teco diagnostics

TECO DIAGNOSTICS
CREATININA KINASA
CK-MB
_____________________________________________________________________________________________________
REACTIVO PARA CREATINA KINASA MB:
Para la determinación cuantitativa de la Creatinina Kinasa MB en suero.
INTRODUCCION.
La Creatinina kinasa es una molécula dimérica compuesta por subunidades M y
B y existe como las isoenzimas MM, MB y BB1. Las subunidades M y B son
inmunológicamente distintas; la CK-MM y la CK-MB están distribuidas
principalmente en el músculo esquelético y cardiaco, respectivamente. Mientras
que la CK-BB esta presente principalmente en el cerebro y en los tejidos
compuestos de músculo liso2. Después infarto agudo al miocardio, la actividad
de la CK-MB aumenta significativamente y su elevación es altamente especifica
para el diagnostico de laboratorio de infarto al miocardio3,4. Aunque la actividad
de la CK usualmente aumenta después de un infarto al miocardio, en algunos
pacientes solo aumenta la actividad de la CK-MB, mientras el total de la CK
permanece en el rango normal5.
En métodos convencionales, las isoenzimas de CK se cuantifican después de
separar las tres especies por electroforesis6, columna de intercambio de aniones7,
o cromatografía de intercambio aniónico. Sin embargo, esos métodos requieren
de mucho tiempo. Recientemente, Wuzburg et.al. Presentó un método de
inmunoinhibición8. Esta metodología forma la base de nuestro reactivo para CKMB.
PRINCIPIO.
La muestra es incubada en el reactivo de CK-MB el cual incluye el anticuerpo
CK-M. La actividad del CK-B no inhibido se determina usando la siguiente serie
de reacciones:
CK
Creatinina Fosfato + ADP --------> Creatinina + ATP
HK
ATP + Glucosa+ <---------> Glucosa-6-Fosfato + ADP
G-6-FDH
Glucosa-6- fosfato + NAD+ <------------> 6- Fosfogluconato +
NADH + H+
La CK cataliza la fosforilación reversible del ADP en presencia de Creatinina
Fosfato para formar ATP y Creatinina. La enzima auxiliar hexokinasa (HK)
cataliza la fosforilación de la glucosa por el ATP formado, para producir ADP y
Glucosa-6-Fosfato (G-6-F). La G6F se oxida a 6 Fosfogluconato con la
producción concomitante de NADH. La formación del NADH, medida a 340
nm, es directamente proporcional a la actividad de CK-B en suero.
COMPOSICION DEL REACTIVO.
1.- Reactivo CK-MB
Creatinina Fosfato 30 mM; Adenosina-5'-Fosfato 2mM;
Nicotinamida Adenina Dinucleótido (NAD) 2mM; Hexokinasa
(Levadura) ≥ 3000 U/L; Glucosa-6-Fosfato Deshidrogenasa
(Bacterial) ≥ 2000 U/L
2. CK-MB Diluyente:
Buffer 100 mM, Anticuerpo CK-M Anti-Humano (Cabra) en suficiente cantidad
para inhibir hasta 1500 U/L de CK-MM a 37°C
PRECAUCIONES.
1.- Para uso diagnostico in Vitro solamente.
2. Practique todas las precauciones requeridas para el manejo de todos los
reactivos de laboratorio. El pipeteo con la boca no se recomienda para ningún
reactivo de laboratorio.
PREPARACION DEL REACTIVO.
Reconstituya cada frasco de reactivo de CK-MB con el volumen de diluyente
indicado en la etiqueta. Agite para disolver.
ALMACEN Y ESTABILIDAD.
El reactivo sin reconstituir y el diluyente deben almacenarse de 2 - 8°C.
Son estables hasta la fecha de caducidad. El reactivo reconstituido es estable por
al menos 7 días en refrigeración (2-8°C) y por 24 horas a temperatura ambiente
(15 – 30°C).
COLECTA DEL ESPECIMEN.
El suero es el espécimen de elección para esta prueba. Evite la exposición de las
muestras a la luz solar intensa. Almacene las muestras en refrigeración (2-8°C)
pero no más de una semana. El congelamiento de las muestras (-20°C) da una
perdida de actividad mínima.
SUSTANCIAS INTERFERENTES.
