermentación maloláctica, sino que además permitan conocer la cepa
(o cepas) concretas de O. oeni responsables.
La técnica de secuenciación multilocular o MLST
está basada en la secuenciación de fragmentos de varios
genes conservados o housekeeping [1]. Estos genes codifican proteínas que realizan funciones básicas para el mante-
nimiento de la viabilidad celular por lo que en ellos la tasa de
mutación es muy baja, por lo que representan unos indicadores muy estables en el tiempo.
2.1. Cepas bacterianas
Se estudiaron 18 cepas de O. oeni y 16 cepas de L.
plantarum aisladas en el Instituto de Fermentaciones Industriales (CSIC) o suministradas por la Colección Española de
Cultivos Tipo.
2.2. Estudio del patrón de restricción de la región
intergénica 16S-23S rDNA amplificada mediante PCR.
Los fragmentos intergénicos 16S-23S se amplificaron utilizando los oligonucleótidos 16S14F y 23S1R y se cortaron con los enzimas de restricción: AluI, CfoI, DdeI, NdeI y
TaqI.
2.3. Ribotipia
El DNA cromosómico se cortó con el enzima de restricción EcoRI. Los fragmentos obtenidos se separaron en un
gel de agarosa, y se transfirieron a una membrana mediante
la técnica de Southern. La sonda 16S rDNA se marcó con digoxigenina y se detectó mediante quimioluminiscencia.
2.4. Amplificación mediante PCR y secuenciación de los
fragmentos de los genes housekeeping
Los genes housekeeping utilizados para ambas especies, O. oeni y L. plantarum, codifican las siguientes pro-
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3.2. Tipificación de cepas de Lactobacillus plantarum
teínas: fosfoglucomutasa (pgm), D-alanina-D-alanina ligasa
(ddl), y la subunidad B de la DNA girasa (gyrB). Para el análisis de O. oeni además se utilizó el gen que codifica la transcetolasa (recP) y la enzima maloláctica (mleA) [2]. En el caso
de L. plantarum se utilizó los genes que codifica la subunidad ATPasa de la fosforibosilaminoimidazol carboxilasa
(purK1), la glutamato deshidrogenasa (gdh), y la proteína reparadora de errores en el DNA (mutS) [3]. Fragmentos de
estos genes se amplificaron mediante PCR a partir de DNA
cromosómico de las cepas estudiadas.
Los resultados obtenidos en los distintos métodos
de tipificación para cepas de L. plantarum se muestran en la
Tabla 2. Según el análisis mediante ribotipia, todas las cepas
de L. plantarum presentaron un patrón de cuatro bandas,
aunque se pudieron diferenciar cuatro patrones o ribotipos
distintos entre ellos. Respecto al análisis de la región intergénica 16S-23S rDNA, todas las cepas de L. plantarum presentaron un patrón idéntico en todas ellas.
Tal como muestra la Tabla 2, se definieron 14 perfiles
alélicos. Todos los perfiles se diferenciaron en varios genes,
excepto ST-5 y ST-6 que difirieron sólo en el gen gdh. Por otro
lado, todas las cepas pueden distinguirse por su única combinación de alelos, excepto dos pares de cepas las cuales presentaron secuencias idénticas en todos los genes analizados.
2.5. Análisis de los datos
Para cada gen analizado, se compararon las secuencias obtenidas en todos los aislados y a cada secuencia diferente (alelo) se le asignó un número. Cada aislado
está definido por un “perfíl alélico” (“Sequence type” o ST)
obtenido a partir de la combinación de los números correspondientes a los alelos en todos los genes analizados. Una
determinada y específica combinación de alelos representa
un “perfil alélico”. Los perfiles alélicos se identifican por un
número arbritario asignado por su orden de descripción.
Aquellas secuencias que se diferencian incluso en un único
nucleótido se consideran alelos distintos.
Tabla 4. Propiedades de las cepas de L. plantarum
analizadas y su perfíl alélico.
3. RESULTADOS
3.1. Tipificación de cepas de Oenococcus oeni
Los resultados obtenidos en los distintos métodos
de tipificación para cepas de O. oeni se muestran en la
Tabla 1. Según el análisis de ribotipia, todas las cepas de
O. oeni presentaron un patrón de tres bandas, aunque se
pudieron diferenciar dos patrones distintos entre ellos. Respecto al análisis de la región intergénica 16S-23S rDNA,
todas las cepas de O. oeni analizadas compartieron el
mismo patrón.
La Tabla 1 resume los perfiles alélicos de las cepas
de O. oeni analizadas en este estudio. Todos los perfiles alélicos encontrados difirieron en varios genes, excepto los perfiles alélicos ST-11 y ST-13 que difirieron sólo en un gen. En
el caso de O. oeni, cada cepa presenta un perfil alélico distinto, por lo que todas las cepas pueden ser distinguidas una
de otra por una combinación específica de alelos.
Tabla 1. Propiedades de las cepas de O. oeni
analizadas y su perfíl alélico.
a
RT, Ribotipo; bITS, RFLP-ITS tipo; cST, Tipo según MLST; d ND, no hay datos disponibles.
4. CONCLUSIONES
La aplicación de dos métodos utilizados frecuentemente para la tipificación de bacterias ponen de manifiesto
la necesidad de unos métodos más discriminantes para diferencira entre las cepas de O. oeni y L. plantarum. Los esquemas de secuenciación multilocular MLST desarrollados
en este trabajo son unos métodos útiles para caracterizar precisa e inequívocamente las cepas de O. oeni y L. plantarum
puesto que presentan un grado de diversidad suficiente para
obtener una alta discriminación.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. ENRIGHT, M.C.; SPRATT, B.G. 1999. Multilocus sequence typing. Trends Microbiol 7, 482-487.
2. DE LAS RIVAS, B.; MARCOBAL, A.; MUÑOZ, R. 2004.
Allelic diversity and population structure in Oenococcus oeni as determined from sequence análisis of housekeeping genes. Appl Environ Microbiol 70, 7210-7219
3. DE LAS RIVAS, B.; MARCOBAL, A.; MUÑOZ, R. 2005.
Development of a multilocus sequence typing method for analysis of Lactobacillus plantarum. Microbiology 152, 85-93.
6. AGRADECIMIENTOS
a
RT, Ribotipo; bITS, RFLP-ITS tipo; cST, tipo según MLST; d ND, no hay datos disponibles
Este trabajo ha sido realizado gracias a la financiación recibida de los proyectos RM03-002 (INIA),
07G/0035/2003 (CAM) y AGL2005-00470 (CICYT).
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ESTUDIOS IN VITRO SOBRE LA ELIMINACIÓN DE OCRATOXINA A MEDIANTE
BACTERIAS LÁCTICAS DEL VINO
Héctor Rodríguez 1, Vincenzo del Prete 2, Alfonso V. Carrascosa 1,
Blanca de las Rivas 1, Emilia García-Moruno 2, Rosario Muñoz 1
1
Departamento de Microbiología, Instituto de Fermentaciones Industriales, CSIC, C/ Juan de la Cierva 3, 28006 Madrid, España.
Tno 91 562 2900, E-mail: [email protected]
Resumen:
2
CRA-Istituto Sperimentale per lÉnologia, Via Pietro Micca, 14100 Asti, Italia.
Las micotoxinas son metabolitos tóxicos producidos por hongos filamentosos. En vinos se encuentra la ocratoxina A,
que está producida por hongos pertenecientes a las especies Aspergillus y Penicillium. Se han realizado diversos estudios para
reducir la presencia de OTA en mostos y vinos; los procedimientos propuestos se basan en la eliminación física, química o
biológica de la OTA. Este estudio pretende determinar la interacción in vitro entre OTA y bacterias lácticas del vino. Para ello
se han estudiado 15 cepas pertenecientes a cinco especies de bacterias lácticas frecuentemente aisladas en vino. Las bacterias
lácticas estudiadas son capaces de reducir un 8-28% los niveles de OTA presente en el medio de cultivo. La OTA eliminada del
medio, se recuperó parcialmente (31-57%) a partir de las bacterias sedimentadas. Además, en tres especies representativas
se demostró que extractos libres de células no son capaces de degradar OTA. Los resultados obtenidos indican que la reducción
de OTA por bacterias lácticas es debida a un fenómeno de unión a las células bacterianas.
Palabras clave: Ocratoxina A; micotoxinas; bacterias lácticas; Oenococcus oeni; Lactobacillus plantarum.
1. INTRODUCCIÓN
Las micotoxinas son metabolitos tóxicos producidos
por hongos filamentosos. La ocratoxina A (OTA) es una
micotoxina producida por especies de Aspergillus y Penicillium.
OTA se ha detectado en productos vegetales, entre ellos el vino
[1]. Se han realizado estudios para la reducción del contenido
de OTA en vinos y mostos de uva, los procedimientos
propuestos se basan en la eliminación física, química o
biológica de la OTA. Respecto a la reducción biológica se han
descrito mecanismos de degradación o adsorción para la
eliminación de micotoxinas mediante microorganismos.
Se ha comprobado que durante la fementación del
mosto, la concentración de OTA disminuye como resultado de
la acción de levaduras, y además, esta disminución depende
de la cepa de levadura implicada [2]. La ecología microbiana
del vino es más compleja, y en muchos vinos, se produce la fermentación maloláctica llevada a cabo por las bacterias lácticas. Oenococcus oeni es la principal bacteria encargada de
realizar la fermentación maloláctica, aunque también están presentes bacterias de los géneros Lactobacillus y Pediococcus.
Puesto que la descontaminación biológica de micotoxinas utilizando microorganismos es una de las estrategias
más conocidas para reducir los niveles de micotoxinas en alimentos, este estudio pretende estudiar la eficacia de diversas
bacterias lácticas enológicas para eliminar OTA en un medio
de laboratorio y conocer cual es el mecanismo de esta reducción, degradación o adsorción.
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Se estudiaron 15 cepas de bacterias lácticas aisladas en el Instituto de Fermentaciones Industriales (CSIC), en
el Istituto per lÉnologia (Asti) o suministradas por la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Las cepas anlizadas
pertenecen a las especies: Oenococcus oeni, Lactobacillus
plantarum, Lactobacillus brevis, Leuconostoc mesenteroides
y Pediococcus acidilactici.
2.2. Ensayo de adsorción
Las bacterias lácticas se crecieron hasta una fase de
crecimiento exponencial tardía en un medio basal (MB) [3] o en
MLO conteniendo OTA en una concentración final de 5µg/l. Los
cultivos se dividieron en dos alícuotas. Una de ellas se centrifugó, y se midió la concentración de OTA en el sobrenadante
y en las bacterias sedimentadas. Con la segunda alícuota se
siguió un protocolo similar, pero las bacterias sedimentadas se
lavaron tres veces en tampón fosfato 50 mM, pH 6,5.
2.3. Ensayo de degradación enzimática
Las bacterias lácticas se crecieron hasta una fase
de crecimiento exponencial tardía en un medio basal (MB) o
en MLO conteniendo OTA en una concentración final de
5µg/l. Los cultivos se centrifugaron y las bacterias se lavaron
tres veces en tampón fosfato 50 mM, pH 6,5. Las bacterias lavadas se resuspendieron en el mismo tampón y se rompieron
mediante una prensa de French. La suspensión celular se
centrifugó, y el sobrenadante obtenido constituyó el extracto
enzimático. Este extracto se incubó durante 48 h en presencia de OTA (5µg/l).
2.4. Análisis de OTA
La concentración de OTA en los sobrenadantes y en
las soluciones de lavado se determinó siguiendo el método
de Visconti et al. [4], que implica la utilización de una columna
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de inmunoafinidad seguido de un análisis mediante HPLC. El
límite de detección del método es de 0,01 µg/l, y el límite de
cuantificación es de 0,02 µg/l. Las bacterias sedimentadas se
resuspendieron dos veces en metanol absoluto durante 1 h
para extraer la OTA. Después de una centrifugación, se separó y evaporó el sobrenadante. Para determinar la concentración de OTA presente, el residuo seco se reconstituyó con
la fase móvil en el momento del ensayo cromatográfico.
3. RESULTADOS
3.1. Reducción de OTA en los cultivos líquidos de
bacterias lácticas del vino
Se crecieron dos cepas de bacterias lácticas en un
medio sintético y se tomaron muestras a distintos intervalos
de la incubación para estudiar el efecto de la biomasa bacteriana en la reducción de OTA. Los resultados obtenidos
muestran que la reducción de OTA está relacionada con el
crecimiento bacteriano (datos no mostrados), por lo que se
decidió realizar los análisis de reducción de OTA en una fase
exponencial tardía de crecimiento.
55,02% del total de la OTA eliminada del medio) (datos no
mostrados). Además, en los cromatogramas obtenidos no se
observan productos de degradación de OTA.
En las tres cepas de bacterias lácticas seleccionadas (O. oeni RM11, L. plantarum CECT 748 y L. brevis
RM273) se midió la fuerza de la unión entre la célula bacteriana y OTA. Para ello, las células sedimentadas se lavaron
tres veces en tampón fosfato (50 mM, pH 6,5), midiéndose
la concentración de OTA en cada una de las soluciones de lavado y en las células lavadas finales. Tal como muestra la
Tabla 2, toda la OTA unida a las células bacterianas apareció
en la primera solución de lavado, no detectándose OTA en
los lavados posteriores ni en las células bacterianas lavadas.
Tabla 2. Ocratoxina A recuperada de las células sedimentadas y
lavadas
Tabla 1. Reducción de OTA en medio de cultivo inoculados con
bacterias lácticas
4. CONCLUSIONES
Las bacterias lácticas son capaces de reducir el
contenido de OTA de un medio de cultivo mediante un mecanismo de unión o adsorción a las células bacterianas. Esta
reducción varía entre un 8 y un 28% en función de la cepa de
bacteria láctica analizada. Se ha demostrado que las bacterias lácticas estudiadas no son capaces de degradar OTA.
La Tabla 1 muestra la disminución de OTA ocasionada por el crecimiento de bacterias lácticas en un medio sintético.
3.2. Degradación de OTA mediante extractos de
bacterias lácticas del vino
Para los estudios de degradación de OTA se seleccionaron tres cepas de bacterias lácticas (O. oeni RM11, L.
plantarum CECT 748 y L. brevis RM273). Los resultados demuestran que la incubación de los extractos de bacterias lácticas en presencia de OTA no produce una reducción en la
concentración de OTA (datos no mostrados). Por ello, el mecanismo responsable de la reducción en la concentración de
OTA no es la degradación.
3.3. Adsorción de OTA a los cultivos de bacterias lácticas
del vino
Al analizar la OTA unida a las células bacterianas,
se comprobó que sólo una porción de la OTA eliminada del
medio aparece unida a las células bacterianas (del 31,50 al
5. BIBLIOGRAFÍA
1. BELLÍ, N..; MARÍN, S.; DUAIGÜES, A.; RAMOS, A.J.;
SANCHÍS, V. 2004. Ochratoxin A in wines, musts and
grape juices from Spain. J Sci Food Agric 84, 591-594.
2. CECCHINI, F.; MORASSUT, M.; GARCÍA-MORUNO, E.;
DI STEFANO, R. 2006. Influence of yeast strain in ochratoxin A content during fermentation of white and
red must. Food Microbiol 23, 411-417.
3. ROZÈS, N.; PERES, C. 1998. Effects of phenolic compounds on the growth and the fatty acid composition
of Lactobacillus plantarum. Appl Microbiol Biotechnol
49, 108-111.
4. VISCONTI, A.; PASCALE, M; CENTONZE, G. 1999. Determination of ochratoxin A in wine and beer by immunoaffinity clean-up and HPLC analysis with
fluorometric detection. J Chromatogr 864,89-101.
6. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido realizado gracias a la financiación recibida de los proyectos AGL2005-00470 (CICYT),
RM03-002 (INIA) y 07G/0035/2003 (CAM). H. Rodríguez
agradece al programa I3P-CSIC la concesión de una beca
predoctoral.
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ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DEL GEN RECA PARA LA IDENTIFICACIÓN Y
DISCRIMINACIÓN DE CEPAS DE Lactobacillus hilgardii AISLADAS DE VINO
Héctor Rodríguez, Blanca de las Rivas, Rosario Muñoz
Resumen:
Departamento de Microbiología, Instituto de Fermentaciones Industriales, CSIC, C/ Juan de la Cierva 3, 28006 Madrid,
Tfno. 91 562 2900, E-mail:[email protected]
Los lactobacilos heterofermentativos aislados de vino pertenecen fundamentalmente a las especies Lactobacillus
brevis, Lactobacillus hilgardii y Lactobacillus buchneri. Sin embargo, la taxonomía de estas especies es confusa puesto que a
menudo los métodos fenotípicos convencionales producen identificaciones erróneas. La secuenciación del 16S rDNA es un
método útil para la diferenciación de las especies de lactobacilos heterofermentativos aislados de vino. Mediante la
secuenciación de un fragmento del gen recA también se ha podido discriminar entre las distintas especies de lactobacilos
heterofermentativos. Adicionalmente, este método ha sido útil para discriminar entre cepas de L. hilgardii aisladas a partir de
diferentes tanques de fermentación, procedentes de una misma bodega y de la misma cosecha, en los cuales se habían
producido paradas de fermentación. Los resultados demuestran que la especie L. hilgardii es una especie muy heterogénea.
Las cepas de L. hilgardii analizadas no producen aminas biógenas, pero si son potenciales precursores de etil carbamato.
Palabras clave: Lactobacillus hilgardii; lactobacilos heterofermentativos, gen recA; método de tipificación; paradas de
fermentación.
1. INTRODUCCIÓN
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Los lactobacilos heterofermentativos aislados de
bebidas alcohólicas pertenecen generalmente a las especies
Lactobacillus brevis, Lactobacillus hilgardii, o especies relacionadas como Lactobacillus buchneri. Sin embargo, la taxonomía de estas especies es confusa, puesto que la mayoría
de estos lactobacilos presentan una considerable diversidad
fenotípica [1]. Por ejemplo, L. buchneri se distingue fenotípicamente de L. brevis por su capacidad para fermentar melezitosa; sin embargo, se han descrito algunas cepas de L.
brevis que también pueden fermentar melezitosa. De manera
similar, las cepas de L. brevis se diferencian de las cepas de
L. hilgardii por su capacidad para fermentar arabinosa; sin
embargo, se han identificado cepas de L. hilgardii que fermentan arabinosa.
Puesto que la identificación de lactobacilos heterofermentativos de vino es a menudo ambigua, la investigación está centrada actualmente en su identificación mediante
la aplicación de métodos de biología molecular. La secuenciación del 16S rDNA es una de las técnicas más utilizadas,
pero en ocasiones es insuficiente para distinguir especies
muy relacionadas. Se ha propuesto el gen recA como un
marcador útil para diferenciar especies de algunos géneros
bacterianos.
Las paradas de fermentación constituyen uno de los
problemas más importantes en vinificación. Sus causas son
numerosas, problemáticas de diagnosticar, y difíciles de rectificar. Se han aislado cepas de lactobacilos heterofermentativos partir de diferentes tanques de fermentación,
procedentes de una misma bodega y de la misma cosecha,
en los cuales se habían producido paradas de fermentación.
Los objetivos de este estudio son: 1) evaluar el método de
secuenciación del 16S rDNA para identificar los lactobacilos
heterofermentativos aislados; 2) comparar la validez del método de secuenciación de un fragmento del gen recA, 3) discriminar entre las distintas cepas de los lactobacilos aislados,
y 4) estudiar la presencia de marcadores relevantes en enología, como son la producción de aminas biógenas o de etil
carbamato.
Se estudiaron 5 cepas de lactobacilos heterofermentativos aisladas a partir de diferentes tanques de fermentación, procedentes de una misma bodega y de la misma
cosecha, en los cuales se habían producido paradas de fermentación. La cepa L. hilgardii CECT 4786 se obtuvo de la
Colección Española de Cultivos Tipo (CECT).
2.2. Técnicas de identificación específicas de especie
Para la secuenciación del 16S rDNA, se amplificó
mediante PCR un fragmento de 1,3 kb del 16S rDNAs utilizando la pareja de oligonucleótidos 63f y 1387r descrita previamente [2]. Para la amplificación del gen recA, se utilizaron
oligonucleótidos degenerados basados en dominios conservados en las proteínas RecA que amplifican un fragmento de
360 pb [2].
2.3. Técnicas de tipificación utilizadas para cepas de L.
hilgardii
RFLP-ITS: La región intergénica 16S-23S rRNA,
amplificada mediante PCR, se digirió con las enzimas de restricción NdeI, TaqI, AluI y CfoI. RAPD: La técnica de amplifi-
ISBN 978-84-690-6060-5
cación de fragmentos de DNA al azar se realizó con los oligonucleótidos M13, OPA20 y A22 [2].
2.4. Presencia de genes que codifican aminoácido
descarboxilasas
Para estudiar la presencia de los genes que codifican las aminoácido descarboxilasas responsables de la síntesis de aminas biógenas, se utilizó un método de PCR
múltiple que detecta simultáneamente la presencia de los
genes que codifican las proteínas responsables de la síntesis de histamina, tiramina y putrescina [2].
2.5. Presencia de los genes de la ruta de la arginina
deiminasa
Para estudiar la presencia de los genes que codifican las proteínas implicadas en la ruta de la arginina deiminasa, responsable de la formación de precursores de
carbamato de etilo, se utilizaron oligonucléotidos específicos
basados en regiones conservadas de las proteínas arginina
deiminasa, ornitina transcarbamilasa y de la carbamato quinasa [2].
3. RESULTADOS
3.1. Clasificación de las cepas de Lactobacillus spp.
aisladas de vinos en paradas de fermentación
La mayoría de las cepas de lactobacilos heterofermentativos aislados de vino pertenecen a las especies L. hilgardii, L. buchneri y L. brevis, las cuales están muy
relacionadas. La Figura 1 muestra el elevado grado de identidad que presentan las secuencias del 16S rDNA de las
cepas tipo de estas especies.
3.2. Diversidad molecular entre las cepas de L. hilgardii
mediante análisis RFLP-ITS y RAPD
Al analizar la secuencia del gen recA de las cepas
de L. hilgardii aisladas de vinos en paradas de fermentación,
se comprobó que existían pequeñas diferencias entre ellas
(0-2%) las cuales podrían ser útiles para su tipificación. Al
aplicar el análisis RFLP-ITS, todas las cepas de L. hilgardii
aisladas, excepto una de ellas, comparten el mismo patrón.
Por ello, este método no es discriminante entre las cepas de
L. hilgardii. Sin embargo, el análisis RAPD realizado con el
oligonucleótido M13 mostró una alta discriminación entre las
cepas de L. hilgardii analizadas (Figura 2).
Mediante la aplicación de estos tres métodos de tipificación, se han podido diferenciar todas las cepas de la especie L. hilgardii estudiadas. Los resultados demuestran que
L. hilgardii es una especie heterogénea.
3.3. Caracterización genotípica de marcadores relevantes
en enología
L. hilgardii es una especie que puede crecer en
vinos y, por tanto, influir en la calidad sanitaria del vino final.
En las bacterias lácticas, la degradación de la arginina por la
ruta de la arginina deiminasa es un mecanismo para la formación de precursores de carbamato de etilo. Con objeto de
detectar la presencia de los genes implicados en la ruta de la
arginina deiminasa, se han amplificado cada uno de los tres
genes de la ruta en las cepas de L. hilgardii aisladas. Todas
las cepas analizadas amplifican un fragmento del tamaño esperado. Este resultado indica que las cepas de L. hilgardii
pueden ser consideradas como potenciales productores de
carbamato de etilo.
Figura 1. Comparación de las secuencias 16S rDNA
de las cepas tipo de L. buchneri, L. hilgardii y L. brevis.
Figura 2. Patrones RAPD obtenidos con los oligonucleótidos M13
(A), A22 (B) y OPA20 (C) de las cinco cepas de la especie L.
hilgardii analizadas
Los lactobacilos heterofermentativos analizados en
este estudio y aislados de vinos en paradas de fermentación
pertenecen a la especie L. hilgardii en base a su secuencia
del 16S rDNA.
Al secuenciar un fragmento interno de 280 pb del
gen recA en estas especies se comprueba que el grado de
identidad disminuye, puesto que L. hilgardii muestra una
identidad del 82% con L. buchneri y del 77% con L. brevis. El
grado de identidad es menor que el obtenido con las secuencias del 16S rDNA, por lo que permite una mayor discriminación entre especies cercanas.
Mediante TLC se ha comprobado que ninguna de
las cepas de L. hilgardii analizadas es capaz de producir aminas biógenas; además, con objeto de relacionar la no-producción de aminas con la ausencia de los correspondientes
genes, se realizó un experimento de PCR-múltiple para la detección simultánea de los genes que codifican aminoácido
descarboxilasas. Ninguna de las cepas de L. hilgardii analizadas produjo la amplificación de una banda del tamaño esperado. Por ello, se puede concluir que en estas cepas no
están presentes los genes que codifican aminoácido descarboxilasas responsables de la síntesis de aminas biógenas.
39
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4. CONCLUSIONES
La secuencia parcial del gen recA es un método eficaz y seguro para la identificar molecularmente la especie L.
hilgardii de las especies relacionadas L. buchneri y L. brevis.
Mediante la aplicación de diversos métodos de tipificación a
cinco cepas aisladas de la misma bodega en el misma cosecha, se ha concluído que L. hilgardii es una especie muy heterogénea. Puesto que L. hilgardii es una especie aislada de
vino, se han examinado propiedades relevantes en enología
y se ha comprobado que estas cepas no producen aminas
biógenas, sin embargo, son potenciales productores de carbamato de etilo
40
5. BIBLIOGRAFÍA
1. LE JEUNE, C; LONVAUD-FUNEL, A. 1994. Lactobacillus hilgardii and Lactobacillus brevis DNA analysis
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2. RODRÍGUEZ, H.; DE LAS RIVAS, B.; MUÑOZ, R. 2007.
Efficacy of recA gene sequence análisis in the identification and discrimination of Lactobacilllus hilgardii
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Food Microbiol 115, 70-78
6. AGRADECIMIENTOS
A los proyectos RM03-002 (INIA), 07G/0035/2003
(CAM) y AGL2005-00470 (CICYT).
ISBN 978-84-690-6060-5
LEVADURAS NO-Saccharomyces DE ADICIÓN EXÓGENA PARA
CRIANZA SOBRE LÍAS
Felipe Palomero, Santiago Benito, Antonio Morata, Fernando Calderón, José Antonio Suárez
Resumen
Laboratorio de Enología. Dpto. Tecnología de Alimentos, ETSI Agrónomos UPM
Ciudad Universitaria, S/N. Madrid 28040
913365745 [email protected]
Se han estudiado levaduras osmófilas, no Saccharomyces, para realizar la crianza sobre lías, pretendiendo que
el proceso sea más rápido, seguro y efectivo. Para ello, y sobre un medio autolítico modelo se han adicionado liofilizados
de cultivos puros de levaduras de los géneros Schizosaccharomyces, Saccharomycodes y como testigo una cepa de
Saccharomyces cerevisiae previamente seleccionada por sus buenas aptitudes autolíticas. La pared celular de estas
levaduras no Saccharomyces muestra una arquitectura molecular en su estructura y composición química, específica y
particular, debido a la existencia de carbohidratos y azúcares derivados, inusuales dentro de la fam. Saccharomycetaceae.
La investigación de la cinética de liberación de polisacáridos se ha efectuado mediante cromatografía de
exclusión molecular HPLC/RI, empleando dos columnas acopladas en serie para aumentar la capacidad de resolución
de la técnica. A los dos meses de crianza sobre lías con agitación orbital semanal, las levaduras osmófilas ensayadas
mostraron una liberación de polisacáridos nueve veces superior a la cepa seleccionada de Saccharomyces ssp. Además,
éstas levaduras muestran un pico de elución temprana correspondiente a polisacáridos de mayor tamaño molecular, no
existentes en Saccharomyces cerevisiae y que podrían resultar de interés enológico por sus posibles propiedades
sensoriales en palatabilidad y mantenimiento de formas estables de color.
Palabras clave: HPLC/RI, autolisis, polisacáridos, no-Saccharomyces, Schizosaccharomyces
1. INTRODUCCIÓN
Actualmente la técnica de crianza sobre lías esta
cobrando especial relevancia en la elaboración de vinos tintos ya que constituye una herramienta eficaz para la obtención de vinos particulares, y de calidad diferenciada en un
mercado cada vez más global, saturado y marcado por la homogeneidad. Debido a la gran cantidad de recursos que son
necesarios para su realización, (depósitos, barricas, mano de
obra, análisis sensorial, batonnâges, etc.) resulta una técnica
cara y no exenta de dificultades, en la que muchos grupos
de investigación centran sus esfuerzos con el objetivo de minimizar las desventajas que ésta supone, y obtener productos equilibrados de manera más rápida y sencilla.
La fracción polisacárida liberada a partir de las envueltas celulares debido a la propia dotación enzimática de la
célula, β-Glucanasas y manosidasas de pared, es de todos
los productos liberados en autolisis, la que mayor influencia
ejerce en las propiedades sensoriales y fisicoquímicas de los
vinos envejecidos mediante esta técnica. La composición a
nivel cualitativo, así como la organización de los polisacáridos
en las envueltas celulares de levaduras presentan diferencias significativas entre especies. Sin embargo, sólo algunos
géneros han sido estudiados en profundidad en cuanto a
composición en carbohidratos, y aún menos son los trabajos
que se han centrado en la distribución de estos componentes
en las paredes celulares [1]. Weijman & Golubev diferencian
tres tipos celulares dentro de la familia Saccharomycetaceae,
entre los que están Saccharomyces-type con glucosa y manosa, y Schizosaccharomyces-type con galactosa, glucosa y
manosa. La pared de Saccharomyces cerevisiae contiene
como componente resistente, mayoritariamente β-(1→3) glucano con ramificaciones laterales en menor proporción de β(1→6) glucano. Estas fibras se entrelazan junto con
pequeñas cantidades de quitina para formar una estructura
tridimensional en la que descansan los complejos de proteína
y glucomanano, componentes mayoritarios de la pared.
Schizosaccharomyces pombe es una levadura con
una estructura y composición particular debido a la existencia de polisacáridos y azúcares derivados inusuales dentro
de la familia Saccharomycetaceae. Kopecká et al. (1995) estudiaron mediante microscopía electrónica y después de diferentes tratamientos enzimáticos, la organización de las
envueltas de esta levadura, encontrando en la presencia de
α-galactomanosa en vez de manosa y un α-(1→3)glucano las
diferencias más relevantes en cuanto a composición con Saccharomyces cerevisiae. La organización estructural de estas
levaduras se muestra en los modelos realizados a partir de
los estudios anteriormente citados.
Ya se ha demostrado que la cinética de liberación
de polisacáridos varía en función de la cepa de levadura utilizada [2,3]. La organización estructural particular de los géneros de levadura explicados anteriormente, unido al
diferente comportamiento autolítico mostrado por diferentes
cepas de levaduras, sugiere cinéticas de liberación de polisacáridos satisfactorias en crianza sobre lías cuando se utilizan levaduras de Schizosaccharomyces-type [4]. Para el
empleo de lavaduras no Saccharomyces es indispensable la
generación de una biomasa de forma exógena para su posterior adición al vino y fermentado, de acuerdo con el nuevo
método de crianza sobre lías desarrollado por Suárez-Lepe
y Morata [5]. Este método tiene las ventajas de, por un lado
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minimizar los aportes de nutrientes y contaminantes que suceden en las tradicionales crianzas sobre lías, y por otro permitir el uso de levaduras seleccionadas de acuerdo a su
favorable condición autolítica.
Se utilizó una solución hidroalcohólica acidulada a
pH 3,5 con ácido tartárico a modo de medio modelo autolítico.
La cesión de polisacáridos fue estudiada para las cepas osmófilas Schizosaccharomyces pombe cepa 936 y Saccharomycodes ludwigi cepa 980, de la colección de cultivos del
Instituto de Fermentaciones Industriales (CSIC), tomando
como testigo la cepa G3(7) de Saccharomyces cerevisiae,
aislada y seleccionada por sus buenas aptitudes autolíticas
en el Dpto. Tecnología de Alimentos, ETSI Agrónomos, UPM.
La biomasa de levadura para los ensayos de
crianza sobre lías se obtuvo por fermentación en medio
YEPD enriquecido en glucosa hasta 100 g·L-1. La biomasa se
preparó y añadió según el nuevo método de crianza sobre
lías anteriormente comentado [5]. Los polisacáridos se obtuvieron a partir de los medios modelos mediante precipitación
en medio apolar ácido, para su posterior filtrado en membrana de 0,45 µm.
El análisis de polisacáridos se realizó mediante cromatografía líquida de alta presión acoplada a detección por
índice de infrarrojos (HPLC/RI), utilizando una columna de
exclusión molecular. La separación, por tanto, se realizó en
función del tamaño molecular y las diferentes fracciones obtenidas para este parámetro fueron comparadas con patrones de pululanos, de tamaño conocido.
3. RESULTADOS
La concentración de polisacáridos obtenida en las
muestras correspondientes a las levaduras osmófilas ensayadas, fue más de diez veces superior a la alcanzada por la
cepa G3(7) de Saccharomyces cerevisiae. Este enriquecimiento tan acelerado del vino en polisacáridos de diferentes
tamaños moleculares, (Fig.1.) fuerza la estabilización tartá-
Fig. 1. Cromatograma HPLC/RI de exclusión molecular de autolisados a los dos meses de crianza sobre lías.
Saccharomyces cerevisiae en gris.
rica y proteica y puede suponer una mayor integración y redondez del vino al final del proceso de crianza, o lo que es lo
mismo, la consecución de estos atributos en menor tiempo.
A los dos meses, los valores de polisacáridos de los
autolisados, se asemejan aproximadamente, a los conseguidos por un Saccharomyces ssp. a los 6 o 7 meses en crianza
sobre lías. Esta rápida liberación puede explicarse en primer
lugar, por la diferente estructura y composición química de
las envueltas celulares de estos géneros de levaduras, y en
segundo lugar, por la mayor cantidad de elementos resistentes necesarios en las paredes celulares de estos microorganismos, para soportar presiones osmóticas elevadas (Fig. 2.).
Fig. 2. Estructura y composición de las paredes celulares de Schizosaccharomyces pombe (arriba)
y Saccharomyces cerevisiae (abajo).
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También se observa en los cromatogramas (Fig. 1.)
que estas levaduras presentan un pico de elución temprana.
Comparando con los marcadores de tamaño molecular conocido, se obtiene que estos picos corresponden a biopolímeros mayores de 78,8 104 KDa, tamaño muy superior al
mayor de los fragmentos liberados por Saccharomyces cerevisiae, y que pueden resultar de interés enológico por sus
propiedades sensoriales en palatabilidad y mantenimiento de
formas estables de color.
4. CONCLUSIONES
En el ámbito de aplicación del nuevo método de
crianza sobre lías, el empleo de levaduras de géneros no
Saccharomyces, como las osmófilas ensayadas, constituye
una alternativa interesante, al mostrar éstas, cinéticas de liberación muy positivas con respecto a las cepas de levadura
utilizadas convencionalmente. Entonces, ¿Por qué no utilizar
en el futuro y previa investigación constatada otros géneros
de levadura no Saccharomyces en crianza sobre lías, si éstos
se mostrasen más favorables al efecto? Los tiempos de
crianza podrían así acortarse, enriqueciéndose el medio rápidamente en polisacáridos y manoproteínas de pared, y
mostrando además, un perfil en cuanto a tamaño molecular
más complejo, lo que resultaría interesante desde el punto
de vista fisicoquímico (estabilización tartárica y proteica), y
sensorial, en palatabilidad y densidad en boca.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. KOPECKÀ, M.; FLEET, G.H.; PHAFF, H.J. 1995. Ultrastrucure of the Cell Wall of Schizosaccharomyces
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2. MORATA, A.; CALDERÓN, F.; GONZÁLEZ, M.C.; SUÁREZ-LEPE, J.A. 2005. Release of polysaccharydes in
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adding β-glucanases. In Vino Analytica Scientia, Montpellier, France, 7-9 July.
3. PALOMERO, F.; MORATA, A.; BENITO, S.; GONZÁLEZ,
M.C.; SUÁREZ-LEPE, J.A. 2007. Convencional and
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anthocyanin content. Food Chem. Article in press, doi:
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5. SUÁREZ-LEPE, J.A.; MORATA, A. 2006. Nuevo método
de crianza sobre lías. P-200602423.
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ISBN 978-84-690-6060-5
DETECCIÓN DE Brettanomyces EN VINOS TINTOS MEDIANTE MEDIOS DE CULTIVO
SELECTIVO-DIFERENCIALES
Santiago Benito, Felipe Palomero, Antonio Morata, Fernando Calderón, José Antonio Suárez
Resumen
Laboratorio de Enología. Dpto. Tecnología de Alimentos, ETSI Agrónomos UPM
Ciudad Universitaria, S/N. Madrid 28040
Se han estudiado diferentes medios selectivos y diferenciales para aislar Brettanomyces/Dekkera analizando además
comparativamente las ventajas e inconvenientes de los ya existentes. Dichos medios se basan en las principales peculiaridades
fisiológicas de Brettanomyces/Dekkera (actividad vinilfenolreductasa, resistencia al etanol, desarrollo en anaerobiosis,
generación de acidez volátil, resistencia a actidiona, asimilación de etanol, cinética de desarrollo,…), utilizando agentes
selectivos (actidiona, cloramfenicol, anoxia, etanol, sorbato potásico) y diferenciales (ácido p-cumárico, verde de bromocresol,
carbonato cálcico). De las levaduras estudiadas sólo los géneros Dekkera/Brettanomyces, Pichia guilliermondi, Kloeckera
apiculata, Schizosaccharomyces pombe y algunas cepas de Candida parapsilosis son capaces de crecer en presencia de
Actidiona. La utilización de ácido p-cumárico por Dekkera/Brettanomyces provoca la aparición de descriptores olfativos atribuidos
al 4-etilfenol. La adición de verde de bromocresol en los medios de cultivo permite distinguir a las levaduras según su capacidad
para generar ácido acético en función de la pigmentación adquirida. La presencia de pequeñas cantidades de azúcares
asimilables acelera el desarrollo de Dekkera considerablemente. La utilidad de estos medios en bodega es rápida y efectiva para
detectar estas levaduras y aplicar medidas preventivas y/o terapéuticas, que eviten la formación de etilfenoles.
Palabras clave: Brettanomyces/Dekkera, factor selectivo-diferencial, falso positivo, actidiona, etilfenoles.
1. INTRODUCCIÓN
El aislamiento de Brettanomyces/Dekkera mediante
medios convencionales resulta dificultoso debido a la menor
velocidad de crecimiento y presencia poblacional respecto de
otras especies de levaduras y hongos. Por ello es preciso recurrir a factores selectivo-diferenciales, tales como los antibiótico actidiona (antifúngico) o cloramfenicol (antibacteriano)
[1,2,4], ácido sórbico [2], fuentes de carbono selectivas como
etanol [5] o maltosa, trealosa y sacarosa [2], etanol como antimicrobiano [3].
Los principales inconvenientes [Tabla1] de los medios empleados son los falsos positivos producidos por levaduras resistentes a actidiona [Fig.1.], el tiempo de obtención
de resultados y las contaminaciones por hongos oportunistas [Fig.2.], especialmente en medios sólidos.
Tabla 1. Ventajas e inconvenientes de medios empleados
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Fig. 1. Levaduras resistentes a Actidiona (10 y 100 mg/l).
Fig. 2. Contaminaciones por hogos que dificultan o imposibilitan actividades de recuento y aislamiento.
Con objeto de paliar estos inconvenientes se emplean factores diferenciales como el ácido p-cumárico y el
verde de bromocresol, que indican respectivamente la presencia de levaduras con actividad vinilfenolreductasa y la presencia de levaduras generadoras de ácido acético en
concentraciones significativas.
Se han empleado medios modelo diferentes (Tabla
2) con varios microorganismos y vinos reales con contenidos
anormales de etilfenoles. Se dosificaron a razón de 20 ml en
placas Petri estériles para medios sólidos, ó 50 ml en matraces para medios líquidos. Previamente, de esterilizaron en
autoclave durante 16 minutos a 121 ºC. El ácido p-cumárico,
verde de bromocresol y antibióticos fueron añadidos en solución etanólica tras ser filtrados con membrana de 0,45 µm.
Los ensayos se realizaron por triplicado y fueron incubados
a 25 ºC. 125 ml de cada vino problema con contenidos elevados de 4 etilfenol se mezclaron con 125 ml de medio YEPDEAC líquido y otros 125 ml se filtraron con membranas de
0,45 µm, las cuales fueron depositadas en el mismo medio
pero agarizado al 2 %. La generación de 4 etilfenol fue determinada por HPLC. Posteriormente 100 µl de cada medio
líquido considerado positivo (Actividad vinilfenolreductasa positiva) y 1000 µl de cada medio líquido negativo fueron inoculados por inmersión en medio DBDM (Medio selectivo
recomendado para este género) sólido en placa de Petri. En
la posterior clasificación taxonómica se emplearon las pruebas clásicas de asimilación y fermentación de azúcares. Además se han introducido dos pruebas adicionales, Resistencia
a Actidiona y actividad enzimática vinilfenolreductasa determinada por HPLC en YEPD líquido con 100 mg/l de ácido pcumárico, lo cual permite estimar el rendimiento de cada
cepa.
Tabla 2. Medios selectivo-diferenciales para cultivo de Brettanomyces/Dekkera. EL: Extracto de levadura (g/l), Glc: Glucosa (g/l),
Pept: Peptona (g/l), Et: etanol (%vol), Act: Actidiona (mg/l), pC: ácido p-cumárico (mg/l), BG: Verde de bromocresol (mg/l),
Clor: cloramfenicol (mg/l), BN: base nitrogenada (g/l), AS: ácido sórbico (mg/l).
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3. RESULTADOS
Todas las cepas estudiadas de las especies Dekkera bruxellensis, Dekkera anomala, Kloeckera apiculata,
Hanseniospora uvarum, Pichia guilliermondi, Schizosaccharomyces pombe y dos cepas de Candida parapsilosis (1336
y 1355) presentan resistencia a 10 y 100 mg/l de Actidiona.
Sólo Dekkera bruxellensis, Dekkera anomala, Pichia guilliermondi fueron capaces de asimilar etanol como única fuente
de carbono. El etanol en medio líquido es microbicida para
Kloeckera apiculata, Hanseniospora uvarum y Candida parapsilosis para 8% vol, pero sólo en medios líquidos, probablemente debido a la evaporación del etanol o condiciones
de aerobiosis. El ácido sórbico resulto eficaz al inhibir levavaduras resistentes a actidiona como Kloeckera apiculata,
Hanseniospora uvarum, Candida parapsilosis y Schizosaccharomyces pombe para dosis de 250 mg/l. Pichia guilliermondi resulta inhibida por 500 mg/l pero el retraso es de 96
horas. El recuento y detección de Dekkera/Bretanomyces en
los vinos problema fue imposible de realizar en placas debido
a contaminaciones por hongos [Figura 2]. En los vinos que
presentaron actividad vinilfenol reductasa, fue aislada y clasificada Dekkera bruxellensis en medio DBDM.
4. CONCLUSIONES
De los resultados obtenidos en este trabajo experimental se pueden deducir las siguientes conclusiones:
Los principales inconvenientes de los medios selectivo-diferenciales existentes son los falsos positivos producidos por levaduras sin actividad vinilfenolreductasa y
frecuentes contaminaciones por hongos oportunistas en medios sólidos.
El factor selectivo actidiona ha demostrado ser bastante efectivo frente a la mayoría de las levaduras mayoritarias en vinificación. De las levaduras estudiadas sólo Dekkera
bruxellensis, Dekkera anomala, Kloeckera apiculata, Hanseniospora uvarum, Pichia guilliermondi, Candida parapsilosis
y Schizosaccharomyces pombe son capaces de crecer en
presencia de Actidiona (10 mg/l y 100 mg/l), pudiendo ocasionar falsos positivos en la mayoría de los medios comer-
46
cializados. La utilización de ácido p-cumárico junto con levaduras de los géneros Dekkera/Brettanomyces provoca la
aparición de descriptores olfativos atribuidos al 4-etilfenol,
permitiendo detectar su presencia entre falsos positivos. La
presencia de glucosa acelera el desarrollo de levaduras del
género Dekkera respecto de los medios que no la emplean,
aunque disminuye la selectividad de estos. Los cultivos realizados en medios líquidos solucionan los problemas ocasionados por hongos oportunistas y permiten la cuantificación
de etilfenoles por cromatografía. La especie predominante
con actividad vinilfenol reductasa en los vinos contaminados
estudiados ha sido Dekkera bruxellensis [1].
5. BIBLIOGRAFÍA
1. VAN DER WALT, J.P.; VAN KERKEN, A.E. 1960. The
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3. ALGUACIL, M.; FIDALGO, M.; JIMÉNEZ, J.; LOZANO,
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ISBN 978-84-690-6060-5
INOCULACIÓN DE LEVADURAS SECAS ACTIVAS MEDIANTE SIEMBRA DIRECTA:
ESTUDIO DE SU IMPLANTACIÓN
Nuria Barrajón1, Santiago Alonso1, Eva Navascués2, Ana Briones1
1
Tecnología de los alimentos. Facultad de Química. Universidad de Castilla La Mancha; Avda. Camilo José Cela, 10, 13071, Ciudad Real. Teléfono:
926295300 ext. 3478. e-mail: [email protected]
2
Resumen:
Agrovin, Polígono Los Alces s/n Alcázar de San Juan, Ciudad Real
En enología, para la elaboración de vinos de calidad, es frecuente el empleo de cultivos iniciadores de levaduras
comerciales seco-activas. La adición de LSA se hace imprescindible cuando se trabaja en depósitos de fermentación de gran
capacidad, donde los riesgos de desviación sensorial y de paradas de fermentación son mayores. En la mayoría de las bodegas
de Castilla La Mancha, donde se utilizan grandes cantidades de levaduras seleccionadas, se desconoce a nivel industrial sus
porcentajes de implantación, y por ello se decidió estudiar la dinámica de las levaduras adicionadas y conocer si eran las
responsables o no de conducir la fermentación. Los aislados obtenidos se compararon con la huella genética del cultivo iniciador
mediante la técnica del DNAmt. Los resultados muestran que en un 60% de los casos la LSA se había implantado
adecuadamente a mitad de fermentación, mientras que en alguna ocasión la imposición del iniciador fue nula incluso en esta
etapa del proceso.
Palabra clave: Saccharomyces, vinificación, levadura seco-activa, siembra directa.
1. INTRODUCCIÓN
Para la elaboración de vinos de calidad, competitivos en el mercado, son deseables unos criterios comunes en
las distintas elaboraciones, que permitan ofrecer un producto
característico y sometido a las menores desviaciones cualitativas posibles. Por ello, el empleo de cultivos seleccionados industriales de levaduras seleccionadas (LSA) se ha
hecho extensivo en todo el sector.
De igual modo, la práctica del levadurado (adición
de LSA) de mosto y uva se hace imprescindible cuando se
trabaja en depósitos de fermentación de gran capacidad y en
las vinificaciones de mostos blancos muy limpios, donde los
riesgos de desviación sensorial y de paradas de fermentación son mayores; estos dos puntos concurren en buena
parte de las bodegas y cooperativas de Castilla La Mancha.
Además la variedad blanca Airén, mayoritaria en la zona, presenta escaso potencial aromático, lo que se intenta contrarrestar con la formación y liberación de aromas por
determinadas cepas de levaduras.
Así pues, se tiende a que la fermentación esté dirigida por levaduras comerciales seco-activas (Saccharomyces cerevisiae) añadidas a los tanques de fermentación
(temperatura y rehidratación adecuadas) por siembra directa.
No obstante, a pesar de emplear cultivos iniciadores ocurren
a veces fermentaciones incompletas que dan lugar a vinos
inadecuados, posiblemente debido a que la levadura inoculada no se ha logrado imponer en el proceso, ya que se desconocen sus porcentajes de implantación. Y es por esto que
uno de los retos biotecnológicos que se está abordando en
esta zona, es el control, durante la vinificación, de la imposición e implantación de las levaduras seco activas empleadas. Este hecho es indispensable tanto desde el punto de
vista económico como desde el de calidad.
Mediante el uso de técnicas de biología molecular
como el análisis de restricción del DNA mitocondrial, ha sido
posible demostrar que una levadura inoculada se impone en
el tanque de fermentación, y lo hace a unos niveles tales que
conduce la fermentación vínica.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Recogida de muestras
Durante la vendimia de 2005 se visitó una cooperativa de la provincia de Toledo, y se muestrearon seis depósitos de las variedades Airén, Tempranillo, Garnacha Tintorera,
y Shiraz (nombrados R1-R6), inoculados cada uno de ellos
con distintas cepas comerciales de LSA (nombradas como AD). Las muestras se tomaron al inicio y mitad de fermentación.
En esta bodega se cumplimentaron unas fichas de
trabajo en donde se recopilaba información como el estado
sanitario de la uva, la técnica e intensidad de la clarificación
o el protocolo de rehidratación de las levaduras seco activas
utilizado (medio de rehidratación, tiempo del proceso, temperatura del mosto, empleo de agitación o adición de nutrientes).
2.2. Recuento y aislamiento de levaduras
Para llevar a cabo el recuento de las levaduras presentes en cada depósito y etapa de fermentación, cada
muestra y sus diluciones seriadas se sembraron en superficie sobre Agar YPD (1% extracto de levadura, 2 % peptona,
2 % glucosa). Tras la incubación a 28 ºC / 48 h se realizó
una réplica sobre Agar Lisina de las placas contables con el
fin de poder seleccionar aquellas colonias pertenecientes al
género Saccharomyces.
47
ISBN 978-84-690-6060-5
Se eligieron, al azar, 10 colonias del género Saccharomyces, de las que se obtuvieron cultivos puros para su
posterior identificación a nivel de cepa.
Fig. 1. Biodiversidad de cepas Saccharomyces
en los diferentes depósitos muestreados
2.3. Análisis de restricción del DNA mitocondrial
Para el análisis de restricción del DNAmt, los cultivos de Saccharomyces se crecieron en caldo YPD durante
18 horas. La extracción del DNA y el análisis de restricción se
efectuaron siguiendo el protocolo propuesto por Querol y colaboradores (1992). Un volumen de 10 µL de DNA se digirió
con la endonucleasa HinfI. Los fragmentos de restricción se
separaron en un gel de agarosa al 1.5 % adicionado con bromuro de etidio (0.5 µg /mL).
3. RESULTADOS
Tras la extracción y restricción del DNA de los 120
aislados de Saccharomyces, se compararon los perfiles genéticos obtenidos con el de la levadura comercial en cada
caso, conociendo así los % de implantación de las LSA empleadas. Estos % de implantación, junto con la variedad de
mosto, la dosis de levadura empleada y la temperatura de
inoculación se presentan en la Tabla 1:
Tabla 1. Porcentaje de implantación de LSA en diferentes muestras
48
Se considera levadurado eficaz cuando más del
80% de la población viable corresponde a la levadura seleccionada; sin embargo, cuando la implantación se encuentra
por debajo del 50% el levadurado habría sido ineficaz. En la
Tabla se observa que en casi todos los depósitos la levadura
comercial empleada se impuso eficazmente en la fase tumultuosa de la fermentación, si bien en algunos casos no predominó desde el inicio del proceso. En la muestra R3, los %
de implantación fueron relativamente bajos; no obstante, la
misma levadura (A) alcanzó un 100% de imposición, incluso
a menor dosis, en la vinificación de Airén (R1). Cabe destacar que en el depósito R5 la LSA fue totalmente desplazada
por las cepas autóctonas. Los resultados menos favorables
de implantación se obtuvieron en la fermentación de la variedad Tempranillo.
En la Fig. 1 se muestra la biodiversidad de la población de Saccharomyces en los distintos tanques de fermentación. En ella se observa como la muestra R5, tanto al
inicio, mitad y final de fermentación, presenta una gran variedad de cepas autóctonas que han desplazado por completo a la levadura comercial empleada, aunque ninguna de
ellas aparece de forma dominante. De igual modo se aprecia
como en los depósitos R3, R4 y R6 a medida que transcurre
la fermentación, la levadura comercial logra imponerse en la
fase tumultuosa.
En las Fig. 2A y 2B se recogen algunos de los perfiles genéticos de los aislados obtenidos. En la 2A se observa
que el 80 % de los aislados presentan el mismo patrón que
la levadura seco-activa empleada (P). En cambio, en la
Fig.2B, que corresponde a una muestra en fase tumultuosa,
se aprecia la presencia de cepas autóctonas en detrimento
de la levadura seleccionada utilizada en este caso, si bien
ninguna de ellas predominó de forma significativa. Cada uno
de los símbolos señala qué cepas autóctonas son iguales
entre sí y diferentes al patrón de la LSA comercial.
A)
Fig.2. Perfiles de restricción de DNA mitocondrial de
algunos aislados de Saccharomyces
B)
4. CONCLUSIONES
Tras el correcto uso de las levaduras seco activas,
en la mayoría de los depósitos la cepa comercial logro imponerse, en más de un 80%, en la fase de fermentación tumultuosa, y en algunos casos dirigió la fermentación desde el
comienzo del proceso.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. PRETORIUS, I. S. 2000. Tailoring wine yeast for the
new millennium: novel approaches to the ancient art
of winemaking. Yeast. 16, 675.
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conducted by active dry yeast strains. Appl. Environ.
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purezza con l’impiego dei lieviti selezionati attiviti
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4. POIRIER, I., MARÉCHAL, P.A., RICHARD, S., GERVAIS,
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strongly dependant on rehydration kinetics and the
temperature of dried cells. J. Appl. Microbiol. 86, 87-92
ISBN 978-84-690-6060-5
DEGRADACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS PRESENTES EN VINO MEDIANTE
CEPAS DE Lactobacillus plantarum
José María Landete, Héctor Rodríguez, Blanca de las Rivas, Rosario Muñoz
Resumen:
Departamento de Microbiología, Instituto de Fermentaciones Industriales, CSIC, C/ Juan de la Cierva 3, 28006 Madrid.
Tno 91 562 2900. E-mail:[email protected]
Los compuestos fenólicos influyen en las características sensoriales y nutricionales del vino. La especie Lactobacillus
plantarum, modelo de cultivo iniciador en biotecnología de alimentos vegetales, es una de las especies de bacterias lácticas
mayoritarias en vino. El estudio pretende analizar la capacidad que presentan varias cepas de L. plantarum para degradar 15
de los compuestos fenólicos mayoritarios presentes en vinos. Los sobrenadantes de cultivos de L. plantarum crecidos en
presencia de los compuestos fenólicos se analizaron para comprobar su posible degradación, así como para determinar el
compuesto producido. Los resultados obtenidos indican que todas las cepas de L. plantarum presentan un comportamiento
similar y sólo son capaces de metabolizar 7 de los 15 compuestos fenólicos analizados. Tiene especial relevancia la
descarboxilación de algunos ácidos cinámicos (ácido p-cumárico y ácido ferúlico) que originan la formación de vinilfenoles (4vinilfenol y 4-vinilguayacol, respectivamente), y su posterior reducción, con la formación de etilfenoles. La producción de estos
fenoles volátiles tiene una gran influencia en el aroma del vino.
Palabras clave: Lactobacillus plantarum; ácidos cinámicos; fenoles volátiles; vinilfenoles; compuestos fenólicos.
1. INTRODUCCIÓN
Los compuestos fenólicos revisten una gran importancia en enología debido al papel que juegan directamente
o indirectamente sobre la calidad de los vinos. En efecto, son
el origen del color y de la astringencia, además de algunas de
sus propiedades nutricionales y farmacológicas.
La composición fenólica del vino depende de numerosos factores entre los que se encuentran la variedad de
uva (blanca o tinta), el modo de estrujado, la posible inclusión o eliminación antes de la fermentación de los hollejos,
semillas y pulpa de la uva (especialmente en las variedades
tintas), el tipo de vinificación (temperatura y tiempo de maceración) y el envejecimiento. La composición fenólica también se modifica durante la fermentación por la actividad de
las levaduras las cuales son capaces de metabolizar algunos
de los compuestos fenólicos presentes. Y en último término,
el contacto del mosto y del vino con la barrica de madera también contribuye a la presencia de compuestos fenólicos en el
vino.
El proceso de fermentación produce cambios cualitativos y cuantitativos en la composición fenólica del vino. Durante la fermentación, los compuestos derivados del ácido
hidroxicinámico se hidrolizan a ácido hidroxicinámico libre, el
cual se puede después oxidar y convertir en fenoles volátiles
por acción de descarboxilasas presentes en las levaduras, o
ser adsorbidos por las levaduras. Aproximadamente, el
27,6% de los ácidos hidroxicinámicos se pierden durante el
proceso de vinificación. En la mayoría de los vinos tintos se
produce un segundo proceso fermentativo, la fermentación
maloláctica, llevada a cabo por bacterias lácticas. Los compuestos fenólicos van a influir en el crecimiento de estas bacterias, y algunos de ellos van a ser degradados por las
bacterias lácticas como consecuencia de su crecimiento en el
mosto y vino.
La especie de bacteria láctica L. plantarum es el
modelo de bacteria láctica ubicua en sustratos vegetales
ricos en compuestos fenólicos. La particularidad metabólica
que presenta L. plantarum para compuestos fenólicos se ve
también reflejada en la observación de que esta especie tiene
uno de los genomas más grandes entre las bacterias lácticas
poseyendo, por tanto, un alto potencial metabólico. Este estudio se ha planteado con objeto de conocer la capcidad de
L. plantarum para metabolizar algunos de los compuestos fenólicos presentes en el vino.
Se estudiaron 4 cepas de L. plantarum aisladas de
diferentes orígenes. L. plantarum CECT 748T, suministrada
por la CECT y aislada de col fermentada; L. plantarum
WCSF1, suministrada por el Dr. M. Kleerebezem (Wageningen Centre for Food Sciences, NIZO Food Research) y aislada de saliva; L. plantarum LPT57/1 suministrada por el Dr.
J. L. Ruíz-Barba (Instituto de la Grasa, CSIC) y aislada de
aceitunas; y L. plantarum RM-76 aislada en el Instituto de
Fermentaciones Industriales (CSIC) de una muestra de vino.
2.2. Ensayo de degradación de compuestos fenólicos
Las cepas de L. plantarum se inocularon en el
medio basal descrito por Rozès y Peres [1]. Estos cultivos se
utilizaron como inóculos para medios conteniendo compuestos fenólicos. Los compuestos fenólicos analizados son:
ácido gálico (5 mM), ácido protocatéquico (15 mM), tirosol
(15 mM), ácido vainillíco (25 mM), catequina (15 mM), epicatequina (15 mM), quercitina (25 mM), ácido cafeíco (15 mM),
49
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ácido siríngico (15 mM), ácido p-cumárico (5 mM), ácido ferúlico (15 mM), metil galato (5 mM), ácido cinámico (5 mM),
triptofol (5 mM), y ácido salicílico (25 mM). Los compuestos
fenólicos se extrajeron con acetato de etilo y se analizaron
mediante HPLC.
2.3. Análisis mediante HPLC
Para la detección de compuestos fenólicos se utilizó un equipo cromatográfico (Thermo Electrón) compuesto
por una bomba cuaternaria P400 SpectraSYSTEM y un detector de diodos UV6000LP. Se utilizó un gradiente de solvente A (agua:ácido acético, 98:2) y solvente B
(agua:acetonitrilo:ácido acético, 78:20:2) en un cartucho
Nova-pack C18 (25 cm x 4.0 mm d.i.) según el método descrito por Bartolomé y cols. [2].
3. RESULTADOS
3.1. Degradación de compuestos fenólicos por L.
plantarum
Todas las cepas de L. plantarum mostraron un comportamiento similar respecto a su capacidad para degradar
los distintos compuestos fenólicos ensayados, puesto que
fueron capaces de degradar las mismos compuestos fenólicos. De todos los compuestos ensayados sólo se degradaron
el ácido cumárico, ácido caféico, ácido ferúlico, ácido gálico,
metil galato, ácido protocatequíco, ácido sinápico. La Figura
1 muestra los cromatogramas obtenidos con algunos de
estos compuestos.
Fig. 1. HPLC cromatogramas que muestran la degradación de algunos de los ácidos fenólicos ensayados
3.2. Compuestos fenólicos originados
metabolismo de L. plantarum
50
por
el
Las cepas de L. plantarum degradaron algunos de
los compuestos fenólicos ensayados originando compuestos
con gran importancia en el aroma, como los etilfenoles.
Tal como muestra la Tabla 1, la mayoría de los compuestos metabolizados por las cepas de L. plantarum son ácidos los cuales experimentan una descarboxilación, que en
algunos casos va acompañada de una reducción. La Figura
2 muestra algunas de las posibles rutas implicadas en la degradación de estos compuestos fenólicos.
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Fig. 2. Posibles rutas implicadas en la degradación de
compuestos fenólicos por L. plantarum
4. DISCUSIÓN
Lactobacillus plantarum es capaz de modificar alguno de los compuestos fenólicos presentes en vino originando compuestos con repercusión en el aroma. En la
actualidad, las enzimas implicadas permanecen sin caracterizar, a excepción de una descarboxilasa de ácidos fenólicos
(PDC) que ha sido descrita previamente [3].
5. BIBLIOGRAFÍA
Fig. 2. Posibles rutas implicadas en la degradación de
compuestos fenólicos por L. plantarum
1. ROZÈS, N.; PERES, C. 1998. Effects of phenolic compounds on the growth and the fatty acid composition
of Lactobacillus plantarum. Appl Microbiol Biotechnol
49, 108-111.
2. BARTOLOMÉ, B.; PEÑA-NEIRA, A.; GÓMEZ-CORDOVÉS, M. C. 2000. Phenolics and related substances in
alcohol-free beers. Eur Food Res Technol 210, 419-423.
3. CAVIN, J.-F.; BARTHELMEBS, L.; DIVIES, C. 1997. Molecular characterization of an inducible p-coumaric
acid decarboxylase from Lactobacillus plantarum.
Appl Environ Microbiol 63, 1939-1944
6. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido realizado gracias a la financiación recibida de los proyectos AGL2005-00470 (CICYT),
RM03-002 (INIA) y 07G/0035/2003 (CAM).
51
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MEJORA DEL PROCESO DE REHIDRATACIÓN DE LA LEVADURA SECA ACTIVA EN
ENOLOGÍA
Boris Rodríguez Porrata, María Novo, José Guillamon, Nicolás Rozès, Albert Mas,
Ricardo Cordero Otero
Resumen:
Dep. Bioquímica y Biotecnología, Universidad Rovira i Vigili, calle Marcel·lí D., 43007-Tarragona
Tel: 977558793, E-mail: [email protected]
El empleo de la Levadura Seca Activa (LSA) como inóculo en la producción vínica ha sustituido a la fermentación
espontánea. El uso de LSA asegura una rápida iniciación de la fermentación, ayudando así a la obtención de una calidad más
uniforme del vino. El objetivo de este estudio es analizar la optimización de las condiciones de rehidratación de la LSA mediante
la determinación de la viabilidad y vitalidad. La rehidratación de la LSA se ha estudiado en diferentes soluciones a una
temperatura de 37°C durante 30 min. La viabilidad celular se realizó por recuento de colonias en medio completo. La vitalidad
se determinó a partir de la medida indirecta del CO2 liberado al inicio de la fermentación mediante el cambio de impedancia.
Cuando se encontró una mejora del índice de vitalidad celular se cuantificó la pérdida de componentes intracelulares evaluando
así el grado de recuperación de las membranas en dichos medios. Se observó una mejora de hasta el 30% en la vitalidad
celular cuando la rehidratación se realizó en presencia de iones metálicos y de un 5% con compuestos que aumentan la fluidez
de membrana, los compuestos antioxidantes u oxidantes no presentaron ninguna mejora.
Palabras clave: Levadura seca activa, rehidratación, permeabilidad de membrana, vitalidad, viabilidad
1. INTRODUCCIÓN
El empleo de la levadura seca activa (LSA) como inóculo en la fermentación vínica se implementó en los Estados
Unidos en la década de los 60 y se extendió 20 años después
en Europa con niveles crecientes de producción y demanda
por año. Por su eficiente imposición sobre la microflora nativa
presente en el mosto inicial, la LSA no sólo garantiza una rápida iniciación de la fermentación, sino que determina un producto final de calidad uniforme. Por este motivo, la
rehidratación de la LSA es una etapa clave en la producción
del vino, durante la cual ocurren cambios, como la reparación
de las estructuras celulares, que comprometen la vitalidad y
viabilidad de la levadura rehidratada [1, 2, 3]. A pesar de la
importancia de esta etapa en la producción del vino, hay un
conocimiento limitado acerca de los cambios que ocurren en
la LSA durante el proceso de rehidratación, la influencia de
los mismos en calidad del producto final y que aspectos de
las prácticas establecidas en bodega se pudieran mejorar. El
objetivo de este estudio, fue determinar las condiciones de rehidratación para asegurar mejoras en la viabilidad y vitalidad
de las levaduras antes de su inoculación en el mosto.
52
Este trabajo se realizó con un lote de Levadura
Seca Activa (LSA) de la cepa vínica QA23 (Lallemand S.A.,
Canada). Se evaluó el efecto bioquímico sobre la vitalidad y
viabilidad celular al ser rehidratadas con soluciones de distintos compuestos: que aumentan la fluidez membrana (pcresol, o-cresol, m-cresol, alcohol bencílico y 2-etil-phenol), o
la rigidez (dimetil sulfóxido), fuentes de carbono (glucosa, rafinosa y trehalosa), fuentes nitrogenadas (prolina y gluta-
mato), iones metálicos (Mg2+, Ca2+, Fe2+ y Fe3+), agentes oxidantes y antioxidantes (H2O2 y ácido ascórbico) y el agua
pura se tomó como medio de rehidratación de referencia. En
todos los casos 1 g de LSA fue rehidratada en un volumen
final de 10 mL a 37°C durante 30 minutos.
La vitalidad se determinó a partir de la medida indirecta del CO2 liberado al inicio de la fermentación mediante
el cambio de la impedancia de una solución de KOH 0,02 %.
Para ello se empleó el analizador microbiológico BacTrac
4300 (SY-LAB Instruments, Austria), y la población tratada
fue de 107 células·ml-1 de YPD a 15°C. Se usó esta temperatura como artilugio para poder obtener valores de impedancia en la fase exponencial de la curva (comprendida entre el
5 el 15%), viendonos limitados por la frecuencia mínima de
lectura entre mediciones sucesivas del BacTrac que es de 10
minutos. Los valores de impedancia 10% obtenidos se utilizaron para evaluar la vitalidad celular a posteriori del tratamiento de rehidratación. La viabilidad celular se evaluó por
recuento de colonias en medio YPD tomando como referencia las UFC correspondientes a las células rehidratadas con
agua. No se han observado diferencias estadísticamente significativas de viabilidad celular entre los diferentes tratamientos de rehidratación que se experimentaron.
La pérdida de nucleótidos se utilizó como parámetro indirecto para evaluar el grado de deterioro de la membrana citoplasmática. El contenido de nucleótidos en la
solución de rehidratación se determinó por medición de la absorbancia a 260 nm y 280 nm. Estos valores se usaron para
calcular los nucleótidos equivalentes en mg ml-1 aplicando la
Ecuación 1.
Nucleótidos equivalentes = (0.063 x A260) – (0.036 x A280)
La citometría de flujo se empleó para contabilizar el
número de células de la población con daños de membrana
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usando el marcador fluorescente ioduro de propidio (IP) que
presenta afinidad por el ADN y el ARN. Las células con membranas sanas son impermeables al IP, y aquellas donde la
membrana no actúa como barrera presentan un aspecto fluorescente permitiendo así cuantificar su representación por
medio del citómetro de flujo.
3. RESULTADOS
La figura 1 muestra el comportamiento de la vitalidad
de la LSA rehidratada en soluciones de distintos compuestos
agrupados por clase: fuentes nitrogenadas y de carbono (A),
iones metálicos (B), agentes oxidantes y antioxidantes (C), y
agentes que favorecen la fluidez o rigidez de la membrana citoplasmática (D). Los valores representados fueron corregidos
con los pesos secos de partida de cada una de las muestras
tratadas independientemente. En el caso de células rehidratadas en presencia de glucosa se observó un ligero aumento
de la vitalidad respecto a las rehidratadas en agua pura. Sin
embargo, la rehidratación en presencia de magnesio mostró
una mejoría de un 30 % respecto a la condición de referencia.
En los otros tratamientos no se observó una influencia positiva
del medio de rehidratación sobre la vitalidad.
La cinética de pérdida de nucleótidos durante la rehidratación se evaluó con una frecuencia de 5 minutos y los
valores representados fueron normalizados con los pesos
secos de partida para cada una de las muestras (Fig. 2). Los
compuestos aquí evaluados se seleccionaron por sus efectos antagónicos registrados en la experiencia precedente. La
condición agua, p-cresol y DMSO presentan una fuga continua de metabolitos hasta el minuto 25 de incubación, distando
significativamente de la condición glucosa y magnesio en las
cuales esta pérdida se detuvo a los 15 minutos de comenzado el tratamiento. En la levadura el magnesio interviene en
la síntesis y actividad de cientos de enzimas, de compuestos
ricos en energía, como regulador esencial del ciclo celular,
juega un rol importante en la coordinación del metabolismo, y
puede constituir complejos con los fosfolípidos de membrana
[4]. Por estas razones, las levaduras rehidratadas en presencia de magnesio podrían acortar los tiempos de reinicio de los
procesos de reactivación metabólica, resultando en una rápida reparación de las estructuras celulares para sobrevivir al
estrés acaecido durante el proceso de secado y rehidratación
de la LSA. Además, se ha sugerido que los iones calcio y la
glucosa tienen un efecto estabilizador sobre las membranas
durante la rehidratación [1, 2].
Fig. 1. Efecto de diferentes medios de rehidratación sobre la vitalidad celular. Los datos representados corresponden a valores medios de
experiencias realizadas por triplicado para cada condición. Abreviaturas: AA, ácido ascórbico; BA, alcohol bencílico; DMSO, dimetil sulfóxido;
E, glutamato; EH, etil hexanol; EP, etil-phenol; Fe II, FeSO4; Fe III, Fe Cl3; Gluc, glucosa; HP, peróxido de hidrógeno; P, prolina; PB, 2-fenil 1butanol; PC, p-cresol; PP, 2-fenil 1-propanol; Raff, rafinosa; SO, SO2; Treh, trehalosa.
Se piensa que los iones calcio se enlazan con las
cabezas polares de los fosfolípidos formando puentes salinos entre dos moléculas de fosfolípidos vecinas permitiendo
la reparación temporaria de la membrana [2]. Indirectamente,
nuestros datos no avalan esta hipótesis ya que el desempeño
de las levaduras rehidratadas en presencia de calcio presentan un tiempo de impedancia-10% ligeramente superior
al observado para la condición de referencia. Respecto a la
glucosa, se ha planteado que el ingreso irrestricto al citoplasma celular promovería la formación de redes proteicos
53
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reduciendo así la cinética de difusión de las sustancias intracelulares al medio [1].
En la industria del vino el uso de la tecnología de citometría de flujo se la utiliza para cuantificar la viabilidad de
las levaduras, de las bacterias y para la determinación de las
poblaciones de levaduras presentes durante la fermentación.
Nosotros hemos utilizado esta tecnología para evaluar el
grado de deterioro de las membranas plasmáticas al finalizar
el proceso de rehidratación celular. Las levaduras rehidratadas durante 30 minutos a 37°C en agua pura, calcio, magnesio y glucosa presentaron un 76% de células en las cuales
la membrana citoplasmática había funcionado como una barrera para el ioduro de propidio. En cambio, los compuestos
DMSO y el p-cresol que actúan en la fluidez de la membrana
Fig. 2. Determinación de la concentración de
nucleótidos en los diferentes medios durante el proceso de
rehidratación. Las células fueron rehidratadas a 37°C en agua (□)
o en presencia de glucosa 2% (■), Mg2+ 5mM (■), DMSO 125 mM
(░) y p-cresol 5mM (▓). Las barras de error representan la
dispersión de las experiencias independientes realizadas por
triplicado.
una alteración de la misma durante el proceso de rehidratación. La similitud de espectros citométricos obtenidos para
las células tratadas con calcio y magnesio, en conjunción con
los valores de vitalidad representados en la Fig. 1 nos permiten sugerir que la pronta reactivación celular, impulsada
por el magnesio, provendría de un reestablecimiento temprano de la actividad metabólica y no de un efecto único
como sustancia-emplasto de la membrana.
4. CONCLUSIONES
En este estudio hemos podido caracterizar, para
una serie de diferente condiciones fisiológicas de rehidratación de la LSA, un medio rehidratante-magnesio donde se
pudo reducir hasta 2/3 el tiempo necesario para la reactivación fermentativa de las células. Además, hemos determinado que diferentes condiciones de rehidratación inciden en
la cinética de pérdida de compuestos intracelulares, siendo el
magnesio y la glucosa los más favorables para la detención
temprana de la misma. La citometría de flujo nos dejó demostrar que la modificación de la fluidez de membrana durante el proceso de rehidratación incrementa su
permeabilidad no selectiva.
5. BIBLIOGRAFÍA
mostraron aproximadamente un 53% de las células permeables al marcador fluorescente. Estos datos nos permiten sugerir que los altos valores de fuga de compuestos
intracelulares de las células tratadas con agentes que modifican la fluidez de membrana (Fig. 2) son concomitantes con
54
1. Becker, M.J.; Blumbergs, J.E.; Ventina, E.J.; Rapoport,
A.I. 1984. Characteristics of cellular membranes at
rehydration of dehydrated yeast Saccharomyces cerevisiae. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 19 347-352
2. Becker, M.J.; Rapoport, A.I. 1987. Conservation of yeasts by dehydration. In: Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology. A. Fiechter Ed.
3. Rapoport, A.I.; Khrustaleva, G.M.; Chamanis, G.; Beker,
M.E. 1995. Yeast anhydrobiosis: permeability of the
plasma membrane. Microbiol. 64 229-232
4. Birch, R.M.; Ciani, M.; Walker, G.M. 2003. Magnesium,
calcium and fermentation metabolism in wine yeasts.
J. Wine Res. 14 3-15
ISBN 978-84-690-6060-5
ESTUDIO DEL EFECTO DE PRÁCTICAS ENOLÓGICAS EN LA EVOLUCIÓN DE
DISTINTAS POBLACIONES MICROBIANAS EMPLEANDO TÉCNICAS
INDEPENDIENTES DE CULTIVO
Imma Andorrà, Sara Landi, Braulio Esteve-Zarzoso, Albert Mas, Jose Manuel Guillamón
Departamento de Bioquímica y Biotecnología. Facultad de Enología. Universidad Rovira y Virgili. Tarragona.
Resumen
En la transformación de mosto de uva en vino se ven implicados diferentes grupos de levaduras y bacterias lácticas
y acéticas. El desarrollo inadecuado de alguno de estos grupos microbianos puede tener importantes repercusiones en la
calidad del producto final. Dos prácticas generalizadas en bodega dirigidas a la normalización microbiana del proceso son la
adición de SO2 y la inoculación de levaduras. En el presente trabajo, se ha analizado el efecto de ambas prácticas sobre las
poblaciones bacterianas (bacterias lácticas y acéticas) y de levaduras y utilizando una metodología de recuento e identificación
en base a técnicas independientes de cultivo. Para ello, se han utilizado la PCR a tiempo real (rtPCR) y la electroforesis en
gradiente desnaturalizante (DGGE) para la cuantificación e identificación de los distintos microorganismos del vino. Estas dos
técnicas se han utilizado para analizar directamente muestras de fermentaciones alcohólicas industriales. La primera conclusión
de este estudio es que hemos detectado una mayor diversidad de especies a lo largo del proceso, comparado con el análisis
tradicional de recuento e identificación de colonias. Con respecto al efecto del SO2 y la inoculación, ambos actúan disminuyendo
los recuentos y diversidad de especies, particularmente los bacterianos.
1. INTRODUCCIÓN
Las fermentaciones vínicas son el resultado de la
actividad de una microbiota compleja que produce una serie
de compuestos que determinan la calidad del vino final. Los
microorganismos mayoritarios durante el proceso son las levaduras y las bacterias lácticas, responsables de la fermentación alcohólica y maloláctica respectivamente, junto con las
bacterias acéticas, responsables de la acetificación (producción de vinagre) y del picado acético. El control de la evolución de la microbiota se realiza mediante diferentes prácticas
enológicas que tienen como objetivo evitar la proliferación de
ciertos microorganismos y favorecer la imposición de otros,
con el objeto de mantener las características propias de un
vino. En ese sentido las más generales en bodega son la inoculación de una cepa de levadura iniciadora de la fermentación y la adición de anhídrido sulfuroso como antimicrobiano
y antioxidante.
Un elemento fundamental del control de las poblaciones durante las fermentaciones es la aplicación de métodos de análisis de microorganismos. Las técnicas de cultivo
tradicionales para la identificación y cuantificación de microorganismos se basan en el uso de medios selectivos, seguido
del aislamiento de cultivos puros y finalmente la aplicación
de tests confirmativos. A pesar de ser económico, el recuento
en placa consume tiempo y en general, se necesitan varios
días en el laboratorio especialmente cuando se trabaja con
un gran número de muestras, además de que en algunos
casos depende del estado fisiológico del microorganismo la
respuesta a dichos tests. A lo que se añade el hecho de que
algunos microorganismos no pueden responder al medio de
cultivo debido a las alteraciones celulares, la falta de nutrientes específicos o incluso, encontrarse en el discutido estado “viables pero no cultivables” [1]. En ese sentido la
irrupción de las técnicas moleculares significan en primer
lugar la independencia del estado fisiológico al analizar el
DNA y en segundo lugar una mayor rapidez de análisis. No
obstante el desarrollo de nuevas técnicas moleculares permite el análisis de muestras que no necesitan un cultivo previo, por lo que se eliminan los efectos selectivos de los
medios de cultivo y se puede analizar tanto la diversidad
como incluso cuantificar la microbiota presente en el proceso.
En algunos casos incluso se puede reducir el tiempo de
forma considerable.
El objetivo del presente trabajo ha sido la utilización
de técnicas independientes de cultivo (DGGE-PCR, PCR a
tiempo real o cuantitativa) para el análisis de los efectos de
las prácticas mencionadas anteriormente (inoculación de cultivos iniciadores y uso del SO2) sobre la microbiota de la fermentación vínica.
2.1. Muestras
Se estudiaron cuatro fermentaciones distintas de la
variedad Cariñena de la finca experimental de la Facultad de
Enología. Un mosto inicial único se distribuyó en 4 fermentadores en los que se añadió inoculo y sulfuroso (60 mg/l)
(+I+S), sólo inoculo (+I-S), sólo sulfuroso (-I+S) y sin ninguna
adición (-I-S). Se han utilizado como cepas de referencia las
cepas tipo provenientes mayoritariamente de la CECT.
2.2. Análisis moleculares
Para el análisis molecular se realizó la extracción
de DNA, utilizando siempre el mismo el protocolo [2]. Para la
PCR cuantitativa se utilizaron los primers y condiciones des-
55
ISBN 978-84-690-6060-5
critos para levaduras [2], bacterias lácticas [3] y bacterias
acéticas [4]. Para el DGGE se utilizaron los primers y condiciones descritas para levaduras [5] bacterias lácticas [6] y
bacterias acéticas [3].
3. RESULTADOS
Fig 1. Perfiles de DGGE de los amplificados de la region V7-V8
del 16S rDNA, obtenidos con los primers WBAC1GC-WBAC2 del
DNA aislado de cepas de bacterias acéticas de referencia.
1, Ac. pasteurianus;2, Ac.aceti; 3, G. oxydans; 4, Ac. pasteurianus;
5, Ac. aceti; 6, Ac. oeni; 7, G. oxydans; 8, Ga. hanseni; 9, Ga.
hanseni., M1 Marcador de 1,2,3,4, Marcador 2 de 5,6,7,8,9.
3.1. DGGE
56
Se obtuvieron amplificados de la región D1-D2 del
gen ribosomal 26S para diferentes cultivos puros de cepas
de referencia de levaduras, bacterias lácticas y bacterias acéticas. Estos amplificados se utilizaron como marcadores para
la identificación posterior de los amplificados obtenidos en las
muestras vínicas
En el marcador de levaduras se diferenciaron bien
todas las especies, excepto S. cerevisae, C. sake, D. anomala y Z. rouxii, que presentan una banda común. En todas
las fermentaciones se ha podido visualizar esta banda
común, así como la que correspondía a C. stellata al principio de las fermentaciones inoculadas. Entre estas dos fermentaciones, la adición de SO2, no reveló ninguna diferencia
significativa. En las otras dos fermentaciones se observa
que los primeros días de fermentación aparece una banda
que podría corresponder a C. mesenterica. Se ha detectado
que la cepa comercial utilizada en las fermentaciones presenta una doble banda, una de las cuales corresponde a la
de las cepas de referencia de S. cerevisiae. La heterogeneidad en los genes ribosomales en cepas poliploides de S.
cerevisiae podría ser la razón de la doble banda. En las fermentaciones inoculadas se observa la presencia de esta
doble banda, mientras que en las fermentaciones no inoculadas aparece una única banda, por lo que se confirma que
en las fermentaciones inoculadas se ha implantado la cepa
inoculada, mientras que en las no inoculadas han crecido
cepas de S. cerevisiae diferentes, que podrían provenir del
mosto o de las instalaciones. Todas las bandas que han aparecido en los geles se han recortado, reamplificado y secuenciado, para confirmar las identificaciones realizadas por
comigración.
En la identificación de bacterias acéticas, el marcador construido diferencia todas las cepas a excepción de A.
pasteurianus y A. aceti. En las cuatro fermentaciones distintas aparecen dos bandas una de ellas corresponde a G. hansenii y la otra corresponde al grupo formado por A.
pasteurianus/A. aceti. No se ha visto efecto alguno de las diferentes prácticas enológicas en la diversidad de bacterias
acéticas encontradas, aunque estas bandas se enviaran a
secuenciar para confirmar resultados.
En la identificación de bacterias lácticas se pueden
diferenciar todas las especies, aunque la especie L. brevis
presenta dos bandas y una de ellas coincide con la banda de
la especie P. pentosaceus. Las especies P. parvulus y L.
buchneri presentan una banda muy parecida. En las distintas
fermentaciones no se ha obtenido producto de amplificación,
esto es debido a que la concentración de bacterias lácticas es
inferior al límite de detección de este método, que teóricamente es 102 cel/ml.
3.2. rtPCR
Antes de realizar el análisis de rtPCR de las muestras se han elaborado rectas de calibrado para bacterias acéticas, bacterias lácticas y levaduras. Para ésta último grupo
se ha construido además, una recta de calibrado especifica
para las levaduras del género Saccharomyces, otra para las
pertenecientes al género Hanseniaspora y otra para levaduras totales (sin tener en cuenta la especie). Las levaduras totales aumentaron de 106 cel/ml a 107 cel/ml. En
Saccharomyces se ha observado un aumento de la población
de 105 cel/ml a 107 cel/ml, con un retraso en el desarrollo de
Saccharomyces en las fermentaciones no inoculadas, pero
con el mismo tamaño de población final. Hanseniaspora presenta un aumento de la población hasta 106 cel/ml para disminuir a valores de 103-104 cel/ml al final de la fermentación.
En bacterias lácticas se obtuvieron concentraciones
del orden de 101-102 cel/ml, excepto a final de la fermentación
no inoculada y no sulfitada que presentó un aumento hasta
104 cel/ml. En este caso se pudo confirmar el inicio de la fermentación malo-láctica. En el caso de bacterias acéticas las
cuatro fermentaciones experimentan un descenso de la población de 105 cel/ml en el inicio de la fermentación hasta 103104 cel/ml en el vino final.
4. CONCLUSIONES
Se ha podido observar que ambas técnicas tienen
gran utilidad para ser utilizadas en el seguimiento de las poblaciones de microorganismos durante la fermentación alcohólica. La principal ventaja de la PCR-Q es que permite la
identificación y cuantificación de microorganismos con una
elevada especificidad y sensibilidad. Es una buena técnica
para hacer análisis de rutina por su gran rapidez. La técnica
de la DGGE, en cambio no es cuantitativa, pero permite diferenciar especies en una matriz compleja como puede ser el
vino. Es decir en un caso observamos la diversidad microbiológica, mientras que en la otra identificamos y cuantificamos unos organismos bien definidos. Adicionalmente, ambas
son técnicas independientes de cultivo, lo que permite anali-
ISBN 978-84-690-6060-5
zar muestras rápidamente y sin la posible selectividad que
impone el crecimiento en medio de cultivo para algunas especies. Una limitación es la posible diferenciación entre microorganismos vivos y muertos, aspecto sobre el que
estamos trabajando.
5.BIBLIOGRAFIA
1. MILLET, V.; LONVAUD FUNEL, A. 2000. The viable but
non-culturable state of wine microorganisms during
storage. Lett. Apll. Microbiol. 30: 136-141.
2. HIERRO, N.; ESTEVE-ZARZOSO, B.; GONZÁLEZ, A.;
MAS, A. GUILLAMON, JM. 2006. Real-Time Quantitative PCR (QPCR) and Reverse Transcription-QPCR
for Detection and Enumeration of Total Yeast in Wine.
Appl. Environ. Microbiol. 72 (11): 7148-7155.
3. LOPEZ, I.; RUIZ-LARREA, F.; COCOLIN, L.; ORR, E.;
PHILSTER, T.; MARSHALL, M.; VANDERGHEYNST, J.;
MILLS, D. 2003. Design and Evaluation of PCR Primers for Análisis of Bacterial Populations in Wine by
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis. Appl. Environ. Microbiol. 69(11): 6801-6807.
4. GONZÁLEZ, A.; HIERRO, N.; POBLET, M.; MAS, A.;
GUILLAMÓN, JM. 2006. Enumeration and detection of
acetic acid bacteria by real-time PCR and nested
PCR. FEMS Microbiol. Lett. 254: 123-128.
5. SANDHU, G.; KLINE, B.; STOCKMAN, L.; ROBERTS, G.
1995. Molecular Probes for Diagnosis of Fungal Infections. J. Clin. Microbiol. 33(11): 2913-2919.
6. MEROTH, C.; WALTER, J.; HERTEL, C.; BRANDT, M.;
HAMMES, W. 2003. Monitoring the Bacterial Population Dynamics in Sourdough Fermentation Processes
by Using PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis. Appl. Environ. Microbiol. 69(1): 475-482.
6. AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo ha sido financiado por los proyectos AGL2004-02307/ALI y AGL2004-07494-C02-02/ALI
del Ministerio de Educación y Ciencia.
57
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ANÁLISIS DE LA CONJUGACIÓN DE LEVADURAS HOMOTÁLICAS DURANTE LA
FERMENTACIÓN DE MOSTO
Jesús Ambrona1, J. A. Regodón2, Manuel Ramírez1
1
Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad de Extremadura, 06071 Badajoz. Tel: 924289426. Fax: 924289427
2
Resumen:
Departamento de Química Analítica, Facultad de Ciencias, Universidad de Extremadura, 06071 Badajoz.
Las poblaciones naturales de levaduras vínicas presentan un alto nivel de homocigosis, lo que hasta ahora se había
explicado mediante el modelo de “renovación genómica” propuesto por Mortimer (1994). Este estudio muestra que la frecuencia
de conjugación de levaduras del mismo clon-espora o diferentes tétradas es muy baja. Existe además una restricción en la
conjugación de levaduras de la misma tétrada como consecuencia de la distancia entre el gen MAT y su centrómero. La
velocidad de la tendencia a la homocigosis depende de la distancia entre el gen en cuestión y su respectivo centrómero. Este
fenómeno es interesante desde el punto de vista tecnológico porque puede provocar cambios indeseables en las propiedades
de levaduras vínicas asociadas al ecosistema viñedo-bodega.
Palabras clave: Renovación genómica, homotalica, conjugación, levadura.
1. INTRODUCCIÓN
Muchas cepas silvestres de S. cerevisiae son homocigóticas para muchos genes. Esto ha sido explicado por
el mecanismo de renovación genómica propuesto por Mortimer[1], según el cual las células haploides homotálicas se
vuelven diploides homocigóticas mediante cambio de tipo sexual y conjugación con células hermanas procedentes de la
misma espora. De esta forma se eliminan los alelos letales
recesivos o que disminuyen la viabilidad, ya que las nuevas
células homocigóticas para alelos que mejoren la viabilidad
pueden sustituir a la cepa original. La esporulación necesaria para la renovación genómica en levaduras vínicas podría
ocurrir al final de la vinificación o incluso durante el crecimiento vegetativo[1, 2]. Esto ha sido utilizado en laboratorio
para mejorar levaduras y obtener cepas con mayor viabilidad
y por tanto más útiles en industria[2]. En este trabajo estudiamos el comportamiento sexual de las levaduras vínicas en
un medio natural como el mosto de uva en fermentación, analizando la posible tendencia a la homocigosis, tras el proceso
de esporulación y conjugación preferencial entre las levaduras procedentes de la misma espora [1], o durante el crecimiento vegetativo a lo largo de la fermentación por
recombinación mitótica [3]; o si ocurre lo contrario, una tendencia a la heterocigosis (o mantenimiento de la misma)
como consecuencia de la conjugación aleatoria entre levaduras procedentes de esporas distintas.
58
Cepas de levadura: SMR10-11D (MATα/MATa,
HO/HO, SMRR/SMRR, (k2+)) es una levadura vínica killer,
resistente a sulfometurón metilo. SMR10-11DNK
(MATα/MATa, HO/HO, SMRR/SMRR, (k20)) es una levadura
no killer obtenida a partir de SMR10-11D. YMR107w (mat a,
ho, his3, leu2, met15, ura3, ymr107::G418R) es una levadura
haploide de laboratorio obtenida de EUROSCARF (Europe-
an Saccharomyces crevisiae Archive for Functional Analysis). E339 (MATα/MATa, HO/HO, ura3-52/ura3-52,
ymr107∆::G418R/ymr107∆::G418R, (k20)) es un clon espora
no killer procedente del cruce SMR10-11DNK×YMR107w.
H77 (MATα/MATa, HO/HO,URA3/ura3∆0 SMRR/smrS,
ymr107∆::G418R/ILV2, (k20)) es un híbrido heterocigótico no
killer procedente del cruce SMR10-11DNK×E339. Todas
estas cepas vínicas fueron construidas para conseguir un
alto porcentaje de esporulación y viabilidad de las esporas y
marcadores genético apropiados para analizar la frecuencia
de conjugación entre las diferentes levaduras que conviven
en el mosto en fermentación.
Análisis de la conjugación entre células haploides
procedentes de diferentes tétradas: se realizó con las cepas
SMR10-11DNK y E339. Se mezclaron en una placa de YEPD
con un micromanipulador 40 tétradas intactas de cada cepa.
La porción de YEPD con las tétradas fue inoculada en mosto
estéril. Como control se inoculó mosto con 50 µl de SMR1011DNK y 50 µl de E339. Las células que presenten fenotipo
SMRR G418R se habrán originado por conjugación de células
de diferentes tétradas.
Análisis de la conjugación entre células haploides de
una misma tétrada: se realizó con el híbrido H77. Se colocaron
40 tétradas intactas en una porción de una placa de YEPD con
ayuda de un micromanipulador, la cual fue inoculada en mosto
estéril. Como control se inoculó mosto estéril con 50 µl de un
cultivo de H77. Las células que presenten fenotipo SMRR
G418R se habrán originado por conjugación de células de diferentes clones esporas de la misma o de diferentes tétradas.
3. RESULTADOS
3.1. Análisis de la conjugación entre células haploides
procedentes de diferentes tétradas
Previamente comprobamos que ambas cepas esporulaban bien (por encima de un 70% de tétradas) y que la
ISBN 978-84-690-6060-5
viabilidad de sus esporas era alta (por encima de un 91%).
Los resultados de las frecuencias de marcadores a lo largo
de las fermentaciones se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Análisis de marcadores a lo largo de la fermentación de
mosto inoculado con tétradas y células vegetativas de
SMR10-11DNK (SMRR) y E339 (G418R)
El mosto inoculado con tétradas tardo más en iniciar
la fermentación debido al tiempo necesario para la germinación de las esporas. Sólo detectamos un 2% de células heterocigóticas (SMRR G418R) en la fermentación inoculada con
tétradas, es decir que la conjugación entre esporas procedentes de diferentes tétradas ocurre en muy baja frecuencia.
cadores será como se muestra en la Fig 1A. La conjugación
de estas esporas entre sí dará como resultado la formación
de levaduras heterocigóticas en un 100%. Si se produce recombinación entre el gen MAT y su centrómero (frecuencia
de 0.3x0.5), Fig 1B, o la recombinación entre el gen ilv2 y su
centrómero (frecuencia 0.7x0.5), Fig 1C, la conjugación de
las esporas entre sí dará como resultado un 50% de células
heterocigóticas. Si se produce recombinación tanto entre ilv2
y su centrómero como entre MAT y su centrómero, (frecuencia 0.5x0.3), la frecuencia de marcadores será la que se
muestra en la Fig 1D. Teniendo en cuenta todas las posibilidades calculamos una frecuencia teórica de heterocigóticos
de 0.7125 la cual es muy semejante a la encontrada al comienzo de la fermentación del mosto inoculado con tétradas.
Fig. 1. Posibles segregaciones de marcadores en la cepa H77 tras
un proceso de esporulación
3.2. Análisis de la conjugación entre células haploides
de una misma tétrada
Previamente comprobamos que la cepa esporulaba
bien (por encima de un 72% de tétradas) y que la viabilidad
de sus esporas era alta (por encima de un 91%). Los resultados de las frecuencias de marcadores a lo largo de la fermentación se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Análisis de marcadores a lo a lo largo de la fermentación
de mosto inoculado con tétradas y células vegetativas de H77
(ymr107D::G418R /ymr107, ILV2(smrS) /ILV2(SMRR)).
El mosto inoculado con tétradas tardo más en iniciar la fermentación debido al tiempo necesario para la germinación de las esporas. En la fermentación inoculada con
células vegetativas no detectamos células homocigóticas, es
decir que no se han producido fenómenos de esporulación ni
recombinación mitótica a lo largo de la misma. En el mosto
inoculado con tétradas se observó una baja proporción de
homocigóticos, es decir que no se produjo conjugación entre
células hermanas procedentes de la misma espora, sino más
bien una conjugación rápida (sin dar tiempo a que se produzca cambio de tipo sexual) entre células de distinto tipo sexual procedentes de la misma tétrada pero de distinta espora.
Teniendo en cuenta que la conjugación entre esporas de diferentes tétradas ocurre en baja frecuencia, estos
resultados se pueden explicar de la siguiente forma: los marcadores G418R y SMRR se encuentran ligados en fase de repulsión a 63cM del centrómero en el cromosoma XIII. MAT
se encuentra a 30cM del centrómero en el cromosoma III. Si
no se producen fenómenos de recombinación (lo que ocurrirá con una frecuencia de 0.5x0.7) la segregación de mar-
4. CONCLUSIONES
La esporulación y la restricción en la conjugación
conducen a una pérdida de heterocigosidad en las cepas homotálicas de S. cerevisiae debido a la distancia entre el gen
MAT y su centrómero. La rapidez de esta pérdida de heterocigosidad depende de la distancia entre el marcador y su centrómero, siendo más rápida para aquellos genes no ligados.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. MORTIMER, R.K., et al. 1994. Genome renewal: a new
phenomenon revealed from enetic study of 43 strains
of Saccharomyces cerevisiae derived from natural
fermentation of grape musts. Yeast.. 10: p. 1543-1552.
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changes in Saccharomyces cerevisiae during wine fermentation. Appl. Environ. Microbiol., 66(5): p. 2057-2061.
59
ISBN 978-84-690-6060-5
EFECTO DE LA ADICIÓN DE ÁCIDOS GRASOS SOBRE LA ADAPTACIÓN DE
Saccharomyces cerevisiae A BAJAS TEMPERATURAS
Marian Redón, José Manuel Guillamón, Albert Mas, Nicolas Rozès
Departamento de Bioquímica y Biotecnología, Facultat d’Enologia, Universitat Rovira i Virgili, C/ Marcel.lí Domingo, s/n, Tarragona 43007.
Email: [email protected]
Resumen:
Las fermentaciones a bajas temperaturas mejoran el perfil organoléptico de los vinos blancos o rosados. La
rehidratación de Levadura Seca Activa se realiza a temperaturas elevadas (37ºC) y su inoculación a bajas temperaturas produce
choque térmico y mortalidad elevada. Uno de los primeros sensores del cambio de temperatura son los cambios lipídicos de la
membrana plasmática. Una temperatura de 13ºC supondría una rigidificación de la membrana. Las levaduras responderían
aumentando la síntesis de ácidos grasos insaturados que al igual que el ergosterol necesitan oxígeno para su síntesis. Esta
situación puede ocasionar un problema desde el punto de vista enológico ya que en vinificación en blanco estamos bajo
condiciones de hipoxia. En el presente trabajo se ha estudiado como modificar la composición de la membrana lipídica mediante
la adición de diferentes ácidos grasos (C12, C16:1, C18:3, C18) en el medio de crecimiento. Tras esta adición se analizó la
composición lipídica global de la célula (ácidos grasos, esteroles y fosfolípidos) y el efecto de esta composición sobre la
capacidad fermentativa y viabilidad celular. Los resultados muestran que los ácidos grasos adicionados son incorporados por
las células incrementando su concentración celular. También existe buena correlación entre determinados lípidos y la capacidad
fermentativa a bajas temperaturas.
Palabras clave: Saccharomyces cerevisiae, ácidos grasos, ergosterol, fosfolípidos, bajas temperaturas, vitalidad.
1. INTRODUCCIÓN
60
Saccharomyces cerevisiae es la levadura responsable de la fermentación alcohólica. Hoy en día en la mayoría de bodegas se realizan inoculaciones con levadura Seca
Activa para asegurar la obtención de fermentaciones homogéneas y evitar posibles paradas de fermentación. Las fermentaciones a bajas temperaturas mejoran el perfil
organoléptico de los vinos blancos o rosados [1-4] pero las levaduras se encuentran en condiciones adversas para su desarrollo lo que puede provocar problemas tanto al inicio de la
fermentación (fases de latencia largas) o a la finalización (fermentaciones lentas o paradas). Las bajas temperaturas afectan al metabolismo lipídico lo que se puede traducir en
cambios a nivel de la composición lipídica de la membrana
plasmática de las levaduras modificando por consecuencia
su fluidez.
La membrana plasmática está formada principalmente por lípidos. Aproximadamente el 75% de los lípidos de
la membrana son fosfolípidos que forman una bicapa lipídica
debido a su carácter amfipático. Las colas de ácidos grasos
hidrofóbicas dirigidas hacia el interior y su grado de insaturación afectarán directamente el estado físico de la membrana.
Para una misma composición lipídica a temperatura óptima
de crecimiento (25ºC), los fosfolípidos se encuentran en estado fluido mientras que una bajada de temperatura supondría una rigidificación de la membrana. Frente a esta
situación las levaduras en condiciones de aerobiosis sintetizarían ácidos grasos insaturados (UFA) mientras que en condiciones de hipoxia como es el caso de vinificaciones en
blanco existe un mecanismo alternativo como la producción
de ácidos grasos de cadena media (MCFA) que podrían sustituir los UFA y por consecuencia mantener un estado de flui-
dez correcto de la membrana. Sin embargo altas concentraciones de MCFA son tóxicas para las células con peligro de
producir fermentaciones lentas o incluso paradas [5].
Los restantes 20% de los lípidos de la membrana
están constituidos por moléculas de esteroles. El ergosterol
es el esterol característico de los hongos y también necesita
la presencia de oxígeno para su síntesis. A parte de ser imprescindible para la viabilidad de la levadura [6], el ergosterol tiene un papel de regulador del estado físico de la
membrana [7].
El objetivo de este estudio es ver si la adición de
ácidos grasos de estructura diferente pueda mejorar la vitalidad de las levaduras a baja temperatura modificando su composición lipídica.
Se han realizado crecimientos con medio de cultivo
óptimo (YEPD) inoculados con la levadura seca activa QA23
(Lallemand, S.A.) overnight con agitación a una temperatura
de 25ºC. Se ha determinado el efecto de la adición de cuatro
diferentes ácidos grasos: C12, C16:1, C18:3 y C18, (0.5mM)
sobre la viabilidad (contaje de las colonias en medio sólido)
y vitalidad de las levaduras a bajas temperaturas (13ºC). La
capacidad fermentativa (vitalidad) se estudió mediante la determinación de la disminución de la impedancia por el método indirecto causado por la reacción entre el CO2 producido
por las levaduras con el KOH presente en el vial del aparato
comercial denominado Bac-Trac 4300(SY-LAB). También se
ha estudiado el efecto de la adición de los ácidos grasos
sobre la composición lipídica global de la célula. A partir de
una biomasa de 5·10 8 cel/ ml se ha analizado la composición en ácidos grasos totales de las células por cromatogra-
ISBN 978-84-690-6060-5
fía de gases [8], la de los fosfolípidos y lípidos neutros por
cromatografía en capa fina (TLC). También se ha determinado el contenido total en fósforo de los fosfolípidos [9].
3. RESULTADOS
3.1. Efecto de los ácidos grasos sobre la viabilidad y la
vitalidad
La adición de los diferentes ácidos grasos en el
medio de crecimiento de las levaduras no produjo una mejora
significativa de la viabilidad ni de la vitalidad a 13 ºC sino que
incluso tuvo un efecto perjudicial sobre la capacidad fermentativa de las levaduras (Fig.1).
Figura 1. Capacidad fermentativa de las levaduras a 13ºC tras
crecimiento en YEPD con la adición de diferentes ácidos grasos.
nido en ergosterol no aumentara mientras que los ésteres de
esteroles se acumulaban (Tabla 1). De los resultados obtenidos, parece que el C18 provocaría una inhibición de la síntesis del ergosterol afectando por consecuencia la vitalidad de
las células. Sorprendentemente la adición de ácido laurico
(C12) incremento significativamente el porcentaje en ergosterol en las células. Con la presencia de ácidos grasos, el
contenido total en triacilgliceroles (TG) descendió excepto en
el caso de la adición de C18:3. Wagner y Daum [10] observaron que los TG eran también importantes lípidos de reserva
en las células, los cuales necesita S.cerevisiae para la formación de precursores como PA y diacilgliceroles.
Tabla 1. Composición en esteroles tras crecimiento en YEPD con
adición de diferentes ácidos grasos. Los esteroles se expresan en
porcentajes de la concentración total de esteroles ± SEM. TG: triacilgliceroles. nd: no detectado, * = diferencias significativas p ≤ 0.05.
3.2.3. Composición en fosfolípidos
3.2. Efecto de los ácidos grasos sobre la composición
lipídica
3.2.1. Composición en ácidos grasos
Todos los ácidos grasos suplementados (C12,
C16:1, C18 y C18:3) fueron asimilados por las células incrementado su concentración celular respecto al control (Fig. 2).
Además esta adición de ácidos grasos externa provocó una
disminución en la producción total en ácidos grasos por parte
de la célula. Hubo una asimilación de los diferentes ácidos
grasos aunque a la vez una inhibición selectiva de otros ácidos grasos pero manteniendo el porcentaje en UFA.
Figura 2. Porcentaje en ácidos grasos de cadena media (MCFA),
ácidos grasos saturados (SFA) e insaturados (UFA)
3.2.2. Composición en lípidos neutros
El contenido en esteroles totales disminuyó drásticamente en presencia del ácido esteárico (C18) (Tabla 1).
También se observó que esta adición provocó que el conte-
También se detectaron cambios en la composición
en fosfolípidos debidos al efecto de la suplementación de ácidos grasos. El contenido total en fosfolípidos se incrementaba con la adición de C12 y disminuía con la de C18:3.
Respecto al porcentaje relativo de cada fosfolípido, la adición
de C18 produjo un mayor contenido en PC y menor en PS,
PE; CL y PA que el control. No obstante el principal fosfolípido
cuyo porcentaje fue afectado por la adición de cualquier ácido
graso fue la PS.
Tabla 2. Composición fosfolipídica tras crecimiento en YEPD y
adición de diferentes ácidos grasos. Los fosfolípidos se expresan
como porcentajes de la concentración total en fosfolípidos ± SEM.
PI: phosphatidylinositol, PS: phosphatidylserine. PE:
phosphatidylethanolamine, PC: phosphatidylcholine, CL: cardiolipin,
PA: phosphatidic acid. * = diferencias significativas p ≤ 0.05
4. CONCLUSIONES
Para dar sentido a los datos obtenidos de análisis
complejo se realizó un análisis de correlación a través del
cual se vio que existe una correlación positiva entre el contenido en fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina y la capacidad
fermentativa de las levaduras a bajas temperaturas.
61
ISBN 978-84-690-6060-5
5. BIBLIOGRAFÍA
1. LLAURADÓ J., CONSTANTÍ M., ROZÈS N., MAS A.
2002. Low temperature alcoholic fermentation in high
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2. BELTRAN G., TORIJA M.J., NOVO M., FERRER N., POBLET M., GUILLAMÓN J.M., ROZES N., MAS A. 2002.
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6. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado por el proyecto del
gobierno español AGL2004-02307/ALI
ISBN 978-84-690-6060-5
ECOLOGÍA Y DIVERSIDAD DE BACTERIAS LÁCTICAS Y PRESENCIA DE AMINAS
BIÓGENAS EN VINOS DE CRIANZA BIOLÓGICA
M. Victoria Moreno-Arribas, M.Carmen Polo
Resumen:
Instituto de Fermentaciones Industriales, CSIC. Juan de la Cierva, 3. 28006 Madrid. E-mail: [email protected]
En este trabajo se ha investigado la ecología y diversidad de bacterias lácticas y la presencia de aminas biógenas
en 36 muestras de vinos de crianza biológica durante su elaboración industrial. Se ha comprobado que la fermentación
maloláctica tiene lugar en las primeras fases de la crianza biológica. Se ha detectado una baja incidencia y población de bacterias
lácticas, pero la diversidad de las especies bacterianas aisladas es mayor que la que se ha descrito previamente en la
bibliografía. Se ha determinado también la capacidad de los aislados de producir aminas biógenas, comprobándose que L.
zeae, además de ser una de las especies predominantes durante la crianza biológica, es también una de las principales
productoras de putrescina. Las concentraciones de aminas biógenas detectadas en los vinos de crianza biológica estudiados
son bajas, lo que puede ser debido a los bajos niveles de aminoácidos presentes en los vinos de crianza biológica.
Palabras clave: vinos de crianza biológica; bacterias lácticas; aminas biógenas; actividad aminoácido descarboxilasa
1. INTRODUCCIÓN
Desde el punto de vista microbiológico, la elaboración de vinos de crianza biológica implica fundamentalmente
el desarrollo de levaduras que forman el denominado ‘velo’ o
‘flor’ en la superficie del vino. Las bacterias lácticas también
pueden desarrollarse y contribuir a las características de los
vinos de crianza biológica, sin embargo su presencia y papel
en este proceso enológico ha recibido muy poca atención [1].
En este trabajo se ha estudiado la ecología y diversidad de bacterias lácticas y la presencia de aminas biógenas
durante la elaboración y crianza de treinta y seis muestras
de vinos de crianza biológica.
Se analizaron las siguientes muestras de vinos, que
se elaboraron en distintas bodegas de la zona de Jerez: 6
vinos jóvenes, 10 vinos ‘sobretabla’, y 20 muestras sometidas
a envejecimiento según el sistema de ‘criaderas y solera’, que
incluían 4 vinos envejecidos durante 1 año (3ª criadera), 6
vinos envejecidos durante 2 años (2ª criadera), 9 vinos envejecidos entre 3-5 años (1ª criadera) y 1 vino envejecido durante 10 años (solera). Para el aislamiento de bacterias
lácticas, se han empleado tres procedimientos distintos. En el
primero, las muestras y diluciones de las mismas, se inocularon directamente en medios de cultivo específicos, como son
el medio MRS y el medio MLO. En los otros dos procedimientos, se llevó a cabo un proceso previo de enriquecimiento
en medio líquido. Las cepas de bacterias lácticas se identificaron mediante análisis de la secuencia que codifica para la
subunidad 16S del ADN ribosomal. La descarboxilación de
aminoácidos se determinó empleando el método descrito por
Maijala [2]. El análisis de aminas biógenas y aminoácidos se
realizó empleando la metodología descrita previamente por
Marcobal et al. [3] y Moreno-Arribas et al. [4], respectivamente.
3. RESULTADOS
La tabla 1 muestra la población residual de bacterias lácticas detectada en todos los vinos analizados. En los
vinos jóvenes, la población fue baja, con valores máximos de
102 ufc/ml. Durante la crianza biológica, únicamente se detectaron bacterias lácticas en los vinos de los dos primeros
años de envejecimiento, siendo los vinos de la 3ª criadera (1
año de envejecimiento) los que presentaron la máxima población bacteriana (104 ufc/ml). Se han aislado 31 cepas de
bacterias lácticas a partir de 16 de las 36 muestras de vinos
analizadas (Tabla 1). La diversidad de las especies identificadas ha dependido del tipo de vino. En los vinos jóvenes
predominaron las especies Lactobacillus hilgardii y L. plantarum mientras que L. zeae y Leuconostoc mesenteroides
fueron dominantes en los sobretabla y en las criaderas. El
número de cepas con capacidad de producir aminas biógenas se muestra también en la Tabla 1. De las 31 cepas examinadas, 6 mostraron actividad aminoácido descarboxilasa.
Algunas de ellas, procedían de los vinos sobretabla (20% de
los aislados) y, especialmente de los vinos envejecidos durante 2 años. Se ha comprobado que L. zeae, además de
ser una de las especies predominantes durante la crianza
biológica, es una de las principales productoras de putrescina. La concentración de aminas biógenas en los vinos estudiados se muestra en la tabla 2. No se ha detectado la
presencia de aminas biógenas en los vinos jóvenes, mientras que las aminas histamina, tiramina, putrescina y cadaverina se detectaron en los sobretabla y en los vinos durante
la crianza biológica.
Las concentraciones de aminas biógenas detectadas en los vinos estudiados son bajas, especialmente si se
compara con otros tipos de vinos, como es el caso de los
vinos tintos. Este hecho puede ser debido a los bajos niveles
de aminoácidos presentes en los vinos de crianza biológica
(Tabla 2).
63
ISBN 978-84-690-6060-5
Tabla 1. Población residual de bacterias lácticas, especies aisladas y cepas con actividad aminoácido descarboxilasa
nd: no detectado
Tabla 2. Valores medios, desviación estándar (SD) y rango de la concentración de aminas biógenas y aminoácidos (mg/L) en los vinos
nd: no detectado
4. BIBLIOGRAFÍA
64
1. SUÁREZ, J.A., CALLEJO, M.J., COLOMO, B. 1994. Lactic acid production in Sherry-type wines from the
Rueda Appelllation of Origin Region. Bull ’OIV 755756, 15-24
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acid composition of the different nitrogenous fractions during the aging of wine with yeast. J. Agric.
Food Chem., 46, 4042-4051
5. AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen la financiación del Ministerio de Educación y Ciencia para la ejecución del proyecto
AGL2006-04514/ALI y la asistencia técnica de Gracia García. Igualmente agradecemos a las Bodegas por habernos
suministrado los vinos de crianza biológica empleados en
este estudio.
ISBN 978-84-690-6060-5
EVALUACIÓN IN VITRO DEL EFECTO DE NUEVOS FUNGICIDAS SOBRE LA FLORA
LEVADURIFORME HABITUAL DE LA UVA
José María Cayuela2, Adela Martínez-Cacha2, Paula Payá1, José Oliva1,
Miguel Ángel Cámara1, Alberto Barba1.
1
Dpto. Química Agrícola, Geología y Edafología. Universidad de Murcia. Campus de Espinardo, 30100, Murcia. Telf. 968367482, e-mail: [email protected]
2
Dpto. Tecnología de los Alimentos y Nutrición. Universidad Católica San Antonio (UCAM). Campus de los Jerónimos, 30107, Guadalupe (Murcia).
Resumen:
La presencia de residuos de fungicidas puede modificar la población microbiana de la planta y el suelo, llegando a
afectar al crecimiento y la viabilidad de algunas levaduras, que terminarán por alterar el proceso de fermentación del mosto.
También, la modificación de la flora levaduriforme puede conducir a alteraciones en las características organolépticas finales
del vino. En el presente estudio se ha evaluado el efecto inhibidor de seis fungicidas de reciente comercialización (Famoxadona,
Fenhexamida, Fluquinconazol, Kresoxim-metil, Quinoxifen y Trifloxistrobin) sobre el crecimiento de Sacharomyces cerevisiae,
Hanseniaspora uvarum, Dekkera bruxellensis, Zygosacharomyces rouxii y Torulaspora delbrueckii, levaduras habitualmente
presentes en la flora natural inicial de la uva y el mosto. El efecto se ha medido mediante la determinación de halos de inhibición
de las distintas levaduras inoculadas sobre medio GPYA. Los resultados muestran ausencia de efecto inhibidor excepto en el
caso de kresoxin-metil sobre el crecimiento de Hanseniospora. uvarum. El crecimiento de esta levadura resulta inhibido a una
concentración de 400 ppm. Esta concentración supone el doble de la dosis recomendada por la casa comercial para el
tratamiento en viñedo del formulado que contiene este fungicida.
Palabras clave: fungicidas, levaduras, halos de inhibición.
1. INTRODUCCIÓN
La fermentación es una reacción microbiológica
compleja que constituye una etapa fundamental en la producción de vinos de calidad. Tradicionalmente, es un proceso
natural y espontáneo en el que se produce un constante desarrollo e interacción entre levaduras, bacterias y hongos filamentosos procedentes de la superficie de las uvas o de la
flora residente en el ambiente de la bodega [1, 2]. La diversidad y evolución de la población de levaduras contribuye a la
aparición de productos finales que condicionan de forma significativa a las características finales del vino [1, 3-5].
El desarrollo de la microflora salvaje inicial está sujeta a variaciones entre bodegas de la misma D.O. e incluso
de una vendimia a otra dentro de la misma instalación. Esta
variabilidad se manifiesta tanto en las especies aisladas,
como en el porcentaje en el que aparecen en la población y
puede ser el origen de alteraciones de las características sensoriales del vino o cuando menos de la pérdida de sus características típicas [1,6]. Existen factores de diferente
naturaleza que pueden provocar estas modificaciones: climáticos (temperatura, pluviosidad, etc.), geográficos, de producción (grado de madurez de la cosecha), daños físicos de
origen biológico o atmosférico y variedad de la uva [1, 7-8].
Aunque la influencia de los anteriores factores es de gran importancia, lo que más puede alterar las rutas bioquímicas de
la fermentación es el empleo de fungicidas, al provocar un
efecto selectivo sobre la población microbiana [9-10].
En este trabajo se evalúa el efecto in vitro de seis
fungicidas de reciente comercialización (famoxadona, fenhexamida, fluquinconazole, kresoxim-metil, quinoxifen y trifloxistrobin) sobre los que no existen datos acerca de su posible
interferencia en el crecimiento de levaduras habitualmente
aisladas en los procesos de vinificación.
2.1. Levaduras empleadas en el ensayo
Las levaduras estudiadas han sido: Saccharomyces cerevisiae (CECT 1942), Dekkera bruxellensis (CECT
1009), Hanseniaspora uvarum (forma imperfecta no esporógena: Kloeckera apiculata) (CECT 11107), Zigosaccharomyces rouxii (CECT 1232) y Torulaspora delbrueckii (CECT
10651).
2.2. Productos fitosanitarios evaluados
Los productos fitosanitarios evaluados han sido:
Equation Pro GR (Famoxadona 22,5%), Teldor WG (Fenhexamida 50%), Castellan GD (Fluquinconazol 25%), Stroby
WG (kresoxim-metil 50%), Arius SC (Quinoxifen 25%) y Flint
WG (Trifloxistrobin 50%). Las concentraciones empleadas en
el estudio han sido dos veces la concentración recomendada
en el modo de empleo.
2.3. Metodología analítica
Técnica de difusión en disco. Se ha determinado el
efecto de los fungicidas objeto de estudio sobre el crecimiento de las distintas levaduras en la superficie de medio
GPYA midiendo los halos de inhibición. Los análisis se han
realizado por duplicado para cada producto fitosanitario a una
concentración 2 veces superior a la concentración recomen-
65
ISBN 978-84-690-6060-5
dada según el modo de empleo del preparado comercial. Las
placas con medio GPYA se han inoculado superficialmente
mediante inundado con 2 ml de una suspensión de levaduras
en medio GPY (0.36 unidades de absorbancia) retirándose
el exceso de líquido tras dos minutos espera. Los discos de
6mm de diámetro (Oxoid) se han cargado con 15 µl de las
correspondientes disoluciones de producto comercial esterilizados por filtración. Los discos se han colocado con una
densidad de 6 por placa incluyendo en todas ellas un blanco
y un fungicida de amplio espectro como referencia positiva.
Tras 48 horas de incubación a 25ºC se ha procedido a la medida de los radios de los halos de inhibición alrededor de los
discos.
3. RESULTADOS
El efecto de los productos fitosanitarios ensayados
sobre las distintas levaduras ha sido desigual aunque de
forma general no se ha apreciado inhibición del crecimiento
en superficie. Sólo se aprecia de forma clara un efecto inhibidor del crecimiento de H. uvarum en presencia de Kresoxinmetil a una concentración de 400ppm (2 veces la
concentración recomendada). Este efecto se manifiesta con
la aparición de un halo de inhibición de 1cm de radio (Fig. 1).
Este producto no manifiesta ningún efecto sobre el resto de
levaduras incluidas en el estudio.
Figura 1: Halos de inhibición de Estrobi kreso (400ppm) sobre H.
uvarum
Esta misma especie junto con S. cerevisiae es ligeramente inhibida por el formulado comercial Flint WG (trifloxistrobin 50%), concentración ensayada de 300ppm aunque
el halo de inhibición es inferior a 1 mm.
Estos resultados, a falta de confirmación del efecto
sobre el crecimiento en medio líquido, demuestran la ausencia de efectos inhibitorios de los fitosanitarios estudiados
sobre la flora habitual en los procesos de vinificación. Los valores ensayados han sido muy superiores a los LMRs legislados por España y la UE para uva de vinificación.
Tabla 1. Longitud del radio del halo de inhibición.
66
4. CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos concluyen una falta de influencia de los distintos fitosanitarios ensayados en el proceso de fermentación. Aun a concentraciones superiores al
doble de la recomendada no se observa inhibición del crecimiento en superficie de las levaduras ensayadas, excepto
sobre H. uvarum, especie que se ha mostrado más sensible
frente a Kresoxin-metil. La modificación del crecimiento de
esta especie no debe influir a priori en el proceso de fermentación y por tanto en las características finales del vino.
5. BIBLIOGRAFÍA
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de Murcia.
ISBN 978-84-690-6060-5
CONTRIBUCIÓN DE LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA REALIZADA POR
Oenococcus oeni Y Lactobacillus plantarum, A LA COMPOSICIÓN FENÓLICA NO
ANTOCIÁNICA DE VINOS TINTOS
M. Victoria Moreno-Arribas1, Teresa Hernández1, Isabel Estrella1, Fernanda Ruiz-Larrea2
1
2
Instituto de Fermentaciones Industriales, CSIC. Juan de la Cierva, 3. 28006 Madrid.
Departamento de Alimentación y Agricultura, Universidad de La Rioja, Av. Madre de Dios 51, 26006 Logroño. E-mail: [email protected]
Resumen:
En este trabajo se estudió el efecto de la fermentación maloláctica en la composición fenólica no antociánica de vinos
tintos. A partir de un vino de la variedad Tempranillo, se realizaron distintos experimentos de fermentación maloláctica
espontánea, a escala industrial. Además se llevaron a cabo inoculaciones con cuatro cepas de bacterias lácticas distintas
seleccionadas, dos de la especie Oenococcus oeni y otras dos de Lactobacillus plantarum, todas ellas cepas autóctonas de la
D.O.Ca. Rioja. Los experimentos se hicieron por duplicado en depósitos independientes, analizándose un total de 11 vinos. El
análisis de compuestos fenólicos se realizó por HPLC-PAD y HPLC-(ESI)MS. En todos los casos, la fermentación maloláctica
modificó la composición fenólica del vino, de forma diferente dependiendo de las bacterias lácticas implicadas.
Palabras clave: vino; bacterias lácticas; fermentación maloláctica; polifenoles no antocianicos
1. INTRODUCCIÓN
En la fermentación maloláctica (FML) de los vinos
intervienen diferentes géneros de bacterias lácticas, fundamentalmente Lactobacillus, Pediococcus y Oenococcus,
siendo, Oenococcus oeni la especie mayoritaria. [1].
Los compuestos fenólicos presentes en los vinos
contribuyen a sus características organolépticas, fundamentalmente al color, astringencia y amargor. Estos compuestos
tienen además propiedades antioxidantes, como captadores
de radicales libres, por lo que se les atribuye efectos beneficiosos para la salud. Existen referencias bibliográficas que
indican una reducción del contenido en antocianos y polifenoles totales de los vinos después de la FML [2], pero son
escasos los datos sobre la influencia en otro tipo de compuestos fenólicos.
En este trabajo se estudió el efecto de distintas especies y cepas de bacterias lácticas O. oeni y L. plantarum
sobre la composición fenólica no antocianica de un vino tinto
de la variedad Tempranillo, después de la FML. El objetivo
fue evaluar cómo la actividad metabólica de estas bacterias
puede alterar la composición fenólica del vino y determinar
las diferencias que pueden atribuirse a cada una de las cepas
utilizadas.
Se partió de un vino de la variedad Tempranillo (AF),
con el que se realizaron distintos experimentos de fermentación maloláctica a escala industrial. Una fermentación espontánea (MLFs) y a su vez se llevaron a cabo inoculaciones
con cuatro cepas distintas de bacterias lácticas seleccionadas, dos de la especie Oenococcus oeni (Oe-18 y Oe-159) y
otras dos de Lactobacillus plantarum (Lp-51 y Lp-39), todas
ellas, cepas autóctonas de la D.O.Ca. Rioja. Los experimen-
tos se hicieron por duplicado en depósitos independientes,
analizándose un total de 11 vinos.
La extracción de los compuestos fenólicos de los
vinos se realizó según lo descrito por Fernández de Simón
[3]. El análisis, identificación y cuantificación de los compuestos fenólicos, se realizó por HPLC-PAD y HPLC-(ESI)MS
[4].
3. RESULTADOS
Durante la FML no se observaron diferencias en el
grado alcohólico, acidez volátil o acidez total entre los distintos microorganismos, permaneciendo todos los vinos en rangos normales de pH y acidez volátil, y tal como se esperaba,
se observó una disminución de la acidez total.
En la Figura se muestra un cromatograma tipo, que
corresponde al vino después de la FML espontánea. (MLFs).
Se han identificado 39 compuestos fenólicos, hidroxibenzoicos, hidroxicinámicos, alcoholes, flavonoles, flavanoles y estilbenos, que se presentan detalladamente en la Tabla, junto
con sus concentraciones. Los números de los picos en la
tabla corresponden a los del cromatograma.
Se observó un comportamiento distinto entre O.
oeni y L. plantarum, encontrándose también diversidad dentro de cada grupo. En todos los casos, la fermentación maloláctica modificó la composición fenólica del vino,
comprobándose que algunas de las cepas seleccionadas
para este estudio, hidrolizan los isómeros trans de los esteres tartáricos de los ácidos cinámicos, lo que indica que estos
compuestos, son sustratos de las bacterias lácticas del vino.
A su vez, se detectó un incremento de la concentración de
ácidos hidroxicinámicos libres, lo que puede ser de interés
ya que estos compuestos están directamente relacionados
con la concentración de vinilfenoles en vinos. En la mayor
parte de los casos los isómeros cis se ven menos afectados.
67
ISBN 978-84-690-6060-5
Los compuestos hidroxibenzoicos parecen ser a los
que menos afecta la FML con las distintas cepas de bacterias
lácticas, y esto se observa más concretamente en los vinos
que se han inoculado con O-18 y Lp-39, que tienen concentraciones similares al de MLFs.
Es importante el aumento de las distintas formas de
resveratrol, que es más acusado en los isómeros trans, sobre
todo en los vinos que proceden de la fermentación espontánea (MLFs) y los de Oe-18.
Se observó, en algunos casos, un incremento de las
concentraciones de (+) catequina, (-) epicatequina, tirosol,
miricetina y quercetina, lo que puede contribuir a la calidad organoléptica y biológica de los vinos estudiados, por la implicación de estos compuestos en estas características. Las
procianidinas (dímeros y trímeros) sufren en general un aumento después de la FML.
Figura. Cromatograma del vino después de
la fermentación alcohólica (AF)
Tabla. Concentración (mg/L) de compuestos fenólicos no antocianicos de los vinos
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4. CONCLUSIONES
De los resultados de este trabajo se puede deducir
que las bacterias lácticas son capaces de hidrolizar los isómeros trans de los derivados tartáricos de los ácidos cinámicos, con la liberación de los correspondientes ácidos libres.
Como consecuencia de esto se ha de tener en cuenta la presencia indeseable de enzimas descarboxilasas que pueden
actuar sobre los ácidos libres formando vinilfenoles, responsables de aromas indeseables durante la elaboración del vino.
El aumento observado en la concentración de procianidinas, junto con el de catequina y epicatequina es importante, debido al papel que juegan estos compuestos en
los fenómenos de complejación con los antocianos, lo que influye muy directamente en el color de los vinos resultantes.
La microbiota natural del vino ha mostrado mayor
impacto en el contenido de algunos de estos compuestos en
los vinos, que las cepas de bacterias lácticas inoculadas seleccionadas.
Los compuestos fenólicos están involucrados en algunas actividades biológicas por su actividad de captura de
radicales libres, por lo que las diferencias en las concentraciones observados en los vinos sometidos a la FML con diferentes microorganismos, pueden dar lugar a diferencias en
la actividad antioxidante resultante. Por esta razón y de
acuerdo con los resultados obtenidos, se puede sugerir que
las bacterias lácticas que actúan en el vino pueden ser uno
de los factores que contribuyen a los potenciales beneficios
de los vinos en la salud.
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Chim. Acta (2006). 563,116-125.
6. AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen la financiación del Ministerio
de Educación y Ciencia para la ejecución del proyecto
AGL2006-04514/ALI y la asistencia técnica de Sergio Robredo. Igualmente agradecemos a las Bodegas Roda SA. por
habernos suministrado los vinos tintos.
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CONTROL DEL ÁCIDO MÁLICO MEDIANTE LA ACCIÓN CONJUNTA DE BACTERIAS Y
LEVADURAS SELECCIONADAS
Kenza Almabouada, Almudena Fernández-López, María Sancho, Enrique David Sancho
Resumen:
Departamento de Microbiología. ETSIAM, Universidad de Córdoba. Edificio Severo Ochoa, planta baja.
Campus Universitario de Rabanales. 14071-Córdoba. 957-212528, [email protected]
Los vinos finos de la Denominación de Origen de Montilla- Moriles no deben contener acido málico en la fase de
crianza, para evitar problemas de calidad organoléptica y de inestabilidad microbiológica. La fermentación maloláctica es una
desacidificación bacteriana del ácido málico, cuyo desarrollo en aquellos vinos es impredecible e inespecífico. Por otra parte,
existen levaduras capaces de transformar el ácido málico mediante la fermentación maloetanólica. En base a ello, el objetivo
del presente trabajo consiste en controlar la evolución del ácido málico, induciendo su degradación antes de que el vino joven
se transfiera a las botas de crianza. Para ello, se han seleccionado cepas de bacterias del ácido láctico y de levaduras vínicas
capaces de realizar las fermentaciones maloláctica y maloetanólica, respectivamente, además de otros parámetros selectivos.
Así mismo, se ha procedido a su caracterización empleando criterios taxonómicos, fisiológicos y moleculares. Por último, se ha
ensayado el efecto de una inoculación mixta, constituida por poblaciones seleccionadas de ambos tipos microbianos, para
inducir y controlar la evolución del ácido málico durante la vinificación.
Palabras claves: Saccharomyces cerevisiae, bacterias del ácido láctico, fermentacion maloetanólica, fermentación
maloláctica, ácido málico.
1. INTRODUCCIÓN
70
La evolución del ácido málico (0,8 – 1,5 g/l) durante
la elaboración de los vinos finos de crianza en la zona vitivinícola de Montilla-Moriles es bastante impredecible e inespecífica [1]. Este tipo de vinos no debe contener ácido málico
en la fase de envejecimiento, para evitar problemas de mala
calidad organoléptica e inestabilidad, lo que obliga a controlar los niveles de dicho ácido a lo largo de la vinificación. La
eliminación preferente del ácido málico, por vía biológica,
tiene lugar por medio de la fermentación maloláctica (FML)
[2], proceso llevado a cabo por las bacterias del ácido láctico
(BAL), que desacidifican el vino al transformar el ácido málico en ácido láctico y anhídrido carbónico.
Una forma general de controlar dicha fermentación,
en cualquier región vitivinícola, se basa en el empleo de inóculos bacterianos seleccionados; sin embargo, los resultados no suelen ser satisfactorios en muchas ocasiones. Por
otra parte, existe una segunda, conocida como fermentación
maloetanólica (FME) [3], menos importante y frecuente que la
FML, que permite a las levaduras transformar el ácido málico en etanol.
En consecuencia, el objetivo del presente trabajo
trata de la búsqueda de cepas de bacterias y levaduras autóctonas capaces de reducir o eliminar el contenido de ácido
málico de los mostos o vinos jóvenes, antes de que éstos
sean transferidos a las escalas de la crianza. Para ello, es
preciso seleccionar cepas de ambos tipos microbianos, estableciendo las condiciones operativas necesarias con el fin
de optimizar la degradación del ácido málico por medio de
un inóculo formado por una población mixta de levaduras y
bacterias del ácido láctico.
El aislamiento de las cepas de levadura (200 cepas;
medio YPD + tetraciclina 100 µg/ l) se realizó tanto durante la
fase fermentativa como de la crianza, mientras que el de las
cepas de bacterias del ácido láctico (200 cepas; medio MRS
+ jugo de tomate + cicloheximida 100 µg/l), solamente se
efectuó durante la fase fermentativa (campañas de 2005 y
2006). La identificación de las cepas de levadura se basó en
diferentes pruebas, tales como: morfología celular, crecimiento en lisina, asimilación de nitrato, fermentación de azúcares, tolerancia al litio, entre otras [4]. La identificación de las
bacterias del ácido láctico se basó en la tinción de Gram, reacción de la catalasa, fermentación de hidratos de carbono,
crecimiento a diferentes temperaturas, tolerancia a NaCl e hidrólisis de arginina [5].
Tras la identificación, se eligieron únicamente las
cepas de levadura pertenecientes a Saccharomyces cerevisiae y las cepas de bacterias del ácido láctico. Posteriormente, se procedió a seleccionar cepas de levadura, capaces
de efectuar la fermentación maloetanólica (YPD + 1 g/l ácido
málico, 28 ºC), así como cepas bacterianas que realizasen
la fermentación maloláctica. En este último caso, la prueba
tuvo lugar en un tampón (MES + 1 g/l ácido málico, 37 ºC),
lo que permitió seleccionar aquellas cepas que modificasen
más el pH en dicho medio. Se utilizó la cromatografía liquida
de alta resolución (HPLC) para determinar el contenido de
ácido málico de las muestras líquidas empleadas. Los ensayos de microvinificación se realizaron sobre mosto corregido
(75 - 100 mg/l metabisulfito potásico, pH 3,4 y 2 g/l de ácido
málico) y se utilizaron diversos tipos de inóculos (concentración total: 107 ufc/ml).
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3. RESULTADOS
La identificación de las cepas de levadura y de bacterias aisladas demostró la preponderancia de Saccharomyces cerevisiae (190 cepas, 95 % del total), razas cerevisiae
(en la fase fermentativa) y capensis (en la crianza), y de diversas bacterias del ácido láctico, predominando varias especies de Lactobacillus (140 cepas, 70 % del total), como L.
plantarum, L. hilgardii y L..casei. Como parte de la selección
primaria bacteriana se estudió la evolución del pH, en tampón
MES + ácido málico como única fuente de carbono. De las
140 cepas ensayadas, sólo el 40 % fue capaz de realizar parcial o totalmente la fermentación maloláctica (28 % modificaron el pH -entre 0,2 y 0,4 uds.de pH, y 12 % lo modificaron en
más de 0,7 uds.; 24 h). En los casos más favorables se apreció el cambio de pH a tiempos cortos (< 1 hora), (figura1). Se
encontraron cepas que realizaban la FML, degradando el
ácido málico (10 – 90 %, en 7 días).
Fig. 1. Evolución del pH de un medio tamponado (MES),
conteniendo ácido málico como única fuente carbonada,
inoculado con BAL. (cepa B -811)
Las Fig. 2 y 3 muestran, respectivamente, un ejemplo de la evolución del ácido málico y su correspondiente cromatograma de una de las cepas seleccionadas (B- 811).
Fig. 2. Evolución de los ácidos málico y láctico por la cepa B- 811,
en medio MES + ácido málico
La capacidad de las cepas de levadura autóctona
aisladas, para realizar parcialmente la FME fue muy escasa
(15 cepas, 8 % del total). Por otra parte, la degradación del
ácido málico (5 – 20 % del total) se producía mejor en
medio rico que en mosto (Fig. 4).
Fig. 4. Evolución del ácido málico por una levadura seleccionada
(L- 523)
Se realizaron ensayos de microvinificación empleando distintos inóculos, añadidos al comienzo de la fermentación: (i) levaduras seleccionadas, (ii) bacterias lácticas
seleccionadas, (iii) bacterias lácticas comerciales, y (iv) levaduras y bacterias lácticas autóctonas seleccionadas. Al
mismo tiempo, se estimó la viabilidad de la microbiota a lo
largo de cada ensayo. En todos los casos se observó una disminución de ácido málico, aunque con porcentajes diferentes. Los mejores resultados se consiguieron cuando el
inóculo estaba constituido por una población mixta de levaduras y bacterias. En este último caso, en ensayos realizados
con diferentes poblaciones de levaduras y bacterias, se consiguió una disminución media del ácido málico (60 % del contenido inicial), que se mantuvo constante a partir de los tres
días de la inoculación. El caso más favorable correspondió al
inóculo formado por las cepas L-523 y B-811, en el que se
logró una degradación del 95 % del contenido inicial, a los 7
días de la inoculación. La viabilidad de los cultivos bacterianos descendió gradual y rápidamente a partir de las 24 horas
de la inoculación, hasta mantenerse la población (<> 104/ml)
a las 72 horas. La población de levaduras sobrevivía a los
ocho días del comienzo del ensayo (> 105), iniciándose la
mortalidad de la misma a partir del sexto día (Fig. 5).
Fig. 5. Evolución de la densidad de población bacteriana (B-811)
y de levaduras(L-523) en mosto
Fig. 3. Consumo del ácido málico por una bacteria láctica
seleccionada (B- 811), en medio MES + ácido málico,
uno y siete días después de la inoculación
4. CONCLUSIONES
Los resultados indican varios hechos, tales como:
(i) existe un predominio de cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae, razas cerevisiae, durante el curso de la fase
71
ISBN 978-84-690-6060-5
fermentativa, y capensis, durante la crianza; así como de especies de Lactobacillus, durante la fase fermentativa; (ii) la
capacidad de realizar la FME, parcialmente, es muy escasa
en las levaduras vínicas, no obstante, se han seleccionado
cepas para ser utilizadas como inóculo; (iii) se han seleccionado especies de Lactobacillus, eficaces en la realización de
la FML; y (iv) la acción conjunta de levaduras y bacterias lácticas, empleadas como inóculo mixto, es una alternativa a
considerar de cara a inducir la disminución del contenido de
ácido málico de los mostos y vinos.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. CALERO, F. 1993. La Fermentación Maloláctica en la
zona vitivinícola Montilla-Moriles”: fisiología de las
bacterias implicadas e inducción de dicha fermentación a nivel industrial. Tesis doctoral, Universidad de
Córdoba
72
2. BENEDUCE L, SPANO G, VERNILE A, TARANTINO D ,
MASSA S, 2004. Molecular characterization of lactic
acid populations associated with wine spoilage, J.
Basic Microbiol. 44: 1,10-16.
3. REDZEPOVIC S, ORLIC S, MAJDAK A, KOZIMA B,
VOLSCHENK H, VILJOEN-BLOOM M. 2003. Diferencial
malic acid degradation by selected strains of Saccharomyces during alcoholic ferementation. Int. J.
Food Microbiol.
4. BARNETT JA, PAYNE RW, YARROW IJ. 1990. Yeast:
characterization and identificación, (2ª Ed.), Cambridge University Press, London.
5. AXELSSON L.T., 1993. Lactic acid bacteria: classification and physiology. In: Lactic Acid Bacteria. Salminen, S., Von Wright, A. (Eds.). Marcel Dekker, New
York, pp.1–64
ISBN 978-84-690-6060-5
MODELO MATEMÁTICO DE LOS EFECTOS DE ALGUNAS VARIABLES ENOLÓGICAS
SOBRE EL CRECIMIENTO DE LA LEVADURA VÍNICA
Almudena Fernández- López1, Rafaela Dios2, Enrique David Sancho1
1
Departamento de Microbiología. ETSIAM, Universidad de Córdoba. Edificio Severo Ochoa, planta baja. Campus Universitario de Rabanales.
14071-Córdoba. 957-212528, [email protected]
2
Resumen:
Dpto de Estadística, Econometría, Investigación Operativa y Organización de Empresas. Univ. de Córdoba.
La aplicación de un análisis matemático a la evolución de las poblaciones de levaduras durante la elaboración del vino,
podría ser útil para establecer un modelo del comportamiento y la variabilidad de las levaduras de la fermentación y del velo
como respuesta a los efectos de diversos parámetros enológicos (pH, temperatura y etanol, con o sin adaptación), sobre el
tiempo de generación (G), aplicando técnicas estadísticas propias de variables cuantitativas continuas. Los cálculos se
realizaron con el paquete estadístico Statistical Product and Service Solutions (12.0). Los resultados denotan la existencia de
subgrupos homogéneos de levaduraa, que corresponden a los diferentes estadíos (fermentación, postfermentación criaderas
y solera) de la elaboración de un vino fino de crianza. Esta observación podría ser considerada a la hora de seleccionar inóculos
autóctonos para ser utilizados a nivel industrial.
Palabras clave: Crecimiento, Etanol, Levaduras, Modelo matemático, Vino fino.
1. INTRODUCCIÓN
Las levaduras pueden crecer en unos rangos, más
o menos amplios, según las condiciones ambientales, con
unos niveles máximos, mínimos y óptimos de crecimiento. El
crecimiento de las levaduras durante la elaboración del vino
fino de crianza está afectado por numerosas variables, entre
las que destaca el etanol. La presencia de éste en el medio,
puede incrementar los efectos negativos que otros parámetros enológicos (temperatura, pH), ya poseen por sí mismos.
La influencia de la temperatura durante el curso de la fermentación alcohólica es compleja, ejerciendo diferentes efectos en función de la presencia de ciertos compuestos, que
pueden afectar a la fluidez de la membrana [1]. Además, el
pH tan ácido (<> a 3,3) al que se inicia la fermentación en la
zona de Montilla-Moriles, produce estreses que también se
ven potenciados por la presencia de etanol, a pesar de la homeostasis de la levadura para regular su pH [2].
La complejidad de los procesos biológicos aconseja
el iniciar su estudio de forma parcial. Es el caso del crecimiento microbiano, el cual ha sido estudiado mediante varios
modelos matemáticos [3]. Los modelos cuantitativos, proponen ecuaciones en base a una hipótesis sobre la naturaleza
del sistema y de los principales factores que lo controlan. A
pesar de ser modelos complejos y difíciles de obtener, presentan ventajas con respecto a los cualitativos, al ser empleados en la predicción del comportamiento del sistema
biológico bajo condiciones no experimentales. El modelo cinético para el crecimiento más difundido [4], establece una
relación funcional entre m, (tasa de crecimiento por unidad
de aumento de biomasa), y la concentración de un único nutriente limitante. El presente trabajo, estudia las posibles incidencias de los factores en el tiempo de generación (G),
mediante técnicas de modelización, inferencia y contrastación. Esta metodología nos permite estimar, para cada factor
analizado, el cambio en el crecimiento que cabría esperar
ante un incremento unitario de cada uno.
Se ha estudiado el efecto de diversos parámetros
de interés enológico (temperatura, pH, etanol) sobre G, de
diversas cepas aisladas a lo largo de las fases de la vinificación de la zona vinícola de Montilla-Moriles [inicio de la fermentación (Fi), final de la fermentación (Ft), fase
postfermentativa (Pf,), 3ª criadera (C3), y solera (So)]. Se crecieron las cepas en YPD, considerando dos temperaturas (20
y 28 ºC), dos pHs (4,0 y 6,8), y varias concentraciones de
etanol [2, 4 y 6 % (v/v)], con o sin adaptación previa de los
precultivos al etanol. Los datos obtenidos se han tratado aplicando técnicas estadísticas propias de variables cuantitativas continuas [5], con distintos enfoques: univariante, con
medidas descriptivas de posición y dispersión; bivariante,
contemplando las relaciones entre cada dos variables (grupo,
temperatura, pH y etanol), así como las posibles incidencias
de éstas sobre la variable objetivo (G); y multivariante, detactando las incidencias independientes que producen los
factores considerados en la variable objetivo. Los cálculos se
han llevado a cabo con el paquete estadístico SPSS 12.0.
3. RESULTADOS
3.1. Efectos de la temperatura
Los resultados obtenidos en el estudio del efecto
de la temperatura (20 y 28 ºC) se muestran en la Tabla 1.
Todos los grupos de levaduras crecieron más rápidamente
(menor G) a 28 ºC, siendo las levaduras de la fase de
crianza más lentas (mayor G) y con un mayor rango de crecimiento que las de fermentación y postfermentación, sobre
73
ISBN 978-84-690-6060-5
todo a 20 ºC. Los grupos Fi, Ft y Pf mostraron un comportamiento similar, con respecto al intervalo de temperatura estudiado; sucediendo lo mismo entre los grupos de la fase de
crianza (C3, So).
con los grupos Pi, Pt y Pf y otro con el C3 y So, de modo que
había diferencias entre ambos conjuntos, pero no entre los
grupos que componían cada conjunto (P= 0,00).
Tabla 1. Diferencias encontradas en las medias de los valores del
tiempo de generación, para los diferentes grupos, considerando
las dos temperaturas de estudio (20 y 28 ºC).
los distintos % de etanol (2, 4 y 6 v/v).
El modelo matemático estimado para el estudio de
la influencia de la temperatura sobre el tiempo de generación,
se presenta en la siguiente ecuación (Ec. 1):
La ecuación del modelo propuesto para el estudio
de la incidencia del etanol sobre G (Ec .3) es:
G= 271,053 + 28,307*Grupo - 7,539*Temperatura 0,586*Inter GrT
3.2. Efectos del pH
Los resultados para el estudio del pH (4,0 y 6,8) se
exponen en la Tabla 2, donde se muestra un menor G a pH
6,8, en todos los grupos. También, se observó un menor intervalo entre los valores de G, para los pHs estudiados, que
para las temperaturas, lo que indicó que ésta era un factor
de mayor incidencia sobre G. Los grupos Fi, Ft y Pf, mostraron un comportamiento similar al observado con los cambios
de Tª, lo que no sucedió en los grupos de la crianza (C3 y So).
los dos pHs estudiados (4,0 y 6,8).
El modelo matemático estimado para el estudio de
la influencia del pH sobre G (Ec. 2) es el siguiente:
G= 81,861 + 11,884*Grupo - 3,211*pH
3.3. Efectos del etanol
74
El estudio del efecto del etanol sobre G, se llevó a
cabo con cepas de levadura, crecidas en varias concentraciones de etanol [2, 4 y 6 % (v/v)]. Los resultados obtenidos
se representan en la Tabla 3. Se realizó un análisis de la varianza (ANOVA) para estudiar si había diferencias significativas en el tiempo de generación en los diferentes grupos.
Globalmente no se puede aceptar la igualdad de medias,
luego hay diferencias significativas considerando los 5 grupos, a un nivel inferior al 1 ‰. Estudiando las diferencias
entre parejas se establecieron dos conjuntos diferentes, uno
G= 57,804 + 10,661*grup o+ 13,086*Etanol + 1,176*Inter
GrEtanol
3.4. Adaptación al etanol
Se estudia el posible efecto de la adaptación de las
cepas al etanol, comparando G del apartado anterior (células
crecidas directamente en etanol), con células crecidas previamente en etanol (Tabla 4). Los resultados no mostraron diferencias apreciables en los valores medios de G, con y sin
adaptación al etanol.
tiempo de generación, para los diferentes grupos, considerando la
adaptación o no a etanol.
(EC. 4):
El modelo matemático estimado es el siguiente
G= 61,836 + 11,369* Grupo + 12,338*Etanol - 12,861*
Adaptación + 0,727* InterGrE
3.5. Influencia de las variables grupo, pH, temperatura y
etanol sobre G
Se estimó un modelo de regresión multivariante con
las variables: endógena (G), y explicativas (grupo, temperatura, etanol, pH y adaptación). Así mismo, se incluyeron en el
modelo términos que recogían las intercorrelaciones bivariantes entre cada dos variables explicativas, para obtener el
posible efecto añadido al estar juntas en el experimento. El
modelo matemático estimado fue el siguiente, Ec.4:
G= 288,058 + 29,484*Grupo - 7,33*Tª +12,383* Etanol 3,117*pH – 12,861*Adaptación + 0,712*InterGrE 0,644*InterGrTª
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4. CONCLUSIONES
Se pueden establecer varias conclusiones: (i) las levaduras de los grupos de la fermentación y postfermentación
tienen un crecimiento más rápido que los grupos de velo; (ii)
el efecto del etanol sobre el crecimiento, diferencia dos grandes conjuntos, el compuesto por los grupos de fermentación
y postfermentación, y los de crianza; y (iii) las levaduras vínicas pueden diferenciarse en subgrupos homogéneos, que se
corresponden con los diferentes estadíos de la elaboración
de un vino fino de crianza, en base a la influencia de diferentes factores enológicos sobre el crecimiento de dichas levaduras. Esta observación puede ser determinante a la hora de
seleccionar inóculos autóctonos para ser empleados a nivel
de bodega.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. SUUTARI M, et al. 1990. Temperature adaptation in yeasts: the role of fatty acids. J. Gen. Microbiol., 136 (8):
1469-1474.
2. ROWE PS, FRANCIS F, GOLULDING J. 1994. Rapid
isolation of DNA sequences flanking microsatellite repeats. Nucleic Acids Res., 22 (23): 5135-5136.
3. BARFORD JP, HALL RJ. 1978. An evaluation of the approaches top the mathematical modelling of microbial growth. Process. Biochem., 13: 22-26.
4. MONOD J. 1942. Recherches pur la croissance des
cultures bactériennes .Hermann et Cie. Paris.
5. MARTÍN A, LUNA J.1990. Bioestadística para las ciencias de la salud. Ediciones Norma. Madrid.
75
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POLIMORFISMO GENÉTICO DE LAS CEPAS DE LA LEVADURA DE LA CRIANZA
Almudena Fernández-López; María Sancho; Inmaculada Andújar; Kenza Almabouada;
Enrique David Sancho
1
Resumen:
Departamento de Microbiología, Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos y de Montes, Universidad de Córdoba.
Edificio Severo Ochoa, planta baja. Campus Universitario de Rabanales. 14071-Córdoba. 957-212528, [email protected]
El control microbiológico durante la vinificación es uno de los objetivos de la moderna enología, siendo conveniente
conocer la evolución de la población microbiana, autóctona y/o comercial, a lo largo del proceso. La identificación de las
diferentes especies o razas de levaduras se ha basado tradicionalmente en criterios morfológicos y fisiológicos. Actualmente,
la diferenciación de las levaduras se suele completar mediante diferentes técnicas de biología molecular. La caracterización de
las cepas de crianza presentes en los vinos finos de la D.O. de Montilla-Moriles, mediante la electroforesis del ADN total en
campo pulsante (PFGE) y el polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción del ADN mitocondrial (RFLP), muestra
la implantación de una línea poblacional de levaduras a lo largo de la crianza, así como un bajo polimorfismo genético, fruto del
alto nivel de presión selectiva que se ejerce en la elaboración de estos los vinos finos.
Palabras clave: Caracterización molecular, Levaduras, Vino fino, PFGE, RFLP
1. INTRODUCCIÓN
La obtención de un vino tipificado y de calidad es el
resultado de un proceso complejo en el que intervienen numerosos factores, entre los cuales ocupa un lugar predominante la actividad de la microbiota, sobre todo en los vinos de
crianza biológica mediante un velo (“flor”) de levaduras. El
control microbiológico durante la vinificación es uno de los
objetivos de la moderna enología, siendo conveniente conocer la evolución de la población microbiana, autóctona y/o comercial, a lo largo del proceso.
La identificación de las diferentes especies o razas
de levaduras se ha basado tradicionalmente en criterios morfológicos y fisiológicos [1]. Frente a ello, las técnicas de biología molecular están siendo muy útiles en la identificación y
caracterización, ya que se analiza su genoma con independencia del estado fisiológico de las células. Una conclusión al
respecto, bastante fundamentada, aconseja la combinación de
varias de ellas para caracterizar de forma definitiva a una cepa
[2]. Entre las técnicas más utilizadas destacan: PCR (Polymerase Chain Reaction), RFLP (Random Fragment Length Polymorphism), PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis.
La evolución de las poblaciones de las diferentes
razas de levaduras de flor durante la crianza de los vinos de
las regiones vinícolas de Montilla-Moriles [3] o de Jerez [4],
corresponde a una sucesión escalar de aquéllas, llegando a
predominar una raza de Saccharomyces cerevisiae. En todos
los casos, las razas de las levaduras de velo desplazan, total
o parcialmente, a las fermentativas.
76
Se seleccionaron 100 cepas a lo largo del proceso
de elaboración del vino fino con crianza biológica (20 de cada
criadera y de la solera), de la Bodega Alvear de la zona vinícola Montilla-Moriles. Para el estudio del polimorfismo genético de las levaduras de crianza biológica se han utilizado la
combinación de dos técnicas moleculares. La electroforesis
en campo pulsante (PFGE), puesta a punto hace dos décadas (Olson, 1989), permite la separación de fragmentos de
ADN de gran tamaño (de 250 á 2.700 Kb), equivalente al tamaño del cromosoma de levaduras, en una matriz de gel de
agarosa. Los cromosomas enteros, sometidos al campo eléctrico, migran y se orientan, de este modo, se obtienen unos
perfiles cromosómicos (cariotipos). En la técnica de RFLP,
los fragmentos de restricción se obtienen cuando se digiere
el ADN con un enzima que corta la cadena de ADN por un
punto determinado (secuencia específica de cuatro a seis nucleótidos) que la enzima es capaz de reconocer. Esta técnica
ha sido útil para la identificación y caracterización única de
cepas de levaduras enológicas (silvestres y comerciales) [5],
así como para la verificación de su estabilidad genética. El
análisis de restricción se realizó mediante la digestión del
ADN genómico con las enzimas Hinf I y Rsa I.
3. RESULTADOS
3.1. Perfil cromosómico
Los resultados mostraron 5 cariotipos diferentes
(tipos I, II, III, IV y V) durante la fase de crianza (Fig. 1). La representación de estos tipos, en función de las diferentes criaderas y solera estudiadas, varió a lo largo del tiempo de
envejecimiento del vino (Tabla 1).
Figura 1. Cariotipos de las levaduras de crianza de Montilla-Moriles.
I
II
III
IV
V
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3.2. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de
restricción del ADN mitocondrial
Con el fin de profundizar en la caracterización de
las cepas, se estudió el perfil de ADN mitocondrial, seleccionando, dentro de cada escala de la zona vinícola estudiada, aquellas cepas que mostraban diferencias en su
cariotipo. Por la combinación de los perfiles de ADN mitocondrial obtenidos con las dos enzimas de restricción (Hinf
I y Rsa I), se obtuvieron 5 perfiles diferentes (Fig. 2). Como
ocurrió en el estudio del cariotipo, los perfiles de ADN mitocondrial se distribuyen a lo largo de las criaderas y solera, y varía en función del estado de elaboración del vino
(Tabla 1).
Figura 2. Perfiles de ADN mitocondrial de las cepas, obtenidos por la combinación de las enzimas Hinf I y Rsa I .
H2
R1
H1
R1
H1
R3
Tabla 1. Distribución de los patrones de ADN cromosómico y
mitocondrial de las cepas de la crianza del vino fino
(Montilla-Moriles).
4. CONCLUSIONES
Se pueden establecer varias conclusiones: (i) Las
levaduras de la crianza presentan un bajo polimorfismo genético con respecto a los microorganismos de interés industrial, fruto del alto nivel de presión selectiva que se ejerce en
la elaboración de los vinos finos de Montilla-Moriles. (ii) La distribución por la escala de envejecimiento o crianza indica una
preponderancia del patrón I / H2R1 (cariotipo y perfil de ADN
mitocondrial), que se encuentra a lo largo de todo el proceso,
coexistiendo en las primeras escalas con los otros patrones
minoritarios, pero que terminó por imponerse totalmente en la
solera. El hecho de que se llegue a correlacionar un determinado patrón molecular con el estado de envejecimiento del
vino fino, puede ser la base para seleccionar inóculos de
cepas de levadura de la crianza de forma más eficaz.
H3
R3
H3
R2
H4
R2
5. BIBLIOGRAFÍA
characterization and identification, (2ª Ed.), Cambridge
University Press, London.
2. FERNÁNDEZ-ESPINAR MT, LÓPEZ V, RAMÓN D, BARTRA E, QUEROL A. 2001. Study of the authenticity of
commercial wine yeast strains by molecular techniques. Int. J. Food Microbiol., 70:1-10.
3. SANCHO ED, HERNÁNDEZ E, RODRÍGUEZ A. 1986.
Presumed sexual isolation in yeast populations during production of sherrylike wine. Appl. Environ. Microbiol., 51:395-397.
4. ESTEVE-ZARZOSO B, PERIS MJ, GARCÍA-MAIQUEZ
E, URUBURU F, QUEROL A. 2001. Yeast population
dynamics during the fermentation and biological
aging of sherry wines. Appl. Environ Microbiol.,
67(5):2056-61.
5. GUILLAMÓN JM, BARRIO E, HUERTA T, QUEROL A.
1994. Rapid characterization of four species of the
Saccharomyces sensu stricto complex according to
mitochondrial DNA patterns. Int. J. Syst. Bacteriol.,
44:708-714.
77
ISBN 978-84-690-6060-5
CARACTERIZACIÓN DE LEVADURAS DE VINO ECOLÓGICO
DE LA DENOMINACIÓN DE ORIGEN DE MONTILLA-MORILES
María Sancho, Inmaculada Andujar, Kenza Almabouada, Almudena Fernández,
Enrique David Sancho
Departamento de Microbiología, Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos y de Montes,
Edificio Severo Ochoa, planta baja. Campus Universitario de Rabanales, Universidad de Córdoba, 14071-Córdoba. 957-212528, [email protected]
Resumen:
La producción de vinos ecológicos es una alternativa al descenso del mercado mundial de los vinos. Actualmente
existen en España unas cien bodegas de elaboración. A falta de una normativa específica se aplican reglas sobre el cultivo de
la viña y diversas operaciones enotécnicas. La caracterización de las levaduras implicadas en la elaboración del vino fino
ecológico (Piedra Luenga) ha sido realizada en las Bodegas Robles (zona Montilla-Moriles, Córdoba). A destacar el manejo de
una cubierta vegetal en el viñedo, un control estricto de las correcciones del mosto, la no inoculación con levaduras o bacterias
comerciales y el empleo de unos mínimos tratamientos físicos. Se aislaron y clasificaron cepas de levaduras de fermentación
y crianza, según criterios morfológicos, fisiológicos y moleculares. El patrón de razas de Saccharomyces cerevisiae fue
semejante al del vino fino tradicional, predominando la raza cerevisiae (60 %) en la fermentación, y capensis (85 %), en la
crianza. En esta fase, se detectó la presencia de una población (17,5 %) de levaduras no Saccharomyces, que debe ser
controlada. La distribución del perfil cromosómico de las cepas muestra un polimorfismo mayor que el encontrado en el vino
fino convencional de la misma zona (33 % frente al 5 %).
Palabras clave: vino ecológico, Montilla-Moriles, Saccharomyces cerevisiae capensis, PFGE, RFLP
1. INTRODUCCIÓN
Una de las alternativas más interesantes surgidas
a raíz del descenso del mercado mundial de los vinos tradicionales es la que promueve el consumo de los vinos ecológicos. Este tipo de vinos se elabora mediante procedimientos
naturales, respetuosos con el medio ambiente, que comprende al suelo, viñedo y bodega. En ningún momento pueden utilizarse elementos químicos no naturales; además, la
fermentación debe ser realizada por las cepas silvestres y las
operaciones enotécnicas de correcciones y ajustes están
muy restringidas.
La microbiota de levaduras implicadas en la elaboración de vinos finos de crianza biológica en la región vitivinícola de “Montilla-Moriles” (Córdoba), está constituida por
levaduras de la fase fermentativa y levaduras de velo (“flor”),
responsables de la crianza. La caracterización de dichas poblaciones muestra algunos hechos destacables, tales como
la estabilidad de las poblaciones, el aislamiento sexual existente entre ellas y el alto grado de polimorfismo genético [1,
2]. El objetivo del presente trabajo es el de caracterizar la microbiota de levaduras implicada en la producción del vino fino
de crianza ecológico (Piedra Luenga, Bodegas Robles, D.O.
Montilla-Moriles) con el fin de compararla con la correspondiente al vino fino de crianza convencional.
78
En este trabajo se han utilizado cepas de levadura
(100 de fermentación y 160 de crianza -3ª, 2ª, 1ª criadera y
solera-), aisladas, en la campaña de 2005, durante la elaboración del vino fino de crianza, ecológico, “Piedra Luenga”
(Bodegas Robles, zona Montilla-Moriles). La identificación de
las cepas se basó en diferentes pruebas, tales como: morfología celular, crecimiento en lisina, asimilación de nitrato, fermentación de azúcares, formación de velo, tolerancia al litio,
entre otras [3, 4]. La caracterización de las levaduras se ha
completado con la aplicación de algunas técnicas moleculares, como la electroforesis de cromosomas mediante el
campo pulsante (Pulsed Field Gel Electrophoresis –PFGE-)
y el análisis de los fragmentos de restricción del ADN mitocondrial (Restriction Fragment Length Polymorphisms –
RFLP-). (Guillamón y col., 1994). La primera permite estudiar
la variabilidad de los cariotipos de las cepas vínicas [5]. Este
ensayo se realizó con 30 cepas de levaduras de la fermentación y 60 cepas de levadura de la crianza (15 cepas de
cada criadera y solera). Para la obtención de las muestras, se
siguió un protocolo descrito [6, 7], con algunas modificaciones. El análisis RFLP es una técnica muy empleada en la
identificación y caracterización única de cepas de levaduras
enológicas (silvestres y comerciales) así como para la verificación de su estabilidad genética. El protocolo seguido [8, 9],
con ligeras modificaciones, se aplicó a 10 cepas de crianza,
de la 1ª criadera, por ser un estadío intermedio de dicha fase
de envejecimiento.
3. RESULTADOS
Los resultados obtenidos tras realizar las pruebas
antes descritas constataron la existencia mayoritaria de
cepas pertenecientes al género Saccharomyces (93 cepas
de la fermentación y 132 de la crianza). El comportamiento
fermentativo de estas cepas ofreció los resultados que se
muestran en las Figuras 1 y 2, respectivamente.
ISBN 978-84-690-6060-5
Figura 1. Distribución de las cepas de la fermentación
identificadas, pertenecientes a las razas cerevisiae, chevalieri y
capensis de Saccharomyces cerevisiae.
Con el fin de profundizar en la caracterización de
las cepas de la crianza, por considerarlas más relevantes en
este tipo de vinos, se estudió el perfil de ADN mitocondrial,
seleccionando 10 cepas (raza capensis) de la 1ª criadera. El
análisis de restricción de dichas cepas (cariotipos II y III)
mostró dos patrones de ADN mitocondrial, siendo uno de
ellos (H2R2) mayoritario (85 %) (Fig. 3).
Figura 3. Perfiles de ADN mitocondrial de las cepas
de la 1ª criadera.
Figura 2. Distribución de las cepas de la crianza identificadas,
pertenecientes a la raza capensis de Saccharomyces cerevisiae.
4. CONCLUSIONES
En relación a otras pruebas, cabe destacar estos
resultados: todas las cepas de crianza formaron velo, en un
máximo de 5 días, mientras que solamente el 8 % de las
cepas de fermentación lo formó; y las cepas de la fermentación mostraron ser tolerantes al litio (97 % de las cepas toleraron > 50 mM LiCl), mientras que la totalidad de las cepas
de crianza fueron sensibles al catión (100 % < 50 mM LiCl).
La electroforesis del ADN total en campo pulsante se
realizó a 30 cepas de fermentación (15 de mosto yema y 15 de
mosto de recorte) y 60 de crianza, previamente seleccionadas. Se determinaron 4 cariotipos distintos, que se numeraron por orden de aparición (I, II, III y IV). Las diferencias más
destacables fueron (Tabla 1): desaparición del cromosoma XII;
existencia de un cromosoma entre el IV y XV, existencia de un
cromosoma sobre el XV, cromosomas II y X separados del
XIV, y cromosomas VI y I separados. La distribución de los cariotipos fue: tipo I (15 %), II (50 %), III (20 %) y IV (15 %).
Tabla 1. Diferencias cromosómicas en los cariotipos
El patrón de distribución de las cepas de levadura
identificadas durante la elaboración del vino fino ecológico de
crianza es muy semejante al correspondiente al vino fino tradicional (predominio de S.c. cerevisiae -60 %- en la fermentación, y de S.c. capensis -85 %- durante la crianza), salvo en
que en el primero se aprecia, en la criaderas más jóvenes,
una concentración superior (17,5 %) de cepas no pertenecientes a Saccharomyces, por lo que es aconsejable efectuar un control de la evolución de dichas poblaciones. En
resultados no mostrados, se han encontrado cepas pertenecientes a los géneros Hansenula, Pichia y Kloeckera. El
grado de polimorfismo mostrado en el vino ecológico (33 %)
fue muy superior al del vino tradicional (5 %).
5. BIBLIOGRAFÍA
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ISBN 978-84-690-6060-5
CONSTRUCCIÓN DE LEVADURAS VÍNICAS TRANSGÉNICAS ESTÉRILES, IME1∆,
INCAPACES DE PERDURAR EN LA NATURALEZA
Jesús Ambrona1, Emiliano Zamora2, Manuel Ramírez1
1
Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad de Extremadura 06071 Badajoz
Tel: 924289426. Fax: 924289427. E-mail: [email protected].
2
Resumen:
Estación Enológica, Almendralejo, Badajoz, España
El uso industrial de levaduras transgénicas supone un peligro ya que pueden diseminarse introduciendo en la
naturaleza combinaciones artificiales de genes con consecuencias impredecibles. Sería interesante poder utilizar levaduras
estériles, incapaces de esporular y conjugar con otras levaduras naturales. Estas levaduras no sobrevivirían a los periodos
cíclicos de ausencia de nutrientes, desapareciendo en bodegas y viñedos en menos de un año. Hemos construido levaduras
vínicas, ime1∆, incapaces de esporular y conjugar, con marcadores genéticos de fácil detección, que desaparecen rápidamente
en las fermentaciones de mosto tras el proceso de esporulación. Estas levaduras mantienen las mismas propiedades
biotecnológicas que las cepas vínicas originales, sin que se observe ningún efecto deletéreo de la mutación ime1∆.
Palabras clave: esporulación, estéril, fermentación, levadura, transgénico.
1. INTRODUCCIÓN
En los últimos 16 años se han realizado progresos
interesantes en la modificación genética de levaduras vínicas
y sus aplicaciones en la industria [1-4]. Aparte de las limitaciones técnicas, los organismos modificados genéticamente
no llegan a los consumidores por el largo y costosos procedimiento administrativo y la desconfianza de los consumidores.
En el caso del vino surge un problema adicional de las especificidades de su comercio, incluyendo regulaciones internacionales, nacionales y locales. La disponibilidad de procesos
para controlar eficientemente los organismos modificados genéticamente en la naturaleza evitaría la desconfianza de los
consumidores y e impulsaría de nuevo la mejora genética de
levaduras vínicas mediante ingeniería genética.
Muchas de las levaduras vínicas silvestres S. cerevisiae aisladas de fermentaciones de mostos son cepas diploides homotálicas [5, 6]. Esporulan en ausencia de
nutrientes originando esporas haploides que son muy resistentes a condiciones ambientales adversas. Esta esporulación puede ocurrir cada año al final de la vendimia,
sobreviviendo las esporas a los periodos entre vendimias. Al
comienzo de la siguiente vendimia las esporas germinan originando levaduras haploides. Estas células haploides pueden tener dos tipos sexuales, a y α. Cada uno de ellos
conjuga con el otro tipo restaurando el estado diploide que
es el predominante en las fermentaciones de mosto [7]. La
parte sexual del ciclo biológico de las levaduras (esporulación y conjugación) no es necesaria para la elaboración de
vino, aunque sí para la supervivencia de la levadura en condiciones adversas. Si las levaduras son incapaces de iniciar
meiosis, esporular y conjugar, sexualmente estériles, desaparecerán de la naturaleza ya que no pueden sobrevivir en
el ecosistema viñedo-bodega. IME1 es un gen no esencial
necesario para que la levadura entre en meiosis [8, 9]. Las levaduras diploides homocigóticas ime1∆ pueden reproducirse
de forma asexual mediante gemación y realizar un metabolismo normal, pero no pueden esporular. En este trabajo analizamos el uso de nuevas levaduras vínicas transgénicas
ime1∆, con buenas propiedades fermentativas, como estrategia para la aplicación industrial de organismos modificados
genéticamente, al mismo tiempo que evitamos su diseminación en la naturaleza. Estas nuevas cepas estériles de levaduras con marcadores genéticos apropiados, podrían ayudar
a prever el riesgo de la diseminación de organismos modificados genéticamente en la naturaleza.
Cepas de levadura: SMR10-11D (MATa/MATa,
HO/HO, SMRR/SMRR, [k2+]) es una levadura vínica killer, resistente a sulfometurón metilo. SMR10-11DNK (MATa/MATa,
HO/HO, SMRR/SMRR, [k20]) es una levadura no killer obtenida a partir de SMR10-11D. E324 (MATa/MATa, HO/HO,
ura3∆0/ura3∆0, ime1∆::G418R/ime1∆::G418R,[k20]) es un
clon espora no killer procedente del cruce SMR1011DNK×YJR094C. H77 (MATa/MATa, HO/HO,URA3/ura3D0
SMRR/smrS, ymr107D::G418R/ILV2, [k20]) es un híbrido heterocigótico no killer procedente del cruce SMR1011DNK×E339. YJR094C (mat a, ho, his3, leu2, met15, ura3,
ime1∆::G418R) es una levadura haploide de laboratorio obtenida de EUROSCARF (European Saccharomyces Cerevisiae Archive for Functional Analysis).
Análisis de la esporulación de levaduras vínicas alteradas en el proceso de meiosis (ime1∆): Se inocularon 5
ml de mosto Pardina estéril suplementado con 200 µl de uracilo con cultivo de las cepas H74, E324, SMR10-11D y
SMR10-11DNK; y con mezclas de ellas (mezcla 1: 50%
SMR10-11DNK + 50% E324 y mezcla 2: 50% SMR10-11D +
50% H74). Se tomaron muestras a lo largo de las fermentaciones para analizar la frecuencia de marcadores y, paralelamente, muestras de 100 µl que se pusieron a esporular a
81
ISBN 978-84-690-6060-5
25ºC hasta obtener abundantes tétradas. Se tomaron 40 tétradas de la mezcla 1 y 40 tétradas de la mezcla 2 a partir de
las placas de esporulación y se inocularon separadamente
en dos tubos con 5 ml de mosto estéril para realizar una segunda fermentación, a lo largo de la cual se repitió el proceso
anteriormente descrito. Las tétradas obtenidas a en esta segunda fermentación se usaron, al igual que en la primera,
para inocular por tercera vez mosto estéril (5 ml) y realizar
una última fermentación.
3. RESULTADOS
Todos los mostos terminaron la primera fermentación en tiempos similares. La evolución de la frecuencia de
marcadores a lo largo de la misma se muestra en la Tabla 1.
En todas las fermentaciones inoculadas con una
sola levadura, el 100% de las células mantenía el marcador.
En la fermentación inoculada con la Mezcla 1 se observa un
desplazamiento de la cepa E324 por la cepa SMR10-11DNK
desde el principio, aunque ambos marcadores permanecen al
final de la fermentación. En la fermentación inoculada con la
Mezcla 2, ambos marcadores comienzan en la misma proporción oscilando a lo largo de la misma para terminar con
una mayor proporción de la cepa transgénica (H74).
En la segunda fermentación se utilizó como inóculo
tétradas obtenidas a partir de la muestra del día 7 de la primera fermentación. La evolución de la frecuencia de marcadores a lo largo de esta segunda fermentación se muestra
en la Tabla 2.
El marcador G418R (cepa E324) desaparece en la
fermentación inoculada con la Mezcla 1, como era de esperar ya que esta cepa es homocigótica para ime1∆. Sin embargo, en la fermentación inoculada con esporas de la
Mezcla 2 permanecen ambos marcadores (G418R y SMRR),
si bien se observa un desplazamiento de SMRR por G418R.
Además se encontraron células sin marcador como resultado
de la conjugación entre esporas IME1 (procedentes de la
cepa H74) con células hermanas.
Se realizó una tercera fermentación inoculando con
esporas obtenidas a partir de la muestra del día 14 de la 2ª
fermentación. La evolución de marcadores a lo largo de la
misma se muestra en la Tabla 3.
Tabla 1. Evolución de la frecuencia de marcadores a lo largo de la primera fermentación
UFC/ml: unidades formadoras de colonia. Se analizaron entre 100 y 300 colonias
Tabla 2. Evolución de la frecuencia de marcadores a lo largo de la segunda fermentación
Tabla 3. Evolución de la frecuencia de marcadores a lo largo de La tercera fermentación
82
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Al igual que en la fermentación anterior, el marcador
G418R todavía permanece en la población tras dos procesos
de esporulación. Además detectamos células con ambos
marcadores resultado de la conjugación de células procedentes de esporas de diferentes tétradas, que pueden formarse aunque en baja frecuencia [7]. La aparición de estos
heterocigóticos demuestra la posibilidad de diseminación en
la naturaleza de resistencias a drogas u otros genes presentes en levaduras transgénicas al pasar de las levaduras inoculadas en mosto a las levaduras silvestres por conjugación.
4. CONCLUSIONES
Para impedir la diseminación de levaduras comerciales o genes de resistencia en la naturaleza es necesario
que las levaduras sean mutantes homocigóticas ime1/ime1.
No es suficiente ligar un marcador genético o un gen de resistencia a droga a mutaciones ime1 en una levadura heterocigótica IME1/ime1, es necesario además que ime1 esté
en homocigosis.
La aparición de células con ambos marcadores de
resistencia demuestra la posibilidad de diseminación en la
naturaleza de resistencias a drogas u otros genes presentes en levaduras transgénicas al pasar de las levaduras inoculadas en mosto a las levaduras silvestres mediante
conjugación.
5. BIBLIOGRAFÍA
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83
ISBN 978-84-690-6060-5
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE CEPAS ENOLÓGICAS DE
Lactobacillus plantarum
Beatriz Rojo-Bezares, Yolanda Sáenz, Laura Navarro, Lorena Díez, Myriam Zarazaga,
Fernanda Ruiz-Larrea, Carmen Torres
Resumen:
Departamento de Agricultura y Alimentación. Universidad de La Rioja.
c/ Madre de Dios 51. 26006 Logroño. Teléfono: 941 299 749. e-mail: [email protected]
Se han caracterizado dos cepas de la especie L. plantarum, J23 y J51, provenientes de un mosto de uva tinta y de
un vino tinto respectivamente. Ambas cepas presentan actividades inhibitorias del crecimiento de otras bacterias lácticas (BAL)
de origen enológico, tanto de su misma especie como de las especies L. hilgardii, L. paracasei, L. brevis, L. fermentum, L.
pentosus y de los géneros Pediococus y Oenococcus. Estas actividades antimicrobianas son en ambos casos de naturaleza
peptídica y por tanto, se denominan plantaricinas [1]. En los resultados que se presentarán se demuestra que la producción de
la actividad J51 es dependiente de la cantidad de inóculo inicial de la cepa productora (mecanismo “quorum-sensing”), mientras
que la producción de la actividad J23 es inducida por la presencia de otra cepa de BAL, utilizándose en todos los experimentos
como cepa inductora: L. hilgardii J81. Se mostrarán las cinéticas de producción de ambas actividades y el efecto que producen
el pH ácido del medio, la presencia de etanol y la presencia de glucosa, tanto sobre el crecimiento de las cepas como sobre la
producción de las actividades plantaricina.
Palabras clave: Lactobacillus plantarum, plantaricinas, actividad antimicrobiana.
1. INTRODUCCIÓN
Las bacterias lácticas (BAL) de la especie Lactobacillus plantarum se encuentran ampliamente diseminadas y
pueden colonizar los más diversos nichos ecológicos, entre
ellos se encuentran los vinos y los mostos de uva [4]. Cepas
L. plantarum se utilizan en multitud de fermentaciones industriales por la producción de ácido láctico. También son importantes por su producción de sustancias antimicrobianas
de naturaleza peptídica llamadas bacteriocinas, activas frente
a microorganismos de la misma especie o especies con estrecha relación taxonómica con la cepa productora [1, 2]. Los
parámetros físico-químicos del vino (etanol, pH, anhídrido
sulfuroso, polifenoles, temperatura,…), la reserva de azúcares (glucosa, fructosa,…) así como otros componentes resultantes del metabolismo de las levaduras influyen en el
desarrollo de las BAL responsables de la fermentación maloláctica (FML) del vino. Dependiendo de esas condiciones
del vino, las BAL crecerán en mayor o menor medida y producirán un cierto tipo de metabolitos u otro. El objetivo de
este trabajo es estudiar la producción de actividad plantaricina por dos cepas enológicas: L. plantarum J23 y J51, y los
factores que influyen en esa producción.
2.1. Método de detección de actividad antimicrobiana:
“spot-on-the-lawn” modificado [3]
84
Las cepas de la especie L. plantarum J23 y J51 se
inocularon en forma de botón en placas de medio TSA
(Difco) suplementado con 0,5% de extracto de levadura, y se
incubaron durante 24 h a 30ºC en estufa de CO2. Posteriormente, se inoculó la cepa indicadora (Tabla 1): se fundieron
5 ml de BHI semisólido en un tubo de ensayo. Cuando los
tubos estuvieron atemperados, se inocularon 40 µl de una
suspensión 1 McFarland en 0,9% de NaCl de la cepa indicadora y se dejó solidificar. Las placas se incubaron durante
24 h a 30ºC en anaerobiosis, analizándose después la presencia o ausencia de halos nítidos de inhibición del crecimiento alrededor del botón de la bacteria productora.
2.2. Método de detección de actividad antimicrobiana en
placas microtiter
El ensayo en placas microtiter de 96 pocillos se llevó
a cabo del siguiente modo: cada pocillo de la placa microtiter
contenía 50 l de MRS-líquido (2X), 50 µl de diluciones dobles
seriadas de extracto activo libre de células y 10 µl de la cepa
indicadora (5x105 UFC/ml de Pediococcus pentosaceus
FBB63 para la cepa J23, y L. hilgardii J81 para la cepa J51).
La cepa indicadora estaba resuspendida en agua destilada
estéril. Las placas microtiter fueron incubadas durante 12-15
h, en estufa de CO2 a 30ºC, después de lo cual se midió la
densidad óptica a 600 nm (DO600) en un lector de placas microtiter (Bio-Rad microtiter reader). La actividad antimicrobiana de los extractos activos libres de células, se calculó en
unidades arbitrarias, definiendo una unidad arbitraria (UA)
como el factor de dilución de la muestra que inhibe el 50% del
crecimiento de la cepa indicadora (50% de la turbidez del control positivo de crecimiento de la cepa indicadora).
2.3. Efecto del etanol, pH y concentración de glucosa en
la producción de actividad bacteriocina de
L. plantarum
Para llevar a cabo el seguimiento del crecimiento y
la producción de actividad bacteriocina a lo largo del tiempo
ISBN 978-84-690-6060-5
de la cepa L. plantarum J23, procedente de un mosto, y la
cepa L. plantarum J51, procedente de un vino acabado, bajo
distintas condiciones de concentración de etanol, pH y concentración de glucosa, se prepararon matraces de 100 ml de
MRS-líquido con diferentes concentraciones de etanol (de 4
a 12% v/v), a diversos pHs (de 3 a 6) ajustados con 1 M de
HCl, y dos medios de cultivo [TSBYE con diferentes concentraciones de glucosa (0, 2, 5, 10 y 20 g/L). y MRS-líquido].
La cepa L. plantarum J23 se inoculó en cocultivo
con L. hilgardii J81 (108 UFC/ml y 107 UFC/ml, respectivamente), ya que la cepa J23 necesita unas condiciones de inducción para producir actividad antimicrobiana [4].
Paralelamente se prepararon todos los controles correspondientes, para poder determinar el crecimiento de las cepas
L. plantarum J23 y L. hilgardii J81 por separado. De forma similar se estudió la cepa L. plantarum J51, empleándose para
ello el cultivo de la cepa J51 con un inóculo inicial de 108
UFC/ml, puesto que inóculos con un menor número de células no auto-inducen la producción de actividad antimicrobiana
de J51 ya que es dependiente de mecanismos de “quorumsensing” [5]. Todos los cultivos fueron incubados a 30ºC en
agitación y su evolución se siguió a lo largo de 72 h, midiendo
la DO600. La actividad antimicrobiana de las muestras se analizó por el ensayo de placas microtiter.
3. RESULTADOS
La Tabla 1 muestra la actividad antimicrobiana de
las cepas L. plantarum J23 y J51 ensayada por el método de
“spot-on-the-lawn” usando otras BAL como indicadoras. El
espectro de inhibición de las cepas L. plantarum J23 y J51 incluyó cepas de los géneros Oenococcus (61% y 91%, respectivamente), Pediococcus (70% y 100%, respectivamente)
y Lactobacillus (16% y 68%, respectivamente) siendo L. plantarum J51 más activa que la cepa J23.
El estudio del efecto de diversos componentes del
medio de cultivo se llevó a cabo mediante el ensayo de microtiter. Tanto la cepa L. plantarum J23 como la cepa inductora fueron muy sensibles a las concentraciones de etanol,
cambios de pH y diferentes concentraciones de glucosa del
medio, así como el tipo del medio de cultivo, observándose
que una disminución en el crecimiento venía asociada a una
menor producción de actividad antimicrobiana.
Por otro lado, la cepa L. plantarum J51 se comportó
de forma similar con respecto al pH y la concentración de glucosa, de modo que tanto su crecimiento como su actividad
bacteriocina se estaban directamente relacionados. Sin embargo, el comportamiento de J51 con respecto al etanol presente en el medio difirió del comportamiento de J23. En la
Fig.1 se muestra el crecimiento y la producción bacteriocina
de J51 a diferentes concentraciones de etanol en el medio.
Se observó que pequeñas concentraciones de etanol (6% y
8%) tienen un efecto activador de la producción de actividad
antimicrobiana de J51 a pesar de que el crecimiento celular
se encontraba disminuido. Estos resultados ponen de manifiesto la adaptación a la presencia de etanol de esta cepa
procedente de un vino acabado. Cuando la concentración de
etanol en el medio se aumentó al 12 %, ya tanto el crecimiento celular como la producción bacteriocina de L. plantarum J51 se vieron disminuidos.
4. CONCLUSIONES
-
-
La producción de bacteriocinas y el grado de eficacia inhibiendo otras cepas BAL no depende de la especie, es
una característica propia de cada cepa.
Tanto el pH ácido como la presencia de etanol en el
medio afecta negativamente al crecimiento de la cepa L.
plantarum J23 y en consecuencia la producción de actividad bacteriocina disminuye significativamente.
La presencia de bajas concentraciones de etanol (6-8%)
en el medio de cultivo estimulan la producción de bacteriocina de la cepa L. plantarum J51.
Un descenso en la concentración de glucosa en el medio
de cultivo produce un descenso de la producción de bacteriocina en ambas cepas de L. plantarum.
Los parámetros físico-químicos y los componentes del
medio son sumamente importantes para controlar tanto el
crecimiento de las cepas L. plantarum como la producción de sustancias antimicrobianas, y afectan de diferente
manera a cepas de la misma especie.
5. BIBLIOGRAFÍA
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85
ISBN 978-84-690-6060-5
Tabla 1.- Actividad antimicrobiana de L. plantarum J23 y J51 frente a 70 BAL indicadoras por el método “spot-on-the-lawn”.
a
Clara inhibición del crecimiento (++), débil inhibición del crecimiento (+), ausencia de inhibición del crecimiento (-).
Fig. 1. Efecto de diferentes concentraciones de etanol (0%, 6%, 8%, 10% y 12%) en el crecimiento y en la producción de la
actividad bacteriocina de L. plantarum J51. Abreviaturas: ACT: actividad antimicrobiana, CB: crecimiento bacteriano.
86
ISBN 978-84-690-6060-5
EFECTO ANTIMICROBIANO DE LA NISINA SOBRE LA POBLACIÓN DE BACTERIAS
LÁCTICAS Y ACÉTICAS DE UN VINO DURANTE SU CONSERVACIÓN
Yolanda Sáenz, Lorena Díez, Cauré B. Portugal, Beatriz Rojo-Bezares, Myriam Zarazaga,
Carmen Torres, Fernanda Ruiz-Larrea
Resumen:
c/ Madre de Dios 51. 26006 Logroño. Teléfono: 941 299 749. e-mail: [email protected]
El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de la bacteriocina nisina en combinación con metabisulfito sobre el
crecimiento de una población residual de bacterias y levaduras de un vino tinto conservado en botella. Se utilizaron
combinaciones binarias de metabisulfito (en el rango de 28 a 100 mg/l) con nisina en grado alimentario, Nisaplina (Danisco)
(rango de 0 a 50 mg/l). Los resultados mostraron un efecto inhibitorio sinérgico de ambos antimicrobianos sobre la población
de bacterias acéticas, y se comprobó la resistencia de las levaduras del género Saccharomyces al efecto inhibitorio de la nisina.
También se determinó la actividad antimicrobiana de varias cepas productoras de las bacteriocinas Pediocina PA-1, Lactocina
y Nisina Z frente a bacterias lácticas y acéticas de origen enológico. La cepa de Lactococcus lactis productora de nisina Z fue
la más activa inhibiendo el crecimiento de las 70 bacterias lácticas estudiadas y cepas de bacterias acéticas del género
Gluconobacter.
Palabras clave: Nisina, metabisulfito, bacteriocina, conservación del vino.
1. INTRODUCCIÓN
La fermentación maloláctica es un proceso de transformación que sufren los vinos tintos de alta calidad, proporciona características positivas tales como la desacidificación
o la estabilización microbiológica, e incrementa la complejidad aromática y de sabor del vino. Este proceso consiste en
la descarboxilación del ácido málico en ácido láctico y se lleva
a cabo por bacterias lácticas (LAB), principalmente por la especie Oenococcus oeni. Si la fermentación maloláctica no se
controla correctamente y las LAB crecen de manera inapropiada, la calidad del vino disminuye e incluso llega a perderse
[1]. De forma similar, el crecimiento de bacterias acéticas
(AAB), capaces de oxidar el etanol a ácido acético, tiene consecuencias nefastas sobre la calidad del vino. Por lo tanto, el
control de un crecimiento bacteriano apropiado durante la
elaboración y conservación del vino es de suprema importancia para obtener vinos de alta calidad. Actualmente durante el proceso de elaboración del vino, se adiciona
anhídrido sulfuroso a la uva prefermentada y al producto final,
lo que previene el crecimiento de microorganismos indeseados, actúa como antioxidante y mantiene los beneficios de
los polifenoles del vino [2; 3]. Sin embargo, por sus posibles
riesgos en la salud humana, los organismos internacionales
(OMS, FAO, OIV) han establecido límites máximos de anhídrido sulfuroso en los vinos y recomiendan su reducción en
bebidas y alimentos. Por otra parte, la nisina es una bacteriocina producida por una LAB calificada con la categoría de
GRAS (“Generally Recognized As Safe”) por la FDA y está
aprobada en más de 40 países como conservante en alimentos [4]. Este lantibiótico de 35 aminoácidos y propiedades
catiónicas, se produce de manera natural por cepas específicas de la especie Lactococcus lactis. Asimismo la pediocina
PA-1/AcH producida por cepas del género Pediococcus, también se comercializa para emplearse en alimentación. En la
actualidad no se autoriza todavía la adición de ninguna de
estas bacteriocinas en vino.
El objetivo de este trabajo fue favorecer la conservación de un vino tinto mediante el empleo combinado de los
agentes antimicrobianos metabisulfito y nisina, controlando
el crecimiento de bacterias lácticas, acéticas y levaduras de
origen enológico.
2.1. Condiciones de cultivo y crecimiento de bacterias
La Tabla 1 muestra la colección de microorganismos incluida en este trabajo: 70 bacterias lácticas (LAB) y 23
bacterias acéticas (AAB). Las cepas de O. oeni se cultivaron
durante 3-4 días en placas de MLO agar a 30ºC y bajo condiciones estrictas de anaerobiosis (concentración final de CO2
del 7-10%), mientras que el resto de LAB se cultivaron durante 48h en placas de MRS agar a 30ºC en una atmósfera
con un 5% de CO2. Las AAB se incubaron a 30ºC en placas
de mannitol agar durante 48h.
2.2. Detección de actividad antimicrobiana de distintas
bacteriocinas
Se estudió la actividad de Pediococcus acidilactici
C652, Lactobacillus sakei C654 y Lactococcus lactis C144
productoras de las bacteriocinas pediocina PA-1, lactocina S
y nisina Z, respectivamente, frente a las distintas cepas indicadoras de origen enológico (Tabla 1), empleando el método
“spot-on-the-lawn” en placas de TSA [9].
87
ISBN 978-84-690-6060-5
2.3. Trabajo en bodega
Un vino tinto acabado se analizó química y microbiológicamente y se sometió a la acción combinada de distintas concentraciones de metabisulfito (28, 50 y 100 mg/L) y
de nisina (0, 3, 6.25, 20 y 50 mg/L; Nisaplina, Danisco) en
colaboración con una bodega de la región. Estos vinos se
embotellaron, realizándose los ensayos por triplicado para
cada condición estudiada. Después de cuatro meses de conservación se tomaron muestras homogéneas de todos los
vinos sometidos a la acción antimicrobiana y se realizó el seguimiento de la población microbiana mediante siembras de
alícuotas de estas muestras en medios de cultivo específicos
para LAB y AAB.
La presencia de levaduras Brettanomyces se determinó tras sembrar las muestras en YPD agar con bromocresol e incubadas durante una semana a 30ºC, y el resto de
levaduras en YPD agar a 30ºC durante 48h. Se realizaron recuentos y aislamientos de cepas resistentes a la acción de
ambos antimicrobianos solos o en combinación. La identificación de géneros y especies microbianas se llevó a cabo
mediante métodos bioquímicos tradicionales (tinción de
Gram,...) y de biología molecular: PCR universales para levaduras y para bacterias, con posterior secuenciación automática [5, 6] y PCR específicas para identificar
Brettanomyces y Saccharomyces [7, 8].
3. RESULTADOS
3.1. Efecto de bacterias productoras de bacteriocinas
sobre las bacterias del vino
La mayor actividad antimicrobiana se detectó con
la cepa productora de nisina Z, muy activa frente a todas las
BAL estudiadas y algunas Gluconobacter. Los halos de inhibición del crecimiento de las 23 cepas de la especie O. oeni
fueron muy superiores a los del resto de LAB de origen enológico estudiadas. La cepa productora de pediocina PA-1 fue
activa frente a todas las cepas de O. oeni y a 14 de las otras
47 BAL.
La cepa productora de lactocina S produjo halo de
inhibición sólo en dos de las 70 BAL, siendo inactiva frente al
resto de bacterias estudiadas (Tabla 1).
3.2. Efecto combinado de metabisulfito y nisina en la
conservación de un vino
El vino de partida presentaba una la baja carga bacteriana y a lo largo de los cuatro meses que duró el estudio
no se detectó crecimiento de LAB en las muestras de vino.
Por otra parte, la población de AAB cultivables era significativa, y en la Fig. 1 se observa que existen reducciones en la
población de AAB al aumentar la concentración de nisina en
combinación con las distintas concentraciones de metabisulfito. Se comprobó la resistencia de las levaduras Saccharomyces y Brettanomyces al efecto inhibitorio de la nisina.
88
4. CONCLUSIONES
-
-
Se observó que la cepa Lactococcus lactis C144 productora de nisina Z fue muy activa frente a las 70 LAB estudiadas, siendo especialmente sensibles las cepas de la
especie O. oeni.
Se detectó un efecto sinérgico entre el metabisulfito y la
nisina en el crecimiento de las AAB enológicas, lo cual indica que la combinación de ambos antimicrobianos puede
constituir un nuevo método de conservación del vino que
permitiría la utilización de menores concentraciones de
metabisulfito que las empleadas en la actualidad.
5. BIBLIOGRAFÍA
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isolated from grape must. Food Microbiol. 24: 482–491
ISBN 978-84-690-6060-5
Fig. 1. Poblaciones de AAB (log UFC/ml) detectadas en las botellas de vino sometidas a la acción de metabisulfito y nisina después de
cuatro meses de conservación. Muestras: El número indica concentración de metabisulfito (1: 18; 2: 50 y 3: 100 mg/L)
y la letra señala la concentración de nisina (A: 0, B: 3, C: 6.25, D: 20, y E. 50 mg/L).
Tabla 1. Actividad antimicrobiana de cepas productoras de Pediocina PA-1,
Lactocina y Nisina Z frente a bacterias lácticas y acéticas según el método de “spot-on-the-lawn”.
a
(+) inhibición del crecimiento, (-) ausencia de inhibición del crecimiento.
89
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SEGUIMIENTO DE LA AUTOLISIS ACELERADA DE LÍAS DE LEVADURAS POR
PECTINASAS Y β-GLUCANASAS
Oscar Fernández1; Rocío Rodríguez1, Domingo Rodríguez1, José Barrau1, Jose Mª Ryan2,
Zenaida Guadalupe1, Belén Ayestarán1
1
Departamento de Agricultura y Alimentación. Universidad de la Rioja, C/Madre de Dios 51, 26006 Logroño, La Rioja, España; Tel: +34 941 299 722,
E-mail: [email protected]
2
Resumen:
Bodega Cvne Viña Real, C/ Carretera Logroño-Laguardia, Km 4.8, Laguardia, Alava, España
El uso de enzimas comerciales para acelerar la autolisis de las lías produjo un incremento en la liberación al medio
de polisacáridos totales con respecto a las lías control. Las diferencias más significativas se alcanzaron en la manosa y en la
glucosa, azúcares constituyentes de manoproteínas y glucanos, obteniéndose diferencias de hasta un 35% y 112%
respectivamente. Esta fuerte liberación se produjo sobre todo durante los primeros 21 días del proceso de autolisis. La
acidificación de las lías sin combinación de enzimas no tuvo ningún efecto sobre los glucanos parietales de las lías.
Palabras clave: autolisis acelerada, enzimas, lías y polisacáridos.
1. INTRODUCCIÓN
90
La crianza sobre lías es una técnica, que aunque
laboriosa, en la actualidad se está utilizando para la elaboración de vinos blancos y tintos por sus efectos positivos. Existen ventajas a nivel organoléptico, como son la reducción de
astringencia, mayor redondez del vino o persistencia aromática [1]. Otro efecto positivo que se consigue es una mayor
estabilidad físico-química, debido a la presencia de moléculas como las manoproteínas, que juegan un papel importante
como coloides protectores [1].
Las lías están compuestas por microorganismos
que han completado la fermentación, además de residuos orgánicos y sales tartáricas [2]. Durante la crianza, al poner el
vino en contacto durante un tiempo prolongado con las lías,
éste se enriquece en distintos compuestos intracelulares y
en polisacáridos parietales como son los glucanos y manoproteínas. Esto es debido a la autolisis de dichas lías, en la
que se produce una desorganización del sistema de membrana, liberándose enzimas hidrolíticos y componentes celulares al exterior [3].
El proceso de autolisis es un proceso lento que
puede durar desde meses a años, por lo que en la actualidad se utilizan distintas técnicas para acelerar dicho proceso.
La adición de enzimas comerciales intensifica la acción de
las enzimas endógenas, enriqueciendo el medio más rápidamente y/o en mayor cantidad con los compuestos cedidos
por los microorganismos. Este tipo de tratamiento es habitual
en bodega, pero no se realiza un seguimiento de lo que ocurre durante la lisis de las lías.
El objetivo de este trabajo es analizar los cambios
que se producen en la distribución y contenido de los polisacáridos liberados durante la autolisis de las lías con adición
de un preparado enzimático comercial, compuesto por pectinasas y β-glucanasas.
En la Bodega Cvne Viña Real se realizaron vinificaciones de Vitis vinífera var. Tempranillo. Tras la fermentación
alcohólica se eliminaron las lías gruesas y se realizó una fermentación maloláctica sobre las lías finas. Finalizada la fermentación maloláctica, se seleccionaron los mejores vinos y
se recuperaron sus lías finas, que se mezclaron en depósitos
de 1000 litros, donde se sulfitaron hasta 40 mg/l de SO2 y se
acidificaron con ácido tartárico (2.5g/l). Las lías se distribuyeron entonces en barricas usadas y a la mitad de las mismas
se les añadieron 15 g/Hl de una mezcla comercial de pectinasas y β-glucanasas (LE o lías con enzimas), a la otra mitad
de las lías no se les aplicó este tratamiento enzimático (LC o
lías control). Todas las barricas, que se giraron diariamente, se
mantuvieron a una temperatura de 10ºC y con nivel de SO2
libre de 25 mg/l. Se tomó una primera muestra de las lías en
los depósitos de mezcla de 1000 litros y posteriormente se tomaron muestras de las lías en las barricas, a los 21 días de su
introducción en barricas y a los 59 días.
La distribución de pesos moleculares de los polisacáridos parietales liberados se realizó mediante HRSEC con
columnas Shodex OHpack KB-803 y KB-805 (30 x 0.8 cm,
Showa Denko, Japan). El método analítico para la cuantificación de polisacáridos se realizó según el método descrito
por Ayestarán et al. [4]. Los polisacáridos se aislaron del resto
de macromoléculas por precipitación en frío con etanol-ácido.
La composición de los residuos glicosídicos se determinó por
GC-FID y GC-MS de sus trimetilsilil-ester O-metil glicósidos
(TMS) tras una metanolisis ácida y derivatización.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La Fig. 1 muestra la distribución de los pesos moleculares de los polisacáridos liberados en las distintas mues-
ISBN 978-84-690-6060-5
tras de lías. Se observa la presencia de 5 picos que eluyen
aproximadamente a los 15, 16.7, 18, 21.3 y 22.8 minutos. Los
tres primeros picos, que corresponden a moléculas con un
peso molecular comprendido entre P-400 (404 kD) y P-5 (5.9
kD), son atribuidos tanto a la presencia de polisacáridos parietales procedentes de las levaduras, como mananos y ma-
noproteínas, como a otros polisacáridos de la uva como arabinogalactoanos, arabinogalactano-proteínas y ramnogalacturanonanos tipo II dímeros [4]. Los dos últimos picos poseen
pesos moleculares menores a P-5 (5.9 kD) y son debidos a
la presencia de polisacáridos de bajo peso molecular o fragmentos de otras moléculas.
Fig. 1. Distribución de pesos moleculares de los polisacáridos mediante HRSEC con columnas Shodex OHpack KB-803 y KB-805. A)
Evolución durante el proceso de autolisis. B) Diferencias entre tratamientos al final del proceso de autolisis
La Fig. 1A muestra la distribución de los pesos moleculares de los polisacáridos liberados a lo largo del proceso
de autolisis. Se puede ver como con el transcurso del tiempo,
el medio se fue enriqueciendo en polisacáridos, fundamentalmente de alto peso molecular. Esto es debido a la autolisis
de las lías donde se ceden polisacáridos parietales al medio
como manoproteínas y glucanos [5].
La Fig. 1B muestra la distribución de los pesos moleculares de los polisacáridos liberados al final del proceso
de autolisis, tanto en las lías tratadas con enzimas como en
las control. Las lías con enzimas poseen una mayor respuesta de moléculas con alto peso molecular que las lías sin
tratamiento enzimático, indicando que las enzimas comerciales adicionadas hidrolizaron en mayor grado las moléculas
de mayor peso molecular.
Las diferencias observadas con la distribución de
los pesos moleculares de los polisacáridos se aprecian también en la Fig. 2, que muestra la evolución en el contenido
de polisacáridos totales en las lías con enzimas y en las control durante todo el tiempo de muestreo. Durante los primeros
21 días de autolisis, en ambos casos se produjo una importante cesión de polisacáridos al medio (56-75%), que continuó de forma más atenuada hasta el final de la autolisis. Si
comparamos los dos tratamientos en la última fecha de
muestreo, se observa como el contenido de polisacáridos fue
un 15% más elevado en las lías con adición de enzimas comerciales.
Entre los azúcares constituyentes de los polisacáridos, la manosa y la glucosa fueron los monosacáridos principales, constituyendo un 60% y un 17% del total
respectivamente en las lías con enzimas, y un 51% y un 8%
en las lías control (datos no mostrados). La presencia de
estos azúcares puede utilizarse como indicativa de la canti-
dad de manoproteínas y glucanos en el medio, ya que la cantidad de manosa es una estimación de la cantidad de manoproteínas [4] y la glucosa de la de glucanos.
En la Fig. 3 se observa la evolución de la concentración de manosa y glucosa en las lías estudiadas. Las lías
iniciales presentaron una cantidad muy superior de manosa
en el medio que de glucosa, indicando un fuerte predominio
de las manoproteínas sobre los glucanos. Durante el proceso
de autolisis se produjo además una fuerte liberación de estos
coloides al medio, tanto en las lías con enzimas como en las
control, aunque fue más acusada en las lías con adición de
enzimas comerciales (Fig. 3A). El caso de la glucosa fue algo
distinto ya que la liberación de este azúcar al medio fue prácticamente nula en las lías control durante todo el proceso de
autolisis, pero no así en las lías con enzimas, donde se produjo un incremento de un 240% (Fig. 3B). Este hecho indica
que la sola acidificación de las lías no produce ningún efecto
sobre los glucanos de las paredes celulares de las lías y que
es necesaria la adición de preparados enzimáticos comerciales con β-glucanasas para romper estos polisacáridos.
Al final del proceso de autolisis, las lías con adición
de enzimas comerciales presentaron un 35 % más de manosa y un 112% más de glucosa que las lías control. Estas diferencias fueron ya perceptibles a los 21 días de la autolisis,
indicando que el proceso de autolisis acelerada podría reducirse considerablemente en el tiempo.
4. BIBLIOGRAFÍA
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5. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo se ha realizado gracias a la financiación del Proyecto API06/B03 de la Universidad de La Rioja.
Polisacáridos Totales (mg/l)
Fig. 2. Evolución de los polisacáridos totales (mg/l) de las lías con enzimas (LE) y las lías sin tratamiento enzimático (LC)
92
Glucosa (mg/l)
Manosa (mg/l)
Fig. 3.Evolución del contenido en A) manosa (mg/l) y B) glucosa (mg/l) de las lías con enzimas (LE) y las lías sin tratamiento enzimático (LC)
ISBN 978-84-690-6060-5
EFECTO DE DIFERENTES TRATAMIENTOS DE AUTOLISIS ACELERADA DE LÍAS DE
LEVADURAS EN EL COLOR DE VINOS TINTOS
Oscar Fernández1; Rocío Rodríguez1, Domingo Rodríguez1, José Barrau1, Jose Mª Ryan2,
Zenaida Guadalupe1, Belén Ayestarán1
1
Departamento de Agricultura y Alimentación. Universidad de la Rioja, C/Madre de Dios 51, 26006 Logroño, La Rioja, España; Tel: +34 941 299 722,
2
Bodega Cvne Viña Real, C/ Carretera Logroño-Laguardia, Km 4.8, Laguardia, Alava, España
Resumen:
El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de la adición del 1% de lías finas autolisadas con distintos tratamientos
en la composición del color del vino durante los dos primeros meses de crianza en barrica. No se observaron diferencias en la
composición del color durante esta corta etapa de crianza.
Palabras clave: autolisados, composición del color, IPTs y crianza sobre lías.
1. INTRODUCCIÓN
La crianza del vino sobre lías finas es una práctica
tradicional de vinificación usada en diferentes países. Durante la crianza sobre lías los componentes celulares de las
levaduras, compuestos intracelulares y polisacáridos parietales como glucanos y manoproteínas, son liberados al vino
por autolisis. La autolisis de las levaduras es un proceso
lento, que puede durar desde meses hasta años. Así, las técnicas de aceleración del proceso de autolisis han adquirido
importancia al lograr en menor tiempo de contacto la liberación de los compuestos celulares al vino. Otra ventaja que
tiene la aplicación de estas técnicas es que el riesgo de contaminantes que afecten negativamente al perfil organoléptico,
como los aromas sulfhídricos de reducción, queda reducido
al volumen de lías finas tratadas y no al vino que se pretende
madurar en barrica con un porcentaje de lías autolisadas. No
obstante este procedimiento supone interrumpir el proceso
de vinificación hasta que finalice la autolisis acelerada.
Entre las técnicas de autolisis acelerada, las más
usadas en bodega son la acidificación y la adición de enzimas comerciales, como β-glucanasas y pectinasas. La acidificación reduce la temperatura óptima de activación del
complejo enzimático responsable de la autodestruccion celular de las levaduras [1]. Las β-glucanasas y pectinasas aceleran la hidrólisis de los polisacáridos parietales de las
levaduras, pero sólo los fragmentos de polisacáridos de bajo
peso molecular se mantienen en suspensión en el vino [2].
Estos polisacáridos, en su rol de coloides protectores, pueden unirse a los compuestos fenólicos del vino tinto, reduciendo su reactividad, aumentando su estabilidad coloidal e
incrementando el color estable [3].
En este trabajo se estudia el efecto de la adición de
un porcentaje de lías finas autolisadas en la composición del
color del vino durante los primeros meses de crianza en barrica. Las técnicas empleadas para obtener las lías finas autolisadas fueron: a) acidificación y b) acidificación combinada
con una mezcla de β-glucanasas y pectinasas. Así mismo,
se estudia la composición del color de las lías al final del proceso de autolisis y del vino tinto antes de introducirlo en barrica.
En la Bodega Cvne Viña Real se elaboró uva de
Tempranillo y durante la maceración-fermentación se aplicaron diferentes técnicas enológicas con el fin de extraer el máximo color de la uva. Tras los trasiegos realizados después
de la fermentación maloláctica, el vino se distribuyó en nueve
barricas nuevas de roble francés de 225 litros. A seis de ellas
se les adicionó un 1% de lías autolisadas: a tres se les añadió un autolisado obtenido por acidificación de las lías finas
(AA), y a las otras tres un autolisado obtenido por combinación de dos técnicas de aceleración, acidificación y empleo
de enzimas β-glucanasas y pectinasas (AC). Las tres barricas
sin adición de autolisado se consideraron como vinos testigo
(T). El periodo de crianza del vino en barrica se inició en el
momento de incorporar los autolisados y finalizará al cabo de
12 meses.
Se tomaron muestras de los autolisados al final del
proceso de autolisis acelerada y del vino testigo sin introducir en barrica. Durante el periodo de crianza, la primera muestra se recogió inmediatamente después de adicionar las lías
autolisadas al vino en barrica y corresponde al día cero de
crianza, y las siguientes a los 30 y 60 días de crianza.
Los parámetros enológicos generales (grado alcohólico, pH, acidez total, acidez volátil y ácido tartárico) fueron realizados de acuerdo a los métodos oficiales de la OIV.
El ácido L-málico y L-láctico se determinó por métodos enzimáticos descritos en los métodos oficiales de análisis de
AOAC. Todas las muestras fueron analizadas en triplicado.
El color rojo del vino (CR), color de la copigmentación (CC), color estable al bisulfito (CEB), color de los antocianos monómeros (CAM) y el índice de polifenoles totales
93
ISBN 978-84-690-6060-5
(IPT) de las muestras se determinó por el método de Levengood y Boulton [4]. Las medidas espectrofotométricas fueron
realizadas en el espectrofotómetro Cary 300 Scan UV-vis
(Varian Inc., Madrid, Spain) usando cubetas de cuarzo de 2
y 10 mm. Todas las muestras fueron analizadas en triplicado
y todos los valores de absorbancia se corrigieron a 10 mm.
Los resultados de los parámetros enológicos generales de las lías al final del proceso de autolisis acelerada se
presentan en la Tabla 1. Se observa que los valores de acidez volátil son normales para este tipo de producto y estos
valores son similares a los obtenidos al inicio del proceso de
autolisis (valores no mostrados). Esto indica que durante el
proceso de autolisis no hubo alteraciones microbianas. La
técnica de acidificación empleada para la autolisis explica los
resultados de pH, acidez total y ácido tartárico.
Tabla 1. Parámetros generales de las lías autolisadas al final de
la autolisis acelerada con acidificación, AA, y con el método
combinado, AC, (acidificación combinada con enzimas
β-glucanasas y pectinasas)
la Tabla 2 se observa que la diferencia entre el color
rojo (CR) del autolisado acidificado y el del combinado fue
baja y que el color de los antocianos monómeros (CAM), de
la copigmentación (CC) y del color estable al bisulfito (CEB)
fue similar en ambos autolisados, al igual que ocurrió con los
valores de IPTs. En ambos autolisados la contribución del
color de los antocianos monómeros al color rojo del vino fue
aproximadamente del 50%, la del color copigmentado aproximadamente del 31% y la del color estable al bisulfito del
18%. En el vino testigo la contribución del color de los antocianos monómeros al color rojo fue del 50%, la del color copigmentado del 28% y la del color estable al bisulfito del 27%.
Tabla 2. Composición del color e índice polifenoles totales de las
lías autolisadas al final de la autolisis acelerada con acidificación,
AA, y con el método combinado, AC, (acidificación combinada con
enzimas β-glucanasas y pectinasas), y del vino testigo (T) antes
de introducirlo en barrica
94
A partir de los resultados de CR, CAM, CC y CEB
de la Tabla 2 se calculó el color teórico (Ct) de CR, CAM, CC
y CEB de la mezcla formada por un 1% de lías autolisadas y
un 99% de vino testigo. Los resultados del color rojo y de sus
componentes obtenidos después de realizar la mezcla en bodega al día cero de crianza se presentan en la Tabla 3. La
correlación entre los resultados del color teórico y los del
color de la mezcla realizada en bodega fue buena (Ct =
0.99Cr – 0.04; r2 = 0.991, siendo Ct = color teórico y Cr = color
real en el día cero de crianza).