Las muestras extremadamente hemolizadas no son adecuadas para esta prueba
ya que pueden contener altos niveles de adenil kinasa, El ATP, y la Glucosa-6fosfato, interfieren con la prueba y arrojan falsos resultados. Las drogas y otras
sustancias que pueden interferir con la determinación de la actividad de
creatinkinasa, han sido enlistadas por Young et.al10. El procedimiento descrito
puede sobre estimar los valores de CK-MB si la actividad CK-BB en suero es
muy alta. Sin embargo, la actividad CK-BB esta usualmente ausente en el suero
de individuos normales y pacientes con infarto al miocardio11. Algunas
investigaciones han observado una macroforma de BB (inmunoglobulina
acomplejada), la cual puede medirse como B en este ensayo12, 13, 14. La presencia
de macro BB en el espécimen debe sospecharse si la actividad de CK-B medida
por este procedimiento representa más del 20% de la actividad total de CK.
MATERIALES REQUERIDOS Y NO PROPORCIONADOS:
1.- Instrumentos de pipeteo precisos.
2.- Tubos/Gradillas
3.- Reloj
4.- Espectrofotómetro.
5.- Block térmico (37°C) o baño Maria.
6.- Suero control.
PROCEDIMIENTO AUTOMATIZADO.
Vea las instrucciones en la aplicación específica para el instrumento.
NOTA: Algunos instrumentos requieren volúmenes de reconstitución diferentes
a los indicados en la etiqueta del frasco.
PROCEDIMIENTO MANUAL
1.- Reconstituya el reactivo CK-MB de acuerdo a las instrucciones.
2.- Pipetee 1.0 ml de reactivo CK-MB en los tubos apropiados y pre incube a
37°C por al menos dos (2) minutos.
3. Lleve el espectrofotómetro a cero con agua a 340 nm.
4. Agregue 0.050 ml (50μl) de muestra al reactivo, mezcle e incube por minuto
por cinco (5) minutos a 37°C.
5. Después de cinco minutos, lea y registre el cambio en absorbancia por minuto
por dos (2) minutos.
6. Calcule el promedio en la diferencia en absorbancia por minuto
(ΔAbs./min.).
7. La ΔAbs./min multiplicada por el factor 3376 (vea Cálculos) arrojará
resultados de CK-B en IU/L.
8. Las muestras con valores sobre 1500 IU/L deben diluirse 1:1 con salina, se
reevalúan y los resultados son multiplicados por dos (2).
NOTA: Si el espectrofotómetro a usarse requiere un volumen final mayor a 1.0
ml para lecturas exactas, se debe usar 3.0 ml de reactivo y 0.15 ml(150 μl) de
muestra. Si el espectrofotómetro a usarse está equipado con una cubeta de
temperatura controlada, la mezcla puede dejarse en la cubeta mientras se toman
las lecturas.
LIMITANTES.
El procedimiento asume que la actividad de CK-BB en la muestra es
insignificante. Si esta presente una cantidad significativa CK-BB, entonces la
actividad de CK-MB también se sobrestimará.
CALCULOS
1. Actividad CK total:
Determine la actividad total de CK en suero de acuerdo a las instrucciones
proveídas en el instructivo para el reactivo de CK.
TECO DIAGNOSTICS
CREATININA KINASA
CK-MB
_____________________________________________________________________________________________________
2. Actividad CK-B:
IU/L = ΔAbs./min. × VT × 1000 = Abs./min. × 1.050 × 1000
PL × є × VM
1× 6.22 × 0.050
= ΔAbs./min. × 3376
Donde:
ΔAbs./min. = Promedio del cambio de absorbancia por minuto.
VT = Volumen total de reacción (1.050)
1000 = Conversión de IU/ml a IU/L
PL = Paso de luz en cm (1.0)
є = Absortividad milimolar de NADH (6.22)
VM = Volumen de muestra en ml (0.050)
3.- Actividad CK-MB.
La actividad CK-MB es calculada a partir de la actividad CK-B como sigue:
Actividad CK-MB (U/L)= Actividad CK-B U/L x 2*
*La molécula CK-MB es un dímero consistente de una subunidad B y una
subunidad M. El anticuerpo acomplejado con la subunidad M resulta en la
perdida de la mitad de la actividad catalítica de la molécula de CK-MB. De esta
manera, la actividad de CK-MB en la muestra es igual a dos veces la actividad
CK-B.