Tabla 3. Evolución de la composición del color y del índice
polifenoles totales del vino con 1% de autolisado durante la
crianza en barrica
En el día cero de crianza se observa en la Tabla 3
que los vinos con 1% de autolisado (T+AA y T+AC) tuvieron
valores de Color Rojo (CR) ligeramente superiores al vino
testigo y que estos valores fueron similares en los vinos con
autolisado. La contribución del color de los antocianos monómeros (CAM), de la copigmentación (CC) y del color estable al bisulfito (CEB) al color del vino con lías acidificadas
(T+AA) fue respectivamente del 43%, 29% y 27.5%, valores
similares a los obtenidos en el vino con lías obtenidas con el
tratamiento combinado (T+AC). Esto indica que las técnicas
empleadas de autolisis acelerada afectan de manera similar
a la composición del color rojo del vino. Al comparar la contribución del color de los antocianos monómeros al color del
vino en los vinos con 1% de lías autolisadas y en los vinos
testigo, se obtiene un incremento aproximadamente del 4%
a favor del testigo (46.7% de CAM). Sin embargo, la contribución de los antocianos copigmentados al color rojo del vino
testigo es un 4% más baja que en los vinos con autolisado
(» 29% en ambos casos). Las diferencias entre del color estable al bisulfito en los vinos fueron mínimas.
A los dos meses de crianza se observa una ligera
pérdida del color rojo en todos los vinos respecto al tiempo
cero de crianza (Tabla 3) y además fue similar en todos ellos.
La contribución del color de los antocianos monómeros al
color de ambos vinos autolisados se redujo en un porcentaje
similar, aproximadamente del 2%, mientras que en el testigo
esta reducción fue del 5%. El porcentaje de color debido a la
copigmentación en ambos vinos autolisados se mantuvo y en
el testigo se incrementó un 4%. La contribución del color estable al bisulfito de los vinos incrementó en todos los casos
entre el 1y 2%. En el corto periodo de crianza realizado no se
observaron todavía diferencias del color rojo ni de los IPTs
entre los vinos con autolisado y el testigo. No obstante, en
los vinos con 1% de autolisado, la disminución del porcentaje de color debido a los antocianos monómeros fue menor
que en el testigo en el mismo periodo de tiempo. Es conocido que las reacciones de formación de pigmentos estables
sólo ocurren en presencia de antocianos monómeros, por ello
es necesario continuar con este estudio hasta el final de la
crianza prevista (12 meses).
ISBN 978-84-690-6060-5
4. BIBLIOGRAFÍA
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5. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo se ha realizado gracias a la financiación del Proyecto API06/B03 de la Universidad de La Rioja.
95
ISBN 978-84-690-6060-5
PÉPTIDOS CON BIOACTIVIDAD ECA INHIBITORIA Y ANTIOXIDANTE LIBERADOS
DURANTE LA AUTOLISIS DE LAS LEVADURAS
Encarnación Pueyo, Juan M. Alcaide-Hidalgo, M. Carmen Polo, Adolfo J. Martínez-Rodríguez
Resumen:
Instituto de Fermentaciones Industriales (CSIC). C/ Juan de la Cierva 3, 28006. Madrid. Spain
Se ha estudiado la actividad inhibitoria de la ECA (IECA) y la capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORACFL) de los péptidos aislados en un vino modelo durante la autolisis acelerada. Se ha empleado una cepa de S. cerevisiae y se
ha realizado la toma de muestras a las 6, 24, 48, 121 y 144 horas de autolisis. La concentración de péptidos aumenta durante
la autolisis, mientras que las bioactividades aumentan durante las primeras 121 h, disminuyendo posteriormente. Para
comprender mejor la implicación de los péptidos en las dos bioactividades estudiadas, estos han sido separados en dos
fracciones: F1, constituida por los péptidos hidrofílicos y F2, constituida por los péptidos hidrofóbicos. Los péptidos de la fracción
F2 han resultado ser los máximos responsables de la actividad IECA y ORAC-FL.
Palabras claves: autolisis de levaduras, vino, peptidos, IECA, ORAC-FL
1. INTRODUCCIÓN
En la elaboración de vinos espumosos y de vinos
envejecidos sobre lías, hay un tiempo de envejecimiento del
vino con las células de levadura. Durante ese tiempo tiene
lugar la autolisis de las levaduras [1-2]. Los compuestos nitrogenados son los compuestos mayoritarios que se liberan
durante ese proceso [3-4].
En los últimos años, se han identificado péptidos
con actividad biológica en diferentes alimentos. Muchos de
estos trabajos se basan en el estudio de péptidos con actividad inhibitoria de la enzima convertidora de angiotensina
(IECA) [5-7], enzima implicada en el control de la presión arterial. Sin embargo, tan solo existen dos trabajos sobre la actividad IECA de los péptidos del vino [8-9], y se desconoce si
los péptidos liberados por las levaduras durante la autolisis
pueden presentar actividad IECA.
Los péptidos presentes en los alimentos también
pueden presentar actividad antioxidante [10-11] y algunos autores han encontrado péptidos en alimentos con ambas actividades [5, 12]. Los polifenoles son los compuestos con
actividad antioxidante que se encuentran en mayor proporción en los vinos. Pero algunos autores han encontrado que
péptidos provenientes de hidrolizados de levaduras también
presentan actividad antioxidante [13-14].
El objetivo de este trabajo es evaluar la actividad
IECA y la actividad antioxidante (ORAC-FL) de los péptidos
liberados por las levaduras durante la autolisis acelerada en
un medio vínico modelo.
2.1. Cepa de levadura y condiciones de autolisis
96
Se ha utilizado la cepa comercial de levadura Saccharomyces cerevisiae EC1118, suministrada por Lallemand
(Madrid, España) en forma de levadura seca activa. La hidratación de las levaduras, el lavado de las mismas, el medio
vínico modelo utilizado y las condiciones de incubación para
llevar a cabo la autolisis de las levaduras han sido descritos
por Martínez-Rodriguez y Polo. [15]. La toma de muestra se
llevó a cabo a las 6, 24, 48, 121 y 144 horas.
2.2. Determinaciones analíticas
La concentración de los aminoácidos libres y de
aminoácidos libres más péptidos se determinó siguiendo el
método de ninhidrina-Cd y de ninhidrina convencional, respectivamente [16, métodos 5 y 1]. Los péptidos se cuantificaron por la diferencia entre los resultados obtenidos con los
dos métodos de ninhidrina utilizados.
2.3. Fraccionamiento de los autolisados
El fraccionamiento de los autolisados se llevó a
cabo siguiendo la metodología descrita por Takayanagi and
Yokotsuka [8] usando una columna abierta de 10 X 300 mm
de Cosmosil 140 C18-OPN (Nacalai Tesque Inc., Kyoto,
Japan). Se inyectaron 50 mL de muestra eluyendo la fracción
F1 con agua y la fracción F2 con etanol al 10 %, a un flujo de
2 mL/min. La detección se llevó a cabo a 280 nm. Las fracciones se concentraron a un volumen de 25 mL.
2.4. Actividad inhibitoria de la ECA y antioxidante
La actividad IECA fue determinada siguiendo el método de Cushman y Cheung [17], modificado por HernándezLedesma y col. [18]. El ensayo ORAC-fluoresceina
(ORAC-FL) se llevó a cabo siguiendo el método de Ou y col.
[19], modificado por Dávalos y col. [11].
2.5. Estadística
Se ha llevado a cabo el análisis de la varianza para la comparación de los valores medios. Se ha utilizado el programa
SPSS 14.0 para Windows, version 14.0.1 (Dec. 2005) para
procesar los datos.
ISBN 978-84-690-6060-5
3. RESULTADOS
En la figura 1 se muestra los cambios en la concentración de péptidos durante el proceso de autolisis en la
muestra completa y en las dos fracciones estudiadas, F1 y
F2. En todos los casos la concentración de péptidos aumentó durante la autolisis, excepto en la fracción F1 que experimentó una disminución a las 144 horas. Este
comportamiento se debe a hidrólisis de los péptidos previamentes liberados al medio vínico modelo por las enzimas
proteolíticas que pasan al medio extracelular en etapas tardías de la autolisis, y ha sido descrito anteriormente por otros
autores [3, 15, 20]. Durante toda la autolisis, la concentración
de péptidos en la fracción F2 fue significativamente menor
(p<0,05) que en la fracción F1.
Fig. 1. Evolución del nitrógeno petídico durante la autolisis
acelerada.
actividad IECA, por lo que puede decirse que los péptidos
más hidrofóbicos liberados por las levaduras son los máximos responsables de ambas biactividades.
Fig. 2. Evolución de las bioactividades estudiadas durante la
autolisis acelerada a) Actividad IECA, b) ORAC-FL.
4. CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos han demostrado que los
péptidos liberados por las levaduras durante la autolisis en
un medio vínico modelo presentan actividades multifuncionales, siendo los más activos los péptidos más hidrofóbicos.
Los resultados obtenidos son de gran interés, sobre todo en
vinos elaborados mediante envejecimiento con las levaduras
y en vinos blancos donde el contenido fenólico es muy inferior.
5. BIBLIOGRAFÍA
En la figura 2a se muestra la actividad IECA obtenida para el autolisado completo, así como en las dos fracciones estudiadas, a lo largo de todo el experimento. La
actividad IECA en el autolisado completo, aumenta hasta un
65 % en las primeras 121 h, disminuyendo hasta un 60 % a
las 144 horas. Este comportamiento demuestra que aunque
los péptidos aumentan a lo largo de todo el proceso, los responsables de la actividad IECA disminuyen a las 144 h. La
contribución de la fracción F1 a la actividad IECA es significativamente menor (p<0,05) que la de la fracción F2, a pesar
de que esta presenta una concentración menor de péptidos,
y apenas se modifica desde las 24 horas de autolisis inducida. La fracción F2 experimenta una evolución de la IECA
semejante a la experimentada por el autolisado completo,
siendo esta fracción la máxima responsable de la actividad.
El incremento de péptidos a las 144 horas en la fracción F2
contribuye de forma negativa sobre la actividad IECA, disminuyendo los péptidos activos e incrementándose la concentración de péptidos inactivos.
En la figura 2b se muestran los valores de ORACFL obtenidos para el autolisado completo, así como en las
dos fracciones estudiadas, a lo largo de todo el experimento.
Se observa que en este caso los que presentan un perfil similar son el autolisado total y la fracción F1, aumentando
hasta las 121 horas y disminuyendo posteriormente. Sin embargo, es la fracción F2 la que presenta valores mayores de
ORAC-FL y un comportamiento semejante al obtenido para la
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6. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado por la Comunidad
Autónoma de Madrid (CM-S0505-AGR-0153).
ISBN 978-84-690-6060-5
ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DEL PROCESO DE AUTOLISIS SOBRE LA CAPACIDAD
DE ADSORCIÓN DE OCRATOXINA A (OTA) POR CÉLULAS Y
PAREDES DE LEVADURA
Adolfo J. Martínez-Rodríguez, Yolanda P. Núñez, Encarnación Pueyo, Alfonso V. Carrascosa
Resumen:
Instituto de Fermentaciones Industriales (CSIC). C/ Juan de la Cierva 3, 28006. Madrid. Spain; [email protected]
Para el desarrollo del presente trabajo se utilizó un medio vínico modelo para inducir la autolisis de las levaduras. Se
tomaron muestras en diferentes etapas del proceso. Los resultados obtenidos demostraron que la autolisis afecta a la capacidad
de las levaduras de adsorber OTA del medio vínico. Las levaduras adsorbieron rápidamente la toxina presente en el medio,
pero esta fue liberada de nuevo al mismo durante el transcurso del proceso de autolisis, debido a la degradación de las
estructuras de la pared celular implicadas en la adsorción de la toxina. La concentración de OTA presente en el medio disminuyó
alrededor de un 30% a las 2 h de autolisis, mientras que a las 214 h las levaduras solo retuvieron el 1% de la OTA. Este
comportamiento coincidió con el incremento de la concentración de proteínas y de manosa en el medio vínico durante la autolisis,
lo que demuestra la implicación de estos componentes parietales en la adsorción de la ocratoxina A. Este efecto fue observado
al utilizar lías de levadura para la descontaminación, pero no al utilizar paredes. El tratamiento térmico previo de las lías (85 ºC,
10 min.) provocó que se incrementara significativamente la adsorción de OTA y que esta se mantuviese inalterable durante todo
el experimento.
Palabras claves: autolisis, levaduras, vino, ocratoxina A, manoproteínas
1. INTRODUCCIÓN
La OTA es una micotoxina producida por hongos
de los géneros Aspergillus y Penicillium. El origen de la OTA
en la uva y productos derivados se atribuye fundamentalmente al desarrollo de la especie Aspergillus carbonarius [1].
La OTA es nefrotóxica, teratogénica, hepatotóxica y carcinogénica. Después de los cereales, se ha identificado al vino
como segundo alimento implicado en la ingesta de OTA [2].
Por esta razón, la Organización Internacional de la Viña y el
Vino (OIV) ha propuesto recientemente [3] el límite de 2 mg
/L como la concentración máxima aceptable de OTA en vinos.
Este valor ha sido establecido definitivamente por la Unión
Europea [4] como el límite máximo de OTA que se puede admitir en mostos y vinos a partir de la vendimia del año 2005.
Entre los procedimientos de descontaminación estudiados hasta el momento, el empleo de lías de levadura o
paredes celulares parece ser uno de los más prometedores
[5-7], debido fundamentalmente al papel determinante que
juegan las levaduras en el proceso de fermentación. Se ha
observado que la capacidad descontaminante de las levaduras depende de la cepa utilizada, y aunque existen controversias en cuanto al mecanismo implicado en este proceso,
es la adsorción de la toxina la hipotesis más aceptada. En
este contexto, algunas levaduras actuarían como “esponjas”
adsorbiendo la OTA presente en el vino durante el proceso de
elaboración. Sin embargo, no se ha estudiado como se afectaría la capacidad de adsorción de las lías durante su envejecimiento con el vino. Durante el envejecimiento de las lías
con el vino tiene lugar la autolisis de las levaduras, un proceso de autodegradación celular que comienza una vez que
la célula muere y en el que se hidrolizan tanto estructuras
intracelulares como diversos componentes de la pared celu-
lar. Precisamente, el objetivo fundamental del presente trabajo ha sido evaluar la influencia del proceso de autolisis en
la capacidad de eliminación de la OTA por parte de las levaduras y paredes de levadura.
2.1. Material biológico, condiciones de autolisis y
determinaciones analíticas
Como material biológico se utilizó la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae EC1118, suministrada por
Lallemand (Madrid, España) en forma de levadura seca activa y una preparación comercial de paredes celulares de levadura suministrada por Laffort (Guipúzcoa, España). La
simulación de la autolisis de las levaduras en condiciones
enológicas se llevó a cabo utilizando un vino modelo y siguiendo el procedimiento descrito por Martínez-Rodríguez y
Polo [8]. La concentración de OTA en el medio modelo fue de
10 mg/L y la concentración final de levaduras fue de 1 g/L.
Para la detección y cuantificación de la OTA se empleó HPLC de fase inversa acoplado a un detector de fluorescencia, siguiendo la metodología descrita por Visconti y
col. [9]. La determinación de proteínas [10] y aminoácidos [11]
se realizó empleando métodos colorimétricos. La cuantificación de la manosa y la glucosa liberada durante la autolisis se
llevó a a cabo mediante cromatografía de gases de los trimetilsililderivados [12].
2.2. Estadísticas
Se llevó a cabo un análisis de la varianza de dos vías, usando
99
ISBN 978-84-690-6060-5
3. RESULTADOS
En la Fig. 1 se muestran los resultados obtenidos en
la eliminación de la OTA presente en el vino modelo. Las levaduras adsorbieron en las 2 primeras horas aproximadamente un 30% de la OTA presente en el medio, mientras que
el valor máximo de adsorción de la preparación de paredes
celulares utilizada fue menor (22%). Con el transcurso de la
autolisis se pudo comprobar como la OTA adherida a las levaduras se libera nuevamente al medio vínico, llegando a alcanzar desde las 166 horas prácticamente la concentración inicial.
% de adsorción
Fig. 1. Cambios en la capacidad de adsorción de la OTA (%)
de las levaduras y paredes durante la autolisis
inducida en medio vínico.
100
Sin embargo, el comportamiento observado en el
caso de las paredes celulares fue significativamente diferente
(p<0,05), y su capacidad de descontaminación fue bastante
más estable, pasando de un valor máximo del 22% a las 2
horas hasta aproximadamente un 18 % al final del experimento. El estudio indirecto de la autolisis mediante el análisis de la concentración de proteínas y aminoácidos liberados
al medio vínico modelo permitió confirmar que el patrón de
liberación de la OTA de las paredes celulares de las levaduras coincidió con etapas avanzadas del proceso de autolisis
(más de 100 h de incubación). En etapas avanzadas de la
autolisis, las enzimas hidrolíticas activas actúan sobre diversos componentes de la pared celular, creando poros de gran
tamaño que incluso permiten el paso de las enzimas al medio
extracelular.
Estos resultados sugieren que en el proceso de
eliminación de la toxina por adsorción aparecen implicados
compuestos de la pared celular de las levaduras que se afectan durante el proceso de autolisis. Como se ha demostrado
previamente que las manoproteínas presentes en la pared
celular de las levaduras podrían estar implicadas en la eliminación de toxinas de orígen fúngico [13] y están relacionadas con otros procesos que involucran mecanismos de
adsorción [14], llevamos a cabo un análisis del comportamiento de la fracción de manoproteínas parietales durante la
autolisis de las levaduras.
En la Fig. 2 se representan los resultados obtenidos
del análisis de la manosa presente en el medio vínico en las
diferentes etapas de la autolisis, tanto para las levaduras
como las paredes celulares. Como se puede observar en los
experimentos realizados con levaduras, la mayor disminución en la capacidad de adsorción de la OTA coincide en el
tiempo con un incremento casi exponencial la concentración
de manosa en el medio vínico (166 h y 214 h). Estos resultados demuestran la implicación de las manoproteínas parietales en la adsorción de la OTA, y como este proceso se ve
afectado con la hidrólisis de las mismas durante la autolisis
de las levaduras. En cambio, el comportamiento observado
con la autolisis de las paredes fue diferente, y la cantidad de
manosa liberada significativamente menor (p<0,05), lo que
demuestra que en el proceso de obtención de las paredes
celulares se han eliminado una gran parte de las enzimas hidrolíticas que participan en la autolisis. Este hecho se traduce
en una capacidad de adsorción relativamente constante por
parte de las paredes, a diferencia de las lías de levadura.
El tratamiento térmico previo de las levaduras
(85ºC, 10 min.), permitió que las lías mantuviesen su capacidad de adherencia durante todo el experimento, probablemente debido al daño térmico de la batería enzimática que
participa en los procesos de degradación autolítica. Adicionalmente, el tratamiento térmico incrementó la capacidad de
adherencia de las lías de levadura, elevándola aproximadamente a un 40%. Aunque las causas de este comportamiento
no se han estudiado, es probable que el tratamiento térmico
aumentara los sitios disponibles sobre la pared celular para
la adsorción de la OTA, incrementando de esta forma la eficiencia del proceso de descontaminación.
Fig. 2. Liberación de manosa (mg/L) al medio vínico durante
la autolisis inducida de levaduras y paredes.
mg/L Manosa
el test de Student-Newman-Keuls. Se ha utilizado el programa SPSS 14.0 para Windows, version 14.0.1 (Dec. 2005)
para procesar los datos.
3. CONCLUSIONES
La pared celular de las levaduras, y las manoproteínas constituyentes de la misma, participan de forma activa
en la eliminación de la OTA del medio vínico utilizado a través
de mecanismos de adsorción. La degradación enzimática
que tiene lugar durante la autolisis afecta de forma significa-
ISBN 978-84-690-6060-5
tiva la capacidad de adsorción de la toxina por parte de las levaduras. La inactivación de estas enzimas hidrolíticas por
calor permite utilizar las lías de levadura en el proceso de
descontaminación de la OTA sin que se afecten sus propiedades de adsorción, mejorando incluso la eficiencia del proceso de descontaminación. El uso de paredes celulares en
lugar de levaduras permite obtener una capacidad de adsorción más constante que se afecta menos por la autolisis.
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5. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado por los proyectos
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Científicas (CSIC) y AGL2004-06933-CO2-01/ALI, de la Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología (CICYT).
101
ISBN 978-84-690-6060-5
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LEVADURAS TOLERANTES A ALTAS
CONCENTRACIONES DE AZÚCARES
Teresa García-Martínez1, Oscar Maestre1, Rafael Andrés Peinado2, Juan José Moreno2,
Juan Carlos Mauricio1
1
2
Resumen:
Departamento de Microbiología. Universidad de Córdoba. Campus Universitario de Rabanales. Edificio Severo Ochoa.
Tlf: 957218640, e-mail: [email protected]
Departamento de Química Agrícola y Edafología. Universidad de Córdoba. Campus Universitario de Rabanales. Edificio Marie Curie.
Mostos con elevada concentración de azúcares sufren a menudo paradas de fermentación o fermentaciones lentas.
Esto puede favorecer el desarrollo de microorganismos indeseables, que aumentan la acidez volátil y originan vinos de baja
calidad. El objetivo ha sido seleccionar levaduras capaces de fermentar mostos procedentes de uva pasificada “Pedro Ximénez”,
e intentar inmovilizar a las más adecuadas para la producción de vinos dulces. Se han aislado siete levaduras procedentes de
un mosto de uva pasificada después de su fermentación (11,5%, v/v, de etanol y azúcares iniciales 480 g/L), y se ensayaron
microfermentaciones en medios con concentraciones crecientes de glucosa (25-50% p/v). Se ha estudiado el crecimiento celular,
cinética de fermentación, contenido final de etanol y glucosa residual. Los resultados se compararon con los obtenidos por tres
levaduras con alta tolerancia al etanol. Con la excepción de la cepa X2P, todas las cepas aisladas son potencialmente idóneas
para fermentar mostos de uva pasificada. Las cepas X5 y G1 fueron seleccionadas para su inmovilización con el hongo
filamentoso H3, y se realizaron fermentaciones con 500 g/L de glucosa. Las fermentaciones con células inmovilizadas resultaron
más eficientes que las mismas con células libres, y se demostró que la muerte del hongo ocurre por contacto entre célula-hifa.
Palabras clave: glucosa, levadura, tolerancia, inmovilización.
1. INTRODUCCIÓN
102
Saccharomyces cerevisiae es un hongo sacarofílico
y en su hábitat se encuentra con elevadas concentraciones
de azúcares. Sin embargo, cuando se usa para fermentar
mostos con alta concentración en azúcares se presentan una
serie de problemas como son paradas de fermentación y fermentaciones lentas, que son debidas a la elevada presión
osmótica y al efecto tóxico del etanol sobre las levaduras. La
parada prematura de fermentación produce vinos de baja calidad y estabilidad que favorece el crecimiento de microorganismos no deseables, que pueden producir una elevada
acidez volátil [1]. Así, se recomienda el uso de cepas de levaduras tolerantes a la presión osmótica y al etanol. Las
cepas de Saccharomyces cerevisiae exhiben diferentes comportamientos de fermentación bajo condiciones de estrés [2].
Zuzuarregui y Del Olmo [3] describieron un sistema de selección de levaduras basado en la resistencia a las condiciones de estrés que se producen durante la producción de vino.
También, se ha investigado la expresión de genes de respuesta a estrés de azúcares, con el objetivo de analizar los
efectos debido a la particular hiperosmolaridad generada por
las altas concentraciones de glucosa en los mostos [4]. Los
resultados indican que la respuesta molecular a estas condiciones es compleja y está influenciada por multitud de factores. Una posible solución a la parada y enlentecimiento de la
fermentación de mostos con elevada concentración de azúcares podría ser la aplicación de células de levadura inmovilizadas tolerantes a altas concentraciones de azúcar y etanol.
Así, el objetivo de este trabajo ha sido por un lado aislar, caracterizar y seleccionar levaduras osmo-etanol tolerantes, y
por otro lado inmovilizar células de levadura mediante un
nuevo sistema de inmovilización desarrollado por nuestro
equipo de investigación y realizar fermentaciones con elevada concentración de glucosa.
2.1. Microorganismos,
fermentaciones
medios
de
cultivo
y
A partir de un mosto de uva pasificada Pedro Ximénez con 480 g/L de azúcares y fermentado hasta 11,5% (v/v)
de etanol, se han aislado y seleccionado 7 cepas de levadura
(X2P, X2, X3, X4, X5, X6 y X9). También se han utilizado para
este estudio tres cepas de Saccharomyces cerevisiae de
nuestra colección (E1, F12 y G1) tolerantes al etanol, la primera aislada de un mosto en fermentación y las dos últimas
de un velo de flor de la D.O. de Montilla-Moriles. Las inoculaciones se realizaron con 4 x 106 células/mL. Para los experimentos de inmovilización se ha usado el hongo filamentoso
H3 (Penicillium) aislado del ambiente y las cepas de levadura
G1 y X5. El medio de crecimiento ha sido YPD (1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 5% de glucosa, p/v), las
células se incubaron a 28ºC durante 24 horas en un agitador
orbital a 200 rpm. Se han realizado microfermentaciones con
cada cepa de levadura en medio YPD, previamente esterilizado a vapor fluente durante 30 minutos, con una concentración creciente de glucosa de 25 a 50% (p/v) en tubos
Falcon de 50 mL pinchados con una aguja hipodérmica a
24ºC y a 150 rpm hasta que se dio por finalizada la fermentación. El procedimiento y el medio de inmovilización celular
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fue el mismo que el descrito por Peinado et al. [5], formándose las correspondientes biocápsulas de levadura. Se han
realizado dos fermentaciones con células inmovilizadas en
un medio YPD con 50% (p/v) de glucosa. Previamente a la
inoculación con las biocápsulas, éstas habían fermentado un
medio YPD con 50% (p/v) de glucosa durante 4 días y luego
se lavaron dos veces con el mismo medio fresco. Para comprobar que el hongo filamentoso muere, durante la primera
fermentación, por contacto célula de levadura-hifa se han realizado fermentaciones con tubos de diálisis según Nissen et
al., [6], donde las esferas de hongo filamentoso se introdujeron dentro de los tubos y las células de levadura se mantuvieron fuera de los mismos.
nes de glucosa. Las cepas mostraron velocidades de fermentación similares a concentraciones de glucosa menores
de 38% (p/v), con la excepción de la cepa X2P, que fue
menor. A partir de esta concentración las velocidades de fermentación disminuyeron. En la Fig. 1 se representa la velocidad de fermentación de cada cepa de levadura en la
fermentación con un 50% (p/v) de glucosa, las velocidades
más rápidas de fermentación se observaron para las cepas
X2 y X5.
Fig. 2. Contenido en etanol alcanzado por las cepas en las
fermentaciones comprendidas entre 25 y 50 % (p/v) de glucosa
El recuento de células se ha realizado en un contador de partículas Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer
(Beckman). La cinética de fermentación se ha seguido según
la pérdida de peso de cada tubo de fermentación. La glucosa
y el etanol se han cuantificado según los kits enzimáticos específicos de Boehringer-Mannheim, Alemania.
% Etanol (v/v)
2.2. Métodos analíticos
3. RESULTADOS
Como se ha descrito en la sección material y métodos se han usado diez cepas de levaduras para realizar microfermentaciones con distintas concentraciones de glucosa,
entre 25 y 50% (p/v), en medio YPD. El número de generaciones alcanzado por todas las cepas cuando fermentaron
entre 25 y 38% (p/v) de glucosa fue alrededor de 6, y éste
comenzó a disminuir ligeramente a partir de esta última concentración, excepto para las cepas X2P y X4 que mostraron
una disminución más drástica. Se sabe que el crecimiento
celular de las levaduras se inhibe con concentraciones elevadas de azúcar y por la acumulación de etanol.
Fig. 1. Velocidad de fermentación de las células libres e
inmovilizadas frente al tiempo en medio YPD con un 50 % (p/v)
de glucosa. La monitorización se realizó por pérdida de peso de
los tubos de fermentación debido al desprendimiento de CO2
Una elevada concentración de azúcares también
afecta la actividad fermentadora de las levaduras. En este
trabajo se ha estudiado la evolución de la velocidad de producción de CO2 en medio YPD con diferentes concentracio-
La cepa que produjo una mayor concentración de
etanol en todos los casos fue la cepa X5 (Fig. 2). Así pues, se
ha seleccionado la cepa X5, como mayor productora de etanol, y la cepa G1, como altamente tolerante a éste, para los
experimentos con células inmovilizadas. Ambas levaduras se
co-inmovilizaron separadamente con el hongo H3 de una manera natural sin usar soportes externos. La velocidad de fermentación fue más rápida en las fermentaciones realizadas
con células inmovilizadas (Fig. 1).
La Tabla 1 representa los contenidos en etanol y
glucosa residual en los medios fermentados con un 50% (p/v)
de glucosa.
Tabla 1: Contenido en etanol y glucosa residual en las
fermentaciones con un 50% (p/v) de glucosa
También se ha demostrado en este trabajo mediante experimentos con tubos de diálisis que durante la primera fermentación las células de levadura matan al hongo
filamentoso mediante el contacto físico célula-hifa.
103
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4. CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos sugieren que las cepas X5
y G1 tanto en forma libre como inmovilizada, son potencialmente útiles para la elaboración de vinos dulces naturales a
partir de mostos con elevada concentración de azúcares
como los obtenidos a partir de uva pasificada.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. CARIDI, A.; CRUCITTI, P; RAMONDINO, D. 1999. Winemaking of must at high osmotic strength by thermotolerant yeast. Biotechnol. Lett. 21, 617-620.
2. ZUZUARREGUI, A.; DEL OLMO, M. 2004. Expression
of stress genes in wine strains with different fermentative behavior. FEMS Yeast Res. 4, 699-710.
3. ZUZUARREGUI, A.; DEL OLMO, M. 2004. Análisis of
stress resistance under laboratory conditions constitute a suitable criterion from wine yeast selection.
Antonie Leeuwenhoek 85, 271-280.
104
4. ERASMUS, D.J.; VAN DER MERWE, G.K.; VAN VUUREN, H.J.J. 2003. Genome-wide expresión analices:
metabolic adaptation of Saccharomyces cerevisiae to
high sugar stress. FEMS Yeast Res. 2, 375-399.
5. PEINADO, R.A.; MORENO, J..J.; MAESTRE, O.; MAURICIO, J.C. 2005. Use of a novel immobilization yeast
system for winemaking. Biotechnol. Lett. 27, 14211424.
6. NISSEN, P.; NIELSEN, D; ARNEBORG, N. 2003. Viable
Saccharomyces cerevisiae cells at high concentrations cause early growth arrest of non-Saccharomyces yeasts in mixed cultures by a cell-cell
contact-mediated mechanism. Yeast 20, 331-341.
6. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado por el Proyecto
AGL2005-01232/ALI concedido por el Ministerio de Educación y Ciencia de España y Fondos FEDER.
ISBN 978-84-690-6060-5
ECOLOGÍA DE LAS FERMENTACIONES ESPONTÁNEAS DE MOSTOS Y SU
RELACIÓN CON LA CALIDAD
M. Maqueda1, T. Montero2, P. Cotilla2, M.L. Álvarez2, E. Zamora2, M. Ramírez1
1
Departamento de Ciencias Biomédicas (Área de Microbiología), Universidad de Extremadura, Avda Elvas s/n, Badajoz, España.
Tlfno: 924289426. [email protected] .
2
Resumen:
Estación Enológica, Conserjería Agricultura y Medio Ambiente. Junta de Extremadura. Almendralejo, Badajoz, España.
Se analizaron los parámetros físico-químicos, la población microbiana y la calidad de 106 vinos elaborados mediante
fermentación espontánea en diferentes bodegas. La calidad del vino disminuyó significativamente al aumentar la acidez volátil
por la presencia de una alta población de levaduras no-Saccharomyces y bacterias en fase tumultuosa, que compiten con
Saccharomyces. La acidez volátil se incrementó en los vinos con finales de fermentación lentos por la presencia de bacterias
y por la existencia de azúcares residuales en el vino debido a la escasa población de S. cerevisiae. Sin embargo, cuando
dominaron las levaduras Saccharomyces cerevisiae durante fermentación tumultuosa y su biodiversidad fue alta, la calidad del
vino mejoró significativamente. El uso de anhídrido sulfuroso disminuyó la población de microorganismos indeseables,
favoreciendo el desarrollo de S. cerevisiae, acortando el inicio y el final de fermentación, disminuyendo la acidez volátil y, por
tanto, mejorando la calidad del vino.
Palabras clave: Fermentación, Saccharomyces, no-Saccharomyces, apiculadas, calidad.
1. INTRODUCCIÓN
En la fermentación espontánea del mosto se produce por una sucesión de poblaciones de levaduras, procedentes de la viña o de la bodega que empieza con especies
poco fermentativas presentes en el fruto (Hanseniaspora/Kloeckera, Pichia, Candida) y disminuyen al imponerse las levaduras S. cerevisiae, responsables principales de la
fermentación (1). Se ha descrito que diferentes proporciones
de cada levadura en diferentes estadios de fermentación pueden afectar al aroma del vino produciendo ésteres al principio de fermentación y ciertos alcoholes al final. Por esto, la
dominancia de cada levadura en cada estadío de fermentación determina el aroma final del vino (3).
1.1. Materiales
Análisis microbiológico: toma de muestras al inicio de fermentación (IF), fermentación tumultuosa (FT) y final
de fermentación (FF). Se realizó recuento de viables totales,
Saccharomyces sp., no-Saccharomyces, apiculadas y bacterias. Las cepas de Saccharomyces sp. se diferenciaron por
RFLP del mitDNA mediante electroforesis en gel de agarosa
0,7%. Las imágenes fueron capturadas con el sistema GelDoc (BioRad) y analizadas mediante el software Diversity Database (BioRad). Los microorganismos distintos de
Saccharomyces se diferenciaron según la morfología de la
colonia y aspecto al microscopio.
Índices de biodiversidad: Se calcularon los índices de biodiversidad de Simpson (Ds) y de Shannon- Wienner (H):
Ds= 1/Σ(fi/N)2
H= - Σ[(fi/N)ln(fi/N)]
donde: N= nº total de la población de la muestra
fi= nº individuos de la subpoblación microbiana
Fermentación espontánea de 106 mostos procedentes de 5 zonas diferentes de Extremadura en 5 vendimias. 67 se fermentaron sin ningún tipo de corrección
prefermentativa, y 39 fueron corregidos con 50mg/l de anhídrido sulfuroso y ácido tartárico hasta pH 3.5 antes de la fermentación.
Análisis organoléptico: expresado en porcentaje
de aceptación calculado restándole a 100 la puntuación de
las fichas de cata penalizadoras.
Análisis estadístico: test no paramétrico de MannWhitney y test de correlación de Spearman con el software
SPSS versión 12.0 para Windows (Chicago, IL).
Seguimiento de fermentación: Medidas diarias de
densidad, ºBrix y temperatura. T15, tiempo en días que tardan los microorganismos en consumir el 15% de los azúcares del mosto. T100, tiempo en días que tardan los
microorganismos en consumir el 100% de los azúcares del
mosto.
La dinámica de las 106 vinificaciones se pueden
agrupar en tres tipos distintos: a) S. cerevisiae domina desde
inicio hasta final de fermentación. b) Aparecen varias subpoblaciones de microorganismos en inicio de fermentación y S.
cerevisiae se impone sólo al final. Son las fermentaciones espontáneas más frecuentes (2). c) S. cerevisiae no aparece a
1.2. Métodos
3. RESULTADOS
105
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lo largo de la fermentación. Es el caso de fermentaciones de
uvas podridas.
La presencia de poblaciones altas de Saccharomyces al inicio de fermentación acortó el tiempo de arranque de
la misma (T15 menor) y previno el crecimiento de levaduras
no-Saccharomyces (Tablas 1 y 2). Además, el crecimiento de
Saccharomyces a lo largo de la fermentación, principalmente
en fermentación tumultuosa, previno el crecimiento de apiculadas y bacterias, controlando la acidez volátil y agotando
los azúcares del mosto (Tabla 1), mejorando la calidad del
vino.
La presencia de apiculadas al inicio de fermentación provocó inicios de fermentación incontrolados (T15
menor) y favoreció el crecimiento de bacterias y levaduras
no-Saccharomyces (Tabla 2). El crecimiento de no-Saccharomyces durante fermentación tumultuosa coincidió con el
desarrollo de bacterias durante todo el proceso y de apiculadas al final de fermentación. Además, produjo un aumento de
la acidez volátil que disminuyó la calidad de los (Tabla 2). Finales largos de fermentación (T100 mayor) coincidieron con
un aumento de la acidez volátil y menor agotamiento de los
azúcares del vino, con el riesgo de futuras alteraciones microbianas.
A pesar de todo esto, y siempre que Saccharomyces dominó, la presencia de otros microorganismos durante
la fermentación tumultuosa favoreció la calidad del vino final,
la aceptación aumentó al aumentar el índice de biodiversidad
de Shannon-Wiener (Tabla 1).
Tabla 1. Correlación de Spearman entre el número de cada tipo de microorganismo
(viables/ml), el índice de biodiversidad de Shannon-Wiener de microorganismos totales en los
diferentes estadíos de la fermentación, y los parámetros del vino. Sólo se muestran las
correlaciones significativas.
Tabla 2. Correlación de Spearman entre el número de cada tipo de microorganismo
distintos a Saccharomyces (viables/ml), y los parámetros del vino.
Sólo se muestran las correlaciones significativas.
106
ISBN 978-84-690-6060-5
Para controlar la población microbiana distinta a
Saccharomyces se realizaron fermentaciones espontáneas
(Tabla 3) de mostos pretratados con SO2 y se compararon
con las realizadas con mostos sin pretratamiento. El SO2 disminuyó significativamente la población de no-Saccharomyces (p=0,019) y apiculadas (p=0,000) al inicio de
fermentación aumentando la biodiversidad de las cepas do-
minantes de S. cerevisiae durante la fermentación tumultuosa
(Índice de biodiversidad de Simpson mayor en vinos pretratados, p=0.045), disminuyó el tiempo de arranque, la duración de la fermentación, la producción de acidez volátil, de
láctico, se mantuvieron las cantidades iniciales de málico, y
mejoró la aceptación de los vinos.
Tabla 3. Test no-paramétrico de Mann-Whitney para estudiar el efecto del pretratamiento
fermentativo con SO2 en la ecología de las fermentaciones espontáneas.
Sólo se muestran los parámetros con diferencias significativas.
4. CONCLUSIONES
La presencia y desarrollo de las poblaciones de
Saccharomyces sp. limitan el crecimiento de otros microorganismos distintos a lo largo de la fermentación, pero sobre
todo durante la fermentación tumultuosa, periodo de mayor
actividad metabólica y determinante en la producción de compuestos que afectan a la calidad del vino.
El pretratamiento de los mostos con SO2 limitó el
crecimiento de microorganismos indeseables, favoreció el
desarrollo de más cepas distintas de S. cerevisiae, mejorando el proceso de elaboración y la calidad del vino.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. Fleet, H. F., and G. M. Heard. 1993. Yeast growth during
fermentation, p. 27-54. In G. H. Fleet (ed.), Wine Micro-
biology and Biotechnology. Harwood Academic Publishers, Newark, N.J.
2. Ribéreau-Gayon, P., D. Dubourdieu, B. Donèche, and
A. Lonvaud. 2003. Tratado de Enología: Microbiología
del vino. Vinificaciones., 1998 ed, vol. 1. Hemisferio Sur
S.A., Buenos Aires, Argentina.
3. Vianna, E., and S. E. Ebeler. 2001. Monitoring Ester Formation in Grape Juice Fermentations Using Solid Phase
Microextraction Coupled with Gas Chromatography-Mass
Spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry.
49(2):589 - 595.
6. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado por los proyectos:
IFD97-1074 (DIGESIC, FEDER I+D), 2PR01B002 y
2PR04B003 (Junta de Extremadura). Matilde Maqueda ha
sido becaria del Ministerio de Educación y Ciencia.
107
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BIODIVERSIDAD DE LEVADURAS EN UNA BODEGA DE PAGO
María Chacón, Mª Jesús Ortiz, Nuria Barrajón, Ana Briones.
Tecnología de los Alimentos. Facultad de Química. Universidad de Castilla La Mancha. Avda. Camilo José Cela, 10, 13071, Ciudad Real.
Teléfono: 926295300 ext 3478. e-mail: [email protected]
Resumen:
La elaboración del vino es un proceso microbiológico dinámico en el que ocurre una sucesión de especies y de cepas
de levaduras. La fermentación espontánea de los mostos, se lleva a cabo aún en algunas bodegas de Pago, como la que es
objeto de nuestro estudio. Resulta interesante conocer si en el proceso de vinificación participan una o varias cepas dominantes,
o si por el contrario, existe una gran biodiversidad en la población de Saccharomyces.
La finalidad de este estudio es conocer la variabilidad genética de las cepas vínicas que participan en la fermentación
de los mostos de una bodega de Pago, con la finalidad de seleccionar una/s cepas de levaduras autóctonas para poder ser
usada como cultivo iniciador en la elaboración de los vinos de la citada bodega.
Se muestrearon doce depósitos, en diferentes etapas de fermentación, de las variedades Tempranillo, Shiraz,
Cabernet Sauvignon y Petit Verdot, obteniendo un total de 172 aislados. La presencia de no Saccharomyces fue escasa (3%)
y sólo se aislaron en la variedad Cabernet Sauvignon. Las levaduras Saccharomyces se identificaron a nivel de cepa mediante
restricción del DNA mitocondrial, resultando un total de 21 perfiles genéticos diferentes. La mayor diversidad se encontró en la
variedad Cabernet, y la menor en la de Petit Verdot; se hallaron cuatro cepas dominantes, otros perfiles solo agrupaban a un
3% de las levaduras
Palabras clave: Saccharomyces, Fermentación espontánea, Biodivesrsidad.
1. INTRODUCCIÓN
108
La fermentación alcohólica es la transformación
más importante en la que las levaduras, utilizan los azúcares
y otros componentes de la uva, como sustratos para su crecimiento; convirtiéndolos en etanol, dióxido de carbono y
otros productos metabólicos que contribuyen a la composición química y a la calidad sensorial del vino.
Desde hace años se conoce que la fermentación
espontánea de los mostos por métodos tradicionales, no se
lleva a cabo por una única especie o cepa de levadura, sino
que el vino, es el resultado de la acción combinada de varias
cepas que se desarrollan progresivamente a lo largo del proceso. El concepto de cepa es lo que tiene importancia en una
fermentación industrial ya que pequeñas diferencias genéticas implican diferente comportamiento fermentativo, así en
un mismo tanque coexisten cepas con distintas características enológicas, y sólo las mejores adaptadas predominan y
perduran hasta al final del proceso. Por tanto la elaboración
del vino es un proceso microbiológico dinámico en el que hay
una sucesión de especies y cepas.
Este tipo de fermentaciones favorece la complejidad del vino, pero sus efectos no son predecibles. Por ello,
durante los últimos años, algunas bodegas han usado para la
elaboración de sus vinos, cultivos puros o mezclas de levaduras aisladas de sus propios mostos en fermentación, con
la convicción de que una mejor adaptación de las cepas al
entorno ecológico puede beneficiar la calidad del vino y, que
éste mantenga las peculiaridades sensoriales típicas de cada
región.
El objetivo de este trabajo es el estudio de la dinámica de poblaciones de levaduras Saccharomyces durante
la fermentación alcohólica de diferentes mostos procedentes
de una bodega de Pago localizada en la región de La Mancha, con el fin de seleccionar una levadura con buenas cualidades enológicas y adaptadas al entorno ecológico de la
bodega para usarse como cultivo iniciador.
Durante la vendimia 2006, se muestrearon depósitos de distintas variedades de uva (Cabernet Sauvignon,
Tempranillo, Petit Verdot, Shiraz,) en distintas etapas de fermentación (Inicio, Mitad y Final), resultando un total de 12
muestras.
Cada mosto/vino y sus diluciones seriadas se sembraron en Agar YPD adicionado de tetraciclina y propionato
sódico. Tras el periodo de incubación a 28 ºC / 48 h, las placas correspondientes a las diluciones contables, se replicaron sobre Agar lisina, con el fin de poder seleccionar las
colonias de Saccharomyces. Se eligieron, al azar, 20 colonias de cada muestra.
Los cultivos se crecieron en caldo YPD durante 18
horas. La extracción del DNA y su posterior análisis de restricción se efectuaron siguiendo el protocolo propuesto por
Querol y colaboradores (1992).
ISBN 978-84-690-6060-5
3. RESULTADOS
Del crecimiento en medio lisina, resultó que solo 20
aislados de las muestras de inicio de fermentación correspondían a levaduras no Saccharomyces, encontradas mayoritariamente en el mosto de la variedad Cabernet-Sauvignon.
Por comparación entre las placas de agar YPD y las
de agar lisina, se seleccionaron 172 aislados de Saccharomyces. Cuando se extrajo el DNA de estos aislados, se sometió a restricción y se obtuvieron sus perfiles genéticos.
Tras la comparación de las huellas genéticas de cada una de
las levaduras, éstas se agruparon en un total de 21 perfiles
moleculares distintos, algunos de los cuales se muestran en
la Fig. 1.
En la Fig. 3, se observa la biodiversidad de cepas
de Saccharomyces en la vinificación de las distintas variedades estudiadas. De los 21 perfiles genéticos encontrados, 9
son mayoritarios y, algunos exclusivos de ciertas variedades;
así, el perfil C se aisló en todas las variedades, y en alta proporción; el J aunque en menor cantidad, se halló en casi
todos los tanques; los perfiles A y B son característicos de
Cabernet Sauvignon y Petit Verdot, en cambio M y T son típicos de la variedad Tempranillo. En Shiraz se presentan mayoritariamente las cepas E y H
Fig 3. Biodiversidad de cepas de Saccharomyces en la
vinificación de las variedades tempranillo (T), Shiraz (S),
Cabernet Sauvignon (CS) y Petit Verdot (PV)
Fig. 1. Perfiles de DNAmt de las cepas de Saccharomyces
obtenidos con la enzima de restricción HinfI
4. CONCLUSIONES
La distribución de los aislados en función de sus
perfiles genéticos y de la muestra de la que proceden se recoge en la Fig. 2. Respecto a la dinámica poblacional de
cepas de Saccharomyces, se observa como al inicio del proceso hay mayor variabilidad de cepas, y como a medida que
avanza la fermentación alcohólica ocurre una sucesión de
poblaciones: individuos que desaparecen y son sustituidos
por otros nuevos mejor adaptados a las condiciones ambientales; esta sucesión de cepas es usual en este tipo de
fermentaciones espontáneas. El 26% de los individuos presentaban idéntico perfil (C), por tanto se trataba de un patrón
genético implantado en la bodega; el perfil denominado A incluía al 16% de los aislados, seguido del E con un 11%. Otros
perfiles como el B y M agruparon a un 9%. Los perfiles H y J
agruparon al 7%. Otros (F y T) se encontraron con un porcentaje entorno al 3%, y en el resto de los perfiles se recogieron tan solo uno o dos aislados.
Fig. 2. Distribución de los diferentes perfiles genéticos hallados
en función de la muestra de procedencia
T: Tempranillo; S: Shiraz; CS: Cabernet Sauvignon; PV: Petit Verdot. I: Inicio;
M: Mitad; F: Final
El estudio de la biodiversidad de esta bodega de
Pago, que elabora vinos de alta gama, permitirá iniciar el análisis de las características enológicas de las distintas cepas
encontradas, con la finalidad de seleccionar una/s levadura/s
para la elaboración de sus vinos.
Las cepas mayoritarias halladas, están muy bien
adaptadas y probablemente se encontrarán entre las idóneas
para usar en la vinificación, aportando sus características metabólicas peculiares.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. FERNÁNDEZ, M.; ESPINOSA, J.C., ÚBEDA, J., BRIONES, A. 2001. Yeasts present during wine fermentation: comparative analysis of conventional plating
and PCR-TTGE. Syst Appl Microbiol 96, 639-644.
2. ESTEVE-ZARZOSO, B., GOSTINCAR, A., BOBET, R.,
URUBURU, F., QUEROL, A. 2000. Selection and molecular characterization of wine yeasts isolated from
the ‘El Penedes’ area (Spain). Food Microbiol 17, 553562.
3. QUEROL, A., BARRIO, E., HUERTA, T., RAMÓN D.
4. VILANOVA, M., MARTÍNEZ, C., SIEIRO, C., MASSNEUF,
I., DUBOURDIEU, D. 2003. Ecology of Saccharomyces
cerevisiae in spontaneous fermentations at Rías Baixas Appelation Controle winery. J Inst-Brew.109, 305308
109
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CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DE Oenococcus AISLADAS DE LA FERMENTACIÓN
MALOLÁCTICA DE VINOS TINTOS CENCIBEL ELABORADOS EN
CASTILLA-LA MANCHA: DISEÑO DE UN CULTIVO INICIADOR
P.M. Izquierdo1; S. Seseña2; P. Ruiz2; M. Ll. Palop2
1
Instituto de la Vid y del Vino de Castilla-La Mancha (IVICAM). Crta. Toledo-Albacete s/n. 13700 Tomelloso (Ciudad Real), Spain.
926 508060. [email protected]
2
Resumen:
Universidad de Castilla-La Mancha, Facultad de Ciencias del Medio Ambiente, Campus Tecnológico de la Fabrica de Armas,
Avda. Carlos III s/n. 45071 Toledo.
Se ha realizado la caracterización de 84 cepas de Oenococcus oeni aisladas de muestras de vino tomadas en distintas
etapas de la fermentación maloláctica en bodegas de Castilla-La Mancha. Las propiedades ensayadas han sido la capacidad
para realizar la FML en presencia de elevadas concentraciones de alcohol y bajos pHs, la acidez volátil producida y las
actividades α y β-glucosidasa y xilosidasa. El tratamiento estadístico de los resultados obtenidos permite concluir que ninguna
de las cepas analizadas presenta propiedades significativamente diferentes.
Palabras clave: Fermentación maloláctica, glucosidasas, acidez volátil, Oenococcus oeni.
1. INTRODUCCIÓN
110
La fermentación maloláctica (FML) es una etapa
clave en el proceso de obtención de vinos tintos de calidad
que, tradicionalmente, ocurre de manera espontánea, con la
participación de la microbiota láctica presente en las bodegas. No obstante, y dado que el vino es un medio desfavorable para el crecimiento de estas bacterias, en ocasiones este
proceso transcurre lentamente o incluso puede no llegar a
producirse.
Actualmente, y para evitar estos problemas, se
tiende a utilizar cultivos iniciadores compuestos por bacterias lácticas seleccionadas. Los cultivos iniciadores comercializados están constituidos por cepas de Oenococcus oeni
si bien, y al objeto de mantener las características de identidad de los vinos, es conveniente utilizar cepas autóctonas
seleccionadas que presenten excelentes propiedades tecnológicas.
El proceso de selección requiere de la caracterización previa de las cepas presentes en el proceso espontáneo, en las que se ensayaran las propiedades de mayor
interés, como son la capacidad para realizar la FML (% ácido
málico degradado), el crecimiento a grados alcohólicos elevados y pHs bajos y la producción de acidez volátil. Algunos
autores consideran además de gran interés conocer la actividad glucosidasa que poseen estas cepas, por su contribución al aroma de los vinos.
El objetivo de este estudio es la caracterización tecnológica de 84 cepas de Oenococcus oeni aisladas de muestras de vino tinto de la variedad Cencibel, para lo que se han
realizado las siguientes determinaciones: capacidad para realizar la FML en presencia de elevadas concentraciones de
alcohol (12% y 14%) y bajos pHs (3,5 y 3,3), producción de
acidez volátil y determinación de actividades glucosidasa (α
y β glucosidasa y xilosidasa).
2.1. Cepas
Se han analizado 84 cepas de Oenococcus oeni
procedentes de 16 muestras de vino tinto de la variedad Cencibel tomadas en distintas etapas de la FML en 8 bodegas de
Castilla-La Mancha en la vendimia del 2005.
2.2. Ácido málico degradado a distintos pHs y grados
alcohólicos
Se han ensayado tres condiciones: 12% (v/v) de
etanol y pH 3,5, 12% (v/v) de etanol y pH 3,3 y 14% (v/v) de
etanol y pH 3,5. Sólo aquellas cepas que degradaron más
del 40% del acido málico disponible con un 12% (v/v) de etanol y pH 3,5 se ensayaron en las restantes condiciones.
Los ensayos se han realizado en tubos que contenían 10 mL de un medio sintético compuesto por mosto concentrado (5mL/L), extracto de levadura (5 g/L) y ácido málico
(2g/L), que se llevaba al grado alcohólico deseado (12% ó
14%) con etanol absoluto y a pH 3,3 y 3,5 con una solución
de HCl 1N. Estos tubos eran inoculados al 1% (v/v) con un
cultivo en caldo MLO (Medium Leuconostoc oenus) que contenía una población de células igual a 106 ufc/mL.
En todos los casos los tubos se incubaban a 22ºC
en aerobiosis y tras 7 días se determinaba el porcentaje de
ácido málico degradado y el número de células viables por el
método de recuento en placa en agar MLO.
2.3. Producción de acidez volátil
Se han llevado a cabo pruebas de inducción de la
FML en muestras de vino del final de la fermentación alcohólica, determinándose la acidez volátil producida por cada
ISBN 978-84-690-6060-5
una de las cepas tras este proceso. Para ello, muestras de
100 mL de vino con un 13% (v/v) de alcohol y pH 3,6 que
contenían 2 g/L de ácido málico eran inoculadas al 1% (v/v)
con un cultivo de la cepa en estudio que contenía una población de células adecuada para conseguir 106 ufc/mL en el
vino. Estos cultivos se incubaban a 22ºC hasta la transformación total del ácido málico en ácido láctico.
Figura 1: Ácido málico degradado por las 36 cepas de
Oenococcus oeni seleccionadas, en un medio sintético a
distintos grados alcohólicos y pHs
2.4. Determinación de actividades glucosidasa
El 21,4% de las cepas ensayadas degradaron
menos del 40% del ácido málico tras 7 días de incubación
por lo que no fueron utilizadas en los ensayos posteriores.
36 de las 66 cepas restantes degradaron más del 20% del
ácido málico cuando se incubaban en el medio sintético con
un 14% de etanol y a pH 3,5 y fueron por ello seleccionadas
para los ensayos posteriores. La Fig. 1 muestra los resultados obtenidos para estas 36 cepas en las tres condiciones
ensayadas, observándose que para la mayoría de las cepas,
el porcentaje de ácido málico degradado disminuye de manera muy acusada al aumentar el grado alcohólico y, en
menor medida, al disminuir el pH. La cepa menos afectada
por el pH y el grado alcohólico fue la F12L17 en la que no se
observó una disminución en el % de ácido málico degradado.
Ninguna de las 36 cepas produjo más de 0,2 g/L de
ácido acético durante la incubación.
Los valores de las actividades glucosidasa oscilaron entre 0,05 y 1,95U para la α-glucosidasa, entre 0,16 y
9,61U para la β-glucosidasa y entre 0,00 y 3,17U para la xilosidasa. El tratamiento estadístico ANOVA aplicado a los resultados de este estudio permitió seleccionar 11 cepas, que
mostraron una actividad significativamente mayor con los tres
sustratos ensayados, y que fueron nuevamente ensayadas
utilizando un pH de 3,5 y 14% (v/v) de etanol. La Fig. 2 muestra los resultados obtenidos para cada una de las 3 actividades en las condiciones iniciales del ensayo (parte superior de
la Figura) y el descenso observado en cada una de ellas a pH
3,5 y 14% de etanol (parte inferior de la Figura).
Figura 2: Unidades de actividad glucosidasa (U) (α y β
glucosidasa y xilosidasa) en las 11 cepas seleccionadas a
pH 5,5 (Figura superior) y % de reducción de las actividades a
pH 3,5 y 14% de etanol (Figura inferior)
Actividad Enzimática (U)
3. RESULTADOS
En 7 de las 11 cepas, la actividad α-glucosidasa fue
superior a la β- glucosidasa, siendo la actividad xilosidasa la
menor en 10 de las cepas seleccionadas. Merece ser destacada la actividad β-glucosidasa de la cepa E10L2 en la que,
a pesar de que la actividad residual a pH 3,5 y 14% de etanol fue tan sólo un 4% del valor inicial, se mantenía como una
de las cepas con mayor actividad β- glucosidasa, entre las
ensayadas.
Reducción de la actividad (%)
Se han determinado tres de estas actividades: la βglucosidasa, la α-glucosidasa y la xilosidasa, según el procedimiento descrito por Grimaldi et al. (2000) [1], utilizándose
como sustratos el p-nitro-fenil-β-D-glucopiranósido (10 mM),
el p-nitro-fenil-α-D-glucopiranósido (10 mM) y el p-nitro-fenilxilopiranósido (7,5 mM), respectivamente. Los resultados se
han expresado como unidades de actividad (U) definidas
como milimoles de p-nitrofenol liberado por minuto y por miligramo de peso seco de células.
Los resultados obtenidos en este primer ensayo fueron sometidos a un tratamiento estadístico (ANOVA) y aquellas
cepas que mostraron una actividad significativamente mayor,
fueron ensayadas en las condiciones de pH y grado alcohólico
(pH 3,5 y 14% de etanol) más habituales en la fermentación
maloláctica. El método utilizado para estas determinaciones
fue el indicado anteriormente, ajustando el pH del tampón a
3,5 con HCl 1N y añadiendo la cantidad necesaria de etanol
absoluto para alcanzar los 14 grados alcohólicos.
La actividad xilosidasa fue en 10 de las 11 cepas
estudiadas la más afectada por el pH y el grado alcohólico,
con una reducción que osciló entre el 82 y el 99%. Por el contrario las actividades α-glucosidasa y β- glucosidasa mostraron reducciones entre el 42 y el 89% y entre el 38% y el 96%,
respectivamente. El tratamiento ANOVA aplicado a los resultados de las actividades glucosidasa a pH 3,5 y 14% (v/v) de
etanol, puso de manifiesto que la cepa E10L2 tenía una actividad significativamente mayor.
111
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4. CONCLUSIONES
El tratamiento estadístico de los resultados obtenidos (% ácido málico degradado, acidez volátil y actividades
glucosidasa) ha mostrado que ninguna de las cepas analizadas es significativamente diferente, lo que hace necesario
plantear estudios adicionales para la selección de aquella/s
con mejores propiedades.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. GRIMALDI, A.; MALEAN, H.; JIRANEK, V. 2000. Identification and partial characterization of glycosidic ac-
112
tivities of comercial strains of the lactic acid bacterium, Oenococcus oeni. Am. J. Enol. Vitic. 51, 362-369.
6. AGRADECIMIENTOS
Este estudio ha sido realizado con las subvenciones recibidas de la Junta de Comunidades de Castilla-La
Mancha (PCC-05-003-02) y de la Universidad de Castilla-La
Mancha (TC20070091). P. Ruiz es becaria de la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha.
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BIODIVERSIDAD MOLECULAR DE LAS LEVADURAS SACCHAROMYCES “SENSU
STRICTO” PRESENTES EN FERMENTACIONES ESPONTÁNEAS DE EXTREMADURA
M. Maqueda1, I.M. Barrio Vélez1, M.L. Álvarez2, E. Zamora2, M. Ramírez1
1
Departmento de Ciencias Biomédicas (Área de Microbiología), Universidad de Extremadura, Avda Elvas s/n, 06071 Badajoz, España.
Tfno: 924289426. [email protected]
2
Resumen:
Se analizaron 3399 levaduras Saccharomyces “sensu stricto” procedentes de 106 fermentaciones espontáneas de
mostos de 4 zonas vitícolas de Extremadura. De los 137 patrones de RFLP de ADNmit encontrados, el 82.5% fueron nuevos,
el 13.1% ya fueron descritos previamente, y el 4.4% coincidieron con levaduras seleccionadas comerciales. Algunos patrones
estuvieron más representados que otros, así el 80% de las levaduras se corresponden con sólo el 13.9% de los patrones.
Aunque la biodiversidad de cada fermentación varió significativamente según el año, se observaron tres modelos distintos: 1)
Un patrón de RFLPs domina la fermentación coexistiendo con otros minoritarios que se suceden modificando el índice de
biodiversidad durante la fermentación; 2) Sucesión de patrones variando o no el índice de biodiversidad; 3) Los mismos patrones
se mantienen durante toda la fermentación sin sucesión ni variación de la biodiversidad. La presencia de bacterias al inicio de
fermentación, y de levaduras killer en fase tumultuosa y final de fermentación, disminuyó significativamente la biodiversidad de
la población de Saccharomyces. No se encontró relación entre el grado de biodiversidad de la población de Saccharomyces y
la complejidad organoléptica del vino.
Palabras clave: Saccharomyces, cepas, RFLP, biodiversidad.
1. INTRODUCCIÓN
En la fermentación espontánea de los mostos se
produce una sucesión de poblaciones de levaduras que empieza con especies poco fermentativas pero numerosas que
disminuyen al aumentar la concentración de etanol en el
medio, dominando entonces las levaduras S. cerevisiae indígenas (1), entre las que también puede ocurrir una sucesión de cepas debido a las interacciones entre las mismas y
a la presencia de un medio estresante potencialmente selectivo como es el mosto-vino (2). Al ser la subpoblación de Saccharomyces la dominante puede determinar la calidad del
vino, y su efecto puede depender de la diversidad de su población y de la dinámica de las distintas cepas.
1.1. Materiales
3999 levaduras Saccharomyces “sensu stricto” aisladas de fermentaciones espontáneas de 106 mostos procedentes de 4 zonas de Extremadura en 5 vendimias
diferentes.
1.2. Métodos
Seguimiento de fermentación: Medidas diarias de
densidad, ºBrix y temperatura.
Análisis microbiológico: toma de muestras al inicio de fermentación (IF), fermentación tumultuosa (FT) y final
Saccharomyces “sensu stricto”, no-Saccharomyces, apicula-
das y bacterias. Las cepas de Saccharomyces sp. se diferenciaron por RFLP del mitDNA (3) mediante electroforesis
en gel de agarosa 0,7%. Las imágenes fueron capturadas
con el sistema GelDoc (BioRad) y analizadas con el software
Diversity Database (BioRad).
Índices de biodiversidad: Se calcularon los índices de biodiversidad de Simpson (Ds) y de Shannon- Wienner (H):
Ds= 1/Σ(fi/N)2
H= - Σ[(fi/N)ln(fi/N)]
donde: N= nº total de la población de la muestra
fi= nº individuos de la subpoblación microbiana
las fichas de cata penalizadoras.
Análisis estadístico: test ANOVA de 1 vía, test no
paramétrico de Mann-Whitney y test de correlación de Spearman, todo con el software SPSS 12.0 para Windows (Chicago, IL).
3. RESULTADOS
Se detectaron 137 patrones de mitDNA correspondientes a sendas cepas diferentes de Saccharomyces, presentes en distinta proporción en el total de levaduras
analizadas (Tabla 1).
De ellos, 19 patrones aparecieron con una frecuencia mayor de 1% y en conjunto se corresponden con el 80%
de las levaduras analizadas (13.9% de los RFLP totales). El
45.22% del total de levaduras correspondieron a sólo dos de
estos patrones, P84 y P88. El 20% de las levaduras corres-
113
ISBN 978-84-690-6060-5
pondieron a 118 patrones minoritarios con frecuencia menor
de 1%. El 82.5% de los 137 patrones se aislaron por primera
vez en este estudio, el 13.9% ya fueron descritos previamente, y el 3.6% coincidieron con patrones de levaduras seleccionadas comerciales, y además estos últimos se
encuentran entre los patrones más frecuentes, de 1.21% a
6.97% (Tabla 1).
Tabla 1. Número y porcentaje de las diferentes cepas de
Saccharomyces “sensu stricto” presentes en las
fermentaciones espontáneas
La biodiversidad de las cepas de Saccharomyces
durante la fermentación varió de unas vinificaciones a otras,
y dependió del año (Tabla 2) y del estado fitosanitario de la
uva (Tabla 3). No obstante, la dinámica de los patrones durante fermentación pudo agruparse en tres modelos (Fig. 1):
1) Un patrón de RFLPs domina la fermentación coexistiendo
con otros minoritarios que se suceden modificando el índice
de biodiversidad durante la fermentación (Fig.1A); 2) Sucesión de patrones, variando o no el índice de biodiversidad
(Fig.1B); 3) Los mismos patrones se mantienen durante toda
la fermentación sin sucesión ni variación de la biodiversidad
(Fig.1C). La frecuencia de cada tipo fue 59.21%, 26.32%, y
14.47% respectivamente.
El índice de biodiversidad varió significativamente
(p=0.009) con el año de vendimia (Fig. 2), con índices más
altos en 2000 (Hs = 1.6), 2002 y 2005 (Hs = 1.2 en ambos
casos) (Fig. 2B). La diferencia entre el 2000 y 2005 se debe
a la frecuencia de las diferentes cepas de Saccharomyces
que se impusieron durante la fermentación (Fig.2A). En el
2005 hubo mayor número de cepas frecuentes (codominaron mayor número de cepas), haciendo el Índice de Simpson
significativamente (p=0.019) mayor (Ds = 3.1) al de 2002 (Ds
= 2.8).
La biodiversidad también varió significativamente
(p=0.041) según el estado fitosanitario de la uva (Tabla 3).
Fue menor en fermentaciones de uvas deterioradas que en
Fig. 1. Tres ejemplos modelo de dinámica de poblaciones de Saccharomyces “sensu
stricto” encontradas en las 106 fermentaciones espontáneas.
Fig. 2. Evolución de la biodiversidad total de Saccharomyces “sensu stricto” con los años.
A: Índice de Simpson (Ds). B: Índice de Shannon-Wiener (Hs).
114
ISBN 978-84-690-6060-5
las de uvas sanas. Esto pueden deberse a la mayor presencia de bacterias al inicio de fermentación en las uvas deterioradas, aunque no fue estadísticamente significativa (Tabla
2) que impiden el desarrollo de más cepas diferentes de Saccharomyces en fermentación tumultuosa (Tabla 3).
Tabla 2. Test no-paramétrico de Mann-Whitney para estudiar el
efecto del estado fitosanitario de la uva sobre la biodiversidad de
Saccharomyces “sensu stricto” y sobre el número de bacterias en
las fermentaciones espontáneas.
La presencia de levaduras killer durante la fermentación tumultuosa también influyó negativamente sobre la biodiversidad de la población de Saccharomyces (Tabla 3). Las
cepas killer matan a las sensibles reduciendo el número
cepas distintas en la población.
Tabla 3. Correlación de Pearson entre el número de cada tipo de
microorganismo (viables/ml), el porcentaje de levaduras killer, y
los índices Ds y H de microorganismos totales en los diferentes
estadíos de la fermentación.
4. CONCLUSIONES
Aunque la población de Saccharomyces “sensu
stricto” fue muy diversa en el conjunto de las fermentaciones
espontáneas, sólo dos patrones, P84 y P88, representaron
un 45,22% de las levaduras totales, el resto de los patrones
aparecieron con frecuencias inferiores al 7%, y la gran mayoría de ellos (80%) no superó el 1%.
La biodiversidad de Saccharomyces “sensu stricto”
dependió del año, del estado fitosanitario de la uva, y de las
interacciones intra e interespecíficas de las poblaciones de
los distintos microorganismos, pero no determinó la calidad
del vino.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. HEARD, G. M., AND G. H. FLEET. 1985. Growth of natural yeast flora during the fermentation of inoculated wines. Appl. Environ. Microbiol. 38(1):22-25.
2. HOWELL,K.S., BARTOWSKY,E.J., FLEET,G.H., HENSCHKE,P.A. 2004. Microsatellite PCR profiling of Saccharomyces cerevisiae strains during wine
fermentation. Letters in Applied Microbiology. (38): 315320.
3. QUEROL, A., E. BARRIO, AND D. RAMÓN. 1992. A
comparative study of different methods of the yeast
strain characterization. System. Appl. Microbiol.(15):439-446.
6. AGRADECIMIENTOS
No se encontró relación entre el grado de biodiversidad de la población de Saccharomyces y la calidad organoléptica del vino.
115
ISBN 978-84-690-6060-5
LIBERACIÓN Y FORMACIÓN DE AROMAS VARIETALES A PARTIR DE PRECURSORES
“GLICOSÍDICOS” PROCEDENTES DE VARIEDADES NEUTRAS DURANTE EL
TRANSCURSO DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
Natalia Loscos, Purificación Hernández-Orte, Juan Cacho, Vicente Ferreira
Laboratorio de Análisis del aroma y Enología. Dpto Química Analítica. Facultad de Ciencias. Universiad de Zaragoza. C/ Pedro Cerbuna, 12. 50009 Zaragoza.
Telf. 976762076. E-mail: [email protected]
Resumen:
En este trabajo se ha llevado a cabo la fermentación alcohólica de un mosto adicionado con extracto de precursores
procedentes de diferentes variedades de uvas neutras, utilizando para ello 3 levaduras del tipo Saccharomyces cerevisiae. Los
vinos obtenidos fueron analizados mediante análisis sensorial descriptivo y GC-MS. En todos los casos, la adición de precursores
dio lugar a un aumento de las notas florales de los vinos obtenidos. Se observó que la concentración de 51 de los 79 compuestos
químicos determinados era dependiente de la adición de precursores y, para la mayoría, de la levadura utilizada. De los
compuestos determinados, tan sólo β-damascenona, β-ionona y los vinilfenoles superaron sus umbrales de olfación. Sin
embargo, se comprobó que ciertos compuestos ejercen una acción concertada sobre el aroma.
Palabras clave: glicosídos, aromas, S. Cerevisiae, vino, fermentación alcohólica.
1. INTRODUCCIÓN
Desde el descubrimiento de los precursores glicosídicos en los años 70 se ha llevado a cabo una intensa investigación, sin embargo, todavía quedan muchos
interrogantes por resolver acerca del papel que juegan las
moléculas aromáticas que derivan de ellos sobre las propiedades sensoriales de los vinos, especialmente en el caso de
los procedentes de variedades neutras. Es un hecho que en
el caso de estas variedades, los aromas varietales se forman
durante la fermentación alcohólica, no obstante, no se sabe
todavía con claridad de qué moléculas precursoras proceden,
ni cuál es el papel de la levadura en la formación de estos
aromas. Los objetivos de este trabajo son determinar qué
moléculas aromáticas se forman por acción de las levaduras
durante la fermentación alcohólica a partir de fracciones de
precursores y cuál es el papel sensorial que juegan éstas en
el aroma del vino.
116
Para la obtención del extracto de precursores, se
utilizaron uvas de las variedades Macabeo, Sauvignon Blanc,
Merlot y Parraleta, procedentes de la D.O. Somontano
(2005). Los precursores procedentes tanto de los hollejos
como del mosto para cada variedad (1.5Kg) fueron extraídos
mediante SPE utilizando resinas LiChrolut EN y siguiendo un
protocolo similar al descrito por Ibarz et al. [1]. Finalmente,
los extractos procedentes de las 4 variedades se juntaron
para dar lugar a la mezcla (160mL disolución acuosa 50%
EtOH) utilizada para adicionar los mostos. Se utilizaron 3 levaduras del tipo S. cerevisie, AR2 (L1), NT 116 (L2) y QA23
(L3). Las fermentaciones de laboratorio se llevaron a cabo
por triplicado a partir de mosto de la variedad Macabeo
(2005). La cantidad de precursores adicionada fue aproximadamente el doble de la concentración presente en el
mosto. Se llevó a cabo la determinación de los aromas fermentativos de los vinos obtenidos utilizando el método propuesto por Ortega et al. [2] (extracción L-L y GC-FID) y de
los aromas minoritarios utilizando el método propuesto por
Lopez et al. [3] (SPE y GC-MS). Los tests sensoriales fueron
llevados a cabo por personal del laboratorio con gran experiencia en análisis sensorial. Para el análisis descriptivo, el
panel escogió 8 descriptores (Fig. 1) cuya intensidad debía
ser puntuada utilizando una escala 0-3. El efecto sensorial
de los odorantes identificados fue estudiado mediante tests
triangulares, en los cuales los odorantes fueron adicionados
a un vino sintético (10% EtOH, 5g/L ácido tartárico, pH 3.2).
3. RESULTADOS
3.1. Análisis sensorial descriptivo
Los resultados del análisis sensorial descriptivo
pueden verse en la fig. 1. Como puede verse en la figura, los
vinos obtenidos a partir de mostos adicionados de precursores presentan en todos los casos un aumento de la nota floral. Se obtuvieron resultados muy variables en función de la
levadura para el resto de descriptores.
3.2. Composición cuantitativa de los vinos obtenidos
En la tabla 1 se muestran las concentraciones de
una parte de los aromas determinados. Como puede verse,
la composición aromática de los vinos obtenidos depende
significativamente de la adición de los precursores al mosto
y de la levadura utilizada en la fermentación.
ISBN 978-84-690-6060-5
Fig. 1: Telas de araña correspondientes a los vinos obtenidos con (LA) y sin (L) adición de precursores para las levaduras 1, 2, 3 (datos
correspondientes a 3 réplicas). *Diferencia significativa para un nivel de confianza de P>0.95; ** para P>0.99.
Tabla 1. Concentración de aromas (µg/L) (media de 3 réplicas). a,b,c,d,e: Diferentes letras indican diferencias significativas para un nivel de
confianza del 95%. N.d.: no detectado. NA,A: sin y con adición de extracto de precursores, respectivamente. 1Significativo factor levadura,
2
Significativo factor adición (resultados ANOVA 2 factores, nivel confianza 95%).
117
ISBN 978-84-690-6060-5
El efecto de la levadura no solo fue evidente en el
caso de los compuestos fermentativos sino también en compuestos de origen pre-fermentativo o varietal. En cuanto a los
aromas fermentativos, se observó que la levadura 2, era particularmente activa en la síntesis de compuestos procedentes
del metabolismo de aminoácidos (isobutanol, acetato de isoamilo o alcohol isoamílico), mientras que la levadura 3, producía una mayor concentración para aquellos compuestos
procedentes del metabolismo de ácidos grasos (acetaldehído, butirato de etilo o el ácido hexanoico). En el caso de los
compuestos varietales, el efecto de la levadura es más complejo, y los únicos hechos claros son, la mayor producción de
vinilfenoles por parte de la levadura 3; que los vinos obtenidos con la levadura 1 contienen las menores cantidades de
Z-3-hexenol, δ-lactonas y cinamatos, y las mayores de E-2hexenol y γ-lactonas; y que los vinos obtenidos con la levadura 3 presentan las mayores concentraciones de δ-lactonas.
La adición de precursores afecta a compuestos de prácticamente todos los orígenes bioquímicos, incluyendo varios
compuestos fermentativos. Los mayores incrementos de concentración se observaron en el grupo de las vainillas. Otros
compuestos que presentan incrementos importantes son cinamato y dihidrocinamato de etilo, guaiacol, acetovanillona y
β-ionona. El análisis de muestras control (mostos no fermentados, adicionados con extracto de precursores) muestra
que para la mayoría de compuestos el proceso de hidrólisis
ácida tiene una contribución despreciable (datos no presentados). Dichas muestras contenían cantidades relativamente
altas de ácido 2-etilhexanoico, 2-fenoxietanol, etilparaben,
vainilla, siringaldehido, β-citronelol y furfural; y menores concentraciones (menos del 15% del total formado) de guaiacol,
vanillato de metilo y linalol.
3.2. Efectos sensoriales ligados a la adición de
precursores
Los incrementos de concentración ligados a la adición de precursores fueron para la mayoría de compuestos
poco importantes en relación a su umbral de olfación (excepto para β-damascenona, β-ionona, 4-vinilfenol y 4-vinilguaiacol). Por tanto, el efecto sensorial de los odorantes se
estudió agrupando los compuestos más relevantes en función de su estructura química u origen bioquímico (norisoprenoides, terpenos, fenoles, cinamatos, lactonas y vainillas).
Cuando los grupos cinamatos, lactonas, terpenos y vainillas
fueron adicionados conjuntamente, se observó una clara di-
118
ferencia sensorial (aumento de las notas dulces y florales),
la cual no se observaba al añadir estos grupos individualmente. Este efecto sensorial significativo se mantenía incluso
al eliminar uno de los grupos. No obstante, al adicionar solamente 2 de los 4 grupos, tan sólo se observó la existencia de
un efecto aditivo o sinérgico cuando se adicionaron conjuntamente terpenos y cinamatos.
4. CONCLUSIONES
Este trabajo ha demostrado que parte del aroma varietal de los vinos procedentes de variedades neutras, se
debe a la presencia de un cierto número de compuestos, que
aunque se encuentran presentes en bajas concentraciones y
presentan bajos valores de aroma, ejercen una acción conjunta sobre el aroma final del vino. Estos compuestos se forman durante la fermentación alcohólica bajo la acción de las
levaduras, sin embargo, la naturaleza de las moléculas precursoras deberá ser determinada en estudios posteriores.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. IBARZ, M.J.; FERREIRA, V.; HERNANDEZ-ORTE, P.;
LOSCOS, N.; CACHO, J. 2006. Optimization and evaluation of a procedure for the gas chromatographicmass spectrometric analysis of the aromas generated
by fast acid hydrolysis of flavor precursors extracted
from grapes. J. Chromatogr. A 1116 217-229.
2. LOPEZ, R.; AZNAR, M.; CACHO, J.; FERREIRA, V.
2002. Determination of minor and trace volatile compounds in wine by solid-phase extraction and gas
chromatography with mass spectrometric detection.
J. Chromatogr. A 966 167-177.
3. ORTEGA, C.; LOPEZ, R.; CACHO, J.; FERREIRA, V.
2001. Fast analysis of important wine volatile compounds Development and validation of a new method
based on gas chromatographic-flame ionisation detection analysis of dichloromethane microextracts. J.
Chromatogr. A 923 205-214.
6. AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen la financiación del Ministerio
de Educación y Ciencia (proyecto AGL2004-06060). N.L ha
recibido una beca del programa FPU.
ISBN 978-84-690-6060-5
ESTUDIO DE LA IMPOSICIÓN DE UNA CEPA DE Acetobacter pasteurianus EN LA
PRODUCCIÓN INOCULADA DE VINAGRE DE VINO POR EL MÉTODO
TRADICIONAL Y SUMERGIDO
Carlos Vegas(1), Wendu Tesfaye(2), Carla Jara(1), Estibaliz Mateo(1), Ángel González(1),
Lourdes Morales(2), M. Carmen García Parrilla(2), José Manuel Guillamón(1), Montse Poblet(1),
Albert Mas(1), Ana Troncoso(2), Mª Jesús Torija(1)
(1)
Departamento de Bioquímica y Biotecnologia, Facultat d‘Enologia. Universitat Rovira i Virgili. C/ Marcel.lí Domingo s/n. 43007 Tarragona. Tlf 977558464;
Fax: 977558232; email: [email protected]
(2)
Resumen:
Área de Nutrición y Bromatología. Facultad de Farmacia. Universidad de Sevilla. C/ P. García González Nº 2. 41012. Sevilla.
El vinagre de vino puede ser obtenido por dos métodos de acetificación: cultivo superficial o sumergido; siendo las
bacterias acéticas las responsables de la acetificación. El presente estudio tiene como objetivo hacer un seguimiento de la
inoculación de una cepa de Acetobacter pasteurianus en dos acetificaciones llevadas a cabo por dos métodos diferentes:
sumergido y superficial. Para la identificación a nivel de especie, se empleó la técnica de PCR-RFLP del 16S rDNA y a nivel de
cepa, la técnica de (GTG)5-PCR. Los resultados mostraron que en el cultivo superficial la cepa inoculada se impuso a lo largo
de la acetificación; sin embargo, esta cepa no fue aislada en el cultivo sumergido, predominando en este caso, dos cepas de
Gluconacetobacter hansenii. Esta falta de imposición puede deberse al cambio tan extremo de condiciones a las que fue
sometida la cepa, con continuo aporte de oxígeno. La aparición de Ga. hansenii puede deberse a que estas condiciones
adversas hayan favorecido el desarrollo de otras cepas y especies minoritarias que no se habían detectado y que pueden
encontrarse en el inóculo por contaminación durante su proliferación en la vinagrería.
Palabras clave: cultivo superficial, cultivo sumergido, A. pasteurianus, Ga. hansenii
1. INTRODUCCIÓN
Las Bacterias acéticas (BA) son microorganismos
Gram negativos, elipsoidales, que poseen un metabolismo
aerobio estricto con el oxígeno como último aceptor de electrones. Las BA son las responsables del proceso de acetificación transformando el etanol en ácido acético. La
producción de vinagre puede realizarse por dos métodos bien
diferenciados que influyen en su calidad final. Por un lado, el
método tradicional o de Orleans que aún siendo una acetificación lenta consigue vinagres de gran calidad y riqueza aromática y por otro lado, el método rápido obtenido con
sistemas de cultivos sumergidos y aireación forzada. En este
último, a pesar de que el tiempo se reduce considerablemente el producto final sufre una notable pérdida en su calidad organoléptica.
Hasta ahora, los cultivos de BA utilizados en la producción de vinagres son cultivos mixtos. Esto es debido en
parte, a la falta de métodos de identificación fiables, lo que ha
impedido una buena selección y mantenimiento de posibles
cultivos iniciadores. Recientemente se han descrito técnicas
de biología molecular rápidas y de fácil manejo como la PCRRFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) del
16S rDNA [1], la técnica de ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) o REP-PCR (Repetitive Extragenic Palindromic) [2] que permiten diferenciar las
bacterias acéticas a nivel de género, especie e incluso a nivel
de cepa.
El presente estudio tiene como objetivo hacer un seguimiento de la inoculación de una cepa de Acetobacter pasteurianus (AVF2) en dos acetificaciones llevadas a cabo una
de ellas, por el método de cultivo superficial y la otra, por el de
cultivo sumergido. Para realizar el seguimiento de la cepa inoculada se utilizaron métodos rápidos de biología molecular.
2.1. Preparación del inóculo
La cepa utilizada como inóculo, AVF2, fue aislada
de cultivos superficiales durante un estudio ecológico [3] realizado en la vinagrería La Guinelle (Banyuls, Francia). Esta
cepa resultó ser la cepa mayoritaria en todas las acetificaciones estudiadas. AVF2 fue crecida, inicialmente, en medio
liquido GY (5% D-glucose, 1% yeast extract) a 28ºC durante
2 días con agitación y posteriormente, se preparó la madre
con vino previamente filtrado hasta alcanzar una acidez del
5%. Cabe destacar que parte de este proceso se realizó en
la vinagrería. Para controlar que durante su multiplicación, el
inóculo continuaba siendo puro se aislaron colonias en medio
solido GY (5% D-glucose, 1% yeast extract, y 2% agar), y se
identificaron por técnicas moleculares.
La extracción de DNA se realizó mediante el método
CTAB de Ausubel et al (1992) [4]. Para la identificación a nivel
de especie, se utilizó la técnica de PCR-RFLPs del 16S rDNA
119
ISBN 978-84-690-6060-5
descrita por Ruiz et al (2000) [1]. Y para la identificación a nivel
de cepa se aplicó la técnica de (GTG)5-PCR [5].
2.2. Acetificación por cultivo superficial
Esta acetificación se realizó en la vinagrería La Guinelle en barricas de roble americano de 60L de volumen. Se
tomaron muestras a lo largo de la acetificación: T0 (0,9%
ácido acético), TM (3% de ácido acético) y TF (6% ácido acético). En dichos puntos, se midieron diferentes parámetros físico-químicos (etanol, pH, temperatura, oxigeno disuelto,
azucares residuales), y se hicieron recuentos de BA totales
por cámara de Neubauer en microscopio óptico y viables por
siembra en placa. La imposición de la cepa inoculada se analizó por PCR-RFLPs del 16S rDNA [1] y (GTG)5-PCR [5].
2.3. Acetificación por cultivo sumergido
Esta acetificación se realizó en la Universidad de
Sevilla en un acetificador de laboratorio (B. Braun Biotech
S.A.) de 5L de volumen. Esta acetificación consistió en 5 ciclos (variación de acidez en cada ciclo de 3-7% aprox.). Se
tomaron muestras en los 3 últimos ciclos: Ciclo III (36 horas,
6,9% de ácido acético), Ciclo IV (30 horas, 7%) y Ciclo V (36
horas, 7,35%). Los parámetros controlados y los análisis realizados fueron los mismos que en el método por cultivo superficial.
3. RESULTADOS
3.1. Cultivo superficial
A lo largo de esta acetificación los parámetros de
pH, temperatura, oxigeno disuelto y azucares residuales
mostraron valores constantes. Los recuentos de BA obtenidos con el microscopio fueron del orden de 108 cél/mL, mientras que los obtenidos en placa lo fueron de 106 cél/mL,
diferencias ya esperada en este tipo de acetificaciones debido a la presencia de posibles bacterias viables pero no cultivables [6]. Las identificaciones de las colonias aisladas en
placa mostraron una total imposición (100%) de la cepa AVF2
de A. pasteurianus en todos los puntos de la acetificación
(Fig.1). Cabe destacar que la velocidad de acetificación obtenida tras la inoculación de la cepa AVF2 es notablemente
superior a la observada en las acetificaciones espontáneas
realizadas previamente en esta vinagrería.
Fig.1. Perfiles de (GTG)5-PCR de las muestras tomadas durante la
acetificación superficial. M: Marcador 100 bp ladder.
120
3.2. Cultivo sumergido
Los resultados de los parámetros físico-químicos
fueron constantes a lo largo de los ciclos. Por lo que respecta
a la imposición de la cepa, a diferencia de lo que sucedía en
la acetificación en cultivo superficial, ninguna de las colonias
aisladas durante los tres ciclos estudiados se correspondía
con el perfil de AVF2. De hecho, las colonias aisladas no pertenecían al género Acetobacter sino a Gluconacetobacter
(Ga). La caracterización a nivel de especie no fue concluyente pudiendo pertenecer a Ga. hansenii, Ga. xylinus o Ga.
europaeus. La diferenciación de estas especies en base al
16S rDNA resulta difícil debido al alto porcentaje de homología entre sus secuencias (>98%). El análisis realizado a nivel
de cepa reveló la presencia de dos perfiles diferentes, cepa
1 y 2 (Fig. 2A).
Fig.2. A) Perfiles de (GTG)5-PCR B) Evolución de la presencia de
los distintos perfiles a lo largo de la acetificación sumergida
A)
B)
Durante el ciclo III, hubo una imposición total de la
cepa 1, mientras que en ciclo IV a pesar de que esta cepa
continua siendo la mayoritaria, se detecta la presencia de la
segunda cepa. La cepa 2 pasó a ser la mayoritaria en el ciclo
V (Fig. 2B), lo que parece indicar una adaptación progresiva
de ésta a las nuevas condiciones.
4. CONCLUSIONES
La cepa AVF2 de A. pasteurianus resultó ser un
buen iniciador en la acetificación con cultivo superficial, lo que
se podría explicar por el hecho de que esta cepa ha sido seleccionada en este tipo de acetificaciones.
En la acetificación por cultivo sumergido, la cepa
de AVF2 fue reemplazada por la imposición de dos cepas de
Ga. hansenii, Ga. xylinus o Ga. europaeus, lo cual puede deberse a la falta de adaptación de esta cepa a las nuevas con-
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diciones de acetificación, principalmente la oxigenación continua. La procedencia de las cepas de Gluconacetobacter no
está clara, pero es probable que haya habido una contaminación durante la multiplicación de inóculo en la vinagrería.
Su no detección en la preparación de la madre podría deberse a su presencia minoritaria unida a la rápida imposición
de la cepa AVF2 en condiciones que le eran favorables.
La conclusión principal de este trabajo es la importancia de emplear inóculos que hayan sido seleccionados en
las mismas condiciones que se van a utilizar en la acetificación.
5. BIBLIOGRAFÍA
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(GTG)5-PCR fingerprint method for the identification
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la Elaboración de Vinagres. Córdoba-España
6. MILLET V., LONVAUD-FUNEL A. 2000. The viable but
nonculturable state of wine micro-organisms during
storage. Lett. Appl. Microbiol. 30, 136-141.
6. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido posible gracias al proyecto
CRAFT nº 017269 del 6º Programa Marco de Investigación
de la Unión Europea y al proyecto nº AGL2004-07494-C0202 del Ministerio de Educación y Ciencia.
121
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ESTUDIO DE LA VIABILIDAD DE LOS CULTIVOS INICIADORES EN DEPÓSITOS DE
FERMENTACIÓN INOCULADOS MEDIANTE PIE DE CUBA
Nuria Barrajón1, Raquel Martín de Vidales1, Eva Navascués2, Ana Briones1
1
Tecnología de los alimentos. Facultad de Químicas. Universidad de Castilla La Mancha. Avda. Camilo José Cela, 10, 13071, Ciudad Real. Teléfono:
926295300 ext. 3478. e-mail: [email protected]
2
Resumen:
Agrovín. Polígono Los Alces, s/n. Alcázar de San Juan. Ciudad Real.
En algunas bodegas de Castilla La Mancha los depósitos de fermentación se inoculan mediante la técnica llamada
pie de cuba, asegurando así un comienzo rápido del proceso. Además, considerando el precio de los cultivos iniciadores, y las
dosis medias de empleo, supone un importante ahorro económico al usar una única dosis de levadura para inocular varios
millones de litros. Esta técnica no se emplea para vinos de calidad, pero es frecuente en las bodegas y cooperativas que
elaboran a gran escala.
Sin embargo, se sospecha que se provoca un estrés adicional en las levaduras, y que la población de células del
inoculo se agota en las adiciones sucesivas, ya que cuando una célula se multiplica en condiciones de stress algunos
constituyentes imprescindibles como el ergosterol se diluyen de generación en generación.
Por este motivo, este trabajo se enfoca a estudiar qué le sucede a la población de levaduras cuando se emplea dicha
técnica de inoculación; para ello, se muestrearon en varias bodegas de la región 10 depósitos inoculados mediante pie de cuba.
Los aislados obtenidos se compararon con la huella genética del cultivo iniciador mediante la técnica del DNAmt. Los resultados
muestran que, en contra de lo esperado, en la mayoría de los depósitos la levadura se implanta adecuadamente a mitad del proceso.
Palabras clave: Saccharomyces, Pie de cuba, Vinificación, Levaduras seleccionadas.
1. INTRODUCCIÓN
122
Desde hace una decena de años, el empleo de cultivos seleccionados industriales de levaduras fermentativas
se ha hecho extensivo a todo el sector enológico: una única
cepa, conocida y controlada, es responsable de la etapa fermentativa en la vinificación, evitando anomalías como paradas fermentativas y, en definitiva influyendo en una mejor
calidad del vino, tanto del gusto como del aroma. No obstante, ninguno de los beneficios de las levaduras seleccionadas podría aprovecharse, si los cultivos iniciadores no se
utilizan adecuadamente; la cepa elegida tiene que dominar
el proceso desde su inicio y poseer buenas condiciones fisiológicas con el fin de que su crecimiento sea más rápido y
eficaz que el del resto de la población autóctona.
Sin embargo, dado el elevado precio de los cultivos
seleccionados, y las dosis medias de empleo (15-25g/Hl de
mosto o 100Kg de uva), en algunas bodegas, como las que
han participado en este estudio, se utiliza para la elaboración
de vinos de baja gama la técnica de inoculación denominada
pie de cuba. Básicamente, consiste en adicionar a un tanque
parcialmente lleno la levadura seco activa en la dosis recomendada, y una vez alcanzada la etapa de fermentación tumultuosa, se añade de nuevo mosto fresco, y así
sucesivamente hasta completar el depósito. Otra variante utilizada, es preparar un cultivo madre con la levadura seleccionada y cuando ésta se encuentran en su fase exponencial
de crecimiento, parte del mosto en fermentación se añade
como inóculo a varios tanques. Estas técnicas, aunque suponen una ventaja económica, estresan y agotan la capacidad de crecimiento y de fermentación de las levaduras
empleadas, pudiendo quedar desplazadas durante el proceso por otras cepas autóctonas mejor aclimatadas al entorno ecológico.
Resulta por tanto indispensable y deseable, comprobar a lo largo del proceso de fermentación el comportamiento de las levaduras seco activas cuando se utilizan este
tipo de técnicas de siembra.
Durante la vendimia de 2005, se muestrearon diez
depósitos de la variedad Airén, procedentes de 5 bodegas
(A, I, F, G, J) de la DO La Mancha. Todos los depósitos se
inocularon con LSA mediante alguna de las técnicas descritas anteriormente. Las muestras se tomaron al inicio, mitad y,
en algunos casos, final de fermentación.
Cada muestra y sus diluciones seriadas se sembraron en Agar YPD. Tras 48 h a 28 ºC se realizó una réplica
de las placas contables sobre Agar lisina, con el fin de poder
seleccionar las colonias del género Saccharomyces. Se eligieron, al azar, 10 colonias de cada muestra.
Los cultivos se crecieron en caldo YPD durante 18
horas. La extracción del DNA y su posterior análisis de res-
ISBN 978-84-690-6060-5
tricción se efectuaron siguiendo el protocolo propuesto por
Querol y colaboradores (1992).
3. RESULTADOS
Cuando se extrajo el DNA de los 270 aislados Saccharomyces y se sometió a restricción, se obtuvieron sus perfiles genéticos; la comparación de dichos perfiles con el de la
levadura comercial empleada en cada caso, permitió conocer
el % de implantación de la LSA en cada depósito. Estos %
junto con la variedad de mosto, dosis empleada y temperatura de inoculación, se recogen en la Tabla 1.
Se considera que la implantación sólo habrá ocurrido de modo eficaz si más del 80% de los aislados se corresponden con el patrón genético de la levadura seco
activa utilizada; sin embargo, cuando estos valores oscilan
entre el 50% y el 80%, el levadurado sólo sería medianamente eficaz.
Tabla 1. Porcentajes de implantación de las levaduras
seco activas en las muestras estudiadas
Fig. 1. Coexistencia de levaduras autóctonas con la cepa
comercial en los depósitos de fermentación estudiados.
Las Fig. 2A y 2B corresponden a los perfiles de los
aislados obtenidos en muestras de inicio y mitad de fermentación respectivamente. En el primer caso se observa que,
todos los perfiles son iguales al de la cepa inoculada, situada
en ambos extremos de la figura; en cambio en la segunda,
donde se marcan con el mismo símbolo las cepas iguales, ninguno de ellos coincide con el de la levadura comercial, y además hay una cepa autóctona que se aisló en más de un 50%.
Fig.2. Perfiles de restricción de DNA mitocondrial de
algunos aislados de Saccharomyces
A) Inicio de fermentación
B) Final de fermentación
4. CONCLUSIONES
Las muestras A2, A7 y I1, corresponden a depósitos
que iban rellenándose de forma sucesiva con mosto fresco;
el muestreo (M1, M2 y M3) se realizó cuando se alcanzaba
la etapa tumultuosa después de cada adición de mosto. El
resto de los tanques se inocularon partir de un cultivo madre
de LSA.
Contrariamente a lo esperado, se observa que de
los 7 depósitos inoculados a partir de un cultivo madre, en 5
de ellos la levadura comercial se impuso en más de un 80%.
En los tanques en los que se iba adicionando mosto fresco,
los resultados son diversos, así por ejemplo en el A2 hay un
100 % de implantación, incluso en la tercera adición de
mosto; en cambio en el I1, la LSA empleada no logro imponerse, y fue sustituida por cepas autóctonas, quizá debido a
que la temperatura de inoculación fue de 14ºC.
Por otra parte, se estudió la coexistencia de levaduras autóctonas, Saccharomyces y no Saccharomyces, con
la levadura comercial. La Fig. 1 muestra la biodiversidad durante el proceso de fermentación en cada uno de los depósitos, así en la muestra A2 y A5, la LSA se impuso totalmente
a la población autóctona. En el A4, además de la cepa inoculada, se detectó la presencia de no Saccharomyces. En los
tanques A3, A6, A7 y G1 la población autóctona coexiste con
la cepa inoculada, pero no logra desplazarla. En cambio en
I1 y J2, la fermentación se lleva a cabo mayoritariamente por
Saccharomyces espontáneas.
A pesar de que era previsible que las levaduras inoculadas fueran desplazadas por cepas autóctonas mejor aclimatadas al entorno ecológico, y menos estresadas, los
resultados muestran que en la mayoría de los depósitos sembrados mediante pie de cuba, la levadura seco activa se implantó adecuadamente a mitad del proceso.
5. BIBLIOGRAFÍA
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Vini d’ Italia, Vol. 31(3), 17-22.
123
ISBN 978-84-690-6060-5
APLICACIÓN DE UN NUEVO PREPARADO DE LEVADURAS “YSEO” PARA MOSTOS
PROBLEMÁTICOS EN SU FERMENTACIÓN
J. C. Bohlscheid1, G. Specht2, A. Julien2, A. Palacios2, J. Maloney3, B. Bertheau3,
D. Gore3, and Charles G. Edwards1
1
Department of Food Science and Human Nutrition. Washington State University, Pullman, WA, 2Lallemand, Inc., 3Ste Michelle Wine Estates
Resumen:
Se utilizó un nuevo preparado de levaduras seleccionadas (sin incurrir en los organismos genéticamente modificados)
producidas mediante un sistema nuevo para fermentar mosto de uva tinta de tres añadas procedentes del Estado de Washington
(2004-2006). Se controló la tasa de fermentación, el crecimiento de las levaduras, la inhibición de la fermentación maloláctica
y la producción de SH2. La evaluación sensorial se llevó a cabo en los vinos terminados. En cuanto a la fermentación, se
probaron tres tratamientos: (a) uso de ICV D254 y Syrah como cepas de levadura, (b) uso de ICV D254 y Syrah con el
suplemento nutricional Fermaid añadido al mosto antes de la fermentación, o (c), uso de ICV D254 y Syrah preparadas con el
denominado proceso “YSEO” (Yeast Security Optimization). Las fermentaciones se llevaron a cabo a nivel de laboratorio y en
una bodega comercial. Las fermentaciones en laboratorio de los mostos de 2004 y 2005 no mostraron diferencias en cuanto
al crecimiento de levaduras, aunque se lograron unas tasas de fermentación más rápidas con los nutrientes añadidos. La
levadura YSEO produjo unas concentraciones de SH2 significativamente inferiores para todas las cepas y añadas. En la bodega,
la levadura YSEO fermentó con unas tasas iguales o más rápidas que el resto de los tratamientos. No se percibió ningún efecto
sobre la fermentación maloláctica de ninguno de los tratamientos con levaduras. La evaluación sensorial de las uvas de 2004
mostró diferencias significativas entre los vinos, aunque ninguno se consideró de inferior calidad.
Palabras clave: Saccharomyces cerevisiae, mostos difíciles, proceso Yseo.
1. INTRODUCCIÓN
La ralentización o parada de la fermentación y/o una
producción excesiva de SH2 durante la fermentación del
mosto pueden deberse a distintos factores (1, 2). Aunque las
deficiencias en nitrógeno asimilable para las levaduras (NFA)
en el mosto pueden provocar estos problemas, la falta de vitaminas y factores de crecimiento también pueden estar relacionados (3, 5). Algunos estudios han asumido que el
mosto contiene suficientes nutrientes para una actividad y
crecimiento adecuado de las levaduras (4), aunque la incorporación de (FDA) y otros nutrientes (vitamina B, Fermaid,
cortezas o extractos de levaduras, etc.) son prácticas habituales en muchas bodegas. A pesar de que Saccharomyces
puede asimilar y utilizar directamente estos nutrientes, también otros microorganismos presentes en el mosto pueden
hacer lo mismo, lo que podría provocar problemas de inhibición de la fermentación alcohólica y/o estropear el vino.
En colaboración con Lallemand, Inc., se prepararon
en su planta de producción levaduras seleccionadas comúnmente utilizadas (ICV D254 y Syrah) en condiciones de un
nuevo desarrollo industrial de producción (YSEO – Yeasts
Security Optimization). Los nuevos métodos de propagación
se desarrollaron para superar las condiciones limitantes de
vinificaciones problemáticas. Este proceso no emplea técnicas de modificación genética (GMO), si no únicamente medios naturales de crecimiento específicos.
Los objetivos del proyecto fueron:
124
(1) Demostrar que la levadura YSEO funciona de
forma diferente y complementaria en mostos problemáticos a
la incorporación de nutrientes (p.ej., Fermaid), específicamente en lo que a cinética de la fermentación se refiere y no
inhibe la fermentación maloláctica.
(2) Demostrar que la levadura YSEO reduce los defectos en el aroma como el “carácter reducido”.
(3) Demostrar que la levadura YSEO puede impedir
el crecimiento de microorganismos dañinos por la mayor facilidad de implantación.
Para demostrar estas hipótesis se llevaron a cabo
fermentaciones a gran escala en una bodega comercial, que
controló la tasa de fermentación y que incluyó une evaluación sensorial de los vinos terminados; en paralelo a esto, las
fermentaciones en el laboratorio midieron la evolución del
SH2, el crecimiento de las levaduras y la tasa de fermentación
2.1. Fermentaciones en bodega
1. Tratamientos:
a. Levadura (25 g/Hl)
b. Levadura (25 g/Hl) más Fermaid (25 g/Hl)
c. Levadura YSEO (25 g/Hl)
2. Mostos Syrah:
Año Vol. fermentación (L)
2004 1135 (triplicado)
2005 2000 (único)
2006 3500 (único)
NFA (mg/L)
300
80
80
Levadura
ICV D254
Syrah
Syrah
Las uvas se recogieron mecánicamente a ~28°Brix
y el mosto fue diluido con agua hasta ~24°Brix. El dióxido de
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azufre (45 ppm) fue aplicado en la estrujadora y se añadió
ácido tartárico para obtener un pH ≤ 3.6. Antes de la inoculación, los mostos se refrigeraron durante 24 horas. Las temperaturas de fermentación se dejaron subir y luego se
mantuvieron a ≤ 30°C, con bazuqueos y remontados realizados de acuerdo con el protocolo de la bodega. El sangrado y
prensado de la pasta tuvo lugar a ~ 5°Brix, donde las diferentes fracciones completaron la fermentación alcohólica (AR
≤ 0.2%). Las cepas de bacterias MCW y Viniflora iniciaron la
fermentación maloláctica en 2004 y 2005 respectivamente, y
en 2006 se produjo una fermentación maloláctica espontánea. Los vinos inoculados con fermentación maloláctica se
transfirieron a barriles de roble para completar el envejecimiento del vino durante 9 meses con sulfitado (35 ppm) y trasiego cada 3 meses. Los vinos se filtraron (0.45 µm) y
embotellaron.
2.2. Fermentaciones en el laboratorio
Las fermentaciones semi-anaeróbicas se iniciaron
en los mostos de lágrima Syrah y Cabernet Sauvignon de
2005 (90 mg NFA/L). Las fermentaciones se realizaron por
triplicado utilizando fermentadores sellados de 3L. El SH2 se
midió de acuerdo con Wang et al. (6).
3. RESULTADOS
3.1. Fermentaciones a escala de bodega comercial
• La fermentación con levaduras YSEO se completó antes o
al mismo tiempo que la fermentación con nutrientes añadidos, el efecto del proceso YSEO no es suplido por la aplicación de nutrientes.
• No hubo inhibición de la fermentación maloláctica en ningún caso.
• No se produjeron indicios de crecimiento de microorganismos considerados como contaminantes debido a los nutrientes añadidos.
• No hubo diferencias significativas en cuanto a la producción de acidez volátil. Donde se observa una interesante
ventaja para las levaduras YSEO.
• La diferencias sensoriales indicaron que los tratamientos
producían vinos “marcadamente más limpios ” para 2004
y 2005.
• Se detectaron diferencias sensoriales positivas (mas fruta,
menos reducción u menos amargor) entre YSEO y la levadura estándar para los vinos de 2004. Se identificaron
algunas diferencias entre el tratamiento con YSEO y la incorporación de nutrientes.
• Se van a realizar análisis en vinos de 2005 y 2006.
125
ISBN 978-84-690-6060-5
3.2. Fermentaciones a escala de laboratorio
• Importante reducción de la producción de SH2 para YSEO.
• Sin diferencias en la tasa de crecimiento o población máxima entre los tratamientos.
• Las fermentaciones con nutrientes añadidos se completaron más rápido que las fermentaciones con YSEO o tipo
estándar.
• Ligero aumento de la AV con el tratamiento estándar frente
a los tratamientos con YSEO o nutrientes añadidos.
4. CONCLUSIONES
Las levaduras tipo YSEO se comportaron bien o
mejor que las levaduras estándar o las levaduras estándar
con nutrientes. Esto ocurrió en términos de tasa de fermen-
126
tación a escala comercial, incluso en mostos con un nivel
bajo de nitrógeno. Además, la levadura YSEO no afectó a la
FML ni promovió el crecimiento de microorganismos contaminantes.
La evaluación sensorial de los vinos estableció diferencias entre los vinos debido a los tratamientos y los vinos
de 2004 mostraron unas características mejorando la valoración en boca, a favor de la levadura YSEO en comparación
con la levadura estándar, reduciendo al mismo tiempo el
aroma a azufrado.
Las fermentaciones en laboratorio también mostraron la supresión del impacto del sulfhídrico por parte de las levaduras YSEO.
5. BIBLIOGRAFÍA
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ISBN 978-84-690-6060-5
MEJORA DE LA CALIDAD DEL VINO CON LEVADURAS AUTÓCTONAS
SELECCIONADAS. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE 6 CAMPAÑAS
M. Maqueda1, T. Montero2, P. Cotilla2, M.L. Álvarez2, E. Zamora2, M. Ramírez1
1
Departamento de Ciencias Biomédicas (Área de Microbiología), Universidad de Extremadura, Avda Elvas s/n, Badajoz, España.
Tlfno: 924289426. [email protected] .
2
Resumen:
Se analizan los parámetros tecnológicos y la calidad de 154 vinos elaborados con 7 nuevas levaduras seleccionadas durante
seis campañas en diferentes bodegas. Todas estas levaduras proceden de cepas autóctonas y llevan marcadores genéticos que
permiten su fácil monitorización en bodega: resistentes a cicloheximida (E3AR1, 7AR y E7AR1), resistentes a sulfometurón metilo
(SMR1011D y SMR165AR), y rodamina-blancos (Rod231B y Rod256D). Se realizaron vinos control mediante fermentación espontánea,
y vinos referencia con levaduras seleccionadas comerciales. Cada levadura vínica influyó de forma diferente sobre los parámetros
enológicos, principalmente sobre los relacionados con el metabolismo de las levaduras. Se observaron diferencias significativas en la
imposición de cada levadura, vigor fermentativo, acidez volátil, acetaldehído, acetato de etilo, e isobutanol. Sin embargo, la contribución
a la mejora en la calidad organoléptica respecto a los vinos control, aunque fue patente, no fue estadísticamente significativa.
Palabras clave: Fermentación, Saccharomyces, resistencia, imposición, calidad.
1. INTRODUCCIÓN
La elaboración de vinos es una actividad económica
muy importante en Extremadura. Uno de los factores determinantes de la calidad es la fermentación alcohólica de los
mostos y ha de ser controlada para evitar variaciones en la
calidad dependientes de la existencia de microorganismos
contaminantes.
El uso de levaduras seleccionadas puede ser una
solución para mejorar la calidad de los vinos. Aunque existen
levaduras secas activas (LSA) comerciales, la mayoría de las
usadas en Extremadura son de origen francés y están aclimatadas a otras condiciones ambientales. Resulta mucho
más adecuado utilizar cepas autóctonas, mejor aclimatadas
a las condiciones de la zona y que pueden implantarse aún
en presencia de las otras levaduras silvestres (6). Además,
estas cepas locales pueden asegurar la tipicidad de los vinos
de la zona.
2.1. Materiales
Fermentación de 154 mostos procedentes de 8 variedades de uva. Se utilizaron nueve levaduras Saccharomyces cerevisiae: EX88 (killer), 7AR (killer, cyh2R), E7AR1
(killer, cyh2R), SMR165AR (killer, smrR), E3AR1 (killer,
cyh2R), SMR1011D (killer, smrR), Rod231B (killer, rodamina
blanca), Rod256D (killer, rodamina blanca). Todas estas levaduras son, o proceden de, levaduras autóctonas seleccionadas de la D.O. Ribera del Guadiana (1,2,5). La cepa K1
(killer y resistente a diurón y eritromicina) es una levadura comercial de LALVIN (LALLEMAND). Se realizaron controles
de fermentación espontánea. Seguimiento de fermentación:
Medidas diarias de densidad, ºBrix y temperatura.
2.2. Métodos
Análisis microbiológicos: toma de muestras al inicio de fermentación (IF), fermentación tumultuosa (FT) y final
Saccharomyces sp., no-Saccharomyces, apiculadas y bacterias. Las cepas inoculadas de Saccharomyces sp. se diferenciaron mediante la réplica en placa con droga o colorante
(1,2,5) excepto EX88 cuyo seguimiento se realizó por RFLP
del mitDNA (6). Las imágenes de los geles con RFLPs (agarosa 0.7% en TBE 0.5x) después de la electroforesis fueron
capturadas con el sistema GelDoc (BioRad) y analizadas mediante el software Diversity Database (BioRad).
Parámetros físico-químicos: Las determinaciones
de densidad, pH, acidez total, acidez volátil, azúcares reductores, grado alcohólico, ácido málico y ácido láctico se realizaron según los métodos oficiales de la CEE (3) y los
componentes volátiles se analizaron mediante cromatografía
gaseosa con detector de ionización de llama (4)
las fichas de cata penalizadoras del Consejo Regulador de
la D.O. Ribera del Guadiana.
Análisis estadístico: test paramétrico de análisis
de la varianza (ANOVA de un factor) con el software SPSS
versión 12.0 para Windows (Chicago, IL).
3. RESULTADOS
De los 23 parámetros analizados en las 154 vinificaciones (Tabla 1), en 8 se aprecian diferencias significativas
(p≤0.05): T15, T100, células viables iniciales (UCF/ml), % imposición, acidez volátil, acetaldehído, acetato de etilo e isobutanol. Todas las vinificaciones inoculadas se iniciaron y
127
ISBN 978-84-690-6060-5
finalizaron antes que los controles espontáneos (T15 y T100
menores). Entre las fermentaciones inoculadas, las más rápidas en iniciar y en terminar fueron E3AR1 (1.6 días) y
Rod231B (1.9 días). Todas las levaduras mostraron gran capacidad para desplazar a la microbiota silvestre (imposición
mayor de 70%), y las que mejor se impusieron fueron
Rod231B (98.4%) y Rod256D (97.4%). E3AR1 fue la cepa
que produjo menor acidez volátil y Rod256D la que más (0.18
g/l y 0.39 g/l, respectivamente), aunque siempre por debajo
de los límites establecidos para un vino de calidad (0.6 g/l).
Sin embargo, los niveles de acetato de etilo producido por
Rod256D fueron los más bajos (24.9 mg/l) junto con los de
SMR1011D (24.0 mg/l). Los valores más altos de acetato de
etilo los produjo 7AR (70.6 mg/l), muy cercano al umbral de
percepción (75mg/l), pero lejos del considerado picado acético (160 mg/l). Hubo diferencias significativas en la producción de acetaldehído según la levadura inoculada. La más
productora fue 7AR, aunque lejos de los 75 mg/l límite máximo para vinos de calidad, mientras que la menos productora fue Rod231B (21.3 mg/l). Las diferencias en las
cantidades de isobutanol también variaron significativamente
con la levadura utilizada. Así, la más productora fue E3AR1
(67.3 mg/l) y la menos SMR1011D (35.6 mg/l).
Se observaron diferencias interesantes pero no estadísticamente significativas (p>0.05) en los siguientes parámetros. Acidez total, superior en las levaduras inoculadas que
en el control, siendo los vinos elaborados con Rod231B (7.9
g/l) y Rod256D (7.8 g/l) los de mayor acidez total. Azúcares
reductores, también mayor en los vinos de fermentación espontáneas (1.33 g/l), aunque dentro del límite de 2 g/l de los
vinos secos, siendo la levadura SMR1011D la que agotó más
los azúcares. Metanol (los valores más altos correspondieron a SMR1011D, y los más bajos a 7AR. Alcoholes superiores, E3AR1 fue la más productora y Rod231B la menor.
Formación de 1-propanol, mayor en SMR165AR (34.4 mg/l)
y menor en E3AR1.
Aplicando el test de Duncan, aún cuando en algún
caso el análisis ANOVA no fue significativo, para algunos parámetros se pueden establecer dos, tres o incluso cuatro grupos homogéneos de levaduras con un nivel de confianza del
95%. Así, se agruparon en dos grupos según T15, T100, acetaldehído, isobutanol y amílicos; en tres grupos homogéneos
según la acidez volátil, y en cuatro grupos según % de imposición y producción de acetato de etilo.
4. CONCLUSIONES
Tabla 1. Valor medio (± error típico) de los parámetros de los vinos control y los elaborados con las diferentes levaduras seleccionadas.
Análisis de la varianza para estudiar el efecto de la inoculación del mosto con distintas levaduras seleccionadas.
128
Desde el punto de vista tecnológico (vigor fermentativo y rapidez en finalizar fermentación), los vinos se pueden agrupar en aquellos elaborados espontáneamente y los
vinificados con cualquiera de las levaduras inoculadas. Sin
embargo, cada levadura vínica influyó de forma diferente
sobre los parámetros enológicos relacionados con la capacidad de desplazar a las poblaciones microbianas silvestres y
con el metabolismo de las levaduras, acidez volátil, formación de acetaldehído, acetato de etilo e isobutanol, principalmente. A pesar de todo, la contribución a la mejora en la
calidad organoléptica respecto a los vinos control, aunque fue
patente, no fue estadísticamente significativa.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. AMBRONA J.; MAQUEDA, M.; ZAMORA, E.; MANUEL
RAMÍREZ. 2005. Sulfometuron Methyl Resistance as
Genetic Marker for Monitoring Yeast Populations in
ISBN 978-84-690-6060-5
Wine Fermentations. Journal of Agricultural and Food
Chemistry. 53, 7438-7443.
2. AMBRONA J.; VINAGRE, A.; MAQUEDA, M.; ÁLVAREZ,
M.L.; AND RAMÍREZ M. 2006. Rhodamine-white as a
genetic marker for monitoring yeast populations in
wine fermentations. Journal of Agricultural and Food
Chemistry. 54, 2977-2984.
3. CEE, R. 1990. Nº 2676, Métodos de análisis comunitarios aplicables al sector del vino, p. 191.
4. GLORIES, Y. 1974. Recherches sur la structure et les
propietés des composés phéndiques polymerisés
des nins rouges. Précipitation par l’aldehy de formique et par l’acide chlorydrique concentré. Connais
V.et V. 1:57
5. PÉREZ, F.; REGODÓN, J. A.; VALDÉS, M. E.; DE MIGUEL, C.; RAMÍREZ, M. 2000. Cycloheximide resistance as marker for monitoring yeasts in wine
fermentations. Food Microbiol., 17, 119-128.
6. QUEROL, A., E. BARRIO, AND D. RAMÓN. 1992. A
comparative study of different methods of the yeast
strain characterization. System. Appl. Microbiol.(15):439-446.
6. AGRADECIMIENTOS
129
ISBN 978-84-690-6060-5
DISEÑO DE UNA PLANTA PILOTO ECONÓMICA PARA PRODUCCIÓN DE
LEVADURAS VÍNICAS
M. Maqueda1, F. Pérez-Nevado2, J.A. Regodón3, M. Ramírez1
1
Área de Microbiología (Edificio Juan Remón Camacho). Departamento de Ciencias Biomédicas. Facultad de Ciencias. UEx. Avda. Elvas s/n, Badajoz, España.
Tfno: 924289426. [email protected]
2
Área de Nutrición y Bromatología. Departamento de Producción Animal y Ciencia de los Alimentos. UEx.
3
Resumen:
Departamento de Química Analítica. Facultad de Ciencias. UEX.
La producción de levaduras vínicas sufre un fuerte auge debido a su uso en la elaboración de vinos de calidad. Se
comercializan como levaduras secas (LSA) o frescas, siendo las LSA las más usadas debido a su larga vida útil. Sin embargo,
pueden tener problemas de viabilidad, sus costes de producción son altos, y necesitan una rehidratación previa. Hemos diseñado
un proceso de producción de levaduras frescas a escala piloto. El proceso es sencillo, económico, de fácil y rápida aplicación,
y alcanza buenos rendimientos. Se elaboraron concentrados de levaduras seleccionadas de la D.O. “Ribera del Guadiana”,
utilizando como sustrato melaza de remolacha azucarera o mosto de uva. Durante el proceso se controló el aporte de azúcares,
la aireación, el pH, la temperatura y la formación de espuma, calculándose el rendimiento final de las levaduras producidas.
Aunque todas las levaduras producidas resultaron aptas en bodega, el rendimiento de la producción varió dependiendo
fundamentalmente del sustrato utilizado y del volumen del cultivo.
Palabras clave: levadura, fuente de C, temperatura, aireación, rendimiento en peso.
1. INTRODUCCIÓN
La producción de levaduras para vinificación ha sufrido un fuerte auge debido al uso, cada vez más extendido,
de levaduras seleccionadas en la elaboración de vinos de calidad. Éstas se comercializan en diversas formas, como levaduras secas o levaduras frescas, siendo las levaduras
secas activas (LSA) las consideradas más adecuadas y prácticas para vinificaciones debido a su larga vida útil [1]. Sin
embargo, las levaduras frescas presentan una mayor viabilidad, sus costes de producción son menores, y no necesitan
una rehidratación previa. En trabajos anteriores de nuestro
grupo se han seleccionado y caracterizado una serie de levaduras autóctonas de la D.O. “Ribera del Guadiana”, a partir de las cuales se han conseguido diversos mutantes
[2][3][4][5]. La utilidad de estas levaduras para la obtención
de LSA se ha analizado en estudios previos [1]. Como complemento de estos trabajos, consideramos de gran importancia realizar estudios de la producción de levaduras frescas
para elaborar vinos en zonas cercanas. El objetivo de este
trabajo ha sido el diseñar un método fácil y económico para
la producción de levaduras vínicas autóctonas para su uso
en la industria. Se realizaron 49 producciones en 5 años consecutivos empleando nueve levaduras seleccionadas.
130
Cepas de levadura: Se utilizaron nueve levaduras
Saccharomyces cerevisiae: EX88 (killer), 7AR (killer, cyh2R),
E7AR1 (killer, cyh2R), SMR165AR (killer, smrR), E3AR1 (killer, cyh2R), SMR1011D (killer, smrR), Rod231B (killer, rodamina blanca), Rod256D (killer, rodamina blanca). Todas
estas levaduras son, o proceden de, levaduras autóctonas
seleccionadas de la D.O. Ribera del Guadiana [2][3][4][5].
Fermentadores: Para el crecimiento aerobio de las
levaduras se utilizaron fermentadores de acero inoxidable de
50 L (36 cm diámetro ´ 51 cm altura), 100 L (46 cm ´ 61 cm)
y 350 L (65 cm ´ 1.2 m). Los fermentadores poseen una entrada de aire estéril y una salida para los gases. En su parte
inferior presentan un difusor tubular para una adecuada agitación y aireación del cultivo. Además, disponen de un sistema de toma de muestras y de control de pH, así como de
una válvula para la extracción del cultivo.
Medios de cultivo sin fuente de carbono: En función del tipo de producción se emplearon dos medios de cultivo, uno para la producción con melazas (2 g/L de extracto
levadura, 0.75 g/L de fosfato amónico y 1 g/L de sulfato de
magnesio heptahidratado) y otro para la producción con
mosto sulfitado (2 g/L de extracto levadura, 8 g/L de fosfato
amónico, 0.6 g/L de sulfato de magnesio heptahidratado, 3
g/L de sulfato de amonio, 0.2 g/L de cloruro potásico, ajustando el pH a 4-4.5).
Fuente de carbono: Se utilizaron dos fuentes de
carbono: Melazas de remolacha azucarera, diluidas en agua
para obtener distintos porcentajes de azúcares en el volumen
final de producción (1, 1.5, 2, y 2.5%), y ajustando el pH a
3,5-4 para evitar el desarrollo de contaminantes. El resto de
producciones se realizaron con Mosto sulfitado (19.2 ºBrix),
diluido para obtener un 2% de azúcares en el volumen final
del cultivo, y con el pH ajustado a 3.5-4.
Preparación de inóculos: Los inóculos para la producción se realizaron con cultivos puros seriados de las levaduras en medio YEPD (glucosa 2%, extracto de levadura
1%, peptona 2%) en condiciones de agitación (200 rpm) a
ISBN 978-84-690-6060-5
30ºC. El volumen de cultivo se fue aumentando progresivamente hasta obtener inóculos del 10% del volumen final de
producción.
Producción a escala piloto: La producción de levaduras se realizó durante 5 años consecutivos (2001-2005),
empleando diferentes volúmenes de cultivo: 25 L (en fermentador de 50 L de capacidad) y 50 L (fermentador de 100
L) y 100, 150, 200 y 250 L (fermentador de 350 L). Las levaduras se produjeron mediante un proceso aerobio añadiendo
la fuente de carbono en un gradiente creciente continuo en
base a los requerimientos teóricos del cultivo en crecimiento.
El diagrama de la producción se detalla en la Figura 1. En
primer lugar, se adicionó el inóculo de levaduras (10% del volumen final) al fermentador con el medio de cultivo sin fuente
de carbono. Una vez inoculado, se realizó la producción durante 24 horas a temperatura ambiente y con fuerte aireación
(1-1.5 m3 de aire por min). Para ello, se adicionó continuamente la fuente de carbono al fermentador (melazas en distintas concentraciones, o mosto sulfitado, según el caso),
empleando una bomba peristáltica con flujo controlado para
mantener bajas las concentraciones de azúcar y conseguir
un crecimiento aerobio de la levadura. La fuente de carbono
se suministró en las primeras 18-20 horas de cultivo. Transcurrido este tiempo, las levaduras se mantuvieron en condiciones de aireación 4 horas más. Cuando fue necesario, se
adicionó un antiespumante de uso alimentario (Antifoam 64,
Sigma-Aldrich). Al finalizar el proceso, las levaduras se concentraron por decantación a 4ºC durante 5 días. Tras retirar
el sobrenadante, los cultivos concentrados se lavaron con
agua estéril y se conservaron hasta su utilización congeladas (-20ºC) en 20% de glicerol.
Control del proceso y del producto: A lo largo de
la producción se determinó la DO600nm, pH del medio, la temperatura, y presencia de contaminación mediante observación microscópica.
Cálculo del rendimiento: Se centrifugaron 100 mL
del cultivo final a 2000 rpm durante 3 min. El rendimiento se
expresó en peso en gramos de levadura por litro.
Análisis estadístico: Se realizaron tests ANOVA de
1 vía con el software SPSS 14.0 para Windows (Chicago, IL).
Fig. 1. Diagrama del proceso de producción de levadura para vinificación en planta piloto. 1. Producción del inóculo;
2. Preparación del cultivo en el fermentador; 3. Preparación de la fuente de carbono; 4. Aireación; 5. Salida de gases;
6. Inoculación; 7. Recolección y decantación; 8. Conservación.
El rendimiento varió significativamente dependiendo
de la fuente de carbono empleada (p=0.000); el mayor rendimiento medio (43.5 g/L) se obtuvo con melazas (Tabla 1).
Tabla 1. Valor medio (± error típico) del rendimiento en peso de la
producción de levaduras en planta piloto. Análisis de la varianza
para estudiar el efecto de la fuente de carbono sobre el
rendimiento de la producción.
Otro parámetro que incidió significativamente sobre
el rendimiento (p=0.022) fue el % de azúcares por volumen
final de las melazas (Tabla 2). Los rendimientos medios aumentaron a medida que el % de azúcares se acercó al 2%.
Sin embargo, con el 2,5% el rendimiento fue muy bajo; señalas que en este caso se produjo una floculación de las levaduras que interfirió en el cálculo de los rendimientos.
Además, a partir de 2% de azúcar el rendimiento puede disminuir por el cambio metabólico de respiración a fermentación debido al efecto Crabtree [5].
El volumen de cultivo (Tabla 3) también influyó significativamente sobre la producción (p=0,000), obteniéndose
mayores rendimientos medios (52.5 g/L) para volúmenes de
131
ISBN 978-84-690-6060-5
Tabla 2. Rendimiento en peso de la producción de levaduras en
una planta piloto. Análisis de la varianza para estudiar el efecto de
% en azúcares suministrado sobre el rendimiento de la producción.
Tabla 3. Rendimiento en peso de la producción de levaduras en
planta piloto. Análisis de la varianza para estudiar el efecto del
volumen de cultivo sobre el rendimiento de la producción.
200 L y para 25 L (51.5 g/L). Estos altos rendimientos coincidieron con temperaturas iniciales del cultivo bajas (Tabla 3 y
4), que alarga el tiempo de producción incrementando la evaporación y la concentración del cultivo.
Tabla 4. Correlación de Pearson entre el rendimiento (gr/L), la
temperatura mínima (ºC) y el tiempo (horas) de la producción
de las levaduras vínicas..
Valores seguidos de letras (A, B Y C) indican diferentes grupos homogéneos obtenidos con el test de Duncan
con un nivel de confianza del 95%. Los datos corresponden
a la media ± error típico de 36 experimentos independientes.
Los rendimientos obtenidos con todas las levaduras fueron buenos, entre 33.6 g/L y 41.7 g/L (Fig. 2A). Aunque
se observaron diferencias entre ellas, no fueron significativas
(p=0,887). Es decir, todas las levaduras fueron igual de aptas
para la producción de levaduras frescas de vinificación en
nuestras condiciones de trabajo.
Finalmente, el año en que se realizó la producción
también influyó significativamente (p=0.005) en el rendimiento de la producción (Fig. 2B). El año de mayor rendimiento medio fue el 2002 (46.6 g/L) y el de menor, 2001 (30.9
g/L). Esta variabilidad fue debida a las diferencias en las temperaturas mínimas entre los años de producción, más bajas
en los años de mayor rendimiento.
132
g levadura/L cultivo
g levadura/L cultivo
Fig. 2. Rendimientos de producción en gramos de levadura
centrifugada por litro de cultivo según: A. Cepa de levadura; B. Año.
4. CONCLUSIONES
Nuestro estudio ha permitido diseñar y optimizar un
método simple y económico para la producción de levaduras
frescas. La fuente de carbono más adecuada es melazas,
adicionada al medio de cultivo hasta alcanzar 2% de azúcar
sobre volumen final. Los mejores volúmenes de producción
fueron 25 L en fermentador de 50 L y 200 L en fermentador
de 350 L. Todas las levaduras utilizadas fueron adecuadas
para la producción de levaduras frescas. Se encontró una variación en los rendimientos obtenidos dependiendo del año,
achacable a cambios en la temperatura inicial de crecimiento
y en la calidad de las melazas.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. PÉREZ-NEVADO, F.; REGODÓN, J.A.; RAMÍREZ,M.
2003. Producción de Levaduras Secas Activas (LSA)
para vinificación con levaduras autóctonas seleccionadas de la D.O. Ribera del Guadiana. Alimentaria
Enero-Febrero, 139-145.
2. REGODÓN, J.A.; PÉREZ, F.; VALDÉS, M.E.; DE MIGUEL, C.; RAMÍREZ, M. 1997. A simple and effective
approach for selection of wine yeast strains. Food Microbiology. 14 (3): 247-254.
3. AMBRONA J.; MAQUEDA, M.; ZAMORA, E.; and MANUEL RAMÍREZ. 2005. Sulfometuron Methyl Resistance as Genetic Marker for Monitoring Yeast
Populations in Wine Fermentations. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53, 7438-7443.
4. AMBRONA J.; VINAGRE, A.; MAQUEDA, M.; ÁLVAREZ,
M.L.; AND RAMÍREZ M. 2006. Rhodamine-white as a
genetic marker for monitoring yeast populations in
wine fermentations. Journal of Agricultural and Food
Chemistry. 54, 2977-2984.
5. PÉREZ, F.; REGODÓN, J. A.; VALDÉS, M. E.; DE MIGUEL, C.; RAMÍREZ, M. 2000. Cycloheximide resistance as marker for monitoring yeasts in wine
fermentations. Food Microbiol., 17, 119-128.
6. STANBURY P.F., WHITAKER A. and HALL S.J. 1995.
Principles of fermentation technology. 2º edition. Elsevier Science. ISBN: 0-7506-4501-6.
6. AGRADECIMIENTOS:
ISBN 978-84-690-6060-5
ESTUDIOS DE TOXICIDAD DE LEVADURAS Saccharomyces FRENTE A NOSaccharomyces DURANTE FERMENTACIONES DE MOSTO
F. Pérez-Nevado1, H. Albergaria2, T. Hogg3, J.A. Regodón4, F. Gírio2
1
2
Área de Nutrición y Bromatología. Dpto. de Producción Animal y Ciencia de los Alimentos. Universidad de Extremadura. Badajoz.
Tfno. 924286200. e-mail: [email protected]
Unidade de Fisiologia Microbiana e Bioprocessos. Departamento Biotecnologia. Instituto Nacional de Engenharia Tecnologia e Inovação. Lisboa. Portugal.
3
Escola Superior de Biotecnologia. Universidade Católica Portuguesa. Porto. Portugal.
4
Dpto. de Química Analítica. Universidad de Extremadura. Badajoz.
Resumen:
Durante la fermentación del mosto de uva las levaduras del género Saccharomyces desplazan rápidamente a otras
no-Saccharomyces presentes inicialmente. Trabajos previos atribuyen la muerte de esas levaduras a su baja resistencia al
etanol. Sin embargo, nuestros estudios han comprobado que están implicadas otras sustancias tóxicas producidas por
Saccharomyces. El objetivo de este trabajo fue caracterizar las toxinas que producían la muerte de levaduras no-Saccharomyces
durante la fermentación, en base a su termorresistencia y a su tamaño. De los resultados obtenidos se concluye que estamos
en presencia de uno o varios compuestos tóxicos distintos a las toxinas killer, capaces de actuar durante la fermentación de
mosto, termoestables, y con un tamaño inferior a 10 kDa.
Palabras clave: Levaduras no-Saccharomyces, cultivos mixtos, killer, compuestos tóxicos, interacciones levaduralevadura.
1. INTRODUCCIÓN
Durante el proceso de vinificación, las levaduras del
género Saccharomyces son capaces de eliminar rápidamente
a otras levaduras no-Saccharomyces presentes inicialmente
en el mosto. En trabajos previos, la principal causa de muerte
se atribuye a la baja resistencia de las no-Saccharomyces al
etanol [1]. Sin embargo, existen otros compuestos producidos
por levaduras durante la fermentación alcohólica que pueden
inhibir el desarrollo de otras levaduras, entre los que se incluyen algunos metabolitos como ácidos grasos de cadena corta
y media (ej.: ácido acético, hexanoico, octanoico o decanoico)
[1]. Otros mecanismos inhibitorios que se pueden producir son
los relacionados con la producción de toxinas killer [2][3]. Las
levaduras killer son capaces de producir compuestos extracelulares (proteínas o glicoproteínas) que causan la muerte
de otras cepas sensibles a los mismos [4]. En estudios previos
de nuestro grupo [5] hemos comprobado que las levaduras
Saccharomyces son capaces de producir la muerte de otras
no-Saccharomyces durante la fermentación, mediante la secreción de sustancias tóxicas distintas al etanol y a las toxinas
killer. En base a lo anterior, el objetivo de este trabajo fue caracterizar las toxinas que producían la muerte de levaduras
no-Saccharomyces a lo largo de la fermentación, determinando su termorresistencia y su tamaño.
Cepas de levaduras. Se emplearon dos cepas de
levaduras, Hanseniaspora guilliermondii NCYC 2380 (aislada
de la región vínica de Douro, Portugal) y Saccharomyces cerevisiae CCMI 885 (Culture Collection of Industrial Microorganisms, INETI, Portugal).
Medios de cultivo. Los inóculos se prepararon creciendo las levaduras en medio YEPD líquido (10 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de peptona y 20 g/L de glucosa). La
determinación del número de viables durante las fermentaciones se realizó con YEPD agar (YEPD líquido suplementado con 20 g/L de agar).
Medio de fermentación: Para las fermentaciones
se empleó medio WYPD-modificado (5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de peptona, 100 g/L de glucosa, 100 g/L de
fructosa, 5 g/L de sulfato de amonio; ajustando el pH a 3,5).
Determinación de azúcares y etanol. La determinación de las concentraciones de azúcares (glucosa y fructosa) y etanol, se realizó mediante HPLC (Merck Hitachi,
Germany) usando una columna Sugar-Pack (Waters, USA).
Estudios con medio autoclavado. Para determinar la termorresistencia de las toxinas producidas por las levaduras S. cerevisiae, un volumen de 1 L de medio
WYPD-modificado se inoculó con un cultivo mixto de H. guilliermondii y S. cerevisiae hasta obtener una concentración
final de 106 UFC/mL de cada una de ellas. Una vez inoculado, el medio se incubó a 18ºC y, tras fermentar durante 3 y
6 días, volúmenes de 400 mL se esterilizaron por filtración (a
través de un filtro de 0,22 micras) y se autoclavaron (121 ºC,
15 min). Estos medios prefermentados se dividieron en volúmenes de 200 mL y se reinocularon con dos concentraciones de H. guilliermondii (104 y 106 UFC/mL). Se realizaron 4
tipos de fermentaciones: FA34 y FA36, medios fermentados
3 días inoculados con 104 UFC/mL y 106 UFC/mL; FA64 y
FA66, medios fermentados 6 días inoculados con 104 y 106
UFC/mL. Tras inocular, se incubaron a 18 ºC durante 10 días,
determinándose el consumo de azúcares, la producción de
etanol y el número de células viables.
Estudios con medio prefermentado y ultrafiltrado. En la determinación del tamaño de las toxinas se si-
133
ISBN 978-84-690-6060-5
guió una sistemática similar a la del estudio anterior, inoculando un volumen de 1 L de medio WYPD-modificado con
cultivos mixtos de H. guilliermondii y S. cerevisiae hasta concentraciones de 106 UFC/mL e incubando a 18 ºC. En este
caso, el medio se fermentó y a los 4 días, 800 mL se esterilizaron por filtración (filtro de 0,22 micras). Parte del medio
(400 mL) se ultrafiltró a través de una membrana de 10 kDa
(mediante un sistema de filtración tangencial Millipore Stirred
Cells 8050). Tanto el medio filtrado amicróbicamente (medio
F), como el ultrafiltrado (medio FU), se dividieron en volúmenes de 200 mL, reinoculándolos con H. guilliermondii en dos
concentraciones (104 y 106 UFC/mL). Los 4 tipos de fermentaciones realizadas fueron: F4 y F6, con medio filtrado amicróbicamente, inoculando con 104 y 106 UFC/mL
respectivamente; y FU4 y FU6, con medio ultrafiltrado, inoculando con 104 y 106 UFC/mL. La incubación se llevó a cabo
a 18 ºC durante 10 días. A lo largo de ese tiempo se determinaron las concentraciones de azúcares y etanol y el número de células viables.
pocos días. Dicha muerte fue más rápida en medio prefermentado 6 días (FA64 y FA66), que en el de 3 días (FA34 y
FA36). Es decir, los compuestos tóxicos se encuentran en
mayores concentraciones el día 6. Además, la velocidad de
muerte dependió de la concentración inicial de levaduras; al
inocular 104 UFC/mL (FA34 y FA64), se produjo la muerte
completa ya el segundo día de fermentación. En las fermentaciones inoculadas con 106 UFC/mL (FA36 y FA66), no se
produjo una muerte completa de las levaduras hasta el día 3.
Por tanto, las toxinas producidas por S. cerevisiae están asociadas a la fermentación, son resistentes a elevadas temperaturas y se encuentran en concentraciones lo
suficientemente elevadas en el medio para eliminar al menos
106 UFC/mL ya desde el tercer día de fermentación.
Fig. 2. Evolución del número de levaduras a lo largo del tiempo en
medio prefermentado y autoclavado: medio prefermentado 3 días
e inoculado con 104 ( ) y 106 ( ) UFC/mL; medio
prefermentado 6 días inoculado con 104 ( ) y con 106 ( )
UFC/mL
3.1. Efecto del tratamiento térmico sobre las toxinas
Para determinar el efecto de altas temperaturas
sobre las toxinas, se prefermentó el medio y tras autoclavarlo
se inoculó con levaduras H. guilliermondii. Durante la incubación se analizó la evolución de azúcares y etanol para
comprobar si se habían fermentado los azúcares. En ningún
caso se apreció consumo de azúcares, ni producción de etanol (Fig. 1.A y 1.B). Es decir, las levaduras inoculadas no fueron capaces de fermentar los azúcares del medio. Este
comportamiento no se debe a una falta de nutrientes, pues
las concentraciones de azúcares en medio prefermentado 3
días (57,7 g/L de glucosa y 75,5 g/L de fructosa) y en el de 6
días (22,8 g/L de glucosa y 51,3 g/L de fructosa), eran suficientes para el crecimiento de las levaduras. Además, las
concentraciones de etanol (12,0 g/L en medio de 3 días y
55,7 g/L en el de 6 días) no eran tan elevadas como para inhibir su crecimiento; en estudios previos se había comprobado que esas mismas levaduras eran capaces de producir
hasta 80 g/L de etanol [5].
Fig. 1. Evolución de las concentraciones de: glucosa, en medio
autoclavado inoculado con 104 ( ) y 106 ( ) UFC/mL; de
fructosa, inoculando con 104 ( ) y 106 ( ) UFC/mL; y de etanol,
inoculando con 104 ( ) y 106 ( ) UFC/mL. A, medio fermentado
3 días; B, medio fermentado 6 días
134
Analizando el perfil de UFC/mL (Fig. 2), en todos los
casos se observa una muerte completa de las levaduras en
3.2. Determinación del tamaño de las toxinas
Se determinó el tamaño relativo de las toxinas, ultrafiltrando el medio prefermentado e inoculándolo con H. guilliermondii; los resultados se compararon con los obtenidos
con medio prefermentado y filtrado amicróbicamente. Al analizar las concentraciones de glucosa, fructosa y etanol a lo
largo de la incubación, no se observaron cambios en las mismas (datos no mostrados). Estos resultados indican que H.
guilliermondi fue incapaz de crecer en este medio.
Al determinar el número de viables a lo largo del
tiempo (Fig. 3), se observa que en medios inoculados con 104
UFC/mL de H. guilliermondii, en menos de 6 días se produjo
una rápida muerte de las levaduras, tanto en el filtrado amicróbicamente (F4), como en el ultrafiltrado (FU4). Con inóculos de 106 UFC/mL (F6 y FU6), también se produjo la
muerte de las levaduras, aunque en un tiempo mayor, debido
a la mayor carga de microorganismos presentes. Por tanto,
estamos en presencia de uno o varios compuestos tóxicos
producidos por las levaduras S. cerevisiae que presentan un
tamaño inferior a 10 kDa. Ese tamaño es menor al de las toxinas killer producidas por esas levaduras y analizadas en
otros trabajos [6]; además, en estudios previos se había comprobado que las levaduras S. cerevisiae empleadas eran killer-sensibles [5]. Por tanto, los causantes de la muerte
celular serían toxinas diferentes (ej.: péptidos, proteínas o gli-
ISBN 978-84-690-6060-5
coproteínas de pequeño tamaño) o incluso otros compuestos producidos durante la fermentación de las levaduras [1].
Fig. 3. Evolución del número de levaduras a lo largo del tiempo en
un medio filtrado amicróbicamente inoculado con 104 (○) y 106 (◊)
UFC/mL y medio ultrafiltrado inoculado con 104 (●) y 106 (♦)
UFC/mL
4. CONCLUSIONES
Las levaduras S. cerevisiae producen una o más
compuestos tóxicos que provocan la muerte de levaduras H.
guilliermondii. Estas toxinas están presentes desde el día 3
de fermentación en una concentración suficiente para eliminar rápidamente al menos 106 UFC/mL. Las toxinas no son
termolábiles, pues su efecto no desaparece tras autoclavar el
medio. Además, las toxinas producidas por las levaduras S.
cerevisiae presentan un tamaño inferior a 10 kDa, siendo diferentes a las toxinas killer conocidas en S. cerevisiae.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. FLEET, G.H. 2003. Yeast interactions and wine flavour.
Int. Journal of Food Microbiol. 86, 11-22.
2. PÉREZ, F.; RAMÍREZ, M.; REGODÓN, J.A. 2001. Influence of killer strains of Saccharomyces cerevisiae
on wine fermentation. Antonie van Leeuwenhoek 79,
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3. REGODÓN, J.A.; PÉREZ, F.; VALDÉS, M.E.; DE MIGUEL, C.; RAMÍREZ, M. 1997. A simple and effective
approach for selection of wine yeast strains. Food Microbiology. 14 (3): 247-254.
4. SCHMITT, M.J., BREINIG, F. 2002. The viral killer
system in yeast: from molecular biology to application. FEMS Microbiology Review 26, 257-276.
5. PÉREZ-NEVADO, F.; ALBERGARIA, H.; HOGG, T.;
GÍRIO, F. 2006. Cellular death of two non-Saccharomyces wine-related yeasts during mixed fermentations with Saccharomyces cerevisiae. Int. Journal of
Food MIcrobiol. 108, 336-345.
6. CHMITT, M.J., BREINIG, F. 2002. The viral killer system
in yeast: from molecular biology to application. FEMS
Microbiology Review 26, 257-276.
6. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado por el proyecto
POCTI/AGR/39974/2001 (Fundação para a Ciência e Tecnología, Portugal). F. Pérez-Nevado ha sido beneficiario de
una beca del II PRI+DT+I (Consejería de Educación, Ciencia y Tecnología, Junta de Extremadura y Fondo Social Europeo).
135
ISBN 978-84-690-6060-5
SEGUIMIENTO MEDIANTE FISH DE BACTERIAS LÁCTICAS DURANTE LA VINIFICACIÓN
Sara Callejón, Lucia Polo, Sergi Ferrer, Isabel Pardo
Resumen:
ENOLAB – Laboratorio de Microbiología Enológica, Departamento de Microbiología y Ecología, Universidad de Valencia
Dr. Moliner, 50. 46100 Burjasot (Valencia).963543145. [email protected]
La hibridación fluorescente in situ (FISH) es una técnica que permite simultáneamente la detección y recuento directo
de especies en una muestra, sin necesidad de cultivo. En este trabajo se ha empleado esta técnica para cuantificar e identificar
las poblaciones de bacterias lácticas responsables de la fermentación maloláctica (FML), y las presentes durante el
envejecimiento. Los recuentos obtenidos se compararon con los procedentes de la siembra en placa, y la identificación por
FISH con la identificación mediante PCR específica y 16S-ARDRA.
La única especie presente en este muestreo durante la FML y el envejecimiento de los vinos fue O. oeni, y la evolución
de la población de esta especie variaba en función de las condiciones aplicadas al vino. Se observó una total coincidencia de
los resultados de identificación tanto por FISH como por PCR específica y 16S-ARDRA. Los recuentos resultaron ser más
elevados en FISH, debido al hecho de que esta técnica detecta organismos totales y no sólo las viables como en el caso del
recuento en placa.
Este método es mucho más rápido para seguir la evolución de las poblaciones durante la FML al proporcionar
resultados cuantitativos tiempos mucho más cortos, evitando el cultivo de los microorganismos.
Palabras clave: FISH, Fermentación Maloláctica, Oenococcus oeni, Bacterias Lácticas, Recuento e identificación.
1. INTRODUCCIÓN
136
Generalmente, el análisis de las poblaciones microbianas se circunscribe a los vinos terminados y listos para
embotellar con el fin de estimar el riesgo de alteración durante el periodo de comercialización. Sin embargo, es importante conocer la evolución de la microbiota autóctona a lo
largo del proceso de vinificación y envejecimiento del vino,
para predecir con suficiente antelación los cambios beneficiosos o perjudiciales que pueda sufrir el vino como consecuencia del crecimiento microbiano.
Entre las bacterias que existen en el vino están las
bacterias lácticas, responsables de la (FML) pero también de
diversas alteraciones del vino. En cuanto a las bacterias lácticas (BAL) responsables de la FML la más conocida es Oenococcus oeni que se multiplica en el vino al final de la
fermentación alcohólica para transformar el ácido málico en
ácido láctico. Entre las alteraciones más conocidas producidas por las BAL destaca el aumento de la acidez volátil.
Asimismo, al final de la FML las bacterias aún vivas
atacan el ácido cítrico del vino para producir acidez volátil y
diacetilo. El género Oenococcus es el que, generalmente predomina en los vinos y parece ser el más adaptado para realizar la FML minimizando los riesgos. Pero el predominio de
Oenococcus sobre otras especies de BAL no es sistemático
y no es raro que, en ausencia de control, se pueda asistir a
una FML ligada al desarrollo de bacterias lácticas indeseables (Lactobacillus, Pediococcus), responsables de defectos
organolépticos.
De todo ello surge la necesidad de un método rápido capaz de detectar y cuantificar la microbiota propia del
vino durante todo el proceso de vinificación:
La hibridación fluorescente in situ (FISH) es una
técnica que permite simultáneamente la detección y recuento
directo de especies en una muestra, sin necesidad de cultivo.
La técnica se basa en la hibridación de sondas específicas
fluorescentes con rRNA 16S (diana). El complejo sonda-diana
se puede visualizar con el microscopio de fluorescencia.
En este trabajo se ha empleado esta técnica para
cuantificar e identificar las poblaciones de BAL responsables
de la FML, y las presentes durante el envejecimiento.
Para este estudio se emplearon vinos de Tempranillo y Cabernet-Sauvignon procedentes de la D.O. Somontano. Procesamos las muestras tomadas a lo largo de la
fermentación y durante el envejecimiento del vino, y se analizaron en paralelo utilizando la técnica de FISH [1] y el crecimiento en placas de MRS y MLO durante 4-6 días a 28°C
con posterior identificación mediante 16S-ARDRA [2] y PCR
específica [3].
Para el recuento de bacterias fijadas por hibridación
in situ se utilizó un programa de análisis de imagen automatizado llamado CellC© [4].
2.1. Protocolo FISH:
1.- Filtración de la muestra para su recogida en filtro de
policarbonato
2.- Fijación celular mediante deshidrataciones seriadas en
etanol (50, 80, 96%)
3.- Permeabilización mediante la adición de lisozima
4.- Adición al filtro de tampón de hibridación y sonda
5.- Incubación en una cámara húmeda a una temperatura y
tiempo determinados en función de la sonda
6.- Lavado del filtro en tampón atemperado para eliminar
uniones inespecíficas
7.- Lavado del filtro agua filtrada estéril
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Fig. 1. Matraz Kitasato para la fijación de la muestra en filtro de
policarbonato de 0.22 µm de poro
Se observó una total coincidencia de los resultados
de identificación tanto por FISH como por PCR específica y
16S-ARDRA. Ello demuestra la idoneidad de este sistema al
compararlo con otros métodos moleculares de probada fiabilidad como son el 16S-ARDRA y la PCR específica.
Este método es mucho más rápido para seguir la
evolución de las poblaciones durante la FML al proporcionar
resultados cuantitativos en tiempos mucho más cortos, evitando el cultivo de los microorganismos, que son necesarios
para la realización de otro tipo de pruebas moleculares.
Fig 4. Estudio de la evolución de la microbiota autóctona en las variedades de Tempranillo y Cabernet-Sauvignon en depósito desde
final de la fermentación maloláctica hasta 6 meses de crianza.
2.2. Identificación por 16S-ARDRA y PCR específica:
Siembra en placas de MRS y MLO con natamicina a
28 ºC durante 2-5 días, a partir de las colonias aisladas se realizó una amplificación del gen 16S-rDNA según describe
Rodas et al [2], los productos de PCR fueron digeridos con la
enzima de restricción MseI y los fragmentos visualizados en
un gel de agarosa obteniendo un perfil propio de cada especie.
Se procedió a realizar una PCR específica de O.
oeni como describen Zapparoli et al. [3], que amplifica un fragmento de 1025 parejas de bases del gen del enzima maloláctico de esta especie. Los cebadores son On1
(5’-TAATGTGGTTCTTGAGGAGAAAAT-3’) y On2 (5’-ATCATCGTCAAACAAGAGGCCTT-3’), y la amplificación de
PCR es de 30 ciclos (45 segundos a 94°C, 2 minutos a 64°C
y 2 minutos a 72°C).
MLO: recuento de viables en medio MLO. OENI: recuento de O. oeni
totales mediante FISH (sonda específica de O. oeni). EUB: recuento de
bacterias totales mediante FISH (sonda general EUB 338).
4. CONCLUSIONES
La única especie presente en este muestreo durante la FML y el envejecimiento de los vinos fue O. oeni, y
la evolución de la población de esta especie variaba en función de las condiciones aplicadas al vino (Figs. 2 y 3).
Los recuentos obtenidos con ambos tipos de aproximación son comparables, teniendo en cuenta que FISH permite un recuento de totales mientras que el crecimiento en
placa permite sólo el de viables.
Se ha observado en los vinos analizados una total
correlación en los resultados de identificación observados por
la técnica FISH y 16S-ARDRA.
La técnica de FISH se aplica directamente a las muestras de mostos y vinos, y permite cuantificar e identificar de
forma rápida y simultánea (unas 3 horas) las distintas poblaciones microbianas a lo largo de la vinificación. De este modo,
posee ventajas frente a otras metodologías moleculares, además de ser una tecnología directamente aplicable en bodega
para el control de calidad de vinos en fermentación y acabados.
Tras los 20 días de finalización de la FML se observa (Fig. 4) una bajada significativa del número de O. oeni
detectados mediante recuento en placa y las sondas. A partir de los dos meses de crianza no se detectaron bacterias
lácticas viables, que sí se cuantificaron mediante el empleo
de las sondas marcadas con fluorocromos. Los recuentos resultaron ser más elevados en FISH, debido al hecho de que
esta técnica detecta organismos totales y no sólo las viables
como en el caso del recuento en placa.
1. BLASCO, L.; FERRER, S.; PARDO, I. 2003. Development of specific fluorescent oligonucleotide probes
for in situ identification of wine lactic acid bacteria.
FEMS Microbiology Letters 225: 115-123.
2. RODAS, A.M.; FERRER, S.; PARDO, I. 2003. 16SARDRA, a tool for identification of Lactic Acid Bacteria isolated from grape must ana wine. Sistematic and
Applied Microbiology 26: 412-422.
3. ZAPPAROLI, G.; TORRIANI S.; PESENTE P.; DELLAGLIO F. 1998. Design and evaluation of malolactic
enzyme gene targeted primers for rapid identification
and detection of Oenococcus oeni in wine. Lett. Appl.
4. SELINUMMI, J.; YLI-HARJA, O.; PUHAKKA, J.A. 2005.
Software for quantification of labeled bacteria from
digital microscope images by automated image
analysis. BioTechniques 39: 859-863.
3. RESULTADOS
Fig. 2. Hibridación in situ con la sonda de O. oeni.
Fig. 3. Hibridación in situ con fluoresceína de bacterias totales.
5. BIBLIOGRAFÍA
137
ISBN 978-84-690-6060-5
EMPLEO DEL KIT DE FLUORESCENCIA LIVE/DEAD PARA EL SEGUIMIENTO DE LA
VIABILIDAD DE CULTIVOS INICIADORES INOCULADOS EN VINO
Sara Callejón, Isabel Pardo, Sergi Ferrer
Resumen:
ENOLAB – Laboratorio de Microbiología Enológica, Departamento de Microbiología y Ecología, Universidad de Valencia.
Dr. Moliner, 50. 46100 Burjasot (Valencia).963543145. [email protected]
El kit de viabilidad contiene el fluorocromo SYTO9 que es una pequeña molécula que puede penetrar en las bacterias
que poseen intacta la membrana plasmática, proporcionando una fluorescencia verde, y el fluorocromo IP (ioduro de propidio)
penetra a través de las membranas dañadas, por lo tanto no viables, proporcionando fluorescencia de color rojo. Se han hecho
modificaciones en el protocolo de aplicación de esta técnica para resolver los problemas que se presentaron en su uso en vino.
La aplicación de esta técnica permite estimar el número y estado fisiológico de cultivos iniciadores inoculados en vino para
realizar la fermentación maloláctica.
Se inoculó un cultivo iniciador en un vino, y se tomaron muestras durante los seis días posteriores a su inoculación,
fecha en la cual este cultivo ya había degradado todo el ácido málico.
La viabilidad de las bacterias obtenida por esta metodología se comprobó mediante recuento en placa. Los resultados
se mostraron coincidentes al recuento mediante fluorocromos.
La aplicación de fluorocromos permite estimar la viabilidad de las células inoculadas y realizar recuento de vivas y
muertas en un breve período de tiempo sin necesidad de recurrir a métodos que requieran del cultivo y largos periodos de
incubación.
Palabras clave: SYTO9, Ioduro de propidio, Fermentación maloláctica, cultivo iniciador, viabilidad.
1. INTRODUCCIÓN
138
Las bacterias lácticas (BAL) llevan a cabo la fermentación maloláctica (FML) en el vino, que supone la transformación de ácido málico (dicarboxílico) en ácido láctico
(monocarboxílico). La FML es un proceso imprescindible para
la obtención de vinos tintos de calidad, y sobre todo en aquellos que van a ser sometidos a un proceso de envejecimiento
en barrica. Con la FML se consigue una reducción de la acidez del vino, así como una mayor estabilidad microbiológica
y complejidad en los aromas del vino. Las especies directamente relacionadas con la FML de los vinos son Oenococcus oeni, y en menor medida otras BAL.
Las BAL también pueden provocar alteraciones de
los vinos dando lugar a una perdida en la calidad del mismo,
por lo que surge la necesidad de controlar la FML de los
vinos. Una práctica cada vez más habitual en las bodegas es
la adición de cultivos bacterianos seleccionados iniciadores
de la FML con el fin de conseguir un mayor control microbiológico del proceso. Los cultivos iniciadores de la FML comercializados en la actualidad están constituidos por cepas
de la especie O. oeni aisladas de vinos y seleccionadas para
conferir las mejores características con una alta eficacia fermentativa.
Se ha adaptado al vino una técnica microscópica
rápida de recuento de células y seguimiento del estado fisiológico de O. oeni. Esta técnica evita los problemas derivados
de los métodos tradicionales de recuento, como la elección
de un medio de cultivo adecuado, la utilización de atmósferas
controladas (anaerobiosis) y los largos periodos de incubación. Esta técnica está basada en la tinción de las células con
el Kit LIVE/DEAD® BacLight™ (Molecular Probes) que contiene dos marcadores de ácidos nucleicos (SYTO9 y IP). El
fluorocromo SYTO9 es una pequeña molécula que puede penetrar en las bacterias que poseen intacta la membrana plasmática, proporcionando una fluorescencia verde. El
fluorocromo IP penetra en las membranas dañadas, por lo
tanto no viables, proporcionando una fluorescencia de color
rojo.
Se procedió a la inoculación en vino de un cultivo
de O. oeni iniciador de la fermentación maloláctica, en dos
concentraciones celulares y dos condiciones distintas: a una
parte del cultivo se le realizó un tratamiento de preadaptación con HCl y etanol [3], y la otra no se modificó. Se tomaron muestras de estos vinos y se siguió el estado fisiológico
de las células y su número a lo largo del tiempo mediante
fluorescencia y por recuento en medio sólido.
Las muestras destinadas al recuento por fluorescencia fueron centrifugadas a 3000 rpm durante cinco minutos para eliminar levaduras y el sobrenadante fue de nuevo
centrifugado a 13000 rpm para obtener las células bacterianas, a continuación se resuspendieron en 100 µl de H2O
miliQ estéril y se añadieron 0.3 µl del Kit LIVE/DEAD®, se
dejaron incubando a temperatura ambiente y oscuridad
quince minutos y se colocaron 5 µl de la muestra en los pocillos escavados del porta mostrado en la figura 1, para su visualización en el microscopio de fluorescencia. Se utilizó
como agente de prolongación de la fluorescencia Vectashield.
ISBN 978-84-690-6060-5
Fig. 1. Protocolo resumido de aplicación del kit de Viabilidad
LIVE/DEAD®
Los recuentos microscópicos de bacterias viables
fueron obtenidos mediante el empleo del Kit LIVE/DEAD®.
Se consideraron viables las células con fluorescencia de
color verde, y no viables las que presentaban color rojo. En
algunas células se observaron colores amarillentos o anaranjados que serían propios de bacterias dañadas en parte y
con estados de viabilidad intermedios; éstas podrían equivaler a células en estado “viable no cultivable” (VNC) [1]. Para
este trabajo, dado que en cualquier caso no darían lugar a
colonias en las placas de cultivo, se consideraron como
muertas.
Con el fin de poder comparar los resultados obtenidos por microscopía de fluorescencia y los obtenidos por el
método tradicional de recuento en placa, se procedió a contar las cadenas de O. oeni visualizadas al microscopio y no
células individuales, ya que cada cadena da lugar a una colonia en medio sólido.
3. RESULTADOS
La preadaptación del cultivo iniciador con etanol y
HCl a las condiciones del vino, no dio lugar a una importante
mejoría en la viabilidad final del cultivo. Se observaron solamente algunos aumentos de viabilidad en varios de los casos
tras un día de permanencia en vino, y solamente en un caso
al final de la FML (Tabla 1).
Tabla 1. Concentración del inóculo en los vinos 1 y 2.
Comparación de los resultados obtenidos al siguiente día
de la inoculación y al final de la fermentación maloláctica
(FFML) con los sistemas de recuento mediante el
kit de viabilidad y el recuento en placa.
El recuento de bacterias viables obtenido por fluorescencia es siempre mayor al que se obtiene mediante recuento en medio sólido, por lo que la diferencia supone un
estado en las células VNC [1-2]. Este grupo de VNC llegó a
alcanzar desde un 7% hasta 40% en este estudio (Tabla 1).
Se observa también una disminución en el número
de colonias crecidas en las placas de recuento para las
muestras al final de la FML respecto al primer día de permanencia en vino; esta disminución no es tan acusada cuando
se estima el estado metabólico de las células mediante el kit
de viabilidad. Se observa incluso un ligero aumento con esta
última técnica en casi todos los casos en los que no se ha realizado la preadaptación del cultivo. Sin embargo, los cultivos preadaptados perdían algo de viabilidad en ese tiempo.
4. CONCLUSIONES
El uso del Kit LIVE/DEAD® BacLight™ facilita un
resultado rápido y cuantitativo del estado fisiológico del cultivo iniciador de la FML, puesto que podemos monitorizar el
proceso de implantación en el vino sin necesidad de realizar
cultivos que supondrían una semana de crecimiento a 28ºC
y las posteriores pruebas moleculares.
Además con este método se pueden obtener datos
de una gran parte de la población láctica que no crece en
medio sólido pero que permanece en el vino en un estado
VNC. Estas bacterias pueden ser en algunos casos de importancia para la realización de la FML porque están metabólicamente activas, aunque no sean capaces de crecer en
medio sólido.
Este sistema supone una metodología rápida, sensible, reproducible y de fácil manejo en el laboratorio, además de poseer las ventajas de los métodos rápidos e
independientes de cultivo, por lo que es altamente aplicable
en bodega.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. MILLET, V.; LONVAUD-FUNEL, A. 2000. The viable but
non-culturable state of wine micro-organisms during
storage. Letters in Applied Microbiology 30 136 – 141.
2. MORENO, Y.; COLLADO, MC.; FERRÚS, MA.; COBO,
JM.; HERNÁNDEZ, E.; HERNANDEZ, M. 2006. Viability
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dairy products stored at 4ºC using LIVE/DEAD® BacLight™ staining and conventional plate counts. International Journal of Food Science and Technology 41
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3. GRAÇA DA SILVEIRA, M.; SAN ROMAO, M.V.; LOUREIRO-DIAS, M.C.; ROMBAUX, F.M.; ABBE, T. 2002.
Flor citometric assessment of membrana integrity of
etanol stressed Oenococcus oeni cells. Applied and
Environmental Microbiology 68 6087-6083.
139
ISBN 978-84-690-6060-5
DIFERENCIAS EN LA GENERACIÓN DE AMINAS EN LA VINIFICACIÓN DE LAS
VARIEDADES TEMPRANILLO Y CABERNET SAUVIGNON
Resumen:
Dpto. Microbiología y Ecología. Facultad de Biología. Universidad de Valencia
Las aminas biógenas son bases orgánicas de bajo peso molecular que se forman con frecuencia en alimentos y
bebidas. La amina más abundante en el vino es la putrescina, encontrándose también en concentraciones más bajas histamina,
tiramina y feniletilamina, se pueden formar como consecuencia de la descarboxilación de los aminoácidos del mosto o del vino
por las bacterias lácticas.
En este trabajo se han comparado la evolución de las aminas durante la fermentación y el envejecimiento del vino de
dos variedades distintas: Cabernet Sauvignon y Tempranillo en la DO Somontano y se ha relacionado con la microbiota existente.
Los resultados muestran una mayor concentración de putrescina en mostos de Cabernet Sauvignon que en Tempranillo. Los
mostos de Tempranillo son más susceptibles a la formación de aminas. La formación de aminas durante la fermentación
alcohólica (FA) se debe a las levaduras y durante la fermentación maloláctica (FML) y crianza a O. oeni. Se han aislado tres
cepas de esta especie. V.oenos y S1 aparecen asociadas a la FML y S2 está presente durante la crianza y es la responsable
de la mayor producción de putrescina, cadaverina y tiramina.
Palabras claves: aminas biógenas, bacterias lácticas, vino, Tempranillo, Cabernet Sauvignon
1. INTRODUCCIÓN
Las aminas biógenas son compuestos nitrogenados que aparecen con frecuencia en alimentos fermentados
(vino, quesos, salchichas, etc.) y que tienen efectos negativos sobre la salud humana y la calidad de estos alimentos.
De las aminas presentes en vinos podemos destacar la histamina y la tiramina por sus efectos perjudiciales sobre la
salud humana (nauseas, hipertensión, palpitaciones, enrojecimientos, dolor de cabeza, etc.) [1], y la putrescina por
ser la más frecuente y abundante. La putrescina y otras aminas como la cadaverina, la feniletilamina y la triptamina tienen un efecto negativo sobre el aroma y sabor, además de
potenciar, junto con el alcohol, los efectos perjudiciales
sobre la salud de la histamina y la tiramina [2].La presencia
de la histamina en vinos supone una barrera a la exportación, países como Suiza tienen límites de 10 mg/L y otros
países como Francia, Bélgica y Alemania se plantean disminuir incluso hasta 2 mg/L los limites permitidos. En este
trabajo se estudia la influencia de la variedad de uva, de la
microbiota presente durante la vinificación y del tipo de recipiente en el que se realiza la FML sobre la generación de
aminas biógenas.
140
Las muestras se obtuvieron en distintos momentos
de la vinificación y crianza en barrica de mostos procedentes
de las variedades tintas Tempranillo y Cabernet Sauvignon.
Estos vinos se inocularon con la levadura UCLMS 377, (Bio
Springer Maisons-Alfort, Francia) y realizaron la FA en depósito, posteriormente parte del vino se trasvasó a barrica y
parte se mantuvo en depósito donde realizaron la FML es-
pontánea. Posteriormente los que habían hecho la FML en
depósito se distribuyeron en barricas donde envejecieron por
un periodo de 8 meses. Los momentos de muestreo fueron:
mosto antes de fermentación, tras la fermentación alcohólica
(FA), tras la fermentación maloláctica (FML), a los 4 y 8
meses de crianza en barrica. Se cuantificaron histamina, tiramina, putrescina y cadaverina mediante HPLC según describieron H. Orte et. al. [3]. Se llevaron a cabo un recuento y
aislamiento de bacterias lácticas mediante siembra en placas de MRS y MLO que se incubaron a 28 ºC durante 4-7
días. Las colonias aparecidas se aislaron en estos medios y
se identificaron mediante 16S-ARDRA (Rodas et al.) [4]. Las
bacterias aisladas pertenecientes a O. oeni, se tipificaron mediante la técnica de RAPD con el cebador M13 según Zapparoli et al. [5].
En la variedad Tempranillo se produce formación
de aminas durante la fermentación alcohólica (FA), sobretodo de histamina, putrescina y cadaverina se forman en
menor cantidad. Este aumento de aminas se debe posiblemente a la actividad de levaduras, ya que las únicas especies de bacterias lácticas que aparecen (L. plantarum, L.
hilgardii y P. parvulus) están exclusivamente en el mosto en
muy baja concentración y desaparecen durante la fermentación alcohólica. Las aminas biógenas sufren dos aumentos importantes, uno entre FA y final FML y otro desde final
FML a 4 meses de crianza, destacando la histamina y la putrescina en este último periodo. No se aprecian modificaciones importantes en las concentraciones de tiramina ni de
cadaverina en el envejecimiento (Tabla 1).Mayor concentración de putrescina e histamina en TEMBW que en
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TEMDW .Durante la FML aparecen dos cepas de la especie
O. oeni; una cepa autóctona (S1), ya presente en baja concentración al final de la FA y una cepa comercial Viniflora
oenos. Esta última que ha sido utilizada en la bodega para
inoculación de vinos aparece en estos vinos no inoculados
posiblemente por la contaminación accidental debida al uso
de maquinaria de bodega común (Fig. 1). En el período de
final FML a 4 meses de crianza, aislamos Viniflora oenos y
S2, una segunda cepa autóctona distinta de S1.S2 aparece
en TEMBW coincidiendo con el incremento de putrescina e
histamina.
Tabla 1: Evolución de la concentración de aminas (mg/L) a lo largo
de la vinificación y envejecimiento de la variedad de uva Tempranillo.
a): Mosto antes de la fermentación alcohólica (T = 0 días); b): Vino
después de la fermentación alcohólica (T = 8 días); c): Vino
después de la fermentación maloláctica: c1) T = 31 días, c2) T = 27
días, c3)=45días; d): Vino después de 4 meses de envejecimiento
en barrica d1)T = 152 días y d2)T = 211 días; e): Vino después de
8 meses de envejecimiento en barrica e1)T = 257 días y e2) T =351
Fig.1. Evolución de la microbiota láctica durante la elaboración y
crianza. S1 y S2 son cepas de O. oeni autóctonas). V. oenos es la
cepa comercial. Rec BAL: recuento total de bacterias lácticas).
L. plant: Lactobacillus plantarum). L. hilg.: Lactobacillus hilgardii)
P. parv: Pediococcus parvulus).
En la variedad Cabernet Sauvignon cabe destacar
que partimos de una concentración de aminas muy diferente
a la variedad Tempranillo, siendo relevante la elevada concentración en mosto de la putrescina, que aumenta sobretodo a lo largo del envejecimiento, equiparándose a las
cantidades encontradas en Tempranillo.
Se aprecian ligeros aumentos de la histamina, putrescina y cadaverina durante la FA, la tiramina permanece
igual. Estos cambios se deben a la actividad de las levaduras
ya que no se han aislado bacterias lácticas ni en mosto ni
tras la FA. En el periodo desde el final de la FA hasta el final
FML la histamina, tiramina y putrescina aumentan levemente
debido a la presencia de V. oenos y S1. La cadaverina no
sufre a penas variación.
En CAMDW se produce un mayor aumento que en
CAMBW de histamina, tiramina y putrescina entre los 4 y 8
meses de envejecimiento en barrica. En CAMBW la evolución de la putrescina y tiramina es similar a CAMDW, manteniéndose constante la histamina durante todo el proceso de
crianza.
Durante los 4 primeros meses de envejecimiento se
han detectado los tres tipos de cepas S1 y S2 en el caso de
CAMDW y V. oenos y S2 en el caso de CAMBW. (Fig.2)
A partir de estos datos podemos deducir que S2 es
la cepa que produce mayor cantidad de putrescina, aunque
también produce histamina y tiramina en menor cantidad, las
diferencias entre CAMDW y CAMBW se deben a las distintas
concentraciones bacterias, S1 también produce putrescina
pero en menor cantidad que S2; V. oenos es una de las responsables del aumento de histamina.
No parece haber una influencia notable en el tipo
de recipiente sobre la concentración de aminas.
Fig.2. Evolución de la microbiota láctica durante la elaboración y
crianza. S1 y S2 son cepas de O. oeni autóctonas.
V. oenos es la cepa comercial.
4. CONCLUSIONES
Se ha observado que existe una relación entre la
generación de aminas, el tipo y concentración de cepa de O.
oeni y el momento de la vinificación pero no con el tipo de recipiente donde se realiza la fermentación maloláctica. La
mayor acumulación de aminas se produce fundamentalmente
durante el periodo de crianza y las aminas que más aumentan son la histamina y la putrescina. Las cepas que mayoritariamente aparecen durante la crianza en barrica son V.
oenos y S2; ambas se han mostrado productoras de histamina, siendo la cepa S2 la principal responsable de la síntesis de putrescina. También ambas pueden producir
cadaverina y tiramina. La cantidad de estas aminas al final
de la crianza está relacionada con la concentración de células viables, tanto de V. oenos como S2, y con el tiempo que
141
ISBN 978-84-690-6060-5
permanecen vivas durante el envejecimiento. A pesar de que
aparecen las mismas cepas en Cabernet y Tempranillo, se
aprecia que la variedad Tempranillo es más susceptible a la
generación de aminas, sobretodo de histamina y putrescina.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. BAUZA, T., BLAISSE, A., TEISSEDRE, P.L., CABANIS,
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ISBN 978-84-690-6060-5
EFECTO DE LA LISOZIMA, SO2, MICROOXIGENACIÓN, TIPO DE RECIPIENTE Y
ADICIÓN DE CULTIVOS MALOLÁCTICOS SOBRE LA GENERACIÓN DE AMINAS
EN VINOS DE TEMPRANILLO
Resumen:
Dpto. Microbiología y Ecología. Facultad de Biología. Universidad de Valencia 963544390. [email protected]
Las aminas biógenas son bases orgánicas de bajo peso molecular, que se forman con frecuencia en bebidas y
alimentos fermentados y que pueden ser peligrosas para la salud. En vinos se han identificado putrescina, isoamilamina,
histamina, tiramina, cadaverina y feniletilamina. Las aminas pueden estar presentes de forma natural en el mosto, pero también
pueden ser formadas por las bacterias lácticas como consecuencia de la descarboxilación de los aminoácidos presentes en el
mosto o en el vino. Las bacterias lácticas están presentes a lo largo de toda la vinificación Se ha propuesto el uso de lisozima
para controlar a la población láctica en determinados momentos, por ejemplo antes de utilizar cultivos malolácticos. Se ha
descrito que la generación de aminas se ve propiciada en barrica y tras la fermentación maloláctica y que los cultivos comerciales
pueden contribuir a disminuirlas. La microoxigenación es una técnica que ayuda a la estabilización del color de los vinos, pero
de la cual se desconocen sus efectos sobre la microbiota y sobre la formación de aminas
Los objetivos de este trabajo han sido: 1) analizar el efecto de la microoxigenación, adición de sulfuroso y lisozima y
tipo de recipiente sobre la microbiota y generación de aminas.; 2) evaluar la efectividad del uso de cultivos malolácticos
seleccionados para minimizar estos compuestos; 3) dilucidar en qué momento del proceso de vinificación se generan las
distintas aminas biógenas y 4) determinar cuales son las bacterias responsables de la generación de aminas.
Palabras clave: lisozima, bacterias lácticas, aminas biógenas, microoxigenación
1. INTRODUCCIÓN
Las aminas biógenas (AB) son bases orgánicas de
bajo peso molecular formadas frecuentemente en alimentos
y productos fermentados. Estos compuestos causan problemas en la salud humana ingeridos en altas concentraciones
[1].Se han identificado veinticuatro aminas diferentes en vino,
siendo las putrescina la más abundante [2]. Las aminas pueden estar presentes de forma natural en el mosto, pero también pueden formarse por las bacterias lácticas (BAL) durante
la FML o envejecimiento por la descarboxilación de los aminoácidos presentes en el vino. La concentración de los aminoácidos depende de la variedad de uva, condiciones
climáticas, composición del suelo [3] y maduración del grano
[4, 5] y varía durante la vinificación. Algunos autores han demostrado que cepas pertenecientes a Pediococcus parvulus,
Oenococcus oeni, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus brevis y Lactobacillus buchneri son capaces de producir histamina, tiramina, feniletilamina y cadaverina [6-11] La
aplicación de la lisozima para limitar el desarrollo de las BAL
han mostrado resultados variables [12, 13].El SO2 utilizado
en vinificación actúa inhibiendo el crecimiento de bacterias.
Generalmente se asume que la generación de aminas es
más importante en barrica y que se puede limitar con el uso
de bacterias seleccionadas [16]. Aunque se han hecho muchos estudios sobre la microoxigenación de los vinos, éstos
se han centrado en la estabilización del color pero no sobre
la microbiota láctica. Los objetivos de este trabajo han sido
estudiar la influencia que tienen la lisozima y el SO2, la microoxigenación, el tipo de recipiente en el que se realiza la
FML y la adición de cultivos malolácticos sobre la generación
de aminas en vinos.
Los experimentos se realizaron durante la vinificación de un mosto de Tempranillo (D.O. Somontano). El mosto
se inoculó a razón de 20 mg/L, con la levadura UCLMS 377
(Bio Springer Maisons-Alfort, Francia), y realizó la fermentación alcohólica (FA) en depósito. Tras la FA se adicionaron
dosis distintas de sulfuroso (3-5 g/HL) y trascurridas 48 h la
lisozima (20-50 g/HL) según el tipo de experimento (Fig.1).
Posteriormente se microoxigenó en depósito con dosis de 60
mg/L/mes. El vino se distribuyó en depósito y barricas donde
se realizó la fermentación maloláctica (FML) bien por las BAL
autóctonas o bien por bacterias seleccionadas a razón de 5.8
mg/L (V. oenos, Christian Hansen, Hoersholm, DK) (Fig.1).
Los vinos que realizaron la FML en depósito se distribuyeron
posteriormente en barricas. Todos envejecieron por un periodo de 6 meses. Los momentos de muestreo fueron: mosto,
antes de fermentación, tras fermentación alcohólica (FA), 48
h tras la adición de SO2, 48 h tras la adición de lisozima, tras
FML, a los 2, 4 y 6 meses de crianza en barrica. El recuento
de BAL se realizó por siembra en placas de MRS y MLO que
se incubaron a 28º C durante 4-7 días, finalmente se procedió a un aislamiento de colonias que se identificaron a nivel
de especie mediante 16S-ARDRA [14] y a nivel de cepa en el
caso de O. oeni por RAPD, utilizando el cebador M13 [15].
Histamina, tiramina, putrescina, y cadaverina se cuantificaron mediante HPLC [17].
143
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Fig.1.Esquema de trabajo para la adición y dosis de SO2, lisozima y microoxigenación.
TENOMDW: Tempranillo no oxigenado maloláctica en depósito con bacterias autóctonas. (3 g/HL SO2)
TENOMBW: Tempranillo no oxigenado maloláctica en barrica con bacterias autóctonas. . (3 g/HL SO2)
TENOMBS: Tempranillo no oxigenado maloláctica en barrica con bacteria láctica seleccionada. (3 g/HLSO2+20 g/HL lisozima).
TENOMDS: Tempranillo no oxigenado maloláctica en depósito con bacteria láctica seleccionada. (3 g/HLSO2+20 g/HL lisozima).
TENMB: Tempranillo no maloláctica barrica. (5 g/HL SO2+ 50 g/HL lisozima)
TEOXMBS: Tempranillo oxigenado maloláctica en barrica con bacteria láctica seleccionada. (3 g/HLSO2+20 g/HL lisozima).
TEOXMDS: Tempranillo oxigenado maloláctica en depósito con bacteria láctica seleccionada. (3 g/HLSO2+20 g/HL lisozima).
TEOXMBW: Tempranillo oxigenado maloláctica en barrica con bacterias autóctonas. (3 g/HL SO2)
TEOXNMB: Tempranillo oxigenado no maloláctica en barrica. (5 g/HL SO2+ 50 g/HL lisozima)
3.1. Efectos de lisozima, SO2 y microoxigenación sobre
la población láctica y AB.
Se observó que la microoxigenación no influye en la
evolución de la población láctica. El efecto de la lisozima es
difícil de interpretar: solo se aprecia inhibición de crecimiento
de BAL con las dosis más altas de lisozima (TENONMB). El
SO2 solo consigue reducir a la mitad la población láctica
cuando se utiliza a dosis de 5 g/HL, dosis más bajas no
muestran un efecto claro. Hay un aumento de BAL de aproximadamente dos órdenes de magnitud durante la FA, coincidente con un aumento de casi 2 mg/L de histamina, 1.5
mg/L de tiramina y putrescina y 0.2 mg/L de cadaverina (las
responsables de su síntesis pueden ser las levaduras o las
BAL). En mosto aparecen pequeñas poblaciones de L. paracasei (103 ufc/mL) y Leuc. mesenteroides (102 ufc/mL) que
disminuyen en FA, mientras que dos cepas de O. oeni, V.
oenos y S1, aparecen en elevadas concentraciones (105
ufc/mL) al final de FA. El uso conjunto de lisozima y SO2 solo
provoca una reducción de 1/3 la población de BAL cuando se
emplean las dosis más altas de ambos casos. En el resto de
casos ni uno ni otro disminuyen los recuentos.
ducción de histamina en vinos no inoculados que en inoculados. El aumento de la putrescina se produce por igual en inoculados y no inoculados y parece más alto en barrica que en
depósito. Tiramina desciende en vinos en los que ha habido
adición de lisozima y se mantiene o aumenta en los otros. La
cadaverina aumenta ligeramente en todos los casos excepto
en TENONMB. El incremento en histamina parece estar relacionado con la concentración de O. oeni durante el envejecimiento mientras que el aumento de putrescina parece estar
relacionado con los recuentos de la cepa autóctona S2 en
ese periodo. No se aprecia efecto de la inoculación en ese
periodo. Hay un aumento de bacterias desde el final de la FA
hasta el final de la FML en todos los casos, excepto en los
casos en los que se previno. Se hallan recuentos del orden
de 108 ufc/mL en aquellos vinos no inoculados que han hecho
la FML, mientras que en los inoculados la población máxima
alcanzada está entre 7.12 x 106 en barrica, y 3.2 x 107 ufc/mL
en depósito de acero. Al final de la FML hemos detectado la
presencia de las cepas V. oenos y S1 en cantidades muy semejantes en vinos no inoculados, mientras que en vinos inoculados sólo hemos detectado V. oenos.
Tabla 1.Efecto del sulfuroso y lisozima sobre la microbiota láctica.
3.2. Efecto del tipo de recipiente y adición de cultivos
malolácticos sobre la generación de AB.
144
La evolución de las AB desde FFA hasta FFML es
que disminuye la histamina en aquellos vinos que fueron tratados con lisozima mientras que hubo un aumento en el resto
de hasta 4.5 mg/L. Sin embargo, la putrescina aumento en
todos los casos hasta 5.5 mg/L siendo mayor su incremento
en los depósitos en los que no se añadió lisozima y relacionándose en este caso con un aumento de la población láctica. Las otras aminas aumentan ligeramente en todos los
casos .Hay una implantación de la bacteria inoculada, y en
los no inoculados coexisten S1 y V. oenos en concentraciones similares. Durante el envejecimiento hay una mayor pro-
El muestreo realizado en el vino en el que se previno
la FML al tiempo en el que los otros la finalizaron, demostró la
presencia única de la cepa V. oenos en baja concentración (5.8
x 104 ufc/mL). Durante el envejecimiento, el número de BAL
va decreciendo, y en la mayor parte de los casos no se detectan bacterias viables tras los dos primeros meses de envejecimiento (Tabla 2). Durante el envejecimiento aparece la cepa
S2 de O. oeni, aunque su desarrollo es muy limitado y no supera en ningún caso las concentraciones de 103 ufc/mL; la
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única excepción es del vino inoculado que llevó a cabo la FML
en barrica, en el cual la cepa S2 alcanzó niveles de 105 ufc/mL.
En todos los vinos en los que se observó la presencia de esta
cepa se encontró una mayor cantidad de putrescina. Durante
el periodo de crianza se han detectado aumentos notables en
putrescina (entre 7-11 mg/L) e histamina (3.5-8.4 mg/L) en
todos los casos. S2 es la cepa que produce mayor cantidad
de putrescina, aunque también produce histamina y tiramina
en menor cantidad. S1 también produce putrescina pero en
menor cantidad que S2; V. oenos es una de las responsables
del aumento de histamina. En este sentido, no se observan diferencias significativas entre la FML efectuada en depósito o en
barrica para los vinos sin inocular, ni siquiera en relación a los
tiempos de aparición de dichas AB. Sí que se observó un claro
aumento de la putrescina cuando la FML se realizó en barrica
y no en depósito en los vinos inoculados con V. oenos.
Tabla 2. Efecto tipo de recipiente,
cultivos malolácticos y momentos de vinificación.
No se aprecia influencia del tipo de recipiente sobre
los recuentos obtenidos al final de la FML, ni sobre los tipos
de cepas encontrados en ese momento, que son V. oenos y
S1: en ambos tipos de recipientes aparecen ambas cepas.
V. oenos aparece como cepa única al final de la FML en los
vinos inoculados, independientemente de en qué tipo de recipiente haya tenido lugar esta fermentación, mientras que
en los no inoculados se presenta asociada a S1 tanto en
vinos que han realizado la FML en barrica como en depósito.
4. CONCLUSIONES
1. No se aprecia efecto inhibidor de la lisozima, solo recuentos más bajos en los experimentos con dosis de lisozima
de 50 g/Hl.
2. La microoxigenación y el SO2 no influyen en la evolución
de la población láctica
3. La menores concentraciones de histamina en vinos inoculados podría relacionarse con la implantación de la bacteria comercial pero no explicaría la disminución que sufre
esta amina desde FFA hasta FFML. Esto podría relacionarse con la adición de lisozima.
4. No se aprecia influencia del tipo de recipiente sobre los recuentos obtenidos a final de FML, ni sobre los tipos de
cepas encontrados ni sobre el contenido de aminas.
5. La cepa S2 aparecida durante el envejecimiento es la
mayor productora de putrescina.
6. El incremento en histamina parece estar correlacionado
con la presencia de niveles medios o altos de V. oenos y
S1 durante la crianza.
5. BIBLIOGRAFÍA
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145
ISBN 978-84-690-6060-5
IDENTIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS PRESENTES EN EL VINO MEDIANTE
HIBRIDACIÓN EN EL “ENOCHIP”
ENOLAB-Laboratorio de Microbiología Enológica, Departamento de Microbiología y Ecología, Facultad de Biología, Universidad de Valencia,
C/ Doctor Moliner 50, 46100 Burjasot (Valencia). 96 354 3145 [email protected]
Resumen:
El objetivo de este trabajo ha sido la identificación de los microorganismos presentes durante la vinificación utilizando
un enochip. El enochip se basa en el uso de sondas de DNA específicas para detectar las diferentes especies de bacterias y
levaduras que se han descrito como implicadas en el proceso de vinificación. Las sondas específicas se han diseñado a partir
de regiones variables de los genes 16S para bacterias y 26S para levaduras.
Una de las principales ventajas que confiere este sistema de identificación frente a otros alternativos es que permite
detectar microorganismos directamente desde el vino, sin necesidad de realizar cultivos. Otra cualidad del sistema es que
permite detectar todos los microorganismos presentes en la muestra al mismo tiempo, tanto si son levaduras como bacterias
lácticas o acéticas.
Se han analizado diferentes mostos y vinos de la D.O. Utiel-Requena con esta técnica. Los resultados obtenidos se
han contrastado con los proporcionados por otras técnicas moleculares (16S ARDRA), lográndose unos resultados similares
en todos los casos.
Las principales ventajas del uso de este sistema son su rapidez, su versatilidad y su fiabilidad.
Palabras clave: enochip, bacterias acéticas, bacterias lácticas, levaduras, vino
1. INTRODUCCIÓN
Gran cantidad de microorganismos se desarrollan
a lo largo del proceso de vinificación. Las levaduras suelen
estar presentes en el mosto y en el vino en las primeras fases
de su elaboración, especialmente la especie Saccharomyces
cerevisiae, responsable de la fermentación alcohólica. También podemos encontrar otras levaduras alterantes que dan
lugar a sabores o aromas no deseables. Las bacterias lácticas (BL) se desarrollan una vez las levaduras han completado la primera fermentación. Son las responsables de la
fermentación maloláctica, proceso muy deseable para la obtención de vinos de calidad, aunque también pueden causar
alteraciones. Las bacterias acéticas (BA) siempre tienen efectos perjudiciales produciendo el picado acético de los vinos.
El objetivo de este trabajo es evaluar el uso de un
chip electrónico para monitorizar la evolución de las especies
de microorganismos durante la vinificación. Para ello hemos
utilizado un enochip basado en el uso de sondas de DNA específicas para las diferentes especies de bacterias y levaduras asociadas al proceso de vinificación. Las sondas
específicas de especie se han diseñado en base a regiones
variables de los genes 16S y 26S para bacterias y levaduras
respectivamente. Se ha contrastado la fiabilidad de la identificación por este método utilizando otras técnicas moleculares de identificación previamente descritas.
2.1. Origen y procesamiento de las muestras de vino
146
Se tomaron muestras en diferentes momentos de
la vinificación de uvas Macabeo, Bobal y Tempranillo de la
D.O. Utiel-Requena: mosto, vino al final de la fermentación
alcohólica y en fermentación maloláctica. Las muestras se
sembraron en diferentes medios de cultivo sólidos: MRS con
0.5 g/L de L-cisteína y MLO (ambos con natamicina), y GPYA,
y se incubaron cuatro días a 28 ºC hasta obtener colonias
aisladas. Las colonias crecidas se identificaron mediante la
técnica del 16S-ARDRA e ITS-ARDRA, descritas a continuación. En paralelo se realizó una extracción del ADN total y
una posterior amplificación para identificar las especies presentes mediante el enochip.
2.2. Identificación de especies mediante el enochip
A partir de 1 mL de cada muestra se realizó la extracción de ADN según el protocolo descrito por Gindreau et
al. [1] incubando 10 minutos la muestra al añadir la PVP (polivinilpirrolidona).
Se amplificó por PCR un fragmento del gen ribosomal 16S de alrededor de 360 pb utilizando los cebadores I1B
biotinilado e I2B [2] para detectar las BL. También se amplificó otro fragmento del mismo gen de aproximadamente 260
pb con los cebadores I7B biotinilado e I8B para detectar las
BA. Y por último se amplificó un fragmento del gen 26S con
los cebadores NL1 biotinilado y NL4 [3] para detectar las levaduras. Tras purificar los amplificados mediante un kit de
purificación y cuantificar el DNA, las muestras se diluyeron a
una concentración de 500 nM en agua Mili Q y desnaturalizaron en un termociclador a 94 ºC durante 5 minutos. Las
muestras biotiniladas se colocaron en una placa multipocillos
y fueron dirigidas electrónicamente a posiciones concretas
del chip con un volumen de histidina 100 mM y se añadió un
control que contenía histidina 100 mM y agua Mili Q en el
mismo volumen final que las muestras. La hibridación se llevó
ISBN 978-84-690-6060-5
a cabo según las instrucciones de NanoChip Molecular Biology Workstation, tal como describe [4]. Las sondas específicas utilizadas estaban marcadas con los fluoróforos Cy3 y
Cy5 y la señal de fluorescencia fue leída a diferentes temperaturas progresivamente mayores, 24, 25, 27 y 29 ºC para
los dos fluoróforos empleados.
2.3. Identificación de especies mediante 16S–ARDRA /
ITS-ARDRA
En el caso de las bacterias, se amplificó por PCR el
gen 16S, según describe Rodas et al. [5]. Se amplificó también el fragmento ITS de las levaduras con los cebadores
ITS1 y ITS4 [6]. Se llevó a cabo la digestión de 500 ng del
producto amplificado con 5 U de enzimas de restricción: MseI
para las bacterias lácticas, AluI para las acéticas y HaeIII para
las levaduras, incubando 3 horas a 37 ºC. Posteriormente los
fragmentos de restricción se separaron en un gel de agarosa
al 2% obteniéndose un perfil de bandas característico para
cada especie.
Los perfiles de restricción obtenidos a partir de los
diferentes aislados fueron introducidos junto a los de diferentes cepas de referencia en el programa Bionumerics version 2.5 (Applied Maths) y analizados usando el método de
agrupamiento UPGMA y el coeficiente de correlación de Dice.
3. RESULTADOS
3.1. Identificación de especies mediante el enochip
Los resultados obtenidos con el enochip se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Especies de bacterias y levaduras identificadas con
el enochip. A: Acetobacter; G: Gluconobacter;
Ga: Gluconacetobacter; L: Lactobacillus; O: Oenococcus;
P: Pichia; S: Sacchraromyces; N.D.: no detectado.
3.2. Identificación de especies mediante 16S–ARDRA /
ITS-ARDRA
Los resultados obtenidos por la técnica del ARDRA
se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Especies de bacterias y levaduras identificadas por
16S–ARDRA / ITS-ARDRA. H: Hanseniapora; P: Pediococcus;
T: Torulaspora; N.D.: no detectado.
4. CONCLUSIONES
El enochip permite la identificación directa de los
microorganismos desde el vino, pese a ser un medio complejo y con gran cantidad de inhibidores. Ésta es una de las
principales ventajas de esta técnica ya que podemos detectar microorganismos sin necesidad de realizar cultivos, lo
cual reduce bastante los tiempos de los análisis y facilita la
adopción de medidas correctoras rápidas. Además, algunos
de los aislados sólo fueron detectados por esta técnica, ya
que no crecieron en placa debido posiblemente, a su reducida viabilidad o a su difícil adaptación a crecer en medios de
laboratorio. Un ejemplo de ello fue la identificación de la bacteria acética Gluconacetobacter liquefaciens que se encontraba presente en la mayoría de los vinos analizados y en
uno de los mostos, y que a pesar de ello no se pudo aislar
en placa.
En general, la técnica del ARDRA permitió identificar un mayor número de especies que el enochip. Es el caso
de las levaduras Torulaspora delbruecki y Hanseniaspora
uvarum; la razón que explica este hecho parece estar relacionada con la baja concentración relativa de estas especies
en las muestras. Posiblemente, la gran cantidad de ADN total
dificulta la correcta hibridación de las especies minoritarias
con su sonda específica.
Por lo tanto, la identificación de los microorganismos del vino con el enochip supone una interesante alternativa a las ya conocidas, siempre y cuando no se encuentren
en una proporción relativa muy baja. Las principales ventajas
del enochip frente a otras técnicas moleculares de identificación que requieren del cultivo, es su rapidez y su capacidad
de detectar varios microorganismos al mismo tiempo. Estas
ventajas suponen que se puedan adoptar tempranamente
medidas de seguridad que eviten alteraciones antes de que
la elevada concentración de microorganismos comprometa
la calidad final del vino.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. GINDREAU, E.; WALLING, E.; LONVAUD-FUNEL, A.
2001. Direct polymerase chain reaction detection of
ropy Pediococcus damnosus strains in wine. Journal
of Applied Microbiology 90: 535-42
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study of wine Lactobacillus strains: taxonomic implications. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 55: 197-207
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Yeast diversity and persistence in botrytis-affected
wine fermentations. Appl. Environ. Microbiol. 68: 488493
4. MAÑES, R.; PARDO, I.; FERRER, S. 2005. Diseño de
sondas de hibridación para un biochip capaz de detectar microorganismos alterantes de vinos. Avances
en ciencias y técnicas enológicas-1. Jornadas Científicas de los Grupos de Investigación Enológica. Instituto
Tecnológico Agrario de Castilla y León. GIENOL 2005.
ISBN: 84-933654-8-3 pp 205-206
147
ISBN 978-84-690-6060-5
5. RODAS, AM.; FERRER, S.; PARDO, I. 2003. 16S-ARDRA,
a tool for Identification of lactic acid bacteria isolated
from grape must and wine. Systematic and Applied Microbiology 26: 412-22
6. ESTEVE-ZARZOSO, B.; BELLOCH, C.; URUBURU, F.;
QUEROL, A. 1999. Identification of yeasts by RFLP
analysis of the 5.8S rRNA gene and the two riboso-
148
mal internal transcribed spacers. International Journal
of Systematic Bacteriology 49: 329-37
6. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado con el proyecto
AGL2003-03689.
ISBN 978-84-690-6060-5
DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE Brettanomyces/Dekkera EN VINOS POR
TÉCNICAS MOLECULARES
ENOLAB-Laboratorio de Microbiología Enológica, Departamento de Microbiología y Ecología, Facultad de Biología, Universidad de Valencia,
C/ Doctor Moliner 50, 46100 Burjasot (Valencia). 96 354 3145. [email protected]
Resumen:
Se ha descrito una gran variedad de levaduras como contaminantes del vino. De todas ellas, las especies de
Brettanomyces/Dekkera son probablemente las que más preocupan al sector enológico. Se ha demostrado que estas levaduras
son capaces de desarrollarse en vinos de crianza o en botella, a pesar de los elevados niveles de etanol, y de producir olores
desagradables por síntesis de compuestos fenólicos olores atribuidos a esta levadura varían desde olor animal, establo, sudor
de caballo, cuero…
El objetivo de nuestro trabajo fue la detección e identificación de Brettanomyces/Dekkera en diferentes vinos tintos
cuyas propiedades organolépticas estaban alteradas. La detección directa del vino se llevó a cabo mediante el empleo de un
enochip con sondas específicas para esta especie. Paralelamente, se sembraron placas de cultivo de las que se recuperaron
colonias para su identificación mediante ITS-ARDRA y PCR específica. Los resultados obtenidos fueron similares con todas las
técnicas empleadas, lo que demuestra la validez del enochip para detectar e identificar Brettanomyces/Dekkera directamente
del vino, sin necesidad de cultivo previo.
Palabras clave: Brettanomyces/Dekkera, enochip, PCR específica, ITS-ARDRA, detección e identificación
1. INTRODUCCIÓN
Una gran variedad de levaduras se han descrito
como contaminantes del vino. Las levaduras del género Brettanomyces, que se conocían desde hace tiempo como contaminantes de cerveza y sidra, también se han descrito como
contaminantes de vinos. Concretamente, la especie Brettanomyces/Dekkera bruxellensis se ha detectado en vinos tintos que llevan más de seis meses en barrica y es en este
período de crianza donde la población de estas levaduras aumenta de manera lenta pero sin competencia.
El principal efecto perjudicial que estas levaduras
tienen sobre el vino es el desarrollo de aromas desagradables que se describen como olor a animal, establo, sudor de
caballo, cuero u orina de ratón entre otros. Esto es debido a
la capacidad de estos microorganismos para sintetizar compuestos fenólicos volátiles mediante descarboxilación de los
ácidos hidroxicinámicos, obteniéndose como resultado final
los etilfenoles. De ahí la gran necesidad de desarrollar para
su detección métodos moleculares rápidos que no requieran
el cultivo, ya que los que sí dependen de cultivo retrasan la
identificación una o dos semanas.
Se tomaron muestras de vinos de la D.O. Rioja que
estaban en proceso de envejecimiento en barrica y que mostraban alteradas sus propiedades aromáticas. Las muestras
fueron sometidas a métodos moleculares de detección e
identificación de Brettanomyces spp. dependientes (ITSARDRA) e independientes de cultivo (enochip). Para los métodos dependientes de cultivo, las muestras se sembraron en
medio de cultivo sólido GPYA y se incubaron siete días a 28
ºC hasta obtener colonias aisladas. Éstas se observaron al
microscopio y se seleccionaron las que tenían la morfología
celular ojival o cilíndrica propia de Brettanomyces [1], tal
como se muestra en la Fig.1.
Fig. 1. Levaduras aisladas del vino observadas al microscopio
2.1. Identificación de Brettanomyces/Dekkera bruxellensis
en el enochip
A partir de 1 mL de cada muestra se realizó la extracción de ADN según el protocolo descrito por Gindreau et
al. [2] incubando 10 minutos la muestra al añadir la PVP.
Se amplificó un fragmento del gen 26S con los cebadores NL1 biotinilado y NL4 [3] y los productos de PCR fueron visualizados en un gel de agarosa y purificados mediante
un kit de purificación. Tras cuantificar el DNA en un gel de agarosa con un marcador de concentración (Low DNA Mass Ladder, Invitrogen), las muestras fueron diluidas a 500 nM y
desnaturalizadas en un termociclador. Se colocaron en una
placa multipocillos con un volumen de histidina 100 mM y fueron dirigidas electrónicamente a posiciones concretas del chip.
La hibridación con la sonda específica de D. bruxellensis se
149
ISBN 978-84-690-6060-5
llevó a cabo según las instrucciones de NanoChip Molecular
Biology Workstation [4]. La sonda estaba marcada con el fluoróforo Cy3 y la señal de fluorescencia se detectó a diferentes
temperaturas progresivamente mayores, 24, 25, 27 y 29 ºC.
Fig. 2. Intensidad de fluorescencia de la hibridación de las
muestras con la sonda específica de Brettanomyces en el
enochip. Las posiciones 3 y 10 de la segunda fila,
corresponden a la muestra que dio señal positiva.
2.3. Identificación de B./D. bruxellensis por la técnica
ITS-ARDRA
Se amplificó por PCR el fragmento ITS de las levaduras con los cebadores ITS1 y ITS4 [5] directamente desde
colonia. Tras visualizar los productos de PCR en un gel de
agarosa, se cuantificaron y se llevó a cabo la digestión de
500 ng de ADN con 5 U de HaeIII, incubándose 3 horas a 37
ºC. Posteriormente los fragmentos de restricción se observaron en un gel de agarosa al 2%.
Los perfiles de restricción obtenidos de los diferentes aislados fueron comparados con los de varias cepas de
referencia, entre las que se encontraba D. bruxellensis CECT
1451T.
2.4. Detección de Brettanomyces por PCR específica
A partir de las colonias crecidas en las placas se realizó una PCR con los cebadores DB90F y DB394R descritos por Cocolin et al. [6] que amplifican específicamente un
fragmento de aproximadamente 305 pb del ADN de B. bruxellensis y B. anomalus. Se incluyeron otras levaduras del
vino como control negativo. Los productos de PCR fueron visualizados en un gel de agarosa.
3. RESULTADOS
En una de las muestras analizadas con el enochip,
se detectó hibridación con la sonda específica de Brettanomyces/Dekkera bruxellensis, tal como se muestra en la
Fig.2. La señal de fluorescencia fue al menos tres veces más
intensa que el ruido de fondo.
Se observó crecimiento en las placas de todos los
vinos analizados pero sólo en la muestra correspondiente al
mismo vino en el que se detectó señal de hibridación con el enochip, apareció un tipo de colonia cuya morfología colonial y celular se correspondía con la de Brettanomyces. El recuento en
placa de esta muestra reveló que el tamaño de la población era
30 UFC/mL. Todos los aislados seleccionados como posibles
Brettanomyces mostraron el mismo patrón de restricción que la
cepa de referencia de Brettanomyces/Dekkera bruxellensis
CECT 1451T cuando se analizaron por la técnica del ARDRA.
Los mismos aislados se amplificaron con los cebadores específicos DB90F y DB394R y todos dieron un producto de PCR del tamaño esperado (305 pb). Ninguna
levadura perteneciente a otras especies, empleadas como
controles negativos, dieron lugar a fragmento de amplificación.
4. CONCLUSIONES
150
De todas las muestras analizadas, sólo una mostró la
presencia de Brettanomyces/Dekkera. Los resultados de identificación fueron idénticos por las tres técnicas empleadas, tanto dependientes como independientes de cultivo. En las placas
correspondientes a las otras muestras, crecieron colonias bacterianas pero no se observó ninguna levadura. Hay que tener en
cuenta el bajo nivel de detección de la técnica del enochip, ya que
fue capaz de detectar la presencia de tan solo 30 ufc/mL.
Aunque los resultados fueron idénticos con todas
las técnicas empleadas, los obtenidos por técnicas independientes de cultivo son mucho más rápidos, unas pocas horas,
frente a los métodos tradicionales con siembra en placa que
conllevan de 1 a 2 semanas. Ello contribuirá a una rápida actuación, incluso preventiva, que evitará alteraciones del vino.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. NAVASCUÉS, E. 2007. Brettanomyces/Dekkera: control y detección en bodegas. ACE Revista de EnologíaCIENCIA 78: 14-20
2. GINDREAU, E.; WALLING, E.; LONVAUD-FUNEL, A.
2001. Direct polymerase chain reaction detection of
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of Applied Microbiology 90: 535-42
3. MILLS, D. A.; JOHANNSEN, E. A., COCOLIN, L. 2002.
Yeast diversity and persistence in botrytis-affected
wine fermentations. Appl. Environ. Microbiol. 68: 4884-93
4. MAÑES, R.; PARDO, I.; FERRER, S. 2005. Diseño de
sondas de hibridación para un biochip capaz de detectar microorganismos alterantes de vinos. Avances
en ciencias y técnicas enológicas-1. Jornadas Científicas de los Grupos de Investigación Enológica. Instituto
Tecnológico Agrario de Castilla y León. GIENOL 2005.
ISBN: 84-933654-8-3 pp 205-206
5. ESTEVE-ZARZOSO, B.; BELLOCH, C.; URUBURU, F.;
QUEROL, A. 1999. Identification of yeasts by RFLP
analysis of the 5.8S rRNA gene and the two ribosomal internal transcribed spacers. International Journal
of Systematic Bacteriology 49: 329-37
6. COCOLIN, L.; RANTSIOU, K.; IACUMIN, L.; ZIRONI R.;
COMI, G. 2004. Molecular detection and identification
of Brettanomyces/Dekkera bruxellensis and Brettanomyces/Dekkera anomalus in spoiled wines. Appl.
Environ. Microbiol. 70: 1347-55
6. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado con el proyecto
AGL2003-03689.
ISBN 978-84-690-6060-5
ELABORACIÓN Y COMERCIALIZACIÓN DE LEVADURAS LOCALES SELECCIONADAS
D. Manuel Álvarez Rangel1
1
Resumen:
Heral Enología S.L. 606958139-924671333. [email protected]
Heral Enología, S. L. es una empresa extremeña cuuya actividad original era la de asesoría técnica enológica. A
causa de los problemas de fermentación de algunos mostos, contactó con el Dr. Manuel Ramírez Fernández del dpto. de
microbiología de la Uex para producir y comercializar levaduras seleccionadas autóctonas que satisficieran las necesidades del
sector vitivinícola extremeño. Fruto del trabajo en común, se han firmado convenios de cesión de patente y de transferencia de
tecnología para la elaboración de levaduras.
Palabras clave: Heral Enología, Levaduras, Uex, Tecnología.
1. HERAL ENOLOGÍA, S. L.
Heral Enología nace como fruto de la necesidad
que tienen muchas bodegas extremeñas de un apoyo técnico sin necesidad de contratar a personal cualificado fijo.
Así, la primera actividad de la empresa fue la asesoría técnica
enológica. Posteriormente, debido al estrecho contacto con el
mundo del vino, se pone de manifiesto la demanda de muchas bodegas de una serie de productos enológicos que
deben ser diseñados a la medida de sus necesidades, a diferencia de la mayoría de los productos y aditivos comerciales que están diseñados para vinos estándar sin tener en
cuenta las peculiaridades de cada zona vitivinícola. Heral
Enología comienza la fabricación de productos y aditivos enológicos (activadores de fermentación, clarificantes) “a medida” para bodegas extremeñas. En esta búsqueda incesante
por mejorar los vinos extremeños, Heral Enología encuentra
apoyos en la Universidad de Extremadura y firma convenios
de colaboración y de cesión de patentes. Fruto de esta Colaboración, Heral Enología comienza a fabricar levaduras de
uso enológico (única fábrica en España), que comercializa
en forma de levadura líquida activa con 100% de viabilidad,
y que han sido utilizadas con éxito en muchas bodegas de
Extremadura, así como de Valencia y Portugal, recibiendo los
vinos elaborados con estas levaduras premios a nivel regional (Espigas), Nacional (Baco) e Internacional (Arabel, Internacional de Bruselas).
Actualmente, Heral Enología ha comenzado la edificación de sus nuevas instalaciones en el polígono industrial
de Almendralejo donde, en colaboración con Fomento de
Emprendedores, pretende instalar la única fábrica de levaduras en España, mediante la creación de una nueva empresa que se constituirá como “spin-off” de la Universidad de
Extremadura.
Como último paso de crecimiento, Heral Enología
adquiere en agosto de 2006 el laboratorio LAVIN, reconocido
por la Junta de Extremadura para análisis de vinos, aceites y
aguas, para poder ofrecer a sus clientes un servicio técnico
enológico integral.
Fruto de esta aún corta andadura, Heral Enología
cuenta entre sus clientes con el 90% de las bodegas de Ex-
tremadura, así como con numerosos agricultores y empresarios extremeños y españoles.
Por otra parte, Heral Enología recibió en 2004 el
Premio CTAEX a la Empresa Innovadora en su modalidad de
procesos por una nueva técnica de elaboración de aceitunas
de aderezo que permite utilizar las lejías como fertilizante previo tratamiento. Este proceso está patentado y se está desarrollando un proyecto de investigación junto con CTAEX,
para solucionar el problema de contaminación que suponen
estos vertidos y ampliar las áreas de actividad de nuestra
compañía. Además, ha comenzado a colaborar con la Universidad de Extremadura y la Estación Enológica de Almendralejo en un proyecto de investigación de selección y mejora
genética de levaduras autóctonas extremeñas para elaboración de cava.
Por último, indicar que Heral Enología cuenta entre
su plantilla con un Licenciado en Químicas, Licenciado en
Enología, Titulado en Educación y Técnico en Elaboración de
Vinos.
2. RELACIONES CON LA UEX
En 1998, D. Manuel Álvarez Rangel (socio fundador de Heral Enología, S. L.) y el grupo de investigación del
Prof. Manuel Ramírez Fernández comienzan un contacto que
se iría haciendo más estrecho a medida que pasaba el
tiempo basado en el estudio y el desarrollo tecnológico de la
colección de levaduras que éste grupo había aislado y caracterizado poco antes.
Los primeros pasos consistieron en la utilización a
escala semiindustrial de levaduras autóctonas (cepa EX88,
patente nº 9500624; y levaduras marcadas genéticamente,
patente nº 9700605) en mostos extremadamente limpios y
muy pobres en nutrientes, en los cuales otras levaduras comerciales no eran capaces de desarrollar fermentaciones satisfactorias, pues daban como resultado vino con muchos
azúcares reductores y alta acidez volátil, o bien había que renunciar a los aromas. Estas pruebas dieron resultados bastante satisfactorios, tanto en parámetros analíticos como en
desarrollo de aromas. De esta forma, debido a las facilidades dadas por la bodega y a la buena predisposición de la
151
ISBN 978-84-690-6060-5
UEX, se comenzó a emplear levadura líquida seleccionada
por primera vez en Extremadura a escala industrial.
Posteriormente, en 1999, fruto de la indudable simbiosis entre los dos protagonistas de esta historia, D. Manuel Álvarez pasó a formar parte del grupo de
investigadores del equipo que dirigía el Prof. Manuel Ramírez. La función de D. Manuel Álvarez consistía en la producción de distintas cepas de levadura líquida, desarrollo
de distintas vinificaciones tanto en blanco como en tinto con
diferentes variedades, el estudio del nivel de imposición de
las distintas cepas en las diferentes vinificación frente a levaduras silvestres mediante el uso medios de cultivos selectivos (las levaduras son resistentes a ciertos antibióticos)
y el análisis del ADN mitocondrial, así como estudiar la calidad de los vinos resultantes y su evolución.
En 2001, D. Manuel Álvarez cambia la empresa pública por la privada y asume la dirección técnica de Bodegas
Lar de Barros, donde comienza la elaboración, crianza y embotellados de vinos jóvenes, crianzas y reservas así como la
elaboración de cavas, familiarizándose con el uso y empleo
de gran diversidad de levaduras secas comerciales.