Ejemplo:
Si el promedio del cambio de absorbancia por minuto es 0.020, entonces: 0.020
× 3376 = 67.5 IU/L (Actividad CK-B)
NOTA: Actividad CK-MB (IU/L) = Actividad CK-B (IU/L) × 2
Por ejemplo, si la actividad CK-B es 67.5 IU/L entonces CK.MB=67.5 x 2 =
135.0.
El porcentaje de la actividad CK-MB en la muestra es:
% Actividad CK-MB = Actividad CK-MB × 100
Actividad total CK
Por ejemplo, si la actividad total de CK es 1007 IU/L, la actividad CK-B es 67.5
IU/L, y la actividad de CK-MB es 135 IU/L entonces:
% actividad CK-MB = 135 × 100% = 13.5%
1007
CALIBRACION.
Este procedimiento está estandarizado en base a la absorción milimolar del
NAD. El reactivo CK-MB es adecuado para la prueba de isoenzima de CK
cuando la actividad total de CK en la muestra no excede 1500 IU/L a 37°C.
CONTROL DE CALIDAD:
El suero control normal y anormal se utiliza para monitorear la validez de la
reacción. Los valores deben ser aceptables para este método a esta temperatura.
Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de valores
esperados, ya que existen diferencias entre los instrumentos, los laboratorios y
las poblaciones locales.
CARACTERISTICAS DE DESARROLLO.
1. Linealidad: 1500 IU/L.
2.- Sensibilidad: Basado en un instrumento con resolución de 0.001, este
procedimiento tiene una sensibilidad de 4 IU/L.
3.
Comparación: Estudios realizados entre este procedimiento y el
procedimiento de Sigma arrojaron un coeficiente de correlación de 0.98 con una
ecuación de regresión de y= 0.98 X – 0.823 (N=40)
4. Precisión:
Dentro de pruebas
Media (IU/L)
D.E.
C.V. (%)
Normal
34
2.8
8.2
Anormal
132
9.9
7.5
Entre pruebas
Normal
Anormal
Media (IU/L)
32
122.8
D.E
3.1
9.2
C.V. (%)
9.8
7.4
REFERENCIAS
1. Dawson, D M, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm 21: 346 (1965).
2. Neumeir D., Tissue Specific Distribution of Creatine Kinase
Isoenzyme, H. Lang, Editor, Springer Verlag, New York, p 85-109
(1981).
3. Wagner, et al,, Circulation: 47:263 (1973).
4. Bais R., Crit Rev., Clin. Lab Sci, 18:291 (1982).
5. D'Souza JP et al., Clin. Biochem. 11:204 (1978).
6. Robert et al., Am. J. Cardiol. 33:650 (1974).
7. Mercer D.W., Clin. Chem. 20:36 (1974).
8. Gerhardt et al., Clin. Chem. Acta 78:29 (1977).
9. Kaehmar, J.F. and Moss, D.W.: Fundamentals of Clinical
Chemistry. Tietz N.W. ed. Saunders, W.B. Co., Philadelphia, 686
(1976).
10. Young, D. S, et al., Clin Chem 21:10 (1975).
11. Lang, H et al., Clin. Chem. 28:1439 (1982).
12. Lott J.A., Clin. Lab Med. 6:547 (1986).
13. Ljungdahl 1., Gerhartdt W., "Creatine kinase isoenzyme variants in
human serum." Clin. Chem 24:832, (1978).
14. Urdal P, Landaas S: "Macro-creatine kinase BB in serum, and some
data on its prevalence.," Clin. Chem 25:461, (1979).
15. Wu AHB, Bowers CN Jr: "Evaluation and comparison of
immunoinhibition and immunoprecipitation methods for
differentiating MB from BB and macro forms of creatine kinase
isoenzymes in patients and healthy individuals.," Clin Chem: 2017,
(1982).
C610: 10/01
Fabricado por:
FACTORES DE CONVERSION DE TEMPERATURA.
Para convertir la actividad de CK-MB a 37°C para el valor de 30°C, multiplique
el resultado por 0.60.
VALORES ESPERADOS15:
0-24 IU/L (37°C)
0-14 IU/L (30°C)
%CK-MB <5.5%.
Distribuido por:
Grupo Tecnología y Laboratorios S.A de C.V.
T. (81) 8370 7992
www.grupotecnolab.com