En 2002, nace Heral Enología, S. L. como fruto del
afán emprendedor de los hermanos Pedro y Manuel Álvarez
Rangel, cuyos objetivos ya explicamos anteriormente.
En 2004, comienza la colaboración (nunca se había
roto el contacto) entre la UEX y Heral Enología, S. L. con la
firma de dos convenios de cesión de patentes y dos convenios de transferencia de tecnología, según los cuales la empresa puede utilizar las instalaciones de la UEX para producir
la levaduras diseñadas por el grupo de investigación. El coste
de la regalía que Heral Enología, S. L. realiza a la UEX es
del 5% de la facturación en concepto de levadura.
Hasta la fecha, la producción de levadura ha ido
creciendo año a año obteniéndose excelentes resultados
tanto en fermentaciones de calidad como en fermentaciones
difíciles. En concreto, las producciones de los años 2004,
2005 y 2006 han sido de 500, 1.500 y 2.500 litros de concentrado respectivamente de levadura concentrada con una
población de 4-8·109-10 ufc/ml aproximadamente.
Fig. 1. Grafica de evolución de la población de
levaduras en el fermentador.
152
3. PROCESO PRODUCTIVO
El proceso productivo consta de tres fases bien diferenciadas:
3.1. fase de laboratorio/planta piloto
En esta fase, se obtienen inóculos puros de alto
vigor y alta concentración de levaduras para pasar a la fase
de propagación industrial.
3.2. Fase industrial
Se lleva a cabo en planta con fermentadores de tamaño variable, en ambiente aerobio mediante el burbujeo de
aire estéril en el seno del depósito y empleando un mosto nutritivo como medio de cultivo.
3.3. Fase de concentración
Una vez se llega a fase estacionaria en la reproducción de levaduras, se trasvasa a depósitos de decantación que se conservan a 3-4 ºC hasta que la levadura
sedimenta, después se elimina el sobrenadante y la levadura
queda lista para su comercialización.
Fig. 2. Esquema del proceso productivo de
la elaboración de levaduras.
4. CARACTERÍSTICAS DE LA LEVADURA
LÍQUIDA COMERCIAL
Actualmente, Heral Enología, S. L. tiene firmados
convenios con la UEX para la cesión de patentes de cuatro
cepas levaduras por una duración indefinida, sin exclusividad. Todas estas levaduras se caracterizan por:
1. Baja producción de acidez volátil.
2. Buen agotamiento de azúcares.
3. Bajos requerimientos nutricionales.
4. Gran resistencia al alcohol.
5. Resistencia a alta temperaturas.
6. Buena producción de aromas fermentativos.
7. Poca adsorción de antocianos.
8. Alto rendimiento alcohólico.
9. Cinética de fermentación elevada.
10. Fenotipo asesino
11. Resistencia a SO2.
ISBN 978-84-690-6060-5
Además, a estas características tecnológicas inherentes a la levadura, hay que sumar otras ventajas tecnológicas debido al formato en que se comercializan, es decir,
concentrado líquido de levadura activa:
1. Facilidad de manejo.
2. No necesita activación ni rehidratación.
3. Ahorro en tiempo y mano de obra.
4. No se necesita instalación de agua caliente ni
otra infraestructura.
5. Elevada viabilidad.
6. Gran vigor (corto periodo de latencia).
7. Bajo precio (50% sobre las cepas comerciales
más comunes).
8. Posibilidad de conservar durante mucho tiempo
si fuera necesario (congelación).
Las principales ventajas competitivas frente a levaduras secas activas son el precio, la facilidad de uso y el ahorro de tiempo que supone la adición directa. Además, la
levadura se comercializa con el asesoramiento técnico de
Heral Enología, S. L. (Supervisión de los procesos, observación microscópica, analítica de mostos difíciles, etc) necesario para la bodega, lo que representa la mayor ventaja
competitiva frente a otras empresas del sector que tienen un
contacto mucho menos estrecho con los clientes.
5. LÍNEAS FUTURAS DE DESARROLLO
En un futuro, Heral Enología, S. L. pretende desarrollar una nueva línea de producción de levaduras “a medida” que consistirá en poner a disposición de cada bodega
una colección particular de levaduras aisladas en los viñedos
de la bodega y de uso exclusivo para ésta. De este modo, se
pretende potenciar el concepto de “terroir” desde el punto de
vista microbiológico para conferir unas características exclusivas a los vinos, es decir, para que la variable microbiológica dentro de la elaboración de los vinos se exprese con las
características propias de la zona geográfica donde se producen los vinos de una determinada bodega, potenciando los
conceptos de exclusividad y diferenciación.
Con respecto a la aplicación de concentrado de levadura para la elaboración de vinos espumosos, Heral Enología, S. L. está colaborando con la UEx y la Estación
Enológica de Almendralejo para seleccionar algunas levaduras interesantes para este tipo de fermentaciones, así como
realizar mejora genética de las cepas seccionadas para facilitar la lisis celular de las levaduras una vez terminada la fermentación.
Por otra parte, Heral Enología, S. L. comenzará en
breve a desarrollar a nivel de laboratorio la producción de
otros microorganismos de interés enológico como bacterias
para la fermentación malolácticas (Oenococus oeni), y otros
microorganismos de interés industrial.
Por último, otra línea de actividad que se está estudiando es el asesoramiento para el establecimiento de pequeñas fábricas de levadura en las distintas zonas vinícolas
de España mediante un sistema de asesoría muy parecido
al de las “franquicias”. Con esto se lograría llegar a un gran
número de clientes con un contacto muy estrecho que facilita
la posibilidad de asesoramiento y monitorización exhaustiva
en el empleo de las levaduras en todo momento.
153
ISBN 978-84-690-6060-5
LA MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA: UNA HERRAMIENTA INNOVADORA PARA
EL CONTROL MICROBIOLÓGICO RÁPIDO EN BODEGA
Sergi Ferrer, Isabel Pardo
Resumen:
ENOLAB - Laboratori de Microbiologia Enològica. Departament de Microbiologia i Ecologia.
Facultat de Biologia, Universitat de València. E46100 Burjassot-València. 963544390. [email protected]
El control microbiológico en bodega necesita de sistemas cada vez más rápidos y fiables para dar respuesta a las
necesidades de la producción de vinos. Los sistemas de microscopía de fluorescencia han evolucionado mucho en la últimos
años, permitiendo así avances importantes como identificar en muy poco tiempo microorganismos deseables y alterantes,
estimar la efectividad de la inoculación con cepas comerciales, posibilitar el control de fraudes y protección de cepas patentadas,
limitación de las cantidades de sulfuroso a añadir en la vinificación al ejercer un mejor seguimiento y control de las poblaciones
microbianas, etc. El equipamiento necesario es mínimo, y el entrenamiento del personal es sencillo y rápido, siendo técnicas
que pueden ser empleadas fácilmente por bodegas, empresas de servicios y centros de la administración.
Palabras clave: Microscopía de fluorescencia (FISH), viabilidad, control microbiológico, embotellado, APPCC.
1. DESCRIPCIÓN DE LAS TECNOLOGÍAS
154
La microscopía de fluorescencia aplicada al terreno
de la enología presenta distintas aplicaciones, que tienen en
común el empleo del microscopio mediante fluorescencia
como paso final para la visualización de las muestras. Es una
técnica que se emplea desde hace bastantes años, pero que
en los últimos tiempos ha adquirido una nueva dimensión al
permitir contar e identificar células individuales, así como estimar su estado metabólico directamente en el vino y en poco
tiempo.
Como equipamiento, es necesario disponer de un
microscopio de fluorescencia, más algún equipamiento auxiliar de bajo coste según la técnica concreta que se pretenda
aplicar, como una centrífuga de sobremesa. Para la técnica
de FISH es preciso contar además con un sistema de filtración y algún baño termostático.
Dos de las técnicas de microscopía de fluorescencia de mayor repercusión actualmente en la enología son técnica de FISH (Fluorescence In Situ Hybridisation), que
permite la identificación a distintos niveles taxonómicos, y la
estimación del estado fisiológico y de viabilidad de las células mediante “kits”. En este último caso, se estima la integridad de las células mediante permeabilidad selectiva a
distintos fluorocromos, o la capacidad de los microorganismos de realizar determinadas reacciones acopladas a sustancias que cambian su estado de fluorescencia.
La técnica de FISH se utiliza para la identificación
de microorganismos mediante el empleo de sondas específicas, y resulta de gran utilidad en enología [1]. El mosto o
vino a analizar puede filtrarse directamente sin ningún tratamiento previo, ajustando el volumen filtrado a la concentración de microorganismos presentas en la muestra. Tras una
fijación y permeabilización de las células, se hibrida la muestra con la sonda o la serie de sondas específicas que se
desee. La hibridación se basa en la unión específica de cada
sonda fluorescente con las secuencias ribosomales presen-
tes en cada célula. Al existir numerosas copias de estas moléculas, el nivel de la señal es suficientemente elevado como
para poder observarlo con un microscopio de fluorescencia.
También pueden emplearse sondas generales que nos permitirá detectar y contar todas las levaduras y bacterias presentes. Tras un lavado y secado, se procede a la
visualización en el microscopio de fluorescencia. Al conocer
el volumen de muestra del que se parte y el número de células que se cuenta al microscopio, el resultado es cuantitativo
y totalmente exacto. Como podemos emplear distintas sondas específicas para la misma muestra, podemos identificar
y contar al mismo tiempo varios microorganismos contra los
que hayamos empleado esas sondas, según la especificidad
de cada una: por ejemplo, una sonda general nos contará
tobas las bacterias presentes, una sonda del género Leuconostoc nos identificará las perteneciente a ese grupo, y una
sonda específica de Oenococcus oeni nos dará el recuento y
la identidad de las pertenecientes a esa especie. El proceso
completo puede durar unas pocas horas: en la mayoría de
ocasiones, en menos de 3 horas partimos de la muestra y llegamos hasta el recuento e identificación completa.
En el caso de la estimación de la viabilidad de las
células, aún se requiere menos equipo, preparación y coste.
Bien con componentes preparados por el propio técnico, o
bien mediante el empleo de distintos “kits” disponibles en el
mercado, rápidamente podemos determinar el estado fisiológico de bacterias y levaduras del mosto o del vino, y por lo
tanto de la viabilidad de dichas células. Tan sólo es necesario normalmente un lavado de las células (en ocasiones ni
tan siquiera es necesario) y una tinción con los componentes
que nos determinarán la viabilidad de las células de una
forma individual. En unos pocos minutos, tendremos una respuesta también cuantitativa en este caso, ya que lo que se
comprueba es la integridad de la membrana celular, o la capacidad de las células de realizar determinadas reacciones
acopladas a sustancias que cambian su estado de fluorescencia.
ISBN 978-84-690-6060-5
2. CAMPOS DE APLICACIÓN
En la bodega, o en una empresa de servicios o un
laboratorio de la administración, la microscopía de fluorescencia se puede aplicar a casos muy distintos, como los siguientes:
- seguimiento de cepas inoculadas como cultivos
iniciadores
- seguimiento de las poblaciones microbianas en los pies
de cuba y en las resiembras sucesivas
- control de fraudes y protección de cepas patentadas
- detección precoz de microorganismos contaminantes no
deseables o perjudiciales
- detección precoz del momento de inicio de las
fermentaciones alcohólica y maloláctica
- estimación de la probabilidad de paradas de fermentación
alcohólica o maloláctica
- estudio de la dinámica de especies naturales en vinos y
mostos
- estudio de la biodiversidad asociada a los procesos de
obtención de vinos
- efecto de las prácticas enológicas sobre la evolución de
las poblaciones microbianas
- control microbiológico rápido, útil para APPCC, en distintos
puntos de bodega y momentos de la vinificación
- ……..
Todo ello, se puede traducir en una serie de beneficios indiscutibles para mejorar la calidad y seguridad de los
vinos, por ejemplo:
- conocer la efectividad de diversos tratamientos realizados
al vino, como la adición de sulfuroso, centrifugación,
centrifugación, clarificación, lisozima, etc.
- conocer la verdadera evolución de las poblaciones de las
diversas cepas de levaduras y bacterias en el vino, tanto
de las autóctonas como de las inoculadas
- conocer qué cepas de microorganismos se desarrollan
mejor
- obtener cepas microbianas autóctonas que puedan ser
usadas como iniciadores de fermentación alcohólica o
maloláctica
- detectar rápidamente la presencia de microorganismos
alterantes (levaduras, bacterias lácticas y bacterias
acéticas) en el proceso de vinificación y poder corregir a
tiempo los parámetros de vinificación
- poder limitar las cantidades de sulfuroso a añadir en la
vinificación, al ejercer un mejor seguimiento y control de
las poblaciones microbianas
- disponer de técnicas de recuento de totales y viables, y de
identificación de especie o de cepa de los diversos grupos
de microorganismos que rindan resultados precisos en
pocas horas (control de expedición de vinos, aduanas,
etc.)
- ……..
3. TRANSFERENCIA DE LA TECNOLOGÍA
Esta tecnología se halla disponible ya para una
transferencia efectiva al sector, incluso con las nuevas incorporaciones de identificación de microorganismos y determinación de la viabilidad de células. De hecho, hay algunas
bodegas que ya la han adoptado en sus trabajos rutinarios.
Hay que señalar que una dotación de un microscopio no es
demasiado costosa, y tienen múltiples aplicaciones para una
bodega, una empresa de servicios, o un laboratorio de la administración; el gasto en consumibles tampoco es elevado.
Controlar la eficacia de un tratamiento es importante en bodega, por ejemplo para la filtración previa al embotellado, o el
éxito de una inoculación. Nos hemos encontrado también en
el caso de detectar un crecimiento potencialmente peligroso
de bacterias acéticas en vinos donde todavía no se había
producido una alteración detectable por incremento de la acidez volátil, lo que llegó a la adopción de las correcciones necesarias antes de producirse la alteración.
Una ventaja importante de estas técnicas es que el
entrenamiento del personal es sencillo y rápido. En poco
tiempo se puede entrenar al personal, sin ser necesaria una
alta cualificación del mismo, para que aprendan a usar las
técnicas a nivel de usuario y sean capaces de realizar en
poco tiempo muchos análisis microbiológicos rutinarios con
estas metodologías.
Hay que indicar además que la rapidez en la obtención de resultados permite la adopción de decisiones y/o
medidas correctoras en muy poco tiempo, lo cual es muy conveniente en determinados momentos de la producción o comercialización de los vinos. Finalmente, un aspecto que hace
estas técnicas muy atractivas frente a otras técnicas moleculares es que tienen una elevada componente visual, y ello
las hace más asequibles y asimilables por parte de muchas
personas: las células se identifican de forma individual al microscopio y se “ven” literalmente. No se trata de una serie de
bandas en un gel de más fácil o difícil interpretación, sino que
el usuario “identifica” esas formas y colores con la identidad
o el estado fisiológico del microorganismo en la muestra.
4. BIBLIOGRAFÍA
1. BLASCO, L.; FERRER, S.; PARDO, I. 2003. Development of specific fluorescent oligonucleotide probes
for in situ identification of wine lactic acid bacteria.
FEMS Microbiology Letters 225: 115-123.
155
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Análisis y Control de Calidad
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ISBN 978-84-690-6060-5
IDENTIFICACIÓN DE DOS NUEVOS FLAVONOLES MAYORITARIOS EN UVAS TINTAS:
3-GLUCÓSIDOS DE LARICITRINA Y SIRINGETINA
Isidro Hermosín Gutiérrez1, Noelia Castillo Muñoz1, Sergio Gómez Alonso2, Esteban García Romero2
1
2
Escuela Universitaria de Ingeniería Técnica Agrícola, Universidad de Castilla-La Mancha, Ronda de Calatrava, 7,
13071 Ciudad Real, Teléfono: 926 295253; e-mail: [email protected].
Instituto de la Vid y el Vino de Castilla-La Mancha (IVICAM), Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha, Carretera Albacete s/n, 13700 Tomelloso.
Resumen:
Mediante HPLC-DAD-ESI-MS/MS se ha confirmado que los flavonoles mayoritarios (>5%) en las uvas de siete variedades tintas comunes (Tempranillo, Garnacha, Garnacha Tintorera, Cabernet Sauvignon, Merlot, Syrah y Petit Verdot) son
los conocidos: 3-glucósidos de kampferol (1xOH), quercetina (2xOH), isoramnetina (1xOH y 1xOCH3) y miricetina (3xOH), y 3glucurónidos de quercetina y miricetina. Adicionalmente, se identificaron dos nuevos flavonoles glicósidos mayoritarios (5-10%)
poco conocidos: los 3-glucósidos de laricitrina (2xOH y 1xOCH3) y siringetina (1xOH y 2xOCH3). El Análisis de Componentes
Principales aplicado a los perfiles característicos de los ocho flavonoles mayoritarios anteriores, permitió una satisfactoria diferenciación varietal para los perfiles de flavonoles de las siete variedades de uva consideradas.
Palabras clave: uva tinta; flavonoles; laricitrina; siringetina; diferenciación varietal.
1. INTRODUCCIÓN
Los flavonoles son unos compuestos fenólicos presentes en los hollejos de las uvas en forma glicosilada, que
ofrecen protección frente a la radiación UV [1]. Destacan por
ser unos excelentes copigmentos, estabilizando el color del
vino tinto y fomentando la extracción de antocianos durante
la vinificación [2], y por poseer una alta capacidad antioxidante [3]. Además, los flavonoles podrían usarse en la caracterización varietal de uvas, de forma análoga a los
antocianos en uvas tintas [4], pero con la ventaja añadida de
que los flavonoles se encuentran tanto en uvas tintas como
blancas. Hasta la fecha no ha existido un criterio generalizado para saber cuáles son los flavonoles mayoritarios, debido a la escasez de identificaciones debidamente
fundamentadas de éstos, aunque se admite que en uvas tintas se encuentran flavonoles derivados de las agliconas
kaempferol (1xOH), quercetina (2xOH), isoramnetina (1xOH,
1xOCH3) y miricetina (3xOH). Entre los posibles glicósidos,
se admite generalmente la presencia de los 3-glucósidos de
todas las agliconas anteriores, junto con los 3-glucurónidos
de quercetina, miricetina y quizás kaempferol. Otros posibles
glicósidos descritos incluyen 3-galactósidos y diversos 3-diglicósidos [5].
Mediante extracción selectiva en fase sólida de los
flavonoles del hollejo y por análisis HPLC-DAD-ESI-MS/MS,
ha sido posible separar e identificar de forma inequívoca los
flavonoles glicósidos mayoritarios (porcentajes molares >5%)
en las uvas tintas de 7 variedades ampliamente extendidas
(Tempranillo, Garnacha, Garnacha Tintorera, Cabernet Sauvignon, Merlot, Syrah y Petit Verdot) y establecer sus perfiles
varietales característicos de flavonoles.
Las uvas analizadas estaban en su momento óptimo de madurez para su vinificación, y fueron muestreadas
en el momento de la vendimia. Tras separar los hollejos,
éstos fueron extraídos con la mezcla MeOH:H2O: HCOOH
(50:48.5:1.5), y los flavonoles fueron aislados por extracción
en fase sólida sobre cartuchos Oasis MCX, tras lo cual fueron analizados por HPLC-DAD-ESI-MS/MS [6]. Los resultados fueron tratados estadísticamente para el Análisis de
Componentes Principales (SPSS, versión 11.0) en busca de
la posible agrupación de las muestras por variedades.
3. RESULTADOS
El uso combinado de los datos generados por el
detector de masas ESI-MS/MS (modo positivo de ionización)
y la comparación con patrones, comerciales o aislados previamente, para la mayoría de los flavonoles separados (Fig.
1), permitió identificar los siguientes flavonoles glicósidos
mayoritarios (porcentajes molares >5%): los 3-glucósidos de
miricetina, quercetina, kaempferol, isoramnetina y siringetina,
y el 3-glucurónido de quercetina. El 3-glucósido de siringetina
coincidió con un patrón comercial y su identificación como flavonol mayoritario en todas las muestras de uvas analizadas
constituye una novedad, si bien su presencia había sido previamente detectada en una muestra de uva Cabernet Sauvignon [7] y en muchas otras variedades de uva tinta pero como
flavonol minoritario [8]. Otros dos flavonoles mayoritarios fueron detectados en todas las muestras de uva, y su identificación se basó en las características de sus espectros de absorción UV-Vis y de masas (Fig. 2). Uno de estos flavonoles fue el
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3-glucurónido de miricetina, previamente descrito en uvas y
vinos tintos [5], y el otro flavonol fue el 3-glucósido de laricitrina. La presencia de este último había sido descrita previamente en orujos de uva Nerello Mascalese [9] y en bastantes
variedades de uvas tintas pero como flavonol minoritario [8].
Al aplicar el Análisis de Componentes Principales a
la matriz de datos constituida por las muestras de uvas ana-
lizadas y los porcentajes molares de los ocho flavonoles mayoritarios considerados, se obtuvo una satisfactoria separación de las muestras cuando se marcaron en función de la
variedad a la que pertenecían (Fig. 3). Únicamente las muestras de uvas de la variedad Syrah mostraron un solapamiento
que les impidió agruparse de forma diferenciada del resto de
variedades.
Fig. 1. Estructura de los ocho flavonoles glicósidos mayoritarios encontrados en uvas de variedades tintas.
Fig. 2. Espectros UV-Vis del 3-glucurónido de miricetina y del 3-glucósido de laricitrina, y espectros de masas (MS y MS2)
correspondientes al 3-glucósido de laricitrina.
160
Fig. 3. Representación de las muestras de uvas tintas en el espacio formado por los tres primeros Componentes Principales obtenidos en el
Análisis de Componente Principales de los perfiles de flavonoles glicósidos. CS, Cabernet Sauvignon; G, Garnacha; GT, Garnacha Tintorera;
M, Merlot; PV, Petit Verdot; S, Syrah. Se indican las variables más correlacionadas con cada uno de los Componentes Principales
(loadings entre paréntesis).
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4. CONCLUSIONES
Con la identificación de los 3-glucósidos de laricitrina y siringetina, se completa la serie de posibles flavonoles
que se podían esperar para las uvas tintas de Vitis vinifera:
flavonoles monohidroxilados (kaempferol), dihidroxilados
(quercetina y su único producto de metoxilación, isoramnetina) y trisustituidos (miricetina y sus productos de monometoxilación y dimetoxilación, laricitrina y siringetina,
respectivamente). Esta serie es similar a la conocida para los
antocianos, salvo que en las uvas tintas de Vitis vinifera no se
halla el antociano monohidroxilado, pelargonidina, aunque sí
se encuentra en otras especies vegetales.
Los dos nuevos flavonoles se encuentran en proporciones importantes (5-10%) en las uvas tintas de las variedades analizadas. Se propone que la caracterización de
variedades de uvas tintas por medio de sus perfiles característicos de flavonoles se puede llevar a cabo considerando
las proporciones molares de los siguientes ocho flavonoles
mayoritarios: los 3-glucósidos de kaempferol, quercetina, isoramnetina, miricetina, laricitrina y siringetina, junto con los 3glucurónidos de quercetina y miricetina.
5. BIBLIOGRAFÍA
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2. SCHWARZ, M.; PICAZO-BACETE, J.J.; WINTERHALTER, P.; HERMOSÍN-GUTIÉRREZ, I. 2005. Effect of copigments and grape cultivar on the color of red wines
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3. DE BEER, D.; JOUBERT, E.; GELDERBLOM, W.C.A.;
MANLEY, M. 2005. Antioxidant activity of South African red and white cultivar wines and selected phenolic compounds: in vitro inhibition of microsomal
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4. HERMOSÍN GUTIÉRREZ, I.; GÓMEZ ROMERO, E.
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La Mancha: perfiles varietales característicos de la
uva y de los vinos monovarietales, y evolución durante la maduración de la baya. Alimentaria 41, 127139.
5. MAKRIS, D.P.; KALLITHRAKA, S.; KEFALAS, P. 2006.
Flavonols in grapes, grape products and wines: burden, profile and influential parameters. J. Food Comp.
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6. CASTILLO-MUÑOZ, N.; GÓMEZ-ALONSO, S.; GARCÍAROMERO, E.; HERMOSÍN-GUTIÉRREZ, I. 2007. Flavonol profiles of Vitis vinifera red grapes and their
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8. MATTIVI, F.; GUZZON, R.; VHROVSEK, U.; STEFANINI,
M.; VELASCO, R. 2006. Metabolite profiling of grape:
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9. AMICO, V.; NAPOLI, E.M.; RENDA, A.; RUBERTO, G.;
SPATAFORA, S.; TRINGALI, C. 2004. Constituent of
grape pomace from the Sicilian cultivar Nerello Mascalese. Food Chem. 88, 599-607.
6. AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al Instituto de la Vid y el Vino
de Castilla-La Mancha por la financiación recibida para la realización de este trabajo (Proyecto PREG-05-024).
161
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CARACTERIZACIÓN DEL AROMA DE VINOS TINTOS ENVEJECIDOS. IMPLICACIÓN
DE LAS DIFERENTES FAMILIAS DE ODORANTES EN LA PERCEPCIÓN DE LA NOTA
FRUTAL Y OTRAS
Ana Escudero, Eva Campo, Juan Cacho, Vicente Ferreira
Laboratorio de Análisis del Aroma y Enología. Departamento de Química Analítica. Facultad de Ciencias. Universidad de Zaragoza.
Tlfno: 976 76 25 03. [email protected]
Resumen:
Se ha estudiado el perfil aromático de 5 vinos tintos envejecidos. Se ha realizado análisis sensorial descriptivo, análisis químico cuantitativo y análisis olfatométrico utilizando un extracto de espacio de cabeza dinámico. Las diferencias encontradas mediante el estudio químico y olfatométrico han sido corroboradas mediante análisis sensorial. Del estudio olfatométrico,
destacar que ninguna de las 45 sensaciones más importantes eran producidas por un compuesto desconocido. Estudios de correlación y de adición nos han posibilitado conocer el papel de diferentes compuestos o familias de compuestos en la percepción de varias notas del aroma. La nota vegetal de este tipo de vinos ha sido explicada por la isobutil-2-metoxipirazina y en menor
medida por el hexanol y el c-3-hexenol. La t-wiskilactona es la responsable de la nota a madera. El guaiacol es responsable de
la nota a tostado en estos vinos. La nota caramelo-dulce ha sido explicada por la suma de 5 compuestos con características
florales y dulces. El carácter fenólico se debe a la presencia de 12 fenoles volátiles. Y por último, la nota fruta de baya de los
vinos tintos está relacionada con el efecto aditivo de 9 ésteres. El etanol ejerce un efecto se supresión del carácter frutal, mientras que compuestos norisoprenoides y el sulfuro de dimetilo lo ensalzan.
Palabras clave: interacción, potenciación y supresión de aromas, vino tinto.
1. INTRODUCCIÓN
Recientemente se han publicado trabajos para elucidar los responsables de las notas de los vinos tintos envejecidos [1, 2], comenzando mediante olfatometría de
extractos totales. Pero hemos comprobado [3] que utilizando
un sistema de espacio de cabeza dinámico con SPE se obtienen mejores resultados en cuanto a la jerarquización de
componentes aromáticos.
Por otro lado, la comprobación mediante análisis
sensorial de los compuestos responsables de diferentes
notas, mediante ensayos de adición o mezclas sintéticas es
algo imprescindible. Ya ha sido trabajada la interacción entre
la nota frutal y madera [4], y también el poder potenciador de
compuestos azufrados sobre la nota frutal [5]. En este estudio que presentamos se pretende explicar el papel jugado por
las diferentes familias de compuestos en las diferentes notas
de los vinos tintos, y en concreto, la frutal.
Vinos: Abadía de Retuerta Special Selection 1998,
Torres Grans Muralles 1998, Cims de Porrera Classic 1999,
Tannat Amat 2000 y Tannat Bouza 2004.
Análisis sensorial descriptivo y tests triangulares [3].
HS-SPE-GCO [3]. Análisis químico cuantitativo [6, 7, 8, 9].
3. RESULTADOS
162
El análisis sensorial descriptivo generó las notas alcohólico, reducción, dulce, fenólico, fruta pasa, frutal, vegetal, madera y tostado.
El análisis GCO proporcionó la Tabla 1, con las pistas de los principales responsables de las notas localizadas
anteriormente.
Tras encontrar correlaciones entre datos (olfatométricos y cuantitativos) de algún compuesto o suma de compuestos e intensidades de notas sensoriales se procedió a
su comprobación sensorial.
La adición sobre vino desaromatizado de guaiacol
proporcionó la nota a tostado y la adición de wiskilactona
aportó una nota a madera. También se probó con la suma de
los compuestos señalados como S en la Tabla 1, generándose una nota dulce; al igual que los compuestos señalados
como P y la nota fenólico; o como V y la nota vegetal.
Una experimentación más tediosa requirió la explicación de la nota frutal, ya que adiciones sobre vino desaromatizado de los compuestos señalados como F no generó
nota frutal. En busca del por qué obtuvimos que el etanol
ejerce un efecto de supresión de esta nota y que se necesitan norisoprenoides como la β-damascenona o la β-ionona
para potenciarla; al igual que concentraciones de 10 ppb de
DMS. Sólo así conseguimos aportar notas frutales a un vino
desaromatizado.
4. CONCLUSIONES
Lo más relevante de este trabajo es la elucidación
de diferentes notas sensoriales de vinos tintos envejecidos.
La nota vegetal es aportada por IBMP, hexanol y c-3-hexenol.
Para la nota dulce es suficiente con cinamato e hidrocinamato
de etilo, linalol, acetato de fenil etilo y fenilacetaldehido. Y
para la nota frutal no basta con una suma de diferentes acetatos, ésteres e isoésteres etílicos. Hay que entender el juego
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Tabla 1. Odorantes encontrados mediante GCO en los 5 vinos estudiados. Se presentan los datos de retención en dos columnas, el grupo de
compuestos al que pertenecen (F, frutal; V, vegetal; P, fenólico y S, dulce), la descripción aromática, la identificación química, los porcentajes
de frecuencia (%FM) y las diferencias entre los valores de %FM máximo y mínimo de los 5 vinos
163
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entre el etanol (supresor), norisoprenoides (potenciadotes) y
DMS (potenciador) con los diferentes ésteres.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. CULLERE, L.; ESCUDERO, A.; CACHO, J.; FERREIRA,
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2. FERREIRA, V.; AZNAR, M.; LOPEZ, R.; CACHO, J.
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8. CAMPO, E.; CACHO, J.; FERREIRA, V. 2006. Solid
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novel aroma powerful ethyl esters. Assessment of
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9. LÓPEZ, R.; LA PEÑA, A.C.; CACHO, J.; FERREIRA, V.
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6. AGRADECIMIENTOS
AGL2004-06060. Eva Campo disfrutó una beca del
programa FPI español.
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DETERMINACIÓN DE TRANS-RESVERATROL EN VINO MEDIANTE MICRO-HPLC CON
DETECCIÓN FLUORESCENTE
Ricardo López1, Paola Dugo2, Luigi Mondello2 , Vicente Ferreira1
1
Laboratorio de Análisis del Aroma y Enología. Dpto. Química Analítica. Universidad de Zaragoza. 50009 Zaragoza. Tf.976761290 [email protected]
2
Resumen:
Dipartimento Fármaco-chimico, Facoltà di Farmacia, Università di Messina, viale Annunziata, 98168 Messina, Italia
Un nuevo método para la determinación cuantitativa de trans-resveratrol ha sido optimizado y validado. El método se
basa en la inyección directa de 500 nL de vino en un sistema HPLC equipado con una micro-columna de fase reversa de 100
mm x 0.32 mm y detección espectrofluorimétrica. El intervalo de respuesta lineal del método cubre el intervalo normal de concentraciones del analito en el vino y se extiende por dos órdenes de magnitud con r2=0.9994. Un total de 23 vinos han sido analizados con el método propuesto obteniendo valores de concentración dentro del intervalo publicado por otros autores.
Palabras clave: trans-resveratrol, vino, micro-HPLC
1. INTRODUCCIÓN
Las propiedades del trans-resveratrol relacionadas con la salud han conducido al desarrollo de una amplia
variedad de métodos analíticos para su análisis en vinos.
Los métodos publicados comprenden GC-MS [1] , GC-FID
[2] y electroforesis capilar con diversos tipos de detección
[3], pero la mayor parte de los métodos se basan en la
RP-HPLC. La detección con está técnica de separación
engloba la absorción UV [4], métodos electroquímicos,
espectrometría de masas [5] y detección espectrofluorimétrica [6-8].
En los últimos años, el interés en la cromatografía líquida realizada con microcolumnas (micro-LC) ha aumentado
considerablemente. Esto se debe principalmente a su habilidad para trabajar con pequeñas cantidades de muestra, pequeños flujos volumétricos, y su mejor capacidad de
detección debida a la reducción de la dilución cromatográfica. Además, los pequeños flujos utilizados en micro-LC permiten el acoplamiento directo con los detectores de
espectrometría de masas, y facilitan el acoplamiento con los
sistemas de LC multidimensional. El objetivo del presente trabajo es el desarrollo y validación de un método basado en la
micro-LC para la determinación cuantitativa de trans-resveratrol en el intervalo de concentraciones encontradas habitualmente en el vino.
2.1. Reactivos y disoluciones
Se preparó una disolución stock (1000 mg/L) de
trans-resveratrol en metanol y se almacenó a -20ºC. Las disoluciones diluidas para identificar el trans-resveratrol y para
preparar la curvas de calibrado se prepararon justo antes del
correspondiente análisis. Todas las disoluciones fueron protegidas constantemente de la luz.
2.2. Instrumentación
Los análisis HPLC se realizaron en un sistema
HPLC de Shimadzu con un detector espectrofluorométrico
RF-10AXL equipado con una celda de microflujo. Para reducir el flujo se empleó un divisor de flujo Accurate (LC Packings) entre la bomba y el inyector. La columna usada fue
una Discovery Biopeptide C18 de 10 cm x 0.32 mm y 3 µm de
diámetro de partícula (Supelco). La inyección manual se realizó con un micro-inyector Rheodyne 7520. Los parámetros
de detección fueron 300 nm para la longitud de onda de excitación y 381 nm para la longitud de onda de emisión.
2.3. Condiciones cromatográficas
La elución se llevo a cabo usando un gradiente binario en alta presión con un flujo de 4 µL/min. El disolvente
A fue agua/ácido acético 95:5 (v/v); el disolvente B fue acetonitrilo. Se empleó el siguiente gradiente: 10% B mantenido
durante 1 min, de 10 a 12% de B en 25 min, de 12 a 15% de
B en 5 min, de 15 a 100% de B en 7 min, y 100% B durante
10 min. Las alícuotas de 500 nL de las disoluciones patrón o
de los vinos se inyectaron directamente.
2.4. Muestras de vino
Un conjunto de vinos italianos comerciales producidos durante los años 2001, 2002 y 2003 fue analizado según
el método propuesto. De ellos, 15 eran vinos tintos, 7 blancos
y uno rosado. Las muestras de vino se filtraron a través de
una membrana de 0.45 µm y se inyectaron directamente en
el sistema cromatográfico.
165
ISBN 978-84-690-6060-5
3.1. Optimización del método
Para encontrar las longitudes de onda óptimas de
excitación y emisión se registraron diversos espectros de excitación y emisión de trans-resveratrol en el modo de barrido
del detector espectro fluorimétrico. Las longitudes de onda
óptimas se encontraron a 300 nm para la excitación y 381 nm
para la emisión. Estos datos concuerdan con los encontrados en la literatura [6].
De acuerdo con la bibliografía, el flujo lineal a través
de una columna empaquetada es independiente de su diámetro interno, y por tanto, los métodos desarrollados en columnas convencionales deberían ser directamente
transferibles a microcolumnas [9]. Sin embargo, los gradientes ya publicados no dieron una buena separación de los
picos cromatográficos en nuestro sistema. Una explicación
podría ser que los sistemas convencionales y micro no son
directamente comparables por una serie de diferentes pará-
metros tales como gradientes en alta o baja presión, volúmenes extra-columna y el tipo de empaquetamiento del relleno C18. Por tanto, se desarrolló un nuevo gradiente (ver
epígrafe 2.3) con el que fue posible alcanzar suficiente resolución en el pico de trans-resveratrol en menos de 30 min (figura 1). Esto puede considerarse razonable teniendo en
cuenta la complejidad de la muestra y el hecho de que no se
realizó ningún tipo de prefraccionamiento.
Un problema común en micro-LC es la disminución
en la sensibilidad de la detección debido a que los volúmenes
que se pueden inyectar son muy pequeños. Se calcula que el
máximo volumen de inyección para una microcolummna de
10 cm x 0.32 mm y 3 µm dp es de aproximadamente 30 nL [9].
Sin embargo, usando un pequeño porcentaje de disolvente
orgánico al principio del cromatograma es posible en algunos
casos conseguir un focalización on-column. Aplicando esta
técnica de inyección el volumen inyectado en el presente método se incrementó hasta 500 nL sin distorsiones en la forma
de los picos y con la correspondiente mejora en la sensibilidad del método.
Fig. 1. Cromatograma micro-HPLC de un vino tinto obtenido con el método propuesto
3.2. Calibración, reproducibilidad y recuperación
166
La calibración se realizó inyectando en cuadruplicado 9 disoluciones patrón de trans-resveratrol, y relacionando el área media de pico frente a la concentración de
trans-resveratrol. El intervalo de concentraciones en el que
la respuesta era lineal (r2=0,9994) se determinó desde 20
hasta 2060 µg/L. El límite de detección, calculado como 3
veces la desviación típica de la línea base en la zona de elución del trans-resveratrol en una muestra real, fue de 5 µg/L.
Este resultado es equivalente a los anteriormente publicados
utilizando detección fluorescente pero trabajando con columnas analíticas convencionales [7,8,10,11]. La reproducibilidad
intermedia se calculó con un vino tinto dopado con una disolución patrón de trans-resveratrol hasta 153 µg/L. El vino dopado se analizó cinco veces en diferentes días siguiendo el
método propuesto. La recuperación se determinó mediante
adición de cantidades conocidas de trans-resveratrol a un
vino tinto, y analizándolo por quintuplicado con y sin dopaje.
La reproducibilidad calculada de esta forma, expresada como
RSD, fue de 5% y la recuperación del método de 103 ± 6%.
Por tanto, la calidad del método y en particular de la micro-LC
fue satisfactoria considerando los pequeños volúmenes inyectados y las bajas concentraciones determinadas.
3.3. Análisis de muestras de vino
El método se aplicó al análisis de trans-resveratrol
en 23 vinos. Los resultados obtenidos en el análisis por triplicado de los vinos se encontraron en la mayor parte de los
casos dentro del intervalo calibrado. La concentración media
de los vinos tintos (n=15) fue de 773 µg/L (máximo 2240 µg/L,
ISBN 978-84-690-6060-5
mínimo 31 µg/L), mientras que en los vinos blancos no se encontraron cantidades apreciables en 4 vinos y en los otros 3
la media fue de 47 µg/L. En el vino rosado la concentración
determinada fue de 240 µg/L. Estos resultados confirman los
datos publicados por otros investigadores, respecto a que el
contenido de trans-resveratrol en los vinos tintos es mayor
que en los vinos blancos, independientemente de la tecnología aplicada en la elaboración [12].
4. CONCLUSIONES
El método presentado permite la cuantificación de
trans-resveratrol en vino mediante un protocolo muy sencillo
basado en el uso de la micro-LC. El método analítico ha sido
validado estudiando la reproducibilidad y la recuperación en
muestras reales. El método presenta una serie de ventajas
relacionadas con el uso de columnas capilares, tales como
un flujo volumétrico muy reducido con los beneficios asociados de reducción del impacto medioambiental. En conclusión,
la combinación de la micro-LC con la detección fluorescente
proporciona suficiente sensibilidad para cuantificar el contenido de trans-resveratrol en los vinos.
5. BIBLIOGRAFÍA
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167
ISBN 978-84-690-6060-5
PERFIL AROMÁTICO DE DIFERENTES VINOS TINTOS JÓVENES PROCEDENTES DE
LAS ISLAS CANARIAS
Laura Culleré1, Ana Escudero1, Juan Pedro Pérez-Trujillo2, Vicente Ferreira1, Juan Cacho1
1
Laboratorio de Análisis del Aroma y Enología. Dep. Química Analítica, Universidad de Zaragoza. Pza San Francisco, s/n 50009 Zaragoza, España. Telf: 976761000 Ext 3330; e-mail: [email protected]
2
Resumen:
Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología, Universidad de La Laguna, 38201 La Laguna, Tenerife, España.
Se ha estudiado el aroma de cinco vinos tintos monovarietales canarios (Negramoll, Listán negro, Tintilla, Vijariego
negro y Baboso negro). Para ello se han llevado a cabo una evaluación sensorial, un estudio olfatométrico (GC-O) y se han aplicado técnicas de análisis químico. La olfatometría se ha desarrollado a partir de extractos obtenidos mediante una técnica de
espacio de cabeza dinámico [1]. Ocho odorantes han resultado significativamente diferenciantes en las intensidades olfatométricas percibidas por el panel de sniffers: b-Damascenona, octanal, 2-metoxifenol, cinamato de etilo, furfural, 4-metilpentanoato
de etilo, 2,3-pentanodiona y por último la 3-isopropil-2-metoxipiracina. Además, algunos odorantes identificados se han percibido en una única variedad de vino. Este es el caso de la 2,3-pentanodiona y del 3-etilfenol hallados tan sólo en el vino Negramoll, el 4-metilpentanoato de etilo presente en el Vijariego negro y por último la 3-isopropil-2-metoxipiracina y el valerato de etilo
detectados únicamente en la variedad Tintilla. También cabe destacar que este estudio olfatométrico ha permitido identificar por
primera vez en el vino al odorante 2-metil-3-metilditiofurano, (con un olor similar al furantiol).
Palabras clave: aroma, olfatometría, vinos Canarios, 2-metil-3-metilditiofurano.
INTRODUCCIÓN
Las Islas Canarias constituyen un territorio no filoxerado, y por tanto conservan un patrimonio varietal único en
el mundo, con variedades desaparecidas del contenido europeo. Los vinos canarios debido a sus propias características de localización (insularidad, configuración del terreno,
lejanía a mercados, etc…) y por el mantenimiento de ciertas
tradiciones, sufren unos inconvenientes que no padecen los
peninsulares. Ahora bien, estos vinos también gozan de indudables ventajas. Las principales variedades de uva empleadas en la producción de vinos tintos canarios son Listán
negro y Negramoll, aunque se emplean otras variedades
como son la Tintilla, Baboso negro y Vijariego negro.
El objetivo de este artículo es el estudio del perfil
aromático, (tanto desde el punto de vista sensorial, olfatométrico como químico cuantitativo), de vinos tintos jóvenes
elaborados a partir de uvas de distintas variedades tintas procedentes de Canarias. De esta manera se podrán extraer
conclusiones interesantes y hasta el momento no conocidas
sobre estas variedades.
2.1. Reactivos y Standard
168
Todos los standard químicos empleados pertenecen a Sigma (St. Louis, US), Aldrich (Gillingham, UK), Fluka
(Buchs, Suiza), Lancaster (Strasbourg, Francia), PolyScience
(Niles, USA), Interchim (Monlucon, Francia), Chemservice
(West Chester, USA) y Firmenich (Genova, Suiza). Las resinas LiChrolut EN y los cartuchos de prolipropileno son de
Merck; el etanol absoluto, pentano y sulfato de amonio de
Panreac. La extracción en fase sólida semiautomática se ha
llevado a cabo en un sistema VAC ELUT 20 de Varian.
2.2. Muestras de vino
Los vinos seleccionados para este estudio fueron
cinco tintos monovarietales elaborados a partir de Negramoll
(D.O. Ycoden-Daute-Isora), Listán negro (D.O. Ycoden-Daute-Isora), Tintilla (D.O. Acoden-Daute-Isora), Vijariego negro
(D.O. El Hierro) y Baboso negro (D.O. El Hierro). Todos estos
vinos fueron proporcionados por la bodega Viñatigo (Tenerife).
2.3. Análisis sensorial
El panel sensorial estaba formado por 7 miembros
de nuestro grupo de investigación, todos ellos con una larga
experiencia en este tipo de análisis. En primer lugar se seleccionaron los términos descriptivos más representativos de
estos vinos. Así, los 10 descriptores elegidos fueron los siguientes: Fruta pasa, fruta fresca, dulce, especiado, herbáceo, tostado, madera, alcohólico, animal y reducción.
Después de un periodo previo de entrenamiento se evaluaron
cada una de las muestras de vino, mediante una escala nocategórica (donde 0= ausencia y 9= alta intensidad). Con el
fin de determinar la existencia de diferencias significativas en
las medianas obtenidas para cada uno de los descriptores
entre las distintas muestras se recurrió al test de Friedman
(test no paramétrico).
2.4. Estudio olfatométrico (GC-O)
Los volátiles del vino se recogen en un sistema de
purga y trampa siguiendo la estrategia de espacio de cabeza
ISBN 978-84-690-6060-5
desarrollada por nuestro grupo de investigación [1]. El trap
consistía en un cartucho de SPE (0,8 cm diámetro interno, 3
mL volumen interno), conteniendo 400 mg de resinas LiChrolut EN. Estas resinas fueron elegidas por la excelente habilidad que muestran para extraer compuestos aromáticos
[2].
GC-O análisis: Los sniffings de los extractos concentrados de vino se llevaron a cabo en un cromatógrafo de
gases de Thermoquest equipado con un FID y un puerto de
sniffing (ODO-1 de SGE). La columna empleada fue DB-WAX
de J&W (Folsom, CA, USA), 30m x 0,32 mm d.i., con 0,5 mm
de espesor de fase. Se ha trabajado con una presión constante de 52 kPa durante todo el análisis (H2). El volumen de
inyección fue de 1 mL en modo splitless. El inyector y el detector se mantuvieron ambos a 250ºC y el programa de temperatura del horno fue el siguiente: 40ºC durante 5 minutos,
a continuación se empleó una rampa de 4ºC/min hasta 100ºC
y 6ºC/min hasta alcanzar 220ºC (20 minutos). Los sniffings
se llevaron a cabo por un panel de 6 jueces, que debían
medir las intensidades percibidas para cada uno de los odorantes en una escala de 4 puntos (0 -3), permitiendo también
las puntuaciones intermedias. Los resultados olfatométricos
se procesaron mediante las frecuencias modificadas correspondientes.
2.5. Análisis químico cuantitativo
Se analizaron los compuestos mayoritarios siguiendo el método propuesto y validado con anterioridad [3].
También se cuantificaron los compuestos minoritarios basándonos en el método desarrollado por López y colaboradores [2].
3. RESULTADOS Y CONCLUSIONES
3.1. Estudio sensorial
Se ha realizado un test de Friedman que ha mostrado como términos más discriminantes los siguientes: “tostado” (con una significatividad del 98%), “animal” y
“herbaceo” (significatividad del 95%) y finalmente el descriptor “fruta pasa” (con un nivel de significatividad del 80%). El
“tostado” presenta su máximo en el Vijariego negro, seguido
del Baboso y Tintilla. El término “animal” es especialmente
intenso en el Baboso negro y en menor medida en el Vijariego negro y en el Negramoll. Por otro lado, la nota “herbacea” se percibe exclusivamente en el Tintilla, y la “fruta pasa”
aparece con la máxima intensidad en el Negramoll seguido
de cerca del Tintilla.
3.2. Estudio olfatométrico (GC-O)
Los resultados obtenidos se han expresados como
% Frecuencias modificadas, de manera que aquellos odorantes que no han alcanzado un valor del 30% en ninguno
de los vinos estudiados se han considerado como ruido. Después de esta simplificación, 28 son los odorantes resultan-
tes. Todos ellos han podido identificarse. Cabe resaltar que
uno de ellos (2-metil-3-metilditiofurano, responsable de una
nota aromática descrita como fritos barbacoa, cebolla muy similar a la característica del furantiol, ha sido identificado por
primera vez en vino. Para ello ha sido necesario recurrir a la
cromatografía multidimensional (MDGC), dado que este compuesto coeluye con el succinato de dietilo (mayoritario en el
vino) tanto en columna polar como en DB5 En relación a este
nuevo odorante se creyó conveniente evaluar su potencialidad aromática a través del cálculo de su umbral de olfacción
(ortonasal y retronasal) tanto en vino sintético como en vino
tinto. El umbral ortonasal obtenido en vino tinto fue de sólo
250 ppt y el retronasal de 500 ppt; valores que ponen en evidencia la potencialidad de dicho odorante.
En la siguiente tabla se clasifican los odorantes
según las %FM obtenidas. La primera categoría (%FM >
40%) está formada prácticamente por odorantes de origen
fermentativo, y constituye la base del aroma de estos vinos.
Otro criterio de clasificación más interesante se
basa en el potencial para introducir diferencias sensoriales
entre muestras. Según el test ANOVA nueve odorantes son
los más discriminantes entre estas variedades, tal y como
muestra la Tabla 1.
3.3. Estudios cuantitativos
Los odorantes más discriminantes desde el punto
de vista cuantitativo han sido la 2,3-butanodiona, cinamato
de etilo, acetato de 3-metilbutilo, b-damascenona, ácido butírico y el 2-metoxifenol, entre otros. Algunos de ellos ya habían sido considerados como discriminantes tras el estudio
olfatométrico.
Para concluir añadir que los resultados cuantitativos obtenidos, en términos generales, han reforzado los extraídos del análisis sensorial y olfatométrico.
4. BIBLIOGRAFÍA
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169
ISBN 978-84-690-6060-5
5. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido subvencionado por el proyecto
AGL-2004-06060. Los autores agradecen a las Bodegas Vi-
ñatigo (Tenerife) el que hayan proporcionado las muestras de
vino.
Tabla 1. Clasificación de los odorantes según las medias de las frecuencias modificadas (%)
170
ISBN 978-84-690-6060-5
RESIDUOS DE NUEVOS FUNGICIDAS EN VINOS: EFECTOS SOBRE EL COLOR
José Oliva1, Paula Payá1, Miguel Ángel Cámara1, José María Cayuela2, Adela Martínez-Cacha2,
Alberto Barba1
1
2
Dpto. Química Agrícola, Geología y Edafología. Universidad de Murcia. Campus de Espinardo, 30100, Murcia.
Telf. 968367482, e-mail: [email protected]
Dpto. Tecnología de los Alimentos y Nutrición. Universidad Católica San Antonio (UCAM). Campus de los Jerónimos, 30107, Guadalupe (Murcia).
Resumen:
En este trabajo se estudia la influencia de los residuos de seis fungicidas de reciente comercialización (famoxadona, fenhexamida, fluquinconazole, kresoxim-metil, quinoxifen y trifloxistrobin), sobre el color final de vinos tintos (var.
Monastrell). Con la uva vendimiada se realizaron trece microvinificaciones: testigo sin tratar, 6 tratadas individualmente
a plazo de seguridad y 6 en las condiciones más desfavorables (un día antes de la vendimia). Los tratamientos se llevaron a cabo con la dosis recomendada por la casa comercial de cada uno de los formulados. Las vinificaciones se realizaron por triplicado con un periodo macerativo de 8 días. Terminada la fermentación y tras el trasiego y la estabilización,
se determinaron los siguientes índices y parámetros indicativos de la composición fenólica de los vinos obtenidos: intensidad colorante, tono, índice de Folin, índice de polifenoles totales, antocianos totales, taninos, catequinas, porcentaje de copigmentación y parámetros CIELab. Los datos obtenidos fueron sometidos a tratamiento estadístico, mediante
la comparación del vino testigo con los vinos restantes al objeto de comprobar si los valores medios de los parámetros
estudiados difieren significativamente. Los resultados obtenidos nos muestran que existen diferencias significativas entre
vinificaciones y para algunos parámetros estudiados.
Palabras clave: fungicidas, vino tinto, Monastrell, color.
1. INTRODUCCIÓN
La materia colorante de un vino está formada por
un conjunto complejo de compuestos fenólicos procedentes
de la uva, que son responsables del color, astringencia y estructura de los vinos. Por lo tanto, los compuestos fenólicos
tienen una gran importancia en enología, debido al papel que
juegan directa o indirectamente sobre la calidad de los vinos.
Además, el mercado vitivinícola actual demanda vinos tintos
de un elevado color y cuerpo, es decir, con un contenido polifenólico alto. Pero también exige que dichas características
sean estables en el tiempo.
Los factores que influyen en el menor o mayor contenido de estos compuestos fenólicos en el vino son edafoclimáticos (composición, fertilidad y disponibilidad de agua
en el suelo, temperatura, lluvias); genéticos; culturales (poda,
abonado, riego, condiciones de insolación presencia de residuos de plaguicidas, etc.) [1-6]; y enológicos, como tiempo y
temperatura de la vinificación, presencia de SO2, pH, fenómenos de copigmentación, microoxigenación, etc. [7-8]. El
factor menos estudiado de todos los anteriores, es sin duda,
el efecto o la influencia que los residuos de plaguicidas presentes en la uva o en el vino pueden tener sobre la composición fenólica. Además, actualmente, para que la uva
presente un buen estado sanitario en el momento de la vendimia, a lo largo de su ciclo vegetativo se deben realizar diversos tratamientos fitosanitarios para controlar plagas y
enfermedades. Por todo lo anterior, con este estudio se pretende aportar nuevos datos que determinen el efecto que tienen los residuos de seis fungicidas de reciente
comercialización (famoxadona, fenhexamida, fluquinconazole, kresoxim-metil, quinoxifen y trifloxistrobin) sobre el contenido final de los compuestos fenólicos en vinos tintos de
Monastrell (D. O. Jumilla).
2.1. Material vegetal
La uva tinta utilizada fue de la variedad Monastrell,
mayoritaria en la D.O. Jumilla, en buen estado sanitario y con
un grado de madurez adecuado para obtener vinos de calidad.
Tabla 1. Formulados de los fungicidas utilizados y dosis de aplicación.
171
ISBN 978-84-690-6060-5
2.2. Productos estudiados y tratamientos fitosanitarios
En la parcela seleccionada se delimitaron 7 parcelas de ensayo (cada una con 36 cepas y marco de plantación
de 2,5 x 2,5 m): una testigo sin tratamiento y 6 tratadas individualmente con cada uno de los fungicidas. En cada parcela
se realizaron dos tratamientos: uno respetando el plazo de
seguridad y otro, una vez vendimiados los ensayos a plazo de
seguridad , en las condiciones críticas (un día antes de la vendimia). La parcela no había recibido ningún tratamiento con
los fungicidas estudiados y en el momento de la primera aplicación no existían residuos de ningún producto fitosanitario.
2.3. Proceso de vinificación
Partiendo de 15 kilos de uva, se realizó el estrujado, despalillado y sulfitado (80 mg/kg) de la misma. Una vez
introducida la vendimia en los fermentadores se mantuvo macerando 8 días entre 24-28 ºC con removidos diarios. Tras el
prensado y una vez finalizada la fermentación alcohólica, se
trasegó el vino y se sometió a los procesos de clarificación y
filtración. Todas las vinificaciones se realizaron por triplicado.
2.4. Metodología analítica
Sobre el vino estabilizado y mediante la metodología usualmente utilizada, se determinación los siguien-
tes parámetros: intensidad colorante, tono, índice de Folín,
índice de polifenoles totales, contenido en antocianos,
taninos, catequizas, % de copigmentación y parámetros
CIELab.
2.5. Análisis estadístico
Los datos fueron sometidos a tratamiento estadístico, aplicando en primer lugar una prueba de homogeneidad de varianzas (test de Levene) indicativa del tipo de
análisis a utilizar (paramétrico o no paramétrico). Para
todos los parámetros estudiados, excepto para taninos, %
de copigmentación e índice de folón, se realizó un análisis
no paramétrico (test de Mann-Whitney-Wilcoxon), para el
resto un análisis paramétrico de la varianza (ANOVA de un
factor) mediante la aplicación del test de la diferencia
menor significativa (DMS). El tratamiento se ha realizado
utilizando la aplicación informática SPSS 13.0 para Windows.
3. RESULTADOS
En las tablas 2 y 3 se muestran los resultados del
análisis estadístico al que se han sometido cada uno de los
índices y parámetros analizados para ensayos con tratamiento a plazo de seguridad y en condiciones críticas.
Tabla 2. Contenido (n=6) en compuestos fenólicos de vinos elaborados con uvas tratadas a plazo de seguridad (media ± DS).
I.C.=Intensidad colorante; IPT=Índice Polifenoles Totales; A= Antocianos totales; T=Taninos; C=catequizas; %Comp= % copigmentación; G:S.= Grado de significación (p≤0,05)
Tabla 3. Contenido (n=6) en compuestos fenólicos de vinos elaborados con uvas tratadas en condiciones críticas (media ± DS).
172
I.C.=Intensidad colorante; IPT=Índice Polifenoles Totales; A= Antocianos totales; T=Taninos; C=catequizas; %Comp= % copigmentación; G:S.= Grado de significación (p≤0,05)
ISBN 978-84-690-6060-5
De los datos de ambas tablas se desprende que
existen diferencias significativas entre el vino testigo y los
elaborados en presencia de residuos de fungicidas para
todos los parámetros excepto para la intensidad colorante y tono. Como la intensidad colorante constituye el principal elemento de juicio en la fase visual del análisis sensorial. Si tenemos en cuenta, que el único factor diferenciador entre vinificaciones es la presencia o ausencia de
los fungicidas, se observa que la presencia de éstos no
ha influido en la disminución de la difusión de los compuestos fenólicos del hollejo al mosto durante el período
de maceración.
El valor absoluto del índice de polifenoles totales
es indicativo de la capacidad de ese vino para ser sometido
a crianza. En nuestro estudio, se observa que aunque existen diferencias significativas, al ser mayores los valores de
IPT para los ensayos que muestran esas diferencias con el
testigo, la presencia de los fungicidas no afectan negativamente. Con el índice de Folin ocurre lo mismo que en el caso
anterior. Los datos de antocianos totales, catequinas y taninos nos muestran diferencias significativas para varios plaguicidas aunque los valores absolutos son superiores al
testigo. Los ensayos con quinoxifen y trifloxistrobin dan vinos
con % de copigmentación inferiores al vino testigo.
4. CONCLUSIONES
Como conclusión, los vinos obtenidos en presencia
de los productos estudiados, presentan para la mayoría de
compuestos diferencias significativas desde el punto de vista
analítico, sin embargo sensorialmente y en función de su aptitud para la crianza no influyen de forma negativa en la composición fenólica del vino. Tampoco se observa una clara
influencia de la concentración de estos fungicidas en el color
del vino, ya que los resultados obtenidos son similares para
ensayos con uvas tratadas a plazo de seguridad o en condiciones críticas. Los valores superiores en los ensayos con
presencia de algunos de estos productos fitosanitarios, sólo
podrían deberse a que los coadyuvantes que llevan los for-
mulados (tensioáctivos, emulgentes, etc) puedan beneficiar la
difusión de los compuestos fenólicos del hollejo al mosto.
5. BIBLIOGRAFÍA
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173
ISBN 978-84-690-6060-5
EVOLUCION DE LAS CARACTERÍSTICAS CROMÁTICAS DURANTE LA CRIANZA EN
BARICA DE VINOS ELABORADOS CON LA VARIEDAD TEMPRANILLO
Eva Mª Monago1, Mª Julia Marín1 y Concepción De Miguel2
1
2
Facultad de Ciencias. Universidad de Extremadura. Departamento de Química Analítica. Avda. de Elvas, s/n.06071-BADAJOZ.
Tfno: 924289392. E-mail: [email protected].
Escuela de Ingenierías Agrarias. Universidad de Extremadura. Departamento de Biología, Ecología y Ciencias de la Tierra. Crta. De San Vicente, s/n.
06071-BADAJOZ.
Resumen:
La evolución de las características cromáticas de un vino es un hecho inherente a la edad del mismo. Pero las condiciones en que dicha evolución va a tener lugar, va a depender, sin duda, de la composición química de cada vino, que además será quien defina su capacidad para la crianza. Con el objetivo de caracterizar el color de un vino y su evolución durante
la crianza, se analizan cuatro vinos elaborados con la variedad Tempranillo, de la denominación de Origen “Ribera del Guadiana”,
procedentes de cuatro parcelas cultivas en vaso y secano, vaso y riego, espaldera y secano y espaldera y riego. Los datos obtenidos están referidos a parámetros del sistema CIELab, Intensidad colorantes, Tonalidad y Componentes Rojo, Azul y Amarilla. Los vinos de cada una de las 4 parcelas son sometidos a crianza en barricas de roble durante un periodo de 7 meses, y
su evolución comparada con la sufrida por los mismos vinos mantenidos en botella en las mismas condiciones de humedad y
temperatura.
1. INTRODUCCIÓN
En Extremadura se ha producido un cambio del cultivo tradicional de la vid, en forma libre, a plantas apoyadas
en espaldera. El nuevo sistema de conducción lleva consigo
un manejo adecuado del cultivo, lo que sugiere la necesidad
de conocer el compartimiento de este nuevo sistema en las
condiciones en que se desarrollaba el antiguo, pero sobre
todo cuando además se somete a las plantas a un régimen
hídrico diferente, de menor limitación en la alimentación hídrica. Se plantea por ello este trabajo con el objetivo de valorar, en las condiciones edafoclimáticas de la D.O. Ribera
del Guadiana qué sistemas de conducción y riego se adaptan mejor a la variedad Tempranillo, para alcanzar unos vinos
de calidad, y cómo evolucionan los compuestos responsables del color de dichos vinos cuando se someten a un proceso de envejecimiento en barricas de roble.
Se estudian por un lado, las características espectrofotométricas del color de los vinos (intensidad, tonalidad y
porcentajes de componentes roja, amarilla y azul), y por otro
lado, se define de forma más precisa el color de los vinos utilizando el espacio de color CIELab.
174
El trabajo se ha desarrollado con uvas Tempranillo
cultivadas en cuatro fincas acogidas a la D.O. Ribera del
Guadiana. Dos de las fincas estaban cultivadas en vaso y las
otras dos en espaldera. Dentro de cada uno de los sistemas
de conducción teníamos una plantación en secano y la otra
con riego por goteo.
Las vinificaciones se llevaron a cabo en la Bodega
Experimental de la Facultad de Ciencias. Concluida la fermentación y obtenido los 4 vinos rama, se someten a un tra-
siego, y al cabo de 15 días entran en barrica de roble. Paralelamente otra partida de cada uno de los vinos elaborados
es embotellada y conservada en las mismas condiciones de
luz, temperatura y humedad que las barricas. Cada 20 días
se extrae una muestra del vino de las barricas y de las botellas y se somete a análisis de los compuestos responsables
del color. Las medidas se realizan en un espectrofotómetro
Hitachi-160 UV-VIS, con cubetas de 1 cm y de 10 mm de
paso de luz. A cada muestra extraída se le analiza I.P.T., Intensidad y Tonalidad [1], %Componente Rojo, Amarillo y Azul
y coordenadas cromáticas L, a, b, C, y H [2].
3. RESULTADOS
En la tabla I aparecen los datos de los 4 vinos rama
elaborados con variedad tempranillo, y procedente de las 4
fincas estudiadas.
Como se puede observar, tanto al considerar los
parámetros generales, como los relativos a las características cromáticas, se observa que los vinos procedentes de
un viñedo en secano, con independencia del sistema de
conducción, presentan mayor grado alcohólico, mayor I.P.T.
y mayor intensidad colorante. Por el contrario, los vinos procedentes de plantaciones de tempranillo con sistema de riego, son los que presentan mayor tonalidad, indicativo de la
mayor contribución relativa de la componente amarilla de
estos vinos al color de los mismos. En este sentido indicaremos que, los dos vinos procedentes de plantaciones con
riego, presentan una tonalidad mayor a 0,7, valor considerado por [3] como el límite superior que deben tener para
este valor los vinos jóvenes. Siguiendo con el análisis de la
contribución de las componentes del color, indicaremos que
los vinos procedentes de tempranillo en secano poseen
mayor porcentaje de componente roja que los que han
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Tabla I.- Parámetros enológicos generales y de color, de los 4 vinos de tempranillo elaborados.
estado sometidos a riego, en tanto que el porcentaje de
contribución de la componente azul es mayor en estos últimos.
Así mismo, los vinos de tempranillo con riego poseen ángulos de tono que los sitúan en el 4º cuadrante, en
tanto que los procedentes de viñedos en secano poseen ángulos de tono encuadrados en el 1º cuadrante, lo cual podría
permitirnos establecer una discriminación de los vinos según
el parámetro H*, en función de aplicación /no aplicación de
riego. De acuerdo con Climent y Pardo [4], aquellos vinos tintos cuyos ángulos de tono son negativos deben ser clasificados en la categoría de tintos pálidos, lo cual corroboraría la
influencia del riego en las plantaciones de tempranillo, sobre
el color de los vinos.
Si analizamos la evolución de estos vinos ramas,
desde la entrada en barrica o el mantenimiento en botella,
hasta transcurrido aproximadamente 7 meses, observamos
lo siguiente (Tabla II):
1.- En todos los casos estudiados se produce un
descenso del I.P.T.
2.- El descenso de la Intensidad Colorante presenta
pérdidas más acusadas cuando el vino está embotellado que
cuando ha sido sometido a un proceso de envejecimiento en
barricas de roble. [4] encuentran descensos de este valor, al
estudiar la evolución en vinos tintos elaborados con las variedades Bobal y Tempranillo. Se produce un aumento de la
tonalidad en todos los casos, lo que indica una mayor contribución de la componente amarilla y/o menor de la componente roja. Resultados similares fueron encontrados [4], al
estudiar la evolución cromática de vinos tintos elaborados
Tabla II.- Parámetros colorimétricos de los 4 vinos de tempranillo tras permanecer 7 meses en barrica y/o en botella
175
ISBN 978-84-690-6060-5
con las variedades Bobal, Garnacha y Tempranillo en la D.O.
Utiel-Requena.
3.- Se detecta un aumento del porcentaje de componente amarilla mayor en los vinos que permanecen en barrica. Las pérdidas del porcentaje de contribución de
componente roja son mayores en todos los vinos de barrica,
salvo para los procedentes de espaldera en secano, donde
las pérdidas de componente roja son mayores en botella (al
igual que en la tonalidad). Las pérdidas de componente azul
son mucho más acusadas en los vinos procedentes de riego,
que en los que proceden de secano (4 veces más), llegándose incluso al caso paradójico de existir hasta cierta ganancia en los vinos de espaldera y secano.
4.- La luminosidad disminuye en todos los vinos,
después de permanecer 7 meses en barrica, y aumenta después de la permanencia del mismo tiempo en botella, con excepción de los vinos procedentes de vaso y secano.
Disminuciones de este parámetro durante la maduración de
vinos de la D.O. Utiel-Requena, fueron detectadas por [4]. Se
observa, cómo tras el periodo de envejecimiento de 7 meses
tanto en barrica como en botella, la luminosidad muestra un
comportamiento claramente opuesto al de la intensidad colorante. Resultados similares a éstos fueron encontrados por
[5] al analizar 277 vinos tintos en los que se comparaban sus
parámetros colorimétricos estándar con sus parámetros CIELab.
5.- Las pérdidas de la coordenada cromática a*
(pérdida de color rojo) son mayores en los vinos que han permanecido 7 meses en botella. El aumento de la coordenada
cromática b* (aumento de color amarillo) es mayor en los
vinos de botella, en todos los casos. Resultados similares de
pérdidas de coordenada a* y aumentos de coordenada b*,
fueron detectadas por [6] al analizar la evolución del color de
vinos tintos de Rioja sometidos a envejecimiento en barricas
de roble.
6.- Las disminuciones de cromaticidad son mayores en los vinos de botella en todos los casos estudiados. El
parámetro C* muestra un comportamiento prácticamente paralelo al de la intensidad colorante, encontrando los valores
máximos y mínimos para este parámetro en los vinos procedentes de vaso secano envejecidos en barrica y vaso riego
mantenido en botella, respectivamente.
7.- El ángulo de tono H* evoluciona en todos los
tipos de vinos, hasta situarse al final del tiempo de permanencia en barrica o botella en el primer cuadrante. En todos
los casos, el H* de los vinos de barrica es mayor que el de los
de botella, excepto en el caso de los vinos de espaldera secano, que es prácticamente el mismo. Esta evolución de tono
es lógica, como consecuencia de las evoluciones de las coordenadas a* y b* comentadas anteriormente. Este hecho fue
también puesto de manifiesto al analizar la evolución del
color de vinos de Rioja por [6], en 1998. El parámetro tono
muestra así mismo una clara correlación con la tonalidad, en-
176
contrándonos que pequeñas diferencias en la tonalidad de
los vinos, tienen su equivalencia en ángulos de tono también
distintos. Así el vino con menor tonalidad (0,81), el procedente de vaso secano mantenido en botella, es el que posee
menor ángulo de tono (13,35). En el extremo opuesto aparece el vino procedente de espaldera riego y envejecido con
barrica con valores respectivos de tonalidad y ángulo de tono
de 0,92 y 23,83.
4. CONCLUSIONES
1.- Los vinos tempranillo elaborados con uvas de viñedos en secano, además de presentar mayor graduación alcohólica, son los que poseen mayor I.P.T., mayor Intensidad
Colorante y valores de ángulo de tono que los sitúan en tonalidades rojo violetas, en tanto que los elaborados con tempranillo cultivado en riego, presentan mayor contribución de
la componente amarilla y ángulos de tono que se corresponden con tonalidades rojas pálidas.
2.- El envejecimiento en barricas supone menores
pérdidas de intensidad colorante que la maduración de los
mismos vinos en botella, después de un periodo de 7 meses.
Paralelamente, tanto la disminución de la coordenada colorimétrica a* como el aumento de la coordenada b*, son más
acusadas cuando el vino madura en botella que cuando envejece en barricas de roble.
3.- El sistema de conducción y la aplicación de riego
muestran clara influencia en los vinos sometidos a envejecimiento en barrica y maduración en botella, encontrando los
valores mínimos y máximos tanto en tonalidad como en ángulo de tono en los vinos de vaso secano madurados en botella y espaldera riego envejecidos en barrica,
respectivamente, después de 7 meses.
5. BIBLIOGRAFÍA
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5. SALINAS, Mª R. 2004. Las coordenadas cromáticas
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vino. Rev. Enólogos, nº 28, pp. 24-27.
6. IÑIGEZ, M. 1998. Color y envejecimiento en vinos tintos de Rioja. ACE, Revista de Enología.
ISBN 978-84-690-6060-5
COMPORTAMIENTO DE LA ACTIVIDAD ODORANTE FRENTE AL PARDEAMIENTO DE
VINOS DULCES PEDRO XIMÉNEZ DURANTE SU CRIANZA OXIDATIVA
Luis Zea, Margarita Chaves, Lourdes Moyano y Manuel Medina
Resumen:
Departamento de Química Agrícola, Facultad de Ciencias, Universidad de Córdoba, Campus de Rabanales, Edificio C-3,
14014 Córdoba, Tfno: 957218636, e-mail: [email protected]
Se ha estudiado por Cromatografía Gaseosa la fracción aromática de vinos dulces Pedro Ximénez elaborados en la
Denominación de Origen Montilla-Moriles tras 0, 1.3, 4.2, 7.0 y 11.5 años de crianza oxidativa. Los Valores de Actividad Odorante (VAOs) de los 45 compuestos identificados se han sometido a una regresión lineal frente a la absorbancia a 420 nm, tomada como referencia del grado de crianza (pardeamiento) de los vinos. De acuerdo con los resultados obtenidos 21
compuestos han mostrado una buena correlación con esta medida espectrofotométrica, aunque solamente acetato de etilo, 2,3butanodiona, 2,3-pentanodiona, octanoato de etilo, decanal, linalol, succinato de dietilo y eugenol se comportaron como odorantes activos (VAO > 1). Por otra parte, para explicar la variablidad de estos compuestos durante la crianza, se ha realizado
con ellos un análisis de factor que permite extraer tres factores que acumulan el 55.2 %, el 20.4 % y el 17.0 %, respectivamente,
de la variabilidad total. La elevada participación en los tres factores, los mayores coeficientes de regresión frente a la A420 y
los altos VAOs de la 2,3-butanodiona y del linalol durante todo el periodo de envejecimiento, sugieren su posible utilización
como indicadores de la crianza de los vinos estudiados.
Palabras clave: Crianza oxidativa, Vino dulce, Pedro Ximénez, Actividad odorante.
1. INTRODUCCIÓN
Ciertos vinos dulces españoles con Denominación
de Origen se elaboran siguiendo un proceso especial, conocido como pasificación, en el cual tras la cosecha los racimos
de las uvas se exponen sobre esterillas de esparto a la acción
directa del sol durante 5-10 días, dependiendo de las condiciones meteorológicas. Esta práctica es solamente posible
en zonas climáticas templadas o semiáridas situadas al sur
del país como son Málaga, Jerez y Montilla-Moriles. En particular, en esta última región la cosecha se realiza en la segunda quincena del mes de agosto, alcanzándose fácilmente
una temperatura máxima superior a 40 ºC durante la pasificación de las uvas. Tras un cuidadoso prensado se obtiene
un mosto muy dulce, muy oscuro, muy viscoso y con un
aroma muy característico, que tras su encabezado se somete
a un prolongado periodo de envejecimiento oxidativo a través del sistema llamado de “criaderas y solera”.
En general, a medida que transcurre la crianza oxidativa los vinos tipo sherry procedentes de uva blanca se van
a oscurecer (pardeamiento) y su aroma va a transformarse
enormemente [1-4] tanto más cuanto más extenso sea el envejecimiento. Por otra parte, dada la complejidad de la fracción aromática del vino, tanto desde el punto de vista
cuantitativo como cualitativo, parece razonable admitir que
los compuestos que exhiben mayor Valor de Actividad Odorante (VAO), definido como el número de veces que un compuesto supera la concentración umbral, son los mayores
contribuyente al perfil aromático del vino [5-6].
En este trabajo se estudia paralelamente al pardeamiento de los vinos como fenómeno característico de la
crianza oxidativa, los cambios de ciertos compuestos con
impacto odorante (VAO > 1) de los vinos dulces Pedro Ximénez durante su envejecimiento industrial. La finalidad de este
estudio es obtener criterios para explicar ampliamente el proceso de la crianza oxidativa de estos vinos.
2.1. Vinos
Se utilizaron vinos dulces Pedro Ximénez con un
tiempo de crianza oxidativa de 0, 1.3, 4.2, 7.0 y 11.5 años,
elaborados según el sistema tradicional de “criaderas y solera” característico de la Denominación de Origen MontillaMoriles. Para cada vino se tomaron muestras de 20 botas,
escogidas al azar en diferentes puntos de la bodega que, una
vez homogeneizadas, suministraron el volumen necesario
para realizar los análisis. Los vinos presentaron unos contenidos naturales en azúcares reductores en torno a 420 g/L y
en etanol entre 13.4 y 13.6 % (v/v).
2.2. Análisis experimental
Las medidas de la A420 se realizaron en un espectrofotómetro Beckman DU-640 en cubetas de cuarzo de 1
mm después de centrifugar el vino durante 15 min a 3000
rpm. Los compuestos del aroma se cuantificaron por Cromatografía Gaseosa (Hewlett-Packard 5890 series II) empleando una columna capilar (SP-1000 de 60 m x 0.32 mm) y un
detector FID. Previamente a la inyección en el cromatógrafo
se realizó una extracción con freón en continuo de 100 mL
de vino durante 24 hr y seguidamente se concentraron los
extractos hasta 0.2 mL (concentrador micro Kuderna-Danish).
177
ISBN 978-84-690-6060-5
La temperatura del horno se programó como sigue: 5 min a
45 ºC, 1 ºC/min hasta 195 ºC y 90 min a 195 ºC. Inyector y detector se mantuvieron a 275 ºC. El gas portador fue helio a 9
psi y con split 1:100. Todos los compuestos fueron identificados mediante Espectrometría de Masas (HP-5972 MSD).
La absorbancia a 420 nm, que proporciona información acerca del color amarillo-marrón del vino, ha sido utilizada por muchos autores como un índice del pardeamiento
del mismo. Como puede observarse en la Fig. 1, su evolución respecto al tiempo de envejecimiento de los vinos estudiados se ajusta muy bien a una línea recta (r = 0.9665). De
acuerdo con este resultado, podría razonablemente aceptarse que el aumento de color pardo, además de constituir
un hecho muy representativo de la crianza oxidativa de los
vinos dulces Pedro Ximénez, podría utilizarse como índice
para estimar el avance de dicho proceso. Asimismo, podría
resultar ventajoso considerar a la absorbancia a 420 nm
como referencia para evaluar el comportamiento de cualquier
otro parámetro durante el envejecimiento.
Fig. 1. Representación lineal de la A420 frente al tiempo de
envejecimiento.
Por otro lado, el análisis de la fracción aromática de
los vinos permitió cuantificar 45 compuestos del aroma, aunque sólo 8 de ellos mostraron una buena correlación lineal
con la A420, exhibiendo asimismo actividad odorante (VAOs
> 1) durante la mayor parte de la crianza (Tabla 1). Como
puede observarse, a los 11.5 años fueron octanoato de etilo,
2,3-Butanodiona y linalol los compuestos que exhibieron los
mayores VAOs y, por tanto, los más contribuyentes al aroma
final de estos vinos, mientras que la 2,3-Pentanodiona sólo
mostró actividad odorante en este último punto. Asimismo,
los mayores coeficientes de regresión correspondieron a la
2,3-Butanodiona, linalol y decanal.
Para explicar la variabilidad encontrada en las diferentes muestras de vino se realizó un análisis de factor tomando como variables los 8 compuestos del aroma listados
en la Tabla 1. Los tres factores extraídos acumularon el 92,6
% de la variabilidad, recayendo sobre los dos primeros el
55.2 y el 20.4 % respectivamente. En la Fig. 2 se representan las cargas de los compuestos después de la rotación
sobre los tres factores extraídos, y como puede observarse,
acetato de etilo, decanal, 2,3-butanodiona y linalol fueron los
compuestos que más participaron sobre el primer factor, representando así mejor los cambios aromáticos producidos
durante la crianza.
4. CONCLUSIONES
De acuerdo con la elevada carga en los tres factores extraídos, los mayores coeficientes de regresión frente a
la A420 y los altos VAOs de la 2,3-butanodiona y del linalol
durante todo el periodo de envejecimiento, sería posible considerar a estos compuestos como indicadores aromáticos de
la crianza oxidativa de los vinos estudiados.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. FABIOS, M.; LOPEZ-TOLEDANO, A.; MAYEN, M.; MERIDA, J.; MEDINA, M. 2000. Phenolic compounds and
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biological ageing. J. Agric. Food Chem., 48, 2155-2159.
Tabla 1. VAOs durante el envejecimiento (años) y coeficiente de regresión lineal frente a la A420.
178
nd: no detectado
ISBN 978-84-690-6060-5
Fig. 2. Participación de los compuestos del aroma en los
tres factores.
2. ZEA, L.; MOYANO, L.; MORENO, J.; CORTES M.B.; MEDINA, M. 2001. Discrimination of the aroma fraction
of sherry wines obtained by oxidative and biological
ageing. Food Chem., 75, 79-84.
3. ORTEGA, A.F.; LOPEZ-TOLEDANO, A.; MAYEN, M.;
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4. CASTRO, R.; NATERA, R.; BENITEZ, P; BARROSO,
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subjected to biological aging. J. Agric. Food Chem., 50,
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6. MORENO, J.A.; ZEA, L.; MOYANO, L.; MEDINA, M.
2005. Aroma compounds as markers of the changes
in sherry wines subjected to biological ageing. Food
Control, 16, 333-338.
6. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido realizado gracias al Proyecto
AGL2006-04285 del MCyT.
179
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ESTUDIO DE LA MADURACIÓN FENÓLICA ZONAL EN LAS VARIEDADES GARNACHA
Y CARIÑENA EN LA D.O. TERRA ALTA
Maite Edo, Montse Nadal, Míriam Lampreave
Dept. de Bioquímica i Biotecnlogia. Facultat d’ Enologia de Tarragona. Universitat Rovira i Virgili. Campus Sescelades.
Marcel·lí Domingo, s/n, 43007 Tarragona. email: [email protected]
Resumen:
El objetivo del presente trabajo fue realizar el seguimiento de la madurez para determinar la composición fenólica de
la uva asociada a diferentes cinéticas de maduración de las variedades garnacha y cariñena. Para cada variedad se estudiaron 3 zonas clasificadas en tempranas, medias y tardías, según la entrada de la vendimia en bodega.
Para ello se determinó el peso de las bayas, el grado alcohólico probable, la acidez y el pH de la pulpa y los antocianos de los hollejos. Los resultados indicaron, que la composición de la uva en vendimia en zonas tempranas alcanzaba mayor
contenido en azúcares, niveles más elevados de polifenoles y menor contenido en ácidos que en las tardías. En cuanto a variedades, la cariñena era más rica en contenido de antocianos de la piel, en polifenoles de la baya entera y el tamaño de la baya
mayor que en garnacha.
Palabras clave: madurez tecnológica, madurez fenólica, pulpa, hollejo.
1. INTRODUCCIÓN
En la gran mayoría de zonas vitivinícolas se vendimian las uvas en función del contenido de azúcar y el nivel de
acidez total. La medición de estos parámetros solo nos indica el estado de madurez de la pulpa que la mayoría de las
veces no se corresponde con la de los hollejos [1]. Es muy
importante considerar el concepto de madurez fenólica, ya
que nos da información acerca del nivel de maduración de
los hollejos de las bayas. En la práctica, los viticultores alargan el período de permanencia de la uva en la vid para alcanzar un adecuado nivel de fenoles, compuestos
directamente relacionados con la calidad de los vinos tintos
[2]. Las uvas vendimiadas en zonas más frías [3] a menudo
no alcanzan su completa maduración y por lo tanto poseen
menor contenido de azúcares y antocianos. Las uvas procedentes de regiones más cálidas [1], en estadios precoces de
la maduración alcanzan mayores concentraciones de azúcares y compuestos fenólicos [4].
La finalidad del ensayo fue estudiar la evolución de
los distintos compuestos de calidad a lo largo de la maduración, tanto en la pulpa como en la piel. El método Glories nos
permite realizar una medición precisa del estado de madurez fenólica de la baya y del porcentaje de extracción de antocianos. En el presente estudio se determinó la cinética de
maduración y la composición final de la uva en las variedades
garnacha y cariñena en distintos microclimas.
180
Las variedades estudiadas fueron garnacha tinta y
cariñena procedentes de las localidades de Batea y Vilalba
dels Arcs, respectivamente, situadas en la D.O. Terra Alta.
Ambas variedades están conducidas en vaso, con una antigüedad alrededor de 10 años. Para cada localidad se estu-
diaron 3 zonas con microclimas distintos, clasificados en tempranos, medios y tardíos, según la entrada de la vendimia en
bodega.
Para cada variedad se realizaron muestreos de uva
durante la maduración con una periocidad de entre 6 y 9 días
a partir de la segunda semana de agosto. El muestreo en
campo consistió en recoger entre 10 y 14 racimos dependiendo de su tamaño, a partir de los cuales se separaban al
azar una muestra de 100 bayas destinadas al control clásico:
análisis del grado alcohólico (Gap), acidez total (ATT) y pH
con la finalidad de determinar el estado de madurez tecnológica de la uva. Otra muestra de 200 bayas era destinada al
análisis de madurez fenólica de baya entera, para el cual se
utilizó el método Glories y se pudieron analizar el mosto directamente y los extractos a pH 1 y a pH 3’6 y, finalmente,
una muestra de 20 bayas se destinó al análisis de antocianos
de los hollejos, los cuales se midieron (550nm) por espectrofotometría. En los extractos obtenidos se midieron los polifenoles totales (280nm), y catequinas con solución DMAC
(640nm), mediante espectrofotometría, antocianos fácilmente
extraíbles (520nm), en la muestra tratada con solución a pH
3’6 y los antocianos totales (520nm), en la muestra tratada
con solución a pH 1 [5].
Todos los análisis se realizaron por triplicado y se
aplicó ANOVA y el test de Fisher para conocer la existencia
de similitudes o diferencias entre las variables estudiadas.
3. RESULTADOS
En los controles clásicos para determinar la madurez tecnológica, se observó como en zonas tempranas había
una mayor concentración de azúcares y, por tanto, menor en
ácidos (Tabla 1). En estas zonas, el grado alcohólico probable iba en aumento progresivamente a lo largo de la maduración [6]. El tamaño de la baya era menor en la variedad
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garnacha, la cual no presentaba diferencias significativas estadísticamente entre las tres zonas; aunque la cariñena presentaba un contenido de antocianos de los hollejos más
elevado, tal y como se desprende del análisis de antocianos
de la piel, a medida que el peso de las bayas se incrementa
con la maduración (Figuras 1 y 2).
En los análisis de composición fenólica, se encontraron valores superiores de IPT y antocianos totales y extraíbles en la variedad cariñena, sin embargo, el contenido de
monómeros procianidina (DMAC) [7] fue más elevado en la
variedad garnacha (Figuras 3 y 4). Algunos autores [8] han
observado que, a lo largo de la maduración, las catequinas
Tabla 1. Valores de los distintos parámetros en el momento de la vendimia en la variedad Cariñena i Garnacha.
Fig. 1 y 2. Evolución del peso de baya y antocianos de los hollejos a lo largo de a maduración en las variedades Cariñena y
Garnacha. Te. : Temprana; M.: media; Ta. : Tardía. P. b.: peso baya; Ant. ho. : Antocianos hollejos.
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monoméricas disminuyen su concentración para dar lugar a
oligómeros y polímeros. Según la tabla 1, los resultados en
vendimia indican que en las zonas tempranas se acumulaban más fenoles (IPT) que en las zonas más tardías, como se
constata al comparar las concentraciones de antocianos totales entre las tres épocas de cosecha, ya que existen diferencias estadísticamente significativas entre las distintas
fincas en una misma variedad. Sin embargo, en la variedad
garnacha las concentraciones de los antocianos de los hollejos y los extraíbles en zonas tempranas, solamente presentaban diferencias con las zonas medias.
4. CONCLUSIONES
Según el aspecto zonal, las fincas más tempranas
son las que antes alcanzan la madurez y además, presentan
los valores más elevados de grado alcohólico probable (Gap),
acidez total (ATT), IPT y DMAC. En cuánto al pH, éste es muy
parecido en las tres zonas para cada variedad. Según el aspecto varietal, la garnacha muestra una acumulación rápida
de compuestos fenólicos después del envero, mientras que
en cariñena, la cinética es más lenta y progresiva hasta la
vendimia. No obstante, en ambas, la máxima concentración
de compuestos fenólicos se alcanza dos o tres semanas
antes de la vendimia, período en el que los antocianos disminuyen ligeramente hasta el final de la maduración.
En conclusión, la madurez tecnológica es previa a la
madurez fenólica en las dos variedades. Según los microclimas, los menores valores de compuestos fenólicos encontrados en las zonas medias permiten realizar una nueva
clasificación de éstas en zonas tardías y nos indican que factores edafoclimáticos podrían ser la causa de la incompleta
maduración de la uva.
5. BIBLIOGRAFÍA
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vino, enero / febrero, 59-64.
6. AGRADECIMIENTOS
Este estudio ha sido financiado por el proyecto Nacional AGL 2005-06927-CO-02 y por el Proyecto CIDEM de
la bodega Unió de Cooperatives.
ISBN 978-84-690-6060-5
ESTUDIO DE LA MADUREZ FENÓLICA EN EXTRACTOS DE PIELES Y SEMILLAS DE
UVA: PUESTA A PUNTO DE UN MÉTODO DE REFERENCIA BASADO EN LA TÉCNICA
DE HPLC
Susanna Muñoz, Montserrat Mestres, Olga Busto, Josep Guasch
Resumen:
Grup de Química Analítica Enològica i dels Aliments
Departament de Química Analítica i Química Orgànica. Facultat dÉnologia. Universitat Rovira i Virgili
C/ Marcel·lí Domingo s/n, 43007 Tarragona, España. Tel: 977 55 84 96; fax: 977 55 84 46
[email protected]
Se propone un método para la determinación y cuantificación individualizada del contenido en flavanoles y antocianos en extractos de pieles y semillas de uva, con el fin de utilizarlo como método de referencia en la validación de un ulterior
método rápido, útil para el control de calidad en bodega. El método de referencia está basado en la técnica de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detector de diodos en serie (DAD), mientras que el rápido se basa en la técnica de infrarrojo con transformada de Fourier (FT-IR).
Palabras clave: HPLC-DAD; polifenoles; uva.
1. INTRODUCCIÓN
La materia colorante del vino está formada por un
conjunto complejo de compuestos fenólicos procedentes de
las uvas llamados comúnmente polifenoles. Éstos se encuentran principalmente en las semillas y en las capas internas de la piel de la baya. Aunque existen diferentes familias
de compuestos fenólicos en el vino tinto, por su importancia
enológica, destacan los antocianos y los taninos. Los antocianos son, por su parte, los responsables del color de la uva
de los vinos jóvenes y, por polimerización, de los vinos envejecidos. Y los taninos, que están constituidos en su mayor
parte por los polímeros de la catequina son, además, los responsables de la astringencia del vino.
En la maduración de las uvas se distinguen actualmente dos factores: la maduración de la pulpa y la maduración de la piel [1]. Tradicionalmente se ha valorado la
maduración de la pulpa, relacionando los azúcares y los ácidos, que, tras la fermentación, confieren al vino el característico equilibrio alcohol-acidez que garantiza su estabilidad y
sus propiedades organolépticas básicas. Actualmente, para
definir el estado de maduración óptimo en variedades tintas,
se valora adicionalmente la maduración de la piel, ya que en
ella se hallan los compuestos polifenólicos [1]. Por este motivo se considera interesante concretar un índice de maduración de estos compuestos.
Entre los grandes avances de la instrumentación
analítica, destaca una técnica que se caracteriza por su
capacidad de aportar gran cantidad de información en un
tiempo de análisis mínimo. Esta técnica es la espectroscopia de infrarrojo con transformada de Fourier (FT-IR),
que aporta una información global relacionada con la composición de la muestra, para, mediante diferentes técnicas quimiométricas, obtener información sobre parámetros concretos [2].
2.1. Patrones y reactivos
El acetonitrilo y el etanol, ambos de calidad HPLC,
fueron suministrados por Scharlau (Barcelona, España), así
como el ácido L(+)-Tartárico y el ácido clorhídrico 37%, de
calidad R.A.. El ácido trifluoroacético (TFA), también para
HPLC, fue comprado a Fluka® (Madrid, España).
La (+)-catequina, la (-)-epicatequina, las procianidinas B1 y B2, la cianidina-3-glucósido (kuromanina), la peonidina-3-glucósido y la malvidina-3-glucósido (oenina) fueron
suministradas por Fluka® (Madrid, España). La delfinidina3-glucósido (mirtillina) fue proporcionada por Extrasynthèse®
(Genay, Francia). Todos los patrones eran de una pureza superior al 90%. Para cada uno de estos analitos se preparó
una solución madre patrón de concentración determinada por
disolución de la cantidad adecuada de patrón en etanol. En
el caso de los antocianos se realizó una adición de 0,1% de
ácido clorhídrico. Para la preparación de las muestras necesarias para los distintos ensayos realizados se procedió a la
disolución de estas soluciones madre con la cantidad adecuada de vino sintético (120 ml de etanol, 5 g de ácido L(+)Tartárico y agua Milli-Q c.s.p. 1 L, pH 3,20 con una solución
de hidróxido sódico).
2.2. Muestras
En primer lugar se llevó a cabo una inspección técnica de la finca y, teniendo en cuenta aspectos agronómicos,
tales como superficie, marco de plantación, etc. se procedió
a delimitar las zonas definitorias de la parcela. Así pues, se
marcaron las cepas de las filas representativas para cada variedad (Cabernet sauvignon, Pinot noir, Cariñena, Monastrell,
183
ISBN 978-84-690-6060-5
Merlot, Tempranillo, Syrah y Garnacha tinta), de donde semanalmente, durante el período de maduración, se recogían
las muestras hasta el día de la vendimia.
2.3. Método de extracción
Para llevar a cabo el estudio de la maduración fenólica, se hace necesario el uso de un método de extracción
de los compuestos fenólicos que se hallan en las partes sólidas de la uva. Por ello, y tras una adecuada revisión bibliográfica, se procedió a aplicar el método de extracción de Di
Stefano et al. [3].
2.4. Análisis cromatográfico de flavanoles y antocianos
por HPLC-DAD
Para el análisis cromatográfico se emplea un cromatógrafo de líquidos HP Agilent modelo 1100 con detector
de diodos en serie (DAD) (Agilent Technologies, Madrid, España). La separación se lleva a cabo en una columna Kromasil 100 C18 (250mm x 3mm i.d., 5µm) suministrada por
Scharlau (Barcelona, España), a una temperatura de 20ºC,
usando como fase móvil un solvente A (0,2% TFA en agua) y
un solvente B (0,2% TFA en acetonitrilo). Es necesario trabajar con un multigradiente de elución tal y como se describe:
0% B en el minuto 0; 9% B en el min. 10; 18% B en el min.
25; 26% B en el min. 40; 100% B en el min. 42; 100% B en el
min. 44; 0% B en el min.45, a un flujo constante de 1 ml/min.
En estas condiciones, los compuestos eluyen en 36 minutos
(Fig. 1). El volumen de muestra inyectada es de 10µl. Los flavanoles se detectan a una longitud de onda de 280 nm; los
antocianos, a 520 nm.
2.6. Validación del Método
2.6.1. Cálculo de la repetibilidad y precisión intermedia
Para corroborar el buen funcionamiento del método
establecido, fue calculada la repetibilidad utilizando una solución mezcla de los patrones a concentración elevada y otra
a concentración baja. Se realizaron seis inyecciones de cada
solución y se calculó el coeficiente de variación (CV) de los
resultados obtenidos. En lo que a la precisión intermedia se
refiere, ésta también se calculó para una solución mezcla de
patrones a concentración elevada y para otra a concentración baja. Para ello se introdujeron cambios tales como el día,
la hora y el orden de inyección. Se realizaron 12 inyecciones
en días alternos (durante 2 semanas).
2.6.2. Cálculo de las recuperaciones
Otro parámetro analítico que permite asegurar el
buen funcionamiento del método es el cálculo de la recuperación, ya que este parámetro nos proporciona una medida de
su exactitud. Para ello se cuantificó el contenido de los analitos
estudiados en los extractos de pieles y de semillas, empleando la técnica de las adiciones estándar, y se comparó este
resultado con el obtenido utilizando la técnica del patrón externo. Para la obtención de las rectas de adiciones estándar se
analizaron duplicados de un extracto de pieles y otro de semillas, fortificados a dos niveles de concentración (bajo y alto).
3. RESULTADOS
Debido a que el grano de uva nunca es representativo de toda una parcela, se hace necesario aplicar un plan de
Fig. 1. Cromatograma de un extracto de pieles de la variedad Merlot. Antocianos: 1. Mirtillina; 2.Kuromanina;
3. petunidina-3-glucósido; 4.peonidina-3-glucósido; 5.oenina; 6. peonidina; 7.malvidina.
2.5. Rectas de Calibrado
184
Para verificar la linealidad de la respuesta de los diferentes analitos a las longitudes de onda especificadas, se
prepararon e inyectaron por duplicado entre 6 y 8 disoluciones en vino sintético (dependiendo del rango de concentración del patrón [4]) de distintas concentraciones para cada
uno de los analitos utilizados. Se construyó la curva de calibrado para cada patrón representando el área de pico cromatográfico de cada compuesto vs su concentración.
muestreo. Para verificar la validez del nuestro, se llevó a cabo
una serie de análisis. El mosto procedente del estrujado de
100 bayas se utilizó para la realización de las determinaciones de glucosa, fructosa, pH y acidez total. Los resultados
obtenidos se analizaron estadísticamente mediante el análisis de la varianza (ANOVA) con un nivel de significancia del
0,05%. Los coeficientes de variación (CV) resultaron estadísticamente comparables entre las diferentes variedades y
entre los diferentes días de muestreo para cada una de ellas,
ISBN 978-84-690-6060-5
pudiendo afirmarse, por tanto, que el plan de muestreo realizado es correcto y nos proporciona una buena representabilidad del viñedo de cada parcela.
La elección del método de extracción debe resultar
de un compromiso entre un método completo (habitualmente
largo y costoso) y un método rápido (normalmente incompleto). Con el afán de minimizar el tiempo de aplicación del
método de extracción de Di Stefano et al. [3], optamos por
utilizar únicamente el procedimiento de maceración de 48
horas a 30ºC.
Los valores de los coeficientes de correlación obtenidos en la rectas de calibrado de nuestros analitos
(r2=0,9811-0,9992) fueron satisfactorios, lo que confirmaba la
respuesta lineal en el rango de concentraciones considerado
[4]. En el estudio de precisión desarrollado, el método resultó
altamente repetitivo, con un CV inferior al 5,2%, y, en lo que
se refiere a la precisión intermedia, el comportamiento de las
soluciones patrón fue bueno durante el tiempo de estudio,
con un CV inferior al 8,5%. Finalmente, y teniendo en cuenta
la dificultad de trabajar con compuestos tan inestables como
los determinados, se obtuvieron valores aceptables de recuperación: 100-116% para flavanoles y 70-135% para antocianos.
predicción del potencial fenólico que tendrá un vino a partir de
la uva. Esta técnica, al igual que otras técnicas rápidas, precisa de una rigurosa etapa de calibración previa, la cual, en
el caso de los compuestos polifenólicos, requiere del uso de
la cromatografía líquida (HPLC). El método aquí desarrollado
nos permite identificar y cuantificar de forma individualizada
los polifenoles (flavanoles y antocianos) más importantes de
la uva, a diferencia de otros métodos publicados anteriormente, en los que, habitualmente, se refiere la concentración
de cada uno de ellos a la malvidina.
Entre las características que definen la calidad en
general de los vinos, el color constituye un factor determinante. Por dicha razón, hoy en día es de vital importancia introducir, en el sector enológico, la técnica del FT-IR para la
6. AGRADECIMIENTOS
4. CONCLUSIONES
5. BIBLIOGRAFÍA
1. RIBÉREAU-GAYON, P.; DUBOURDIEU, D.; DONÈCHE,
B.; LONVAUD, A. 2000. The Grape and its Maturation.
In: Handbook of Enology (vol 1). John Wiley & Sons,
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3. UMMARINO, I.; FERRANDINO, A.; CRAVERO, M.C.; DI
STEFANO, R. 2001. Evoluzione dei polifenoli di uve di
biotipo di Pinot nero durante la maturazione. LÉnologo 71-82
4. FLANZY, C. (coord.). 2000. Enología: Fundamentos
Científicos y Tecnológicos. Mundi Prensa. ISBN 847114-859-5.
Los autores agradecen al Ministerio de Ciencia y
Tecnología la financiación del proyecto AGL2003-04995.
185
ISBN 978-84-690-6060-5
COMPOSICIÓN FENÓLICA DE VINAGRES OBTENIDOS POR ACETIFICACIÓN CON
CULTIVO SUPERFICIAL EN BARRICAS DE DIFERENTES MADERAS
Cerezo, A.B., Tesfaye, W., Garcia Parrilla, M.C., Troncoso, A.M.
Resumen:
Área de Nutrición y Bromatología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla,
C/ P. García González-2, E-41012 Sevilla, España.
Tlfn. +34 (9)54556761, Fax. +34 (9)54233765, e-mail: [email protected]
En los últimos tiempos la restauración demanda productos de calidad, vinagres selectos, con notas sensoriales particulares y singulares. El presente estudio tiene por objeto evaluar la influencia de diversas maderas de las barricas en la composición fenólica de vinagres. Se han empleado barricas de cerezo, roble, castaño y acacia de 60 L de capacidad, fabricadas
ex profeso con idéntico tratamiento; en ellas se llevó a cabo la acetificación con cultivo superficial. Se han empleado dos tipos
de sustrato (vinos tintos variedad Garnacha procedentes del Priorat y de Banyuls (Francia)). Los compuestos fenólicos se determinaron por CLAE-DAD evaluándose los cambios en la concentración de ácidos hidroxibenzoicos, cinámicos, flavan-3-ol, y
estilbenos. El análisis discriminante permitió clasificar los vinagres obtenidos en barricas de diferente maderas con un 97% de
aciertos en la clasificación de muestras de vinagres de Banyuls y un 100% de aciertos en el caso de los vinagres del Priorat.
Los ácidos gálico, protocatéquico, vainíllico, siríngico, tirosol (+)-catequina son las variables incluidas en las funciones de clasificación. Los cambios en la composición fenólica más relevantes a lo largo de la acetificación son la disminución del glucósido de resveratrol y de la (+)-catequina.
Palabras clave: vinagre de vino tinto, polifenoles, acetificación en madera, cultivo superficial, HPLC.
1. INTRODUCCIÓN
186
El vinagre de calidad, prácticamente valorado tan
solo en la alta restauración y gastronomía ha visto acrecentada notablemente su demanda en los últimos años. Los vinagres de mayor prestigio, son sin duda, aquellos vinagres
elaborados de forma artesanal (acetificación en cultivo superficial). Estos vinagres alcanzan altos precios en el mercado debido a que tanto su velocidad de acetificación como
su estancia en madera son procesos largos en el tiempo. Sin
embargo, estos vinagres siguen produciéndose de manera
tradicional y son escasos los controles tanto de la materia
prima como del proceso de fermentación y envejecimiento [1,
2].
La calidad de un vinagre viene influenciada por la
materia prima, el método de elaboración empleado y el envejecimiento en madera. La defensa del mismo debe fundamentarse en criterios de calidad, y es recomendable que
estos se basan en medidas objetivas de constituyentes de su
composición química y en criterios sensoriales de aceptación
por el consumidor [3].
Las características de las maderas que se emplean
en la construcción de barricas incluye: la resistencia física a
la filtración y al golpe, la inercia gustativa, flexibilidad y durabilidad natural. Aun que no existen suficientes estudios sobre
la utilización de otros tipos de madera en construcción de barricas además de madera roble, en España se han usado la
madera cerezo, castaño y olmo para reparar las cubas de
roble. Sin embargo vinagres como Aceto Balsámico Tradicionale di Modena se elaboran utilizando barricas construidas de diferentes tipos de madera como castaño, cerezo,
fresno, morera o moral además de roble [4].
La composición química de la madera incluye sustancias de tipo macromolecular como son la celulosa, la hemicelulosa y la lignina y en menor medida otros componentes
como son los galotaninos y elagitaninos. También hay elementos interesantes y diversos que pueden ser extraídos con
disolventes, acuosos o de otro tipo: fenoles, ácidos grasos,
lactonas, alcoholes, etc. [5].
Los compuestos polifenólicos han sido considerados como parámetro fundamental debido al papel que juegan en los cambios que determina la calidad final de los
productos de origen vegetal (vino, vinagre etc...) [6,7]. Durante la elaboración de vinagre sobretodo cuando la acetificación y el envejecimiento se realizan en barricas de madera
la evolución de estos compuestos viene influenciado por carácter oxidativa del proceso o extracción de los compuestos
fenólicos de la madera (degradación de ligninas y taninos).
La determinación de estos compuestos se lleva a cabo mediante Cromatografía Liquida de Alta Resolución (CLAE) inyectando directamente el vinagre sin manipulación alguna
salvo la filtración [8,9].
El objetivo de este estudio es evaluar los cambios
de los compuestos fenólicos de vinagres de vino tinto elaborados en barricas de maderas diferentes (Acacia, castaño,
Cerezo y Roble) durante el proceso de acetificación, comprobando la influencia de la madera en la composición final
de los vinagres.
2.1. Muestras
El estudio se ha llevado a cabo en 166 muestras de
vinagres de vino tinto variedad Garnacha procedentes del
ISBN 978-84-690-6060-5
Priorat y de Banyuls (Francia). Se han empleado barricas de
(cerezo, roble, castaño y acacia) de 60 L de capacidad, fabricadas ex profeso con idéntico tratamiento; en ellas se llevó
a cabo la acetificación con cultivo superficial. 83 muestras
son vinagres elaborados en Banyuls (Francia) y 85 muestras
elaboradas en una bodega de Priorat.
Estas muestras corresponden a vinos de partida,
muestras tomadas en fase de acetificación así como vinagres acabados (aproximadamente 6º acéticos).
2.2. Determinación de compuestos polifenólicos
El análisis por CLAE se llevo a cabo en un equipo
Agilent 1100 series conectado a un detector de UV-VIS. El vinagre se inyecta directamente sin manipulación alguna salvo
la filtración (filtros de uso único Millex-LCR13 de 0,45µm). La
columna utilizada es Zorbax StableBond C18 column (30 mm
X 4,6 mm), 3,5 µm tamaño partícula. El flujo es de 4ml/min
(una válvula HP microsplitter limita el flujo al detector a 1
ml/min). La columna se mantiene a temperatura constante de
30 ºC. Se realizo una inyección de 20 µl. La duración de cada
análisis completo es de 20 minutos. La resolución es de 2.4
nm. Los compuestos fenólicos se identificaron y se cuantificaron en las siguientes longitudes de onda (280 nm, 320 nm,
365 nm y 520 nm) [10]. La cuantificación se llevo a cabo mediante calibrado externo comparando las áreas de los picos
identificados en las muestras con la de los patrones.
Los antocianos totales se determinaron mediante el
método de diferencia de pH [11].
3. RESULTADOS
Se han identificado un total de 12 compuestos (ácidos fenólicos, flavanoles, estilbenos) en las muestras analizadas en concentraciones que oscilan entre 166 mg/l para
ácido gálico y 2,5 mg/l para la epicatequina (Tabla 1).
El análisis de la varianza permitió comprobar qué
compuestos fenólicos presentaban diferencias significativas
en función de las diferentes maderas: Ácido Gálico, Protocatéquico, Tirosol, Ácido Vainíllico, Catequina, Ácido Siríngico, Galato de etilo y Ácido Cafeoil Tartárico.
Con respecto al proceso de acetificación se observaron diferencias significativas en el glucósido de resveratrol
y catequina, que disminuyen a lo largo del proceso.
El análisis discriminante permite clasificar las muestras en 4 grupos en función del tipo de madera. Los porcentajes de acierto de clasificación son del 98% y del 100%.
Los antocianos totales disminuyen significativamente en todas las acetificaciones estudiadas, no existiendo relación entre tipo de madera empleado y cambios en este índice.
4. CONCLUSIONES
El tipo de madera empleado en la obtención de vinagres de vino mediante fermentación con cultivo sumergido
tiene una clara influencia en la composición fenólica final de
los vinagres.
5. BIBLIOGRAFÍA
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Tabla 1. Concentraciones (mg/L) de los compuestos fenolicos en los vinagres acabados
Aplicando el análisis de cluster (Método de Ward´s)
se observa cómo tienden a agruparse las muestras elaboradas en el mismo tipo de madera, no existiendo agrupaciones
en función del grosor de la madera, si bien en los estadíos iniciales de la fermentación acética no existe esta diferenciación.
4. Bergonzini, R. (1979). L’aceto balsámico. Ed. Mundi Zanetti. Modena.
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Unit F1.2.1-13.
6. AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al proyecto WINEGAR (Cooperative Research under the Sixth Framework Programme
of the European Community (2002-2006) por la financiación
del proyecto.
ISBN 978-84-690-6060-5
ACEPTABILIDAD SENSORIAL DE VINOS DE LA TIERRA RIBERA DEL ARLANZA
Encarnación Fernández-Fernández1, Josefina Vila-Crespo2, Sonia Barrera-Redondo1
1
2
Dpto. Ingeniería Agrícola y Forestal. Área de Tecnología de Alimentos. Universidad de Valladolid. Campus de Palencia. ETS de Ingenierías Agrarias. Avda.
Madrid 44. 34071 Palencia. Telf.: 979108353. E-mail: [email protected]
Dpto. Anatomía Patológica, Microbiología, Medicina Preventiva y Salud Pública, Medicina Legal y Forense. Área de Microbiología. Universidad de Valladolid.
Campus de Palencia. ETS de Ingenierías Agrarias. Avda. Madrid 44. 34071. Palencia. Telf.: 979108 E-mail: [email protected]
Resumen:
Hoy en día existe un creciente interés en conocer la preferencia de los consumidores hacia los vinos de determinadas zonas vitivinícolas de España. Para ello, es necesario determinar la influencia que cada atributo sensorial tiene en la elección del vino y, por lo tanto, en la aceptabilidad de los vinos por parte de un grupo de consumidores.
El objetivo de este trabajo es medir la aceptabilidad sensorial de seis vinos tintos elaborados en la ETSIIAA de Palencia (UVa) con uva procedente de la Ribera del Arlanza, y dos comerciales producidos por dos bodegas pertenecientes a la
denominación de Vinos de la Tierra Ribera del Arlanza.
Un grupo de 162 consumidores midieron la aceptabilidad de los ocho vinos para el color, olor, sabor, persistencia en
boca y aceptabilidad global, utilizando una escala hedónica de nueve puntos. Además se obtuvo información sobre la segmentación de la población y sobre la frecuencia de consumo y tipo de vino consumido habitualmente.
Los mapas de preferencia internos indicaron que los consumidores preferían los vinos elaborados a los comerciales
en todos los descriptores estudiados. Además uno de los vinos elaborados se caracterizó por una mayor intensidad de sabor,
persistencia en boca y aceptabilidad global.
Palabras clave: aceptabilidad, consumidores, vino tinto, mapas de preferencia
1. INTRODUCCIÓN
La aceptabilidad de los consumidores hacia un producto depende de muchos factores que pueden estar relacionados con el producto en sí mismo, con los consumidores
o con el ambiente [1]. Las características del producto (atributos sensoriales, precio, marca comercial, disponibilidad,
etc.) y de los consumidores (edad, sexo, nivel socio-económico, educación, etc.) pueden conducir a diferentes niveles
de la aceptabilidad del producto [2].
Hoy en día existe un interés creciente en conocer
cómo influyen los atributos sensoriales en la elección de diferentes vinos de determinadas zonas vitivinícolas de España
y, por lo tanto, en la aceptabilidad de los vinos por parte de un
grupo de consumidores. En particular, este tipo de estudios
es interesante para aquellos vinos que están buscando el reconocimiento de sellos de calidad por parte de la administración, como por ejemplo los vinos de la Ribera del Arlanza, en
la provincia de Burgos, que desde el año 1998 disfrutan de la
mención de “Vino de la Tierra”.
El objetivo de este trabajo es evaluar la aceptabilidad desde el punto de vista sensorial de ocho vinos tintos.
Seis de ellos elaborados en la ETSIIAA de Palencia (UVa)
con uva procedente de la Ribera del Arlanza y dos comerciales producidos por dos bodegas pertenecientes a la denominación de Vinos de la Tierra Ribera del Arlanza.
Se realizaron tres vinificaciones con uva tinta procedente de la localidad de Royuela de Riofranco (Burgos)
perteneciente a la denominación de Vinos de la Tierra Ribera del Arlanza. En la primera vinificación se siguió un método tradicional de elaboración de vino tinto con inoculación
de levaduras comerciales para la realización de la fermentación alcohólica. Una vez finalizada la fermentación alcohólica se descubó y se obtuvo el vino yema, y los orujos se
prensaron para obtener el vino prensa. Posteriormente se
inocularon bacterias lácticas comerciales para realizar la
fermentación maloláctica de cada una de las fracciones por
separado. En la segunda vinificación se elaboró un vino tinto por el procedimiento de doble pasta, siguiendo el mismo
proceso tecnológico con inoculación de levaduras y bacterias comerciales, por lo que también se obtuvieron dos tipos
de vinos: vino tinto doble pasta yema y doble pasta prensa.
Por último se llevó a cabo una vinificación tradicional tal y
como se hacía en las bodegas de la Ribera del Arlanza sin
inoculación de levaduras ni de bacterias. Una vez terminados todos los vinos fueron sulfitados y embotellados
siguiendo las mismas pautas.
Un grupo de 162 consumidores evaluaron la
aceptabilidad de ocho vinos (Tabla 1) para el color, olor,
sabor, persistencia en boca y aceptabilidad global utilizando una escala hedónica de nueve puntos. Además
se obtuvo información sobre la segmentación de la
población y sobre la frecuencia de consumo y el tipo
de vino consumido habitualmente. El análisis estadístico se realizó utilizando el paquete estadístico SPSS
vers. 13.0 para Windows.
189
ISBN 978-84-690-6060-5
Tabla 1. Vinos utilizados en el estudio
3. RESULTADOS
La muestra de consumidores utilizada para este trabajo estaba formada por un 54,94% de hombres y un 45,06%
de mujeres, con un rango de edad comprendido entre los 1824 años (63,58%), mayoritariamente solteros (87,65%) y estudiantes (77,78%). Con una frecuencia de consumo de vino
de 2 a 4 veces al mes (29,63%) y una vez a la semana
(26,54%), siendo los vinos que habitualmente consumen:
joven (36,42%), de cosechero (24,69%) y de crianza
(22,84%).
En las Fig. 1, 2, 3, 4 y 5 se representan la aceptabilidad de los consumidores junto con las ocho muestras de
vino evaluadas para cada uno de los descriptores.
Fig. 1. Mapa de preferencia interno color
Fig. 2. Mapa de preferencia interno olor
190
Fig. 3. Mapa de preferencia interno sabor
Fig. 4. Mapa de preferencia interno persistencia
Fig. 5. Mapa de preferencia interno aceptabilidad global
Fig. 6. Mapa de preferencia de atributos y muestras
ISBN 978-84-690-6060-5
Finalmente en la Fig. 6 se representan las muestras
de vino y los atributos sensoriales evaluados por los consumidores.
4. CONCLUSIONES
Los resultados indicaron que los consumidores preferían los vinos elaborados en la ETSIIAA de Palencia (muestras 1, 2, 3, 4, 5 y 6) a los comerciales (muestras 7 y 8) en
todos los descriptores estudiados. Además el vino tinto doble
pasta prensa (muestra 6) se caracterizó por una mayor in-
tensidad de sabor, persistencia en boca y aceptabilidad global.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. SANTA CRUZ, M.J.; MARTINEZ, M.C.; HOUGH, G.
2002. Descriptive analysis, consumer clusters and
preference mapping of commercial mayonnaise in Argentina. J. of Sensory Studies 17, 309-325.
2. RANDALL, E.; SANJUR, D. 1981. Food preferences,
their conceptualization and relationship to consumption. Ecology Food Nutr. 11, 151-161.
191
ISBN 978-84-690-6060-5
SCREENING DE TCA EN VINOS TINTOS DE CRIANZA ESPAÑOLES
M. Luisa Copete(1), José Miguel Carot(2), M. Dolores Esteve(3), M. Dolores Climent(3), M. Rosario Salinas(1)*
(1) Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos. Universidad de Castilla – La Mancha. Avda. de España, s/n, E02071, Albacete (España). Tlf:
967599310. * [email protected]
(2) Departamento de Estadística e Investigación Operativa. Universidad Politécnica de Valencia. Camino de Vera s/n, E46022, Valencia (España).
(3) Departamento de Química. Universidad Politécnica de Valencia. Camino de Vera s/n, E46022, Valencia (España)
Resumen:
El 2,4,6-tricloroanisol (TCA) es el principal responsable del defecto de los vinos denominado “gusto a corcho” o “cork
taint”. Se pretende conocer el alcance de este problema en vinos tintos de crianza de las principales Denominaciones de Origen españolas, y su relación con el grado alcohólico, acidez, pH, precio y algunas características indicadas en las etiquetas.
Se encontró en el 6 % de los vinos, en concentraciones comprendidas entre 4,13–216,6 ng/L, especialmente en muestras con
grado alcohólico entre 13–13,9%, acidez entre 5–5,9 g/l y pH entre 3,2 y 3,6. La incidencia del problema fue menor en vinos
criados en madera de roble francés, de cosechas anteriores a 1995 y precios de venta superiores a 15 €.
Palabras clave: “gusto a corcho”, TCA, vino tinto, crianza.
1. INTRODUCCIÓN
192
Uno de los problemas más serios en el sector vinícola es el defecto organoléptico denominado “gusto a corcho”, “sabor a moho” o “cork taint”. Tradicionalmente se ha
considerado al tapón de corcho como el responsable del
mismo debido principalmente al uso del lavado con cloro de
la materia prima. El abandono en la actualidad de esta técnica no ha suprimido la aparición del problema, por lo que el
origen de las contaminaciones puede ser múltiple. Aunque
se han identificado diferentes moléculas implicadas en esta
alteración, son los halofenoles y haloanisoles los principales
responsables de transmitir ese desagradable aroma a los
vinos [1]. Los primeros, además de ser compuestos altamente tóxicos y muy utilizados como desinfectantes o fitosanitarios, son los precursores de los segundos [2]. De entre
todas las sustancias susceptibles de provocar esta anomalía
el más importante es el 2,4,6-tricloroanisol (TCA), compuesto
de bajo umbral de percepción olfativa (10 ng/L) que aparece
con más frecuencia en vinos con “gusto a corcho” [3]. A pesar
de su gran importancia, el conocimiento acerca de los mecanismos de su formación es más bien escaso. Algunas hipótesis la plantean a partir de la síntesis por catabolismo de
fenoles o de anisoles altamente clorados, pero la más aceptada es la basada en la biometilación a partir de clorofenoles
[4 y 5]. La formación de TCA a partir de su precursor (2,4,6triclorofenol), y en general la de los haloanisoles a partir de
los halofenoles, puede estar influida por el pH o el contenido
alcohólico del medio. Se sabe que pH elevados limitan la formación de pentaclorofenol y tetraclorofenol; o que el etanol
puede actuar en etapas de metilación bioquímica por su influencia en la desnaturalización de enzimas [6]. Con este trabajo se pretende: cuantificar TCA en vinos tintos de crianza
españoles, determinar el alcance real del problema y su distribución en la producción nacional, y conocer la relación
entre la presencia de este compuesto y los valores de pH,
acidez total y grado alcohólico de los vinos.
Se ha realizado un amplio estudio de determinación
y cuantificación de TCA en 600 vinos tintos de calidad, de las
categorías crianza, reserva y gran reserva, de las principales Denominaciones de Origen españolas. Para diseñar la
muestra se utilizaron datos de comercio interior, eligiendo las
cuatro D.O. mayoritarias (Rioja, Mancha, Ribera del Duero y
Valdepeñas), que representan el 74 % del total nacional. De
entre las D.O. minoritarias se intentó que todos los sectores
geográficos estuvieran representados, optando así por D.O.
Somontano, Penedés, Navarra, Jumilla y Valencia. Para cada
DO se adquirieron distintas marcas comerciales (según información de las bodegas, Consejos Reguladores y guías comerciales de vinos) y se analizaron tres botellas de cada una.
Para la identificación y cuantificación del TCA se ha
empleado el método propuesto por Zalacain et. al., (2004) [7]
consistente en una extracción mediante “stir bar sorptive extraction” (SBSE) y posterior análisis por cromatografía de
gases y espectrometría de masas. Esta nueva técnica se vale
de un agitador magnético recubierto de polidimetilsiolxano
que se comercializa como “twister” en donde quedan retenidos los compuestos volátiles del vino que después se liberan mediante desorción térmica. La identificación de TCA se
realizó usando la librería NIST del equipo utilizado y para su
cuantificación se emplearon gráficas de calibración construidas por dilución con vino sintético de una disolución del patrón comercial de TCA. También se ha determinado el grado
alcohólico, la acidez total y el pH según los Métodos Oficiales de Análisis (ECC, 1990) [8]. Para ampliar el trabajo y disponer de una mayor información se han tenido en cuenta los
datos indicados en las etiquetas de las botellas de vino, con-
ISBN 978-84-690-6060-5
siderando principalmente el año de cosecha, el tipo de madera de las barricas y el precio de venta al consumidor.
Los datos han sido procesados mediante el programa UNSCRAMBLER 9.2, empleando el método CART
(Classification And Regresión Trees, que es un algoritmo binario desarrollado por Breiman et al., (1984) [9]. CART divide
los datos en dos subconjuntos, de modo que los casos comprendidos dentro de cada uno de los subconjuntos sean más
homogéneos que en el subconjunto anterior. Es un proceso
recursivo que se repite hasta alcanzar el criterio de homogeneidad o hasta llegar a otro criterio de parada. La misma variable predictora puede ser usada varias veces en distintos
niveles del árbol.
3. RESULTADOS
En la Fig. 1 se muestra el árbol de decisión obtenido para el TCA en el que se relaciona su presencia con el
grado alcohólico, el pH y la acidez total de cada muestra.
Cada DO se ha identificado con una letra: Rioja (R), Mancha
(M), Ribera del Duero (D), Valdepeñas (V), Somontano (S),
Penedés (P), Navarra (N), Jumilla (J) y Valencia (L). Se han
establecido los siguientes grupos: Grado alcohólico (A): A1:
11–11,9 %; A2: 12–12,9 %; A3: 13–13,9 %; A4: 14–14,9 %.
pH: pH1: < 3,19; pH2: 3,2 – 3,39; pH3: 3,4 – 3,59; pH4: > 3,6.
Acidez Total (Ac): Ac1: 4 – 4,9; Ac2: 5 – 5,9; Ac3: 6 – 6,9; Ac4:
7 – 7,9.
Se ha detectado la presencia de TCA en el 6 % de
los vinos analizados, con unas concentraciones que se mueven en el intervalo 4,13 – 216,6 ng/L. El mayor número de
muestras contaminadas aparece en vinos con grado alcohólico entre 13 y 13,9 %, acidez total entre 5 y 5,9 g/l y pH entre
3,2 y 3,6; especialmente en Reservas y Grandes Reserva.
Por otro lado, los vinos criados en madera de roble francés,
procedentes de cosechas anteriores a 1995 y con precios de
venta superiores a 15 € fueron los que menos incidencia del
problema tuvieron. En ningún caso las tres botellas de la
misma marca de vino presentaron TCA. Únicamente en el 20
% de las muestras contaminadas eran dos de las tres botellas semejantes las que contenían este compuesto, pero en
concentraciones muy diferentes. En el restante 80 % de
casos encontrados, era una única botella del grupo de tres
en la que se podía cuantificar TCA.
4. CONCLUSIONES
La incidencia de este problema es diferente en las
D.O. estudiadas, destacando Jumilla como la única en la que
Fig. 1. Árbol de decisión relacionando la presencia de TCA con pH, acidez total y grado alcohólico de los vinos.
193
ISBN 978-84-690-6060-5
no se encontró TCA. En el 85 % de las muestras con presencia de este compuesto, la concentración estaba por encima de su umbral de percepción olfativa. El que en la
mayoría de los casos sólo una de las tres botellas de la
misma marca, tipo y características haya presentado TCA,
indica que la fuente de la contaminación no está en el proceso de elaboración del vino de una manera global, sino que
puede encontrarse en los materiales que entran en contacto
con cada fracción independiente de vino (madera, botellas o
tapones).
El “gusto a corcho” aparece en menor proporción
en vinos criados en barricas de roble francés con precios de
venta superiores a 15 €, pudiendo estar relacionado con una
mayor calidad de los medios empleados en la elaboración de
los mismos. Esta misma teoría puede servir para explicar por
qué el mayor número de vinos con presencia de TCA proceden de las cosechas posteriores a 1995. Fue en esta época
en la que hubo un gran auge de los vinos de crianza, y a falta
de materias primas de calidad o fácilmente disponibles, se
empezaron a emplear en muchos casos barricas o tapones
de corcho de una calidad reducida o tratados con productos
químicos que elevaron el nivel de contaminantes de estos y
que fueron transferidos a los caldos tras su contacto con
ellos.
Aunque no existe bibliografía que determine la relación entre contenido de TCA y pH o contenido alcohólico
de un vino, en este trabajo se ha observado que hay determinados intervalos de estos parámetros químicos en los que
aparecen un mayor número de muestras con presencia de
TCA. Sería objeto de otros estudios ahondar más en este
tema y analizar cómo repercuten estas características químicas del vino en los diferentes mecanismos de formación
del TCA.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. MAGA, J.A., (1978). Simple phenol and phenolic compounds in food flavour. Cri. Rev. Food Sci. 10, 323-372.
194
2. NICHOLSON, D.K., WOODS, S.L., ISTOK, J.D., PEEK,
D.C. 1992. Reductive dechlorination of chlorophenols
by a pentachlorophenol acclimated methanogenic
consortium. Appl. Environ. Microbiol. 58: 2280-2286.
3. CHATONNET, P.; BONNET, S. ; BOUTOU, S. ; LABADIE,
M. D. 2004. Identification and responsability of 2,4,6tribromoanisole in musty, corked odors in wine. J.
4. MAUJEAN, A., MILLERY, H., LEMARESQUIER, P. 1985.
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goût de bouchon et goût de moisi. Rev. Fr. Oenol. 99 :
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5. SILVA PEREIRA, C.; PIRES, A.; VALLE, M. J.; VILAS
BOAS, L.; FIGUEIREDO MARQUES, J. J.; SAN
ROMAO, M. V. 2000. Role of Chrysonilia sitophila in
quality of cork stoppers for sealing wine bottles. J.
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6. NOILET, O. 1996. Étude de l´évolution de la teneur du
liège en contaminats organo-chlorés au cours de la
fabrication des bouchons. Modèlisation au laboratoire-Transposition à líndustrie. Lab EXCELL. Université de Bordeaux.
7. ZALACAIN, A.; ALONSO, G. L.; LORENZO, C.; IÑIGUEZ,
M.; SALINAS, M. R. 2004. Stir bar sorptive extraction
for the analysis of wine cork taint. J. Chromatogr. A
1033, 173-178.
8. ECC. 1990. Commission Regulation VO 2676/1990
concerning to stablishment of common analytical methods in the sector of wine. Off J. Eur. Commun., L272
(3), 1-192.
9. BREIMAN,L., FRIEDMAN, J.H., OLSHEN, R.A., STONE,
C.J., 1984. Classification and regresión trees. Belmont, California: Wadsworth.
6. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de
Educación y Ciencia a través del proyecto AGL2004-04609.
ISBN 978-84-690-6060-5
ESTRATEGIAS PARA EL ANÁLISIS DE DATOS EN ESTUDIOS DE SCREENING EN
VINOS
Carot, J.M. (1) *; Copete, M.L (2); Esteve, M.D. (3); Climent, M.D. (3); Salinas, M.R. (2); Jabaloyes, J. (1)
* (1) Departamento de Estadística e Investigación Operativa. Universidad Politécnica de Valencia. Camino de Vera s/n E46022. Valencia, España.
(2). Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos. Universidad de Castilla-La Mancha. Avda España, s/n, E02071, Albacete. España.
Resumen:
(3) Departamento de Química. Universidad Politécnica de Valencia. Camino de Vera s/n E46022. Valencia, España.
En estudios de screening, en los que se diseña y realizan muestreos probabilísticos para estimar los valores de unas
pocas variables respuesta, es frecuente que el análisis de datos consista únicamente en el cálculo de estimaciones de esos parámetros y de su variabilidad. Algunos problemas que suelen aparecer en este tipo de estudios son el número reducido de
muestras que puede estudiarse en los estudios preliminares y la aparición de interacciones de orden elevado entre los factores que pueden afectar a las variables respuesta; estas situaciones dificultan el cálculo de estimaciones fiables de los parámetros
objetivo. En este trabajo, se explora la efectividad de varias técnicas de análisis multivariante para extraer la máxima información de los datos observados, determinando grupos homogéneos de muestras que permitan rediseñar nuevos planes de muestreo para poder calcular secuencialmente estimaciones más precisas de los parámetros estudiados. Entre las herramientas de
análisis de datos cabe destacar por su eficiencia las técnicas de árboles de decisión basados. En este estudio se ha planteado
un screening para determinar los niveles de halofenoles y haloanisoles en vinos de crianza españoles.
Palabras clave: TCA, vino tinto, muestreo, árboles de decisión,
1. INTRODUCCIÓN
Cuando se realizan muestreos probabilísticos destinados a realizar estudios de screening para estimar los valores de unas pocas variables respuesta, es frecuente que el
análisis de datos consista únicamente en el cálculo de estimaciones de esos parámetros y de su variabilidad. En este
tipo de estudios es de gran interés la determinación de dónde
se producen diferencias significativas y por supuesto de qué
orden de magnitud son. Sin embargo, para ello es necesario
plantear contrastes estadísticos que requieren el cumplimento razonable de ciertas hipótesis de partida. Algunos problemas que suelen aparecer en este tipo de estudios son el
número reducido de muestras que puede estudiarse en los
estudios preliminares y la aparición de interacciones de orden
elevado entre los factores que pueden afectar a las variables
respuesta; estas situaciones dificultan el cálculo de estimaciones fiables de los parámetros objetivo.
En este trabajo se presenta la metodología estadística empleada para analizar los niveles de halofenoles y
haloanisoles en vino, sustancias relacionadas con el defecto
organoléptico denominado “gusto a corcho”, “sabor a moho”
o “cork taint”. Este es uno de los problemas más serios en el
sector vinícola. Tradicionalmente se ha considerado al tapón
de corcho como el responsable del mismo debido principalmente al uso del lavado con cloro de la materia prima. El
abandono en la actualidad de esta técnica no ha suprimido la
aparición del problema, por lo que el origen de las contaminaciones puede ser múltiple. Aunque se han identificado diferentes moléculas implicadas en esta alteración, son los
halofenoles y haloanisoles los principales responsables de
transmitir ese desagradable aroma a los vinos [1]. Los primeros, además de ser compuestos altamente tóxicos y muy
utilizados como desinfectantes o fitosanitarios, son los precursores de los segundos [2]. De entre todas las sustancias
susceptibles de provocar esta anomalía el más importante es
el 2,4,6-tricloroanisol (TCA), compuesto de bajo umbral de
percepción olfativa (10 ng/L) que aparece con más frecuencia en vinos con “gusto a corcho” [3].
Para la estimación de los niveles de TCA en vinos
españoles se ha realizado un estudio de screening. En este
trabajo, se presenta la metodología empleada para el análisis estadístico de los datos obtenidos.
Se diseño un muestreo para la cuantificación de
TCA en vinos tintos de calidad, de las categorías crianza, reserva y gran reserva, de las principales Denominaciones de
Origen españolas. Para diseñar la muestra se utilizaron datos
de comercio interior, eligiendo las cuatro D.O. mayoritarias
(Rioja, Mancha, Ribera del Duero y Valdepeñas), que representan el 74 % del total nacional. De entre las D.O. minoritarias se intentó que todos los sectores geográficos estuvieran
representados, optando así por D.O. Somontano, Penedés,
Navarra, Jumilla y Valencia. Para cada DO se adquirieron distintas marcas comerciales (según información de las bodegas, Consejos Reguladores y guías comerciales de vinos) y
se analizaron tres botellas de cada una. Se utilizó un muestreo estratificado por D.O. y categoría (crianza, reserva y
gran reserva) con afijación proporcional con un tamaño
muestral de 600 vinos. Debido a la dificultad en obtención de
195
ISBN 978-84-690-6060-5
muestras en algunos casos se planteo una ponderación posterior para ajustar los tamaños muestrales a los poblacionales.
Los datos se procesaron con el programa Answer
Tree 3.0, SPSS 14 y Unscrambler 9.0. El método utilizado fue
el método CART (Classification And Regresion Trees); que
es un algoritmo binario desarrollado por Breiman et al., (1984)
[4]. CART divide los datos en dos subconjuntos, de modo que
los casos comprendidos dentro de cada uno de los subconjuntos sean más homogéneos que en el subconjunto anterior. Es un proceso recursivo que se repite hasta alcanzar el
criterio de homogeneidad o hasta llegar a otro criterio de parada. La misma variable predictora puede ser usada varias
veces en distintos niveles del árbol.
3. RESULTADOS
Los análisis paramétricos de evaluación de diferencias significativas no han proporcionado resultados satisfactorios debido a varios motivos: en primer lugar no cumplen
las hipótesis previas que se exige a este tipo de datos (normalidad, homocedasticidad y linealidad); además el número
de muestras es pequeño en algunos casos lo que hace que
sea imposible en ocasiones estimar con fiabilidad si existe o
no diferencias significativas; finalmente la aparición de interacciones de orden elevado dificulta la aplicación de este tipo
de métodos.
Para el análisis se ha recurrido a una técnica basada en métodos no paramétricos. La técnica utilizada es el
método Classification and regresion trees (CART) que es un
algoritmo que permite trabajar con las condiciones expuestas anteriormente. En nuestro caso, después de realizar el
muestreo y ponderar adecuadamente los datos se ha sometido a este método, que secuencialmente busca grupos homogéneos entre los que haya diferencias significativas y
dentro de los cuales los elementos que se encuentren no presenten diferencias significativas. Se utilizó como variable respuesta los valores halofenoles y haloanisoles (TCA, TeCA,
PCA, TCP, Teca y TBA). Como variables explicativas las siguientes: DO, categoría, precio, cosecha, precio, madera, pH,
acidez y alcohol.
Como características del método se han utilizado
un número máximo de 10 ramificaciones, con 5 elementos
para desarrollo en el nodo filial y parental y una validación
cruzada de 10 grupos.
En la Figura 1 se muestra uno de los árboles obtenidos para los niveles de TCA en vinos españoles mediante
el método CART.
Figura 1. Árbol de decisión para evaluar niveles de TCA.
196
ISBN 978-84-690-6060-5
4. CONCLUSIONES
La técnica de árboles de decisión mediante el método CART se ha mostrado muy adecuada y eficiente en estudios de screening, frente a otras técnicas paramétricas clásicas. En particular se ha utilizado con eficacia en un estudio de
evaluación de halofenoles y haloanisoles en vinos españoles.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. MAGA, J.A., (1978). Simple phenol and phenolic compounds in food flavour. Cri. Rev. Food Sci. 10, 323-372.
2. NICHOLSON, D.K., WOODS, S.L., ISTOK, J.D., PEEK,
D.C. 1992. Reductive dechlorination of chlorophenols
by a pentachlorophenol acclimated methanogenic
consortium. Appl. Environ. Microbiol. 58: 2280-2286.
3. CHATONNET, P.; BONNET, S. ; BOUTOU, S. ; LABADIE,
M. D. 2004. Identification and responsability of 2,4,6tribromoanisole in musty, corked odors in wine. J.
4. BREIMAN, L., FRIEDMAN, J.H., OLSHEN, R.A., STONE,
C.J., 1984. Classification and regresión trees. Belmont,
California: Wadsworth.
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ISBN 978-84-690-6060-5
ESTUDIO PRELIMINAR DE LA PRESENCIA DE 4-ETILFENOL EN VINOS TINTOS DE
CRIANZA ESPAÑOLES
Teresa Garde(1), Amaya Zalacain(1), Cándida Lorenzo(1), Gonzalo L. Alonso(1), M. Dolores Climent(2),
M. Dolores Esteve(2), M. Rosario Salinas(1)
(1) Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos. Universidad de Castilla – La Mancha. Avda. de España, s/n, E02071, Albacete (España). Tlf:
967599310. * [email protected]
(2) Departamento de Estadística e Investigación Operativa. Universidad Politécnica de Valencia. Camino de Vera s/n, E46022, Valencia (España).
Resumen:
En este trabajo se estudió la presencia de 4-etilfenol en vinos tintos de crianza de las denominaciones de origen con
mayores ventas en el mercado (Rioja, La Mancha, Ribera del Duero, Valdepeñas). Los resultados mostraron que sólo en 5
vinos, de 65 analizados, no se detectó 4-etilfenol. En el resto de vinos, la presencia de este compuesto presentó gran variabilidad. Los vinos con mayor contenido de 4-etilfenol tenían grados alcohólicos de 12,5 y 13, aunque no se encontró correlación
entre ambos parámetros. Tampoco se observó relación entre el pH del vino y su contenido en 4-etilfenol.
Palabras clave: envejecimiento en barricas, calidad del vino, denominaciones de origen españolas.
1. INTRODUCCIÓN
El 4-etilfenol es un compuesto que se forma a partir del ácido p-cumárico mediante transformaciones microbiológicas llevadas a cabo por levaduras contaminantes
Brettanomyces/Dekkera [1]. En los vinos envejecidos en barricas, principalmente cuando éstas han sido usadas varias
veces, puede formarse 4-etilfenol, compuesto indeseable
para la calidad del vino ya que le puede aportar olores desagradables. Brettanomyces es una levadura de crecimiento
lento, por lo que la alteración se presenta principalmente durante la crianza del vino. En las barricas de roble, este microorganismo tiene a su disposición el sustrato y el tiempo
suficiente para realizar su actividad. La naturaleza porosa de
la madera y su difícil limpieza contribuyen a que las poblaciones existentes se mantengan incluso después del lavado
de la barrica. El aroma asociado a este compuesto en los
vinos tintos se describe como a establo, a cuero, medicinal y
a sudor de caballo [2]. La formación de 4-etilfenol es un serio
problema económico, especialmente en vinos de calidad que
requieren largos envejecimientos en barricas de roble. Por
ello, el objetivo de este trabajo fue estudiar la presencia de 4etilfenol en vinos tintos de crianza españoles. Para ello se
analizaron 195 botellas de vino, correspondientes a 65 vinos
diferentes, de las cuatro denominaciones de origen españolas con mayores ventas en el mercado (Rioja, La Mancha,
Ribera del Duero y Valdepeñas).
La adquisición de los vinos se llevó a cabo en grandes superficies. Para este estudio se compraron tres botellas
correspondientes a tres lotes diferentes de un mismo vino. El
198
número total de botellas adquiridas fue de 195, que correspondieron a 65 vinos tintos de crianza diferentes (Tabla 1).
Para la determinación del 4-etilfenol se empleó el método
propuesto por Marín et al. [3] que consiste en una extracción
mediante “stir bar sorptive extraction” (SBSE) y posterior análisis por cromatografía de gases y espectrometría de masas
(GC-MS). También se determinaron el grado alcohólico y el
pH de los vinos [4].
De los 65 vinos estudiados, tan sólo en 5 de ellos no
hubo presencia de 4-etilfenol (Tabla 1). La única denominación de origen en la que se detectó este compuesto en todos
sus vinos fue la de Ribera del Duero. Para las denominaciones de origen Rioja y La Mancha, el número de vinos con
presencia de 4-etilfenol inferior a la media total fue el doble
que los que presentaron presencia superior a la media total.
En los vinos de Valdepeñas, la presencia de este compuesto
fue siempre inferior a la media (Tabla 1). La presencia de 4etilfenol en los vinos tintos de crianza estudiados presentó
gran variabilidad (Tabla 2). La media de las áreas relativas,
respecto al estándar interno, de este compuesto fue de 1,5 ±
1,3. Por comparación con datos obtenidos en otros análisis
de 4-etilfenol llevados a cabo en nuestro laboratorio, se
puede decir que este área pudo corresponder a una concentración por encima del umbral de percepción del 4-etilfenol
en vinos tintos (620 µg/l) [1]. Este resultado coincide con lo
encontrado por Pollnitz et al. [5] en un muestreo de 61 vinos
tintos australianos. Los vinos de Ribera del Duero fueron los
que presentaron una media mayor, seguidos por los vinos de
Rioja (Tabla 2).
ISBN 978-84-690-6060-5
Tabla 1. Número de vinos de crianza analizados (entre paréntesis se muestra el número de botellas) y presencia de 4-etilfenol
en los vinos de las 4 denominaciones de origen estudiadas.
Se analizaron 3 botellas pertenecientes a lotes diferentes de cada uno de los 65 vinos a estudio (n = 195).
Tabla 2. Media del área relativa del 4-etilfenol obtenida en
el análisis cromatográfico de los vinos de crianza de las diferentes denominaciones de origen estudiadas.
En este trabajo también se estudió la relación entre
la presencia de 4-etilfenol y dos parámetros enológicos muy
importantes en el vino, como son el grado alcohólico y el pH.
Estos parámetros pueden influir en la síntesis de 4-etilfenol
por las levaduras Brettanomyces/Dekkera [6, 7]. Los vinos
con mayor presencia de este compuesto tenían grados alcohólicos de 12,5 y 13, si bien no se encontró correlación entre
ambos parámetros (Figura 1a). Aunque cabría esperar una
relación inversa entre la presencia de este compuesto y el
grado alcohólico del vino, ya que el etanol inhibe el crecimiento de estas levaduras contaminantes [7], otros factores
importantes, como el número de usos de las barricas [6] y la
concentración de su ácido precursor, que presenta gran variabilidad de concentraciones en función de la variedad uva
empleada [8], también pueden contribuir de forma decisiva a
la formación de este compuesto durante el envejecimiento
del vino. No se observó ninguna correlación entre el pH de los
vinos tintos estudiados y la presencia de 4-etilfenol (Figura
1b), probablemente debido a lo anteriormente explicado para
el etanol. Ortega-Heras et al. [8] tampoco observaron correlación entre el grado alcohólico y el pH y la presencia de 4etilfenol en vinos envejecidos en barricas de roble.
4. CONCLUSIONES
El 4-etilfenol se detectó en 60 de los 65 vinos estudiados, es decir, en 180 de las 195 botellas analizadas, por lo
que puede decirse que este compuesto estuvo presente en la
inmensa mayoría de los vinos tintos de crianza de las denominaciones de origen estudiadas. Aunque la presencia de
este compuesto en los vinos mostró gran diversidad, la media
podría corresponder a una concentración por encima del umbral de percepción del 4-etilfenol en vinos tintos, por lo que
este compuesto pudo contribuir de forma negativa en la calidad de los vinos. Por otro lado, no se observaron correlaciones entre el grado alcohólico y el pH y la presencia de
4-etilfenol en los vinos, si bien los vinos con grados alcohólicos de 12,5 y 13 fueron los que mostraron mayor presencia
de este compuesto. Consecuentemente, habría que hacer un
esfuerzo para intentar reducir la presencia de 4-etilfenol en
los vinos tintos de crianza españoles.
5. BIBLIOGRAFÍA
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200
Dekkera bruxellensis in enological conditions. Food
8. ORTEGA-HERAS, M.; GONZÁLEZ-SANJOSÉ, M. L.;
GONZÁLEZ-HUERTA, C. 2007. Consideration of the influence of aging process, type of wine and oenological classic parameters on the levels of wood volatile
compounds present in red wines. Food Chem. en
prensa.
6. AGRADECIMIENTOS
Deseamos agradecer al Ministerio de Educación y
Ciencia la financiación del proyecto AGL2004-04609.
ISBN 978-84-690-6060-5
SEGUIMIENTO Y AUTOMATIZACIÓN DE LOS PARÁMETROS ANALÍTICOS DE
INTERÉS EN LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
Isabel López Infante 1, Juan Fernández Novales1, José Morales Ordóñez1, Pilar Ramírez Pérez1, Virginia
González Caballero1 y José Antonio García Mesa2
IFAPA. Instituto de Investigación y Formación Agraria y Pesquera
1
Centro de Cabra. Antigua Ctra. Cabra-Dª Mencía km 2,5 14940 Cabra. Córdoba. Tlf: 957596645
e-mail: [email protected]
2
Resumen:
Centro Venta del Llano. Ctra. Bailén-Motril km 18,5 23620 Mengíbar. Jaén
El objetivo principal de este trabajo es el de automatizar el control de la fermentación a través de un sistema de flujo
que nos va a permitir obtener medidas directas de los parámetros: azucares reductores, masa volúmica, IPT y color.
La instrumentación empleada consiste en un espectrofotómetro portátil UV-Vis-NIR con un rango de longitudes de
onda desde 200 a 1100 nm y una bomba peristáltica. Las muestras en ensayo son directamente introducidas en el detector por
el sistema de bombeo tras una simple filtración.
Los coeficientes de regresión obtenidos al comparar los métodos oficiales con la tecnología NIR aplicada a la determinación de los citados parámetros son bastante elevados, lo que nos permite avanzar las posibilidades reales de esta técnica
en el control de la fermentación alcohólica de los vinos.
Palabras Clave: vino, Fermentación, Espectroscopia infrarroja cercana, PCR.
1. INTRODUCCIÓN
El parámetro de control fundamental durante la fermentación alcohólica de vinos blancos es la densidad o masa
volúmica del mosto. En los vinos tintos, además, es necesario conocer el contenido en polifenoles totales (IPT) y el grado
de extracción de la materia colorante.
Durante la vendimia es habitual que el laboratorio
de control se vea desbordado por el gran número de muestras que es necesario analizar en un corto espacio de tiempo,
por lo que la reducción del tiempo y la automatización de
estas determinaciones serían de gran ayuda para el sector.
En este trabajo se han desarrollado diversas metodologías, basadas en técnicas espectroscópicas, que permiten determinar diferentes parámetros tales como: masa
volúmica, concentración en azúcares reductores, IPT y color.
Los métodos desarrollados no requieren ninguna
preparación de la muestra (salvo una filtración), eliminándose
las etapas de toma de muestra, dilución, lectura de absorbancias, etc. habituales en los métodos convencionales. De
esta forma se eliminan los errores asociados a dichas operaciones previas, se reduce el tiempo de análisis y se automatiza el proceso analítico, reduciéndose por tanto el coste
de dichos análisis.
Las muestras que se han utilizado en este trabajo
proceden de los distintos proyectos de viticultura y enología
desarrollados en el IFAPA Centro de Cabra durante la campaña 2006-2007.
Durante la vendimia 2006 hemos podido hacer seguimientos continuos y parciales de fermentaciones comparando los diferentes equipos de medida en la determinación
de azúcares reductores, masa volúmica, IPT y color.
La instrumentación empleada consiste en un
espectrofotómetro portátil UV-Vis-NIR con un rango de longitudes de onda desde 200 a 1100 nm y una bomba peristáltica. Las muestras en ensayo son directamente introducidas en el detector por el sistema de bombeo tras una simple filtración.
Se trata de un equipo de bajo coste, constituido por
los siguientes elementos; fuente de luz, cable óptico de fibra
de vidrio, bomba peristáltica, cubetas de flujo de cuarzo de diferentes pasos de luz, ordenador para la recogida de datos y
un software para su procesado, tal como se muestra en la
Fig. 1.
Los equipos utilizados en el desarrollo del trabajo
para las determinaciones oficiales de IPT, Color, y Azúcares
reductores, son un espectrofotómetro Thermo Electro Corporation, Helios-a UV-visible y un titrador automático CRISON TT2050.
La Metodología utilizada fue: Azúcares Reductores
(Rebelein, 1974), Color (Glories, 1978), Índice de Polifenoles Totales (Riberau Gayón, 1970) y Masa Volúmica
(D.O.C.E., 1990).
3. RESULTADOS
El objetivo principal de este trabajo como ya se ha
comentado anteriormente es el de automatizar el control de
la fermentación a través de un sistema de flujo que nos va a
201
ISBN 978-84-690-6060-5
Fig. 1. Equipo Nir Automatizado
Fig. 4. Determinación del IPT
Fig. 5. Determinación del Color
permitir obtener medidas directas de los parámetros; azúcares reductores, masa volúmica, IPT y color.
Esta automatización se va a traducir en una mejora
tanto en la calidad del producto, como en la rapidez de la determinación y finalmente en una reducción de costes.
Los coeficientes de regresión obtenidos al comparar los métodos oficiales con el método propuesto durante la
fermentación alcohólica en las determinaciones de los parámetros de IPT y Color son los que mostramos en las Fig. 2 y
3.
202
Fig. 2. Determinación del IPT
Fig. 6. Modelo de Predicción de Masa volúmica
Fig. 3. Determinación del Color
Fig. 7. Modelo de Predicción de Azucares reductores
ISBN 978-84-690-6060-5
Para la determinación de la masa volúmica y el contenido en azúcares reductores se creó un modelo con Unscrambler mediante Regresión por componentes Principales
(PCR). La Fig. 6. y la Fig. 7 reflejan los modelos de predicción
obtenidos para la masa volúmica y los azucares reductores
durante la fermentación alcohólica.
En la tabla 1 y la tabla 2 se comparan los valores
predichos con estos modelos con los valores de referencia.
4. CONCLUSIONES
Los coeficientes de regresión obtenidos al comparar los métodos oficiales con la tecnología NIR aplicada a la
determinación de los citados parámetros son bastante elevados, lo que nos permite avanzar en las posibilidades reales de esta técnica en el control de la fermentación alcohólica
de los vinos.
Las metodologías desarrolladas se han aplicado al
seguimiento de fermentación en condiciones reales de trabajo, permitiendo una monitorización del proceso de fermentación de forma sencilla, rápida y eficaz, siendo los resultados
obtenidos plenamente coincidentes con los correspondientes
a los métodos convencionales.
Tabla 1. Valores del Modelo de
Predicción de Masa volúmica
5. BIBLIOGRAFÍA
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JUAN, PM Y COL. 2004. “Near infrared reflectance,
spectroscopy and multivariate analysis in Enology Determination or screening of fifteen parameters in
different types of wines”. Analytica Chimica Acta 527
(1): 81 - 88.
Tabla 2. Valores del Modelo de
Predicción de Az. Reductores
203
ISBN 978-84-690-6060-5
ESTUDIO DE DIFERENTES MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE
MERCAPTANOS POLIFUNCIONALES, A NIVEL DE NG L-1, BASADOS EN SU
DERIVATIZACIÓN CON PFBBR Y SU POSTERIOR DETECCIÓN MEDIANTE GC-MS-NICI
Laura Mateo Vivaracho1, Juan Cacho1, Vicente Ferreira1
1
Laboratorio de Análisis del Aroma y Enología, Facultad de Ciencias, Universidad de Zaragoza, C/ Pedro Cerbuna 12, 50009, Zaragoza.
[email protected]
Resumen:
Se han desarrollado diferentes métodos rápidos para la determinación en vino de tioles polifuncionales, cuyo aroma
es importante a niveles de ng l-1. Dichos métodos se basan en la formación de sus pentafluorobencil-derivados en presencia
de un álcali fuerte y añadiendo pequeñas cantidades de bromuro de pentafluorobencilo (PFBBr). En todos los casos se utiliza
un volumen pequeño de vino. Los métodos que se describen se diferencian en el medio en que se realiza la reacción de derivatización: microextracción en fase sólida (SPME), reacción en medio líquido o extracción en fase sólida (SPE). Los derivados
son detectados mediante espectrometría de masas utilizando la ionización química de iones negativos (NICI-MS). El objetivo
de los métodos es la determinación simultánea de 2-metil-3-furantiol –MF-, 2-furfuriltiol -FFT-, 4-mercapto-4-metil-2pentanona –MP-, acetato de 3-mercaptohexilo -MHA- y 3-mercaptohexanol -MH. Los límites de detección fueron del orden del
ng l-1, todos ellos por debajo de los umbrales de olfacción de estos compuestos. Tanto la repetitibilidad de los métodos (10%<
RSD< el 17%) como la linealidad (0.98< R2<0.999) son satisfactorias.
Palabras clave: tioles, mercaptanos, bromuro de pentafluorobencilo, aroma, GC-NCI-MS.
1. INTRODUCCIÓN
Los mercaptanos polifuncionales MF, FFT, MP, MHA
y MH son aromas muy potentes responsables de las características sensoriales de numerosos productos, tales como el
café, la fruta de la pasión, el mango y algunos vinos.
Tanto la inestabilidad de estos compuestos, como
sus pobres propiedades espectrométricas y cromatográficas,
hacen que se hayan descrito pocos métodos para su cuantificación. Los métodos descritos hasta el momento se basan
en el acomplejamiento selectivo de la función tiol con mercurio orgánico [1-3], o en la derivatización de dicho grupo con
4-vinilpiridina [4].
Los pentafluorobencil-derivados se pueden determinar, selectivamente y con gran sensibilidad, mediante GCMS utilizando la ionización química de iones negativos (NICI).
Está propiedad es la que se explota en el presente trabajo
para desarrollar potentes métodos analíticos.
El objetivo de este trabajo es el desarrollo de estrategias de derivatización con PFBBr (estudio de formatos, medios de reacción y condiciones) que permitan la
determinación cuantitativa de mercaptanos a niveles de ultratraza en matrices complejas.
2.1. Microextracción en fase sólida (SPME) [5]
204
Se utiliza una fibra de PDMS-DVB de 65 µm de espesor de fase. Se trabaja con viales sellados de 20 ml. La
fibra se expone 5 min a los vapores de 10 ml de tributilamina,
5 min a los vapores de una disolución acuosa con un 10% de
acetona de 200 ppm de PFBBr y finalmente 10 min a los va-
pores de 10 ml de vino que contienen 0.05 g de EDTA. Los
procesos de extracción se realizan a 55 ºC y agitación de 250
rpm. La fibra con los derivados formados, se desorbe en splitless durante 2 min a 275 ºC y los analitos derivatizados se
cuantifican mediante GC-MS-NICI en un cromatógrafo de
gases Shimadzu QP-2010.
2.2. Reacción en medio líquido [6]
Seis ml de vino se extraen con 1.5 ml de benceno
que contienen 4 estándares internos. En este extracto se forman los pentafluorobencil-derivados de los mercaptanos añadiendo pequeñas cantidades de PFBBr (100 mg l-1) y de un
álcali fuerte: diazabicyclo 1.8 [5.4.0] undec-7-ene (DBU). Después de lavar el producto de la reacción con una disolución
agua: metanol (5:1), 0.5 M en HCl, se inyectan directamente
en un cromatógrafo de gases 20 µl del extracto obtenido. Los
derivados son detectados mediante GC-MS-NICI.
2.3. Extracción en fase sólida
En un cartucho de 50 mg de resinas Bond Elut ENV
de Varian, se cargan 6 ml de vino. A continuación se añaden
4 ml de una disolución de fosfato 0.2 M con 40 % MeOH y pH
7.7 para eliminar los componentes volátiles mayoritarios en el
vino. Los derivados se forman en el cartucho añadiendo 1 ml
de disolución de DBU en agua al 6.7 % y 50 µl de una disolución de 2000 ppm de PFBBr en hexano. Se deja que la reacción transcurra durante 20 min a temperatura ambiente.
Pasado este tiempo se añaden 100 µl de una disolución de
2000 ppm de tioglicerol en DBU acuosa del 6.7 %, para eliminar el exceso de reactivo; de nuevo se deja que la reacción
transcurra durante 20 min a temperatura ambiente. Pasado
ISBN 978-84-690-6060-5
este tiempo y antes de eluir se lava el cartucho con 4 ml de
una disolución de ácido fosfórico 0.2 M con 40 % MeOH. Los
PFB-derivados se eluyen con 600 µl de hexano con un 25 %
de dietil-éter. Se analizan los derivados inyectando 2 µl en
splitless en el sistema de GC-MS-NICI.
3. RESULTADOS
3.1. SPME
Se ha conseguido un método totalmente automático para el análisis de FFT y MHA, dos de los compuestos
clave en el aroma de numerosos productos. Con este método se pone de manifiesto que el proceso automático de derivatización en la fibra de SPME, es una alternativa muy
competitiva para el análisis de analitos inestables que se encuentran en muy bajas concentraciones, sin embargo, todavía son necesarios más estudios para entender los
mecanismos de reacción y el comportamiento de la fibra, ya
que no ha sido posible obtener resultados satisfactorios para
todos los analitos.
La repetitividad del método, expresada como desviación estándar relativa, se encuentra entre el 10 y el 20 %
para niveles altos y bajos de concentración, respectivamente.
Estos valores son satisfactorios teniendo en cuenta que trabajamos a niveles de partes por trillón.
Los límites de detección y cuantificación son 0,3 y 1
ppt, respectivamente, para el FFT, mientras que para el acetato MHA, toman valores de 3 y 10 ppt.
El rango lineal del método se extiende poco más de
un orden de magnitud, pero afortunadamente cubre las concentraciones que cabe esperar para estos analitos en vino.
En cuanto a la calibración, se realizó en base a diferentes estándares internos. El uso de dichos estándares no
permite hacer las calibraciones empleando vino sintético,
pero sí empleando vinos fortificados.
3.2. Reacción en medio líquido.
Se observó que el disolvente influye de forma significativa en el rendimiento de la reacción, tal y como se puede
ver en la Figura 1. También resulta fundamental la presencia
de un álcali fuerte para que se produzca la reacción de forma-
ción de los derivados en presencia de pequeñas cantidades
de reactivo. Los mejores resultados se obtuvieron con DBU.
El método permite determinar simultáneamente
FFT, MP, MHA, MH. Para el MF no se obtuvieron resultados
consistentes. Los límites de detección fueron 0.5 (FFT), 0.1
(MP), 0.6 (MHA) y 7 (MH) ng l-1, todos ellos por debajo de los
umbrales de olfacción de estos compuestos. Tanto la repetitibilidad del método (10%< RSD< el 17%) como la linealidad
(0.98< R2<0.999) son satisfactorias. El rango lineal es mayor
de 2 órdenes de magnitud, de modo que se cubre ampliamente el rango en el que estos compuestos se encuentran
en el vino. Las pendientes de las rectas de adición estándar
construidas para diferentes vinos fueron muy similares.
Sin embargo, la aplicación de este método resulta
problemática a medio plazo, debido al estrés sufrido por el
sistema cromatográfico como consecuencia de la presencia
de reactivo sin derivatizar.
3.3. SPE
El método permite determinar simultáneamente MF,
FFT, MP, MHA, MH. Los límites de detección fueron del nivel
de ng l-1, para todos ellos por debajo de los umbrales de olfacción de estos compuestos. Tanto la repetitibilidad del método (5%< RSD< el 20%) como la linealidad (0.97< R2<0.999)
son satisfactorias.
La ventaja de este método es que permite estabilizar la matriz y eliminar el reactivo en exceso, lo que garantiza
una mayor estabilidad y robustez del sistema a medio plazo.
4. CONCLUSIONES
La utilización de PFBBr como reactivo derivatizante
permite la formación de derivados que se pueden detectar de
forma selectiva y con una gran sensibilidad mediante GC-MSNICI. Los métodos desarrollados buscan el obtener una
buena señal para cada uno de los analitos mediante un procedimiento fácil y en el que la manipulación de la muestra
sea mínima, puesto que estamos trabajando a nivel de ultratrazas con compuestos inestables, elusivos y fácilmente
acomplejables.
En la siguiente tabla se puede ver una comparativa
de los diferentes métodos descritos.
Fig. 1. Efecto del disolvente en el rendimiento relativo de la reacción.
205
ISBN 978-84-690-6060-5
Tabla 1. Comparativa de los métodos basados en la derivatización con PFBBr.
5. BIBLIOGRAFÍA
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chromatography-negative ion mass spectrometric
analysis of their pentafluorobenzyl derivatives. J.
Chromatogr. A. 1146(2): p. 242-250.
ISBN 978-84-690-6060-5
ESTUDIO COMPARATIVO DEL CONSUMO DE AMINOÁCIDOS Y AMONIO EN
ACETIFICACIONES CON CULTIVO SUPERFICIAL Y AMONIO EN ACETIFICACIONES
CON CULTIVO SUPERFICIAL Y SUMERGIDO
Raquel Mª Callejón1, Wendu Tesfaye1, Mª Jesús Torija2, Albert Mas2, Ana Mª Troncoso1,
Mª Lourdes Morales1
1
Área de Nutrición y Bromatología. Facultad de Farmacia. Universidad de Sevilla. Tfno: 954556761.
2
Resumen:
[email protected]
Departamento de Bioquímica y Biotecnología. Facultad de Enología. Universitat Rovira i Virgili.
Se han estudiado los cambios en el contenido de aminoácidos y amonio durante diferentes procesos de acetificación
de tres vinos tintos mediante cultivo superficial y cultivo sumergido (8 acetificaciones superficiales y 3 sumergidas). Se tomaron muestras al inicio y al final de las mismas.
La determinación de aminoácidos y amonio se realizó por CLAE-fluorescencia empleando AQC como agente de derivatización precolumna. Este método, validado satisfactoriamente, demostró su utilidad para el análisis rutinario de dichos compuestos durante la acetificación.
Los resultados mostraron que al inicio de la acetificación el aminoácido más abundante fue prolina seguido de arginina. Se observó un comportamiento diferente entre los dos métodos de acetificación, siendo mucho menor el consumo de
aminoácidos en la acetificación sumergida que en la superficial. En esta última, el más consumido fue la prolina, siendo la arginina la principal fuente de nitrógeno en los sistemas sumergidos, lo cual parece estar relacionado con la especie de bacterias acéticas implicadas en el proceso. Además, parece existir cierta correlación entre requerimiento de nitrógeno de estas
bacterias y duración del proceso de acetificación.
Palabras clave: vinagre de vino, aminoácidos, AQC, vino, bacteria acética.
1. INTRODUCCIÓN
La conversión del vino en vinagre se lleva a cabo
por las bacterias acéticas, las cuales se sitúan bien en la superficie o sumergidas en el líquido a acetificar [1]. Las bacterias acéticas son microorganismos aerobios y utilizan como
fuente de nitrógeno los aminoácidos presentes en el medio
[2,3]. Estos compuestos, son precursores de compuestos
aromáticos [4] y de aminas biógenas [5].
El consumo de nitrógeno y de aminoácidos durante
la fermentación alcohólica ha sido estudiado [6-9], pero sin
embargo existen pocos trabajos sobre este tema en la fermentación acética [3].
El objetivo de este trabajo es usar el 6-AminoquinolilN-Hidroxisuccinimidil Carbamato (AQC) como agente derivatizante para la determinación de aminoácidos durante los procesos de acetificación. Este agente reacciona con aminoácidos
primarios y secundarios produciendo derivados estables y altamente fluorescentes. Además el exceso de reactivo se hidroliza durante la reacción de derivatización evitando interferencias
[10]. Asimismo se pretende conocer los diferentes requerimientos de estos compuestos para las bacterias acéticas tanto
en los métodos superficiales como en los sumergidos.
2.1. Muestras
Se han seguido tres acetificaciones sumergidas llevadas a cabo en un fermentador a escala de laboratorio y
nueve acetificaciones superficiales obtenidas en barriles (60
L de capacidad) de diferentes maderas. Como material de
partida se ha empleado tres vinos tintos. Las muestras se tomaron al inicio y al final de la acetificación (6-7 grados acéticos), resultando un total de 22 muestras.
2.2. Derivatización y análisis por CLAE
Para la derivatización de los 22 aminoácidos y amonio estudiados en este trabajo se utilizó el kit “AccQ-Fluor”
(Waters, USA), siguiendo las instrucciones del mismo.
El análisis por CLAE se llevó a cabo en un equipo
Waters conectado a un detector de fluorescencia, empleando
una lex de 250 nm y una lem de 395 nm. El volumen de inyección fue 20 mL, el flujo 1 mL/min, a 34ºC y se empleó un
gradiente cuaternario.
3. RESULTADOS
El nitrógeno total fue evaluado considerando conjuntamente el nitrógeno aportado por los aminoácidos libres
y el procedente del amonio. Con respecto a la acetificación
superficial, se observaron consumos de nitrógeno muy variables, constatándose descensos entre el 41 y 23%, que
pueden ser debidos a los diferentes tiempos invertidos en las
acetificaciones. En las acetificaciones con cultivo sumergido,
el descenso medio del nitrógeno fue de 2.9%, por tanto, las
demandas de éste son menores cuanto más rápidos son los
procesos (Fig. 1.). Además, esta diferencia de consumo también puede ser debida a que el crecimiento de la biomasa y
207
ISBN 978-84-690-6060-5
en el metabolismo secundario de las bacterias es más activo
en las acetificaciones superficiales. Los descensos en la concentración total de nitrógeno resultaron ser estadísticamente
significativos para los procesos de acetificación superficial.
Fig.1. Consumo de nitrógeno en las acetificaciones
superficiales y sumergidas
Al inicio de la acetificación, el aminoácido mayoritario fue prolina, siendo su consumo solamente importante en
las acetificaciones superficiales, entre 200-300 mg/L. En los
procesos sumergidos, la concentración de prolina permaneció constante. Este hecho puede ser debido a las diferentes
cepas y especies de bacterias acéticas implicadas en ambas
acetificaciones.
El segundo aminoácido en orden de abundancia,
arginina (entre 8.5-26% del nitrógeno asimilable), disminuyó
significativamente durante la acetificación sumergida. Este
compuesto descendió en la mayoría de los procesos superficiales, pero estos cambios sólo fueron significativos en la mitad
de ellos. El ácido glutámico y alanina estaban entre los cinco
aminoácidos más abundantes y consumidos en la acetificación sumergida. Con respecto a las acetificaciones superficiales, hubo un consumo significativo de alanina y por el contrario,
el ácido glutámico aumentó. Por otro lado, aunque la metionina
apareció en baja concentración, sufrió descensos estadísticamente significativos en todos lo casos siendo del orden de cuatro veces superior en las acetificaciones superficiales.
No fue posible cuantificar amonio en las acetificaciones sumergidas; sin embargo, sus áreas relativas parecen
decrecer a lo largo del proceso. En las acetificaciones superficiales, este compuesto fue solamente usado por las bacterias acéticas en algunos casos, apareciendo nuevamente
una correlación con la duración de la fermentación.
En un fermentador Frings empleando como sustratos sidra, vinos blancos y tintos, resultó ser la leucina el aminoácido más importante en términos de aporte y consumo de
nitrógeno [3]. Sin embargo, en ninguna de nuestras experiencias ésta fue el aminoácido más consumido, ni la principal fuente de nitrógeno asimilable.
Finalmente, asparagina, glutamina, cisteína y triptófano no se detectaron en ninguna de las muestras estudiadas.
4. CONCLUSIONES
208
Se ha seguido el consumo de nitrógeno en los dos
tipos de acetificaciones, siendo mayor en las superficiales.
Además, se ha observado que el requerimiento de nitrógeno
de las bacterias es proporcional al tiempo invertido en el pro-
ceso de acetificación. En los sustratos iniciales, el aminoácido mayoritario, en términos de abundancia, fue prolina seguida de arginina. El aminoácido más consumido en la
acetificación superficial fue prolina y arginina en la sumergida. Este diferente patrón de consumo de aminoácidos podría estar relacionado con las diferentes cepas de bacterias
acéticas implicadas en los procesos.
5. BIBLIOGRAFÍA
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9. HERNÁNDEZ-ORTE, P.; IBARZ, M.J.; CACHO, J.; FERREIRA, V. (2006). Addition of amino acids to grape
juice of the Merlot variety: Effect on amino acid uptake and aroma generation during alcoholic fermentation. Food Chem 98:300-310
10. HERNÁNDEZ-ORTE, P.; IBARZ, M.J.; CACHO, J.; FERREIRA, V. (2003). Amino acid determination in grape
juices and wines by HPLC using a modification of the
6- Aminoquinolyl-N-Hydroxysuccinimidyl Carbamate
(AQC) method. Chromatogr 58:29-35
ISBN 978-84-690-6060-5
RELACIÓN ENTRE EL TAMAÑO DEL GRANO Y LA CALIDAD DE UVA PARA
VINIFICACIÓN
David García-Víllora, Amaya Zalacain, Jose R Sáez, Gonzalo L. Alonso*, M. Rosario Salinas
Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos. Universidad de Castilla-La Mancha.
Avda España, s/n, E02071, Albacete. Tf: 967 599310 * [email protected]
Resumen:
Se ha estudiado la relación entre dos tamaños de grano de uvas Cencibel (pequeño: diámetro 3-7 mm; grande diámetro 7-15 mm) su calidad enológica y precio. Los parámetros analizados han sido: peso de 100 granos, ºBaumé, acidez total,
pH, y los relacionados con la madurez fenólica. Se ha propuesto una fórmula para el pago de la uva que tiene en cuenta el kilogrado y la madurez fenólica. Las uvas pequeñas frente a las grandes presentaron mejor madurez de la pulpa y más adecuada
madurez fenólica. La fórmula mostró una importante diferenciación entre los precios de las uvas.
Palabras clave: Uva, tamaño de grano, madurez fenólica, precio
1. INTRODUCCIÓN
La calidad del vino está relacionada con diversas
características del grano de uva, entre las que el tamaño ha
sido considerado de gran importancia por diversos autores.
Así, se ha sugerido que una disminución del tamaño del
grano supone un aumento de la proporción de hollejo en la
masa de la vendimia, y por tanto puede haber una mayor
concentración de los compuestos localizados en el hollejo,
en especial polifenoles. El tamaño del grano al final de la cosecha depende, además del factor varietal, de la interacción
entre la fertilidad del suelo y la cantidad de azúcares suministrados por la planta a la baya. Por ello un grano pequeño
no siempre indica que proceda de una cosecha pequeña de
un terreno muy pobre con alto potencial cualitativo, pues podría proceder de una cosecha muy abundante producida en
cualquier tipo de suelo con un bajo potencial cualitativo [1].
En este trabajo pretendemos conocer la relación entre el tamaño de grano de uvas Cencibel recogidas en su momento
óptimo de madurez, cultivadas en una zona de la D.O. La
Mancha, y su calidad enológica y precio. En la calidad enológica se ha tenido en cuenta el contenido polifenólico y su
extractabilidad.
Se utilizaron uvas Cencibel cultivadas en la zona de
San Clemente (Cuenca), perteneciente a la D.O. La Mancha.
Las uvas se vendimiaron en su momento óptimo y procedieron de seis parcelas: dos cultivadas en vaso-secano, dos cultivadas en espaldera-regadío y dos cultivadas en
vaso-regadío. El sistema de riego fue por goteo a razón de
1000-1200 m3/ha. Las muestras de uvas se recogieron en los
remolques procedentes de cada parcela a la entrada en la
bodega (Cooperativa Vinícola Nuestra Señora de Rus). En
cada muestreo se cogieron 4 kg de uva de distintos puntos
del remolque. Los racimos se desgranaron mediante un corte
en el pedicelo y se calibraron según el diámetro de la baya
(calibre SOMET). Se consideraron dos grupos, el de granos
pequeños con diámetros entre 3 y 7 mm, y el de granos grandes con diámetros entre 7 y 15 mm. Se hicieron las siguientes medidas: peso de 100 granos, grado Baumé, pH, acidez
total [2]. La madurez fenólica se determinó según Glories [3]
que proporcionó los parámetros: IPT, antocianos totales, Extractabilidad Antociánica (%EA) y Madurez de Pepita (%MP).
En la Tabla 1 se muestran los resultados de los parámetros enológicos utilizados habitualmente para decidir la
fecha de vendimia. El peso medio de los granos pequeños
es de 1g frente a 1,7 g de los granos grandes, aunque si tenemos en cuenta el tipo de cultivo, se observa un tamaño
medio mayor tanto para los granos grandes como para los
pequeños en las uvas cultivadas en vaso-regadío. El contenido en azúcares fue también mayor en las uvas pequeñas
que en las grandes alcanzándose un valor medio de 14,9
frente a 14,5 respectivamente, mostrando los mayores valores las uvas cultivadas en espaldera-regadío. El valor medio
del pH fue mayor en los granos pequeños que en los grandes, destacando también las uvas cultivadas en espalderaregadío con los mayores valores y los menores cuando se
cultivaron en vaso-secano. Las uvas de tamaño pequeño tuvieron mayores valores medios de acidez total que las de tamaño grande siendo las cultivadas en vaso-regadío las más
ácidas. Finalmente, la relación azúcar/acidez estuvo comprendida entre 3-5 ya que las medidas se realizaron el mismo
día de la vendimia y este había sido el criterio elegido para la
elección de la fecha, de manera que los valores medios para
los dos tamaños de grano fue similar (4,1), no obstante, las
ratios mas bajas se alcanzaron en las uvas cultivadas en
vaso-regadío.
El IPT y el contenido en antocianos tanto a pH=1
como a pH= 3,2 es significativamente superior en las uvas de
tamaño pequeño que grande para todos los tipos de cultivo
estudiados (Tabla 2). El potencial total polifenólico (pH=1) es
un 10% superior en las uvas de granos pequeños destacando
las cultivadas en vaso-secano con los mayores valores. La
209
ISBN 978-84-690-6060-5
Tabla 1.- Parámetros enológicos de uvas Cencibel de tamaño pequeño (3-7 mm diámetro) y de tamaño grande
(7-15 mm diámetro).
misma tendencia se observa en el IPT a pH 3,2, aunque las
uvas cultivadas tanto en espaldera-regadío como en vaso
secano muestran valores similares y superiores a las de
vaso-regadío. El potencial total antociánico alcanza los máximos valores medios en las uvas cultivadas en vaso-secano
en ambos tamaños de grano aunque un 15% superior en los
pequeños. También el contenido de antocianos extraíbles es
un 15% mayor en las uvas de tamaños pequeños, encontrándose los niveles más bajos en las cultivadas en vaso-regadío. Por todo ello podemos decir que las uvas procedentes
de cultivo en vaso-regadío son las de menor contenido polifenólico con independencia del tamaño del grano.
Los parámetros que mas se utilizan como criterio
de madurez fenólica son el %EA y el %MP, el primero está relacionado con el grado de fragilidad de la membrana celular
y varía entre 20 y 70 y el segundo con la contribución de los
taninos de las pepitas y varía entre 10 y 60. Para ambos se
aconseja valores entorno al 30% y mejores cuanto más
bajos. En la Tabla 2 se puede ver que los valores de %EA varían entre 38,5 y 24,4 lo que sugiere una aceptable capacidad
de todas las uvas para extraer los antocianos aunque esta
es un 3% menor en las uvas de tamaño pequeño. El %MP
varía entre 44,3 y 55,9 lo que indica una excesiva presencia
de los taninos de las pepitas, pero estos valores son en todos
los casos inferiores en las uvas de tamaño pequeño, hecho
que sugiere que en estas es menor la contribución de los taninos agresivos de las pepitas. El conocimiento del grado de
madurez fenólica de la uva es de gran utilidad para poder decidir la fecha de vendimia óptima, clasificar en bodegas las
uvas según su calidad y finalmente decidir las estrategias de
vinificación. Por ello es interesante que esta información
pueda repercutir en el viticultor de manera que las uvas de
mayor calidad fenólica se paguen a mayores precios. En este
trabajo hemos propuesto una fórmula de pago al viticultor
manteniendo la fórmula tradicional, puesto que este es el criterio establecido en la zona, pero incorporándole la calidad
fenólica. Utilizamos como base del pago el precio del kilogrado (grados Baumé x kilo de uva), estableciendo una corrección porcentual sobre el valor de este según la variación
de los valores de los parámetros de madurez fenólica (antocianos potenciales, %EA, %MP) de las distintas muestras
respecto de la media. La fórmula empleada es: Precio
(euros)= kilogrado x n (euros/kilogrado) x [(100 + %FF)/100].
En donde %FF es el factor fenólico y se calcula como la suma
de los porcentajes de diferenciación respecto del valor medio
de los antocianos potenciales, %EA, %MP (Tabla 2) teniendo en cuenta que el valor de %EA y de %MP será negativo si es superiores al valor medio.
En la Tabla 3 se muestran los precios de las uvas
según el kilogrado y según la fórmula propuesta, que está
más de acuerdo con la calidad real de la uva. Para los cálculos se tuvo en cuenta que el precio del kilogrado (ºBaumé
x kilo de uva) de la campaña de 2005 fue de 0,0172 euros.
Obviamente, mediante el sistema tradicional de pago de uva,
las más rentables para el viticultor son las de tamaño mayor
y mayor contenido de azúcar, hecho que queda reflejado en
la columna “precio kilogrado de 100 granos”. Sin embargo, al
tener en cuenta el factor %FF las uvas pequeñas se revalorizan en todos los casos, mientras que las uvas grandes disminuyen su valor con la excepción de las cultivadas en
espaldera-regadío, que son las que alcanzan un mayor precio y por tanto las que mejor asocian producción y calidad.
Tabla 2. Parámetros de madurez fenólica de uvas Cencibel de tamaño pequeño (3-7 mm diámetro)
y de tamaño grande (7-15) mm diámetro).
210
ISBN 978-84-690-6060-5
Tabla 3. Precio (euros) de uvas Cencibel de tamaño pequeño (3-7 mm diámetro)
y de tamaño grande (7-15 mm diámetro).
1,2,3,4,5,6 indican diferentes parcelas. Letras diferentes indican diferencias significativas al nivel del 0.05%
4. CONCLUSIONES
Las uvas Cencibel de tamaño pequeño tienen mejor
madurez de pulpa, mayor contenido polifenólico, similar extractabilidad antociánica y menor contribución de los taninos
de las semillas que las de tamaño grande. Sin embargo su
mayor calidad no se ve recompensada si se mantiene como
hasta ahora el pago al viticultor según el precio del kilogrado,
por ello la fórmula propuesta permite considerar la calidad teniendo en cuenta también el pago tradicional. Si tenemos en
cuenta las dificultades de las empresas del sector para introducir cambios en los criterios de pago, esta podría ser una
sencilla fórmula que aúna los criterios clásicos con los actuales de pago por calidad.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. CHAMPAGNOL, F. 1984. Eléments de physiology de la
vigne et de viticulture generals. Ed. Auteur. Saint-Gelydu-Fesc. Montpellier.
2. ECC. 1990. Commission Regulation VO 2676/1990
concerning to stablishment of common analytical methods in the sector of wine. Off J. Eur. Commun., L272
(3), 1-192.
3. GLORIES, Y.;AUGUSTIN, M. (1994). La maturité phenolique des raisins rouges. Les Polyphenols Facteurs
de la Qualité. Sitevinite. Bordeaux. 117.
211
ISBN 978-84-690-6060-5
APLICACIÓN DE GLICOSIDASAS A VINOS ELABORADOS CON LA VARIEDAD
VERDEJO: EFECTO SOBRE SU COMPOSICIÓN TERPÉNICA
José Manuel Rodríguez-Nogales1, Encarnación Fernández-Fernández2, Josefina Vila-Crespo3,
Rubén Mahamud1, Diana Santos3
1
2
3
Dpto. Ingeniería Agrícola y Forestal. Área de Tecnología de Alimentos. Universidad de Valladolid .Campus de Palencia. ETS de Ingenierías Agrarias. Avda.
Madrid 44. 34071 Palencia. E-mail: [email protected]
Dpto. Anatomía Patológica, Microbiología, Medicina Preventiva y Salud Pública, Medicina Legal y Forense. Área de Microbiología. Universidad de Valladolid
.Campus de Palencia. ETS de Ingenierías Agrarias. Avda. Madrid 44. 34071 Palencia. E-mail: [email protected]
Resumen:
El empleo de preparados enzimáticos ricos en glicosidasas, principalmente -glucosidasa, al final de la fermentación
permite enriquecer el medio en compuestos aromáticos varietales. En este sentido, el objetivo de este trabajo fue medir el potencial aromático de nueve preparados enzimáticos comerciales ricos en actividades glicosidasas empleados durante la elaboración de un vino Verdejo. La composición terpénica de los vinos se determinó mediante cromatografía de gases. De los
resultados obtenidos, se puso de manifiesto que los preparados enzimáticos comerciales, con actividades glicosidasas, potencian el carácter varietal del vino, y que el grado de enriquecimiento en terpenos depende del preparado enzimático comercial empleado.
Palabras clave: Verdejo, terpenos, componentes principales, glicosidasas.
1. INTRODUCCIÓN
212
El aroma del vino está formado por una gran variedad de compuestos aromáticos que provienen de la uva, de
los procesos fermentativos, y/o de los procesos de crianza
del vino. Los aromas varietales se pueden encontrar en formas libres, siendo percibidos por el olfato, tal cual se encuentran en la uva o, por el contrario, en formas combinadas
como glicósidos. Estos compuestos combinados bajo este
estado no presentan propiedades olfativas, pero que durante
transcurso de la elaboración pueden transformarse en formas libres y comunicar al vino sus aromas característicos [1].
La liberación de aromas a partir de precursores
combinados se puede acelerar por medio de las enzimas glicosidasas. La enzima β-D-glucosidasa (EC 3.2.1.21) libera
sustancias volátiles (monoterpenoles, norisopreonides y fenoles volátiles) a partir de monoglucósidos. En el caso de diglicósidos, intervine en una segunda etapa para liberar la
aglicona después de la ruptura del azúcar terminal por una αL-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55), una β-Dapiofuranosidasa y una α-L-ramnosidasa (3.2.1.40) [2].
La hidrólisis enzimática catalizada por los complejos enzimáticos de la propia uva y/o de las levaduras es
muy limitada, ya que estas enzimas presentan baja actividad bajo condiciones fermentativas. Sin embargo, el uso de
enzimas exógenas de origen fúngico permite enriquecer el
vino en compuestos aromáticos. En este sentido, y debido
a que los cambios en los perfiles aromáticos debidos a un
tratamiento enzimático con glicosidasas son diferentes de
un vino a otro, en función de la composición química del
mosto y de las técnicas enológicas empleadas, es necesa-
rio un estudio individualizado para cada tipo de vino y variedad de uva empleada. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto producido por nueve extractos
enzimáticos comerciales sobre la fracción aromática terpénica de vinos Verdejo.
2.1. Glicosidasas
Se seleccionaron nueve extractos enzimáticos con
actividad glicosidasa, principalmente β-glucosidasa, de distintas casas comerciales (Lafazym arom; Scottzyme BG; Endozyme β split; AR2000; Depectil Ar; Novarom Blanc; Enovil
varietal; Depectin revelation; β-Lallzyme). La dosis empleada
fue la máxima recomendada por el fabricante.
2.2. Vinificaciones
El trabajo se realizó en la bodega experimental de
la E.T.S. de Ingenierías Agrarias de Palencia durante la vendimia del 2006. Las vinificaciones se realizaron siguiendo un
esquema clásico de elaboración de vino blanco en depósitos
de 250L, con mosto procedente de uvas de la variedad Verdejo procedentes de la D.O. Rueda. Concluida la fermentación, el vino se trasegó a botellones de vidrio de 4L de
capacidad y se les añadió el extracto enzimático. Paralelamente, se incluyó un vino control al que no se le adicionó enzimas. Después de dos semanas a 14-16ºC, los vinos se
clarificaron con bentonita, se sulfitaron y embotellaron. Todos
los experimentos se realizaron por triplicado.
ISBN 978-84-690-6060-5
2.3. Separación e identificación de terpenos y
norisoprenoides
Para la extracción e identificación de terpenos e
norisoprenoides se siguió el método propuesto por Versini [3]
que implicaba una extracción en fase sólida donde los distintos compuestos aromáticos se fraccionaron por retención selectiva en cartuchos C18. Los extractos se analizaron con un
cromatografo de gases (HP 6890) equipado con un inyector
automático y un detector de ionización de llama FID. La identificación de los componentes aromáticos de los vinos se realizó mediante la comparación de sus tiempos de retención
con los obtenidos con patrones de referencia preparados en
una disolución de etanol al 12% (v/v). Las muestras se extrajeron y analizaron por duplicado.
Figura 1. Análisis por componentes principales aplicado al
contenido en terpenos y norisoprenoides de los vinos
Verdejo elaborados sin (contr ol) y con la adición de distintos extractos enzimáticos ricos en β-glucosidasa (1-9)
3. Resultados y discusión
El eugenol, éter metil eugenol y 1,8-cineol, y en
menor proporción el nerol, β-pineno, α-terpineol, α-pineno y
β-ionona fueron los componentes aromáticos que se presentaron en mayores niveles. Tal y como era de esperar, el
vino control mostraba menor abundancia en estos compuestos aromáticos. Además, se pudo constatar que el enriquecimiento en compuestos aromáticos dependía del tipo de
extracto enzimático empleado.
Del análisis por componentes principales de los
datos cromatográficos, se obtuvieron dos componentes principales significativas que explicaban el 76% de la varianza
total. La primera componente principal (CP1) explicaba el
52% de la varianza, y se encontraba positivamente correlacionada con los siguientes compuestos aromáticos: eugenol,
1,8-cineol, β-pineno y nerol (Tabla 1). La segunda componente principal (CP2), estaba correlacionada fuertemente y
positivamente con el α-terpineol y la β-ionona, y negativamente con el éter metil eugenol.
La Fig. 1 muestra el gráfico obtenido tras seleccionar las dos componentes principales como ejes. Claramente
se observa como el vino control se situó a valores negativos
y positivos de la CP1 y CP2, respectivamente, totalmente separado de los vinos con tratamiento enzimático. El vino control se caracterizó por poseer los menores niveles en todos
los compuestos aromáticos, especialmente para el eugenol,
éter metil eugenol, y α y β-pineno.
Además, se obtuvo una gran diversidad aromática
en los vinos tratados con enzimas, si bien, se observaron algunas agrupaciones. Los vinos con los extractos enzimáticos
1, 2 y 4 se encontraron agrupados en el cuadrante del gráfico
Tabla 1. Tabla de pesos de las variables en las
componentes principales
con valores positivos para CP1 y CP2. Estos vinos mostraron
los mayores niveles en compuestos aromáticos, especialmente, en α-terpineol, β-ionona, y 1,8-cineol. Los vinos 3 y
6, se localizaron cerca del centro de origen del gráfico, indicando una composición menos rica en componentes aromáticos. El vino 5 se caracterizó por poseer bajos niveles de
β-ionona y α-terpineol, y mayores de éter metil eugenol. A valores negativos de la CP1 se localizaron los vinos 7, 8 y 9,
correspondiendo con bajos niveles de eugenol, 1,8-cineol, βpineno y nerol.
4. CONCLUSIONES
A partir de los resultados obtenidos podemos concluir que la aplicación de extractos enzimáticos ricos en glicosidasas potencia el carácter varietal de los vinos Verdejos,
observándose mayores niveles de eugenol, éter metil eugenol, 1,8-cineol, nerol, β-pineno, α-terpineol, α-pineno y β-ionona en los vinos tratados enzimáticamente. Además, los
perfiles aromáticos de los vinos fueron diferentes en función
del tipo de extracto enzimático aplicado, lográndose vinos
más aromáticos con los extractos enzimáticos 1, 2 y 4.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. FLANZY, F. 2003. Aromas. In: Enología: fundamentos
científicos y tecnológicos. AMV Ediciones. ISBN:
8489922748.
2. GRASSIN, C.; FAUQUEMBERGUE, P. 1996. Wine. In:
Industrial enzymology. Stockton Press. ISBN: 156159-163-7.
3. VERSINI, G.; ORRIOLS I.; DALLASERRA, A. 1994.
Aroma components of Galician Albarino, Loureira
and Godello wines. Vitis 33 165-170.
6. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo está subvencionado por la Junta de
Castilla y Léon (VA014B06).
213
ISBN 978-84-690-6060-5
ANÁLISIS COMPARATIVO DE LA FRACCIÓN AROMÁTICA
DE VINOS DE LA D.O. RUEDA
José Manuel Rodríguez-Nogales1, Encarnación Fernández-Fernández2, Josefina Vila-Crespo3,
Marta Ramas1, Sandra Laso1
1
2
3
Dpto. Anatomía Patológica, Microbiología, Medicina Preventiva y Salud Pública, Medicina Legal y Forense. Área de Microbiología. Universidad de Valladolid
.Campus de Palencia. ETS de Ingenierías Agrarias. Avda. Madrid 57. 34004 Palencia. E-mail: [email protected]
Resumen
Se ha estudiado la composición volátil mayoritaria de 20 vinos blancos de la D.O. Rueda agrupados en cuatro categorías: vino Verdejo, vino Sauvignon blanc, vino Verdejo fermentado en barrica y vino Verdejo con crianza. La composición de
la fracción volátil mayoritaria de los vinos varió según la variedad de uva y el sistema de elaboración empleado. Tras un análisis discriminante de los datos, los compuestos acetato de etilo, lactato de etilo, etanol y metanol presentaron mayor poder de
discriminación para clasificar las muestras en cada una de las cuatro categorías establecidas. De este modo, el 95% de las
muestras de vino fueron clasificadas correctamente en su categoría.
Palabras clave: D.O. Rueda, compuestos volátiles, análisis discriminante, vinos comerciales
1. INTRODUCCIÓN
El vino es un producto complejo, resultado de una
larga secuencia biológica, bioquímica y tecnológica que ocurre durante su elaboración [1]. Su composición volátil depende de diversos factores como son la variedad de uva, las
condiciones edafológicas y las prácticas enológicas [2]. La
modificación de dichos factores marca sensiblemente el perfil aromático del vino y permite la tipicidad del mismo.
La zona de producción amparada por la D.O. Rueda
se encuentra en la Comunidad de Castilla y León y está integrada por 72 municipios, situados al sur de la provincia de
Valladolid, al oeste de Segovia y al norte de Ávila. La D.O.
Rueda es una de las pocas zonas vinícolas especializadas
en la elaboración de vino blanco y en la protección y desarrollo de su variedad autóctona Verdejo. El perfil aromático
de los vinos de Rueda se debe a la fuerte personalidad de la
variedad Verdejo junto con la presencia de cantidades minoritarias de Sauvignon blanc, Viura y Palomino, que se pueden encontrar hasta en un 15% en los vinos Verdejos Rueda.
Además, algunas bodegas de la D.O. Rueda están llevando
a cabo fermentaciones en barrica y crianzas largas, con el
ánimo de ampliar su gama de productos [3].
En este sentido, el objetivo de este trabajo fue estudiar la fracción volátil mayoritaria de distintos vinos blancos
de la D.O. Rueda elaborados con distintas variables enológicas durante las vendimias del 2003-2005.
214
Para este estudio se seleccionaron 20 vinos comerciales de la D.O. Rueda de las vendimias del 2003-2005,
distribuidos en cuatro categorías: quince vinos Verdejo (20042005), dos vinos Sauvignon blanc (2005), un vino Verdejo fermentado en barrica (2005) y dos vinos Verdejo con crianza
(2003).
La separación de los componentes aromáticos mayoritarios del vino se realizó con un equipo de cromatografía
de gases (HP 6890) equipado con un inyector automático y
un detector de ionización de llama FID. Los alcoholes superiores, debido a sus elevadas concentraciones en el vino, no
requieren extracción previa a su análisis por cromatografía
de gases. Las condiciones cromatográficas fueron: inyección,
2 µL; columna capilar INNOWAX (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm,
J&W); temperatura del inyector, 250ºC; temperatura del detector, 260ºC; programa de temperaturas: 35ºC durante 15
min, con una rampa de 3ºC/min, hasta 190ºC. La identificación de los componentes aromáticos de los vinos se realizó
mediante la comparación de sus tiempos de retención con
aquellos obtenidos con patrones de referencia preparados en
una disolución de etanol al 12% (v/v). Las muestras se analizaron por duplicado y los resultados se expresaron en % de
área.
El programa estadístico empleado para el análisis
de varianza y discriminante fue Statgraphics 4.0 (Rockville,
MD, USA).
En el análisis de los compuestos volátiles mayoritarios por CG-FID, se detectaron siete alcoholes (metanol, etanol, 1-propanol, isobutanol, butanol y metil-1-butanol), dos
ésteres (acetato de etilo y lactato de etilo) y un aldehído (acetaldehído dietil acetal). En todas las categorías de vinos (vino
ISBN 978-84-690-6060-5
Verdejo, vino Sauvignon blanc, vino Verdejo fermentado en
barrica y vino Verdejo con crianza), los componentes volátiles mayoritarios más abundantes fueron el etanol, el metil-1butanol y el acetato de etilo.
Tras un análisis de varianza (ANOVA) se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre las cuatro categorías de vinos para el acetato de etilo, 1-propanol,
isobutanol, lactato de etilo y metanol. Los menores niveles
de acetato de etilo y 1-propanol se observaron en los vinos
Verdejo, mientras que el isobutanol, el lactato de etilo y el metanol se detectaron en menor porcentaje en los vinos Sauvignon blanc. En el vino Verdejo con crianza, el componente
volátil mayoritario menos abundante fue el lactato de etilo.
Los vinos Verdejo fermentados en barrica contenían mayores
niveles de isobutanol y metanol.
Con el objetivo de comprobar si los compuestos volátiles mayoritarios analizados contenían suficiente información para discriminar y predecir las muestras de vino entre
las cuatro categorías establecidas, se aplicó un análisis discriminante por pasos sucesivos. Las variables acetato de
etilo, lactato de etilo, etanol y metanol presentaron mayor
poder de discriminación y fueron seleccionadas para la construcción de las funciones de discriminación.
Las figura 1 muestra el gráfico de dispersión de las
muestras de vino para las dos primeras funciones discriminantes, observándose una correcta agrupación de las muestras en cada una de las categorías. La primera función fue
capaz de discriminar los vinos fermentados en barrica y con
crianza del resto de los vinos. Dicha función discriminante
está asociada con coeficientes positivos para el acetato y lactato de etilo, y negativos para el metanol. La segunda función
discriminante presentó coeficientes positivos para el metanol
y el acetato de etilo, y coeficientes negativos para el etanol y
el lactato de etilo. El vino fermentado en barrica se situó a
valores positivos de la segunda función, mientras que los
vinos con crianza se localizaron a valores negativos. Por otro
lado, los vinos Verdejo se situaron a valores negativos de la
primera función, correspondiendo con bajos valores de acetato y lactato de etilo. El porcentaje de clasificación correcta
de los vinos, según las funciones de clasificación definidas
por las cuatro variables, fue de un 95% (Tabla 1). Únicamente
una muestra de Verdejo fue clasificada incorrectamente como
vino Sauvignon blanc.
Fig. 1. Diagrama de dispersión de los vinos de la D.O.
Rueda en la primera y segunda función discriminante (V:
Verdejo; VB: Verdejo fermentado en barrica; VC: Verdejo
con crianza; S: Sauvignon blanc)
4. CONCLUSIONES
Se ha observado diferencias significativas en la
composición volátil mayoritaria de los vinos blancos elaborados con diferentes variedades de uva (Verdejo y Sauvignon
blanc) y con distintas técnicas de elaboración (fermentación
en barrica y con crianza). Tras un análisis discriminante de
los datos, el 95% de las muestras de vino se clasificaron correctamente en su grupo.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. FLANZY, F. 2003. Aromas. In: Enología: fundamentos
científicos y tecnológicos. AMV Ediciones. ISBN:
8489922748.
2. TROOST, G. 1985. Tecnología del vino, Omega S.A.
ISBN: 8428207429
3. CONSEJO REGULADOR DE LA D.O. RUEDA. 2007.
(http://www.dorueda.com/es/index.php)
6. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo está subvencionado por la Junta de
Castilla y Léon (VA014B06).
Tabla 1. Tabla de clasificación de los vinos de la D.O. Rueda
215
ISBN 978-84-690-6060-5
PUESTA A PUNTO DE UN MÉTODO DE ANÁLISIS MEDIANTE GC-MS
PARA EL CONTROL DE MADURACIÓN AROMÁTICA DE LA UVA. ESTUDIOS
PRELIMINARES
Luciano Vera, M. Pilar Martí, Olga Busto, Josep Guasch
Resumen:
Grup de Química Analítica Enològica i dels Aliments (QAea)
Departament de Química Analítica i Química Orgánica. Facultat dÉnologia de Tarragona. Universitat Rovira i Virgili.
Campus de Sescelades.c/ Marcel·lí Domingo s/n. E-43007 Tarragona.
Telf. 977558496, e-mail: [email protected]
Se ha puesto a punto un método de análisis para el estudio de la evolución del contenido aromático de las uvas durante las distintas etapas de maduración antes de la vendimia, con el fin de utilizarlo como referencia en el control de madurez
aromática mediante nariz electrónica (HS-MS). El análisis de los compuestos aromáticos se realizó mediante GC-MS, tras un
imprescindible tratamiento de la muestra, tanto para la liberación de los compuestos aromáticos de sus precursores, como para
la concentración de los mismos. En el proceso de optimización de este método se prioriza un tratamiento de la muestra, con
una maceración e hidrólisis que garanticen el mínimo de tiempo.
Palabras clave: SPE, Maceración pelicular, precursores aromáticos, GC-MS.
1. INTRODUCCIÓN
216
Los componentes responsables del aroma característico de las diferentes variedades de uvas se encuentran localizados principalmente en la piel y, en menor grado, en la
pulpa. Estos compuestos volátiles están presentes normalmente en cantidades trazas y se encuentran en formas libres
y ligadas, éstas últimas usualmente como glicósidos [1]. Dos
terceras partes de los glicósidos se encuentran en el mosto,
mientras que el resto se halla en la piel de la uva, por lo que
es importante la participación del hollejo para garantizar una
recuperación mas completa. Por el contrario, los terpenos libres se encuentran casi en su totalidad en la piel [2], así
como C13-norisoprenoides, compuestos derivados de bencenos y alcoholes alifáticos, por lo que es importante la maceración para su extracción [3].
Se puede encontrar diversos métodos para la extracción de aromas de las uvas, como algunos que se han
desarrollado con la utilización de HS-SPME [3,4] o a través
de SPE [1,5], entre otros. El control de la maduración aromática de las uvas necesita un método rápido y simple de
análisis de compuestos volátiles, usando en lo posible una
pequeña cantidad de muestra [3]. Con estas características,
se ha desarrollado un método de análisis mediante GC-MS
de los aromas liberados a través de una hidrólisis rápida de
los precursores, analizando la piel y el mosto por separado
[6].
El método presentado en este trabajo intenta reducir la cantidad de muestra y el tiempo de análisis, empleando
una maceración pelicular, que consiste en dejar en contacto
el mosto con las partes sólidas de las bayas [7]. El objetivo
final es su aplicación en el control de madurez aromática mediante la técnica rápida de HS-MS.
Los reactivos utilizados han sido de calidad de reactivo analítico. Se ha usado una resina Lichrolut EN (Merck).
Se han utilizado distintas variedades de uvas blancas de la finca experimental Mas dels Frares de la URV recogidas durante el período comprendido entre
julio–septiembre de 2006. La variedad utilizada para este
análisis es Moscatel (150g) recogida el día 10 de agosto. El
método empleado es el propuesto en bibliografía [6], aunque
se han efectuado algunas modificaciones en la maceración y
algunos ajustes de variables. El método utilizado se resume
a continuación: a) Trituración de 150 gramos de uva con 5
g/L de NaF a pH 6; b) maceración pelicular a 22ºC y 14 horas;
c) Retención de los glicósidos en Lichrolut EN y elución con
etilacetato:metanol 4:1; d) Hidrólisis ácida a 100ºC (1 h en
contacto con ácido cítrico 0,2M); e) Retención de compuestos volátiles con Lichrolut EN y elución con 700uL de diclorometano; f) Concentración a 50µL e inyección de 3uL en el
cromatógrafo.
Se ha utilizado un detector de espectrometría de
masas con rango de masas de 35-300m/z. La columna cromatográfica utilizada fue CP-Wax 57CB (50m x 250µm x
0,20µm) con rampa de temperatura de 40ºC durante 3 min,
10ºC/min hasta 90ºC, 2ºC/min hasta 220ºC manteniéndose
durante 37 min.
3. RESULTADOS
Tras ensayar otras posibilidades de tratamiento de
la muestra, empleando la técnica de la SPE, se optó por la
maceración pelicular, en aras de disminuir al máximo la duración de dicho tratamiento. Se han detectado un total de 87
ISBN 978-84-690-6060-5
Tabla 1. Algunos de los compuestos identificados mediante
maceración pelicular en orden de tiempo de retención
compuestos tras un análisis duplicado de las muestras, de
los cuales se han identificado 63 de acuerdo a la aparición de
éstos en ambos cromatogramas y por la similitud de sus
áreas, en base al patrón interno (4-metil 2- pentanol). Entre
ellos, podemos destacar la presencia de ácidos (16), compuestos C6 (5), terpenos (6), alcoholes (6), ésteres, compuestos bencilos (7), norisoprenoides (3) y otros de distinto
origen. Merece la pena destacar el gran porcentaje de ácidos, dato que no aparece en la bibliografía consultada. Alguno de los compuestos identificados se muestran en la tabla
1, ordenados de acuerdo al tiempo de retención.
El análisis por duplicado de las muestras de Moscatel y las áreas de los picos encontrados e identificados tomando como referencia el patrón interno se muestra en la Fig
1 (el valor numérico corresponde a cada uno de los compuestos según la tabla 1). Puesto que el método está en una
etapa inicial, la réplica del análisis no es muy repetitiva, como
en el caso del α terpineol (11) por ejemplo, debido en parte a
la dificultad que se presentó en el momento de concentrar las
muestras a un volumen de 50µL. A pesar de aquello, puede
observarse cierta tendencia en lo que respecta a sus concentraciones en algunos compuestos.
Fig. 1. Gráfico de concentración relativa al patrón interno
para los 64 compuestos identificados
4. CONCLUSIONES
Considerando el tiempo empleado y la cantidad de
muestra, el tratamiento de las muestras de uva empleando
maceración pelicular es una buena opción para análisis y
más aun para su utilización en control de maduración aromática. Se requiere la optimización futura de algunas varia-
bles como son por ejemplo la cantidad de fase adsorbente, el
tiempo y temperatura de maceración entre los más importantes, esto permitirá un mejor control del tratamiento de las
muestras y además una mejora en la reproducibilidad de los
análisis.
Se puede destacar de acuerdo a los resultados obtenidos la cantidad de ácidos encontrados, la cual es muy superior a cualquier otro método similar, comprendiendo en este
caso cerca de un 25% del total de los compuestos identificados.
De acuerdo a esto, se ha logrado disminuir el trabajo de obtención de compuestos aromáticos. Esto es, por la
necesidad de establecer un método para emplearlo de referencia en la medida mediante FT-IR de la madurez aromática de la vendimia.
De igual modo, y en forma paralela, se están estudiando métodos de pretratamientos de muestra menos laborioso, pero con la misma fiabilidad.
5. BIBLIOGRAFÍA
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5. CARBALLEIRA, L;CORTÉS, S; DE LA PEÑA,M.L.G;
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6. IBARZ, MJ; FERREIRA, V; HERNANDEZ-ORTE, P;
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by fast acid hydrolysis of flavor precursors extracted
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7. BAUMES, R; BAYONOVE, C; CORDONNIER, R; TORRES, P; SEGUIN, A. (1989). Incidente de la macération pelliculaire sur la composante aromatique des
vins doux naturels de muscat. Revue Française dÓenologie 116 6 - 11
6. AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al Ministerio de Ciencia y
Tecnología la financiación del proyecto AGL 2003-04995.
217
ISBN 978-84-690-6060-5
INFLUENCIA DE LOS CLARIFICANTES Y DE LOS COADYUVANTES DEL TIRAJE
SOBRE LA CAPACIDAD ESPUMANTE DE UN VINO BLANCO DE BOBAL
García, M. J.; Álvarez, I.; Lizama, V.; Aleixandre, J.L.
Instituto Universitario de Ingeniería de Alimentos para el Desarrollo. Departamento de Tecnología de los Alimentos. Universidad Politécnica de Valencia..Camino de Vera s/n. Apdo. Correos 22012. 46071 - Valencia. España.
e-mail: [email protected]
Resumen:
La producción de vinos base destinados a la elaboración de vinos espumosos blancos a partir de variedades tintas
como la Bobal, requiere el empleo de un agente decolorante del mosto que permita eliminar antocianos y taninos extraídos de
las partes sólidas durante el proceso de extracción del mosto sin que haya pérdida de aromas, aminoácidos, proteínas y polisacáridos que ejercen una gran influencia en la calidad de estos vinos. La acumulación de espuma en la superficie del vino depende del contenido en este de sustancias tensioactivas entre las que destacan proteínas, aminoácidos, lípidos y polisacáridos.
Este trabajo pretende aportar información sobre el efecto de diferentes clarificantes (bentonita, gelatina y albúmina) y de los coadyuvantes del tiraje (bentonita y Colle 2P) sobre la capacidad espumante de un vino blanco elaborado a partir de la variedad
de uva Bobal.
Palabras clave: vino espumoso, proteínas, mosalux, tiraje.
INTRODUCCIÓN
La producción de vinos base destinados a la elaboración de vinos espumosos blancos a partir de variedades
tintas como la Bobal, requiere el empleo de un agente decolorante del mosto que permita eliminar antocianos y taninos
extraídos de las partes sólidas durante el proceso de extracción del mosto sin que haya pérdida de aromas, aminoácidos, proteínas y polisacáridos que ejercen una gran influencia
en la calidad de estos vinos [1].
La clarificación del vino base tiene influencia sobre
la fracción proteica del vino, y por tanto sobre las características organolépticas y de calidad de la espuma. La acumulación de espuma en la superficie del vino depende del
contenido en este de sustancias tensioactivas entre las que
destacan proteínas, aminoácidos, lípidos y polisacáridos. [2].
Por ello, es de vital importancia el estudio del efecto de los diferentes clarificantes sobre la composición del vino base utilizado en la elaboración de vinos espumosos.
En la solución de tiraje que se adiciona para realizar
la segunda fermentación, se incluye habitualmente algún coadyuvante como la bentonita, aunque esta cantidad de bentonita incluida en la solución de tiraje es al menos diez veces
inferior que la empleada en los tratamientos que se llevan a
cabo para eliminar proteínas en los vinos, puede modificar la
composición nitrogenada y la calidad sensorial de los vinos
[3].
Este trabajo pretende aportar información sobre el
efecto de diferentes clarificantes y de los coadyuvantes del tiraje sobre la fracción aromática y la calidad de la espuma de
un vino blanco espumoso elaborado a partir de la variedad
Bobal.
218
Para la realización de este estudio se partió de 50
litros de vino obtenidos de la variedad Bobal. Este vino se
elaboró siguiendo el método tradicional de elaboración de
vino base para vinos blancos espumosos.
Los 50L de vino base se distribuyeron en 5 lotes
que fueron sometidos a 5 tipos de clarificación diferentes:
Testigo, Bentonita (30g/hL), Bentonita (30g/hL) + Gelatina
(3g/hL), Bentonita (30g/hL) + Albúmina (3g/hL), Albúmina
(3g/hL). En el tiraje se adicionaron las levaduras responsables de la segunda fermentación (20g/hL), fosfatil como nutriente para dichas levaduras (10g/hL), y el licor de tiraje.
Cada lote fue tratado con dos tipos de coadyuvantes distintos para facilitar el removido y posterior eliminación de las levaduras: bentonita 3g/hL y Colle 2P 3g/hL. (es un preparado
comercial, mezcla de distintos coadyuvantes del tiraje).
Todas las determinaciones se realizaron por triplicado y el estudio está basado en la media de los resultados
obtenidos. Los análisis físico-químicos se realizaron siguiendo los “Métodos Oficiales de Análisis” de la OIV (1990),
mediante los cuales se determinaron: anhídrido sulfuroso,
acidez volátil, título alcohométrico, azúcares reductores. Se
utilizó el método Bradford (1976) para determinar el contenido total de proteínas. El análisis de los compuestos volátiles se ha efectuado por grupos, en función de su
concentración, por Cromatografía de gases (HP 6890) con
detección por ionización de llama.
La capacidad el vino para producir espuma se ha
medido mediante el Mosalux que permite apreciar la espumabilidad de los vinos [4]. Mediante este sistema se puede
medir la altura máxima a la que llega la espuma (HM) que se
ISBN 978-84-690-6060-5
asimila generalmente a la espumabilidad del vino, y a la altura
de la estabilidad (HS) que se asimila generalmente a la persistencia de la espuma. El tratamiento estadístico (ANOVA)
de los resultados analíticos obtenidos en los vinos, se ha
efectuado con la ayuda del paquete informático Statgraphics
Plus 5.0.
3. RESULTADOS
Los resultados muestran que el tipo de coadyuvante
ejerce un efecto significativo al 99% y al 95% sobre la concentración de algunos compuestos analizados: acetaldehído,
acetato de hexilo, geraniol, linalol, γ-butirolactona, dietilsuccinato, y dietilglutarato que aumentan con el coadyuvante
Colle 2P. Por el contrario, butirato de etilo, n-amylalcohol, lactato de etilo, octanoato de etilo y nerol, disminuyen significativamente cuando se utiliza Colle 2P.
En la Fig. 1 se puede observar que el uso exclusivamente de la bentonita comporta una disminución en algunos de compuestos analizados en el vino espumoso,
mientras que otros aumentan. Aunque la cantidad de bentonita incluida en la solución de tiraje es diez veces inferior a la
utilizada en los tratamientos de clarificación ensayados,
puede modificar la calidad sensorial de los vinos, es por ello,
que se ha planteado esta investigación. Estudios realizados
por Martínez-Rodríguez y Polo [5] ponen de manifiesto que la
calidad sensorial olfativa era menor en los vinos espumosos
a los que se había adicionado bentonita en el tiraje frente a
los elaborados sin adición de bentonita, sin embargo en este
estudio este efecto no se produce en todos los compuestos
analizados.
En la Fig. 2 se presenta el contenido de las proteínas totales en los vinos tratados con diferentes clarificantes.
Como muestran los resultados, la bentonita provoca una disminución de las proteínas totales [2].
Fig 1. Influencia de los coadyuvantes del tiraje sobre los
compuestos volátiles (mg/L) del vino espumoso
La utilización de gelatina o albúmina conjuntamente
con la bentonita parece ejercer un efecto protector sobre las
proteínas del vino, lo que explica una mejor calidad de la espuma en estos vinos.
Figura 2. Influencia del tipo de clarificante sobre el
contenido total de proteínas y sobre las características de
la espuma.
219
ISBN 978-84-690-6060-5
En lo que respecta a las propiedades espumantes
de los vinos, se observa que la clarificación con bentonita provoca una disminución de la espumabilidad (HM) y de la persistencia de la espuma (HS) mientras que la utilización de
bentonita asociada a gelatina o albúmina permite mantener o
mejorar la calidad de la espuma. Los vinos que presentan
mejores características de la espuma son los clarificados sólo
con albúmina como muestra la Fig.2.
En la Fig. 3 se muestran los resultados correspondientes al efecto de los coadyuvantes del tiraje ensayados
sobre las características espumantes y el contenido en proteínas de los vinos elaborados. Como puede observarse, la
bentonita provoca una disminución tanto de la espumabilidad
(HM) como de la persistencia de la espuma (HS), que coincide también con la disminución del contenido total de proteinas en estos vinos espumosos.
Fig. 3. Influencia de los coadyuvantes del tiraje sobre el
contenido total de proteínas y sobre las características de
la espuma.
4. CONCLUSIONES
La variedad Bobal permite obtener vinos base para
la elaboración de vinos espumosos blancos de calidad.
220
Los coadyuvantes del tiraje utilizados en este estudio tienen una influencia significativa en la mayoría de componentes volátiles analizados en el vino espumoso, pero su
efecto no es claro, ya que en algunos casos se produce un
aumento de la concentración de volátiles con la bentonita y
en otros esto se produce con la Colle 2P.
La utilización de bentonita tanto en la clarificación
como coadyuvante del tiraje provoca una pérdida de proteínas en el vino que afecta negativamente a las espumabilidad
(HM) y a la estabilidad de la espuma (HS). La utilización de
bentonita asociada a gelatina o a albúmina ejerce un efecto
protector sobre las proteínas del vino provoca una mejora de
la calidad de la espuma del vino efervescente, aunque los valores mas altos de HM y HS aparecen en los vinos clarificados con albúmina.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. PUEYO, E.; OLANO, A.; POLO, M.C.; 1995b. Neutral
monosaccharides composition of the polysaccharides from must, wines and cava wines, Revista española de Ciencia y Tecnología de Alimentos, 35,191-201.
2. VANRELL, G.; CANALS, R.; ALBET, S.; CANALS, J.M.;
FORT, F.;AROLA, L.; ZAMORA, F.; 2006. Influence of de
use of bentonite as a riddling agent on foam quality
and protein fraction of sparkling wine. Food Chemistry.
3. MARTÍNEZ-RODRÍGUEZ A.; POLO M.C.; 2000. Characterization of the nitrogen compounds released during yeast autolysis in a model wine system. J. Agric.
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4. MAUJEAN, A.; POINSAUT, P.; DANTAN, H.;BRISSONET,
F.; COSSIEZ, E.; 1990. Étude de la tenue et de la qualité de mousse des vins effervescents – II. Mise au
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5. MARTÍNEZ-RODRÍGUEZ A.J.; POLO M.C.,2002. Effect
of the addition of bentonite to the tirage solution on
the nitrogen composition and sensory quality of sparkling wines. Food Chemistry 81 (2003) 383-388.
6. AGRADECIMIENTOS
Los autores del proyecto agradecen la financiación
a la Universidad Politécnica de Valencia, Vicerrectorado de
Investigación, Desarrollo e Innovación (20040938) y a la Bodega Pago de Tharsys de la D.O. Utiel-Requena.
ISBN 978-84-690-6060-5
OBTENCIÓN INSTANTÁNEA DE LA MADUREZ TECNOLÓGICA DE LA UVA DE LA
VENDIMIA 2006 POR MEDIO DE ESPECTROFOTOMETRÍA DE INFRARROJO
Rosario Vila1, José Ignacio Fernández1, Rocío Gil1, Adrián Martínez1
1
Instituto Murciano de investigación y desarrollo agrario y alimentario C/ Mayor, s/n. 30150 La Alberca (Murcia).968-757580. [email protected]
Resumen:
El método generalizado para la elección del momento óptimo de vendimia, en función del vino que se quiera elaborar, es la determinación de los análisis clásicos de la maduración tecnológica (ºBaumé, pH, acidez total, evolución del peso de
granos), que dan información acerca de la madurez de la pulpa. Es esencial en la industria vinícola la existencia de un sistema
objetivo, rápido y económico de medida de la calidad de uva ya que hoy en día si bien existen métodos analíticos que dan gran
información en este sentido, son lentos y caros. Con este trabajo se quiere mostrar un método rápido y económico para la determinación de los parámetros de la madurez tecnológica de la uva: la espectrofotometría de infrarrojo. Se ha llevado a cabo la
calibración del equipo para la determinación de los parámetros ºBrix, ºBaume, Acidez total y pH con coeficientes de correlación
entre 95 y 99%.
Palabras clave: madurez tenológica, infrarrojo medio, ºBaumé, acidez total
1. INTRODUCCIÓN
El vino es actualmente una bebida altamente popular, y los consumidores cada vez son más exigentes en
cuanto a su calidad.
La calidad del vino es directamente proporcional a
la calidad de los racimos, por lo que es necesario profundizar
en el conocimiento de la materia prima para poder seleccionar la calidad de la vendimia, y lo que es fundamental, determinar el momento optimo de la misma. De esta forma se
puede progresar en la calidad de los productos elaborados.
Así pues la caracterización del potencial cualitativo de la vendimia es, lógicamente, una de las prioridades del viticultor y
del enólogo que quieren producir vino de calidad adaptado al
mercado [1].
El método generalizado para la elección del momento óptimo de vendimia, en función del vino que se quiera
elaborar, es la determinación de los análisis clásicos de la
maduración tecnológica (ºBaumé, pH, acidez total, evolución
del peso de granos), que dan información acerca de la madurez de la pulpa.
Por todo lo mencionado es esencial en la industria
vinícola la existencia de un sistema objetivo, rápido y económico de medida de la calidad de uva ya que hoy en día si
bien existen métodos analíticos que dan gran información en
este sentido, son lentos y caros [2].
El material vegetal utilizado son 205 muestras de
uva de la vendimia del 2006 procedentes de parcelas situadas en la denominación de origen Jumilla.
Como equipo se utiliza un espectrofotómetro FT-IR
cuyo sistema óptico es un interferómetro [3].
La espectrofotometría de infrarrojo medio (EMI) se
basa en la medida de las frecuencias de las vibraciones de
los enlaces químicos en grupos funcionales, como C-C, C-H,
C=O, O-H y N-H, sometidas a la absorción de radiación en la
región del infrarrojo medio (4000-670cm-1 números de onda).
Las medidas de las frecuencias se procesan por medio de
procedimientos matemáticos, que incluyen la Transformada
de Fourier y dan como resultado un espectro de absorbancia.
La EMI es normalmente aplicada como una técnica
de correlación por lo que la obtención de buenas calibraciones es un punto clave, ya que éstas van a influir directamente
en la calidad de los resultados. Los espectros se correlacionan con las correspondientes concentraciones de los componentes de una matriz de muestra a través de un proceso
de calibración que incluye procedimientos estadísticos multivariantes [4] como análisis de componentes principales
(PCA), regresión de componentes principales (PCR), y regresión de mínimos cuadrados (PLS).
El procedimiento de trabajo para utilizar esta técnica como método de cuantificación o de determinación de
la calidad de la uva o vino es el siguiente:
1º Selección de los parámetros que definen la calidad de la uva.
2º Selección del set de muestras de calibración.
Este es un punto importante, la integridad del modelo de calibración depende totalmente del set de muestras utilizado
para crearla Para obtener resultados cuantitativos el set de
muestras debe recoger toda la variabilidad y representatividad de fenómenos implicados en la cosecha (variedad, procedencia geográfica, tipo de vendimia, tipo de viña, estados
de maduración, climatología...). La calibración se debe realizar con muestras de un rango amplio y uniforme para cada
uno de los parámetros a modelar [5].
3º Análisis de las muestras por los métodos de referencia usuales en el laboratorio.
4º Paralelamente se analizan las muestras con el
espectrofotómetro con un método previamente definido obteniendo así los espectros de las mismas. La muestra no requiere ningún tipo de preparación. Únicamente se debe
triturar la uva, centrifugar el triturado y filtrarlo. Se debe con-
221
ISBN 978-84-690-6060-5
trolar la temperatura a la que se realiza el análisis por lo que
es aconsejable utilizar una celda de medida termostatizada.
Los espectros se obtienen por duplicado y se utiliza la media
de los mismos.
5º Cuando se dispone de los análisis de referencia
de laboratorio y de los espectros se procede a la correlación
entre ellos, es decir a la definición del modelo de calibración.
Aquí juega un papel importante la quimiometría, es decir, la
aplicación de procedimientos matemáticos para el procesado,
evaluación e interpretación de grandes cantidades de datos.
Se aplica a la búsqueda de correlaciones estadísticas entre
los espectros y el conocimiento de las propiedades de una
muestra [6]. En este momento se deben identificar y eliminarsi es el caso- las muestras extrañas (outliers) y por último se
debe validar el modelo.
3. RESULTADOS
La Tabla 1 muestra los resultados obtenidos para
los modelos de calibración de cuatro parámetros básicos medidos en mostos (pH, grados Brix y Baume y Acidez total) de
la vendimia del año 2006. En la tabla aparece el error estándar de predicción (SEP), la varianza y el coeficiente de correlación. Los datos obtenidos reflejan que se han obtenido
modelos aceptables, pero todavía no lo suficientemente adecuados para cuantificación.
4. CONCLUSIONES
Se puede concluir que esta técnica, por sus características de rapidez, bajo coste, fácil manejo… y por los resultados obtenidos hasta el momento, es una potencial herramienta muy útil en la determinación de la calidad en enología.
El campo de investigación de FT-IR es relativamente reciente y aunque algunas respuestas ya están ade-
lantadas quedan todavía muchas por descifrar, además el dominio de los nuevos sistemas analíticos no se improvisa enseguida. La técnica está empezando a desarrollarse y es
evidente que todavía requiere tiempo de investigación. Buscamos en la actualidad nuevas calibraciones que proporcionen menores errores de predicción.
5. BIBLIOGRAFÍA
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4. NIEUWOUDT, H.; PRIOR, B.; PRETORIUS, I.; MANLEY,
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models in wine and for the detection and classification of outlier samples. Journal of Agriculture and Food
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spectroscopy, and of the characteristics of a novel
PbS CCd array based near infrared spectrometer. Applied Spectroscopy reviews 37 (4) 383-402.
Tabla 1. Resumen modelos de calibración para mosto del 2006
222
ISBN 978-84-690-6060-5
EFECTO DE LA ADICIÓN PREFERMENTATIVA DE COPIGMENTOS EN LA
COMPOSICIÓN POLIFENÓLICA DE LOS VINOS DE TEMPRANILLO
Victoria Lizama; Inmaculada Álvarez; Mª José García; Rafael Apolinar; José Luis Aleixandre
Resumen:
Instituto de Ingeniería de Alimentos para el Desarrollo. Universidad Politécnica de Valencia
Cmno de Vera, s/n. 46022 Valencia. Tf. 963879838. [email protected]
El objetivo de este estudio es determinar la influencia de la adición prefermentativa de copigmentos en la composición polifenólica de los vinos. Para ello se ha utilizado uva de la variedad Tempranillo procedente de Utiel-Requena, que previo despalillado-estrujado fue sometida a distintas adiciones de copigmentos y a distintos tratamientos prefermentativos. Se han
realizado 6 experiencias de adición, por triplicado, de las cuales un grupo corresponde a las vinificaciones testigo y 5 experiencias a las vinificaciones con adiciones prefermentativas (ac. cafeico, rutina, catequina, tanino de hollejo de uva blanca, y tanino de pepita de uva blanca). El periodo de maceración-fermentación fue de 10 días en todos ellos. Una vez concluida la
fermentación alcohólica y maloláctica (previa siembra de levaduras y bacterias seleccionadas), y tras un período de estabilización natural de dos meses, se ha procedido a determinar la composición polifenólica de estos vinos. Se observa un aumento
de la Intensidad Colorante y del porcentaje de antocianos copigmentados, así como del Índice de Folin- Ciocalteu, en la práctica totalidad de los vinos suplementados con copigmentos, a excepción de los vinos suplementados con tanino procedente de
pepita de uva blanca, que no ha mostrado un efecto significativo con relación al testigo.
Palabras clave: maceración prefermentativa, Tempranillo, polifenoles, copigmentación.
1. INTRODUCCIÓN
Después de la fermentación, el contenido en antocianos decrece por degradación, precipitación, unión con sulfuroso, acomplejado con metales [1]. Minimizar estas
pérdidas de color es importante para conservar la calidad de
los vinos. Las reacciones de polimerización entre los antocianos y flavanoles permiten preservar el color de los vinos,
sugiriendo algunos autores que las reacciones de copigmentación de antocianos son el primer paso hacia la formación de
los de los pigmentos poliméricos estables [2 y 3].
Las reacciones de copigmentación han sido estudiadas en soluciones modelo, encontrándose que intervienen
en ellas algunos compuestos del grupo de los ácidos hidroxicinámicos y de los flavonoides, actúan sobre la coloración
de los antocianos, en distintas condiciones de pH, temperatura y concentraciones de copigmento y de antociano [4, 5 y
6]. En los mostos y vinos, los cambios de color producidos
son originados por reacciones de complejación de los antocianos con metales o de copigmentación con compuestos naturales presentes en las uvas. Las moléculas que actúan
como copigmentos incluyen una gran variedad de compuestos tales como polisacáridos, ácidos orgánicos, aminoácidos,
ácidos fenólicos, flavanoides e incluso los propios antocianos. Algunos autores, [7 y 8] estudiaron la copigmentación
con ácido cafeico y catequina, ambos constituyentes naturales de las uvas y vinos, adicionando estos componentes al
mosto antes de la fermentación, y establecieron que el ácido
cafeico presente en mosto parece tener un notable efecto en
la extracción del color, lo que puede ser debido a que contribuye a disolver más pigmentos debido a los equilibrios de copigmentación y a que los antocianos proporcionan más color
cuando están copigmentados. La adición de rutina se ha ensayado tanto en soluciones modelo como en vinos [9], obte-
niéndose incrementos significativos en la coloración de vinos
tintos mediante la adición prefermentativa de rutina. Otros autores [10], estudian el efecto de la adición de rutina, ácido cafeico y ácido p-cumárico a mostos de la variedad Cencibel y
Cabernet Sauvignon, encontrando que la rutina potencia la
copigmentación y la extracción de antocianos en los vinos de
Cencibel, pero observan que los ácidos hidroxicinámicos dan
lugar a resultados contradictorios, especialmente el ácido cafeico.
Estos resultados sugieren que la concentración de
copigmentos tienen una gran importancia en la concentración
de antocianos y en el color del vino tinto, y que la composición en pigmentos y copigmentos de la uva puede tener tanta
importancia como las técnicas enológicas empleadas [11].
Las uvas utilizadas para realizar el ensayo, fueron
de la variedad Tempranillo, vendimiadas en la D.O. Utiel-Requena con 13 ºBé. Una vez depalillada y estrujada, la uva se
encuba y se suplementa con 90 mg/kg de distintos copigmentos: ácido cafeico, rutina, catequina, proantocianidina de
hollejo y tanino de pepita ambos procedentes de uva blanca.
La fermentación tiene lugar a Tª controlada entre 25-28ºC.
Todos los ensayos se realizaron por triplicado en depósitos
de acero inoxidable siempre-llenos de 50 L de capacidad.
Durante la fermentación alcohólica se determinó
diariamente la temperatura y densidad, y se realizaron dos
bazuqueos diarios. Todos los depósitos fueron descubados
a la misma densidad. Tras la finalización de la fermentación
maloláctica, el vino es corregido en SO2 y embotellado, analizando la composición polifenólica a los tres meses.
Los parámetros convencionales está incluidos en el
Reglamento Oficial de la Unión Europea (34), es decir, den-
223
ISBN 978-84-690-6060-5
sidad, etanol, pH, azúcares, acidez volátil y total, contenido
en sulfuroso libre y total.
La composición fenólica se determinó por métodos
espectrofotométricos: IPT [12]; Taninos, Antocianos Totales
e Índice de Polimerización [13]; Intensidad Colorante, Tono,
Índice de HCl [14]; Índice de Ionización [14]; e Índice de
PVPP [14].
3. RESULTADOS
Los valores obtenidos en las determinaciones analíticas convencionales, son los habituales para vinos tintos jóvenes, sin hallarse diferencias significativas entre los
diferentes ensayos. Las figuras 1 y 2 se muestran el efecto de
los distintos copigmentos adicionados sobre los compuestos
polifenólicos a los tres meses del embotellado.
A tenor de los resultados obtenidos, la concentración de antocianos totales es superior en los ensayos suplementados con copigmento; siendo mayor este efecto con
rutina y ácido cafeico, existiendo diferencias significativas
(Fig. 1). Este mismo resultado fue obtenido por [7 y 8], en ensayos realizados con la adición prefermentativa de ácido cafeico y la de rutina, debido a que su presencia favorece la
extracción de antocianos durante la maceración. La concentración de catequinas, resulta significativamente superior en
los vinos obtenidos tras la adición prefermentativa de catequina, proantocianidina de hollejo de uva blanca y tanino de
pepita de uva blanca, debido a su naturaleza.
Fig. 1. Composición de antocianos totales y catequinas de
los vinos a los tres meses del embotellado.
polimerización, que sí aparecen en las vinificaciones realizadas con la adición prefermentativa de ácido cafeico y rutina.
El comportamiento observado en la intensidad colorante en la
figura 2, sigue la misma tendencia que el Índice Ionización
(que estima los antocianos que contribuyen al color), no existiendo diferencias significativas a los tres meses de embotellado entre los distintos ensayos realizados, pero con valores
superiores, que indican que el color puede ser más estable en
el tiempo, pudiéndose encontrar en un futuro diferencias significativas entre los aditivos en relación al testigo, y sobre
todo teniendo en cuenta los resultados obtenidos en las determinaciones del Índice de PVPP y en el Índice de Polimerización, apareciendo en ambos diferencias significativas con
respecto al testigo.
Fig. 2. Composición polifenólica de los vinos a los tres
meses del embotellado. Intensidad Colorante (I.C.); Tonalidad; Índice de Polifenoles Totales ( I.P.T.); Índice DMACH
(I. DMACH%); Índice de Ionización (I.I.%); Índice PVPP
(I.PVPP%); Índice de Polimerización (I.POL.%)
El Índice de PVPP, es una estimación de las uniones antociano-tanino y el Índice de Polimerización, la polimerización de antocianos, contribuyendo su aumento a una
estabilidad del color de los vinos, lo cual está relacionado con
el incremento de Intensidad Colorante y el descenso del Tono
para todos los ensayo en comparación con el vino testigo.
4. CONCLUSIONES
224
La intensidad colorante de los vinos a los tres
meses de embotellado resulta superior, aunque no se encuentran diferencias significativas, en los vinos adicionados
con copigmentos, en relación al vino testigo, siendo más acusado este efecto en el caso de la adición de ácido cafeico y
rutina, debido a que favorecen la extracción de antocianos. El
descenso significativo de la tonalidad en los vinos adicionados con copigmentos, indicaría una protección de los antocianos frente a la oxidación por parte de los copigmentos
adicionados. El Índice de DAMCH, representa una estimación del grado de polimerización de taninos, siendo inversamente proporcional a éste; los resultados obtenidos tal y
como se observa en la figura 2, ponen de manifiesto que con
la adición de flavanoles (catequina, proantocianidina de uva
blanca y tanino de pepita de uva blanca), a los tres meses de
embotellado no se han formado moléculas con alto grado de
La adición prefermentativa de copigmentos, favorece el incremento de Intensidad Colorante, la concentración
de antocianos totales, así como las uniones antociano-tanino,
que favorecen la estabilidad del color en el tiempo.
5. BIBLIOGRAFÍA
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6. AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen la financiación del proyecto
de investigación por el Ministerio Ciencia y Tecnología (AGL
2006-10723-C02-02).
225
ISBN 978-84-690-6060-5
EFECTO DE GLUTATIÓN Y L-CISTEÍNA COMO INHIBIDORES DE LA FORMACIÓN DE
COMPUESTOS PARDOS DERIVADOS DE LA REACCIÓN DE (+)-CATEQUINA Y ÁCIDO
GLIOXÍLICO
T. Márquez1, C. Millán1, J. Mérida2, J. M. Ortega1
1
2
Resumen:
Dpto. Microbiología. Universidad de Córdoba. Campus de Rabanales. 14014 Córdoba, España.
tfno: 957218640, e-mail: [email protected]
Dpto. Química Agrícola y Edafología. Universidad de Córdoba. Campus de Rabanales. 14014 Córdoba, España.
tfno:957218636
Se ha estudiado la reacción de (+)-catequina con ácido glioxílico en soluciones modelo, utilizando dos agentes inhibidores de la oxidación presentes en las células de levadura, glutatión y L-cisteína.
La presencia de ambos agentes inhibió parcialmente la formación de compuestos pardos. Tras 36 días de reacción
la medida de absorbancia a 420 nm disminuyó desde 23.5 u.a. en ausencia de inhibidores, hasta valores de 2.2 y 9.1 u.a. en
presencia de glutatión y de L-cisteína, respectivamente. El análisis por HPLC de los compuestos pardos originados reveló una
ralentización en su formación, a la vez que un descenso en su concentración en presencia de ambos agentes, que fue más pronunciado en el caso de glutatión, lo que indica su mayor poder inhibidor en la formación de compuestos responsables del pardeamiento.
Palabras claves: (+)-catequina, ácido glioxílico, glutation, L-cisteina, pardeamiento.
1. INTRODUCCIÓN
226
Una de las vías involucradas en el pardeamiento de
vinos blancos implica procesos de oxidación siendo, generalmente los polifenoles, los compuestos responsables de este
fenómeno (Cheynier et al. 1990). Concretamente, los monómeros de flavanos y oligómeros juegan un importante papel
en estas reacciones de oxidación. En este sentido Es-Safi et
al. (2003) han señalado la reacción de flavanos con ácido
glioxílico (presente en el vino como producto de oxidación del
ácido tartárico), como una de estas rutas de pardeamiento.
De otra parte, diversos autores han puesto de manifiesto la capacidad de las levaduras de adsorción de polifenoles (Salmon et al. 2002). En este sentido, autores como
Bonilla et al (2001) han propuesto a estos microorganismos
en tratamientos de acabado en el vino blanco. No obstante,
además de este efecto de retención, las levaduras en contacto con soluciones modelo de algunos flavanos, muestran
un retraso en la velocidad de pardemaniento, lo que sugiere
un efecto inhibidor en la formación de compuestos coloreados (López-Toledano et al. 2002). Estos resultados refuerzan
algunas observaciones que, tradicionalmente, se vienen desprendiendo en el estudio del envejecimiento biológico de
vinos finos Sherry, en el cual las levaduras de velo tienen un
efecto de competencia con fenoles frente al consumo de oxígeno, protegiendo a estos últimos de la oxidación (Mérida et
al. 2006). Estas apreciaciones, junto a otras relacionadas con
la mejora de algunos caracteres organolépticos, pueden justificar la práctica enológica tradicional en algunas regiones
vitivinícolas de envejecimiento sobre las lías de levaduras fermentativas (Salmon et al. 2002).
En este trabajo se ha estudiado, en solución modelo tipo vino, la reacción de (+)-catequina con ácido glioxílico, en presencia de dos compuestos presentes en la célula
de levadura, glutation y L-cisteina, conocidos por sus propiedades antioxidantes (Elskens et al. 2001; Lavigne et al.
2003, 2007), con el fin de evaluar su efecto sobre el pardeamiento de vinos blancos.
2.1. Reactivos:
(+)-Catequina fue suministrada por Sigma-Aldrich
Chemical, S.A. (Madrid, España). Acido glioxílico, glutatión, Lcisteína, etanol, acido acético, acetonitrilo y ácido fórmico
fueron obtenidos de Merck (Darmstadt, Germany). El agua
desionizada fue purificada antes de su uso con un Milli-Q
Water System (Millipore, Bedford, MA).
2.2. Reacciones:
Se han utilizado tres soluciones hidroalcohólicas (14
% v/v en etanol) con (+)-catequina (10,3 mM) y ácido glioxílico (5,1 mM). El pH se ajustó a 3.2 con NaOH 4N. Una de las
soluciones fue tratada con glutatión reducido, la segunda con
L-cisteína; ambos se añadieron al inicio de la reacción y en
concentración de 2,5 mM. La tercera solución se mantuvo
en ausencia de agentes inhibidores. Las disoluciones fueron
incubadas durante 50 días a 20 ºC.
ISBN 978-84-690-6060-5
2.3. Medidas espectrofotométricas:
Las disoluciones fueron filtradas a través de filtros
Milliipore de 0,45 µm. Se realizaron medidas espectrofotométricas a 420 nm con un espectrofotómetro Beckman, modelo DU 600, con una célula de 10 mm de paso de luz.
2.4. Medidas de oxígeno:
El oxígeno disuelto en las soluciones se midió con
un Disolved Oxygen Controller (Cole-Parmer).
2.5. Análisis HPLC/DAD:
Después de filtradas las muestras (Millipore, 0,45
µm de tamaño de poro) fueron analizadas por inyección directa en un HPLC (TermoFinnigan Spectra System P4000)
provisto de un detector de diodo array (TermoFinnigan, UV
6000 LP). Los compuestos eluidos fueron registrados a 280,
450 y 560 nm y expresados en áreas de pico. La columna
fue de fase reversa Merck C18 (250 mm x 4.6 mm i.d., 5 µm
de tamaño de partícula). Las condiciones cromatográficas
fueron las descritas por Mérida et al. (2006 ).
En la fig.3 se representa la evolución de una serie
de compuestos coloreados de mayor grado de polimerización
(HP) formados a partir de compuestos intermedios de la reacción. Estos pigmentos poliméricos están descritos como
responsables de la alta absorción que presenta el vino en las
proximidades de 450 nm durante el proceso de envejecimiento (Es-Safi et al. 1999).
Como se observa en ambas figuras, la presencia de
glutatión y L-cisteína ralentizó la formación de estos compuestos a la vez que inhibió parcialmente su formación. Si
bien, cabe señalar que la concentración alcanzada fue menor
en presencia de glutatión lo que indica su mayor poder inhibidor en la formación de compuestos responsables del pardeamiento.
Fig.2. Evolución del xantilium y trímero xanteno-xantilium
en el transcurso de la reacción.
( - ο-: testigo , -▲- : glutatión, -■-: L-cisteína).
3. RESULTADOS
La reacción de (+)-catequina y ácido glioxílico se inicia con la condensación del flavano con el ácido originando
compuestos incoloros, que por posterior oxidación dan sales
de xantilium coloreadas que absorben en la zona amarillomarrón del espectro (Es-Safi et al. 2003).
La fig. 1 muestra la evolución de la absorbancia a
420 nm en el transcurso de la reacción, en las tres condiciones ensayadas. Como puede observarse, cuando la reacción (+)-catequina-ácido glioxílico transcurrió en ausencia de
innhibidores, la absorbancia comenzó a aumentar a partir del
octavo dia hasta alcanzar valores de 23.5 u.a. al final de la reacción. La presencia de L-cisteina y glutation consiguió disminuir notablemente los valores de absorbancia hasta 9,1 y
2,2 u.a., respectivamente.
Fig.3. Evolución de los compuestos altamente
polimerizados en el transcurso de la reacción.
Fig.1 .Evolución de la absorbancia a 420 nm durante 36
días de reacción.
En la fig.2 se representa la evolución del xantilium
y trímero xanteno-xantilium en el transcurso de la reacción
en las tres condiciones ensayadas.
La figura 4 muestra la evolución del oxígeno disuelto en la solución modelo durante el desarrollo de la reacción. Cuando la reacción transcurrió en ausencia de
inhibidores se observó un descenso en la concentración de
oxígeno presumiblemente debido a su actuación en reacciones de oxidación de productos de condensación de (+)-catequina y ácido glioxílico (Es-Safi et al. 2002), lo que se reflejó
en la alta concentración de compuestos coloreados formados (fig. 2 y 3). En presencia de glutatión y L-cisteína la con-
227
ISBN 978-84-690-6060-5
centración de oxígeno permaneció prácticamente constante.
Esto sugiere que la inhibición parcial en la formación de compuestos pardos observada, hipotéticamente se deba a la
existencia de reacciones de oxido-reducción entre el ácido
glioxílico y dichos agentes, las cuales ocurrirían al margen
del oxígeno disuelto en el medio.
Fig.4. Evolución de la concentración de oxígeno en cada
una de las soluciones durante 36 días de reacción.
4. CONCLUSIONES
La adición de compuestos específicos presentes en
las levaduras, glutatión y L-cisteína, se comportan como inhibidores de la oxidación de compuestos responsables del
pardeamiento en vinos blancos. En la reacción de (+)-catequina y ácido glioxílico, estos agentes retrasan la formación
de los polímeros de mayor peso molecular responsables mayoritarios del aumento de color. El glutatión origina una mayor
disminución en la concentración de compuestos coloreados,
por lo que se muestra más efectivo en la prevención del pardeamiento.
228
5. BIBLIOGRAFÍA
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ISBN 978-84-690-6060-5
ESTUDIO DEL POTENCIAL DE LA VARIEDAD PALOMINO FINO PARA LA
ELABORACIÓN DE AGUARDIENTES PARA BRANDY DE JEREZ
Mª Soledad Jurado, Belén Puertas, Emma Cantos
Resumen:
IFAPA Centro Rancho de la Merced. CICE. Junta de Andalucía. Apartado 589. 11471, Jerez de la Frontera
Tfno: 956 03 46 18. Fax: 956 03 46 10. e-mail : [email protected]
El brandy de Jerez es una bebida espirituosa de fama internacional, muy importante para la economía del sector bodeguero jerezano. Se elabora envejeciendo aguardientes de vino en botas de roble previamente envinadas. Actualmente se producen unos 100 millones de botellas al año, cifra que supone aproximadamente el 95% del total del brandy español.
Los aguardientes que se han utilizado tradicionalmente para la elaboración de brandy de Jerez provienen fundamentalmente de los vinos de la variedad Airén, que es la variedad blanca más cultivada en España, localizándose su cultivo principalmente en Castilla La Mancha.
En Jerez, la variedad de vid tradicionalmente cultivada y con la que se elaboran los vinos característicos de la zona,
es la Palomino fino. Actualmente existe gran interés en el sector en producir brandy a partir de aguardientes de vino de esta
variedad.
En este trabajo se han estudiado las características agronómicas y enológicas de mostos, vinos y destilados de la variedad Palomino fino, durante las cosechas de 2004, 2005 y 2006.
A partir de los resultados obtenidos puede concluirse que con la variedad Palomino fino se obtienen aguardientes de
características muy apropiadas para la elaboración de brandy de Jerez.
Palabras clave: aguardiente, holanda, vino, brandy de Jerez, Palomino fino.
1. INTRODUCCIÓN
La calidad de un aguardiente viene determinada
por la calidad de la materia prima, la composición del fermentado obtenido y finalmente, por cómo se ha realizado la
destilación [1, 2, 3, 4]. Con la destilación, se pretende separar del medio fermentado (el vino), no sólo el etanol, sino también aquellos compuestos volátiles (impurezas o congéneres)
que proporcionan al destilado su sabor y olor agradable típico. De esta manera, la influencia de los compuestos minoritarios es más importante que la del propio etanol, al
depender de ellos las características organolépticas del
aguardiente obtenido, debiendo tratarse el proceso como la
destilación de una mezcla multicomponente [4].
Los aguardientes de vino más apreciados para la
elaboración de brandy son los llamados bajos grados u holandas, que se obtienen por destilación discontinua del vino
en alquitaras de cobre. Las holandas tienen una graduación
alcohólica comprendida entre 60 y 70% vol. y son muy ricas
en sustancias volátiles procedentes del vino (impurezas o
congéneres), que aportan a la holanda olores más profundos, de carácter vinoso, que la diferencian de los destilados
obtenidos por otros sistemas de destilación [5].
El cobre es el metal más ampliamente utilizado en
la fabricación de aparatos de destilación ya que es muy maleable, buen conductor del calor y resistente a la corrosión
por los ácidos del vino. Pero su cualidad más importante, que
hace que se siga utilizando en lugar de usar otros metales
más inocuos, como el acero inoxidable, es que actúa como
catalizador en reacciones de esterificación, contribuyendo a
la formación de aromas que pasan al destilado. También
actúa como catalizador en reacciones de acomplejamiento
de moléculas poco agradables a nivel organoléptico, como
los ácidos grasos y los compuestos azufrados residuales del
vino (tioles y mercaptanos) [2].
La variedad de vid con la que se elaboran los aguardientes para brandy de Jerez es la Airén, que es la variedad
blanca más cultivada de España, localizándose su cultivo
principalmente en Castilla La Mancha [5]. Actualmente, existe
gran interés en el sector bodeguero jerezano en producir
brandy a partir de aguardientes de vino de la variedad Palomino fino, que es la mayoritaria en la zona, con la que tradicionalmente se han elaborado los vinos característicos de
esta región. De esta manera, se le da otra alternativa a la producción vitícola de la zona, que hasta ahora se ha destinado
únicamente a la elaboración de vino.
En este trabajo se ha estudiado el potencial agronómico y enológico de la variedad Palomino fino para producir holandas para brandy de Jerez. Para ello, se ha realizado
el estudio agronómico, seguimiento de la maduración, vinificación y destilación del vino de la variedad Palomino fino durante las cosechas de 2004, 2005 y 2006.
Se cuenta con una parcela experimental en la que
hay plantadas 120 cepas de Palomino fino, cultivadas en secano. El terreno es albariza, clásico de la zona. Asimismo se
dispone de bodega experimental a escala piloto (con moledoras, prensas y fermentadores de 100 litros de capacidad
con sistema de refrigeración por ducha), alquitara de cobre
(provista de caldera de 25 litros de capacidad, retrógrado, refrigerante y con butano como combustible), cámara de frío
para conservar los vinos y laboratorio, equipado para reali-
229
ISBN 978-84-690-6060-5
zar los controles enológicos pertinentes. Entre los equipos de
laboratorio cabe destacar: valorador automático Crison, densímetro digital Anton Paar (Mod. DMA 4500), espectrofotómetro UV/VIS Perkin Elmer (Mod. Lambda 25),
espectrómetro de absorción atómica Perkin Elmer AAnalyst
200, HPLC Waters (Detector PDA 996 e IR 2410) y GC Perkin Elmer Autosystem (detector FID).
Los controles agronómicos realizados comprenden
fenología, sensibilidades y producción. El seguimiento de la
maduración para determinar la fecha óptima de vendimia se
realizó semanalmente, a partir de envero, y consistió en la
determinación del peso medio de la baya, residuo seco a 110
ºC, grado Baumé, pH, acidez total, ácido tartárico e índice de
maduración de una muestra de aproximadamente 1,5 Kg de
uva, tomada de cepas previamente marcadas. La vinificación
fue la tradicional para un vino blanco, a temperatura de fermentación controlada de 18 ºC, con adición de un inóculo de
levaduras comerciales (20 g/hl de Actiflore PM), y adición de
SO2 hasta una concentración de 70 mg/L. Una vez terminado, el vino se destiló de forma discontinua simple (un único
proceso de destilación) en alquitara de cobre (volumen destilado: 25 litros de cada vino). Se recogieron distintas fracciones de destilado. En base al análisis por GC y al contenido
en SO2 de cada fracción, se definió la cabeza, el corazón u
holanda y la cola del destilado. La destilación se consideró
terminada cuando el grado alcohólico del destilado obtenido
descendió hasta 20% vol. La refrigeración de los vapores hidroalcohólicos se realizó de manera que la temperatura de
salida del destilado fuera inferior a 15 ºC. Velocidad de destilación: 27ml/min.
Las determinaciones analíticas realizadas a los
vinos fueron: grado alcohólico, densidad, acidez total, pH, acidez volátil, ácidos orgánicos, glicerina, azúcares reductores,
SO2 libre y total, extracto seco, metales, compuestos volátiles, índice de Folin-Ciocalteu, D.O. 420 y D.O. 520. A los destilados se les determinó grado alcohólico, densidad, pH, SO2
libre y total, contenido en cobre y compuestos volátiles. Los
métodos utilizados en las determinaciones analíticas de mostos, vinos y destilados han sido los comunitarios de referencia [6, 7, 8], o en su defecto, los métodos usuales. El análisis
sensorial de vinos y destilados se llevó a cabo por un panel
de catadores entrenados, utilizando las fichas oficiales de
cata de la O.I.V.
3. RESULTADOS
Estudio agronómico: El año 2004 se caracterizó
por ser un año lluvioso (756 L/m2) mientras que 2005 (197
L/m2) y 2006 (391 L/m2) fueron años secos. Esto hizo que la
producción fuera mayor en 2004 (Fig. 1.). La vendimia se realizó a finales de agosto y el estado sanitario de la uva al llegar a bodega fue bueno los tres años estudiados.
Estudio enológico: Los vinos fermentaron correctamente hasta quedar con contenidos de azúcares reductores inferiores a 2 g/L. Las determinaciones de: densidad,
glicerina, ácidos orgánicos (acético, cítrico, láctico, málico,
succínico y tartárico), metales (calcio, cobre, hierro, potasio,
sodio y zinc) y compuestos volátiles (acetaldehído, acetato
de etilo, metanol, n-propanol, isobutanol e isoamílicos), presentaron los valores normales para vinos blancos. En cata,
los vinos presentaron color amarillo pálido, aroma afrutado y
en boca fueron frescos y ácidos, como corresponde a un vino
joven.
Tabla 1. Determinaciones analíticas de los vinos.
Tabla 2. Determinaciones analíticas de las holandas.
Fig. 1. Producción de uva (Kg/cepa).
230
(1) n-Propanol + Isobutanol + n-Butanol + 2-Butanol + Amílico + Isoamílico + n-Hexanol + Cis-3-hexen-1-ol + 2-Feniletanol.
(2) Hexanoato de etilo + Octanoato de etilo + Decanoato de etilo + Laurato de etilo.
ISBN 978-84-690-6060-5
Destilación: En función del contenido en SO2 total
y de compuestos volátiles de las fracciones de destilado obtenidas, se consideró: cabezas, entre el 1 y el 2% del volumen de vino destilado; holanda, entre el 14 y el 16%; y colas,
el 3,5%. El resto se consideró vinazas.
Para catarlas, las holandas fueron rebajadas con
agua destilada hasta grado alcohólico de 20% vol. Resultaron
ser muy aromáticas, con carácter afrutado y herbáceo, aunque algo punzantes, debido al SO2. El contenido en cobre es
demasiado elevado, pero esto se puede corregir elaborando
los vinos sin adición de SO2.
En cuanto al resto de parámetros analizados, los
valores obtenidos han sido los normales para una holanda.
Si la vinificación se realiza sin adición de sulfuroso,
conservando los vinos únicamente con frío y aislados del oxígeno, la destilación en alquitara será más rentable, ya que
se podrá reducir o incluso evitar efectuar el corte de cabezas, con lo que se obtendrá un mayor volumen de holanda y
con un grado alcohólico más elevado. También se reducirá
el contenido en cobre de los destilados, ya que se evitará la
corrosión que ejerce el ácido formado a partir del SO2 al destilar el vino.
4. CONCLUSIONES
La variedad Palomino fino es una variedad productiva, que da vinos de elevado grado alcohólico, con lo que su
empleo en la obtención de destilados puede ser rentable. La
producción se puede aumentar si se cultiva con riego.
Los aguardientes obtenidos a partir de esta variedad presentan características analíticas y organolépticas idóneas para su envejecimiento como brandy de Jerez.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. TANNER, H.; BRUNNER, H.R. 1982. La distillation moderne des fruits: un guide pour les dis-
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S.L. D.L.: M. 47042-2002.
REGLAMENTO CEE Nº 2676/1990 de la Comisión, de
17 de septiembre, por el que se establecen los métodos
de análisis comunitarios aplicables en el sector del vino
(D.O.C.E. Nº L272, de 3 de octubre, 1990).
REGLAMENTO CE Nº 2870/2000 de la Comisión, de
19 de diciembre de 2000, que establece métodos
comunitarios de referencia para el análisis de bebidas
espirituosas. D.O.C.E. Nº L333 de 29 de diciembre de
2000.
REGLAMENTO CE Nº 2091/2002 de la Comisión, de 26
de noviembre de 2002, que modifica el reglamento CE Nº
2870/2000. D.O.C.E. Nº L322 de 27 de noviembre de
2002.
6. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo se ha realizado gracias al proyecto financiado por el INIA RTA 2006-00036-C02-00 “Potencial
agronómico y enológico de variedades blancas de vid como
materia prima en la obtención de aguardientes para brandies
de Jerez”.
231
ISBN 978-84-690-6060-5
EVOLUCIÓN DE AMINAS EN VINO CHARDONNAY ENVEJECIDO SOBRE LÍAS:
INFLUENCIA DEL BATONNAGE
Resumen:
Departamento de Química Aplicada, Universidad Pública de Navarra
Campus Arrosadía s/n. 31006. Pamplona. Tf. (948)169598. e-mail: [email protected]
Algunos vinos blancos de la variedad Chardonnay se envejecen sobre sus lías en barricas de roble durante varios
meses para favorecer la calidad del vino. Durante este periodo tiene lugar la autolisis de las levaduras, que libera al medio
compuestos nitrogenados. Los resultados mostraron que el batonnage influyó en la concentración de histamina y tiramina,
siendo sus concentraciones superiores en las muestras sometidas a batonnage. El efecto del batonnage se observó después
de 135 días de permanencia del vino con las lías.
Palabras clave: envejecimiento sobre lías, aminas, Chardonnay, batonnage
1. INTRODUCCIÓN
Algunos vinos de la variedad Chardonnay se fermentan en barricas y después se les deja reposar sobre las
lías durante varios meses. Durante este tiempo el vino puede
permanecer sobre lías en reposo o puede ser agitado con un
bastón (batonnage). Las aminas son derivados nitrogenados
que pueden ser tóxicos o tener un efecto negativo sobre el
aroma del vino. La concentración de las aminas biógenas en
el vino depende de varios factores. Soufleros et al. [1] encontraron que los aminoácidos precursores y el nitrógeno
amínico son factores que influyen en la concentración final
de aminas biógenas del vino. La autolisis de microorganismos libera en el vino compuestos de bajo peso molecular
como compuestos nitrogenados, polisacáridos y lípidos. Por
tanto, el envejecimiento del vino sobre lías puede influir sobre
la formación de aminas en el producto. Por estas razones, el
objetivo de este trabajo ha sido estudiar la evolución de las
aminas en un vino Chardonnay envejecido sobre lías durante
180 días.
2.1. Muestras y vinificación
232
El mosto usado para este trabajo fue Vitis vinifera
var. Chardonnay, que se obtuvo tras prensar la uva (0,5 atm)
y desfangar el mosto por sedimentación natural. El mosto se
introdujo en cuatro barricas de 225 L fabricadas con roble
francés de Nevers, donde se realizó tanto la fermentación alcohólica como la maloláctica. El vino de dos de las barricas
envejeció con batonnage semanal de las lías y el de las otras
dos permaneció en reposo sin batonnage. Todas las muestras se envejecieron durante 180 días en bodega. La fermentación alcohólica duró 12 días (azúcares residuales < 2,5
g/L); tras esta fermentación se ajustó el SO2 total a 25 mg/L.
La fermentación maloláctica ocurrió tras la inoculación de Oenococcus oeni en concentración de 0,01 g/L (Uvaferm Alpha,
Lallemand) y duró 64 días. Para llevar a cabo el estudio se to-
maron muestras de cada una de las barricas tras 45, 90, 135
y 180 días de envejecimiento del vino sobre lías. Los parámetros enológicos de los vinos tras 180 días de envejecimiento se encontraron dentro de la normalidad.
2.2. Preparación de la muestra. Análisis de aminas y
aminoácidos por HPLC
Para la determinación de aminas se utilizó el método descrito por Torrea y Ancín [2]. Para ello se empleó un
cromatógrafo líquido Waters (Cromatografía Div., Milford, MA)
equipado con dos bombas modelo 510, inyector automático
717 Plus y detector de fotodiodo modelo 996. Se empleó una
columna Pico-Tag de fase reversa (300 mm x 3.9 mm i.d.),
con fase estacionaria compuesta por sílice amorfa enlazada
a grupos dimetiloctadecilsililo. Las aminas analizadas fueron
histamina, tiramina, putrescina, cadaverina, feniletilamina, espermidina, dietilamina, dimetilamina, etilamina, pirrolidina,
isobutilamina, isopropilamina y hexilamina. Feniletilamina y
espermidina no pudieron separarse por lo que se cuantificaron juntas. La determinación de aminoácidos se hizo según
el método descrito por Ancín et al. [3]. Para ello se empleó el
mismo cromatógrafo descrito anteriormente, pero equipado
con un detector de fotodiodo modelo 996. Se empleó la
misma columna Pico.Tag.
3. RESULTADOS
La concentración total de aminas biógenas del vino
Chardonnay aumentó durante el envejecimiento sobre lías,
de manera que al final del periodo de envejecimiento la concentración de estas aminas (no-batonnage: 29,72 ± 0,5; batonnage: 32,32 ± 0,5) fue significativamente superior (p<0,05)
a la encontrada en el vino joven tras la fermentación maloláctica (8,6 ± 0,5 mg/L). La mayor concentración de aminoácidos en el medio podría haber producido mayor cantidad de
aminas biógenas durante el envejecimiento del vino sobre
lías, ya que la descarboxilación de aminoácidos es un mecanismo adicional para la obtención de energía por parte de los
ISBN 978-84-690-6060-5
microorganismos cuando no disponen de otras fuentes de
energía. También forma parte del mecanismo de defensa de
las levaduras contra el medio ácido [4].
La concentración de tiramina (Fig. 1b) en el vino
envejecido durante 180 días con batonnage fue un 68 %
superior a la concentración encontrada en la muestra sin
batonnage. Existió una correlación positiva entre el tiempo
de almacenamiento del vino en barrica y la concentración
de tiramina en la muestra envejecida con batonnage, especialmente a partir de los 45 días de envejecimiento sobre
lías. La concentración de histamina al final del envejecimiento (Fig. 1a) fue un 21,4 % superior en la muestra con
batonnage, que en la muestra sin batonnage. Por lo que, la
influencia de la agitación de las lías en la concentración de
esta amina fue inferior al que se produjo en la tiramina. La
concentración de histamina aumentó en ambas muestras
durante el envejecimiento del vino sobre lías. Tras 180 días
de envejecimiento, la concentración de histamina en el vino
Chardonnay se encontró en el rango de 8-20 mg/L, donde
los vinos pueden presentar efectos negativos si se consumen en grandes cantidades [1]. La putrescina (Fig. 1c) fue
la amina mayoritaria en el vino y su concentración aumentó
(200 %) durante los primeros 45 días del envejecimiento del
vino en barrica sobre lías; posteriormente su concentración
permaneció constante y sobre ella no influyó el batonnage.
El hecho de que la putrescina fuera la amina que más
incrementó su concentración al principio del envejecimiento
del vino sobre lías pudo ser debido a que la concentración
de arginina (Fig. 2c) fue superior a la concentración del resto de aminoácidos precursores de aminas (Fig. 2a y 2b). No
se encontró correlación entre la formación de aminas biógenas en el medio y la evolución de sus aminoácidos precursores durante el envejecimiento (Fig. 1 y 2). Esto pudo ser
debido a que el vino es un medio complejo donde los aminoácidos se están descarboxilando por una parte, mientras
que por la otra están siendo liberados al medio por el autolisado de las levaduras. Cadaverina y el par feniletilamina +
Fig. 1. Evolución de la aminas biógenas (mg/L) en un vino Chardonnay envejecido con y sin batonnage.
Fig. 2. Evolución de los aminoácidos precursores de aminas (mg/L) y del nitrógeno amínico (mg
envejecido sobre lías con y sin botonnage.
/L) en un vino Chardonnay
233
ISBN 978-84-690-6060-5
espermidina mantuvieron sus concentraciones iniciales
(0,58 ± 0,07 y 1,6 ± 0,2; respectivamente) prácticamente
constantes a lo largo del envejecimiento.
Con el fin de ver la influencia de la agitación de las
lías en la concentración de aminas del vino durante el envejecimiento, se realizó un análisis cluster. Para ello, primero
se realizó un análisis de componentes principales para reducir el número de variables. De manera que se obtuvieron cuatro nuevas variables normalizadas que explicaban el 87,1 %
de la variabilidad y que se emplearon para realizar el análisis
cluster. El dendograma obtenido (Fig. 3) muestra un grupo
de muestras en el que están incluidos los vinos envejecidos
sin agitación durante menos de 135 días y el vino conservado
durante 45 días con agitación. El resto de las muestras se
encontraron a mayor distancia de este primer grupo. Estos
resultados sugieren que la aplicación de batonnage presentó
efecto sobre la concentración de aminas en periodos largos
de tiempo. Esto puede ser debido a que la aireación producida por el batonnage acelera la autolisis, ya que interfiere
en la estructura y en las funciones de las células [7]. Como se
muestra en la Fig. 2d, la concentración de nitrógeno amínico
fue significativamente superior (p<0,05) en la muestra con
batonnage. Sin embargo, en un medio tan complejo como el
vino, es difícil establecer correlaciones directas entre la formación de aminas biógenas y la evolución de los aminoácidos precursores.
CONCLUSIONES
La concentración de aminas biógenas en un vino
Chardonnay envejecido sobre lías fue superior a la concentración de estos compuestos en el vino joven. El batonnage
produjo un incremento en la concentración de histamina y tiramina del vino, al final del proceso de envejecimiento; siendo
la concentración de estas aminas superior en las muestras
sometidas a batonnage. El efecto del batonnage se observó
después de 135 días de permanencia del vino con las lías.
BIBLIOGRAFÍA
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and other wine compounds. Am J Enol Vitic 49:266-78.
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Fig. 3. Dendograma obtenido de la aplicación de un análisis cluster a las cuatro variables factoriales obtenidas de los datos de
aminas cuantificadas en el vino envejecido durante 180 días con y sin batonnage (nB: no-batonnage; B: batonnage)
234
ISBN 978-84-690-6060-5
EFECTO INHIBIDOR DEL VINO EN LA FORMACIÓN DE ALGUNOS TÓXICOS
CULINARIOS EN EL PROCESADO DE ALIMENTOS CÁRNICOS
M. R. Khan, R. Busquets, L. Puignou
Resumen:
Departamento de Química Analítica. Universidad de Barcelona
C/ Martí i Franquès, 1-11, E-08028, Spain
Telf:934021915, e-mail: [email protected]
Se ha estudiado la presencia de aminas heterocíclicas en platos de carne cocinados siguiendo recetas tradicionales
españolas, dónde se ha incluido vino en la preparación de algunos de ellos. Se ha observado el efecto inhibidor del vino en la
formación de HCAs. La determinación de HCAs se ha efectuado mediante extracción en fase sólida y cromatografía de líquidos acoplada a la espectrometría de masas en modo tándem.
Palabras clave: vino, aminas heterocíclicas, espectrometría de masas
1. INTRODUCCIÓN
La dieta se considera como una de las fuentes de
exposición más importantes a carcinógenos. Algunos tóxicos
endogénicos, como la acrilamida, hidroximetil furfural, furano
o aminas heterocíclicas se generan en procesos de cocción
a causa de las transformaciones que experimentan azúcares
y aminoácidos del propio alimento (reacción de Maillard). Las
aminas heterocíclicas, HCAs, se forman principalmente al cocinar alimentos proteicos, y hasta hoy se han identificado más
de 20 HCAs en platos de pescado y de carne cocinados. De
entre todas las HCAs, PhIP (2-amino-1-metil-6fenilimidazo[4,5-b]piridina) es la más abundante. Recientemente, “U.S National Toxicology Program” ha clasificado las
aminas heterocíclicas IQ, MeIQ, MeIQx, PhIP como “reasonably anticipated human carcinogens”. Es necesario desarrollar y promover el uso de hábitos y componentes
culinarios que minimizen la exposición de estos tóxicos. En
este trabajo se ha estudiado el efecto beneficioso del vino en
la inhibición de la formación de HCAs.
2.1 Materiales del análisis
Todos los disolventes y reactivos utilizados han
sido de calidad analítica y fueron comprados a Merck
(Darmstadt, Germany). Para la extacción de las aminas se
emplearon los siguientes cartuchos adsorbentes: C18 100
mg, PRS 500 mg (Varian, Harbor City, USA) y tierra de diatomeas (Hengoed, Mid-Glamorgan, UK). Los compuestos
estudiados fueron 2-amino-1,6-dimetilimidazo[4,5-b]piridina
(DMIP), 2-amino-3-metilimidazo[4,5-f]quinolina (IQ), 2-amino-3,4-dimetilimidazo[4,5-f] quinolina (MeIQ), 2-amino-3,8dimetilimidazo[4,5-f]quinoxalina (MeIQx), 2-amino-3,4,8trimetilimidazo[4,5-f]quinoxalina (4,8-DiMeIQx), 2-amino3,7,8-trimetilimidazo[4,5-f]quinoxalina (7,8-DiMeIQx), 2-amino-6-metildipirido[1,2-a:3’,2’-d]imidazole (Glu-P-1), 2-aminodipirido[1,2-a:3’,2’-d]imidazole (Glu-P-2), 2-amino-3,4,7,8-
tetrametilimidazo[4,5-f]quinoxalina (4,7,8-TriMeIQx), 2-amino-1-metil-6-fenilimidazo[4,5-b]piridina (PhIP), 3-amino-1,4dimetil-5H-pirido[4,3-b]indole (Trp-P-1), 3-amino-1-metil5H-pirido[4,3-b]indole (Trp-P-2), 2-amino-9H-pirido[2,3b]indole (A C), 2-amino-3-metil-9H-pirido[2,3-b]indole
(MeA C), fueron comprados a Toronto Research Chemicals (Toronto, Canada), y 1-metil-9H-pirido[4,3-b]indole
(Harman), 9H-pirido[3,4-b]indole (Norharman), fueron comprados a Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA).
Los vinos se han comprado en tiendas locales, con
la excepción de los vinos D.O. Tarragona que han sido amablemente cedidos por la Universidad Rovira i Virgili. Vinos
D.O. Tarragona: Vino A: Crianza, 2001. Cabernet sauvignon
(50%), merlot (20%), tempranillo (15 %), cariñena (15%).
Vino B: Reserva, 2001. Cabernet sauvignon (50%), merlot
(25%), syrah (25%). Vino C: Reserva, 2000. Cabernet sauvignon (33%), merlot (17%), tempranillo (33%), syrah (17%),
vintage 2000. D.O. Utiel-Requena: Vino D: 2002. Tempranillo
(100%). D.O. Penedès: Vino E: Vino joven, 2004. Merlot, D.O.
Valdepeñas: Vino F: Reserva, 2001. Tempranillo (100%). Vino
G: Vino joven, 2005. Xarel·lo, Macabeo y Parellada.
2.2 Instrumentos y aparatos
Cromatógrafo de líquidos HP 1100 (Agilent Technologies USA) dotado de una bomba cuaternaria y un inyector
automático fue acoplado a un espectrómetro de masas.
La separación cromatográfica se realizó con con
una columna SymmetryÒ C8 (150 x 2.1 mm) de 5 µm de tamaño de partícula (Waters, Milford, U.S.A). La separación óptima de los analitos se consiguió con una fase móvil binaria
a un flujo de 0.3 ml×min-1. Solución A: acetonitrilo y solución
amortiguadora B 30 mM acido acético-acetato de amonio
ajustada a pH 4.5. El gradiente de separación: 0-0.5 min,
5% A; 0.5-15 min, 5-20% A; 15-18 min, 20-60% A; 18-24 min,
60% A; 24-27 min, retorno a condiciones iniciales. El volumen de inyección fue de 5 µl. En este estudio se han usado
dos espectrómetros de masas distintos, uno de ellos dotado
con un analizador de trampa iónica (LCQ Finnigan MAT, San
235
ISBN 978-84-690-6060-5
Jose, CA) y el otro con analizador de triple cuadruplo
(API3000, PE SCIEX, Canada), ambos con fuente de electrospray. La determinación por esta técnica se ha realizado
en modo MS/MS. La temperatura en la superficie de alimento
durante la cocción se ha monitorizado mediante sondas termopares (Nomadics Stillwater, OK). La homogenización de
la muestra de análisis se ha llevado a cabo con un homogenizador Ultra-Turrax® T 25 basic (IKA, Staufen).
2.3 Procedimientos culinarios
Los filetes de ternera (100 g, 8-10 mm de grosor)
fueron cocinados mediante dos tipos de procedimientos culinarios: simples y elaborados. Los procedimientos simples
han implicado únicamente el uso de aceite de oliva (fritura) y
sal (1g/filete). En la cocción de ternera mediante procedimientos culinarios elaborados, típicos españoles, se ha
usado una gran variedad de componentes, destacando el uso
de vino en el proceso culinario.
Chuletas de ternera con pimientos. Componentes:
harina, mantequilla, aceite de oliva, pimiento verde asado,
caldo de ternera, sal y vino G. T cocción: 210-225 ºC tiempo:
3 min/cara. Redondo de ternera asado con boniato. Componentes: zanahoria, puerros, pimiento verde, ajos, harina, sal
y vino F. T cocción: 210-225 ºC tiempo: 35 min/cara. Lomo
de ternera asado. Componentes: ajo, perejil, aceite de oliva,
pimienta negra, sal y vino G. T cocción: 210-225 ºC tiempo:
10 min/cara.Ternera guisada. Componentes: aceite de oliva,
verdura pochada (cebollas, zanahoria, tomate, pimiento, puerro), tomillo, romero, pimienta, patatas, pasas, champiñones,
perejil, sal y vino F. T cocción: 210-225 ºC durante 30
min/cara.
Se han realizado estudios de marinado con distintos
vinos A, B, C, D, E para determinar el efecto producido por
éstos en la formación de HCAs cuando es usado como componente culinario. Alternativa y paralelamente se usó una solución de etanol al 13 % en agua para encontrar el efecto del
medio de marinado. En estos ensayos se usaron filetes de
pollo (80 g, 8 mm de grosor). La cocción se realizó durante 5
min/cara en una paella termostatizada a T: 220 ºC. No se usó
ni aceite ni sal [1].
2.5 Tratamiento y cuantificación de la muestra
236
La superficie de la carne cocinada (3 mm) fue separada y triturada. El tratamiento de muestra se realizó siguiendo el procedimiento previamente publicado [2]. La
superficie de carne triturada (3 g) se mezcló con NaOH 1M en
una proporción 1:2 y se homogenizó la mezcla mediante un
brazo Ultraturrax. 9 g de la pasta resultante se dispersó
sobre tierra de diatomeas (13 g) y se empaquetó en una columna. Los analitos fueron extraídos mediante 75 ml de acetato de etilo y transferidos a un cartucho intercambiador
iónico PRS. Éste se lavó con acetato de etilo (7 ml), con una
mezcla de metanol/agua (4:6) (15 ml) y con agua (2ml). Las
HCAs fueron eluidas hacia un cartucho C18 mediante acetato de amonio 0,5 M ajustado a pH 8,5 (20 ml). Finalmente
los analitos fueron eludíos con metanol/amoníaco (9:1) (0,8
ml). La muestra purificada resultante fue evaporada con ni-
trógeno hasta sequedad. Las muestras se guardaron a 4ºC
hasta su análisis por LC-MS/MS. La cuantificación se realizó
mediante adición estándar.
3. RESULTADOS
La carne de ternera cocinada siguiendo distintos
procedimientos de cocción ha generado HCAs a diferentes
niveles. Las concentraciones de las HCAs estudiadas se
muestran en las Fig. 1 y Fig. 2 (ternera) y en Fig. 3 (pollo).
PhIP ha sido la amina mutagénica más abundantes en todos
los procesos de cocción, encontrándose hasta 3,5 ng/g en
ternera a la plancha, sin embargo en pollo se ha observado
unos niveles mucho más altos, de hasta 72 ng/g. Es bien conocido que esta amina heterocíclica se genera con más
abundancia en aves de corral. En la Fig. 1 y Fig. 2 se han
omitido los niveles de los comutágenos Harman y Norharman. Estos comutágenos se generaron en un rango de 2-16
ng/g, tanto en la ternera cocinada con procedimientos simples como siguiendo recetas mas elaboradas. No se han detectado las aminas Glu-P-1, Glu-P-2, IQ, MeIQ y
7,8-DiMeIQx, siendo su límite de detección estimado 0,01
ng/g cuando se utilizó el espectrómetro de masas de triple
cuadrupolo.
Es importante destacar la disminución de los niveles
de HCAs en ternera, por debajo de 1 ng/g, cocinando mediante las recetas mas elaboradas con respecto a los procedimientos más simples (fritura, a la plancha, rebozado). Este
hecho puede ser debido a la acción de los compuestos antioxidantes incorporados de los distintos componentes y a
una transferencia de calor a la carne menos eficaz durante su
cocción. Con el fin de estudiar el efecto del vino, se marinó
carne de pollo, previamente a la fritura, con distintos vinos
(A-E) y con una mezcla hidroalcohólica simulando vino (5
min/cara a T: 220 ºC). A modo de ejemplo en la Fig. 3 se
muestra el efecto de marinar con vino en PhIP, observándose
por primera vez un gran efecto inhibidor de la formación de
los mutágenos estudiados. Se ha demostrado que son los
componentes minoritarios del vino y no su matriz hidroalcohólica los responsables del efecto quimioprotector encontrado. Concretamente PhIP fue reducida hasta en un 88%
cuando la carne se marinó durante 24 h. A modo de ejemplo,
en esta figura (Fig. 3) se muestran sólo los resultados obtenidos para PhIP con los vinos de D.O. Tarragona, sin embargo resultados comparables se han observado con vinos
de D.O. Penedès y Utiel-Requena.
4. CONCLUSIONES
En el presente trabajo se ha hallado una importante
reducción de aminas heterocíclicas en el procesado de carne
de ternera cuando se ha cocinado siguiendo procesos culinarios elaborados, en los cuales se ha incluido vino. Adicionalmente se ha confirmado en el procesado de carne de pollo
el efecto quimioprotector del vino frente a la generación de
aminas heterocíclicas debido a componentes de su matriz.
Este efecto quimioprotector se ha encontrado en todos los
vinos probados hasta el momento.
ISBN 978-84-690-6060-5
Figura 1. Contenido de HCAs en ternera cocinada frita,
a la plancha y rebozada
Figura 3. Efecto de los tres vinos y de una solución
etanólica de referencia en la formación de HCAs a distintos
tiempos de marinado.
Figura 2. Contenido de HCAs en ternera cocinada
con procesos elaborados incluyendo
5. BIBLIOGRAFÍA
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R. Márquez, R. Natera, R. Castro*, C. García
Resumen:
Centro Andaluz de Investigaciones Vitivinícolas. Universidad de Cádiz.
Pol. Río San Pedro, s/n, 11510, Puerto Real, (Cádiz). Tlf: 956016456
E-mail: [email protected].
La fracción volátil de un vino está determinada por cientos de compuestos de muy diferente naturaleza química.
La presencia o ausencia de éstos en el producto final viene condicionada por todos y cada uno de los factores que confluyen en su elaboración, desde las condiciones climatológicas bajo las cuales se desarrolla la uva hasta la etapa de envejecimiento a la que puede someterse el vino obtenido, pasando por las condiciones específicas de vendimia y
fermentación, sin olvidar la variedad de uva empleada.
En muchos casos, la variedad de uva empleada condiciona totalmente el perfil aromático del vino obtenido, al
persistir los compuestos volátiles ya presentes en la uva de partida a lo largo de todo el proceso de vinificación.
En Andalucía, los vinos dulces son obtenidos a partir de dos variedades de uva, Moscatel y Pedro Ximénez, tras
un tradicional proceso que incluye una etapa de secado de las uvas por exposición directa al sol y posterior envejecimiento
dinámico.
En este estudio se ha llevado a cabo la caracterización de la fracción volátil de diferentes muestras de vinos dulces naturales andaluces procedentes de ambas variedades de uva con vistas a evaluar aquellos compuestos que pueden ser relevantes a la hora de condicionar el perfil organoléptico de este tipo de vinos.
Palabras clave: Vinos dulces andaluces y compuestos volátiles.
1. INTRODUCCIÓN
238
La fracción volátil del vino está determinada por
centenares de compuestos químicamente diferentes. Los alcoholes, aldehídos, ésteres, ácidos, monoterpenos, y otros
compuestos de menor importancia constituyen generalmente
la fracción volátil de este producto. Su presencia o ausencia
en un vino particular depende de varios factores incluyendo
el ambiente (clima y suelo), madurez y variedad de la uva,
fermentación y otras condiciones en la vinificación y envejecimiento.
Algunos de estos compuestos están ya presentes
en las uvas; otros se forman durante los procesos de fermentación y del envejecimiento [1]. En muchos casos la variedad
de uva empleada en la obtención de un vino particular determina totalmente el aroma de ese vino. Esto es porque ciertos
compuestos presentes en la uva persisten a través del proceso de vinificación. Muchos de estos compuestos son de tipo
terpénico, aunque hay también otros que son específicos en
ciertas variedades. El grado al cual estos compuestos persisten desde la uva al vino será influenciado por las condiciones
de vinificación y envejecimiento [2]. Sin embargo, el proceso
de vinificación en sí mismo y particularmente la fermentación
alcohólica realizada por las levaduras, genera la parte mayor
de los compuestos aromáticos presentes en el vino [3].
En Andalucía, los vinos dulces son obtenidos tras
el secado de las uvas por la exposición directa al sol. Se elaboran en Málaga, Montilla-Moriles y Jerez mediante un método tradicional, usando dos variedades de uvas, Moscatel y
Pedro Ximénez.
El proceso comienza con la corta escrupulosa de
racimos, en perfectas condiciones de madurez y sanidad vegetal, que se transportan en cajas, con sumo cuidado para no
romper las uvas hasta el almijar o paseras donde se extienden sobre redores o capachos de espartos de 1,5 a 2,0 metros de diámetro o sobre largas tiras de material plástico de
aproximadamente un metro de ancho. Expuestos al sol, los
racimos van pasificándose lentamente, perdiendo agua, concentrándose todos sus componentes, evolucionando los aromas de la uva y acelerando su maduración por un complejo
proceso en el que tiene una clara influencia las condiciones
climatológicas. Durante la noche las uvas soleadas en redores o en tiras de material de plásticos se tapan plegando el
propio redor para evitar la deposición del rocío y se procede
a voltear al día siguiente, con el propósito de homogenizar
las condiciones de sobremaduración o secado natural.
Las uvas logran niveles de azúcar de 300 g/l y se
prensan empleando prensas hidráulicas.
Después de esto, debido al alto contenido de azúcar y por lo tanto, una fermentación difícil, se fortifica con etanol para asegurarse que el vino contendrá por lo menos
15-18 % de alcohol.
El vino dulce joven se somete generalmente a un
sistema del envejecimiento oxidativo dinámico, envejecimiento en solera.
En este estudio el objetivo es caracterizar los compuestos químicos principales que constituyen la composición
libre de aroma y podrían ser relevantes para determinar el
perfil organoléptico de los vinos dulces andaluces obtenidos
de las uvas Moscatel y Pedro Ximénez. Ambas variedades
ISBN 978-84-690-6060-5
de la uva son aromáticas y la persistencia de ciertos compuestos varietales en los vinos finales debe depender de las
condiciones exigentes de su vinificación y envejecimiento.
2. MATERIALES Y MÉTODO
2.1 Muestras
Veinte vinos dulces andaluces fueron analizados.
Todas eran muestras comerciales compradas en España. Las
muestras fueron divididas en dos categorías según variedad
de uva, diez de la variedad Moscatel y diez de la variedad
Pedro Ximénez.
2.3 Determinación de componentes volátiles
Los perfiles aromáticos fueron determinados por
duplicado sometiendo a las muestras a una etapa previa de
microextracción en fase sólida (SPME), previamente optimizada en nuestro Grupo de Investigación [4], seguida de CG.
Para la identificación de las señales obtenidas se
empleó un cromatógrafo de gases con detector de masas
(impacto electrónico y cuadrupolo).
2.4 Tratamiento estadístico
Diferentes técnicas estadísticas (análisis de clusters, análisis de componentes principales, etc.) fueron empleadas a la hora de abordar el estudio de los datos
correspondientes a la fracción aromática de las diferentes
muestras. Para ello se hizo uso del paquete estadístico “Statgraphics Plus 5.1” para Windows XP.
3. RESULTADOS
Treinta compuestos volátiles fueron identificados en
las muestras estudiadas. Su presencia se podría explicar ba-
sándonos en una relación entre el contenido de estos compuestos y las variedades particulares empleadas, junto con
las condiciones específicas del proceso de vinificación y envejecimiento.
Los principales compuestos volátiles cuantificados
han sido: acetato de etilo, alcoholes isoamílicos, lactato de
etilo, ácido acético, 2-furaldehido, linalool, succinato de dietilo, a-terpineol y 2-feniletanol.
Los vinos Moscatel demostraron un alto contenido en linalool, a-terpineol y limoneno. Karagiannis et al.,[5]
encontraron que las concentraciones libres del linalool,
citronelol, nerol y geraniol disminuyen durante el envejecimiento prolongado en madera, aunque estas disminuciones se pueden contrarrestar por la hidrólisis de los terpenos glicosilados durante el mismo período. Bitteur et
al.,[6] encontraron un aumento en el contenido de los terpenos en uvas moscatel sometidas a metabolismo anaerobio a una temperatura de 32ºC. Por lo tanto, en nuestro caso, estas altas concentraciones en los vinos Moscatel se podrían explicar atendiendo a un posible metabolismo anaerobio de las uvas durante el secado por la
exposición al sol.
El envejecimiento en madera (edad del barril, grado
de tostado) y el proceso de producción (con una etapa inicial
del secado de las uvas al sol) debería explicar el alto contenido en 2-furaldehido encontrado para estos vinos en particular.
3.3 Análisis estadístico
El dendrograma obtenido tras el análisis de Clusters de los resultados obtenidos se muestra a continuación
(fig.1). Podemos observar tres agrupaciones principales, un
para los vinos dulces de Pedro Ximénez; y dos para los vinos
dulces de la variedad moscatel. Como se puede demostrar,
uno de estos grupos solamente agrupa a tres muestras, dos
de ellos del mismo productor de vino.
Fig. 1: Dendrograma obtenido con los compuestos volátiles de las muestras estudiadas.
M: Vino Moscatel; PX: Vino Pedro Ximénez.
239
ISBN 978-84-690-6060-5
Así mismo, se realizó un análisis de componentes
principales (PCA) observándose en la figura 2, dos tipos de
vinos identificados según su composición aromática: primero
los vinos de la variedad Pedro Ximénez (valores negativos
de PC1 y valores positivos de PC2), y un amplio grupo constituido por los vinos obtenidos de las uvas moscatel (valores
negativos de PC2).
Los compuestos volátiles responsables de esta distribución junto a algunos característicos de la variedad de uva
empleada son aquellos obtenidos durante la fermentación alcohólica y/o durante el secado al sol.
4. CONCLUSIONES
Se ha caracterizado la fracción volátil de los vinos
dulces Andaluces obtenidos a partir de dos variedades de uva
muy aromática. A pesar de estar sometidos a procesos de
vinificación y envejecimiento similares, la variedad de uva de
partida marca el perfil organoléptico final del vino obtenido.
5. BIBLIOGRAFÍA
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review. CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 12, 59-111.
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Am. J. Enol. Vitic. 55, 346-354.
4. CASTRO, R.; NATERA, R.; BENÍTEZ, P.; BARROSO,
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conjunction with GC-MS. Anal. Chim. Acta, 513, 141150.
5. KARAGIANNIS, S.; ECONOMOU, A.; LANARIDIS, P.
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from the island of Samos. 2000. J. Agric. Food Chem.
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6. BITTERU, S., TESNIERE, C., SARRIS, J.; BAUMES,
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43, 41-48.
6. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo está subvencionado por el Ministerio
de Ciencia y Tecnología (AGL 2003-03774).
Figura 2: Distribución en el plano constituido por los dos primeros componentes
principales de las diferentes muestras estudiadas.
240
ISBN 978-84-690-6060-5
DIFERENCIACIÓN ENTRE LOS CULTIVARES ALBARÍN BLANCO Y BLANCO
LEGÍTIMO POR SUS PERFILES FENÓLICOS EN HPLC-DAD
Antón Masa, Mar Vilanova
Resumen:
Misión Biológica de Galicia (CSIC). Apartado 28 – 36080-Pontevedra
Tlf. 986 854800 [email protected]
En este trabajo se plantea el estudio de los compuestos fenólicos de las variedades Albarín blanco y Blanco legítimo
mediante HPLC-DAD con el fin de establecer las diferencias existentes entre ellas, pudiéndose concluir que el método permite
diferenciar perfectamente entre ambas a pesar de que en algún trabajo ampelográfico se ha afirmado que se pudiera tratar de
la misma variedad.
Palabras clave: Albarín blanco, Blanco legítimo, HPLC-DAD, compuestos fenólicos
1. INTRODUCCIÓN
Tradicionalmente, la diferenciación entre variedades de vid (Vitis vinifera L.) se ha basado en la descripción de
sus características morfológicas y agronómicas, pero hoy en
día es de sobra conocida la influencia que las condiciones
ambientales tienen sobre muchos de estos parámetros, lo
que obliga a buscar marcadores bioquímicos y moleculares
que permitan lograr este objetivo. En este sentido, la identificación de compuestos de naturaleza fenólica en vid, es hoy
una herramienta de indudable utilidad en la caracterización
de variedades de vid [1,2,3].
El objetivo fundamental de nuestro trabajo es el diferenciar las variedades de vid Albarín blanco y Blanco legítimo mediante el estudio de sus perfiles fenólicos por
HPLC-DAD, ya que en algún caso se ha considerado la posibilidad de que se trate de una única variedad.
Las plantas utilizadas se encuentran en colección
en la Misión Biológica de Galicia (Pontevedra), y el estudio se
ha realizado durante el trienio 2004-2006. El material vegetal
(uvas en estado de madurez tecnológico) se ha mantenido a 20 ºC hasta el momento de su utilización. A partir de las pieles
y siguiendo los métodos descritos por Masa [4], se han extraído, diversos compuestos fenólicos que se han separado e
identificado (total o parcialmente) mediante técnicas cromatográficas (HPLC, PC, TLC) y espectrofotométricas (UV/vis).
Las diferencias significativas existentes entre los
perfiles fenólicos para las variedades estudiadas fueron calculadas mediante la utilización del programa Enterprise
Guide 3 System (SAS Institute, Cary, NC, USA) y las representaciones gráficas con el programa Sigmaplot 2001 para
Windows (SPSS, USA).
3. RESULTADOS
En este estudio se han podido identificar, parcial
o totalmente, un total de 35 compuestos fenólicos, que
una vez cuantificados nos han permitido establecer la “huella dactilar” para cada una de las variedades estudiadas.
En la Fig. 1 se presentan los cromatogramas tipo (extraidos a 356 nm) para cada variedad, mientras que la Tabla
1 muestra (en % de área de pico) los contenidos medios
para los tres años estudiados de los 35 compuestos fenólicos separados, así como las características cromatográficas y espectrofotométricas de cada uno de ellos. Para
7 de estos compuestos (los picos 1, 9, 10, 22, 23, 29 y
33) existen diferencias significativas (p<0.05) entre ambas
variedades.
4. CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos muestran evidentes diferencias entre el perfil fenólico de las dos variedades estudiadas; en este sentido, hay que destacar de forma particular
las diferencias en concentración en derivados de la Quercetina (74.78% para el Albarín blanco y 67.65% para el Blanco
legítimo) y del Kaempferol (18.98% para Albarín blanco y
26.32% para el Blanco legítimo) y muy especialmente la relativa a los picos 22 y 23 (Quercetina-3-O-glucósido y Quercetina-3-O-rhamnosido, respectivamente) que permiten
diferenciar perfectamente las dos variedades estudiadas.
5. BIBLIOGRAFÍA
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chromatography. J. Chromatogr. 1094, 34-41.
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4. MASA A. (2001). Kaempferol-3-O-fructósido y quercitina-3-O-fructósido: Dos nuevos flavonoides presen-
241
ISBN 978-84-690-6060-5
tes en Vitis vinifera cv “Albariño”. XXIII Jornadas de
Viticultura y Enología Tierra de Barros (Almendralejo)
6. AGRADECIMIENTOS
Este estudio fue financiado por el proyecto
XUGA40301B94 del gobierno de Galicia (España). M. Vilanova es investigadora contratada Isidro Parga Pondal (Xunta de
Galicia).
Tabla 1. Valores medios y desviación estándar de los compuestos fenólicos identificados y cuantificados en Albarín blanco y
Blanco legítimo en los años 2004, 2005 y 2006.
242
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A)
B)
Fig. 1. Cromatogramas tipo: a) Albarín blanco y b) Blanco legítimo.
243
ISBN 978-84-690-6060-5
CARACTERIZACIÓN DE LA INFLUENCIA DEL COLOR SOBRE MEDIDAS ÓPTICAS IR
PARA MONITORIZAR LA PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE VINO
Miguel A. Pérez1, A. García1, Jesús A. Baro3, R. Crespo2, Carlos E. Carleos4, Luis M. Cárcel2
1
2
Dpt. de Ingeniería Eléctrica y Electrónica de la Universidad de Oviedo. Campus de Viesques s/n 33203 Gijón
Dpt. de Ingeniería Agrícola y Forestal de la Universidad de Valladolid. Campus de la Yutera 34004 Palencia.
3
4
Resumen:
Dpt. de Ciencias Agroforestales de la Universidad de Valladolid. Campus de la Yutera 34004 Palencia.
Dpt. de Estadística e Investigación Operativa de la Universidad de Oviedo. Campus de Viesques s/n 33203 Gijón
Este trabajo presenta un estudio completo de la caracterización de la influencia del color sobre varios parámetros ópticos del vino. El color del vino es un parámetro variable, cuyo valor se puede determinar mediante estándares industriales, de
elevada importancia tanto en el procesado como en la caracterización final del vino.
Sin embargo, el color se puede considerar un elemento perturbador de ciertas medidas ópticas, en general en todas
aquellas en que no se realice a través del propio líquido, como las realizadas con turbidímetros en línea. En estos casos se debe
recurrir a fuentes de luz IR para reducir la absorción de luz y reducir así las perturbaciones. Se presenta un estudio de varios
vinos que muestra el efecto del color sobre las determinaciones ópticas. Los resultados demuestran que sólo se producen pequeñas perturbaciones en esa zona del espectro en relación con un estándar de agua ultra pura. Por tanto, las medidas ópticas del vino se pueden realizar con IR con baja perturbación debida el color.
Palabras clave: IR, espectrofotometría, color, absorbancia.
1. INTRODUCCIÓN
Las medidas ópticas realizadas en líquidos que implican el hecho de que la luz atraviese una porción de ese líquido pueden verse afectadas por la atenuación de la luz a lo
largo de su recorrido. Esa atenuación puede deberse a las
causas que se pretenden medir o pueden deberse a causas
ajenas a la medición, constituyendo una interferencia más o
menos importante en el proceso según se muestra en la Fig.
1.
En particular, en la industria del vino, la turbidez es
una de esas medidas ópticas que obliga a que la luz atraviese una porción del vino; esta medida resulta un parámetro básico de calidad en vinos acabados y de control durante
los procesos de vinificación. Para un vino acabado, la turbidez suele ser muy baja, en la mayoría de los casos, menor de
1 o 2 NTU pero, durante los procesos de vinificación, los valores alcanzables pueden llegar a ser muy altos, superando
el valor de 2000 NTU lo que establece un margen de medida
muy amplio. La turbidez cuantifica el número de partículas en
suspensión en un líquido y se mide obteniendo el nivel de luz
dispersado por esas partículas [3] [4] [7] [8] [9] [10] según
puede apreciarse en la Fig. 2.
Para reducir la influencia de la atenuación de la luz
a lo largo del camino recorrido a través del vino, las medidas
se deben hacer en el infrarrojo próximo y emplear algún procedimiento de tipo nefelométrico como el que se mostraba
en la Figura 2 que permita cuantificar el número de partícu-
Fig. 1. Algunos de los fenómenos más frecuentes que sufre la luz cuando atraviesa un líquido.
La mayoría de ellos dependen de diversas circunstancias propias del líquido como su color, composición,
cantidad de partículas en suspensión, temperatura, etc..
244
ISBN 978-84-690-6060-5
Fig. 2. Determinación de la turbidez mediante un turbidímetro de tres haces, uno emisor y dos receptores para leer la
luz directa y la dispersada por las partículas en suspensión
en el líquido.
atenuación y turbidez. Sin embargo, en este caso, surge
la duda del efecto del color sobre la medida ya que la atenuación podría deberse a la turbidez o la interferencia del
color según se indicó en la Fig. 1. En los siguientes apartados se va a estudiar esa influencia para acotar la máxima incertidumbre que una actuación de este tipo introduciría en la medida.
las a través de la relación entre la luz transmitida y la luz dispersada [9] [10], dando lugar a diversas soluciones para sensores en aplicaciones de todo tipo [1] [2] [5] [6]. Una medida
ratiométrica como esa eliminaría la influencia del color a cualquier longitud de onda. Sin embargo, en márgenes de medida muy amplios como el que se pretende, aparecen
comportamientos poco deseables, con curvas no lineales y,
lo peor de todo, no monótonas que produce valores iguales
para valores diferentes de turbidez según se muestra en los
resultados experimentales de la Fig. 3.
El problema podría resolverse, midiendo sólo la
luz transmitida a través del vino y evitando la medida de
la luz dispersada, apareciendo una buena relación entre
Fig. 3. La medida ratiométrica directa causa un problema
de indefinición debido a que valores de turbidez diferentes
producen un mismo valor de salida. Por ejemplo, con 200
NTU se obtiene un valor semejante al que se tiene con 0
NTU lo que resulta totalmente inaceptable.
Para comprobar el efecto del color se han efectuado una serie de medidas de absorción en la zona de
infrarrojo donde trabajaría un sistema de medida de turbidez como el que se indicó en la Fig.2. Se han elegido
un total de 12 vinos acabados y comercializados, de los
que 5 son tintos, tres rosados y cuatro blancos; para ellos,
se ha obtenido el espectro de absorción en la zona del
infrarrojo de la fuente de luz mediante un sistema como
el que se muestra en la Fig. 4.
El sistema que actúa como banco de ensayo consiste en una fuente de luz infrarroja realizada con el LED
L7758 que admite una corriente máxima de 100 mA y que
tiene su pico de emisión en 850 nm, con un ancho de banda
de 50 nm y con un espectrofotómetro tipo VIS-NIR 2000 de
Ocean Optics capaz de medir en la zona de emisión del LED;
el sistema se completa con un computador que recoge y procesa los datos, obteniendo la absorción relativa respecto a la
de una muestra de agua ultra pura que se analizará también
en este sistema.
3. RESULTADOS
Los resultados obtenidos con el sistema de la Fig. 4
se muestran en las gráficas de la Fig. 5, donde se puede observar las pequeñas diferencias que surgen en la absorción
para las muestras de vino en relación con la que presenta el
agua ultra pura.
Los espectros de la figura 5 se pueden integrar para
obtener un efecto totalizador que permita evaluar el error total
que supondría la absorción de la luz en la zona infrarroja. Así,
en la Tabla 1 se muestran estos totales que no alcanzan, en
ningún caso, un error del 1%, incluso despreciando la información que puede suponer conocer a priori el tipo de vino
con el que se está trabajando. Si se usase este dato, el efecto
sería aún menor y podría estimarse en un error menor del
0,2% para tintos y rosados y en un efecto despreciable para
los vinos blancos estudiados.
Fig. 4. Banco de ensayo para la obtención del espectro de absorción de muestras de vino.
245
ISBN 978-84-690-6060-5
Figura 5. Absorciones relativas de diversos vinos respecto a la que presenta el agua ultra pura en el margen de trabajo del LED
L7758, que comprende la zona de IR próxima al espectro visible. Como se puede ver, los niveles de absorción son realmente
pequeños y representarán un efecto despreciable
5. BIBLIOGRAFÍA
4. CONCLUSIONES
Se puede concluir, entonces, que es posible hacer la
medida de turbidez – o cualquier otra en que se utilice la zona
del IR – en vino sin preocuparse del efecto del color puesto
que las pérdidas e incertidumbres producidas por él se mantienen dentro de márgenes muy estrechos. Así, es factible
emplear técnicas no ratiométricas para la medida de turbidez
en vino cuando los valores de esta variable resulten bajos.
1. COUTO, L.M. AND CALDEIRA, M.A. 2002 Port-wine
spectral monitoring Spectroscopy Europe 14/5, pp. 2227.
2. COUTO, L.M. AND CALDEIRA, M.A. 2003 Port wine
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5. GARCÍA, A. ET. ALL, 2005 A New Design of Low-Cost
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6. S. MYLVAGANAM , T. JAKOBSEN, 2001 Turbidity sensor for under water applications Aanderaa Instruments
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Tabla 1. Influencia del tipo de vino en la absorción de luz en el infrarrojo en relación con el agua ultra pura.
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9. OIV, 1994 Compendium of International Methods for
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10. OIV 2000 Wine turbidity, Resolution OENO 4/2000.
11. COLOMBRE, S., MALHERBE, S., SABLRYROLLES J.M.
2005 Modelling alcoholic fermentation in enological
conditions: feasibility and interest, Ann. J. Enol. Vitc.
56:3
6. AGRADECIMIENTOS
Los resultados que se presentan en este trabajo
han sido obtenidos a lo largo del proyecto de I+D financiado
por el MEC, con referencia DPI 2005-09200-C02-02.
247
ISBN 978-84-690-6060-5
DETERMINACION DEL ESTADO DE MADUREZ DE UVAS TINTAS MINORITARIAS EN
CASTILLA-LA MANCHA MEDIANTE ANALISIS SENSORIAL
E. Sánchez-Palomo1; P.M. Pérez Juan2; M.A. González-Viñas1
1
Área de Tecnología de Alimentos. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad de Castilla-La Mancha
Avda. Camilo José Cela, 10, 13071 Ciudad Real.
2
Resumen
LIEC Poligono industrial calle XI, parcela R-113, 13200 Manzanares. Ciudad-Real
Se ha estudiado la evolución del perfil sensorial de las uvas de la variedad Tortosí minoritaria en la región de Castilla-La Mancha comparándola con la de la variedad Cencibel que es la que presenta mayor superficie de cultivo en esta región.
El estado de madurez de las uvas ha sido determinado mediante la aplicación del Análisis Sensorial Descriptivo Cuantitativo
(QDA)
Palabras clave: Uvas; Análisis Sensorial; Madurez; Índices químicos
1. INTRODUCCIÓN
248
La calidad de la uva y por tanto del vino, es el resultado de la interacción de numerosos factores entre los que
se incluyen aspectos biológicos, físicos, climáticos y culturales. Esta calidad, está directamente relacionada con su estado de madurez, el cual debe considerarse por tanto un
factor determinante a la hora de elaborar vinos, en consecuencia el momento de la vendimia determinará en gran medida la calidad final del vino.
La madurez de la uva es un fenómeno complejo,
que hasta el momento ha estado sobretodo definido por características químicas [1]. De forma tradicional la máxima expresión de las características varietales se asociaba con una
concentración de azúcares y acidez adecuadas, pero actualmente se está valorando en mayor medida la utilización de
los distintos índices de madurez. La madurez tecnológica o
madurez de la pulpa corresponde al estado en el cual la acumulación de azúcares en la pulpa es máxima, la acidez es
baja, y la relación azúcares/acidez elevada. La madurez fenólica o madurez pelicular es alcanzada cuando el potencial
antocianos es máximo, las paredes celulares están suficientemente degradadas para permitir una buena extracción de
los antocianos y la contribución de los taninos de las semillas
a la concentración total de taninos es baja [2]. Sin embargo,
el análisis químico no permite más que una visión parcial de
estos índices de madurez. Además, los métodos de análisis
de polifenoles y antocianos actuales limitan mucho las posibilidades de desarrollo de estas mediciones a nivel de bodegas y viñedos. No es posible analizar, hoy en día, antocianos
o polifenoles al mismo ritmo que el grado potencial o acidez
total en la uva.
En el caso de los vinos, el análisis sensorial descriptivo y cuantitativo constituye una herramienta interesante de caracterización, con la condición de basarse
siempre en descriptores precisos y rigurosamente definidos. Algunos autores [3,4] han propuesto como método
alternativo y de fácil aplicación el Análisis Sensorial Des-
criptivo de las uvas para determinar el momento óptimo
de vendimia.
El objetivo del presente trabajo fue la aplicación del
Análisis Sensorial Descriptivo Cuantitativo al estudio del perfil sensorial de las uvas de la variedad minoritaria Tortosí durante las tras últimas semanas antes de su elaboración y
compararlos con los de la variedad Cencibel que es la que
presenta mayor superficie de cultivo en la región de CastillaLa Mancha.
Se han analizado uvas de dos variedades tintas cultivadas en la región de Castilla-La Mancha, Cencibel y Tortosí
recogidas en perfecto estado sanitario durante las tres últimas semanas antes de su elaboración, de acuerdo con un
plan de muestreo establecido.
El Análisis Sensorial Descriptivo Cuantitativo de
las uvas fue realizado por el grupo de 10 catadores expertos en análisis sensorial, según el método propuesto por
Rousseau y col en el año 2000 [5], con algunas modificaciones, sobre tres uvas de cada una de las variedades
escogidas al azar. Para ello, una muestra representativa
de la vendimia, aproximadamente 200 bayas, era manualmente recogida a primera hora de la mañana. La toma
muestra se realizó procurando que fuera representativa
de la parcela y del estado general de madurez de la viña
(diferentes cepas, con mayor o menor exposición al sol,
diferentes zonas de la parcela con mayor o menor densidad de plantas…)
El método se basa en el análisis individual de las
tres principales partes de la uva: pulpa, hollejo y granilla.
Cada catador evaluó una lista de descriptores que permitió la
caracterización visual, táctil y gustativa de las uvas, utilizando
una escala estructurada de 4 puntos. En general, las escalas
utilizadas para la cuantificación de cada uno de los descriptores estaban acotadas en el extremo izquierdo por poco in-
ISBN 978-84-690-6060-5
tenso y muy intenso en el extremo derecho, siendo los puntos intermedios medianamente intenso e intenso.
En las Figuras 1 y 2 se muestran respectivamente,
la evolución de los atributos del perfil sensorial de las uvas de
las variedades Cencibel y Tortosí, durante las tres últimas semanas antes de su elaboración.
En cada una de las variedades de uva estudiadas,
el perfil sensorial está representado por un histograma que
muestra las puntuaciones medias otorgadas por los catadores para cada atributo según la escala estructurada utilizada.
De manera general podemos afirmar que, en
ambas variedades de uva, la maduración de las uvas se caracteriza por:
- Una pérdida de elasticidad de la uva, evolución del
color hacia rojo oscuro con notas negras.
- Un aumento del azúcar de la pulpa y disminución
de la acidez.
- Una pérdida de aromas herbáceos de la pulpa
desarrollándose aromas frutados.
Sin embargo, la evolución del perfil sensorial de
cada una de las variedades estudiadas, pone de manifiesto
que los cambios en las características sensoriales del hollejo
fueron más lentos que los de la pulpa aunque la evolución de
la acidez, del azúcar y de los aromas herbáceo y frutado se
desarrolló en el mismo sentido, manteniéndose práctica-
mente constante la firmeza del hollejo. Con respecto al perfil
sensorial de la granilla, apenas se observaron cambios durante las tres últimas semanas antes de su elaboración. Esta
evaluación general coincide con lo observado por otros autores en el seguimiento del perfil sensorial de diferentes variedades de uva durante su maduración, aunque los perfiles
sensoriales son diferentes en función de la variedad de uva
[5]. En este sentido hay que decir que las uvas de la variedad
Tortosí frente a las de la variedad Cencibel presentan una
evolución más rápida del color externo y de las notas frutales,
alcanzándose mayores valores de estos atributos con mucha
mayor antelación.
A la vista de los resultados obtenidos del Análisis
Sensorial de uvas en el momento de la elaboración, así como
durante el seguimiento realizado en las semanas previas a
la elaboración, podemos observar como, el método de Análisis Sensorial de las uvas ofrece al viticultor y al enólogo una
herramienta interesante para tomar decisiones sobre la fecha
de vendimia.
Este método de evaluación puede ser utilizado
como complemento de los controles de madurez tradicionales, permitiendo caracterizar mejor el nivel de madurez de la
uva, sobretodo en la fase final de la maduración, cuando la
acumulación de azúcares se ralentiza y el potencial aromático
y el fenólico evolucionan rápidamente.
Por otro lado, permite caracterizar mejor el potencial
cualitativo de la vendimia, y realizar una primera evaluación de
la calidad de los vinos que van a ser elaborados a partir de ellas.
Figura 1 Histograma de la evolución del perfil sensorial de las uvas de la variedad Cencibel durante las tres últimas semanas
de su elaboración
249
ISBN 978-84-690-6060-5
Figura 2 Histograma de la evolución del perfil sensorial de las uvas de la variedad Tortosí durante las tres últimas semanas de
su elaboración.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. FLANZY C. 1998. Oenologie, fondements scientifiques et technologiques. Collection Sciences et Techniques Alimentaires. Lavoisier Tec et Doc.
2. SAINT CRICQ DE GAULEJAC, NATHALIE, VIVAS N.,
GLORIES Y.,1998 Maturité phénolique, définition et
contrôle. Revue Francaise d’Oenologie. N173, P22-25.
3. DELTEIL D., 2000, Evaluation sensorielle du profile
gustatif des vins. Revue des Œnologues, nº 94, 21-23
4. DELTEIL D. 1996. Utilisation de l’analyse sensorielle
pour la caractérisation des effets des levures sur les
250
vins rouges. Les arômas du vin, caractérisation et genèse. Toulouse 10 mai 1996, Lallemand S.A., Toulouse,
59-62
5. ROUSSUAU, J.; DELTEIL, D. 2000. Présentation dùne
méthode dánalyse sensorielle des raisins. Principe,
mhétode et grille dínterpretation. Revue Française
d´Œnologie, nº 183, 10-13.
6. AGRADECIMIENTOS
Se agradece la financiación de éste trabajo a la
Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha a cargo del
proyecto PBI 05-051.
ISBN 978-84-690-6060-5
EFECTOS DE PYRACLOSTROBIN EN EL PROCESO FERMENTATIVO DE UVAS
VARIEDAD TEMPRANILLO Y EN LAS CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICAS DEL
VINO ELABORADO
Laura Lagunas-Allué 1, Luis Vaquero-Fernández1, María Teresa Martínez-Soria1, Purificación FemándezZurbano1, Jesús Sanz-Asensio1, Miguel López-Alonso2, Luis Carlos Mateo-García3
1
Resumen:
Departamento de Química. 2 Departamento de Agricultura y Alimentación. Universidad de La Rioja.
Madre de Dios, 51. 26006 Logroño. Tfno: 941 299 622. e-mail: [email protected]
3
Delegado técnico de BASF
Pyraclostrobin es un fungicida de la familia de las estrobilurinas las cuales poseen un amplio espectro de actividad y
son uno de los pocos grupos de control tanto para Mildiu como para Oidio [1]. En este trabajo se comparan los efectos en el
proceso fermentativo de uvas variedad tempranillo de este nuevo fungicida aplicado en la misma parcela de viñedo durante tres
años consecutivos a las dosis recomendadas. Los resultados obtenidos a lo largo de estos tres años muestran que la presencia de este producto no afecta al proceso fermentativo. Asimismo, se han observado diferencias en parámetros como concentración de lacassa, pH y color en el vino obtenido con uvas tratadas comparado con el control sin tratar. El análisis sensorial de
estos vinos también muestra diferencias organolépticas entre sí.
Palabras clave: Pyraclostrobin, estrobilurinas, Tempranillo, Proceso fermentativo, Análisis sensorial.
1. INTRODUCCIÓN
El que las uvas lleguen a bodega en condiciones lo
más óptimas posibles requiere de una buena y correcta práctica vitícola. Uno de los enemigos de la calidad de las uvas
son las enfermedades a que se pueden ver sometidas las
cepas. El estado sanitario de las uvas es un parámetro de
calidad de las mismas. Algunas de las enfermedades más
habituales de las viñas son la Botrytis (Botrytis cinerea), el
Oídio de la vid (Uncinula necator) y el Mildiu de la vid (Plasmopara vitícola). Las consecuencias del desarrollo de estos
hongos son muy importantes tanto en la producción de las
uvas como en los múltiples problemas que pueden ocasionar en la elaboración. Los síntomas de la enfermedad en la
viña se hacen evidentes al comienzo de la maduración,
cuando las bayas son más sensibles y en condiciones climáticas adecuadas se expande de forma rápida afectando al
rendimiento de la viña y a la calidad del vino [2]. La utilización
de productos fitosanitarios (fungicidas) sobre el habitual ataque y propagación de estos hongos proporciona hasta este
momento los resultados más satisfactorios, actuando con
efectos tanto preventivos como curativos [3]. No obstante, la
utilización de estos productos conlleva algunos importantes
inconvenientes como son: la posible presencia de residuos
(materia activa y/o metabolitos) en los mostos y vinos [4-6],
la influencia de estos en la ralentización y/o paralización de
la fermentación alcohólica y maloláctica [7,8], causando en
algunos casos variaciones en la composición aromática y con
ello en la calidad final del vino.
En el presente trabajo se ha determinado la influencia de un nuevo producto fitosanitario en su utilización
como tratamientos para evitar enfermedades en la Vitis vinifera, variedad Tempranillo, así como sus posibles efectos en
la fermentación y en la calidad del vino. El Pyraclostrobin, es
un fungicida que pertenece al grupo de las Estrobilurinas, N{2-[1-(4-clorofenil)-1H-pirazol-3-iloxilmetil]fenil}(N-metoxi) carbamato, registrado actualmente por la BASF como Cabriotop,
grupo que posee un amplio espectro de actividad y son unos
de los pocos grupos de control tanto para Mildiu como para
Oídio.
2.1. Materiales
Densímetro, Termómetro, Refractómetro, Equipo
para acidez volátil García Tena, Equipo para análisis de anhídrido sulfuroso Rankine, pHmetro, Espectrofotómetro de
absorción molecular UV-VIS, Equipo de análisis NIR Foss
Grape Scan.
2.2. Tratamiento y Elaboración
Las cepas variedad Tempranillo procedentes de la
misma parcela en la zona de Rioja Alta (dentro de la Denominación de Origen Calificada Rioja) fueron tratadas con Cabriotop (5% Pyraclostrobin) durante tres años
consecutivos,2004, 2005 y 2006 a la dosis recomendada por
el fabricante BASF Española, de 2 kg/Ha. Se dejaron un número de filas sin tratar con el fin de tener un testigo de la parcela.
La elaboración se llevó a cabo en la bodega experimental de la Universidad de La Rioja. La uva se vendimió en
el mes de octubre. Una vez vendimiada, se pasó a la despalilladora-estrujadora y la pasta fue conducida a los depósitos
de fermentación de 100 L. La elaboración se realizó por duplicado tanto para el testigo como para la uva con tratamiento.
251
ISBN 978-84-690-6060-5
Posteriormente se inocularon los depósitos (30
g/HL) con la cepa Saccharomyces cerevisiae. Se realizó un
seguimiento de la fermentación alcohólica midiendo los parámetros más importantes. Una vez finalizada la fermentación alcohólica, se procedió al descube y el vino yema
obtenido se llevó a depósitos de 50 L. Posteriormente se llevó
a cabo la fermentación maloláctica sembrando (1 g/HL) las
bacterias lácticas Oenococcus oeni. Se siguió la fermentación realizando un control periódico de la cantidad de ácido
málico mediante método enzimático y Foss Grape Scan. Una
vez finalizadas las fermentaciones se tomaron muestras para
realizar los correspondientes análisis.
Fig. 1. Evolución del % de azúcar durante la fermentación
en cada depósito.
tenecientes a la Asociación de Enólogos de La Rioja junto
con egresados y alumnos de la Licenciatura de Enología en
la Universidad de La Rioja.
3. RESULTADOS
3.1. Evolución de la Fermentación
La Figura 1, correspondiente al año 2004 y representativa de los tres años estudiados, muestra la evolución
del contenido de azúcar durante la fermentación alcohólica.
Se observa un inicio más rápido de las fermentaciones de los
mostos de uvas tratadas con respecto al testigo. A partir de
las 60 horas siguen una misma tendencia con valores similares en el % azúcar.
En cuanto a la fermentación maloláctica, en 2004 y
2005 su duración fue de 23 y 20 días respectivamente. En
2006, dicha fermentación duró 57 días. En ninguno de los
tres años se encontraron diferencias entre el testigo y el vino
tratado.
3.2 Parámetros de la Fermentación
En la Tabla 1 se resumen los valores encontrados
para los diferentes parámetros estudiados en las muestras
Tabla 1. Valores de distintos parámetros al inicio y final de la fermentación.
2.3. Análisis Sensorial
252
Aproximadamente tres meses más tarde, se realizó
el análisis sensorial a través de un test Duo-Trio para comprobar si los vinos procedentes del tratamiento podían ser diferenciados de forma significativa. Más tarde se realizó un
análisis descriptivo sobre los mismos vinos. Los análisis organolépticos fueron realizados por un panel de expertos per-
tomadas tanto al inicio como al final de la fermentación correspondiente a los años 2004, 2005 y 2006.
En el primer año de tratamiento, 2004, se observan
en las uvas tratadas con Pyraclostrobin unos valores superiores para ºBrix y acidez total respecto al testigo tanto en
mosto como en vino. Los valores correspondientes a Índice
de Polifenoles Totales (IPT), cantidad de taninos e Índice de
Color (IC) son muy similares a los del testigo en las mues-
ISBN 978-84-690-6060-5
tras de vino, final del proceso. Para pH y tonalidad tampoco
se encuentran diferencias. El grado alcohólico alcanzado es
inferior que al de los vinos sin tratamiento.
Para las uvas del año 2005 tratadas con Pyraclostrobin se observaron unos valores ligeramente inferiores para
ºBrix en el caso del mosto y para grado alcohólico en las
muestras de vino. Los valores obtenidos de pH y acidez total
del mosto y vino son muy similares. Tampoco se encuentran
diferencias para IPT, cantidad de taninos, IC y tonalidad.
En la elaboración con uvas tratadas en el año 2006
con Pyraclostrobin se observan unos valores ligeramente inferiores para ºBrix y acidez total. IPT, cantidad de taninos e IC
presentan valores inferiores a los del vino testigo. El grado
alcohólico del vino elaborado en este año es superior al testigo.
El test Duo-Trío realizado para determinar si los
vinos procedentes de distintas uvas pueden diferenciarse,
demostró que los vinos elaborados con uvas tratadas con
Pyraclostrobin, y sin tratamiento, no difieren entre sí a un
nivel de significación del 5%. A continuación se realizó un
análisis descriptivo de los vinos. Se comentaron las características de la fase visual, olfativa y gustativa. En la fase visual
se observa que los vinos de uvas tratadas con Pyraclostrobin
presentan una capa ligeramente mayor que el testigo y un
mayor componente violáceo en el color. En la fase olfativa
los vinos elaborados con presencia del fungicida tienen una
intensidad aromática más baja que el control, con una calidad
aromática limpia y franca en químico. Los dos tipos de vinos
presentan un carácter frutal y vegetal similar. Dentro de la
fase gustativa, los sabores se encuentran más equilibrados
en los vinos que proceden de uvas tratadas. Los dos poseen
un tacto suave y ligero. Ambos presentan un postgusto con
carácter marcadamente frutal, siendo el vino tratado menos
persistente que el testigo.
4. CONCLUSIONES
Las diferencias obtenidas en los parámetros estudiados durante los tres años muestran que la presencia de
Pyraclostrobin no afecta de forma sistemática a ninguno de
ellos.
El análisis sensorial muestra que no se aprecian diferencias significativas entre los diferentes vinos para cada
año.
La presencia de Pyraclostrobin no modifica la evolución del proceso fermentativo ni las características organolépticas del vino elaborado.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. KEINATH, A.P.; DUBOSE, V.B. 2004. Evaluation of
fungicides for prevention and management of powdery mildew on watermelon. Crop Protection 23, 3542.
2. DUBOS, B. 1999. Maladies cryptogamiques de la
vigne. Editions Feret, Bordeaux, France.
3. MUCKENSTURM N.; DECOIN, M. 2000. La pourriture
grise de la vigne: Pourquoi la lutte échoue parfois, et
comment la faire réussir. Phytoma, 525, 50-52.
4. CABRAS, P.; ANGIONI, A. 2000, Pesticide residues in
grapes, wine and their processing products. J. Agric.
Food Chem., 48, 967-973.
5. RIAL-OTERO, R.; CANCHO-GRANDE, B.; SIMAL-GÁNDARA, J. 2003. Multiresidue method for fourteen fungicides in white grapes by liquid-liquid and
solid-phase extraction followed by liquid chromatography-diode detection. J. Chromatogr. A, 992, 121131.
6. COUDERCHET, M. 2003, Benefits and problems of
fungicide control of Botrytis cinerea in vineyards of
Champagne. Vitis, 42, 165-171.
7. NAVARRO, S; BARBA, A.; OLIVA, J.; NAVARRO, G.;
PARDO, F. 1999. Evolution of residual levels of six
pesticides during elaboration of red wines. Effect of
wine-making procedures in their dissappearance. J.
Agric. Food Chem., 47, 264-270.
8. CABRAS, P.; FARRIS, G.A.; FIORI, M.; PUSINO, A. 2003.
Interaction between fenhexamid and yeasts during
the alcoholic fermentation of Saccharomyces cerevisiae. J. Agric. Food Chem., 51, 5012-5015.
6. AGRADECIMIENTOS
A la Universidad de La Rioja por la Beca FPI concedida a Dª. Laura Lagunas Allué y por el proyecto ANGI
2004/18. Al INIA por la Infraestructura (proyecto VIN00-054C2-01). Al MEC por la concesión del proyecto AGL200502313/ALI. A Bodegas D. Mateos S.L. y a la Asociación de
Enólogos de La Rioja.
253
ISBN 978-84-690-6060-5
EFECTOS DE LA UTILIZACIÓN DEL FUNGICIDA PIRIMETANIL EN LA ELABORACIÓN
DE VINOS TINTOS
Luis Vaquero-Fernández 1, Laura Lagunas-Allué 1, María Teresa Martínez-Soria 1, Purificación FemándezZurbano 1, Jesús Sanz-Asensio 1, Miguel López-Alonso 2, Luis Carlos Mateo-García 3
1
Departamento de Química
2
Madre de Dios, 51. 26006 Logroño. Tfno: 941 299 622. e-mail: [email protected]
3
Resumen:
Delegado técnico de BASF
Pirimetanil es un fungicida muy utilizado en vid, pertenece a la familia de las anilinopirimidinas y actúa de modo sistémico contra la infección del hongo Botrytis cinerea. En este trabajo se estudia el efecto sobre la fermentación alcohólica y maloláctica que tiene la aplicación de este fungicida a las uvas de la variedad Tempranillo durantes tres años consecutivos en la
misma parcela de Rioja Alta.
Los resultados obtenidos muestran que la presencia de este producto no afecta a los procesos de fermentación alcohólica y maloláctica. Se han observado ligeras diferencias en parámetros como grado, pH, acidez y color en el vino obtenido
con uvas tratadas comparado con el testigo. Se ha realizado el análisis sensorial de los vinos obtenidos.
Palabras clave: Pirimetanil, Tempranillo, Proceso fermentativo, Análisis sensorial.
1. INTRODUCCIÓN
254
Los tratamientos fitosanitarios, necesarios para la
prevención del ataque de diferentes plagas y enfermedades,
realizados sobre uvas destinadas a la vinificación conllevan
el riesgo de la posibilidad de que los productos aplicados
estén presentes en el mosto o en el vino elaborado. Por otro
lado y mediante transformaciones físicas, químicas o biológicas de las materias activas de partida, pueden aparecer
otros productos secundarios o productos de degradación
(metabolitos) los cuales pueden resultar igual o más tóxicos
que las propias materias activas de los plaguicidas utilizados
[1-3].
La aplicación indiscriminada de plaguicidas, especialmente cuando no respetan sus periodos de seguridad
entre el tratamiento y la vendimia, pueden producir unos niveles en el mosto superiores a los permitidos. Por otra parte,
la presencia de plaguicidas también ha sido asociada a determinados efectos negativos sobre el metabolismo de las levaduras, con paradas o aletargamiento de las
fermentaciones, y sobre las propiedades organolépticas de
los vinos disminuyendo su calidad final [4,5]. Estas circunstancias pueden suponer importantes pérdidas económicas
principalmente para los productores de vino.
El objetivo particular de este trabajo ha sido el
estudio de la influencia del fungicida Pirimetanil en la fermentación alcohólica de uvas variedad Tempranillo tratadas
con este producto durante tres años consecutivos 2004,
2005 y 2006. Pirimetanil es un fungicida muy utilizado en
vid, pertenece a la familia de las anilinopirimidinas y actúa
de modo sistémico contra la infección del hongo Botrytis
cinerea [6].
2.1. Materiales
Densímetro, Termómetro, Refractómetro, Equipo
para acidez volátil García Tena, Equipo para análisis de anhídrido sulfuroso Rankine, pHmetro, Espectrofotómetro de
absorción molecular UV-VIS, Equipo de análisis NIR Foss
Grape Scan.
2.2. Tratamiento y Elaboración
Las cepas variedad Tempranillo procedentes de la
misma parcela situada en la zona de Rioja Alta dentro de la
DOCa. Rioja fueron tratadas con Scala (37,4% Pirimetanil)
en las épocas correspondientes a final de floración y envero,
durante tres años consecutivos, a la dosis recomendada por
el fabricantes (BASF Española) de 2 L/Ha. Se dejaron un número de filas sin tratar con el fin de tener un testigo de la parcela.
La elaboración se llevó a cabo en la bodega experimental de la Universidad de La Rioja. La uva se vendimió en
el mes de octubre. La uva se pasó a la despalilladora-estrujadora y la pasta fue conducida a los depósitos de fermentación de 100 L. La elaboración se realizó por duplicado tanto
para el testigo como para la uva con tratamiento.
A continuación se inocularon los depósitos con levaduras a una dosis de 30 g/HL. Se realizó un seguimiento
de la fermentación midiendo los parámetros más importantes: densidad, temperatura y acidez volátil. Una vez finalizada
la fermentación alcohólica, se procedió al descube y en el
vino yema obtenido se llevó a cabo la fermentación malolác-
ISBN 978-84-690-6060-5
tica sembrando las bacterias lácticas (1 g/HL). Se siguió la
fermentación realizando un control periódico de la cantidad
de ácido málico mediante método enzimático y Foss Grape
Scan. Una vez finalizadas las fermentaciones se tomaron
muestras para realizar los correspondientes análisis y acondicionar el vino obtenido para resguardarlo de futuras alteraciones hasta ser embotellado.
Fig. 1. Evolución del % de azúcar durante la fermentación en cada depósito
Aproximadamente tres meses más tarde, se realizó
el análisis sensorial a través de un test Duo-Trio para comprobar si los vinos procedentes del tratamiento podían ser diferenciados de forma significativa. Más tarde se realizó un
análisis descriptivo sobre los mismos vinos. Los análisis organolépticos fueron realizados por un panel de expertos pertenecientes a la Asociación de Enólogos de La Rioja junto
con egresados y alumnos de la Licenciatura de Enología en
la Universidad de La Rioja.
3. RESULTADOS
3.1. Evolución de la fermentación
Correspondiente al año 2004 y representativa de
los tres años estudiados, la Figura 1 muestra la evolución del
contenido de azúcar durante la fermentación alcohólica. Se
observa un inicio más rápido de las fermentaciones de los
mostos de uvas tratadas con respecto al testigo. A partir de
las 90-100 horas siguen una misma tendencia con valores similares del % de azúcar. La fermentación malolática tuvo la
misma duración para el testigo y Pirimetanil en los años 2004
y 2005 (23 y 20 días respectivamente), mientras que en el
año 2006 el testigo acabó a los 54 días, 20 días más que el
vino procedente de uvas tratadas.
3.2. Parámetros de fermentación
En la Tabla 1 se resumen los valores encontrados
para los diferentes parámetros estudiados en las muestras
tomadas tanto al inicio como al final de la fermentación en los
tres años estudiados.
En las uvas de 2004 tratadas con Pirimetanil se observan unos valores superiores para º Brix, y acidez total respecto al testigo tanto en mosto como en vino. El Índice de
Polifenoles Totales (IPT), la cantidad de taninos, el Índice de
Color (IC) y pH en mosto y vino presentan valores ligeramente inferiores a los del testigo en las muestras de vino.
Para la tonalidad no se encuentran diferencias. Cabe destacar los bajos valores encontrados en la determinación de la
lacassa, debido al buen estado sanitario de la uva. El grado
alcohólico alcanzado es inferior que al de los vinos sin tratamiento.
Para las uvas del 2005 tratadas con Pirimetanil se
observaron unos valores ligeramente inferiores para º Brix,
Tabla 1. Valores de distintos parámetros al inicio y final de la fermentación en los tres años
255
ISBN 978-84-690-6060-5
pH y acidez total del mosto y vino respecto al testigo. El IPT,
la cantidad de taninos y el IC presentaron valores superiores
a los del testigo. Para la tonalidad no se encuentran diferencias. Los bajos valores encontrados de la lacassa se debieron al buen estado sanitario de la uva. El grado alcohólico
alcanzado fue inferior que al de los vinos sin tratamiento.
En la elaboración con uvas del 2006 tratadas con
Pirimetanil se observan unos valores ligeramente inferiores
para º Brix y pH en el mosto y el vino respecto al testigo. El
IPT, la cantidad de taninos y el IC presentan valores inferiores a los del vino testigo. Para la acidez total el valor encontrado en mosto es ligeramente inferior, mientras que no se
encuentran diferencias en el vino, al igual que ocurre con la
tonalidad del vino. También se encuentras bajos niveles de lacassa. El grado alcohólico alcanzado es similar al del vino sin
tratamiento.
3.2. Análisis sensorial
El test Duo-Trio realizado demostró que los vinos
elaborados con uvas tratadas con Pirimetanil, y sin tratamiento, no difieren entre sí a un nivel de significación del 5%.
A continuación se realizó un análisis descriptivo de los vinos.
En la fase visual se observa que los vinos de uvas tratadas
con Pirimetanil presentan mayor capa que el testigo y un
mayor componente violáceo en el color. En la fase olfativa
los vinos elaborados con presencia del fungicida tienen una
intensidad aromática más baja que el testigo. Los dos tipos
de vinos presentan un carácter frutal y vegetal similar. Dentro de la fase gustativa, los sabores se encuentran más equilibrados en los vinos que proceden de uvas tratadas. Los dos
vinos poseen un tacto suave y ligero. Ambos presentan un
postgusto con carácter marcadamente frutal, siendo poco
persistentes.
4. CONCLUSIONES
Existen diferencias respecto al testigo en la maduración de la uva, con un menor grado Brix en las uvas tratadas en dos de los tres años estudiados. El grado alcohólico
alcanzado también fue inferior o similar en las distintas campañas.
Los valores de lacassa encontrados son más bajos
en el caso de las uvas tratadas con Pirimetanil.
En dos de los tres años estudiados los valores de IPT
y de IC de los vinos procedentes de uvas tratadas fueron inferiores al testigo. No se encontraron diferencias en tonalidad.
256
El pH fue inferior en todos los años tanto en el
mosto como en el vino.
El análisis sensorial muestra que no se aprecian diferencias significativas entre los diferentes vinos para cada
año.
La presencia de Pirimetanil no modifica la evolución
del proceso de fermentación ni las características organolépticas de los vinos elaborados.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. CABRAS, P.; ANGIONI, A. 2000, Pesticide residues in
grapes, wine and their processing products. J. Agric.
Food Chem., 48, 967-973.
2. RIAL-OTERO, R.; CANCHO-GRANDE, B.; SIMAL-GÁNDARA, J. 2003. Multiresidue method for fourteen fungicides in white grapes by liquid-liquid and
solid-phase extraction followed by liquid chromatography-diode detection. J. Chromatogr. A, 992, 121131.
3. COUDERCHET, M. 2003, Benefits and problems of
fungicide control of Botrytis cinerea in vineyards of
Champagne. Vitis, 42, 165-171.
4. NAVARRO, S; BARBA, A.; OLIVA, J.; NAVARRO, G.;
PARDO, F. 1999. Evolution of residual levels of six
pesticides during elaboration of red wines. Effect of
wine-making procedures in their dissappearance. J.
Agric. Food Chem., 47, 264-270.
5. CABRAS, P.; FARRIS, G.A.; FIORI, M.; PUSINO, A.
2003. Interactio between fenhexamid and yeasts
during the alcoholic fermentation of Saccharomyces cerevisiae. J. Agric. Food Chem., 51,
5012-5015.
6. FRITZ, R.; LANEN, C.; CHAPELAND-LECLERC, F.; LEROUX, P. 2003. Effect of the anilinopyrimidine fungicide pyrimethanil on the cystathionine B-lyase of
Botrytis cinerea. Pesticide Biochemistry and Physiology,
77, 54-65.
6. AGRADECIMIENTOS
Al Gobierno de La Rioja por la Beca FPI concedida
a D. Luis Vaquero y por el proyecto ANGI 2004/18 concedido.
Al INIA por la Infraestructura (proyecto VIN00-054-C2-01). Al
MEC por la concesión del proyecto AGL2005-02313/ALI. A la
Universidad de La Rioja. A Bodegas D. Mateos S.L. A la Asociación de Enólogos de La Rioja.
ISBN 978-84-690-6060-5
PERFIL DEL AROMA DE VINOS TINTOS DE VARIEDADES MINORITARIAS EN LA
REGIÓN DE CASTILLA-LA MANCHA
E. Sánchez-Palomo1; M.S. Pérez Coello1; M.A. González-Viñas1
1
Resumen:
Área de Tecnología de Alimentos. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad de Castilla-La Mancha
Avda. Camilo José Cela, 10, 13071 Ciudad Real.
Se han estudiado dos vinos tintos jóvenes de variedades de uva cultivadas en la región de Castilla-La Mancha: Uno
elaborado con la variedad de uva Cencibel y otro con una variedad minoritaria de esta región Moravia Dulce. Se han analizado
por CG-EM y CG-O cuantitativa con los extractos orgánicos obtenidos por SPE y Análisis Sensorial descriptivo cuantitativo con
la ayuda de un panel constituido por 10 catadores.
Palabras clave: Vino; Aroma; CG-EM; CG-O; Análisis Sensorial
1. INTRODUCCIÓN
Desde el punto de vista químico el aroma del vino
es extremadamente complejo y esta complejidad se pone de
manifiesto en las propiedades sensoriales. Algunos compuestos se encuentran presentes en todos los vinos en concentraciones similares considerándose base del aroma. Por
otro lado, existen algunos compuestos denominados “compuestos impacto” cuyas concentraciones difieren en función
del tipo de vino y que son los responsables de las diferencias
sensoriales entre vinos [1]. Es importante conocer el papel
jugado por los distintos componentes volátiles en la percepción global del aroma del vino y en las distintas notas que lo
caracterizan. Las técnicas olfatométricas han sido utilizadas
en numerosas ocasiones para la determinación de los compuestos responsables del aroma de vinos [2, 3, 4]. El objetivo
de este estudio fue, por un lado determinar el perfil químico
y sensorial de los vinos tintos jóvenes elaborados con las variedades de uva Cencibel y Moravia Dulce cultivadas en Castilla-La Mancha y por otro determinar cuales de los
compuestos volátiles pueden ser los responsables de las características sensoriales de los vinos.
Uvas de las variedades Cencibel y Moravía Dulce
cultivadas en la región de Castilla-La Mancha recogidas en su
punto óptimo de maduración y en perfecto estado sanitario.
Para la obtención de los vinos las uvas se despalillaron, estrujaron y se realizaron fermentaciones a escala de laboratorio (10L). Todas las fermentaciones se realizaron por
duplicado a temperatura controlada de 18ºC utilizando como
inóculo la levadura seleccionada Sacharomyces cerevisiae
cerevisiae C.E.C.T. nº 10835.
La extracción de los compuestos volátiles de los
vinos se realizó según el método propuesto por Sánchez-Palomo [5] utilizando cartuchos de polipropileno-divinilbenceno
de 0.5g de fase sólida, utilizando 4-nonanol como patrón interno. Los compuestos libres fueron eluídos con diclorome-
tano (10mL) y posteriormente concentrados hasta un volumen final de 0.5µL.
El análisis cuantitativo de los diferentes odorantes
se realizó mediante cromatografía de gases espectrometría
de masas [5].
El análisis olfatométrico se llevó a cabo por un panel
entrenado de 5 catadores con experiencia en CG-O utilizando
los extractos orgánicos obtenidos por SPE Se utilizó un cromatógrafo 4890 (Agilent) con FID y puerto de sniffing (SGE)
con humidificador a la salida de la columna cromatográfica.
La cuantificación de las intensidades de los diferentes atributos se realizó utilizando una escala de 3 puntos. Las condiciones cromatográficas fueron las mismas que para el
análisis de los compuestos libres. Todos los extractos se evaluaron por duplicado
El análisis sensorial fue realizado por un panel formado por diez catadores expertos en análisis sensorial de
vinos utilizando los atributos que previamente habían sido seleccionados por consenso como los que mejor describían las
características de los vinos. Para la cuantificación de los diferentes atributos se utilizaron escalas no estructuradas de
10cm y algunas sustancias de referencia. Todos los vinos se
evaluaron por duplicado en una sala de cata [6] utilizando
copas normalizadas [7].
En la figura 1 se muestra la concentración de los
principales grupos compuestos varietales del aroma de los
vinos Cencibel y Moravia Dulce. A la vista de los resultados
podemos observar como los vinos elaborados con la variedad de uva Moravía Dulce presentan en general menores
concentraciones de los principales grupos de compuestos
varietales que los vinos de la variedad Cencibel. Cabe destacar que en ambos casos son los compuestos C6 y los
compuestos bencénicos los grupos de compuestos varietales mayoritarios, destacando la presencia de compuestos
terpénicos y C 13 -norisoprenoides cuya importancia se
encuentra en que son considerados como compuestos
257
ISBN 978-84-690-6060-5
impacto del aroma de los vinos debido a sus bajos umbrales de percepción olfativa.
Figura 1. Concentración (µg/L) de los principales grupos de
compuestos varietales del aroma de los vinos.
cuantificados de manera satisfactoria. Entre los componentes
con intensidades olfatométricas medias mayores se encuentran ácidos (isobutírico, butírico, isovalérico, hexanoico, octanoico, decanoico, ésteres etílicos (isobutirato de etilo,
caproato de etilo, caprilato de etilo…), acetato de isoamilo, linalol, beta-damascenona, guaiacol, beta-ionona, 2-feniletanol, delta-nonalactona, eugenol y vainillina.
De los 95 compuestos identificados y cuantificados
en el estudio olfatométrico, 17 de ellos se han encontrado en
concentraciones superiores a su umbral de percepción olfativa. Los aromas más potentes desde el punto de vista cuantitativo han sido, beta-damascenona, dihidocinamato de etilo,
4-vinilguaiacol, guaiacol, caprilato de etilo, caprato de etilo,
vainillina y acetato de isoamilo entre otros.
5. BIBLIOGRAFÍA
En la tabla 1 se muestran los descriptores sensoriales utilizados por los catadores para describir el aroma de
los vinos objeto de este estudio. El análisis sensorial del perfil aromático de los vinos puso de manifiesto importantes diferencias entre el aroma de estos dos vinos así, el perfil
sensorial de los vinos de la variedad Cencibel se caracterizó
por aroma a frutas rojas, regaliz con notas de pimienta y
fresco, mientras que los vinos elaborados con la variedad de
uva Moravia Dulce se caracterizaron por un aroma más neutro con notas a frutas rojas, regaliz, pimienta y tabaco con
menor intensidad que en el caso de los de la variedad Cencibel.
El análisis de los datos obtenidos mediante es estudio olfatométrico nos permite identificar qué compuestos
son los responsables del aroma de los vinos. En el análisis olfatométrico de los extractos orgánicos del aroma de los vinos
de las variedades se han detectado un total de 103 descriptores del aroma de los cuales 95 han sido identificados y
1. FLANZY, C. 2000. En Enología Fundamentos Científicos
y Tecnológicos. (Mundi Prensa eds.), pp 137-166, Madrid, España.
2. GUTH, H. 1997. J. Agric. Food Chem. 45, 3027-3032.
3. CULLERÉ, L.; ESCUDERO, A.; CACHO, J. Y FERREIRA, V. 2004. J. Agric. Food Chem., 52, 1653-1660.
4. ESCUDERO, A.; GORGANZA, B.; MELÚS, M.A.;
CACHO, J Y FERREIRA, V. 2004 J. Agric. Food Chem.,
52, 3516-3524.
5. SÁNCHEZ-PALOMO E. Estudio del potencial aromático de vinos de variedades minoritarias cultivadas
en Castilla-La Mancha. Tesis Doctoral Diciembre 2006
6. ISO 1997. Sensory Analysis. Apparatus wine-tasting
glass. ISO 3591-1997, Group B, 3 pp.
7. ISO 1998.Guide for the installation of a chamber for
sensory analysis. ISO 8589-1998, Group E, 9 pp.
6. AGRADECIMIENTOS
Se agradece la financiación de éste trabajo a la
Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha a cargo del
proyecto PBI 05-051.
Tabla 1. Perfil olfativo del vino Moravia Agria. Puntuación media de 10 catadores (2 duplicados)
258
ISBN 978-84-690-6060-5
NUEVA APORTACIÓN ANALÍTICA PARA EL ESTUDIO DEL CAMBIO DE COLOR DE
LOS VINOS TINTOS
María-Pilar Sáenz Navajas, María Teresa Tena, Purificación Fernández Zurbano
Resumen:
Departamento de Química. Universidad de La Rioja, C/ Madre de Dios 51, E26005 Logroño, La Rioja, España
Tlf: 941 299 622. e-mail: [email protected]
Los compuestos responsables del color de vinos tintos jóvenes, los antocianos libres, tienden a reaccionar con otros
compuestos de tal forma que con el tiempo esto afecta al color de los vinos. Éste cambia desde el rojo-azulado de los vinos tintos jóvenes hasta el rojo-naranja (tejas) de los vinos muy envejecidos. Como consecuencia de estas reacciones, los antocianos del vino desaparecen gradualmente a la vez que se forman pigmentos más estables que serán los responsables del color
final del vino envejecido.
El análisis mediante Electroforesis Capilar de Zona (CZE) de distintas disoluciones sintéticas del antociano mayoritario en las uvas, malvidina 3-monoglucósido y flavanoles, catequina y epicatequina, en presencia y ausencia de acetaldehído
ha permitido evaluar de forma conjunta pigmentos con distintas características cromáticas. Los pigmentos formados en las distintas disoluciones sintéticas aparecen en tres zonas distintas del electroforegrama, de tal forma que los tiempos de migración
de los pigmentos derivados parecen estar directamente relacionados con el color que manifiestan.
Palabras clave: malvidina 3-monoglucósido, flavanoles, acetaldehído, CZE.
1. INTRODUCCIÓN
Los vinos tintos poseen una compleja composición
polifenólica. La evolución de los compuestos polifenólicos durante la elaboración y envejecimiento de los vinos tintos definirá las características organolépticas del vino final. Durante
la conservación de éstos tienen lugar cambios no sólo en el
color sino también en el sabor, aroma y astringencia. Las reacciones que tienen lugar entre los antocianos monoméricos
y los compuestos fenólicos presentes en las uvas y el vino,
tales como flavanoles y/o proantocianidinas, inducen a la formación de nuevos compuestos que producen una estabilización del color, así como un descenso en la astringencia y
amargor [1]. En bibliografía se han descrito posibles mecanismos implicados en la formación de estos pigmentos poliméricos, pudiendo tener lugar o bien mediante condensación
directa [2,3] o mediada por puentes etilo en presencia de acetaldehído [4,5]. Los compuestos fenólicos de bajo peso molecular, no sólo monómeros sino también oligómeros, han
sido analizados y determinados por métodos cromatográficos. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) ha
permitido su separación e identificación mediante el uso de
distintos detectores como el de fila de diodos (DAD) o espectrometría de masas (MS). Sin embargo, el análisis de polifenoles de alto peso molecular resulta complicado con estas
técnicas, ya que los pigmentos poliméricos y flavanoles de
alto peso molecular eluyen como un conjunto de picos no resueltos con elevados tiempos de retención [6].
Recientemente, nuestro grupo de investigación ha
demostrado que la Electroforesis Capilar de Zona es una técnica eficaz a la hora de separar pigmentos poliméricos [7], ya
que las señales electroforéticas obtenidas para vinos envejecidos están directamente correlacionadas con el índice químico de envejecimiento y por lo tanto pueden ser usadas
para estimar la edad del vino. El objetivo de este trabajo fue
estudiar la evolución de mezclas fenólicas en vino sintético
mediante CZE, con el fin de determinar la naturaleza de los
picos electroforéticos anteriormente citados. Para ello, distintas disoluciones de Mv3glc, flavanoles (catequina y epicatequina), tanto en presencia como ausencia de acetaldehído
fueron preparadas en vino sintético y analizadas regularmente mediante CZE. La asignación de los picos correspondientes a los nuevos derivados formados así como a los de
sus precursores fue realizada en base a sus espectros Uv-Vis
así como a sus tiempos de migración. El estudio de la evolución de cada uno de los compuestos fue útil para establecer
tanto el orden de aparición y desaparición como las relaciones entre los precursores y derivados y por lo tanto, para evaluar la estabilidad de éstos. Este estudio puede ser
interesante para su identificación en muestras de vino real.
Para abordar el objetivo propuesto se realizó el seguimiento de 10 disoluciones preparadas en vino sintético.
Las concentraciones iniciales fueron de 200 µg/ml de malvidina-3-glucósido (M), 2000 µg/ml de catequina (C), 2000
µg/ml de epicatequina (E) y 200 µg/ml de acetaldehído (A).
Las disoluciones se guardaron a 20 ºC bajo atmósfera de oxígeno durante 6 meses. Las distintas mezclas que se prepararon se muestran en la tabla 1.
Todas las muestras se analizaron mediante CZE
que permitió seguir la evolución de los compuestos de las
mezclas preparadas. El capilar usado fue de sílice fundida de
56 cm de longitud efectiva y 75 µm de diámetro interno. La disolución tampón utilizada fue de tetraborato disódico en una
concentración de 50 mM y pH de 9.4 con un 10% de metanol
(v/v) como modificador. La separación se llevó a cabo a 10 ºC
259
ISBN 978-84-690-6060-5
y aplicando 25 kV. La detección se realizó en el cátodo sin
inversión del flujo electrosmótico. Los electroforegramas se
registraron a 280, 520 y 599 nm y los espectros se midieron
de 200 a 599 nm con un detector de fila de diodos.
Fig.2. Espectros UV-Vis de los pigmentos derivados de
Mvglc.
Tabla 1. Disoluciones mezcla en vino sintético
En los vinos tintos se acepta como un patrón general de evolución del color aquel que va desde el color rojo con
reflejos violáceos, propio de vinos recién obtenidos y jóvenes, al color rojo-teja con tonalidades pardo-amarillentas, propio de los vinos añejados y bastante oxidados. A continuación
se hace una exposición de los pigmentos derivados de
Mv3glc detectados mediante CZE, que pueden ser responsables de los distintos colores del vino. No hay que pasar por
alto que el color resultante de un vino es siempre la interacción de todos los pigmentos y que el color de cada uno está
a su vez influido por factores que pueden ser activos en algún
momento de la vida del vino. La evolución de Mv3glc fue estudiada en presencia de catequina (disolución 7) y de epicatequina (disolución 8), así como en presencia del antociano
con acetaldehído y catequina (disolución 9) o epicatequina
(disolución 10). En la Fig.1 se muestran los electroforegramas de los picos correspondientes a los pigmentos detectados derivados de Mv3glc y en la Fig.1b sus espectros
UV-Vis correspondientes. A continuación se detalla la formación de los derivados de Mv3glc en función del color que presentan.
Fig.1. Electroforegramas de las disoluciones 7 a los 176
días de reacción (Mv3glc y catequina) y 9 a los 44 días de
reacción (Mv3glc, acetaldehído y catequina) con las zonas
correspondientes al color de los pigmentos derivados de
Mv3glc.
260
3.1. PIGMENTOS ROJOS AZULADOS
Los pigmentos derivados del antociano y de los flavanoles con pigmentación roja-azulada fueron: DFAM1 y
DFAM2; donde DFAM denota derivado de flavanol, acetaldehído y Mv3glc. Los derivados DFAM1 y DFAM2 (Figura 2a)
presentan un espectro UV-Vis con un máximo a 284.5 nm,
además de absorción en la región de los azules (560 nm),
con un ligero desplazamiento hipsocrómico respecto de
Mv3glc (Figura 2a). Escribano-Bailón y col. [4] describieron
el color y la estabilidad de pigmentos formados a partir de
condensaciones entre Mv3glc y catequina mediados por
puentes etilo, formados en presencia de acetaldehído, concluyendo que éstos poseían tonos azulados y eran más estables a cambios de pH y SO2 que los antocianos libres.
Francia-Aricha y col. [8] describieron la formación de pigmentos con estructuras en las que M3glc y proantocianidinas
de bajo peso molecular se unían mediante puentes etilo con
características espectrales similares a los derivados DFAM1
ISBN 978-84-690-6060-5
y DFAM2. Por ello, estos derivados parecen ser productos de
condensación entre Mv3glc y un flavanol o proantocianidinas
con puentes etilo. Además, ambos derivados, presentan una
relación carga-tamaño similar, ya que aparecen a tiempos de
migración de 21.2 y 21.5 min respectivamente, comparables
con los que aparecen en la literatura para antocianos de bajo
peso molecular [9].
3.2. Pigmentos rojos
El único pigmento rojo derivado del antociano y de
los flavanoles fue DFM2; donde DFM denota derivado de flavanol y Mv3glc. El espectro UV-Vis de este compuesto (Figura 2b) muestra dos regiones de absorción: la primera en
torno a 340 nm, lo que confirma la condensación de Mv3glc
en la posición 4 del flavanol a través del carbono 8 [10] y una
segunda región de absorción en la zona de los rojos con un
máximo a 516.5 nm. El derivado DFM2 aparece en las disoluciones 7 y 8 cuando DFM1, que presenta pigmentación roja
anaranjada, comienza a descender. Así que el derivado rojo
anaranjado DFM1 parece ser el precursor del pigmento rojo
DFM2, que presenta una relación carga-tamaño menor, ya
que aparece a menores tiempos de migración.
3.3. Pigmentos rojos anaranjados
Los derivados que presentan pigmentación roja
anaranjada son DFM1 y DFAM3; el primero se formó en presencia de Mv3glc y un flavanol, a diferencia del segundo que
además necesitó la presencia de acetaldehído para su formación. Ambos derivados poseen un máximo de absorción
en torno a 340 nm (Figura 2c), lo que confirma la condensación de Mv3glc y un flavanol a través de la posición 4 [10].
Por otro lado, estos pigmentos presentan otro máximo en la
región de los rojos y los amarillos a 490.5 nm el derivado
DFM1 y a 488.5 nm DFAM3, debido a la presencia del antociano en la molécula. Ambos compuestos aparecen a tiempos de migración que corresponden con los pigmentos
poliméricos descritos por Sáenz-López y col. [7]. En general,
se ha observado que los derivados formados en presencia
de acetaldehído poseen una menor estabilidad o al menos
una mayor reactividad que los formados por unión directa
entre Mv3glc y un flavanol, ya que los primeros desaparecen
a lo largo del estudio a diferencia de los productos de con-
densación directa que no cesan su formación desde que son
detectados hasta el final del estudio.
4. BIBLIOGRAFÍA
1. Ribéreau-Gayon, P.; Glories, Y.; Maujean, A.; Dubourdieu,
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2. Vivar-Quintana, A.M.; Santos-Buelga, C.; Francia-Aricha,
E.M.; Rivas-Gonzalo, J.C. 1999 Formation of anthocyanin-derived pigments in experimental red wine.
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3. Salas, E.; Atanasova, V.; Poncet-Legrand, C.; Meudec,
E.; Mazauric, J.P.; Cheynier, V. 2004 Demonstration of
the occurence of flavanol-anthocyanin adducts in
wine and in model solutions. Anal. Chim. Acta., 513,
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4. Escribano-Bailón, M.T.; Álvarez-García, M.; Rivas-Gonzalo, J.C.; Heredia, F.J.; Santos-Buelga, C. 2001 Color
and stability of pigments derived from the acetaldehyde-mediated condensation between malvidin-3o-glucoside and (+)-catechin. J. Agric. Food Chem.,
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5. Pissarra, J.; Mateus, N.; Rivas-Gonzalo, J.; SantosBuelga, C.; De Freitas, V. 2003 Reaction between malvidin 3-glucoside and catechin in model solutions
containing different aldehydes. J. Food Sci., 68, 476481.
6. Bakker J. 1985 HPLC of anthocyanins in Port
wines: determination of ageing rates. Vitis, 25,
203-214.
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zone electrophoresis. J. Chromatogr. A, 1052, 191-197.
8. Francia-Aricha E.M.; Guerra M.T.; Rivas-Gonzalo J.C.
and Santos-Buelga C. 1997 New anthocyanin pigments
formed after condensation flavanols. J Agric. Food
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9. Calvo, D.; Sáenz-López, R.; Fernández-Zurbano, P.;
Tena, M.T. 2004 Migration order of wine anthocyanins
in capillary zone electrophoresis. Anal. Chim. Acta,
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10. Timberlake, C.F.; Bridle, P. 1980 Developments in food
colors I. J. Walford (Ed.) Applied Science Publishers; London, p.126.
261
ISBN 978-84-690-6060-5
PREPARACIÓN DE EXTRACTOS ENZIMÁTICOS ACUOSOS RICOS EN POLIFENOLES
Y ALTA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE A PARTIR DE SUB-PRODUCTOS DE LA
VINIFICACIÓN
Ana García-Martínez1, L., Olga Cremades1, Isabel Galocha1, Juan Parrado1, Juan Bautista1
1
Resumen:
Departamento de Bioquímica, Bromatología, Toxicología y ML.. Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla
c/ Prof. García González 2, Tfno, 954556113, [email protected]
La utilización de los subproductos de la vinificación, ricos en proteínas y polifenoles, actualmente poco utilizables,
podrían constituir una materia prima de partida para la preparación de productos de alto valor añadido, tanto en el campo de la
nutrición humana (alimentos funcionales) como en aplicaciones en viticultura moderna como nutriente funcional para la vid, e
inductor metabólico de parámetros de calidad en las plantas. En la presente comunicación se presentarán resultados a escala
piloto (10-50 L) para la obtención de extractos enzimáticos de subproductos de vinificación, extractos enzimáticos de orujo
(EEO). Se describirá el proceso y se discutirá la composición química/física del EEO, prestando especial atención a su composición fitoquímica funcional. Se describirán también sus propiedades funcionales como agentes antioxidantes.
Palabras clave: Residuos vinificación, hidrólisis enzimática, péptidos, antioxidantes.
1. INTRODUCCIÓN
El principal subproducto de la industria vitivinícola
es el orujo de uva, del que en España se producen unos 250
millones de kilogramos por año. Este subproducto está constituido por restos de raspón, piel y semillas de uva, y se destina fundamentalmente para la obtención de alcohol mediante
fermentación y destilación, y como alimento animal, teniendo
ambos procesos un bajo rendimiento y una baja calidad nutricional, respectivamente. Este material esta infrautilizado y
la mayor parte es almacenado al aire libre produciendo serios
problemas medioambientales [1]. Sin embargo, este subproducto tiene un alto potencial en nuevos usos, como por ejemplo, como fuente de fermentación de hongos [2] o bien, como
alimento funcional mediante su conversión en nuevos productos por extracción selectiva de sus componentes [3].
2.1 Caracterización físico-química
El contenido en proteínas, carbohidratos totales,
grasas, cenizas, macro y microelementos se han determinado siguiendo los protocolos estándares. El perfil de peso
molecular de las proteínas y péptidos se ha determinado en
un ÄKTApurifier (Amersham-biotech), mediante cromatografías de exclusión molecular utilizando una columna Superdex
200HR. Los macro y micronutrientes se han analizados por
Espectrómetrometria de Emisión Atómica por Plasma acoplado inductivamente (ICP) usando un equipo Fisons-ARL
3410. Los polifenoles totales se han determinados colorimétricamente mediante el método de Folin-Ciocalteau.
2.2. Capacidad antioxidante total (CAT)
262
La CAT se ha determinado por el método del fosfomolibdeno [4], utilizando gálico y ascórbico como patrones.
Consecuentemente, los resultados se expresan como miliequivalentes de gálico o ascórbico por g de producto seco,
respectivamente.
3. RESULTADOS
3.1. Proceso de obtención
El orujo utilizado se ha obtenido tras el proceso de
vinificación de uva variedad Tempranillo. Este subproducto,
directamente sin proceder a su secado o estabilización, se
ha sometido a un proceso de de hidrólisis enzimática, que lo
convierte en un nuevo producto totalmente soluble (Patente
en elaboración).
El producto final, EEO es un líquido de un color oscuro totalmente soluble en agua, el cual puede ser convertido en polvo mediante atomización en un spray-dryer.
3.2. Composición química del EEO
El análisis de la composición química del EEO (ver
Tabla 1) muestra que el principal componente es nitrógeno
en forma de proteínas, mostrando un enriquecimiento selectivo respecto a la materia prima de partida. Lo que es de una
gran importancia para futuros usos nutricionales tanto en viticultura, como para su uso en forma de aditivo inductor de la
fermentación alcohólica.
Respecto a la distribución molecular del tamaño de
las proteínas, se observa que los EEO están formados por
péptidos y aminoácidos libres, fundamentalmente. Lo que representa una propiedad muy importante ya que a nivel funcional éste es el rango de tamaño óptimo para una mayor
biodisponibilidad, ya que tanto en las plantas como en las levaduras la absorción del nitrógeno proteico está condicionada
por el tamaño molecular.
El EEO desde el punto de vista de la viticultura
constituye una fuente de bioestimulantes vegetales com-
ISBN 978-84-690-6060-5
Fig. 1 Esquema del proceso de obtención del extracto enzimático de orujo
puesta principalmente por péptidos, amino ácidos, y polisacáridos, que desde el punto de vista nutricional produce una
rápida y alta absorción independiente de la actividad fotosintética, y por otra parte al estimula el metabolismo y disminuye
el estrés de las plantas, concretamente de la vid.
La composición de macro y microoelementos del
EEO es muy importante desde el punto de vista de su uso
en viticultura, en la Tabla 2 se muestra la composición en
macro y micronutrientes del EEO. La importancia, de esta
composición, radica tanto en el tipo de oligoelementos
como en su biodisponibilidad, ya que los elementos se presentan en forma soluble, quelados con los péptidos, lo cual
hace que su aplicación sea muy eficiente. Respecto a su
contenido, destaca el potasio, elemento que en el EEO se
encuentra concentrado casi dos veces respecto a la materia de partida. Lo que es realmente interesante ya que la vid
necesita altas dosis de potasio para la translocación de los
azúcares. Una disminución en su contenido reduce el desarrollo vegetativo, lo que conlleva una disminución del rendimiento.
Tabla 1. Composición química.
Fig. 2. Perfil de pesos moleculares mediante cromatografía de filtración molecular
263
ISBN 978-84-690-6060-5
Tabla 2 Composición macro y microelementos
bico, valores realmente interesantes para su utilización como
ingrediente de alimentos funcionales antioxidantes. Probablemnet, esta capcidad antioxidante sea consecuencia del
alto contenido en polifenoles que presenta el EEO, 6,82 meq
de Ácido Gálico/ml.
4. CONCLUSIONES
El K juega varios papeles esenciales para el crecimiento de la planta y su reproducción. Entre estos está la formación de azúcares y almidones, síntesis de proteínas y
división celular. Además está involucrado en numerosos procesos químicos que afectan a otros nutrientes dentro de la
planta, mejora la resistencia al frío y es importante para regular el balance del agua (suelo-planta).
Por otro lado el EEO podría tener un uso como inductor de la fermentación alcohólica como un extracto que
aporta nitrógeno orgánico de fácil absorción, ya que las levaduras no tienen sistemas proteolíticos exocelulares [5]
pero sí son capaces de asimilar nitrógeno proteico de pequeño tamaño, que es mucho más eficiente que el nitrógeno
inorgánico.
3.3. Capacidad antioxidante
La capacidad antioxidante se ha evaluado mediante
un método que cuantifica la actividad antioxidante total de
muestra biológica compleja, evaluando las diferentes contribuciones tanto de compuestos antioxidantes hidro- como liposolubles. El método utilizado se basa en la reducción del
Mo(VI) a Mo(V) y la formación del complejo fosfato/Mo(V) a
pH ácido el cual puede ser evaluado espectrofotométricamente. La actividad antioxidante se ha evaluado en relación
a dos compuestos antioxidantes estándar como son el ácido
gálico y el ácido ascórbico.
Los resultados muestran (ver Tabla 3) que el EEO
en forma líquida, presenta una capacidad antioxidante total
de 2,9 meq de Ac. Gálico/ml y de 8,65 meq de Ácido Ascór-
Se ha desarrollado un proceso biotecnológico, basado en el uso de enzimas, para la obtención de un nuevo
producto (EEO) a partir de subproductos de la vinificación. El
EEO es un producto totalmente soluble, que presenta un alto
contenido en proteínas, en forma de péptidos y aminoácidos
libres, oligoelementos en forma de quelatos y que además
presenta una actividad antioxidante importante debido a su
cotenido en polifenoles. Debido a su composición el EEO
tiene una gran potencialidad de usos. Así, en viticultura como
bioestimulante vegetal, en la fermentación alcohólica como
sustrato de apoyo y en la industria alimentaria como componente antioxidante, en la formulación de alimentos funcionales, para combatir procesos patológicos relacionados con
la producción de sustanciaos oxigenadas activas y/o radicales libres.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. BOTELLA, C. ORY, I. WEBB, C. CANTERO, D. BLANDINO A.. 2005. Hydrolytic enzyme production by Aspergillus awamori on grape pomace. Biochem Eng. J.
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2. SÁNCHEZ, A. YSUNZA, F. BELTRÁN-GARCÍA, MJ. ESQUEDA, M. 2006. Biodegradation of viticulture wastes by Pleourotus: A source of microbial and human
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Food Chem. 50 2537-2542.
3. MONAGAS, M. HERNANDEZ-LEDESMA, B. GÓMEZCORDOVÉS, C. BARTOLOMÉ, B. 2006. Commercial
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Grape Skins: Antioxidant and Chemical Characterization J. Agric. Food Chem. 54, 319-32.
4. PRIETO, P. PINEDA, M. AGUILAR, M. 1999. Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity
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of vitamin E. Analytical Biochemistry, 269, 337–341.
5. ROSE JS, HARRISON JS. 1987. The Yeasts: Yeasts
and the Environment. New York: Academic Press.
6. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado por el proyecto
MMA-262/2006/2-1.2 y AGL2005-02962.
Tabla 3 Actividad antioxidante (CAT) y contenido en polifenoles del EEO
264
ISBN 978-84-690-6060-5
INFLUENCIA DE UN FITONUTRIENTE CON FITOHORMONAS EN LA EXPRESIÓN DE
ANTOCIANOS Y EL COLOR EN UVAS SYRAH Y CABERNET SAUVIGNON
Parrado J.1, Escudero-Gilete M.L.1, García-Martínez A1, Romero E2, Bautista J.1, González-Miret M.L.1,
Heredia, F.J.1
1
Departamento de Bioquímica, Bromatología, Toxicología y ML. Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla
c/ Prof. García González 2, Tfno, 954556113, [email protected]
2
Resumen:
Departamento de I+D. Pevesa S.L Apart. 75 E-41520 El Viso del Alcor, Sevilla
Se describe la influencia de un fitonutriente, cuya composición química principal es nitrógeno en forma de péptidos, ricos en glutamina, arginina y fenilalanina, y fitohormonas (auxinas, giberillinas, citoquininas), durante la maduración de bayas de dos variedades de uvas, Syrah y Cabernet Sauvignon. La aplicación del fitonutriente muestra como
principal resultado un efecto en la cantidad y composición de antocianos, así como en el color de los mostos. Los análisis cromatográficos demuestran un aumento de la cantidad de pigmentos mayoritarios (diglucósidos antociánicos) respecto al testigo, a lo largo de la maduración. Por otra parte, la evaluación del color del mosto por colorimetría triestímulo
pone de manifiesto desplazamientos claramente perceptibles de los puntos de color sobre el plano a*b* hacia los tonos
(hab) más rojos y descensos de la claridad (L*) de hasta 10 unidades CIELAB. Así, la fertilización con bioestimulantes
(nutrición funcional) puede inducir un incremento en la expresión de antocianos y el consiguiente efecto sobre parámetros organolépticos y la calidad alimentaria.
Palabras clave: Fitonutriente, vid, uvas, color, antocianos.
1. INTRODUCCIÓN
El desarrollo de procesos de conversión de biomasa orgánica de origen vegetal en productos de alta absorción y disponibilidad por las plantas ha sido llevado a
cabo en los últimos años. Las plantas absorben y asimilan nitrógeno y carbono orgánico [1] y fitohormonas directamente,
vía foliar y radicular. Así, actualmente se usan extractos de
origen vegetal y de algas con fines nutricionales, para estimulación del metabolismo y como soporte de situaciones de
estrés.
Los compuestos fenólicos en la vid tienen diferentes
funciones fisiológicas. Entre ellos, los antocianos son determinantes en la calidad del vino. El desarrollo de nuevos extractos bioestimulantes usando productos vegetales tiene
gran interés ya que es conocido el fenómeno de interacción
entre la nutrición de la vid y la expresión de antocianos. La
biosíntesis de antocianos en la planta es un proceso controlado genéticamente; es bien conocida la influencia de diferentes factores a nivel vitícola, como técnicas de cultivo y
fertilización. Otras como las condiciones ambientales (temperatura, intensidad lumínica) afectan a la expresión de las
enzimas involucradas en la vía de los flavonoides induciendo
una acumulación de antocianos [2]. La presencia de actividad fitohormonal exógena es otro de los factores implicados
en la inducción de antocianos en la vid y en cultivos celulares de Daucus carota [3].
En este trabajo se muestra el efecto de la aplicación de un extracto enzimático vegetal con actividad fitohormonal, a lo largo de la maduración de las bayas en dos
variedades de uva, Syrah y Carbernet Sauvignon, sobre di-
ferentes parámetros como el tipo y la cantidad de antocianos,
y el color.
2.1. Aplicación de bioestimulantes
En una plantación de Vitis vinifera var. Syrah y Carbernet Sauvignon, seleccionaron 3 sectores idénticos (2 hectáreas). Todos los sectores tuvieron el mismo manejo y
tratamiento vitícola, con plantas de la misma edad. La diferencia radicó en la aplicación de bioestimulante: el sector A
sin bioestimulación vegetal, el sector B tratado con 6 litros de
bioestimulante por hectárea y sector C tratado con 24 litros
por hectárea. La aplicación del bioestimulante se realizó por
fertirriego en 6 aplicaciones quincenales a partir del 1 Junio.
2.2. Caracterización fisicoquímica del bioestimulante y
los mostos
Se evaluó el contenido de proteínas, carbohidratos,
grasas, cenizas, macro y microelementos del extracto de
bioestimulante vegetal (BVE) siguiendo los protocolos estándares. También se evaluó el tamaño molecular de las proteínas y péptidos, tanto del bioestimulante como de los mostos,
mediante cromatografías de exclusión molecular con una columna Superdex 200HR (Amershambiotech) usando un ÄKTApurifier (Amershambiotech). La composición aminoacídica
del BVE se determinó por HPLC de fase reversa derivatizando los aminoácidos con AQC. Las fitohormonas Auxinas
y Giberellinas se determinaron por GC-MS y las Citoquininas
mediante HPLC de fase reversa.
265
ISBN 978-84-690-6060-5
2.3. Medidas colorimétricas
Las medidas de color se realizaron con un espectrofotometro de fotodiodos UV-vis HP 8452 (Hewlett-Packard,
Palo Alto, CA), y el espectro visible (380-770 nm) obtenido
fue procesado siguiendo el método de ordenadas ponderadas (Dl 2 nm) hasta la obtención de los parámetros CIELAB
(L*, a*, b*, C*ab, hab) y CIELUV (s*uv) utilizando el software
CromaLab [4].
2.4. Análisis de antocianos
Los antocianos fueron analizados por HPLC con
una columna Zorbax C18 en un HPLC1100 (Hewlett-Packard,
Palo Alto, CA) con detector de fotodiodos. La velocidad de
flujo fue de 0.8 mL/min, y el volumen de inyección 50mL, con
longitud de onda de detección a 525 nm.
3. RESULTADOS
El extracto bioestimulante vegetal procede de la digestión enzimática de una mezcla de residuos orgánicos vegetales, principalmente sorgo, maíz, trigo procedentes de la
industria del bioalcohol y algarroba [5].
La caracterización fisicoquímica muestra un producto totalmente soluble cuyo principal componente es el Nitrógeno proteico en forma péptidos y aminoácidos libres
(>85% p/p). El tamaño molecular evaluado mediante cromatografía de filtración no muestra diferencias, estando en
ambos casos los péptidos más del 80% por debajo de 1 Kilodalton (Figura 1). El proceso hidrolítico conduce a un cambio drástico en el tamaño proteico molecular produciendo un
aumento en la funcionalidad nutricional debido a su rápida y
total absorción. Respecto al perfil aminoacídico, el del BVE
está muy compensado en los porcentajes relativos de todos
los aminoácidos y tiene altos contenidos en glutamina y fenilalanina. La glutamina es un aminoácido principal en el metabolismo del nitrógeno en las plantas, el nitrógeno inorgánico
pasa por su conversión enzimática en glutamina. Ésta es
usada en las reacciones de transamidación, en la síntesis de
proteínas o en el transporte de carbono y nitrogeno en la
266
planta [6], y la fenilalanina es un importante precursor, tanto
de fitohomonas como de flavonoides.
3.1. Contenido fitohormonal
La hidrólisis enzimática utilizada en la producción
del BVE conduce a la extracción de fitohormonas a partir de
las materias vegetales. Dicho componente tiene como principales características su variada composición, evaluándose
las principales familias de fitohormonas (auxinas, giberellinas, citoquininas) mostradas en la Tabla 1, y por otra parte su
solubilidad, debido a una quelación con el componente proteico. La presencia de fitohormonas como nutriente tiene una
fuerte influencia en la expresión de antocianos en plantas
(vid) y cultivos celulares. Así, el ácido absicico incrementa la
expresión de los genes implicados en su biosíntesis en vid y
en cultivos celulares in vitro. En cultivos celulares, auxinas
(ácido indolacetico (IAA) y naftóxico (NAA)) y la kinetina producen un efecto similar; otras fitohormonas como ácido jasmónico producen efectos similares en cultivos celulares de
Vitis vinifera.
3.2. Composición de antocianos
La cuantificación de antocianos en los mostos de
las plantas tratadas con BVE muestra en ambos casos que
los derivados de la malvidina especialmente la malvidina-3monoglucosido y el derivado acetilado, son altamente inducidos con el tratamiento. El BVE induce la expresión de una
mayor cantidad de antocianos y específicamente la inducción
de malvidina-3-monoglucósido, principal componente expresado (Tabla 2).
Otro de los aspectos relevantes que se ha encontrado es la aparición temprana de estos antocianos mencionados anteriormente en referencia al testigo correspondiente.
Para ambas variedades, al mes de iniciarse el tratamiento,
aparecen grandes diferencias en la expresión de malvidina3-monoglucósido (MV3g) y demás derivados de la malvidina.
Concretamente para Syrah, la expresión de MV3g se duplica
en el caso de la dosis 1, y se cuadruplica para la dosis 2,
siempre con respecto al testigo. Para Cabernet, no se apre-
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Tabla 2. Contenido en Antocianos mg/ml. Muestra recolectada en maduración
Tabla 3. Contenido en Antocianos mg/ml. Muestra recolectada en el envero
Tabla 4. Parámetros CIELAB. Muestra en maduración
Figura 2.Diagrama de color CIELAB (Cabernet Sauvignon)
Figura 3. Diagrama de color CIELAB (Syrah)
cia esta diferenciación en cuanto a la dosis, siendo 6 y 5,75
veces superior la expresión de MV3g para la dosis 1 y la
dosis 2, respectivamente.
2. DOKOOZLIAN, N.; LUVISI, D.; MORIYAMA, M.;
SCHRADER, P. 1995. Cultural practices improve
color, size of “Crimson Seedeles”. California Agric.
49, 36-40.
3. JEONG, S.T.; GOTO-YAMAMOTO, N.; KOBAYASHI, S.
ESAKA, M. 2004 Effects of plant hormones and shading on the accumulation of anthocyanins and the expression of anthocyanin biosynthetic genes in grape
berry skins. Plant science .167, 247-252.
4. HEREDIA, F.J.; ÁLVAREZ, C.; GONZÁLEZ-MIRET, M.L.;
RAMÍREZ, A. 2004. “CromaLab®, análisis de color”. Registro General de la Propiedad Intelectual SE-1052-04.
Sevilla. Spain.
5. PARRADO, J.; ROMERO, E.; BAUTISTA J. 2005 Procedimiento para la obtención de bioestimulantes a
partir de residuos agroindustriales. Registro General
de la Propiedad Intelectual P2005/00207. Madrid,
Spain.
6. SECHLEY, K.A.; YAMAHA, T.; OAKS, A. 1992. Compartmentation of nitrogen assimilation in higher
plants. Int. Rev. Cytol. 134, 85-163.
3.3. Evaluación del color
La evaluación del color del mosto por colorimetría
triestímulo confirma estos resultados: se obtienen desplazamientos significativos y claramente perceptibles por un ojo humano no entrenado (DE* >10) de los puntos de color sobre el
plano (a*b*) (Figuras 2 y 3) hacia los tonos (hab) más rojos; y
descensos de claridad (L*) de 10 unidades CIELAB (Tabla 4).
Las coordenadas colorimétricas son similares en
ambas variedades, aunque en Syrah se da una diferenciación en el tono con respecto al testigo. El tratamiento induce
una disminución del tono hacia rojos más netos.
4. BIBLIOGRAFÍA
1. CHAPIN, FS.; MOILANEN, L.; KIELLAND, K. 1993 Preferential use of organic nitrogen for growth by a nonmycorrhizal arctic sedge. Nature. 361, 150.
267
ISBN 978-84-690-6060-5
CONTROL DE PARÁMETROS RELACIONADOS CON LA CALIDAD Y SEGURIDAD
ALIMENTARIA EN LA ELABORACIÓN DE VINOS DULCES NATURALES ANDALUCES
Mª Jesús Hernández, Mónica Schwarz, Mª de Valme García-Moreno,
Dominico A. Guillén, Carmelo G. Barroso.
Departamento de Química Analítica, Facultad de Ciencias, Universidad de Cádiz, Centro Andaluz de Investigaciones Vitivinícolas (CAIV).Campus Universitario
de Puerto Real s/n, 11510, Puerto Real, Cádiz. 956016456 [email protected]
Resumen:
La elaboración de vinos dulces naturales trae consigo una primera etapa de secado de la uva al sol, con vistas a concentrar el contenido en azúcar. Las condiciones climatológicas adversas de dicha operación pueden afectar considerablemente
en la calidad y seguridad alimentaria de los vinos obtenidos. Para evitar las influencias climatológicas adversas se puede proceder al secado de la uva mediante cámaras climáticas, que controlan humedad y temperatura, evitando la aparición de alteraciones no deseadas que afecten la calidad y el estado sanitario de los vinos obtenidos.
En el presente trabajo se ha estudiado la evolución de parámetros responsables de la calidad y seguridad alimentaria durante la elaboración de vinos dulces naturales andaluces. Los parámetros analizados han sido el contenido en ocratoxina
A, ácido glucónico, índice de melanoidinas, poder antioxidante, índice de polifenoles totales y ácidos orgánicos. Las variedades de uva empleadas, Moscatel de Alejandría y Pedro Ximénez, provenientes de tres regiones andaluzas (Cádiz, Córdoba y
Málaga), fueron sometidas a ambos procesos de pasificación natural en paseras y artificial en cámara climática. Se efectuaron
muestreos durante las diferentes etapas que comprenden la elaboración de este tipo de vinos.
Palabras clave: pasificación natural, pasificación artificial, seguridad alimentaria, vinos dulces naturales.
1. INTRODUCCIÓN
268
El proceso de elaboración de los vinos dulces naturales constituye su seña más particular, junto con las variedades de uva utilizadas, con alto contenido en azúcar y
aromas primarios, que se enriquecen aún más empleando
una práctica tradicional, el asoleo, el cual consiste en mantener los racimos al sol varios días para lograr una pasificación parcial de la uva.
No obstante, en este proceso existen riesgos
como la lluvia o la humedad de la noche, que pueden provocar una pérdida en la calidad y también posibles riesgos
para la salud pública, como el ataque por hongos con alteración de niveles de ácido glucónico y producción de ocratoxina A. El proceso de asoleo es un tratamiento en el que
la uva puede alcanzar altas temperaturas por exposición al
sol, provocando principalmente pérdida de aromas y de acidez, hidrólisis de ésteres fenólicos, pérdidas totales de las
procianidinas e isoflavonas, así como aparición de compuestos resultante de la deshidratación de los azucares
(furfurales). El efecto de la insolación y exposición del fruto
a altas temperaturas, puede provocar la aparición de productos como melanoidinas, compuestos poliméricos característicos de las etapas finales de la reacción de Maillard.
Para evitar estos problemas se plantea controlar el secado
de la uva, mediante el uso de una cámara climática bajo
condiciones controladas de humedad y temperatura, y comparar los resultados obtenidos, bajo la óptica de la seguridad alimentaria entre ambos procesos de secado, natural y
artificial, y cómo estos afectan a la calidad de los vinos dulces naturales obtenidos.
2.1. Muestras
Se han utilizado cuatro tipos de muestras: uvas de
la variedad Pedro Ximenez procedentes de la D.O. Montilla
Moriles (Córdoba), y de la D.O. Málaga, y uvas de la variedad
Moscatel de Alejandría procedentes de Chipiona (Cádiz) y de
la D.O. Málaga. Se efectuaron muestreos durante las diferentes etapas que comprenden la elaboración de este tipo de
vinos, cubriendo tanto la fase de secado natural como la artificial.
2.2. Métodos de pasificación
Se han empleado dos métodos diferentes de pasificación: asoleo, o pasificación natural, y pasificación artificial
en cámara climática. Durante el asoleo los racimos de uvas
depositados en redores (esteras de esparto) son expuestos
al sol durante varios días, logrando el secado de la uva y concentración de azúcares. En el secado artificial los racimos
son depositados en una cámara de cultivo Ibercex serie H
con 60 Kg de capacidad y control de humedad y temperatura
por aire, al abrigo de las condiciones ambientales. Debido al
volumen de muestras estudiadas, y al espacio finito de la cámara utilizada en la pasificación artificial, fue necesario el empleo de una segunda cámara para realizar la pasificación de
las uvas Pedro Ximénez procedentes de Córdoba. Esta segunda cámara no era exactamente igual, ni en tamaño ni en
condiciones de almacenamiento, que la utilizada en los otros
estudios, concretamente es una cámara de laboratorio con
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una cabida de 3 Kg de uva máximo. El proceso de pasificación obtenido en esta segunda cámara fue algo más acelerado pudiendo no ser comparable alguno de los resultados
obtenidos en este proceso con los obtenidos en los otros procesos de pasificación artificial.
2.3. Parámetros analizados
A continuación se detallan los parámetros estudiados junto con los métodos utilizados en su análisis y cuantificación: el índice de melanoidinas se obtuvo mediante
diálisis de las muestras y determinación del color por espectrometría a 345 nm [1]; la determinación de ácidos orgánicos
se llevó a cabo mediante cromatografía iónica con detección
conductimétrica [2]; la determinación del poder antioxidante
(PA) se efectuó mediante un método diseñado y puesto a
punto por el grupo de investigación [3]; el índice de polifenoles totales (IPT) se analizó con el método de Folin-Ciocaletu
[3]; el contenido en ácido glucónico se determinó empleando
un test enzimático suministrado por Boehringer-Manheim (RBiopharm); el control de Ocratoxina A (OTA) se realizó mediante HPLC con detección fluorimétrica: previa preparación
con polietilenglicol y bicarbonato sódico, las muestras fueron
inyectadas en el sistema cromatográfico en fase móvil tamponada a pH 9,4.
3. RESULTADOS
3.1. Determinación de ácidos orgánicos
Debido al gran número de ácidos orgánicos presentes en las muestras estudiadas (acético, cítrico, formico,
láctico, málico, succínico y tartárico) consideramos mostrar
aquellos con un mayor interés, bien enológico, bien desde
el punto de vista de la seguridad alimentaria, concretamente los ácidos acético, cítrico, málico y tartárico. En la Tabla 1
se muestran los datos de concentración de estos ácidos
para las muestras estudiadas y los procesos de pasificación
utilizados. Los niveles aumentan durante la pasificación.
Esta tendencia en el acético es más acusada cuando el
proceso es natural, mientras que en el cítrico es mayor en
la pasificacion artificial. Los acidos málico y tartárico presentan un comportamiento muy parecido en ambos procesos de pasificación, salvo en la variedad Pedro Ximénez,
donde el tartárico no presenta un patrón único de comportamiento.
Tabla1. Datos de concentración de los ácidos acético, cítrico, málico y tartárico encontrados en las muestras estudiadas.
Tabla 2. Datos de concentración de poder antioxidante e índice de polifenoles totales encontrados en las muestras estudiadas.
Tabla 3. Datos de absorbancia a 345 nm de las muestras estudiadas, antes y después del proceso de diálisis.
269
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3.2 Poder Antioxidante e Índice de Polifenoles Totales
De los cuatro grupo de muestras analizadas en tres
de estos se pone de manifiesto un mayor PA e IPT durante el
proceso de pasificación artificial con respecto al proceso natural tal y como podemos observar en la Tabla 2. El hecho de
que las muestras de Pedro Ximénez provenientes de Córdoba tuviesen un mayor PA e IPT en soleo natural que en cámara se puede justificar por ser el grupo de muestras que se
pasificó en una cámara distinta. Por otro lado se vio que la relación entre ambos parámetros fue de r2=0,82 lo que confirma
el alto grado de influencia del contenido polifenólico sobre el
poder antioxidante.
3.3. Evolución de melanoidinas
De los datos mostrados en la Tabla 3 se desprende
que el proceso de pasificación afecta al contenido en melanoidinas de las muestras, medido este como la absorbancia
a 345 nm de las muestras dializadas. El proceso de secado
natural disminuye el valor del índice de melanoidinas y el proceso de secado artificial lo aumenta; este comportamiento
coincide con el observado en el poder antioxidante.
3.4. Contenido en ácido glucónico
En la Tabla 4 se muestran las concentraciones de
ácido glucónico junto con las concentraciones de Ocratoxina
A encontradas en las muestras analizadas, indicando el tipo
de variedad de uva y el tipo de soleo empleado. Se observa
como el secado artificial en cámara climática mantiene los niveles de ácido glucónico por debajo de los obtenidos mediante el proceso tradicional, al permitir la pasificación de la
uva de forma controlada.
3.5. Control de ocratoxina A
Al comparar ambos procesos de pasificación (Tabla
2), podemos observar como en general (salvo en las muestras de la variedad Pedro Ximénez procedentes de la D.O.
Montilla) el contenido en OTA obtenido durante el secado en
cámara climática es inferior al alcanzado en el proceso de
pasificación tradicional. Además, la pasificación artificial mantiene los valores de OTA por debajo del nivel máximo (2 µg/L)
establecido por la legislación de la Unión Europea [4].
4. CONCLUSIONES
A la vista de los resultados obtenidos, podemos afirmar que el empleo de una cámara climática como técnica alternativa de pasificado de las uvas, nos permitiría realizar el
proceso de pasificación de forma controlada, optimizando los
parámetros relacionados con la calidad y seguridad alimentaria.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. RIVERO-PÉREZ, M.D.; PÉREZ-MAGARIÑO, S.; GONZÁLEZ-SAN JOSÉ, M.L. 2002. Role of Melanoidins in
Sweet Wines. Analytical Chimica Acta, 458, 169-175.
1. GUILLEN, D.A.; BARROSO, C.G.; ZORRO, L.; CARRASCAL, V.; PÉREZ-BUSTAMANTE, J. A. 1998. Organic acids analysis in “Brandy de Jerez” by
ion-exclusion chromatography, “post-column” buffering and conductimetric detection. Analusis 26, 186189.
3. ALONSO A.M.; GUILLÉN D.A.; BARROSO C.G. 2003.
Development of an electrochemical method for the
determination of antioxidant activity. Application to
grape-derived products. Eur. Food Res. Technol. 216,
445-448.
4. Commission Regulation (EC) No. 123/2005 of 26 January
2005, Official Journal of the European Union. L25 (2005)
3.
6. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado por el Plan Nacional
de I+D+I 2000-2003 (AGL 2003-03774) y por el Plan Nacional de I+D+I 2004-2007 (AGL2006-12852).
Tabla 4. Datos de concentración de ácido glucónico y ocratoxina A encontrado en las muestras estudiadas.
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SEGUIMIENTO EN CONTINUO DE MICROFERMENTACIÓNES ALCOHÓLICAS
MEDIANTE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE PROTÓN
Eva López-Rituerto, Iván Antón, Alberto Avenoza, Jesús H. Busto,* Jesús M. Peregrina.*
Departamento de Química, Universidad de La Rioja, Grupo de Síntesis Química de La Rioja, UA-CSIC, 26006 Logroño. Fax: +34 941 299655.
[email protected], [email protected]
Resumen:
Recientemente nuestro grupo de investigación ha puesto a punto un protocolo de RMN de protón para la cuantificación de los ácidos málico y láctico en procesos de fermentación alcohólica y maloláctica sin necesidad de preparación previa
de la muestra (qHNMR). Nuestro objetivo ahora es la monitorización en continuo de estos procesos mediante RMN de protón.
Con este objetivo se han realizado microfermentaciones en tubos de RMN, empleando para ello cantidades inferiores al mililitro, con el fin de evaluar la acción de las levaduras sembradas. Esta monitorización en continuo permite la toma de datos cada
dos horas y la realización del seguimiento de diversos compuestos en un solo experimento.
Palabras clave: Resonancia Magnética Nuclear, cuantificación, fermentación alcohólica.
1. INTRODUCCIÓN
La Resonancia Magnética Nuclear (RMN) es una
técnica espectroscópica basada en las propiedades magnéticas de los núcleos y desde 1943 ha estado ligada a los premios Nobel, tanto de Física, como de Química y Medicina.
La RMN y en concreto la RMN de protón (1H RMN) permite
la detección simultánea de una gran cantidad de componentes orgánicos o metabolitos presentes en una muestra. La
única condición para su presencia en el espectro es la existencia en la molécula de protones, algo que la gran mayoría
de los productos de interés poseen [1].
Dentro del campo de la Química la RMN ha sido
empleada como una potente herramienta estructural para la
caracterización de nuevos compuestos y para el estudio de
las diferentes conformaciones que pueden adoptar las biomoléculas en disolución. Sin embargo, en los últimos años la
técnica está siendo explorada en campos como el de la Ciencia de los Alimentos o en Ciencias de la Salud. Dentro del estudio de los alimentos, la RMN presenta una forma directa de
cuantificar diversos compuestos de una mezcla compleja en
un solo experimento. A esta reciente aplicación se le denomina como qHNMR [2] (de sus siglas en inglés quantitative
hydrogen nuclear magnetic resonance) y está siendo la base,
junto con la espectrometría de masas, de la moderna rama
de la ciencia bautizada como metabonómica. Dentro del terreno de las bebidas, y en concreto en la enología está siendo
considerable el aumento de publicaciones que relacionan
ambos aspectos, vino y RMN.
De esta forma, se han desarrollado en los últimos
años perfiles metabólicos sobre frutas, zumos de frutas,
aceite de oliva, café, sidra y también por supuesto sobre
mosto y vino. De todos estos trabajos cabe destacar dos por
su extremada calidad. Uno desarrollado por el profesor Jens
Duus, de los laboratorios Carlsberg de Dinamarca, en el que
se aborda la cuantificación de aminoácidos y ácidos orgánicos en la cerveza. Por otro lado, en un reciente estudio, el
famoso enólogo francés Jean-Pierre Gaudillere (Director de
Investigación del Instituto Nacional de Investigación Agrícola,
INRA de Burdeos) en colaboración con científicos expertos
en RMN han desarrollado esta metodología sobre vinos de
Burdeos [3].
En nuestro grupo de investigación estamos desarrollado un proyecto en el que se ha puesto a punto la metodología para la obtención de información cuantitativa mediante 1H
RMN de muestras procedentes de diferentes bodegas [4].
Para la comprobación del buen funcionamiento del método
decidimos, en un primer lugar, realizar la cuantificación de
algún compuesto de fácil medición por otra técnica. Escogimos, por su importancia en la elaboración del vino, el seguimiento de los ácidos málico y láctico. De esta forma hemos
analizado la evolución de diversos vinos desde su entrada en
bodega hasta la finalización de la fermentación alcohólica y
posteriormente la fermentación maloláctica (Fig. 1).
Con los buenos resultados obtenidos decidimos
abordar la cuantificación de diversos componentes en fermentaciones realizadas en el propio tubo de RMN. Abordamos en este trabajo un primer estudio exploratorio realizando
una microfermentación alcohólica a temperatura controlada y
con toma de datos de forma continua.
La uva procede de la finca Vista Hermosa del término municipal de Tudelilla y corresponde a una variedad
garnacha de 20 años. El mosto fue obtenido tras un despalillado total con doce horas de maceración y un posterior sangrado. Una vez decantado el mosto fue inoculado con
levaduras (Saccharomyces cerevisiae, Uvaferm BC®, 40 mg
en 60 mL) y se cogieron 0.45 mL de mosto a los que se les
añadió 0.05 mL de D2O (relación H2O/D2O 9:1). La muestra
fue introducida en un tubo de RMN cerrándolo con un tapón
perforado con la finalidad de permitir la salida de CO2.
Los experimentos fueron realizados en un espectrómetro Bruker Avance equipado con una sonda de detección inversa de 5-mm con gradientes en Z (BBI H-BB Z-GRD)
271
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Fig. 1. Evolución de los ácidos málico y láctico medidos por
1H RMN y su comparación con los datos obtenidos mediante medidas enzimáticas
y con unidad de temperatura variable. La adquisición de los
espectros fue realizada con el programa TOPSPIN (versión
1.3) y el procesado de los mismos se realizo con el programa
MestRe-C (versión 4.9.9.9)
Los espectros de 1H RMN se realizaron directamente sobre la muestra de vino con la preparación comentada anteriormente utilizando un programa de pulsos de
presaturación de agua (zgpr, pl19 a 60 dB y un ángulo de 90°)
a la temperatura constante de 299 K. Se realizaron 30 experimentos de forma continua con una duración de cada experimento de 2 h y 30 min empleando el programa auxiliar de
Bruker multizg. La anchura espectral fue fijada en 10 ppm y
los datos recogidos en 64 K después de 128 scans más 4
scans previos. El retardo entre pulsos (d1) fue de 60 segundos con el fin de entrar en el intervalo de 5xT1 para todos los
protones tal y como sugiere la literatura específica. El pulso
de 90 fue convenientemente calibrado en 6.9 s con un nivel
de potencia de -1 dB. Los experimentos fueron llevados a
cabo con las herramientas ATM (tuning y matching automático) y GRADSHIM.
3. RESULTADOS
Conforme se realizaron los experimentos se fueron
monitorizando para comprobar la evolución de la fermenta-
Fig. 2. Seguimiento de la fermentación alcohólica en un tubo de RMN
Fig. 3. Evolución de etanol, ácido acético (gráfica A) y de los ácidos málico y láctico (gráfica B)
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Fig. 4. Evolución de los aminoácidos alanina y prolina y del ácido succínico (gráfica A)
y de los aminoácidos arginina y GABA (gráfica B)
ción alcohólica. En la Fig. 2 se muestra siete espectros de 1H
RMN, desde las 2 horas y media hasta las 75 horas, observando claramente la evolución de las señales de etanol y la
disminución de las señales correspondiente a los azucares.
Los espectros una vez registrados fueron escrupulosamente tratados siguiendo el protocolo previamente descrito [4] para aumentar la eficacia de la cuantificación. Se
realizó la transformada de Fourier aplicando una función de
ventana exponencial con un número de puntos en la parte
real de 64K. La corrección de fase se realizó de forma manual
y la línea base se ajusto mediante multipuntos.
La cuantificación se efectuó mediante un patrón externo de concentración conocida sobre el que se registró un
1
H RMN en las mismas condiciones que las utilizadas para el
seguimiento de la fermentación.
En la Fig. 3 se aportan los datos de la evolución
para el etanol y el ácido acético (gráfica A) y para los ácidos
málico y láctico (gráfica B). Se observa claramente, que dada
las condiciones de fermentación, la aparición de gran cantidad de acético frena la progresión del etanol. Con los mismos experimentos se pudieron realizar los análisis de otros
componentes como los que aparecen en la Fig. 4. Los aminoácidos alanina y prolina y el ácido succínico pudieron ser
cuantificados mientras que para los aminoácidos arginina y
GABA se dan los valores de las integrales absolutas.
4. CONCLUSIONES
Se ha llevado a cabo una microfermentación en un
tubo de RMN y dentro del espectrómetro, realizando espectros de forma continua para obtener, aplicando el programa
de pulsos adecuado, información cuantitativa de la evolución
de diversos componentes del vino. Se puede realizar un perfecto seguimiento cinético de diversos compuestos sin necesidad de recoger ni alterar la muestra. En futuros trabajos se
tratará de controlar el proceso para que la fermentación alcohólica se realice sin la intervención de procesos colaterales.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. www.nobelprice.org
2. Pauli, G. F.; Jaki, B. U.; Lankin, D. C. 2005. Quantitative
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H NMR: development and potential of a method for
natural products analysis. J. Nat. Prod. 68, 133 – 149.
3. Pereira, G. E.; Gaudillere, J.-P.; Van Leeuwen, C.; Hilbert,
G.; Lavialle, O.; Maucourt, M.; Deborde, C.; Moing, A.;
Rolin, D. 2006. 1H NMR and Chemometrics To Characterize Mature Grape Berries in Four Wine-Growing
Areas in Bordeaux, France. J. Agric. Food Chem. 53,
6382 – 6389.
4. Avenoza, A; Busto, J.H.; Canal, N.; Peregrina, J.M. 2006.
Time Course of the Evolution of Malic and Lactic
Acids in the Alcoholic and Malolactic Fermentation of
Grape Must by Quantitative 1H NMR (qHNMR) Spectroscopy. J. Agric. Food Chem. 54, 4715 – 4720.
6. AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a la profesora Belén Ayestarán por
las muestras aportadas para la elaboración de este trabajo.
I. A. agradece al Servicio Riojano de Empleo el contrato. J. H.
B. agradece al Ministerio de Educación y Ciencia el contrato
Ramón y Cajal.
273
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ELIMINACIÓN DE PLOMO EN VINAGRES SINTÉTICOS Y DE VINO MEDIANTE
RESINAS DE INTERCAMBIO IÓNICO
Mariela Alejandra Labbé1, Fernando Noé Salazar1, Francisco López1
1
Dep. Ingeniería Química. Unidad de Enología del CeRTA. Facultad de Enología de Tarragona. Universidad Rovira i Virgili. Tarragona, España. Tel. 34 977
T558 503. E-mail: [email protected]
Resumen:
El plomo es un elemento de riesgo para la salud humana, ya que se acumula en diferentes órganos del cuerpo,
por ello en los últimos años la tendencia a informar al consumidor del contenido de plomo en los alimentos ha llevado a fijar
límites mínimos a partir del cual es obligatorio etiquetar el producto con la leyenda de contiene plomo, que por ejemplo para
el vinagre de vino en California, USA es de 35 g/L. Por ello se plantea la necesidad de estudiar procesos para disminuir el
contenido del plomo en vinagres, con el fin de eliminar la obligatoriedad de indicarlo en el etiquetado a pesar que tanto su contenido en plomo como su consumo son bajos, y no representan un riesgo para la salud.
En este trabajo se ha estudiado la eliminación de plomo en continuo mediante el empleo de una resina de intercambio iónico (Lewatit TP 207) en vinagres sintéticos y de vino. Los resultados obtenidos han mostrado que este tratamiento permite reducciones del orden del 95% para vinagres sintéticos con concentraciones iniciales de 100ug/L, mientras que para
vinagre de vino blanco, tinto y balsámico estas reducciones son del 40, 20 y 30%, respectivamente.
Palabras clave: Vinagre, Plomo, Intercambio iónico.
1. INTRODUCCIÓN
274
El plomo es un metal pesado caracterizado por ocasionar efectos tóxicos en la salud humana, siendo los alimentos una fuente importante de exposición de plomo para
el público en general, es por ello que el comité mixto de la
FAO/OMS [1] estableció una ingesta semanal provisional tolerable (ISPT) de 25 µg Pb/kg de peso del individuo.
El vinagre es un producto derivado del vino y ya que
no hay trabajos que determinen la fuente de contaminación
de este metal en este tipo de productos, se asume la hipótesis de que la contaminación podría ser la misma que en el
vino, es decir, a través de la transferencia del metal desde el
suelo vía las raíces hasta la uva o a través de los procesos
de vinificación cuando se utilizan equipos o accesorios hechos por latón [2, 3].
El nivel permitido de plomo en vinagres de acuerdo
a la legislación europea y española es 500 µg/L (RD 2070/93)
[4], sin embargo la reciente tendencia de informar al consumidor del contenido de metales pesados en los alimentos ha
llevado a fijar límites mínimos a partir del cual es obligatorio
etiquetar el producto con la leyenda de contiene plomo, que
por ejemplo para el vinagre de vino en California, USA es de
35 µg/L. Por ello se plantea la necesidad de estudiar procesos para disminuir el contenido del plomo en vinagres, con el
fin de eliminar la obligatoriedad de indicarlo en el etiquetado
a pesar que tanto su contenido en plomo como su consumo
son bajos, y no representan un riesgo para la salud, puesto
que para que una persona se exponga al límite de riesgo debería de consumir entre 250-650 ml de vinagre diariamente.
En la literatura existen estudios de aplicación de
procesos de adsorción (resinas, bioadsorbentes, bentonita,
etc.) para la reducción de plomo y otros metales pesados en
tratamientos de aguas residuales y otras soluciones acuosas
[5, 6], en los cuales las concentraciones son del orden de
mg/L, sin embargo existe una gran dificultad en reducir plomo
cuando este está presente en niveles de trazas, debido al
bajo gradiente de concentración o a la baja selectividad del
material adsorbente. Palacios y col., 2001 [7] utilizaron la resina Lewatit TP 207 en la reducción de iones metálicos en
vinos. Labbé y col., 2006 [8] utilizando la misma resina en
sistema discontinuo determinaron las isotermas de adsorción
de plomo presente en vinagres sintéticos y su aplicación en
vinagres comerciales.
Por esta razón en este trabajo se ha estudiado la
eliminación de plomo en sistema continuo mediante el empleo de una resina de intercambio iónico (Lewatit TP 207) en
vinagre sintético y de vino.
El vinagre sintético ha sido preparado a una concentración de 60 g/L de ácido acético y de 100 µg/L de plomo.
Los vinagres comerciales han sido de vino blanco, de vino
tinto y balsámico, adquiridos en el supermercado.
La resina utilizada es Lewatit TP 207 (Bayer, USA).
La que corresponde a una resina macroporosa de intercambio iónico quelante con grupos funcionales de iminodiacetato
y una matriz de estireno.
El proceso de adsorción ha sido llevado a cabo en
una columna de relleno (14,5 cm de largo y 2 cm de diámetro interno) empacada con 35 ml de la resina anteriormente
descrita. El vinagre ha sido bombeado a través de la columna
con ayuda de una bomba peristáltica, Watson Marlow 101
U/R. Después de cada tratamiento, la resina ha sido regenerada según las recomendaciones del fabricante usando HCl.
Un volumen de vinagre sintético equivalente a 80
veces el volumen del lecho de resina (BV) ha sido tratado a
ISBN 978-84-690-6060-5
dos tiempos de residencia, 5 y 10 minutos, para determinar
la condiciones de operación que permitían una mayor reducción de plomo. Este tratamiento se ha realizado por duplicado. Los vinagres de vino blanco, tinto y balsámico han sido
tratados para el tiempo de residencia elegido en la etapa anterior. El volumen tratado ha sido el equivalente a 120 BV.
Además un vinagre de vino blanco ha sido tratado dos veces
consecutivas con el objetivo de ver el efecto de la concentración inicial de plomo.
La concentración de plomo ha sido determinada
antes y después del tratamiento de adsorción usando un espectrofotómetro de adsorción atómica de cámara de grafito
(GFAAS) Perkin Elmer (modelo 1100B), equipado con un
muestreador automático (modelo AS70) y cámara de grafito
(modelo HGA700). Se han utilizado NH4H2PO4 y Mg(NO3)2
como modificadores de matriz.
La reducción de plomo se ha definido mediante la
relación (C0-C)/C0, donde C0 y C son la concentración de
plomo a la entrada y salida de la columna, respectivamente.
3. RESULTADOS
La reducción de plomo en vinagre sintético usando
la resina Lewatit TP 207 se presenta en la Fig. 1, para dos
tiempos de residencia de 5 y 10 minutos, donde se puede observar una rápida reducción de plomo del 74,4 ±7,0 y 90,1
±9,5%, respectivamente, y esta aumenta ligeramente hasta
el final del volumen tratado a valores del 80 y 95 % aproximadamente. Para el tiempo de residencia de 10 minutos se
ha analizado la capacidad de la resina mediante el tratamiento de un volumen de vinagre sintético mayor, equivalente
a 160 BV. Los resultados de este tratamiento se presentan
igualmente en la Fig. 1, y se puede observar que la reducción de plomo se mantiene constante hasta el final del proceso en valores del 95%.
En base a los resultados obtenidos para el vinagre
sintético, se han tratado diferentes vinagres comerciales con
un tiempo de residencia de 10 minutos. La Tabla 1, muestra
la concentración inicial de plomo así como los porcentajes de
Fig. 1. Eliminación de plomo en vinagre sintético con una concentración inicial de plomo de 100 µg/L (•:5 minutos de tiempo de
retención y 80 BV; : 10 minutos de tiempo de retención y 80 BV; ▲:10 minutos de tiempo de retención y 160 BV).
Tabla 1. Resumen de los datos de vinagres comerciales
275
ISBN 978-84-690-6060-5
reducción obtenidos para un volumen de vinagre tratado
equivalente a 120 BV.
La reducción de plomo en los vinagres comerciales
es notablemente inferior a la obtenida para el vinagre sintético. Se puede observar que la reducción es mayor para el
vinagre de vino blanco, 40%, seguida del vinagre balsámico,
30% y finalmente el vinagre de vino tinto, 20%.
La menor reducción en los vinagres comerciales
frente a la del vinagre sintético, se puede justificar a que el
plomo en ellos está ligado a macromoléculas tales como taninos, polisacáridos y fragmentos de proteínas [3]. Comparando las matrices de los diferentes vinagres comerciales, la de
vino tinto es la mas compleja y este hecho explicaría porqué
en vinagres de vino blanco se obtiene una reducción mayor.
Para poder conseguir una mayor reducción del contenido de plomo en el vinagre, se puede aplicar un segundo
tratamiento. Por ejemplo para el vinagre de vino blanco que
ha reducido su contenido en plomo de 73 µg/L a 44 µg/L en
el primer tratamiento, si se vuelve a pasar a través de la columna de resina se consigue reducir su concentración en
plomo a 15 µg/L, representado una reducción del 80%, logrando obtener un producto final con una concentración
menor a 35 µg/L.
4. CONCLUSIONES
Los vinagres comerciales utilizados en este estudio, de acuerdo a la legislación de California estarían obligados a etiquetar advirtiendo al consumidor la presencia del
contenido de plomo. No obstante, al utilizar la resina Lewatit
TP 207 en un sistema continuo y realizando uno o dos tratamientos a los vinagres, el nivel de plomo quedaría por debajo
de lo que exige la norma y por tanto se podría omitir este
tipo de etiquetado.
276
5. BIBLIOGRAFÍA
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7. PALACIOS, V. M.; CARO, I.; PÉREZ, L. 2001. Application of ion exchange techinques to industrial process
of metal ions removal from wine. Adsorption. 17 131138
8. LABBÉ, M.; SALAZAR, F. N.; GÜELL, C.; LÓPEZ,
F. 2006. Reducción de plomo en vinagres mediante resinas de intercambio iónico. IV Congreso de
Ingeniería y Tecnología de Alimentos, CESIA 2006,
Córdoba.
ISBN 978-84-690-6060-5
DESARROLLO DE UN SISTEMA DE FOTODERIVATIZACIÓN POST-COLUMNA ON-LINE
PARA EL ANÁLISIS DE TRANS-RESVERATROL Y TRANS-PICEIDO EN VINO
Teresa Galeano, Isabel Durán, Diego Airado
Departamento de Química Analítica, Facultad de Ciencias, Universidad de Extremadura, Avda de Elvas s/n, C.P. 06071 Badajoz, España .Tel./Fax: 924-289375, e-mail: [email protected]
Resumen:
Tanto el resveratrol como su 3-glucósido, piceido, sufren interesantes reacciones fotoquímicas. La irradiación con luz
ultravioleta de sus trans-isómeros tiene como consecuencia la generación de los cis-isómeros, en un corto espacio de tiempo.
Estos cis-isómeros son muy inestables, y desaparecen rápidamente en favor de compuestos altamente fluorescentes, que presentan máximos de excitación centrados a 260 y 261 nm, y dos máximos de emisión, centrados a 364 y 382, y 361 y 379 nm,
respectivamente. En esta comunicación se presenta un sistema de fotoderivatización post-columna on-line, y se exponen los
resultados de su aplicación en el análisis de vinos mediante LC con detección fluorescente.
Palabras clave: Resveratrol, Piceido, LC, Fotoderivatización, Vino.
1. INTRODUCCIÓN
El resveratrol es un compuesto fenólico derivado del
estilbeno (3,5,4’-trihidroxiestilbeno) que se puede presentar
como aglicona o como 3-glucósido (piceido). Existen dos formas isoméricas, cis- y trans-, de cada uno de ellos.
Fig. 1. Estructuras químicas de trans- (1) y cis-resveratrol
(3), y trans- (2) y cis-piceido (4)
Como otros compuestos de esta familia, el resveratrol se produce de forma natural en un amplio número de familias vegetales con el objeto de cumplir una misión
específica, ser un pesticida natural, a través del cuál, y junto
con otros anabolitos, la planta se defienda de agresiones externas. En 1976 [1] se descubrió la existencia de este compuesto en la vid (Vitis vinifera), comprobándose
posteriormente que su síntesis se produce principalmente en
la piel de las uvas y en muy baja concentración en el resto del
fruto [2]. Como consecuencia, el resveratrol aparece como
componente natural del vino, con concentraciones de glucósido normalmente superiores a las de aglicona [3]. La distribución relativa entre las formas glucosilada y libre en el vino
depende de factores tales como el tipo de fermentación y las
condiciones ecológicas. En cualquiera de sus formas, las
concentraciones de resveratrol en vinos tintos son muy superiores a las encontradas en vinos blancos [4].
Cabe destacar las propiedades beneficiosas que el
resveratrol tiene sobre la salud humana, entre otras: propiedades antitrombóticas, inhibidor de la agregación plaquetaria,
propiedades antioxidantes y anticancerígenas.
Tanto el resveratrol como el piceido son compuestos fotosensibles. La irradiación con luz ultravioleta de sus
trans-isómeros tiene como consecuencia la generación de
los cis-isómeros, en un corto espacio de tiempo. Estos cisisómeros son muy inestables, y desaparecen rápidamente en
favor de compuestos altamente fluorescentes [2, 5]. Esta reacción fotoquímica, es muy interesante desde el punto de
vista analítico, ya que las propiedades fluorescentes de estos
fotoproductos no han sido aun explotadas en aras de mejorar la sensibilidad y selectividad de los métodos de determinación.
En la presente comunicación se presenta un sistema de fotoderivatización post-columna on-line, y se exponen los resultados de su aplicación al análisis de muestras de
vino.
2.1. Reactivos y disoluciones
Todos los disolventes y reactivos empleados fueron grado-HPLC (Merck) y grado reactivo-análisis, respectivamente. Se usó agua ultrapura (Sistema Millipore Milli-Q).
trans-Resveratrol y trans-piceido fueron suministrados por Sigma y Aldrich Chem. Co., respectivamente. Se
prepararon sendas disoluciones etanólicas conteniendo 50.0
mg·L-1 de cada compuesto y se conservaron a -4ºC y aisladas
de la luz.
2.4. Instrumentación y software
Cromatógrafo de líquidos Hewlett-Packard Mod.
1100, compuesto por desgasificador, bomba cuaternaria, válvula de inyección manual de seis vías conteniendo un bucle
277
ISBN 978-84-690-6060-5
de 20 µL, detector UV-visible con arreglo de diodos y detector espectrofluorimétrico de barrido rápido. Fotorreactor consistente en un tubo de PTFE (3.5 m x 0.3 mm d.i. x 1.6 mm
d.e.), helicoidalmente enrollado sobre una lámpara de xenón
de 4 W de potencia, localizado entre la salida de la columna
y la entrada al detector fluorimétrico. El control del cromatógrafo, así como la adquisición y tratamiento de datos se lleva
a cabo con el paquete de software CHEMSTATION. Se emplea como columna analítica una columna Nova-Pak C18, de
dimensiones 150 mm x 3.9 mm d.i. y tamaño de partícula y
poro 4 m y 60 Ǻ, respectivamente. La fase móvil consiste en
una mezcla acetonitrilo:ácido fosfórico en agua al 0.04 %
18:82, v:v, cuyos componentes son previamente filtrados a
través de una membrana de nylon con poros de 0.22 µm y
desgasificados mediante ultrasonidos. El flujo de fase móvil
es 0.9 mL·min-1. El eluato se monitoriza fluorimétricamente a
λexc/em 260/364 nm.
Fig. 2. Espectros de excitación y emisión de fluorescencia
correspondientes a disoluciones conteniendo 57.0 y 60.0
ng·mL-1 de trans-resveratrol (A) y trans-piceido (B), respectivamente, en etanol:agua 40:60, v:v, aisladas de la luz
(··········) (λexc/em 318/390 nm), e irradiadas durante 60 y 180
segundos (———) (λexc/em 260/364 nm (A) y 261/361 nm
(B)), respectivamente
2.5. Procedimiento general. Rectas de Calibrado
Añadir alícuotas de las disoluciones etanólicas de
trans-resveratrol y trans-piceido, conteniendo entre 1.0 y 15
µg de cada analito en matraces volumétricos de 10.0 mL, diluir hasta enrase con agua ultrapura, e inyectar en el sistema
cromatográfico, previo filtrado a través de filtros de PTFE de
20 µm de tamaño de poro (Millex-FG).
2.6. Procedimiento para el análisis de trans-resveratrol y
trans-piceido en vino
Someter al vino a una dilución de 50 veces con
agua ultrapura e inyectar la disolución resultante en el sistema cromatográfico, previo filtrado a través de filtros de
PTFE de 20 µm de tamaño de poro (Millex-FG).
3. RESULTADOS
Tanto trans-resveratrol como trans-piceido son débilmente fluorescentes, presentando máximos de excitación
centrados a 225 y 318 nm, y 230 y 300 nm, respectivamente,
y máximos de emisión a 385 y 395, respectivamente, en
medio hidroetanólico. Se comprueba que la irradiación ultravioleta externa de disoluciones hidroetanólicas de trans-resveratrol y trans-piceido, tiene como consecuencia la
generación de fotoproductos altamente fluorescentes (Fig. 2).
Los espectros de los fotoproductos de resveratrol y piceido se
caracterizan por presentar un intenso y agudo máximo de excitación centrado a 260 y 261 nm, respectivamente, y dos
máximos de emisión, no menos agudos, en torno a 364 y 382
nm y 361 y 379 nm, respectivamente.
Con el objetivo de aunar las ventajas de la cromatografía de líquidos con las propias de esta fotorreacción, se
ha utilizado un sistema de fotoderivatización on-line post-columna para el análisis de trans-resveratrol y trans-piceido en
vinos, anteponiendo un fotorreactor (longitud efectiva = 3.5
m) a la entrada del eluato en el detector de fluorescencia.
Como fase móvil se emplea una mezcla acetonitrilo:ácido fosfórico en agua al 0.04 %, 18:82, v:v (0.9 mL·min-1), anteriormente optimizada para el análisis de estos compuestos en
vino. Como se observa en la Fig. 3A, la fotorreacción hace
posible la detección fluorimétrica de ambos analitos a través
Tabla 1. Parámetros analíticos de calidad para la determinación cromatográfica de trans-resveratrol y trans-piceido.
278
ISBN 978-84-690-6060-5
Fig. 3. Cromatogramas correspondientes a un patrón conteniendo 0.50 mg·L-1 de trans-resveratrol y trans-piceido (A)
y a una muestra de vino tinto comercial diluido 50 veces
(B), con el fotorreactor apagado (··········) y encendido (——
—)
vino de trans-resveratrol y trans-piceido son 3.7 ± 0.1 y 8.0
± 0.4 (media ± desviación estándar, n=3), respectivamente.
4. CONCLUSIONES
Analitos débilmente fluorescentes han sido transformados a fotoproductos fluorescentes, lo que ha permitido
su análisis mediante HPLC con detección fluorimétrica.
5. BIBLIOGRAFÍA
de sus fotoproductos generados on-line. El resumen de los
parámetros analíticos de calidad para la determinación mediante HPLC con fotoderivatización post-columna de los
trans-isómeros del resveratrol y el piceido, se encuentra en la
tabla 1.
El método se aplica al análisis de un vino tinto comercial, encontrándose que la radiación ultravioleta destruye
los principales componentes del vino interferentes con los
analitos de interés, en las condiciones cromatográficas empleadas, y como se observa en la Fig. 3B, se obtienen picos
cromatográficos totalmente resueltos para trans-resveratrol
y trans-piceido. Las concentraciones encontradas en este
1. LANGCAKE, P; PRICE, R.J. 1976. Production of resveratrol by vitis-vinifera and other members of vitaceae as a response to infection or injury. Physiol. Plant
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skins of ripening grapes. Sci. Aliments. 15 411 - 422
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4. KALLITHRAKA, S.; ARVANITOYANNIS, I.; EL-ZAJOULI,
A.; KEFALAS, P. 2001. The application of an improved
method for trans-resveratrol to determine the origin
of Greek red wines. Food Chem. 75 355 - 363
5. OGGERO, J.P. 2000. Study of the ultraviolet irradiation of resveratrol and wine. J. Food Comp. and Anal.
13 93-97
6. AGRADECIMIENTOS
Ministerio de Educación y Ciencia. Proyecto:
CTQ2005-02389. D. Airado agradece a la consejería de Infraestructura y DT (J. Extremadura) su beca predoctoral
(DOE 22/06/04).
279
Página 280 blanca
Crianza y Envejecimiento
Página 282 blanca
ISBN 978-84-690-6060-5
Capítulo 3: Crianza y Envejecimiento
EFECTO DE LAS CONDICIONES DE SECADO SOBRE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA DE
LA MADERA DE ROBLE DESTINADA AL SECTOR TONELERO
Juana Martinez1, Sonia Ojeda1, Pilar Rubio1,
Estrella Cadahía2, Brígida Fernández de Simón2
1
Sección de Viticultura y Enología. Servicio de Investigación y Desarrollo Tecnológico de La Rioja (CIDA).
Ctra Mendavia-Logroño NA-134, km. 88. 26071 Logroño (España). Tfno: 941291833. e-mail: [email protected]
2
Resumen:
Centro de Investigación Forestal (CIFOR-INIA). Apdo 8111. 28080 Madrid.
En este trabajo se estudió la influencia de las condiciones de secado (natural al aire libre, artificial en estufa y mixto)
en la composición química de la madera de roble de dos especies (Q. alba y Q. petraea). Los resultados obtenidos confirmaron
una evolución de la composición polifenólica y volátil de la madera, diferente en función de la especie de roble y tipo de secado
aplicado. El secado natural resultó más adecuado que el mixto y artificial, especialmente para la madera de roble francés, ya
que redujo en mayor medida la concentración de elagitaninos e incrementó la concentración de fenoles volátiles y ciswhiskylactona. El contenido de compuestos volátiles no deseados disminuyó igualmente con los tres tipos de secado.
Palabras clave: madera, roble, secado, polifenoles, volátiles.
1. INTRODUCCIÓN
El proceso de fabricación de barricas comprende
una serie de etapas que condicionan la calidad enológica
final de la madera entre los que cabe destacar el secado y
tostado. La madera verde no puede ser utilizada para la fabricación de barricas, ya que contiene entre un 40-60% de
agua y sus compuestos extraíbles son difícilmente compatibles con el objetivo de mejorar la calidad de los vinos. Esta
operación permite reducir el elevado porcentaje de humedad existente en la madera verde hasta un 12-15%, pero
además se producen modificaciones importantes en su estructura física y composición química que favorecen la calidad enológica.
El secado de la madera en tonelería habitualmente
se realiza de forma natural, durante un tiempo variable entre
18 y 36 meses al aire libre. Además, puede efectuarse de
forma artificial (en estufa ventilada con condiciones de humedad y temperatura controladas durante un tiempo inferior),
o bien alternando el secado al aire libre y en estufa. Cuando
se realiza al aire libre produce un descenso de polifenoles relacionados con características sensoriales negativas como
amargor y astringencia [1, 2] y un incremento de compuestos
volátiles aromáticos, relacionados con caracteres sensoriales de calidad en vinos [1, 3]. Esto se debe a una serie de reacciones bioquímicas influidas por mecanismos físicos que
dependen de las condiciones climáticas, como son procesos
de lixiviación y degradación hidrolítica oxidativa o por la actividad fúngica que tiene lugar en los primeros milímetros de la
madera de las duelas [4]. El secado natural más que una
etapa de deshidratación de la madera es una etapa de afinamiento o curado, comparable según algunos autores a la
maduración de la uva. Sin embargo, el secado natural tiene
el inconveniente de que requiere un largo período de tiempo
que depende del espesor de las duelas, estimándose que
avanza unos 10 mm por año [1].
Con el fin de reducir el periodo de secado y por tanto
de inmovilización de la madera en el parque de secado de la
tonelería y los gastos derivados de ello, se están ensayando
otras alternativas de secado, como son un acabado final en
estufa en condiciones de humedad y temperatura controladas, o bien la realización del proceso completo de forma artificial. Sin embargo, los mecanismos fisicoquímicos implicados
en la evolución de la madera pueden verse afectados por las
diferentes condiciones de secado artificial [5, 6], y con distinta
intensidad según las características particulares de cada especie [1, 2, 6], por lo que cuando se plantea la optimización de
un proceso de secado se hace necesario el control analítico
de la evolución de la composición química de la madera relacionada con la calidad enológica.
En este trabajo se estudió la influencia de 3 tipos de
secado en la composición química de la madera de roble de
2 especies diferentes (Q. alba americano y Q. petraea de la
región francesa de Allier). Los tipos de secado aplicados fueron los siguientes: natural (al aire libre durante 3 años), artificial (en estufa durante 40 días a 40 ºC y una humedad del
70%) y mixto (natural durante 18 meses y acabado en estufa). El secado natural se llevó a cabo en el parque de secado de Tonelería Magreñán, ubicado en Alfaro (La Rioja),
en las condiciones y según la metodología de trabajo habituales de la tonelería. Los secados mixto y artificial fueron
efectuados en otras instalaciones, bajo la supervisión de la
empresa citada.
Para la caracterización química de la madera, se tomaron muestras a partir de 5 duelas cada tipo de roble,
muestreadas de forma aleatoria en el parque de secado. El
análisis de los polifenoles y taninos de la madera fue realizado por cromatografía líquida de alta resolución, utilizando
detector de diodo de Array según la metodología previamente
283
ISBN 978-84-690-6060-5
284
roble y la variedad de respuestas frente a las condiciones de
secado se ha utilizado el análisis estadístico multivariante canónico (Fig. 3) y además, se ha centrado la discusión de resultados en aquellos de especial interés por sus
características sensoriales. En ambos tipos de madera se observa una evolución de los volátiles en función de las condiciones de secado, siendo más evidente en la madera
sometida a secado natural (muestras N y n), que mostró mayores incrementos de la concentración de la mayoría de los
fenoles volátiles (guayacol, etilguayacol, vinilguayacol, siringol y metilsyringol) y del isómero cis de la whiskylactona.
Figura 3. Análisis canónico discriminante de los
compuestos fenólicos (guayacol, metilguayacol,
etilguayacol, vinilguayacol, siringol, metilsiringol,
vinillisringol, fenol, eugenol e isoeugenol), isómeros cis
y trans de la whiskylactona y piranonas (maltol,
isomaltol) en la madera verde y después de los
diferentes secados: V, f- roble verde americano y
francés; M, m- mixto; A, a- artificial; N, n- natural.
Porcentaje de varianza del 85%, correlación canónica
para can 1 y can 2 de 0,985 y 0,928 respectivamente.
Los compuestos off-flavors (Fig. 4), relacionados
con aromas herbáceos, se redujeron de forma similar con los
tres tipos de secado en las dos especies de roble, aunque en
el roble francés el descenso fue mayor.
Figura 4. Compuestos off-flavors en la madera
verde y sometida a los diferentes secados:
A- roble americano y B- roble francés
Para el estudio del elevado número de compuestos
volátiles implicados en el potencial aromático de la madera de
(ug/g)
(ug/g)
(ug/g)
Figura 1. Elagitaninos en la madera verde y después
de los diferentes secados:
A- roble americano y B- roble francés
(ug/g)
La composición química de la madera roble experimentó una notable modificación durante el proceso de secado, influenciada por las condiciones en las que se realizó.
Los resultados obtenidos confirmaron un descenso del contenido de elagitaninos, con diferencias en función de la especie de roble, y cierto incremento de su composición volátil
y polifenólica de bajo peso molecular, en la madera sometida
a condiciones de secado natural [1-3]. Igualmente, se constató la enorme variabilidad que presenta la madera de robl

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